TWI230611B

TWI230611B - Anti-infection composition and food containing such anti-infection composition

Info

Publication number: TWI230611B
Application number: TW091110088A
Authority: TW
Inventors: Wakoto Bukawa; Tatsuhiko Kan
Original assignee: Combi Co
Priority date: 2001-05-21
Filing date: 2002-05-15
Publication date: 2005-04-11
Also published as: SG93936A1; CN1386510A; KR20020089149A; CN1269490C

Description

1230611 五、發明說明（1) 【發明之技術領域】本發明係有關含有松簟屬·布萊傑·目利之k , 、爻抽出物及乳酸菌之加熱處理菌體作為有效成分之感染抑制組成物含有該組成物之飲食品。【發明之技術背景】已知擔子菌綱ha ladake科之菇之松蕈屬·希常- • 唧來傑•目利（Agaricus blazei Murill、日本名川理哈、幸」）為具有可預防·改善癌症、過敏、糖尿病、高血壓等效果成分，例如有關抗腫瘍活性成分，各自從該子實體^ 酸性多糖體（日本特開昭64- 6 71 94號公報）、中性多ϋ (曰本特開昭64-67195號公報）及蛋白多糖體（日士 # ^ β本特開平 2-78630號公報），從菌絲體分劃出蛋白多糖體f α丄 τ V日本特開昭6 1 - 4 7 5 1 8號公報）、尤其是從菌絲體之培養溏民/恩液分割出蛋白多糖體（日本特開昭平61-47519號公報）。一松蕈屬·布萊傑·目利被廣泛利用於健康。例如於特開2 0 0 1 -1 03927號公報揭示配合有將松葦 τ 在加壓下用水性溶劑抽出，將該抽出物用5 〇 % 磨兹 ^ ¢,1 獲得之松蕈屬蘑菇抽取物之食用組成物。 ▲ 於日本特開20 0 1 _17130號公報揭示有以於松煎液中混合有醋及蜂蜜為特徵之含有松蕈屬品。 1更康飲料食於日本特開平1 1 -32 723號公報揭示有將松堇之鹵4體、子實體及該混合物或該等之培養殘液維素酶為主體之酵素劑進行分解處理，此時、 J α侵件之含有

1230611 五、發明說明（2) 多量β -葡聚糖之生理活性物質作為主材料之健康食品。又，自古以來乳酸菌亦作為健康食品廣泛被攝取，已知除了具有改善腸内菌叢之平衡、減低腸内腐敗產物、改善糞便性狀之效果之外還具有免疫賦活效果。例如於特開〇1 48796號公報揭示有以乳酸球菌ADl〇l(Enterococcus faecalis AD101)菌株之死菌體作為主成分之免疫調整劑0 =曰本特開平丨0_29946號公報揭示有以乳酸菌或該處降低ϊ i有效成分之具有回復因藥劑所引起液性免疫機能 -之作用之液性免疫回復劑。於曰本特開平6_805 75號公報揭广或菌體含有物作為有效成分為特=== 體之公報揭示有以含有乳酸菌菌活組成物“及/或細胞質劃分含有物為特徵之免疫賦【發明解決課題】利用品松丄π:自”或乳…然廣泛生理效果者。早獨攝取時能充分滿足所以^ 交制病# i t明之目的為提供經口攝$ , ¥ ϋ μ t # ㈣感染效果之感染抑制 ^優越之抑飲令。物及含有該組成物之【解决課題之方法】

