TWI275118B - Sample box of electron microscope for observing a general sample/live cell - Google Patents

Description

1275118 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係與電子顯微鏡有關，特別是指—種 一般樣品/活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒。 、 5【先前技術】 、按:習知技術中’在操作電子顯微鏡來觀察物 通常係受限於電子顯微鏡内的樣品腔室之真空環产， 待觀察的物體必須為非揮發性的物體方能進行觀$。若= 揮發性物體，例如液態或氣態的流體物質，在置二真 品腔室後產生的大量氣體，不僅會造成電子束無法通ς物 體進行繞射或成像的實驗，亦會導致顯微鏡電子搶等高真 空區域的真空度下降或造成污染，而損壞電子顯微鏡间” 由上可知，受限於真空環境的限制，傳統電子顯微鏡 只能在其樣品腔室内觀察固態物質之結構，或觀察脫水後 15的生物細胞(例如原核細胞prokaryote的細菌，與真核細胞 eukaryote的動植物），病毒等等生物組織，並不能觀察流體 樣品或流體環境中具有生理功能的細胞與病毒等等，當然 更無法在一大氣壓的流體ί哀境下觀察細胞核内DNA轉錄 (transcription) RNA、RNA 轉譯（translation)蛋白質 20 (Protein)、細胞質内微管體(microtubules)等生化反應過程， 以及神經肌肉接合(neuromuscular junction)處的傳導生理 (physiology of transduction)機制等等生命現象過程。 因此，必須有一種裝置可在其内部置入活體細胞或活 體組織，並可將該裝置置入於電子顯微鏡内進行觀察。目 1275118 前，雖已有部份人士提出在電子顯微鏡内提供一種可觀測 之環境，例如GaiP· L·領導的研究群在2002年展示的成果 雖可在電子顯微鏡下觀察氣、液、固相化學反應的實驗(Gai Ρ· L· ’ Microscopy & Microanalysis 8，21，2002)。但是其缺 .5點是無法有效的控制液、氣樣品層的厚度，以避免電子束 無法穿透或大幅降低顯微鏡解析度。同時自樣品室逸散的 高壓蒸氣或從外界注入氣室區的高壓氣體將充滿電子顯微 > 鏡樣品室中上下極塊(pole pieces)間的整個空間，也會造成 電子因撞擊過多氣體分子產生之多重散射效應變得非常嚴 ίο重，而導致電子束無法順利成像或進行電子繞射的實驗。 此外，GaiP· L·的設計仍必須將顯微鏡的主體分解才能 將這些零件安裝，故量產的可能性不高。 有鑑於此，本案發明人乃經過不斷之試作與實驗後， 終於發展出本發明之樣品盒，而可解決前述問題，可用來 15置入叙樣品或活體細胞，藉以配合供電子顯微鏡進行觀 > 測。 【發明内容】 本發明之主要目的在於提供一種可供觀測一般樣品/活 2〇體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其可供置入一般樣品或活 體細胞，藉以配合供電子顯微鏡進行觀測。 本發明之次一目的在於提供一種可供觀測一般樣品/活 體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其具有極薄的厚度，即使 内部注入液體，亦不會使電子顯微鏡之電子束無法穿透， 1275118 進而可供觀測。 緣是’依據本發明所提供之一種可供觀測一般樣品/活 、 體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，包含有：一殼體，内部具 有一容室，該殼體之頂底面各具有至少一觀視孔連通於^ 5容室且彼此相對同轴，位於該殼體頂面之觀視孔底端與位 於該殼體底面之觀視孔頂端相距小於50/^ιη;其具有極薄 φ ❸厚度’即使内部注入液體樣品，亦不會使電子顯微鏡之 電子束無法穿透，進而可供觀測；並可供置入一般樣品或 活體細胞，藉以配合供電子顯微鏡進行觀測。 10 【實施方式】 為了詳細說明本發明之構造及特點所在，茲舉以' 五較佳實施例並配合圖式說明如后，其中： 15

