TWI299061B

TWI299061B - Method for detecting analytes by means of an analyte/polymeric activator bilayer arrangement

Info

Publication number: TWI299061B
Application number: TW093132658A
Authority: TW
Inventors: Gao Zhiqiang; Xie Hong; Zhang Chunyan; Hong Yu Yuan
Original assignee: Agency Science Tech & Res
Priority date: 2003-10-29
Filing date: 2004-10-28
Publication date: 2008-07-21
Also published as: JP2007510154A; AU2004284367B2; CN1875113A; AU2004284367A1; WO2005040403A1; EP1685257A1; US20070105119A1; CN100590200C; TW200526788A; EP1685257A4

Description

1299061 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於分析感應器的領域。更明確而言，本發明係關於利用電極配置们則樣本中分析物的方法，該電極二特色為可形成一導電雙層分析物以及可增加該分析物在電極表面之導電性的物質。本發明亦係關於可有效進行此方法的電極配置以及利用此電極配置做為生物感測器。【先前技術】偵測和量化分析物如巨分子生物聚合物不僅為分析化學亦為生物化學、食品科技或醫學上的基本方法。至今，最常使用於生物聚合物之存在和濃度的測定方法包括利用自動放射顯影、螢光、化學發光或生物發光及電化學技術進行偵測（討論於例如如kker，毋·和 Telting

Diaz.M.(2002)Anal.Chem.74, 2781 〜2800)。然而，自動放射顯影術由於使用危險的放射化學物質故無法應用於許多的領域，同時，光偵測法通常需經過繁瑣的標示程序以及其反應劑和設備過於昂貴。另一方面，鑑於電化學偵測技術具有較高的靈敏度及較低的成本，故已成為另一種較佳的選擇。至於核酸分子的偵測目刚為應用三種主要的電化學摘測法，亦即熱導係數測量法（Park，S.J·等人（2002) ScienCe 295,1503 〜1506)、核酸插入法（Zeman， S.M•等人 1299061 (1998)Proc.Natl.Acad.Sci.美國 95，11561 〜1 1565;Erkkila，K.E· 等人（1999)0^111.1^乂.99,2777〜2795)以及藉由催化擴增法的债測（Caruana, D.J.和 Heller，A.J.(1999)J· Am· Chem_Soc」21，769 〜774;Patolsky，F· 等人 (2002)Angew.Chem.Int.Ed.41，3 3 98〜3402)〇前文中 Park等人已曾報告利用以金奈米粒子（gold nanoparticles)功能化之募核苷酸的DNA陣列偵測方法。然而，已發現此方法的偵測極限為500飛米（fM)，故無法鑑定編碼如轉錄因子或特定細胞表面受体之極稀少的核酸物種。由於大部分的DNA-插入劑不但可插入雙股DNAs(dsDNA) 亦可經由靜電相互作用和單股DNA分子結合，故核酸插入法即使程度較輕但仍經常受到低信號噪音比（signal_t〇-n〇ise) 的妨礙。然而，已合成一種和dsDNA結合'更具選擇性（但非專一性）的改良二茂鐵標示萘二亞胺縫製插入物（Takenaka，s. 等人（2000)Anal. Chem.72，1334〜1341)。目前先進的DNA生物電子學已著重於做為生物電催化劑 (bi〇electrocatalysts)之核酸/酵素共軛物的應用（^『仙⑽和 Heller，如前述；Patolsky等人，如前述）。同樣，在dna感測方法的擴增中利用核酸功能化脂質体或奈米粒子做為粒子標籤（particulate labels)。最近，已報告酵素擴增偵測法對 38_驗基募核:g：酸的债測極限為G.5飛米，其相當於約議 1299061 分子⑽ang，Y.等人（2003)Anal Chem，第咖24頁）。缺而，通常此靈敏度僅限於分析長度為2G〜5G驗基的短囊寡核苦酸。由於有較高㈣景信號故不易利㈣這些方㈣測較大的核酸分子如基因体DNAs’其在皮米_或甚至奈米之範圍内的靈敏度極低。因此，亟需一種可供選擇的分析物偵測方法，其可克服上述的限制並且甚至可在高靈敏度之下仙巨分子分析物。【發明内容】在二樣中本發明提供一種藉由偵測電極電化學偵測分析物分子的方法，此方法包括： (a)固定能在偵測電極上結合準備偵測之分析物分子的捕捉分子； ⑻以_電極接觸含準備偵測之分析物分子的溶液； (C)在偵測電極上使含分析物分子的溶液結合至捕捉分子，因而使捕捉分子和分析物分子形成複合物，該複合物在電極上形成第一層； (d)使偵測電極接觸一電化學活化劑，其中該電化學活化劑具有和捕捉分子及分析物分子所形成之複合物互補的淨靜電荷，因而在電極上形成第二層，其中第二層和第一層共同形成一導電雙層； 0)使偵測電極與能夠分別往返傳遞電子於電化學活化劑 l299〇6i 和電極之間的物質相接觸； (f)進行偵測電極的電性測定； (§)所獲得的結果和對照測定值相比較而偵測出分析物。在另一態樣中，本發明提供一種電極配置，其具有可有攻執行此處所揭示之分析物分子之電化學偵測的偵測電極，其包括： U)在偵測電極上含有捕捉分子間之複合物的第一層，其能夠結合準備偵測的分析物分子和分析物分子；以及 (b)含有電化學活化劑的第二層，其中該電化學活化劑具有和捕捉分子及分析物分子所形成之複合物互補的淨靜電荷，其中第二層和第一層共同形成一導電雙層。又另一態樣中，本發明提供一種可電化:學偵測分析物分子的生物感測器，其包括： (a) — 4貞測電極； (b) 在偵測電極上含有捕捉分子間之複合物的第一層，其能夠結合準備偵測的分析物分子和分析物分子；以及 (c) 含有電化學活化劑的第二層，其中該電化學活化劑具有和捕捉分子及分析物分子所形成之複合物互補的淨靜電荷，其中第二層和第一層共同形成一導電雙層。又另一態樣中’本發明提供一種水溶性氧化還原聚合物，其包括： 8 1299061 (a) 含有二茂鐵（ferrocene)衍生物的第一單体；以及 (b) 含具有能獲得淨電荷之（終端）伯酸或鹼、酸或鹼功能基之丙稀酸衍生物的第二單体。在一具体例中，此新穎水溶性氧化還原聚合物之丙烯酸衍生物以通式⑴為代表： ch2

