TWI282371B - PNA chip using plastic substrate coated with epoxy group-containing polymer, method of manufacturing the PNA chip, and application of detecting single nucleotide polymorphism using the PNA chip - Google Patents

Description

1282371 17226pif.doc 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是關於一種肽核酸(Peptide Nucleic Acid, PNA) 晶片，更特別的是包含預設去氧核糖核酸（DNA)序列固 定化在塗佈環氧基聚合物之塑膠基版的肽核酸(PNA)晶片。 【先前技術】 本發明之優先權是依2004年6月24日在韓國智財局 專利申請號No.10-2004-0047677，相關揭露之技術發明倂 入本案之參考資料。 肽核酸(以PNA簡稱）最初發展是爲了標的基因藥物。 因爲肽核酸具互補去氧核糖核酸（DNA)優越的雜交特性 有相當多的報告記載。肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA) 雜交是基於肽核酸（PNA)單股之間與互補的去氧核糖核 酸（DNA)單股之間強鹼基配對。也就是最重要的肽核酸 (PNA)特性即優越的去氧核糖核酸（DNA)辨識能力去 氧核糖核酸。肽核酸（PNA)之結構很類似去氧核糖核酸。 肽核酸（PNA)具中性的胜肽骨幹結構類似帶負電荷的磷 酸鹽骨幹的去氧核糖核酸與重複的N-(2-胺基乙基氨基乙 酸【N-(2-amin〇ethyl)glycine】單位透過醯胺（Amide)鍵連 結。已知的四個核鹼（nucleobases)包含在肽核酸（PNA) 佔據相似位向的去氧核糖核酸與相似距離的肽核酸（PNA) 也是幾乎一樣的去氧核糖核酸。與去氧核糖核酸不同的 是，肽核酸（PNA)不會核酸酶與蛋白酶降解，且生理活 性穩疋。甚至，當雙股去氧核糖核酸（DNA)之熱穩定性 1282371 17226pif.doc 被鹽類濃度影響時，因爲帶負電荷的去氧核糖核酸（DNA) 骨幹，雙股肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/ (DNA)之熱穩定 性基本上不會被鹽類濃度影響，因爲中性的肽核酸（PNA) 骨幹。低鹽濃度依賴肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/ (DNA) 之雙股降低介於肽核酸（PNA)與去氧核糖核酸間的靜電 排斥力，所以增加肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/ (DNA)雙 股之熱安定性。因爲肽核酸（PNA)的許多優點，肽核酸 (PNA)產生許多重要生理應用與診斷應用，且是傳統相 關去氧核糖核酸（DNA)的方法無法達到的。 肽核酸（PNA)固定化技術已經被以相似去氧核糖核 酸（DNA)固定化技術進行硏究。大部分現有的去氧核糖 核酸（DNA)固定化方法是基於固定化單股去氧核糖核酸 使其能與分析物進行雜交。吸附去氧核糖核酸到固態表主 要被使用的方法（Nikiforov and Rogers，ha/ ㈣. 7PP5)。雜交的方法（Proudnikov et al,，β/οΜ細.79外； Rehman et al.9 Nucleic Acids Res. 1999) 法(Nilsson et al·，/加/价oc/iem· 7外5」已經被發展的相當 好。照相平版印刷（photolith〇graphy )是被廣泛應用於寡 核甘酸固定化步驟的方法’主要是化學合成（Gerhold et al.， 5W. 7999)。共價鍵介於支持物與反應群透 過砂院結合寡核苷酸（R〇gers et al，，如α/万/oc/^m. 〇外），形成一自我組合的單層（Higashi et al.，/ /咖to·· 7外9)等形式。在上述方法，生物基質的可以 物理方法固定化，例如吸附方法，以特殊或結構化的位向 1282371 17226pif.doc 限制，且有偵測上的限制，例如非特定吸收的背景訊號。 甚至，因爲環氧矽烷可以塗佈在玻璃基質但是無法在塑膠 基質，基質的調整因此受到限制。 生物分子或高分子的陣列可以用噴墨點狀印刷、陣列 印刷技術則是、照相平版印刷、電子定位印刷。 噴墨點狀印刷是將生物分子以三度空間移動的的微滴 定位在預設的位置。陣列印刷使用類似原子筆頭的針頭所 形成的陣列印刷生物分子。照相平版印刷藉選擇性使用光 照於預定的位置以附著生物分子於定點。電子定位印刷是 選擇性應用電極執行微電極陣列以固定化生物分子陣列於 預定的電極上。本發明中，一肽核酸（PNA)陣列使用非 接觸性噴墨引刷定位。 爲尋找上述先前技術的解決方案，本發明之發明人發 現結合含有環氧數脂的高分子於一般的塑膠基質足量且有 效的固定化肽核酸（PNA)，形成本發明之特徵。 【發明內容】 本發明提供一新的肽核酸（PNA)晶片以有效且具經 濟效益的方法固定化肽核酸（PNA)於一般塑膠基質。 本發明也提供一有效生產肽核酸（PNA)晶片的方法。 本發明也提供一使用肽核酸（PNA)晶片偵測SNP(單 核甘酸多態性，Single Nucleotide Polymorphism)的方法。 本發明的目的在提供一肽核酸（PNA)晶片包含一預 設的去氧核糖核酸（DNA)序列固定化於一塗佈有含環氧 基之聚合物塑膠基質的肽核酸（PNA)探針。 