TWI299335B - Anti-microbal peptides and uses thereof - Google Patents

Description

1299335 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明有關抗微生物蛋白質之胜肽片段及其用途。 【先前技術】 ί抗微:生物蛋白皙友极技嫩4 %成；九&丄、、&，_ .

卒取出來，具有抑制一些革蘭氏陽性菌與陰性菌的特性·。 Pleurocidin在1 997年由Cole等人的研究發現（c〇le ΑΜ 過去已知許多抗微生物蛋白質可自脊椎動物中分離出，該 性’例如保思定(^16111>〇(：丨(|丨11)， 汉切犯术祗禦致病源。魚類 交，這些黏液具有殺菌的特 最早是由比目魚的體表黏液 et al· J Biol Chem 272: 1 2008-1 3，1 997)，為玉種比目魚 中的抗微生物蛋白質，是一種具有25個胺基酸基團的胜肽， 存在於體表的黏液中，具有對抗微生物的活性。 這種具有對抗微生物的蛋白質，也在不同的生物中被發 現’例如鲽魚。在鲽魚中所發現的抗菌蛋白，其具有一段活 性區域，胺基酸序列為GWRTLLKAEVKTVGKLALKHYL，此段區域 可對抗革蘭氏菌及真菌的感染（patrZykat A. et al.

Antimicrob Agents Chemother 47: 2464-70， 2003)。 近年來’ Yin等人在石斑魚中發現了 一段類似抗菌胜肽的 cDNA 序列，命名為 epinecidin-l(Yin ZX. et al. Aquaculture 253: 204-1 1，2006)。但並沒有在組織中證明 1299335 層脂質體’多層脂質體’或球形體中製成。此組合物可影響 生理狀態’溶解度，體内釋放的速率，以及體内清除之速率。 組合物之選擇可依據該抗菌蛋白的物理化學特性而決定。有 關醫藥組合物的給付式’可由在此領域具通常知識者依 據該組合物的物理化學特性而決定，包括但不限於，口服， 腹腔注射’皮下注射’靜脈注射，肌肉注射，

