TWI250025B

TWI250025B - Skin care composition

Info

Publication number: TWI250025B
Application number: TW089103959A
Authority: TW
Inventors: Simon Alaluf; Martin Richard Green; Gerald Patrick Mcneill; Johanathan Richard Powell; Anthony Vincent Rawlings
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 2000-03-06
Publication date: 2006-03-01
Also published as: WO2000037040A1; JP2002532531A; ATE482749T1; CN1335763A; AU1972000A; CZ20012333A3; EP1140003B2; GB9828379D0; CA2355633A1; CZ302773B6; PL200949B1; BR9916450B1; BR9916450A; AR021949A1; RU2253443C2; CA2355633C; EP1140003B1; ES2350900T5; JP4460169B2; ES2350900T3

Description

1250025 五、發明說明（1) ___ ajiiLs 本發明係關於一種施：其改進皮膚之條件及外^至人類皮膚之局部组合物及關於外觀之用途。皮膚是經由皮膚病學 s 中央加熱取暖），或經，、病，裒丨兄肆虐（風，空氣調節，敗，暴露皮膚至太陽可正常老」匕程序（時老化），受到衰用於改進皮膚之外觀及：速哀敗（光老化）。近年來，對求已大為增加。及條件之化粧組合物及化链方法之需

消費者尋求"抗老化"化粧產品其治療或延緩時老化及光老化之能見跡象諸如皺紋，細紋，鬆弛，色素沉著過度及老斑，與時倶增。 _ 除抗老化外，消費者也時常自化粧產品尋求其他利益。 ”敏性皮膚’’之觀念也已掀起消費者對化粧產品其改進敏性、乾燥、粗糙及/或鱗片皮膚之外觀及條件及以舒慰紅色、刺激及/或癢皮膚者之需求。消費者也期望化粧產品其治療斑點，丘疹，缺點等者。

用於改進皮膚之條件及外觀之皮膚照護化粧及皮膚病學組合物包含聚不德和必需脂肪酸之長鍵三甘油脂，其自由酸及其鹼或銨鹽是此技藝所熟知者。例如，英國專利GB 2 1 8 1 3 4 9 A —種由亞油酸之三甘油酯組成之組合物用於改進皮膚之光滑及彈性°Dr· August w〇lff Gmbh製造之 "Lino la Fett，f是一種商業產品供用於治療乾燥皮膚病症，及皮膚病，其含共軛亞油酸之9，1 1異構物之混合物

第7頁 1250025 五、發明說明（2) 及其他成分。 …、而’對局部施用至皮膚之替代的有治療/延緩去化化粧組合物用於細紋，鬆他，色素沉著過度及老斑，、繼續象有/如皴紋，物及化被方法，其除抗老化外，提供其需求。組合改進乾燥、舨鈥芬絆μ UL a者 ,^ 见皮膚照護諸如供及癢皮膚是特別受歡迎。保件及以舒慰刺激〇人丝已意外地發現經由施用化粧組人富含共軛亞油酴 _ .. . ^ 0物，其是特定地、职L兑油I之一種特殊異構物或

以獲得正常皮膚由於時老丁f物’至皮膚可鬆弛，色辛沉荖過声；^ 土老化堵如皺紋，細紋，片狀，紅，癢，刺激皮膚，古Ϊ 乾，粗糙，鱗· 降利戲皮膚之有效治療及預防。概要說明 … 根據本發明之第一方面， _ (a )丘4r su ^仏種局°卩組合物其包含： G ^ /或其衍生物含共軛亞油酸分，在其中至少50重量％之共輪亞、、山辦爲娃从六—· η 亞油酸及/或分疋作為順9反1 1異構物吞^在，及 (b) —種皮膚病學上可接受的媒質。此類組合物供局部施用$ ,冰用至人類皮膚供化粧性治療/預防皮膚條件選自敏紋，鬆他，氺4口 ^ 者 ^ ^ 他先知傷皮膚，敏性皮膚，乾皮膚，粗糙皮膚，鱗片狀皮膚，〜士壶 ^ ^ . ★ 皮久贗紅皮膚，刺激皮膚，瘪皮膚及老斑組成之組群是特別：田、丄 > w u 7引週用。廷些組合物也可用於施用至皮膚作為對斑點，丘疹及缺點之一種化粧治療或作為一種化粧皮膚照護產品其促進皮膚修補及/或增強膠原在皮

