TWI274591B - Composite scaffold for remedying articular cartilage tissue and preparation thereof - Google Patents

Description

1274591 玖、發明說明： 發明所屬之技術領域 本發明係關於一種關節軟骨組織修補用複合式支架， 尤其有關一種呈圓柱形栓塞之關節軟骨組織修補用複合式 支架。 先前技術 骨關節炎不但會造成關節軟骨的磨損，嚴重者軟骨之 下的硬骨（軟骨下骨）的血管甚至會穿透鈣化層而侵入軟骨 區’造成軟骨下骨過度的增生，因而生成骨刺，將關節軟 骨的功能全部毀壞。因此，若需要將組織工程支架植入骨 關節炎患者的關節來修復，要是無法阻止血管的穿透，就 异是能將關節軟骨的受損完全修復，短期内亦會因軟骨下 骨過度增生而使關節軟骨再度損壞而前功盡棄；所以，唯 有將受損的軟骨和鈣化區連同軟骨下骨一併用具有分隔層 的組織工程支架取代，才可避免骨關節炎再度復發。 發明内容 本發明的一主要目的在提供一種應用在關節軟骨 (articular cartilage)的組織修補的組織工程支架（Ussue engineering scaffold) ° 本發明提供一種仿關節軟骨構造的關節軟骨組織修補 用複合式支架，其能促進關節軟骨細胞的體外培養。 本發明的關節軟骨組織修補用複合式支架具有_緻密 1274591 — 層將軟骨區和硬骨區分開（即分隔層），以達到阻止軟骨下 硬骨區的血管侵入軟骨區的效果。 本發明的較佳具體實施例包括（但不限於）下列項目： 1 · 一種關節軟骨組織修補用複合式支架，包含·· 一仿關節的硬骨區的下多孔性陶竟層； 一仿關節的軟骨區底層的上多孔性陶究層，·及 一介於該下及上多孔性陶瓷層之間且連結兩者之緻密 性陶瓷分隔層；及 選擇性的一仿關節的軟骨區中間層的多孔性生物高分 子支架層，其接著於該上多孔性陶甍層。 2·如第1項的複合式支架，其中該分隔層為硬化或燒 結的磷酸鈣骨水泥、硫酸鈣骨水泥或者生物玻璃 (bioglass)，其孔徑小於5微米（μιη)。 3·如第2項的複合式支架，其中該分隔層為硬化或燒 結的填酸_骨水泥。 4·如第3項的複合式支架，其中該磷酸鈣骨水泥包含 攝酸三約鹽（tricalcium phosphate)粉末。 5·如第2項的複合式支架，其中該分隔層具有小於1 毫米（mm)的厚度。 6 ·如第1項的複合式支架，其包含該多孔性生物高分 子支架層。 7·如第6項的複合式支架，其中該多孔性生物高分子 支架層為明膠或膠原蛋白。 8.如第7項的複合式支架，其中該明膠或膠原蛋白為 1274591 ' 經過交聯劑處理之交聯的明膠或膠原蛋白。 9·如第6項的複合式支架，其中該多孔性生物高分子 支架層具有90-95體積％的孔隙度及200-500微米（μηι)的孔 徑。 10·如第6項的複合式支架，其中該多孔性生物高分 、 子支架層具有1-3毫米（mm)的厚度。 ， 11·如第1項的複合式支架，其中該下多孔性陶瓷層 為硬化或燒結的磷酸鈣骨水泥、硫酸鈣骨水泥或者生物玻 璃，其具有20-30體積％的孔隙度及100_2〇〇微米（μπι)的孔 徑。 12·如第11項的複合式支架，其中該下多孔性陶瓷層 / 為燒結的磷酸鈣骨水泥。 ’ 13·如第12項的複合式支架，其中該磷酸鈣骨水泥包 、 含聚合磷酸躬鹽（calcium polyphosphate)粉末。 、 14·如第11項的複合式支架，其中該下多孔性陶瓷層 _ 具有2-5毫米（mm)的厚度。 15·如第1項的複合式支架，其中該上多孔性陶瓷層 為硬化或燒結的磷酸鈣骨水泥、硫酸鈣骨水泥或者生物玻 螭，其具有10·50體積％的孔隙度及50-300微米（μηι)的孔 徑。 16·如第15項的複合式支架，其中該上多孔性陶瓷層 為燒結的磷酸鈣骨水泥。 17·如第16項的複合式支架，其中該磷酸鈣骨水泥包 含聚合碟酸釣鹽（calcium polyphosphate)粉末。 1274591 18·如第15項的複合式支架’其中該上多孔性陶兗層 #有0.2-2毫米（mm)的厚度。 19·如第1項的複合式支架’其為一圓柱體，直徑介 於5-2〇毫米（mm)。 20·如第6項的複合式支架，其進一步包含貼附、生 長於該多孔性生物高分子支架層的軟骨細胞與組織。 2 1. 一種製備關卽軟骨組織修補用複合支架的方法， _ 包含下列步驟： # a)壓製一第一多孔性陶瓷前驅物粉末以形成一下多孔 性陶瓷層生胚； b) 於該下多孔性陶瓷層生胚的一表面上放置一緻密性 陶瓷分隔層，或於該表面上塗佈一層由緻密性陶瓷前驅物 ‘ 粉末與一水溶液混合所形成的糊，硬化該糊而於該表面上 . 形成一緻密性陶瓷分隔層； c) 將一中空柱狀模具置於該分隔層上，及將一第二多 φ 孔性陶瓷前驅物粉末注入於該模具内，於是該第二多孔性 陶瓷前驅物粉末被堆疊於該分隔層上；或者壓製一第二多 孔性陶瓷前驅物粉末以形成一上多孔性陶瓷層生胚，再將 其放置於該分隔層上；及 d) 燒結步驟C)所獲得的疊置結構，於是形成一具有上 多孔性陶曼層、分隔層及下多孔性陶竟層的三明治結構。 22.如第21項的方法，其進一步包含： e) 準備一生物高分子溶液； f) 將一中空柱狀模具置於該三明治結構的上多孔性陶 1274591 - 竞層上’及將該生物高分子溶液注入於該模具内，形成該 生物南分子溶液的一貯池，再冷卻該貯池成膠狀物後取掉 模具； g) 將該膠狀物與一含有交聯劑的水溶液接觸，而形成 交聯的高分子柱狀物；及 h) 清洗該交聯的高分子柱狀物，再經冷凍乾燥後形成 一附著於該上多孔性陶瓷層的多孔性生物高分子支架層。 23.如第21項的方法，其進一步包含： > 準備一含有生物高分子及交聯劑的水溶液； f )將一中空柱狀模具置於該三明治結構的上多孔性陶 瓷層上，及將該水溶液注入於該模具内，形成該生物高分 子溶液的一貯池，再冷卻該貯池成膠狀物後取掉模具； g’）靜置形成交聯的高分子柱狀物；及 h)清洗該交聯的高分子柱狀物，再經冷凍乾燥後形成 附著於該上多孔性陶瓷層的多孔性生物高分子支架層。 • 24.如第22或23項的方法，其進一步包含： •)/又潤該夕孔性生物高分子支架層，再經冷涞乾燥以 开y成一更新結構的多孔性生物高分子支架層。 實施方式 根據本發明的一較佳具體實施例所完成的關節軟骨組 織修補用複合式支架，如圖1所示，包含： 一仿關節的硬骨區的下多孔性陶瓷層、1〇 ; 一仿關節的軟骨區底層的上多孔性陶瓷層20 ; 1274591 一介於該下及上多孔性陶瓷層之間且連結兩者之緻密 性陶瓷分隔層30 ;及 接著於該上多孔性陶曼層的仿關節的軟骨區中間層 的多孔性明膠層40。 