TWI233440B - Antibodies and FV fragment that recognise IOR C2 antigen - Google Patents

Description

1233440 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（1 ) 發明領域 本發明係關於生物科技的領域以及尤其是得自遺傳工 程技藝之新穎的重組抗體，是一種專一性的嵌合抗體，是 一種人類化的抗體且係得自鼠科的I〇R C 5抗體之單鏈 F v片段’其可識別C 2抗原表現的抗原決定部位，其爲 糖蛋白質複合體，彼在正常的以及惡性結腸直腸細胞中均 有表現。 發明背景 目前雖然測試過許多不同的治療結腸直腸癌的方法， 然而至今仍公認外科手術爲僅有的治病方法。當在早期階 段偵測到腫瘤，外科手術可達到較高的倖存百分比，但不 幸地是大部分診斷出的案例中腫瘤均已轉移。 目前，增加倖每之策略包括〃診斷、治療以及流行病 學之應用，在疾病未散播至器官外層之階段，腫瘤仍可用 外科切除的方式治療。因此流行病學因子的知識與新治療 方法的發展將有助於增加倖存。 近年來已使用單株抗體（Mabs )或其片段，標記上放 射性同位素，經由免疫T射線圖的方法偵測癌症。 Mabs可能可爲作爲放射性同位素之攜帶者並標定相關的腫 瘤抗原。 某些放射性標記的抗體已用於作爲偵測與腫瘤相關的 癌症胚胎的抗原（癌胚抗原）。將對抗癌胚抗原之抗體用 I 一 1 3 1或I 一 1 2 5標記，可用於偵測腫瘤產生之癌 -4- (請先閱讀背面之注意事 丨||»裝—— 項寫本頁) ί訂·

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233440 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（2 ) 胚抗原或相關的標識（美國專利第3， 6 6 3， 6 8 4號 、第 3， 867, 363 號、第 3， 9 2 7, 193 號） 〇 Mabs亦可標記T C — 9 9 m得到”活體中”診斷之分 子。 經Kohler·以及Mil stein的融合瘤抗體技藝對免疫化學 產生革命性的發展並對疾病之硏究以及臨床的診斷提供可 ___能的新穎試劑（Kohler G; MUstein C.( 1 975)Nature 256 ，495—497)。此類抗體並未顯示強大的治療的功 效，但可例行的產生應用於基礎的硏究以及臨床診斷的老 鼠單株抗體（m A b s )，使用此類”活體中”免疫療法 之困難在於，彼在人類中會降低半衰期、人類免疫系統辨 視老鼠抗體效應子結構區的能力差，以及亦因爲彼爲外來 的免疫球蛋白所以苛引發抗球蛋0反應（HAMA反應） 進而干擾治療。 遺傳工程之發展對於操作抗體基因的能力產生革命性 的影響，彼可產生減低或消除免疫性以及增強所欲求之效 應或功能的m A b s ，並用此類抗體治療或診斷一些病狀 。此類操作可提供另一種選擇，將鼠科的m A b轉換成具 有相同抗原結合性質之人類形式化的抗體（Morn son S. L;et al 1 984，P.N.A.S. USA，81，6851 — 6855) 〇 最近已發展一些方法用以人類化鼠科的或老鼠抗體， 當彼用於人類時可降低對抗外來蛋白質異種的反應。 -5- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) »·裝 寫女 _ Λβ— ϋ in n If i 一口，aw fi n —ϋ ϋ— ϋ— I i

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1233440 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（3 ) 第一種降低免疫性的方法是產生”嵌合的”抗體。此類 分子中，將多變的結構區插入人類架構，此方法不僅可降 低免疫產生性且亦可增進效應或功能’因爲彼爲人類化的 抗體，因此可爲免疫系統辨識（Morrison S. L et al ( 1984)P.N.A.S，USA 81，6851 - 6 8 5 5 )。雖然此類嵌合的分子仍然保留鼠科的變異區 ，但仍可辨視原始的抗原，且其恆定區不會產生免疫性。 _ 其他作者曾企圖將齧齒動物抗原結合位點直接的構築 入人類抗體，其方法係僅從鼠科的抗體移植抗原結合位點 ，而不是全部的多變的結構區（Jones P.T et al ( 1 986) Nature 32 1,522-524, verhoeyen M et al ( 1 988)science 239, 1534- 1 5 36)。Rietchmann (Rietchmann L. et al ( 1 9 8 8) Nature 3 32, 3 23 -3 27; Quee C. et al ( 1 989) P.N.A.S USA 86,10029 -10033)已針對此方）去發展出一些相關的應用用途，然而其 他作者則致力於重新塑造抗體，其中包括在人類F R S中 加入一些鼠科的殘基以回復原始抗原的親和性（Tempest， P.R (1991) Biotechnology 9，266-272) 〇 Mateo et al· ( U S 專利第 U S 5 7 1 2 1 2 〇號） 描述一種降低鼠科抗體免疫產生性的方法。此方法中，修 飾僅限於嵌合抗體中的多變結構區及具鼠科專一性的架構 。此外，此類修飾僅限於具有兩性分子螺旋結構之F R S 區域，因此抗原決定部位有可能被T細胞辨識。此方法用 人類免疫球蛋白中相同位置之胺基酸取代鼠科的兩性分子 區域內部的殘基，及涉及結合位點之三度空間結構之胺基 -6 - (請先閱讀背面之注意事項θ寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1233440 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（4 ) 酸，即分尼（vernier )區，C D R s的標準構造，並排除 介於輕及重鏈之間相的胺基酸。 此修飾抗體的方法描述於Mateo et al，其可保留原始的 抗體辨視以及結合至抗原的能力，以及產生較低的免疫性 ，因此增加治療的功效。經由此程式僅須進行數個突變即 可得到免疫產生性低於嵌合抗體的修飾抗體。 I〇R C 5的鼠科單株抗體（專利申請案W〇 9 _ 7 / 3 3 9 1 6 )是免疫球蛋白G 1的同功型，得自用 S W 1 1 1 6細胞（結腸直腸的腺癌）免疫的Balb/c ，可 優先辨識惡性以及正常的結腸直腸的細胞表面以及細胞質 表現的抗原。此抗體不辨識癌胚抗原、路易士（ Lew1S ) a 、路易士（ Lew1S ) b、亞洲型路易士（ Lew1S )等正常的 單細胞核細胞之細胞膜抗原，亦不會辨識紅小球（如血球 等) (Vazpuez A. M. e卜 al，Hy七ridoma 11，pag. 245-256, 1992) 。 使用S W 1 1 1 6細胞膜萃取物之西方墨點法硏究顯 示此抗體可確認一種含有二種分子量形式（1 4 5以及 19 0 Kda )之糖蛋白質複合體，稱爲i〇r C2(Vazpuez A. M. et al，Year Immunol. Basel, Karger，vol. 7，pag. 1 37 - 1 45, 1993) 。 亦可從已知的最新技藝得知使用遺傳工程技藝，可從 單株抗體構築重組片段。有許多報告證實使用不同抗體片 段可”在活體中”診斷以及治療疾病。 Ira Pasta net a l.(EP 0796334 A 1)曾描述使用專一地辨識 (請先閱讀背面之注意事 丨命裝—— 項儀寫本頁) 訂i--------

