TWI290175B

TWI290175B - A method for promoting growth of gene recombinant cell and enhancing production of target gene product

Info

Publication number: TWI290175B
Application number: TW093140200A
Authority: TW
Inventors: Yun-Peng Chao; Zei-Wen Wang; Yu-Hsin Chen
Original assignee: Taichung Distr Agricultural Im
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2007-11-21
Also published as: JP2006174833A; TW200621984A; US20060141571A1

Description

1290175 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係建構一種包含編碼為天冬胺酸分解酶 (aspartase )核酸序列之重組載體以及一種利用該重組載體以促進宿主細胞生長和增加欲表現的目標基因產物生產量的方法。【先前技術】運用基因工程技術可達到在細胞中大量生產重組型多 /蛋白質（recombinant polypeptide/protein)之目的’其基本原理在於將目標基因（target gene)選殖（cloning)至一適當載體（vector)上，該目標基因可包含工農業用酵素、治療性蛋白質（therapeutic proteins)、抗原性多肽 (antigenic polypeptides)和抗體（antibodies)等。之後再將所得到的重組型載體（recombinant vector )轉形（transform ) 至一勝任宿主細胞（competent host cell)中。另一方面’由於許多因素皆可能造成被轉形至轉形宿主細胞的載體不穩定而流失，因此可以將目標基因直接箝入（insertion ) 細胞中之染色體來解決這個問題，箝入方法可藉由噬菌體 /病毒感染（phage/virus infection )、轉移子移位傳導 (transposition by transposons )或同源性基因重組 (homologous recombination)方式達成（Haldimann et al· (2001)，J. Bacteriol·，183: 6384-6393)。以上述方式所形成之重組型宿主細胞（recombinant host cell)可於一適當的培養基與培養條件下進行培養，並適時誘導該目標基因的表 1290175 現，俾以達到大量生產所需基因產物的目的。迄今用以生產重組型多肽/蛋白質之宿主細胞中，大腸桿菌co/〇是最被廣泛運用且最為成功的生產細胞。而適用於此菌種所研發出的載體（或稱質體）種類也相當多，其中主要包括高複製數目的質體型態（如 ColEl)、中複製數目的質體型態（如pi 5 A)和低複製數目的質體型態（如 pSClOl)等（Makrides α/· (1996)，M/crM/o/· Αν·，60:512-538)。這些載體一般會建構具有一可誘導的人工啟動子（inducible artificial promoter)，最常被使用的人工故動子包括 lac、Ipp、trp、tac、trc、araBAD、、 T7 A1和T7啟動子等，而被用來誘導這些啟動子的方式為加入異丙基-β-D-硫代半乳糖敗喃苷 (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)、乳糖 (lactose)、阿拉伯糖（arabinose)，或是溫度的變化等 (Makrides ei α/· (1996)，M/erMzW· 7?ev·，60: 512-538)。因此將一目標基因選殖位在該人工啟動子的下游區域，便可根據啟動子調控的特性適時啟動誘導機制來達到調控該目標基因的表現的目的。一般而言，源自各種不同生物的基因幾乎都可以在大腸桿菌内被表現，而其相關的操作技術發展至今也已經相當成熟。然而在實際運用上，仍有一些問題亟待解決，例如’當被誘導大量生產重組型多肽/蛋白質時，生產細胞往往會承受極大的生理代謝負擔（metabolic burden)，意即生產細胞内觸發所謂的逆境反應（stress responses)，進而致使細胞的生長緩慢（Schweder ei a/· (2002), Appl. Mkroho/.出58:330-337)。這種結果往往會引發 1290175 細胞内產生大量的熱休克蛋白質（heat shock proteins)，而導致所生產的重組型多肽/蛋白質遭受到蛋白質分解酶的分解攻擊（Bahl α/· (1987)，Ge似 Z)ev·，1:57-64)，進而造成細胞生長停滯（Kurland d α/· (1996)，Mo/· M/crMb/·， 21:1-4);另一方面，也可能引發rRNAs的破壞並造成核糖體的瓦解，最終導致細胞死亡（Dong以α/· (1995)，J· 177:1497-1504)。值得一提的是，由轉形宿主細胞所大量生產出的重組型多肽/蛋白質，無論是否與宿主細胞的代謝生長相關或是否具有毒性，均可能於轉形宿主細胞内引發逆境反應，而無法達到大量生產重組型多肽/ 蛋白質的目標。此外，源自不同生物的基因在大腸桿菌内大量表達生產，往往容易造成内涵體（inclusion body )之生成。過去的研究結果顯示，在大腸桿菌中大量生產硫氧化還原蛋白 (thioredoxin)可以促進細胞内的還原狀態，而有助於所生產真核生物細胞的蛋白質的溶解性（LaVallie ei α/. (1993)， Bio/Technology, 11:187-193 ； Yasukawa et al. (1995), J. 5/(9/· CT^m·，270:25328-25331)。在正常的細胞生理狀況下，硫氧化還原蛋白和榖胱甘肽-穀胱還原氧化素 (glutathione/glutaredoxin)所構成的反應途徑，可使得大腸桿菌細胞内兩種細胞質内酵素（intracellular enzymes)，如核糖核苦酸還原酶（ribonucleotide reductase)和氧化壓力反應轉錄因子（oxidative response transcription factor)，在它們參與的反應周期中經由此反應機制而形成雙硫鍵 (Aberg et al (1989), J. Biol Chem., 264:12249-12252 ； Zheng d a/· (1998)，279:1718- 1721)。 1290175 在工業化的生物製程（bioprocesses)中，提供好氧性轉形宿主細胞的發酵培養時所需的氧氣，對宿主細胞的生長和重組型多肽/蛋白質之生產量有極大影響。發酵液中^ 氧度可藉由機械方法來改善，例如增加搜拌速率、通氣旦或攪拌葉片的設計，不過這些方法在大發酵槽規模操作時其效果極為有限，且耗費能源而增加發酵的成本。尤其在高細胞密度發酵時，高氧氣的消耗量往往可能造成發酵液中溶氧度受限，因而限制細胞的生長和重組型多肽/蛋白質的生產量。於Khosla等人之先前研究顯示，在低溶氧條件（hypoxic condition)的發酵培養過程下，表現透明顫菌物種（)之血紅蛋白（hemoglobin)基因的大腸桿菌細胞可促進其生長和增加細胞總質量（Khosla and Bailey (1988), Nature, 331:633-635) ° 透明韻囷屬細囷是一群可於缺氧的環境（oxygen-poor environments)下生長的長絲狀需氧性細菌（filamentous aerobic bacteria)。在低溶氧條件下，透明顫菌屬細菌内會誘導生成一種可溶性血紅蛋白，經由光譜性（spectral)、結構性（structural)以及動力學（kinetic)方面的分析證實透明顫菌屬細菌的血紅蛋白和真核生物的友紅蛋白（eucaryotic hemoglobins)具有同源性（homology) (Webster ei α/· (1974)， J. Biol. Chem. 249:4257-4260; Wakabayashi et al. (1986), Nature^ 322:481-483; Orii et al. (1986), J. Biol. Chem. 261:2978-2986)。於Khosla等人之美國專利公告號第5,049,493號中揭示關於含有透明顫菌血紅蛋白核苷酸序列的質體的轉形宿主細胞，可用於增進宿主細胞的生長以及提高細胞的代 1290175 謝物與蛋白質的生產。另有文獻報導，在低溶氧條件的發酵培養過程中，生產透明顫菌血紅蛋白的重組型大腸桿菌可以有效地增加細胞本身蛋白質的生成量（Khosla ei α/. (1990)，价Wrec/ma/ogy，8:849-853)以及重組型 α-;殿粉酶 (α-amylase)的產量（Khosravi ei α/· (1990), Plasmid, 24:190-194)。此外，當以枯草桿菌（eaczY/ws 和中國倉氣卵巢細胞（Chinese hamster ovary cell)作為宿主細胞，在低溶氧條件下，含有透明顫菌血紅蛋白的重組型細胞同樣地可以生產出較高量的重組型蛋白質（Kallio and Bailey (1996), Biotechnol. Prog., 12: 31-39 ； Pendse and Bailey (1994)，44:1367-1370)。在實際發酵操作上，運用饋料批次發酵法（fed-batch fermentation)可有效達到高細胞密度的培養，而增加單位發酵體積内的細胞質量也可增加總蛋白質的產量。不過，細胞行發酵代謝時往往會生成代謝廢棄物質如有機酸類，其中如醋酸具有破壞細胞電子傳遞系統（或呼吸系統）的功能，進而影響ATP的製造。根據過去的研究所提出的醋酸抑制細胞正常生理代謝的機制（Baronofsky以α/·， (1984), AppL Environ. Microbiol. 48 :1134-1139; Lull and Strohl (1990),^/. Environ. Microbiol 56:1004-1011 ) ^ iiL· 為醋酸在中性pH環境中以離子化（CH3COCT)和質子化 (CH3COOH)兩種形式存在，質子化的醋酸具有弱的親脂性可以穿過細胞質膜進入胞内，在胞内（pH 7.5)解離成 CH3COCT和H+，因而降低了細胞膜内的pH值，使細胞膜内外的△ pH減小而致使質子推動力（proton motive force )的減弱，結果減少細胞内所能生成的能量。 1290175 在好氧（aerobic)的條件下，醋酸在細胞中形成的機制雖然仍是未知，不過一般認為細胞的葡萄糖攝取速率未受到適當的调控’而且三叛酸循環（tricarb〇XyliC acid CyCle) 的效能不彰，以致細胞所攝取的碳源在糖分解途徑 · (glycolysis )和在三羧酸循環的代謝流量（metab〇Uc flux ) · 造成分佈不均，因此在細胞中生成醋酸（EI-Mansi and

