TWI271435B

TWI271435B - Polymerare Chain Reaction chip

Info

Publication number: TWI271435B
Application number: TW094121783A
Authority: TW
Inventors: Gwo-Bin Lee; Jr-Hau Wang; Jia-Sheng Liau
Original assignee: Univ Nat Cheng Kung
Priority date: 2005-06-29
Filing date: 2005-06-29
Publication date: 2007-01-21
Also published as: US20070004032A1; TW200700551A

Description

1271435 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明是有關於一種三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片，特別是指一種可進行環狀流動式聚合酶連鎖反應的晶片。【先前技術】近年來，隨著微機電製程技術之成熟，已在許多不同的領域中有顯著的發展，尤其在微小化快速生醫檢測分析更扮演了十分重要的推手角色。藉由微機電製程技術所生產之微流體生醫檢測晶片，其具有高檢測效能、可拋棄式、可攜帶性、低樣品及檢體消耗量、低耗能、體積小以及成本低等優點。尤其以整合全程微流體系統於同一晶片上之設計，最具發展潛力以及市場價值。聚合酶連鎖反應（Polymerase Chain Reaction，簡稱 PCR) 是近年來極為重要的一項去氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA)增殖技術。其是藉由溫度的控制將去氧核糖核酸雙螺旋變性（Denaturation)、缓冷配對（Annealing)、複製 (Extension)三個步驟，將標定的去氧核糖核酸序列（target sequence)放大至數百萬倍。自1993年開始，微小型聚合酶連鎖反應晶片在世界各國已有相當多的研究發表出來。但目前多數是利用以下兩種方式進行，其中之一是樣品移動式，其控制數個固定區域溫度，配合循環參數，使樣品在各控溫區移動。另一種是虽度循環式，其是將樣品固定於一區域中，配合循環參數，改變 5 1271435 反應區域之溫度。但上述反應晶片大多只能針對以去氧核糖核酸為基底的病毒及細菌作檢測反應，並且具有高消耗功率、溫度均勻性不佳等缺點。晶片100，其具有一基座10，於基座1〇特定位置上以微影技術（Lithography)及金屬沉積技術沉積出一金屬薄層的加熱裝置101，及一層溫度感測器103，該加熱裝置1〇]及溫度感測器103的金屬薄層係延伸至基座1〇周緣，便於電性連接於其電源及儀器（圖未示）。於加熱裝置1(H及溫 ⑻上先覆蓋有-看薄的蓋玻片】3,再於蓋玻片13 = 有-容置# 15，通常該容置槽15是以聚二甲基矽氧烷 (P〇lydimethyIsii〇xane，PDMS)來製作。本習知例於操作時’是先將欲進行聚合酶連鎖反應的去核酸調配液體置放於該容置槽15，以自動控，加熱裝fHH進行增溫、降溫、增溫的標準步驟 = 疋的循環次數後，即完成去氧核糖核酸的卿。動二=知的方式，其雖然無需驅動液體，省去-些驅衣但八加熱裝置1 〇 1的辦π血眼、w 進行且進行反應的過程中；是否二_:的時間來的停留於預設值，都可能無；母-人改變後都準確過程的溫度是失去準確产，則：體旱握，所以如果其中幾個法正確的得到結果。㈢至/、很大甚至無請參見圖2，為另一稀羽其是屬H合酶連鎖反隸置200, 種車又為大型的微流體裝置’其設置有三個加熱裝 1271435 置21 ’分別定溫於55度、72度、％度，該％度是會隨檢體DNA種類的不同而有所差異，再於三個大型加熱裝置21 上設置有一層流體層22,該流體層22上密佈有微管道221。其操作時，是先將欲進行聚合酶連鎖反應的去氧核糖核酸调配液體填充入該微管道221，再以一驅動裝置（通常是一大型液體幫浦，圖未不）驅動液體於微管道221中流動，使液體依序流經於該等加熱裝置21上，進行增溫、降溫、增温

的標準步驟，即可完成去氧核糖核酸的複製。而沒種習知的方式，不但必須於流體層22上設置複雜的微官迢221外，且控制液體於微管道221内的流速是一定的，因為其必須控制液體於每一加熱裝i 21域需經過的時間，才足夠其反應，所以，流速控制相當重要。此習知微官這221於每一溫度區所設計的長度是固定的，無法加以修改，$也意味著液體於每一溫度的反應時間被固定了，且聚合酶連鎖反應的次數也是固定的，如圖2中所不的20、25、30、35、40，所以必需符合這些次數後，才能取出液體，可以說本習知對於反應次數、反應時間、於每均完全無法因應實際狀況加以修一溫度的反應時間比例改。因此，本發明人精心研發出製程簡易，結構單純，降低溫度影響的聚合酶連鎖反應晶片。【發明内容】本發明之目的’在提供—種更可被靈活運用的聚合酶連鎖反應晶片’其製程㈣，結構單純’且可彈性控制反應溫

