TWI288176B - Probe medium and method of producing the same - Google Patents

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1288176 (1) 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於探針介質，包括能專一結合至目標物質 之探針以及製造此探針介質之方法。此外，本發明係關於 有效固定化探針在基底上之探針介質、製造此探針介質之 方法、以及使用此探針介質固定化探針之方法。此外，本 發明係關於經固定化探針在基底上得到的固定化探針基底 、以及使用此固定化探針基底偵測目標物質之檢測成分以 及檢測方法。 【先前技術】 生物科技最近的進步，包括··遺傳工程學以及分子生 物學，使得脫氧核糖核酸以及RNA之含量可以診斷傳染 性疾病、癌症、遺傳疾病等。用於診斷核酸例如脫氧核糖 核酸或RNA的工具之一中，其注意力已集中在脫氧核糖 核酸晶片以及脫氧核糖核酸陣列。包括脫氧核糖核酸晶片 以及脫氧核糖核酸陣列、探針例如核酸之臨床檢驗工具是 固定於基底，然後使用探針和目標物質雜交以偵測目標物 質。此能專一結合至目標物質，例如脫氧核糖核酸、RNA 、以及核酸之探針是可溶解於水以及如此彼可容易地溶於 水，但幾乎不可溶解於有機溶劑，例如：乙醇、異丙醇、 異戊醇、二丙二醇、以及氯仿。 爲了形成預先製備的探針例如脫氧核糖核酸晶片或脫 氧核糖核酸陣列是經墨點方法或類似方法固定化之基底， -4- (2) 1288176 當探針固定於基底時一般是經溶解探針於內含水或水之混 合物以及酸鹼度-調整材料之水溶液以製備探針介質，以 及將探針介質與基底接觸將探針固定在基底上。更明確的 說，例如日本專利申請案H0 8-23 975描述將探針固定在基 底上之方法，其中探針水溶液是經溶解脫氧核糖核酸於水 加以製備以及將如此製備的探針介質分發以及滴到表面處 理的平板以將探針固定在基底上。此外，日本專利申請案 公開第H05- 1 92 1 98號描述經調整脫氧核糖核酸之濃度製 備探針介質之方法，其係經溶解脫氧核糖核酸於10-毫莫 耳濃度Tris-HCl (ρΗ7·6)/1-毫莫耳濃度乙二氨四醋酸溶液 、添加四倍體積之Η20以及五倍體積之一個固定緩衝液 (1 .5 M NaCl，0.3 M Tris-HCl(酸鹼度 8·0)、以及 0‘3 Μ MgCl 2)至緩衝的脫氧核糖核酸，以及共同攪拌。此外日 本專利申請案公開第2000- 1 4697 1號，描述一種方法，其 係製備5’-端點引入生物素之寡核苷酸水溶液、點上異氰 酸酯顯微玻片、以及固定，在37 °C反應15分鐘。此外， 在曰本專利第2794728號中，單股脫氧核糖核酸經TE緩 衝液（10毫莫耳濃度Tris-HCl(酸鹼度7.5)/ 1毫莫耳濃度 乙二氨四醋酸）系列的稀釋製備探針介質。將製備的探針 介質點上硝化纖維素薄膜，接著空氣-以及加熱-乾燥將脫 氧核糖核酸固定在基底上。 然而包括探針（常用且能分別專一結合至目標物質）之 探針培養液，作爲基質將探針固定在基底上，沒有一種探 針介質，其中探針是溶於有機溶劑而不溶於水溶液。此外 (3) 1288176 ，沒有一種探針介質，其中內含能溶解於有機溶劑而不溶 於水浴液之探針。 在各習見的探針培養液之內，能專一結合至目標物質 的探針是溶於水或一個含有水、酸鹼度-調整物質、以及 降低吸附物質之水溶液。此外，亦習知的是宜添加小量以 (乙）二醇爲底質的溶劑或酒精爲底質的溶劑將探針介質藉 由點或類似方法點在基底上。然而沒有一種製備的探針介 質是將探針例如脫氧核糖核酸或RNA之核酸溶於不溶探 針的有機溶劑。因此，因爲探針不溶於有機溶劑，所以難 於體認僅包括有機溶劑而不含水之探針介質可適當的將探 針介質點在基底上。 溶解探針（諸如DNA或RNA之核酸）於有機溶劑中以 自樣本中萃取該探針係爲習知。然而作爲將探針固定在基 底上之探針介質，沒有一種探針介質其是將探針溶於有機 溶劑。此外，結合探針例如脫氧核糖核酸或RNA之核酸 至能結合核酸之載體時，載體係懸浮於內含結合核酸之表 面活性劑的溶液以萃取探針。然而沒有一種案例其探針是 溶於內含表面活性劑之溶液，然後使用此溶液作爲探針介 質。 【發明內容】 本發明槪要 本發明第一個目的是提供探針介質，其係包含能專一 結合至目標物質的探針、有機溶劑、以及在有機溶劑內溶 (4) 1288176 解探針之物質。 本：# S月第二個目的是用溶劑溶解探針以及用此溶解探 隹十5： ί容齊ί從溶劑中分離探針、以及添加有機溶劑至探針以 溶解其中之探針。 本發明第三個目的是確認由探針之沈澱和再溶解而於 有^幾溶劑中溶解探針的物質量以及準備沈澱該探針之該物 質量’因而有效地溶解該探針於該有機溶劑中。 描述如下之本發明已解決上述的問題。即本發明包括 下列構型：（1 ) 一種探針介質包括能專一結合至目標物質 之探針、內含一個有機溶劑之基質、以及在有機溶劑之內 溶解探針之物質。此探針宜爲核酸探針。較佳之有機溶劑 爲不溶解探針的溶劑。在有機溶劑之內溶解探針之物質較 佳者爲兩性的物質。在有機溶劑之內溶解探針之物質較佳 者係選自：正十六烷基三甲基溴化銨、正十六烷基三甲基 氯化銨、以及十六烷基氯化吡啶、或內含至少一種選自此 集團物質之混合物。較佳者，此探針介質進一步的包含將 探針固定在基底之上之物質。將探針固定在基底上之物質 ，較佳者爲矽烷偶聯劑。較佳者，此探針介質進一步的包 含可溶解探針的溶劑。在有機溶劑之內溶解探針之物質其 含量宜調整在可觀察到探針介質濁度的範圍以內。 (2)—種製造含有能專一結合至目標物質之探針的探 針介質的方法，其包含以下之步驟：在可溶解探針的溶劑 之內溶解探針；從溶劑中經有機溶劑之內溶解探針物質之 溶劑的作用分離探針；以及在有機溶劑之內經加入有機溶 (5) 1288176 劑至探針溶解探針。在有機溶劑之內溶解探針之物質其含 量宜基於產物之探針長度以及探針莫耳數。在有機溶劑之 內溶解探針之物質其含量宜根據分離自溶劑之探針含量。 (3) 經墨點在基底上提供探針介質將探針固定在基底 上之方法。 (4) 以探針固定方法製作之檢測元件。 依據本發明，經使用包括能專一結合至目標物質之探 針、內含有機溶劑之基質、以及在有機溶劑之內溶解探針 之物質的探針介質，探針可有效地固定於基底。此探針介 質包括在有機溶劑之內溶解探針允許探針溶於有機溶劑之 探針以及物質，而製備在基底上點上探針介質具有適當的 組成之探針介質。此外，當探針介質含有將探針固定在基 底上之物質時，此探針可有效地結合至此物質以固定此探 針，使此探針有效地固定於此基底之上。此外，經探針以 及物質間之結合可將探針固定在基底上，此製程之控制很 簡單以及製造時間很短。 此外依據本發明固定不同探針在基底上時，可基於各 探針類型選擇任何型式之結合物質以及其濃度。此外，可 視探針類型選擇適當固定探針之物質。此外，可視探針以 及將探針固定在基底上之物質製備探針介質之組成。因此 ，在最佳的條件下每個探針類型以及固定探針之物質的組 合中，許多不同探針可結合至基底。 此外，在可溶解探針的溶劑之內溶解探針之後，在有 機溶劑之內溶解探針之物質作用在溶劑上時可從溶劑中分 -8- 1288176 (6) 離W針以及在探針中加入一種有機溶劑以在有機溶劑之內 溶解探針，從而有效地將探針固定在基底上。 較佳具體實施例之說明 依據本發明之探針介質包括能專一結合至目標物質之 探針、內含一個有機溶劑之基質、以及在有機溶劑之內溶 解探針之物質。此外，本發明之探針介質的製作方法包含 之步驟爲：在可溶解探針之溶劑內溶解探針、將探針與物 質作用在有機溶劑內溶解探針以從溶劑中分離探針、以及 添加入一個不溶解探針的有機溶劑在有機溶劑之內溶解探 針。依據本發明，製造探針介質之方法包含上述的步驟。 此外，依據本發明將探針固定在基底上之方法包含使探針 介質吸附在基底上之步驟。 :單股的核酸探針、單鏈脫氧核糖核酸探針 、單股的RNA探針、單股的PNA探針、以及單糖鏈探針 。