Holms，（1989) /· CJe/?· 135 :2875-2883 )。戶斤以先前的研究便使用葡萄糖攝取率低的突變菌株（Chou w α/. (1994)，仿⑽叹· 44:952-960)或是運用發酵策 _ 略來控制細胞生長速率以減少醋酸生產量（Lee (1996)， 7>伙心5沁ec/mo/· 14:98-105)，這些方法包括維持定量溶氧度（DO stat)、維持定量pH值（pH stat)和基質進料法 (substrate feeding)。影響醋酸的生成的因素很多，諸如比生長速率、培養基、温度、溶氧度和細胞本身等，但是細胞内醋酸的生成主要是經由可逆反應酵素磷酸乙醯轉移酶 (phosphotransacetylase，)和乙醯激酶（acetate kinase， acA:)的轉化代謝途徑。因此先前研究便利用基因工程技術馨來建構剔除ρία或此免基因的菌種（Dedhia ei a/· (1994)，

Biotechnol Bioeng. 44:132-139; Diaz-Ricci et al. (1991), 38:1318-1324)，或將醋酸以及醋酸生成的前趨代謝物質轉化成其他較不具傷害的物質 ~ (Aristidou et al. (1994), Biotechnol Bioeng. 44:944-951;

Aristidou ei a/· (1995)，iVog. 11:475-478) ’ 以減少細胞在生長時醋酸的累積，進而改進細胞的生長與重組蛋白質的生產量。 10 1290175 此外’先前的研究也藉由改變碳源補充途徑 (anaplerotic pathway)來提升細胞的碳源使用效率以減少碳源的浪費。大腸桿菌是利用所謂的r磷酸轉移酵素系統」 (phosphotransferase system)來攝取胞外的葡萄糖，當細胞内的代謝中間物磷酸烯醇丙酮酸（ph〇Sph〇enolpyruvate)將本身的磷酸根藉著「磷酸轉移酵素系統」的轉移反應提供給葡萄糖時，葡萄糖在被傳送通過細胞膜時即被磷酸化而在細胞内形成6-填酸葡萄糖（glucose 6-phosphate)。6-鱗酸葡萄糖可經由糖分解途徑（glycolysis)生成的磷酸稀醇丙酮酸，接著藉由磷酸烯醇丙酮酸酸基化酶 (phsophoenolpyruvate carboxylase,仲为轉化成草醋酸 (oxaloacetate)，作為補充三羧酸循環（tricarb〇xyiic acid cycle)碳源之用（參見第一圖）。於Chao等人的研究中發現增加構酸稀醇丙酮酸酸基化酶活性的大腸桿菌可將把碳流量（carbon flux)轉向至三羧酸循環而避免導入醋酸生成的途徑中，並且將磷酸烯醇丙酮酸導離「磷酸轉移酵素系統」的途徑而使得細胞的葡萄糖攝取量降低，結果可使得細胞生長產率（growth yield)(即指每克消耗的葡萄糖可生產的細胞質量）增加一倍（(!：1^〇&11(11^〇(1993)，4^厂 M/eroMo/· 59:4261-4265)。同樣的，Farmer 等人的研究中也報導在大腸桿菌細胞中同時增加磷酸烯醇丙酮酸酸基化酶和位在三羧酸循環的碳源補充酵素的異擰檬酸分解酶（isocitrate lyase)的活性，可以完全有效控制細胞醋酸的生成（Farmer and Liao (1997)，4pp/·

MicrM沁/. 63··3205-3210)。另一方面，March 等人的研究中顯示在大腸桿菌中表現丙酮酸酸基化酶（pyruvate 1290175 carboxylase )，可使得轉形宿主細胞有效的使用碳源並減少醋酸的生產，結果可以增加68°/。的重組蛋白質的生成量 (March et al. (2002)， Appl. Environ. Microbiol· 68:5620-5624) ° 由於重組型多肽/蛋白質的高生產量攸關生技工業的產業競爭力，如何增進重組型多肽/蛋白質的生產量，無疑是生物技術產業上的一個極為重要的研發課題。由於目前對於促進細胞生長和提升重組型蛋白質之產量仍有許多改進的空間。因此，開發對於細胞生長和增進重組型多肽/蛋白質的生產之新技術為一值得研究之課題。【發明内容】由於蛋白質在細胞内的合成是一種高能量需求的程序，而細胞内能源的生成則依賴細胞代謝分解所攝取到的碳源，因此要如何達到提高細胞生產重組蛋白質的目標，申請人認為一方面應使得細胞獲取較多的碳源，另一方面細胞則能有效利用所攝取的碳源，以轉化生成較多的能源。細胞可以藉由分解碳源的代謝途徑來衍生能源，然就每單位碳源所能生成的能量和前趨代謝物（precursor metabolites )以供細胞生長所需而言，葡萄糖可說是一種好的碳源，不過在細胞使用葡萄糖時，往往會延生出一種抑制細胞攝取其他碳源的機制（Postma以α/·(1993) M/crrM沁/. 57:534-594)。例如大腸桿菌使用「磷酸轉移酵素系統」來攝取胞外的葡萄糖，同時可藉由此系統來抑制運送（transport)其他破源的穿透酶（permease) 1290175 的活性，進而使得細胞在攝取葡萄糖的同時無法使用這些碳源，包括乳糖（lactose )、蜜二糖（melibiose )、麥芽糖（maltose)和甘油（glycerol)等，這個現象被稱之為 m 「誘導物排除」（inducer exclusion)。另外，這個系統也可以抑制大腸桿菌内的腺嘌吟基循環酶（adenylate · cyclase)的活性，致使胞内環單礎酸腺甘（cyclic AMP， cAMP)濃度降低，因而導致許多基因的表現受到抑制包括一些用於運送碳源（如三羧酸循環的中間代謝物、木質糖（xylose )、鼠李糖（rhamnose )和半乳糖（galatose ) ) _ 的穿透酶基因，而使得細胞在攝取葡萄糖的同時亦無法使用這些碳源，這個現象則稱之為「分解物抑制」 (catabolite repression )。申請人分析發現（參見第一圖），在使用葡萄糖為碳源的情況下，若使得細胞具有天冬胺酸分解酶（aspartase )的活性，將可胞外的天冬胺酸運送至細胞内加以分解以生成三羧酸循環的中間代謝物一丁稀二酸（fumarate )，如此預期細胞將可以同時獲取較多的碳源包括葡萄糖和丁烯二酸，另一方面轉化獲取的丁烯二酸可經由三羧酸循環途徑代謝生成草醋酸籲 (oxaloacetate )，並生成於醯胺腺嗓呤二核苦酸 (nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH)以使得細胞獲取更多的能量。本發明之目的在於提供一種促進細胞生長之方法， ‘ 包含：（a)將一編碼為天冬胺酸分解酶之核酸序列選殖於一載體，成為一重組載體；（b)將步驟（a)之重組載體轉形至一宿主細胞，產生一重組型宿主細胞；及（c)將步驟（b) 之重組型宿主細胞培養於培養基中，使細胞中之天冬胺 13 1290175 酸分解酶之基因表現，進而促進前述重組型宿主細胞之生長。该重組載體其特徵包含啟動子、編碼為天冬胺酸分解轉之核1序列以及複製源點（〇rigin〇frepHcati〇n)，其中前述核酸序列可操控連接並插入前述啟動子的下游。該重組載體可視複製源點種類不同（例如pMB1複製源點製態、PBR322複製源點型態、p15A複製源點型態、pSCl〇1 複製源點型態、R1複製源點型態、RK2複製源點型態、 R6K複製源點型態、ρ複製源點型態或pSF1010複製源點型態等）’而攜帶高複製數目或低複製數目的天冬胺酸分解酶之核酸序列，該載體包含一般遺傳工程技術中所使用的載體’例如，嗤囷體（bacteriophages)、質體（plasmids)、黏接質體（cosmids)、病毒（viruses)或反轉錄病毒 (retroviruses)。進一步，本發明所使用之天冬胺酸分解酶之核酸序列係來自大腸桿菌、細菌、酵母菌、真菌、昆蟲、植物、動物以及或人類細胞，較佳係來自大腸桿菌。本發明所提供之重組載體，其中前述之啟動子其目的在於調控天冬胺酸分解酶之基因表達，該啟動子可為以異丙基硫代半乳糖吡喃苷（IPTG)調控之誘導啟動子，組成性（constitutive)啟動子或其他可調控之啟動子例如啟動子、T7啟動子、T7 A1啟動子、/似啟動子、吵啟動子、 ire啟動子、啟動子或xjpRpL啟動子等。其中前述方法之宿主細胞可包含原核生物細胞 (prokaryotic cells)或真核生物細胞（eukaryotic cells)。適用於本發明的原核生物細胞包括，但不限於下列的細胞，例如大腸桿菌（五· cW)、枯草桿菌（β· whz·/以）、乳酸桿菌屬 14 1290175 物種（⑽)、鏈黴菌屬物種μ.) 以及沙門氏傷寒桿菌ί少尸/π·);藍綠藻 (Cyanobacteria);放線菌（dci/似所γπία)等。適用於本發明的真核細胞包含，但不限於下列的細胞，例如麵包酵母菌 · (Saccharomyces cerevzW似）或嗜甲醇酵母菌（尸化办/“ ‘ …）；植物細胞可衍生自裸子植物（gynosperms)或被子植物（angiosperms)，以單子葉植物（monocots)與雙子葉植物（dicots)為佳，特別是作物（crops)，而且是取自這些植物的根、莖、葉或分生組織（meristem)等部位，並以原生質 _ 體（protoplasts)或癒合組織（callus)的形式被培養；昆蟲細胞可衍生自果蠅S2細胞以及秋行軍蟲（办0办piera 的Sf21細胞與Sf9細胞；動物細胞可以是培養的細胞或活體内細胞，包括如CHO、BHK、Hela等。此外，將形成的重組型宿主細胞培養於一合適的培養基中，俾以容許該基因表現。適用於進行DNA重組技術的宿主細胞的適當培養基以及培養條件，在生物技術領域令已被詳知。例如，可將宿主細胞培養在本技藝中所慣用的發酵生物反應器、搖動燒瓶、試管、微滴盤 _ 與平淺培養皿令，且該培養可在適合於重組型宿主細胞生長的溫度、pH值及氧含量下進行；例如，可用於培養宿主細胞的培養基，其中包括碳源（如葡萄糖、乳糖、蔗糖、糖蜜（molasses )、澱粉（starch)和穀粒（cereal grains) * 等）、氮源（如氨鹽類（ammonium salts )、尿素（urea )、石肖酸鹽（nitrates)、玉米萃取液（corn steep liquor)、大豆粉（soybean meal)和酵母萃取物（yeast extract)等）、鱗酸鹽（phosphate )、硫酸鹽（sulfate )、生長因素（如維 15 1290175 他命、胺基酸、核酸等）以及微量金屬（如钟、鎮、妈、鐵、鋅、鈉、鈷、錳、銅等）。前述方法之步驟中則使用搖動燒瓶，而所使用之培養基可為任何含有天冬胺酸之培養基例如LB、LB加葡萄糖、M9加葡萄糖以及天冬胺酸或M9加葡萄糖、酵母萃取物以及天冬胺酸等。前述之LB 其成分包含酵母萃取物（5g/L)、胰蛋白觫（tryptone，10 g/L)、NaCl (5g/L)，因此推測LB應内含有天冬胺酸成分。此外，前述之M9其成分包含Na2HP04 (6g/L)、KH2P〇4 (3 g/L)、NaCl (0.5g/L)、NH4Cl (lg/L)、MgS〇r7H20 (1 mM)、 CaCl2 (0.1 mM)。本發明之另一目的係提供一種增加細胞生產目標基因產物生產量之方法，前述方法之步驟如下：（a)建構一含有編碼天冬胺酸分解酶之核酸序列之重組載體；（b)建構一含有欲表達之目標基因之重組載體；（c)將步驟（a)與（b)之重組載體共同轉形至一宿主細胞，產生一重組型宿主細胞；及（d)將步驟（c)之重組型宿主細胞培養於培養基中，並誘導使前述重組型宿主細胞生產天冬胺酸分解酶以及欲表達之目標基因產物，其中前述天冬胺酸分解酶係可增加前述重組型宿主細胞生產欲表達之目標基因產物之生產量。該載體如前述方法之重組型載體之構造，具有調控天冬胺酸分解酶之基因表達之啟動子，該啟動子可為IPTG 調控誘導之啟動子，組成性啟動子或其他可調控之啟動子，且天冬胺酸分解酶之核酸序列係來自大腸桿菌、細菌、酵母菌、真菌、昆蟲、植物、動物以及或人類細胞。前述目標基因產物包含重組蛋白質或多狀。前述重組 1290175 蛋白質可為各種形式的蛋白質，包括位於細胞質 (cytoplasm)或細胞間質（periplasm)内的蛋白質、位於細胞膜（membrane)上或細胞外（extracellular)的蛋白質，以及工業、農業、食品、環境、水產業和畜牧業用的酵素，尤其胃是醫療用蛋白質和胜肽，諸如干擾素（interferon)、間白素 * (interleukin)、動物或人類激素（animal or human hormone)、免疫性抗原和抗體等。此外，本發明實例中欲表達重組蛋白質可包括異源蛋白質或同源蛋白質，異源蛋白質例如水母綠色螢光蛋白質（d叫worea green 馨 fluorescent protein )，同源蛋白質例如半乳糖苷分解酶。