1282371 17226pif.doc 本發明之塑膠基質可以適任何塑膠基質被聚合物塗佈 著。較佳的塑膠基質是一塑膠基質選自由聚甲基丙烯酸甲 酯（polymethylmethacrylate ，PMMA)、聚碳酸酯 (polycarbonate，PC)、冰片烯（Norbornene)、環烯烴共聚 物（COC，Cyclic Olefin Copolymer)、氣化聚亞酸氨 (fluorinated polyimide )、聚苯乙烯(PS，polystyrene)、苯 乙烯-丁 二烯共聚合物（SBC，styrene-butadiene copolymer)、丙烯丁二烯苯乙烯共聚合物(ABS，Acrylonitrile Butadiene Styrene)、 苯乙烯-丙烯（SAN，Styrene AcryloNitrile)、與聚颯（polysulfone)所組成的族群。一般 塑膠基質相對於一般玻璃基質是較便宜且不需要分離的表 面處理。甚而，塑膠基質較具彈性不像玻璃基質易碎，且 具優越攜帶性，容易儲存與處理。另外，透明的塑膠基質 溶液偵測訊號因爲不會產生發射螢光。 在本發明，含環氧基之聚合物可以是任何聚合物，但 較佳的是含環氧基混合共聚合物包含含環氧基壓克力單體 與無含環氧基的壓克力單體。共聚合物可依塑膠基質種類 來選擇。特別是包含環氧基的共聚合物可以調節含環氧基 壓克力單體的重量比。甚至使用合適單體可以加強鄰近的 肽核酸（PNA)共聚合物。 在主曼明實施例中，此含環氧基之聚合物是一含環氣 基壓克力單體與一高黏滯性的壓克力單體所形成的共聚合 物，分子式姐下： <分子式1> 1282371 17226pif.doc -[CR3R3-CR】R3-X]n - 其中R1是一含環氧基酯類，R3是一氫或一烷基，且X 是一高黏滯性的丙烯酸酯化合物。

本發明，高黏滯性壓克力單體可以是任何丙烯酸酯類 單體可加強UV-引發硬化塗佈的丙烯酸酯類（參照T. Jaworek, Macromol Symp., 159? 197, 2000; Cliff Roffey, f, Photogeneration of Reactive Species for UV Curing’’， 1997)。較佳的高黏滯性的丙烯酸酯類單體是一在25°C環境 下具黏度8-6,000 cp高黏滯性的丙烯酸酯類單體，且更佳 的選擇是選自由雙季戊四醇羥基丙烯酸戊酯 (dipentaerythritol hydroxypentaacrylate，DPHA)、雙丙烯 酸 9-乙烯二醇酯（9-ethyleneglycol diacrylate，9-EGDA)、三 -四丙烯酸戊赤藻糖醇（pentaerythritol tri_tetraacrylate， PETA)、雙丙烯酸聚乙烯二醇400酉旨（polyethyleneglycol 400 diacrylate)、雙丙烯酸三丙二醇脂（tripropyleneglycol diacrylate)、三丙烯酸三甲基醇丙基酯（trimethylol propane triacrylate)、與六丙嫌酸雙戊赤藻糖醇(dipentaerythritol hexaacrylate)所組成的族群。 本發明之一實施例，此含環氧基含環氣某之聚合物是 一含環氧基丙烯酸酯類單體與一吸附性丙烯酸衍生物能被 吸附在塑膠某晳的共聚合體，代表性分子式如下列分子式 2 ： <分子式2> -[CR3R3-CRlR3^CR3R^CR2R3]n - 1282371 17226pif.doc 其中R1是一含環氧基酯類，R2烷基，且R3是一氫 或一院基。 在本發明，吸附式丙烯酸酯衍生物可以是任何丙烯酸 酯類衍生物，結構相似於包含此種丙烯酸酯衍生物單體的 塑膠基質聚合物，且物理性質類似塑膠基質確保容易吸附 於塑膠基質。較佳的吸附性丙烯酸酯類衍生物選自由甲基 丙烯酸甲酯（MMA)、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯 (EMA)、丙烯酸η-丙酯、甲基丙烯酸η-丙酯、丙烯酸異丙 酯、與甲基丙烯酸異丙酯等所組成的族群。當塑膠基質由 聚甲基丙烯酸甲酯（ΡΜΜΑ)所組成時，特別佳的狀況是使 用甲基丙烯酸甲酯（ΜΜΑ)當作吸附性丙烯酸酯類衍生 物，因爲聚甲基丙烯酸甲酯（ΡΜΜΑ)的物理性質幾乎等 於甲基丙烯酸甲酯（ΜΜΑ)。 本本發明之環氧基於含環氧基含環氧基之聚合物，例 如包含一含環氧基丙烯酸酯類單體於含環氧基含環氧基之 聚合物範圍可以從重量百分比0.1到100 °/。，較佳的是 重量百分比爲10 %或更多，且更交的範圍是重量百分比介 於20-30 %。如果環氧基重量百分比含量少於10%，就可能 因爲環氧基含量太低導致在累積肽核酸（ΡΝΑ)於一小範 圍上有困難，也降低螢光訊號。另一方面，環氧基含量超 過重量百分比40%是較不合適的，因爲一肽核酸（ΡΝΑ) 的固定化速率不會直接與環氧基密度成正比。這可能是因 爲相對增加含有環氧基的塗佈溶液而幫助包埋的環氧基表 面，所以阻礙有效的反應環氧基表面與肽核酸（ΡΝΑ)。 1282371 17226pif.doc 在本發明，一肽核酸（PNA)探針的末端胺基可以直 接結合一含環氧基含環氧基之聚合物塗佈在塑膠基質之 上。然而，較佳的是增加一碳數1到5 (C5_8)的羰酸連 結子包含一胺基且在有或無醚類的存在下連結到肽核酸 (PNA)探針的末端胺基。連結子增加肽核酸（PNA)探 針的特殊位向，因此最佳化肽核酸/去氧核糖核酸 (PNA/DNA )的雜交。 