例如就在探針介質之內探針之穩定性而言，製備之含雙 體至5 00聚體之探針，尤其是雙體至80聚體的探針介質 其含量是介於0.05至500毫莫耳/升（以下”升”縮寫成”1”） ，尤其是介於0.5至50毫莫耳/升。 探針可帶有與基底結合之反應位點。反應位點可爲官 能基、生物素等，可提供具有適當長度的連結子部份。例 如官能基可包括胺基（NH2)基團、羰基（COOH)基團、氫硫 基（SH)基團及羥基（〇H)基團。特定言之，較佳之探針官能 基是胺基（因爲易於合成此探針官能基）或氫硫基團（因爲 -9- (7) 1288176 此探針官能基之反應性佳）。 可溶解探針的溶劑包含水、乙二醇、以及丙二醇。此 外，如須要可使用兩種或多種溶劑組合。水中加鹽例如氯 化鈉或酸例如磷酸後可成爲一種溶解探針之溶液。 在有機溶劑之內溶解探針之物質宜爲兩性劑以及特別 包含表面活性劑、能形成微胞催化劑之表面活性劑等。尤 其較佳的表面活性劑是陽離子表面活性劑，包括：十六烷 基氯化吡啶、鯨蠟基三甲基溴化銨、以及鯨蠟基三氯化甲 銨。就探針之穩定性而言，以及探針溶解至有機溶劑之溶 解度而言，可調整表面活性劑在探針介質內之含量至例如 0.2微莫耳/升或更多，較佳者1微莫耳/升或更多，但少 於400,000微莫耳/升或更少，較佳者少於40,000微莫耳/ 升或更少。調整表面活性劑施於探針介質之用量是基於探 針產物之長度以及探針之莫耳數。調整表面活性劑施於探 針介質之用量亦可基於分離自溶劑之探針量。此外，表面 活性劑施於探針介質之用量是經檢查沉澱或重新溶解之探 針証實以及然後加以調整始探針可沈澱。此外，本案發明 人發現表面活性劑之含量宜調整在探針介質導致白色渾濁 懸浮液的範圍之內。 不溶解探針的有機溶劑不僅包含醇類以及酮類且亦包 含許多其它有機溶劑，例如能將探針固定在基底上之溶劑 (例如砍院偶聯劑）。此外’在探針介質內之有機溶劑可爲 單一的類型或兩種或多種類型之混合物。當探針結合至基 底而未與其匕物質重疊時’即在不溶解探針的有機溶劑之 -10- (8) 1288176 內不含將探針固定在基底之上之有機溶劑，較佳之不溶解 探針的有機溶劑爲例如不具有探針與基底反應之反應位點 的醇類。此外，不溶解探針的有機溶劑可包含經由探針與 基底間之反應能將探針固定在基底上之有機溶劑。特定言 之，當探針不結合至基底或者幾乎不結合至基底時，不溶 解探針的有機溶劑宜含有一個將探針固定在基底上之有機 溶劑。將探針固定在基底上之有機溶劑中具有和探針與基 底反應之反應位點的溶劑可爲矽烷偶聯劑或其類似物。已 知有各式各樣不同的矽烷偶聯劑，較佳者包含環氧基矽烷 偶聯劑、異氰酸酯矽烷偶聯劑、氫硫基矽烷偶聯劑、氯丙 基矽烷偶聯劑、以及胺基矽烷偶聯劑。考量探針至基底之 固定性質，在基質之內將探針固定在基底上之有機溶劑含 量在探針介質之內宜調至例如0.05至50,000微莫耳/升， 尤其是10至500微莫耳/升。探針官能基與有機溶劑間之 反應較佳者爲官能基之間化學反應之共價鍵。在化學反應 中，當探針之官能基是胺基（NH2)基團時，較佳的有機溶 劑包含環氧基矽烷偶聯劑、異氰酸酯矽烷偶聯劑、氫硫基 矽烷偶聯劑、以及氯丙基矽烷偶聯劑。當探針之官能基是 羰基（COOH)基團時，較佳的有機溶劑包含胺基矽烷偶聯 劑以及氫硫基矽烷偶聯劑。當探針之官能基是氫硫基（SH) 基團時，較佳的有機溶劑包含環氧基矽烷偶聯劑、異氰酸 酯矽烷偶聯劑、以及乙烯基矽烷偶聯劑。此醇類包含乙醇 、1-丙醇、1-丁醇、以及2-丁醇。酮類包含丙酮和甲基乙 基酮。胺基矽烷偶聯劑包含γ-胺基丙基三甲氧基矽烷、以 -11 - 1288176 Ο) 及N-(3-(氨乙基）γ-胺基丙基三甲氧基矽烷。環氧基矽烷 偶聯劑包含γ-縮水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷、以及γ-縮水甘油氧基丙基三乙氧基矽烷。異氰酸酯矽烷偶聯劑包 含γ_異氰酸酯丙基三乙氧基矽烷、以及γ-異氰酸酯丙基 三甲氧基矽烷。氫硫基矽烷偶聯劑包含γ-氫硫基丙基三甲 氧基矽烷。氯丙基矽烷偶聯劑包含γ -氯丙基三甲氧基矽烷 。乙烯基矽烷偶聯劑包含乙烯基三甲氧基矽烷。不溶解探 針的有機溶劑可爲此類有機溶劑之混合溶劑。較佳之溶解 探針的有機溶劑爲攪拌探針、可溶解探針的溶劑、在有機 溶劑之內溶解探針之物質，以及製備探針介質時不會分離 成兩種或多種相之不溶解探針的有機溶劑、或有機溶劑混 合物製備的有機溶劑。 此外，如須要此探針介質中可與水溶性聚合物材料混 合。水溶性聚合物材料包含聚乙烯醇（PVA)、聚乙烯基啦 咯烷酮（PVP)、paogen、羧甲基纖維素（CMC)、羥基乙基 纖維（HEC)、右旋聚醣、以及支鏈澱粉。較佳的水溶性聚 合物材料一般而言是例如聚乙烯醇（PVA)以及聚乙烯基啦 略院酮（PVP)。若須要可使用單獨或組合之聚合物材料。 攪拌水溶性聚合物材料與基質較佳的方法包括之步驟 爲製備預先完全溶解水溶性聚合物材料於預定濃度的溶液 、稱重此製造的聚合物材料溶液以在基質內取得聚合物材 料溶液預定的濃度、以及攪拌此稱重的聚合物溶液與基質 。聚合物材料溶液之特定實施例包含一種得自稱重適當量 的聚乙烯醇粉劑以及於粉劑中添加純水到預期0.5至5% -12- (10) 1288176 質量濃度，接著在加熱下在水之內溶解粉劑的聚合物材料 溶液。較佳者，將製造的聚合物水溶液混合到探針介質， 於探針介質內的含量是0·01至1 %之質量。 有許多方法可製造探針介質。 選擇不同方法時是視於不溶解探針的有機溶劑是否含 有將探針固定在基底上之有機溶劑而定。 當不溶解探針的有機溶劑含有將探針固定在基底上之 有機溶劑時，下列方法可作爲第一種製程。起先將探針和 量的可溶解探針的溶劑混合，在溶劑中溶解探針。然後將 在有機溶劑之內溶解探針之物質加入已溶解探針的溶劑中 。添加物質之方法包含攪拌物質與已溶解探針的溶劑之製 程、在可溶解探針的溶劑之內溶解物質之製程以在攪拌之 前使其具有預定的濃度、以及在不溶解探針的有機溶劑之 內溶解物質之製程以在攪拌之前使其具有預定的濃度。其 中，爲了能夠有效攪拌，較佳的製程是在攪拌之前先在可 溶解探針的溶劑之內溶解物質。在可溶解探針的溶劑中， 有機溶劑內之溶解探針之物質其濃度越高越好，才可能在 有機溶劑之內有效地溶解探針。將內含在有機溶劑之內溶 解探針之物質的溶液滴入已溶解探針的溶劑中以及隨後加 以混合。適當設定滴入物質之含量，在有機溶劑之內溶解 探針之物質的莫耳數相當於探針之莫耳數與探針之鏈長乘 以〇·2至4之結果，較佳者乘以0.5至3。經加入在有機 溶劑之內溶解探針之物質至已溶解探針的溶劑，可自溶劑 分離探針。此外，分離的探針可經離心收集和沉澱。滴入 -13- (11) 1288176 將探針固定在基底之上之有機溶劑以及與內含分離探針的 溶劑混合。雖然用量取決於探針官能基或將探針固定在基 底上之有機溶劑而變化，有機溶劑的攪拌量可適當地調至 0.5至500倍莫耳之莫耳數，較佳者是探針莫耳數之1.0 至50倍。此外，就固定探針的基底之性質而言，在探針 介質之內它的含量宜調至0.05至50,000微莫耳/升，更佳 者例如1 〇至5 00微莫耳/升。攪拌方法無特別限制，只要 能經添加在有機溶劑之內溶解探針之物質以及將探針固定 在基底上之有機溶劑攪拌分離的探針即可。當將探針固定 在基底之上之有機溶劑的比重是高於可溶解探針的溶劑， 經溫和地滴入固定探的有機溶劑到內含分離的探針之溶劑 中可獲得一個有效的反應，以及沈澱以及離心產生之混合 物可得到沉澱。若須要可加熱。加熱時溫度可增加至40 °C至80 °C。當將探針固定在基底之上之有機溶劑之比重 小於可溶解探針的溶劑時，應能充分的自溶劑分離探針， 且沈澱在容器之內固定探針至其底部，接著溫和地滴入固 定探針的有機溶劑到內含探針之溶劑上。其後，密封容器 ，然後傾斜或攪拌內含物使其互相反應。當比重大時若須 要它可加熱。和將探針固定在基底上之有機溶劑攪拌之後 ，若準備製造單一相的探針介質混合物，則添加一個單相 的有機溶劑。