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1233440 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（5 ) 與路易士 Y抗原相關的碳水化合物的抗體，其多變區域構 築之單鏈F V片段。使用此類片段可發展出偵測帶有此抗 原細胞之方法。他亦提出此片段對帶有抗原細胞具有抑制 劑之效應。 本發明之揭示： . 本發明係關於使用遺傳工程技藝得到之重組抗體，更 ___明.確的說是從依據布達佩斯條約於六月11日1 99 7寄存入 European collection of cell cultures 寄存編號 ECCC 9706 1 10 1之融合瘤製作得到的嵌合抗體、人類化的抗體以 及鼠科I〇R C 5抗體的單鏈F v片段。此抗體可確認正 常以及惡性結腸直腸細胞表現的C 2抗原（糖蛋白質複合 體）之抗原決定部位。 發明之詳細描述 合成互補D N A以及放大鼠科C 5變異區的基因 從大約1 0 6個單株抗體C 5融合瘤細胞萃取細胞質的 RNA(Vazpuez A.M. et al. Year Immunol, Basel, Karger, vol 7, pag. 1 37 - 1 45，1 993)。萃取 RNA 之方法描述於（FaloroJ.， Treisman,R. ,and Kemen, R. ( 1 989). Methods in Enzymology 65:718-749)。 互補DNA合成反應之組成物，包括5微克RNA、 2 5微微莫耳引子（引子設計成可與鼠科免疫球蛋白G 1 恆定區之開端以及鼠科輕鏈恒定的/c區域雜交）、2 . 5 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） · I — I I I 1 I ‘Ϊ I I I I I · (請先閱讀背面之注意事項I、寫本頁) J:

1233440 A7 B7 五、發明說明（6 ) 毫莫耳濃度之各去氧核苷酸（dNTp s ) 、5 〇毫莫耳 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 濃度T r i s - HC 1酸驗度7 . 5、75毫莫耳濃度K C 1、1 0毫莫耳濃度DTT、8毫莫耳濃度MgC 12以 及1 5單位之R N A水解酵素抑制劑（RNA guard，

Pharmacia )總體積爲5 0微升。樣品在7 〇 °c下加熱1〇 分鐘並緩慢的在3 0分鐘內冷卻至3 .7 °C，然後加入 1 〇 〇單位之反轉錄酵素’在4 2 °C下繼續反應1小時。 .一 -·使用聚合酵素連鎖反應（P C R )放大輕鏈（v κ ) 以及重鏈（VH)之變異區。簡言之，將5微升vh或 VK之互補DNA與2 5微微莫耳專—的引子、2 · 5毫 莫耳濃度之各dNTP、5微升之l0xDNA聚合酵素 緩衝彳谷液、以及1單之此酵素混合。樣品在熱週期9 4 C、3〇秒，5〇C、3〇；72°C、1分鐘；之下進行 2 5週期’最後在f 2。(：下反應5分鐘。 放大的互補D N A之選殖及定序 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將純化的V Η以及V K互補d N A選殖入T a載體（ ΤΑ Clorung kh· Promega，USA )。菌落用二去氧方法使用 T7 DNA PoUPharmacia，瑞典）定序。 構築嵌合的基因 從T A載體經酵素限制水解得到輕及重鏈變異區，並 選殖入表現載體（C〇l〇ma et al， J〇urnal 〇f

Immunological methods, 1 5 2, 89- 1 04 1992)0 ----------- ----------—-- - .. - 9 - Λ Λ J / ) V J J ,1 - » 1233440 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（7 ) 從T A載體用E c 〇 RV以及N h e I水解切出vh 基因’並選殖入PAH 46 〇4表現載體（內含人類恆 定的免疫球蛋白G 1以及組織胺醇抗性基因）。 生成的建築體稱爲C S V Η〜p a Η 4 6 〇 4。將從 ΤΑ經E c oRV以及S a 1 I水解切出之νκ基因選殖 入PAG46 2 2。此載體含有g p.t抗性並可作爲人類 之/c恆定區。生成的建築體稱爲C5VK-PAG4622。 嵌合的抗體表現 將N S〇細胞與用P v u I水解線性化後之〇微克 的C5VH— PAH46 04以及1 〇微克之〇57匕— P A G 4 6 2 2進行電穿透。將D N A混合後，於乙醇中 沈澱並溶於2 5微升水中。將大約1 0 7 N S〇細胞生長至 一半滿，離心收穫k再懸浮於〇、5毫升D Μ E N，在電 穿透光析管中合倂水解之D Ν Α。於冰中靜置5分鐘之後 ，將細胞施予1 7 0伏特及9 6 0微法拉弟之脈衝，並置 於冰中3 0分鐘。然後將細胞置於2 0毫升之D Μ E N ( 內含1 0 %胎牛血淸）並於4 8小時後回收。此時將細胞 重新分配至9 6孔測試盤，並施用選擇性培養基（〇 Μ Ε Ν，10%胎牛血淸，0 . 8微克/毫升黴酚酸’ 250 微克/毫升黃嘌呤）。在1 0天後肉眼即可見到轉染之菌 落。 將內含轉染菌落之測試孔中之培養液用E L 1 S Α測 量人類抗體之存在。將微量滴定盤孔塗覆山羊抗一人類r -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 丨·裝—— -項漏寫本頁) 訂---------