7 1271435 度週期、各反應的時間比例、各反應的時間長短的。本發明三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片，是用於將去氧核糖核酸為基底之檢體經聚合酶連鎖反應，複製其特徵片段，其具有一基座、一流體層、一氣壓層，於基座上設有三個環狀排列的加熱裝置，該流體層是疊置於基座上，並設有一環狀微流體流道，而該氣壓層則是疊置於流體層上，對應的設有三個環狀排列的氣室，該等氣室是連接於一空壓裝置。更進一步的於每一加熱裝置旁分別設置有一個溫度感測器，便於自動化的控制溫度。於該流體層上設有一與微流體流道相連通的容置槽，用以容置一欲進行聚合酶連鎖反應（PCR)的液體，再利用空壓裝置控制氣室，使液體注入環狀流道内，並將每一加熱裝置加以定溫。藉由控制空壓裝置來控制該等氣室的進氣狀態，使反應液體環流於三加熱裝置上，進行聚合酶連鎖反應。【實施方式】有關本發明之前述及其他技術内容、特點與功效，在以下配合參考圖式之較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。參見圖3,為本發明三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片500 的一較佳實施例，本實施例具有一基座6、一流體層7及一氣壓層8。該基座6於本實施例中為一玻璃片體，其具有一上表面 1271435 61，於上表面61上以微光顯影技術及金屬蒸鍍技術，沉積出二個環狀排列圍繞成一圓形的加熱裝置，分別為第一、第一、第三加熱裝置621、622、023，每一加熱裝置約佔三分之一的圓周長，且彼此間間隔微小的間距，每一加熱裝置分別延伸出兩電性連接的接點625，這些接點625是配置於上表面61的兩相對側邊。

另外’以同樣的方式於每一加熱裝置旁沉積出一對應的溫度感測器，分別為第一、第二、第三溫度感測器63丨、632、 633，該等溫度感測器631、632、633亦是以環狀排列圍繞成一圓形，每一溫度感測器約佔三分之一的圓周長，於本實 %例中二個溫度感測器63 1、632、633是位於三個加熱裝置 621、622、623内緣，而每一溫度感測器於兩端分別延伸出一電性連接的接點635,這些接點635是配置於上表面61的兩相對側邊，與前述接點625並列設置。凊配合參見圖4、5，必須加以說明的是，本實施例的加熱裝置621、622、623與溫度感測器63丨、632、633是先於上表面61上沉積出一層白金層（pt，如圖4所示），再於對應該等延伸接點625、635處沉積出一層黃金層（Au，如圖5所不)’主|考里疋因為金的電阻小，傳輸效果佳，而白金的電阻大，作為加熱材料極佳。丹如圖3所示，本實施例之流體層7是以聚二甲基矽氧院（PDMS)來製作，其為_層透明薄層，具有一第—面η及一相反的第-面72 ’於流體層7貫穿有一容置槽74,容置槽74是貫穿第一面71及第二面72，而於第二面72上朝向 9 1271435 第一面71凹設有一環狀流道75及_料总、及微官逼77,該環狀流道 75的大小疋對應前述三個加熱裝置621、622、 - 吻设的，而微管道77是用以聯通容置槽74及環狀流道乃說明於後。乍用將

祕壓層8同樣是以聚二甲㈣氧糾順）來製作，具有-第三面81及-相反的第四面82，由第四面82朝向第^ 面81凹設有三個環狀排列圍繞成—圓形的氣室，分別μ -、第二、第三氣室831、832、833，於第四面82上另凹嗖有三個微管道’分別為連通第一氣室831的微管道如，= 通第二氣室832的微管道842，連通第三氣室833的微管道 843 ’於每-微管道841、842、843的另一端分別貫穿二= 穿槽，該等穿槽均貫穿第三面81及第四面82，分別為第—、第二、第三穿槽851、852、853 ’每—穿槽均與相連的微管道相互連通。另於，氣壓層8第四面82朝向第三面81凹設有_£型槽861及一第四穿槽863,該第四穿槽863是貫穿至第三面 81，而Ε型槽861則未貫穿至第三面81，兩者間並以一微管道865相互連通，其作用容後說明。請配合參見圖6，本實施例於組裝時，是將前述基座6、流體層7及氣壓層8加以疊置，且於基座6與流體層7間先以玻璃材質的蓋玻片5 01加以區隔，再將流體層7之第二面72朝向蓋玻片501蓋合於蓋玻片5〇1上，並使環狀流道 75位於二個加熱裝置621、622、623上方，且保持基座6上的複數個接點625、635外露，也就是不被蓋玻片5〇1或流 ⑧ 10 1271435 體層7覆蓋，便於將接點625、635連接於外部電源與儀器（圖未示）。此時，流體層7上的容置槽74 —端抵接於蓋玻片5〇1 表面上，所以於容置槽74處即形成可供調配液體置放的區域0