本發明為加速關節軟骨細胞體外培養的生長速度，在 仿關節的軟骨區底層的上多孔性陶瓷層2〇另固定上一層 多孔性明膠層40以加速長成軟骨組織。因此，除了明膠外 亦可採用任何可加速軟骨細胞體外培養速度之高分子材料 (明膠係一種生物高分子）。 以下為本發明複合式支架每層的作用： (1) 下多孔性陶瓷層10，其仿關節的硬骨區（b〇ne zone):仿關節的軟骨下骨、海綿骨和密質骨。硬骨區的材 料選用磷酸鈣（calcium phosphate，為生醫陶瓷材料），例如 β-CPP (聚合磷酸妈鹽（caicium p〇iy_ph〇Sphate))，其厚度設 定為3 mm，孔隙度需求為20〜30體積❶/。，孔徑需求约為 100〜200 μιη 〇 (2) 上多孔性陶竟層2〇,其仿關節的軟骨區底層（b〇u〇m cartilage zone):仿關節軟骨的鈣化層區。仿關節軟骨的鈣 化層區（軟骨底層）的材料選用鱗酸辦，例如P_Cpp，其厚度 ά疋為0.2〜2 mm ’孔隙度需求為1 〇〜5〇體積％，孔徑需求 為50〜300 μιη (均視是否加上該多孔性明膠層4〇而定）。 (3) 多孔性明膠層40 :仿關節軟骨的鈣化層區以上的支 架材料則選用明膠（gelatin)，支架厚度設定為2mm，孔隙 度需求為90〜95體積％，孔徑需求為2〇〇〜5〇〇 μπχ。該多 1274591 孔性明膠層40可使用豬皮明膠為材料。明膠是膠原蛋白變 性的產物且含有RGD序列能幫助軟骨細胞貼附、生長，並 可以維持細胞活性。但是未經過任何處理的明膠易被降 解’吸水後明膠會變過軟，導致抗壓縮機械強度不足。所 以較佳的將明膠以一交聯劑，例如戊二 (glutaraideliyde， 簡稱GA)或茜草（genipin，簡稱GP)進行交聯反應，加強該 明膠層40結構的熱穩定性和抗壓縮強度。 (4)分隔層30:分隔硬骨區和軟骨區的一層薄層。分隔 . 層的材料選用麟酸弼，例如β-TCP (磷酸三釣鹽（tri-calcium phosphate))，其厚度越薄越好，孔隙度要求<5體積％，孔 徑要求<5 μιη。 實施例： 複合式支架的製程 1· 複合式支架的製造（其中分隔層及多孔性明膠層的製 g 造另述） (1) 取0·3 g的非晶形聚合麟酸詞鹽（acpp)粉末以5嘲壓鍵 成型得到直徑10 mm的生胚（此CPP層係作為複合式 支架的硬骨層）。 (2) 在生胚上放置製造好的TCP分隔層薄片（另如下述）， 或採TCP陶瓷粉末以塗布的方法在生胚上加上tcp分 隔層。再在分隔層上放置一中空圓柱形模具，取〇.〇4§ 的aCPP粉末倒入模具内，於是在該生胚上形成一由 aCPP粉末所構成的圓柱（在採用多孔性明膠層加速長 11 .1274591 成軟骨組織的情況下，此圓柱或圓片亦可採用較簡易 的另行壓製的aCPP生胚疊於分隔層上即可，其製傷可 採相同於步驟（1)的壓錠或其他薄片製造的方法）。 (3)以10〇C/min升溫至900°C，於900〇C持溫2 hr後以空 氣退火。 (4) 2. 將陶瓷片以去離子水清洗，浸於絕對酒精中且放入烘 粕内以11 〇。(：除水，於是製得一具三明治結構的半成 品’置於乾燥箱中保存。各層的厚度為：上多孔性陶 竟層1 mm ;分隔層0.61 mm ;下多孔性陶瓷層3 mm。 