1233440 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（8 ) 鏈專一的抗體，於p B s T (磷酸鹽緩衝的生理食鹽水， 內含〇· 0 2% Tween 2〇，酸鹼度7 . 5)淸洗之後， 將內含轉染株測試孔中之培養液1 0 0微升添加至各量滴 定盤，在3 7 °C下反應1小時。各孔用P B S T淸洗，加 入共軛結合的山羊抗-人類/c、輕鏈專一的抗體，以及在 室溫下反應一小時。然後用P B S T.淸洗，加入內含二乙 醇胺之受質緩衝溶液。於3 0分鐘之後測量4 0 5 n m之 .吸光度。 用人類化之T抗原決定部位構築人類化的I〇R C5h。 T抗原決定部位之預測。 使用A Μ Ρ Η I程式分析I〇R C 5變異區序列， 其預測之斷片序列爲7或1 1個胺基酸長之兩性分子螺旋 ，彼係與Τ免疫產生性相關。亦可使用S Ο Η Η Α程式預 測厭水性的螺旋（Elliot e、t al. Immunol. 138: 2949-2952, ( 1 9 87)。此類算則可預測I〇R C 5輕及重鍵變異區中與T 抗原決定部位呈現相關的片段。 分析變異區之同源相似性 比較對應的人類多變結構區後，確認鼠科的分子與人 類序列大部分具同質性之I〇R C 5多變結構區。人類序 列資料庫可參見基因庫以及Ε Μ B L，二者均可上網得到 。用電腦的自動化方法（PC-DOS HIBIO PR0SIS 06-00, Hitachi )進行比對。 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公« ) 裝·------^1 訂 f—1------ (請先閱讀背面之注意事項I寫本頁)

1233440 A7 B7 五、發明說明（9 ) 分析免疫產生性之降低 此方法係經由人類化可能的T細胞抗原決定部位以降 低免疫產生性，其僅在F R S進行數個突變，特別是兩性 分子的螺旋，排除涉及結合位點三度空間結構之位置。 此方法係比較鼠科的免疫球蛋白V Η及V K區域與大 部分同質性的人類免疫球蛋白序列，·並確認鼠科以及人類 序列之間可能之不同的殘基（僅限於F R S區之中，內部 __-兩性分子的區域）（Kabat Ε. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health )，僅在與人類序列相同位置對鼠科之殘基進行突 變 〇 老鼠標準構造架構或分尼（vernier )區的殘基不涉及 突變，因爲彼在三級結構上具有顯著的效應並可影響結合 位點。在三級‘結構上進行取代額的外資料可利用變異區三 度空間之分子模式得之。 在N S〇細胞中選殖以及表現人類化之I〇R C 5抗 體。 於進行P c R重疊之後可得到突變以及人類化之V Η 以及V Κ，將得到的對應至I〇R C 5之人類化Τ細胞抗 原決定部位的基因，用相似於表現.嵌合抗體的方法選殖入 表現載體，產生下列質體：C5Vkhu-PAG4622以及〔5〃111111-PAH4 604。基因轉殖入N S〇細胞之條件與先前描述之嵌合 抗體完全相同。 得到單鏈之F v片段.建築以及表現s c F v . -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X.297公釐） (請先閱讀背面之注意 丨裝—— 事項寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233440 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（10 ) 此策略包括使用P C R之第一次放大，以修飾V Η以 及V L序列，包括在表現載體上選殖入核酸內切酶限制位 點。放大係使用精確序列設計的寡核苷酸。 於放大之後，純化變異區並用對應的限制酵素水解。 純化D Ν Α片段並連結至表現載體。稍後，將此類基因的 建築體用以下習見的方法在大腸桿菌中表現。 從生產細胞萃取蛋白質的方法，其係爲使用超音波的 、-破碎方法，並合倂S D S聚丙烯醯胺電泳凝膠、硝基一纖 維素轉移以及西方轉漬法分離可溶解的以及不溶的分層。 蛋白質部分的純化，其進行方法包括：（i )用超音 波及離心分離可溶解及不溶的材料、（2 )用低莫耳濃度 之尿素淸洗並溶於高濃度之尿素。將溶解的材料用金屬離 子親和層析法純化蛋白質。稍後，蛋白質在緩衝溶液中恢 復其構形。 * 1 實施例 實施例1 得到嵌合的單株抗體 V Η及V K互補D N A，係使用產生單株抗體IORC5 融合瘤萃取之R Ν A經反轉錄酵素作用後得之。使用之特 定引子爲： VH： 5'AGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCAGTGGATAGAC 3' VK： 5'GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG 3' V Η及V K鏈之A D N C係使用聚合酵素連鎖反應（ _ -13- (請先閱讀背面之注意 --裝--- 事項鑛寫本頁) n n a— Lr 一-eJI n ϋ ϋ 1 n ·

