TWI266631B - Method and apparatus are provided for rapid cell separation - Google Patents

Description

1266631 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明侧於—種可㈣且無梯度密歧無抗體之分離細胞的裝 置及方法，特別是指利用各細胞表面分子物理性質之不同，與管柱中所充 真的娜產生交互作用纟官柱中各有不同的滯留時間，進而將不同的細 胞分離之一種可快速分離細胞之裝置及方法。 【先前技術】 在現7錢的研究上，研發人員希望能找出藥物在細胞上作用的位 置以瞭解藥物作用在細胞上的機制，進而研發出更有效或更安全之藥物； 在式驗的》又。十上利用均負的細胞來闡明藥物的作用機制，以得到藥物針 對特定細胞族群的反應，區別藥物對不同組織的影響；因此如何將細胞分 =化，在_實驗中扮射分重·角色；提供單_族群的細胞，不僅 疋提供杈為直接可觀察的目標，亦可了解藥物在特^細胞中的作用機轉。 習用分離細胞之方法主要有兩種，—是利用狀之溶液，例如聚嚴糖 (Ficoll) (Perc〇11#^_^^^6^^^ "^^(P〇iyvinyiPyroHdo^ , 同之物質所產生_度，根據各種細胞其本身細胞密度的不同，藉由離心 的方式，而將不__分離於不_密度梯射，進而達到細胞分離的 效果，美國專利Us. Pat. N〇咖邱所提出之發明，即為一種可製成 良好梯度之震置；然而，利職度梯度方絲分離細胞，其操作方式較困 難且費時，而所用之細胞分離液亦可能對細胞產生毒性，㈣響細胞之品 質0 1266631 另一種分離細胞的方式係為利用專一性抗體辨識特定之細胞表面分 子，此抗體可共價結合或以親和力結合螢光物質或是含鐵成分之物質，若 使用結合螢光物質之抗體，則可用細胞分離儀(cells〇rter)辨別特定之螢光， 再使之帶電’利用電場可將特定細胞加以分離，如美國專利us· Pat. N0. 4,629,687 ;若使用結合含鐵物質之抗體，則可利用磁場將抗體標定之細胞 分離，以此原理所發明出來之裝置及其改良裝置如美國專利u s. pat· N〇. 5,240,856、5,684,712、5,691，208、5,705,059、5,711，871 及6,468,432等；然 而，利用抗體篩選特定細胞，除了試劑的價格昂貴之外，因抗體的發展而 有侷限性；同時，抗體的使用也使得分離後之細胞無法在臨床上直接應用。 另外，Shibusawa於1999年提出利用表面親和力（surfaceaffmity)的性 質來分離細胞’將抗體結合在固定相(stationary phase)的樹脂或是玻璃珠 上’利用競爭物緩衝溶液的沖洗以分離細胞；在Shibusawa所發表的論文中

