TWI262085B - Methods and compositions for increasing transfection efficiency of cells in vitro - Google Patents
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1262085 五、發明說明（1) ..袓..關ijfr案之交叉^^ 本案請求以澳洲專利 文件，其整内容併述於此：：：PQ 2 5 9 3 / 9 9號做為優先權 技術領邊 u "。 概略而言，本發明係 毒方法於試管内或活體入細·，特別藉非病 -步係有關輸送癌症治…酸至細胞。本發明進 發明背景 療用樂劑特別是針對膀胱癌。 儘管基因療法晚近已夕 、 的輸送入各種類型細胎夕2進展，但有效的將基因治療性 原因在於並無方法可；：：別係活體内輸送尚未能達r生 療分子，若非不可能：；：!？上足量的基因以及其它； 具有選擇滲透性屏障。吊疋困難的，原因在於細胞膜 分子成功地進入目標細， 卩，田基因或其它生物活性 或是在基因的例子中，^ ^ I此被分解、不當地被運送 ， 無法適當轉錄。 目標細胞缺乏有效輪送方法， 曰 個例子為膀胱之尿路上皮&肖if # ΐ i 土因治療上的一 膀胱癌。嶽内視鏡以及膀胱内化學治療」：：= 的進展，表淺膀胱癌仍有高復發率及侵襲率（Nsey〇 υ〇相虽 Lamm DL· ( 1 9 9 6 )Sennn 〇ncol· m6〇4)。目前，’最 成功的治療係每週滴注「活」卡介苗（BCG)至膀胱2小時取 (Morales， A·等人（1976) J· Urol·， 116: 18〇 —183 ;
Brosman, S.A. (1992) Urol. Clin. North Am., 19*
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第 6 頁 1262085 五、發明說明（2) 5 5 7 - 5 6 4 )。雖然有效，例行反應率為6 〇 — 了 〇 %，但常見例如 排尿困難、血尿、頻尿及膀胱炎等副作用，且有時非常嚴 重（Lamm DL· (1992)北美泌尿科臨床，565-572) ◦此 外’有相^數目的病人對BCG治療無反應，且常出現毒性 。探討BCG活化免疫反應的機轉，結果證實細胞激素、共 同刺激分子以及黏著分子於輔助對抗腫瘤的胞毒反應上扮 演要角（Tamguchi， K.等人（ 1 9 9 7 ) Clln. Exp. Immunol ·， ，li^: 131-5， 1999 ;Patard， J.J.等人（1998) Urol. Res·，155-9 ;Kurisu， K.等人（I 9 94 )cancer Immunol. Immunother j 3 9:24 9- 5 3 ; Sander, B 等人 ( 1 9 9 6 ) J. Urology，JL51:5 3 6 -4 1 ; CHow， Ν· H·等人 ( 1 9 98 )Ur〇l〇gy，M: 1015-9 ;jacks〇n，A.M.等人（ 1 9 9 5 )
Clin. Exp. Immunol. , : 3 6 9 - 7 5 ) ° 表；^月方脱癌具有某些4寸色使其特別有利於採用活體基因 治療’也就是腫瘤常為侷限性，治療基因可經由簡單的膀 胱内投藥而直接接觸腫瘤。此外，腫瘤對治療的反應可和 易地使用膀胱鏡及尿液細胞學來判定。成功地轉移感染^ 渡性細胞上皮的一大障礙為糖胺基聚糖層的存在，該層變 成DNA複體攝取上的顯著障礙（Ruponen，μ等人（ 1 9 9 9 )曰又 Biochim. Biophys. Acta，1415 : 331 -41 ) ° 病毒表現載體已經用來將特定基因局部導引至膀胱 (Sutton，Μ·Α·等人（ 1 9 9 7 )Ur〇l〇gy，1 73-8 0 ; Lee， S.S·荨人（1994) Cancer Res·，3325-8)。但病毒載體 於臨床上有多項限制，例如免疫原性及安全性。晚近，由
1262085 五、發明說明（3) L 1等人從事的研究，由於在人膀胱癌細胞系觀察到病毒受 體層面差異，故質疑以腺病毒為基礎的基因治療膀胱癌的 效果（Li，γ·等人（ 1 9 9 9 )Cancer Res·，”： 3 2 5 — 3 〇)。 基因治療的替代方法涉及微脂粒媒介輸送入DNA細胞 。非病毒性系統之優點為其非受體依賴型，因此可應用至 全部腫瘤。Br 1 gham等人首次報告使用陽離子性微脂粒將 DNA 輸送入組織（Brigham，LK·等人（ 1 9 8 9 )Am· j· Med.、 S c 1 : 2 7 8 - 8 1 ) ◦由於當陽離子性脂質已經為於活體 =局部或系統性輸送DNA至組織的有效載劑（Plautz，G f 等人（ 1 9 9 3 )Proc· Natl. Acad. Sci· USA，：y· 4 64 5-9·
Na=;n G.J..等人（ 1 9 9 3 )Pr〇c. NaU. Acad厂Sci· usA,^〇 • 11 ，Zhu， N·等人（1 9 9 3 )Scienee，261 · 2 0 9- 1 1 )。陽離子性微脂粒於臨床上有多種優於毒^因 優點。包括使用由簡單質體至染色體：达一糸定 庫巳圍的基因構成體，且安全性之憂慮較少。但盆 為，相較於病毒技術，其轉移感染效率相對較低。、… 如此，仍然需要有一種可提高轉移感染效率，-特別是尿 路上皮細胞之轉移感染效率 ' 胱之一般性方法。 +方法帛作為輪送藥劑至膀 發明概論 本發明提供輸送藥劑至細胞的改良方法 苔酸輸送至尿路上皮細胞。今日發 f別1將承 .^ 〜兄便用增溶的膽固醇作 為〜加劑可提升與陽離子性脂質、陽離子性 體複合之D N A的轉移感染效率。較佳地 。" 人千竿乂仏地，膽固醇係使用環
1262085
五、發明說明（4: 糊精’較佳為曱基-/9 -環糊精來、、六 木 g >谷。雖妙 管试驗或活體試驗轉移感染尿敗 …、特佳係用於試 吩上皮細偷，1 -感染方法可應用於轉移感染多種A ^ 本發明之轉移 溶膽固醇對與陽離子性脂質、陽 ^蜗型。此外，增 1污離子性平人心 合之D N A進入尿路上皮細胞的提升力文果 Ό物或樹狀體複 内輸送而將其它類型之藥劑輸送至^尿’可應用至藉膀胱 於試管試驗或活體試驗中。 上皮細胞，不論是 種或多種聚罐至細胞。該方法:方法’以轉移感 染 因此，在一特徵方面，本發明提供 酸與（i i)陽離子性脂質、陽離子性妓:匕含將（1 )聚核苷 合，以及（i i i )增溶的膽固醇製劑組人-物或彳对狀體或其組 合物，以及將轉移感染組合物施用至"纟而形成轉移感染組 轉移感染以聚核苷酸。較佳增溶的.胞，如此細胞即被 精增溶的膽固醇。較佳環糊精為甲^〜固知製劑包含以環糊 當環糊精包括α -環糊精，召—環糊二，万—環糊精。其它適 化/3 -環糊精，第三胺/3 -環糊精，ϋ，Τ —環糊精，硫酸 羥丙基-/3 -環糊精，2, 6-二〜〇_曱其乐四胺万―環糊精，2 — 万-環糊精，6-去氧-6-S- y5〜D_丰二召~裱糊精，羥乙基— 麥芽糖-庚糖，磺丁基醚nU糖吼喃糖基+硫-環 ，緩甲基-乙基十環糊精，：：：1甲基環糊精 /5-環糊精’隨機曱基—/5-環糊浐土 ,環糊精’二曱基-
及，夕牙糖基-/3-環糊精。較佳陽離子性脂質為1)〇口1^，較 佳树狀體為舒派費（S u p e r f e c t)。其它適當陽離子性脂質 及相ί 片大體包才舌DOPE ，D0TMA ，DOGS ，DODAB ，D〇DAC ，DOSPA
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第9頁 1262085 五、發明說明 -，DC-Chol，D0IC，D0PC，DMRIE，PAMAM，聚離胺酸，聚 組胺酸，聚精胺酸，聚伸乙基亞胺，聚（4 -乙烯基呲啶）， 聚（乙烯基胺），聚（4 -乙烯基-N -烷基鹵化啦啶錄），或其 組合◦該方法可用於轉移感染多種聚核苷酸，例如質體 DNA、病毒DNA、染色體片段、反訊息寡核苷酸、反訊息硫 代磷酸酯寡核苔酸、R N A分子及核糖酶（r i b ◦ z y m e s )或其組 合。 本發明之轉移感染方法較佳用於真核細胞，更佳用於哺 乳類細胞及更佳用於尿路上皮細胞。轉移感染方法可於試 管試驗進行，例如轉移感染組合物施用於培養中的細胞。 另外，該方法可經由施用轉移感染組合物至活體細胞而於 活體試驗進行。較佳具體實施例中，轉移感染組合物係藉 膀胱内輸送至個體膀胱而施用至活體尿路上皮細胞。 另一特徵方面，本發明提供一種輸送藥劑至個體尿路上 皮細胞之方法。該方法包含將藥劑與增溶的膽固醇製劑組 合而形成製劑組合物，以及經由膀胱内輸送該醫藥組合物 至個體膀胱，故藥劑被輸送至個體的尿路上皮細胞。較佳 增溶的膽固醇製劑包含使用環糊精增溶的膽固醇。較佳環 糊精為曱基_ /5 - ί展糊精。其它適當壞糊精包括α -壞糊精 ，/3 -環糊精，r -環糊精，硫酸化石-環糊精，第三胺冷― 環糊精，第四胺/3 -環糊精，2 -羥丙基-/3 -環糊精，2，6 -二-〇-曱基-/3 -環糊精，經乙基-/3 -環糊精，6 -去氧-6-S-/3-D-半乳糖咄喃糖基-6-硫-環麥芽糖-庚糠，磺丁基醚-召-環糊精，羧甲基-/5 -環糊精，羧曱基-乙基-/3 -環糊精