1230611 五、發明說明（4) 之抽出物及乳酸菌之加熱處理菌體作為有效成分 f ’攝取該等、组成物可期待優越之預防病5菌=安 ’、。又，於飲食品中添加本發明之减毕抑杳丨。感染可提供預防病原菌等感染之飲食品。之感木抑制組成物，本發明感染抑制組成物之抑制感今尚不明瞭。認為是經由將松蕈屬·布' 用機序至體及/或菌絲體培養物之抽出:目利之子實併用攝取，可使以E % έ田胎=及礼酸菌之加熱處理菌體胞性免产機谨Li ΝΚ細胞及7細胞為中心之Γ 【發明之實施形態】，、有效率地進行。本發明感染抑制組成物有八 :·目利之子實體抽出物可；蕈屬.布萊實體原物或是由將該經乾燥 2，·目利之子出獲得。具體而言，可由蔣p乾鹿物用水、乙醇等溶劑抽鐘，將所獲得之抽出液 7於120C抽出30分又，松輩屬.ίίϊ Hi濃縮、乾燥獲得。由將松蕈屬·布萊傑·目' 利，絲體培養物之抽出物可養基培養，將獲得之之種菌用含有碳源及氮源之培之操作、抽出獲得。、5經乾燥之菌體經由與上述相同本發明中，松蕈屬布μ 絲體培養物之抽出物亦可使隹目利之子實體及/或菌本發明感染抑制組成物二=品。處理菌體為將乳酸菌體經由之乳酸菌之加熱 m處理所獲得之死菌體，可

313641.ptd 1230611 五、發明說明（5) 由下述之方法獲得。乳酸菌可由在樂果撒培養基，於30至45 °C培養12至72 小時後，經由離心分離等適當之方法將菌體回收。將所回收之菌體水洗、濃縮，將該濃縮菌體懸濁液於8 〇至1 1 5 °C 加熱處理30分鐘至3秒鐘後經由喷霧乾燥、凍結乾燥等適當方法乾燥獲得。上述之乳酸菌可列舉乳酸球菌 (Enterococcus faecalis)、乳酸腸球菌（Enterococcus faecium)、嗜乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus)、乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei)、乳酸乳桿菌 (Lactobacillus lactis)、瑞士乳桿菌（Lactobacillus herveticus)、長雙岐桿菌（Bifidobacterium Longum)、短雙岐桿菌（Bifidobacterium breve)、嗜熱性鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)等°本發明中又以使用具有更強力免疫賦活活性之乳酸腸球菌（E n t e r 〇 c 〇 c c u s faecalis)(ATCC 1 9433、ATCC 1 450 8、ATCC23655)特別理想。乳酸球菌之加熱處理菌體亦可使用市售之例如「EF巴瓦」、「EF- 2 00 1」（二者均為商品名，控必（股）公司製造）、「FK-23」（商品名，曰曰製藥公司製造）。本發明之感染抑制組成物以含有上述松蕈屬·布萊傑·目利之子實體及/或菌絲體培養物之抽出物〇. 5至9 9. 5 質量％、上述乳酸菌之加熱處理菌體99.5至0·5質量％較理想。又以含有松葦屬·布萊傑·目利之子實體及/或菌絲體培養物之抽出物含有10至90質量％、上述乳酸菌之加熱處理菌體90至10質量％更理想。各有效成分若在上述範

313641.ptd 第9頁 1230611 五、發明說明（7) 中，調製試驗液（250¾克/毫升）。料，實驗MR庫存品」、曰本農業工業（股）公司製投予後母曰觀察一次（觀察期為1 4曰），任何一群都死亡例。觀察期結束時將所有之老鼠解剖檢查時主要未發現異常。又，於投予後第7日、第1 4日測定體經由t-檢定，以有意義水準5%進行群間之比較。妹表1所示。 Q 1】將4週歲之ICR系老鼠（雄雌各2〇隻，購自日本艾斯— 滋（股）公司）進行預備飼育約1週後分成試驗群（雄二各^ 隻）及對照群（雄雌各10隻），於試驗群，將上述試驗液以乳酸球菌之加熱處理菌體換算為5，0 0 0毫克/公斤體重用田管強制單次經口投予。於對照群，將精製水（雄·· 〇 · 7毫月升、雌· 0 · 6毫升）以同樣之'方法投予，於將室溫設定為土 2 °C、照明時間設定為1 2小時/日之飼育室飼育。又，、試驗期間自由攝取水及飼料（商品名「老鼠、小老鼠用㈤；形J 造） MTV if