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公《 ) 1233440 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（11 ) P CR)以T a ρ聚合酶酵素放大，VH的特定引子含 E C 〇 R V / Ν Η E I 限制位點，V K 含 ECORV/S ALI。特 定的引子爲： V Η :寡核苷酸1 : 5 ^ GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3 ^ 寡核苷酸2 : 一 5'TGGGTCGAC(AT)GATGGGG(GC)TGTTGTGCTAGCTGAGGAGAC 3' v κ :寡核苷酸1 : 5 GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT)3' 寡核苷酸2 : 5 AGCGTCGAOTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3' 將P C R產物選殖入T A載體（ΤΑ cloning kit, Invitrogen )。用二去氧方法使用 T7 DNA Pol(Pharmacia ) 定序十二個非依存的菌落。V Η及V K序列與Kabat之次群 2具有高度相關。 然後，將V Η鏈用E C〇R V / Ν Η E I水解，V K 鏈用ECORV/SAL I水解，並分別地將VH及VK 選殖入ΡΑΗ4604及PAG4622。此類載體來自 Sherie Morrison (UCLA，California, USA )，並用在哺乳動 物細胞表現免疫球蛋白。P A Η 4 6 0 4載體包括人類 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公麓） · n n I ϋ ϋ il n )：eJf ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ H I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)

1233440 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（12 ) 恆定區免疫球蛋白Gl ’ PAG 4622具有人類Ck (使用聚合酵素連鎖反應產生之變異區表現抗體分子的新 II tic IS ， M. Josefina Coloma et al， Journal of Inmunological methods，1 52 ( 1 992)，89- 1 04 )。選殖入 i 〇 R C 5 區域生 成的建築體稱爲vHCS — PAH4604及VK&S — P A G 4 6 2 2。 · 將1 0微克嵌合的載體c 5VH - PAH4 6 0 4及 、_.1 _0 微克 C 5 V K - P A G 4 6 2 2 用 P V ϋ I 水解線性 化後以電穿透法送入N S 0細胞。共同混合D Ν Α後用乙 醇沈澱並溶於2 5微升水。將大約1 〇 7 N S 0細胞生長至 半滿，離心收穫並再懸浮於〇 · 5毫升D Μ E N，於電穿 透作用光析管中合倂水解之DN Α。在冰中於靜置5分鐘 之後，給予細胞1 7 0伏特及9 6 0微法拉弟之脈衝，並 進一步的置於冰中^ 0分鐘。然後將細胞置於2 0毫升含 1 0%胎牛血淸之DMEN，並容許其康復4 8小時。接 著將細胞重新分佈至9 6孔測試盤，並施用選擇的培養液 (D Μ E N、1 〇 %胎牛血淸、1 0毫莫耳濃度組織胺醇 )。1 0天後肉眼可見轉染菌落。 E L I S Α測量後顯示內含轉染菌落之測試孔中的培 養液，有嵌合抗體的存在。在微量滴定盤之測試孔中塗覆 山羊抗一人類抗體（r鏈專一的抗體，.Sara lab)。於 P B S T (磷酸鹽緩衝的生理食鹽水，其中內含〇 . 〇 2 % Tween 2 0，酸鹼度7 · 5 )淸洗之後，各微量滴定盤 中添加入來自內含轉染菌落之測試孔的培養液2 0微升 -15 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項β寫本頁) 裝 ，項 w· mis / I I I I Mi· aw MM ·

1233440 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（13 ) 在3 7 °C下反應1小時。測試孔再次用P B S T、凊洗’再： 加入鹼性磷酯酶共軛結合的山羊抗-人類a：抗體（輕鏈專 一的抗體），在室溫下反應一小時。然後測試孔再次用 P B S T淸洗並加入內含二乙醇胺受質之緩衝溶液。於 3〇分鐘之後測量4 0 5 n m之吸光。 ’ 實施例2 得到不同版本之人類化抗體 __ 將V Η及V K I 0 R C 5序列與人類資料庫序列 相比較，得到大部分與人類I 0 R C 5同質之序列。 然後測定V Η及V Κ區域中兩性分子的區域或可能的 Τ細胞抗原決定部位。 V Η中在位置1 〇以及1 7引入突變，分別將胺基酸 ASP及SER取代成GLY及Thr。此類突變係用 PCR重疊加以完邊，第一次PC R使用引子1及2、3 及4，該PCR產物與使用2及4引子的第二次PCR重 疊，引子之序列如下：（Kamman，M.，Laufs，J.，Schell，.J.， Gronemborg, B. Rapid insertional mutagenesis of DN A by polymerase chain reaction (PCR). Nucleic Acids Research 1 7:5404,1 989 )。 突變重鏈1 0及1 7之引子 引子1 : 5 1 GAGTCAGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGACACTTTCACTCACC 3 ' -16- (請先閱讀背面之注意事項 "^裝.丨丨 -項寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公笼） 1233440 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（14 ) 引子2 : 5' TGGGTCGAC(AT)GATGGGG(GC)TGTTGTGCTAGCTGAAGAGAC 3' 引子3 : 5 1 GGT GAGT GAAAGT GT CT GAGAAGGTTTCACCAGGCCAGGTCCTGACTC 3 1 引子4 : -5' GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTOTrCT 3' 定序証實突變之後，將新突變引入此突變的D N A， 新突變係引入位置4 3及4 4，分別以L Y S及G L Y取 代ASN及LYS。重疊之方法如前述的重疊方法。定序 証實突變，此新建築體稱爲C 5VHh u。 此類突變使用之引子爲： 重鏈4 3及4 4上之突變引子 引子1 : 5 CAGTTT CCAGGAAAAGGACTGGAATGGATG 31 引子2 : 5' TGGGTCGAC(AT)GATGGGG(GC)TGTTGTGCTAGCTGAAGAGAC 3' 引子3 : 51 CATCCATTCCAGTCCTTTTCCTGGAAACTG 31 -17- (請先閱讀背面之注意事項 裝--- -¾ JI: -H ϋ ϋ 一s,, 4' ·ϋ ϋ i_l ϋ n i··— i_i 1

