TWI221773B - Stabilized protein compositions - Google Patents

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1221773 Α7 一 Β7 五、發明說明（1 ) 發明領域 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明是關於經穩定化之蛋白質組成物。本發明之經 穩定化的組成物有用於遞送治療有效量的蛋白質，包括細 胞株刺激因子，譬如牛的顆粒球細胞株刺激因子（b G -C S F )給包括人類、牛、豬、馬、山羊、綿羊、狗和貓 等哺乳動物且能持續一段時間。更特別的是本發明的穩定 化組成物包括Η E P E S，T E S和TRICINE之類的穩定 化緩衝液能使蛋白質於活體內及活體外維持活性一段時間 發明背景 有效治療用的蛋白質配方，譬如G — CSF，目前仍 困難於將其在活體內及活體外的活性保留且延長儲存壽命 。此類蛋白質配方必需維持它們的活性及生物完整性一段 適當期間以有效治療。此外，此類蛋白質配方必需可大量 製造，以及可以藥學上可接受之方式給與動物。 藥學組成物的蛋白質已以冷凍或凍乾的形式提供使用 且維持蛋白質活性於活體外的貯存條件下一段較長之時間 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 〇 凍乾製備於使用前需以藥學上可接受的稀釋劑，譬如 注射用的無菌水再組合。藥學組成物的蛋白質已以液體形 式提供使用。此類液體蛋白質配方過時會失去蛋白質活性 ，尤其在提高溫度時，因此較難於貯存時保留活性。 有效治療的蛋白質配方，不論是固體（凍乾）或液體 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221773 A7 ___ B7 五、發明說明（2) 形式’很難於給與動物之後不會快速失去活性，譬如經由 皮下注射給動物時。在注射位置會快速失去蛋白質活性導 致此蛋白質不便於治療哺乳動物的感染，因爲有效治療需 於所含蓋的治療期間能有每日的劑量。譬如牛顆粒球細胞 株刺激因子（b G - C S F )之類的顆粒球細胞株刺激因 子（G — C S F s )在40°C或以上溫度時不穩定，這是 由於失去二級結構及雙硫鍵互換，而隨後失去活性。由於 牛體溫約4 0 °C左右，因此在注射處會失去活性，且注射 處是在生理P Η値範圍內。 用於延長儲存壽命的各種蛋白質配方已知悉。美國專 利號5 ，104，651 ，1992年4月14曰發布（ Boone et al.)關於一 G — C S F的藥學組成物及一在ρ Η 3 · 0 — 3 · 7範圍內傳導力少於1000/zmhos/ cm的酸。美國專利號4，992 ，271 ，1991年 2月1 2日（Fernandes et al.)發布一藥學組成物，包含一 具生物活性的介白素2蛋白質，此類組成物是在ρ Η 6 · 8到7 · 8間溶解於水溶性的攜帶物介質內，以及進 一步包含使用於蛋白質的穩定劑，譬如人類血淸白蛋白。 美國專利號4，623 ，717 ，1986年11月18 日（Fernandes et al )發布關於巴斯德殺菌法處理過的活性 治療蛋白質組成物，巴斯德滅菌處理前先將熱敏感性之治 療活性蛋白質與糖或還原糖及一胺基酸之穩定化量的物質 混合。美國專利4，645，830，1987年2月 2 4日（Yasushi et al.)發布關於穩定的介白素2組成物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 1221773 A7 B7 五、發明說明（3) --------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ’包括介白素2、人類血淸白蛋白及一還原性化合物溶於 P Η 3到6的溶液中。美國專利號4，6 4 7 ，4 5 4於 1987年3月3曰（Cymbalista )發布關於以聚乙烯吡 咯酮穩定化人類成纖維細胞干擾素的方法。美國專利號 4 ’ 675 ’ 184 於 1987 年 6 月 23 日（Hasegawa et al.)發布關於治療病毒性感染用的藥學組成分，包括干 擾素、一個三或更高的多元糖醇、一有機緩衝液和一藥物 攜帶者或稀釋劑，其中此組成物的p Η約3到6。全部前 述之參考資料皆完整倂入本文參考資料中。 有效治療種類的蛋白質之一範例爲顆粒球細胞株刺激 因子（G - C S F s )。顆粒球細胞株刺激因子（G — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 C S F )是已知的數種糖蛋白生長因子之一，是爲細胞株 刺激因子。此類細胞株刺激因子可支持造血前驅細胞的增 殖，以及刺激專一性骨髓前驅細胞的增殖和分化成爲顆粒 細胞。此外，G - C S F能夠刺激嗜中性顆粒球細胞株的 形成，以及引發老鼠骨髓單核血球細胞在活體內的最終分 化。G - C S F也顯示可刺激嗜中性球的功能活性而導致 增加其殺微生物活性。已知G - C S F的1 7 4個胺基酸 序歹[]。 重組形式的C S F s和G - C S F s已被製備。已知 人類G - C S F之D Ν Α編碼的選殖及表現（Nagata，S. et al.，Nature, 319，415- 418(1986) °W〇 —A — 8604606 和W〇一A — 8604506 描述 編碼人類G — C S F的基因。美國專利號 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 _____ B7 五、發明說明（4) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 5 ’ 606 ’ 024 於 1997 年 2 月 25 日（Boone et al·)和美國專利號5，472，857於1 995年1 1 月5日發布描述編碼犬顆粒球細胞株刺激因子（c g -C S F )的基因，以及給與有效量之人類及犬類G_ C S F於犬類或貓類用以治療或預防感染的方法。美國專 利號 4 ’ 810，643 於 1989 年 3 月 7 曰（Souza ) 發布描述人類G - C S F類似多胜肽。歐洲專利申請號 719 860於1996年7月3日發表描述天然發生 的牛顆粒球細胞株刺激因子（b G - C S F )的胺基酸序 列，及編碼b G - C S F的D N A序列和給與有效量的G 一 C S F於動物用以治療或預防乳腺炎的方法。W〇一 A 一8702060描述人類G-CSF類似多胜肽，並敘 述它們的序列及製造方法。美國專利號 4 ，8 3 3 ，1 2 7 於 1 9 8 9 年 5 月 2 3 日（〇no et al. )發布描述一新穎具生物活性的人類顆粒球細胞株刺激因 子。歐洲專利申請號6 1 2 8 4 6於1 9 9 4年8月 3 1日發表敘述一些G - C S F類似物及包含此類似物的 組成物。全部前述的參考資料皆完整倂入本文參考資料中 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 0 顆粒球細胞株刺激因子有用於作爲抗-感染劑，其作 用是增加動物的免疫勝任力而非針對一特別微生物之生長 所必需或毒素。在獸醫學上可標的到非專一性免疫反應導 致增加抵抗微生物感染的其它可獲之藥劑商品很少。可得 到的控制方法受限於傳統的抗微生物劑及受限於有限的生 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221773 A7 ___ B7 五、發明說明（5) 物體。在牛奶回收期間所關聯的經濟損失限制了傳統抗微 生物劑的運用。目前的疫苗可針對有限的一些種類，且這 些試劑的效用領域廣泛的不同。最成功的疫苗（大腸桿菌 J 5 )，由於其相關內毒素的污染之安全性而限制它們於 全球廣泛使用。 乳腺炎是影響全球乳製品的主要問題疾病。美國每年 關於乳腺炎而損失的經濟力超過美金十億。這些損失相關 於死亡率、牛奶的丟棄、急性和慢性減少牛奶的製造、增 加早期揀選及藥物和畜牧勞工的消耗。臨產的乳牛表現受 損的免疫反應（嗜中性球功能）而增加他們的乳腺敏感於 細菌感染。此類增加易感受性之衝擊的例證可經由約4 0 %的首次臨床乳房內感染是發生在生產後的前兩星期內而 證明之。關於乳腺炎的細菌致病原範圍很廣，包括革蘭氏 陽性及陰性微生物。一些已知可導致乳腺炎的致病性微生 物包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳症鏈球菌、乳頭 鏈球菌 （streptococcus uberis )、 缺乳鏈球菌 （ streptococcus dysgalactiae )、產氣桿菌、克雷白氏肺炎桿 菌（klebsiella pneumoniae )及綠膿桿菌。這些致病原是透 過乳頭導管進入乳房，並使乳汁製造的組織發炎而導致形 成結疤組織造成永久性的喪失產乳能力。各種形式的乳腺 炎包括：乳房感染、慢性乳腺炎、臨床乳腺炎及次臨床乳 腺炎。 目前的抗微生物劑治療及疫苗有很多缺點而限制使用 於泌乳期的牛隻。而抗生素治療控制乳腺炎的方法尙未發 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂---------^wi 1221773 A7 _— B7 五、發明說明（6 ) 現。因此需要一生物治療劑有用於恢復正常免疫勝任力及 降低乳腺炎發生率和嚴重性。 牛呼吸道疾病也稱爲載運熱（shipping fever )是另一 常見影響牛隻的疾病。牛呼吸道疾病影響牛隻是在運送到 飼養場或牧場之後，此結果是來自各種影響牛隻的壓力， 包括斷奶、閹割、去角、禁食、過度擁擠、曝露到感染性 試劑、飮食改變和溫度改變，再加上感染到數種已知之致 病原的任一種即可。溶血性巴斯德氏菌是導致牛呼吸系統 傷害最常見的致病原。 很多額外的感染性疾病，包括各種生殖疾病是已知可 影響人類、豬、牛、狗、貓、馬、山羊和綿羊。發生在牛 隻的此類例子是子宮炎。 因此需要一穩定的蛋白質組成物，可以在活體內乃保 留有效治療性一段持續時間。此外，也需要能提供活體外 較長儲存壽命及保存的蛋白質配方。 發明槪述 本發明是關於一經穩定化的蛋白質組成物，包含一蛋 白質及一穩定化緩衝液，且此組成物能維持此蛋白質的治 療作用持續一段時間。 本發明的特殊實施例包括一經穩定化的蛋白質組成物 ，而此組成物存在於生理P h値中。 本發明的其它特殊實施例包括一經穩定化的蛋白質組 成物，而此組成物存在於生理溫度中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _ 9 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼-裝-----I--訂---------^wi - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221773 Α7 _ Β7 五、發明說明（7) 本發明的其它特殊實施例包括一經穩定化的蛋白質組 成物，其中的穩定化緩衝液是選自HEPES、 TES及 TRICINE。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的其它更加特殊實施例包括一經穩定化的蛋白 質組成物，其中的持續期間至少約3天。 本發明的其它更加特殊實施例包括一經穩定化的蛋白 質組成物，其中的蛋白質是選自細胞株刺激因子、生長激 素、介白素、干擾素、細胞激素、抗體和抗原。 本發明的更特殊實施例包括一經穩定化的蛋白質組成 物’其中的蛋白質選自人類G 一 CSF、牛G — CSF和 犬 G — C S F。 本發明的更特殊實施例包括一經穩定化的蛋白質組成 物’其中的蛋白質是G - C S F，且其存在濃度範圍爲 0 · 0 1到5毫克/毫升。 本發明的其它特殊實施例包括一經穩定化的蛋白質組 成物’其中的蛋白質是G 一 c S F，且其中的穩定化緩衝 液是選自 HEPES、TES 和 TRICINE。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明的其它更特殊實施例包括一經穩定化的蛋白質 組成物’其中的蛋白質是G _ C S F，且其中的穩定化緩 衝液的存在濃度範圍爲〇 · 〇 5莫耳濃度到2莫耳濃度。 本發明的其它更加特殊實施例包括一經穩定化的蛋白 質組成物’其中的蛋白質是G 一 c s F ,且其中的組成分 是存在於生理p Η中。 本發明的其它更加特殊實施例包括一經穩定化的蛋白 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） 1221773 A7 B7____ 五、發明說明（8 ) 質組成物，其中的蛋白質是G — C S F，且其中的組成物 存在於生理溫度中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的更特殊實施例包括一經穩定化的蛋白質組成 物，其中的蛋白質是牛G — CSF。 本發明的其它特殊實施例包括一經穩定化的蛋白質組 成物，其中的蛋白質是牛G — CSF，且其中的bG — CSF是存在於濃度範圍爲〇·〇1到5毫克/毫升。 本發明的其它特殊實施例包括一經穩定化的蛋白質組 成物，其中的蛋白質是牛G — C S F，且其中的穩定化緩 衝液是選自HEPES、TES和丁 RICINE。 本發明的其它更加特殊實施例包括一經穩定化的蛋白 質組成分，其中的蛋白質是牛G — C S F，且其中的穩定 化緩衝液是存在於濃度範圍〇 · 〇 5莫耳濃度到2莫耳濃 度。 本發明的其它更加特殊實施例包括一經穩定化的蛋白 質組成分，其中的蛋白質是牛G — C S F，且其中的組成 分是存在於生理p Η中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明的其它更加特殊實施例包括一經穩定化的蛋白 質組成分’其中的蛋白質是牛G - C S F，且其中的組成 分是存在於生理溫度中。 本發明的經穩定化之蛋白質組成物以包含牛G -C S F於Η E P E S緩衝液中之組成物爲佳。而此 Η E P E S緩衝液以濃度範圍約〇 · 〇 5莫耳濃度到2莫 耳濃度爲更佳。此類牛G - C S F配方以存在於ρ η 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 7ΤΓ ----- 1221773 A7 B7 五、發明說明（9) 7 · 5的生理p Η値爲佳。再者，此類較佳的牛G -C S F配方能維持治療效用的牛〇 一 c S F濃度持續一段 時間，約至少3天到7天，或更多天。 再者，本發明之經穩定化的蛋白質組成物是包含牛G 一 C S F於Η E P E S緩衝液中的組成物，能提供較長時 間的儲存壽命及貯存。此Η E P E S緩衝液以濃度範圍 0 · 〇 5莫耳濃度到2莫耳濃度爲佳。此類組成物內容以 維持在ρ Η 4 · 〇到7 · 5較佳，以4 · 0爲佳，以及在 溫度低於4 0 °C較佳，以約4 °C爲佳。延長儲存壽命和貯 存的範圍約3週到1 8個月，而以6週到1年爲佳。 本發明進一步關於一藥學上可接受劑量形式的經穩定 化之蛋白質組成物，以非經腸道方式給與哺乳動物，包括 一蛋白質及一藥學上可接受的穩定化緩衝液，且此組成物 能使此蛋白質維持於治療效用持續一段時間，其中，蛋白 質的存在是足夠量到提供哺乳動物保護作用持續一段期間 〇 本發明的特殊實施例包括一藥學上可接受的劑量形式 ’其中的劑量形式進一步包含一選自構成黏性修飾劑和表 面作用劑的組成分。 本發明更進一步關於製備一藥學上可接受劑量形式之 經穩定化蛋白質組成物的方法，此組成物以非經腸道方式 給與哺乳動物，包括將蛋白質和穩定化緩衝液結合的步驟 ，此經穩定化的蛋白質組成物能使此蛋白質維持治療效用 持續一段時間，其中蛋白質的存在是足夠量到提供哺乳動 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · 111 — I — I — I — — 1---. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221773 A7 ____ B7 五、發明說明（1〇) 物保護作用至少3天。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明更進一步關於在哺乳動物中治療或預防感染的 方法’包含以一經穩定化的蛋白質組成物給與此哺乳動物 ’而此組成物具治療有效量，其中的經穩定化蛋白質組成 物包括一蛋白質及一穩定化緩衝液，其組成物能使此蛋白 質維持治療效用持續一段時間。 本發明的特殊實施例包括此類治療或預防哺乳動物受 感染的方法，其中的蛋白質是G — C S F。 本發明進一步關於治療或預防牛的乳腺炎、子宮炎或 牛呼吸道疾病的方法，包含給與此哺乳動物一經穩定化的 G - C S F組成物，此組成物含有對哺乳動物治療有效量 的經穩定化G - C S F組成分，其中該經穩定化G -C S F組成物包含G - C S F和一穩定化緩衝液，此組成 分能使此蛋白質維持治療有效濃度持續一段時間。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明更進一步關於一方法用以在哺乳動物體內維持 具治療效用的蛋白質濃度持續一段期間，包括給與此哺乳 動物一經穩定化的蛋白質組成物，其中的經穩定化蛋白質 組成物包含一蛋白質及一穩定化緩衝液，此組成分能使此 蛋白質維持治療有效濃度持續一段時間。 本發明的特殊實施例包括在哺乳動物體內維持治療有 效濃度之蛋白質持續一段時間的方法，其中的穩定化緩衝 液是選自 HEPES、TES 和 TRICINE。 本發明的其它特殊實施例包括在哺乳動物體內維持治 療效用之蛋白質濃度持續一段時間的方法，其中持續的期 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 Α7 Β7 五、發明說明（11) 間至少約3天。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的其它特殊實施例包括在哺乳動物體內維持治 療效用之蛋白質濃度持續一段時間的方法，其中的蛋白質 是選自細胞株刺激因子、生長激素、細胞激素、抗體和抗 原等。細胞激素的特殊範例包括介白素，譬如介白素i 一 1 8和干擾素，譬如干擾素α、/3和r。 本發明的更特殊實施例包括在哺乳動物體內維持治療 效用之蛋白質濃度持續一段時間的方法，其中的蛋白質是 細胞株刺激因子。 本發明的其它更加特殊實施例包括在哺乳動物體內維 持治療效用之蛋白質濃度持續一段時間的方法，其中的蛋 白質是選自人類G— CSF、牛G — CSF和犬G — C S F。 本發明的其它更加特殊實施例包括在哺乳動物體內維 持治療效用之G — C S F濃度持續一段時間的方法，其中 的G-CSF是存在於濃度範圍爲〇·〇1到5毫克/ 毫升中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明的其它更加特殊實施例包括在哺乳動物體內維 持治療效用之G - C S F濃度持續一段時間的方法，其中 的穩定化緩衝液選自Η E P E S、T E S和丁RICINE。 本發明的其它更加特殊實施例包括在哺乳動物體內維 持治療效用之G - C S F濃度持續一段時間的方法，其中 穩定化緩衝液存在於濃度範圍約0 · 0 5莫耳濃度到2莫 耳濃度間。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） "14 ' 1221773 A7 B7 五、發明說明（12 ) 本發明的其它更加特殊實施例包括在哺乳動物體內維 持治療效用之G - C S F濃度持續一段時間的方法，其中 的G — CSF是牛的G — CSF。 本發明的其它更加特殊實施例包括在哺乳動物體內維 持治療效用之b G - C S F濃度持續一段時間的方法，其 中的bG—CSF是存在於濃度範圍約〇·〇1到5毫克 /毫升中。 本發明的其它更加特殊實施例包括在哺乳動物體內維 持治療效用之b G - C S F濃度持續一段時間的方法，其 中的穩定化緩衝液選自Η E P E S、T E S和TRICINE。 本發明的其它更加特殊實施例包括在哺乳動物體內維 持治療效用之b G - C S F濃度持續一段時間的方法，其 中的穩定化緩衝液是存在於濃度範圍約〇 · 〇 5莫耳濃度 到2莫耳濃度。 本發明更進一步關於一套組，用於給與哺乳動物一經 穩定化蛋白質組成物，包含具有治療有效量的蛋白質爲第 一內容物以及具有藥學上可接受的穩定化緩衝液爲第二內 容物’其中當第一內容物之治療有效量蛋白質和第二內容 物之藥學上可接受之穩定化緩衝液緩衝液結合時，能使此 蛋白質在哺乳動物體內維持治療有效濃度持續一段時間。 本發明的特殊實施例包括一套組，其中的蛋白質是以 足夠量存在，提供保護作用給哺乳動物至少3天。

