TWI272105B

TWI272105B - Cattle reproduction vaccines

Info

Publication number: TWI272105B
Application number: TW092122872A
Authority: TW
Inventors: Paul Joseph Dominowski
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 2002-08-26
Filing date: 2003-08-20
Publication date: 2007-02-01
Also published as: NZ565206A; AU2003263390B2; IS7672A; JP2006501237A; PL375548A1; JP2012092126A; PL216541B1; HK1078457A1; KR20060116037A; JP2009215309A; HRP20090271A2; RS20050177A; UY27948A1; EA200500275A1; HRP20050192B1; AR041047A1; US20100266629A1; EP1743652A1; US9662384B2; AP2005003238A0

Description

1272105 (1) 玖、發明說明【發明所屬之技術領域】本發明係關於對動物投用有效量之組合疫苗治療或預防第1以及2型牛病毒性下痢病毒（BVDV)、第1型牛泡疹病毒（BHV— 1)、牛呼吸道合包病毒（BRSV)、副流行性感冒病毒（P 1 3 )、胎兒彎曲桿菌、犬鉤端螺旋體、流感傷寒型鉤端螺旋體、鉤端螺旋體屬（Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno)、黃疽出血鉤端螺旋體、鉤端螺旋體屬（Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis) 以及波摩那問號狀鉤端螺旋體感染動物引起的疾病或病症之組合疫苗以及方法。組合疫苗可爲全部或局部的細胞去活化物或經修飾之活製劑。【先前技術】發明背景已知和第1型牛泡疹病毒（Β Η V - 1 )倂發症相關的五種病毒牛呼吸道疾病（BRD )是：牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBR)、第1以及2型牛病毒性下痢病毒（BVDV) 、牛呼吸道合包病毒（BRSV )、以及副流行性感冒病毒 (Ρ 1 3 )，其可導致影響酪農業經濟極大之母牛一小牛之呼吸以及生殖系感染。BRD可引發廣汎的臨床症候群，包括急性呼吸道疾病及流產。呼吸形式之BRD，其特徵爲發炎、腫脹、出血、及呼吸道黏膜壞死並伴隨著高燒、神經性厭食症、沮喪、流鼻液、呼吸困難、以及口發炎。一 4- (2) 1272105 IBR及BVDV病毒能在懷胎的所有三個三個月期中誘發流產，但是多半是發生在妊娠的後半段，且經常沒有其它臨床症候的徵候（Ellis et al. (1 996) JAVMA 208: 393 -400; Ellsworth et al. ( 1994 ) In · Proceedings, 74th Conference of Research Workers in Animal Disease : 34) o 第1型牛泡疹病毒（BHV — 1)是α疹病毒科次群之一，且會產生各種臨床形式的牛隻疾病，包括：呼吸以及生殖器官感染、結膜炎、腦炎、及流產。以往控制BHV - 1感染病時是利用包含活體減毒的病毒疫苗（Gerber，J. D.? et al.? 1 9 7 8, Am. J. Vet. Res. 39 ： 75 3 - 760;

Mitchell, D·，1974，Can. Vet. Jour .15 : 148 — 151)、去活性病毒（Frerichs，G. N·，et al·，1982，Vet. Rec. Ill : 116 — 122)、以及病毒的次單體例如，三種主要的 BHV —1醣蛋白中的一種，在此技藝中稱爲gl、gill、及gIV (Babiuk，L. A.，et al·, 1987，Virology 159 : 57 — 66; van Drυnen? S.， et al.， 1993, Vaccine 11 : 25— 35)。此外，已說明BHV — 1 gIV糖蛋白質重組、縮短的版本（在此技藝中稱爲BHV — 1 tglV)具有誘發黏膜免疫對抗BHV - 1 白勺肯b 力(van Drunen， S·， et al·， 1994， Vaccine， 12 : 12 9 5 —1 3 02 )。然而，此種BHV - 1疫苗是禁用於血淸陽性或血淸陰性的妊娠牛隻，並也禁用於哺乳小牛之妊娠母牛。

第1以及2型BVDV已涉及各種臨床症候群。硏究顯示此病毒可導致嚴重的初級呼吸道疾病；持續感染的（PI (4) 1272105 分娩 P I 小牛（（M a 1 m q u i s 15 J . A m · V e t · M e d · A s s o c · 1 5 2 :763 — 768 ( 1968) ; Ross, et al.5 J. Am. Vet. Med. A s s o c · 1 8 8 : 6 1 8 — 6 1 9 乂 1 9 8 6 ))。此類小牛對此病毒具免疫耐受性且在其有生之年血液中持續帶有病毒。他們是爆發黏膜疾病的來源（Liess, et al.5 Dtsch. Tieraerztl. Wschr· 8 1 ·· 48 1 — 487 ( 1 974 ))且極易感染微生物造成之疾病，例如肺炎或腸內的疾病（Barber，et al.，Vet. Rec. 117： 459464 ( 1 98 5 ))。依據培養細胞中BVDV病毒的生長硏究，可分離出二種病毒生物型：在感染的細胞中誘發細胞病變效應（cp ) 之病毒以及不誘發細胞病變效應（ncp )之病毒（Lee et a 1. ? A m. J. Vet. Res* 18 : 952 — 953; Gillespie et al.， Cornell Vet .5 0 : 73 — 79，1 96 0 ) 。Cp 變異體是來自前感染 ncp 病毒的 PI 動物（Howard et al·, Vet. Microbiol. 13 :3 6 1 — 3 69，1 9 87; Corapi et al·，J. Virol. 62 : 282 32827, 1988)。基於BVD病毒之病毒顆粒表面糖蛋白質E2的5’ 非轉譯區域（NTR )的遺傳多樣性以及抗原性的差異，一般將此二種主要基因型分爲：第I以及II型。第1型 BVDV是古典的或傳統的病毒品系，通常在具有免疫能力的動物中只產生溫和的下痢，而第2型BVDV是一種致病性高的新興病毒，能產生血小板減少症、出血以及急性的致命疾病（Corapi et al.，J. Virol. 6 3 : 3 93 4 - 3 943; Bolin et a 1. ? Am. J. Vet. Res. 53 · 2157 — 2 1 63; Pellerin et al.? Virology 203 : 260 — 268，1994; Ridpath et al.，Virology 1272105 (5) 205 : 6 6 — 74，1994; Carman et al.，J. Vet. Diagn. Invest. 1 0 : 2 7 — 3 5, 1 99 8 )。使用一組單株抗體（Mabs )和動物產生的病毒專一性抗血淸之交互中和反應測定顯示第I以及II型BVDV病毒有顯著的抗原性（Corapi et al·，Am. J. Vet. Res· 51 : 1388 — 1394，1990)。任一基因型之病毒可爲二種生物型中的一種，即cp或ncp病毒。硏究BVD病毒感染的動物顯示BVD病毒誘發動物之 B 細胞以及 T —細胞反應（D ο n i s e t a 1., V i r ο 1 〇 g y 1 5 8 ·· 1 6 8 — 1 73，1 9 8 7; Larsson et al.? Vet. Microbiol. 3 1 ： 3 17 —3 2 5 5 1 9 9 2; Howard et al.? Vet. Immunol. Immunopathol. 3 2: 3 03 — 3 1 4，1 992; Lambot et al.，J. Gen. Virol. 78 ： 1 0 4 1 — 1 0 4 7, 1 997; Beer et al·，Vet. Microbiology. 58 : 9-22,1997)。目前使用化學去活性BVD病毒分離株已發展出許多 BVDV 疫苗（Fernelius et al·，Am. J. Vet. Res. 33 : 1421 —1431，1 9 7 2; Kolar et al.? Am. J. Vet. Res. 33 * 1415 — 1420，1 9 7 2; McClurkin et al·，Arch. Virol. 58 : 119，1978 )。去活化病毒的疫苗須使用多重劑量以達成初級免疫。一些去活化性BVDV疫苗只可提供保護對抗第I型BVDV 感染（Beer et al·，Vet. Microbiology· 77 : 1 9 5 — 208, 2000 )。由於去活化性BVDV疫苗只能提供短期免疫而無法有效率的提供交互樣型的保護，所以不能保護胎兒（ Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11 : 615 — 625,1995)。 1272105 (6) 另一方面，經修飾之活病毒（M L V )疫苗則提供較高層次的保護。目前，許可的BVDV MLV疫苗是使用在牛或豬細胞中重覆培養得到的衰減病毒製成（Coggins et al.? Cornell Vet.51 * 539? 1961; Phillips et al.? Am. J.

Vet. Res· 3 6 : 1 3 5 —，1 97 5 )，或使用溫度敏感性表現型化學修飾之病毒製成（Lob man η et al.，Am. J. Vet. Res. 45: 2498 —，1 984; 47: 557—561，1 9 8 6 ) 〇單一齊!l 量之 MLV疫苗已足以進行免疫，接種牛隻的免疫持續期間可持續數年。然而，此類使用第I型B V D V病毒品系發展的疫苗，只能保護對抗第I·型病毒。此外，此類現有的 BVDV疫苗不能應用於妊娠牛隻或哺乳小牛的妊娠母牛。在P 1 3病毒單獨作用下一般只會產生程度中等的疾病；然而此病毒在具病理性的生物體包括IBR病毒、 BRSV、以及BVDV下即會在呼吸道繼發性感染，造成典型的運輸發燒症候群。習知導致牛隻的呼吸道疾病之各種病毒中，以 P13病毒的散佈最廣。Ellis et al. ( 1 996 ) JAVMA 208 ： 3 93 - 400.