依據本發明之另一目的，提供依生產一肽核酸（PNA) 晶片的方法，方法包括：混和一含環氧基丙烯酸酯類單體， 一高黏滯性的丙烯酸酯類單體與一光學起始劑，以比例 10-90 : 80_5 : 1-10 ;塗佈該混合物於一塑膠基質之上；使 用紫外光硬化該混合物；且 點狀印刷一肽核酸（PNA)探針於該塑膠基質。 依據本發明之另一目的，本發明更提供一生產肽核酸 (PNA)晶片的方法，方法包括··混合一含環氧基丙烯酸 酯類單體，一與塑膠基質有相似物理性質的丙烯酸酯類衍 生物，與一自由基起始劑，以比例10-99 : 1-89 : 0.1-0.5 ; 自由基-聚合化該混合物；藉著溶解所產生的聚合物於一鎔 劑中塗佈所獲得的一含聚合物溶液於該塑膠基質；且 點狀印刷肽核酸（PNA)探針溶液於該塑膠基質。 在本發明，一適當濃度的鹼，較佳濃度介於0.01-1.0M， 更佳的濃度介於〇·〇5-〇·5 Μ，可以加入肽核酸（PNA)探針 印刷溶液以有效在肽核酸（ΡΝΑ)探針的胺基與一聚合物 的環氧基之間執行一親核性取代反應以協助肽核酸（PNA) 11 < S ) 1282371 17226pif.doc 探針的固定化。鹼可以是一般的鹼例如，氫氧化鈉、氫氧 化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀或路易士酸。 生產該肽核酸（PNA)晶片在存在自由基啓動劑狀況 下依據本發明可以更包括儲存聚合物塗佈的聚合物塗佈的 塑膠基質，在點狀印刷肽核酸（PNA)探針印刷溶液前， 於一濕度在30%或更高的環境下維持4小時或更久。如果 聚合物塗佈的聚合物塗佈的塑膠基質被儲存在少於30%濕 度的狀況下，一介於環氧基與胺基的有效反應可能被降 低，因此訊號也降低。較佳的是儲存該聚合物塗佈的塑膠 基質在一 50-95%濕度狀態。聚合物塗佈的塑膠基質被儲存 4小時或更久以揮發有機溶劑。 依據本發明的再一目的，本發明提供一偵測SNP(單核 苷酸多態性，SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM)的 方法’方法包括：應用標的含去氧核糖核酸 (DNA-containing)反應樣品連結到上述的肽核酸（PNA) 晶片；雜交肽核酸（PNA )探針與標地去氧核糖核酸 (DNA);清洗肽核酸（pnA)晶片以移除未特定反應產物； 且肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜交偵測一螢光訊號 產物。 雖然本發明已以上述較佳實施例揭露如上，然其並非 用以限定本發明。 【實施方式】 本發明將以更完整資料合併圖不於實施例中示範本發 明。 12 1282371 17226pif.doc 本發明提供一含環氧基含環氧基之聚合物做微生物分 子固定化，以分子式1或2於下列陳述： <分子式1> -[CR3R3-CR]RKX]n - <分子式2> ' -[CR3R3-CRlR3-CR3R3-CR2R3]n - 其中R1是一含環氧基碳數3-12 (C3_12)的酯類，R2 是碳數2-16 (C2_16)的烷基酯類，R3是氫或一碳數1-16 • (CH6)的烷基，X是一高黏滯性的丙烯酸酯類化合物， 且η的大小。 仰賴一單體濃度與一反應期間，但可能是1〇到2,000。 該聚合物的合成是藉著紫外線（UV)硬化（參閱1\ Jaworek, Macromol Symp., 159, 197? 2000; Cliff Roffey, Thotogeneration of Reactive Species for UV Curing1, 1997) 或自由基聚合物化作用（參閱Bevington，J.C·，in }Comprehensive polymer Science\ Vol 3，65 1989; Tedder， ^ J.M.? Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 21, 401? 1982) ? 用一丙烯酸酯類化合物。 在合成該聚合物，兩個或更多的丙烯酸酯類單體可以 被使用。不同的組合兩個或兩個以上的丙烯酸酯類單體使 能夠適量調整環氧基含量，所提供一聚合物含適量的環氧 基。 在本例中形成一聚合物塗佈層藉著紫外線（UV)硬化， 一含環氧基丙烯酸酯類單體且至少一高黏滯性丙烯酸酯類 (S ) 13 1282371 17226pif.doc 單體被使用。該丙烯酸酯類單體可以是含有兩個或兩個以 上的乙烯基的單體。本發明提供一組成可被紫外線（UV) 硬化的塗佈溶液，丙烯酸酯類單體組成比例，與有效塗佈 方法以供紫外線（UV)硬化。本例形成一聚合物塗佈層藉 自由基聚合物化，一含環氧基丙烯酸酯類單體，一具有與 塑膠基質相同性質的丙烯酸酯類衍生物，與一常用的自由 基起始劑(偶氮化合物、過氧化物、氧化還原起始劑)被使用 (Graeme moad， 、the chemistry of free radical 1995)。如上所述，含環氧基的量可以用含 環氧基丙烯酸酯類單體的重量百分比來決定。 本例形成一聚合物塗佈層是藉著熱聚合化，另外一含 環氧基丙烯酸酯類單體，一含丙烯酸酯類單體的烷基酯類 也被使用。 在使用紫外線（UV)硬化形成該聚合物塗佈層，該高 黏滯性丙烯酸酯類單體可以選自由雙季戊四醇羥基丙烯酸 戊酯（dipentaerythritol hydroxypentaacrylate，DPHA)、雙 丙烯酸 9-乙烯二醇酯（9-ethyleneglycol diacrylate， 9-EGDA)、三-四丙烯酸戊赤藻糖醇（pentaerythritol tri-tetraacrylate，PETA)、雙丙烯酸聚乙烯二醇 400 酯 (polyethyleneglycol 400 diacrylate)、雙丙稀酸三丙二醇脂 (tripropyleneglycol diacrylate)、三丙烯酸三甲基醇丙基酯 (trimethylol propane triacrylate)、與六丙烯酸雙戊赤藻糖 醇（dipentaerythritol hexaacrylate)所組成的族群。 