TWI299665B

TWI299665B - A method for preparing the extracts from taiwanofungus camphoratus with a capacity for inhibiting the activity of matrix metalloproteinases

Info

Publication number: TWI299665B
Application number: TW95116680A
Authority: TW
Inventors: Ming Yong Lue
Original assignee: Univ Chia Nan Pharm & Sciency
Priority date: 2006-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2008-08-11
Also published as: TW200742584A

Description

1299665 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係有關於一種可抑制基質金屬蛋白酶活性的樟芝萃取物及其製備綠，其樟芝萃取物係由；F同範圍咖精濃度沈澱分離樟芝菌絲體深層培養所獲得的胞外多醣體，尤其可抑制基質金屬蛋白酶的活性。【先前技術】樟芝(η/w臟)/⑽g泌C⑽加)又稱為牛樟芝或牛樟菇，係為台灣特有物種，其只生長在屬於台灣保育樹種的牛樟樹内。根據文獻報導，已知樟芝的有效成分為多體(p〇lysacchari㈣和三萜類(triterpenoids)。現階段，樟芝萃取物已廣泛應用於免疫調節、提高人體造血機能、提高人體運動能力與抗疲勞、治療癌症或腫瘤疾病以及治療B型肝炎等醫藥用途。 /σ 另外，樟芝菌絲體的乙醇萃取物，為超氧陰離子與氫氧自由春基的清除劑，具有抗氧化的功能；而且樟芝子實體與菌絲體的多醣體，可以恢復四氣化碳所引起的肝臟損傷。

唯以上研究應用的樟芝多醣體萃取物，均利用大範圍的酒精沉澱分離而獲得，其酒精濃度係以75 〇〜95 〇%為主；亦即上述^ 究均以總多醣體為主要的實驗萃取物。 L 【發明内容】本發明可抑制基質金屬蛋白酶活性的樟芝萃取物及其製備方法，乃以樟芝分離株之菌絲體深層培養所獲得的胞外多醣體，利用不同的酒精濃度範圍，沉澱樟芝胞外多醣體，分離得到十個不 1299665 同分子量範圍的多醣體。再進行以明膠(gelatin)為受質(substrate) 之基質金屬蛋白酶的蛋白質電泳酵素活性分析(gelatin_|3ased zymography)，發現5〇·〇〜66·7 %酒精濃度範圍沈澱分離的多醣體與 66.7〜75.0 %酒精濃度範圍沈澱分離的多醣體，其分子量分佈範圍為1000〜30000之間，可以有效地抑制基質金屬蛋白酶_2 (matrix metalloproteinase_2, MMP_2)的活性。因此，本發明係利用50 〇〜75 〇 %酒精濃度範圍（「50.0〜66.7%酒精濃度範圍」加上Γ66/7〜75 〇% 酒精濃度範圍」）所沉丨殿分離的棒芝胞外多醣體，分子量分佈範圍為1000〜30000之間，有效應用於抑制基質金屬蛋白酶J的活性。【實施方式】本發明可抑制基質金屬蛋白酶活性的樟芝萃取物及其製備方法，卒取時所應用不同的酒精濃度範圍（如表一），包括1〇個不同的酒精濃度範圍(0〜10.0 %、10.0〜20.0 %、2〇.〇〜33.3 %、33.3〜50 〇 % ^50.0-66.7 % >66.7^75.0 %>75.0^80.0 % ^80.0^85.7 %>85.7^90.0 %、90·0〜95.0%) ’而此階梯式酒精濃度(酒精濃度由低濃度至高濃度)/儿;廣又为離棒之囷絲體深層培養之胞外多醣體的分離方法，其夢以不同/酉精》辰度範圍沉澱分離10個fracti〇ns之樟芝菌絲體深層培養的胞外多醣體之萃取方法簡述如下： θ σ ⑴多聽體溶液與100 %酒精比例為9 :丨（酒精濃度為1〇〇 %)於-20 °C放置overnight，離心（以12〇〇〇 φιη離心2〇分鐘），沉澱多醣體。 (2)多醣體溶液與100%酒精比例為4:1(酒精濃度為2〇〇〇/〇)，上一項剩下的混合溶液依比例添加1〇〇%酒精，於_2〇它放置overnight ’離心（以12_ _離心2〇分鐘），沉殿多酶體。 1299665 ⑶多酶體溶液與100 %酒精比例為2 : U酒精濃度為33 3 %)，上-項剩下的混合溶液依比例添加綱％酒精，於置overnight ’離心（以12_ _離心2〇分鐘），沉殿多膽體。 ⑷多聽體溶液與励％酒精比例為i : 1 (酒精濃度為5〇.〇 /〇) ’上項剩下的混合溶液依比例添加娜％酒精，於_如七放置overnight，離心（以12_ _離心2〇分鐘），沉殿多驗體。 ⑸多體溶液與1()〇%酒精比例為】：2(酒精濃度為⑽ /〇) ’上項剩下的混合溶液依比例添加刚％酒精，於它放 overnight ’離心（以12000 rpm離心2〇分鐘），沉殿多聽體。 (6)多體溶液與励％酒精比例為丨：3 (酒精濃度為乃〇 %)，上-項剩下的混合溶液依比例添加_ %酒精，於2〇亡玫置 overnight，離心（以12_ —離心2〇分鐘)，沉澱多醣體。 ⑺多酿體溶液與100%酒精比例為i : 4(酒精濃度為如〇〇/〇) ’上一項剩下的混合溶液依比例添加1〇〇 %酒精，於_2〇 t玫置 overnight，離心（以12000 rpm離心2〇分鐘），沉澱多醣體。 ⑻多酶體溶液與loo%酒精比例為】：6(酒精濃度為85.7 %)，上一項剩下的混合溶液依比例添加1〇〇 %酒精，於_2〇 t玫置 overnight，離心（以12000 rpm離心2〇分鐘），沉澱多醣體。 (9)多醋體溶液與100%酒精比例為i : 9(酒精濃度為 %)，上一項剩下的混合溶液依比例添加1〇〇 %酒精，於_2〇亡玫置 vemight，離心（以12000 rpm離心2〇分鐘），沉澱多醣體。 (1〇)多醣體溶液與1〇〇%酒精比例為1:19(酒精濃度為95〇 %)，上一項剩下的混合溶液依比例添加1〇〇 %酒精，於_2〇它玫置 overnight，離心（以12000 rpm離心2〇分鐘），沉澱多醣體。 1299665