90103013.ptd 第10頁 1262085 五、發明說明（6) 二乙基-/5 -環糊精，二甲基-/3 -環糊精，隨機曱基-/3 -環糊精，葡萄糖基-/5 -環糊精及麥芽糖基-/3 -環糊精。較 佳具體實施例中，製劑包含（1 )至少一種聚核苷酸以及 (i 1 )陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體或其組合。 本發明之又一特徵方面係有關一種治療個體之膀胱癌之 方法。該方法包含將一種藥劑與增溶的膽固醇製劑組合而 形成治療性組合物，其中該藥劑對膀胱癌細胞具有抗癌活 性，以及藉膀胱内輸送治療組合物至個體膀胱，故個體的 膀胱癌細胞接受藥劑處理。較佳增溶的膽固醇製劑包含以 環糊精增溶的膽固醇。較佳環糊精為曱基-/5 -環糊精。其 它適當環糊精包括α -環糊精，/5 -環糊精，r -環糊精， 硫酸化石-環糊精，第三胺/5 -環糊精，第四胺/3 -環糊精 ，2 -經丙基-/3 -環糊精，2，6 -二- 0 -曱基-/3 -環糊精，羥 乙基- /3 -環糊精，6-去氧-6-S- /3 -D-半乳糖吼喃糖基-6-硫-環麥芽糖-庚糖，磺丁基醚-点-環糊精，羧曱基-/3 -環 糊精，羧曱基-乙基--環糊精，二乙基-万-環糊精，二 甲基-/5 -環糊精，隨機甲基-/?-環糊精，葡萄糖基-万-環 糊精及麥牙糖基-/5 _壞糊精。 較佳治療膀胱癌之藥劑包含至少一種聚核誓酸以及陽離 子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體，其中該聚核苷酸可 提供抗癌活性。例如聚核苔酸包含至少一種表現載體編碼 一種選自介白素、干擾素、群落刺激因子、抗血管生成因 子、抗轉移因子、膜受體及腫瘤抑制劑組成的組群之蛋白 質◦較佳蛋白質包括介白素-1(IL-1)，介白素-2(IL-2)，
90103013.ptd 第11頁 1262085 五、發明說明（7) 介白素—9(il—9)，介白素mil-⑴， 八白素-12(IL-12)，介白素—i3(IL-13)，八 18)，干擾素_α ，干擾素—厶，干擾素、τ J白素18(1 L-噬細胞群落刺激因子（GMCSF )，粒狀細胞粒狀細胞-巨 (GCSF)，巨噬細胞群落刺激因子（MCS /各放因子 )，3,抗血管新生因子，例如血管内皮：^白， (V朗拮抗劑如反訊息分子，抗轉移因= : = 織抑制劑（TIMPS)，以及提高BCG活性;f蛋白％、、且 癌 抗膀耽 膀胱處，卡介苗⑽)治療，療方法使用之較佳額外抗 提r二關轉移感染組合物。本發明 環糊精，羧甲基〜乙美 β 子性脂質、陽離子性聚合物式w至少一種聚核普酸；陽離 劑。較佳增溶的膽固醇製劑句；J狀體；及增溶的膽固醇製 。較佳環糊精為甲基環二以以環糊精增溶的膽固醇 -環糊精，/5 —環糊精，r 1 J。其它適當環糊精包括α 三胺/5-環糊精，第四胺/^精，硫酸化環糊精，第 ，2,6-…基*環二精^精，2-經丙基卞環糊精 氧mD_半乳糖吼喃糖基經乙基_ 環糊精，6一去 丁基醚-万-環糊精，羧甲基广石硫-銥麥牙糖-庚糖，磺 —環糊精，二乙基-/5-環糊精， 1262085 五、發明說明（8) .曱基-/5 -環糊精，葡萄糖基-β -環糊精及麥芽糖基-/3 -環 糊精。較佳陽離子性脂質為DOTΑΡ，而較佳樹狀體為舒派 ~費。其它適當陽離子性脂質及樹狀體包括DOPE，D0TMA， DOGS ， D0DAB ， D0DAC ， D0SPA ， DC-Choi ， D0IC ， D0PC ， DMR IE，PAM AM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸，聚伸乙 基亞胺，聚（4 -乙烯基吼啶），聚（乙烯基胺），聚（4 -乙烯 基-N -烧基鹵化吼咬1¾)，或其組合。轉移感染組合物可包 含多種聚核苷酸中之一或多者，例如質體DNA、病毒DNA、 染色體片段、反訊息寡核苷酸、反訊息硫代磷酸酯寡核苷 酸、RNA分子及核糖酶，或其組合。 發明之詳細說明 本揭示内容中，各別公開文獻、專利案及公告專利申請 案係以識別引述參照。此等公開文獻、專利案及公告專利 申請案之揭示併述於此以供更完整說明本發明之相關的業 界現況。 因此為了更方便了解本發明首先定義若干術語。 文中「轉移感染」一詞（例如「轉移感染的」、「被轉 移感染的」）係表示將聚核苷酸分子由外在位置引進細胞 内部的過程。 文中「聚核苷酸分子」一詞用於涵蓋由兩個或兩個以上 共價鍵聯結之聚核菩酸鹼基組成的分子，包括去氧核糖核 酸（DNA)分子及核糖核酸（RNA)分子。形成聚核苷酸分子之 核苷酸典型係藉填酸二酯鍵聯彼此聯結，但「聚核苷酸分 子」一詞也用於涵蓋藉其它鍵聯聯結的核苷酸，例如藉硫
90103013.ptd 第13頁 1262085 五、發明說明（9) _代磷酸酯鍵聯聯結。聚核苷酸分子之非限制性實例包括質 體DNA、病毒DNA、染色體片段、反訊息寡核苷酸、反訊息 '硫代磷酸酯、RNA分子及核糖酶。 文中「陽離子性脂質」用於表示包含至少一個及最典型 兩個脂肪酸鏈以及一個帶正電荷之極性頭基組成的分子。 典型陽離子性脂質具有十二基（C12)或十六基（錄堪基，C16) 脂肪酸鏈，但「陽離子性脂質」一詞用於也涵蓋帶有其它 長度脂肪酸鏈之脂質◦陽離子性脂質之非限制性實例包 含： D0TAP(1，2 —二醯基—3 —三曱基敍丙烧） DOPE (二油醯基石粦月旨基乙醇胺） D0TMA( [2, 3 -貳（油醯基）丙基]三甲基氯化銨 DOGS(二-十八基醯胺基甘胺醯基精胺） D 〇 D A B ( ^ —十 >臭 4 匕二 4安） D〇DAC( 十^ |漠、化^氣） 0〇3?八（2,3-二油醯基氧1-[精胺羧胺基乙基]^-二曱 基-1 -丙銨） DC-Ch〇l(3 /3[N —(n，，N’ —二甲基胺基乙院）胺基曱陳基] 膽固醇，二油醯基） D〇IC(l-[2-(油酸基氧）-乙基]-2 -油酸基-3-(2 -經乙基） 咪嗤琳4¾氯化物） 0 P C (二油睡基填脂基膽驗） DMRIE(二肉豆蔻醯基氧丙基二甲基羥乙基溴化銨） 文中「陽離子性聚合物」一詞用於表示可縮合核酸（例
90103013.ptd 第14頁 1262085 五’‘發明說明（10) 如D N A )之帶正電荷聚合物。陽離子性聚合物包括聚電解質 及陽離子性聚肽類。陽離子性聚合物之非限制性實例包括 聚離胺酸、聚組胺酸、聚精胺酸、聚伸乙基亞胺（PE I ) 、聚（4 -乙烯基咄啶）、聚（乙烯基胺）以及聚（4 -乙烯基-N -烧基鹵化吼咬f為）。 文中「樹狀體」一詞用於表示陽離子性星爆形聚合物。 此乃球狀聚合物係來自於銨中心藉多層球狀生長形成。樹 狀體之非限制性實例包括舒派費及帕碼（PAM AM )。 文中「膽固醇」一詞用於表示帶有四個稠合環的天然類 固醇（固醇），以及其與長鏈脂肪酸形成的酯以及保有調節 膜流體性的類似物。膽固醇及膽固醇酯類屬於血漿脂蛋白 之組成分及動物細胞之外細胞膜組成分，其可調節膜之流 體性。保有調節膜流體性能力之膽固醇類似物為業界已知 (例如參考 Gimpl，G·等人（1997)Biochemistry 3 6 : 1 0 9 5 - 1 0 9 74 )，包括例如5 -膽固烯、5 -孕烯-3 /?-醇-20 -酮 、4 -膽固烯-3 -酮及5 -膽固烯-3 -酮。 文中「增溶的膽固醇製劑」一詞用於表示膽固醇已經使 用可提高膽固醇的水中溶解度之增溶劑而增溶於水的膽固 醇製劑（亦即增溶的膽固醇製劑之水中溶解度係高於單獨 膽固醇之水中溶解度）。增溶劑典型為水可溶性化合物， 其有個空穴而讓親脂分子可填塞於其中。較佳增溶劑為環 糊精。膽固醇的增溶作用（例如結合入增溶劑如環糊精）可 以放射性標記膽固醇例如[1，2，6，7 - 3 H ( N )]膽固醇監視（市 面上得自杜邦/新英格蘭核公司），例如參考P a n g等人
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第15頁 1262085 五、發明說明（π) (1999) Biochemistry 38:12003-12011。「增溶膽固醇製 劑」一詞非用於表示膽固醇結合於微脂粒雙層。 文中「環糊精」一詞用於表示寡醣環狀環圈分子其具有 親水性外表面以及疏水性中央空穴，其中疏水中央空穴可 攜帶親脂物質（例如膽固醇）◦ 「環糊精」包括含具有6、7 或8葡萄糖吼喃糖單位（分別為α -、/9 -及r -環糊精）以及 更大環（已經分離出含9 - 1 3葡萄糖ϋ比喃糖單位之環糊精）之 分子，但較佳使用/5 -環糊精於本發明。「環糊精」一詞 也用於包括α -、/3 -及r -環糊精（或甚至更大環）衍生物 ，其非限制性實例包括硫酸化点-環糊精，第三胺/3 -環糊 精’第四胺yS -環糊精’ 2 -說丙基-万-環糊精，2，6 -二-〇-甲基-/3 -環糊精，經乙基-/5 -環糊精，6 _去氧-6 - S - /5 - D -半乳糖13比喃糖基-6 -硫-環麥芽糖-庚糖’續丁基鍵-/5 -環 糊精，魏曱基-yS -環糊精，敌曱基-乙基-/3 -環糊精，二 乙基-/5 -環糊精，二曱基-/3 _環糊精’隨機曱基-_環糊 精，葡萄糖基-/3 -環糊精及麥芽糖基-/3 -環糊精。較佳用 於本發明之環糊精為甲基-/?-環糊精。環糊精之結構及藥 理應用綜論於Szejtli，J. (1994) Med. Res. Reviews 1 4 : 353-386 及Rajewski，R.A.及Stella，V.J. (1996) J. Pharm. Sci. 1 1 42 - 1 1 6 9。 文中「轉移感染組合物」一詞表示由聚核苷酸，陽離子 性脂質或樹狀體，以及增溶膽固醇製劑的組合製成的組合 物。 文中「藥劑」一詞用於包括具有藥物活性之化合物，其