本發明的一較佳組成物是一穩定化蛋白質組成物，包 括牛G - C S F和Η E P E S緩衝液，此組成分能使牛G (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1-------I ^---------^vi . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -15- 1221773 A7 五、發明說明（13 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

一 c s F在哺乳動物體內維持治療有效濃度至少3天，其 中的組成物p Η値約7 · 5以及其溫度約在生理溫度或 4 0 °C。當其中的哺乳動物是牛時，此組成物特別有用。 更特別的是，此Η E P E S緩衝液是存在於濃度範圍 〇 · 0 5莫耳濃度到2莫耳濃度之間。其中的Η E P E S

緩衝液’存在濃度爲1莫耳濃度爲佳。而牛的G - C S F 以存在濃度範圍爲〇 · 〇 1到5毫克/毫升爲佳，G -C S F的濃度爲約〇 · 1毫克/毫升最佳。

本發明進一步關於一經穩定化的蛋白質組成物，包含 牛G — C S F和Η E P E S緩衝液，此組成物能提供延長 的儲存壽命範圍約從3週到1 8個月。其中的HE P E S 緩衝液濃度範圍約從0 · 0 5莫耳濃度到2莫耳濃度爲佳 〇 其中的組成物存在於P Η 7 . 5，且其溫度約少於 4 0 °C爲佳，最好是4 °C。其中延長儲存壽命範圍以6週 到1年爲佳。因此如此經穩定化的組成物能延長儲存壽命 。且可維持在4 0 °C。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖式之敘述 圖1顯示0 · 1毫克/毫升的bG — CSF溶液在 p Η 7 · 5時，以時間爲函數，在〇 · 1莫耳濃度、1莫 耳濃度和2莫耳濃度Η E P E S緩衝液中於4 0 °C之貯存 條件下的穩定度（回復百分比）° 圖2顯示〇 · 1毫克/毫升的136 — CSF溶液在 16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（14) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) P Η 7 · 5時，以時間爲函數，在0 . 1莫耳濃度、1莫 耳濃度和2莫耳濃度T E S緩衝液中於4 0 °C之貯存條件 下的穩定度（回復百分比）。 圖3顯示0·1毫克/毫升的bG-CSF溶液在 P Η 7 · 5時，以時間爲函數，在0 · 1莫耳濃度、1莫 耳濃度和2莫耳濃度TRICINE緩衝液中於4 0 °C之貯存條 件下的穩定度（回復百分比）。 圖4顯不2晕:克/毫升的b G — C S F溶液在p Η 7 · 5時，以時間爲函數，在0 · 1莫耳濃度、1莫耳濃 度和2莫耳濃度Η E P E S緩衝液中於4 0 °C之貯存條件 下的穩定度（回復百分比）。 圖5顯示2毫克/毫升的b G-C S F溶液在pH 7 · 5時，以時間爲函數，在0 · 1莫耳濃度、1莫耳濃 度和2莫耳濃度T E S緩衝液中於4 0 °C之貯存條件下的 穩定度（回復百分比）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖6顯示2毫克/毫升的b G - C S F溶液在p Η 7 · 5時，以時間爲函數，在0 . 1莫耳濃度、1莫耳濃 度和2莫耳濃度TRICINE緩衝液中於4 0 t之貯存條件下 的穩定度（回復百分比）。 圖7顯示以分別溶於水、1莫耳濃度Η E P E S緩衝 液、1莫耳濃度T E S緩衝液和1莫耳濃度TRICINE緩衝 液的b G - C S F配方治療牛隻後的全部週邊血液PMN 計數（以0小時値的對照百分比表示）。 圖8顯示以時間爲函數時，bG - CSF (以毫克/ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（15) 笔升袠示濃度）在Neupogen®緩衝液（對照組，p Η 4·0) ，ΡΗ7·4的HEPES緩衝液，ΡΗ7·0 的p B S緩衝液，ρ η 8 · 5的H a n k s緩衝液和Ρ Η 8 · 2的碳酸氫酸緩衝液中的穩定度。 圖9顯示以時間爲函數時，b G — C S F (以毫克/ 毫升表示濃度）在1〇〇〇毫莫耳濃度、500毫莫耳濃 度、100毫莫耳濃度、50毫莫耳濃度和20毫莫耳濃 度Η E P E S緩衝液於4 °C時的穩定度。 圖1 0顯示兩個b G — C S F溶液的熱克値（仟卡/ 莫耳/度）對溫度（°C )之情形。上面是b G - C S F配 方於PH7 · 5之PBS中的熱克値，最高溫度是47°C ’而下面是bG—CSF配方於pH7·5之1莫耳濃度 HEPES中的熱克値，最高溫度是59t:。 圖1 1顯示以時間爲函數，溶於水中之b G — C S F (對照組）、溶於1莫耳濃度Η E Ρ E S之b G — C S F 和溶於1莫耳濃度HEPES之bG - CSF + 1 0% poloxamer在牛隻體內的ρ Μ N百分比圖（嗜中性球）。 圖1 2顯示bG — CSF在1莫耳濃度HEPES緩 衝液於ρ Η 7 · 5時的溶解度，以在3 1 0毫微米對b G 一 CSF濃度（毫克/毫升）之吸光度來測量。