在本發明之實例中，該醫藥組合物經由腹腔注射。’ 在本文中，該術語「動物」包括所有動物種類，例如水生動物及哺乳類動 物。在-實施例中’該水生動物為魚類。該哺乳類動物係指任何被定義為 哺乳類的動物，包括人類。較佳情況下，該哺乳類動物為人類。 在本文中’「水生動物的微生物感染」係指任何可導致水生動物活動力 下降或死亡的病原’例如_感染。這些主要病原多為水中環境的常 在囷’其中最常見的是弧菌。在_實施例中，以死亡率作為判斷感染結果 的依據，且造成此感染之細菌為創傷弧菌。 在本文中，「感染性疾病」係指與感染相關的疾病，包括由病源感染直 接造成的（如細菌感染），或是在疾病進行中所併發的感染症狀，例如免疫 功能低下所導致的·，都在本發鶴_範圍巾。在_實施例中，該疾 病為綠膿桿菌引發的敗血症。 本务明有關於^又胜肽片段及其醫藥組合物，其包含一段序列編號 辱或序列編號2之胺基酸序列，及其具活性的變異體。根據本發明之一 汽施例，該二胜肽片段命名為石斑魚抗菌蛋白〜3。在此所述的活性 為對抗微生物感染的活性，特別是細菌。序列編號丨或序列編號2的胺基 1299335 酸序列係來自本發明中選殖的cDNA。於本發明之一實施例 中，以其他水生動物已知的抗菌蛋白密碼設計引子，以石斑 魚cDNA資料庫為模板，進行PCR放大後，得到石斑魚抗菌蛋 白〜3的cDNA，將此序列以insightII程式的同源模式分析 其最小能量（Accelrys，SanDiego，CA，USA)，得到其結構 模型，得序列編號1或序列編號2的胺基酸序列，認為是具有活 性的片段，即本發明胜肽片段。 石斑魚抗菌蛋白-3的結構模型中，石斑魚抗菌蛋白—3被預 测為兩性分子的α-螺旋狀結構，與其他抗菌蛋白類似，其功 能為在微生物上形成孔洞，造成滲透壓不平衡而導致微生物死亡。在分析 多肽的特性之後，推測出石斑魚抗菌蛋白—3應在細胞質内被傳 送。此結果暗示石斑魚抗菌蛋白—3應由細胞内傳送至細胞外 分泌，以對抗感染。石斑魚抗菌蛋白-3的胺基酸序列具有一 個核仁位置訊息（NLS)，NLS可能與先天性免疫的訊息傳導有關，因 為NLS不只出現在所有抗菌蛋白中，也在其他具有調節功能的分子中出現 (Schedlich LJ· et al. J Biol Chem 275: 23462-70， 2000)。 當考慮本發明的胺基酸序列範圍時，所有本發明所述實施 例中包含序列編號：1及序列編號：2的蛋白質或胜肽的胺基 酸序列，均包括在本發明範圍中的胺基酸序列中，舉例來說， 本發明中提及兩段合成的抗菌蛋白一3胜肽（g-pie 5 —34)與 (g-pie 5-25)，皆在本發明所涵蓋範圍内。進一步包括根據 本發明以上所述，併入保留性胺基酸置換之胜肽之所有胺基 酸序列。進一步包括更大蛋白質之胺基酸序列，該蛋白質併 入本發明中含有序列編號·· 1或序列編號：2的該蛋白質或胜 1299335 狀’包括融合蛋白，以及併入訊息胜肽的未成熟蛋白質。 本發明利用其他方式證明該胜肽片段具有對抗微生物的 活性’例如RT-PCR或組織染色。分析此可編碼為此胜肽片段 • 的基因或其產生的蛋白質在不同組織的表現量，由組織分佈 的情形顯示，此基因或蛋白質主要表現在接觸外來物的器官 中，如石斑魚的頭腎，皮膚及小腸中。另外以病源分子刺激 後’該基因表現量也上升，更證實了該已分離之蛋白質胜肽片 > 段具有對抗微生物的活性。以藥物動力學分析抗菌蛋白-3胜肽在血 清中的濃度，顯示其具有良好的反應速率，不會黏附在水生動物及哺乳類 動物鈐血管壁上，具有隨著血液循環全身的特性，符合藥物開發的 特色。 _ II本發明胜肽片段具有在水生動物内對抗細菌感染的活 1 性’例如創傷弧菌感染。在一實施例中，以合成並純化的兩段石斑魚 抗菌蛋白-3胜肽片段，即具有序列編號：丨與序列編號：2胺基酸序列之 本發明胜肽片段，進行抗菌活性測試。該胜肽片段可有效對抗革蘭氏陰 > 性菌及革蘭氏陽性菌，顯示此胜肽片段具有高度的抗菌活性，且以此胜肽 片段達到相同抗菌效果，比表現全長蛋白質序列所需成本更低。 在另一實施例中，在石斑魚中注射p〇ly( I):p〇ly(C)以觀察抗菌蛋 白-3的mRNA表現量。p〇iy(i):poly(c)是類似RM的聚核酸 (Polynucleotide)，由兩條同性聚合物（H〇mo p〇lymers)組成；其中一 邊是聚核糖次黃嗓吟核酸（Polyriboinosinic acid)，另一邊是聚核糖細 胞嘧啶核酸（Polyribocytidylic acid)。每一邊的鏈狀結構就像自然存 11 (Η ) 1299335 在的RNA -樣。兩條單鏈之間靠氫鏈結合起來。人工合成的核酸 p〇iy(i):p〇iy(c) ’能夠刺激細胞合成如干擾子（Interfer〇n)的蛋白質， 保護其他細胞不受病毒的感染。在本發明的實例中，利用p〇ly⑴:吨⑹ . ?丨發抗g蛋白-3的表現’顯示本發明胜肽片段也具有抗病毒之活性。 另一方面，本發明有關於一種具有對抗水生動物（例如魚或蝦） 賴生物感染活性之醫藥組合物’其包含—段分離之蛋白質及 , 其具相同活性的變異體，其中該分離之蛋白質包含序列編號】或序列編號 鲁 2之胺基酸序列。在_實施例中，藉由以創傷弧誠染吳郭魚及石斑魚的 實驗本發明所使賴魚類感染模式，為在此領域所熟知的方法，包含只以 腹腔注射創傷弧菌的對驗，及以腹腔注射創傷弧菌與本發明胜肽片段的 不同實驗組’本發明胜肽片段的劑量為每條魚〇. i料。最後以魚類的死亡 率判斷本發明胜肽片段對於細菌感染的保護效果。而該胜狀片段確實可 降低水生動物受微生物感染之死亡率。 另方面’本發明有關於一種具有預防或治療哺乳類動物的感染 • I疾病活性之醫藥組合物，其包含一段分離之蛋白質及其具相同活性的 - 變異體，其中該分離之蛋白質包含序列編號1或序列編號2之胺基酸序 丨根據本發明之具體實施例，湘動物模式，以腹腔注射本發明胜肽的 Ί、、、、且及以腹腔注射綠膿桿菌與本發明胜肽片段的不同實驗組。最後以 死亡率判斷本發明胜肽片段對於細菌感染的保護效果。而該蛋白質胜狀 片段可在哺乳類動物受細菌侵襲時降低死亡率，因此可作為

12 1299335 下反應兩分鐘，72 °C下反應兩分鐘，共35循環；之後將PCR 反應的結果以2%洋菜膠分析。引子序列如下： P1 ·· 5’ -TCAAGCTTCGATGAGGTGCATCGCCCTCTTTC (序列編號： 3) 以及， P2 : 5’ -CGGGATCCTCAGGCAAAAGCTTTCTCTCGTTC (序列編號： 4) 。 引子序列為根據已知的比目魚pleurocidin密碼區域而設計 (登記編號：AY273181 與 AY273180)，美洲擬鲽 ⑽(登記編號：AF301515 與 kY?>Q\b\2)，美 f 綠 Glyptocephalus cynoglossus (登記編 號：AY273177)，美洲黃蓋 0$ Umanc/a ferrugjfnea (登記編 號：AY2731 75)，以及石斑魚及 (EST clone，登 記編號：BQ096584)。經過PCR放大後，將樣品從洋菜膠上萃 取出來，並接入載體 pIRES2-EGFP 中（BD Biosciences, San Jose，CA，USA)。隨機選擇菌落並以載體的引子將雙股都進 行定序。含有保留性序列的多肽，以psort軟體（可在網站上 取得 http ://psort. ims, u-tokvo. ac. jp/form2. html)進行 訊息胜肽在細胞内運送的分析。 實例一：分離RNA並以RT-PCR定量mRNA的表現量 收集五隻石斑魚（體重大約5公斤）的組織，以下列步驟萃取RNA(Chen JY. et al· DNA Cell Biol 17: 359-76，1998)。在組織分佈實驗中，收集血 液，鰓，心臟，頭腎，小腸，肝臟，肌肉，以及皮膚，以相同方法得到織 RNA。藉石斑魚抗菌蛋白—3的mRNA表現，以相對即時定| +