分隔層薄片的製造 ⑴將 95 g 的 β-TCP 和 5 g 的 Na4P2〇7.l〇H20 (sodium pyrophosphate)溶於100 mL的去離子水中，混合均勻。 (2) 放入烘箱内以9〇〇c除水。 (3) 以粉碎機打碎成粉末，再置於乾燥箱中保存。 (4) 取0.1 g的粉末以4噸壓錠成型得到直徑1〇 mm的生 胚。 (5) 以5°C/min升溫至1180°C，保持該溫度6 hr後，以空 氣退火。 (6) 將陶瓷片以去離子水清洗，浸於絕對酒精中且放入烘 箱内以110〇C除水，再置於乾燥箱中保存。 3.多孔性明膠層的製造 多孔性明膠層的製造包括使明膠在低溫轉變成果凍狀 的膠，再將果束狀的膠浸入一交聯劑溶液中進行交聯反 應’待反應完成後’再經過清洗、冷凍、冷;東乾燥等步驟。 12 •1274591 • 實驗步驟： (1) 配置不同重量。/〇的明膠水溶液，放入5〇°c值溫水槽並 攪拌1小時。 (2) 在前述所製造的具三明治構造的半成品支架之上多孔 性陶瓷層上放置一中空圓柱形模具，再將步驟（1)的溶 • 液倒入模具内（此時明膠溶液將滲入上多孔性陶竟層 中，爾後經交聯反應與冷凍乾燥達成固定於該上多孔 _ 性陶瓷層），並放入冰箱冷卻成膠後取掉模具。 (3) 將支架放入〇·5重量％的戊二醛（glutaraldehyde，簡稱 GA)或0·5重量％的茜草（genipin，簡稱Gp)溶液中，於 室溫下進行交聯反應兩天。 (4) 將支架取出，用苯胺酸清洗再用二次去離子水清洗三 次。 (5) 將支架放入-20〇C冰箱内3小時。 (6) 放入真空冷凍乾燥機（_55C>C及1〇〇加〇⑺内，時間為 _ 3 6小時。 (7) 於室溫下浸潤後再做一次冷凍乾燥。 本製備方法可單獨製造多孔性明膠支架，僅需在上述 步驟⑺令將步驟⑴的溶液倒入半封閉的中空圓柱形模呈 内即可。餘均同上述。 …、 本1明將多孔性明膠層接著於上多孔性陶究層的方法 =採用—較簡易的步驟’即將上述步驟⑺〜⑺改為： 將步驟⑴的浴液混人重量％的戊二路（以）或 ^里％的茜草（GP) ’於5G°C恆溫水槽中㈣2分鐘， 13 1274591 即倒入上述步驟（2)所述的 聯反應兩天後取掉模具。 模具内，再於室溫下進行交 再進行上述步驟（4)〜（7)。 複合式支架的評估 1· 分隔層薄片的評估 分隔層為分隔硬骨區和軟骨區的一層薄片，其作用在 於阻止硬骨區的血管過度增生至軟骨區。分隔層的材料選 用β-TCP’其厚度越薄越好（若採用塗布的方法可甚薄），孔 隙度要求<5體積％，孔徑要求<5 μπι。 依據實驗結果，燒結後的TCP分隔層直徑為8.36 mm，厚度為〇·61 mm，孔隙度由燒結前的46體積％降至燒 結後的3體積％，由掃瞄式電子顯微鏡（sem)圖可見Tcp 分隔層幾乎沒有孔洞，可能的孔徑趨近於〇。因此，此Tcp 陶瓷片為一合適的分隔層材料。 2·複合式支架的評估（多孔性明膠層的評估另述） 数蜂養軟骨細胞的# _ 組織工程支架所培養出的關節軟骨組織，其細胞外間 貝（extracellular matrix)的酷胺素（giyCOsamin〇giyCan，簡 稱GAG)s里應為經脯胺酸（hydroxyproline，簡稱HP)含量 的3〜5倍才與天然軟骨組織的細胞外間質的成分符合，本 實施例的實驗結果即相當符合此點。 