圖1 3顯示牛的G — C S F在1莫耳濃度HE Ρ E S 緩衝液和在4 0 °C Ρ B S中的穩定度（初始濃度百分比） 〇

圖1 4顯人類的G — CSF在1莫耳濃度he PE S (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝--------訂---------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -18^ 1221773 Α7 Β7 五、發明說明（16) 緩衝液和在4 0 °C P B s中的穩定度（初始濃度百分比） 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖1 5比較人類G — CSF和牛G — CSF在pH 7 · 5的1莫耳濃度Η E P E S緩衝液的穩定度（初始濃 度百分比）。 圖1 6顯示bG — CSF在4〇。(：的1莫耳濃度 Η E P E S緩衝液中，於P Η 4 · 〇時對時間（天）的初 始濃度百分比。 圖1 7顯示bG — CSF在耳濃度 Η E P E S緩衝液中，於P Η 7 · 5時對時間（天）的初 始濃度百分比。 圖1 8顯示bG — CSF在4CTC的1莫耳濃度 T E S緩衝液中，於ρ Η 4 · 0時對時間（天）的初始濃 度百分比。 圖1 9顯示bG - CSF在4〇°C的1莫耳濃度 T E S緩衝液中，於ρ Η 7 · 5時對時間（天）的初始濃 度百分比。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖2 0顯示將樣品貯存在5 t時的R Ρ Η P L C初 始b G — C S F濃度百分比對時間（週）的結果。 圖2 1顯示將樣品貯存在5 I：時的S Ε Η P L C初 始b G - C S F濃度百分比對時間（週）的結果。

圖2 2顯示將樣品貯存在3 0 °C時的R Ρ Η P L C 初始b G - C S F濃度百分比對時間（週）的結果。

圖2 3顯示將樣品貯存在3 0 °C時的S Ε Η P L C 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221773 A7 ___ B7 五、發明說明（17) 初始b G - C S F濃度百分比對時間（週）的結果。 圖2 4顯示將樣品貯存在4 0 °C時的R Ρ Η P L C 初始b G - C S F濃度百分比對時間（週）的結果。 圖2 5顯示將樣品貯存在4 0 °C時的S Ε Η P l C 初始b G - C S F濃度百分比對時間（週）的結果。 圖26是bG — CSF的CD (循環雙色，circuiar dichroism )光譜分析。 圖2 7是在波長2 2 2毫微米時以溫度爲函數的莫耳: 橢圓率。 圖28顯示bG — CSF在40°C時於PH7 · 5的 各種濃度Η E P E S緩衝液中對時間（天）的初始濃度百 分比。 圖2 9是將溶於1莫耳濃度HEPE S的bG — C S F配方與對照組配方於注射後（小時）的W B C對時 間的圖形。 發明之詳細說明 本發明是關於以驚異發現之蛋白質爲基礎的經穩定化 之蛋白質組成分，且特別的是此蛋白質有用於治療人類、 狗、豬、山羊、綿羊、馬和豬等哺乳動物的感染，且可經 由添加HEPES、TES及TRICINE等穩定化緩衝液到 蛋白質內使其穩定化，因此經穩定化的蛋白質組成物在活 體內及活體外皆能維持此蛋白質活性持續一段時間。本發 明的經穩定化蛋白質組成物在活體內的活性方面，能於哺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -20- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂--------- 1221773 A7 B7 五、發明說明（18) 乳動物體內維持此蛋白質的有效治療濃度持續一段時間。 特別的是本發明是一 b G — C S F溶於HE P E S或 T E S之類的穩定化緩衝液的持續釋放（持續活性）配方 ，能提供延長治療的藥劑活性。已知b G - C S F在4 0 °C左右時會變性，以及在中性p Η時不穩定。由於生理 ρ Η値接近中性且牛的體溫近4 0 °C因此這點非常重要。 本發明的經穩定化組成物的蛋白質可以是天然發生的 蛋白質，分離或純化的蛋白質，或重組製造的蛋白質。蛋 白質經化學修飾劑化學性修飾的蛋白質也包括於本發明內 ，譬如甲硫胺酸氧化作用、半胱胺酸硫-烷基化和雙硫鍵 加入/3 -氫硫基乙醇、離胺酸胺基烷基化等等。使用於本 發明的經穩定化之蛋白質組成物的蛋白質以G — C S F爲 佳，最佳是bG — CSF蛋白質。 “ G - C S F ”是意指顆粒球細胞株刺激因子，包括 天然形式及其全部變異形式和突變形的顆粒球細胞株刺激 因子，舉例而言，包括具有一個或更多胺基酸刪除、取代 和/或加入的重組變異體。此類變異體及突變形乃保留全 部或足夠的生物活性以提供哺乳動物治療益處。G -C S F的天然形式是一含有1 7 4個胺基酸的糖蛋白，且 有一形式是有3個額外的胺基酸。兩種形式皆有5個半胱 胺酸殘基，其中4個形成兩個雙硫鍵鍵結而一個是游離形 式。 其它適合使用於本發明之經穩定化的蛋白質組成物的 蛋白質範例包括活性素（acUvms ) ，L —選擇素（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 21 - 1221773 A7 ___B7___ 五、發明說明（19) selectin )、CD— 18和I CAM— 1之類的附著分子， 化學增活激素（chemokine )，趨化性因子，紅血球生成素 ，生長因子，抑制素，胰島素，干擾素α、/3及r，介白 素1 一 1 8，瘦素（leptin )，巨噬細胞發炎性蛋白質，嗜 中性球抑制因子，制瘤素（oncostatins )，巨噬細胞遷移 抑制因子，巨噬細胞刺激因子，嗜中性球素，生長激素釋 放因子（somatostatins )，生長激素（全部物種）如豬、 牛或人類，幹細胞因子，腫瘤壞死因子，血小板生成素和 全部相關及可溶之接受器蛋白質用於給與哺乳動物時能提 供益處或治療結果。可使用於本發明之經穩定化蛋白質組 成物的特別蛋白質範例顯示在表1中。其它可使用於本發 明之經穩定化的蛋白質組成物的蛋白質包括敘述於硏究發 展系統目錄（R&D Systems Catalogue, 614 Mckinley Place NE，Minneapolis MN 55413, USA )中的那些蛋白質，此也倂 入本文參考資料中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 —訂---------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 準 標 家 國 國 中 用 適 度 尺 張 紙 本 (21 格 規 釐 公 97 22 1221773 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（20)