15 1299335 錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)分析在不同組織的分佈情形。在以等量脂質多 醣LPS刺激(每隻魚5純魚的平均重量為1〇克），與不同量脂質多酷哪 刺激後(每隻魚50，1G，5,與1㈣，分析組織分佈情形。在以不同量 p〇ly(I):P〇ly(C)-刺激的實驗中，濃度為每隻魚〇1，丨，5，以及1〇 #g。 在注射LPS或poly(I):p〇ly(C) 360分鐘後萃取總舰。 將mRNA轉錄為cDNA，並以cDNA進行RT_PCR分析抗菌蛋白及冷—actin 的表現量。Taqman probe以及引子均根據ABI的步驟設計（AppUed

Biosystems，Perkin-Elmer Coid，Boston，ΜΑ 02118, USA)。所有樣品都 進行二重複的實驗。PCR反應以AppliedBiosystems系統（7000序列偵測 系統）即時PCR儀器及GeneArop序列偵測系統軟體進行。反應中包含5 # g 不同組織的總RNA。相對定量RT-PCR的Mastermix試劑（Applied Biosystems，Perkin-Elmer)用作定量之用。在每個反應盤中均包含cdna模 板，Taqman probe，Mastermix試劑，以及反應緩衝液。石斑魚抗菌蛋 白-3的即時定量PCR引子序列如下： 正向引子catcgccctctttcttgtgttg (序列編號：5)以及 反向引子ccctccccgggttcag (序列編號·· 6); 石斑魚beta-act i η基因： 正向引子ccagccttccttccttggt (序列編號：7)以及 反向引子 gcacttcatgatgctgttgtaggt (序列編號：8); 石斑魚Mx基因： 正向引子 tggtcaaggagcagatcaaacag (序列編號：9)以及 16 1299335 反向引子 aacgccttcctaacagtatctccta (序列編號：1 〇)。 總反應體積為25 //1，該反應在96孔盤進行，並在96 °C下反應15 秒，60°C下反應60秒，共40循環。以65°C為起始溫度進行 分解反應，以分析PCR產物的分解溫度。以平均值±標準差表示n 個實驗的結果，η代表每種RNA來源的實驗次數。以SAS統計軟體分析其組 間差異，p (*)<〇· 〇5或；7 (**)< 〇.〇1為具有明顯差異。

利用相對性即時RT-PCR，可決定抗菌蛋白-3 mRNA在不同 組織的表現量，結果如圖1 A所示。每個數據皆以h mRNA的表現量正常化。如圖1A中所顯示，抗菌蛋白〜3在頭 腎，小腸，以及皮膚的表現量最多，此結果顯示抗菌蛋白一3 基因的局部作用。圖1B顯示在Lps刺激後，抗菌蛋白—3心難 在不同組織的表現量。在以Lps刺激六小時後，在頭腎部位 的抗囷蛋白-3以及皮膚中的Mx mRNA最早被偵測到。為了解 LPS及p〇ly I ·· poly c對石斑魚抗菌蛋白-3表現量的調節作 用，在石斑魚中注射不同劑量的[以或p〇ly I: p〇iy c ， ▲ wv刀竹七级黑机囷蛋白的表現 里如圖2Α所不，相較於對照組（不經處理）魚類，在5〇 # g ml LPS作用下，抗菌蛋白的表現量在穩定狀態下增; 倍。在圖2B中，相认此丄rm , / . 四 …-為口 ϋ的衣巩置隹穩定狀態下增 倍。在圖2Β中’相較於對照組（不經處理）魚類，在“g/, 作用下’抗菌蛋白_3的表現量在穩定狀, 旦 一、、口果顯不石斑魚抗菌蛋白-3的基因表, 置會在lps及D0】vm ，/ 的處理下增加。