CH c=o

I

R 其中 R 為選自含 CnH2n-NH2、CnH^rrCOOH、 NH-CnH2nP〇3H和NH-CnH2nS〇3H的基群，其中烷基鏈可選擇性被取代以及其中n為從〇至12的整數。又另㉟樣中’本發明提供—種製備水溶性氧化還原聚合物的方法，該方法包括：〜使含可聚合二茂鐵衍生物的第—單体和含能獲得淨電荷之具有酸或鹼功能基之丙烯酸衍生物的第二單体產生聚口反應，、中D亥來合反應為在含水酒精溶液内進行。【實施方式】如本發明發現利用電化學生物聚合物（其通常為無導活化劑可明顯改善偵測分析物電性或低導電性）的靈敏度，該 1299061 催化齊 1以溶解形式存在並且其於溶液内之淨電荷和準備# 測之分析物分子或含其之複合物為互補（即，相反）。由於具電荷故可經由層與層間的自動排列 :分析物和含其之複合物與電化學活化劑共同形成極為穩疋的雙層配置。此雙層在全部電極表面上具有，，電子交換橋’’(或”電子梭”)的功能，其可影響電極上用於痛測分析物的電流。雙層配置亦具有提供電極較大和較均勻接觸面積的優點’其和其他已知的技術比較亦具有增加本發則貞測方法之靈敏度的優點。根據本發明所述，，偵測，，-詞意指定性和定量性摘測樣本内的分析物’意即一詞亦包括判斷樣本内是否存在分析物。藉由本方法，可準確伯測出低於約丨飛莫耳（即ι〇_ΐ5 莫耳)的分析物濃度。適合本發明偵測之夺析物的濃度約為 1〇-12至1〇·15莫耳。分析物偵測的濃度上限通常約為n莫耳。應注意者為若樣本内之分析物的濃度高於l〇_n莫耳時，可稀釋該樣本而使其靈敏度落在本發明的可债測範圍内。此處”捕捉分子”一詞意指單一類型的分子，例如具有一已知核酸序列的單股核酸探針。然而，捕捉分子亦可包括不同類型的分子，例如具有不同核酸序列的核酸探針（其因此亦呈現不同的結合特異性）。此捕捉分子亦可為抗体或其他類型的蛋白質狀結合分子例如對一已知配体（ligand)具有如抗体 1299061 之專一結合特性的anticalins⑧類多戗（亦參考Beste等人 (1999)Proc.Natl. Acad.Sci·美國 96，1898 〜1903)，其可辨 _ 蛋白質狀化合物的不同表面區域（抗原決定部位 (epitopes))。使用不同類型的捕捉分子不僅可同時或連續偵測對特定類型捕捉分子具有結合特異性的不同分析物，例如兩種或多種基因組DNAs，亦可經由如核酸分子之5、和3，端或受体分子之兩個配体結合部位的不同辨識序列偵測相同的分析物，其甚至可偵測含極少量分析物複本的樣本。此處所述，，電化學活化劑，，一詞意指能活化傳遞電子於分析物和電極間之物質的任何化合物，其可結合準備偵測之分析物（具#-性較佳）並且具有較高於該分析物的電流導電性。在本發明的-具体例中，其電化學活化劑為—種聚合孽化還原介質。在本發明的某些具体例中，#電化學活化劑含氧化還原活化金屬離子” b類金屬離子的實施例包括銀、金、銅、錄、鐵、始、餓或釕離子或其混合物，其可做為陽離子而藉由靜電相互作用結合準㈣測之分析物表面上的負離子基。例如，若準備谓測之分析物為核酸時，此陽離子結合至該核酸之請子磷酸㈣幹。若_物為蛋白質時，此陽離子可結合至如天門冬胺酸或楚胺酸之酸性胺基酸的側鏈。 1299061 通$適虽的聚合氧化還原介質在分析樣本的期間必需具有可避免或實質上減少氧化還原物質之擴散損失的化學“ 構造。此非釋出型聚合氧化還原介質包括以共價鍵附著於聚合化合物的氧化還原物質。此氧化還原聚合物一般為過渡金屬（transition metal)化合物，其中氧化還原活化過渡金屬化側基為以共價鍵結合至適當聚合物的骨幹，其本身具有或不具有電活丨生其貫加例包括聚（乙烯二茂鐵）和聚（乙稀二茂鐵共丙烯醯胺）。或者，此聚合氧化還原介質可含有一種離子鍵氧馨化還原物質。通常，這些介質包括耦合至一相反電荷之氧化還原物質的帶電荷聚合物。此類型的實施例包括負電荷聚合 1 物例如Nafion⑧（杜邦），其耦合至如鐵或釕聚吡啶基陽離子 · 之正電荷氧化還原物質，或反之包括正電荷聚合物例如聚〇 _ 乙烯咪唑），其耦合至負電荷氧化還原扬質如鐵氰化物 (ferriCyanide)或亞鐵氰化物（ferr〇cyanide)。此外，氧化還原物質亦可被配位鍵結至聚合物。例如，藉由餓或鈷2,2，_雙吡❿ 啶基複合物配位至聚（1-乙烯咪唑）或聚乙烯吡啶）形成氧化還原介質。另一實施例為藉由餓4,4，-二甲基-2,2、雙吡啶基複合物配位聚（4-乙烯吡啶共丙烯醯胺）。可利用之氧化還原介質以及其合成方法述於美國專利號碼5,264，1〇4、 5’356,786、5,262,035、5,320,725、6,336,790、6,551，494 和 6,576,1〇1 〇 12 1299061 在本發明進一步的具体例中’其電化學活化劑為選自後述之新穎類型的氧化還原聚合物。簡言之，此新穎類型的氧化還原聚合物包括聚（乙稀二茂鐵）、聚（乙稀二茂鐵）共丙稀酿胺、聚（乙烯二茂鐵）共丙_及聚（乙稀二茂鐵）共丙婦酿胺基_(CH2)n-續酸和聚（乙稀二茂鐵）共丙稀酿胺基-仰* 膦酸，其中η為〇至12的整數。此處所述能傳遞電子的物質，，一詞意指在電化學活化劑活化後旎於電化學活化劑和電極之間往返傳遞電子的物質。此物質能供給和再接受電子，故可降低或增加該物質至少一原子的氧化狀態。因此，可插入或結合導電雙層而分別形成分析物/捕捉分子複合物及電化學活化劑分子。傳遞電子的物質雖用於此目的。然而，此物質亦能做為捕捉分子而具有同時傳_電子的功㊣。特別是當準備偵測之分析物為酵素基質時，更可利用電測量法偵測其轉換過程（參考實施例2)。在本發明一具体例中，其傳迗電子的物質為一種酵素或酵素共輛物。通常，可使用任何產生可偵測電流的酵素。此酵素可選自氧化還原酶之族。適合氧化還原酶的實施例包括葡萄糖氧化酶、氫過氧化酶、乳酸鹽氧化酶、醇脫氫酶、羥基丁酸酯脫氫酶、乳酸脫氫酶、甘油脫氫酶、山梨糖醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、蘋果酸鹽脫氫酶、半乳糖脫氫酶、蘋果 13 1299061 酸鹽氧化酶、半乳糖氧化酶、黃嘌呤脫氫酶、醇氧化酶、膽鹼氧化酶、黃嘌呤氧化酶、膽鹼脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、草酸鹽氧化酶、膽紅素氧化酶、麩胺酸脫氫酶、麩胺酸氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸鹽氧化酶、細胞色素c氧化酶，及兒茶酚氧化酶。準備以本發明方法偵測之分析物可為核酸、寡核苷酸、蛋白質、戗或其複合物如DNA/蛋白質_或RNA/蛋白質_複合物。此分析物亦可為募_或多醣或具有免疫性半抗原特性之游離或共軛型的低分子量化合物。此類化合物的實施例包括小分子藥物、營養素、殺蟲劑或毒素，僅列舉數例。在本發明一較佳具体例中，其準備偵測之分析物為核酸分子。因而，此處，，核酸或核酸分子，，意指基因組dna、cDna 以及RNA分子。”募核苷酸，，一詞根據本韻^明意指長度約ι〇至80個鹽基對（bp·)的較小核酸分子（DNA和rna)，其長度以15至40鹽基對較佳。核酸可為雙股但亦可具有至少一條單股區或全部為單股型式，例如導因於先前熱變性或其他偵測時使用的股分離方法。本發明一較佳具体例中，已預設準備偵測之核酸的序列，即已知全部的序列或至少其中一部分的序列。由於本發明的偵測方法具有極高的靈敏度，故準備偵測的核酸分子可取自含低複本數、中複本數或高複本數的基因組樣本。 14 l299〇6i 根據本發明方法之偵測核酸的適合捕捉分子包括核酸探針’即單股DNA或RNA分子。探針較佳為具有和標的核酸部分或全部互補的序列。核酸探針可為合成的募核苷酸或較長的核酸序列，但後者的構造不可折疊而阻礙探針和準備偵測之核酸的雜交。同時，較佳的捕捉分子為含有修飾核苷 k如攜f生物素-、異經洋地黃毒苦配体或硫醇基-標不的核酸探針。然而，其亦可使用DNA-或 RNA_結合蛋白質或物質做為捕捉分子。 _ 在本發明另一較佳具体例中，其準備偵測之分析物為蛋枭或钱這些可包括21種天然的胺基酸（包括>6西基半胱胺、酉文Μ-亦包括例如以糖殘基修飾或任何類型之轉譯後修飾的— 胺基酸。藉由本發明之方法，其亦可偵測核酸和蛋白質的複合物’例如RNA·結合蛋白質與其共輕rnA標的或轉譯因子與其各自DNA-結合功能區的複合物。债測蛋白質或钱的捕捉分子較佳為具有蛋白質或钱結φ 合活性的任何類型配体。此類配体的實施例包括低分子量酵素激動劑或拮抗劑、受体激動劑或拮抗劑、藥劑、糖、抗体或能特異性結合蛋白質或戗的任何分子。不論分析物是否具有結合活性，捕捉分子可藉由任何適當的物理或化學相互作用被固定於伯測電極上。這些相互作用包括例如斥水性相互作用、凡德瓦爾相互作用或離子 15 1299061 4目互作m共價鍵H步意指若不適合直接固定於電 β面彳才#捉刀子可藉由斥水性相互作用 '凡德瓦爾相互用或靜電相互作用或藉由鍵合物分子的共價鍵連接而被固定於電極的表面。亦可利用對捕捉分子具有結合活性的分為鍵〇物刀子’然後藉由非共價鍵相互作用結合至鍵合物刀子的方法固定該捕捉分子，即複合物形成作用（參考實施例2,其中以葡萄糖氧化酶分子做為捕捉分子）。本發明方法可利用技藝中已知之實質上具有叫貞測或工作電極的任何電極配置。此電極配置通常亦具有一反電極以及-參考電極。偵測電極可為一般的金屬電極（金電極、銀電極等）或由聚合材料或碳所製成的電極，可視需要修飾電極表面以利於捕捉分子的岐。具有㈣電極的電極配置亦可為-種塗佈金層和氮化矽層之常用的矽或戽化鎵基板，其隨後藉由習知的光蝕刻和蝕刻技術而形成其電極配置。在構造上偵測電極和反電極之間視使用的技術以及準備偵測之分析物類型而有不同的距離。電極間的距離通常為從約5〇微米至1，000或數仟微米。根據本發明的方法在單一次測定令亦可同時或連續偵測超過一種以上類型的分析物。依此目的，可使用如此處所揭示之具有多數個電極配置的基板，其中不同類型的捕捉分子固定於各別電極配置的電極上，各捕捉分子對特定準備偵 16 1299061 測之分析物具有（特異性）親和力 $ 亦可使用多數個僅具有一種類型之捕捉分子的電極配置。 …用於本發明方法之電極配置的實施例為習知的曰又里(lnterdlgItated)電極。因此，可利用—種具有多數财叉型電極，即電極陣列，的配置進行平行或多重測定。另一曰種可使用的電極配置為一種形成溝槽或凹槽的電極配置法’其藉由例如將能結合分析物之捕捉分子固定於金層相反兩邊壁上的固持區而形成。曰技術塗佈捕捉分子本發明方法的第一步驟包括將能結合準備偵測之分析物固定於電極的表面。可利用任何技#令f知的—般技術固定捕捉分子。若進行多種分析物㈣測，射利用例如嘴墨為減少背景信號，視需要可單獨或配谷捕捉分子加入阻斷劑。當個別加入時，為避免未結合分析物分子之捕捉分子和電化學活化劑產生非特異性的相互作用，可在配製溶液前或在電極（塗佈捕捉分子）已接觸樣本溶液之後加人阻斷劑。適合此用途之阻斷劑為可被固定於電極上並且能阻止（或至少可明顯減少）捕捉分子和分析物分子間相互作用的物質。此類阻斷劑的實施例包括硫醇分子、二硫化物、诖吩衍生物和聚T土吩衍生物。可特別有效用於本發明的一種阻斷劑為硫醇 11 -硫醇分子，例如16-硫醇基十六烷酸、12_硫醇基乙烷酸 17 1299061 基癸酸或10-硫醇基癸酸。然後使3準備彳貞測之分析物分子的溶液如電解液接觸電極而使刀析物分子結合至捕捉分子並且在電極表面上形成第一層。若溶液内含有多數種準備偵測的不同分析物時，則選擇使該分析物能同時或依序結合至其各自捕捉分子的環境條件。在分析物分子結合至捕捉分子之後，可從電極上除去未結合的捕捉分子。未結合之捕捉分子的移除雖然可視情況而定但通常有其需要，因為某種捕捉分子（例如募核苷酸）不僅能結合準備偵測之分析物亦可和增加該分析物之導電性的物質（例如可還原金屬陽離子）相結合，因而干擾電化學的測定結果。可利用酵素法除去未結合的捕捉分子。若捕捉分子為DNA探針日守’其可利用如綠豆（腿μ 核酸酶、核酸酶pi或核酸酶si之酵素選擇性地破壞單股DNA。若捕捉分子為低刀子里配体時，這些配体經由一種酵素性可斷裂共價鍵而固定於電極上’例如經由一種酯鍵。此時，可利用例如羧基醋水解酶（S旨水解酵素）除去未結合配体分子。此酵素可選擇性地水解電極和未結合配体分子之間的酯鍵。對照之下由於減v鍵結的立体可接近性故仍可完整保留電極和配体分子之間以钱或蛋白質結合的醋鍵。然後使偵測電極接觸電化學活化劑，其準備偵測之分析 18 l299〇6l 物為經由特異性捕捉分子固定於電極上，因而使催化劑結合 :該分析物而產生電導性。電化學活化劑具有與捕捉分子和刀析物分子所形成之複合物互補的淨電荷，因而在電極上形成第一層，其中第二層和第一層經由靜電的自動排列而共同形成穩定的導電雙層。此外，偵測電極與能夠分別往返傳遞電子於電化學活化劑和電極之間的物質相接觸，其有利於或甚至可放大分析物和電極間的電子傳遞。電化學活化劑在接觸電極配置之前或在已結合至電極配置之後’能傳遞電子的物質可和電化學活化劑同時加入。可使用任何可傳遞電子的物質，其在被電化學活化劑活化時（及視需要在基質分子存在下）能往返電化學活化劑而進行電子的傳遞。因此，合至導電雙層而形成於電極表此物質可附著、插入或結面。在本發明一較佳具体例中’此物質為-種酵素或酵素共輛物。導電雙層的層與層共軛構造可明顧減少或甚至消除能傳遞電子之物質的非特異性吸附作用及靜電相互作用，因而導致較高的信嶋比和較高的偵測限度。接著，以偵測電極進行電性測量。根據本發明的電性測量包括電流和電壓的測定。然後將所獲得的結果和捕捉分子無法結合準備偵測之分析物的對照測定值相比較。此類，，對照’’捕捉分子的實施例為具有非和標的核酸分子互補戋無法 19 1299061 和準備偵測之受体分子相互作用 ^ > 他刀子1配体的核酸探針。右该兩種電性測量，即測定士樣本值”和”對照值，，，之間的差異值大於預設的閥值時，備偵測的分析物、 j判疋樣本溶液内含有準此方法亦可設計成同時測量分析物的參考值和測值。其方法為例如僅以對照介質進行參考值的測量，並且時測量認為可能含準備偵測之分析物的樣本溶液。