Fractions 沉殿樟芝胞外多醣所利用的酒精濃度範圍〇〜10.0% 10·0 〜20.0%

20.0 〜33.3% 33.3 〜50.0% 50.0^66.7% 66·7 〜75.0%

Fraction 1 Fraction 2 Fraction 3 Fraction 4 Fraction 5 Fraction 6 Fraction 7 Fraction 8 Fraction 9 Fraction 10 75.0 〜80.0% 80.0^85.7% 85.7^90.0% 90·0 〜95.0%

利用不同賴濃絲圍(Ρ㈣式浦濃度)沉射離樟芝胞外多釀體’可得到10個fractions之不同分子量範圍的多醣體混合物’經膠體穿透層析法(gel permeation chromatography)分析所獲得的滯留時間(retentiontime)與分子量分佈範圍（如表二）。再收集繼代培養48小時的3T3老鼠纖維母細胞培養液[内含基質金屬蛋白酶(MMPs)]，分別以0·5 mg/ml的1〇 fractions樟芝胞外多醣體處理 1299665 細胞培養液，反應〇或48小時，再進行以明膠(gelatin)為受質 (substrate)之基質金屬蛋白酶的蛋白質電泳酵素活性分析 (gelatin-based zymography)，摘測 10 fractions 不同分子量範圍的樟芝胞外多醣體是否會抑制MMPs (MMP-9及MMP-2)的酵素活性；上述實驗所使用的「細胞培養液」為已培養3T3細胞48小時的細胞培養液，先將「細胞培養液」與3Τ3細胞分離，僅使用「細胞培養液」進行實驗。

. 各fraction樟芝胞外多醣體

Fractions .................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 滯留時間(min) 分子量的分佈(Da)

37.69 > 950,000 39.87 450,000〜950,000 43.69 120,000〜450,000 46.61 30,000〜120,000 47.81 3,000〜30,000 54.22 1，000〜3,000 58.87 <1000 59.29 <1000 <1000

Fraction 1 Fraction 2 Fraction 3 Fraction 4 Fraction 5 Fraction 6 Fraction 7 Fraction 8