看臟重果L

------ ---(公克）〜投予前投土後7日投予後14日 — 雄雌雄雌雄雌〜對照群 30.7+ 1.2 26.7土 1.5 34.9± 1.4 29.2± 1.9 37.3± 1.9 31.0± l.f 群 3〇.7± 1.3 27.0± 1.4 35.5+ 2.0 -—---- 29,2± 1·7 38.3土 2.7 31.3+ 1.9^ 1230611 五、發明說明（8) 從表1 ’各群間雄、結果認為於乳酸球菌加重之增加並…差異。由以上之之LD5G在5, 〇〇〇毫八:處理菌體之老鼠，單次經口投予笔克’公斤體重以上。將7週歲之Β Α丨R ι 公司)分成4群(每群各?〇隻雌二(:二曰本克雷亞(股) 制經口於試驗群投予γ )，用月s母群母日1次各自強物（乾燥子實體0_3毫^/售屬布萊傑.目利之子實體抽出微克/隻）之混合物、於史隻私）與乳酸球菌加熱處理菌體（10 體（20微克/隻）、於比較群較9群丨投予/L酸球菌加熱處理菌、較群2投予松蕈屬·布萊傑.目利之子實體抽出物（乾燥子實體〇. 6毫克/隻）、⑨對照群投予磷酉夂緩衝鹽水（phosphsate buffer saline' PBS)(0 2 毫升/ 隻）投予1週。 | 然後，於老鼠腹腔内注射李斯特菌（Listeria monocytogenes )使成2x 10 5CFU/隻後，觀察各群老鼠之生存率。又’於試驗期間自由攝取水及飼料（商品名「粉末飼料CE-2」、日本克雷亞公司製造）。該結果如第1圖所示，於第1圖，試驗群、比較群1、》與對照群相比，顯示非常高之生存率。尤其是於試驗群之老鼠，連1隻都沒有死亡，明瞭李斯特菌之感染·增殖被抑制。置例2_ 與實施例1相同操作，從試驗開始1週前起，每日j次於各群之老鼠強制經口投予試驗試樣，使感染李斯特菌。

1230611 五、發明說明（9) 然後採取老鼠之脾臟’測定脾臟所感染李斯特菌數之變化。具體而言’感染後於苐1、3、5、7曰採取脾臟，將該脾臟磨碎’懸濁於填酸緩衝鹽水中’將該懸濁液階段式稀釋，移至「李斯特增邊培養基」（商品名、默克公司製造）、培養（2 5°C、48小時），测定所出現之菌群體數，該結果如第2圖所示。由第2圖明瞭從感染後第3日起，於對照群，李斯特菌數增加，相對地，於試驗群、比較群1、2則減少。尤其是於試驗群，該減少之比例較大。

由該等結果明暸，將松蕈屬·布萊傑·目利之子實體抽出物與乳酸球菌加熱處理菌體併用，經口攝取比各自單獨攝取時顯示優越之感染抑制效果。經由體抽出物抑制效果下述之方法研究將松簟屬·布萊傑·目利之子實與乳酸球菌加熱處理菌體併用，經口攝取，感染之作用機序。 ^ 1 ) C D 3陽性α点型T細胞之表面抗原解析了、於檢疫·驗收完成後將已飼育1週之BALB/C老鼠（雌、 I週歲、購自曰本查爾滋利巴（股）公司）分成2群（每群3 用胃管每群每日1次連續經口投予，於試驗群投予松蕈凰 * /隹15 ·布萊傑·目利之子實體抽出物（乾燥子實體0·2毫克）與乳酸球菌加熱處理菌體（2 〇微克/隻）之混合物（〇 _ 2 =升/隻）、於對照群投予磷酸緩衝鹽水（0 · 2毫升/隻）1週從老鼠尾靜脈注射李斯特菌（Listeria