於流體層7蓋合於蓋玻片501後，再將氣壓層8之第四面82朝向流體層7第一面71，將氣壓層8蓋合於流體層7 上，使排列成環狀的氣室831、832、833位於環狀流道75 上，以及使E型槽861位於微管道77上，且流體層7上的谷置槽74必須外露，而不被氣壓層8覆蓋，不然會使得欲進行聚合酶連鎖反應（PCR)的調配液體難以無法填充。當前述晶片500完成組裝後，須於第一、第二、第三及第四牙槽851、852、853、863上插設管路（圖未示），該等管路是連接於-空壓機（圖未示），藉由程式控制而自動化的㈣空壓機需對哪—穿槽進氣與排氣，而進氣與排氣的作用將况明於後。另外，前述的複數個接點625、635亦已連接於外部電源與儀器。 >

;操作本實施例時，是先將欲進行聚合酶連鎖反應（pcR) 的。周配液版細己a成，此部分為熟知者均能輕易理解的，不再贅述於此。將調配液體置放於容置槽74内，在此之前必須控制空壓機對所有的穿槽85卜852、853、863進氣，經由微管道841、842、843、865，使該等氣室撕、832、833 充入氣體膨脹，而向下方的環狀流道75壓抵，該E型槽861 亦會被充入氣體膨脹，而向下方的微管道77壓抵，所以置放於容置槽74内的調配液體此時並不會流入微管道”内。 1271435 將E型槽861排氣，之後將第一、第二、第三氣室831、 832、833排氣，即會使得調配液體由微管道77流入環狀流道75内，然而並不一定要使三個氣室依序排氣，主要是控制調配液體可順利的流入環狀流道75即可，而本實施例是採取依序排氣的方式，使得調配液體充滿環狀流道75，接著將E型槽861進氣，壓住微管道77，使調配液體不會由微管道77流出至容置槽74。當即將進行聚合酶連鎖反應（PCR)時，須先將三個氣室的其中兩個進氣，使調配液體集中於未進氣的氣室下方，本實施例是先將第二、第三氣室832、833先行進氣，所以調配液體會流至第一氣室83 1下方，然而由於流體層7是以聚二曱基矽氧烷（PDMS)來製作，具有彈性，不會造成破損的情形。調配液體集中於第一氣室83 1下方後，將三個加熱裝置 621、622、623配合其溫度感測器63 1、632、633，分別定溫於95°C、53°C、72°C，該53t：是隨檢體DNA的不同須加以更改的，而對應第一氣室831下方的為95°C，對應第二氣室832下方的為53°C,，對應第三氣室833下方的為72t：。所以，調配液體於第一氣室831下方會處於95°C的狀態下，將去氧核糖核酸（DNA)雙股變成單股，於適當時間後，將第二氣室832排氣，第一氣室831進氣，即可使調配液體於環狀流道75内流動，且流動至第二氣室832下方，使得調配液體處於53°C的狀態下，引子（Primer)會與單股去氧核糖核酸（DNA)結合。

12 1271435 再於適當時間後，將第三氣室833排氣，第二氣室832 進氣，即可再使調配液體於環狀流道75内流動，且流動至第三氣室833下方，使得調配液體處於72°C的狀態下，單股的去氧核糖核酸（DNA)開始複製成雙股。如此’使調配液體於環狀流道75經過一個循環，即完成一次去氧核糖核酸（DNA)的複製，所以依序對第一、第二、第二氣室831、832、833加以控制其進氣舆排氣，即可輕易的完成數個循環的去氧核糖核酸（DNA)複製，而當完成預設人數後，最後再將E型槽861排氣，使微管道77暢通，並、子斤有氣至83 1、832、833進氣，該調配液體即可由環狀流道75經微管道77流出於容置槽74。由上述結構可知本發明的晶片設計單純，製程較為簡於聚β酶連鎖反應（PCR)時，調配液體均可快速輕易的私動到下-區域進行，幾乎完全屏除溫度升降的時間浪 — 1」仕思的控制三個區域的溫度，及調配液體了，域所㈣的時間，也就是說可以藉由控制氣室的進了格孔_ 控制調配液體於區域内所停滯的時間，所以以依據實際狀況改變這此俨二仏件且调配液體於三區域内的衣數也可以隨意改誊，所 :任一循環結束後取出調配、“ 衣人歡後才月匕取出，SU匕，本發明具问度的&活度，對於反應次數、間比例，均可因庫反應蚪間、於母-溫度說 J因應m際狀況加以修改。【圖式簡單說明】 13 1271435 圖1是一種習知溫度循環式聚合酶連鎖反應晶片的立體示意圖；圖2是一種習知的聚合酶連鎖反應裝置的示意圖；圖3是本發明三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片一較佳實施例的立體分解示意圖；圖4是圖3較佳實施例中於基座上所沉積出的白金平面示意圖； ^ Μ 丫於丞厓上所 (Au)平面示意圖；及而為了方便了圖ό疋目3車父佳貫施例的組合上視圖解’圖中並未繪出蓋破片。