Fraction 9 59.29 <1000

Fraction 10 57.41 藉由gelatin-based zymography的酵素活性分析，證明fracti〇n 1299665 5 (以5〇·〇〜66.7 %酒精濃度範圍沈澱分離所獲得的樟芝胞外多醣體) 與fraction (以66.7〜75.0 %酒精濃度範圍沈澱分離所獲得的樟芝胞外多醣體)可以有效地抑制基質金屬蛋白酶_2的活性。因此，本發明乃利用fraction 5與fraction 6的樟芝胞外多醣體混合物，即 5〇.〇〜75.0 %酒精濃度範圍（「50.0〜66.7 %酒精濃度範加上 66.7〜75.0 %酒精濃度範圍」）所沉澱分離的樟芝胞外多醣體抑制 ΜΜΡ-2 (matrix metalloproteinase-2)活性的效果最佳【請參閱第一圖】；其中，fraction 5與fraction ό的樟芝胞外多醣體之分子量分佈範圍為1〇〇〇〜30000之間（如表二）。本發明可抑制基質金屬蛋白酶活性的樟芝萃取物及其製備方法’由上述藉料同騎濃度職分轉芝騎獅層培養之胞料畴體的萃取方法，其分離方法詳述如下：將樟芝_體液態深層培養後_浮液以離心機_啊離心，分成固_絲體與澄清培養液，再將該澄清培養液與應％酒精以比例為丨：丨混合 (:酉精濃度為 %)，於·2〇。(：放置Gvemight，離心（以12_稱離心20分鐘）’沉殿分離出分子量較大(分子量大於的棒芝胞外多雜’離心後的澄清液（含有5G G %的酒精濃度）依比例添加娜％酒精將酒精濃度調至75.Q %，於_2() 放置㈣而咖，離心（以12000 ,離心20分鐘）’沉;殿分離出分子量範圍為 1〇〇〇〜30000之間的樟芝胞外多餹體。此步驟所沉澱分離出之棒芝胞外多醣體’具有明顯抑制MMP_2活性的能力【請參閱第一圖之 5與6】。、本發明可抑讎質金屬蛋白酶活性轉芝萃輸及其製備方法’其製備方法包括固態培養、菌絲體液態深層培養以及分離出 1299665 樟芝萃取物之步驟，其製備步驟如下： (1)樟芝分離株的固態培養：將樟芝菌絲體接種於圓形平面典養盤上，培養基組成為malt extract (麥芽抽出物）2 0/。、 ° 萄糖）2%、bacto peptone (蛋白腺）0·1 〇/〇、bact〇啊月旨=(葡放置於26 °C恆溫箱中靜置培養約20至30天；曰/〇 (2)杯之分離株的菌絲體液態深層培養：刮取圓形平典、的菌絲體接種於三角燒瓶中，使用無澱粉類成份的培養旯，養孤

成伤包括glucose (葡萄糖）2%、malt extract (麥芽抽出物） bacto peptone (蛋白脒）i 〇/〇、MgS〇4 (硫酸鎮）〇〇5 %、酸二氫鉀）0·05 %、K2HP〇1 2 (構酸氫二鉀）〇·05 %，振盪速产為 rpm、溫度28它、ρΗ 5·5 (接菌前），於迴轉式振盪恆溫箱^養約一

11 1 樟芝分離株的5公升發酵槽菌絲體液態深層培養··將二角燒瓶的液態深層培養物接種於發酵槽内，培養基配方成份與上述相同，攪拌速度為120 rpm、溫度28 t、通氣量丨vvm，培養^ 5〜7天； " 2 樟芝萃取物(分子量範圍為looo〜30000之間的樟芝胞外多醣體)之分離：將樟芝菌絲體液態深層培養後的懸浮液以離心機 8000 rpm離心，分成固體菌絲體與澄清培養液，再將該澄清培養液與100 %酒精以比例為丨：丨混合（酒精濃度為5〇〇 %)，於_2〇 C放置overnight ’離心（以12000 rpm離心20分鐘），沉澱分離出分子量較大(分子量大於30000)的樟芝胞外多醣體，離心後的澄清液（含有50.0 %的酒精濃度）依比例添加1〇〇 %酒精將酒精濃度调至 75·0’ 於-20放置 overnight，離心（以 12000 rpm 離 1299665 心2〇分鐘），沉澱分離出分子量範圍為1000〜3〇〇〇〇之間的樟芝胞外多醣體。綜上所述，本發明可抑制基質金屬蛋白酶活性的掉芝萃取物 ^其製備方法’其料萃取物係的戰__濃度分離棒芝囷絲體深層培養所獲得的胞外多醣體，明顯有效地抑制基質金屬蛋白酶（MMP-2)的活性，該胞外多醣體之分 1000〜30000 之間，H # 5〇 w 轉料齡卿_的騎濃度範圍為 (S ) 12 1299665 【圖式簡單說明】第一圖 •為利用 fractions 1 〜5 盘 frjw; a 〔 /、tractions 6〜1〇的樟芝菌培養之胞^雜分顺理m _培養基， ml的知i處理48小時，再分析細胞培養液中基質金屬蛋白轉的活性，結果顯示丘acti〇n 5 (lane习與fracti〇n 6 (lane 6)可明顯抑制基質金屬蛋白酶的活性。【主要元件符號說明】