本發明亦係關於一種電極配置，其具有一種適合執行此處所揭示之分析物分子之電化學俄測的偵測電極，其包括: ⑷固定於偵測電極上的第一層’其含有能結合準㈣測之分析物之捕捉分子間的複合物，和一分析物分子；以及 03)含有電化學活化劑的第二層，其中該電化學活化劑具有與捕捉分子和分析物分子所形成之複丨合物互補的淨靜電荷，其中第二層和第—層共同形成一導電雙層。本發明一較佳電極配置中，伯測電極上形成部分導電雙層的電化學活化劑為一種能傳遞電子於分析物和電極之間的聚合氧化還原介質。其較佳之電極配置為電化學活化劑内 3有金屬離子，以及最佳之具体例為這些金屬離子為選自含報 '金、銅、韓、鐵、銘、餓、釘，及其混合物。在本發明一具体例中，其電極配置進一步含有能傳遞電子刀別往返於聚合氧化還原介質和電極之間的物質，其中該 20 1299061 物質可附著、插入或結口王谓列電極上的導電雙層。一較佳電極配置中，今 i明 ^物貝為一種酵素或酵素共軛物。可利用本發明之俏、㈧電極以及相應的電極配置物感測器。此類感測号馮生恭了應用於疔多領域例如分析化學、物化學、藥理學、微峰生于、良品科技或醫學以分析已知本内特定分析物的存在和请樣在矛，農度。例如，生物感測器可用於監測糖尿病患者的血液式 ’ 皿 ^ 夜或尿液樣本中的㈣糖，或重症加護期間的乳酸鹽H此類生物m亦可料制及定量飲水札口口或任何其他食物中的污染物。生物感測器的另—種應用方法為使用於基因定序計劃中，例如谓測疾病導因或指標之核酸多變型（SNPS)的基因或突變基因。另―方面，此生物感測器亦可用於蛋白f体學，以及用於鑑別㈣受体分子的配体。丨本發明亦係關於-種電化學偵測分析物分子的生物感測器，其包括： (a) 一偵測電極； (b) 制電極上的第一層，其含有能結合準備_之分析物之捕捉分子間的複合物，和一分析物分子；以及 (c) 含有電化學活化劑的第二層，其中該電化學活化劑具有和捕捉分子及分析物分子所形成之複合物互補的淨靜電％，其中弟一層和第一層共同形成一導電雙層。 21 1299061 本發明亦係關於新穎的二茂鐵化氧化還原聚合物，盆特別適合用於本發明之该測方法做為電化學活化劑以及任何其他已知的電化學偵測法。含二茂鐵單体通常雖然極不易進行自由基的聚合反應’但是本發明已發現可利㈣類介質穩定而輕易地製備含二茂鐵的氧化還原聚合物，例如從以過硫酸鹽（㈣ulfate salt)做為自由基起始劑的乙醇和水混合物。

、這些以二茂鐵衍生物為基礎的聚合物在均質系統中可被用做為擴散電子轉移介質。這些以二茂鐵衍生物為基礎的聚合物亦可被用做為固 :於電極表面然後附著至一蛋白質分子如酵素或抗原的介質，其經由酵素和氧化還原聚合物側鏈内之可交聯功能基間的交聯作用。 ^適合做為形成氧化還原聚合物之第一單体的可聚合二 ”鐵衍生物必需為具有不飽和鍵的側鏈，例如C-C雙鍵或二鍵或N-N雙鍵《s_s雙鍵。此類侧鏈的實施例包括以通式· 為代表的烯烴基。此雙鍵在碳鏈上可位於任何的位置亦可使用芳族基，例如苯基、曱苯甲醯基和萘基。此外， ϋ Λ a基團亦包括被取代的原子，其中以例如鹵素（如氣、氣、溪或碘）、氧或羥基取代基團内碳原子上的一或多個 | ”子。其他實施例包括炔基和二硫化物基團。在本發明聚合物的某些具体例中，其可聚合二茂鐵衍生 22 !299〇61 物為選自含乙烯-二茂鐵、乙炔_二茂鐵、苯乙烯_二茂鐵和氧化乙烯-二茂鐵的基團。這些衍生物内若含有不飽和鍵，則可使二茂鐵分子經由和另亦具有至少一不飽和C-C雙或三鍵、或N-N雙鐽或 s-s雙鍵的分子經由自由基聚合反應所產生的共聚合反應而附著至聚合物骨幹。用於和可聚合二茂鐵衍生物產生共聚合反應的第二單体，可使用能獲得淨電荷之具有伯酸或鹼功能基的任何丙烯酉文何生物。亦即，本發明可提供正電荷及負電荷聚合物，因此儘管捕捉分子和分析物分子之間形成複合物的電荷仍可確保上料電雙層的形成。通常，做為單体的適合丙烯酸何生物有兩項條件。4 了和二茂鐵衍生物產生共聚合反應，其必需具有至少-個例如纟^冑或為、《㈣雙鍵 5、雙鍵的不飽和1建。其次，丙烯酸衍生物必需分別藉由產生H +離子或藉由接受H+離子而具有Bronsted-Lowry酸或鹼的功此。犯提供Br〇nsted-L〇wry酸或鹼之功能基的實施例。括月b接又H+離子以形成帶電荷胺基、或羰基的伯胺基團， 2當酸功能性解離而釋A H +離子時能供給H +離子的硫酸 ^在此方面，應、/主意雖然本發明較佳為使用伯胺，但為了 — 電荷氧化還原聚合物故熟習本技藝之人仕亦可使用 3有仲或第二級胺基團的丙烯酸衍生物。在此方面，亦應 23 1299061 力此丨生馱或鹼雖然為第一級但不必然為終端基，其可為較短側鏈，，内，，的分支側鏈。雖…、:任何適合的丙烯酸衍生物具有酸或鹼功能基，但是做為本感測器之氧化還原聚合物的第二單体較佳為具有下列通式（I)的丙烯酸衍生物單体： ch2

CH

I c=〇

I

R 其中 R 為選自含 CnH2n_NH2、CnH2n-CO〇H、 NH-CnH2n-P〇3H和NH-CnH2n-S03H的基溷，其中烷基鏈選擇性被取代，以及其中n為從〇至丨2的整數，較佳為從〇至8。因此，其烷基可為直鏈或支鏈並且可包括雙或三鍵或環狀構造如環己基。R取代基内之適合脂肪族部分的實施例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、異戊基、己基、環己基或辛基，，僅列舉數例。此脂肪族基可進一步被取代以芳族基，例如苯基、_素原子、其他鹼或酸性基團或乳炫基。可做為取代基的舉例性芳族基包括苯基、甲苯甲醯基或紊基。_素原子可選自氟、氣或漠。適合之氧烷基的實施例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基，同時 24 1299061 甲基、 -N(甲基）2、_N(乙基）2或,（丙基）2。 η-烧基為選自—nh 在某些具体例中，本發明之氧化還原聚合物的分子量為介於約ι，_和5，_料頓之間，妹佳為介於約2测和4,0〇〇道耳頓之間。本發明已發現自由基起始劑的含量可影響聚合反應的程度。高量的自由基起始劑可明顯降低聚合反應而產生低分子I的氧化還原聚合物。此亦表示在此聚合反應過程中和一般自由基聚合反應比較僅需極少量的自由基起始劑。除自由基起始劑的使用量之外，將詳述於下之本發明製造過程中的反應劑加入順序亦影響聚合反應的效率。在本發明另一具体例中，氧化還原聚合物之二茂鐵的負載量為介於約2%至約20%之間，一般為約3%至約14%之間。本發明亦係關於一種製備如水溶性氧{化還原聚合物的方法。此方法基本上涉及可聚合二茂鐵衍生物之第一單体單位和含丙烯酸衍生物之第二單体單位的聚合反應以產生共聚物，例如伯、仲或第三級丙烯醯胺。丙烯酸衍生物具有能獲得淨電荷的酸或驗功能基。重要的是，聚合反應需存在起始劑條件下於含水酒精介質内進行。可改變單体和起始劑的加入順序。例如，可在酒精介質内混合第一和第二單体，然後加入起始劑以誘發反應。亦可在含水酒精介質内先溶解其中之一單体，然後在混合物加入 25 1299061 其他單体之前加入起始劑。了利用任何易混合於水的月曰肪族酒精如乙醇，或芳族酒至1 ·· 1(酒精/水）之間的範圍。為 3 : 1 〇有機酒精製備酒精介質，例如精如酚。其容積比通常在5: 1 在某些具体例中，其容積比約在本發明的一具体例中，二利用έ乙醇和水之含水酒精溶劑進行本方法。 ▲雖然不加入起始劑亦可進行聚合反應，但以加入起始劑 k佳’其可攻擊單体内位於不飽和鍵之富含電子的中心。因此’在本發明另一具体例並，、為藉由加入游離自由起始劑誘發聚合反應。、可使用任何的游離自由起始劑。其實施，包括無機鹽如過硫酸鹽’或有機化合物如過氧苯甲醯或i，2·-偶氮基·雙_異丁如基匕（AIBN)，其能產生稱為起始劑片段的基片段，其分別具有-個可做為自由基的未配對電子，而可攻擊單体單位内的不飽和鍵。 _ 本毛明方法的某些具体例中，其自由基起始劑為選自έ過姒自文銨、過硫酸鉀和過硫酸鈉之基團。在本备明上述的某些具体例巾，其加入之自由基起始劑的重I比為每1公克單体介於約20毫克至40毫克之間。本毛明的方法可在室溫的回流下進行，但通常在低 26 1299061 於100°C下進行。尤曰^ 在一八体例中’其聚合反應為在約60T：至 8 0 °C之間的回流下進行。聚合反應的所需時間視偵用了间祝便用/皿度及加入反應液内之起始劑的量而定。通當，取人G處从士 ♦ 口反應的時間約介於1 〇至4〇小時之間，並且較佳為約24小時。 ⑽本發明方法的一具体例進一步包括在聚合該第一和第單体之别產生一種反應前混合物，其包括：將丙烯酸何生物單体單位溶解於含水酒精介質内；然後自由基起始齊彳’以及然後將可聚合二茂鐵衍生物單体單位加入混合物。上述方法的進—步具体射，為了獲得具有適當分子量彳黏度的氧化還原聚合物，其反應前混合物之可聚合二茂鐵何生物的丙烯酸衍生物添加量較佳為約介於單体加入量的 5%至15%之間。又在另一具体例中，可聚合二茂鐵衍生物_單体單位為在加入反應混合物之前先溶解於含水酒精介質内。以為具艘實施例宜妹例1 LMA之偵測通# ’如第1圖所示之方法進行根據本發明的核酸偵測。首先’將做為捕捉分子（20)之硫醇化募核苷酸（亦攜帶一生物素修飾做為標誌）和做為阻斷劑（1 5)以降低背景之硫醇 27 1299061 刀子的混合物固定於金電極表面上（1〇)。然後，使電極接觸可犯3有標的分析物（3 〇)的溶液。隨後和其互補之含生物素標的DNA(即捕捉分子）雜交而經由印白素·生物素 (avidin、biotin)相互作用附著酵素-共軛物（5〇)。最後，透過層與層間的靜電自動排列將氧化還原聚合物（4〇)攜帶至電極表面此氧化還原聚合物層可電化學地活化結合在標的DNA 上的酵素標誌。在基質分子（55)的存在下，可測定基質在催化氧化作用下所產生的電流。此電流和樣本溶液内之分析物濃度有直接的關係。