BRSV可優先感染下呼吸道，感染之嚴重性多半是由免疫系統對關鍵的病毒蛋白質的反應測定。Bolin et al.( 1990) Am J Vet Res 51 : 703。感染的牛隻一般而言呈現非特異性的症候，包括鼻孔以及眼睛流出血淸、溫和的（經常是雙相的）發燒、以及乾咳。更多嚴重感染的牛隻會發展出嚴重的咳嗽、用口的困難呼吸、以及口周圍流起泡的口水、及拒絕進食及飮水。Ellis et al. ( 1 996 ) JAVMA 1272105 (7) 20 8 ： 3 93 - 400. 鉤端旋體病是由鉤端螺旋體屬之螺旋體引起的疾病，爲一種重要經濟家畜的動物性感染。鉤端螺旋體屬（ Leptospira borgpetersenii serovar h ar dj ο ? L . hardjo)以及夠端螺旋體屬（L. interrogans serovar pomona、波摩那型鉤端螺旋體）是最常見與世界各地牛隻鉤端旋體病相關的二種血淸變型。在美國的牛隻調查中，29%有L. hardjo ，23 %有波摩那型鉤端螺旋體之血淸性反應。鉤端螺旋體經由黏膜或破裂皮膚侵入身體，經由血液散播。他們有腎以及生殖器官道的趨性，較不常見爲眼球玻璃液以及中樞神經系統的趨性。最常見的感染方法，是直接或間接和感染的尿液、牛奶、或胎盤液接觸，但是亦/可經性行爲以及經卵巢的傳輸感染。感染鉤端螺旋體屬之牛隻會導致急性的發燒、缺乳、流產、或早產以及虛弱的感染牛隻，以及可促成生育衰竭以及低的受孕率。可用抗生素治療感染，但是抗生素治療對非泌乳的或妊娠的牛隻並不明顯。該牛隻會形成腎臟急性的或慢性感染，造成尿道蛻去含致病生物體的上皮並感染其它動物或管理牛隻的人。鉤端螺旋體屬之免疫是具有血淸變型的專一性，雖然多年來已有疫苗，但最多只能誘發不良以及短暫的免疫。因此需要發展一種組合疫苗對抗多樣性的抗原，保護妊娠以及哺乳母牛及其後代之安全以適應酪農業以及牛肉母牛市場的須要。因此本發明提供疫苗以治療以及預防導致動物例如母牛以及牛隻呼吸道以及繁殖疾病之主要感染 -10- (8) 1272105 。本發明進一步的提供產生免疫性的組成物以及治防由動物疾病或病症的方法。【發明內容】本發明槪要本發明提供治療或預防感染至少一個第I型或 BVDV、BHV1、P13、BRSV、胎兒彎曲桿菌、犬鉤體、流感傷寒型鉤端螺旋體、鉤端螺旋體屬（Lej borgpetersenii hardjo-prajitno)、黃痕出血鉤端螺夠端螺旋體屬（L e p t 〇 s p i r a b 〇 1. g p e t e r s e n i i h ar dj 〇-以及波摩那問號狀鉤端螺旋體引起的動物疾病或病法，其係包含對動物投用有效量之組合疫苗。. 本發明方法可保護動物，例如牛（特定言之乳免於呼吸感染和繁殖的疾病。本發明方法可保護動妊娠母牛免於由IBR引起的流產以及第1以及2型引起的持續性胎兒感染。本發明方法亦可保護動物娠母牛以及哺乳小牛之妊娠母牛，免於由第1以2 B V D V引起的持續性感染。因此，本發明方法可保動物、妊娠動物以及泌乳動物。本發明方法使用之組合疫苗可爲全部或局部的劑（例如經修飾之活製劑）。依據本發明投用之組可包括其它成份，例如佐劑，且可視需要在組合疫用第二種或多種抗原。第二抗原係選自包括（但非 :第1型牛皰疹病毒（BHV - 1 )、牛病毒性下痢療或預第2型端螺旋丨 t 〇 s p i r a 旋體、 )o v i s ) 症之方奶牛）物例如 B VD V 例如妊乏2型護育齡細胞製合疫苗苗中使限制）病毒（ -11 - 1272105 (9)

第1或2型BVDV )、牛呼吸融合病毒（BRS V )、副流行性感冒病毒（P 1 3 )、犬鉤端螺旋體、流感傷寒型鉤端螺旋體、鉤端螺旋體屬（L e p t 〇 s p i r a b 〇 r g p e t e r s e η i i hardioprajitno)、黃疽出血鉤端螺旋體、波摩那問號狀鉤端螺旋體、夠端螺旋體屬（L e p t 〇 s p i r a b 〇 r g p e t e r s e n i i hardjo-bovis)、鉤端螺旋體屬（Leptospira brat is lava) 、胎兒彎曲桿菌、犬新孢子蟲、胎兒滴蟲、牛黴漿菌、睡眠嗜血菌、溶血性曼氏桿菌以及巴氏桿菌。【實施方式】發明之詳細描述本發明提供治療或預防由動物感染IBR、BVDV、P1 3 、BRSV、胎兒彎曲桿菌及/或鉤端螺旋體屬引起的疾病或病症的方法，其係對動物投用有效量之組合疫苗。

在某些具體實施例中，本發明方法使用之疫苗包含經修飾的活疫苗以及醫藥學上可接受的載體、或經修飾之活疫苗以及佐劑。爲了說明本揭示，而非限制本發明之方法，本發明之詳細描述可分成以下之兩個部份’以描述或說明本發明某些特色、具體實施例或用途。定義以及縮寫本文術語之''治療或預防〃疾病或病症係指降低或排除致病的第1以及2型BVDV病毒；IBR; P13; BRSV; -12- (12) 1272105 之活的抗原、至少一個第二抗原和佐劑，其可防止或降低感染危機及/或改善感染症狀。在較佳的具體實施例中第二抗原是去活性抗原。在較佳的具體實施例中組合疫苗的來源是 PregSure ® 5(Pfizer，Inc·) 、PregSure ® 5 — L5 ( Pfizer，Inc.)以及 PregSure ® 5 — VL5 ( Pfizer，Inc. )。組合疫苗尤佳的來源是PregSure ® 5 — VL5。組合疫苗成分對抗病源菌的保護效應通常是經過誘發患者免疫反應、細胞調節或體液免疫反應或兩者的組合加以達成。一般而言，破壞或降低 BVDV、IBR、及/或 P 1 3感染的發生率、改善症狀、或從感染的病患加速的除去病毒可表示組合疫苗組成物的保護效應。本發明供應之疫苗組成物可保護對抗第1型以.及第2型BVD病毒（二者之一或兩者）引起的感染與BHV— l(IBR)引起的流產以及 P13及BRSV引起的呼吸感染。本發明投用組合疫苗治療或預防由動物感染IBR、 BVDV、P13、BRSV、胎兒彎曲桿菌及/或鉤端螺旋體屬引起的疾病或病症的方法，在此亦稱爲疫苗接種方法。本文術語之 ''組合疫苗〃，其係用於本發明方法，包括例如去活性全部或局部的C . f e t u s及/或鉤端螺旋體屬細胞製劑、去活性第1以及2型BVDV及/或一種或多種經修飾之活抗原例如 BHV — 1、P13及/或BRSV。本發明疫苗組成物的具體實施例之一包含有效量之一種或多種上述的BVDV病毒，較佳者爲cpBVD - 2菌株 5 3 5 3 7 ( ATCC PTA - 4 8 5 9 ) ； cpBVD — 1 菌株 5 960 ( -15- 1272105 (13) cpBDV — 1 菌株 5960 - National Animal Disease Center， United States Department of Agriculture, Ames, Iowa)； IB R 是突變株 R B L 106 ( National Institute of Veterinary Research，Brussels，Belgium) ; P13 是突變株 RBL 103 ( RIT，Rixensart，Belgium) ; BRSV 菌株 3 75 (Veterinary Medical Research Institute，Ames, Iowa)。疫苗組成物中可直接的利用純化的BVDV病毒，或較佳者BVD病毒可經化學方法去活化或連續在體外生長加以進一步的衰減。典型地疫苗含有約1 X 1〇3至約1 X 1〇1()溶菌班或菌落形成單位之病毒，和獸醫可接受的載體以及佐劑，體積介於〇. 5至5毫升之間以及較佳者約2毫升。疫苗組成物中提供有效保護效應的病毒精確量可由熟練的獸醫師測定。適用於疫苗組成物之獸醫可接受的載體將可爲描述於下之任何載體。典型的治療路徑是肌肉內或皮下注射約0.1至約5毫升之疫苗。本發明之疫苗組成物也可包含額外的有效成分，例如對抗BVDV之其它疫苗組成物，例如描述於 WO 9512682、WO 9955366、美國專利第 6,060,457 號、美國專利第6,0 1 5,795號、美國專利第6,001，613號、以及美國專利第5，5 9 3，8 7 3號。經由單一的防疫注射或經由多重防疫注射可完成疫苗接種。視需要可從接種動物收集血淸以及測試抗BVD病毒抗體之存在。本發明另一具體實施例中，疫苗組成物是用於治療 -16- 1272105 (14) BVDV感染。據此，本發明提供治療第1型或第2型、或第1型及第2型BVD病毒組合感染的動物病患之方法，其係對動物投用有效治療量之本發明BVD病毒。另一具體實施例中本發明疫苗組成物可有效的增進牛群生育性，以及降低從牛隻傳輸疾病至人類的危機。 ''動物患者〃意指包含任何易受BVDV、BHV.、P13 、BRSV或鉤端螺旋體屬感染之動物，例如：牛、羊及豬

〇在實行本發明方法時，將本發明疫苗組成物投用至牛隻較佳者係經由肌肉內的或皮下路徑，雖然其它路徑亦可利用，例如：經口的、鼻腔內的（例如氣溶膠或其它非針的投用路徑）、淋巴結內的、皮膚內的、腹腔內的、直腸的或陰道的投用路徑、或路徑之組合。亦可能須要追加療程，此劑量療程可調整至供應最佳的免疫。

''產生免疫性〃意指BVD病毒驅使動物產生免疫反應對抗第1型或第2型BVD病毒、或對抗第1型0及第 2型BVD病毒二者的能力。此免疫反應可爲主要由細胞毒的T 一細胞調節的細胞免疫反應，或主要由助手T -細胞活化B細胞導致抗體生產所調節的體液免疫反應。依據本發明，較佳病毒是經由化學試劑去活性或在作爲產生免疫性的組成物之前在細胞培養連續生長繁殖加以衰減。此衰減方法是熟悉此技藝的專業人士所熟知的方法

