TWI269035B - Cell counting/classifying chip, the fabrication thereof, and the method of using the cell counting/classifying chip - Google Patents

Description

1269035 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 綱是有關於一種細胞計數分類晶片及其製造方法 ’特別是指-種利用邊鞘流聚焦樣品流體寬度且❹刻技 5 術製作的細胞計數分類晶片。 【先前技術】 一般於生物科技業及學界中之細胞計數方式大多是使 用如圖！所示的由Miyaky所提出之細胞計數器ι以邊鞠流 聚焦一樣品流體的方式，將該樣品流體聚焦至寬度僅容一籲 1〇 細胞流過的寬度，再計數該樣品流體中之細胞數量。該細 胞計數晶片中形成-邊勒流就須接引一管路ιι〇至該細胞計 數益’再加上注入樣品流體之管路m &輸出流體之管路 112就需四條管路。因此，如須同㈣測多種樣品流體時， 須接引更多之管線以形成更多之邊鞘流，於測試及組裝上 15 都不方便。 參閱圖2，由於該細胞計數器1是以複數刻有不同形狀 之簍空槽孔的玻璃片12〜16互相疊貼以形成複數中空之流_ 體通道，並注入樣品流體及水進入該等通道，使水形成邊 鞘ML夾細聚焦該樣品流體，容易造成玻璃板12〜ι6間缝隙， 〇 漏洩流體，且於製作上也較為繁雜。 另外’細胞計數之方法大略有兩種，第一種是利用勞 光‘疋來檢測經染色做為標籤的細胞，以雷射集中光束於 聚焦後之樣品流體上，藉由細胞照射雷射光後放射或是散 射出來的光’即可知道細胞的大小、形狀及化學組成成份 1269035 、:在實際的應用時’細胞必須準確地經過量測區域的雷射 先束正中央，以確保能得到最大的輸出訊號。但上述之细 =計數方式需先將細胞染色，製作費時又麻煩，且其使用 設備需要極高精準度的流體動力及雷射光束，因此應用此 方式所組合的細胞計數器及儀器設備體積都很龐 昂貴，使用成本較高。 另一種細胞計數器是在細胞流體聚焦的一管道末端埋 藏入一對軸向對應於該管道兩侧的光纖並通入雷射光，利 用細胞經過光纖時，細胞阻斷二光纖間之光線，引起光線籲 的變化來偵測到細胞。而其流體驅動是以整合電極來驅動 細胞流聚焦，使細胞皆維持同一高度，細胞引起之光線訊 號變化強度一致。但此項技術需製作電極，光纖對準等精 密之程序，製程較為繁雜。 【發明内容】 於是’本發明即在提供一種製作簡易、不易茂漏及低 製作成本且可同時偵測多條細胞流並予以分類的細胞計數 分類晶片及其製作方法。本發明另一目的即在提供一種使鲁 用成本低廉’不須昂貴設備儀器的細胞檢測方法。 本發明細胞計數分類晶片，適用於計數一樣品流體内 之細胞數量，該細胞計數分類晶片包含··一透明基座，及 一中空地形成於該基座内的微管道單元。該微管道單元具 有·一主通道、一互相平行間隔排列於該主通道之二側的 副通道，及一連通於該主通道與該等副通道之末端的匯流 通道。該主通道之頭端連通至一形成於該基座表面供所述 7 1269035 樣品流體進入之導入孔。該等副通道之頭端互相連通並連 通至一形成於該基座表面供水流體進入之導入孔。該匯流 通道是用於匯流接引樣品流體及水流體並連通至一形成於 該基座表面之流出孔。