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝--------訂--------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（21) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具治療益處潛力的蛋白質 腦衍生性神經營養因子（ Β D Ν F ) C D 3 1 ( P E C A Μ — 1 ) C D I〇 纖毛性神經營養因子（C Ν Τ F ) 纖毛性神經營養因子接受器 a ( C N T F R a ) C R G — 2 ( I Ρ — 1 0 ) C X C R - 1 (I L - 8 R A ) C X C R — 2 (I L - 8 R Β ) C X C R — 3 C X C R - 4 (融合素） 細胞激素誘發之嗜中性球趨化因子 1 ( C I N C 一 1 ) 細胞激素誘發之嗜中性球趨化因子2 β (C I N C — -2 β ) 細胞激素誘發之嗜中性球趨化因子 a ( C I N C - 2 a ) 細胞毒殺性T -淋巴細胞 — 相關分子4 ( c 丁 LA -4 ) E -選擇素 內皮素一 1 ( E T - 1 ) 嗜紫杉素（E 0 t ) 嗜紫杉素一 2 (Ε ο t — 2 ) 表皮生長因子 (Ε G F ) 上皮衍生性嗜中性球誘素7 8 ( E N A — 7 8 ) 紅血球生成素接受器（E Ρ 〇 R ) 紅血球生成素 (Ε ρ ο ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 裝 ----訂———-----鲁 -24- 1221773 A7 B7 五、發明說明（22) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具治療益處潛力的蛋白質 Fas ( C D 9 5 ) 成纖維細胞生長因子4 ( F G F 4 ) 成纖維細胞生長因子5 ( F G F — 5 ) 成纖維細胞生長因子6 ( F G F — 6 ) 成纖維細胞生長因子7 / K G F ( F G F —7 ) 成纖維細胞生長因子8 ( F G F 一 8 ) 成纖維細胞生長因子8 b ( F G F 一 8 b ) 成纖維細胞生長因子8 c ( F G F 一 8 C ) 成纖維細胞生長因子9 ( F G F _ 9 ) 酸性的成纖維細胞生長因子 ( F G F acidic ) 鹼性的成纖維細胞生長因子 ( F G F basic ) 纖維連結蛋白（F N ) F i t - 1 F i t — 3配位體 分層素 神經膠質細胞株衍生性神經趨化因子 ( G D N F ) 糖蛋白130 (gpl30 ) 顆粒球趨化性蛋白質（G C P — 2 ) 顆粒球細胞株刺激因子（G — C S F ) 顆粒球細胞株刺激因子接受器 ( G 一 C S F R ) 顆粒球巨噬細胞株刺激因子 ( G Μ — C S F ) 生長相關蛋白質（GR〇） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂——,·-----春. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -25- 1221773 A7 B7 五、發明說明（23) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具 治 療 益 處 潛 力 的 蛋 白 質 生 長 相 關 蛋 白 質 a ( G R 〇 a ) 生 長 相 關 蛋 白 質 β ( G R 〇 β ) 生 長 相 關 蛋 白 質 Ύ ( G R 〇 r ) 血 濾 液 C C 化 學 增活 激 素 1 ( H C C 一 1 ) 肝 素 結 合 上 皮 生 長 因 子 ( Η Β _ E G F ) 肝 細 胞 生 長 因 子 ( Η G F ) 遺 傳 調 節 素 a ( Η R G _ a ) 遺 傳 調 節 素 β 1 ( Η R G — β 1 ) 1 一 3 0 9 胰 島 素 類 似 生 長 因 子 ( I G F _ 1 ) 干 擾 素 r ( I F N — r ) 介 白 素 1 接 受 器 拮 抗 劑 ( I L 一 1 r a ) 介 白 素 1 1 接 受 器 ( I L 一 1 1 R ) 介 白 素 1 2 Ρ 7 〇 ( I L 一 1 2 P 7 〇 ) 介 白 素 1 3 ( I L — 1 3 ) 介 白 素 1 6 ( I L 一 1 6 ) 介 白 素 2 接 受 器 a ( I L — 2 R a ) 介 白 素 2 接 受 器 β ( I L 一 2 R β ) 介 白 素 3 ( I L 一 3 ) 介 白 素 4 接 受 器 ( I L — 4 R ) 介 白 素 5 ( I L 一 5 ) 介 白 素 7 接 受 器 ( I L 一 7 R ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 26· 1221773 A7B7 五、發明說明（24) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具治療益處潛力的蛋白質 介白素9 I P — 1 0 J E / M C P - 1 角質細胞生長因子/ F G F — 7 ( K G F ) L 一選擇素 潛伏期相關胜肽（ T G F 一 β 1 ) (L ,A P T G F - /3 1 ) 潛伏轉形生長因子/5 1 ( Latene T G F _ β 1 ) 痩素（0 Β ) 痩素接受器（Leptin R ) 白血病抑制因子接受器 a ( L I F R a ) 白血病抑制因子（ L I F ) L F A - 1 胰島素-類以生長因子 I 接受器 ( I G F 一 I R ) 胰島素類似生長因子 I I ( I G F 一 I I ) 細胞間附著分子3 ( I C A M — 3 ) 細胞間附著分子1 ( I C A M 一 1 ) 介白素1 1 ( I L 一 1 1 ) 介白素1接受器形 I ( I L 一 1 R I ) 介白素1 0 ( I L 一 1 0 ) 介白素1 0接受器 ( I L 一 1 0 R ) 介白素1 2 ( I L — 1 2 ) 介白素1 2 p 4〇 ( I L — 1 2 P 4 〇 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^裝 ----訂--------- -27- 1221773 A7 B7 五、發明說明（25) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具 治 療 益 處 潛 力 的 蛋 白 質 介 白 素 1 3 接 受 器 a ( I L 一 1 3 R a ) 介 白 素 1 5 ( I L 一 1 5 ) 介 白 素 1 7 ( I L — 1 7 ) 介 白 素 1 8 / 1 G 1 F ( I L 一 1 8 ) 介 白 素 2 ( I L — 2 ) 介 白 素 2 接 受 器 r ( I L 一 2 R r ) 介 白 素 3 接 受 器 a ( I L 一 3 R a ) 介 白 素 4 ( I L 一 4 ) 介 白 素 5 接 受 器 a ( I L 一 5 R a ) 介 白 素 6 ( I L 一 6 ) 介 白 素 6 接 受 器 ( I L 一 6 R ) 介 白 素 7 ( I L _ 7 ) 介 白 素 8 ( I L 一 8 ) 介 白 素 9 接 受 器 ( I L 一 9 R ) 介 白 素 1 a ( I L 一 1 a ) 介 白 素 1 β ( I L — 1 β ) 介 白 素 1 接 受 器 形 I I ( I L 一 1 R I I ) Μ a C 一 1 a 鏈 巨 噬 細 胞 株刺 激 因 子 ( Μ — C S F ) 一 巨 噬 細 胞 株 刺 激 因 子 接 受 器 ( M 一 C s F R ) 巨 π遼 細 胞 發 炎性 蛋 白 1 r ( M I P 一 1 r ) 巨 u遼 細 胞 發 炎性 蛋 白 2 ( Μ I P — 2 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -28^· .W裝--------訂---------- 1221773 A7 B7 五、發明說明（26) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具治療益處潛力的蛋 白 質 巨噬細胞發炎性蛋白 3 a ( Μ I Ρ 一 3 a ) 巨噬細胞發炎性蛋白 3 β ( Μ I Ρ 一 3 β ) 巨噬細胞發炎性蛋白 1 a ( Μ I Ρ — 1 a ) 巨噬細胞發炎性蛋白 1 β ( Μ I Ρ 一 1 β ) 巨噬細胞遷移抑制因 子 ( Μ I F ) 巨噬細胞刺激蛋白質 ( Μ S Ρ ) 巨噬細胞衍生性化學 增 活 激 素 ( Μ D C / D C - C K 1 ) MARC/MCP— 3 中激素（Μ K ) MIG 單核球趨化性蛋白質 1 / Μ C A F ( Μ C P — 1 ) 單核球趨化性蛋白質 2 ( Μ C Ρ — 2 ) 單核球趨化性蛋白質 3 ( Μ C Ρ 一 3 ) 單核球趨化性蛋白質 4 ( Μ C Ρ — 4 ) 單核球趨化性蛋白質 5 ( Μ C Ρ — 5 ) 神經細胞附著因子（ N C A Μ ) 神經營養素3 ( N T — 3 ) 神經營養素4 ( N T 一 4 ) 具治療益處潛力之蛋 白 質 制瘤素Μ (〇S Μ ) Ρ -選擇性（C D 6 2 Ρ ) 胎盤生長因子（P I G F ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -29 - 1221773 A7 B7 五、發明說明（27) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具治療益處潛力的蛋白質 胎盤生長因子2 (P IGF -2 ) 原形質硒穀胱甘肽過氧化酶 血小板G Ρ Π b / G P m a (c D 4 1 a ) 血小板衍生性內皮細胞生長因子 ( Ρ D 一 E C G F ) 血小板衍生性生長因子（P D G F ) 血小板衍生性生長因子A鏈 (Ρ D G F A Chain ) 血小板衍生性生長因子A A (Ρ D G F 一 A A ) 血小板衍生性生長因子A B (Ρ D G F 一 A Β ) 血小板衍生性生長因子B鏈 (Ρ D G F Β Chain ) 血小板衍生性生長因子B B (Ρ Β G F 一 Β Β ) 血小板衍生性生長因子接受器α ( Ρ D G F R a ) 血小板衍生性生長因子接受器/3 ( Ρ D G F R β ) 多營養素（Ρ Τ Ν ) 前- Β細胞生長刺激因子/ S D F 一 1 ( Ρ Β S F ) R A N T E S 分泌性白血球蛋白酶抑制劑 (s L Ρ I ) 幹細胞因子接受器（S C F R ) 幹細胞因子（S C F ) 基質細胞衍生性因子1 /3 / Ρ Β S F ( S D F 一 1 β ) 基質細胞衍生性因子1 / P B S F ( S D F — 1 ) 基質細胞衍生性因子1 α / Ρ Β S F ( S D F — 1 a ) 血子板生成素（Τρο) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^30- 1221773 A7B7 五、發明說明（28) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具治療益處潛力的蛋白質 胸腺及活化調節化學增活激素 ( Τ A R C ) 胸腺表現之化學增活激素 ( T E C K ) 轉形生長因子α ( T G F __ a ) 轉形生長因子/3 ( T G F 一 β ) 轉形生長因子/3 1 .2 ( 丁 G F 一 β 1 2 ) 轉形生長因子/3 2 (τ G F — β 2 ) 轉形生長因子Θ結合蛋白質 I ( Τ G F — β b P I ) 轉形生長因子/3 I (T G F 一 β I ) 轉形生長因子/3接受器形Π ( Τ G F 一 β R Π ) 轉形生長因子/3接受器形ΠΙ ( Τ G F — β R m ) 轉形生長因子/ /3 5 ( Y G F 一 β 5 ) 轉形生長因子/ /3 3 ( T G F 一 β 3 ) T r k Β 腫瘤壞死因子α ( Τ N F 一 a ) 腫瘤壞死因子冷（ Τ N F 一 β ) 腫瘤壞死因子接受器形 I ( T N F R I ) 腫瘤壞死因子接受器Π ( 丁 N F R Π ) 血管細胞附著分子 1 ( V C A Μ 一 1 ) 血管內皮生長因子 (V E G F ) 較佳之蛋白質是有用於治療或預防人類、狗、牛、豬 、山羊、綿羊、馬和豬等哺乳動物的感染。此類感染可能 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -31 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1221773 A7 B7__ 五、發明說明（29) 是細菌感染或原蟲感染，或由病毒引起。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本文所使用的“感染”一詞，除非其它指示，包括發 生在哺乳動物體內的細菌性原蟲、真菌及病毒的感染，以 及此類感染的相關疾病，而可經由給與本發明的經穩定化 之蛋白質組成物而被治療或預防。 可使用本發明之經穩定化的蛋白質組成物治療的感染 性疾病包括下列範例，但不限制牛的感染性疾病，譬如牛 乳腺炎相關但不限制的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳頭 鏈球菌、缺乳鏈球菌、無乳症鏈球菌、克雷白氏稈菌屬、 白喉桿菌屬；牛呼吸道疾病相關但不限制的感染性牛鼻氣 管炎病毒（I B R )、副流行性感冒病毒（P I 3 )、牛 病毒性腹瀉病毒（B V D )、多死性巴斯德氏菌（ Pasteurella multocida )、溶血性巴斯德氏菌）Pasteurella haemolytica )和睡眠性嗜血桿菌（Haemophilus somnus ) ;子宮炎類的生殖疾病；和牛腹瀉相關但不限制的大腸桿 菌和球孢子蟲屬。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其它的感染疾病範例可用本發明之經穩定化的蛋白質 組成物治療的包括但不限制狗的感染性疾病，譬如膿皮病 、狗的呼吸道疾病亦稱爲狗咳嗽。 本發明的經穩定化蛋白質組成物除了治療或預防感染 ，亦使用於提供治療益處。除了治療或預防感染之外；治 療益處或效用的範例之一是給與狗和貓重組的人類G -C S F以改善化學治療所引起的脊椎骨髓抑制，且能使更 具侵略性的癌症治療程序可以執行。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（3G) 本文所使用的“穩定化”一字，除非是特別指示，其 它所提是關於可維持蛋白質的治療效用濃度持續一段時間 。維持此蛋白質的治獠有效濃度，可發生在給與哺乳動物 本發明的經穩定化蛋白質組成物之後，或在活體外使用之 前或貯存期間。本發明的蛋白質組成物的穩定度可使用文 中所敘述的方法，經由初始濃度百分比對時間決定之。 將本發明的經穩定化組成物給與哺乳動物之後，能提 供維持治療有效濃度的蛋白質，而此蛋白質的治療益處效 用可持續超過一段時間。除非特別指示，本文中所使用的 “持續一段時間”是關於在一段時間內仍保留此蛋白質的 治療有效濃度，此可發生在給與哺乳動物本發明的經穩定 化蛋白質組成物之後，或在活體外的使用前，或貯存期間 皆可。 比較之後得知，給與哺乳動物相同的蛋白質時，存在 穩定化緩衝液者比存在於水中或P B S對照溶液中的蛋白 質可提供較長時間的持續性治療有效濃度之益處或治療效 用。另外在活體外的貯存條件下，相同蛋白質存在於穩定 化緩衝液者，比存在於水或P B S中的對照組溶液者具更 佳的穩定度，可提供較長時間的持續性治療有效濃度。持 續一段期間以至少3天爲佳，而7天左右或更久最佳。 除非是特別指示，文中所使用的“治療有效濃度”一 詞是指可在各種給與方法中提供治療效用的蛋白質量。此 量可經由已知之技藝快速決定。而蛋白質的量將視感染形 態及嚴重性、給與路徑等而決定。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 閱 讀 背 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221773 A7B7 五、發明說明（31) “穩定化緩衝液”是意指數種緩衝液，當與本發明之 經穩定化組成物中的蛋白質結合時，可提供一經穩定化的 蛋白質組成物，而此組成物能維持此蛋白質的治療有效濃 度持續一段時間。治療有效濃度的維持可經由技藝已知的 方法測量蛋白質活性決定之。穩定化緩衝液以在生理p Η 値下操作爲佳。穩定化緩衝液包括但不限制是有機緩衝液 ，譬如通常稱作“好緩衝液”在ρ Η 6到8 · 5內操作的 兩性離子緩衝液。此類穩定化緩衝液的範例包括： HEPE (Ν— 2 —羥基乙基六氫吡畊—Ν — 2 —乙烷磺 酸），TES (Ν —三（羥基甲基）甲基一2 —胺基乙烷 磺酸），和TRICINE (Ν —三（羥基甲基）甲基甘胺酸， 二甲胂酸，二（2 —羥基乙基）—亞胺一三（羥基甲基） 甲烷（BISTRIS )，六氫吡畊Ν，Ν ’二一（2乙烷磺酸 )(PIPES)，咪唑和三（羥基甲基）胺基甲烷（ T R I S )。能使用於本發明之經穩定化的蛋白質組成物 的緩衝液範例顯示在表2中。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表2 緩衝液 P K a MES 2 —（ N —嗎啉基）乙院礦酸 5.96 bis-tris 二-(2 -羥基乙基）亞胺-三-(羥基甲基）甲烷 6.36 ADA N — 2 —乙醯胺亞胺二醋酸 6.43 ACES N -2 -乙醯胺基）亞胺二醋酸 6.54 PIPS 六氫吼卩井—Ν，Ν’ 一二一（2 —乙院磺酸） 6.66 MPOSO 3 — ( Ν -嗎啉）一 2 -（經基丙院磺酸） 6.75 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -34- 1221773 A7B7 五、發明說明（32) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 緩衝液 p K a bis-tris pr opne 1 ’ 3 —二[三（羥基甲基）甲基胺]丙烷 6.80 BES N，N —二一（2 —羥基乙基）一 2 —胺 基乙烷磺酸 6.88 MOPS 3 -（N -嗎啉）丙院磺酸 7.01 TES N -三一（羥基甲基）甲基-2-胺基丙烷磺酸 7.16 HEPES N — 2 —經基乙基六氨D比哄一 Ν’ — 2 一 胺基乙烷磺酸 7.31 DIPSO 3 —〔Ν -二（羥基乙基）一胺基〕一 2 -羥基丙烷磺酸 7.35 TAPSO 3 -〔Ν — （三一羥基甲基）甲基胺基〕 一 2 -羥基丙烷磺酸 7.39 POPSO 六氫吡畊-Ν，Ν’二-(2-羥基丙烷磺酸） 7.63 HEPPSO Ν-羥基乙基六氫吡畊-Ν’-2-羥基丙烷磺酸 7.73 Tricine Ν —三（羥基甲基）甲基甘胺酸 7.79 EPPS Ν— 2 —羥基乙基六氫吡畊一 Ν’ 一 2 — 胺基丙烷磺酸 8.00 bicine Ν，Ν —二（2 —羥基乙基）甘胺酸 8.04 TAPS Ν -三（羥基甲基）-甲基-3·胺基丙烷磺酸 8.11 AMPSO 3— Ν_ (α ，α —二甲基羥基乙基）一 1 胺基- 2 -羥基丙烷 9.10 CAPSO 3-Ν-環己胺磺酸 1 9.43 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -35^ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221773 A7 B7 _ 五、發明說明（33) 本發明的經穩定化蛋白質組成物P Η範圍可約從 4 · 0 到 8。 除非特別指示，文中所使用的“生理Ρ Η ” 一詞是指 在哺乳動物內所得的ρ Η値範圍，包括人類、牛、豬、馬 、山羊、綿羊、狗和貓。哺乳動物的生理Ρ Η通常在 6 · 5到8的範圍內。 本發明的經穩定化蛋白質組成物的溫度範圍可約從 2 CTC 到 5 0 〇C。 除非特別指示，文中所使用的“生理溫度”一詞是依 據哺乳動物體內的溫度，包括人類、牛、豬、馬、山羊、 綿羊、狗和貓。哺乳動物的生理溫度通常在3 7 °C到4 1 °C的範圍內。一些典型哺乳動物的生理溫度如下：人類 3 7 t ;牛 3 8 t ;狗 3 9 t ;山羊 3 9 °C ;馬 3 7 °C 和 豬 3 7 t。 本發明之經穩定化的蛋白質組成物所包含的蛋白質以 G - C S F爲佳，而更佳是將牛G - C S F溶於 Η E Ρ E S緩衝液、T E S緩衝液和TRICINE緩衝液等穩 定化緩衝液中。所得之經穩定化的蛋白質組成物能維持 b G - C S F活性於治療有效濃度持續一段時間，至少3 天，且是在牛的生理ρ Η及生理溫度4 0 °C內。 經穩定化的蛋白質組成物可經由將蛋白質和穩定化緩 衝液使用已知可得的技術結合在一起而製備。用於製備經 穩定化之蛋白質組成物的特殊方法，包括使用純化形式的 蛋白質，依據技藝中已知的蛋白質純化技術製備。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂------ 1221773 A7 _B7 五、發明說明（34) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 對於有治療價値的特殊蛋白質，可將此特殊蛋白質（ 以其最大溶解度）溶解於數種緩衝液中的一種，譬如 HEPES、TES、 TRICINE或其它緩衝液，以各種不 同濃度的緩衝液如0 · 0 5到2莫耳濃度溶解。再者，溶 液的pH可能不同，典型從pH4 · 0到8。蛋白質在特 殊緩衝液內的最大溶解度，可經由技藝中已知的傳統方法 決定。此溶液可貯存於欲給與之哺乳動物的生理溫度中， 且溶液中所存在的蛋白質量能以時間爲函數而決定之。溶 液中的蛋白質治療有效濃度可經由以時間爲函數偵測蛋白 質的回收百分比而決定。剩餘的蛋白質量或蛋白質的回收 百分比，可與用於治療益處之已知的蛋白質閾値濃度加以 比較。持續一段時間之天數的決定可經由剩餘在溶液中的 蛋白質量相同於或大於已知之治療益處所需之蛋白質閾値 濃度而得知。有效作爲穩定化緩衝液的緩衝液，當與特殊 蛋白質結合時，將提供此蛋白質維持治療有效濃度持續一 段時間，亦即此持續時間比未溶於穩定化緩衝液之相同蛋 白質給與哺乳動物時有較長之維持時間。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 蛋白質的穩定度可以時間爲函數測量蛋白質活性而決 定之。蛋白質的未展開溫度（T m )可使用作爲蛋白質在溶 液穩定度及活體內穩定度的標記。一特殊蛋白質的未展開 溫度是指在此溫度時，蛋白質失去其二級結構’且傳統上 可使用技藝已知的方法，譬如差別掃描熱量分析儀決定蛋 白質活性。 存在於本發明之經穩定化的蛋白質組成物的蛋白質量 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（35) ’範圍約0 . 1毫克/毫升到5毫克/毫升。而G — CSF的範圍以〇·1毫克/毫升到3毫克/毫升爲佳。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 依據本發明之經穩定化的蛋白質組成物的一範例’此 組成物包含b G — C S F及Η E P E S緩衝液，其中的 bG - CSF存在的濃度範圍約從〇 · 1到5毫克/毫升 ’且其中的Η E P E S緩衝液的存在濃度範圍約從〇 · 1 莫耳濃度到2莫耳濃度。而bG - CSF濃度以在〇 · 1 毫克/毫升到3毫克/毫升之範圍較佳。 依據本發明之經穩定化的蛋白質組成物的另一範例， 此組成物包含b G - C S F及T E S緩衝液，其中的b G 一 C S F存在的濃度範圍約從〇 . 1到5毫克/毫升，且 其中的T E S緩衝液的存在範圍約從〇 . 1莫耳濃度到2 莫耳濃度。而bG-CSF濃度以〇·1毫克/毫升到3 毫克/毫升之範圍較佳。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依據本發明之經穩定化的蛋白質組成物的另一範例， 此組成物包含b G — C S F及TRICINE緩衝液，其中的 b G - C S F存在的濃度範圍約從〇 · 1到5毫克/毫升 ’且其中的TRICINE緩衝液的存在範圍約從〇 , 1莫耳濃 度到2莫耳濃度。而bG — CSF濃度以〇 · 1毫克/毫 升到3毫克/毫升之範圍較佳。 本發明的經穩定化蛋白質組成物可用技藝已知的傳統 方法製備成冷凍形式或凍乾形式。凍乾形式的蛋白質能以 穩定化緩衝液再組合。而此溶液亦可以液體形式貯存以立 即使用。本發明的經穩定化蛋白質組成分是以液體形式爲 本紙張尺度適財關家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) 7W：' 1221773 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（36) 佳，能維持其活性於一段長時間的貯存。 本發明之經穩定化蛋白質組成物能經口服、非經腸道 (皮下、血管內、腹膜內及肌肉內）、吸入之鼻腔、眼球 內或皮內或經由注射方法等，使用技藝中已知的技術形式 給與。以非經腸道給與爲佳。 不考慮給與的路徑，本發明的經穩定化蛋白質組成物 可以傳統已知方法或技藝熟知之技術製備成具藥學可接受 劑量形式的配方。 本發明的經穩定化之蛋白質組成物以藥學上可接受劑 量形式爲佳，適用於皮下給與。典型用於皮下給與之藥學 上可接受劑量形式的體積不超過2 0毫升（如同給與馬和 牛）。且爲無菌（適合使用於哺乳動物內），更進一步對 哺乳動物具良好之耐受性，亦即不會引起注射位置的腫脹 、疼痛或壞死。 通常本發明之藥學上可接受之劑量形式可以包括其它 藥學上可接受的組成分，舉例而言，界面活性劑或淸潔劑 ，黏度修飾劑，糖或蛋白質，而這些添加的組成分能適用 於有效、安全的藥劑給與。譬如，本發明的經穩定化蛋白 質組成物的藥學上可接受之劑量形式，能使用攜帶者、穩 定劑、稀釋劑和/或防腐劑等可接受之傳統作法製成配方 。稀釋劑可包括水、生理食鹽水、右旋糖、酒精、甘油等 。用於等滲透力的添加劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇 、山梨糖醇和乳糖等等。穩定劑可包括白蛋白等等。其它 合適的賦形劑或添加劑是已知於技藝之技術中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -39· .^^裝· — — 訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1221773 A7 B7 五、發明說明（37) 本發明的經穩定化蛋白質組成物能以套組提供，包括 一具有治療有效量之蛋白質爲第一內容物，以及一具有藥 學上可接受之穩定化緩衝液爲第二內容物。此蛋白質能以 冷凍或凍乾形式的固體存在，或以液體形式存在。穩定化 緩衝液能與蛋白質結合，並給與哺乳動物，亦即治療有效 量之蛋白質的第一內容物與藥學上可接受之穩定化緩衝液 之第二內容物結合時，能使此蛋白質在哺乳動物體內維持 治療有效濃度持續一段時間。 本發明的特殊實施例包括一套組，其中的蛋白質是以 足夠量能提供哺乳動物保護作用至少3天的形式存在。 本發明之藥學上可接受之劑量形式範圍約從0 · 1微 克/公斤到5 0微克/公斤，以1微克/公斤到2 5微克 /公斤爲佳，而3 0微克/公斤到2 5微克/公斤最佳。 最好的劑量形式是2 4微克/公斤的b G - C S F。此劑 量至少約3天有效用。 下列範例提供本發明的特殊實施例，但本發明並不因 此只限制在這些特殊的範例範圍內。 範例1 bG — CSF 在 HEPES、TES 和 TM_C—INE 緩衝液中 的持續穩定度 製備HEPES (N — 2 -經基乙基六氫卩比哄一N — 乙院磺酸）、TES (N —二（經基甲基）甲基一 2 —胺 基乙烷磺酸），及TRICINE (N -三（經基甲基）甲基甘 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝-------訂------ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -40- 1221773 A7 -- B7 五、發明說明（38) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 胺酸）此三種緩衝液〇 · 1莫耳濃度、1莫耳濃度及2莫 耳濃度等的不同濃度緩衝液。緩衝液得自Fluka Biochernica USA。每種緩衝液以氫氧化鈉調整其p Η値到7 · 5 ( J. Τ· Baker，USA )。使用 〇 · 2 微孔的 G V 濾孔（Millipore USA )過濾緩衝液使其無菌。因此所製備的Η E P E S、 T E S及TRICINE緩衝液的濃度是每種緩衝液皆各製備 〇·1、 1及2莫耳濃度。 將4 · 69毫克的bG — CSF (以效力53 · 3% 爲基礎）加入到2 5毫升體積的錐形瓶內，然後加入上述 各種不同濃度的TES、 TRICINE及HE PES緩衝液製 備包含0·1毫克/毫升bG-CSF的各種溶液。 將93 · 8毫克的bG — CSF (以效力53 · 3% 爲基礎）加入到2 5毫升體積的錐形瓶內，然後加入上述 各種不同濃度的T E S、 TRICINE及Η E P E S緩衝液製 備包含2毫克/毫升b G - C S F的各種溶液，每種緩衝 液濃度記錄如表3。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 然後將b G-C S F配放透過〇 · 2 2微孔的低蛋白 質結合濾孔（MUUpore G. V.)過濾。將每1毫升的各配方 分裝於1毫升的包裝內，然後放置在4 0 °C的烤箱9天。 此b G - C S F經緩衝液穩定化的溶液所製備的0 · 1毫 克/毫升bG — CSF是在（1) HEPES緩衝液·· 0.1、 1及2莫耳濃度；（2 ) T E S緩衝液：0 · 1 、1及2莫耳濃度；及（3) TRICINE緩衝液：0 · 1、 1及2莫耳濃度內。每一分裝每隔3天就移除樣品，並以 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（39) 大小排除Η P L C ( S E C - Η P L C )分析之。結果顯 示在圖1到6及表3和表4。 表3 HEPES TES TRICI NE 時間 0.1 1 2 0.1 1 2 0.1 1 2 (天） 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 濃度 濃度 濃度 濃度 濃度 濃度 濃度 濃度 濃度 0 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 3 15% 95% 78% 16% 85% 100% 17% 85% 94% 6 9% 96% 82% 11% 97% 98% 10% 79% 88% 9 5% 95% 83% 9% 93% 98% 5% 70% 86% (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表3顯示製備如上敘述之0·1毫克/毫升bG— C S F溶液，以時間爲函數的回收百分比（剩餘量）。此 溶液是貯存在4 0 t。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表4 HEPES TES TRICI NE 時間 0.1 1 2 0.1 1 2 0.1 1 2 (天） 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 莫耳 濃度 濃度 濃度 濃度 濃度 濃度 濃度 濃度 濃度 0 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 3 2% 43% 62% 3% 78% 95% 2% 46% 72% 6 0% 37% 54% 2% 75% 89% 0% 3 8% 65% 9 0% 33% 49% 0% 70% 88% 0% 31% 5 8% 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -42- 1221773 Α7 Β7 五、發明說明（4G) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表4顯示製備如上敘述之2 . 0毫克/毫升bG -C S F溶液，以時間爲函數的回收百分比（剩餘量）。此 溶液是貯存在4 0 °C。 圖1到3顯示0·1毫克/毫升之bG—CSF溶液 在p Η 7 · 5，4 0 °C的貯存條件下，分別在各種濃度之 0·1莫耳濃度、1莫耳濃度及2莫耳濃度HEPES、 T E S及TRICINE緩衝液內的穩定度。如圖1到3所顯示 ，當緩衝液濃度增加到1莫耳濃度及以上時，可促進b G 一 C S F穩定度或活性之維持。在1莫耳濃度的η E P E S內，〇 · 1毫克/毫升之bG—CSF的回收率爲9 0 % (圖 1 )。 圖4到6顯示2·0毫克/毫升之bG—CSF溶液 在p Η 7 · 5 ’ 4 0 °C的貯存條件下，分別在各種濃度之 0 · 1莫耳濃度、1莫耳濃度及2莫耳濃度HEPES、 T E S及TRICINE緩衝液內的穩定度。再次如圖4到6所 顯不，當緩衝液濃度增加到1莫耳濃度及以上時，可促進 b G - C S F穩定度或活性的維持。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在表3和4及圖1至6的數據顯示，存在he P E S 、T E S及TRICINE緩衝液可顯著維持b G — C S F的活 性持續一段時間，從3到9天。 範例2 渣_於.水_1莫耳濃-度_ Η E P E g一、_ i墓耳濃度τ E S及1 莫耳濃度TRICINE緩衝液之b G —ϋ f配方在活體內之 一 43- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 ___B7_— 一五、發明說明（41) 進行 將溶於水、1莫耳濃度Η E P E S、1莫耳濃度 TES及1莫耳濃度TRICINE緩衝液之b G — C S F配方 於小牛體內進行活體內測試。取2 4微克/公斤劑量給與 小牛，並偵測Ρ Μ N (嗜中性球）的數目。 圖7顯示以溶於水、1莫耳濃度HEPES、 1莫耳 濃度TES及1莫耳濃度TRICINE緩衝液之b G - C S F 配方治療小牛後的全部週邊血液Ρ Μ N計數（以對照0小 時之値的百分比表示）。從單一注射得知全部三種緩衝液 皆將近有1 0 0小時的含蓋範圍。如此證明全部三種緩衝 液於活體內的注射處，可提供持續一段時間的蛋白質活性 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ϋ ϋ ϋ 範例3 HE Ρ E S緩衝液對b G - C S F在活體外穩定度的影響 ----訂------