本發明產生免疫性的組成物包括較佳病毒爲BVDV -17- (15) 1272105 cp 5 3 6 3 7 ( ATCC No. PTA- 4 8 5 9 )。本發明產生免疫性的組成物包括的另一較佳病毒爲B V D V 5 9 6 0。本發明產生免疫性的組成物進一步包括的較佳病毒是OR株，其爲突變株RBL 1 06。本發明產生免疫性的組成物包括的另一較佳病毒爲P13，其爲突變株RBL 103。本發明產生免疫性的組成物包括的另一較佳病毒爲B R S V品系3 7 5。本發明之產生免疫性的組成物也可包含額外的有效成分，例如對抗BVDV之其它產生免疫性的組成物，例如描述於共同申請中的申請案序號 0 8 / 1 0 7，9 08、 WO 95 1 268 2、WO 9 95 53 66、美國專利第 6,06 054 5 7 號、美國專利第6，0 1 5，7 9 5號、美國專利第6，0 0 1，6 1 3號、及美國專利第5,5 93,8 73號。；、_ V，此外，本發明產生免疫性的以及疫苗組成物能包含一種或多種獸醫可接受的載體。本文之''獸醫可接受的載體〃包括任何以及所有的溶劑、分散培養液、塗料、佐劑、安定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌及抗真菌劑、等張劑、吸收延緩劑等。稀釋劑包含水、生理食鹽水、葡聚糖、乙醇、甘油等。等張劑包含氯化鈉、葡聚糖、甘露糖醇、山梨糖醇、及乳糖等。穩定劑包含白蛋白等。佐劑包括（但非限於）：RIBI佐劑系統（Ribi Inc·)、明礬、氫氧化鋁凝膠、膽固醇、水包油乳狀液、油包水乳狀液，例如： Freund’s完全的以及不完全的佐劑、嵌段共聚物（ CytRx，Atlanta GA) 、SAF — M ( Chiron，Emeryville CA )、AMPHIGEN ® 佐劑、皂素、Qui 1 A、Q S — 21 ( -18- 0100 ( 1272105 (16)

Cambridge Biotech Inc.? Cambridge MA ) ' GPI-

Galenica Pharmaceuticals, Inc.? Birmingham, AL) 皂素分層、單磷醯基脂肪A、阿夫立定脂質-胺佐自大腸桿菌之熱不穩定的腸毒素（重組型或其他）毒素、或胞壁醯二肽，等等。產生免疫性的組成物步的包含一種或多種其它免疫調節劑，例如：介白擾素、或其它細胞激動素。產生免疫性的組成物亦慶大黴素以及硫柳汞。本發明中佐劑以及添加劑之濃度能立即由熟悉此技藝之專業人士測定，本發明包含約50微克至約2000微克之佐劑以及疫苗組成者包含約5 0 0微克/ 2毫升之劑量。另一較佳的具例中，本發明疫苗組成物包含約1微克/毫升至約克/毫升之抗生素，更佳者少於約3 0微克/毫升素。取決於治療路徑，本發明產生免疫性的組成物種不同的形式製造。例如，產生免疫性的組成物可成適用於注射的無菌水溶液或分散液的形式，或使乾燥技藝製造成冷凍乾燥的形式。冷凍乾燥的產生的組成物一般是維持在約4 °C，以及可重新調配於液，例如生理食鹽水或以及Η E P E S，含或不含佐劑本發明產生免疫性的組成物可投用於動物病患免疫反應對抗第1型或第2型BVD病毒，或對抗: 以及第2型BVD病毒。據此，本發明另一具體實供刺激免疫反應對抗第1型或第2型BVD病毒、或其它劑、來、霍亂能進一素、干能包含用量及組成物物較佳體實施 60微之抗生可用各以製造用冷凍免疫性安定溶〇以誘發第1型施例提 —Ρ- iU4_L J— 或H f几 -19- 1272105 (17) 第1型以及第2型BVD病毒組合之方法，其係對動物投用有效量之上速本發明之產生免疫性的組成物。、、動物患者〃意指包含任何易受B V D V感染之動物，例如：牛、羊及豬。依據本發明方法，用於治療動物的較佳產生免疫性的組成物包括BVDV cp53637病毒及/或BVDV cp5960病毒。內含BVDV病毒之產生免疫性的組成物，較佳者係經化學品去活化或連續的生長培養衰減，較佳者係經由肌肉內的或皮下路徑投用至牛隻，雖然其它路徑亦可利用，例如：經口的、鼻腔內的、淋巴結內的、皮膚內的、腹腔內的、直腸的或陰道的投用路徑，或組合之路徑。免疫準則可使用技藝上已知的方法最佳化。可對動物投用單一劑量，或在二至十週之投藥間隔內進行兩種或多種防疫注射。取決於動物年齢，可再投用產生免疫性的或疫苗組成物。例如，本發明打算對健康的牛隻在年齡六個月之前進行疫苗接種，以及在年齢六個月進行疫苗再接種。另一實施例中，本發明打算對生育前之牛隻在生育前約 5週進行疫苗接種以及在生育前約2週再一次進行疫苗接種以保護胎兒對抗第1以及2型BVDV引起的感染。組合疫苗單一劑量之半年的疫苗再接種亦可考慮用以預防胎兒感染BVDV。誘發牛隻免疫反應之程度以及本質可用各種技藝評估。例如可從接種動物收集血淸以及測試專一性抗BVDV病毒之抗體是否存在，例如用習見的病毒中和反應分析。 •20- 1272105 (18) 本文術語之 ''牛隻〃意指牛科動物，包括（但非限於 ):閹牛、公牛、母牛、及小牛。本文之牛隻意指妊娠以及泌乳的牛。較佳者，本發明方法係施用於非人類之哺乳動物；較佳者是泌乳的或妊娠母牛以及其胎兒。本文術語之 ''有效治療量之〃或 ''有效量〃意指組合疫苗充分的引起被投用動物免疫反應之量。免疫反應可包含（而未限制）：誘發細胞及/或體液免疫。疫苗治療上的有效用量取決於利用的特定病毒、牛隻症狀及/或感染之程度而變化，以及可由獸醫師測定。去活性（部分或全部細胞）及經修飾之活疫苗本發明方法.使用之去活性或經修飾之活疫.苗能使用各種技藝上已知的方法製備。例如，可使用已知技藝直接從已感染的母牛子宮得到 BVDV分離株。 BVDV的分離株可使用各種已知方法去活性，例如用雙體性乙烯亞胺（BEI )處理菌株，描述於美國專利第 5，5 6 5，2 0 5號，或用例如福馬林、戊二醛、加熱、β p l、或技藝上習知的去活化劑去活化。除了去活性病毒分離株之外，疫苗產物亦可包括適量的一種或多種常用的佐劑。適當的佐劑包括（但非限於） :無機的凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質，例如溶血卵磷脂·’糖苷，例如皂素衍生物例如Quil Α或GPI0 100 ;聚醣醛酸多元醇；多元陰離子；非離子性嵌段聚合物， -21 - 1272105 (19)

例如 Pluronic F — 127 ( B.A.S.F·，USA );肽類；礦物油 ’"[列如 Montanide ISA — 50 ( Seppic, Paris, France )、 C a r b ο p o 1、A m p h i g e n、Amphigen Mark II ( Hydro nics, USA) 、Alhydrogel、油乳狀液，例如礦物油乳化物，例如BayolF/Arlacel A以及水，或植物油乳化物、水以及乳化物例如卵磷脂；明礬；牛細胞激動素；膽固醇；以及佐劑結合物。較佳的具體實施例中，皂素內含水包油乳化物是習見的微型流化體。應用於本發明疫苗以及方法中第1型BVDV尤佳的來源是 PregSure ® (PFIZER INC·)，其中內含 BVDV 品系 5960 (得自 National Animal Disease Center ( NADC), USD A，Ames，ΙΑ )。應用於本發明疫苗以及方法中第2型 BVDV 尤佳的來源是 PregSure ® ( PFIZER INC·)，其中內含 BVDV 品系 5 3 6 3 7 ( ATCC PTA - 4 8 5 9 )，得自 University of Guelph，Guelph, Ontario o

較佳者，品系5 96 0以及5 3 63 7係用BEI去活化並用市售之佐劑調製，較佳之佐劑爲 Q u i 1 A —膽固醇_ Amphigen ( Hydronics, USA)。本發明產生免疫性的以及疫苗組成物較佳的劑量約2 · 0毫升。本發明方法以及組成物中可包含防腐劑。本發明考慮包含之防腐劑爲慶大黴素以及硫柳永。亦可添加載體，較佳者爲P B S。製備經修飾之活疫苗，例如經一系列培養以使菌株毒性衰減則爲已知的技藝。去活性BVDV分離株也能合倂下列之細菌及病毒，包 - 22- 1272105 (20) 括（但非限於）：第1型牛皰疹病毒（Β Η V — 1 )、牛呼吸融合病毒（B R S V )、副流行性感冒病毒（Ρ 1 3 )、胎兒彎曲桿菌、犬鉤端螺旋體、流感傷寒型鉤端螺旋體、鉤端螺旋體屬（Leptospii. a borgpetersenii hardjo - prajitno) 、黃疽出血型鉤端螺旋體、鉤端螺旋體屬（Leptospira borgpetersenii hardjo — bovis)以及波摩那問號狀夠朗螺旋體。劑量及投藥模式效量之組合疫苗，包括妊，以提供有效的免疫對抗 I型以及2 )相關的胎兒 3至4週的時間區段內對例如，在動物年齡約1至第一次投用之後約1至約