該二副通道中之水流體流至該匯流 通道時形成二邊鞘流，該二邊鞘流限制由主管道流出之樣 品流體的寬度至單一細胞可流通之寬度，並由監測流經之 細胞數量計算樣品流體内含之細胞數量。 該細胞計數分類晶片之製造方法包含以下步驟： (A)於一水平之基板之頂面上蝕刻出一主通道、一平鲁 行間隔於該主通道兩側的副通道，及頭端共同連通主通道 及該等副通道末端的一匯流通道，該等副通道之頭端是互 相連通。（B )在該基板之該等主通道之頭端以鑽孔機鑽出 一貫穿至該基板底面之導入孔，於該等副通道之頭端共同 連通處鑽出一貫穿至該基板底面的注入孔，及於該匯流通 道之末立而鑽出一貫穿至該基板底面的流出孔。（C )把一玻 璃上板覆蓋於該基板頂面並進行高溫接合。 而使用該細胞計數分類晶片檢測細胞之方法係使用一 _ 數位攝影機擷取影像的方式檢測該細胞計數分類晶片内之 樣品流體的細胞，所述樣品流體之寬度僅容一細胞單獨流 過’該細胞檢測方法之步驟如下：（A)以所述數位攝影機 拍攝所述樣品流體流動之數位影像。（B)目選該數位影像 中樣品流體之流程中的一小段落作為一第一區域。（c^監 測該第—區域中之影像灰階值。（D)計數該第_區域之影 像灰階值改變次數，該第一區域中影像灰階值改變之次數 1269035 就代表細胞流過之數目。 本發明之功效能在於提供一設備構造簡單，並節省封 裝、測試時間，簡化製作程序，且減低縫隙茂漏之機會。' 益可偵測細胞數目及種類，且可藉著施加介電泳力於微管 5 道單疋末端進行細胞分類回收的細胞計數分類晶片及其製 造與使用方法。 【實施方式】 有關本發明之前述及其他技術内容、特點與功效，在 以下配合參考圖式之一較佳實施例的詳細說明中，將可清 IQ 楚的明白。 參閱圖3、圖4與圖5，該細胞計數分類晶片是用於計 數複數樣品流體2内之細胞數量，該細胞計數分類晶片包 括一透明之基座3、一中空地形成於該基座3内的微管道單 元4,及一插伸於該微管道單元4内之電極單元7。 15 該基座3是由透明之鈉玻璃材質製作而成，概略成水 平之板狀。 该微管道單元4具有：二水平中空的主通道41、四互 相平行間隔排列於該主通道41旁的副通道42、一接續於該 等主、副通道41、42末端並管徑寬度漸縮的頸通道43、一 2〇 接績連通該等副通道42之頭端的輸水通道44、一連通於該 之兩側。 頸通道43末端的匯流通道45，及連通於該匯流通道45頭 、末端間並分別向兩側延伸至該基座3外的一第一分類通 道46與一第二分類通道47。該四副通道42是兩兩成對， 每一對副通道42是分別平行排列於一主通道41 9 1269035 該等主通道41於連通該頸通道43處各形成一通道寬度漸 縮的主喷嘴411，該等副通道42於連通該頸通道43處亦各 形成一通道寬度漸縮的副噴嘴421。該頸通道43速通該等 主、副通道41、42處寬度較寬，接通該匯流通道45處之 5 寬度較窄，概略形成一漏斗形狀。於本實施例中是以二主 通道41及四副通道42以分析兩種樣品流體2内之細胞做 說明，實際上一主通道41配合二副通道42就可分析一種 樣品，需同時分析多種樣品流體2時，就增加主通道41及 副通道42之數量即可應用，因此實施上不以上述之數量為_ 10 限。 該等主通道41之頭端内周面上分別形成一貫穿至該基 座3之底面的導入孔412，以分別供所述兩種樣品流體2流 入该二主通道41内。該輸水通道44頭端内周面上形成一 貫穿至該基座3底面的一注入孔441，並分支出複數分歧段 442，該等分歧段442就是連通至該等副通道42之頭端， 亦即該四副通道42之頭端是藉由該輸水通道44來共同連 通，也藉由該輸水通道44以導引水流體進入該四副通道42# 本貝％例中水流體是去離子水，但只要水中無明顯雜質 ，亦可以用普通水做為水流體。