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） 1233440 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（15 ) 引子4 : 5' GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3 V K中位置1 5 、4 5 、6 3之突變係分別用L· E U 、ARG、SER 取代 ILE、LY.S 及 Thr 。製作突 變之重疊P c R如先前所描述。使用之引子其序列展示如 _下。新基因的建築體稱爲C 5 V k h u。 輕鏈上位置1 5之突變引子 引子1 : 5 * TTGTCGGTTACCCTTGGACAACCAGCC 3 * 引子2 : ^ 5' AGCGTCGACTTACGTTT (TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3' 引子3 : 51 GGCTGGTTGTCCAAGGGTAACCGACAA 3 * 引子4 : 5 ggggatatccaccatgagg(gt)cccc(at)(ga)ctcag(ct)t(ct)ct(tg)gt 輕鏈上位置4 5之突變引子 引子1 : -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 裝---- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂----------

1233440 A7 B7 五、發明說明（16 ) 5 丨 GGCCAGTCTCCAAGGCGCCTAATCTAT 3· 引子2 : 5 ' AGCGTCGACTTACGTTT (TG) ATTTCCA (GA) CTT(GT) GTCCC 3 ' 引子3 : . 5' ATAGATTAGGCGCCTTGGAGACTGGCC 31 引子4 :

5' GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GT 輕鏈上位置6 3之突變引子 引子1 : 5f CCTGACAGATTCAGTGGCAGTGGATCA 3， 引子2 : 5 ' AGCGTCGACTTACGTTT (TG) ATTTCCA (GA) CTT (GT) GTCCC 3 ' 引子3 : 5' TGATCCACTGCCACTGAATCTGTCAGG 31 引子4 :

5' GGGGATATCCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)(GA)CTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GT -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項3寫本頁)

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233440 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（17 ) 所有突變經定序証實 將人類化VK及VH選殖入載體PAG4 6 2 2及 P A Η 4 6〇4 ，得到以下之建築體C5VkhuPAG4622及 C5VHhu-PAH4604。 將1 0微克之人類化C5VHhu — PAH4 60 4 及1〇微克之C SVKh u — PAG.4 6 2 2用電穿透法 送入N S〇細胞。此類載體係用P V U I水解線性化。 電穿透作用以及偵測表現人類化抗體I〇R C 5 h菌 落之方法如前述之嵌合抗體。 實施例3 構築單鏈F v片段： 從I〇R C 5 mAb多變的結構區（VH及VL )構築s c FV片段（VH -連結子一 VL)。將表現載 體選殖入大腸桿菌進> 行表現。 步驟（a ) 構築s c F v 其策略爲用P C R進行第一次放大，修飾VH及V L 區域序列，其中包括在表現載體s pPACIB.7pUs及 pPACIB.9plus中選殖入限制內核酸酶位點。放大時使用之 寡核苷酸係依精確的序列設計。 重鍵： . 4066: ECORV-FR1-VH 5'·GGGATATCTGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGA·.3' 4255: EC0RV-FR4-VH 5 ..CAGGATATCGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC_·3' -20- (請先閱讀背面之注意事項 丨舞裝.丨丨 -項綱寫本頁) 訂Η--------

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1233440 A7 B7 五、發明說明（18 ) 輕鏈：

2938： Sal I-FR1-VL 5 ’·CGTCGACGATATCCAGATGAC(AC)CA(GA)ACT(AC)C··3'

2935: Apa I- FR4-VL 5 ATGGGCCCTi l(TC)A(TG)(TC)TCCAGCTTGGT.- 於放大此區域之後，純化及水解V H ( E C〇R v ) 及V L ( S a 1 I - A p a I )。將純化的D N A片段 連結入事先用限制酵素水解的p P A C I B . 9 P 1 u s 及pPACIB.7plus載體。 質體p P A C I B ' 7 p 1 u s係修飾成可將大腸桿 菌表現的異性蛋白金輸出至胞外質。此質體含有調控的序 列並具有以下之功能：啓動子序列（色氨酸）、信號肽序 歹IJ (〇MP A )、連結肽序列（Chaudhary et al.，1990)以 及有助於純化此蛋白質，在成熟的蛋白質C -端之編碼6 個組胺酸的結構區（Gavilondo，J.V· et al. Proceedings of the IV Annual conference on Antibody Engineering. IBC Conferences Inc. Coronado, C A. December 8- 1 0, 1 993) o 質體p P A C I B . 9 p 1 u s (圖1 )係經修飾後 可在大腸桿菌中表現細胞質的異性蛋白質。此質體含有調 控的序列並具有下列功能：啓動子序列（色氨酸）、高效 率的表現蛋白質，源自I L — 2 h之2 7 a a片段、以及 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233440 經濟部智慧財產4員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（19 ) 有助於純化此蛋白質在成熟的蛋白質C -端之編碼6個組 胺酸的結構區（Gavilondo，V. et al. Proceedings of the IV Annual conference on Antibody Engineering. IBC Conferences Inc. Coronado，CA. December 8-10，1993) o 將P C R反應產物轉形入勝任的大腸桿菌細胞（·品系 M C 1 〇 6 1 )，並種植入固體選擇的培養基，以及在 3 7 °C之下生長。選擇重組載體係將細菌的菌落接種至培 _ 一養液，並從此培養中萃取質體DN A ( Molecular cloning, A Laboratory manual, second edition, 1 989, Sambrook, Fritsch and Maniatis)。質體DNA係依據選殖步驟用ECORV、 Sa 1 I/Apa I 、xh〇 I/Apa I 水解，於施用 至瓊脂糖凝膠之後用u v光照射並以目視檢查，選擇具有 二個條帶水解模式之重組菌落，一個條帶對應至pPACIB.7 及9 plus (大約2 /9仟鹼基），另一條帶對應至預期結構 區（VH或VL大約320鹼基對，scFv約720鹼 基對）。V Η結構區插入之方向係用D N A定序檢查。