C代表未加入樟芝胞外多醣體於3T3細胞培養基，放置〇小時。 N代表未加入樟芝胞外多醣體於3T3細胞培養基，放置48小時。 ΜΜΡ-9 代表 matrix metalloproteinase-9。 MMP-2 代表 matrix metalloproteinase-2。 92 kDa代表MMP-9的分子量。 72 kDa代表MMP-2的分子量。

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Claims

Ι29966%Η；?9 1 - :..π 上一> ；十、申請專利範圍·· 、一種可抑制基質金屬蛋白酶活性的掉芝萃取物，，卒取物伽樟芝分離關絲體深層培養後產生，為樟芝特有二夕醣體，分子量範圍為1000〜30000之間。、性的專利f圍第1項所述之「可抑__白酶活 2卒取物」，其中’樟芝萃取物係源自樟芝分離株菌絲體深層坧養後，所得的整個懸浮液。性的^如申1專圍第2項所述之「可抑制基#金屬蛋白酶活声:林t」’其巾，樟芝萃取物細自樟芝分離祕絲體深曰β養後，所得的整個懸浮液中的澄清培養液。 4、如申請專利範圍第3項所述之「可抑制基質金屬蛋白酶 ^的樟芝卒取物」’其中，樟芝萃取物係源自掉芝分離株菌絲體冰層培養後’所得的整個懸浮液中的澄清培養液所含的胞外多醣體。 5、如申請專利範圍第4項所述之「可抑制基質金屬蛋白酶 •活性的樟芝萃取物」，其中’樟芝萃取物係源自樟芝分離株菌絲體深層培養後’所得的整麵浮液中的澄清培養液所含的胞外多醣體，經萃取所得者。 6、-種如中請專利翻第i項所述之可抑制基f金屬蛋白酶活性的樟芝萃取物之製備方法，其製備步驟如下：，⑴棒芝分離株的固態培養：將樟芝菌絲體接種於圓形平面培養盤上’培養基組成為malt extract (麥芽抽出物)2 %、咖寥（葡萄糖）2%、bacto peptone (蛋白腺）〇1 %、_〇黎（缓脂）2 %，放置於26 C怪溫箱中靜置培養約2〇至3〇天； (S) 14 1299665 (2) 樟芝分離株的菌絲體液態深層培養··刮取圓形平面谇的囷絲體接種於三賴瓶巾，使用無麟賊份的培養基，配方成份包括glUC〇Se (葡萄糖）2〇/〇、malt extract (麥芽抽出物）2%、 bacto _0ne (蛋白腺）丨％、MgS〇4 (硫酸鎮）⑽5 %、叫吵(碟酸-虱鉀)⑽5 %、Κ2ΗΡ〇4(磷酸氫二鉀)⑽5 %，振盪速度為奶 rpm /皿度28 C、pH5·5 (接菌前），於迴轉式振盡恒溫箱培養約一週； ' (3) 樟芝分離株的5公升發酵槽菌絲體液態深層培養：將三角燒瓶的液態深層鱗物接種於鱗_，培養基配方成份與上述相同，攪拌速度為120 rpm、溫度28°C、通氣量1 vvm，培養約 5〜7天； … (4) 樟芝萃取物(分子量範圍為1〇〇〇〜3〇〇⑻之間的樟芝胞外多醣體)之分離：將樟芝菌絲體液態深層培養後的懸浮液以離心機 8000 rpm離心，分成固體菌絲體與澄清培養液，再將該澄清培養液與100 %酒精以比例為1 :丨混合（酒精濃度為50 0 %)，於_2〇 C放置overnight，離心（以12000 rpm離心2〇分鐘），沉澱分離出分子量較大(分子量大於30000)的樟芝胞外多醣體，離心後的澄清液（含有50·0 %的酒精濃度）依比例添加1QQ %酒精將酒精濃度調至75.0 %，於·20 °C放置overnight，離心（以12000 rpm離心20分鐘），沉澱分離出分子量範圍為1000〜3〇〇〇〇之間的樟芝胞外多體。 15