物育種前約5週進行第一行第二次投用。後續投用完成。另一較佳的具體實前接種，在年齡6個月之，較佳者是在一年內完成依據本發明，對牛隻投用有娠母牛以及哺乳小牛之妊娠母牛疾病以及牛病毒性下痢病毒（第感染。具體實施例之一中，在約小牛投用二個劑量之組合疫苗。約3個月時進行第一次投用。在 4週進行第二次投用。較佳的具體實施例中，在動次投用。在動物育種前約2週進的疫苗劑量，較佳者是在一年內施例中，動物在年齡約6個月之後再接種。後續投用的疫苗劑量組合疫苗的有效量取決於疫苗之成分以及投用療程。典型地，當疫苗中使用去活性牛病毒性下痢病毒製劑時， -23- 1272105 (21) 每劑量的B V D V疫苗內含約1 〇 3至約1 〇 113菌落形成單位，以及較佳者每劑量的BVDV (第1以及2型）疫苗約105 至約1 08菌落形成單位，在約3至4週期間投用至動物兩次的情況下是有效的劑量。在約3至4週期間投用至動物兩次的情況下，較佳者提供有效免疫的組合疫苗中每劑量的BVDV (第1以及2型）含有約1〇5至1〇8菌落形成單位以及更佳者每劑量約1 〇6菌落形成單位。在動物育種前約5週進行第一次投用。在動物育種前約2週進行第二次投用。後續投用的疫苗劑量，較佳者是在一年內完成。動物在年齢約6個月之前接種，在年齢6個月之後再接種。後續投用的疫苗劑量，較佳者是在一年內完成。依據本發明，當投用較佳的產物 PregSure ® 5(

Pfizer, Inc.)時，較佳者投用PregSure ® 5兩次，每次之用量約〇 . 5毫升至約5.0毫升，較佳者約1 . 5毫升至約 2.5毫升，以及更佳者約 2毫升。當投用較佳的產物 PregSure ® 5 — L5 或 PregSure ® 5— VL5 時’較佳者投用 PregSure ⑧ 5— L5 或 PregSure ® 5— VL5 兩次，每次之用量約〇. 5毫升至約1 0.0毫升，較佳者約3毫升至約7毫升，以及更佳者約5毫升。在動物育種前約5週進行第一次投用。在動物育種前約2週進行第二次投用。後續投用的疫苗劑量，較佳者是在一年內完成。動物在年齡約6個月之前接種，在年齡6個月之後再接種。後續投用的疫苗劑量，較佳者是在一年內完成。依據本發明，投藥可經習知的路徑達成，包括：口服 -24- 1272105 (22) 、鼻腔內、黏膜塗覆、經皮、以及非經腸（例如：靜脈內、腹腔內、皮膚內·、皮下或肌肉內）路徑。較佳投藥路徑是皮下或肌肉內投·藥。本發明亦爲單一劑量於一週年再接種一次的疫苗接種法’所以不需要爲了產生及/或維持免疫力對抗感染而對小牛在一週年的再接種前投用額外的劑量。依據本發明投用之組合疫苗能包含額外的成份，例如佐劑（例如無機的凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質，例如膽固醇、溶血卵磷脂；糖苷，例如皂素衍生物，例如 Quil A、QS— 21或GPI— 0】00;聚醣酵酸多元醇；多元陰離子；非離子性嵌段聚合物，例如聚醣醛酸F - 1 27 ; 類；礦物油，例如 Montanide · ISA - 50、carbopol、 Amphigen、Alhydrogel、油乳狀液，例如乳化之礦物油，例如BayolF/Arlacel A以及水、或乳化之植物油、水以及乳化物例如卵磷脂；明礬；牛細胞激動素；以及佐劑結合物）。依據本發明，對年齡大約3個月大的牛隻投用有效量之組合疫苗可提供有效的免疫對抗呼吸感染以及繁殖的疾病、以及降低流產。本發明也提供免疫牛隻包括（但非限於）母牛、小牛、以及育齡前之小牝牛對抗BVDV (第1以及2型）引起的感染、歸因於IBR'BVDV (第1以及2型）、P13、 B R S V 1、彎桿菌病之呼吸道疾病以及鉤端螺旋體病的方法，該方法包含對動物投用至少一個劑量’以及較佳者二個 -25- 1272105 (23) 劑量之組合疫苗，以對動物進行免疫對抗BVD ( 1以及2 型）、IBR、P13、BRSV、犬鉤端螺旋體、流感傷寒型鉤端螺旋體、鉤端螺旋體屬（Leptospira borgpetersenii hardio— prajitno)、黃疽出血型鉤端螺旋體、波摩那問號狀飽端螺旋體、鉤端螺旋體屬（L e p t 〇 s p i r a b ο 1· g p e t e r s e n i i hardjobovis)、鉤端螺旋體屬（Leptospira bratislava)、及胎兒彎曲桿菌引起的感染。較佳的具體實施例係於皮下投用疫苗。另一較佳的具體實施例係於肌肉內投用疫苗。此外，較佳者疫苗劑量包含約2毫升至約7毫升，以及較佳者約5毫升，每毫升內含約1 〇3至約1 0 1 G菌落形成單位/每劑量之病毒。另一較佳的具體實施例中V疫苗包含約2毫升v每毫升內含約 1〇3至約101G菌落形成單位/劑量之病毒。組合疫苗最好投用至動物兩次；一次在約年齡1至約3個月，一次則在約1至4週後。本發明也亦考慮以單一劑量疫苗於半年內再接種以及在生育之前再接種疫苗。 #發明也提供保護牛胎兒免於胎兒感染和持續性的胎兒感染之方法，其包含對動物投用至少一個劑量，以及較佳者二個劑量之組合疫苗以免疫胎兒對抗BVD (第1以及2型）、：iBR、P13、BRSV、犬鉤端螺旋體、流感傷寒型鉤纟而螺旋體、夠端螺旋體屬（L e p t 〇 s p i r a b ο 1· g p e t e r s e n i i har*dic^pi»ajitno )、黃疽出血型鉤端螺旋體、波摩那問號狀飽端螺旋體、鉤端螺.旋體屬（L e p t 〇 s p i r a b ο 1· g p e t e r s e n i i hardjo-bovis)、飽端螺旋體屬（Leptospira bratislava) -26- 1272105 (24) 、及胎兒彎曲桿菌引起的感染。組合疫苗對動物投用兩次 ’〜次在生育之前約五週，而另一次則在生育之前約二週〇本發明亦對動物，較佳者牛隻投用有效量之組合疫苗以治療或預防該動物包括持續性的胎兒感染之病症以及生產的病症，例如流產。本發明用下列實施例進一步說明（但非限制）。實施例1 材料以及方法動物-五十六隻BVDV血淸陰性（即其具有之血淸中和反應[SN ]値效價< 1 : 2 .)適於生育之母牛係得自多種來源，在硏究期間維持於硏究的分離設備。每隻動物用雙重複的耳標籤加以確認’每耳一個標籤。若動物遺失耳標籤則重新裝上新的標籤。在硏究之前，將測驗動物接種商品疫苗以進行鉤端旋體病、彎桿菌病（弧菌病）、以及梭狀芽胞桿菌之感染。測驗動物是維持在獸醫的監視下，獸醫每天臨床的監測測驗動物。測g式疫苗-測試疫苗是多價的、經修飾之活的牛傳染性鼻m管炎（I B R )—副流行性感冒3 ( P 1 3 )—呼吸道合包病毒（RSV )疫苗之乾燥形式，用去活性、合倂佐劑之液體 BVDV 疫苗再水合（Pflzer Inc, New Y〇rk，Νγ )。將內a取小重BVDV— 1和—2免疫劑量之.BVDV成分與無园的佐劑合倂。計算疫苗製劑大流體8重複滴定之幾何 -27- 1272105 (26)

Dubo vi EJ· Vet Pailiol 1992;29: 27 - 32)。從母牛頸靜脈放出5 - 1 0毫升全血樣品並置於內含肝素之試管以製備進行病毒分離之血塊黃層細胞。在局部的麻醉下以左邊一鄰接的剖Μ手術收集羊水以及從子宮抽吸3 - 5毫升樣本〇剖腹生產或自然流產後，無菌下地從胎兒收集眼、脾、胸腺、以及3個腦切片（腦幹/中腦、大腦、及小腦）。嘗試從均質化胎兒組織上淸液之細胞培養中分離病毒。爲了進行免疫組織化學評估，將胎兒組織包埋在石蠟中以及使用內含抗—BVDV單株抗體之腹水的1 : 8 00以及1 : 600稀釋液進行雙重複測試。生物辨識數據分析-接種組（Τ2以及·:Τ3 )相對於這安慰劑對照組（Τ1 )，母親及胎兒第2型BVDV感染發生率在統計上顯著減少，顯示攻擊後之保護作用。使用 Fisher氏精確的測驗比較（1 )攻擊後前14天母牛病毒血症之發生率、（2)分離自羊水之BVDV、（3 )自然流產或剖腹生產後從胎兒組織和胎兒血分離之 BVDV、以及（4 ) BVDV陽性之胎兒組織免疫組織化學。使用混合的線性模型和重覆計量分析血淸中和反應値效價。使用變方分析之最小平方法，計算幾何平均値效價（ GMT )，其中排除未受攻擊母牛的S N資料。使用或然率値P S 0.0 5測定統計顯著性。

胎兒保護硏究- 5 6隻待測母牛隨機分配到三個測驗組，IM安慰劑組（Tl ) 、IM疫苗接種組（T2 )、及SC -29- 1272105 (27) 疫苗接種組（T 3 )，如表1所示。母牛在硏究之〇天以及 2 1天接種疫苗或安慰劑。所有的案例中’第0天之防疫注射是投用在頸部左邊，以及第2 1天之防疫注射是投用在頸部右邊。第1天，母牛是給予預扮美侖孕酮乙酸鹽的飼養爲期 1 4天。第3 2天，對所有的母牛進行IΜ前列腺素注射（