(S 17 1299335 14些結果可支持石斑魚抗菌蛋白—3表現後往皮膚運送，以 對抗微生物的假設，且在先天性免疫的第一線扮演重要的角 色。在本發明中也發現，石斑魚抗菌蛋白—3的表現，也會與 1^3及？〇17(1):13〇17(〇刺激的劑量成正比。雙股跗“化肋幻 是病毒感染時的分子模式，因為在大多數病毒複製時，會製 造雙股RNA。在本文中，也發現石斑魚抗菌蛋白—3可辨認雙 股RNA，並在基因活化後進一步引起Μχ基因的活化。此結果 表示石斑魚抗菌蛋白-3基因不只受LPS的刺激，同時也避免 宿主受到病毒的感染。這些結果顯示抗菌蛋白可對抗細菌與 病毒的感染。 根據推論的胺基酸序列合成兩種不同長度石斑魚抗菌蛋白 -3的本發明胜肽片段： 石斑魚抗菌蛋白-3 ( g-pie 5-34)，序列為 GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLVTRRRHGVEE(序列編號：1);以及 石斑魚抗菌蛋白-3 (g-ple 5-25)序列為 GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLV(序列編號：2)。 實例二：石斑魚抗菌蛋白-3於石斑魚體内分佈之分析 多株抗體镅借 多株抗體委託創生生物科技股份有限公司代為製作（台北， 台灣）。簡單來說，為了讓根據本發明合成的抗菌蛋白一3 (g-pie 5-34)胜肽片段與攜帶蛋白質結合，在兩隻兔子中 以皮下注射每隻打入i mg胜肽與完全弗氏佐劑（CMWde Freund’ Sadjuvant)1混合的劑量。接下來每隔十四天注射 18 1299335 胜肽與完全弗氏佐劑的混合物，共五次。在第五次注射的一 週後，收集兔子的血清抗體並以胜肽親合性方法純化。以西 方墨點法測試血清抗體對抗根據本發明胜肽片段之活性。 組織免疫染氙方法 • 結織免疫染色實驗中，取得魚肥，小腸，心臟以及頭腎 後立即以4/β已緩衝之中性福馬林固定24q分鐘，經過脫 . 水以及石臘包埋。將石斑魚組織連續橫向切片後(5 ”)，在 • 二甲苯中脫臘並再水化(rehydrated)。再水化後，以擰檬酸 • 緩衝液⑽值6.0)在95飞下預先處理切片10分鐘，並在 室溫下在含有3%過氧化氫的甲醇中靜置3〇分鐘，以阻斷内 生性的過氧化酶活性。將鏈黴和素（strepavidin)阻斷溶液 與生物素（biotin)阻斷溶液分別靜置15分鐘，之後以浸潤緩 衝液清洗。利用5%BSA阻斷該溶液5分鐘，再以浸潤緩衝液 清洗5分鐘。加入以1: 5稀釋的多株抗體或事先採血的血清 抗體，與切片在25 下靜置60分鐘，之後將之清洗。將二 級抗體（結合生物素的抗兔子IgG)加入樣本中靜置3〇分鐘， • 之後以浸潤緩衝液清洗。在玻片中加入鏈黴和素HRp 3 〇分鐘 後’以浸潤緩衝液清洗。加入染色試劑（DAB)丨〇分鐘後顯色， 再β洗一遍。加入蘇木精（hemaf〇Xy 1 in) 1 〇分鐘以作為對比 染色’且將該玻片以Scot ter’ s溶液清洗以增強顏色。在連 縯酒精中將切片脫水，並浸入二甲苯清洗。最後將載玻片固 定劑滴在玻片上，蓋上蓋玻片。以附有CCD照相機（DXM —1 200, Nikon)的 Nikon (Tokyo, Japan) E 600 顯微鏡拍攝顯微照 片0 19 1299335

Mi 為决疋石斑魚抗菌蛋白一 3在組織中的表現，以免液染色方 法偵測不同器官中的表現量，結果發現石斑魚抗菌蛋白—3在 鰓絲表皮細胞與小腸表皮細胞中金清中的多株抗體有強烈的 免疫反應（圖3 )，證實石斑魚抗菌蛋白—3存在石斑魚小腸與 鲶中。與事先採血的抗血清實驗比較，在鰓與小腸的表皮細 胞中並無染色反應。無論心臟或頭腎都沒有任何親和性純化 血清多株抗體或事先採血的血清抗體，對抗菌蛋白—3的免疫 反應。在石斑魚中，抗菌蛋白一3可能在消化道與氣體交換器 官扮演一個重要的角色，用於抵抗外來微生物的侵犯。 實例三：抗菌活性分析 达l—目魚pleurocidin胜肽輿兩段石斑裊抗链蛋白一 3之合成 該等胜肽由Genesis Biotech公司利用Fmoc化學固態流程 合成。萃取粗製的胜肽，冷凍乾燥，之後以反向高效液態層 析（RP-HPLC)純化。以純化胜肽之分子量及純度分別由質譜儀 及HPLC分析。合成的胜肽放置於磷酸鹽緩衝液中（PH值7. 4) 備用。該合成之比目魚 pleurocidin 胜肽序列為 GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL ;而根據本發明之石斑魚抗菌 蛋白 -3 (g-pie 5-34) 序 列 為 GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLVTRRRHGVEE(序列編號：1);以及石 斑魚抗菌蛋白 -3 (g-pie 5-25)序列為 GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLK序列編號：2)。 體外抑菌分极· 20 1299335 g-plew5 ··石斑魚抗菌蛋白以（本發明具有序列編號· 2之脞妝Μ ί；Μ wf-ple ··比目魚pleuroddin胜肽 · <肚肌/i仅y ΝΑ:不活化

微生物 g-ple 5 革蘭氏陰性菌 pg/ml Enterobacter aerogenes (BCRC10370) 25 Enterobacter cloacae subsp (BCRC10401) 100 Grouper vibrio alginolyticus 3.125 Klebsiella oxytoca (BCRC 13985) 12.5 Salinivibrio costicola subsp (^CRC12910) 3.125 Vibrio vulnificus (YJ016) 6.25 Vibrio harveyi fBCRC13812) 3.125 Vibrio harveyi (^CRC12907) 25 Vibrio vulnificus (204) 6.25 Vibrio alginolyticus fBCRC 12829) 6.25 Pseudomonas aeruginosa fATCC 19660) NA Yersinia enterocolitica subsp (BCRC 13999) 100 g-ple 5-25 MIC wf-ple MIC pg/ml pg/ml 50 50 100 >100 12.5 6.25 100 50 12.5 3.125 50 50 12.5 3.125 12.5 6.25 12.5 6.25 12.5 6.25 60 45 100 50 1之胜肽片段） 2之胜肽片段） g-ple 5-34 :石斑魚抗菌蛋白„4 (本發明具有序 g-plew5 :石斑魚抗菌蛋白纟·2“本發明具有序 wf-ple :比目魚pleur0Cidin胜肽 观 NA:不活化 在本發:的結果輸’本發明兩财同蝴胜肽片段均 蘭氏陰性囷及革蘭氏陽性菌的殺菌活性， 平 所不，本發明月生肽片段(石斑魚抗菌蛋白—3胜狀心囷治性，如表i 5 25)在體外實驗中具高度活性，顯示其潛在抗菌功敦。5 34 ^ δ-ρΐ6 中，細菌注射前，單敝射—次本發明胜肽片段，可^時切駿内實驗 之功放。預先以本發明胜肽片段處理也可以提高魚類存活率、隻房每·