所以該聚合物塗佈層之形成是藉著紫外線（UV)硬化 14 1282371 17226pif.doc 組成含環氧基丙烯酸酯類單體與至少一前述高黏滯性的丙 烯酸酯類單體。 在該藉著紫外線（UV)硬化形成的聚合物塗佈層，重 量百分比該含環氧基丙烯酸酯類單體與高黏滯性的丙烯酸 酯類單體比例變化從0.1 : 99.9到100 : 〇。較佳的是調整 含環氧基丙烯酸酯類單體量以便將生物分子固定化重量百 分比到10 wt%或更高。 該自由基聚合物化可以在90°C或更低形成以預防環氧 基的開環反應。 自由基聚合化，合成的聚合物平均分子量可以因反應 期間長短而調整。較佳的方式是執行自由基聚合化維持1 到6小時以製備預設的塗佈溶液並確保塗佈透明度或預防 脆裂。 該自由基聚合化之終止是藉著使用醇類例如甲基醇來 產生沈澱物。 一乾燥的聚合物在自由基聚合化後可以溶解在四氫呋 喃、二氯甲烷等以製備一濃度0.1-5%含聚合物的塗佈溶 液。爲預防脆裂的形成或提供透明度，較佳的是製備一濃 度1-3%含聚合物的塗佈溶液。 一基質塗佈上述高分子層可以是一通用的矽晶圓或玻 璃，較佳爲一塑膠基質，且更佳的是一透明塑膠基質。傳 統上，製成完善的昂貴玻璃主要使用做爲一晶片基質。然 而，在本發明，依一般不昂貴的塑膠基質具容易處理的特 性被使用來克服使用玻璃基質的缺點。一般而言，此“透 15 (S ) 1282371 17226pif.doc 明塑膠基質”包含基質選自由聚甲基丙烯酸甲酯 (polymethylmethacrylate ， PMMA)、聚碳酸酯 (polycarbonate，PC)、冰片烯（Norbornene)、環烯烴共聚 物（COC，Cyclic Olefin Co聚合物）、氟化聚亞醯氨 (fluorinated polyimide)、聚苯乙烯(PS，polystyrene)、苯 乙烯-丁二燔共聚合物（SBC，styrene-butadiene co聚合物）、 丙嫌丁二烯苯乙烯共聚合物（ABS，Acrylonitrile Butadiene Styrene)、苯乙烯-丙烯（SAN，Styrene AcryloNitrile)、與聚 颯（polysulfone)所組成的族群。 欲塗佈聚合物以形成塗佈層在塑膠基質之上可以使用 浸泡、噴霧、或印刷的方式等來完成。較佳的塗佈聚合物 塑膠基質是使用儲存在一 5〇%或更高的濕度環境。如果 該聚合物塗佈塑膠基質儲存在較低的濕度狀況，肽核酸 (PNA)的固定化效率會下降。 依據本發明強固定化生物分子，如肽核酸（PNA)於 一含含環氧基塑膠基質可以用簡單且不昂貴的方法來完 成’例如，點狀陣列在一含適當濃度的鹼中執行（氫氧化 鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、路易士酸）。 依據本發明，一含鹼性催化劑的印刷緩衝液被製備以 結合肽核酸（PNA)的胺基到環氧基塗佈的基質。注入印 刷緩衝液使用一噴墨陣列提供簡單且不昂貴的方法來執行 肽核酸（PNA)固定化於基質表面。較佳的固定化肽核酸 (PNA)執行在約23°C且於50-60%濕度環境下。 本發明提供最佳化緩衝液溶液，反應條件，且有效清 16 < S ) 1282371 17226pif.doc 洗方法給特定肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜交使用 上述製備的肽核酸（PNA)陣列。 一緩衝溶液用於肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜 交可以是一含 5X SSC、50mM HEPES、1% SDS、與 0.1% BSA溶液。不需要執行個別的阻斷流程以防止非特定雜 交。 肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜交之後，可以依 序使用四個含IX、〇·1Χ、〇·〇1Χ、與0.001 X SSC的清洗緩 衝溶液(每次5分鐘）。 範例 範例1 :製備以紫外光硬化含環氣基塗佈聚合物之某質 甘胺酸氧甲基丙烯酸甲酯（GMA)目的要與環氧基結 合，雙丙烯酸 9-乙烯二醇酯（9-ethyleneglycol diacrylate， 9-EGDA)，以及一光啓始劑（Irgacure 184，Ciba-Geigy Chemical Co·)以一適當比例（10-90 : 80-5 : 1-10)。光啓始 劑被完全溶解後，反應物混合被塗佈在一聚甲基丙烯酸甲 酯(PMMA)基質之上使用一旋轉塗佈器在500 rpm持續6 秒’且再進丫了 1，000-4,000 rpm持|買20秒。所以’產生的 物質被暴露在254 nm紫外光（UV)在氮氣環境下並乾燥 之。上述方法並不限制於一丙烯酸酯類單體與一塑膠基質 與可能應用到不同種的單體與基質。所以產生含環氧基含 環氧基之聚合物如下列分子式： -[ch2c(ch3)(c(o)och2chch2)ch2ch(c(o)o(ch2ch2o)9 17 C S ) 12823.71 17226pif.doc C(0)CHCH2)]n-。紫外光（UV)硬化若使用DPHA或PETA 替代9-EGDA可以產生一 GMA與DPHA或PETA聚合物。 