Lutalyse，Pharmacia & Upjohn，Kalamazoo，ΜΙ)以同步化動情期。對顯示動情期的母牛用BVDV -陰性精液進行人工授精。在第100天，大約是受孕65天’用直腸的觸診測定母牛懷孕的情況。第1 〇5天，各測驗組隨機選出2 3 隻証實懷孕的母牛（控制組7隻、IM接種組8隻、以及 SC接種組 8隻），重新安置於附近的隔離設‘施，（ Midwest Veter inary Services, Oakland, NE)以及混和群居。第1 1 9天，將這2 3隻待測母牛從鼻腔內注射致病的 BVDV。注射當天以及在8 PC投藥間隔收集血液樣本，.第 119、 121、 123、 125、 127、 129、 133、 140、及 147 天( PC 日；0、 2、 4、 6、 8、 10、 14、 21、及 28)，以分離 BVDV並進行血淸分析。第天（攻擊之後28天），從每隻母牛左邊鄰接的腹肌取羊水。第297天，大約分娩前7 — 14天，待測母牛被運送至 University 〇f Nebraska， Department 〇f Veterinary and Biomedical Services 進行剖腹生產。外科手術之前’從每隻母牛收集血液樣本進行SN分析。剖腹生產後（第3 0 0 — 3 0 1天），從每隻胎兒收集血液樣本。 -30- (28) 1272105 將胎兒安樂死並驗屍收集組織分離BVDV。在一些案例中發生自然流產，則在流產時從牛欄採取血液’樣本以及在二週後偵測。將駢對的血液樣本進行血淸測試 (University of Nebraska Veterinary Diagnositic Center，Lincoln，NE)以及分離BVDV評估流產胎兒（ Pfizer Central Research, Lincoln，NE)以及評估胎兒組織的組織病理學（Saskatoon Veterinary Biodiagnostics， Saskatoon， SK5 Canada)。結果觀察到投用2個疫苗劑量之間或之後並無副作用。所有的母牛在疫苗接種之前（第.0天）呈第1以及2 型 BVDV血淸陰性，證實測驗動物在硏究開始時是無 BVDV免疫性。第1型BVDV之GMT値展示於表2。16 隻接種動物中有十五隻在投用2疫苗劑量後呈血淸轉換現象。編號6 1的母牛（T3組）第1型BVDV之SN値效價在第〇天<1:2、在第21天爲1:19，以及在第33及 119天<1: 2。第2型BVDV之GMT値展示於表3。所有接種的動物包括母牛6 1，在第二劑量後發生血淸轉換。 (母牛61第2型BVDV之SN値效價在第0天<2，在第天爲1: 19，在第33天爲1:2,048，以及在第119天爲1 : 4 3 1 )。繁殖時（第3 2 - 41天），接種的母牛（母牛61除外）第丨型BVDV之SN値效價介於1 : 64至1 : 1 3，7 7 7。接種的母牛在繁殖時第2型BVDV之値效價介於 1272105 (29) 1 : 64至1 : 6,8 8 9。疫苗接種後，iM ( T2 )相對於SC ( T3 )組之GMT値差異在攻擊前投藥間隔或攻擊後均不具統計顯著性。所有的'安慰劑組母牛（T 1 )均保持第1以及 2型BVDV血淸陰性至攻擊時（第：1 19天），顯示本硏究沒有發生偶發的的暴露。所有的安慰劑組之母牛在攻擊後血淸反應，證實每隻動物均遭受到攻擊。安慰劑組第1型 BVDV之PC - GMT顯著的較低於任一疫苗組達成之免疫記憶反應（表2，第14 7天）。相較於疫苗組，安慰劑組母牛也有較低第2型BVDV的PC— GMT，但是這差異只對IM ( T2 )接種動物具有統計顯著性。將3個測驗組証實妊娠的二十三隻母牛，進行免疫攻擊，並使用羊膜穿刺術採樣（表1 )。在羊膜穿刺術（第 147天）以及剖腹生產（第3 00 — 3 0 1天）之間，有7隻母牛流產，4隻是T2組以及3隻是T3組。此外，3隻繁殖的母牛（T1安慰劑組1隻母牛以及T3組2隻母牛）在剖腹生產時發現並未懷孕。此3隻母牛是在第1 0 0天（大約繁殖之後第6 5天）經直腸的觸診証實懷孕，顯示發生後續的未偵測的流產或胎兒再吸收。因爲無法拿到這3隻母牛的胎兒組織進行評估，所以從硏究中移除此類動物。第2 5 9天，T 1安慰劑組編號67之母牛死亡，所以移除它的胎兒不進行BVDV分離。因此，在硏究之結論中，23 隻母牛只有1 2隻被攻擊的母牛進行剖腹生產。對這1 2隻源自剖腹生產的胎兒加上7隻流產胎兒以及死亡母牛的胎兒（共2 0隻）進行B V D V分離評估。 -32- 1272105 (30) 第156天將T2組的38號母牛流產的第123天，以及攻擊之後第37天）。並淸樣品，但是第3 8號母牛在用從外周血 BVDV攻擊後呈現陰性。胎兒嚴重地自體織病理學的以及細菌學的評估揭露絨毛膜締組織的化膿炎症。從肺、肝、及胸腔葡萄球菌。Β V D V分離以及免疫組織化學顯示胎兒不是因攻擊而感染致死。三隻Τ3母牛（編號21、27、及40 ) 第159天流產（懷孕第1 25 — 1 27天， 3 9或40天）。因爲沒有觀察到流產，所屬於那一隻母牛。他們被稱爲未1:知的胎兒知的胎兒1是木乃尹化，具有組織學上典損害。未知的胎兒2是自體溶解，具有多以及壞死性胎盤炎以及大量細菌球菌與發合物。從肺、腎、肝、胃含物以及胎盤的萄球菌。未知的胎兒3是消痩化及自體溶腎、及胃含物分離出葡萄球菌。從這3隻組織得到BVDV分離以及免疫組織化學陰 3隻母牛分離的外周血顯示攻擊後BVDV 牛21以及40之羊水同樣是BVDV陰性：羊水樣本是BVDV陽性。未評估母牛駢對第160天T2組45號母牛的胎兒流產，以及攻擊之後第41天）。硏究結果淸它的胎兒（懷孕未評估駢對的血以及羊水分離之溶解。胎兒經組以及次絨毛膜結的流體分離出豬得到陰性結果，在第158天或在以及攻擊之後第以不知道胎兒是 1、2 或 3。未型的新包蟲症之重病灶的化膿的炎性滲出液的混組織分離出豬葡解。從肺、肝、未知胎兒的所有性結果。所有的陰性。分離自母但是母牛2 7的的血淸樣品。 (懷孕第1 2 8天楚的顯示廣泛的 -33- 1272105 (31) 胎兒自溶現象。從肺、肝、腎、胃含物、及胎盤分萄球菌。呈現具有多病灶血栓形成的胎盤炎以及化管炎。胸腔流體血淸測定是IBR、牛病毒的下痢（、及鉤端旋體病陰性。所有的胎兒組織得到BVDV 免疫組織化學陰性結果。第1 9 5天T 2組6 6號母牛的胎兒流產（懷孕第，以及攻擊之後第7 6天）。從胎兒表面延伸到胎層觀察到明顯的化膿性炎症。從胃含物以及胎盤培腸桿菌以及普通變形菌。駢對的血淸樣品以及胸腔血淸檢驗結果顯示病原學不是IBR、BVD、或鉤端。所有的胎兒組織得到BVDV分離及免疫組織化學果。 ‘ 第2 9 5天將T2組的3 1號母牛流產的它的胎兒第2 6 2天，以及攻擊之後第1 7 6天）。組織病理學揭露滲開壞死化膿的胎盤炎、絨毛膜上皮壞死、以的嗜中性白血球炎症。從這發炎性的病灶培養出革性的球桿菌和棒桿菌。駢對的血淸學檢驗結果顯示不是IB R、B V D、或鉤端旋體病。所有的胎兒組丨 BVDV分離及免疫組織化學陰性結果。得自硏究結束前即列亡之T 1安慰劑組母牛67 外周血樣品以及羊水呈BVDV分離陽性。此母牛的兒組織呈BVDV分離以及免疫組織化學陽性。從1 2隻剖腹胎兒收集的血液樣本測定第1以;; BVDV之SN値效價。從5隻安慰劑組母牛或7隻離出葡膿性脈 B V D ) 分離及 160天盤固有養出大的流體旋體病陰性結 (懷孕的檢查及強烈蘭氏陰病原學織得到之PC 所有胎泛2型接種組 -34- 1272105 (32) 之剖腹胎兒中，沒有一隻呈現第1或2型BVDV血淸陽性

攻擊後病毒分離之結果展示於表4。所有的7隻T 1 安慰劑組母牛均有B V D V病毒血症，証實血淸結果顯示各非接種的動物發活性的攻擊。所有1 6隻T2以及T3接種組（各8隻）攻擊後樣品之血液樣本呈BVDV病毒血症陰性。T2及T3接種組PC病毒血症比率相對於控制的差異是有統計顯著性（0.000 1 )。 1 6隻接種組中有 2隻（百分之12 · 5 )的羊水是 BVDV陽性，相對於7隻安慰劑組母牛中有7隻（百分之 1〇〇 )陽性結，有顯著的統計差異（PS 0.000 1 ) 。T3接種組中編號27以及60之羊水樣品是陽性。母牛27的胎兒病毒分離以及免疫組織化學方法分析呈BVDV-陰性。