23 1299335 在Balb/c老鼠（約19〜21克重）腹腔中打入128 χ i〇6 cfu的綠勝於 菌，60分鐘後，分別在老鼠腹腔中注射2/干 的石斑魚本發明胜肽片段或每隻老鼠1〇〇 Vg萬古霉素。注射後的2小時、 _ 4小時、6小時，犧牲老鼠取一段丨公分的小腸，浸泡在1〇〇w哪中研 .冑，而後稀釋®液並塗在培養皿上，放人37°C培養箱，96G分鐘後計數菌 落數目。 結果 •如圖4所示，本實驗可驗證本發明胜肽片段在腸内抑制細菌的能力。在 以腹腔注射25 的本發明胜肽片段240分鐘後，與注射1〇〇 萬古 霉素的效能幾乎相近。顯示石斑魚抗菌蛋白-3有可能用來作為取代抗生素 的天然物質。 實例四：本發明胜肽片段對吳郭魚及石斑魚的保護效果 魚類實驗模 .利用一種創傷弧菌（204 ;從死去的吳郭魚中培養）的致死 模式來測試本發明合成的石斑魚抗菌蛋白-3 (g~ple 5_25) 势责八 Oreochromis mossambicus)反石抵旁、{E· co/o/i/es)對抗嚴重感染的功效。每組的第一項測試需要50 隻吳郭魚（平均體重〇·2 g，身長3公分）：（a)第一組只注 射創傷弧菌（厂· ; (b)在第二組中，同時注射 創傷弧菌與石斑魚抗菌蛋白―3 (g-pie 5-25)胜狀的浪合物； (c)第三組以創傷弧菌預處理18 0分鐘後，注射該石班魚抗 菌蛋白-3 (g-pie 5-25)胜肽；（d)第四組以石斑魚抗菌蛋白 24 1299335 -3 (g-Ple 5-25)胜肽預處理18〇分料，注射創傷弧 第五組只注射PBS;以及⑴第六組只注射石斑魚抗菌蛋二 (g-Ple5-25)胜肽。第二項測試，每組包含3〇隻石斑 均體重0.2g，身長3公分赞 L ^ 身长^刀）.（a)第一組只注射創傷弧菌厂 叫b)在第二組中，同時注射創傷弧菌與石斑备 抗菌蛋白-3 (g-ple 5-25)胜狀的混合物；⑷帛三組㈣ 傷弧菌預處理60分鐘後，注射石斑魚抗菌蛋白_3 5-25)胜肽；（d)第四組以石斑魚抗菌蛋白_3 (g—pk 胜肽預處理60分鐘後，注射創傷弧菌；（e)第五組只注射 PBS ;以及（f)第六組只注射石斑魚抗菌蛋白_3 (g_pi e卜％ 胜肽。所有實驗均從肛門以腹腔給予，且石斑魚抗菌蛋白3 (g-ple 5-25)胜肽的劑量為每條魚〇. j # g，在1〇 “ ^中戋 單獨^射PBS。創傷弧菌（204)的接種為每條魚注射〗〇#}，丄 X 10 cfu。魚類維持在5-L的水槽中，溫度約為27 γ。每 日紀錄其死亡率，且每日兩次以手餵食魚類商品化飼料。死 亡率圖示以百分比（％)表示，組間差距以Fisher精確檢定法 (Fisher’ s exact test)分析及測試。 强護魚類感染效旲 創傷弧菌㈣//7///^幻（2〇4)為陳俊堯助理教授 (慈濟大學，花蓮，台灣）從死亡的吳郭魚中所分離，此吳郭 魚生長於南台灣一水產池塘。感染創傷弧菌（2〇4)的吳郭魚及 石斑魚所爆發的流行，已在台灣造成大量死亡與嚴重的經濟 損失。石斑魚抗菌蛋白-3胜肽的抗菌活性已在上述内容描 述，且在體外顯示對抗魚類病源創傷弧菌（2〇4)的優越抗菌活 25 1299335 性。因此，本發明選擇一種石斑魚抗菌蛋白-3(g-ple5-25) 胜肽，來測試其在吳郭魚及石斑魚的保護效果。在第-個實 驗中，第五組及第六組以單一劑量（每條魚O.^g，溶於 • I t，或單獨注射PBS)在吳郭魚或石斑魚中注射石斑备 抗菌蛋白-3 (g-ple5_25)胜肽。在168小時的試驗中，並益 魚類死亡(如圖5Α’5β)’顯示石斑魚抗菌蛋白-3(g-ple5, 胜肽對魚類不具毒性，且在m組中，雖然所使用的魚體型 很小，但沒有因為注射技術導致死亡的現象。然而，在⑽ 小時後’只以創傷弧菌注射的吳郭魚累積死亡率已達到 96%，而同時接受創傷弧菌與石斑魚抗菌蛋白-3 (g-ple 5_25) :肽混合注射的組別累積死亡率只有3〇%。接受該胜肽與細 囷此合的組別’比只接受細菌注射的組別死亡率明顯較低。 另外，在以創傷弧菌（2G4泣射前，先以石斑魚抗菌蛋白_3 (g-ple 5-25)胜肽注射18〇分鐘的吳郭魚，累積死亡率為 :%。然而，在以石斑魚抗菌蛋白_3 ("le 5_25)胜肽注射 珂，先以創傷弧菌（204)注射18〇分鐘的吳郭魚，累積死亡率 為78%(如圖5A)。 在石斑魚的實驗組，168小時後’只注射創傷弧菌(2〇4)的 石斑魚存活率A 0%，而注射創傷弧菌(204)與石斑魚抗菌蛋 白一3 (g-ple 5-25)胜肽混合物的石斑魚累積死亡率為3〇%。 接受胜肽與細菌合併注射的組別，比只接受細菌注射的組 別，具有顯著較低的死亡率。另外，在以創傷弧菌（2〇4)注射 蝻，先以石斑魚抗菌蛋白_3 (g_ple 5_25)胜肽注射⑽分鐘 的組別，石斑魚累積死亡㈣17%。然而，在以石斑魚抗菌