圖1之一圖示順序圖表描述塗佈一含環氧基含環氧基之聚 合物層在一常用塑膠基質之上並依本發明之方法固定化肽 核酸（PNA)到含環氧基含環氧基之聚合物層上。 範例2:含環氧基之聚合物塗佈的某皙p自由其自由某 聚合化 甘胺酸氧甲基丙烯酸甲酯（GMA)目的要與環氧基結 合，甲基丙烯酸甲酯(MMA)，一自由基啓始劑【2,2,6,6-四 甲基-4-氧石比 D定（2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinol， TMPO)】，與一分子量調整劑以適當比例混合（99-10: 1-89 : 0.1-0.5 : 0.1-0.5)。該混合物在75°C加熱兩小時且繼 續在90°C下維持0.5-3小時。依據甲基丙烯酸甲酯(MMA) 重量比，反應混合物的黏度會大幅改變，反應因爲反應混 合物的完全故化而終止。當反應混合物黏度達到適當程 度，過量甲基醇加入反應混合物，劇烈攪拌且再結晶。結 果結晶被真空乾燥一天。所獲得的聚合物被以核磁共振儀 分析環氧基含量且以GPC量測平均分子量。重量百分比 0.1-5 %的聚合物被溶解在四氫呋喃。藉一旋轉塗佈器，一 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)基質被固定在旋轉塗佈器以塗 佈2ml的含聚合物塗佈溶液(參考圖1)。該含環氧基含環 氧基之聚合物具如下之分子式·· ，[CH2C(CH3)(C(0)0CH2CHCH2)CH2C(CH3)(C(0)0CH3)]n， < S ) 18 1282371 17226pif.doc

，與一平均分子量(Mw)介於75,000到250,000。一由GMA 與EMA組成的聚合物可以相同方式製備如上所述的自由 基聚合化方法以EMA取代MMA。 該聚合物塗佈基質被儲存在一個50%或更濕的濕度狀 況持續4小時或更久。如果該聚合物塗佈基質被儲存在一 較低的濕度狀況，反應效率介於環氧基與安基可能會更 低’造成訊號下降。圖4描述狀核酸/去氧核糖核酸 (PNA/DNA )雜交結果以便利肽核酸（PNA)陣列來決定 該聚合物塗佈塑膠基質在肽核酸（PNA)固定化之前儲存 狀態。該塗佈含環氧基含環氧基聚合物之塑膠基質被暴露 在不同的濕度狀況（10, 20-30, >50%)。在圖4，PM/MM的 比例代表從完美的配對（PM)到錯誤配對(MM)的去氧核糖 核酸/肽核酸（DNA/PNA)雜交之平均螢光訊號，且介於 完美的配對(PM)與錯誤配對(MM)之間的訊號差異是由一 單一基準差所產生。一較高的PM/MM比例代表肽核酸 (PNA)探針對於標的去氧核糖核酸優越的專一性。參考 圖4，當該聚合物塗佈之基質被儲存在30%或更高的，較佳 是50%或更高的濕度狀況，訊號敏感度(PM/MM比例)會更 優越。 範例3 : 狀核酸（PNA) -03之固定化 在此範例，肽核酸（PNA)固定化程度相對於GMA含 量以範例1與2之方法製備所需之聚合物塗佈塑膠基質。 因此 Cy3-labelled 肽核酸（PNA)rtL-180w (PNAGENE· Inc) 19 1282371 17226pif.doc 被固定化在上述基質。印刷溶液製備與點狀印刷依據範例4 的方法執行。該塑膠基質有不同的環氧基含量20%、30%、 40%、與50%，藉著調整GMA含量來達成。固定化肽核 酸（PNA) rtL-180W的程度可以直接以Cy3-標定的肽核酸 (PNA) rtL-180w螢光強度來決定。在本實驗，不同濃度 的肽核酸（PNA)被嘗試，例如500、400、300、200、與 100 ηΜ。肽核酸（PNA)固定化於基質的塋光影像與陣列 資訊包含不同程度的環氧基描述於圖2A與2B。圖3是圖 2A螢光影像定量分析圖資料。在圖3，點狀組成包括無肽 核酸（PNA) -cy3的螢光強度（S/B比例)被使用作爲背景 訊號。參考圖3，肽核酸（PNA)固定化速率在環氧基含量 20%與30%達到最大。即使在環氧基含量40%與50%，肽 核酸（PNA)固定化的產生也不會有問題。該肽核酸（PNA) nL-180w使用於本範例如下列序列所示： rtL180w : N 端（51) - GTTTCTCC*TGGCT- C 端 (3，)-Cy3 (SEQ ID NO : 2) 〇 範例4 :印刷溶液製備與肽核酸（PNA)陣列牛產 肽核酸（PNA)寡核苷酸（13-mer, PANAGENE，Inc·)被 溶解於一濃度50ιιΜ蒸餾水溶液。此肽核酸（PNA)寡核 苷酸，使用肽核酸（PNA)與一 rtL-180w與rtL-180m。該 肽核酸（PNA)被使用於正向控制肽核酸/去氧核糖核酸 (PNA/DNA)的雜交。該rtL-180w是特定的B型肝炎病毒 20 1282371 17226pif.doc 序列核糖核酸（HBV RNA )聚合酶（Geneln，lnc.)，且該 rtL-180m是一改變序列產生拉美伏錠阻抗性 (lamivudine-resistance )的B型肝炎病毒序列核糖核酸 (HBV RNA )聚合物酶。介於該the rtL-lSOw與該 rtL_180m 只在一個（C-A)鹼基。該 rtL-180w 與該 rtL-180m 被使用以測試序歹[J SNP(單核苷酸多態性，SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM)的辨識性，一濃度 0.1N 的氫氧化鈉（NaOH)溶液使用以協助肽核酸（PNA)固定 化。對每一肽核酸（PNA)，一該rtL-180w與該rtL-180m， 該溶液的獲得是藉著溶解該肽核酸（PNA)寡核苷酸在蒸 餾水中，且混合氫氧化鈉溶液比例爲1 : 1-0.5 ，並置放 於一有96個小槽(96-well)的反應盤。