1230611 五、發明說明（10) monocytogenes )使成14χ i〇4CFlj/隻。又，於飼養期間自由攝取水及飼料（商品名「粉末飼料CE-2」、日本克雷亞公司製造）。於接種李斯特菌後第5日將各群之老鼠屠殺，採取腸管膜淋巴結。將該腸管膜淋巴結用毛玻璃夾住，懸濁於含有10%FBS之RPMI-1640培養液（商品名、姻厝晉 (Introgen)公司製造）、洗淨，用不銹鋼篩子除去多餘之組織片，分別調製試驗群及對照群之腸管膜淋巴結細胞 (以下稱為MLN)。將各MLN懸濁於含有i〇%FBS之RPMI-1640培養液中，使成5x 10 5個/毫升，於6個洞之培養盤（可寧克斯塔 (Corning Co star )公司製造）之每個洞注入1毫升。又，於每個洞加入經絲裂霉素C(mi tomycin C)處理過、未處理過之來自8人18/(：老鼠之脾細胞（5父105個）及李斯特菌加熱死菌體（1· Ox 106CFU)混合作為刺激劑（Stimulator)，於 37 °C、5%二氧化碳存在下培養48小時。上述未處理之老鼠為未投予被驗物質及未進行菌接種之老鼠。將各MLN用下述3種類之標識抗體（所有抗體均購自貝克頓迪克森法敏公司（Becton Dickinson PharMingen)) 染色，進行細胞表面抗原之解析。 0〇丫-〇:1^〇111(〇7)標識抗003£111八1)/^1丁(：標識抗1^1^；3 mAb/PE標識抗CD4mAb /生物素（biotin)標識抗CD8mAb ②Cy標識抗CD3 ε mAb/FITC標識抗TCR a /5 mAb/PE標識抗〔0 6 911^1)/生物素標識抗[0811^乜

313641.ptd 第14頁 1230611 五、發明說明（11) ③Cy標識抗CD3 ε mAb/F ITC標識抗TCR α Θ niAb/PE標識抗CD 12 2mAb/生物素標識抗CD8mAb 亦即，於調製成1_ Ox l〇5個之MLN浮游液申添加上述 ①所示之標識抗體5微升，於4°C保溫45分鐘後用含有5% FBS之漢克（Hank’s)緩衝液洗淨2次，加入莎紅613(SA-RED 613)(商品名、姻厝晉公司製造）5微升，於4它保溫45分鐘後用含有5% FBS之漢克（Hank，s)緩衝液洗淨3次。經由流動細胞計算器（型式「Epics XL」、貝克曼卡特公司 (Beckman Coulter Inc·)製造）解析MLN之表面抗原，求 CD4—CD8+對於CD4+CD8-之比率，比較CD8陽性率。該結果如表2所示。【表2】對於CD3 + α /3 TCR+細胞總數之％ MLN(mean土 SD) 比率（Β/Α) CD4 + CD8-(A) CD4-CD8 + (B) 對照群 29.1+ 1.3 26.4土 1·2 0·9± 0.3 試驗群 20·4± 1·2 43·7± 1·2 2·1± 0·3 由表2明瞭，試驗群之CD8陽性率與對照群相比較為約 2倍高’經由攝取松蕈屬·布萊傑·目利之子實體抽出物及乳酸球菌加熱處理菌體，CD8陽性率變高。又’以CD69(初期活性標識器）及CD 122(1 L-2接受體/3 鏈）作為指標，檢討CD8陽性τ細胞有無活性化。亦即使用上述②、③所示之標識抗體，依照與上述相同之方法解析細胞之表面抗原。該結果如表3所示。