I ·1 I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如下之敘述以各種緩衝液系統製備Ρ Η範圍7 . 0到 8.5的各種0·1毫克/毫升bG-CSF配方。全部 樣品以0 · 2微孔濾孔過濾（GV Milipore，USA )。將樣 品設立穩定度在4 0 °C，且以逆相Η P L C ( RPHPLC)、SEC (HPLC)等如下敘述之生物 分析法偵測7到1 0天。b G - C S F的未展開溫度是以 V P — D S C MicroCalorimetry 系統（U S A )測量。 圖8提供b G - C S F在各種緩衝液系統內的穩定度 比較，包括使用作爲對照組的Neupogen® (可獲商品， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 五、發明說明（42) USA，人類 G— CSF)，在 ρΗ7·4 的 HEPES ，在ρΗ7 · 0的PBS ’HankS緩衝液（可獲商品 ，U S A )和碳酸氫鹽緩衝液。所得結果指出在1莫耳濃 度Η E P E S緩衝液內的b G 一 C S F配方是全部受測試 配方中最穩定的，其與在pH4 · 〇的Neupogen®緩衝液展 現類似的穩定度。由於過去已知b G — C S F在中性或生 理p H値條件下及4 0°C左右或更高之溫度時不穩定’因 此b G — C S F在HE P E S緩衝液中的穩定度如圖8中 所證明之結果令人驚訝且未預期。而b G 一 c s F配方在 pH7·0的PBS中，及HankS緩衝液及碳酸氫鹽 緩衝液中是不穩定的。這些結果的確認如表5之敘述。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表5 緩衝溶液 正專一活性 正專一活性 (毫微克/毫升）初始値 (毫微克/毫升）在 40t *7 天 Neupogen® ( 0.01 0.1 對照組，PH4.0) HEPES(pH7.4) 0.01-0.1 0.01 至 0.1 PBS(pH7.0) 0.1 10 Hanks(pH6.4) 0.01-1.0 100 碳酸氫鹽（PH8.2) 0.1-1.0 100-1000 #較高値對應到較低活性 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 Α7 Β7__ 五、發明說明（43) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 貯存在4 0 〇C的7天期間’在Neupogen®及 Η E P E S緩衝液中的b G 一 C S F並未失去任何活性。 另外，也顯示在p B S中的b G — C S F和在Ha n k S 及碳酸氫鹽緩衝液中的b G 一 C S F ’分別比初始的b G 一 C S F少1 0倍、1 〇 0倍及1 0 0〜1 0 0 0倍活性 。如圖9中所顯示，當HEPES濃度減少時’ bG -C S F穩定度就顯著流失。 圖1 〇是兩種不同bG — CSF溶液的熱克。較上之 熱克的最高溫度爲4 7T： ’是b G — C S F在PB S中於 pH 7 . 5的配方；以及較低之熱克的最高溫度爲59 °C ，是bG — CSF在1莫耳濃度HEPES中於pH 7 · 5的配方。bG — CSF在ρΗ7 · 5 ’缺乏 Η E P E S緩衝液時的未展開溫度爲4 0 °C (開始溫度） ，然而在1莫耳濃度HE P E S中的b G — C S F可增加 1 0 °C的未展開溫度。 範例4 溶於1莫耳濃度Η E P E S之b G__ — CSF配方在活體內 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 之進行 溶於1莫耳濃度Η E P E S的b G — C S F配方的活 體內測試是在小牛體內進行。給與小牛1 2微克/公斤的 劑量，然後偵測白血球細胞（W B C )及Ρ Μ N (嗜中性 球）的數目。結果顯示在圖1 1中。 圖1 1是對時間的Ρ Μ Ν (嗜中性球）百分比圖，是 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（44) 比較三種配方的結果：溶於水中的b G — C S F (作爲對 照組）’溶於1莫耳濃度Η E P E S的b G - C S F和溶 於1莫耳濃度HEPES的bG — CSF + 1 0%聚羥亞 烴類。圖1 1所顯示爲維持於閥値（關於保護作用的濃度 )以上3天或7 2小時的PMN數目。每種配方有6隻牛 受測試。 在第二次硏究中，使用溶於丄莫耳濃度HE P E S緩 衝液的b G - C S F + 1 〇%聚羥亞烴類的2 4微克/公 斤劑量給與小牛，而單一次注射提供近2 0 0小時的保作 用或近8天的保護。這些結果證明η E P E S緩衝液可促 進b G - C S F在活體內的穩定度，因而提供持續一段期 間的活性及此蛋白質運送時的活性。 範例5 溶於1莫耳濃度Η E P E S之b G - C S F的溶解度 決定溶於1莫耳濃度HE P E S之b G-C S F在 p Η 7 · 5時的溶解度。將約8 0毫克的b G — C S F溶 解於3 0毫升的1莫耳濃度Η E P E S緩衝液（p Η 7 · 5 )中。以0 · 2微孔的GV Millipore濾孔過濾此蛋白 質溶液，然後轉移到5 0毫升的超過濾細胞內。供給一已 切掉1 0，0 0 0分子量（M W )的低蛋白質結合膜給此 細胞。利用此超過濾細胞將此蛋白質溶液濃縮。在各種時 間點從細胞中移除樣品，進一步在3 1 0毫微米（測量光 散射力）進行U V — V i s分析，以及經由R Ρ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _ 47 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝--------訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221773 A7 B7___ 五、發明說明（45) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) HP L C濃縮之。作用3 1 0毫微米之吸光度對濃度的結 果。在3 1 0毫微米的吸光度將隨濃度作線性增加；而飽 和時在3 1 0毫微米的曲線突然出現變化，且在3 1 0毫 微米的吸光値顯著增加。此時所出現的濃度爲最大溶解度 。技藝中已熟知此方法且常使用於決定蛋白質的溶解度。 如圖1 2中所顯示，溶於1莫耳濃度HEPES之bG — C S F在p Η 7 . 5時的最大溶解度約5毫克/毫升。此 蛋白質的最大溶解度顯示在曲線中濃度描繪斷點改變的位 置約在5毫克/毫升濃度處，在3 1 0毫微米的吸光度突 然增加，即對應到此蛋白質的最大溶解度。 範例6 HEPES、TES 和 TRICINE 緩衝液對 b G — C S F 未 展開溫度的影響 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 製備含有0 · 5毫克/毫升bG - CSF溶於1莫耳 濃度HEPES、 2莫耳濃度HEPES、 1莫耳濃度 TES、2莫耳濃度TES及1莫耳濃度TRICINE的溶液 ;以及製備含有2毫克/毫升b G - C S F溶於1莫耳濃 度HEPES、2莫耳濃度HEPES，1莫耳濃度 TES、2莫耳濃度TES及1莫耳濃度TRICINE的溶液 。這些溶液的製備如範例1中所敘述的作法相同。對照組 溶液是使用P B S (杜比可氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水（ Dulbecco’s Phosphate buffered Salire )，p Η 7 · 4 )來製 備。此bG — CSF溶液的pH是ρΗ7 . 5。此bG — -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（46) C S F的未展開溫度由差別掃描熱量分析儀（Micr〇caiinc， USA )決定之，亦即在2 〇 t：到9 〇 〇c溫度範圍內使用每 小6 0度的速率來掃描’結果顯示在表6中。 表6 未展開溫度（°C ) PBS HEPES TES TRICINE bG-CSF 濃度 (毫克/毫升） 1莫耳 濃度 2莫耳 濃度 1莫耳 濃度 2莫耳 濃度 1莫耳濃 度 0.5 50.96 56.85 60.05 57.29 62.37 2 54.94 57.62 55.23 60.49 53.68 未展開溫度使用作爲溶液穩定度的記號及蛋白質在活 體內的穩定度。在表6中的結果指出b G — C S F配方在 1莫耳濃度HEPES、TES或TRICINE緩衝液內的未 展開溫度（T m )顯著高於P B S對照組。此三種緩衝液所 升高的T m約2到1 1 °C。而緩衝液濃度大致會影響T m升 高的度數。當Η E P E S濃度從1莫耳濃度增加到2莫耳 濃度時約增加3 °C，而當T E S濃度從1莫耳濃度增加到 2莫耳濃度時約增加5 °C。當b G - C S F濃度增加時， bG — CSF 的 Tm減少。當 bG — CSF 在 HEPES 及 T E S緩衝液內時，當b G - C S F濃度從0 · 5毫克/ 毫升增加到2毫克/毫升時約降低2 °C。當緩衝液濃度爲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝 ----訂--------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -49^ 1221773 A7 B7 五、發明說明（47) 2莫耳濃度及bG-CSF濃度爲0·5毫克/毫升時’ 此T E S緩衝液增加b G - C S F的T m超過1 1 °C。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表6顯示全部三種緩衝液（HEPES、TES及 TRICINE )與PBS比較時顯著增加bG — CSF Tm的 結果。 範例7 溶於P B S及Η E P E S之人類和牛G - C S F配方 度的比較 製備0·15毫克/毫升hG-CSF及bG-C S F之溶於磷酸鹽緩衝生理食鹽水（杜比可氏P B S ’ PH7 · 4)及1莫耳濃度HEPES緩衝液（1莫耳濃 度HEPES，pH7 · 5)的配方。將此配方置於1毫 升分裝瓶中（塡入4 0 0毫升體積）並貯存在4 0°C 1 〇 天。以大小排除色層分析法（S E C - Η P L C )及目視 預測法每3天分析樣品。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖1 3顯示當與P B S比較時，觀察到溶於1莫耳濃 度HE P E S緩衝液的人類G — C S F配方穩定度顯著改 善。當配方在pH7·4的PBS中時，人類G—CSF 於4 0°C超過1 0天後會分解，然而當此配方在1莫耳濃 度Η E P E S緩衝液中時可觀察到6 5 %的回收。 圖1 3及1 4顯示在HEPES及PBS配方中，牛 G — C S F皆比人類G - C S F表現較好的穩定度。在1 莫耳濃度HE P E S配方內的牛G — C S F在4 0°C 1 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（48) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 天之後約觀察到8 0%的回收率，然而人類G — C S F只 有6 5%回收率。牛及人類G - CSF在1莫耳濃度 Η E P E S緩衝液中皆比在P B S中更穩定。 範例8 溶於1莫耳濃度HE P E S配方之人類及牛G- C S F的 穩定度 製備溶於1莫耳濃度Η E P E S緩衝液（1莫耳濃度 HEPES，ρΗ7 · 5)的 0 · 1 毫克/毫升 hG -C S F及b G - C S F配方。將此配方分置於1毫升分裝 瓶（塡入40 0毫升體積）內並貯存在40 °C1 0天。利 用大小排除色層分析法（S E C - Η P L C )及目測法每 隔三天取樣品分析。 圖1 5顯示溶於1莫耳濃度HEPES的牛G -C S F及人G - C S F配方的穩定度。貯存在4 0 t： 1 0天後的牛G — CSF回收率約9 0%，以人G — C S F回收率約7 0 %。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 範例9 西Η方ρ Η對b G- C S F穩定度的影響 〇 · 1毫克/毫升bG — CSF溶液配方是溶於1莫 耳濃度HEPES及1莫耳濃度TES緩衝液’ pH値分 別爲4 · 0及7 · 5。將配方置入1毫升分裝瓶（塡入 4 0 0毫升）並貯存於4 0。(： 1 0天。以大小排除色層分 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ " " 1221773 A7 B7 五、發明說明（49) 析法（S E C - HP L C)每三天分析樣品。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如圖16及18所顯示，在40t，pH4 . 0貯存 1 0天後bG — CSF的回收約1 〇〇%，相較於圖1 7 及1 9所觀察到的於p Η 7 · 5的配方中，b G - C S F 回收約8 0 — 8 5 %。 範例1 Π 渣於1 · 0莫耳濃度HEPES及TES配方之_.P_ = iS F六個月樣品的長期熱穩定度硏究 此硏究所包括的配方如下。得自GibcoBRL ( L 〇 t # 1016436)的1·0莫耳濃度HEPES商品配方 ’而1莫耳濃度TE S的製備粉末是得自Fluka Scientific (L〇t#RA12602)。緩衝液pH値調整至 7.5。BG— CSF 由 Bioprocess (Lot#BP185 一 1 1 )提供，純度爲5 3 · 3 %。 製備0·1毫克/毫升及2·0毫克/毫升之bG-CSF溶於1·〇莫耳濃度HEPES及1·〇莫耳濃度 T E S緩衝液的配方。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 樣品的貯存是使用3 · 5毫升Flint Type 1分裝瓶（ Lot#R04105 — 7322 )，具有 13 毫米的 1 8 8 8 Gray T/F 瓶栓（Lot#R〇5619 -7 4 8 7 )，塡入1 · 0毫升的體積。樣品的貯存及溫度 列於表7中。對每種配方的五個分裝瓶在各時間點之貯存 樣品進行分析。 -52^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（50)