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第16頁 1262085 五、發明說明（12) 非限制性實例包括聚核苷酸、蛋白質、多肽、肽、化學治 療劑、抗生素等。 文中「治療性組合物」一詞用於表示經由組合至少一種 藥劑以及增溶膽固醇製劑製成的組合物，但治療性組合物 可含有額外組成分（例如額外藥劑、陽離子性脂質、樹狀 體或其它可增強治療性組合物的輸送或治療活性之組成 分）。 文中「個體」一詞用於表示需要使用藥劑處理例如需要 治療癌症如膀胱癌之活有機體。較佳個體為哺乳類。個體 例如包括人類、猴、犬、貓、小鼠、大鼠、牛、馬、山羊 及綿羊。個體也包括其它脊椎動物如魚類及鳥類（例如 雞）。 文中「抗癌活性」一詞用於表示一種直接（亦即直接作 用於癌細胞，如對癌細胞有毒的化學治療劑）或間接（例如 經由刺激對癌細胞的免疫反應）抑制癌細胞的生長、存活 或轉移的藥劑。 文中「治療」一詞用於表示緩和一或多種接受治療的疾 病症狀。 文中「治療有效量」一詞用於表示足夠達成欲治療疾病 的治療用量（例如藥劑用量）。 文中「卡介苗（BCG)治療」一詞用於表示膀胱癌之治療 方案，其中BCG係經膀胱内投藥至膀胱而刺激免疫反應。 本發明至少有部分係基於發現增溶膽固醇可用作為添加 劑俾改良細胞的轉移感染效率。膽固醇之較佳增溶劑為環
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第17頁 1262085 五、發明說明（13) 〜米月‘如甲基厶—環糊精。實驗顯示含膽固醇之甲基—召、戸 ^精本身無法改良裸DNA的轉移感染，但#合併使用展 子性脂質（D0TAP)時可提升其轉移感染。於試管試驗，2 種添加較單獨陽離子性脂質（D〇TAp)於轉移感染細胞提 3. 8倍（麥考實例n。於活體試驗，面對内腔的膀胱上 胞可成功地被轉移感染，此乃單獨使用陽離子性脂質所: 法達成的（參考實例6)。當使用的陽離子性脂質為D〇TAp “、、 時，使用D0TAP-DNA比2.7:1(重量：重量）以及D〇TAp對膽 ，醇比6: 1(重量：重量）時可獲得最佳的轉移感染。Cr〇^ 寺人使用DOTAP與膽固醇之混合物發現當使用丨.1 (重量· 重量）D0TAP :膽固醇之比時轉移感染最為理想（以〇(^等· (1998)〇61^了1^厂_5:1 37-43 )。資料指出於血清存在下， 增加膽固醇可提高轉移感染效率。但使用D〇TAp :膽固妒 的組合時，雖然C0S-7細胞可被有效轉移感染，但，鼠^ 路上皮細胞系Μ B 4 9的轉移感染極少。 曱基-/S -環糊精/膽固醇（MBC)複體可對細胞膜提供膽固 醉。雖然非意圖受任何機轉所限，但膽固醇的給予會影響 細胞膜的流體性/剛硬性及滲透性。細胞膜之膽固醇濃度 影響GPI錨定蛋白質於胞内小體（end〇s〇mes)的分類，透過 胞内小體用盡而增加蛋白質的循環（Rodal， s· κ•等人 ( 1 9 9 9 )M〇1. Biol. Cell· JJ:9 6 1 — 74 ) °D〇TAP/ 曱基—/5- 環糊精/膽固醇（DMBC)複體提供膽固醇給DOTAP分子而影響 形成的DOTAP : DNA複體結構。顯示—環糊精可藉腸細胞 改良腺病毒之進入胞内（Croyle，Μ· A.等人（ 1 9 9 8 )Pharm.
90103013.ptd 第18頁 1262085 五、發明說明（14)
Res.珏：1 3 8 4 - 1 3 5 5 )。攝取改良有助於環糊精摧 r : Ϊ : ί用的環糊精皆未載有膽固#。僅使用甲又: =壞醇包裝的環糊精用於提高藉本發明提= 矛夕感^效率的重要性。 I晚Ϊ研究中，Ζ^η6Γ及其同仁分析陽離子性脂質媒介的 基因輸送機轉，證實質體DNA由胞質移動至胞核為成功1 因移轉的限制性因素（Zabner， j等人（1 9 9 5 )】β•力基
Chei，l〇:1 8 9 97_ 9 0 0 7 )。本發明中，發現雖然含膽固 醇可提升轉移感染效率，但對質體DNA由細胞的攝取變 極小。但發現使用DMBC，質體DNA出現於細胞核（泉考^曰例 4)，意味著含括DMBC對DNA由胞内小體脫逃扮演 貝 色，或許避免於溶小體内分解。 本系統中，轉移感染後的基因於尿路上皮細胞表現於活 體内可觀察得轉移感染長達1個月時間。可能與尿路上皮 細胞於活體内的周轉率較慢有關，原因為試管試驗中基因 表現於多次細胞複製之後快速喪失。Morris，BD•等二， (J· Urol·， （1994)1^: 506-509)使用腺病毒轉移感染膀 胱，顯示基因表現明顯至少經歷7日。Harim〇t〇等人（Br. J· Urol· ( 1 9 9 8 : 8 7 0 -8 74 )使用HVJ微脂粒可觀察得基 因表現長達1 0日，以及使用單粒子搶撞擊基因表現可長達 2週。如此本發明之DMBC轉移感染系統用於活體内膀胱轉 移感染與目前偏好使用技術同等（即使非更常）持久。 細胞曝露於DMBC/DNA複體2小時顯示對細胞增生無影響
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第19頁 1262085
(Λ考Λ例5)。MBC的本身於曝露24小時後不會造成細胞辦 ^的下降，但D0TAP顯然會造成下降。但此點不農曰 五、發明說明— 户療ί :曝露的抗增生效果有利’原因在於其有助於提、 α療基因媒介的殺滅細胞腫瘤效果。研究顯示杰 =單獨使用時，對於無胸腺裸小鼠的工類；瘤：種二直 月豆具有抗腫瘤效果（Grosse，Ρ·γ.等人（1 9 9 8 )計J -植
CanCer d:U65_9)。此種效·· 出有關。 ％係/、膽固酉子由細胞流 = = ^MBC/DNA複體僅2小時，即足夠讓尿路上 &侍取大曝露於微脂粒/DNA複體，以及 (參考實例7)。報告子基因半乳糖㈣：f轉移感染 賠咏M · 土 u、p千礼糖甘酶）的表現侷限於 膀胱。M〇rris’ B.D.等人（JUr〇 1 ( 1 9 94 ) 1 5 2:5 〇6_5〇9)使 二腺病毒轉移感染膀胱也觀察得類似結果，此處此種褐限 十月況可能係由於膀胱架構而非使用的輸送系統所致。 % ί i ί轉移感染系統也顯示可於活體内有效輸送細胞 激素基因來清除腫瘤（參考實例g )。 鑑於前文說明’本發明之一特徵方面係有關轉移感染至 口 =酸至細胞之方法。如實例之進-步說明，使 用s冷膽口醇可提升聚核苷酸複合陽離子性脂 性聚合物及樹狀體等化學劑的轉移感染效果。如此於一特 ，方：：本發明提供一種轉移感染至少-種聚核；酸至細 胞之方法’该方法包含將： (i )至少一種聚核苷酸； (χ ：ί) —種陽離子性脂質、一種陽離子性聚合物或一種樹
1262085 五、發明說明U6) 狀體或其組合；以及 (111) 一種增溶膽固醇製劑 組合而形成一種轉移感染^且人 施用該轉移感染至細胞，、田D物，以及 染。 口而細胞以聚核苷酸轉移感 較佳增溶膽固醇製劑包^ /?-環糊精增溶。其它適卷 衣糊精且最佳以甲基〜 精可得自商業上來源。較精包括前文列舉者。環糊 樹狀體為舒派費。其它適先g :子性脂質為D 0 T A P。較佳 物及樹狀體包括前文列以;陽，T性脂質、陽離子性聚合 合物及樹狀體可得自商鞏决、陽離子性脂質、陽離子性聚 類試劑(1 1 )，亦即陽離；;生所轉T感染組合物可包括— 體；或另外試劑（i i)可為:貝、陽離子性聚合物或樹狀 子性聚合物的組合，或雨播"^例如陽離子性脂質與陽離 不同類型陽離子性聚合物。^型陽離子性脂質或兩種 時，較佳增溶膽固醇製H二;^試劑（1)、（11)及 離子性脂質、陽離子性τ加聚核普酸之前混合陽 溫培育-段時間例咖，然後混合物於室 各試劑用量可隨多種；成轉移感染組合物。 及種細胞類型。但最理想轉移感染= 如，陽離子性脂質（或陽離子性聚合物或樹狀體)對二 固醇之最理想比值因不同類型細胞而*，但發現於= 驗中丨：2(D0TAP ·· MBC)比對尿路上皮細胞為最理想/ y式
1M 90103013.ptd 第21頁 l262〇85 五、發明說明（17) 例之』貝或刼離子性聚合物或樹狀體）對增溶胪π 例之非限制性範圍為2:1至卜 去:岭膽固醇之比 製劑（例如曱基-石产糊_ /陷 田準備增溶膽固醇 -^ ^ ± 万—銥糊精/膽固醇或MBC)時，脑π U酉子 糊精之較佳比例為5〇毫克膽：膽固醇對環 用的特定化學劑及條件而定，此項比例可但依據使 醇對環糊精比例之非限制性範圍為至丨^里邊化。膽固 用量也可隨使用的化學劑以及欲轉移感染的。=酸 。使用的聚核誓酸（例如dNA)用量之非限制性、m受 1 0 0微克，更佳為卜5 0微克。陽離子性旨質二·至 性範圍為⑴。。微克’較们。娜克。樹 費）用量之非限制性範圍為}至3〇〇微克，較佳5 舒派 用於活體應用，各化學劑用量可能需由前述較佳數量提 高。 當DOTAP用作為陽離子性脂質時，較佳化學劑用量之 限制性實例有：7.5微克DNA + 20微克DOTAP + 40微克曱 基-/5 -環糊精增溶膽固醇。當舒派費用作為樹狀體時，化 學劑之較佳用量之非限制性實例有：2微克DNA + 22. 5微 克舒派費+ 1 〇微克甲基-/3 —環糊精增溶膽固醇。 本發明之轉移感染方法可用於轉錢染多衫同聚 酸例如質體DNA、病毋ΜΑ、&訊息募核；酸、反訊息硫代 磷酸酯寡核苔酸、RNA分子及核糖酶或其組合。用於基因 治療目的’聚核苷酸典型為編碼欲提供治療效果之表現載 體（容後詳述）。轉移感染方法較佳用於轉移感染真核細胞 1262085 五、發明說明（18) 及更佳為哺乳類細胞。轉移感染方法用於轉移感染尿路上 皮細胞特別有效，但尿路上皮細胞對多種其它轉移感染方 -法有抗性。轉移感染方法可於試管内進行，例如將轉移感 染組合物應用至培養中的細胞進行。轉移感染組合物接觸 培養中的細胞之時間可標準方法變成最理想化◦於試管内 轉移感染時間之非限制性實例為4 8小時，接著洗滌細胞 (例如使用填酸鹽緩衝鹽水洗務）。另外，轉移感染方法可 於活體進行，將轉移感染組合物活體施用至細胞。於較佳 具體實施例中，轉移感染組合物係透過膀胱内輸送（例如 經由套管輸送）至個體膀胱而活體施用至尿路上皮細胞。 其它於活體試驗之轉移感染目標組織包括例如胃、肌肉、 肺、上皮細胞、結腸、子宮、腸、心、腎、攝護腺、皮膚 、目艮、腦、陰莖組織及鼻組織。 於另一特徵方面，本發明提供一種輸送藥劑至膀胱之尿 路上皮細胞之方法，該方法係基於增溶膽固醇可提升物質 被尿路上皮細胞攝取。如此，本發明提供一種輸送一種藥 劑至個體尿路上皮細胞之方法，該方法包括： 將藥劑與一種增溶膽固醇製劑組合而形成一種醫藥組合 物；以及 膀胱内輸送該醫藥組合物至個體膀胱，因此藥劑被輸送 至個體尿路上皮細胞。 較佳增溶膽固醇製劑包含以環糊精，最佳以曱基-/3 -環 糊精增溶的膽固醇。其它適當環糊精包括前文列舉之環糊 精。藥劑例如為至少一種聚核苷酸以及陽離子性脂質、陽