在經過約一個月的體外培養後，由本實施例的複合式 支架的縱切片的曱苯胺藍（toluidine blue)染色圖可見，其與 天然軟骨切片的甲苯胺藍染色圖相似。 1274591 m 3·多孔性明膠層的評估 夕孔性明膠層接著於上多孔性陶瓷層後，進行模擬軟 月組織體外培養的於水溶液中的震盪搖晃的情況，結果顯 不其間連結力甚強，多孔性明膠層不會與上多孔性陶瓷層 脫離。此種連結力可用調整上多孔性陶瓷層的孔隙度與厚 . 度等予以增強。以下所述為測試單獨的多孔性明膠支架的 特丨生及其對培養軟骨細胞的影響，以確認本發明的製造多 孔性明膠結構的方法的效果。 § 當父聯反應的溫度為25。(：時，觀察多孔性明膠支架在 父聯反應後的情形：多孔性明膠支架沒有發生溶解的現 象，也沒有崩解的現象發生。比較經過一次和兩次冷凍乾 燥程序的GA和GP交聯的多孔性明膠支架，由SEM支架 結構分析，可以發現孔徑均為3〇〇〜5〇〇 μιη。但經兩次冷 - 凍乾燥程序的多孔性明膠支架的壁和僅經一次冷凍乾燥者 • 其結構有明顯的不同。如圖2Α至2D所示，可以發現經過 • 兩次冷凍乾燥程序的多孔性明膠支架的結構為孔室體積縮 小而數量增多，結構較均勻，且孔室壁上產生許多小扎洞， 此種結構不但可增加支架的機械強度，且有助於細胞的遷 移分佈及培養液的傳送而有助於組織的生成。 免立性明歷^架對培基斡骨細胞的影響 在經GP交聯再經過二次冷凍乾燥後所得的的多孔性 明膠支架上植入5χ1〇6細胞，培養九天後，將多孔性明膠 支架作石蠟包埋，再作組織切片染色，可以很清楚看出軟 月細胞可以貼附在GA和GP交聯的多孔性明膠支架上。 15 1274591 ' GA交聯的多孔性明膠支架由於GA毒性的關係，貼附於支 架上的軟骨細胞數目非常少，也無法生長出近似正常軟骨 組織的結構。而軟骨細胞於GP交聯的多孔性明膠支架上貼 附的數量很多，其細胞密度、型態類似㈣加大鼠的關節 軚月切片圖上的結構。為瞭解軟骨細胞是否能夠均勻分佈 •在多孔性明膠層的内部，將培養九天的經GP交聯的多孔性 明膠支架作橫截面和縱切面的切片，觀察切片圖上軟骨細 _ 月匕刀佈的凊形。結果顯示軟骨細胞均勻分佈在多孔性明膠 支架的孔洞内，也可以看出軟骨細胞均勻分佈在多孔性明 膠支架的内部。由縱切面和橫截面的切片觀察，可以得知 夕孔丨生月膠支架的孔洞結構被軟骨細胞所填滿。以上證實 ^本發明經GP交聯的多孔性明膠支架適合軟骨細胞的生長。 除了茜草（GP)及戊二酸（ga)外，本發明亦可採用其他 - 父聯劑進行明膠的交聯以形成具足夠機械強度的多孔性明 . 膠層或明膠支架。

• 培養到第三十天，由多孔性明膠支架的外觀（如圖3 A 所不）可以明顯發現有軟骨組織覆蓋住，由圖中可以估算支 架表面軟骨組織的厚度約為300 μηι。而如圖3B所示，所 長成的軟骨組織近似天然關節軟骨組織的結構，具有標示 為1的軟骨的淺層區；標示為2的軟骨的中層區；及標示 為3的軟骨的深層區。此顯示本專利的明膠支架層的適用 性。 4·評估結論 總結以上評估的結果，顯示本發明的複合式支架為合 16 1274591 適的修補關節軟骨組織的生醫支架材料。 於本！X月的另-較佳具體實施例中，不具該多孔性明 膠層的三明治式支羊祐插 Μ 一 、文朱被植入軟骨細胞進行培養。實驗結果 顯示’不具該多孔性明膠層 — 吵續的二明治式支架亦可長出近似 天然關節軟骨組織結構的軟骨 僻〜私I組織（但長成較慢），故不具 該多孔性明膠層的=明夺士加‘丄 八 一月/u式支架亦為合適的修補關節軟骨 組織的生醫支架材料。 