14 1271435 【主要元件符號說明】 500 晶片 6 基座 621 第一加熱裝置 623 第三加熱裝置 631 第一溫度感測器 633 第三溫度感測器 7 流體層 72 第二面 75 環狀流道 8 氣壓層 82 第四面 832 第二氣室 841 微管道 843 微管道 852 第二穿槽 861 Ε型槽 865 微管道蓋玻片上表面第二加熱裝置接點弟二溫度感測裔接點第一面容置槽微管道第三面第一氣室第三氣室微管道第一穿槽第三穿槽第四穿槽 15

Claims

1271435

十、申請專利範圍： 1· -種三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片，用於進行聚合酶連鎖反應（PCR)，該晶片具有：

一基座，於該基座上設有三個環狀排列的加熱裝置及三個溫度感測H，每一加熱裝置搭配有一溫度感測器； -流體層，具有一對應該等加熱裝置設置的環狀流道，該環狀流道係用以供-欲進行聚合酶連鎖反應的調配液體流動循環，該流體層係疊置於該基座上，且使該調配液體不影響該等加熱裝置及溫度感測器；一氣壓層，對應的設有三個環狀排列的氣室，該等氣室是連接於一空壓裝置，藉由控制空壓裝置來控制該等氣室的進氣狀態，進而控制該調配液體於該環狀流道内的流向，使該調配液體環流於三加熱裝置上，進行聚合酶連鎖反應。 2·依據巾請專利範圍第！項所述之三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片，其中，於該流體層與該基座間，夾置有一蓋玻片，使位於該環狀流道的調配液體不會影響該等加熱裝置及該等溫度感測器。 3·依據巾請專利範圍第1項所述之三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片，其中，該基座上的三個加熱裝置各約佔三分之一的圓周長。 (依據中請專利範圍第i項所述之三區環繞式聚合酶連鎖 …BB片其中，5亥專加熱裝置分別延伸出兩供電性連接的接點。 16 1271435 5.專圍第i項所述之三區環繞式聚合酶連鎖 =Γ中，該等溫度感測器分別延伸出兩供電性連接的接點。 6.依據申請專利範圍第丨項 k之一 £裱繞式聚合酶連鎖反應晶片，其中，該等加熱装、衣置共該4溫度感測器是先於該基座上沉積出一層白金層（Pt)，之後再沉積出__層黃金層（Au) 〇依據申請專利範圍第i項所述之三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片’其中’該流體層為聚二甲基石夕氧靡s)。 8·依據中請專利範圍第i項所述之三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片，其中，該氣壓層為聚二甲基石夕氧炫（pMs)。 9·依财請專利範圍第丨項所述之三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片’其中，該流體層具有_第_面及一相反的第二面，於該流體層貫穿有一容置槽，該容置槽是用以容置調配液體。 • 1 〇·依據中睛專利範圍第9項所述之三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片，其中，該環狀流道是凹設於該第二面上，該第 • 二面上亦凹設有一微管道，該環狀流道的大小是對應該等 ‘ 加熱裝置而設的，而該微管道是用以聯通該容置槽及該環狀流道。 11. 依據申請專利範圍第1項所述之三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片，其中，該氣壓層具有一第三面及一相反的第四面，該等氣室是由該第四面朝向該第三面凹設。 12. 依據申請專利範圍第n項所述之三區環繞式聚合酶連鎖 17 1271435 反應晶片，其中，於該第四面上另凹設有三個微管道，分別為連通一氣室，於該等微管道的另一端分別設有一穿槽"亥專牙槽均貝牙該第三面及該第四面，且均與對應的微官道相互連通，於每一穿槽上插設一連通於一空壓機之管路。 1 «3 ·依據申讀' 專利筋圍楚1 1 ^ 項所述之三區環繞式聚合酶連鎖反應晶片，其中，於兮结、〜弟四面朝向該第三面凹設有一 E 型槽，並使該£型样餅曰對應於該流體層上的微管道，該E 型槽是連通於一空壓機，成進而控制該微管道的啟閉。 (S

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