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第23頁 1262085 五、發明說明（19: 離子性聚合物或樹狀 一 生素、干擾素、群落；激因子’樂劑可為化學治療劑、抗 因子、膜受體或其它罝有么抗血官新生因子、抗轉移 核、“時，較佳陽離；性：J為化學劑。當藥劑為聚 派費：其它適當陽離子性脂f ’而較佳樹狀體為 體包括前文列舉者。 、 肖子性聚合物及樹狀 古^另Γ特徵方面，本發明提供一種治疼/ 方法’遺方法包含： 療個體之膀胱癌之 將種樂劑與一種辦：宠瞻 性組合物，i巾 +日/ " 予衣剜組合而形成一種；:A瘆 刃其中該樂劑對膀胱癌細胎1女j 禋/口療 膀胱内輸送治療性組合物至個雕二有抗癌活性；以及 胞使用治療劑處理。 ^知胱，故個體膀胱癌細 較佳增溶膽固醇製劑包含 /5-環糊精增溶的膽固醇。W精’最佳使用甲基— 者。藥劑例如可為至少—種取k §裱糊精包括前文列舉 陽離子性聚合物或樹狀體。=陽離子性脂質、 。當藥劑為聚核皆酸時， 二^剑係以治療有效量輸送 車父佳樹狀體為舒派費。其它a j，子性脂質為D 0 T P A，而 合物及樹狀體包括前文列舉者陽離子性脂質、陽離子性聚 聚核苷酸較佳包含至少— 、 癌治療上具有療效的蛋白質。^現載體其編碼一種於膀胱 呈適合於欲轉移感染細胞1 =現，體包含聚核苷酸其係 表現載體包含一或多個調節=核=酸的形式，表示重組 胞類型的選擇，調節序列 ^通常係基於欲轉移感染細 ’、U操作方式聯結至欲被表現的
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1262085 五、發明說明 白素-9(IL-9)，介白素一 ii(IL-11)，介白素-12(IL-12)， 介白素-13(IL-13)，介白素-18(IL-18)，干擾素-α ，干 擾素-/3 ，干擾素〜γ ，粒狀細胞—巨噬細胞群落刺激因子 (GMCSF )，粒狀細胞群落刺激因子（gcSF )，巨噬細胞群落 刺激因子（MCSF)，熱震蛋白質（HSP)，Ρ53，抗血管新生^ 子，例如血管内皮細胞生長因子（VEGF)拮抗劑如反訊息分 子’抗轉移因子如金屬杳白酶抑制劑（T I Μ P s )，及提高β c g 活性因子如纖維蛋白膠受體、介白素、干擾素、群落刺激
因子及腫瘤抑制劑。較值欲表現的蛋白質為I L-2，GMCSF 及干擾素-γ ，及其組合（例如IL-2、GMCSF及干擾素—γ中 之至少二者）。 μ 另夕卜 ，‘劊例如可為化，于/ 口深削、抗生素、干擾辛、介 白素、群落刺激因子或其它具有治療活性劑。 素 本舍明之膀脱癌治療方法可人 治療方法。較佳其它治療方法二4種上它抗膀脱癌 之實例包括化學治療及輻射户 化療。八匕癌症治療 1一特徵方面，本發明也i供轉_片、九 之轉移感染組合物包含· 專心感染組合物。本發明 (1 )至少一種聚核苷酸； (1 i ) 一種陽離子性脂質、 其組合，以及 聚合物或樹狀體，或 θ π眾劑。 較佳增溶膽固醇製劑包含膽 /5 -環糊精增溶。其它適卷。-子Μ環糊精最佳為曱基 田衣糊精包括前文列舉者。較/
1262085 五又發明說明（22) ^ .陽離子性脂質為D0TAP，而較佳樹狀體為舒派費。盆它 當陽離子性脂質、陽離子性聚合物及樹狀體包括前文 者。本發明之轉移感染組合物可提供成包裝調配劑，例+ 其中各組分劑係提供於容器裝置。包括調配劑進一步包^ 使用轉移感染組合物轉移感染細胞的指示。 進一步藉下列實例舉例說明本發明，但非視為限制性。 下列貫例使用之特定材料及方法說明如後： 材料及方法 P C Μ V 1 a c Z係得自美國，加州，保路奥圖，康特克 (Ciontech)公司。鼠過渡細胞癌細胞系仙49係得自愛荷華 大學，Timothy Ratliff博士。胞質DNA係使用安多富利 (E n d〇f r e e )貝體快爾琴（q i a g e n)套件組（德國，快爾琴公 司）製備。富金（Fugene)係購自德國曼罕，羅氏診斷公司 ，舒派費係購自德國快爾琴公司，DEAE葡萄聚糖係購自美 國，麻里森，波密加（pr〇mega)公司，及磷酸鈣係購自德、 國，法蘭克福，默克（M e r c k )公司。 DMBC轉試驗檢定分析 2 X 1 05細胞接種於蓋玻片上置於6孔組織培養平板置於 RPMI 1 640 ’培養基補充1〇% FBS(澳洲生物科學公司） mM,L-麵^ ’50單位/毫升青黴素及〇.〇5毫克/毫升鏈黴素 (美國，蒙大拿：M'l ，聖路易，西格瑪化學公司）。細胞以、 1XPBS洗2次：，以及使用7·5微克pCMVlacZ複合20微克 D〇TAP(德國哭罕’羅氏診斷公司）及40微克曱基-/3 -環糊 精增溶膽固醇（西格瑪公司）轉移感染。複體係經由使用20
第27頁 1262085 五、發明說明（23) ，mM亥派斯（Hepes)緩衝液（美國，馬里蘭州，洛克維爾，士 伯可BRL (GibcoBRL))調整DNA及DMBC至165微升及混人^" 分鐘製造。使用RPMI 1640培養基調整至工毫升，添:"至 内經歷適當時間然後洗滌且更換3毫升新鮮⑽们拉孔 基。經48小時後’細胞以PBS洗滌、固定及如Weiss，dd^ 等人（ 1 9 9 7 ) Hum· Gene Ther· H 5 4 5- 54 所述染色。以1〇· 倍放大，相對於四個象限的細胞總數，藍色群落平均數 來決定轉移感染效率。轉移感染係以雙套且重複兩次用 行。 人運 j曾生檢定分析 增生係藉測量[14 C ]-胸腺核苷的結合而檢定分析。每 1 X 1 04細胞接種於96孔平底組織培養平板（丹麥，洛斯 來，挪克（Nunc)公司），如前述於最理想條件轉移^毕細 歷適當長度時間（曝露2小時及24小時），洗滌及於” ^ 新鮮RPMI 1 64 0共同培育。於32小時後，取出上清液，^ 胞以1XPBS洗滌。重複三孔接種〇2 we"毫升[14 腹田 Μ比活性56· 5mCl/毫莫耳；美國，德拉威州，威明頓象核 杜邦公司）經歷16小時。樣本係如Zhang，γ.等人（199了）
Int· J· Cancer η:851—7所述收穫。[14c]—胸腺核苔之廷 合係以占結合於對照細胞的百分比表示。對照細胞係由= 經轉移感染的細胞組成。非參數曼—惠特尼（Mant Whitney)!!試驗用於計算統計意義。機率值p<〇 統計上有意義。 傲优為
1262085 發明說明（24) 5-7週齡C57BL6雌小鼠經麻醉；將膀胱插管24號靜脈套 管且使用IX PBS沖洗。DMBC及DNA複體如前述混合15分鐘 。取終混合物使用1 X PBS調整至最終容積4 5 6微升方便滴 注及作膀胱内導入。評估轉移感染曝露時間丨5分鐘、3〇 分鐘、1小時或2小時。於不同時間點’膀胱以ιχ pBS沖洗 去除DNA/DMBC複體。處理後48小時犧牲小鼠。實驗係重複 進行。 組織化學 取出膀胱、肺、腎、心、肝及脾，且於液態氮中冷凍 (Werthmam，P.E.等人（ 1 9 9 6 )J. Ur〇1·匕5:53一6)。厚6微
米的冷；東切片於4 〇C於1. 25%戊二醛固定1〇分鐘，接著與 X-gal於37C共同培育4小時，以及使用血氧素 (haematoxylin)作相對染色〇 對器官進行PCR 為了偵測是否存在有轉移感染後的質體，採用丨acZ基因 獨特的PCR引子。使用的上游引子為$，— GCCGACCGCACGCCGCATCCAGC_3’（序列識別編號：丨）及下游 引子為5’ -CGCCGCGCCACTGGTGT_3’（序列識別編號：2)。 PCR係於總容積25微升進行，含有丨〇〇毫微克基因組MA，2 微升（2.5 mM)dNTPs(美國，貝佛利，新英格蘭生物實驗室 )’2.5微升（10X)反應缓衝液’各^升引子（i〇#M)Am 升（2U)TaQ聚合酶（芬蘭，伊斯普，芬展（Finnzymes))。 PCR程式如下：94t30秒，接著6『c3〇秒，及？2。〇3〇秒共 40週期。GADPH用作為PCR分析之對照。GADpH之引子
1262085
為上游引子5 -CTGCGACTTCAACAG-3,（序列識別編號：3)及 下游引子5, -CACCCTGTTGCTGTAG-3, C序列識別編號：4)。 PCR程式如下·· 94它30秒，58〇c3〇秒及72t：3〇秒共週期 。擴增後的DNA於1%瓊脂糖凝膠藉電泳分析，於紫外光下 使用乙靈溴（ethidium bromide)目測觀察。使用影像主 VDS軟體（Image master VDS software)進行密度計量掃描 ，以及使用分析影像系統軟體（加拿大，安大略省， 研究公司）分析頻帶。 ~ 轉移感染之0NPG檢定分妍 轉移感染細胞以1 X PBS洗兩次，然後使用1 5 〇微升溶解 缓衝液分解。溶解產物之蛋白質内容物藉顯微BCA蛋白質 檢定分析（美國，伊利諾州，洛克福，皮爾斯（p i e r c e ))， 使用牛血清白蛋白作為標準品。細胞蛋白質分解產物於含 4宅克/毫升0 N P G反應混合物檢定分析，及於3 7 °C培育1小 時。藉力口入5 0 0微升1 Μ碳酸鈉中止反應，及測量於4 2 0毫微 米之吸光率。 藉PCR進行胞核及胞質分析 轉移感染細胞之胞核及胞質分選之方式係使用ΤΝΕ緩衝 液（10mM Tris， pH (pH8)，lmM EDTA，l〇〇mM 氣化鈉，1% 艾吉皮可（Igepecal)溫和分解，及於冰上放置10分鐘接著 於微離心機於4 °C於7K離心5分鐘。如此獲得的上清液加標 示，胞質經過萃取及移至新鮮試管。胞核萃取物於5 0 °C使 用蛋白酶K消化（100mM氯化鈉，l〇mM Tris， pH8，0.5% SDS 25mM EDTA及0· 1毫克/毫升蛋白酶K)造粒產物隔夜處