圖式簡單說明 …圖1為本發明的-較佳具體實施例的關節軟骨虹織修 補用複合式支架的剖視示意圖。 θ圖2Α為使用5重量％的明膠水溶液冷卻成膠後，經0.5 重量％的戊二路（glutaraldehyde，簡稱ga)水溶液交聯，再 .經一次冷束乾燥後所得的多孔性明膠支架的咖照片。 • ® 2B為使用5重量％的明踢水溶液冷卻成膠後，經05 重量=的茜草（genipin，簡稱Gp)水溶液交聯，再經—次冷 凍乾燥後所得的多孔性明膠支架的Sem照片。 7 旦圖2C為使用5重量％的明膠水溶液冷卻絲後，經μ 重量％的GA水溶液交聯，再經二次冷凍乾燥後所得沿 性明膠支架的SEM照片。 札 —圖2D為使用5重量％的明膠水溶液冷卻成膠後，毯〇5 重量％的GP水溶液交聯，再經過二次冷凌乾燥後所夕 孔性明膠支架的SEM照片。 的夕 17

Claims (1)

1274591 拾、申請專利範圍 1. 一種關節軟骨組織修補用複合式支架，包含. 一仿關節的硬骨區的下多孔性陶究層； 仿關郎的軟骨區底層的上多孔性陶甍層；及 一介於該下及上多孔性陶瓷層之間且連結兩者之緻密 性陶瓷分隔層；及 & 選擇性的一仿關節的軟骨區中間層的多孔性生物高分 子支架層’其接著於該上多孔性陶竞層。 I 2·如申請專利範圍第丨項的複合式支架，其中該分隔 層為硬化或燒結的磷酸鈣骨水泥、硫酸鈣骨水泥或者生物 玻璃（bi〇glass)，其孔徑小於5微米（μιη)。 3·如申請專利範圍第2項的複合式支架，其十該分隔 層為硬化或燒結的磷酸鈣骨水泥。 4·如申請專利範圍第3項的複合式支架，其中該磷酸 鈣月水泥包含鱗酸二鈣鹽（tricaleium 粉末。 5·如申請專利範圍第2項的複合式支架，其中該分隔 層具有小於1毫米（mm)的厚度。 6.如申凊專利範圍第丨項的複合式支架，其包含該多 孔性生物高分子支架層。 19 1274591 7·如申請專利範圍第6項的複合式支架，其中該多孔 性生物高分子支架層為明膠或膠原蛋白。 8·如申請專利範圍第7項的複合式支架，其中該明膠 或膠原蛋白為經過交聯劑處理之交聯的明膠或膠原蛋白。 9·如申請專利範圍第6項的複合式支架，其中該多孔 性生物高分子支架層具有90-95體積％的孔隙度及200-500 微米（μπι)的孔徑。 10. 如申請專利範圍第6項的複合式支架，其中該多 孔性生物高分子支架層具有1 - 3毫米（mm)的厚度。 11. 如申請專利範圍第1項的複合式支架，其中該下 多孔性陶瓷層為硬化或燒結的磷酸鈣骨水泥、硫酸鈣骨水 泥或者生物玻璃，其具有20-30體積％的孔隙度及1〇0-200 微米（μιη)的孔徑。 12·如申請專利範圍第11項的複合式支架，其中該下 多孔性陶瓷層為燒結的磷酸鈣骨水泥。 13.如申請專利範圍第12項的複合式支架，其中該磷 酸鈣骨水泥包含聚合磷酸鈣鹽（calcium Polyphosphate)粉 20 1274591 末0 14·如申δ青專利範圍第11項的複合式支架，其中該下 多孔性陶瓷層具有2-5毫米（mm)的厚度。 15·如申請專利範圍第i項的複合式支架，其中該上 多孔性陶瓷層為硬化或燒結的磷酸鈣骨水泥、硫酸甸骨水 泥或者生物玻璃，其具有10_50體積％的孔隙度及5〇_3〇〇 微米（μπι)的孔獲。 