例如當將探針固定在基底之上之有機溶劑是 異氰酸酯矽烷偶聯劑以及可溶解探針的溶劑是水，則可經 添加2-丙醇或二丙二醇得到單相。到目前爲止在基底上 固定探針無任何困難，就處理探針介質而言單相是較佳的 -14- (12) 1288176 。添加之有機溶劑量（雖然不是特別地限制）較佳之範圍是 適於設定探針以及將探針固定在基底之預定的濃度至形成 單相的濃度。此外，當須要時水溶性聚合物可和水混合。 攪拌水溶性聚合物和水之方法中，宜製備水溶性聚合物之 水溶液以及然後滴入以及混合以達成預定的量。 第二種製程中，可用以下之方法。起先，滴入在可溶 解探針的溶劑之內溶解在有機溶劑之內溶解探針之物質製 備的溶液以及於內含探針之容器中混合。然後，探針在有 機溶劑之內溶解，而在可溶解探針的基質之內變成不溶。 結果，沈澱出探針。其後，將探針固定在基底之上之有機 溶劑滴到容器，然後良好的混合。爲了充分的偶合探針以 及將探針固定在基底上之有機溶劑，宜調整攪拌之時間以 及溫度。爲了攪拌有機溶劑，攪拌水溶性聚合物和攪拌水 ，進行與第一製程相同之步驟。 第三種製程是預先攪拌探針以及在有機溶劑之內溶解 探針之物質。溶解含小量可溶解探針溶劑的探針之後，滴 入在可溶解探針的溶劑之內溶解在有機溶劑之內溶解探針 之物質製備的溶液以及混合到已溶解探針的溶劑。證實探 針轉向不溶以及沉澱之後，乾燥混合物去除過量的溶劑。 結果，容器內之殘餘物是攪拌探針以及在有機溶劑之內溶 解探針物質之產物。殘餘物可溶於任何有機溶劑，滴入探 針以及混合入將探針固定在基底上之有機溶劑。爲了使探 針充分的耦合至將探針固定在基底上之物質，宜調整攪拌 之時間以及溫度。爲了攪拌有機溶劑，攪拌水溶性聚合物 -15- (13) 1288176 和攪拌水，進行與第一製程相同之步驟。此方法中經攪拌 探針以及在有機溶劑之內溶解探針之物質製備的基質可作 爲固定探針試劑。 當不溶解探針的有機溶劑不含有將探針固定在基底上 之有機溶劑時，第一種製程包括下列步驟。起先正如內含 將探針固定在基底上知有機溶劑之案例，共同混合探針、 可溶解探針的溶劑、在有機溶劑之內溶解探針之物質，以 及然後從溶劑中分離探針。其後，滴入不溶解探針的有機 溶劑以及混合含有分離探針的溶劑。將分離探針溶解於不 溶解探針的有機溶劑，提供由有機溶劑以及可溶解探針的 基質組成之探針介質之基質混合物。由有機溶劑以及可溶 解探針的基質組成之混合基質不形成單一相時，一個額外 的有機溶劑可混合到此混合基質至將探針介質轉變成單一 相的基質。到目前爲止在基底上固定探針無任何困難，就 處理探針介質而言單相探針介質是較佳的。此外，當須要 時水溶性聚合物可和水混合。攪拌水溶性聚合物和水之方 法中，宜製備水溶性聚合物之水溶液以及然後滴入以及混 合以達成預定的量。 第二種製程中，可用以下之方法。起先，滴入在可溶 解探針的溶劑之內溶解在有機溶劑之內溶解探針之物質製 備的溶液以及於內含探針之容器中混合。然後將探針溶於 此有機溶劑。結果’沈殿出探針。其後滴入有機溶劑，然 後混合溶解此探針。有機溶劑可如同第一製程般混合。攪 拌水溶性聚合物和攪拌水可如同第一製程般進行。 -16- (14) 1288176 第三種製程是預先攪拌探針以及在有機溶劑之內溶解 探針之物質。溶解含小量可溶解探針溶劑的探針之後，滴 入在可溶解探針的溶劑之內溶解在有機溶劑之內溶解探針 之物質製備的溶液以及混合到已溶解探針的溶劑。證實探 針轉向不溶以及沉澱之後，乾燥混合物去除過量的溶劑。 結果，容器內之殘餘物是攪拌探針以及在有機溶劑之內溶 解探針物質之產物。殘餘物可溶於有機溶劑，滴入將探針 固定在基底上之有機溶劑並混合以溶解探針。爲了攪拌有 機溶劑，可進行如同第一製程般之步驟。進一步的攪拌水 溶性聚合物和攪拌水可如同第一製程般之進行。 如此得到之探針介質適用於作爲探針介質以製備固定 化探針偵測目標物質。 將得到的探針介質墨點在基底上可製備固定探針之基 底。在其上固定此探針之基底，雖然不受特別地限制，但 考量到偵測知目標物質以及它的多種用途，較佳者是玻片 或石英基底材料、樹脂基底、塑膠基板、或樹脂薄膜。尤 佳的材料是大小1 x 3英吋之玻片。考量探針固定之固定 化性質’當探針介質含有將探針固定在基底上之有機溶劑 ’較佳之基底爲由非鹼玻璃材（不含鹼成分）料製作的玻璃 基板或由石英玻璃材料、塗覆矽土的玻璃材料、或塗覆矽 土的樹脂材料製作的基底。當此探針介質不含有將探針固 定在基底上之有機溶劑時，較佳之基底是表面-處理的玻 璃基板或樹脂材料基底。較佳的表面處理允許探針至容易 地固定於基底。特定言知較佳的表面處理使用偶聯劑以在 -17- (15) 1288176 基底表面上形成與能探針形成共價鍵之官能基。 此外，取決於這偵測目標物質之方法雖然基底之形狀 並非限於平板的形狀，考量基底檢測方法、裝置等的一般 用途，較佳之基底具有平板的形狀。此外，所用的基底表 面平滑性需高。 此外，其上固定此探針之基底，較佳者具有清潔的表 面以均勻地以及穩當地固定化探針。在固定探針之前需要 洗淨基底以確保充分清潔的表面。有許多已知的方法可作 爲洗淨基底之方法。洗淨基底之方法包含用水、藥物溶 液、電漿、UV臭氧、以及空氣吹淨。 因此，宜使用以上之一種洗淨方法，取決於基底之型 態可改變洗淨過程以及其條件。 例如當探針介質含有將探針固定在基底上之有機溶劑 時，宜使用藥物溶液清潔基底的表面。例如用預定濃度的 氫氧化鈉水溶液足以洗淨去除基底表面附著的污物。特定 言之，製備加熱至約5 0 °c的1莫耳/升之氫氧化鈉水溶液 以及在水溶液中擦拭受質表面或在用水溶液沖洗時刷洗以 穩定地移除附著在受質上的污物。去除污物之後，過量的 氫氧化鈉部分可用水清洗。最後，經N2吹去水分。此方 式中基底能均勻地以及穩當地固定化探針介質內之探針。 當探針介質不含有將探針固定在基底上之有機溶劑時 ，宜使用水或溶劑清洗基底之表面、或用空氣吹拂清洗。 例如可用純水去除附著在基底上的外來的物質充分地洗淨 基底之表面。特定言之使用高壓純水沖洗基底之表面去除 -18- (16) 1288176 異物。去除異物之後，基底再一次用純水沖洗洗滌含污染 的純水。最後，經N2吹去水分。此方式中基底能均勻地 以及穩當地固定化探針介質內之探針。 有許多方法將在探針介質內之探針點上基底。特定言 之習知的方法爲釘入法、注射法、以及針入環化法。其中 ，油墨噴射法是較佳的墨點方法，因爲它能至確切地點上 高密度基質。 使用油墨噴射之墨點方法不受特別限制，只要探針介 質從說明如上之油墨噴頭釋出時不實質上影響探針、可溶 解探針的溶劑、不溶解探針的有機溶劑、以及在有機溶劑 之內溶解探針之物質即可，以及基質組成是調製成可正常 自油墨噴頭釋出至基底。例如油墨噴頭是經施用熱能釋放 基質機制之熱泡噴頭，在探針介質之內液體之較佳成分內 含：甘油、硫雙乙醇、異丙醇或乙炔醇。更明確的說， 較佳的探針介質液體內含 5至10%質量之甘油，5至10% 質量之硫雙乙醇、以及〇 · 5至1 %質量之乙炔醇。當噴墨 頭是使用壓電式元件釋放基質的壓電式噴墨頭時，內含乙 二醇及異丙醇之液體對探針介質而言是較佳的成份。更明 確的說內含5至10重量％乙二醇、0.5至2重量％異丙醇 的液體是較佳的探針介質液體。在基質成份，若須要製備 可溶解探針的基質之步驟可經修飾以及可溶解探針的基質 可在攪拌之前添加入水溶性聚合物材料中。 當如此得到之探針介質從油墨噴射頭釋出以及附著在 基底上，釋出基質形成圓形墨點而未延伸至其邊界之外。 -19- (17) 1288176 同樣地，當探針介質點成較高的密度時，可有效地預防毗 連墨點間之連接。注意，本發明中探針介質之特性不受限 制於上述之那些說明。 固定內含於探針介質之內施用在基底上預定位置的探 針之方法，可穩當地預防探針受毗連墨點內之探針的污染 ，以及牢固的將探針固定在基底上，有效之方法係使用有 機溶劑將探針固定在基底之上和各具有可相互反應官能基 之基底上或使用探針以及各具有可相互反應官能基之基底 〇 較佳的實施例中當探針介質含有將探針固定在基底上 之有機溶劑時，在物質上有組合之矽醇（SiOH)基團以及在 基底上有羥基（0H)基團，將探針固定在基底之上。