製備樣品被點狀印刷 在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)基質，使用一噴墨陣列器 (Cartesian卡夾），並儲存在濕度爲50%或更高的環境且在 溫度23-2VC之下達16小時以引發介於環氧基與胺基的足 量反應。在點狀印刷期間，濕度增加以統以維持點狀大小。 肽核酸（PNA)探針寡荷苷酸（13-mers)使用於本範 例的序列如下： 探針A (人工序列）：N C 端(3，）（SEQ ID NO : 1) 探針 W (rtL-180w) : N 端（5，）- GTTTCTCC*TGGCT- C 端(3，）（SEQ ID NO : 2) 探針 M (nL-180m) : N 端(5，）- GTTTCTCA*TGGCT- C 端（3’）（SEQ ID NO : 3) 21 1282371 17226pif.doc 範例5 :晶片反應與SNP(單核苷酸多態件，SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM)的偵測 於範例4中，藉著雜交但分離的阻斷設計，該固定化 肽核酸（PNA)於聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)基質以範例 四的方法製備，清洗並蒸餾五分鐘以移除殘餘的氫氧化 鈉。使用一包含5X SSC (酸鹼度pH 7.0的緩衝劑包含氯化 鈉與檸檬酸鈉），50mM HEPES，1% SDS，與 0.1% BSA 的 雜交緩衝劑。去氧核糖核酸（ΙρΜ〜ΙΟΟηΜ)以螢光染料標 定，命名爲花青染料【cyanine3 (Cy3)】被使用做標的。一 標的去氧核糖核酸（DNA)於雜交溶液在94°C去活性達5 分鐘且培養在42°C達60分鐘。一般而言，相對於去氧核糖 核酸，肽核酸（PNA)有一度的較高熔化溫度(Tm)(每—個 鹼基）。爲移除非特定肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA ) 雜交，使用一 IX SSC緩衝液執行清洗，一 〇·〇1Χ SSC緩衝 液與一 0.001Χ SSC緩衝液（每次5分鐘）。所以肽核酸 (ΡΝΑ)陣列受制於完成水分的移除，且螢光訊號從DNA/ 狀核酸（PNA )雜父產生使用營光偵測雷射掃瞄（Axon

Instrument，Inc·)來量測，在專注於位置65與PMT 400 的條件下。肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜交結果的 螢光影像使用不同的標的去氧核糖核酸與陣列資訊是依序 描述在圖5A與5B。互補的去氧核糖核酸（DNA)寡核甘 酸（oligomideotides)對人工肽核酸（PNA)序歹“正向控 制），辨識一般HBV感染，且用以辨識拉美服錠阻抗性的 22 1282371 17226pif.doc HBV感染相對使用圖5A的（A)、（B)、與（C)的標的去氧核 糖核酸。參考圖5A與5B，肽核酸（PNA)探針是特別與 相關的標的去氧核糖核酸雜交。圖6A與6B描述圖75定 量分析肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜交結果之資 料，依據環氧基含量針對i*tL-180w與rtL-180m，相對的。 從圖6A與6B，可觀察到肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA) 雜交發生最大量在環氧基含量20°/。與30%。 該標的去氧核糖核酸（DNA)寡核甘酸（13-mers)使用 於本範例的序列有： 標的 A : 5* Cy3- CCATCTGGTGGAA-3’（SEQ ID NO : 4) 標的 W : 5’ Cy3- AGCCAG*GAGAAA-3’（SEQ ID NO : 5) 標的 M : 5, Cy3- AGCCAT^GAGAAA-31 (SEQ ID NO : 6) 範例β :肽核酸/去氣核糠核酸（PNA/DNA )雜交藉著 肽核酸（PNA) 連結子 以肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜交，一碳數 5-8 (C5-8)的含胺基之酸期估能如間隙壁附著於的肽核酸 (PNA)末端胺基。圖7A是一槪要式圖示描述一連結子 被使用來最佳化狀核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA)雜交， 依據本發明方法，且圖7B描述不同的連結子之化學結構分 子式連結子。在圖7B，一 〇-連結子是2-(2-胺基乙氧基） 23 1282371 17226pif.doc 乙氧基醋酸【2-(2-aminoethoxy)ethoxyacetic acid】，一 M- 連結子是2-胺基乙氧基醋酸，與一 C-連結子是6-胺基辛酸 (6-aminohexanoic acid )。含胺基之酸附著於肽核酸 (PNA)，是透過一胜肽鍵，且含胺基之酸的一胺基與含環 氧基聚合物層之一環氧基，如上所示範例固定化肽核酸 (PNA)到聚合物層。該連結子附著於肽核酸（PNA)以 防止固定化肽核酸（PNA)聚合在表面且使肽核酸（PNa) 分子代表標的t去氧核糖核酸（DNA)分子。結果，該連 結子的功能有如間隙壁改善使肽核酸（PNA)探針易接近 標的DNA。