16.如申請專利範圍第15項的複合式支架，其中該上 多孔性陶瓷層為燒結的磷酸鈣骨水泥。 17·如申請專利範圍第16項的複合式支架，其中該填 酉夂鈣月水泥包含聚合磷酸鈣鹽（calcium p〇lyph〇Sphate)粉 18·如申請專利範圍第15項的複合式支架，其中該上 多孔性陶垄a β 1 J免層具有0.2-2毫米（mm)的厚度。 19 κ •如申請專利範圍第1項的複合式支架，其為一圓 柱體’直拟人 、 I伙介於5_20毫米（mm)。 20 •如申請專利範圍第6項的複合式支架，其進一步 21 1274591 '包含貼附、生長於該多孔性生物高分子支架層的軟骨細胞 與組織。 21· —種製備關節軟骨組織修補用複合支架的方法， 包含下列步驟： - a)壓製一第一多孔性陶瓷前驅物粉末以形成一下多孔 ^ 性陶瓷層生胚； b) 於該下夕孔性陶竞層生胚的一表面上放置一緻密性 陶瓷分隔層，或於該表面上塗佈一層由緻密性陶瓷前驅物 粉末與一水溶液混合所形成的糊，硬化該糊而於該表面上 形成一緻密性陶瓷分隔層； c) 將一中空柱狀模具置於該分隔層上，及將一第二多 孔性陶瓷前驅物粉末注入於該模具内，於是該第二多孔性 - 陶瓷前驅物粉末被堆疊於該分隔層上；或者壓製一第二多 ' 孔性陶瓷前驅物粉末以形成一上多孔性陶瓷層生胚，再將 _ 其放置於該分隔層上；及 d) 燒結步驟c)所獲得的疊置結構，於是形成一具有上 多孔性陶瓷層、分隔層及下多孔性陶瓷層的三明治結構。 22·如申請專利範圍第2 1項的方法，其進一步包含·· e) 準備一生物高分子溶液； f) 將一中空柱狀模具置於該三明治結構的上多孔性陶 瓷層上，及將該生物高分子溶液注入於該模具内，形成該 生物高分子溶液的一貯池，再冷卻該貯池成膠狀物後取掉 22 1274591 _ 模具； ▲ g)將該膠狀物與一含有交聯劑的水溶液接觸，而形成 父聯的高分子柱狀物；及 h)清洗該交聯的高分子柱狀物，再經冷凍乾燥後形成 附著於該上多孔性陶瓷層的多孔性生物高分子支架層。 23·如申請專利範圍第21項的方法，其進一步包含： e’）準備一含有生物高分子及交聯劑的水溶液； f )將中空柱狀模具置於該三明治結構的上多孔性陶 瓷層上，及將該水溶液注入於該模具内，形成該生物高分 子溶液的一貯池，再冷卻該貯池成膠狀物後取掉模具； g’）靜置形成交聯的高分子柱狀物；及 h) 清洗該交聯的高分子柱狀物，再經冷凍乾燥後形成 一附著於該上多孔性陶瓷層的多孔性生物高分子支架層。 , 24·如申請專利範圍第22或23項的方法，其進一步 包含： i) 浸潤該多孔性生物高分子支架層，再經冷柬乾燥以 形成一更新結構的多孔性生物高分子支架層。 23 1274591 圖3A為經Gp交聯再經過二多人 介今"月 性明膠支架植入5xl〇6細胞，培c軔後所得 膠支架作石犧包埋，再作組織切片及-Η:色性明 鏡放大照片。 ’、、光學顯微 圖3Β為經GP交聯再奴<、a 一 、、$ k二次冷凍乾燥後所得的多 性明膠支架植入5xl〇6細胞 于的夕孔 匕培養二十天後，將多孔性明 膠支架作石蠟包埋，再作έ 作、、且織切片及Η&Ε染色的光學顯料 鏡放大照片。 貝Μ 主要元件之符號說明 10··下多孔性陶瓷層；20 μ夕 20··上多孔性陶瓷層； 30··緻密性陶瓷分隔層 田，4υ••多孔性明膠層 18