合成利用 Dynabeads⑧mRNA DIRECT™套紅(Dynal ASA 〇sl〇, 挪威）依照製造商的指示萃取大鼠肝臟的mRNA。在20微升的總容量中以10奈克mRNA進行反轉錄作用（RT)，其含有取自Sigma-Aldrich 的1 x eAMV緩衝液（5〇毫莫耳 Tris-HCl，pH 8.3、40 毫莫耳 KC1、8.0 毫莫耳 MgCl2、}毫莫耳DTT) , 500微莫耳之各種dNTP ; 1·〇微莫耳的反義引子 (anti-sense primer)、20單位RNase抑制劑和2〇單位之強化鳥類骨髓母細胞病毒反轉錄酶（eAMV)。樣本在56°C的核酸熱循環加熱儀（基因擴增PCR系統9700，Applied Biosystems 公司，Foster市，加州，美國）内培養5〇分鐘，然後利用所 28 1299061 獲得的cDNA做為模板直接進行PCR擴增反應。在50微升的總容量中以2.0微克的RT-反應混合物進行 PCR反應，其含有取自Sigma-Aldrich的lxAccuTaq緩衝液 (5毫莫耳Tris-HCl、15毫莫耳硫酸銨，ρΗ9·3、2·5毫莫耳 MgCl2、0.1% Tween 20) ; 0.40微莫耳的各種引子；2.5單位 JumpStart AccuTaq LA 核酸聚合酶和 10 毫莫耳 dNTP(Roche 大藥廠，Basel，瑞士）。選擇兩種不同的基因做為分析物，即一種管家基因（housekeeping gene)甘油酸-3-構酸脫氫酶 (GAPDH)及一種調節腫瘤蛋白質基因53(TP53)。可利用下列的引子：GAPDH正義，5LATGGTGAAG GTCGGTGTCAA-3,（序列鑑別碼：1) ； GAPDH 反義， 5,画TTACTCCTTGGA GGCCATGT-3,（序列鑑別碼·· 2); ΤΡ53 正義，5，_ATGGAGGATTCACAGTC GGA_3·(序列鑑別碼·· 3); 以及 TP53 反義，5LTCAGTCTG AGTCAGGCCC-3丨（序列鑑別碼：4)。反應中加入不同量的生物素-16-dUTP(Roche大藥廠，德國）或生物素-21-dUTP(Clontech公司，Palo Alto，美國）以合成含生物素之cDNAs。利用下列的方法進行擴增反應：在95 °(：下5分鐘的初步變性步驟之後，在95°C下30秒、55.5°C 下1分鐘和72°C下2分鐘進行35次循環的擴增反應。72°C 下10分鐘的最後延伸步驟為確保合成完整長度的DNA鏈。 29 1299061 在擴增反應之後，在1·〇%瓊脂凝上分離PCR產物並且以溴乙鍵：（ethidium bromide)染色使其呈色（第2圖）。在第2圖中，第1和4條為未添加生物素-dUTP之對照試驗的色帶（lane)。擴增的PCR-片段分別和完整長度大鼠 TP53(色帶 1，1，176 bp)和 GAPDH(色帶 4，1，002 bp)有極一致的大小。標定時，以不同量的生物素-修飾核苷酸混合 dNTPs然後加入PCR反應混合物以檢查標定的效率（分另丨J參考色帶2和3為TP53以及色帶5和6為GAPDH)。生物素 -16-dUTP(或生物素-21-dUTP)/dTTP的比例越高則片段於凝膠上的滯留性越強。然而，增加生物素-修飾核苷酸對正常核苷酸的比例則降低擴增反應的效率，其可能導因於生物素-修飾核苷酸的大量側鏈。實施例1.2 :捕捉探針的固定和單層品質的評估

在偵測DNΑ分析物之前，藉由自動排列將做為捕捉探針之硫醇化寡核苷酸和硫醇分子的混合物固定於金電極的表面上。利用陰離子硫醇分子形成混合單層的阻斷成分以減少標的DN A的非雜交性的攝取。利用下列的捕捉探針：偵測 GAPH，5，-Ti2TTACTCCTTGGAGGCCATGTAG GJJ序列鑑別石焉·· 5)牙口 5*·丁i2ATGGTGAAGGTCGGTGTCAACGG-3’（序列鑑另|J 碼：6)；偵測 TP53 ， 5’-丁 12ATGG AGGATTCACAGTCGGA-3,（序歹|J 鑑別石馬：7)和 5，-丁12丁€ 30 1299061 agtctgagtcaggcccca-3’（序列鐘別碼·· 8);以及4故為對照，5、T12CCTCTCGCGAGTCAACAGAAACG-3·(序列鑑別碼· 9)。根據標準程序利用11 -硫酵基十一烧酸在5，_端硫醇化寡核苷酸並藉由乾淨電極浸潰於50微莫耳募核芽酸溶液内3〜16小時使其在金電極上自動排列。然後以1丨_硫醇基十一烷酸（MUA)阻斷其剩餘表面。利用光學橢圓偏光儀、接觸角和覆蓋表面測量法定期監測金電極上之混合自動排列單層的形成。全部所獲得的資料為包覆於金電極上的單一固定混合分子層。如預期，溶液内單層包覆電極和電活化物質之間的明顯電子傳遞徑路將經由穿過絕緣單層的電子通道。利用循環電量法卜八… voltametry)在含2.5毫莫耳亞鐵氰化物之〇 5〇莫耳内測定捕捉探針單層和混合單層的電子通 < 道障壁特性（第3 圖）°如第3a圖所示，Fe(CN)63-/4-的不可逆電量波 (voltametric waves)具有極大峰至峰的電位分離，在1〇〇 mVs-l為>400 mV，其和在混合單層包覆金電極之裸露金電極所測得的59 mV可逆過程相比較表示該單層可阻止電極和溶液之間的電子傳遞。主要由電子穿過單層所導致的氧化還原電流可明顯降低和失去其可逆特性。利用和餓（4,4，-二甲基 -2,2’-雙吼咬）{_(ΡνΡ_ΡΑΑ_餓）部分吡啶-複合化的聚⑺ 烯吡啶_共-丙烯醯胺）做為氧化還原聚合物等人 31 1299061 (2〇〇3)Angew Chem. Int·出版，4卜 810〜813)。然而，由於氧化還原聚合物帶有正電荷而電極則帶有負電荷，故將電極短暫’又/貝於5.0毫克/毫升的pvp_pAA_餓溶液内即可經由層與層間的靜電自動排列在電極上形成DNA/氧化還原聚合物雙層。如第3b圖所示，雙層包覆電極恰如所預期在水和pBs 徹底π洗之後以及在-〇·4ν和+0.8V之間的許多次重覆電位循環之後仍具有固定化氧化還原的高度可逆表面，而顯示金電極上具有固定化靜電雙層的高度穩定表面。此結果確認全部餓氧化還原中心可到達電極表面並且開始進行可逆非同質性電子傳遞。根據氧化作用尖峰或還原電流尖峰之面積估測結合餓氧化還原中心的總量，1.8〜8.0xl〇-10m莫耳/平方釐米，其視陰離子物質（核酸和酵素標誌）以及結合至電極的核酸量而定。其後亞鐵氰化物溶液之電量試“的結果和得自裸露金電極的結果相同（第3e圖）。由於雙層之形成故可減少電子的㈣。薄膜内存在陰離子物質並不會改變氧化還原聚合物的電化學特性。纽用和偏在初步的雜交試驗中，利用PCR擴增反應混合物做為未進-步純化的分析物。利用含生物素之GW· _A(參考實施例1.1)做為標的，以及利用含〇 1〇莫耳鹽酸的τΕ(ι〇毫莫耳Tris Ηα ’ 1 .〇毫莫耳EDTA)做為雜交緩衝液。雜交之 32 1299061 刖，在95 C下加熱5分鐘後置於冰上冷卻的方法使cDna產生變性。在55t的冰浴内進行3〇分鐘的雜交作用，其中. GAPDH cDNA被互補的捕捉探針選擇性地結合而因此固定· 於電極的表面。以雜交緩衝液重複清洗的方法除去全部非特異性核酸。然後，纟饥下使電極接觸2 5微升葡萄糖氧化酶/印白素D-共軛物（G0x_A，5毫克/毫升；ν_〇Γ實驗室，