1 4隻接種中有1隻的胎兒組織（百分之7. 1 )，T3 母牛60，是呈BVDV分離陽性。相較於6隻T1安慰劑組母牛胎兒中有6隻（百分之100)分離出BVDV，有統計上顯著的差異（P < 0.00 0 1 )。評估各胎兒組織分離 BVDV之結果均爲陽性或陰性。 Μ隻T2以及T3接種組之中有1隻（百分之7.1 )胎兒組織免疫組織化學結果呈BVDV陽性爲（Τ3母牛60) 。6隻T1安慰劑組母牛中有6隻（百分之1 00 )的胎兒組織呈BVDV -免疫組織化學陽性，顯著的高於接種組之發生率（PS 0.000 1 )。各胎兒組織BVDV免疫組織化學評估之結果均爲陽性或陰性。 -35- 1272105 (33) 表5意指病毒分離來源以及2隻具有BVDV分離陽性的接種母牛之前攻擊SN値效價。血淸資料顯为接種組之’27以及60對疫苗接種有免疫地反應。母z 之第2型BVDV之SN値效價在攻擊時低於T3組之，但是此差異不顯著。肌肉內的以及SC疫苗接種總共提供百分之92.9 對抗胎兒BVDV— 2傳染，14隻接種的母牛中有13 胎兒組織呈BVDV分離結果陰性（表4 )。此相當早同疫苗對抗胎兒BVDV- 1攻擊（參見實施例 2)百 88.9之保護（18隻接種組中有16隻是BVDV —分離 )。此二硏究中，百分之1 0 0胎兒感染發生於非接種慰劑組母牛，証實接種暴露至嚴重的免.疫攻擊。從2隻接種母牛27以及60的羊水中分離出攻擊 (表5 )。結果，此二隻母牛被認定是BVDV感染陽即使他們在各8個P C投藥間隔均呈病毒血症陰性。毒分離、高專一性和敏感性之免疫組織化學方法中並測到母牛 2 7流產胎兒中有 B V D V，因此列爲 B V D V 性。胎兒流產可能是由於母牛之BVDV感染過程所造, 爲了確證結果，使用二種方法評估母牛（病毒血及從羊水分離病毒）及其胎兒（免疫組織化學以及從培養分離病毒）之保護。使用最保守的結果測定保護。因此，接種母牛的保護比率爲百分之8 7.5 ( 1 6隻 14隻），由母牛羊水分離出之病毒爲陰性之百分比不疋百分之100 (母牛病毒血症-陰性之百分比）。結果》T3 戸27 GMT 功效隻的期相分之陰性的安病毒性，在病未偵一陰成。症以組織比率中有，而目前 -36- 1272105 (34) 尙未有B V D V攻擊-免疫硏究結果可使接種對抗攻擊（對未接種的控制組產生百分之1 00的胎兒感染）產生百分之 1 00的胎兒保護。即使是經·修飾之活病毒（MLV )疫苗（不常用於評估妊娠母牛）在一個對抗胎兒BVDV - 1之感染保護試驗中也不超過百分之83。（ Cortese VS，Grooms， DL，Ellis J，et al ( 1 998 ) Am J Vet Res. 59： 1 409 - 1413.

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Hi II 09 LZ ei rnl ei κ®^πνκίΒ1;}^Μ}^1^δ&ίΗ12ο:ΙΨ^«5§ίρκ1:3^φτυΗΙ:ϋ^^^πτυ:«#-"^Εν -42- 1272105 (42) 生物辨識數據分析-接種組（τ 2以及τ 3 )相對於這安慰劑對照組（τ 1 )，母親及胎兒感染發生率在統計上顯著減少，顯示攻擊後之保護作用。使用Fisher’s精確測驗比較母牛病毒血症之發生率以及從羊水、胎兒組織分離 BVDV，以及胎兒組織之免疫組織化學。使用混合的線性模型和重覆計量分析血淸中和反應値效價。使用變方分析之最小平方法，計算幾何平均値效價（GMT )，其中排除未受攻擊母牛的S N資料。胎兒保護硏究- 5 9隻測驗動物隨機分配到三個測驗組，IM安慰劑組（Τ1 ) 、IM疫苗接種組（T2 )、及SC疫苗接種組（T3 )，如表6所示。母牛在硏究之0天以及2 1天接種疫苗或安慰劑。所有的案例中，第〇天之防疫注射是投用在頸部左邊，以及第2 1 天之防疫注射是投用在頸部右邊。第 3 2天，對所有的母牛進行IM前列腺素注射（ Lutalyse，Pharmacia & Upjohn，Kalamazoo, MI)以同步化動情期。對顯示動情期的母牛用BVDV -陰性精液進行人工授精。在第96天，大約是受孕60天，以直腸觸診測定母牛懷孕的情況。第1 〇3天，將隨機選自每個測驗組証實懷孕的10隻母牛，重新安置於隔離設施附近（Midwest Veterinary Services，Oakland，NE)。第 117 天，將這 30 隻母牛從鼻腔內注射致病的BVDV。在攻擊當天收集血液樣本，以及在8個後攻擊投藥間，於第1 1 9、1 2 1、1 23、 125、127、131、138、及 145 天分離 BVDV。於第1 4 5天（攻擊之後2 8天），從每隻母牛左邊鄰 -45- 1272105 (43) 接的腹肌取羊水。於第29 5天，大約分娩前7 - 1 4天，待測母牛被運送至 University of Nebraska，Department 〇f V e t e r i n a r y a n d B i o m e· d i c a 1 S e r v i c e s 進行剖腹生產。外科手術之前，從每隻母牛收集血液樣本進行SN分析。剖腹生產後（第2 9 8 - 3 0 0天），從每隻胎兒收集血液樣本。將胎兒安樂死並驗屍收集組織分離BVDV °

若發生自然流產，則在流產時從牛欄採取血液樣本以及在二週後偵測。駢對的血液樣本以及流產胎兒之血液樣本進行血淸測試（University of Nebraska Veterinary D i a g η o s i t i c C e n t e r，L i η c ο 1 η，N E )從胎兒組織分灕病毒， (Pfizer Central Research, Lincoln，NE)以及評估胎兒組織的組織病理學。（S a s k a t ο ο η V e t e ι· i li a r y B i o d i a g η o s t i c s， Saskatoon，SK， Canada。結果

用於胎兒保護測驗的3 0隻母牛之個別SN値在第0 天時是第1以及2型B V D V陰性，證實此類測驗動物在硏究開始對BVDV攻擊是無免疫性。GMT値（表7以及8 ) 指出IM ( T 2組）以及S C ( T 3組）疫苗接種於二個劑量處理後均引起血淸反應。所有Τ 2以及Τ 3組的母牛投用第二次疫苗後血淸轉換（SN値效價: 8 )至第〗型 BVDV以及第2型BVDV。繁殖時（第34一 37天），第！型BVDV之SN値效價範圍爲1: 27至1: 2,900，第2型 BVDV之値效價範圍爲1: 609至1: 13,777。 -46- 1272105 (44) 疫苗接種之後，於各攻擊間隔S C組之GMT値相對於IM組呈小幅上揚，但是這差異不具統計顯著性。攻擊之後二十八天（第14 5天），S C接種組（T 3組）相對於 IM ( T2 )組第1型BVDV之GMT値（表7 )顯示統計顯著的差異。所有的安慰劑組母牛（T1 )均保持第1以及2型 BVDV血淸陰性至攻擊時（第1 17天），顯示本硏究沒有發生偶發的暴露。安慰劑組母牛之血淸可反應攻擊，但是第145天對第1以及2型BVDV反應之GMT顯著低於任一疫苗組之免疫記憶反應（表7以及8 )。在羊膜穿刺術（第145天）以及剖腹生產（第298 -3 00天）之間，有2隻母牛流產，1隻是T1組以及另一隻是T3組。此外，4隻繁殖的母牛（T1安慰劑組2隻母牛以及T3及T3組各1隻母牛）在剖腹生產時發現並未懷孕。此4隻母牛是在第9 6天（大約繁殖之後第6 0天）經直腸的觸診証實懷孕，顯示發生未偵測到的流產或胎兒再吸收。因爲無法拿到這4隻母牛的胎兒組織進行評估，所以從硏究中移除此類動物。因此，在硏究之結論中，3 0 隻母牛中有24隻攻擊的母牛進行剖腹生產，以及總共26 隻剖腹生產或流產的胎兒進行分離BVDV之評估（表6 ) 〇 τ 1組的1 3 1 7號母牛的胎兒在第2 3 8天流產（懷孕第 201天，以及攻擊之後第121天）。胎兒組織病理學的以及細菌學的評估揭露肺炎、絨毛膜的上皮壞死、以及從胃 -47- 1272105 (45) 以及胎盤分離出棒狀桿菌屬。從這母牛的駢對血淸樣品不支持IBR、BVD、或鉤端旋體病是這流產的病原學。在攻擊之後6、8、及10天收集週邊母牛血；羊水；以及胎兒腦、眼、及胸腺，但不是脾，其細胞培養BVDV分離呈陽性。胎兒腦、眼、胸腺、以及脾之BVDV免疫組織化學呈陽性。病在此案例中毒分離以及血淸證據顯示母牛攻擊之後經歷病毒血症是感染BVDV的胎兒是流產主因。 T3疫苗組的1331號母牛的胎兒在第249天流產（懷孕第2 1 2天，以及攻擊之後第1 3 2天）。胎兒的組織病理學以及細菌學評估揭露是患有滲開化膿的肺炎。由胃含物以及肺臟培養顯示有大腸桿菌群細菌大量生長。從這母牛的駢對血淸樣品不支持IB R、B VD、或鉤端旋體病是這流產的病原學。後攻擊投藥間隔收集的所有9隻母牛外周血、羊水、以及胎兒腦、眼、脾以及胸腺於細胞培養後 BVDV分離呈陰性。胎兒組織之免疫組織化學結果呈陰性。然而，集中的胎兒組織細胞培養之BVDV分離呈陽性。這種矛盾結果暗示胎兒組織可能因與含有BVD攻擊病毒之牧草種子的接觸而污染或在之前分離BVDV的屍體剖檢設備受到媒介物之污染。母牛沒有產生後攻擊病毒血症，陽性血淸轉變狀況、及胎兒器官陰性BVDV分離結果支持胎兒不是因爲攻擊而感染BVDV的結論。測定各剖腹胎兒收集的血液樣本第1以及2型BVDV之SN値效價。源自 T 1安慰劑組母牛剖腹生產之7隻胎兒中，沒有一隻呈第1 或2型BVDV血淸陽性。17隻源自T2以及T3接種組母 -48 - (46) 1272105 牛剖腹生產之胎兒中有五隻呈第1型BVDV血淸陽性。四隻胎兒的第1型SN値效價是1 : 2或1 : 4，T2母牛1421 之胎兒的第I型SN値效價是ί : 1 8 1，第2型SN値效價是 1 : 5 12。