(Shibusawa (1999) 乂 5 722, 71-88)利用瓊脂糠凝膠 6B (Sepharose 6B )或是Chromagel A4做為固定相，結合聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG )或是聚丙二醇（p〇iypr〇pyiene glyC〇i，ppg )以用作細胞分離， 其技術可將顆粒球白血球、單核白血球及紅血球區分開來，但是一些白血 球的次族群（sub-population)如T淋巴球(T lymphocyte)、B淋巴球(B lymphocyte)及單核球(monocytes)則無法做有效的分離。 由此可見，上述習用方法仍有諸多缺失，且其操作時間需2至9小時 以上，不僅耗費時間，亦會影響所分離細胞之品質，實非良善之設計者， 而亟待加以改良。 1266631 本案創作人鑑於上述制細齡離分法之各項缺點，⑽思加以改良 創新，並纟好年w旨潛叫究後，胁成功研發完成本件—種可快速 分離細胞之裝置及方法。 【發明内容】 本發狀目的即在於提供-料快収無梯輕度及無減使用之分 離細胞的裝置及方法，除了提供較簡單、快速 迷的知作私序，且不需使用抗 體，並可提供較經濟之裝置及方法，以降低研發成本。 本發明之次一目的係在於提供一 種可快速且無梯度密度及無抗體使用 之分離細胞的裝置及方法， 不品使用特&產生密度梯度的化學藥品及辨識 抗原的抗體，以確保分離出所要的細胞之品質及完整性。 本發明之另一目的係在於提供一種可快速且無梯度密度及無抗體使用 之分離細胞的裝置及方法’以提供可快速且有效分離白血球之次族群的裝 置及方法。 本毛明之X目的係在於提供—種可快速且無梯度密度及無抗體使用 之分離細胞的裝置及方法，可制於藥_檢上，雜供研發人員更方便 有效的藥物篩檢工具。 本么明之#目的係在於提供連續式的分離裝置，可應用於現今流式 細胞儀或其他分析儀的連續性分析應用。 為達上述目的’本發明係發展出—種管柱，利用細胞表面和離子樹脂 交互作用之原理’使細胞得以分離，其作用可進—步分離淋巴球的次族群，· 如圖-所tf ’由於許多藥物係作用於細胞的表面受體，進而會改變細胞表 面的物理性質’因此在有無藥物的作用下，細胞會有不同的滞留時間，·是 1266631 以’依照此原理所發展出來的管柱，將可應驗藥物的篩檢上。 【實施方式】 本發明所提供之-種可快速且無梯度密度及無抗體使狀分離細胞的 裝置及方法，包含—分離細胞之管柱，該f柱之材質可為玻璃、塑膠或金 屬，該管柱内充填有樹脂粒子，該充填粒子之大小為觸微米(micr〇meter) 至4〇〇微米’該樹脂之成分為聚苯乙烯(p〇1卿讀）或聚氯乙稀⑽vi㈣ chloride，PVC)，或是以化學物質或特定化學官能基所修飾之樹脂，其中該 特定化學官能基可為氰基(-CN)、丙基(propyl)、苯基(-phenyl)、氫氧鱗灰石 (hydroxylapatite)、長碳鏈(long chain carbon)、可帶正電之氨基(顺3)、氮， 氮’氮-二甲基(N(CH3)3)、氮，氮-二乙基(n(C2H5)2)、氮，氮-二甲基(n(ch3)2) 及可帶負電之亞硫酸根(S〇3〇、羧基(coo_)等，該化學物質可為糖基（如： °比喃基(pyranyl)或呋喃基(fumnyl)或多醣體(p〇iysaccharide))或可為組成蛋 白質之二十種胺基酸等；該管柱之形狀可為圓柱狀，該管柱可為毛細管， 該管柱直徑大小及長度可視需要而改變。 本發明所提供之分離細胞之裝置及方法，所欲分離之細胞可為血液細 胞，或是附著細胞(attached cells)經解離(dissociation)後呈懸浮細胞之形式。 實施例一藥物輿細胞之交互作用（interaction of cell and chemical) 本實施例中所使用之分離細胞的管柱其管柱内徑(inner diameter)為6毫 米(mm)，管柱長度為180毫米，管柱體積為5毫升(ml)，該管柱内充填有樹 脂粒子，該管柱係先以磷酸緩衝液PBS沖洗，並以磷酸緩衝液PBS充滿該管 柱以備用。 《控制組》 1266631 檢體血液首先利用聚蔵糖細胞分離液（Ficoll)以離心方式分離，取得 周邊血單核球細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，周邊血單核球 細胞以磷酸緩衝液（phosphate buffered saline, PBS)稀釋成為每毫升一百萬 個細胞(lxl06cells/ml)之細胞懸浮液，再將該細胞懸浮液載入至上述管柱上 緣’加入磷酸緩衝液PBS至一定高度後，開始以鱗酸緩衝液pbs沖提該管 柱，流速為每分鐘3毫升，細胞洗出液分別以試管收集，每五滴細胞洗出液 收集一管，每一管的細胞洗出液，分別在顯微鏡下以細胞計數器計算細胞 數目’結果分析如圖二所示。 《實驗組》 檢體血液首先利用聚蔗糖細胞分離液（Fic〇11)以離心方式分離，取得 周邊血單核球細胞(PBMC)，周邊血單核球細胞以磷酸緩衝液pBS稀釋成為 每毫升一百萬個細胞(lxl〇6cdls/ml)之細胞懸浮液，加入外源凝集素⑽㈣ 並調整濃度魏4pg/ml或40μβ/ηι1，反應五分鐘後，將外源凝集素(leetin)處理 之細胞載入至上述管柱上緣，加入磷酸緩衝液pBS至一定高度後，開始以磷 I緩衝液PBS/中提5亥管柱，流速為每分鐘3毫升，細胞洗出液分別以試管收 集’每五滴細胞洗出液收集—管，每_管的細胞洗出液，分別在顯微鏡下 以細胞計數器計算細胞數目，結果分析如圖二所示。 如圖一所不，以外源凝集素(丨ectin)處理過之細胞（實驗組）比未處理之 細胞（控制組）較早被沖提出來，證實外源凝集素(以㈣和細胞產生交互作 用而改、艾細胞的表面分子，使細胞表面之親水性增加，而降低與聚苯乙稀 (pdysty麗)的交互作用，因此細胞較早被沖提出來；是以，藉由此方法可 1266631 評估並分析化學分子、核酸、蛋白質分子與細胞之交互作用。 .實巍倒1_自.皂球次瘗獲li全盤_(-—on卫· 實施例二(A) 在實施例二⑷+，所使用之分離細胞的管柱其管柱内徑(innerdiameter) · 為6毫米，管柱長度為180毫米，管柱體積為5毫升，該管柱内充填有樹脂粒 · 子，該管柱係先以磷酸緩衝液PBS沖洗，並以磷酸緩衝液pBS充滿該管柱以 備用。 白血球濃厚液以磷酸緩衝液PBS稀釋成為每毫升含有一百萬個單核球 馨 細胞(mononuclear cellS)(lxl〇6 cells/ml)之細胞懸浮液，其中仍含有一定量之 紅血球，將該細胞懸浮液載入上述管柱中，以每分鐘3毫升之流速沖提，細 胞洗出液分別以试管收集，每五滴細胞洗出液收集一管，每一管之細胞洗 出液，分別在顯微鏡下，以細胞計數器分別計算紅血球與白血球之細胞數 目’結果分析如圖三及圖四所示；圖三為紅血球之細胞數目，圖四則為白 血球之細胞數目。 因白血球的各次族群需要以不同之抗體來辨別，是以，在每一收集管 鲁 細胞洗出液内，加入αι ug之anti_CD3孑ITC、anti-CD19孑E&anti_CD14 Cy5