在此範例，使用含環氧基之聚合物_塗佈基質含 環氧基20%與30%提供最大的肽核酸（pna)固定化與 肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜交效能。肽核酸（pnA ) 被固定化且肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜交以範例 4與5相同的方式執行，除了使用連結子之外。螢光影像 與陣列資訊用來評估肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA ) 雜交結果是藉著不同種的連結子進行，如圖8A與8B所描 述的。連結子與肽核酸（PNA)的種類被呈現在圖8B之陣 列。在圖8B，H2〇+Na〇H是一負向控制，rtL-W(M)是一 般野生種（變種)肽核酸（PNA)無連結子，〇-W(M)是〇 連結子附著於rtLW(M)肽核酸（PNA)，M-W(M)是M-連結子附著於rtLW(M)肽核酸（PNA)，且C6-W是C6-連結子附著於rtLW肽核酸（PNA)。肽核酸（PNA)-cy3被 使用做定位標誌。圖9A與9B是圖示定量分析圖8A螢光 影像資料。在圖9A與9B，rtLW(M)是無連結子-的一般野 24 1282371 17226pif.doc 生種（變種）肽核酸（PNA)，rtLW(M)-3是Ο-連結子附著 於rtLW(M)肽核酸（ΡΝΑ)，：rtLW(M：M是Μ-連結子附著 於rtLW(M)肽核酸（PNA)，且：rtLW(M)-5是C6-連結子 • 附著於rtLW(M)肽核酸（PNA)。從圖9A與9B，能看出 連結子附著在連結子肽核酸（PNA)呈現更優越的標的去 ^ 氧核糖核酸特定性相對於連結子-自由肽核酸（PNA)探針。 連結子附著的肽核酸（PNA)探針序列使用於本範例 如下列所示： # W(rtL180w)-連結子：5，Cy3- AGCCAG*GAGAAA-3,- 連結子 M(rtL180m)-連結子：5，Cy3- AGCCAT*GAGAAA-3，- 連結子 範例7 :肽核酸/去氬核糠核酸（PNA/DNA )雜交織肽 核酸（PNA)陣列的敏感度評估 以範例1與2製備的該聚合物塗佈基質以濃度10 uM φ 或r 5 uM的肽核酸（PNA)點狀印刷，濃度低於一般已 知使用肽核酸（PNA)的濃度。標的去氧核糖核酸（DNA) 肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA)雜交的敏感度在依照範 例4與5所描述的方法評估。特徵點狀印刷的雜交強度5uM 肽核酸（PNA)(低濃度）顯示相似於25uM肽核酸（PNA) 的程度。可能是因爲肽核酸（PNA)比去氧核糖核酸展現 更高的的親和力，因爲比去氧核糖核酸有較高的Tm値， 一位無電荷所以無排斥力。圖10A與10B描述定量資料 25 1282371 17226pif.doc 分析，依據肽核酸（PNA)探針濃度以偵測肽核酸/去氧核 糖核酸（PNA/DNA)雜交敏感度。 如上所述，依據本發明，肽核酸（PNA)探針能以一 . 有效且具經濟效益的方式被固定化在一般的塑膠基質之 上。使用固定化基質上的肽核酸（PNA)探針可以偵測不 ^ 同的基因變異。甚至，因爲運用肽核酸（PNA)之優越的 物理化學性質，肽核酸（PNA)晶片可以克服一般去氧核 糖核酸（DNA)晶片的缺點。 • 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神 和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者爲準。 【圖式簡單說明】 爲讓本發明之上述和其他目的、特徵和優點能更明顯 易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說 明如下然並非用以限制本發明。 鲁圖1是一槪要的順序圖描述依據本發明，一塗佈含環 氧基含環氧基之聚合物層於一通用的塑膠基質且固定化肽 核酸（PNA)於聚合物層。 圖2A與2B依本發明螢光影像與陣列資訊來評估肽 核酸（PNA)固定化速率的結果，依據一所含的環氧基含 量。 圖3是一圖示定量分析圖2A螢光影像的資料。 圖4描述肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNa )雜交結 (S ) 26 1282371 17226pif.doc 果，肽核酸（PNA)陣列決定在肽核酸（PNA)被固定化 前的最佳化儲存該聚合物塗佈的塑膠基質的條件。 圖5A與5B依據標的去氧核糖核酸與陣列資訊，相對 • 螢光影像分析資料肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜交 結果。 圖6A與6B是圖示定量分析以肽核酸/去氧核糖核酸 (PNA/DNA )雜交結果資料，依據含環氧基之也谓野生 種與rtL180變種，相對比較。 Φ 圖7A是一槪要圖示描述一連結子依照本發明使用於 最佳化肽核酸/去氧核糖核酸（PNA/DNA )雜交，圖7B描 述不同類連結子之化學結構分子式。 圖8A與8B是依據本發明依其肽核酸/去氧核糖核酸 (PNA/DNA )雜交螢光影像與點狀陣列以連結做媒介。 圖9A與9B是圖8A的螢光影像圖式定量分析資料。 圖10A與10B是依據肽核酸（PNA)濃度偵測肽核酸 /去氧核糖核酸（PNA/DNA)雜交定量分析資料。 鲁 所以’本發明會詳述參考資料與下列範例。然下列範 例之目的乃爲描述本發明並非用以限制本發明之範圍。 【主要元件符號說明】 無。 27

Claims (1)