攻擊後病毒分離之結果展示於表9。1 0隻Τ 1安慰劑組母牛中有九隻經歷BVDV病毒血症，顯示發生活性的攻擊。20隻Τ2以及Τ3接種組中有1 9隻各8個攻擊後樣品之血液樣本呈BVDV病毒血症陰性。第123天（攻擊之後 6天）Τ2接種組1421呈BVDV陽性，以及產下的胎兒呈血淸陽性，但是病毒-分離呈陰性。Τ2以及Τ3接種組中有百分之5的後攻擊BVDV病毒血症發生率是顯著的少於控制的百分之9 0 ( P《0 · 0 0 0 1 )。 1 8隻接種中有2隻的胎兒組織（百分之11 .1 ) ，T2

母牛1301及1335，是呈BVDV分離陽性。相較於8隻 Τ1安慰劑組母牛胎兒中有8隻（百分之1 〇〇 )分離出 B V D V，有統計上顯著的差異（p < 0 · 0 0 0 1 )。評估所有胎兒組織的BVDV分離結果呈BVDV -陽性或一陰性，只有 Τ 1母牛1 3 - 1 7例外，4隻胎兒組織樣品中有3個呈陽性 20隻接種組中有2隻（百分之10)的羊水是BVDV 陽性，相對於1 〇隻安慰劑組母牛中有1 〇隻（百分之1 〇〇 )陽性結，有顯著的統計差異（P1 〇 · 〇〇〇 1 ) 。T 2接種組中編號1 3 0 1以及1 3 3 5之羊水樣品是陽性。 1 8隻接種中有2隻的胎兒組織（百分之〗丨·〗），T2 -49 - 1272105 (49) ^$0 侧^IMg。盔水蚱廳 Α·ΜΒίι^φφ(ΙΚ6ΙΙ 濉) (Η<ι<Ν, 〇搬) rail >QS1 (寸)sδω 剧顿 9 (寸$1) Ο 81 寸 τ e ο 0<Νos)_i^ρ 001 (Μ)細¾ρ (HI)

蚱鹽、η<ο9 Μ胡餵縧踅¥，^96搬相«跽驭^©^盔水釙親蚺麽^ 。(^啦£1)^6寸2搬赵7:1(导啭11)9<8口搬5:胡餾侧惩巾 S ·_^Η-^=υ8 : S®S^M ®gHWI 鬌 -52- 1272105 (50) 變吆SS5启(ΛαΛω)雜遯蔟H-起、»遯乐到1濉蔬^啦^鏘钐>0>3到1濉— L^ 在選擇的測驗投藥間隔交互的第1型BVDV血淸中和(SN)幾何平均値效價剖腹生產 (第 298-300 天） 808.2(n=9)d 2,233.2b(n=10) 3,804.6b(n=9)e 2,914.9b(n=19) 羊膜穿刺術 (第145天） 118.0 10,380.lb 20,169.2bjC 14,469.2b 攻擊 (第1Π天） <2 177.4b 281.2b 223.3b 繁殖 (第 34-37 第） <2 414.lb 630.2b 510.8b 疫苗接種 (第21天） <2 5.5b 7.3b 6.3b 疫苗接種 (第〇天） (N <N <N (N V V V V S m ^ U •B罢懲S 鏃 ― 0/10 10/10 10/10 20/20 處理組 Tl(n=10) T2(n=10) T3(n=10) T2 & T3(n=20) 。9 寸寸 ο · o i ~ U 一 )瑝細徵 m · s Λ1:κ-δ_ 鼷。eooovldl ( II ) Κ二歡 tl 揪·SAEEifs _鼷+_ 握-G8AIK}^M}NS, 。侧MH<617(N搬 5： φφ*— 。侧嫔Η<6寸(Ν搬相迕a-测丨

-53- 1272105 (51)

_l^ste启(AaAPQ)撇iE輟κ-劫讎遯分到 Ι^Μ^-φδ»^ΛαΛ3_(Ν^— 8 撇擊 i 剖腹生產 (第 298-300 天） 604.9(n=9)d 1,634.9 b(n=10) 1,879.9b(n =9f /^、 a\ y H II ΰ JD r-H m 卜 /^S 00 、^^ 赃 > Q > PQ 副 (N 搬 S 以攤 m 驿職羊膜穿刺術 (第145天） 48.5 3,756.0b 4,240.4b 3,990.9b 攻擊 (第117天） <1.4 174.8b 309.7b 232.7b 繁殖 (第 34-37 第） <1.4 1,782.9b 2,749.6b 2,214.lb 疫苗接種 (第21天） <1.4 x> 17.7b，c 11.6b 疫苗接種 (第〇天） <1.4 <1.4 <1.4 <1.4 赃IQ H<乐 _ 啦 ίϋ s 緘起 0/10 10/10 10/10 20/20 處理組 Tl(n=10) T2(n=10) T3(n=10) /N o (N II c, m H <N H 。8ΛΙΚ}锬碰} N S 。侧_^61^搬抝片啦测丨。。侧fllH<8e<N搬抝分啦«丨 p。ς I 寸 ooi · ((Nl ) If _ 徵 n I · s AIm:lfs_ 驟'+-__。 G<Noo.ovld~(ll)I=fn:tl^“>Elfs_^+__-

-54- 1272105 酿輕 wHKiini φ ( ΛαΛω)獅螺塚Κ-4Η讎遯迕淫赵 ηί^φ^潘钐 I 6 撇後攻擊病毒分離之方法及發生率胎兒組織免疫組織化學b 8/8(100%)c 2/9(22 2%)c，d 〇/9(0%)c，d 2/18(11.l%)d 胎兒組織病毒分離5 8/8(100%)° 2/9(22.2%)c，d 0/9(0%)d 2/18(11.l%)d X) 錄 Φ 練膽體 9/10(90%) 10/10(100%) l/10(10%)d 2/10(20%)d 0/10(0%)d 0/10(0%)d l/20(5%)d 2/20(10%)d 處理組 T1安慰劑(IM) T2疫苗(IM) T3疫苗(SC) T2 &T3 遯罌馨1|«越^^^:鉍0§_«砮歷酲攤靶@}6-9<?寸1濉^(》钐)^卜11派芻。8 ooovld · ( 11 ) 1=緻鋇揪· s >Efflfs.鼷 +_ 瑶 p 。侧Μ面條鼷蚺趔¥蚱_蚺趔鹧餾盤侧胡wflH ~迤躲#{佧保菡皿导啦£1«:赵^21«:井©11«23 。却51>0>3脈职盌「11111<起、11岷纖題底出^。？|5轵盌«婪鹚侧胡鹦蘅舔侧嫔q 。导啦忉個mrw螺mKDgiH、豳ΛαΛω_讲_嫠up底出_。觀Φ#

-55- 1272105 ®s鏘钐珉Ιί ~盤(AaACQ)雜遯懷^#1«遯井田譴负职湼钝锅^©^鯽鹚芻_|01嗽。|5锬1!}(^8)鳄吆显旮赃151迕攻擊時之BVDV血淸型和交互的SN値效價 BVDV2 1—Η 〇〇 r-H 5： (N 174.8 BVDV1 oo (N Η g 1—H cd S 177.4 病毒分離來源 FT，AF JHC FT, AF? IHC > u N/A 母牛數目 1301 1335 1421 GMT組試驗組 CN (N (N :烟·雜遯分啦"Λυί 繼键徵职·键职盌"UHI :«tt-iv ： ·®、ί3κ盌Hldt 15餃ffllJJPi 降難"一 s ο :κ·κ-" v n

-56- 1272105 (54) 實施例 3

二組之16隻牛在3週時間區段內皮下的接種兩次2 毫升之L· hardjo/波摩那型鉤端螺旋體組合疫苗，疫苗係製備自二種佐劑調配物：1 ) 2 · 5 % A m p h i g e η和Q u i 1 A /膽固醇各2 5 0微克/毫升，以及2) Amphigen/Al 一凝膠。疫苗由移除培養液之死鉤端螺旋體組成，所以內毒素含量很低。兩次注射後紀錄體溫、注射處反應、以及一般的健康狀況。無全身影響，只有輕微的局部反應，臨床上是可接受的。對十六額外的牛隻注射生理食鹽水作爲控制組。疫苗接種之後四週，連續3天從眼以及陰道的滴注 5 X 1 〇6鉤端螺旋體攻擊牛隻。一半的處理組用 serovar hardjo攻擊，另一半用波摩那型鉤端螺旋體。因爲不相關的原因從硏究中消除二隻波摩那型鉤端螺旋體控制組牛隻，使該組只剩下6隻動物。每週一次的收集尿液、以及屍體剖檢收集腎臟樣品，攻擊之後8週，以培養、 PCR、以及螢光抗體顯微鏡檢查（FA)進行評估。 L. hardjo攻擊後，從100%未施行過預防接種的控制組（8 / 8 )偵測尿及/或腎培養中活的生物體，任何接種的動物（〇 / 1 6 )均無法得到陽性培養。波摩那型鉤端螺旋體攻擊之後，67% ( 4/ 6 )之未施行過預防接種的控制組在尿/腎培養顯示出感染，但是接種動物中沒有一隻是腎或尿菌種培養陽性（0 / 1 6 )。由於鉤端螺旋體病可經由污染的尿傳染，預防或減低尿道的蛻皮之能力可適用於測量疫苗功效。相較於控制組 -57- 1272105 (55) 兩個疫苗調配物均可降低鉤端螺旋體病引起的統計顯著之尿道蛻皮。此數據顯示疫苗接種含任一佐劑的兩價l. hardjo /波摩那型鉤端螺旋體疫苗調製有實質上的利益；可經接種福馬林一殺死的組合菌苗保護牛隻免於鉤端螺旋體之感染。實施例 4 材料以及方法