表7 、 議品貯存及時間 丨點功效分析的: 滴要 貯存 初始 3週 6週 1 2週 6週 1年 18個月 5 t： X X X X X X X 3 0 t X X X X X X 4 cr c X X X X (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在進行HPLC分析之前，先將2·0毫克/毫升的 bG—CSF配方稀釋10倍。 從每種貯存室（5，30 ’ 40 °C)中取出每種配方 各3個樣品，並以RP及SE HPLC分析bG— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 C S F功效。每個樣品分析3次。使用先前已決定的標準 曲線計算濃度。決定每一分析的初始b G - C S F濃度百 分比（％ )，並計算每一配方在每一時間點的平均値。繪 描每一貯存溫度之初始平均b G - C S F濃度對時間的圖 形，並指出b G - C S F功效降低的情形。圖2 0及2 1 是經由R P及S Ε Η P L C分析對貯存存於5 °C之樣品 的分析結果。圖2 2及2 3是對貯存於3 〇 °C之樣品的分 析結果，而圖2 4及2 5則是對貯存於4 〇 °C之樣品的分 析結果。 除了溶於1·0莫耳濃度TES的〇·1毫克/毫升 的蛋白質配方之外，貯存於5及3 0 °C的樣品其b G — C S F略有分解。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） " 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1221773 A7 ____ B7__ 五、發明說明（51 ) 範例1 1 Η E p e S緩衝液對生物治療性蛋白質的穩定化的潛能性