1282371 17226pif.doc 十、申請專利範圍： 1. —^種肽核酸（PNA) (Peptide Nucleic Acid)晶片，其 肽核酸（PNA)探針包含預設且固定化的一去氧核糖核酸 (DNA)序列於一塗佈含環氧基含環氧基之聚合物的塑膠 基質，其中含環氧基之聚合物是由一含環氧基丙烯酸酯類 單體與一無環氧基丙烯酸酯類單體所組成的一共聚合物。 2·如申請專利範圍第1項所述之肽核酸（PNA)晶片， 其中該塑膠基質是一透明塑膠基質，材質選自由聚甲基丙 烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA)、聚碳酸酯 (polycarbonate，PC)、冰片烯（Norbornene)、環烯烴共聚 物（COC，Cyclic Olefin Co聚合物）、氟化聚亞醯氨 (fluorinated polyimide)、聚苯乙烯（PS，polystyrene)、苯 乙烯-丁二烯共聚合物（SBC，styrene-butadiene co聚合物）' 丙烯丁二烯苯乙燏共聚合物(ABS，Acrylonitrile Butadiene Styrene)、苯乙烯-丙烯（SAN，Styrene AcryloNitrile)、與聚 颯（polysulfone)所組成的族群。 3. 如申請專利範圍第1項所述之肽核酸（PNA)晶片， 其中含環氧基含環氧基之聚合物是一由一^含環氧基丙烯酸 酯類單體與一高黏滯性的丙烯酸酯類單體所組成的共聚合 物，如下列分子式（1)所示： -[CR3R3-CR】R3-X]n -， (1) 其中R1是一含環氧基酯類，R3是一氫或一烷基，且X 是一高黏滯性的丙烯酸酯類化合物。 4. 如申請專利範圍第3項所述之肽核酸（PNA)晶片， 28 1282371 17226pif.doc 其中該高黏滯性的丙烯酸酯類單體選自由雙季戊四醇羥基 丙烯酸戊酯（dipentaerythritol hydroxypentaacrylate， DPHA)、雙丙烯酸 9-乙烯二醇酯（9-ethyleneglycol diacrylate，9_EGDA)、三-四丙烯酸戊赤藻糖醇 (pentaerythritol tri-tetraacrylate，PETA)、雙丙烯酸聚乙烯 二醇 400 酯（polyethyleneglycol 400 diacrylate)、雙丙烯 酸三丙二醇脂（tripropyl enegly col di aery late )、三丙烯酸三 甲基醇丙基酯（trimethylol propane triacrylate)、與六丙烯 酸雙戊赤藻糖醇（dipentaerythritolhexaacrylate)所組成的 族群。 5·如申請專利範圍第1項所述之肽核酸（PNA)晶片， 其中該含環氧基含環氧基之聚合物是一聚合物含環氧基 丙烯酸酯類單體與一吸附性丙烯酸酯類衍生物能被吸附到 塑膠基質的一共聚合物，如下列分子式(2)所示： -[CR3R3^CRlR3-CR3R3-CR2R3]n - 5 (2) 其中R1是一含環氧基酯類，R2是一烷基酯類，且R3 是一氫或一烷基。 6·如申請專利範圍第5項所述之肽核酸（PNA)晶片， 其中該吸附性丙烯酸酯類衍生物選自由甲基丙烯酸甲酯 (MMA)、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯（EMA)、丙烯酸η-丙酯、甲基丙烯酸η_丙酯、丙烯酸異丙酯、與甲基丙烯酸 異丙酯等所組成的族群。 7·如申請專利範圍第1項所述之肽核酸（ΡΝΑ)晶片， 其中該環氧基於該含環氧基含環氧基之聚合物之含量範圍 29 ^82371 l724if.d〇c 介於2〇到30%。 8·如申請專利範圍第1項所述之肽核酸（PNA)晶片， 其中〜碳數5-8的（C5_8 )羧酸連結子以胺基在醚類存在 ’或不存在下連結到肽核酸（PNA)探針的末段胺基。 ， 9·-種生產肽核酸（PNA)晶片的方法，包括： 混和一含環氧基丙烯酸酯類單體，一高黏滯性的丙烯 酉戈酉旨類單體，與一光學起始劑，以比例1〇_9〇 : 80-5 : 1-10 混合； B 塗佈該混合物於一塑膠基質之上； 使用紫外光硬化該混合物；以及 點狀印刷一肽核酸（PNA)探針於該塑膠基質。 10·-種生產肽核酸（PNA)晶片的方法，包括： 混和一含環氧基丙烯酸酯類單體，一與塑膠基質有相 似物理性質的丙烯酸酯類衍生物，與一自由基起始劑，以 比例 10-99 : 1-89 : 〇·ΐ-〇·5 混合； 自由基-聚合化該混合物； | 藉著溶解所產生的聚合物於一鎔劑中塗佈所獲得的一 含聚合物溶液於該塑膠基質；以及 點狀印刷肽核酸（PNA)探針溶液於該塑膠基質。 Π·如申請專利範圍第9或10項所述之生產肽核酸 (ΡΝΑ)晶片的方法，其中肽核酸（ρΝΑ)探針的印刷容 易包含一 〇·01到1.0Μ的鹼以協助肽核酸（ΡΝΑ)之固定 化。 12·如申請專利範圍第10項所述之生產肽核酸（ΡΝΑ) 30 i2823a,d〇c 晶片的方法，更包括儲存含聚合物溶液塗佈塑膠基質，在 點狀印刷之前，於一 30%或更潮濕狀況下維持4小時或 更久。 13· — 種使用 PNP(Peptide Nucleic Acid)晶片以偵測 SNP(單核苷酸多態性，SINGLE NUCLEOTIDE ' POLYMORPHISM)之用途，包括： 應用標的含DNA反應樣品到前述申請專利範圍第1到 8項中任一項所述之肽核酸（PNA)晶片； • 雜交探針肽核酸（PNA)與標的去氧核糖核酸（DNA ); 清洗肽核酸（PNA)晶片以移去未特定反應的產物； 以及 偵測一螢光訊號是基於肽核酸/去氧核糖核酸 (PNA/DNA )雜交。 31