San Dieg0，加州，美國）3〇分鐘。在以pBs緩衝液清洗三次以除去過量的酵素標誌之後，使電極接觸2·5微升pvp_pAA_ · 餓氧化還原聚合物溶液至少10分鐘然後再以pBS緩衝液清洗。、在法拉第箱（Faraday cage)内以連接pentium電腦之低噪. 音CH儀器公司的660A型電化學分析儀（ch儀器公司，

Austin，德州，美國）進行電化學的測量。‘ pBs緩衝液和含 2〇毫莫耳葡萄糖之PBS緩衝液内進行循環電流測定。使用 Ag/AgCl電極（Cyp簡Systems公司，La··，堪签斯州，· 美國）做為參考電極以及利用翻絲做為反電極。在Ο% V下進行電量測定。全部測得的電位稱之為Ag/Agci參考電極。電極和標的分析物雜交的典型循環電量圖示於第4圖。第4A圖為電極在雜交後於pBS緩衝液（曲線^内和2〇毫莫耳葡萄糖溶液（曲線b)内具有和GAPDH cDNA互補之捕捉探針的電！圖。由於雙層内含有葡萄糖氧化酶，故在葡萄糖存 33 1299061 在下觀察顯見催化電流。相較之，非互補探針無法從PCR 混合物捕捉任何GAPDHcDNA，故酵素声+ 砰京知‘無法結合至電極表面而導致無可偵測的催化電流（分马弟4B圖的曲線&和 b)。當電極組件浸潰於PBS緩衝液内時，緩衝液加入4〇毫莫耳葡萄糖之後電量計在〇·36ν(對Ag/Agci)之氧化電流增加 10.2奈安培(第5圖)。利用非互補之捕捉探針的對照實驗中，可忽略其電流的變化。此電量結果符合其循環電量資料，並且再一次確認可從PCR混合物中成功地偵測出GApDH CDNA’並且具有高度的特異性。在最適的實驗條件下，其動態範圍介於2.G飛莫耳和1.G皮莫耳之間，偵測限度為q 5q 飛莫耳。 JL掩例1」4 :偵測大氟的TP53 cDNA ；依照實施例1所述的方法合成含生物素的大氣τρ53 cDNA。在PCR擴增反應之後，ΤΡ5 3 cDNA的總量為17·2奈克/微升（22.5皮莫耳）。分析含10、50、1〇〇、200、500和800 飛莫耳ΤΡ5 3 cDNA(以ΤΕ緩衝液稀釋）的樣本。在分別加入酵素標誌和氧化還原聚合物之前藉由其互補之捕捉探針將PCR混合物内的TP53-特異性cDNA固定於電極表面（參考實施例丨.3)。在0.36V可測得一催化電流，其和 TP5 3 cDNA的量有直接的關係。如第6圖所示，電流隨著範 34 1299061 圍内TP53 cDNA的濃度而線性上升。其偵測限度為約1 ·〇皮莫耳。利用建議的方法可成功偵測出少至1，500個TP53 DNA 分子複本的樣本体積。據我們所知，此為利用電化學方法目前能偵測出基因組DNA的最低含量。實施例1.S :偵測核酸混合物内的核酸利用生物感測器偵測一混合物内的大腸桿菌1 6S rRNA 以及GAPDH cDNA，混合物内含有0.5〜1，500飛莫耳大腸桿菌16S rRNA、100〜5,000飛莫耳大腸桿菌 23S rRNA、 0.2〜2,000飛莫耳完整長度大鼠GAPDH cDNA、1〜500毫莫耳BSA和1〜100毫莫耳鮭魚精子DNA。GAPDH cDNA的製備方法為分離大鼠肝臟mRN A然後如實施例1.1所述進行 PCR擴增反應。獲得的GAPDH cDNA總量為5.0 土0.5微克。 Γ* > 最後，以pH 8·0的Tris-EDTA緩衝液1〇6倍數稀釋PCR產物0

利用下列的探針：大腸桿菌16S rRNA-特異性捕捉探針： 5 丨-GCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTC AAAAA AAAAAAAAA-3,（序列鑑別碼：10);大腸桿菌16S rRNA-特異性偵測探針：5LAAAAAAAAAAAAAAGCTGCCT CCCGTAGGAGT-3,（序列鑑別碼：11)。依照實施例1.2所述的方法將捕捉探針固定於金電極上。以大腸桿菌RNA樣本進行直接雜交作用和電化學偵測 35 1299061 (分別參考實施例1·3和1.4)。在引入葡萄糖氧化酶和氧化還原聚合物之後，在0.35V 測得的催化電流直接相當於核酸的量。非互補捕捉探針被固定於電極表面上做為對照。其測得之電量反應大腸桿菌1 6S rRNA為2.95奈安培以及GAPDH cDNA為1.65奈安培，其濃度分別相當於290飛莫耳大腸桿菌S 16 rRNA和150飛莫耳GAPDH cDNA(第7圖）。這些結果和凝膠電泳分析法所獲得的值極為一致（3 10飛莫耳大腸桿菌S16 rRNA和1 60飛莫耳GAPDH cDNA，未顯示資料）。實施例1,6 :偵測糸統的選擇性生物感測器的選擇性評估為利用上述的捕捉探針： 5f-GCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTC AA AAAAAAAAAAAAAA_3’（序列鑑別碼：10)以及下列合成的寡核苷酸··互補 Si-AAATTGAAGAGTTTGATCATGaCTCAG A TTGAACGCT GGCAAAAAAAAAAAAAACTCCTACGGGA GGCAGC-3,（序列鑑別碼：12);單一鹼基錯酉己5f'AAATTGA AGAGTTTGATCATGTCTCAGA TTGAACGCTGGC AAAAAA AAAAAAAACTCCTACGGGAGGCAGC-3,(序歹彳鑑別石馬： 13);雙鹼基錯配 5，-AAATTGAAGAGTAJGATCATG；ICTCAG AT TGAACGCTGGCAAAAAAAAAAAAAACTCCTACGGGA GGCAGC-3，（序列鑑別碼：14)(變異核苷酸以粗体和底線表示）。依實施例L2所述的方法將捕捉探針固定於金電極上。 36 l299〇61 利用二種不同DNA募核苷酸的200飛莫耳溶液在最適合序列配對的雜交環境下以丨微升進行雜交反應（分別參考實施例1·3和ι·4，但雜交溫度為53〇c)。獲得之電流反應摘錄於第8圖。偵測介質加入6〇毫莫耳葡萄糖之後最佳配對序列的電流增加為43± 〇·4奈安培（曲線a)，同時單一鹼基錯配（曲線b)和雙鹼基錯配序列（曲線勾分別為1.0± 0.3奈安培和〇3± 〇丨奈安培。因此生物感測器可輕易區別最佳配對和錯配的DNA募核苷酸。酵素基皙的相1 為測定分析物濃度和氧化電流的關聯性，將飽和量 GAPDH cDNA#捉探針固定於金電極表自，然後和1〇微莫耳含生物素的互補GAPDH cDNA相接觸。接著進行雜交反應，經由卵白素-生物素交互作用使其接一葡萄糖氧化酶/卵白素-共軛物。最後，透過層與層間的靜電自我排列將氧化還原聚口物攜▼至電極表面。在〇·35ν工作電位下利肖⑽ 7.4)做為偵測介質。如第9圖所示，至約2〇毫莫耳葡萄糖時，氧化反應電流和偵測分析物之間具有線性關係。在此態樣中應注意，用於此實施例的雙層配置和實施例^ 中完全相同。然而，當準備如實補1侧錢時，為使酵素”飽和”本發明方法必需使用極高的㈣糖濃度，換言之，必需使用極高的葡萄糖氧化速率以達到足夠的靈敏度。當準 37 1299061 備以氧化還原酶之酵素基質取代核酸的偵測時，可利用極高濃度的核酸、含互補核酸的飽和捕捉探針以及如葡萄糖氧化酶的氧化還原酶。由於電流導因於溶液内葡萄糖的氧化作用 (或一般酵素基質的氧化作用），故在偵測葡萄糖或一般的可氧化酵素基質時可利用其電流-濃度之間的關係。應注意實施例2中為以葡萄糖氧化酶分子做為捕捉分子並且同時做為能在電化學活化劑和電極之間往返傳遞電子的物質。因此，實施例2說明本發明的偵測方法，其中該捕捉分子（亦）能在電化學活化劑和電極之間往返傳遞電子。實施例3 :多俄的偵測蛋白質的偵測（類似核酸，參考實施例^摘錄於第u和 lb圖。此時，先利用硫醇分子（如Γ6_硫醇基十六烷酸）包覆 Γ 電極，硫醇分子此時以共價鍵連接捕捉分子做為一種鍵結分子。為了活化鍵合物的羧酸基團，將包覆電極浸潰於乙基一甲基胺丙基）羰二亞胺/N-羥基-琥珀醯亞胺 (EDC/NHS)的混合物内，其將和捕捉分子的胺基形成共價鍵。例如，捕捉分子可為一種抗体或對蛋白質狀分析物具有親和力的低分子量配体。然後使電極接觸被懷疑含有分析物的溶液’而形成捕捉分子和分析物分子的複合物。之後，透過層與層間的靜電自動排列使附著酵素標誌的氧化還原聚合物被攜帶至電極表面（參考第la圖）。在基質分子存在下， 38 1299061 以安培計偵測基質之他 ★、氧化作用所產生的電流。電流和樣 ^ *物，辰度有直接的關係。其亦可如第lb 所不以類似三明治免疫酵素法（_dwich初sA)進行備測。依此目的，複合物含有做為捕捉分子的抗体以及分析物為附著於對分析物亦具有親和力的第：抗体。此第二抗体可共輛至—料，例如做為能在電化學活化劑和電極之間往返傳遞電子之物質的葡葙摘L g 葡匈糖巩化_。之後，附著酵素標誌的氧化還《合物㈣帶而接觸電極表面，因而形成層與層間靜電自動排m參考第la圖）’然後可進行殘㈣測。直4 ··低分体的嘀湔利用如實例3中所述之”類似三明治免疫酵素法”，其使用抗体做為捕&分子以及該捕&抗体之含分析&的複合物接觸共軛至適當酵素的第二抗体，明顯地實質上可藉由本發明偵測任何的小配体例如藥物（可卡因、嗎啡）、營養素（蔗糖、胺基酸# )、環境有害物質（殺蟲劑如三玮、DDT等）。宜旌例~含二1 ·聚（乙浠二茂鐵"共-丙嫌酿胺）、聚（乙嫌二茂嫌_ 益二汚烯酿胺）和聚味二茂鐵-共丙烯醯胺_碏酸）共聚物葡萄糖乳化 Sf(G〇x，EC 1.1.3.4，from Aspergillus niger， 191 units/mg)為購自 Fluka 公司（CH-9470 Buchs，瑞士）。二茂鐵（Fc)、乙烯二茂鐵（VFc)、丙烯醯胺（AA)、丙烯酸（AC)、 2 -丙烯醯基-2 -甲基-1-丙烧石黃酸（“丙烯醯胺基-石黃g复”，AAS， 39 1299061 目錄號碼28,273)和過硫酸鹽為購自Sigma_Aldrich公司⑼