前述質體共同轉形至一宿主細胞之轉形方式可藉由磷酸妈或氣化辦媒介的轉染作用（transfection)、電穿孔法 (electroporation)、微注射法（microinjection)、粒子撞擊法 (particle bombardment)、脂質體媒介的轉染作用 (liposome-mediated transfection)、利用細菌嗟菌體的轉染作用、利用反轉錄病毒（retrovirus)或其他病毒的轉導作用 (transduction)、原生質體融合(protoplast fusion)、農桿菌媒介的轉形法 transformation)或孀I 其他方法達成。該宿主細胞如前述包含細菌、酵母菌、真菌、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。前述天冬胺酸分解酶可增加前述重組型宿主細胞所欲表達之目標基因產物的產量。此外，前述方法之步驟中則使用搖動燒瓶， · 而所使用之培養基係可為任何含有天冬胺酸之培養基例如：LB、LB加葡萄糠、M9加葡萄糖以及天冬胺酸或M9 加葡萄糖、酵母萃取物以及天冬胺酸等。其令LB及M9 之定義同前所述。 17 1290175 此外，由於許多因素皆可能造成被轉形至轉形宿主細胞的載體不穩定而流失，因此可以將天冬胺酸分解酶核酸片段例如大腸桿菌之天冬胺酸分解酶基因（SEQ ID:7)直接箝入 (insertion )細胞中之染色體來解決這個問題，箝入方法可藉由嗟菌體/病毒感染（phage/virus infection)、轉移子移位傳導（transposition by transposons )或同源性基因重組 (homologous recombination)方式達成。因此本發明之又一目的在於一種促進細胞生長之方法，包含下列步驟：（a)將天冬胺酸分解酶之核酸序列插入至一宿主細胞之染色體，以產生一重組型宿主細胞；及（b)將步驟（a)之重組型宿主細胞培養於培養基中，使細胞中之天冬胺酸分解酶之基因表現，進而促進前述重組型宿主細胞之生長。其中前述步驟（a)之天冬胺酸分解酶之核酸序列來自大腸桿菌、細菌、酵母菌、真菌、昆蟲、植物、動物或人類細胞。其中前述步驟（a)中之宿主細胞包含細菌、酵母菌、真菌、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，較佳係來自大腸桿菌。其中前述步驟（b) 中之培養基係為含有天冬胺酸之培養基例如LB、LB加葡萄糖、M9加葡萄糖以及天冬胺酸或M9加葡萄糖、酵母萃取物以及天冬胺酸等。其中LB及M9之定義同前所述。本發明之更一目的在於提供一種增加細胞生產目標基因產物生產量之方法，包含下列步驟：（a)建構一含天冬胺酸分解酶之核酸序列和欲表達之目標基因之重組載體；（b)將步驟（a)之重組載體與天冬胺酸分解酶之核酸序列共同轉形至一宿主細胞，產生一重組型宿主細胞；及（c)將步驟（b) 之重組型宿主細胞培養於培養基中，並誘導使前述重組型宿主細胞生產天冬胺酸分解酶以及欲表達之目標基因產物，其 18 1290175 中前述天冬胺酸分解酶係可增加前述重組型宿主細胞生產欲表達之目標基因產物之生產量。其中前述步驟（b)_之天冬胺酸分解酶之核酸序列來自大腸桿菌、細菌、酵母菌、真菌、昆蟲、植物、動物或人類細胞，較佳係來自大腸桿菌。其中前述步驟（a)中之目標基因產物包含重組蛋白質或多肽。前述步驟重組蛋白質包括異源蛋白質或同源蛋白質；異源蛋白質可為水母綠色螢光蛋白質；同源蛋白質係為卜半乳糖苷分解酶。其中前述步驟（b)中之宿主細胞包含細菌、酵母菌、真菌、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。其中前述步驟（c) 中之培養基係為含有天冬胺酸之培養基例如LB、LB加葡萄糖、M9加葡萄糖以及天冬胺酸或M9加葡萄糖、酵母萃取物以及天冬胺酸等。其中LB及M9之定義同前所述。本發明亦提供另一種增加細胞生產目標基因產物生產里之方法，包含下列步驟、a)將天冬胺酸分解酶之核酸序列插入至一佰主細胞的染色體，以產生一重組型宿主細胞；及 (b)建構一含有欲表達之目標基因之重組載體；（c)將步驟之重組載體轉形至步驟（a)之宿主細胞，產生一重組型宿主細胞，及（d)將步驟（c)之重組型宿主細胞培養於培養基中，並誘導使前述重組型宿主細胞生產天冬胺酸分解酶以及欲表達之目標基因產物，其中前述天冬胺酸分解酶係可增加前述重組型佰主細胞生產欲表達之目標基因產物之生產量。I述 v私重組蛋白質包括異源蛋白質或同源蛋白質；異源蛋白質 :為水母綠色螢光蛋白質；同源蛋白質係為β_半乳糖苷分解，。其中前述步驟（a)中之宿主細胞包含細菌、酵母菌、真菌植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。其中前述步驟（句中之培養基係為含有天冬胺酸之培養基例如lb、lb加葡萄 1290175 糖、M9加葡萄糖以及天冬胺酸或M9加葡萄糖、酵母萃取物以及天冬胺酸等。其中LB及M9之定義同前所述。本發明之作用方式係使得細胞具有天冬胺酸分解酶 (或稱天冬胺酸氨基分解酶（aspartate ammonia-lyase)) 的活性，將細胞外的天冬胺酸運送至細胞内加以分解以生成三魏酸循環的中間代謝物一丁烯二酸（fumarate )(參見第一圖）。在好氧條件下，大腸桿菌的天冬胺酸分解酶的生成濃度很低，而天冬胺酸分解酶的基因表現也受到葡萄糠的「代謝物抑制」的控制（HalpernandUmbarger， (1960) J. Bacteriol. 80:285-288; Woods and Guest, (1987) FEMS MicrM紿/· ZWi· 48:219-224)。因此本發明建構含有天冬胺酸分解酶基因的表現載體，以運用於在宿主細胞中來調節和生產天冬胺酸分解酶，並將轉形至宿主細胞中以使得宿主細胞具有天冬胺酸分解酶的活性。經由申請人研究發現，使得宿主細胞具有天冬胺酸分解酶的活性，可以用以改善生產重組型蛋白質的轉形宿主細胞的特性，例如改善上述重組宿主細胞的代謝途徑以增加細胞密度及蛋白質產量或增進轉形宿主細胞在好氧條件（aerobic conditions)下的細胞質量以及提升生產重組蛋白質的產量，並且有利於轉形宿主細胞在高細胞密度下的培養操作。而從所得實驗結果來看，這個策略確實可以有效解決上述所提的在大量生產重組型蛋白質時所碰到的問題，而對於生物技術產業將會有極為重要的貢獻。【實施方式】本發明係利用一含有天冬胺酸分解酶基因之表現載 1290175 體或天冬胺酸分解酶基因片段運用於在宿主細胞中來調節與生產天冬胺酸分解酶。本發明係可使宿主細胞具有天冬胺酸分解酶的活性，進一步使宿主細胞具有促進細胞生長以及增進重組型蛋白質的生產之特性。以下係藉由數個實施例並配合圖式說明本創作之實施 ’ 態樣。實施例一般實驗方法與材料：本發明令所採用的實驗方法和使用於DNA選殖的相籲關技術，係參考教科書Sambrook J，Russell DW (2001)

Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd ed. Cold

Spring Harbor Laboratory Press，New York 〇本發明戶斤使用之技術包括以限制酶（restriction enzymes)作DNA的剪切反應（DNA cleavage)、使用T4 DNA黏接酶（ligase)作 DNA黏接反應（DNA ligation)、聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction，PCR)、瓊脂凝膠電泳法 (agarose gel electrophoresis)、西方墨點分析（Western blotting)、硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（sodium 鲁 dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)和質體轉形法（plasmid transformation)等，熟悉此項技術人士皆可根據本身的專業素養來實施這些技術，無須過度實驗即可達成。 * 本發明所使用之質體轉形法是以經氣化鈣（CaCl2)處理的勝任細胞來進行。細胞密度是使用分光光度計（V530，

Jasco)來測量，測量波長定為550 nm，所得到的吸光值紀錄為OD550。蛋白質濃度分析則是使用蛋白質分析試劑 21 1290175 (Protein Assay Reagent，BioRad Co·)，並以影像分析儀 (GAS9000, UVItec)來分析定量經電泳凝膠分離的蛋白質。細菌染色體（chromosome)、質體和DNA片段之純化係分別使用Wizard®基因組DNA純化套組（Genomic DNA Purification Kit，Promega Co·)、QIAprep® Spin Miniprep kit (Qiagen Co.)和 NucleoSpin® 核酸純化套組（Nucleic Acid Purification Kit，Clontech Co·)等商業純化套組進行。所有限制酶、T4 DNA黏接酶和Pfu DNA聚合酶 (polymerase)係購自 New England Biolabs。聚合酶連鎖反應中所使用之引子（primers)係由明欣生物科技公司（台北）所合成。使用於測定水母綠色螢光蛋白質之一次抗體 (primary antibody)係講自 BD Biosciences Clontech，而辣根過氧化酶-綴合的山羊抗-兔IgG (horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG)類型之二次抗體（secondary antibody)，以及其餘的化學藥品皆購自於 Sigma Chemical Co.。實施例一、構築含有天冬胺酸分解酶結構基因之表現質體本實施例之DNA選殖過程中所使用的中介細胞 (intermediate cells)為大腸桿菌 XLI-Blue (Stratagene Co·)，菌株在37°C下於Luria-Bertani (LB)培養基（包含酵母萃取物（5 g/L )、胰蛋白腺（tryptone，10 g/L )、NaCl (5g/L))内培養（Miller，J.EL (1972)，Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)，經轉形的大腸桿菌則培養於添加有抗生素的LB培養基内，而使用的抗生素包括胺苄青黴素 1290175 (ampicillin)、氯黴素（chloramphenicol)和康那徽素 (kanamycin)，其使用量分別為 50、20 和 25 pg/mL。

A. 建構含有天冬胺酸分解酶基因（as/^4)的重組質艘 pAl-AspA 根據第三圖所示，本實施例所使用之高複製數目質體 · pAl-AspA係包含一 T7 A1啟動子、/ac/抑制基因及pMBl 複製源點，/ac/抑制基因產物可用於控制T7 A1啟動子，以達到調節天冬胺酸分解酶（EC 4·3·1·1)的表現，其建構方式如下：鲁首先，根據天冬胺酸分解酶結構基因的核苷酸序列 (SEQ ID NO: 7)( Woods et al. (1986), Biochem. J. 237:547-557)合成下面兩個引子。前向引子 5’-cacaggatccacaacattcgtatcgaag_3’ (SEQ ID NO ·· 1) 反向引子 5,-gctaagcttactgttcgctttcatcattatagc-3, (SEQ ID NO ： 2) 上述兩個引子（SEQIDN0..1及SEQIDNO:2)分別被設計成具有限制酶和///>2^111的切割位置（如底線馨所標示者）。接著，以Wizard®基因組DNA純化套組所純化出的大腸桿菌菌株VJS676 (得自於

Dr· Stewart，University of California，Davis，CA，USA)染色體作為模版（template)，並以上述兩個引子進行PCR反 · 應，擴增出一含有天冬胺酸分解酶基因的DNA片段（1.5 kb)。進一步，以NucleoSpin®核酸純化套組來純化所擴增出的DNA片段，並以限制酶如mHI和ΛΪ^ΙΙΙ進行切割，且將所得到的切割產物併入（incorporate )至以5_ΗΙ和 23 1290175 ///Will切開的質體pA199A-2 (如第二圖所示）(Chao以α/· (2003)，/V叹_ 19: 1076-1080 )，而得到質體 pAl-AspA (如第三圖所示）。 « B·建構含有天冬胺酸分解酶基因（α5/Μί)的重組質體 pACYC-AspA * 本實施例所使用之低複製數目質體pACYC-AspA如第五圖所示，包含一 T7 A1啟動子、/π/抑制基因及pl5A 複製源點，其建構方式如下：首先，使用限制酶和而從質體p A1 - Asp A (如第三圖所示）切出一含有鲁

Me/抑制基因、T7 A1啟動子和天冬胺酸分解酶基因之 DNA片段，隨之併入至以Λ/W/I和///Will切開的質體 PCYC184 (如第四圖所示），而獲得質體pACYC-AspA (如第五圖所示）。實施例二、以大腸桿菌生產天冬胺酸分解酶香白皙本實施例係根據前述之質體轉形法，將實例一中所得到之質體 pA199A-2、pAl-AspA、pACYC184 以及 pACYC-AspA分別轉形至大腸桿菌菌株VJS676内，而得 _ 到重組菌株 VJS676/pA199A-2、VJS676/pAl-AspA、 VJS676/pACYC184 和 VJS676/pACYC-AspA。由固態培養皿點選出各個重組菌株的菌落，並接種至 5 mL含有50 gg/mL胺苄青黴素或20 gg/mL氯黴素之LB · 培養基内，並於37°C隔夜培養。之後，將培養之細胞接種至一含有25 mL LB培養基（内含50 pg/mL胺苄青黴素或 20 pg/mL氯黴素）的250 mL燒瓶中，使得細胞起始密度達到0.05 (OD55〇)後，將新接種之菌液培養於一個設定為 24 1290175 37 °C與250 rpm之恆溫震盪培養箱内。待細胞密度達到約〇·3 (OD55〇)時，將不同濃度的IPTG加入培養液中以誘導重組型菌株生產重組型蛋白質產物並持續觀察細胞生長狀況。 · 加入誘導劑6小時後，以離心方式收集細胞，並以高 % 壓均質機（French press，Thermo Spectronic)將收集到的細胞打破，然後以冷凍離心機分離細胞並回收上清液。接著以 Protein Assay Reagent (BioRad Co·)測量所收集的上清液内的蛋白質濃度，並將所收集之樣品（含20 pg的蛋白 | 質）依次裝填至12%聚丙稀醯胺凝膠（polyacrylamide gel)中進行電泳，以分析重組蛋白質之生產量。根據第六圖之蛋白質電泳圖所示，經過發酵培養10 小時後，被誘導生產天冬胺酸分解酶的重組型菌株的蛋白質生產情形，其中徑1 :蛋白質標準物（MBIFermentas); 徑 2 :未生產天冬胺酸酶的重組型菌株 (VJS676/pAl-AspA);徑 3 :以 50 μΜ IPTG 來生產天冬胺酸酶的重組型菌株（VJS676/pAl_AspA);徑4 :以100 μΜ IPTG 來生產天冬胺酸酶的重組型菌株 _ (νΒ676/ρΑ^Α3ρΑ);徑 5 :以 300 μΜ IPTG 來生產天冬胺酸酶的重組型菌株（VJS676/pAl-AspA);徑6:未生產天冬胺酸酶的野生型重組型菌株(VJS676/pACYC-AspA);徑 7 ··以50 μΜ IPTG來生產天冬胺酸酶的型重組型菌株 · (VJS676/pACYC_AspA);徑 8 ··以 100 μΜΙΡΤΘ 來生產天冬胺酸酶的重組型菌株(VJS676/pACYC-AspA);徑9 :以 300 μΜ IPTG來生產天冬胺酸酶的重組型菌株 (VJS676/pACYC-AspA);徑 10 : 2 pg 牛血清蛋白（Bovine 25 1290175