該匯流通道45之末端之内 周面上形成一貫穿至該基座3底面以將樣品流體2及水流 體排流出基座3外的流出孔451。該第一、第二分類通道 46 47疋分別由該匯流通道45岔流分支出來，並分別延伸 至形成於該基座3底面的一第一分類孔461與一第二分類 孔 471 〇 10 1269035 5 10 15 該電極單元7具有—插伸於該匯流通道45内鄰近 -、二分類通道46、47連通處的第_電極71、—播伸二 第-分類通道46内並往第-電極延伸的第二電極 伸於該匯流通道45内並往第-電極延伸的第三電極^ Z -插伸於該第二分類通道47内並彳n極延伸的第四電 極74。藉此，施加電壓於第一與第二電極71、72間或第— 與第三電極71、73間，或第一與第四電極71、Μ間，Z 於該微管道單it 4末端之流體產生介電泳力驅動不;之= 胞分別流入該匯流通道45末端或該第一、第二分類通道2 、47内。本實施例中是以二分類通道作說明，實施上ζ 一 分類通道就可達成分類之功效。 參閱圖4及圖6,本發明利用分流之觀念，以一個栗浦 51推動水流體進入注入孔441，經由輸水通道44分流至四 副通道42,以噴流四條均勻邊鞘流似經頸通道43進入匯 流管道。使用此分流原理，以此類推，即可在同一平面以 -個泵浦51推動水流體以獲得所需的邊鞍流422數目。不 僅節省泵浦51數量之使用，也解省封裝及測試之時間，更_ 可使推動之水流體流速平穩。本實施例中是以蠕動式泵浦 51作為晶片内流體之驅動力，實施上不以此為限。 藉此，該二主通道41注入兩種不同之樣品流體2，而 該等副通道42是由該泵浦51注人水流體，#所有流體經 由該主、副通道41、42之主、副噴嘴411、421後，匯集喷 入該頸通道43，並匯流進入該匯流通道45中時，每一主通 道41之兩側副通道42中流出之水流體形成二邊鞘流422， 20 1269035 5 10 15 20 該二邊鞠流1 形成流體聚焦效應，此時適當地調整邊鞘流422與樣品流 體2之流速比可將樣品流體2之寬度縮減至數微米寬，也 就是該二邊鞘流422可限制樣品流體2之寬度至僅容單一 細胞通過的寬度，運用顯微鏡（圖未示）就可計數所述樣 品流體2中細胞之數量。上述之水流體是去離子水，但只 要水中無明顯雜質，亦可以用普通水做為水流體。但隨著 水流體組成液體種類不同，流體聚焦的所需的速度比亦會 不一樣0 ! 此外，經過邊鞘流422擠壓之樣品流體2中經過計數 之後，可藉由施加電壓於該電極單元7之不同電極之間， 以驅動樣品流體中之不同細胞分別由不同之通道輸出至該 λ ,，外例如，經计數觀察後之細胞如須分類收集至第 一分類孔461時，可施加一交流電壓於該第一電極71與第 電才° 72間以產生一正介電泳力以吸引細胞經由該第一 分類通道46往第-分類孔461輪出至該基座3外收集。運 用相同之原理就可驅動不同種類之細胞分別經由該等分類（ 孔461、471或流出孔451輸出至該基座3外以方便回收再 利用。於上例說明中’亦可用施加電壓產生負介電泳力以 推斥細胞由其他通道輸出的方式來分類細胞，實施上不以 上述之方法為限。另外該等分類通道及電極單元7之主要 分類細胞而設置’於實施上亦可不設置分類通道 ”包極單兀’仍然具有細胞計數之功能，因此實施範圍不 以此為限。 