該組合 點在基底上，經由於物質之矽醇基團與基底之羥基間之反 應’能夠固定內含在探針介質之內施用在基底上之物質。 生成基底特定之實施例中將探針固定在基底之上之有機溶 劑宜包括其具有矽醇基團之矽烷偶聯劑。此外，較佳的基 底亦是表面具有矽土塗層、各基底具有羥基的上述玻璃基 板、石英基底、或樹脂基底。 當探針介質不含有將探針固定在基底上之有機溶劑時 ’在探針上一個胺基（NH2)基團以及在基底上一個環氧基 團之組合，以及在探針上一個胺基（NH2)基團以及在基底 上一個異氰酸酯基團是之組合是較佳的範例。該組合允許 探針經墨點固定於基底，使施用在基底上探針介質內探針 之胺基與基底之環氧基團或異氰酸酯基團相互反應。特定 -20- (18) 1288176 言之較佳之探針是附著一個胺基之脫氧核糖核酸與具有一 個環氧基基底之組合，其製備是經引入環氧基團到說明如 上之表面處理的樹脂基底。 此外，當探針介質含有將探針固定在基底上之有機溶 劑時，宜使探針以及將探針固定在基底之上之有機溶劑經 說明如上之探針以及物質間之反應共同結合。該反應允許 探針以及有機溶劑緊密的相互結合。結果，探針牢固的固 定於基底，允許在在預定的位置形成探針墨點。特定言之 ，製備的探針介質包括其具有胺基作爲官能基之探針，以 及具有一個異氰酸酯基團作爲官能基和探針反應的物質以 及作爲官能基和基底之官能基反應的矽醇基團。然後，經 攪拌預定比率的二丙二醇、異丙醇等與探針介質製備探針 溶液。當探針溶液是使用油墨噴射頭點在具有羥基作爲官 能基之基底上時，探針溶液以穩定的方式在基底上形成預 定尺寸的墨點。因此探針可固定在基底之預定的位置。 此外’當探針以及將探針固定在基底之上之有機溶劑 經彼此間之反應相互結合，宜在探針介質之內混合聚乙烯 醇（P V A )作爲水溶性聚合物材料。更佳者可壳全地預先溶 解。攪拌水溶性聚合物材料到探針介質中可增進在基底上 觀察到的墨點狀態以及亦使墨點上之探針介質在點上後難 以乾燥。結果，探針介質以及基底可更穩當地相互反應， 允許探針固定於基底。此外，就經墨點形成之固定探針之 基底的儲藏狀態而言，即使當經墨點形成之探針介質墨點 已乾燥’上述方法可有效地以及穩定地偵測目標物質。 -21 - (19) 1288176 點上探針介質後宜使基底乾燥。乾燥基底允許探針在 #針介質之內穩當地固定於基底。各式各樣不同的乾燥方 法例如包括真空乾燥以及加熱乾燥。其中加熱乾燥方法是 ®當的，因爲它可穩當地以簡單方法進行。於加熱乾燥方 法中較佳的加熱乾燥方法是用加熱板加熱。特定言之，點 上探針介質的基底是放置在加熱板上加熱。放置預定的時 間之後，自加熱板拿開基底以及然後冷卻。就探針之耐熱 性而言，較佳者加熱板加熱至1 00 °c或更低。更明確的說 較佳之溫度範圍是60°c至90°c。基底放置的時間較佳是 30分鐘或更少。更明確的說較佳者介於1至10分鐘。 例如內含20聚體鹼基長度探針之探針介質係以9微 胃耳/升之探針濃度製備。在有機溶劑之內溶解探針之物 質其加入含量是基於計算探針量乘以鹼基鏈之數目加以調 ^ °較佳者，製備時探針量乘以鹼基鏈之數目得到之量是 乘以〇·5至3。固相以及各油墨噴射頭噴嘴間之距離約 0.2至G.5毫米，當從油墨噴射頭之噴嘴釋出探針介質時 墨點在固相上形成約170至250微米之直徑（這釋放量是 約2 0微微升）。此外，從噴嘴釋放液體時使用放大鏡未觀 察到噴濺之任何墨點（以下稱爲”衛星墨點”）。 例如爲了改進使用固定探針之基底偵測目標物質檢測 之準確度（墨點整合強度），在固相之表面固定探針之後， 基底之非探針鍵合部分可加以阻塞以使其不結合至樣本內 之目標物質。例如，在室溫下浸泡基底於2%牛血清白蛋 白（BSA)水溶液約二小時進行阻斷。就預防目標物質吸附 -22- (20) 1288176 至基底固定探針外之部分的效應而言，BSA水溶液是適當 的。注意，如須要可進行阻斷處理。例如，供應樣本至固 定探針之基底應受限於各墨點，當樣本實質上不吸附至墨 點外之部分時可不進行阻斷。樣本是否吸附至墨點外之部 分，取決於基底之材料。特定言之，當基底是由玻璃製品 、石英、或矽土塗層的樹脂製作時，可不進行阻斷處理。 此方法製備的固定探針之基底可構築成例如包含許多 墨點，取決於其用途各具有相同探針。此外，可構築成包 含分別具有不同類型探針之多數的墨點。必要的話探針之 型態、含量、以及陣列可適當地改變。固定探針之基底中 經此方法安排之探針是製備成高密度的排列。然後，基底 是用於偵測目標物質，鑒定目標物質之鹼基序列。例如當 基底用於偵測樣本之內具有已知鹼基序列的單股核酸目標 物質，可使用具有互補至此單股的核酸目標物質鹼基序列 之鹼基序列的單股核酸作爲探針。固定探針之基底上可製 備在固相上安排包括多數墨點的探針。然後將樣本添加至 各固定探針基底之墨點，接著將基底置於單股的核酸目標 物質與探針雜交之條件下。雜交與否之後，各墨點用已知 的方法偵測，例如螢光檢測。因此，可偵測樣本之內目標 物質存在與否。 當它是作爲確認樣本之內目標物質單股的核酸之鹼基 序列’設定兩種或多種目標物質單股核酸的候選鹼基序列 ’然後將互補至各個單股核酸鹼基序列之鹼基序列作爲探 針點在基底上。接著，將樣本添加至各墨點，然後置於允 - 23- (21) 1288176 Η午目標物質單股的核酸與探針雜交之條件。雜交與否之後 ’各墨點用已知的方法偵測，例如螢光檢測。因此，可確 認相關於目標物質單股核酸之鹼基序列。此外，本發明固 定探針基底之其它用途可爲，例如用於篩檢確認脫氧核糖 辛亥酸-結合蛋白質專一性鹼基序列或篩檢具有結合至脫氧 核糖核酸性質之化學物質。 探針介質可爲液體基質內含有機溶劑、探針、可溶解 探針的溶劑、不溶解探針的有機溶劑、以及在有機溶劑之 內溶解探針之物質、以及若須要可加入之成分、將探針固 定在基底上之有機溶劑。此成份可分成至少二群成份，然 後置於不同容器以獨立製備。彼可提供爲反應劑組套，不 同容器之成份於使用時共同混合。 爲了將探針放置在容器之內，容器宜密封以預防其它 雜質之污染。此外，在攪拌固時定須要能容易地打開容器 。然而容器開口無特別地限制以及容器這內之探針可爲溶 液的形式或粉末的形式（雖然無特別地限制）。當官能基是 氫硫基團時，就探針之穩定性而言，探針經冷凍乾燥方法 硏磨，然後在未增加溫度之下儲存。官能基是胺基時，儲 藏之條件宜將探針保持在凍箱之內以確保探針之穩定性。 然而取決於儲藏時間，探針類型、探針官能基可改變儲藏 之條件。在此方法中，探針可保持在容器之內，然後固定 在基底上時可保持在容器之內加以混合。 在此用途中，當使用表面活性劑作爲在有機溶劑內溶 解探針之物質時，較佳之表面活性劑是溶液的形式。然而 -24- (22) 1288176 ，表面活性劑並非受限制於此。它可爲固態粉劑物質的形 式，使用時可溶解於溶劑中。 爲了將可溶解探針的溶劑、不溶解探針的有機溶劑、 以及將探針固定在基底之上之有機溶劑置於容器之內，容 器可氣密密封以預防其它雜質之污染以及預防溶劑揮發流 失。此外，較佳之容器爲密封容器。此外，宜設計容易打 開之裝置以簡化固定間之攪拌。然而容器開口無特別地限 制。此外，置於容器內溶劑之狀態亦無特別地限制，可爲 溶液或固態物質的形式。此外，將探針固定在基底之上之 有機溶劑可爲水解形成矽醇基團之溶液，此爲將探針固定 在基底上之官能基。儲藏之條件宜在室溫下保持溶劑以確 保溶劑之穩定性。然而依據貯藏時間可改變儲藏之條件。 特定言之，若使用水解的溶液，宜避免於儲藏期間升高溫 度。此外，水解時以及水解之後取決於將探針固定在基底 上之有機溶劑之官能基，宜調整酸鹼度以取得穩定性。 在將探針固定在基底上時，爲了攪拌探針以及定此探 針之有機溶劑（保持在容器之內），若須要可加入水或其它 溶液。此外，溶劑例如水，其爲充分的攪拌提供探針介質 之物質，可保持在另一容器之內，於製備探針介質時混合 【實施方式】 實施例 以下將基於實施例對本發明做更詳細之描述。 -25- (23) 1288176