I 對於以下所討論的蛋白質T m値，是使用Microcal， Model V P — D S C微熱量分析儀決定其在磷酸鹽和 Η E P E S緩衝液中的値。使用來自Aldrich的 Na2HP〇4 (Lo t 號碼 08019PQ)製備 25 毫 莫耳濃度的磷酸鹽緩衝溶液，並調整p Η至7 . 5。而 1 · 0莫耳濃度的Η E P E S緩衝液（ρ Η = 7 · 5，

Lot號碼10164346)是得自GibcoBRL。緩衝液 父換是由 Stirred Ultrafiltration Cell，Model 8010 ( Amico,

Inc )與 YM1 〇 或 YM3 0 Diaflo® Ultrafiltration Membrane ( Amico, Inc )視蛋白質大小互相結合完成。 將得自Bioprocess的2 . 0毫克之凍乾pST (Lo t 號碼41509-217 — 2)重新於2 · 0毫升的 M i 1 1 - Q水中組成。五次交換後，將1 . 〇毫升的重 新組成蛋白質利用Υ Μ 1 〇膜轉移到2 5毫莫耳濃度的磷 酸鹽緩衝液內。剩下的1 . 〇毫升再交換進入1 . 〇莫耳 濃度的HEPES緩衝液內。製備1.0毫克/毫升蛋白 質濃度的樣品，然後以微熱量分析儀分析。P S Τ的微熱 量分析儀在磷酸鹽及Η E P E S緩衝液內進行兩次。 得自Bi〇process的2 · 0毫升Ν I F ( L 〇 t號碼 440631 - 22 - 7)，濃度爲2 .97。將此得自 B1〇pr〇Cess的樣品區分成兩小分裝。取1 · 〇毫升的蛋白質 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -54 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1221773 A7 五、發明說明（52) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 交換到2 5毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝液內，剩餘的N I F則 交換到1 · 0莫耳濃度Η E P E S緩衝液內。在每一個案 例中，有五個交換是使用ΥΜ3 0膜完成。以合適的緩衝 液製備1 · 0毫克/毫升濃度的溶液，並以微熱量分析儀 決定T m値。 具有生物治療的蛋白質及其所對應之溶於Η E P E S 和磷酸鹽緩衝液的T m値列於表8中。 表8 四項生物治療性蛋白質於磷酸鹽及Η E P E S緩衝液中的 微熱量分析儀硏究所得的T m結果 _ _ 蛋白質 在磷酸鹽內的Tw 在HEPES內的Tm V Tm NIF 59.79 63.27 + 3.48 PST (1)56.14 67.90 + 11.76 (2)54.48 63.41 + 8.93 表8顯示HEPES緩衝液提供NIF及pST增加 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 的穩定度 範例1 2 使用Η E P E S緩衝液持續重組牛顆粒球IEL胞株刺激因子 (r b G - C S F )在活體內的活性