野1开爽於其中央之樣品流 12 1269035 於本實施例之晶片中各通道之詳細尺寸請參考圖4，其 中該主噴嘴411之寬度為1〇〇微米，該副通道42之寬度為 15〇微米，而匯流通道45之寬度為24〇微米，而圖6為調 整流速比後，於該匯流通道45中該樣品流體2可聚焦至寬 5 度達17微米之顯微照片。 參閱圖7，以下續對本發明細胞計數分類晶片之製造方 法加以說明： (A) 於一水平之玻璃基板Μ之頂面上塗佈上一光阻 劑層33，再以繪製有如圖4之微通道系統4之圖案的光罩_ 1〇 34覆蓋於該光阻劑層33上，以顯影之技術將該通道分布轉 移至該基板31上，再以玻璃蝕刻液蝕刻該微管道單元4。 該微管道單元已於前詳述，不再贅述。 (B) 在该基板31之該等主通道41之頭端端以鑽孔機 鑽出貝牙至該基板31底面之導入孔412，於該輸水通道 15 44之頭端鑽出一貫穿至該基板31底面的注入孔441、於該 匯流通道45之末端一鑽出一貫穿至該基板31底面的流出 孔45i，及分別於該第一、第二分類通道46、47末端鑽出籲 一貫穿至該基板31底面的一第一分類孔461與第二分類孔 471。再使用硫酸與過氧化氫的混和溶液以煮沸十分鐘的方 20 式將該基板清洗後再烘乾。 (C) 於一玻璃上板32之底面上以蒸錄的方式先後舖 设一層鉻（Cr )金屬及一層金（Au )金屬，再以顯影蝕刻 的方式將該電極單元7以外之金屬刻除，並以丙酮、異丙 醇（Iso-Propyl AlcohoUPA )、去離子水循序沖洗並烘乾。 13 1269035 因為金與玻璃黏著性不好，所以利用鉻 W用絡金屬當中間的介面 使金金屬層可良好附著於該上板底面。 5 10 15 20 (D) 把該上板32 ^位覆蓋於該基板3ι頂面並於一充 滿氮氣環境之高溫燒結爐中’彻高溫加熱上才反Μ及基板 31使玻璃呈現融熔狀態而接合，以使該等通道中空地形成 於該基板3i及上板32 ι在氮氣環境下進行高:接合可 避免金屬電極發生氧化而造成晶片損毁。 (E) 將接合好之上板32及基板31進行封裝，即形成 一細胞計數分類晶片。 以本製作方法製作出細胞計數分類晶片具有以下之優 (1) 僅以一蝕刻該等通道後之玻璃基板31及一上板 32相互璺接並以高溫接合，&習知五玻璃基板疊合之結構 ，減少玻璃板間之隙縫洩漏之機會，也簡化製作程序。 (2) 本製作方法可製作出可同時檢測多種樣品流體2 之a曰片/、須於顯影程序時使用緣製不同通道結構之光罩 34，不會增加製作程序。 本發明之另一目的在於提供使用上述細胞計數分類晶 片的方法，參閱圖8,其係於該細胞計數分類晶片内之兩種 樣品流體2在流體聚焦後，配合一數位攝影機52快速擷取 圖片，並於一處理單元53上處理拍攝之影像，並由影像處 理中檢測細胞。該細胞檢測方法之步驟如下： (A)以所述數位攝影機52拍攝所述樣品流體2之寬 度為僅容單一細胞通過的寬度時流動之數位影像，數位攝 14 1269035 影機52須具有一朝向該晶片之匯流通道45中樣品流體2 的顯微鏡頭，以使攝影的倍率放大，將細胞放大到肉眼可 見的大小，且數位攝影機52輸出一影像訊號。 (B) 以一處理單元53接收該數位攝影機52所輸出之 影像訊號，並解析出複數影像圖片。本實施例之數位攝影 機52是採用每秒94張圖片來拍攝，也就是由該影像訊號 每秒可解析出94張影像圖片。且所擷取影像為灰階圖片， 以利細胞影像之判別。該處理單元53是—般常見之電腦， 但實施上不以上述之方式為限。 | (C) 於該等影像圖片中該二樣品流體2之流程中各選 擇一區域61。 (D) 監測該二區域61中之影像灰階值。數位攝影機 52拍攝之影像為灰階值，在影像中細胞粒子在灰階值中呈 現偏黑狀態’與背景的偏白上有相當程度的對比。利用此 原理’當細胞通過該區域61時會接觸到該區域6丨之兩側 邊線邊線上會因為細胞的灰階值比較黑，與背景灰階值 車乂白有所不同，以此影像變化分析，而可認定-細胞粒子_ 通過。 (E) 计數該二區域61之影像灰階值改變次數。該二 品或61之兩側邊線影像灰階值改變之次數就代表細胞流過 妻目以猎此计數該二樣品流體2内之細胞數量。 ”參閱圖9，利用上述之方式也可用來針對不同大小的細 已粒子來進行汁數。其只須在影像上之每一樣品流體2於 匯流通道45的流程中同時圈選出不同大小之長方形的一第 15 5 10 15 20 1269035 吁^ 區域63並分別對第―、二區域62、63 的卩可。舉例說明如下：如果注入包含兩種不同大小， 胞粒子的樣品流體2進人主通道41中 幻細 纪丨丨达， Τ 而兩種細胞大小分 別為20微米與12微米，則把該、- 分別中μ & — &域62、63寬度 邊续義為20微米與12微米大小，並μ該等區域的兩 纽必須同時損測到灰階變化才能計數得—細胞粒子。去 微未的細胞通過寬度20微米的第—區域62時 : ::ΓΓ區域62的兩邊，所以第一區域62未_:; …田肊。當12微米的細胞通過寬12微米的第二區域( 63 其兩邊線可同時偵測到變化，所以第二區域偵測 並汁數—細胞通過。當20微米的細胞出現時，第—及第二 區域62、63的兩邊線都可同時偵測到影像灰階值變化，戶： 以兩個區域皆會_並計數—細胞通過。計數過程之後， 戶斤圈選的第-區域62計數所得的細胞數目即為真正2〇微 米細胞的數目’而第二區域63計數所數得之細胞數目同時 包含12微米及20微米的細胞數，所以真正12微米的細胞 數目是第二區域63計數測得數字減掉2()微米細胞數即為| 真正的12微米的細胞數目。由此可知，應用上述之方法可 測得兩種不同大小之細胞數目’也就是說此方法可偵測到 數種不同種類之細胞數目。 另外應用數位影像偵測方法亦可測得該樣品流體2之 流速，其測速方法是先在影像上之樣品流體2於匯流通道 45的流程中圈選二區域64，並依偵測細胞之大小定義該二 區域64之尺寸大小。此時由影像中可得知兩區域64間隔 16 1269035 實際距離，並可由影片之數 之時間差，以量測得之時:::知一細胞通過該二區域64 體2之r + 、B差和距離，即可算得該樣品流 篮2之流速。該二.區域64間夕呢她π n c…一 離可依實際樣品流體2中 之細胞禮度：Ε盯定，以準墟旦 之時間。 旱確里取一細胞流經該二區域64間 運用上述之檢測方法，不僅 ^ , Η, ^ ^ 1胃 个惶j Π時叶數兩種樣品流體2

之細胞數ϊ，並可量測彳異叉n I 、" 切不冋大小之細胞數量，及流體之 迷度。 10 15 20 歸納上述，本發明利用利用分流之觀念，僅以一系浦 就可驅動水流體於四副通道中流動形成四條均句邊鞘流， 設備構造簡單，並節省封裝、賴日㈣，更可使推動之水 流體流速平穩。其次是利用餘刻技術製作該晶片，簡化製 作程序，且避免縫隙洩漏之機會。 ^孩取後利用偵測影像灰階 值變化的方法’可同時偵測樣品流體中之不同種類之細胞 數目及樣品流體之流速。以構造簡易之震置達_測細胞 之功用，故禮實能達到發明之目的。 惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不 能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利 範圍及發明說明書内容所作之簡單的等效變化與修飾，皆 應仍屬本發明專利涵蓋之範圍内。 【圖式簡單說明】 圖1是習知之細胞計數器之立體圖，其中最上層之玻 璃板已掀除； 圖2該習知之細胞計數器之立體分解圖； 17 1269035 【圖式之主要元件代表符號說明】 2 樣品流體 451 流出孑L 3 基座 46 第一分類通道 31 基板 461 第一分類孔 32 上板 47 第二分類通道 33 光阻劑層 471 第二分類孔 34 光罩 51 泵浦 4 微管道單元 52 數位攝影機 41 主通道 53 處理單元 411 主喷嘴 61 區域 412 導入孔 62 第一區域 42 副通道 63 第二區域 421 副噴嘴 64 區域 422 邊革肖流 7 電極單元 43 頸通道 71 第一電極 44 輸水通道 72 第二電極 441 注入孔 73 第二電極 442 分歧段 74 第四電極 45 匯流通道 19

Claims (1)

1. l269〇35拾、申請專利範圍 倐

   換 % 日 1 · 一種細胞計數分類晶片，適用於計數一樣品流體内之細 胞數量，該細胞計數分類晶片包含： /透明基座；及 /微管道單元，中空地形成於該基座内，具有： 一主通道，頭端連通至一形成於該基座表面供 所述樣品流體進入之導入孔； 二副通道，互相平行間隔排列於該主通道之二 侧，該等副通道之頭端互相連通並連通至一形成於 該基座表面供水流體進入之注入孔； 一匯流通道，連通於該主通道與該等副通道之 末端以匯流接引樣品流體及水流體並連通至一形成 於該基座表面之流出孔； 該二副通道中之水流體流至該匯流通道時形成二邊 鞘流，該二邊鞘流限制樣品流體之寬度至單一細胞可流 通之覓度’並由監測流經之細胞數量計算樣品流體内含 之細胞數量。 2·依據申請專利範圍第1項所述之細胞計數分類晶片，其 中δ亥注入孔是由該等副通道之連通處内周面上貫通至該 基座底面。 3 依據申請專利範圍第1項所述之細胞計數分類晶片，其 中忒導入孔是由該主通道之〆端内周面上貫穿至該基座 之底面。 喪據申請專利範圍第1項所述之細胞計數分類晶片，其 2〇

   1269035 中並連通至一形成於該'基舊果®之流出孔，該流出孔是 由該匯流通道之一端内周面上貫穿至該基座之底面。 5.依據申請專利範圍第1項所述之細胞計數分類晶片，更 包含一接續於該等主、副通道末端並管徑寬度漸縮的頦 通道’该頸通道之末端就是連接於該匯流通道之末端。 6·依據申請專利範圍第1項所述之細胞計數分類晶片，更 包含一輸水通道，該輸水通道頭端連通於該注入孔，炎 分支出複數分歧段，該等分歧段就是連通至該等副通道 之頭纟而，δ亥輪水通道就是使該等副通道之頭端共同連通 至注入孔。 7.依據申請專利範圍第1項所述之細胞計數分類晶片，其 中該微管道單元更具有—連通於該匯流通道頭、末端間 亚延伸至該基座外的一分類通道，該細胞計數晶片更包 含—電極單元’該電極單元具有—插伸於該匯流通道鄰 極、一插伸於該分類通道内的

   流入分類通道及匯流通道末端。 近該分類通道處的第一電極 第一電極，及一插伸於該應 8·依據申請專利範圍第7項所述之細胞計數分類 組成，鉻金屬分別 金金屬再貼覆於鉻 中，該等電極是由金金屬及鉻金屬所組成 貼附於該匯流通道與分類通道内後，金金 金屬上。 其製造方法包含以 一種細胞計數分類晶片之製造方法， 21 1269035