[實施例 1J (1) 合成探針 作爲專一結合至目標物質探針，其係使用單鏈脫氧核 糖核酸探針。具有序列識別號：1之單鏈脫氧核糖核酸探 針是使用自動化的脫氧核糖核酸合成儀（Model 3 80A， manufactured by App 1 ied B io sy stems，Cο ·，Ltd _)合成。製 備在序列識別號·· 1之單鏈脫氧核糖核酸探針之一個端點 上’18-聚體寡聚體5·-端的羥基經由磷酸鹽基團以及環己 烷結合至氨基酸基團，以及用於下列實驗。 序列識別號：1 5' H2N-(CH2)6-0-P02-0-ACTGGCCGTCGTTTTACA 3' (2) 探針溶劑 使用水作爲可溶解探針的基質。 溶解探針之物質 使用鯨鱲基三甲基溴化銨（正十六碳烷基三甲基溴化 銨）作爲溶解在有機溶劑內之探針的物質。爲了製備鯨蠟 基三甲基溴化銨是完全溶解之水溶液’將鯨蠟基三甲基溴 化銨在5 0 °C水浴下加熱溶解。 (4)不溶解探針的溶劑 -26- (24) 1288176 在下列實驗之內使用矽烷偶聯劑（商品名：KBE-9007 ，由 Shin-Etsu Chemical Co·，Ltd.製作），其中內含具有 一個異氰酸酯基團、異丙醇、以及二丙二醇之矽烷化合物 (3-異氰酸酯丙基三乙氧基矽烷）作爲不溶解探針的有機溶 劑。 (5)製備探針介質 將描述於上述項目（1)序列識別號：1之單鏈脫氧核糖 核酸探針分裝成18-毫微莫耳等量樣本以及然後乾燥。其 後，各等量樣本滴入20微升之純水。滴入約65毫莫耳/ 升鯨蠟基三甲基溴化銨之20微升水溶液作爲在有機溶劑 之內溶解探針之物質以及混合到溶解探針之探針水溶液。 因此，脫氧核糖核酸探針是沈澱在水溶液之內，產生白色 渾濁的探針介質。離心沈澱之脫氧核糖核酸探針後，滴入 3 0微升之上述的固定探針物質。混合物充分的攪拌以及 混合之後，將混合物靜置30分鐘。 然後，將500微升之二丙二醇以及1，〇〇〇微升之異丙 醇有機溶劑滴入混合物以及將混合物攪拌5分鐘。 此外，將聚乙烯醇（PVA)之水溶性聚合物材料溶於純 水，濃度爲0.5%之質量。爲了完全地溶解PVA，在80 °C 熱浴之中攪拌加熱60分鐘。證實所有材料溶解之後，進 行過濾預防噴嘴在噴墨製備PVA水溶液時發生阻塞。 於說明如上製備的探針溶液中滴入5 0微升說明如上 製備的PVA水溶液。最後，滴入純水使探針介質合計達2 -27- (25) 1288176 毫升，然後將混合物攪拌混合5分鐘。於攪拌之後，將混 合物單獨靜置30分鐘以製備探針介質。 (6) 清洗基底 將1 X 3英吋塗覆矽土的鹼石灰玻璃基板（約1 . 1毫米 厚）用純水洗滌從基底之表面去除異物。然後，基底用 UV/03洗淨設備處理五分鐘去除附著在基底表面上之有機 材料。其後，將用UV/03清洗之基底置於卡式盒以及浸 入到5%體積比之無機鹼清潔劑（商品名：Semiclean KG， 由 Yokohama Oils & Fats Industry Co.，Ltd·製作）水溶液 同時使用超聲波照射五分鐘。其後，將基底和卡式盒用流 動之純水沖洗，然後用水清洗去除附著在玻璃基板以及卡 式盒上之清潔劑。洗滌之後，將玻璃基板與卡式盒共同浸 入純水之內，然後經超聲波清洗五分鐘。超聲波清洗之後 ’用流動之純水沖洗基底和卡式盒去除附著在其上的顆粒 。用水清洗之後，對玻璃基板以及卡式盒進行旋轉乾燥。 爲了證實基底已清靜，測量在基底上純水之接觸角。結果 ’所有基底部份是散開狀態。 (7) 點上探針介質 將上述項目（5)製備的探針介質使用油墨噴射裝置點 在基底上。在此案例中使用壓電噴射頭作爲此裝置之油墨 噴射頭。將探針介質裝入壓電噴射頭，然後將基質點在上 述項目（6)製備的玻璃基板上。壓電噴射頭液體釋放表面 -28- (26) 1288176 與玻璃基板附著液體表面間之距離約Ο . 5毫米。完成墨點 之後，使用顯微鏡觀察玻璃基板。結果証實墨點陣列在玻 璃基板之表面形成矩陣形式。點上玻璃基板之後靜置於 8 〇°C加熱板上加熱五分鐘。將加熱板上處理的基底保持在 乾燥器之內。因此，製備固定探針之基底（探針陣列）。 (8)雜交方法 具有互補至上述項目（1)序列識別號：1之單鏈脫氧核 糖核酸探針之鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸探針是經自動 化的DNA合成儀合成。然後，將脫氧核糖核酸探針之5’-端結合至羅丹明取得標記的單鏈脫氧核糖核酸探針。 其後，將標記的單鏈脫氧核糖核酸探針是溶於1莫耳 濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝液（PH7.0)以使最終 濃度爲5 〇毫微莫耳濃度。在此溶液之內，浸入上述項目 (7)得到的固定探針之基底，然後在室溫下（45 °C )雜交二小 時。之後，用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝 液（酸鹼度7.0)清洗探針陣列，接著洗去未和探針核酸雜 交之單鏈脫氧核糖核酸探針。此外，用純水移除過量的鹽 之後，用氮氣吹乾探針陣列。然後，用螢光掃描儀（商品 名：G e n e P i X 4 Ο Ο Ο B，由 A X ο η I n s t r u m e n t s， I n c.製作）評估 探針陣列上之螢光強度。爲了評估，雷射之功率是設定至 100°/。以及PMT是設定至400 V。 (9)結果 -29- (27) 1288176 分析上述項目（8)螢光掃描儀之評估結果。在序列識 別號：1脫氧核糖核酸探針（完全地符合標記的單鏈脫氧 核糖核酸探針）之墨點內，在532毫微米下具有之高螢光 強度是部分之亮度是5531。在532毫微米下墨點之螢光 強度整合値是6 5 9 3 9 1 2。此外，脫氧核糖核酸探針墨點區 域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲40。用螢光觀 察各脫氧核糖核酸探針墨點的結果，各墨點之形狀幾乎是 圓形以及實質上與經點上相同探針介質得到之墨點的螢光 強度並無不同。此外，毗連墨點間之距離幾乎是固定的。 觀察到墨點是排列成晶格形式，間隔約3 0 0微米。 [實施例 2] (1) 探針合成 上述實施例 1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針 可應用於下列實驗。 (2) 探針溶劑 如實施例1之相同方式，使用水作爲可溶解探針的基 質。 (3)溶解探針之物質 使用鯨蠟基三甲基氯化銨（正十六碳烷基三甲基氯化 胃）作爲溶解在有機溶劑內之探針的物質。爲了製備鯨蠟 ®三甲基氯化銨是完全溶解之水溶液，將鯨蠟基三甲基氯 -30- (28) 1288176 化銨在5 0 °C水浴下加熱溶解。 (4)不溶解探針的溶劑 如貫施例1之相同方式，製備異氰酸酯矽烷偶聯劑、 異丙醇、以及二丙二醇之不溶解探針的有機溶劑以及用於 下列實驗。 (5)製備探針介質 將序列識別號：1之單鏈脫氧核糖核酸探針分裝成 18 -笔;微旲耳等量樣本以及然後乾燥。其後，各等量樣本 滴入2 0微升之純水進行溶解。滴入約i 63毫莫耳/升鯨蠘 基二甲基氯化銨之20微升水溶液作爲在有機溶劑之內溶 解探針之物質以及混合到溶解探針之探針水溶液。因此， 脫氧核糖核酸探針是沈澱在水溶液之內，產生白色渾濁的 探針介質。離心脫氧核糖核酸探針後，滴入3 〇微升之上 述的固定探針物質。混合物充分的攪拌以及混合之後，將 混合物靜置60分鐘。 然後，將500微升之二丙二醇以及1，〇〇〇微升之異丙 醇有機溶劑滴入混合物以及將混合物攪拌5分鐘。 此外，如實施例1之相同方式，製備PVA溶液。於 說明如上製備的探針溶液中滴入50微升說明如上製備的 PVA水溶液。最後，滴入純水使探針介質合計達2毫升’ 然後將混合物攪拌混合5分鐘。於攪拌之後，將混合物單 獨靜置30分鐘以製備探針介質。 -31 - (29) 1288176 (6) 清洗基底 如實施例1之相同方式，洗淨基底製備玻璃基板。 (7) 點上探針介質 使用上述項目（5)製備的探針介質，如實施例1之相 同方式點上探針介質以製備固定探針之基底。完成墨點之 後，使用顯微鏡檢查玻璃基板。結果觀察到墨點陣列在玻 璃基板之表面形成矩陣形式。點上玻璃基板之後靜置於 8 〇 °C加熱板上加熱五分鐘。將加熱板上處理的基底保持在 乾燥器之內。因此，製備固定探針之基底（探針陣列）。 (8)雜交方法 如實施例1之相同方式，進行雜交方法。之後，用1 莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝液（酸鹼度7.0) 清洗探針陣列，接著洗去未和探針核酸雜交之單鏈脫氧核 糖核酸探針。此外，用純水移除過量的鹽之後，用氮氣吹 乾探針陣列。然後，用螢光掃描儀（商品名：Gene Pix 4000B，由Axon Instruments, Inc·製作）評估探針陣列上之 螢光強度。爲了評估，雷射之功率是設定至100%以及 PMT是設定至400 V。 (9)結果 分析上述項目（8)螢光掃描儀之評估結果。在序列識 別號：1脫氧核糖核酸探針（完全地符合標記的單鏈脫氧 -32- (30) 1288176 核糖核酸探針）之墨點內，在5 32毫微米下具有之高螢光 強度是部分之亮度是5836。在532毫微米下墨點之螢光 強度整合値是6 3 7 7 2 1 1。此外，脫氧核糖核酸探針墨點區 域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲5 0。用螢光觀 察各脫氧核糖核酸探針墨點的結果，各墨點之形狀幾乎是 圓形以及實質上與經點上相同探針介質得到之墨點的螢光 強度並無不同。此外，毗連墨點間之距離幾乎是固定的。 觀察到墨點是排列成晶格形式，間隔約3 0 0微米。 [實施例 3] (1) 探針合成 上述實施例 1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針 可應用於下列實驗。 (2) 探針溶劑 如實施例1之相同方式，使用水作爲可溶解探針的基 質。 (3) 溶解探針之物質 使用十六烷基氯化吡啶作爲物質使探針溶解在有機溶 劑之內。爲了製備十六烷基氯化吡啶是完全溶解之水溶液 ’將十六烷基氯化吡啶在攪拌下溶解於水。 (4)不溶解探針的溶劑 -33- (31) 1288176 在下列實驗之內使用矽烷偶聯劑（商品名：Y-5 1 87，由 Nippon Unicar Company Ltd.製作），其中內含具有一個異 氰酸酯基團、異丙醇、以及二丙二醇之矽烷化合物（γ-異 氰酸酯丙基三甲氧基矽烷）作爲不溶解探針的有機溶劑。 (5)製備探針介質 將描述於實施例1上述項目（1)序列識別號：1之單鏈 脫氧核糖核酸探針分裝成18-毫微莫耳等量樣本以及然後 乾燥。其後，各分裝中滴入20微升之純水作爲探針溶劑 溶解其中之探針。好好的攪拌混合物，溶解探針經離心後 容器底部無沈澱。滴入約65毫莫耳/升十六烷基氯化吡啶 之5微升水溶液作爲在有機溶劑之內溶解探針之物質以及 混合到溶解探針之探針水溶液。因此，脫氧核糖核酸探針 是沈澱在水溶液之內，產生白色渾濁的探針介質。從溶液 離心沈澱和分離脫氧核糖核酸探針之後，在上述的不溶解 探針的溶劑之中滴入5微升之矽烷偶聯劑。溫和地攪拌混 合物以及混合之後，將混合物靜置60分鐘。 然後，將500微升之二丙二醇以及1，〇〇〇微升之異丙 醇有機溶劑滴入混合物以及將混合物攪拌5分鐘。 此外，將聚乙烯醇（PVA)之水溶性聚合物材料溶於純 水，濃度爲0.5%之質量。爲了完全地溶解PVA，在80°C 熱浴之中攪拌加熱6 0分鐘。證實所有材料溶解之後，進 行過濾預防噴嘴在噴墨製備PVA水溶液時發生阻塞。 於說明如上製備的探針溶液中滴入5 0微升說明如上 -34- (32) 1288176 製備的PVA水溶液。最後，滴入純水使探針介質合計達2 毫升，然後將混合物攪拌混合5分鐘。於攪拌之後，將混 合物單獨靜置3 0分鐘以製備探針介質。 (6) 清洗基底 將1 X 3英吋塗覆矽土的鹼右灰玻璃基板（約1.1毫米 厚）用純水洗滌從基底之表面去除異物。然後，基底用 uv/o3洗淨設備處理五分鐘去除附著在基底表面上之有機 材料。其後，將用UV/03清洗之基底置於卡式盒以及浸 入到5%體積比之無機鹼清潔劑（商品名：SemicUan KG， 由 Yokohama Oils & Fats Industry Co.，Ltd·製作）水溶液 同時使用超聲波照射五分鐘。其後，將基底和卡式盒用流 動之純水沖洗，然後用水清洗去除附著在玻璃基板以及卡 式盒上之清潔劑。洗滌之後，將玻璃基板與卡式盒共同浸 入純水之內，然後經超聲波清洗五分鐘。超聲波清洗之後 ，用流動之純水沖洗基底和卡式盒，然後用水清洗去除附 著在其上的顆粒。用水清洗之後，對玻璃基板以及卡式盒 進行旋轉乾燥。爲了證實基底已清靜，測量在基底上純水 之接觸角。結果，所有基底部份是散開狀態。 (7) 點上探針介質 將上述項目（5)製備的探針介質使用油墨噴射裝置點 在基底上。在此案例中使用壓電噴射頭作爲此裝置之油墨 噴射頭。將探針介質裝入壓電噴射頭，然後將基質點在上 -35- (33) 1288176 述項目（5)製備的玻璃基板上。壓電噴射頭液體釋放表面 與玻璃基板附著液體表面間之距離約0.5毫米。完成墨點 之後，使用放大鏡觀察玻璃基板。結果証實墨點陣列在玻 璃基板之表面形成矩陣形式。點上玻璃基板之後靜置於 8 〇°C加熱板上加熱五分鐘。將加熱板上處理的基底保持在 乾燥器之內。因此，製備固定探針之基底（探針陣列）。 (8)雜交方法 具有互補至上述項目（1)序列識別號：1之單鏈脫氧核 糖核酸探針之鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸探針是經自動 化的DNA合成儀合成。然後，將脫氧核糖核酸探針之5’-端結合至羅丹明取得標記的單鏈脫氧核糖核酸探針。其後 ，將標記的單鏈脫氧核糖核酸探針是溶於1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝液（PH7.0)以使最終濃度爲 50毫微莫耳濃度。在此溶液之內，浸入上述項目（7)得到 的固定探針之基底，然後在室溫下（45 °C )雜交二小時。之 後，用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝液（酸 鹼度7.0)清洗探針陣列，接著洗去未和探針核酸雜交之單 鏈脫氧核糖核酸探針。此外，用純水移除過量的鹽之後， 用氮氣吹乾探針陣列。然後，用螢光掃描儀（商品名： Gene Pix 4000B，由 Axon Instruments，Inc·製作）評估探 針陣列上之螢光強度。爲了評估，雷射之功率是設定至 100%以及PMT是設定至400 V。 -36- (34) 1288176 (9)結果 分析上述項目（8)螢光掃描儀之評估結果。在序列識 別號：1脫氧核糖核酸探針（完全地符合標記的單鏈脫氧 核糖核酸探針）之墨點內，在532毫微米下具有之高螢光 強度是部分之亮度是22 1 80。此外，脫氧核糖核酸探針墨 點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲45。用螢 光觀察各脫氧核糖核酸探針墨點的結果，各墨點之形狀幾 乎是圓形以及實質上與經點上相同探針介質得到之墨點的 螢光強度並無不同。此外，毗連墨點間之距離幾乎是固定 的。觀察到墨點是排列成晶格形式，間隔約3 00微米。 [實施例 4] (1)探針合成 上述實施例 1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針 可應用於下列實驗。 (2 )探針溶劑 如實施例1之相同方式，使用水作爲可溶解探針的基 質。 (3)溶解探針之物質 如實施例3之相同方式，製備將在有機溶劑之內溶解 探針之物質溶於純水的溶液以及用於下列實驗。 -37- (35) 1288176 (4) 不溶解探針的溶劑 如實施例3之相同方式，於下列實驗中使用具有異氰 酸酯、異丙醇、以及二丙二醇內含矽烷化合物（γ_異氰酸 酯丙基三甲氧基矽烷）之矽烷偶聯劑作爲不溶解探針的有 機溶劑。 (5) 製備探針介質 將序列識別號：1之單鏈脫氧核糖核酸探針分裝成 18-毫微莫耳等量樣本以及然後乾燥。其後，各等量樣本 滴入20微升之純水進行溶解。滴入約65毫莫耳/升十六 烷基氯化吡啶之1 0微升水溶液作爲在有機溶劑之內溶解 探針之物質以及混合到溶解探針之探針水溶液。因此，脫 氧核糖核酸探針是沈澱在水溶液之內，產生白色渾濁的探 針介質。從溶液離心沈澱和分離脫氧核糖核酸探針之後， 在上述的不溶解探針的溶劑之中滴入5微升之矽烷偶聯劑 。充分地攪拌混合物以及混合之後，將混合物靜置60分 鐘。 然後，將500微升之二丙二醇以及1，000微升之異丙 醇有機溶劑滴入混合物以及將混合物攪拌5分鐘。 (6)清洗基底 如實施例1之相同方式，洗淨基底製備玻璃基板。 (7)點上探針介質 -38- (36) 1288176 使用上述項目（5)製備的探針介質，如實施例1之相 同方式點上探針介質以製備固定探針之基底。完成墨點之 後，使用顯微鏡檢查玻璃基板。結果觀察到墨點陣列在玻 璃基板之表面形成矩陣形式。點上玻璃基板之後靜置於 8 0°C加熱板上加熱五分鐘。將加熱板上處理的基底保持在 乾燥器之內。因此，製備固定探針之基底（探針陣列）。 (8)雜交方法 如實施例1之相同方式，進行雜交方法。之後’用1 莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝液（酸鹼度7.0) 清洗探針陣列，接著洗去未和探針核酸雜交之單鏈脫氧核 糖核酸探針。此外，用純水移除過量的鹽之後，用氮氣吹 乾探針陣列。然後，用螢光掃描儀（商品名：Gene Pix 4000B，由Axon Instruments，Inc·製作）評估探針陣列上之 螢光強度。爲了評估.，雷射之功率是設定至100%以及 PMT是設定至400 V。 (9)結果 分析上述項目（8)螢光掃描儀之評估結果。在序列識 別號：1脫氧核糖核酸探針（完全地符合標記的單鏈脫氧 核糖核酸探針）之墨點內，在532毫微米下具有之高螢光 強度是部分之亮度是1 95 70。此外，脫氧核糖核酸探針墨 點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲45。用螢 光觀察各脫氧核糖核酸探針墨點的結果，各墨點之形狀幾 -39- (37) 1288176 乎是圓形以及實質上與經點上相同探針介質得到之墨點的 螢光強度並無不同。此外，毗連墨點間之距離幾乎是固定 的。觀察到墨點是排列成晶格形式，間隔約3 00微米。 [實施例5] (1) 探針合成 上述實施例 1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針 可應用於下列實驗。 (2) 探針溶劑 如實施例1之相同方式，使用水作爲可溶解探針的基 質。 (3) 溶解探針之物質 如實施例3之相同方式，製備將在有機溶劑之內溶解 探針之物質溶於純水的溶液以及用於下列實驗。 (4) 不溶解探針的溶劑 如實施例3之相同方式，在下列實驗之內使用矽烷偶 聯劑（商品名：Y-5187，由 Nippon Unicar Company Ltd·製 作），其中內含具有一個異氰酸酯基團、異丙醇、以及二 丙二醇之矽烷化合物（a-異氰酸酯丙基三甲氧基矽烷）作爲 不溶解探針的有機溶劑。 -40 - (38) 1288176 (5)製備探針介質 將序列識別號：1之單鏈脫氧核糖核酸探針分裝成 18 -毫微莫耳等量樣本以及然後乾燥。其後，各等量樣本 滴入2 0微升之純水進行溶解。滴入約6 5毫莫耳/升十六 烷基氯化吡啶之20微升水溶液作爲在有機溶劑之內溶解 探針之物質以及混合到溶解探針之探針水溶液。經攪拌在 有機溶劑之內溶解探針之物質使探針介質先呈現霧狀。然 而滴入以及攪拌20微升溶液之後，証實白色混濁物緩慢 地消失以及稍微地保持一些殘蹟。離心沈澱脫氧核糖核酸 探針。去除上清液之後在不溶解探針的溶劑之中僅滴入5 微升矽烷偶聯劑。之後充分的混合攪拌混合物。攪拌之後 將產物靜置60分鐘。 然後，將500微升之二丙二醇以及1，〇〇〇微升之異丙 醇有機溶劑滴入混合物以及將混合物攪拌5分鐘。 此外，如實施例1之相同方式，製備PVA溶液。於 說明如上製備的探針溶液中滴入50微升說明如上製備的 PVA水溶液。最後，滴入純水使探針介質合計達2毫升， 然後將混合物攪拌混合5分鐘。於攪拌之後，將混合物單 獨靜置3 0分鐘以製備探針介質。 (6)清洗基底 如實施例1之相同方式，洗淨基底製備玻璃基板。 (7)點上探針介質 -41 - (39) 1288176 使用上述項目（4)製備的探針介質，如實施例1之相 同方式點上探針介質以製備固定探針之基底。完成墨點之 後，使用顯微鏡檢查玻璃基板。結果觀察到墨點陣列在玻 璃基板之表面形成矩陣形式。點上玻璃基板之後靜置於 8 0 °C加熱板上加熱五分鐘。將加熱板上處理的基底保持在 乾燥器之內。因此，製備固定探針之基底（探針陣列）。 (8)雜交方法 如實施例1之相同方式，進行雜交方法。之後，用1 莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝液（酸鹼度7.〇) 清洗探針陣列，接著洗去未和探針核酸雜交之單鏈脫氧核 糖核酸探針。此外，用純水移除過量的鹽之後，用氮氣吹 乾探針陣列。然後，用螢光掃描儀（商品名：Gene Pix 4000B，由Axon Instruments，Inc·製作）評估探針陣列上之 螢光強度。爲了評估，雷射之功率是設定至100%以及 PMT是設定至400 V。 (9)結果 分析上述項目（8)螢光掃描儀之評估結果。在序列識 別號：1脫氧核糖核酸探針（完全地符合標記的單鏈脫氧 核糖核酸探針）之墨點內，在532毫微米下具有之高螢光 強度是部分之亮度是7322。此外，脫氧核糖核酸探針墨 點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲45。用螢 光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點的結果顯示各墨點之形 -42 - (40) 1288176 狀幾乎是圓形。相較於其它實施例，其墨點之輪廓模糊以 及幾乎無論確認，本發明墨點之大小約是其1 /2。相同探 針介質形成之墨點間之螢光強度並無不同。此外，觀察到 相鄰墨點間之距離幾乎相同，以及置於格子形式的墨點其 間隔約3 0 0微米。 [實施例 6] (1 )探針合成 上述實施例 1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針 可應用於下列實驗。 (2) 探針溶劑 如實施例1之相同方式，使用水作爲可溶解探針的基 質。 (3) 溶解探針之物質 如實施例3之相同方式，製備將在有機溶劑之內溶解 探針之物質溶於純水的溶液以及用於下列實驗。 (4) 不溶解探針的溶劑 如實施例3之相同方式，在下列實驗之內使用矽烷偶 聯劑（商品名：Y-5187，由 Nippon Unicar Company Ltd.製 作），其中內含具有一個異氰酸酯基團、異丙醇、以及二 丙二醇之矽烷化合物（γ-異氰酸酯丙基三甲氧基矽烷）作爲 -43- (41) 1288176 不溶解探針的有機溶劑。 (5)製備探針介質 將序列識別號：1之單鏈脫氧核糖核酸探針分裝成 18-毫微莫耳等量樣本以及然後乾燥。其後，各等量樣本 滴入2 0微升之純水進行溶解。滴入約6 5毫莫耳/升十六 烷基氯化吡啶之2 · 5微升水溶液作爲在有機溶劑之內溶解 探針之物質以及混合到溶解探針之探針水溶液。經攪拌在 有機溶劑之內溶解探針之物質使探針介質微呈現霧狀。離 心沈澱脫氧核糖核酸探針。去除上清液之後在不溶解探針 的溶劑之中僅滴入5微升矽烷偶聯劑。