步驟（b ) 在大腸桿菌中表現得自IOR C5 Mab基因多變 結構區的s c F V 使用二種選擇自（a )的重組質體，用四個品系之大 腸桿菌進行轉形（TGI、coliB、w31 10、MM294 )，以硏 究選殖基因的表現。基本上重組細菌係生長於含氨比西林 之培養液（L B )，在3 7 t下過夜。用此類培養接種至 內含氨比西林之新鮮培養液，在3 7 °C下反應3小時。然 — -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） · ·1« n ·ϋ n I Hi ^ t n ϋ« 1 im§ Bn* i (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) .1:

1233440 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（20 ) 後在培養液中加入β 一吲哚丙烯酸（色氨酸啓動子之誘發 子）誘發蛋白質的表現。用1 2%之SDS聚丙烯醯胺凝 膠分析樣品，結果指出在此類條件之下構築體 pPACIB.7plus表現的胞外質溶析份蛋白質大約爲2 8 kDA ，pPACIB.9plus重組選殖菌落表現的蛋白質位於3 0· kDA 之條帶，其在T G 1內的表現介於總細菌蛋白質的6 -11%之間。用兔子抗I〇R C 5 Mab之Fab片 __段的抗血淸經由西方轉漬法（Molecular Cloning，A Laboratory manual, second edition de 1 989，by Sambrook, F r i t s c h a n d m a n i a t i s)，以及免疫純化法分析後，顯示此蛋白 質相當於I0RC5之scFv。 實施例4 從細菌培養物得到s c F v，並對抗原進行構 形重整及辨視測定> ^ 步驟（a) 從pPAC IB · 9P 1 us之重組選殖菌 落萃取I〇RC 5之s c Fv並進行構形重整 使用超音波方法破壞生產蛋白質之細胞’並萃取蛋白 質，分離可溶解的以及不溶的分層，合倂S D S -聚丙烯 醯胺電泳凝膠、轉移至硝基-纖維素以及西方轉漬法，證 實蛋白質位於不溶的細菌溶析份。 在此情況之下，蛋白質係用以下之步驟局部地純化： (1 )用超音波及離心分離可溶解的及不溶的材料， (2 )用低莫耳濃度之尿素（2 Μ )淸洗以及 -23-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------f — 訂/--------- (請先閱讀背面之注意事項I寫本頁)

Jk:

1233440 A7 B7 五、發明說明（21) (3)用高莫耳濃度之尿素（6M)溶解。 從溶解的材料，以金屬離子親和層析法純化蛋白質並 用緩衝液恢復構形。 步驟（b ) 腫瘤細胞對s c F v — I〇R C 5片段之結 合測定 . 細胞株： ——- 細胞係得自 Centro de Inmunologia Molecular。將 S W 9 4 8腺癌細胞株在3 7 °C、6 % C〇2下，生長於補 充1 0 %胎牛血淸之L — 1 5培養液。使用Ra」i細胞株（ 來自Biukitt人類跛足療養所）及H u t 7 8 (人類T細胞 株）作爲負控制組。 將此類細胞株在3 7 °C下生長於補充1 0 %胎牛血淸 之 R Ρ Μ I 1 6 2 9。 f 細胞懸浮液之濃度設定爲1 0 6細胞/毫升之P B S ( 其中內含1 %牛血淸白蛋白）。將1 0微升之細胞懸浮液 添加至各測試孔。載玻片用無塵空氣乾燥3小時，並用丙 酮一甲醇（1 : 1 )溶液固定5分鐘，在T B S中水合 1 0分鐘。最後，處理細胞用免疫細胞化學法進行測定。 測定S C F V I 〇 R C 5片段之活性係使用免疫 細胞化學透過免疫過氧化酶技藝進行測定。細胞在3 7 °C 下與單鏈F v I 0 R C 5反應2小時，接著與抗Fab 血淸以及與抗-老鼠過氧化酶共軛結合的（HRPO )抗血淸 反應，各在室溫下反應3 0分鐘。用含有5毫克3 - 3二 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事 —I ϋ n Mmm— LT n 一tfj1 ·1· i— a—·· i·— m n I 本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233440 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（22) 胺基本西丁（ bencldine)、5毫升T B S以及5微升3〇％ 之Η 2 0 2溶液目視過氧化酶所在之位置。反應期間，載玻 片用冰冷的T B S淸洗。 引入水之後，載玻片中力卩入梅氐蘇木紫（ ^11^1:〇1丨11丨1^〇£]\^：^]：)及加拿大香膠加深對比。各實驗包 括正性以及負控制組。 . 免疫細胞化學硏究揭露此片段僅正性的出現在SW948 _ -細胞株，與完整的M a b比較之下顯示中度的標記，此結 果說明此抗体對該細胞株之scFV IOR C5具有專一的辨視。 該標記位於惡性大腸細胞之細胞膜以及細胞質。 圖形簡短的描述 圖1 :圖1顯示質體pPACIB · 9p 1 us的基 因構築體，其爲修飾的質體可在大腸桿菌細胞質表現融合 型蛋白。此質體含有調控的序列，具有下列功能：啓動子 序列（色氨酸）、高效率表現蛋白質源自I L 一 2 h的 2 7 a a片段、以及有助於純化此蛋白質在成熟的蛋白質 C -端之編碼6個組胺酸的結構區。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公芨） 裳------- (請先閱讀背面之注意事項I寫本頁) 訂----------

1233440 <400> 1

Ser Ala Tyr Asn Trp His 1 5 <210〉 2 <211> 16 . <212> PRT <213> Mus musculus <220〉 <221>功能部位 <222> (1)..(16) <223> <400〉 2

Thr lie Ser Thr Asn Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213〉 Mus musculus <220〉 <221>功能部位 <222> (1)..(9) <223> > <400〉 1233440

Asn Asp Glu Arg Ala Trp Phe Ala Tyr <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221〉功能部位 <222> (1)..(16) <223> <4〇0> 4

Leu Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210〉 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220〉 <221〉功能部位 <222〉 （1)..(7) <223> <400〉 5

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1233440 <210〉 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220〉 <221〉功能部位 <222〉 （1)..(9) <223> <400〉 6