第一圖係本發明第一較佳實施例之立體示意圖。 ，二圖係本發明第—較佳實施例之剖視示意圖。 ，二圖係本發明第一較佳實施例之動作示意圖。 第四圖係本發明第一較佳實施例之另一動作示意s 八第五圖(A)(B)(C)係本發明第一較佳實施例之示意日 刀別顯示觀視孔之不同的斷面形狀。 ，六圖係本發明第二較佳實施例之剖視示意圖。 ，七圖係本發明第三較佳實施例之剖視示意圖。 ，八圖係本發明第吨佳實施例之立體示意圖。 第九圖係本發明第五較佳實施例之剖視示意圖。 第十圖係本發明第五較佳實施例之動作示意圖。 20 1275118 丘 苐圖至第一圖所示，本發明第一較佳實施例所提 八 種可供觀測一般樣品/活體細胞之電子顯微鏡用樣品 盒10，主要具有： 一喊體11，可為—體成型或組合而成，本實施例中係 由底座12與一蓋體14所組成者為例，該底座12與該蓋 β間係於兩側各以一卡榫15相接合，該殼體11内部具 有谷至16，該殼體η之頂底面各具有至少一觀視孔17 ^通於4谷至16且彼此相對同軸，各該觀視孔17之孔徑 介於5//m_500//m之間，而以5〇//m為最佳，位於該殼 1〇體11 面之觀視孔17底端與位於該殼體11底面之觀視孔 17頂端相距小於50#m。各該觀視孔17於靠近該容室16 之一端形成較薄之環板171，該環板171具有一穿孔172， 。亥牙孔172之孔徑小於該觀視孔I?，而於各該觀視孔Η 之孔壁及該環板171外表面及該殼體u之外表面施以疏水 I5或超疏水處理，例如製造許多直徑在數百奈米以内的柱狀 物(pillar)，並在其表面附著一層疏水性自我組裝單分子膜 (self-assembly monomolecular layer)，可以使得水滴在此表 面的接觸角（contact angle)大於150度，以達超疏水之功效， 或是使用其它習知的超疏水方法以達不沾水的排水性；並 2〇於該殼體11内壁及該環板171靠近該容室16之端面及該 穿孔172之孔壁施以親水處理，使水可以保存於該殼體u 内，藉由上述之表面疏水或超疏水處理，添加過量的水則 會受到該觀視孔17之孔壁及該環板171外表面所排斥，而 不會殘留在觀視孔17之孔壁與環板171外壁面。本f施^列 1275118 又體11係以微影姓刻技術(microlithography)〔此法 包含貝光製程、蚀刻製程等〕製成。或者是亦可使用雷射 細 jl "刀口工（laser micromachining)或機械微細加工 (mechanical micromachining)等技術製造。該殼體n之一側 5具有一注入孔18。 、則述之樣品盒10在使用時，在對該樣品盒10内置入 液，91及活體細胞樣品92時，可將該液體91及活體細胞 樣口α 92由该注入孔18注入，或者是將適量的液體91及活 ，細，樣品92先直接滴入容室16的底座12内，隨後再覆 蓋體14，而底座12與蓋體14再以一黏著劑接合；該 樣品盒1〇可置於電子顯微鏡(圖中未示）中的一觀測盒21 中，如，二圖所示，該觀測盒21具有一氣室22以及分別 位，該氣至22上下方之一緩衝室24，該樣品盒係置於 15 該^室220，該氣室22上下方各具有一氣孔23,而該觀 3端各具有一外孔2 5，該等外孔2 5與該等氣孔 23以及该荨觀視孔17同軸。 在操作時，係對該氣室22提供預定壓力之蒸氣 =壓為—大纽_和水統(或祕和水蒸氣ς特= W生孔體4 ’ ,緣室22内之水魏可抑舰 率，另外’彌供—大讓特定氣體= 孔至22中’並控制該狀氣體勤與該樣品盒⑺ rieU差小於或等於該容室16时歸_界溢漏麗 eller S. e. al ^ Journal of Food Protection 66 > 1260 , 1275118 2003^11此可縣該容室16㈣㈣雜自該等觀視孔 17 ^出，而僅以蒸氣形態緩慢揮發進入該緩衝室％内。對 該緩衝室24 進行減，所以從該氣室22逸散進入該 -緩衝至24的蒸氣與氣齡被抽以不會逸散出該觀測盒 而進^子隨射，㈣行朗時，躲冑子顯微鏡 的電子束通過該等外孔25以及該等氣孔23以及該等觀視 孔17，即可對該樣品盒1〇内的樣品進行觀測。 