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第30頁 1262085 發明說明（ία 理後製備。胞核DNA使用酚/氯仿萃取兩次，接著藉乙 殿◦如前述進行pCR分析。 ’儿 激素基因 #小=過渡細胞癌細胞系ΜΒ49及細胞激素基因感謝愛荷 f大學，Tlmothy Ratllff博士提供。細胞激素基因轉殖 方、P C I n e 〇表現載體波密加（p r〇m e g a )公司。質體⑽a係使 用安多萄利質體快爾琴套件組（德國，快爾琴公司） 備。 動物 C5 7/BL6雌小鼠（約4-6週齡）得自國立新加坡大學實驗動 物中心，且於大學動物維持中心養育。 i面標^A因之試管試 2 X 105細胞接種於6孔組織培養平板KRpMI 164〇，培養 基補充1 0% FIBS(澳洲生物科學公司），2mM L_麩胺，5〇單 位/毫升青黴素及0.05毫克/毫升鏈黴素（美國，蒙大拿州 ，聖路易，西格瑪化學公司）。細胞以1X pBS洗2次，及以 7· 5微克單一細胞激素基因及各3· 7 5微克細胞激素基因用 於IL-2 + GMCSF組合[其複合2〇微克D0TAP(德國曼罕，羅 氏診斷公司）及40微克曱基—石―環糊精增溶膽固醇（西格瑪 么司）]轉私感染。複體之形成方式係使用2 〇 m Μ亥派斯緩 衝液（美國，馬里蘭州，洛克維爾，吉伯可BRL)調整DNΑ及 DMBC至165微升，及混合15分鐘製造。使用RPMI 164〇培養 基調整至1毫升，添加至孔内歷2小時，然後洗滌後更換3 毫升新鮮RPMI 1 6 4 0培養基。經48小時後，細胞以pBS洗滌
1262085 五、發明說明（27) ，及固定，且以抗MHC-I，抗MHC-II及抗FAS抗體標示◦使用 的二次抗體為螢光素異硫氰酸酯（F I τ c ;美國，加州，法 明金（Phairnungen)公司）。也含括同型對照抗體。加標示 之細胞係於雙重流細胞分析儀（美國，佛羅里達州，庫特 伊皮伊來（Coulter Epics Elite)公司）分析。 3UJ田胞激素處理之抗腫瘤效果 5 X 1 05活存MB49細胞於〇· 1毫升之單一細胞懸浮液處理 前7至1 〇日皮下注入脅腹。僅選用有一致腫瘤大小約〇, 1 5 —〇 · 2 5立方厘米的小鼠，且隨機分成多組接受腫瘤内處理 。處理係每週進行兩次共計三週，藉腫瘤内注射進行，注 射包含100微升IX PBS，DMBC(D〇tap +含膽固醇之曱基化-石-環糊精），IL-2 + DMBC，GMCSF + DMBC，INFr + DMBC 或I L - 2 + G M C S F + D Μ B C的組合。年齡匹配之腫瘤對照組 未接受任何處理。於注射後前至第3 8日每3日使用卡規測 量腫瘤大小。腫瘤大子係以下式計算：長X寬X高。 jL·二細胞懸浮液及流量細胞分析 如所述收穫脾臟。單一細胞懸浮液以抗—CD4，α /5，τ 占’ Ν Κ及抗C D - 8抗體（已經結合法可艾利林 (Phycoerithrin)(PE))加標示，而CD3 +細胞係以結合至勞 光素異硫氰酸酯（F I TC)之抗體加標示。全部抗體皆係構自 美國’加州，法明金公司。標示細胞係於雙重雷射流量細 胞分析儀分析。
萃取及RT-PCR 對全部RNA萃取物，脾臟係根據製造商的指示於1毫升蔡
1262085 五、發明說明（28)
洛克維爾，吉伯可BRL -佐（Tr 1 Z0 1 )試劑（美國，馬里蘭州 )均化。RT-PCR係如所述進行。 、實例 直·非病毒化學劑之試管試驗轉 4%及14· 8% (參考 pCMVlacZ表現質體以2小時時間^私感乐效果 種化學劑之轉移感染效率。D〇TAp々MB49細胞用以評估多 内轉移感染MB49細胞，而效率分/派f可於2小時時間 下表1)。 馮20· 表1 類別 樹狀體 非微脂粗 化學品 化學品 — _____—___ 轉移感染效率 』旨質 —_ 20. 4% 14. 8% 1. 02% ------ 0°/〇 0% 非病毒劑 D0TAP 舒派費 富金 氣i化約 DEAE-葡萄聚糖 μ」二…于a奶竹π微木條件調整為最理想，俾於2小時 獲：取大轉移感染。轉移感染效率係計算使用x__gai染色 ^，色的細胞百分比。使用7· 5微克DNA及2〇微克D〇TAp獲 ^最理想的轉移感染。使用舒派費，需要遠更低量關A來 獲得如同D0TAP之轉移感染率，換言之，2微克DNA使用7.: 从升舒派費。使用萄金獲得極低轉移感染率1 . Q 2 %。氯化 每（〇-40微克）DEAE-葡萄聚糖（0-2微克）、裸DNA皆無法轉 移感染Μ B 4 9細胞。 為了改良轉移感染率，MBC恰於添加DNA之前混合
90103013.pid 第33頁 1262085 :29、 五‘發明說明
DfT:P ’、以及混合物於室溫培育1 5分鐘。添加MBC結果導致 'MR^人地被轉移感染的細胞數目的增加，如圖1A-C所述。當 日士揾口使用日寺，轉移感染效率3·9倍，併用舒派費 兩=.七圖1D)。但產生此種轉移感染效率提高之MBC 而d n里返使用的化學劑改變。最理想的D0TAP轉移感毕俜 糊微克MBC獲得，而丨◦微克對舒派費為最理想= iD()TAP + MBC (DMBC)可獲得最佳轉移感染率，故此項組 3用於全部進一步實驗。也對DMBC與習知D〇TAp :膽固萨 (1:、υ混合物（AVDC)轉移感染效率間作比較。AVDC可轉^ 感染C〇S —7細胞，但轉移感染MB49細胞並不佳。相反地;" DMBC可轉移感染MB49細胞，比較AVDC可提升c〇s —7細胞 轉移感染效果（圖1 E)。 :万-半乳糖苷酶基因表現持續時間 進行使用DMBC轉移感染後卢―半乳糖苔酶（万一gal)基因 表現之特徵化。如圖2A所示，藉〇NPG檢定分析測得蛋白柄 之表現係於化學劑移開之1小時以内發生，且提高直到轉、 移感染後4 8小時。4 8小時後，蛋白質表現穩定下降，至 移感染後1 2曰’ /5 -ga 1活性比第2曰的表現降低7倍（圖 2B)。顯然當細胞複製時，基因喪失及/或變成無聲。 i例3 :轉移感染後DNA的攝取 為了決定使用D0TAP及DMBC時DNA的攝取是否有差異，、 ’、 〉則 量轉移感染後2小時由細胞提取的質體DMA量。為了讓表 結合D N A量減至最低，且獲得真正D N A攝取量的較佳估* 使用1XPBS進行多次洗滌及使用DNAse消化。圖3A及3B ^ ^
90103013.ptd 第34頁 1262085 五、發明說明（30) 由MB4 9細胞萃取的DN A之PCR分析。MB4 9細胞使用兩種化學 劑時質體DNA進入細胞内部之數量似乎類似。因此，轉移 感染的效率觀察得的差異並非由於質體DNA的攝取差異， 或許係由於DNA —旦攝取入細胞内部後不穩定之故。 :質體DNA之胞核及胞質積聚 為了決定及侷限化DNA於使用D0TAP及DMBC轉移感染後的 侷限化，由轉移感染後的細胞準備胞核及胞質萃取物。萃 取物存在有DNA係使用PCR決定。以DMBC轉移感染的細胞， L a c Z基因係侷限於胞核及胞質部分。但單獨使用D 〇 τ a p， 質體DNA僅出現於胞質（圖4A及4B)。GADPH基因用於證實胞 核卒取物存在有胞核DNA，而胞質部分未污染胞核⑽八。 A例5 : DMBC/DNA複體的毒性 細胞增生檢定分析用來計量轉移感染劑的毒 —.......，v 一 t匕較接 ，4 8 j日守後於轉私感染及未經轉移感染細胞的增生而測 里相對毒性。細胞曝露於轉移感染劑2小時及2 4小時。暾 露於DOTAP(D)或DMBC歷2小時的轉移感染後及未經轉移感 2細胞結合的14C一胸腺核苷的濃度無差異（圖…。細胞曝 路於含或未含DNA之DMBC或曝露於⑽了^歷以小時，細 士能力又降，但不具統計意義（圖5B)。 “曰 例6 •藉知胱内滴注轉移感染劑及MA而轉移感染鼠膀肼 透過膀胱内滴注而接受轉移感染DMBC/MA之小鼠（n^6既 )’面對内腔的膀胱上皮細胞在全部小鼠皆被成功 感染（圖“及⑻。於活體内單獨D0TAP無法獲得膀胱上； 細胞的有效轉嶋。膀耽、肺、腎 '脾、心及肝也由皮轉
1262085 五、發明說明（31) 移感染的動物及對照組動物收穫，發現冷〜g a丨的染色皆為 陰性，顯示轉移感染限於膀胱，摘述於下表2。 -表2使用pCMVLacZ染色 轰2 .染色限於膀胱 器官 ___—— /5 -ga 1 活 膀胱 陽性 _ 肺 陰性 _ 肝 陰性 心 ——________1 陰性 _ 腎 陰性 _ 脾 陰性 _ 經由對2小鼠進行PCR分析（圖7 )證實。於小鼠，脾細胞 係與膀胱同時收穫，對照及轉移感染動物之CD3+，CD4 +
，CD8 +，α /5及τ占T細胞濃度係藉流量細胞計量術測 得。對照組與實驗組間未見差異。 此外，腫瘤植入小鼠膀胱，一旦建立其腫瘤，小鼠也使 用pCMVLacZ之DMBC接受膀胱内處理。表淺增生的腔％胎厗 顯示 /5-gal 染色（圖 1〇A —1〇B)。 、、、I 盾