Luis，密蘇里州，美國）。全部其他化學物質如乙酮、乙醇和磷酸鹽緩衝溶液均屬於合格分析級化學品。所使用之溶液均製備自去離子水。利用Agilent 8453紫外線•可視分光光譜儀測定製備自試驗之聚合物的紫外線光譜。利用水中T〇y〇 s〇da高效能凝膠滲透層析法測定分子量，以及校正用標準聚（氧化乙烯）和聚 (乙烯甘油）。 11匕金^聚（乙烯二茂鐵共_丙烯醯脖、製備溶於10毫升乙醇/水（3份對丨份）溶劑混合物之含公克丙烯醯胺的三種樣本。在去氧化10分鐘之後將0·30毫升等量之0.10公克/毫升無氧過硫酸鹽溶液分別加入各樣本内。在0·05公克至0.16公克範圍内的三伤1乙烯二茂鐵溶於去氧乙醇内以形成三份乙烯二茂鐵溶液樣本，計算各樣本内加入的二茂鐵含量而得到分別為95 : 5、90 : 10和85 : 15 之乙烯丙稀醯胺-對-乙烯二茂鐵的添加比例c重量：重量）。然後將各乙烯二茂鐵樣本加入乙烯丙烯醯胺_抑制劑混合物内。在氮氣環境内於70°C下將反應混合物回流24小時。冷卻之後，將反應混合物分別以滴狀加入急速攪拌的丙酮内以沈歲氧化還原聚合物。以丙酮清洗沈殿後的氧化還原聚人物，然後利用多層次-溶解丙酮-沈澱循環的方法進行純化。 1299061 然後將純化產物在50°C的真空下進行乾燥。 (H)舍威聚（乙埽二茂鐵·共-丙烯酴）聚合物製備溶於10毫升乙醇/水（3份對丨份）溶劑混合物之含1〇公克丙烯酸的三種樣本。在去氧化1〇分鐘之後將〇3〇毫升等量之0.10公克/毫升無氧過硫酸鹽溶液分別加入各樣本内。在0.05公克至0.16公克範圍内的三份乙婦二茂鐵溶於去氧乙醇内以形成三份乙烯二茂鐵溶液樣本’計算各樣本内加入的二茂鐵含量而得到分別為95 : 5、90 : 1〇和85 : 15 之丙烯醯胺-對-乙烯二茂鐵的添加比例（重量：重量）。然後將各乙烯二茂鐵樣本加入丙烯醯胺_抑制劑混合物内。在氮氣環境内於7(TC下將反應混合物回流24小時。冷卻之後，將反應混合物分別以滴狀加入急速攪拌的丙酮内以沈澱氧化還原聚合物。以丙酮清洗沈澱後的氧化還^聚合物，然後利用多層次-溶解丙酮-沈澱循環的方法進行純化。然後將純化產物在50°C的真空下進行乾燥。製備.1·(乙烯二茂鐵雖胺基·碭酴、y合物製備溶於1〇毫升乙醇/水（3份對丨份）溶劑混合物之含1〇公克丙烯酸的三種樣本。在去氧化10分鐘之後將〇 3〇毫升等里之0.10公克/毫升無氧過硫酸鹽溶液分別加入各樣本内。在0.05公克至（M6公克範圍内的三份乙稀二茂鐵溶於去氧乙醇内以形成二份乙烯二茂鐵溶液樣本，計算各樣本内 41 1299061 加入的二茂鐵含量而得到分別為95 : 5、90 : 10和85 : 15 之丙烯醢胺-對-乙烯二茂鐵的添加比例（重量：重量）。然後將各乙烯二茂鐵樣本加入丙稀醯胺-抑制劑混合物内。在氮氣環境内於70°C下將反應混合物回流24小時。冷卻之後，將反應混合物分別以滴狀加入急速攪拌的丙酮内以沈殿氧化還原聚合物。以丙酮清洗沈澱後的氧化還原聚合物，然後利用多層次-溶解丙酮-沈澱循環的方法進行純化。然後將純化產物在50°C的真空下進行乾燥。根據一般的原子團聚合反應進行乙烯二茂鐵和丙烯醯胺及其衍生物的共聚合反應。一般的反應方程式說明於第12 圖。然而，為了成功地共聚合單体，必需注意系統内乙烯二茂鐵的終止效應（terminating effect)。乙烯二茂鐵通常在共聚合反應系統中做為基團清道夫的角色。已發現基團起始劑的夏大致上小於正常聚合反應系統的需要量。較大量的基團起如劑可明顯降低聚合反應的效率以及產物的分子量。除此之外’加入的順序亦影響聚合反應的效率。當乙烯二茂鐵和丙烯醯胺溶液中加入過硫酸鹽基團起始 Μ日寸，可發現其聚合反應低於2〇%。其可能因為反應混合物内產生二茂鐵（ferrocenium)而導致聚合反應速率的遲滞以及過早結束聚合物鏈的延長過程。如表丨所示，在最適條件下 1299061 可獲得極高的產量。表1 乙烯二茂鐵和丙烯醯胺及其衍生物的共聚合反應添加比例 (重量/重量）產量（％) 乙烯二茂鐵丨含量（％) 分子量 AA/VFc 95:5 80 4% 3,60Ό AA/VFc 90:10 72 9% 3,100 AA/VFc 85:15 56 11% 2,400 AC/VFc 95:5 75 3% 2,800 AC/VFc 90:10 55 7% 丨 2,500 AC/VFc 85:15 45 6% 2,000 AAS /VFc 95:5 85 6% 4,000 AAS/VFc 90:10 75 9% 35500 AAS/VFc 85:15 62 14% 3,000 然而，當增加乙烯二茂鐵的添加比例時可增加聚合物的產量，此表示即使在聚合反應過程中極為小心操作之下仍存 43 1299061 在基團聚合反應的終止效應。亦發現反應混合物變成藍色時的產®極低’其導因於聚合反應溶液内產生相當大量之二茂鐵之故。其添加量為3至14%之間，其添加量通常少於單体内添加的二茂鐵含量。利用7G素分析儀判定氧化還原聚合物内的二茂鐵添加里。可利用X射線能量散佈分析儀（EDX)進行分析。用於氧化還原產物之樣本上的電子束能量為12〇 keV。利用鋰漂移石夕偵測器分析樣本產生的X射線。利用凝膠滲透層析法測定氧化還原聚合物的分子量。通系’以較南的二茂鐵添加比例製備氧化還原聚合物可獲得較低的分子量以及較廣泛的分子量分佈。合成之共聚物為淡黃色的粉末物質。共聚物的分子量為介於2,000至4,0〇〇道爾頓之間。FT-IR試丨驗（請看第13圖）清楚顯不乙烯吸光度在1，650時完全消失，而表示丙烯醯胺和乙烯一戊鐵已成功被聚合以及其氧化還原聚合物已無單体而具有極高的純度。在LOOOqjOO釐米-1的區域可發現進一步的證據。在1，120釐米-1具有極強吸光度並伴隨一低吸光度時表示氧化還原聚合物内存在二茂鐵基，以及在 1，2 1 8釐米」具有強吸光度表示聚合物内具有醯胺基。紫外線 4驗可再一次確認已成功完成乙烯二茂鐵和丙晞醢胺的共 t合反應。在300奈米處的微小肩部清楚表示為共聚物内的 44 1299061 茂鐵4分（睛看第1 3圖）。氧化還原聚合物内的二茂鐵基和月女或羧酸部分具有以下的雙重功能··具有電子傳遞的氧化還原活性以及具有和蛋白質交聯的化學活性。增加乙烯二茂鐵的添加比例可增加二茂鐵基部分在氧化還原聚合物内的比例。然而，改變乙稀二茂鐵的量亦會影響水口物的產里。當乙烯二茂鐵的添加比例最低時可獲得最高的產量，此和一般在基團聚合反應中二茂鐵基化合物的性質極為一致。如表1所示，雖然聚合物内二茂鐵基部分的含量隨者乙烯二茂鐵的添加比例之增力口而增力口，但此增加不具有線性關係。已發現做為生物偵測之目的時，1〇%之乙烯二茂鐵的添加比例即足夠，其可獲得極佳的傳導性質和成本效盈。聚合反應内之起始劑的用量亦影響氧化還原聚合物的組成和產量。已發現當起始劑在每公克單体_〜4〇毫克的範圍内時可獲得極佳的氧化還原聚合物。 5·2 :取得原聚合物的滌含氧化還原聚合物的磷酸鹽緩衝溶液（PBS)内加入〇〇微克、10微克G〇x以及10微克G0x和1〇毫莫耳葡萄糖。利用第4.9版通用電化學分析系統軟体（gpes)在心⑽让公司的恒電位儀/恒電壓儀下進行電化學測定。法拉第箱内放置- 3-極電池。其電極為—（Ag/AgC1)參考電極、—翻絲反電極以及一金工作電極（表面積為7·94平方毫米）。 45 1299061 一和乙稀二茂鐵比較，合成的氧化還原聚合物在水内具有高溶解度，但是在大部分有機溶劑内則為不可溶。此特性使氧化還原聚合物適合在生物感測試驗内做為介質，而由於大部分酵素僅能在水性介㈣㈣，故特料合料酵素鍵結的生物感測試驗。第15圖為PBS内僅含氧化還原聚合物的典型循環電量圖，該電量圖顯示具有高度可逆的溶液電化學：氧化還原波 Γ於〜G.18V(對Ag/Agci)’電量圖呈限制擴散形狀，陰離和陽離子尖峰電流的波幅相同，尖峰至尖峰的電位間隔為 6〇mV，其極為接近在25t之馬、由p 的理淪值。這些氧化還 =為氧化還原聚合物内之二茂鐵基部分的氧化作用和還驗再t表示聚合物具有極佳的氧化還原活性。此電量試 …可成功地和丙稀醯胺及其衍丨生物產生共聚合的Γ ’亚且聚合物的二茂鐵基部分仍保持其電活性。PBS内的氧化還原聚合物呈實、、宠内白山實‘夜（reai S〇1Ut_)的型式，並且且有自由擴散的性質。溶液内加入不 /、有量圖，而認為單獨之氧化還原聚合物不=絲毫不影響電氧化作用。並h氧化二二 _的催化性