如第四圖所示’若於該樣品盒ω内置人活體細胞樣品 92並庄入預定壓力的水蒸氣(例如一大氣壓的飽和水蒸氣） 與特定氣體之混合氣體93(婦定氣财為氮氣、氧氣、二 氧化碳與舰氣财)時，_樣品盒1Q可置於f子顯微鏡 (圖中未示）中的另-觀測盒21，中，該觀測盒21，内部之 空間係包覆該樣品盒10,且該觀測盒21，了貝底端各且有一 15 ，料耗Μ’與料觀魏n _。哺由各該 硯=孔17的小口徑來限制該樣品盒ω内的氣體或液體基 ^緩慢向外逸散至該觀測盒21，㈣，可達_持該— =内部纽環境之效果’而向外逸散之微量氣體或液體 =氣亦可透過注人孔18持續補充之。又，藉由對該觀測盒 内部抽氣來避免蒸氣與特定氣體的混合氣體％經由該 專外孔25,紐出織測盒21，㈣人電子顯微鏡中。 本發明之同軸的上下觀魏Π輯(小於⑽㈣係屬 關鍵，該距離可保持該樣品盒10内的液體不會太厚，確保 電子束能？透㈣成像，而該樣品盒1G时維持水蒸氣或 液體，即可置入活體細胞來供觀測，亦即，本發明可觀測 20 1275118 /舌體細胞或細菌或病毒，當然亦可觀測不具生命功能的細 胞或其他一般樣品。 又，各該觀視孔17之斷面形狀並不以前揭諸實施例之 形狀為限，而亦可為第五圖（A)所示之直孔狀觀視孔17,，

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亦可為第五圖(B)所示之外大内小之推拔狀觀視孔17,，，或 亦可為如第五圖（C)所示之外大内漸小之階梯狀觀視孔 17，” 〇 請再參閱第六圖，本發明第二較佳實施例所提供 種可供觀測一般樣品/活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒 30，主要概同於前揭第一實施例，不同之處在於： 該樣品盒30上同轴二觀視孔37中，其中一觀視孔 37(例如下方的觀視孔37)内之環板371上之穿孔372上更 封設一非結晶性薄膜374，例如非結晶碳膜。該薄膜374 之厚度約為100至50奈米間，故不會造成電子束產生電子 多重散射的問題，而該樣品盒3〇置人於前揭第—實施例所 =合之觀測盒21或21，時，可依同樣的條 3〇内置人液體或氣體，並可依同樣的操作方式來操作。 $參㈣七圖’本發㈣三祕實關所提供之一 種==卜般樣品/活體細胞之電子顯微制樣 4〇\主要概同於前揭第-實施例，不同之處在於： §亥樣品盒40上同軸二_^| 了丨n 一 ==-非 生電子夕約為漏至50奈米間，故不會造成電子束產 生電子夕重散射的問題。在操作時，可將該樣品盒40直接 20 1275118 置於電子顯微鏡(圖中未示）_來觀測，藉由該薄膜474之設 置’可使得樣品盒40内的液體或氣體被保持在該樣品盒 内。又或可將該樣品盒40置於電子顯微鏡内的一觀測盒 中’利用該觀測盒之氣室及緩衝室來提供減壓的效果(同第 5 -實施例，容不贅述），可藉以降低該等薄膜梢兩面之壓 力差’使得薄膜474可以做得更薄，並可降低對電 影響。 ，第八圖所示，本發明第四較佳實施例所提供之一種 可t、觀測一般樣品/活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，主 10要概同於前揭第一實施例，不同之處在於： 、該樣品盒50之殼體51頂底面亦可設置多組同軸的觀 視孔57 ’可提供更多的觀測位置。本實施例之其餘操作方 式係概同於前揭第一實施例，容不再予贅述。 請再參閱第九圖’本發明第五較佳實施例所提供之一 15種可供觀測一般樣品/活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒 60，主要具有： -殼體6卜係以微影餘刻法製造，該殼體61可為一 體成型或組合而成，該殼體61内部具有至少一隔板611將 ，内部分隔出-容室66以及至少—厚度極薄的氣室69，該 20谷至66之頂底面各具有至少一觀視孔”設於該隔板6ιι， 各該觀視孔67係連通於該容室66且彼此相對同軸，位於 該容室66頂面之該觀視孔67底端與位於該容室 66底面之 該觀視孔67頂端相距小於50_ ;該氣室69係包覆住該 專硯視孔67 ’且該氣室69之頂底面各具有至少一氣孔 11 1275118 f 1，该等氣孔691與該等觀視孔67同軸。各該氣孔691 =於該氣室69之-端與最接近之觀視孔π靠近於該氣 至之—端間的距離可介於5000//m-5//m之間。且該殼 =61於該容室66之-侧設有—注人孔68，以及於該氣室 ⑽之—側設有一注氣孔692。