糌1^ 對轉移感染後膀胱的影響係藉透射”顧 門何f 刀析指出使用任一種轉移感染劑曝霖2 j #护 胞有任何可區別：以：照：=，無法獲得面對内腔細
或膽固醇於積聚於* r :任，不陽離子性脂質 I /包。月方胱上皮細胞通常含有介 σΤ夕空
1262085 五、發明說明（32) ^，但處理後此種空泡數目未見增加。 ·相對於曝露於轉移感染劑時間之轉移感染效率 _為了測定以較短曝曬時間之轉移感染效率，轉移感染複 月豆（P C Μ V L a c Z · D Μ B C )施用於細胞經歷不等時間，隨後移開 及、、、田胞方；元王培養基培養4 8小時收穫及作酶分析。即使 ，移感染時間短至1 5分鐘仍可偵測得冷_ga 1活性，隨著曝 路於轉移感染劑時間的延長而增加（圖8 A )。曝露1 5分鐘與 曝路2小時間的轉移感染率差異為4. 8倍。於活體内曝露時
間愈長，則面對内腔上皮細胞被轉移感染數目愈多（圖8B )° 复^ ··於活體之基因表現時間 於小鼠’監視轉移感染後14、21及30日之/5-gal表現。 至3 0日，表現大減，但仍可偵測（圖9 A及帅）。信號的持久 性可能係由於尿路上皮細胞於活體内之周轉率低，結果導 致pCMVLacZ基因可長時間存在所致。 · D0TAP +曱基化—万—環糊精增溶膽固醇（dMBc)以及 轉移感染後細胞激素基因對M b 4 9細胞及腫瘤生長之影響之 特徵化 記基因之試管試驗表現 MB49細胞單獨及合併使用細胞激素基因轉移感染。2曰 後藉流星細胞計量術測定表現。比較未經轉移感染細胞’ 使用細胞激素轉移感染的細胞發現可表現MHC I類，MHC I I類，FAS，iCAM I，ΚΑΜ II，B71及B72之細胞比例增高 ，摘述於下表3。
90103013.ptd 第37頁 1262085
五、發明說明〔33：; 表3表面蛋白質標記基因之試管試驗表現
已確立之腫瘤内治瘙 測試本發明之轉移感染系統輸送細胞激素产 咏 的腫瘤的能力。包含D Ν Δ編碼下列細胞激夸Γ ^示已、、、二萑立 牙、5 I NΡ ύ ，GMCSF及IL-2 + GMCSF)之轉移咸毕組人私〆 7 後7-10日於帶有腫瘤小鼠之右脅腹進行腫瘤内注射。第7 日小鼠腫瘤之體積示於圖11之線圖。使用細胞激素因基治 療處理的小鼠比較未處理組&DMBC對照組驗證腫瘤生長較 慢。使用INF r (ρ=〇· 〇41) ， GMCSF (p=0.0014)4IL一2 + GMCSF (ρ = 0· 0 0 4 )轉移感染之小鼠於第38日之腫瘤體積（顯 示於圖1 2線圖）顯著較小。使用丨L— 2處理的小鼠僅驗證腫 瘤生長較緩慢。以INF r ，GMCSF及IL-2 + GMCSF處理的全 部小鼠中有3 0 %疾癒。腫瘤體積隨著時間接（第7 — 3 7日）摘 述於第1 3線圖。未處理組有一頭小鼠顯示局部緩解，但快 速減輕體重並過早死亡，提示疾病的轉移。小鼠痊癒率摘
1262085 五、發明說明（34) /述於下表4 : 表4 :疾癒率 處理 完全局部緩解 未經處理 1/10 DMBC 1/10 IL-2 1/10 INF r 3/10 GMCSF 3/10 (GMCSF + IL-2 3/9 脾細胞之細胞激素表現 於未經處理以及經過細胞激素處理之帶有腫瘤小鼠之脾 細胞的細胞激素表現比較正常（未患腫瘤）小鼠的細胞激素 表現而了解細胞激素的產量是否受影響。全部各組藉表現 IL-2，INF- r，TNF- α及GMCSF之mRNA。接受細胞激素處 理小鼠比較未經處理之、DMBC及正常（未患有腫瘤）對照組 之脾細胞之細胞激素m R N A產量全面性增高。使用G M C S F及 I L-2 + GMCSF處理小鼠比較其它細胞激素處理組顯示產生 最大量GMCSF。結果摘述於下表5 : 表5 處理組/mRNA相對於 GADPH(提高倍數） I L - 2 INF- r GMCSF TNF- a IL-2 8.4 3.21 14. 5 7. 3 GMCSF 5.6 2. 92 22. 6 5. 25 INF- r 2. 3 6. 4 10.4 7. 8
90103013.ptd 第39頁 1262085 五、發明說明（35) JL-2 + GMCSF 1.5 6.2 28 7.3 親代 1 1 1 1 ’對照 0. 1 9 1.5 1.2 0.6 DMBC 0.18 0.6 1.4 5.5 IL-2+GMCSF+INF- r 4.3 1.9 8.8 8.9 IL-2+INF- r 1.7 1. 8 0. 97 1 0.9 脾細胞之表現型特徵化 帶有表現型特異性單株抗體小鼠之脾細胞之流量細胞計 量分析顯示未處理組及DMBC處理組之CD3、CD4+及CD8含量 比正常對照組降低。帶有腫瘤的小鼠使用細胞激素基因治 療對CD3、CD4+、CD8+、NK及α /5含量而言類似正常的對 照組。結果摘述於下表6 :
90103013.ptd 第40頁 1262085 五、發明說明（36j .表6 處理 C D 4 % lc D 8 % C D 3 % N K % 未經處 1 1.89 ± 1.09 m
D Μ S C 5.32士 0.4< 0.59± 0.92 6.34± 0/ 12.7 1± L . 1 1 6 6.1 3 + 5.5 9 3 .0 4 ± 0.55 \12± 1.60 .6S± 4.9 13 I .61 ± i + 1 2 2 8.5 8 ± I .9 Ϊ 9 對照 16.81±0.94 11.7+ 0.60 j2 7 . 8 3 士 1-11 |7 4 · 1 5 土 4.59 |2 . 5 4 ± 0.32 31.2 土 5.03 I L-2 14 士 1.16 23.97±2.1 53土 4·57 2.84± 0.497 26.68± 2.53
G M C S F 17-92± 1.74 17.14土 1-73 2 2.4 2 ± 2.： 、11± 0.46 29-02± 4.52 丨L 2 22.9± 2.46 4.47± 1.34 13 ί . 1 3 ± 4 . 49.33± 2.56 12.65± 2.72 64.42± 14.4
G M C S F INF-y 21 .5 0士 1.94 15.66± 1.77 22·54± 2.62 37.86+ 3.08 2.48± 0.4753 22.86土 2.56
90103013.ptd 第41頁 1262085 五，發明說明（37) , 本貫例所述結果證實小鼠膀脱癌細胞使用單一細胞激素 基因轉移感染可誘使MHC I類、I I類及Fas表現的增高。此 '項反應讓癌細胞更具有免疫原性。由腫瘤内轉移感染實驗 發現IL-2、INFr 、GMCSF及IL-2 + GMCSF對腫瘤生長具有 類似的抑制效果。37日後，發現以INF τ、GMCSF、IL-2 + GMCSF轉移感染組比較未處理組之腫瘤大小有顯著差異。 此項資料證貫D Μ B C為試官試驗及活體試驗轉移感染尿路上 皮細胞的有效轉移感染劑。小鼠之腫瘤内研究指出藉非病 毒載體輸送細胞激素基因轉移感染尿路上皮腫瘤細胞可導 致腫瘤生長的停止。 雖然前述發明已經就若干細節舉例說明本發明以求清晰 且容易了解，但業界人士顯然易知可實施某些變化及修 改。因此，說明及實例絕非視為囿限本發明之範圍，本發 明之範圍係由隨附之申請專利範圍所闡釋。
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第42頁 1262085 五、發明說明（:38:) .序列明細
<110> LUSTRE IN\7ESTMENTS PTE LTD
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF PHARMACEUTICAL AGENTS <130> Insert docket number <140> To be assigned <141> Herewith <160> 4 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> E. Coli <400> 1 gccgaccgca cgccgcatcc age <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> E. Coli <400> 2 cgccgcgcca ctggtgt <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213 > Mouse <400> 3 ctgcgacttc aacag <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213 > Mouse <40〇> 4 caccctgttg ctgtag
90103013.ptd 第43頁 1262085 〔圖式簡單說嗯 ~~~ '~—^— ，圖1 A~1C為未轉移感染細胞或WD0TAP或0〇(:轉 相片，比較P〇macZ報告子質體之表現程度。未經=== 染細胞（圖1A)未使用X-gai染色。少數細胞使 /D0TAP轉移感染且以X-gal作陽性染色（圖1B)。^MVlacZ pCMVlacZ/DMBC轉移感染結果導致χ—⑼丨細胞數目增加 1C)。如此，於添加含膽固醇之甲基_ ( D〇TAP(D)後轉移感染效率提高。 U队）至 U柱狀圖顯示MBC對習知轉移感染劑的 i: ϊ 精(smbc)轉移感染的細胞顯示對/5 :=八色為陽性之細胞數目比單獨D0TAP或舒派費增 加。MBC不會提南裸DNA的攝取量。 、曰 柱狀圖顯示⑽此於習知D〇TAp ··膽固a 未經轉移感染細胞(⑽)細毫微米 山又，、里未頒不任何石—gal活性。AVDC可轉移感染 〇s 、，'田L，但無法有效轉移感染MB49細胞。相反地’， =轉移感細細胞以及提升 係圖為Λ狀Λ顯示pCMVLacZ基因之表現與時間之關 至以小時(圖：㈣感染後“、時出現’且穩定升高 至 才（圖2幻。細胞係如實例乙節所述轉移感染，且於 8及12日後使用0NPG檢定分析檢定分析万 性。卢—糾之表現於12日遠較低（圖2B)。 ㈣活 圖3A-3B驗證經由細胞曝露於D〇TAp(D)或⑽沉而讓⑽a進 90103013.ptcl 第44頁 1262085