等與螢光物結合之抗體，以辨別T淋巴球(Tlymph〇cyte，CD3+)、B淋巴球(B 卜_〇_，CD19+)及單核球(monocyte，CDM+)，利用流式細胞儀(flow -cytometer)進行免疫螢光染色分析後，所得之各次族群的相對百分比如圖五 ， 所示。 實施例二(B) 10 1266631 於實施例二(B)中，改變分離細胞之管柱的大小，該管柱内徑(inner diameter)為8毫米，管柱長度為2〇〇毫米，管柱體積為1〇毫升；重複實施例 二(A)所述之試驗’並以每分鐘丨_2毫升之流速沖提該管柱，所得之結果如圖 六及圖七所示，圖六為為白血球之細胞數目，圖七則為白企球各次族群之 相對百分比。 由上述結果可得知，對單一族群之紅血球，該管柱並無分離之效果， 如圖三所示；對於同一檢體内的白血球，經該管柱流洗後，會有分群之現 象，如圖四及圖六所示；進一步以免疫螢光分析，該管柱對白血球之各次 族群T淋巴球(T lymphocyte)、B淋巴球(B lymphocyte)及單核球(m_cyte)具 有分群之效果，並有顯著的差異變化，如圖五及圖七所示。 管柱内徑大小及管柱長度則會些微影響分離效果，管柱直徑較小者， 分離效果較好，如圖五及圖七所示；以小管柱為例，如圖五所示，τ淋巴球 經小管柱分離後，其百分比從26% (第13個收集管）提高至39% (第24個收 集管），比較原始樣品，相對提高50% ;單核球則從25% (第13個收集管） 降至10% (第24個收集管），比較原始樣品，則相對下降約6〇% ;是以，利 用此方法，收集不同時間流洗出之細胞，可快速、有效分離白血球之各次 族群，不但可應用於一般血液細胞之分離，以提供研究之用，亦可應於臨 床上，血癌病人癌細胞之分離及去除。 本創作所提供之一種可快速且無梯度密度及無抗體使用之分離細胞的 裝置及方法，與前述引證案及其他習用技術相互比較時，更具有下列之優 1266631 i.本發明之操作程序簡單、快速’且不需使用抗體即可達分離細胞之 效果，可提供較經濟之裝置及方法，以降低研發成本。 本毛明可不需使用特定之化學藥品，即可達到分離細胞之效果，以 確保所分離之細胞的品質。 3·本發明可快速且有效的分離白血球之各次族群，且不需使用抗體， 疋以，所分離之細胞可直接供後續研發或臨床使用。 4·本發明所提供之分離細胞的裝置及方法，可用崎估並分析化學分 子核酉夂、蛋白質分子與細胞之交互作用，進而應用於藥物筛檢的 研究上。 5·本發明所提供之分離細胞的裝置及方法可作為連續式分離，可銜接 其他分析儀器做連續式或及時分析系統。 6.本發明可應用於一般血液細胞的分離提供研究之用，亦可應於臨床 血癌病人癌細胞之分離及去除。 、上列詳細說明係針對本發明之—可行實施例之具體說明，惟該實施例 並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實 施或變更，例如：管柱_大小及f柱長度，以及不同之充填粒子等變化 之等效性實施例，均應包含於本案之專利範圍中。 斤返本案不仁在使用方法上確屬創新，並能較習用裝置及方法 增進上述_效，紅充分符合新雛及進步性之法_專利要件， 爰依法提晴，懇請責局核准本件發明柳請案，以勵 德便。 執 【圖式簡單說明】 ^266631 圖一為本發明之操作及原理示意圖； 圖二為有/無外源凝集素(Iectin)處理之細胞經小管柱分離後，不同收集· 時間之細胞數目統計圖； · 圖三為白血球濃厚液經小f柱分離後，不職t日相之紅血球細胞數· 目統計圖； · 圖四為白血球濃厚液經小管柱分離後，不同收集時間之白血球細胞數 目統計圖； 圖五為經小管柱分離之白血球，其各次族群之細胞百分比統計圖；# 圖六為白血球濃厚液經大管柱分離後，不同收集時間之白血球細胞數 目統計圖； 圖七為經大管柱分離之白企球，其各次族群之細胞百分比統計圖。 【主要元件符號說明】 1分離管柱 11樹脂粒子 21未處理之細胞 φ 22樂物處理過之細胞 23某物處理過之細胞經官柱分離後，不同收集時間之細胞數目統計圖 3藥物處理 ^ 41未處理之細胞 . 42未處理之細胞經管柱分離後，不同收集時間之細胞數目統計圖 13