Serum Albumin，BSA)。未經IPTG誘導時，無論攜帶高複製數目質體pAl-AspA (即重組菌株VJS676/pAl-AspA) 或是低複製數目質體pACYC-AspA (即重組菌株 VJS676/pACYC-AspA)的菌株生產極微量的天冬胺酸分解酶。相對的是，在加入IPTG誘導劑後，重組菌種開始大量累積生產天冬胺酸分解酶，所生產的酵素量也隨著誘導劑的增量而增加。大腸桿菌天冬胺酸分解酶活性的測定是根據我們較早的文獻（Chao W α/· (2000) M/crM. Tfec/mo/·， 27:19-25)内所報導的方法來進行。主要地，在1 mL的反應溶液中加入所收集的蛋白質樣品（0.05 mg)，反應溶液的組成包含100 mM天冬胺酸、100 mM Tris緩衝液(pH 8.4) 和5 mM MgS04。當在室溫下反應10分鐘後，以高性能液相層析（HPLC)來分析產物，分析條件為：移動相溶液為 0.05 N硫酸，流速為0.5 mL/min，偵測波長為210 nm。酵素的比活性單位為U/mg，而酵素活性單位（U)被定義為每分鐘每pmole的產物產生。從表1之酵素活性測量結果得知，將不同濃度的IPTG加入培養液中可以誘導重組型菌株來生產天冬胺酸分解酶，隨著誘導劑量的增加重組菌株 VJS676/pAl-AspA 和 VJS676/pACYC-AspA 所生產的天冬胺酸分解酶活性也相對增高，估計所被誘導生產出的酵素活性相對於未誘導時的酵素活性可分別達50和100 倍。綜合第六圖與表1之實驗結果顯示，依據本發明而被轉形的野生型大腸桿菌重組菌株具有生產冬胺酸分解酶蛋白質的能力，並且蛋白質產量可以藉由不同IPTG濃度 1290175 來予以控制。表1·經IPTG誘導的重組菌株所生成的天冬胺酸分解酶的活性。 IPTG (μΜ) VJS676/p A1 - Asp A (U/mg) VJS676/pACYC-AspA 0 0.39 0.13 50 11.62 1.97 100 17.18 6.23 300 20.22 13.38 實施例三、誘導生產天冬胺酸分解酶以促進細胞生長本實施例之對照組，其重組菌株VJS676/pA199A-2 和VJS676/pAl-AspA之培養方法係依照實施例二之方式進行，該對照組所使用之培養基為M9(Miller，J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor, NY)外加葡萄糖（0.1 %)和胺苄青黴素（15 gg/mL)。前述M9之成分包含Na2HP04 (6g/L)、KH2P〇4 (3 g/L)、NaCl (0.5g/L)、NH4C1 (lg/L)、 MgSCV7H20 (1 mM)、CaCl2 (0.1 mM)。當新接種的菌液的細胞密度達到大約0·3 (OD55〇)時，即將300 μΜ IPTG加入至培養液中，俾以誘導重組型菌株來生產重組型蛋白質產物，並隨著培養時間來收取菌液樣品以測量細胞密度。由第七圖的生長曲線圖所示，在加入IPTG誘導劑後，生產天冬胺酸分解酶的重組菌株VJS676/pAl-AspA (◊) 的生長趨於緩慢，於發酵十小時後細胞密度只達到0.9 (〇D55〇)。然而在同樣的發酵時間，未生產天冬胺酸分解酶的重組菌株VJS676/pA199A-2 ( )的細胞密度可以達 27 1290175 到1 ·5 ( OD5% )。根據天冬胺酸分解酶的功用主要在於將天冬胺酸（aspartate)分解生成丁烯二酸（fumarate)和氣離子（NH4 )(參見第一圖），然而在這個培養基條件下，在大腸桿菌内誘導生成的天冬胺酸分解酶並不具有任何明顯的生理功用，因此第七圖的結果顯示在此例中生產重組型蛋白質如天冬胺酸分解酶將會造成生產細胞的生理負擔，而導致細胞生長受到抑制。本實施例之實驗組係使用M9外加葡萄糖(〇·ΐ %)、胺 T青黴素（15 pg/mL)以及天冬胺酸（〇·5%)為培養基，且重組菌株 VJS676/pA199A-2 和 VJS676/pAl-AspA 的培養方法係依照前述程序進行，當新接種的菌液的細胞密度達到大約0.3 (OD55〇)時，即將3〇〇 μΜ IPTG加入至培養液中，俾以誘導重組型菌株來生產重組型蛋白質產物，並隨著培養時間來收取菌液樣品以測量細胞密度。由第七圖得知，於發酵十小時後，未生產天冬胺酸分解酶的重組菌株VJS676/pA199A-2 ( # )的細胞密度連21 (〇d55。），而比生長速率（specific gr〇wth me)為〇·23 ,相對的疋生產天冬胺酸分解酶的重組菌株 VJS676/PAl-AsPA(V)卻生長較為快速（比生長速率可達〇·32 ΙΓ1)，最後的細胞密度可達到3·2 (θα%)。相較於對組貝知例，该結果顯示在培養基中含有天冬胺酸的條件下，大腸桿菌内誘導生成的天冬胺酸分解酶具有將天冬胺酸分解成丁烯二酸的生理功用，因此除了葡萄糖之外可提供的額外碳源進入三羧酸循環，而丁烯二酸、、二由好氧性二緩酸循環轉化成草醋酸，同時可以生成於酸胺腺噪呤二核㈣（nic〇tinamide_adenine仙㈣⑽此 28 1290175 NADH ),最後與葡萄糖經糖分解途徑所形成的乙醯輔酶甲（acetyl-CoA)合併形成檸檬酸（citricacid)(參見第一圖）。所以相較於未生產天冬胺酸分解酶的重組菌株，生產天冬胺酸分解酶的重組菌株可藉由分解外源的天冬 . 胺酸來增加有效的碳源和能量，不但可以克服生產重組 · 型天冬胺酸分解酶導致生產細胞的生理負擔的問題（如第七圖所示），而且增加細胞的比生長速率達4〇%和提高細胞的密度可達60%。本實施例更進一步使用LB外加胺节青黴素（50 pg/mL)為培養基進行重組菌株儀 VJS676/PA199A-2 和 VJS676/PAl_AsPA 的培養，培養方式如A述方法。當新接種的菌液的細胞密度達到大約ο」 (ODwg)時，將300 μΜ IpTG加入培養液，俾以誘導重組型菌株來生產重組型蛋白質產物，並隨著培養時間來收取菌液樣品以測量細胞密度。如第八圖所示，於發酵十小時後’生產天冬胺酸分解酶的重組菌株VJS676/pA1-AspA (▽)的細胞欲度可達8·4 ( 〇D55Q )，而未生產天冬胺酸分解酶的重組菌株VJS676/pAi99A-2(鲁）的細胞密度僅達到6.0 ( ODyo)。由於LB培養基配方含有胰蛋白觫和籲酵母卒取物的組成物，所以培養基中内含有天冬胺酸（與第七圖的實驗組使用添加天冬胺酸的培養基的條件相似），因此生產天冬胺酸分解酶的重組菌株可藉由分解外源的天冬胺酸以增加有效的碳源和能量，以致細胞密度，提高達55%。縱上所述，生產天冬胺酸分解酶可以賦予經轉形的宿主細胞具有改善細胞生長和提高細胞密度的能力。 29 1290175 實施例四、以具有天冬胺酸分解酶活性之大腸桿菌生產同源蛋白質（homologous protein ) — β_半乳糠苷分解酶 (β-galactosidase) 曹根據第十二圖，本實施例所使用之質體pTac-Z係包含一個Me啟動子及/ac/q抑制基因，其建構方式如下： · 首先根據質體ρΑΗ55(如第九圖所示）（Haldimann and Wanner，（2001)，《/· 183:6384-6393.)的核普酸序列來合成兩個引子如下所示。前向引子籲 5-taactcgcgataattgcgttgcgctcac-3, (SEQ ID NO : 3) 反向引子 5-cgcccatggtatatctccttcttacaagc-3, (SEQ ID NO ·· 4) 上述反向引子被設計成具有限制酶的切割位置 (如底線所標示者）。接著，以使用QIAprep® Spin Miniperp 套組來純化出的質體ρΑΗ5 5做為模板，加入上述兩個引子以進行PCR反應，而擴增出一段含有抑制基因（/w/q) 和iae啟動子的DNA片段（1.8 kb)。之後，以NucleoSpin® 核酸純化套組來純化所擴增出的DNA片段，且以限制酶 _ iVcoI/EcoRV進行切割，並將所形成的切割產物併入至以切開的質體pTrc99A (如第十圖所示）（Amann ei α/·，（1988)，Ge似，69:301_315)，而得到質體 pTac99A (如第^--圖所示）。 " 進一步根據β-半乳糖苷分解酶基因的核苷酸序列 (Kalnins 以 α/· (1983)，五/· 2:593-597)合成下面兩個引子：前向引子 30 1290175 5-acagccatggccatgattacggattcac -3’ （SEQ ID NO : 5) 反向引子 5-cggaagcttttatttttgacaccagacc -3’ （SEQ ID NO : 6) 上述兩個引子分別被設計成具有限制酶#coI和的切割位置（如底線所標示者）。接著以使用 Wizard⑧基因組DNA純化套組所純化出的野生型大腸桿菌W3110染色體做為模版，並加入SEQ ID NO : 5與6 兩個引子進行PCR反應，而擴增出一含有β-半乳糖苷分解酶基因（/acZ)的DNA片段（3 kb)。