圖式簡單說明 入細胞内部。LacZ基因的存在對未經轉移感毕 細胞使用PCR決定（圖3A)。GADPH用作為陽性料叩私感染 因相對GAPDH之表現係於瓊脂糖凝膠電泳 /、、 基 掃描PCR產物決定（圖3B)。 山"又外置 圖4A-4B藉PCR驗證質體DNA的局部化。園^ Δ e 1 ιυ _ 4A顯示pcr供梯 產物。LacZ基因出現於使用DMBC轉移感染的細胞匕曰 分及胞質（cy)部分’但僅出現於以D0TAP(DM|移感口 貝部分。圖4 B絲員示細胞核（N )部分及胞質（「v、立 y、 已 i貝、l γ)部分相對 GADPH之密度計量分析。 π对1 圖5 A - 5 B為柱狀圖顯示D N A : D Μ B C複體的抗增生效果 列化學劑之抗增生效果：DMBC/DNA，DOTAPoS/D二，DNA下 ，DMBC，DOTAP(D)及MBC係於曝露2小時（圖5A)及24小時 (圖5 B )後與未經處理的MB4 9細胞（C 0N )比較。經由比較 [14 C ]胸腺核苷結合於經轉移感染細胞及未經轉移感染細胞 可決定4 8小時後之相對抗增生效果。 圖6A-6B為相片顯示於活體内尿路上皮細胞之轉移感染 。經轉移感染的膀胱於2日後收穫且染色測量沒—半乳糖答 酶活性。未經轉移感染膀胱用作為陰性對照（圖6 A)。於經 轉移感染膀胱’面對空腔的上皮細胞染色為陽性（圖6 β ) 。（放大4 0倍） 圖7 f頌示於暫時性轉移感染後p c μ V 1 a c Ζ之細胞局限化。 來自未經轉移感染小鼠的器官標示為C表示對照組織。由 使用pCMV 1 acZ/DMBC複體轉移感染之小氣收穫器官標示為 DMBC。除了膀胱外，所有器官皆不存在有冷一半乳糖苷酶
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第45頁 1262085 圖式簡單說明 — .基因經過PCR證實。 圖8 A為柱狀圖顯示於試管試驗曝曬時間對轉移感染效果 的影響。於試管中細胞曝露於⑽人：DMBC複體經歷15、3〇 、6 0及1 2 0分鐘。藉使用x — ga丄染色呈陽性之細胞百分比測 量’曝露時間延長可改良轉移感染效率。 圖8Βι-8Βιν為相片顯示於活體内曝露時間對轉移感染效 果的影響。膀胱曝露於pCMVlacZ/DMBC複體經歷1)15分鐘 ，1 1 ) 3 0分鐘，丄！ ！）6 〇分鐘及i v ) 1 2 0分鐘（放大4 〇倍）。 隨著時間的經過以X — ga i染色的尿路上皮細胞增加。 圖9 A - 9 B為相片顯示於單次膀胱内滴注後，於活體内之 表現持續時間。轉移感染後2日，大部分面對内腔的細胞 皆以X-ga 1染色為陽性（圖9 A ) ^ 3 0日後於較少數細胞仍然 可觀察到/3-gal的表現（圖9B)(放大1〇〇倍）。 圖10A-10B為相片顯示正常（圖10A)及增生（圖1〇B)膀胱 切片的X g a 1染色。膀胱植入μ B 4 9腫瘤細胞之膀胱以 p C Μ V 1 a c Ζ · D Μ B C轉移感染2小時。於增生之表淺内腔細胞 層觀察得藍色染色。（放大1〇〇倍）。
圖1 1為線圖顯示使用細胞激素基因治療（IL —2，GMCSF ，IL-2 + GMCSF或IFN- r )或使用DMBC處理小鼠或未經處理 對照組小鼠於第7曰之腫瘤體積。 圖1 2為線圖頒示使用細胞激素基因治療（I ^ - 2，〇 μ c S F， IL-2 + GMCSF或IFN- r )或使用DMBC處理小鼠或未經處理對 照組小鼠於第3 8日之腫瘤體積。
圖13為線圖顯示使用細胞激素基因治療（IL —2，GM(：SF
\\312\2d-code\90-05\90103013.ptd 第46頁 1262085
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Claims (1)
1262085 « 9〇1〇3〇13 ?η〇6 ί G JUN 年月 日 修正 替換：本 A、申請專利範圍 、1 . 一種於試管内轉移感染聚核苷酸至細胞之方法，該方 法包含將： (1 )至少一種聚核苷酸； (1 1 ) 一種陽離子性脂質、一種陽離子性聚合物或一種樹 狀體或其組合；以及 (ί ί ί ) 一種包含有以一種環糊精增溶之膽固醇的增溶膽 固醇製劑 組合而形成一種轉移感染組成物；以及 施用該轉移感染組成物至細胞，因而細胞以聚核苷酸轉 移感染。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該環糊精為曱基-/9 -環糊精。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該環糊精係選自 ck - ϊ哀糊精’ /3 -壞糊精’ 7^ -壞糊精’硫酸化/5 -壞糊精’ 第三胺/3 -環糊精，第四胺/3 -環糊精，2 -經丙基-/3 -環糊 精，2，6-二-〇-曱基-yS -環糊精，經乙基環糊精，6_ 去氧-6-S- /3 -D-半乳糖吼喃糖基-6-硫-環麥芽糖-庚糖， 磺丁基醚-石-環糊精，羧曱基-/3 -環糊精，羧曱基-乙基-/3 -環糊精，二乙基-/3 -環糊精，二曱基-万-環糊精，隨 機曱基-yS -環糊精，葡萄糖基-万-環糊精及麥芽糖基-/5 -環糊精組成的組群。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中（i i)為一種陽離 子性脂質，其為DOTAP。 5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中（i i)為一種樹狀
C:\總檔\90\90103013\90103013(替換）-2.ptc 第 48 頁 1262085
-—----iJ^_90]£3£]^3 六、申請專利範圍^' -'^·_月η 修正 _種包含有以—滁Μ ^ 種&糊精抽、、办 配該聚核菩酸及陽離子=洛之膽固醇的增溶膽固醇製劑調 月豆。 月曰貝、陽離子性聚合物或樹狀 14.如申請專利範圍第工 基—/5 ~環糊精。 項之方法，其中該環糊精為甲 1 5 ·如申凊專利範圍第 自α -環糊精，点〜環糊精項之方法，其中該環糊精係選 精，第三胺/3 -環糊精，\^ —環糊精，硫酸化万-環糊 環糊精，2, 6-二-^爲第四胺/5 -環糊精，2-羥丙基-冷- 精，6-去氧-6-S- /5—]):半石〜環糊精，羥乙基—召-環糊 庚糖，磺丁基醚-石“扎糖吡喃糖基-6 -硫-環麥芽糖一 μ k糊牲 -乙基-/5 -環糊精，二乙％ ，魏曱基-/3 -環糊精，缓甲基 精，隨機曱基-点—環糊於I石-環糊精，二甲基-/3 -環糊 基- /5 -環糊精組成的級^ 葡萄糖基-/?-環糊精及麥芽糖 1 6 ·如申請專利範圍第。 質為D0TAP。 d項之方法，其中該陽離子性脂 1 7 ·如申請專利範圍第 派費。 d項之方法，其中該樹狀體為舒 1 8 ·如申请專利範圍第 質、陽離子性聚合物或抖項之方法，其中該陽離子性脂 4树狀體係選自DOPE，D0TMA， DOGS ’ D0DAB ’ D0DAC ， dospa ， DC-Choi ， dqic ， dopc ， DMR I E，P AM AM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸，聚伸乙 基亞胺，聚（4 -乙烯基π比啶），聚（乙烯基胺），聚（4 -乙烯 基-N-烷基鹵化吼啶_)，或其組合組成的組群。
(：:\總檔\9〇\90103013\90103013(替換）-2.ptc 第 50 頁 1262085 案號 90103013_年月日__ 六、申請專利範圍 ，1 9.如申請專利範圍第1 3項之方法，其中聚核苷酸為質 體DNA。 —2 0 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該聚核苷酸係 選自病毒DNA，染色體片段、反訊息寡核苷酸、反訊息硫 代磷酸酯寡核苷酸、R N A分子及核糖酶或其組合組成的組 群。 2 1 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該細胞為真核 細胞。 2 2.如申請專利範圍第2 1項之方法，其中該細胞為哺乳 類細胞。 2 3.如申請專利範圍第2 2項之方法，其中該細胞為尿路 上皮細胞。 2 4.如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該轉移感染組 成物係施用至培養中的細胞。 2 5. —種由轉移感染組成物製備使用於輸送藥劑至個體 尿路上皮細胞之藥物之方法，其中該轉移感染組成物之製 備包含： 將藥劑與一種包含有以一種環糊精增溶之膽固醇的增溶 膽固醇製劑組合而形成該轉移感染組成物。 2 6.如申請專利範圍第2 5項之方法，其中該環糊精為甲 基_ /3 •環糊精。 2 7.如申請專利範圍第2 5項之方法，其中該環糊精係選 自6K -壞糊精，/5 _壞糊精’ X -壞糊精’硫酸化/5 -壞糊 精，第三胺/3 -環糊精，第四胺々-環糊精，2 -羥丙基-/5 -