:會有明顯的改變。所得溶液的電化學和單獨之氧：。X “勿溶液極為相似。然而，當該溶液加 :原聚時，溶液内開始進行G〇x斜巧翁祕 $莫耳葡萄糖 U萄糖的酵素性氧化作用。 46 1299061 GOx、FAD内的梟各還原中心被轉換成fadh2。當電極電位知描通過氧化還原臂人 ^ 、Λ 口物的氧化還原電位時，氧化還原聚合物内的二茂鐵部分*曰篁被氧化成接近電極表面的二茂鐵。 GOx 内 FAD/FADH 从 > 2的氧化還原電位為_〇·36ν(對Ag/AgC1)，其返低於一茂鐵/二？§ b ^ —戊鐵離子電對（C0Uple)，FADH2附近的二戊鐵4刀將其氧化回FAD，以及氧化還原聚合物内的二茂鐵 P刀被還原成原來的二茂鐵部分。上述兩種反應形成一種示 ;第圖中的催化循環，或換言之，被GOx氧化的葡萄糖為氧化還原聚合物所仲介。口此氧化還原聚合物的催化反應如第丨3圖所示（淡灰色線條)可明顯加強含葡萄糖之溶液内的氧化作用電流。若 FADH2 K匕還原聚合物和電極之間的電子交換極為迅速時’在電化學氧化作用中可產生大量的二枭鐵部分，並且其依次被FADHj/f消耗。此即為二茂鐵部分和&葡萄糖溶液所獲知之值比較有較低還原電流的原因。這些資料證明氧化還原聚合物在酵素反應中可有效做為氧化還原介質，而使電子從酵素的氧化還原中心穿梭至電極表面。童AA·5·3 ··合成和葡萄糖氣化醢-牛4清白蛋白（GOx-BSA) 玄乙烯二茂鐵-共-丙烯醯胺的缉膜利用氧化還原聚合物和蛋白質的交聯反應研究所形成之薄膜的電化學性質。本樣本中使用酵素G〇x。選擇戊二醛 47 1299061 (glutaraldehyde)和聚（乙二醇）二縮水甘油醚（pegDE)做為交聯劑。生物級戊二醇（50%水中，產品編號〇〇8 67-1 EA)和聚（乙二醇）二縮水甘油醚（PEGDE)(產品編號03800)為取自 Sigma-Aldrich 公司。首先，將得自實施例5 · 1的聚（乙烯二茂鐵-共-丙烯醯胺）沈積於金電極上。以交聯劑修飾GOx-BSA而產生具有終端酸功能基之脂族碳鏈的GOx-BS A，其可和固定介質上之適當功能基產生交聯作用。接著，沈積修飾後之GOx-BSA並使其和固定之起始劑反應。修飾後GOx-BSA上之醛基和 PAA-VFc上之胺基產生反應而形成一交聯共價鍵。在反應完成之後，乾燥PAA-VFc-GOx-BSA薄膜。電量分析金電極上的交聯PAA-VFc-GOx-BSA薄膜。使用空白PBS，並使用50mV/s的電位掃描速率。_ 16圖顯示金電極上的空白PBS内PEG交聯GOx和BSA之PAA-VFc的循環電量圖。如第1 6圖所示，此交聯薄膜恰如預期呈現在水和PBS徹底清洗後極少變化之高度可逆的表面固定氧化還原電對（A· J.Bard，L.R.Faulkner， Electrochemical

Methods，John Wiley & Sons 出版：紐約 2001)，並且在許多次-0.2V和+0.8V之間的重覆電位循環之後顯示在金電極表面上具有高度穩定性的固定化二茂鐵基薄膜。在緩慢掃描速率下，<100 mV/s，具有單電子氧化還原系統的表面如預期 48 1299061

可測得-明顯對稱信號而呈現理想的能斯特㈣⑽叫性質：當觀察溶液内的擴散行為時，尖峰電流和電位掃描速率成比例，尖療-至-尖峰電位間隔遠低於59 mV(請看第15 圖)’並且在半尖聲高度的電流寬度為約90 mV。此結果確認全部的二茂鐵基氧化還原中心可觸及電極表面並且進行可逆性不均勾電子傳遞。當PBS溶液加入1〇毫莫耳葡萄糖時，可獲得-典型的催化性電化學曲線。然而，氧化還原聚合物的還原尖峰已消失(第16圖’灰色線條)。此意味著感測層藉由從還原GQX傳遞電子至二茂鐵基部分而均句地保持在還原狀態。此極佳中介功能之氧化還原聚合物的反應和電流偵測越快速代表生物感測器的電流靈敏度越高。【圖式簡單說明】請參閱以下有關本發明一較佳實施例詳細說明及其附

圖，將可進-步瞭解本發明之技術内容及其目的功效；有關該實施例之附圖為：第1圖略圖說明根據本發明的價測方法。首先，如第ia 圖所示，能結合準備偵測之分析物的捕捉分子20被固定於摘測電極1G的表面。為了佔據電極表面上的游離結合部位以及降低月景#唬’視需要可單獨加入阻斷劑1 5或和捕捉分子共同加入。然後，將偵測電極接觸可能含標的分析物3〇的令液。分析物分子可結合至捕捉分子而在偵測電極的表面上形成第一層。接著，使電極表面接觸電化學活化劑4〇以 49 1299061 及能傳遞電子往返於電化學活化劑和電極之間的物質5〇(以隨意順序或配成混合物）。電化學活化劑的淨靜電荷和捕捉分子及分析物分子所形成之複合物互補，因而在電極上形成第二層，其中第二層和第一層共同形成一導電雙層。在任選的基質分子55中，以安培計偵測基質催化氧化作用所產生的電流。此電流和樣本溶液内的標的分析物濃度有直接的關係。第1 b圖說明利用鍵合物分子修飾偵測電極的表面（例如，金電極）。第2圖為利用不同比例的生物素_dlJTP/dTTP以代表性凝膠電泳法分離編碼完整長度大鼠TP53 cDNA(色帶1〜3)及完整長度GAPDHcDNA(色帶4〜6)的PCR產物。色帶M，dna 大小標δ志。色帶1〜3分別相當於生物素-16-dUTp/dTTp比例為〇·· 100、35: 65和65: 35。色帶4〜6分別相當於生物素 -2hdUTP/dTTP 比例為〇 ·· 10、！ ·· 1〇和 2 : 1〇。第3圖說明（a)在2·5毫莫耳K3Fe(CN)6和〇·5〇莫耳 NaJO4内包覆一混合自動排列單層，（b)在pBs内具有 DNA/氧化還原聚合物雙層，以及（c)在2·5毫莫耳和0.50莫耳NadCU内具有DNA/氧化還原聚合物雙層之金電極的循環電量圖。掃描速率·· l〇〇mV/s。為清楚之便，以1〇乘以（b)的電流標度。第4圖說明和PBS内GAPDHcDNAn4 、 1 CUNA(曲線a)以及20毫莫 50 1299061 耳葡萄糖溶液和（a)與GAPDH cDNA互補之捕捉探針，以及 (b)與GAPDH cDNA非互補之捕捉探針在雜交反應後的金電極循環電量圖。掃描速率：1 〇 mV/s。第5圖說明在PCR混合物内（a)與GAPDH cDNA互補之捕捉探針，以及（b)與GAPDH cDNA非互補之捕捉探針和 GAPDH cDNA雜交反應後的金電極電流反應。工作電位： 0.36 V，40毫莫耳葡萄糖。第6圖說明在2.5微升滴狀内分別和50、100、200和500 飛莫耳TP53 cDNA在雜交反應後的金電極電流反應。工作電位：0.36 V，40毫莫耳葡萄糠。第7圖說明和大腸桿菌16S rRNA、大腸桿菌23S rRNA 之混合物，和完整長度大鼠GAPDH cDNA在雜交反應後的金電極電流反應。曲線（a)相當於大腸桿^ 16S rRNA的反應，曲線（b)為大鼠GAPDH cDNA的反應，同時曲線（c)代表空白對照。使用1微升的微滴。工作電位：0.35 V，60毫莫耳葡萄糖。第8圖說明在1微升微滴内大腸桿菌16S rRNA-特異性 DNA捕捉分子分別和200飛莫耳（a)全互補合成寡核苷酸， (b)單鹼基錯配募核苷酸，以及（c)單鹼基錯配寡核苷酸在雜交反應後的金電極電流反應，以評估檢測系統的靈敏度。工作電位·· 0.35 V，60毫莫耳葡萄糖。 51 1299061 第9圖說明分析物濃度對氧化作用電流的依存度。 GAPDH cDNA捕捉探針被固定於金電極表面並且接觸1〇微莫耳含生物素的GAPDH cDNA。接著進行雜交反應，經由卵白素-生物素相互作用附著酵素-共輛物。最後，透過層與層間的靜電自動排列使氧化還原聚合物被攜帶至電極表面。葡萄糖^(貞測介質· PBS(pH7.4)。工作電位：035 V。第10圖略圖說明以氧化還原聚合物為介質之生物感測器的耦合氧化還原反應。第11圖說明本發明之水溶性和可交聯聚合物的基本單位構造。此圖顯示乙烯二茂鐵和丙烯酸衍生物的共聚物内具有重覆單位。第12圖說明乙稀二茂鐵和丙烯酸衍生物之共聚合反應中的一般反應方程式。丨第13圖為根據本發明方法所製備之pAA_VFc和 PAAS-VFc氧化還原聚合物的富氏轉換紅外光譜。第14圖為Fc、PAA、PAAS和得自和VFc共聚合反應之共聚物的可視紫外光譜。第15圖為各種系統内之氧化還原聚合物的循環電量圖。使用磷酸鹽緩衝溶液，以及取得電量圖所使用的電位掃描速率為 1 00 mV/s。第16圖為在金電極上和葡萄糖氧化酶-牛血清白蛋白 52 1299061 (GOx-BSA)薄膜交聯之氧化還又母聚合物PAA-VFc的另—種以及取得電量圖所使用循環電量圖。使用磷酸鹽緩衝溶液，種的電位掃描速率為5〇 mV/s。 [主要元件符號說明】 10 偵測電極 15 阻斷劑 20 捕捉分子 30 分析物 40 電化學活化劑 50 傳遞電子物質 55 基質分子 53