之後，以NucleoSpin® 核酸純化套組來純化所擴增出的DNA片段，接著以限制酶iVcoI和/ί/ΜΙΙΙ進行切割，並將所形成的切割產物併入到以iVal和所似/111切開的質體pTac99A，而獲得質體 pTac-Z (如第十二圖所示）。根據前述質體轉形法將質體pACYC184和 pACYC-AspA分別與質體pTac-Ζ共同轉形至大腸桿菌菌株 VJS676 内，而得到以下重組菌株 VJS676/pACYC 184/pTac-Z 和 VJS676/pACYC-AspA/ pTac-Z ° 重組型菌株之培養係根據實施例二中所述方式進行之，而使用之營養基分別為LB、LB加上葡萄糠（0.2%)、 M9加上葡萄糖（0.1%)和酵母萃取物（0.5%)以及M9加上葡萄糖（0.1%)、酵母萃取物（0.2%)和天冬胺酸（0.5%)，而抗生素使用量分別為15 pg/mL胺苄青黴素和1 〇 pg/mL 氣黴素。當新接種的菌液的細胞密度達到大約〇·3 (OD550) 時，將100和300 μΜ IPTG加入至培養液中，俾以誘導重組型菌株來生產重組型蛋白質產物，並隨著培養時間收 1290175 取菌液樣品以測量細胞密度，在培養時間達10小時之後，以離心方式收集細胞並測量所生產的β-半乳糖苷分解酶的活性。大腸桿菌β-半乳糖苷分解酶活性測定係根據MiUei·，J. Η. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor，NY: Cold Spring Harbor Laboratory 中所述的方法。將培養中的細胞隨取樣時間取出〇·1 mL的菌液放入至 0.9 mL Z 緩衝溶液（16.1 g/L Na2HP04 · 7H20、5.5 g/L NaH2P〇4 · H20、0.75 g/L KCb 0.246 g/L MgS04 · 7H20、 2.7 mL β-疏基乙醇（β-mercaptoethanol))中，並使最後體積維持為1 mL。之後，加入10 μί甲苯，以旋轉器震遭打破細胞，並以冷凍離心機來分離細胞並回收上清液。於所收集的上清液中加入含有鄰-硝基苯基硫代半乳糖苷（o-nitrophenyl-P-D-thiogalactosidejG mg/mL)的反應溶液0.2 mL。在室溫下反應歷時5分鐘後，予以加入 0.5 mL Na2C03 (1 M)以終止反應，並於420 nm的波長下進行偵測。β-半乳糠苷分解酶的比活性單位被定義為 Miller單位，而酵素總活性的單位則是酵素比活性和所得到的細胞密度（OD55G)的乘積值。表2.經誘導生產β-半乳糖苷分解酶的重組型菌株的生長狀況以及酵素生產量菌株VJS676 質體營養$ 基質 IPTG誘導濃度 (μΜ) 最終細胞密度 (〇D55〇) 酵素比活性 (Miller 單位）酵素總活性: (單位） 0 5.1 330 1690 pACYC184/pTac-Z LB 100 4.8 26600 127680(1) 300 4.7 29100 136770(1) p AC Y C-Asp A/pT ac-Z 0 5.0 310 1550 32 1290175 LB 100 5.7 29810 169920(1.3) 300 5.1 33800 172380(1.3) 0 6.0 130 780 pACYC184/pTac-Z LBG 100 5.9 24600 145140(1) 300 5.8 29800 172840(1) 0 5.7 300 1710 pACYC-AspA/pTac-Z LBG 100 6.5 38800 252200(1.7) 300 5.4 58300 314820(1.8) 0 5.6 500 2800 pACYC184/pTac-Z M9Y 100 5.2 16600 86320(1) 300 4.8 18000 86400 (1) 0 5.7 860 4900 pACYC-AspA/pTac-Z M9Y 100 5.8 18100 104980(1.2) 300 5.2 24000 124800(1.4) 0 4.3 390 1680 pACYC184/pTac-Z M9YA 100 4.1 23800 97580 (1) 300 3.9 27100 105690(1) 0 4.1 380 1560 pACYC-AspA/pTac-Z M9YA 100 5.2 42800 222560 (2.3) 300 4.4 58700 258280 (2.4) *註·括弧中的數字代表是在相同條件下各重組型菌株（VJS676/pACYC-AspA/pTae_z) 相對於對照菌株(VJS676/PACYC184/PTaoZ)所獲得的酵素總活性的比值。相對酵素總活性的计异方式疋將表中經誘導後各重組型菌株所測得的酵素總活性除以經相同IPTG 濃度誘導後對照菌株的酵素總活性。營養基質簡稱：LB，即為LB培養基；LBG , 即為LB培養基加上葡萄糖(0.2%)，M9Y ’即為]V19培養基加上葡萄糖（〇 1% ) 和酵母萃取物(〇·5%) ; M9YA，即為M9培養基加上葡萄糖（〇1%)、酵母萃取物(0.2%)和天冬胺酸（0.5%)。根據表2顯示在不同的培養基培養下，對照菌株 (VJS676/pACYC184/pTac-Z)和具有天冬胺酸分解酶活性的菌株（VJS676/pACYC-AspA/pTac-Z)所生成的卜半乳糖苷分解酶可隨著IPTG誘導量的增加而提高。在以lb 為培養基和相同的誘導條件下，與經誘導的對照菌株所生成的β-半乳糖苷分解酶總生成量（即酵素總活性）相較，具有天冬胺酸分解酶活性的菌株的產量可提高30%，而在 33 1290175 以LB添加葡萄糖為培養基（LBG)的條件下，具有天冬胺酸分解酶活性的菌株的總產量則可提高70-80 %。如實施例三的說明，由於LB營養基内含有天冬胺酸，因此重鴛組型的菌株可藉由生成的天冬胺酸分解酶活性來增進有效的碳源和能量，所以可以提高重組型蛋白質如β-半乳糖 Λ 苷分解酶的產量。同樣的，以Μ9營養基加上葡萄糖和酵母萃取物（Μ9Υ)進行菌株培養時，與經誘導後的對照菌株相較，具有天冬胺酸分解酶活性的菌株可以增加30-50 %的β-半乳糖苷分解酶的總生成量。然而以Μ9營養基加鲁上葡萄糖、酵母萃取和天冬胺酸（Μ9ΥΑ)為培養基時，相較於經誘導的對照菌株，具有天冬胺酸分解酶活性的菌株可提高130-140%的β-半乳糖苷分解酶總生成量。這些結果說明在使用這些營養基的條件下，具有天冬胺酸分解酶活性的菌株可藉此提高細胞内的有效碳源和能量，而額外在培養基中添加天冬胺酸，更能增加胞内碳源和能量的效能，因此可以大量提高重組型蛋白質的產量。實施例五、以具有天冬胺酸分解酶活性的大腸桿菌來生 · 產異源蛋白質（heterologous protein) —水母綠色螢光蛋 ^ % { Aequorea green fluorescent protein) 根據第十三圖，本實施例所使用之質體pACYC-Al 其結構與質體pACYC-AspA (參考第五圖）相似，除了質 ” 體pACYC-Al不含有似的結構基因以外。其建構方式係由質體pACYC-AspA以限制酶万amHI和所以III切割移除的結構基因，再將剩餘的質體DNA以T4 DNA聚合酶（T4DNA polymerase)抹平（blunt ended)，最後以 34 1290175 T4DNA黏接酶黏接以得到質體pACYC-Al (參見第十三圖）〇如第十四圖所示，質體pGFPuv (源自bd Biosciences Clontech )具有pUC複製源點和胺苄青黴素抗性基因，且含有一個突變型的水母（d叫⑽rea Wcior/aJ 綠色螢光蛋白質的結構基因，其基因表現受到一個Zac啟動子調控。根據前述之質體轉形法.，將質體pACYC-Al 和pACYC-AspA分別連同質體pGFPuv轉形至大腸桿菌菌株BL21 ( Novagen Co·)内，而得到以下重組菌株 BL21/pGFPuv/pACYC-Al 和 BL21/pGFPuv/pACYC· AspA 〇重組型菌株的培養係根據實施例二所述方式進行，而使用的營養基分別為LB加上葡萄糖（0.2%)以及M9加上葡萄糖（0.1%)、酵母萃取物（0.2%)和天冬胺酸（〇·5%), 而抗生素使用量分別為15 pg/mL胺苄青黴素和1 〇 gg/mL 氣黴素。當新接種的菌液的細胞密度達到大約0.3 (〇〇55()) 時，將100 μΜ IPTG加入至培養液中，俾以誘導重組型菌株來生產重組型蛋白質產物，並隨著培養時間收取菌液樣品以測量細胞密度，並在培養時間達10小時後，以離心方式收集細胞。並以高壓均質機（French Press)將收集到的細胞打破，然後以冷凍離心機分離細胞並回收上清液。接著以 Protein Assay Reagent (BioRad Co_)來測量所收集的上清液内的蛋白質濃度，並以西方墨點分析來免疫檢測重組型蛋白質的生產量。