   (A )於一水平之基板之頂面上蝕刻出一主通道、 一平行間隔於該主通道兩側的副通道，及頭端共同連通 主通道及该專副通道末端的一匯流通道，該等副通道之 頭端是互相連通； (B)在該基板之該等主通道之頭端端以鑽孔機鑽 出一貫穿至該基板底面之導入孔，於該等副通道之頭端 共同連通處鑽出一貫穿至該基板底面的注入孔，及於該 匯流通道之末端鑽出一貫穿至該基板底面的流出孔； (C )把一玻璃上板覆蓋於該基板頂面並進行高溫 接合。 ° ίο. 11. 12. 13. 晶片之製 板及基板 片之製 片之製 依據申請專利範圍第9項所述之細胞計數分類 造方法’更包含一步驟（D )，是將接合好之上 進行封裝。 依據申請專利範圍第9項所述之細胞計數分類 造方法，其中該基板之材質是玻璃。 依據申請專利範圍第9項所述之細胞計數分類 造方法，其中該上板之材質是玻璃。 依據申請專利範圍帛9 X員所述之細胞計分類晶片之 造方法，其中於步驟（A)中更蝕刻出-連通：該: 通迢頭、末端間並往該基座外延伸的一 ，步驟⑴中於該分類通道之末端;道出1 至4基板底面的分類孔； 貝 而於步驟（C)中於該上板覆蓋於該基板之前， 22 1269035 ♦ 6 4 :. 於上板之底面上舖設金屬，再以顯影蝕刻方式刻出—由 上板周緣延伸至該匯流通道與該分類通道連通處的第一 電極、一由上板周緣延伸至該分類通道末端的第二電極 ，及一由上板周緣延伸至該匯流通道末端的第三電極。 14.依據申請專利範圍第丨3項所述之細胞計數分類晶片之製 造方法’其中於步驟（C)中，是以蒸鍍的方式先後蒸 鍍上鉻金屬及金金屬於該上板之底面。 15· —種使用細胞計數分類晶片之方法，係使用一數位攝影 機擷取影像的方式檢測所述細胞計敖分類晶片内一樣品 流體的細胞，所述樣品流體之流程寬度僅容一細胞單獨 流過，使用細胞計數分類晶片之方法步驟如下： (A) 以所述數位攝影機拍攝所述樣品流體流動之 數位影像； (B) 圈選該數位影像中樣品流體之流程中的一小 段落作為一第一區域； (c )監測该第一區域中之影像灰階值； (D)計數該第一區域之影像灰階值改變次數，該 第-區域中影像灰階值改變之次數就代表細胞流過之數 目。 16 ·依據申請專利範圍f i 5項所述之使用細胞計數分類晶片 之方法，其中，於步驟（c )中是監測該第一區域二側 邊線的灰階值，而於步驟（D)中，該第一區域兩側邊 線之灰階值同時改變才代表一細胞流過。 1 7.依據申明專利範圍第丨6項所述之使用細胞計數分類晶片 23 1269035 、 t ^ >f ; 之方法’其中，於步驟（B )中樣品流體之流程中的另 一小段落作為一第二區域，該第二區域之寬度較第一區 域之寬度小，較大之細胞通過第一、第二區域時，該二 區域之二側邊線之灰階值都同時改變，但如一較小之細 胞流過時，僅第二區域兩側邊線之灰階值會同時改變， 藉此方式可分別計數出兩種大小不同之細胞數量。 18 •依據申請專利範圍第16項所述之使用細胞計數分類晶片 之方法’其中’於步驟（B )中樣品流體之流程中的另 一小段落作為一第二區域，並依偵測細胞之大〜 二區域之尺寸大小，由影像中可得知㈣ 間隔之實際距離’並由影像灰階值改變分析 一 細胞通過該第一、第二區域之時 付 T间呈以夏夠得知時間 差和距離，即為該樣品流體之流速。 24