26 1299335 蛋白-3 (g-pie 5-25)胜肽注射前，先以創傷弧菌（204)注射 60分鐘的吳郭魚，累積死亡率為97%(如圖5B)。 實例五：對感染綠膿桿菌老鼠的保護效果 逢膝桿菌感染動物模式 實驗共分七組，每組20隻Balb/c老鼠(每隻大約20〜22克）。對照組：每 隻老鼠打入1· 28 X 106 cfu綠膿桿菌。12小 時後開始記錄死亡的數目。10 :每隻老鼠先在腹腔注射1〇 的本發明 胜肽片段，540分鐘後，打入1· 28 X 106 cfu綠膿桿菌。12小時後開始記 錄死亡的數目。20 :每隻老鼠先在腹腔注射2〇 //g的本發明胜肽片段， 540分鐘後，打入1· 28 X 1〇6 cfu綠膿桿菌。12小時後開始記錄死亡的數 目。25 :每隻老鼠先在腹腔注射25 的本發明胜肽片段，540分鐘後， 打入1. 28 X 106 cfu綠膿桿菌。12小時後開始記錄死亡的數目。5〇 ••每隻 老鼠先在腹腔注射50#g的本發明胜肽片段，54〇分鐘後，打入128χ1〇6 cfu綠膿桿菌。12小時後開始記錄死亡的數目。 100 ·每隻老鼠先在腹腔注射1〇〇 μ的本發明胜肽片段，54〇分鐘後，打

入1· 28 X 1〇6 Cfu綠膿桿菌。12小時後開始記錄死亡的數目。獅：每隻 老敗先在腹腔注射 的本發明胜肽片段，54()分鐘後，打人l 28 X 1〇6 cfu綠膿桿菌。12小時後開始記錄死亡的數目。 結果 如圖6所不，本實驗驗證石斑魚本發明胜肽片段可以當作預防之藥物， 防/口老鼠在細囷侵襲時降低壯率，但是必須在—個適當的濃度下，過多 27 1299335 或過y都不適g。最佳劑量為每隻老鼠25 ，而5〇#g/m〇use效率次之， 對照組老鼠並無注射本發明胜肽片段，死亡率在24小時内達到最高。 實例六·石斑魚抗菌蛋白—3 (g—ple 5—25)胜肽的藥物動力 學分析 羡物動力學分折方法 在雄性吳郭魚（體重約73.7 ± 16.2克）體内進行抗菌蛋白 -3 (g-pie 5-25)胜肽的藥物動力學分析，先在吳郭魚體内 以靜脈注射單一劑量（每條魚25 // g)的石斑魚抗菌蛋白一3 (g-ple 5-25)胜肽。在注射2〇, 30, 60, 1 20,以及180分鐘後， 測定血清中的抗菌蛋白—3 (g—ple 5一25)胜肽濃度，每個時 間點包含兩支吳郭魚的數值。在每個收集樣本的時間點，麻 醉吳郭魚並採血，離心血液樣本以獲得血清。抗菌蛋白一3 (g-ple 5-25)胜肽在血清中的濃度以LC-MS/MS決定。取含 有〇. U TFA的酸化水950 // 1以及血漿樣品50 # i加入聚 丙烯官中，並以混合器混合i 〇秒。固相萃取管柱spE cartridges (Oasis HLB 1 ml/30 mg (Waters, Milford, MA)) 以2 ml甲醇進行前處理，再調整為2 ml水及2 ml酸化水（含 有〇· 1% TFA);之後將樣品注入spE管柱中，以2 ml酸化水 (含有0· 1% TFA)及2 ml水清洗管柱。將75 χ 12〇—_的聚 丙烯官放在SPE管柱下方，樣品以〇·5 ml ACN沖出，並在 3〇 氮氣氣流吹拂下蒸發乾燥。之後將乾燥後的樣品溶解在 1 00 // 1 80%的ACN液體中，並以混合器混合6〇秒，再將樣 品溶液放入螺旋瓶中供LC-MS/MS分析。LC-MS/MS儀器包含 一個配備有樣品冷卻器（溫度設定為5 。〇的Waters 28 1299335