Trp Gin Gly Thr His Phe Pro His Thr 1 5 <210> 7 <21i> 30 <212> PRT <213〉 Mus musculus <220> <221〉功能部位 <222> (1)..(30) <223> <400> 7

Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser He Thr 20 25 30 1233440 <210> 8 <211〉 14 <212〉 PRT <213> Mus musculus <220> <221〉功能部位 <222> (1)..(14) <223> <400〉 8

Trp He Arg Gin Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu Thr Met Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221>功能部位 <222> (1)..(32) <223> <400〉 9

Arg lie Ser He Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe Leu Gin 15 10 15

Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 1233440 <210〉 10 <211> 11 <212> PRT <213〉 Mus musculus <220> <221>功能部位 <222> (1)..(11) <223> <400> 10

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <220〉 <221>功能部位 <222> (1)..(23) <223> <400> 11

Asp Trp Trp Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15

Gin Pro Ala Ser He Ser Cys 20 1233440 <210〉 12 <211> 15 <212〉 PRT <213> Mus musculus <220〉 <221>功能部位 <222> (1)..(15) <223> <400〉 12

Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Arg Arg Leu He Tyr 15 10 15 <210〉 13 <211> 32 <212〉 PRT <213> Mus musculus <220〉 <221〉功能部位 <222〉（1). .(32) <223〉 <400> 13

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala 15 10 15

Leu Lys lie Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ί 1233440 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220〉 <221> 功能部位 <222> <223> (1)..(17) <400〉 14

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Lys Ser Thr Leu Thr 1 5 10 15

Gly <210> 15 <211〉 42 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> 引子—結合 <222> (1)..(32) <223> <220> <221> 引子—結合 <222> (1)..(42) <223> 1233440 <400〉 15 aggtctagaa ctctccacac acaggagagc cagtggatag ac 42 <210〉 16 <211〉 29 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> 引子一結合 <222〉 （1)..(15) <223> <220> <221〉引子一結合 <222〉 （1)..(29) <223> <400> 16 gcgtctagaa ctggatggtg ggaagatgg <210> 17 <211〉 38 <212〉 DNA <213〉 Mus musculus <220〉 <221> 引子-·結合 <222> <223> (1)..(38) <400〉 17 ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct 29 38

1 1233440 <400〉 18 tgggtcgaca tgatgggggc tgttgtgcta gctgaggaga c 41

<210> 18 <211〉 41 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220> <221> 引子一結合 <222〉 <223〉 (1)..(41) <210〉 19 <211> 39 - <212> DNA <213> Mus musculus <220〉 <221〉 弓j子-結合 <222〉 (1)..(35) <223> i <220> <221> 引子一結合 <222> (1)..(39) <223> <400〉 19 ggggatatcc accatgaggg tccccatgac tcagcttct 39 1233440 <210> 20 <211〉 38 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221>引子—結合 <222> (1)..(3) <223> <220> <221> 引子一結合 <222> (1)..(38) <223> <400> 20 agcgtcgact tacgttttga tttccagact tgtgtccc 38 <210〉 21 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221〉引子—結合 <222> (1)..(48) <223> <400> 21 gagtcaggac ctggcctggt gaaaccttct cagacacttt cactcacc 48 <210> 22 <211> 41 1233440 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221〉引子—結合 <222> (1)..(41) <223> <400> 22 41 tgggtcgaca tgatgggggc tgttgtgcta gctgaagaga c <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213〉 Mus musculus <400〉 23 48 ggtgagtgaa agtgtctgag aaggtttcac caggccaggt cctgactc

<210> 24 <211〉 38 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221>引子一結合 <222> (1)..(38) <223> <400> 24 ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct <210〉 25

V 38 1233440 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> 弓丨子-結合 <222〉 <223> (1)..(30) <400> 25 cagtttccag gaaaaggact ggaatggatg <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Mus musculus <220〉 <221〉 引子一結合 <222> <223> (1)..(41) <400> 26 tgggtcgaca tgatgggggc tgttgtgcta gctgaagaga c <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213〉 Mus musculus <220〉 <221〉 引子-結合 <222> <223> (1)..(30) 1233440 <400> 27 catccattcc agtccttttc ctggaaactg <210> 28 <211〉 38 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220〉 <221>引子一結合 <222> (1)..(38) <223> <400> 28 ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct <210> 29 <211> 27 <212> DNA <2I3> Mus musculus <220> <221>引子-結合 <222> (1)..(26) <223> <400> 29 ttgtcggtta cccttggaca accagcc <210> 30 <211> 38 1233440 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220> <221〉引子—結合 <222> (1)..(38) <223> <400〉 30 agcgtcgact tacgttttga tttccagact tgtgtccc 38 <210〉 31 <211〉 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220〉 <221>引子—結合 <222〉 （1)..(27) <223> <400> 31 ggctggttgt ccaagggtaa ccgacaa 27 <210> 32 <211> 45 <212〉 DNA <213〉 Mus musculus <220> <221〉引子一結合 <222〉 （1)·.(45) <223> 1233440 <400〉 32 ggggatatcc accatgaggg tccccatgac tcagcttctc ttggt 45 <210〉 33 <211〉 27 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220〉 <221〉 引子-結合 <222> <223〉 (1)..(27) <400> 33 ggccagtctc caaggcgcct aatctat 27 <210〉 34 <211〉 38 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221〉 主要轉錄體 <222> <223> (1)..(38) <400> 34 agcgtcgact tacgttttga t'ttccagact tgtgtccc 38

<210> 35 <211〉 27 <212〉 DNA 1233440 <213> Mus musculus <220> <221> 引子-結合 <222〉 <223> (1)..(27) <400〉 35 atagattagg cgccttggag actggcc 27 <210> 36 • <211〉 45 <212〉 DNA <213〉 Mus musculus <220> <221〉 引子-結合 - <222> (1)..(45) <223> <400> 36 ggggatatcc accatgaggg tccccatgac tcagcttctc ttggt 45