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、各在操作時，可將該樣品盒60置於電子顯微鏡内的一觀 ，益^1中，並可配合一治具81實施，如第十圖所示，該 觀測盒71内部之空間係包覆該樣品盒6〇，且該觀測盒71 頂，，各具有一外孔75,該等外孔75與該等氣孔691=及 該，觀視孔67同軸，並可藉由該治具透過該注氣孔的2對 名氣至69注入水蒸氣或其與特定氣體的混合氣體。其餘之 操作方式概同於前揭第一實施例，容不贅述。 又該设體61内谷至66頂底面之各該觀視孔π的穿 孔上均可封設一非晶質薄膜，設置薄膜的方式請參閱前揭 弟一只加例，或亦可僅在下方（或上方）的各該觀視孔67的 牙孔上設置非晶質薄膜。而其實施與操作方式概同於前揭 實施例，容不贅述。 前述諸實施例中，樣品盒内係可供置入活體細胞樣品 92(示於第四圖），活體細胞樣品92可固定於樣品盒内壁面 2〇 (包含内側壁面或内部之頂底面），固定方法即在盒内壁上塗 佈一層如右旋光性的聚離胺酸(poly-D-lySine)之類的細胞固 定劑，或是將細胞固定於如第六圖及第七圖所示觀視孔上 設置之薄膜；藉此，該樣品盒亦可做為小型培養皿，可直 接培養待分析的細胞樣品於此樣品盒内。又，可藉由注入 12 1275118 孔18注入液體培養液與其他待分析之流體物質，並透過一 流出孔(圖中未示)流出，使培養液或待分析之流體物質在容 室16，66内循環流動。而對於第六圖所示觀視孔37'僅單 邊封設薄膜374與第二圖所示觀視孔π未封設薄膜的情形 5來說，在對注入孔18注入活體細胞92及培養液或是待測 之液體樣品91時，在操作上係提供預定壓力的特定氣體於 配合操作的觀測盒之氣室中，並控制該特定氣體壓力與注 入該容室内的液體壓力差小於或等於該容室内液體溶液的 臨界溢漏壓力（Keller S· ei a/·，Journal of Food Protection 1〇 66，1260，2003)，藉此可使注入的培養液或待分析之液體 樣品在容室内循環流動而不會自該觀視孔流出。此外，亦 可利用對該注入孔18抽水或注水，藉以控制該容室16，的 内液體樣品91的量及其壓力。 由上可知，本發明之優點在於： 15 一、可供置入一般樣品或活體細胞，藉以配合供電子 顯微鏡進行觀測。而可依前揭各實施例中所揭露之操作方 法來操作。 μ 二 '本發明可有效控制流體樣品厚度，即使内部注入 液體’亦可維持該液體的厚度不變。此外，利用微影钮刻 20法製造之樣品盒，其内部含有液體樣品之容室以及含有蒸 氣與氣體之氣室的厚度均極薄，故不會造成電子束產生電 子多重散射問題而影響觀測的解析度。 本發明所揭露的各元件，僅係為舉例說明，並非用來 限制本案之範圍，本案之範圍仍應以申請專利範圍為準， 13 1275118 由本發明所衍生的其他的變化及轉用，亦應為本案之申請 專利範圍所涵蓋。

14 1275118 【圖式簡單說明】 第一圖係本發明第一較佳實施例之立體示意圖。 第二圖係本發明第一較佳實施例之剖視示意圖。 第三圖係本發明第一較佳實施例之動作示意圖。 5 第四圖係本發明第一較佳實施例之另一動作示意圖。 第五圖(A)(B)(C)係本發明第一較佳實施例之示意圖， 分別顯示觀視孔之不同的斷面形狀。 • 第六圖係本發明第二較佳實施例之剖視示意圖。 第七圖係本發明第三較佳實施例之剖視示意圖。 ίο 第八圖係本發明第四較佳實施例之立體示意圖。 第九圖係本發明第五較佳實施例之剖視示意圖。 第十圖係本發明第五較佳實施例之動作示意圖。 15 1275118 【主要元件符號說明】 10樣品盒 11殼體 12底座 14蓋體 15卡榫 16容室 5 17，17,，17”， 17’”觀視孔 171環板 172穿孔 18注入孔 21，21’觀測盒 22氣室 23氣孔 24緩衝室 25，25,外孔 30樣品盒 10 37觀視孔 374薄膜 40樣品盒 371環板 372穿孔 47觀視孔 471環板 472穿孔 474薄膜 15 50樣品盒 51殼體 57觀視孔 60樣品盒 61殼體 611隔板 66容室 67觀視孔 68注入孔 69氣室 20 691氣孔 692注氣孔 71觀測盒 75外孔 81治具 91液體 92活體細胞樣品 93混合氣體 16