牛的顆粒球細胞株刺激因子（b G - C S F )是得自 Bioprocess Research and Development-Pfizer ( Groton, CT 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（53) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) )，甘露醇來自 Ε· M. Industries ( Hawthrone，NY )，1 X 杜比克氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水（P B S )來自 G i b c ο B R L ( Grand Island, NY )，檸檬酸鈉及醋 酸鈉得自 Aldrich ( Milwaukee, WI ) Tween — 80 ，氯化鈉及鹽酸來自 J. T. Baker ( Phillipsburg，U S A ) 〇 RP - HPLC —大小一排除色層分析法（SEC) 溶液穩定度是經由R P - Η P L C及S E C偵測。 RP — HPLC的進行是使用Vydac，利用〇 · 1 % T F A H20(溶劑 A)及 0.1%TFA C A N ( 溶劑B )的蛋白質C 4管柱。流速：1毫升/分鐘；紫外 線偵測：2 2 0毫微米；溫度：2 5 t。大小排除色層分 析是使用 TosoHaas ，TSK — GEL SWxl，7.8 毫 米I D x 3 0公分管柱進行。動相：溶於〇 . 〇 5莫耳濃 度檸檬酸鹽緩衝液的0 · 3莫耳濃度氯化鈉，p Η 5 · 7 5 ;流速：1毫升/分鐘；紫外線偵測：2 8 0毫 微米；溫度：2 5 °C。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 微熱量分析儀 變性溫度（T D )是使用V P D S C系統（ M i c r 〇 c a 1. I n c )測量。取約1毫升的溶液載入凹孔中，並與 一參考用安慰劑配以1 0 °C /分鐘的速度進行。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（54) 循環雙色分析 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) b G - C S F的二級結構是使用循環雙色光譜儀偵測 ，以溫度掃描測量附屬（C D *〇R D Model J - 7 1 0 / 7 2 0 — J a p a n S p e c t r 〇 s c 〇 p i c C 〇 ·，L T D )。 生物分析法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 b G - C S F配方在活體外的活性決定是利用老鼠骨 髓細胞增生分析法（B M C分析法）。骨髓細胞是從雌 C F 1老鼠（Charles River )股骨經由移除股骨及使用 3 c c / 2 3 G注射器和漢克氏平衡鹽水溶液（Hanks Balanced Salt Solution, GibcoBRL )緩慢沖出骨髓於無菌下 收集起來。以尼龍篩網過濾細胞懸浮液移除殘渣。然後在 1 1 0 0 r p m下室溫離心1 0分鐘。丟棄上淸液並將沈 澱物以15毫升RPMI培養液（Gi be 〇 BRL) 再打散，補充1 0 %胎牛血淸（G i b c ◦ BRL)， 1%青黴素一鏈黴素（l〇，〇〇〇單位/毫升），1% L —麩醯胺酸（Gibco BRL)。使用 Counter Channelyzer 256量化骨髓細胞，並將細胞濃度調整爲 6 · 6 7 X 1 0 5細胞/毫升。約1 0 5細胞加入9 6 -凹 孔平板的每一凹孔內。然後將牛顆粒球細胞株刺激因子配 方以各種濃度加到每一凹孔內（重覆三次）。在3 7°C ( 5 % C〇2 )培養3天之後，每個凹孔加入3 Η —胸腺核苷 (New England Nuclear, Boston, Mass )至最後濃度爲 2 微 居里/毫升。放射線標記可於3 7 °C ( 5 % C 0 2 )至少進 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（55) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 行1 8小時。將此平板置於—2 0 °C，解凍，利用Brandel 細胞收集器（Biomedical Research and Development Laboratories，Gaithersburg，Maryland )將細胞收集到 9 6 — 凹孔纖維墊上。利用Wallac 1 205 Betaplate液體閃爍計數器 (Wallac, Gaithersburg，Maryland )決定活性。b G — C S F配方的活性經由相對於計數每分鐘對照組（層疊-覆蓋-背景）之計數每分鐘區分樣品而決定。3或更多層 疊-覆蓋-背景的活性被考慮爲陽性。 bG — CSF在活體內的活性 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 b G - C S F配方在活體內的活性是在年輕之異種交 配小牛中測試，這些牛的體重範圍約1 0 0 — 1 5 0公斤 。購買小牛並運送到位在Terre Haute, Indiana的動物衛生 硏究中心，且於分配到硏究之前需至少兩天的適應期間以 利硏究之進行。大部分的小牛使用於一次硏究中，之後至 休息一週才可再分配做第二次硏究。小牛的使用不超過兩 次硏究。要進行硏究之前，被分配到的小牛先篩選1 - 3 天，測試肛溫、體重、健康狀況及全部白血球（W B C ) 計數及分類。通常小牛肛溫2 1 0 4 °F及全部白血球計數 <4000/毫米3或>12，0 0 0/毫米3者被排除於 此硏究。在第0天要治療之前先將小牛放血並稱重。以每 隻小牛體重爲基礎，在治療時間所計算的2 4微克/公斤 b G - C S F配方劑量，經由頸部前肩胛骨的區域皮下注 射給與。治療之後於事前已定的時間經由靜脈穿刺法從頸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) · 58二 ' 1221773 A7 _ B7 五、發明說明（56) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 部取血液樣品，然後收集在含有E D T A抗凝血劑容器內 用以WB C /分類。全部WB C計數是在Nova Celltrak I血 球細胞計數器上進行，亦即使用1 : 2 5 0稀釋於等張稀 釋劑中的全血計數。分類W B C計數的進行是以Diff-Quik 染色組（D a d e )所染色的乾燥血液塗片來計數。一全 部的1 0 OWB C s是在蔡司光學顯微鏡上以1 0 0 X油 鏡及1 2 · 5 X接目鏡計數及分類（放大倍數：1 2 5 0 P Η和溫度對b G — C S F溶液穩定度的影響 表9顯示溫度對b G - C S F穩定度的影響。溫度對 b G — C S F溶液穩定度的衝擊可經由RP — HP L C、 S E C — Η P L C生物分析法及目測（配方：〇 · 1毫克 /毫升bG - CSF，5%甘露醇，10毫莫耳濃度醋酸 鹽緩衝液，0 · 004%tween — 80，pH4 · 0 )得知。如表9中所見，bG — CSF在40°C或40°C 以上的穩定度不連續。經由RP - HP L C及S E C — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 HP L C在4 0°C及以上時會流失親代蛋白質尖峯。在較 高溫度消失親代尖峯是在溶液中增加顆粒化之後。可由目 測觀察及偵測3 1 0毫微米時之光線散射得知。貯存在 4 0 °C 3週的牛G - C S F比貯存在5 °C及3 0 °C者活性 少1 0〜1 00倍。在50°C貯存3週的bG — CSF比 貯存在5 °C及3 0 t的溶液活性少1 0 0〜1 0 0 0倍。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（57) 表9 :以溫度爲函數的b G - C S F穩定度（3週穩定度 溫度 (°C ) RP-HPLC (初始百 分比） SEC-HPLC (初始百分 比） 以 T y n d a 11 燈 目測3 1 〇毫微 米的光線散射 正專一活性 (於BMC分析中的 毫微克/毫升Γ 5 88.5 97.6 淸徹（0.2au) 0.1-1 30 67.3 76.8 淸徹（0.04au) 0.1-1 40 5.6 5.4 微濁（>0.1au) 10-100 50 1.9 無根源尖峯 淆濁（>0.1au) 100-1000 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 *以老鼠B M C分析測試活性（注意：較高數目代表較低活 性） 溫度對b G - C S F的衝擊之後使用循環雙色分析（ CD) °bG-CSF的CD光譜分析結果顯示在圖26 中。光譜分析推測b G - C S F的二級結構大部分爲α - 螺旋，類似人類G - C S F。C D光譜分析在各種溫度檢 驗以決定變性溫度（T D )。圖2 7是以溫度爲函數時’ 在波長2 2 2毫微米（α -螺旋的波長特性）的莫耳橢圍 率圖。在4 0°C及5 0°C之間時，莫耳橢圍率增加，表示 二級結構喪失且b G - C S F變性。 也評估pH對b G - C S F溶液穩定度的影響。爲描 述只有p Η對穩定度之影響而非由於溫度所引起的變性衝 擊，將溶液貯存於3 0 °C ( b G — C S F的T D位於4 0 —50°C)。表10整理出以pH爲函數，在30 °C超過 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 _______Β7___ 五、發明說明（58) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 兩週的b G — C S F穩定度。當Ρ Η增加時蛋白質活性喪 失速度隨之增加。這些數據推論在低ρ η時，b σε S F 的半胱胺酸是質子化的 ，因此配方較穩定 。在高 Ρ Η時，此游離的半胱胺酸包含於雙硫鍵交換反應內，故 較可能引起不穩定。 表1 0 :以pH爲函數時b G — C S F的穩定度（在3 0 °C兩週的穩定度） _ PH RP-HPLC (初始百 分比） SEC-HPLC (初始百分比） 以 Tyndall燈 目測 正專一活性 (於B M C分析中的 毫微克/毫升r 4.0 96.5 100 淸徹溶液 1-10 5.0 91.9 90.1 淸徹溶液 10-100 6.0 75.2 84.6 微小顆粒 100 7.0 30.5 45.7 長型膠狀顆 100-1000 粒 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 *以老鼠B M C分析測試活性（注意：較高數目代表較低活 性） Η Ε Ρ E S緩衝液對b G - C S F溶液穩定.影響 我們已觀察到溶於Ρ Η 7 · 5，1莫耳濃度 Η Ε Ρ E S緩衝液內的b G - C S F配方’即使貯存在 4 0 t數天也表現.較大的溶液穩定度。這是過去沒預期到 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -" 1221773 A7 _ B7 五、發明說明（59) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的，由於先前已知b G — C S F在中性pH不穩定，且在 4 0 °C或大於4 0 °C的溫度會變性。圖2 8例證 Η E P E S緩衝液濃度對b G - C S F在p Η 7 · 5及貯 存於4 0 °C時之溶液穩定度的影響。當Η E P E S緩衝液 濃度降低時，bG - CSF的穩定度顯著減少。1莫耳濃 度HEPES對bG - CSF變性溫度（TD)的影響可 由微熱量分析儀決定。圖1 0是比較兩配方（含1莫耳濃 度HEPES及不含）的bG — CSF之TD的熱克。在 缺乏Η E P E S緩衝液時，內生性熱轉移的開始溫度約 40°C，然而在1莫耳濃度HEPES緩衝液中的bG — C S F配方的T D開始約5 0 °C。變性溫度增加通常是表 示正在穩定化作用。 b G — C S F在活體內的活性 我們測此配方在牛體內的活性。圖2 9是W B C計數 對時間的圖式，是得自溶於1莫耳濃度Η E P E S的b G 一 C S F配方與“對照組”配方比較的結果。“對照組” 是指包包5 %甘露醇，10莫耳濃度醋酸鹽緩衝液， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 丁 ween — 80 ，pH4 · 0 的配方。 如圖2 9中所見，W B C計數停留於2 0 〇 %基線閾 値（可對抗感染之保護作用）以上只有2 4 - 3 0小時。 然而，當b G - C SF溶於1莫耳濃度HEPE S配方時 ，Ρ Μ N數目仍維持於閾値以上至少3天或7 2小時（有 一些案例中W B C維持於閾値以上幾乎一週）。此硏究是 £氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1221773 A7 B7 五、發明說明（60) 可再現的（在每一硏究中每一配方使用6頭牛進行硏究） 。此硏究結果推論Η E P E S緩衝液不僅提供作爲在活體 外的穩定劑，但也能促進b G - C S F在活體內作用。 Η E P E S緩衝液對b G — C S F作用所觀察到之未 預期的結果，促使我們硏究類似緩衝液Μ Ο P S、 HEPPS、TES及TRICINE的情形。這些緩衝液也表 現類似於Η E P E S緩衝液對促進活體外b G 一 C S F穩 定度的結果。因此進行溶於T E S緩衝液及TRICINE緩衝 液之b G — C S F在活體內的硏究，兩配方在牛體內b G 一 C S F活性結果類似Η E P E S配方。 溶於1莫耳濃度HE P E S緩衝液的b G — C S F配 方在活體內可持續b G - C S F的活性。持續作用可以是 促進b G - C S F在注射處之穩定度的結果。當b G -CSF溶於1莫耳濃度HEPES時，bG — CSF在中 性P Η及4 0 °C中的溶液穩定度顯著改善。其它的有機緩 衝液，如 MOPS、HEPPS、TES 及 TRICINE 也能 改善bG-CSF的穩定度。 <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 •63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. 六、申請專利範圍 附件二A: (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第881 13760號專利申請案|修正後無劃線之 中文申請專利範圍替換本 民國92年12月26日修正 1 · 一種安定之蛋白質組成物，其包含顆粒細胞集落 刺激因子（G - C S F )和兩性離子緩衝液，該兩性離子 緩衝液係安定該G - C S F且維持該G - C S F之治療作 用持續一段時間，其中該G - C S F之存在濃度係 0.01 至 5mg/m£〇 2 ·如申請專利範圍第1項之組成物，其中該G — CSF 係牛 G — CSF (bG - CSF)。 3 ·如申請專利範圍第1項之組成物，其中該兩性離 子緩衝液係HEPES、TES或TRICINE緩衝液。 4 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物’ 其中該兩性離子緩衝液之濃度係0 · 5至2 · 0 Μ ° 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物’ 其中該組成物之pH係介於6.5至8·0之間。 6 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物’ 其中該組成物係低於4 0 °C之溫度下安定。 7 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物’ 其中所持續之時間係至少3天。 8 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物’ 其係適於非經腸投遞至哺乳動物體內。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1221773 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 9 ·如申請專利範圍第1至3項中任一項之組成物， 其係另包含黏度改質劑及/或表面活性劑。 1 〇 ·如申請專利範圍第1或2項之組成物，其係用 於治療或預防哺乳動物之感染、或牛之乳腺炎、子宮炎或 牛呼吸道疾病。 j 1 1 .如申請專利範圍第1或2項之組成物，其係適 於形成藥學上可接受之劑型，其中該G - C S F或b G -CSF之含量係〇 · 1至50#g/kg。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁). 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）