(：:\總檔\90\90103013\90103013(替換）-2.ptc 第 51 頁 1262085 修正
皇號9010J^ 六、申請專利範圍 環糊精’ 2，6 -二-〇 —甲美— 精’ 6-去氧-6-Sn^^環糊精’經乙基1〜環糊 庚糖，績丁基峻-^環糊精，幾K基-6-^環麥芽糖— -乙基-/3-環糊精，二乙基土万衣糊精，竣甲基 精，隨機甲基1環糊精，葡萄二产甲基4環糊 基—点—^糊精組成的組群。 ^ 土 衣糊精及麥芽糠 2 8 ·如申凊專利範圍第2 ^ 至少-種聚核答酸及^ :之方法’其中該藥劑包含⑴ 性聚合物或-種樹狀體匕：：離子性脂質、-種陽離』 29.如中請專利範圍第28項之°方法，其中（ 離子性脂質，其為D〇TAp。 马種％ 30·如申請專利範圍第28項之方法’其中⑴）為_種 狀體，其為舒派費。 31 ·如申4專利範圍第2 §項之方法，其中該陽離子性脂 質、陽離子性聚合物或樹狀體係逡自DOPE，D0TMA， D 0 G S ’ D 0 D A B ’ D 0 D A C，D Q s P A，D C，。h 〇 1 ’ D 0 I C ’ D 0 P C， DMRIE，PAMAM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸，聚伸乙 基亞胺’聚（4 -乙稀基p比淀），聚（乙你基胺）’聚（4 -乙稀 基-Ν -完基鹵化吼咬錄），或其組合組成的組群。 3 2 ·如申請專利範圍第2 8項之方法’其中聚核苷酸為質 體DNA 〇 3 3 ·如申請專利範圍第2 8項之方法，其中該聚核苷酸係 選自病毒DNA ’染色體片段、反訊息券核甘酸、反息疏 代磷酸酯寡核苷酸、RNA分子及核糠酶或其組合組成的組
(：:\總檔\90\90103013\90103013(替換），2.ptc 第 52 買 1262085 案號 90103013 年月曰_ifi__ 六、申請專利範圍 .群。 3 4。一種由轉移感染組成物製備使用於個體處理膀胱癌 _之藥物之方法，其中該轉移感染組成物之製備包含： 將一種藥劑與一種包含有以一種環糊精增溶之膽固醇的 增溶膽固醇製劑組合而形成一種治療性組成物，其中該藥 劑對膀胱癌細胞具有抗癌活性。 3 5.如申請專利範圍第3 4項之方法，其中該環糊精為甲 基-/3 -環糊精。 3 6.如申請專利範圍第34項之方法，其中該環糊精係選 自α -壞糊精’ yS -壞糊精’ T _壞糊精’硫酸化/5 -壞糊 精，第三胺/3 -環糊精，第四胺万-環糊精，2 -經丙基-卢-環糊精，2，6 -二- 0 -曱基-/5 _環糊精’經乙基-/3 -環糊 精，6-去氧-6-S- /3-D-半乳糖吼喃糖基-6-硫-環麥芽糖-庚糖，磺丁基醚-万-環糊精，羧曱基-/3 -環糊精，羧甲基 -乙基-yS -環糊精，二乙基-/3 -環糊精，二曱基-石-環糊 精，隨機曱基-/5 -環糊精，葡萄糖基-/3 -環糊精及麥芽糖 基--環糊精組成的組群。 3 7.如申請專利範圍第34項之方法，其中該藥劑包含（i) 至少一種聚核苷酸及（i i) 一種陽離子性脂質、一種陽離子 性聚合物或一種樹狀體或其組合。 3 8.如申請專利範圍第3 7項之方法，其中（i i)為一種陽 離子性脂質其為DOTAP。 3 9.如申請專利範圍第3 7項之方法，其中（i i )為一種樹 狀體其為舒派費。
(：:\總檔\9〇\90103013\90103013(替換）-2.ptc 第 53 頁 1262085 年 月 案號 90103013 六 申請專利範圍 4 0.如申請專利範圍第3 7項之方法，其中該陽離子性月旨 質、陽離子性聚合物或樹狀體係選自D〇pE，D〇TMA， DOGS ’ DODAB ’ DODAC ， DOSPA ， DC-Ch〇l ， DOIC ， DOPC ， DMRI E，PAM AM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸，聚伸乙 基亞胺，聚（4 -乙烯基吡啶;），聚（乙烯基胺），聚㈠-乙 基-N-烷基函化，比啶鑛），或其組合組成的組群。 41·如申請專利範圍第37項之方法，其中該聚核苔酸 含至少一種表現載體，該表現載體編碼至少一種選自介 素、干擾素、群落刺激因子、抗血管新生因子、抗轉移= 子、膜受體及腫瘤抑制劑組成的組群之蛋白質。 42·如申請專利範圍第37項之方法，其中該聚核誓酸 含一種表現載體，該表現載體編碼一 (IL —D、，介白素-川"），介白素-6(IL:6)，介白素 二二，13^ 白 Ϊ—，介白素—12(IL—12)，介白 f = 素，(IL-18)，干擾素…干擾素〜素 \ 7 ，粒狀細胞—巨噬細胞群落刺激因子 (GMCSF)，粒狀細胞群落刺激因子（Gcs 刺激因子（MCSF)，熱震蛋白質（Hsp)，p53，血洛 生長因子拮抗齊](V E G F )，全屬疋& @ 5 皮、.、田胞 ,、Α π V viLur ;至屬蛋白S每組織抑制劑（丁 I MP )， 及纖、、隹蛋白膠受體組成的組群之蛋白質。 43.如申請專利範圍第37項 貝 含-種編碼介白素—2(關之表方現V/。中該劃酸包 44·如申請專利範圍第3?項之 含-種編碼粒狀細胞—巨噬細胞’ ’中該聚核苔酸包 也群洛刺激因子（GMCSF)之表
1262085 _案號 90103013_年月日 修正 六、申請專利範圍 λ現載體。 4 5 ,如申請專利範圍第3 7項之方法，其中該聚核苷酸包 •含一種編碼干擾素-7之表現載體。 4 6.如申請專利範圍第3 7項之方法，其中該聚核苷酸包 含至少一種表現載體其編碼介白素-2 ( I L ~~ 2 )，粒狀細胞-巨噬細胞群落刺激因子（GMCSF)及干擾素-r中之二者或二 者以上。 4 7. —種轉移感染組成物，包含： (i ) 一種聚核苷酸； (1 i ) 一種陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體，或 其組合；以及 (i i i ) 一種包含有以一種環糊精增溶之膽固醇的增溶膽 固醇製劑。 48. 如申請專利範圍第47項之轉移感染組成物，其中該 環糊精為曱基-/3 -環糊精。 49. 如申請專利範圍第47項之轉移感染組成物，其中該 壞糊精係選自_壤糊精’ /5 _壞糊精’ 7^ -壤糊精’硫酸 化/?-環糊精，第三胺/3 -環糊精，第四胺/5 -環糊精，2-經丙基-yS -環糊精，2，6 -二-0 -曱基-/3 -環糊精，經乙基-万-環糊精，6-去氧-6-S- /3 -D-半乳糖吼喃糖基-6-硫-環 麥芽糖-庚糖，石黃丁基醚-/3 -環糊精，繞曱基--環糊 精，竣甲基-乙基_万-環糊精，二乙基-/S -環糊精，二甲 基- /5 -環糊精，隨機曱基-/5 -環糊精，葡萄糖基-yS -環糊 精及麥芽糖基-/5 -環糊精組成的組群。
(：:\總檔\90\90103013\90103013(替換）-2.卩1^ 第 55 頁 1262085 -—---案號 901030]^_年月曰 倏正_ 六、申請專利範圍 —5 0 ·如申請專利範圍第4 7項之轉移感染組成物，其中 (1 1 )為—種陽離子性脂質其為D〇TAp。 5 1 ·如申請專利範圍第4 7項之轉移感染組成物，其中 (1 1 )為一種樹狀體其為舒派費。 3 5 2 ·如申請專利範圍第4 7項之轉移感染組成物，其中該 陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體係選自DOPE， DOTMA ’ DOGS ’ D0DAB ， D0DAC ， D0SPA ， DC-Choi ， D0IC ， ’ DMRIE：，PAMAM，聚離胺酸，聚組胺酸，聚精胺酸， 伸乙基亞胺，聚（4 -乙烯基吼啶），聚（乙烯基胺），聚 (4乙稀基-Ν -；)：完基鹵化吼咬，編），或其組合組成的組群。 5 3 ·如申請專利範圍第4 7項之轉移感染組成物，其中聚 核苷酸為質體DNA。 & 5 4 ·如申請專利範圍第4 7項之轉移感染組成物，其中該 $核答酸係選自病毒DNA，染色體片段、反訊息募核苷 酸、反訊息硫代磷酸酯寡核苷酸、RNA分子及核糖酶或其 組合組成的組群。 、5 5.如申請專利範圍第47至54項中任一項之轉移感染組 f物’其中聚核苷酸、陽離子性脂質、陽離子性聚合物或 树狀與增溶膽固醇製劑之比例為使與該組成物接觸之細 胞可被聚核苷酸轉移感染。 、 56·如申請專利範圍第47至54項中任一項之轉移感染組 j物，其中陽離子性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體與擗 '合，f §子之比例為2 : 1至1 : 3(W/w)以及聚核苷酸與陽離子 性脂質、陽離子性聚合物或樹狀體之比例為1 : 1 1至
1262085 _案號 90103013_年月日__ 六、曱請專利範圍 ，1 :3(w/w ) ° 5 7 .如申請專利範圍第4 7、5 3或5 4項之轉移感染組成 '物，其中當（1 1 )為陽離子性脂質而為DOTAP以及該增溶膽 固醇製劑包含以曱基-/3 -環糊精增溶之膽固醇時，聚核苷 酸和陽離子性脂質和增溶膽固醇之比例為 7. 5:20:40(w/w)。 5 8 .如申請專利範圍第4 7、5 3或5 4項之轉移感染組成 物，其中當（1 1 )為樹狀體而為舒派費以及該增溶膽固醇製 劑包含以曱基-/5 -環糊精增溶之膽固醇時，聚核苷酸和樹 狀體和增溶膽固醇之比例為2 : 2 2 . 5 : 1 0 (w / w)。
匸：\總檔\90\9〇1〇3013\90103013(替換）-2.ptc 第 57 頁
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