Claims

1299061 十、申請專利範圍： 1 ·種利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，係指藉由偵測電極電化學偵測分析物分子的方法，此方法包括： (a) 固疋能在偵測電極上結合準備偵測之分析物分子的捕捉分子； (b) 以偵測電極接觸含準備偵測之分析物分子的溶液； (c) 在偵測電極上使含分析物分子的溶液結合至捕捉分子’因而使捕捉分子和分析物分子形成複合物，該複合物在電極上形成第一層； (d) 使偵測電極接觸一電化學活化劑，其中該電化學活化劑 /、有和捕捉分子及分析物分子所形成之複合物互補的乎静電荷，因而在電極上形成第二層，丨其中第二層和第一層共同形成一導電雙層； (e) 使偵測電極與能夠分別往返傳遞電子於電化學活化劑和電極之間的物質相接觸； (f) 進行偵測電極的電性測定；以及 (g) 所獲得的結果和對照測定值相比較而偵測出分析物。 2·如申晴專利範圍第1項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測刀析物的方法，其中該電化學活化劑為一種能傳遞電子於分析物和電極之間的聚合氧化還原介質。 54 1299061 3 ·如申明專利圍第2項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵’則分析物的方法，其中該電化學活化劑包括金屬離子。 4·如申凊專利範圍第3項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置债测分析物的方法，其中該金屬離子為選自含銀、金、銅、鎳、鐵、鈷、餓、釕和其混合物之基團。汝申明專利範圍第4項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置债測分析物的方法，其中該電化學活化劑為選自聚（乙婦二戊鐵）、聚（乙婦二茂鐵）共丙烯醯胺、聚（乙烯二茂鐵）共丙烯酸及聚（乙婦二茂鐵）共丙烯醯胺基_(CH2)『績酸和聚（乙烯二茂鐵）共丙婦酿胺基_(CH2)n-膦酸之基團，其中^ 〇〜12。申明專利範圍第1項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中能傳遞電子往咚於電化學活化劑之間的物質為一種酵素或酵素共輛物。ί 7·如申請專利範圍第6項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中該酵素為一種氧化還原酶或氧化還原的混合物。 8.如申請專利範圍第7項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中誇备儿、番E A 1 丹干=亥乳化還原酶為選自含葡萄糖氧化酶、氫過氧化酶、乳酸鹽氧化酶、醇脫氫酶、窥基丁酸醋脫氫酶、乳酸脫㈣、甘油脫㈣、山梨糖醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、蘋果酸鹽脫氫酶、半乳糖脫氫酶、蘋果酸趟氧化 55 1299061 辦、半乳糖氧化酶、黃嗓吟脫氫酶、醇氧化酶、膽驗氧化酶、 η嗓吟氧化酶、膽驗脫氫酶、㈣酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、草酸鹽氧化酶、膽紅素氧化酶、麵胺酸脫氳酶、麵胺酸氧化酶、胺氧化酶、NADPH氧化酶、尿酸鹽氧化酶、細胞色素C 氧化酶’及兒茶酚氧化酶之基團。 9·如申咐專利|&圍帛！項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置伯測分析物的方法，其中該捕捉分子能專—性地結合準備 Y貞測的分析物。 10·如申請專利範圍第Ϊ項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置賴分析物的方法，其中該準備制之分析物為選自含核酸、募核《、蛋白質、钱、寡糖、多糖和其複合物之基團。 11.如申請專利範圍第10項所述利用分析聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中該準備偵測之分析物為一種核酸分子。 12·如申請專利範圍第U項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中該核酸分子具有預設的序列。 13. 如申請專利範圍第12項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中該核酸分子至少具有一單股區。 14. 如申請專利範圍第13項所述利用分析物/聚合活化劑雙層 56 1299061 配置偵測分析物的方法，其中該捕捉分子至少一核酸探針具有和準備偵測核酸分子之單股區互補的序列。 15·如申請專利範圍第15項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中該準備偵測之分析物為一種蛋白質或胜戗。 16·如申請專利範圍第15項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中該捕捉分子至少在配体上能姓合蛋白質或胜俄。 17_如申請專利範圍第i項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中該阻斷劑在電極接觸可能含分析物分子的溶液之前被固定於電極上。 18· —種利用分析物/聚合活化劑雙層配置、偵測分析物的方法，係藉由偵測電極電化學偵測分析物分^的方法，此方、、包括： / 法 (a)固定能在偵測電極上結合準備偵測之分析物分子的捕捉分子； ⑻則貞測電極接觸可能含準備谓測之分析物分子的溶液· (0在偵測電極上使該含分析物分子的溶液結合至捕捉分子，因而使捕捉分子和分析物分子形成複合4勿，該複合物在電極上形成第一層； " ⑷使偵測電極接觸一電化學活化劑，其中該電化學活化劑 57 !299〇61 有和捕捉分子及分析物分子所形成之複合物互補的 ^"靜電荷，因而在電極上形成第二層，其中第二層和第· 一層共同形成一導電雙層，以及其令捕捉分子能在電化學活化劑和電極之間往返傳遞電子； )進行偵測電極的電性測定；以及藉由已獲得電性測量之結果和對照測量值的比較偵分析物。士申叫專利砣圍第1項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法’其中—種適合執行之分析物分子電化學偵測的電極配置，其包括： ⑷在偵測電極上含有捕捉分子間之複合物的第一層，其能夠結合準備偵測的分析物分子和分析物分子；以及㈨含有電化學活化劑的第二層，其中該^化學活化劑具有和捕捉分子及分析物分子所形成之複合物互補的淨靜電荷’其中第二層和第-層共同形成-導電雙層。 20·如申請專利範圍第19項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置㈣分析物的方法，其中對於電極配置，該電化學活化劑為-種能在分析物和電極之間傳遞電子的聚合氧化還原介質。 21.如申請專利範圍第20項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置雜析物的方法，其中對於電極配置，該增加分析物 58 1299061 導電性的物質含金屬離子。 22.如申請專利範圍第21項所述利用分配置_分析物的方法，其中對”:二:= 子為選自含銀、金、鋼、鋅、鐵处其中该金屬離合活化劑雙層其進一步含能的物質，其中 23.如申請專利範圍第19項所述利用分析物/聚配置偵測分析物的方法，其中對於電極配置，在聚合氧化還原彳質和電極之間往返傳遞電子該物質可附著、插入或結合至導電雙層。 24.如申請專利範圍第23項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置債測分析物的方法，其中對於電極配置，其中該物質為一種酵素或酵素-共軛物。 25· 一種生物感測器，其利用如申請專利範圍第Μ項所述之電極配置。 26· 一種利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法’其中可電化學偵測分析物分子的生物感測器，其包括： (&) 一偵測電極； (b) 在偵測電極上含有捕捉分子間之複合物的第一層，其能夠結合準備偵測的分析物分子和分析物分子；以及 (c) 含有電化學活化劑的第二層，其中該電化學活化劑具有和捕捉分子及分析物分子所形成之複合物互補的淨靜 59 1299061 電荷其中第二層和第_層共同形成—導電雙層。 27·種利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法’其中水溶性氧化還原聚合物，其包括： ⑷3有可聚合二茂鐵衍生物的第—單体單位；以及 ⑻含具有能獲得淨電荷之伯酸或驗功能基之丙稀酸衍生物的苐二單体單位。 28.如申請專利範圍第27項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置債測刀析物的方法，其中關於氧化還原聚合物，該第二單体單位含具有輯得淨電荷之終❹m力能基的丙烯酸衍生物。 29·如申請專利範圍第27項所述利 κ丨1^刊用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，豆中 ⑽“ 八甲關於乳化還原丨聚合物，該丙雄酸衍生物以通式⑴為代表： ch2 CH I c=〇 I R 其中 R為選自含 CnH2n-NH2、CnH2n_c〇〇H、NH CnH2nP〇3H 和NH-CnH2nS〇3H &基群，其中燒基鍵可選擇性被取代以及其中η為從〇至12的整數。 60 1299061 3〇·如申請專利範圍第27項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中關於氧化還原聚合物，該可聚合二-茂鐵衍生物為選自含乙稀-二茂鐵、乙块_二茂鐵、苯乙稀一茂鐵和氧化乙烯_二茂鐵的基團。礼如申請專利範圍第30項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置伯測分析物的方法’其中關於氧化還原聚合物，該二茂鐵衍生物為乙烯二茂鐵。如申請專利範圍第27項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置價測分析物的方法’其中關於氧化還原聚合物，該氧化還原聚合物的分子量為介於約以叫5侧道耳頓之間。 33·如申請專利範圍第27項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置情測分析物的方法’其中關於氧化還原聚合物，該氧化還原聚合物之二茂鐵的負載量為介於3%至;14%之間。 34.-種所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置㈣分析物的方法，係-種製備水溶性氧化還原聚合物的方法，該方法包括：使含可聚合二茂鐵衍生物的第—單体單位和含能獲得淨電荷之具有酸或驗功能基之丙稀酸衍生物的第二單体翠位產生聚合反應，其中該聚合反應為在含水酒精溶液内進行。 35·如申請專利範圍第34項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置㈣分析物的方法，其中該含水酒精溶液含2· i至曰 61 1299061 1之間体積比例的乙醇和水。从如申請專利範圍第34項所述利用分析物/聚合活化劑雔声配置嫌析物的方法，其中藉由添加自由基起始劑開始該聚合反應。 37.如申請專利範圍第36項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置僧測分析物的方法，其中該白士宜 T々自由基起始劑為選自含過硫酸銨、過硫酸鉀和過硫酸鈉之基圏。 38·如申請專利範圍第36項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置價測分析物的方法，其中加入之自由基起始劑的重量比為每1公克單体介於約20毫克至4〇毫克之間。 39. 如申請專利範圍第34項所述利用分析物/聚合活化劑妙配置㈣分析物的方法’其中該聚合反應為在約阶至8〇 °c之間的回流下進行。丨： 40. 如申請專利範圍第34項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中該聚合反應為在惰性氣体環境下進行。 4L如申請專利範圍第34項所述利用分析物燦合活化劑雙層配置侧分析物的方法，其中該聚合反應的時間為約24小時。 42.如申請專利範圍第34項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置制分析物的方法，其進—步包括在聚合該第—和第二 62 1299061 單体之前形成一預反應混合物，其包括：在含水酒精介質内溶解丙烯酸衍生物單体單位，然後加入自由基起始劑，以及然後加入可聚合二茂鐵衍生物單体單位以形成預反應混合物。 43. 如申請專利範圍第42項所述利用分析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中加人該預反應混合物之丙稀酸

衍生物對可聚合二茂鐵衍生物的添加比例為約佔單体加入重量的5%至15%之間。 44. 如申請專利範圍第42項所 J用刀析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，其中該人 K 口一戍鐵何生物單体單位在加入前先溶解於含水酒精介質内。 45·如申請專利範圍第42項引用勿析物/聚合活化劑雙層配置偵測分析物的方法，复谁^ 丨古化d又層於有機溶劑内。艰原；丨貝此版 46·如申請專利範圍第41 配置偵測分析物的方法，基團。发述利用分析物/聚合活化劑雙層 ^ ^有機溶劑為選自含醚和酮之

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