之後充分的混合攪 拌混合物。攪拌之後將產物靜置6 0分鐘。 然後，將500微升之二丙二醇以及1，000微升之異丙 醇有機溶劑滴入混合物以及將混合物攪拌5分鐘。 此外，如實施例1之相同方式，製備PVA溶液。於 說明如上製備的探針溶液中滴入5 0微升說明如上製備的 PVA水溶液。最後，滴入純水使探針介質合計達2毫升， 然後將混合物攪拌混合5分鐘。於攪拌之後，將混合物單 獨靜置30分鐘以製備探針介質。 (6)清洗基底 如實施例1之相同方式，洗淨基底製備玻璃基板。 (7)點上探針介質 -44- (42) 1288176 使用上述項目（4)製備的探針介質，如實施例1之相 同方式點上探針介質以製備固定探針之基底。完成墨點之 後，使用顯微鏡檢查玻璃基板。結果觀察到墨點陣列在玻 璃基板之表面形成矩陣形式。點上玻璃基板之後靜置於 8 0°C加熱板上加熱五分鐘。將加熱板上處理的基底保持在 乾燥器之內。因此，製備固定探針之基底（探針陣列）。 (8)雜交方法 如實施例1之相同方式，進行雜交方法。之後，用1 莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝液（酸鹼度7.0) 清洗探針陣列，接著洗去未和探針核酸雜交之單鏈脫氧核 糖核酸探針。此外，用純水移除過量的鹽之後，用氮氣吹 乾探針陣列。然後，用螢光掃描儀（商品名：Gene Pix 4000B，由Axon Instruments，Inc·製作）評估探針陣歹[J上之 螢光強度。爲了評估，雷射之功率是設定至100%以及 PMT是設定至400 V。 (9)結果 分析上述項目（8)螢光掃描儀之評估結果。在序列識 別號：1脫氧核糖核酸探針（完全地符合標記的單鏈脫氧 核糖核酸探針）之墨點內，在532毫微米下具有之高螢光 強度是部分之亮度是8 9 7 6。此外，脫氧核糖核酸探針墨 點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲45。用螢 光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點的結果顯示各墨點之形 •45- (43) 1288176 狀幾乎是圓形。相較於其它實施例，其墨點之輪廓模糊以 及幾乎無論確認，本發明墨點之大小約是其1 /2。相同探 針介質形成之墨點間之螢光強度並無不同。此外，觀察到 相鄰墨點間之距離幾乎相同，以及置於格子形式的墨點其 間隔約300微米。 比較實施例1 (1) 探針合成 上述實施例1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針 可應用於下列實驗。 (2) 溶解探針之物質 各實施例1以及2中使用之在有機溶劑之內溶解探針 之物質，並非用於下列實驗。 (3) 固定探針之物質 如實施例1之相同方式，以異氰酸酯矽烷偶聯劑製備 固定探針物質，然後用於下列實驗。 (4) 製備探針介質 將序列識別號：1之單鏈脫氧核糖核酸探針分裝成 18-毫微莫耳等量樣本以及然後乾燥。在其中滴入20微升 之純水，從而加以溶解。滴入3 0微升之上述的固定探針 物質到溶解探針之探針水溶液中，以及經攪拌充分的混合 - 46- (44) 1288176 此混合物。攪拌之後將產物靜置60分鐘。 然後，將500微升之二丙二醇以及1，000微升之異丙 醇有機溶劑滴入混合物以及將混合物攪拌5分鐘。 此外，如實施例1之相同方式，製備PVA溶液。於 說明如上製備的探針溶液中滴入50微升說明如上製備的 PVA水溶液。最後，滴入純水使探針介質合計達2毫升， 然後將混合物攪拌混合5分鐘。於攪拌之後，將混合物單 獨靜置30分鐘以製備探針介質。 (5) 清洗基底 如實施例1之相同方式，洗淨基底製備玻璃基板。 (6) 點上探針介質 使用上述項目（4)製備的探針介質，如實施例丨之相 同方式點上探針介質以製備固定探針之基底。完成墨點之 後，使用顯微鏡檢查玻璃基板。結果觀察到墨點陣列在玻 璃基板之表面形成矩陣形式。點上玻璃基板之後靜置於 8 〇 °C加熱板上加熱五分鐘。將加熱板上處理的基底保持在 乾燥器之內。因此，製備固定探針之基底（探針陣列）。 (7) 雜交方法 如實施例1之相同方式，進行雜交方法。之後，用i 莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝液（酸鹼度7〇) 清洗探針陣列，接著洗去未和探針核酸雜交之單鏈脫氧核 -47- (45) 1288176 糖核酸探針。此外，用純水移除過量的鹽之後，用氮氣吹 乾探針陣列。然後，用螢光掃描儀（商品名：G e n e P i X 4000B，由Axon Instruments，Inc.製作）評估探針陣列上之 螢光強度。爲了評估，雷射之功率是設定至1 〇 〇 %以及 PMT是設定至400 V。 (8)結果 分析上述項目（7)螢光掃描儀之評估結果。在序列識 別號：1脫氧核糖核酸探針（完全地符合標記的單鏈脫氧 核糖核酸探針）之墨點內，在5 32毫微米下具有之高螢光 強度是部分之亮度是5744。在532毫微米下墨點之螢光 強度整合値是4 1 9 1 92。此外，脫氧核糖核酸探針墨點區 域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲40。用螢光觀 察各脫氧核糖核酸探針之墨點的結果顯示各墨點之形狀幾 乎是圓形。相較於其它實施例，此墨點之大小降低至約 1 /4。相同探針介質形成之墨點間之螢光強度幾乎並無不 同。此外，觀察到相鄰墨點間之距離幾乎相同，以及置於 格子形式的墨點其間隔約3 〇〇微米。 -48- 1288176 序列表 <110>CANON KABUSHIKI KAISHA <120>探針介質及製造彼之方法

<130> CF0 1 7 8 8 9TW <150> JP2003-031670 < 1 5 1 > 2003-02-07 < 1 60> 1 <170> Patentln 版本 3.2 <2 1 0> 1 <2 1 1 > 18 <2 1 2> 脫氧核糖核酸 <213>人造的 <220> <22 3 > 脫氧核糖核酸探針 <400> 1 18 actggccgtc gttttac a

Claims (1)

1. (1) 1288176 拾、申請專利範圍 1. 一種探針介質，其包含： 能專一性結合標的物質之探針； 含有有機溶劑之基質；及 使該探針可溶解於該有機溶劑中之陽離子性界面活性 劑。 2 ·如申請專利範圍第1項之探針介質，其中該探針 是核酸探針。 3 ·如申請專利範圍第1項之探針介質，其中該有機 溶劑是該探針不溶的溶劑。 4.如申請專利範圍第1項之探針介質，其中使該探 針可溶解於該有機溶劑中之陽離子性界面活性劑係至少一 種選自正十六烷基三甲基溴化銨、正十六烷基三甲基氯化 銨、十六烷基氯化吡啶、或彼等之任何組合。 5·如申請專利範圍第1項之探針介質，其進一'步包 含將該探針固定在基底上之物質。 6 ·如申請專利範圍第5項之探針介質，其中將該探 針固定在基底上之物質是矽烷偶聯劑。 7 ·如申請專利範圍第1項之探針介質，其進一步包 含可溶解該探針的溶劑。 8 ·如申請專利範圍第1項之探針介質，其中使該探 針可溶解於該有機溶劑中之陽離子性界面活性劑的量係以 該探針鏈長與該探針莫耳數之乘積再乘以〇. 2至4後得到 之莫耳數。 -49- (2) 1288176 9 ·如申請專利範圍第1項之探針介質，其中該探針具 有與該基底結合之反應部位。 10· —種製造探針介質之方法，該探針介質含有能專 一性結合標的物質之探針，該方法包含下述步驟： 在可溶解探針之溶劑中溶解探針； 藉由使該探針可溶解於有機溶劑中之陽離子界面活性 劑與該溶劑作用以自該溶劑中分離該探針；及 藉由添加該有機溶劑至該探針以溶解該探針於該有機 溶劑中。 1 1 .如申請專利範圍第丨〇項之方法，其中使該探針 可裕解於該有機溶劑中之陽離子性界面活性劑的量係以該 探針鏈長與該探針莫耳數之乘積再乘W 〇·2至4後得到之 莫耳數。