動物一 36隻BVDV以及鉤端螺旋體屬血淸陰性（即其具有之血淸中和反應[S N ]値效價< 1 : 2，H ar dj 〇血淸型鉤端螺旋體以及波摩那型夠.端螺旋體之値效價< i : 2 〇 ) 大約7個月、大的小牛係得自多種來源，在硏究期間在 Nebraska維持於分離的硏究設備。每隻動物用雙重複的耳標籤加以確認，每耳一個標籤。若動物遺失耳標籤則重新裝上新的標籤。在硏究之前，將測驗動物接種的對抗梭狀芽胞桿菌屬疾病以及牛呼吸道疾病之藥劑（排除B V D病毒）。測驗動物是維持在獸醫監視下，獸醫每天臨床的監測測驗動物。測試疫苗-實驗的測試疫苗是液體疫苗，內含福馬林去活性L· hardjo— bovis或波摩那型鉤端螺旋體，或兩者 ’以及去活性第1型以及第2型B V D病毒。將B V D V成分合倂無菌的佐劑。計算疫苗製劑大流體8重複滴定之幾何平均値效價’建立B V D V免疫抗原之效能。依據倉鼠致死性模型過程，建立鉤端螺旋體屬免疫抗原之效能。實驗 -58- 1272105 (58) 血液樣本測定第1型以及第2型BVDV値效價。第 1、 56、 70、 77、 84、 9i、 98 以及 105 天，收集每隻動物的尿液樣本（大約45毫升）以說明如上之方法分離鉤端螺旋體屬。第1 1 2以及1 1 3天將動物安樂死，以及評估腎臟是否有上述鉤端螺旋體屬之存在。

結果 GMT値（表12 )指出接受BVDV-鉤端螺旋體組合疫苗（T0 2、T0 3、T04以及T05 )的所有動物在二個疫苗劑量處理後均有血淸反應。T 0 2、T 0 3、T 0 4以及T 0 5組的所有動物在二個第1型BVDV疫苗劑量處理後發生血淸轉換（SN値效價> 1 : 8 ) 。T02、T04以及T05組所有的動

物在二個第2型BVDV疫苗劑量處理後發生血淸轉換（ SN値效價〉1 : 8 )。安慰劑組（TO 1 )或得到一價的L. hardjo- bo vis疫苗之實驗組中所有的母牛均保持血淸第1 以及2型BVDV陰性，顯示此硏究不曾因偶發的暴露危及母牛的安全。總之，BVDV血淸學數據第一次顯示四種不同佐劑調製的包含去活性第1及2型B V D V以及去活性 L· hard job ovis以及波摩那型鉤端螺旋體之組合疫苗能誘發保護的反應對抗牛隻之BVDV疾病，由於母牛之BVDV SN値效價> 1 : 8在技藝上表示產生保護對抗BVDV疾病尿以及腎含鉤端螺旋體屬的結果（表1 3 )指出得到 -61 - 1272105 (59)

B VD V —鉤端螺旋體屬組合疫苗（T02、T03、T04以及 T05 )的所有動物在所有的八個測試時間點是尿_液培養（ CX )陰性（表1 3，第2欄）以及在屍體剖檢（·第丨丨2或 1 1 3天）是腎培養陰性（表1 3，第8欄）。得到鉤端螺旋體屬一價疫苗（T06，正控制組）的母牛同樣是經保護以對抗鉤端螺旋體屬感染。相反的，得到安慰劑疫苗（T0 1 ，負控制組）的母牛基於尿液（表1 3，第2欄）以及腎培養（表13，第8欄）顯示是受到感染，指出疫苗攻擊硏究是有效。總之，L· hardjobovis分離數據第一次顯示四種不同佐劑調製的包含去活性第1及2型BVDV以及去活性L. hardjobovis以及波摩那型鉤端螺旋體之組合疫苗能誘發保護牛隻的反應對抗鉤端螺旋體屬疾病.。

-62- (60)1272105 表1 1 一 BVDV -鉤端螺旋體屬組合疫苗硏究中測驗組之小牛處理疫苗勤物數目劑量體積投服路線劑量/動物投服間隔 T01 生理食鹽水安慰劑 6 5毫升 SC 2 3週 T02 L. hardjobovis-波摩那型鉤端螺旋體-BVDV-l-BVDV-2 之 QAC 6 5毫升 SC 2 3週 T03 L. hardjobovis-波摩那型鉤端螺旋體-BVDV-1-BVDV-2 之 QAC/AI0H 6 5毫升 SC 2 3週 T04 L. hardjobovis-波摩那型鉤端螺旋體-BVDV-l-BVDV-之 DDA 6 5毫升 SC 2 3週 T05 L. hardjobovis-波摩那型鉤端螺旋體-BVDV-1-BVDV-2 之 DDA/AI0H 6 5毫升 SC 2 3週 T06 L. hardjobovis-單價 6 2毫升 SC 2 4週

-63… 1272105 (61) 表12 —第35天第1及2型BVDV血淸中和反應交互的幾何平均値效價以及範圍（# 一 # ) 第3 5天血淸病毒中和反應交互的幾何平均値效價以及範圍（# 一 # ) 處理第1型BVD病毒第2型BVD病毒 T01 <2(<2-<2) <2(<2-<2) T02 1084.9(609-2435) 20.8(16-54) T03 148.0(<2-1218) 5.8(<2-19) T04 1877.9(1024-2896) 34.0(19-91) T05 1084.6(152-3444) 36.1(10-91) T06 <2(<2-<2) <2(<2-<2) 表13 — BVDV -鉤端螺旋體屬組合疫苗對抗hardjo — b 〇 v i s型鉤端螺旋體攻擊之功效的結果 _ 尿液曾經是鉤端螺旋體屬陽性小牛的百分比鉤端螺；! 數最小2 淀體屬陽性尿液天 p方平均百分比腎臟曾; 陽性小f 經是鉤端螺旋的百分比處理 CX FA PCR CX FA PCR CX FA PCR T01 n=6 100a 83.3 a 83.3 a 50.9a 29. la 37.1a 83.3 a 0a 16.7a T02 n=6 ob 0b 0b 0b 0b 〇b 0b 0a 0a T03 n=6 ob 0b 0b 〇b 0b 〇b 0b 50.0a 0a T04 n=6 ob 0b ob ob 0b 0b 0b 0a 0a T05 n=6 ob 16.7ab 16.7ab ob 0.3b 0.4b 0b 16.7a 0a T06 n=6 ob 0b 33.3ab 〇b 0b L6b 0b 0a 0a -64- (62)1272105 在欄內沒有共同上標之數値是有顯著的差異（p < 0.05

-65-

Claims

T272l0i

公，Γ令‘ 拾、申請專利範圍附件4Α : 第92 1 228 72號專利申請案中文申請專利範圍替換本民國95年9月4曰修正 !· 一種產生免疫性的組成物，其包含：經修飾之活的牛泡疹病毒（Β Η V - 1 )；經修飾之活的第3型副流行性感冒病毒（ΡΙ3 )；

經修飾之牛呼吸道合包病毒（BRSV) 去活性之第1型牛病毒性下痢病毒（BVDV — I ); 去活性之第2型牛病毒性下痢病毒（BVDV- 2 );及獸醫學上可接受的載體。 2 ·如申請專利範圍第1項的組成物，其中該載體包含皂素、內含皂素之水包油乳化劑、及/或 Qiiil A、 Amphigen及膽固醇。

3 ·如申請專利範圍第2項的組成物，其中該載體係經微流體化。 4 ·如申請專利範圍第1項的組成物，其中該第1型牛病毒性下痢病毒（BVDV - 1 )和第2型牛病毒性下痢病毒（Β V D V - 2 )係經細胞病變。 5 ·如申請專利範圍第4項的組成物，其中該第丨型牛病毒性下痢病毒（Β V D V — 1 )係Β V D V株5 9 6 0 (源自於美國Iwoa州Ames市之美國農業部國家動物疾病中心）。 6 ·如申請專利範圍第4項的組成物，其中該第2型牛病毒性下痢病毒（BVDV - 2)係BVDV株53637(ATCC 1272105 PTA-4 8 5 9)。 7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項的組成物，其中該組成物進一步包含至少一種選自犬鉤端螺旋體、流感傷寒型鉤端螺旋體、鉤端螺旋體（Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno)、黃疽出血型詢端螺旋體、波摩那問號狀鉤端螺旋體、牛鉤端螺旋體（Leptospira borgpeterseniihardjo-bovis)或胎兒彎曲桿菌之抗原。 8. —種免疫上有效量之申請專利範圍第1至6項中任一項的組成物於製造供在動物體內誘發拮抗至少一種下述病毒之免疫反應用的疫苗上之用途： (a)第1型牛泡疹病毒； (b )第1型牛病毒性下痢病毒； (c )第2型牛病毒性下痢病毒； (d )第3型副流行性感冒病毒（PI3 );及 (e)牛呼吸道合包病毒（BRSV)。 9. 一種免疫上有效量之申請專利範圍第7項的組成物及獸醫學上可接受的載體於製造供在動物體內誘發拮抗至少一種下述抗原之免疫反應用的疫苗上之用途： (a)第1型牛泡疹病毒； (b )第1型牛病毒性下痢病毒； (c )第2型牛病毒性下痢病毒； (d )第3型副流行性感冒病毒（PI3 ); (e )牛呼吸道合包病毒（BRSV ); (f )胎兒彎曲桿菌；及 -2- 1272105 (g)犬鉤端螺旋體、流感傷寒型鉤端螺旋體、鉤端螺旋體（Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno)、黃疽出血型鉤端螺旋體、波摩那問號狀鉤端螺旋體、牛鉤端螺旋體（Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、布丁拉鉤端螺旋體（Leptospira bratislav a)、犬新孢子蟲、胎兒滴蟲、牛黴漿菌、睡眠嗜血菌、溶血性曼氏桿菌及巴氏桿菌。 1 0. —種有效量之申請專利範圍第1至7項中任一項的組成物於製造供預防動物體內持續性胎兒感染用的藥物上之用途。 1 1 . 一種有效量之申請專利範圍第1至7項中任一項的組成物於製造供預防動物體內持續性BVDV感染用的藥物上之用途。 12.如申請專利範圍第1 〇或1 1項之用途’其中該動物係母牛、小牛或小牝牛。