<210> 37 <211> 27 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220〉 <221> 引子一結合 <222> <223> (1)..(27) 1233440 <400〉 37 cctgacagat tcagtggcag tggatca <210〉 38 <211> 38 <212> DNA <213〉 Mus musculus <220〉 <221> 弓丨子-結合 <222> <223> (1)..(38) <2i0> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221〉 引子-結合， <222> <223〉 (1)..(27) <400> 38 agcgtcgact tacgttttga tttccagact tgtgtccc <400〉 39 tgatccactg ccactgaatc tgtcagg <210> 40 <211〉 45 <212〉 DNA <213> Mus musculus 1233440 <220〉 <221〉引子—結合 <222〉（1). .(45) <223> <400〉 40 ggggatatcc accatgaggg tccccatgac tcagcttctc ttggt 45 <210〉 41 <211〉 33 <212〉 DNA <213〉 Mus musculus <220> <221〉 引子-結合 <222> <223> (1)..(33) <400> 41 gggatatctg aggtgcagct tcaggagtca gga 33 <210〉 42 <211> 32 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221〉 引子-結合 <222> <223> (1)..(32) <400〉 42

1233440 caggatatcg cagagacagt gaccagagtc cc <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> 引子—結合 <222> <223> (1)..(33) <400〉 43 cgtcgacgat atccagatga caccagaact acc <210> 44 <211> 29 <212〉 DNA <213〉 Mus musculus <220〉 <221> 引子-結合 <222> <223> (1)..(29) <400〉 44 atgggccctt ttcatgtctc cagcttggt

Claims (1)

1233440 3. 12,( 年月 #j£ i A8 B8 I C8 I D8 Γ、申請專利範圍 附件2A 第8 9 1 2 6 6 2 2號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 民國93年12月9 日修正 1 · 一種重組抗體IOR C5.，其中該重組抗體具有人類輕鏈 及重鏈之固定區，且該重組抗體包含下述輕鏈和重鏈之可變 區的架構和CDRs之序列： 重鏈 FR1: D VQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVTGYSIT FR2：WIRQFPGKGLEWMG FR3: RISI丁 RDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAR FR4： WGQGTLVTVSA CDR1：SDYNWH CDR2·· YISYNGTTSYNPSLKS CDR3：NDEKAWFAY 輕鏈 FR1:DV VMTQTPLTLSVTLGQPAS1SC FR2：WLLQRPGQSPRRLIY FR3: G VPDRFSGSGSGTDFALK1RRVEAEDLGVYYC FR4: FGGG丁 KLEIKRKSTLTG CDRlrKSSQSLLDSDGKTYLN CDR2：LVSKLDS 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CDR3： WQGTHFPHT〇 2 ·如申請專利範圍第i項之重組抗體，其係爲人類化抗 體，其中該人類化抗體於重鏈和輕鏈之架構區包含任一下述 之點突變以降低其免疫原性： 重鏈 位置10之ASP經取代爲GLY ; 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） 1233440 8 8 8 8 ABCD 「、申請專利範圍 位置17之SER經取代爲THR ; 位置43之ASN經取代爲LYS ; 位置44之LYS經取代爲GLY ; 輕鏈 位置15之ILE經取代爲LEU ; 位置45之LYS經取代爲ARG ; 位置63之THR經取代爲SER。 3. —種單鏈Fv片段，其中該片段包含下述輕鏈和重鏈 之可變區的架構和CDRs之序列： 重鏈 FR1: D V Q L Q E S G P G L V K P S Q 丁 L S L T C 丁 V 丁 G Y S I 丁 FR2： WIRQFPGKGLEWMG FR3: RISI丁 RDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAR FR4： WGQGTLVTVSA CDR1：SDYNWH CDR2: YISYNGTTSYNPSLKS CDR3:NDEKAWFAY 輕鏈 FR1: DV VMTQTPLTLS VTLGQPASISC FR2：WLLQRPGQSPRRLIY FR3: G VPD RFSGS GSGTDFALKIRRVEAEDLG VYYC FR4: FGGG丁KLEIKRKSTLTG CDR1： KSSQSLLDSDGKTYLN CDR2：LVSKLDS CDR3: WQGTHFPHTo 4 ·如申請專利範圍第3項之單鏈Fv片段，其係於重鏈 和輕鏈Z架構區含有任一下述之點突變以降低其免疫原 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29<7公釐） (請先閱·#背面之注意事^再填寫本頁) 、1T t- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1233440 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 性： 重鏈 位置10之ASP經取代爲GLY ; 位置17之SER經取代爲THR ; 位置43之ASN經取代爲LYS ; 位置44之LYS經取代爲GLY : 輕鏈 位置15之ILE經取代爲LEU ; 位置45之LYS經取代爲ARG ; 位置63之THR經取代爲SER。 5 . —種用於治療直腸和結腸惡性腫瘤、彼之轉移和 復發之醫藥組成物，其包含申請專利範圍第1或2項之重 組抗體及適當之賦形劑。 6 . —種用於治療直腸和結腸惡性腫瘤、彼之轉移和 復發之醫藥組成物，其包含申請專利範圍第3或4項之單 鏈Fv片段及適當之賦形劑。 7 · —種用於定位及確認直腸及結腸惡性腫瘤之診斷組 成物，其包含申請專利範圍第1或2項之重組抗體。 8 . —種用於定位及確認直腸及結腸惡性腫瘤之診@ _ 成物，其包含申請專利範圍第3或4項之單鏈Fv片段。 9 ·如申請專利範圍第7或8項之診斷組成物，其進〜歩& 含用於放射標記該等抗體或片段之化合物，彼係經混合以^ 生水溶性可投遞之溶液。 10 .如申請專利範圍第9項之診斷組成物，其包含塔、99、 f1-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297«^ί! ;3: 1233440 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍銶-1 8 6、銶-1 8 8或彼之類似物以作爲放射性標記物 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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