Claims (1)

1266631 十、申請專利範圍： 卜種可快速且無梯度密度及無抗體仙之分離細胞的裝置，包含一管柱 及該管柱充填物，該管柱侧以分離不同之細胞族群。 2.如申料魏㈣旧所叙—料料且無做密度及無抗體使用之 勿離細胞的裝置，其中該管柱之材質可為玻璃、塑膠或金屬。 3·如申請專纖圍第1顧叙—種可快速且無做密纽無抗體使用之 分離細胞的裝置，其中該管柱之形狀可為圓柱狀，該管柱可為毛細管， 該管柱直徑大小及長度可視需要而改變。 屯如申請糊_第丨狀―種可快迷且娜度密纽無抗體使用之 分離細胞的裝置，其中該管柱充填物可為樹脂㈣、聚苯乙烯 (polystyrene)或聚氯乙烯(p〇lyvinyl cW〇ride，ρν〇。 5·如申請專職圍細請叙—射㈣且無财密纽餘體使用之 刀離細胞的裝置，其中該管柱充填物可以被化學物質或特定化學官能基 所修飾。 6·如申請專·狀—種可快速且無梯度密度及無抗體使用之 緣細胞的裝置，其中該特定化學官能基可為氰基(_cn)、丙基㈣㈣）、 ^&(-phenyl) ^ ^^^^^(hydroxylapatite) > ^^#(l〇ng chain carbon) ^ 可帶正電之氨基’）、氮，氮，氮_三甲基(n(ch3)3)、氮，氮-二乙基 (Ν((^)2)氮’ i一甲基(哪灿)及可帶負電之亞硫酸根(斷）、羧基 (COCT)等。 7·如申w專她@第5項所述之—種可快速且無梯絲纽無抗體使用之 1266631 分離細胞的裝置，其中該化學物質可為糖基或胺基酸等。 8.如申請專利範㈣7所述之-種可㈣且無梯度密度及無抗體使用之分 離細胞的^置，其中雜基可為吼喃基(卿明或^夫喃基㈣响或多酷 體(polysaccharide) 〇

9.如申請專纖圍第7所述之-種可錢且鄉度密度及無抗舰用之分 離細胞的裝置，其中該胺基酸可為組成蛋白質之二十種胺基酸。 ίο.如申料纖Mi顯狀-種可快敍無梯錢纽餘體使用之 分離細胞的裝置，其中該細胞可為血液細胞，或是附著細胞㈣_ 經解離(disocciation)後呈懸浮細胞之形式。 11. 一種可快速且無梯度密度及無抗體使狀分離細胞的紋，係利用如申 請專利範圍第丨_叙-種可快速錢梯"度及餘體細之分離 細胞的褒置，將所欲分離之細胞樣品以緩衝液稀釋成為一定濃度之細胞 懸浮液後，將該細胞懸浮液注人該裝置中，再使職衝液㈣定流速沖 提該褒置，細胞洗出液以試管收集，依時間間隔或固定細胞洗出液滴數

更換收集之試管，餅触集之細錢行細胞_分離之财，以分析 所分離細胞之品質。 如申請專利範圍第Η項所述之-種可快速且無梯度密度及無抗體使用 之分離細胞的方法，其中該流速係可以自然垂流之方式，或是加一幫浦 推動，以提供穩定之流速。 13·如申料利«第11賴述之-種，速絲梯度密度及|抗體使用 之分離細胞的方法，其中該樣品之注入係可以人工或是機器自動注入之 15 1266631 方式進行。 14.如申請專利範圍第11項所述之一種可快速且無梯度密度及無抗體使用 之分離細胞的方法，其中該細胞族群分離之鑑定係可架接細胞計數器以 計數細胞數目，或架接利用流式細胞儀進行免疫螢光染色分析。

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