Alliance 2795 HPLC。質譜儀為以正向ESI模式操作的

Quattro Ultima (Waters/Micromass， Manchester， UK)。 所有儀器皆以 MassLynx 4· 0 (Waters/Micromass)軟體控 制。液態層析管柱為Luna amino管柱，顆粒大小為5 —_ ， 内後為 150 X 2.0-mm (Phenomenex，Torrance，CA)。使用 ACN與水比例為80/20 v/v，並含有1%氨水的混和液為流動 相，將樣品沖出，沖出體積為μΐ。The injection volume was 1 〇 μ 1 ·該質譜儀以正向ESI模式運作，其條件如下：毛 細管電壓為3·5 kV，錐孔電壓為35V，熱源溫度為8(rc，脫 溶劑氣流溫度為320 °C，脫溶劑器流量（N2)為每小時550公 升，碰撞能置為60 eV，碰撞氣流為氬氣。數據在SRM模式 下利用m/z 779 > 120之轉換獲得。 垄iHL魚中的分析钴类 以靜脈注射單一劑量的石斑魚抗菌蛋白_3 (g-ple 5-25) 合成胜肽到吳郭魚體内，該本發明石斑魚抗菌蛋白—3 (g—pie 5-25)胜肽顯示一下降的藥物動力學反應曲線（如圖7a)。靜 脈注射的平均最高濃度，在2〇分鐘後為1342· 13 ng/mi。注 射後半衰期約為60-80分鐘。 以體重約251〜300克的大鼠進行實驗，此每個實驗組由3隻大氣進行實 驗。分為頸靜脈（IV)(圖7B)、腹腔⑽（圖7C)、皮下（sc)(圖7D)三個不 同部位的組別，每隻注射1〇〇〇 Μ的本發明石斑魚抗菌蛋白〜3 (g-Pie 5-25)胜肽，注射後在1〇分鐘，2〇分鐘，3〇分鐘，丨小時， 29 1299335 小時’ 3小時，各採丨ml的血液，再利用&_s測試血清濃度。結果 如圖7B ’ 7C，7D所示。本實驗驗證本發明石斑魚抗菌蛋白一3 (g—心 25)胜肽並不會祕在錢血管壁上。符合在哺乳鋪侧發的特色。 除非有其他定義，本文中所有技術與科學術語的意義，為 =本I明所屬領域具通常知識者所普遍了解。在此領域具通 =头識者也會判斷本文中所述之任何類似或相等方法及材 料’以用於實施或測試本發明。 【圖式簡單說明】 田結合洋細敘述，所附的申請專利範圍，及圖式閱讀時， 將更能了解下列之發明内容， 在圖中： 圖1為長條圖，係顯示相對性RT—PCR分析特定組織(1A)以及Lps刺激後 ^ 几菌蛋白一3基因表現的結果。圖ία中各組織以字母代表，[

為肝臟Η為〜臟，κ為頭腎，G為總，M為肌肉，！為小腸，s為皮膚，B 為血液。 圖2為長條圖，係顯示相對性RT—pcR分析⑽㈤及邮c (2B)刺激後’對石斑魚抗菌蛋自—3基因表現的影響。 九圖3 &組織免疫染色照片’係顯示石斑魚肥及小腸中免疫 木色之結果。（3A)右方為靜置於事先採血的血清抗體中的石 斑魚腺’㈣照組’而左方為靜置於多株抗體中的石斑魚肥。 (B)右方為靜置於事先採血的血清抗體中的石斑魚小腸， 為對…、組，而左方為靜置於多株抗體中的石斑魚小腸。照片 中的前號指示出—個典型的染色區域。a為肥；b為小腸。 1299335 圖4為曲線圖，係顯示在以綠膿桿菌感染β—/。老鼠後， 本心月胜肽片段與100 萬古霉素具有類似在腸内抑制細菌的能力。 van以腹腔主射1〇〇料萬古霉素的老鼠；咖··以腹腔注射25料本 發明胜肽片段的老鼠。 圖5為曲線圖，係顯示石斑魚抗菌蛋白_3 (口^ ⑸胜狀保護吳 U5A)或石斑魚(5B)避免受創傷弧賊染致死的能力。在此實驗中共有 、、、且（a)第組只注射創傷弧菌厂· ; (b)在第 二組中，同時注射創傷弧菌與石斑魚抗菌蛋白—3 (g—ple5 — 25) 胜肽的混合物；（c)第三組以創傷弧菌預處理i8〇分鐘後， 注射該石斑魚抗菌蛋白—3 (g—ple 5 —25)胜肽；⑷第四組以 石斑魚抗菌蛋白-3 (g-ple 5一25)胜肽預處理18〇分鐘後，注 射創傷弧菌；（e)第五組只注射pBS;以及（f)第六組只注射 石斑魚抗菌蛋白-3 (g—ple 5 —25)胜肽。在第三組及第四組 中，吳郭魚與石斑魚的條件不同，在吳郭魚的感染時間為18〇 分鐘，而石斑魚為60分鐘。在i 68小時後決定累積死亡率。 204 pie ·吳郭魚以每條魚1χ1〇3 cfu的劑量腹腔注射創傷弧 菌，二小時後，接受每條魚〇· 1 # g抗菌蛋白一3 (g—ple 5 —25) 的腹腔注射劑量；ple_2〇4 :吳郭魚接受每條魚〇·丨# g抗菌 蛋白-3 (g-ple 5-25)的腹腔注射劑量，三小時後，接受每條 魚lxlO3 cfu創傷弧菌的腹腔注射劑量；2〇4 + ple :吳郭备同 日寸接文母條魚〇· 1 # g抗菌蛋白—3 (g—pie 5 —25)與ixl〇3cfu 創傷弧菌的腹腔注射劑量；204 :每條吳郭魚接受1χ1〇3 cfu 創傷弧菌（204)的腹腔注射劑量；ple :每條吳郭魚接受 〇.1“忌抗菌蛋白-3 (g-pie 5-25)的腹腔注射劑量。 31