根據第十五圖之西方墨點圖，顯示以M9加上〇.1% 葡萄糖、0.2%酵母萃取物和0.5%天冬胺酸（徑2-5)以及 35 1290175 LB加上0.1%葡萄糖（徑6-9)為培養基的條件下，以水母綠色螢光蛋白質的一次抗體來免疫檢測經IPTG誘導的重組型菌株BL21/pGFPuv/pACYC-AspA和對照菌株 BL21 /pGFPuv/pACYC-A1所生成水母綠色螢光蛋白質的生產情形，其中徑1 :蛋白質標準物（MBI Fennentas);徑 2:未經誘導的對照菌株(BL21/pGFPuv/pACYC-Al);徑3 : 以 100 μΜ IPTG 誘導的對照菌株 (BL21/pGFPuv/pACYC-Al);徑4:未經誘導的重組型菌株（BL21/pGFPuv/pACYC-AspA);徑 5 :以 1〇〇 μΜ IPTG 誘導的重組型菌株(BL21/pGFPuv/pACYC-AspA);徑6 : 未經誘導的對照菌株(8[21々0卩？1^/?八€丫(：-八1);徑7: 以 100 μΜ IPTG 誘導的對照菌株 (BL21/pGFPuv/pACYC-Al);徑8:未經誘導的重組型菌株（BL21/pGFPuv/pACYC-AspA);徑 9 ··以 1〇〇 μΜ IPTG 誘導的重組型菌株(BL21/pGFPuv/pACYC-AspA)。在使用M9加上葡萄糖、酵母萃取物和天冬胺酸為培養基的條件下，於發酵十小時後，未經IPTG誘導的對照菌株（BL21/pGFPuv/pACYC-Al)和重組菌株 (BL21/pGFPuv/pACYC-AspA)的生長密度可達到 4.0 (〇D55〇 )，而經IPTG誘導後，對照菌株 (BL21/pGFPuv/pACYC-Al)的細胞密度達 3·6 (〇〇55〇)，具有天冬胺酸分解酶活性的菌株 (BL21/pGFPuv/pACYC_AspA)可生長至 4·6 ( 〇D55())。根據第十五圖之西方墨點分析所示，經IPTG誘導後的菌株玎以生產較多的水母綠色螢光蛋白質；另外以影像分析儀 (GAS9000，UVItec)來分析定量經電泳凝膠分離的蛋白質 1290175 生成量則顯示，相較於經誘導的對照菌株（徑3)，受誘導的具有天冬胺酸分解酶活性的菌株可以生產多出1〇〇 %的水母綠色螢光蛋白質（徑5)。在使用LB加上葡萄糖為培養基的條件下，於發酵十小時後，無論是否受IPTG誘導的對照菌株 (BL21/pGFPuv/pACYC-Al)的生長密度均達到 5.1 (OD550 )，而未經IPTG誘導的重組菌株 (BL21/pGFPuv/pACYC-AspA)的生長密度也可達到51 (OD^o)。反觀經IPTG誘導的具有天冬胺酸分解酶活性的菌株（BL21/pGFPuv/pACYC-AspA)卻可生長至 6 4 (〇d55〇)。同樣地，根據第十五圖西方墨點分析顯示，對照菌株（BL21/pGFPuv/pACYC-Al)和重組菌株 (BL21/pGFPuv/pACYC-AspA)的水母綠色螢光蛋白質生成量可受到IPTG誘導而增加；以影像分析儀（GAS9000, UVItec)來分析定量經電泳凝膠分離的蛋白質生成量則得知，比較經誘導的菌株的水母綠色螢光蛋白質的生產量，具有天冬胺酸分解酶活性的菌株（徑9)可以生產比對照菌株（徑7)多出5倍的蛋白生成。縱上所述，無論使用M9加上葡萄糖、酵母萃取物和天冬胺酸為培養基或使用LB加上葡萄糖為培養基的條件下，相對於被誘導生產綠色螢光蛋白質的對照菌楝 (BL21/pGFPuv/pACYC-Al)，經同樣條件誘導的具有天冬胺酸分解酶活性的菌株(：81^214〇??1^4八0丫0八3?八)可以生成高出1-5倍的綠色螢光蛋白質，而生長狀況也較佳，最終細胞密度可增加20%以上。此實施例顯示本發明之天冬胺酸分解酶，可以賦予經轉形之宿主細胞提高生成重級 37 1290175 型蛋白質產物（例如水母綠色螢光蛋白質）之效能。其-他貫施熊掃— 在本說明書中所揭露的所有特徵都可能與其他方法結合’本說明書中所揭露的每一個特徵都可能選擇性的以相同、相等或相似目的特徵所取代，因此，除了特別顯著的特徵之外，所有的本說明書所揭露的特徵僅是相等或相似特徵中的一個例子。【圖式簡單說明】第一圖係顯示大腸桿菌細胞内之中樞代謝（central metabolism )包括糖分解和三羧酸循環代謝途徑。其中 ppc ’鱗酸婦醇丙g同酸酸基化酶（phsophoenolpyruvate carboxylase)基因；似/?^4，天冬胺酸分解酶（aspartase) 基因；NADH ，菸醯胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamide-adenine dinucleotide) ° 第二圖係質體pA199A-2之架構圖。其中含有·· pMBl ，質體pMBl的複製源點；PA1，T7 A1啟動子；/加/， /ac/抑制蛋白質基因；m^TlT2，基因轉錄終止位址(transcriptional termination site) ; Apr，胺节青黴素抗性基因，以及多重選殖位址（multiple cloning site, MCS)，其中所包含的核糖體結合位址（rbs)與限制酶切割位置被標示於MCS框内。第三圖係質體pAl-AspA之架構圖。其令含有：ρΜΒΐ〇η·，質體pMBl的複製源點，PA1 ’ Τ7 Α1啟動子；/ac/，/ac/抑制蛋白質基因；rmSTlT2，基因轉錄終止位址；Apr，胺苄青黴素抗性基 38 1290175 因；；os#，天冬胺酸分解酶結構基因(structural gene) ; ，限制酶也mffl切割位址；///rnim，限制酶所Win切割位址；，限制酶iVh/I切割位址。第四圖係質體PACYC184之架構圖。其中含有Cmf， ^ 氣黴素抗性基因；ρ15Α πζ·，質體pl5A的複製源點；TV， - 四環素抗性基因；iVrzJ，限制酶切割位址；i/hdIII，限制酶/ihdIII切割位址。第五圖係質體pACYC-AspA之架構圖。其中含有Cm1*，氣黴素抗性基因；pl5A on·，質體pl5A的複製源點；PA1，T7 A1啟動子；ay/以，天冬胺酸分解酶結構基因；/沉/，/沉/抑制蛋白質基因； ® ，限制酶切割位址；Λ^η/Ι，限制酶TVrwI切割位址； ///•milll，限制酶//zmilll切割位址。第六圖係一生產天冬胺酸分解酶之重組型大腸桿菌的蛋白質電泳圖。第七圖係一重組型菌株 VJS676/pA199A-2和 VJS676/pAl_AspA於M9添加葡萄糖以及M9添加葡萄糖和天冬胺酸之營養基的生長曲線圖。其中加入300 μΜ IPTG進行誘導(如箭頭指示處）。 Φ 第八圖係一重組型菌株VJS676/pA199A-2和 VJS676/pAl-AspA於LB營養基的生長曲線圖。其中加入300 pMIPTG進行誘導(如箭頭指示處）。第九圖係質體ΡΑΗ55之架構圖。其中含有Kmr，康那黴素 (kanamydn)抗性基因；R6Kor/，質體R6K的複製源點；ptac，_ 啟動子；kef，/沉/抑制蛋白質基因；t0，λ噬菌體的基因轉錄終止位址0 39 1290175 第十圖係質體pTrc99A之架構圖。其中含有有Apr，胺苄青黴素抗性基因；Ptrc，啟動子；/π，，/ac/抑制蛋白質基因；rrMTlT2，rr仏5基因轉錄終止位址；五aRV，限制酶五coRV切割位址；以及多重選殖位址，其限制酶切割位置被標示於MCS框内。第十一圖係質體pTac99A之架構圖。其中含有有 APf，胺T青黴素抗性基因；Ptac，Me啟動子；抑制蛋白質基因；rrMT 1Τ2，rr«J5基因轉錄終止位址；五c〇RV，限制酶EeoRV切割位址；t0，λ嗟菌體的基因轉錄終止位址；以及多重選殖位址，其限制酶切割位置被標示於MCS框内。弟十二圖係質體pTac-Z之架構圖。其中含有有Apr，胺苄青黴素抗性基因；Ptac，Me啟動子；/ac/〃，/ac/抑制蛋白質基因；rrMT 1T2，rrM基因轉錄終止位址；/“d β-半乳糖苷分解酶結構基因；///wdlll，限制酶切割位址；iVed，限制酶切割位址；t0，λ嗔菌體的基因轉錄終止位址。第十三圖係質體pACYC-Al之架構圖。其中含有 Cmr，氯黴素抗性基因；pl5A orz·，質體pi5A的複製源點；PA1，T7 A1啟動子；/此/，/(^/抑制蛋白質基因；，限制酶iVrt/I切割位址；[5amHI//iz>2dIII]，限制酶、/^>2dIII切割位址經質體建構過程中被抹平消除。第十四圖係質體pGFPuv之架構圖。其中含有有Apr，胺T青黴素抗性基因；pUC or/，質體PUC的複製源點； Piac ’ /ac啟動子，GFPuv ’水母綠色榮光蛋白質（1分⑽rea green fluorescent protein )結構基因。 40 1290175 第十五圖係一以具有天冬胺酸分解酶活性的大腸桿菌生產水母綠色螢光蛋白質之西方墨點圖。【主要元件符號對照說明】無