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第15頁 1230611 五、發明說明（12) 【表3】對於0〇3+«々1^11+〇〇8 +細胞總數之％ MLN(mean土 SD) CD69 + CD122 + 對照群 38.6 土 1.2 35.5土 1.8 試驗群 42.2± 1.2 43.8士 1.4 由表3明瞭，試驗群之CD69及CD122之陽性率比對照群高，經由攝取松蕈屬·布萊傑·目利之子實體抽出物及乳酸球菌加熱處理菌體，促進CD8陽性T細胞活性化。 (2)細胞漿（cytokin)產生量與上述同樣操作，調製對照群及試驗群之MLN，加入刺激劑，於37°C、在5%二氧化碳存在下培養48小時。培養完成後回收培養液上層澄清液，用ELISA法測定培養液上層澄清液中之細胞漿量（IL-2、IL-10、IL-12、 IFN-7 )。又，使用購自姻得晉（Endogen)公司之測定工具測定IL-2、IL-12、IFN-τ ，使用購自安氏阿札科技公司 (AN’ ALYZA TECHNE Co_，）之測定工具測定IL-1 0。該結果如第3圖所示。由第3圖明瞭，於試驗群，τ helper l(Th-l)型細胞漿之IFN_r及IL-12之產生量非常高，T helper 2(Th-2) 型細胞漿之IL-10之產生量非常低。又，經由RT-PCR法研究細胞漿特異性mRNA之發現量時明瞭，於試驗群，Th-Ι型細胞漿之IL-12、IFN-γ及TNF-α之mRNA顯現量增強。另一方面，Th-2型細胞漿之IL-10

313641.ptd 第16頁 1230611 五、發明說明（13) 之mRNA顯現量無差異。已知，於感染李斯特菌等細胞内寄生細菌之生體内，巨噬細胞或NK細胞被活化，各自產生IL-12及IFN-T該等細胞漿更能使細菌抗原特異性CD8陽性T細胞活化，該結果可經由具有細胞障礙活性（CTL)之CD8陽性T細胞將菌排除。又，經由T細胞產生之TNF-α具有將嗜中性白血球或巨噬細胞等食細胞集合在感染之局部地方之作用。亦即，由上述之各結果認為，將松蕈屬.布萊傑.目利之子實體抽出物及乳酸球菌併用、投予，更促進巨嘆細胞或NK細胞之活化，IL-12及IFN-r等之產生量增大之結果亦促進李斯特菌特異性CD8陽性細胞活化，菌之排除比對照群更快。【發明之效果】如以上之說明’根據本發明，可提供以含有松蕈屬· 布萊傑·目利之子實體及/或菌絲體培養物之抽出物及乳酸菌之加熱處理菌體作為有效成分之具有優越感染抑制效果之組成物。又，經由將本發明之感染抑制組成物添加於飲食品，可提供可預防病原菌等感染之飲食品。、本發明之感染抑制組成物係來自食品，安全性高，經由攝取該組成物，可促進以細胞性免疫為中心之生體防〶機構活性化，可期待預防病原菌等之感染之效果。 w

1230611 圖式簡單說明【圖表之簡單說明】【第1圖】為表示感染李斯特菌後老鼠生存率之圖表。【第2圖】為表示於感染李斯特菌之老鼠脾臟中李斯特菌數測定結果之圖表。【第3圖】為用ELISA法測定腸管膜淋巴結細胞（MLN) 培養液上層澄清液中細胞漿量（IL-2、IL-10、IL-12、 IFN-7 )之結果之圖表。

313641.ptd 第18頁

Claims

0 :^无 §a iL — 5 _號 91110088_M 年/ / 月 Γ a__ 六、申請ϊ利範s 1. 一種感染抑制組成物，其特徵為：含有松蕈屬·布萊傑·目利（Agaricus blazei Murill)之子實體及/或菌絲體培養物之抽出物及乳酸菌之加熱處理菌體作為有效成分。 2·如申請專利範圍第1項之感染抑制組成物，其中，該上述乳酸菌係為乳酸球菌（E n t e r 〇 c 〇 c c u s f a e c a 1 i s )者。 3. 如申請專利範圍第1項或第2項之感染抑制組成物，其中，該組成物係含有上述松蕈屬·布萊傑·目利 (Agaricus blazei Murill )之子實體及/或菌絲體培養物之抽出物0 . 5至9 9. 5質量％、上述乳酸菌之加熱處理菌體99. 5至0. 5質量％者。 4. 一種食品組成物，其特徵為：含有如申請專利範圍第1 項至第3項任何一項之感染抑制組成物。 5. 如申請專利範圍第4項之食品組成物，其中，該食品組成物之每回攝取量係含有上述感染抑制組成物0. 0 1至 1 0公克者。

313641 修正本.ptc 第19頁