(S 1299335 圖6為曲線圖’係顯示先在老鼠體内以腹腔注射不同劑量 的本發明胜肽片段540分鐘後，再以腹腔注射丨· 28 X 1〇6 cfu的 綠膿桿菌，並觀察各組的死亡率。對照組：每隻老鼠打入1.找χ cfu綠膿桿菌小時後開始記錄死亡的數目。 1〇 :每隻老鼠先在腹腔注射10 /zg的本發明胜肽片段，54〇分鐘後，打入 1·28 X 1〇6 cfu綠膿桿菌。20 :每隻老鼠先在腹腔注射2() 的本發明 胜肽片段，540分鐘後，打入1.28 X 106 cfu綠膿桿菌。25 :每隻老鼠先 在腹腔注射25 //g的本發明胜肽片段，540分鐘後，打入1. 28 X 1〇6 Cfu 綠膿桿菌。50 :每隻老鼠先在腹腔注射50 /zg的本發明胜肽片段，540分 鐘後，打入1. 28 X 106 cfu綠膿桿菌。100 :每隻老鼠先在腹腔注射ι〇〇料 的本發明胜肽片段，540分鐘後，打八1· 28 X 106 cfu綠膿桿菌。2〇〇 :每 隻老鼠先在腹腔注射200 /zg的本發明胜肽片段，540分鐘後，打入丨28 X 1〇6 cfu綠膿桿菌。 圖7為曲線圖及長條圖，圖7A係顯示在吳郭魚體内注射單 一劑量（每條魚25# g)的石斑魚抗菌蛋白-3 (g-ple 5-25)胜 肽的藥物動力曲線圖，每個時間點包含兩條吳郭魚的數值。 血清濃度以靜脈給予後每個指定的時間點決定。圖7B〜7D係 顯示在大鼠體内注射單一劑量（每隻1 000 # g)的石斑魚抗菌 蛋白-3 (g-ple 5-25)胜肽的藥物動力曲線圖，每個時間點 包含三隻大鼠的數值。血清濃度以靜脈（7B)，腹腔（7C)，及 皮下（7D)注射後每個指定的時間點決定。

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Claims (1)

1299335 ---Ί___」,„ Β| …-| 第095145242號專利申請案 觀^ 2§修仅)正本 ϋ正申請專利範替換本(97年5月） ^^^ J 1· 一段胜肽片段，其由下列胺基酸序列之一組成： GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLnRRRHGVEE (序列編號：1)或 GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLV (序列編號：2)。 2·根據申請專利範圍第1項之胜肽片段，其中該胜肽片段具有對抗 微生物感染的活性。

3·根據申請專利範圍第2項之胜肽片段，其中該微生物為細菌。 4·根據申請專利範圍第3項之胜肽片段，其中該細菌係從以下組 成之群中選出： 李斯特菌（Listeria /H〇/7〇cy^:oge/]es)，藤黃微球菌 (#icrococcus ， 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)，腹十生鍵球菌 (vSireptococcus pyoge/ies)，無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae)，表皮葡萄球菌（S^ap/iyJococcus epjder/widis)，葡萄球菌（S^ap/jyJococcus sp.)， 木糖葡萄球菌（以ap/jyiococms xWosas)，肺炎鏈 球菌（Streptococcus pneumoniae)，金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus subsp)，腸產氣桿菌 (Enterobacter aerogenes)，陰溝腸桿菌（^terotecter cJoacae subsp.)，石斑魚溶藻弧菌（斤◦叩er Wbrio alginolyticus)，轰酸免雷伯氏 m (Klebsiella oxytoca， fehWWbrio cost/coJa subsp.)，創傷弧菌（Fibrio n/ini/icus)，哈維氏弧菌（Fibrioharv^yi)，溶藻弧菌 1 1299335 ❹7年5·原8曰修(更)正本 (Vibrio ailginolyticus)，綠痕得m(Pseudomonas aer收i/]〇sa)，以及耶耳辛氏腸炎桿菌（}fersi/7ia enterocolitica subsp)。 5. —種醫藥組合物，其包含有效量之根據申請專利範圍第1、2、3或 4項之胜肽片段，及醫藥上可接受載劑。 6. —種具有對抗水生動物的微生物感染活性之醫藥組合 物’其包含一段分離之蛋白質，其中該分離之蛋白質為由如 申請專利範圍第1項所定義之序列編號1或序列編號2之胺基酸 序列組成。 7·根據申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其中水生動物為魚 或瑕。 8.根據申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其中該微生物為細菌。 9 ·根據申睛專利範圍弟8項之醫藥組合物，其中該水生動物以 創傷弧菌F· vuhi/icus感染。 10· —種具有預防或治療哺乳類動物的感染性疾病之醫藥組合 物，其包含一段分離之蛋白質，其中該分離之蛋白質為由如 申凊專利範圍第1項所定義之序列編號1或序列編號2之胺基酸 序列組成。 11 ·根據申請專利範圍第10項之醫藥組合物，其中該哺乳動物為人 類。 12.根據申請專利範圍第1〇項之醫藥組合物，其中該感染性疾病為細 菌感染疾病。 13·根據申請專利範圍第1〇項之醫藥組合物，其中該感染性疾病為敗 血症。 2