41 1290175 序列表 <110>行政院農業委員會台中區農業改良場 <120>促進細胞生長和增加欲表現的目標基因產物生產量之方法 <130> 04p0443 <160〉 7 <170〉 Patentln version 3.3

28 <210〉 1 <211> 28 <212〉 DNA <213> Artificial <220> <223>引子 <400〉 1 cacaggatcc acaacattcg tatcgaag <210〉 2 <211> 33 # <212〉 DNA <213> Artificial <220〉 <223>引子 · <400〉 2 gctaagctta ctgttcgctt tcatcattat age 33 <210〉 3 <211> 28 1 1290175 <212> DNA <213> Artificial <220〉 <223>引子 <400〉 3 taactcgcga taattgcgtt gcgctcac <210> 4 <211> 29 <212〉 DNA <213> Artificial <220〉 <223>引子 <400〉 4 cgcccatggt atatctcctt cttacaagc <210〉 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223>引子 <400> 5 acagccatgg ccatgattac ggattcac <210〉 6 <211> 28 <212〉 DNA <213> Artificial 1290175 <220〉 <223>引子 <400> 6

cggaagcttt tatttttgac accagacc <210〉 7 <211〉 2040 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 tgatcagcga aacactttta atcatctccg ccgctgggtt ttcacccgcc gccatttttt gctgcatcag cacgaaattc ttaaagccct ggttacgtac cagtgacata ccgataactg acgtgaatat aaccagcacg agggtcagca atacccccaa tacatgggca acctgaataa agattgaaat ctcaatatag acataaagga aaatggcaat aaaaggtaac cagcgcaaag gtttctcctg taatagcagc cggttaaccc cggctacctg aatgggttgc gaatcgcgtt tagcttatat tgtggtcatt agcaaaattt caagatgttt gcgcaactat ttttggtagt aatcccaaag cggtgatcta tttcacaaat taataattaa ggggtaaaaa ccgacactta aagtgatcca gattacggta gaaatcctca agcagcatat gatctcgggt attcggtcga tgcaggggat aatcgtcggt cgaaaaacat tcgaaaccac atatattctg tgtgtttaaa gcaaatcatt ggcagcttga aaaagaaggt tcacatgtca aacaacattc gtatcgaaga agatctgttg ggtaccaggg aagttccagc tgatgcctac tatggtgttc acactctgag agcgattgta aacttctata tcagcaacaa caaaatcagt gatattcctg aatttgttcg 1290175 cggtatggta atggttaaaa aagccgcagc tatggcaaac aaagagctgc aaaccattcc 780 taaaagtgta gcgaatgcca tcattgccgc atgtgatgaa gtcctgaaca acggaaaatg 840 catggatcag ttcccggtag acgtctacca gggcggcgca ggtacttccg taaacatgaa 900 caccaacgaa gtgctggcca atatcggtct ggaactgatg ggtcaccaaa aaggtgaata 960 tcagtacctg aacccgaacg accatgttaa caaatgtcag tccactaacg acgcctaccc 1020 gaccggtttc cgtatcgcag tttactcttc cctgattaag ctggtagatg cgattaacca 1080 actgcgtgaa ggctttgaac gtaaagctgt cgaattccag gacatcctga aaatgggtcg 1140 tacccagctg caggacgcag taccgatgac cctcggtcag gaattccgcg ctttcagcat 1200 cctgctgaaa gaagaagtga aaaacatcca acgtaccgct gaactgctgc tggaagttaa 1260 ccttggtgca acagcaatcg gtactggtct gaacacgccg aaagagtact ctccgctggc 1320 agtgaaaaaa ctggctgaag ttactggctt cccatgcgta ccggctgaag acctgatcga 1380 agcgacctct gactgcggcg cttatgttat ggttcacggc gcgctgaaac gcctggctgt 1440 gaagatgtcc aaaatctgta acgacctgcg cttgctctct tcaggcccac gtgccggcct 1500 gaacgagatc aacctgccgg aactgcaggc gggctcttcc atcatgccag ctaaagtaaa 1560 cccggttgtt ccggaagtgg ttaaccaggt atgcttcaaa gtcatcggta acgacaccac 1620 tgttaccatg gcagcagaag caggtcagct gcagttgaac gttatggagc cggtcattgg 1680 ccaggccatg ttcgaatccg ttcacattct gaccaacgct tgctacaacc tgctggaaaa 1740 atgcattaac ggcatcactg ctaacaaaga agtgtgcgaa ggttacgttt acaactctat 1800 cggtatcgtt acttacctga acccgttcat cggtcaccac aacggtgaca tcgtgggtaa 1860 1290175 aatctgtgcc gaaaccggta agagtgtacg tgaagtcgtt ctggaacgcg gtctgttgac tgaagcggaa cttgacgata ttttctccgt acagaatctg atgcacccgg cttacaaagc aaaacgctat actgatgaaa gcgaacagta atcgtacagg gtagtacaaa taaaaaaggc 1920 1980 2040

Claims

1290175 十、申請專利範圍： 1· 一種促進細胞生長之方法，包含下列步驟·· ⑷將一編碼為天冬胺酸分解酶之核酸序列選殖於一載體’以成為一重組載體，其中前述重級栽體係包含：一以異丙基硫代半乳糖吡喃苷（IPTG)調控之啟動子；一編碼為天冬胺酸分解酶之核酸序列SEQ NO: 7，該核酸序列可操控連接並插入該啟動子之下游； (b)將步驟（a)之重組載體轉形至一宿主細胞，以產生一重組型宿主細胞，其中前述宿主細胞係大腸桿菌（五 ⑺"）；及 (C)將步驟（b)之重組型宿主細胞培養於含有天冬胺酸之培養基中，使細胞中之天冬胺酸分解酶之基因表現，進而促進前述重組型宿主細胞之生長。 2·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述步驟（❼之啟動子係包含組成性（constitutive)啟動子或其他可調控之啟動子。 3.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述培養基係為LB。 4·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述培養基係包含LB以及葡萄糖。 5·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述培養基係包含M9、葡萄糖以及天冬胺酸，其中M9含有Na2HP04 (6g/L)、KH2P04 (3 g/L)、NaCl (0.5g/L)、NH4CI (lg/L)、Mgs〇4 • 7H20 (1 mM)、CaCl2 (0.1 mM) 〇 6·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述培養基係 1 1290175 包含M9、葡萄糖、酵母萃取物與天冬胺酸，其中M9含有 Na2HP04 (6g/L)、KH2P04 (3 g/L)、NaCl (0.5g/L)、NH4CI (lg/L)、MgS04 · 7H20 (1 mM)、CaCl2 (0.1 mM) 〇 7· —種增加細胞生產目標基因產物生產量之方法，包含下列步驟： (a) 建構一含有編碼天冬胺酸分解酶之核酸序列之重組載體，其中前述重組載體係包含：一以異丙基硫代半乳糖吡喃苷（IPTG)調控之啟動子；一編碼為天冬胺酸分解酶之核酸序列SEQ ID NO: 7,該核酸序列可操控連接並插入該啟動子之下游； (b) 建構一含有欲表達之目標基因之重組載體，其包含：一以異丙基硫代半乳糖吡喃皆（IpTG)調控之啟動子，一欲表達之目標基因之核酸序列，該核酸序列可操控連接並插入該啟動子之下游； (c) 將步驟⑷與（b)之重組载體共同轉形至一宿主細胞，產生一重組型宿主細胞，其中前述宿主細胞係大腸桿菌；及 (d) 將步驟（c)之重組型宿主細胞培養於含有天冬胺酸之培養基中，並誘導使前述重組型宿主細胞生產天冬胺酸分解酶以及欲表達之目標基因產物，其中前述天冬胺酸分解義可增加前述重組型宿主細胞生產欲表達之目標基因產物之生產量。 8.如申請專利範圍第7項所逃之方法，其中前述含有編碼天冬胺酸分解酶之核酸序列之重組載體的啟動子係包含組成性（constitutive)啟動？或其他可調控啟動子。 9·如申請專利_第7項所述之方法，其中前述含有欲表 2 1290175 達之目標基因之重組載體的啟動子係包I (constitutive)啟動子或其他可調控啟動子。 10.如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述步驟(d)vf? 之目標基因產物包含重組蛋白質或多肽。 11·如申請專利範圍第10項所述之方法，其中前述重組蛋白質包括異源蛋白質或同源蛋白質。 12·如申請專利範圍第11項所述之方法，其中前述之異源蛋白質係為水母綠色螢光蛋白質。 13·如申請專利範圍第11項所述之方法，其中前述之同源蛋白質係為β-半乳糖苷分解酶。 14. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述之培養基係包含LB。 15. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述之培養基係包含LB以及葡萄糖。 16·如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述之培養基係包含Μ9、葡萄糖以及天冬胺酸，其中Μ9含有Na2HP04 (6g/L)、KH2P04 (3 g/L)、NaCl (0.5g/L)、NH4CI (lg/L)、MgS04 • 7H20 (1 mM)、CaCl2 (0.1 mM)。 17·如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述之培養基係包含M9、葡萄糖、酵母萃取物與天冬胺酸，其中M9 含有 Na2HP04 (6g/L)、KH2P〇4 (3 g/L)、NaCl (0.5g/L)、NHUCl (lg/L)、MgS04 · 7H20 (1 mM)、CaCl2 (0·1 mM) 〇