Claims (1)

1275118 、申請專利範圍·· 1· 一種可供觀測一般樣品/活體細 樣品盒，包含有： < 电子顯微鏡用 -殼體’内部具有—容室，該殼體之 少-觀視孔連通於該容室且彼此 ^各具有至 5 15 面之如， 御川軸位於該殼體頂 5〇3 該㈣底面之觀視孔了貞端相距小於 /、、舌體範圍第1項所述之可供觀測-般樣品 ^^5 樣品盒，其中：各該觀視孔之孔 徑介於5/^111-500# ^之間。 ,、J,專利範圍第2項所述之可供觀測-般樣品 ^ ^ 微鏡用樣品盒，其中：該殼體係由一底 座與一蓋體所組成。 4·依據申請專利範圍第3項所述之可供 /活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其中：職體及該= 間係以至少一卡榫相接合。 5.依據中請專利範圍第3項所述之可供觀測—般樣品 /活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其中：至少—該觀視孔 封設一薄膜。 6·依據申請專利範圍第3項所述之可供觀測一般樣品/ 活體細胞之電子顯微鏡祕品盒，其巾：各該觀視孔於靠 近該容室之-端形成較薄之環板，該環板具有—穿孔，該 穿孔之孔徑小於該觀視孔。 7·依據中請專利範圍第6項所述之可供觀測—般樣品/ 活體細胞之電子顯微鏡崎品盒，其巾：該環板靠近該容 17 20 1275118 至之端面及該穿孔孔壁係施以親水處理。 、、8·依據申請專利範圍第3項所述之可供觀測—般樣品/ ’舌體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其中：各該觀視孔可呈 直孔狀或為外大内小之推拔狀，或為外大内漸小之階梯 5 狀。 、9·依據申請專利範圍第3項所述之可供觀測一般樣品/ 活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其中：各該觀視孔之孔 壁係加以疏水處理或超疏水處理。 10·依據申請專利範圍第3項所述之可供觀測一般樣 ίο品/活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其中：該殼體内壁係 施以親水處理。 11·依據申請專利範圍第3項所述之可供觀測一般樣 品/活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其中：該殼體係以微 影蝕刻法或雷射微細加工或機械微細加工。 15 12·依據申請專利範圍第3項所述之可供觀測一般樣 品/活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其中：該殼體之一側 設有一注入孔。 13· —種可供觀測一般樣品/活體細胞之電子顯微鏡用 樣品盒’包含有： 20 一殼體’内部具有至少一隔板將該殼體内部分隔出一 容室以及至少一氣室，該容室之頂底面各具有至少一觀視 孔設於該隔板’各該觀視孔係連通於該容室且彼此相對同 轴’位於該容室頂面之該觀視孔底端與位於該容室底面之 該觀視孔頂端相距小於5〇Am •，該氣室係至少包覆住該等 18 1275118 觀視孔，且該氣室之頂底面各具有至少一氣孔，該等氣孔 與該等觀視孔同軸。 14. 依據申請專利範圍第13項所述之可供觀測一般樣 品/活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其中：各該氣孔靠近 5 於該氣室之一端與最接近之觀視孔靠近於該氣室之一端間 的距離介於5000//m_5/zm之間。 15. 依據申請專利範圍第13項所述之可供觀測一般樣 品/活體細胞之電子顯微鏡用樣品盒，其中：該殼體於該容 室之一側設有一注入孔，以及於該氣室之一側設有一注氣 10 孔。 19