第8頁 1250025 五、發明說明（3) 膚中沉積。根據本發明之第二方面提供一種治療/預防皮·膚條件選自皺紋，鬆弛，光損傷皮膚，敏性皮膚，乾皮膚，粗糙皮膚，鱗片狀皮膚，紅皮膚，刺激皮膚，癢皮膚及老斑組成之組群之方法，該方法包含施用一種如以上所述之局部組合物至該皮膚。在另一方面，本發明提供共軛亞油酸及/或其衍生物含共軛亞油酸分之使用，於一種局部組合物中供治療/預防皮膚條件選自皺紋，鬆弛，光損傷皮膚，乾皮膚，粗糙皮膚，敏性皮膚，刺激皮膚，癢皮膚及老斑組成之組群，其中至少5 0重量％之該共軛亞油酸及/或分是作為順9反1 1異構物存在。本發明之組合物及方法於是提供抗老化利益，其獲致_促進光滑及柔軟皮膚有改進之彈性及皺紋之減少或延遲出現及老化之皮膚有改進之皮膚色澤。達成外觀，紋理及條件方面之一般改進，尤其是關於皮膚之光輝，晶瑩及一般青春外觀。本發明之組合物及方法也是有益於供舒慰及平息敏性、乾燥、粗糙、刺激、紅、鱗片狀及癢皮膚。因此本發明之方法及組合物有利地提供寬廣範圍之皮膚照護利益。用於本說明書中π治療”此詞包括減低，延緩及/或預防上述之皮膚條件諸如皺紋，老化，光損傷，乾及/或刺激皮膚及藉預防.或減低皺紋一般上增進皮膚之品質及改進其外觀及紋理及增加皮膚之撓曲性，堅實性，光滑性，柔軟

O:\61\61731.ptd 第9頁 !25〇〇25 五、發明說明（4) 一"' f生及彈性在其範圍内。根據本發明該化粧組合物及該共軛亞油酸之使用對治療皮膚其已經是在一種皺摺，老化，受光抽倫，乾爍及刺激狀況或供治療年輕皮膚以預防或減低由，於正常老化/光老化程序之那些上述衰敗改變是有用。纟田說明 1異構检jg濃之共挪凸沾祕 Μ共軛亞油酸（在此以後指稱為CLA )包含亞油酸之位置及幾何異構物之一個組群在其中可能有順及反雙鍵在位置 (6，8)，（7，9)，（8，1G)，（9，11)，（10，12)或⑴， 13)之各種組態。因此有24種不同的CLA存在。根據本發明讓.組合物之主要活性成分是該順9，反1丨（在此以後指稱為c9，tU)異構物。該自由酸之此特殊異構物有示於以下之結構式（π : 本發明也包括該自由酸之衍生物其因此包含共軛油酸分。較可取的衍生物包括衍生自該酸之羧基團之取代作用者L諸如酯類（例如視黃酯，甘油三酯，甘油單酯，甘油一酯，磷酸酯），醯胺類（例如神經醯胺），鹽類（例如鹼金屬及鹼土金屬鹽，銨鹽；及/或衍生自該α8碳鏈之取代作用者，諸如α，羥基及/或万-羥基衍生物。在甘油二酯之情況，包括CLA取代分在該甘油骨架之全部位置異構物。該甘油三_必須含至少一組CLA分。例如，在甘油骨架之該三紐可酯化位置，該第丨及第2位置可

第10頁 1250025 五、發明說明（5) 以是以C L A S旨化及被另一種脂類於位置3，或作為一種替代方式’該甘油骨架可以是被CLA於該1及3位置能化及另一種脂類於位置之醋化。請明瞭在本說明書中，無論在何處使用”共軛亞油酸,f或 n CLA"此詞時，也包括其含CLA分之衍生物在内。” CLA分,，指一種CLA衍生物之CLA脂醯基部分。 n c9 tl 1異構物加濃之CLAn意指存在於該組合物令之總 CAL(及/或CLA)分之至少50重量％是以該順9，反丨丨異構形之形態。在該組合物中合宜是該總CLA及/或CLA分之至少 70重量％及最宜是至少90重量％是以C9，tl 1異構物之形態存在。可以根據揭示於WO 97/ 1 8320中之方法製備根據本發明. 之CLA及/或其衍生物含CLA分（在其中在該組合物中該總 CLA及/或CLA分之至少50重量％是以順9，反1 1異構物之形態存在）。在以下例1中揭示一種較可取的製備方法。根據本發明是使用該活性c9 11 1異構物加濃之CLA之有效量於該局部組合物中。正常情況該活性物之量是以該組合物之介於0.00001與50重量％之量存在。更合宜該量是自 0.01至10重量％及最宜是自〇·1至5重量％以於最低成本獲致最大利益。皮膚病學上可接受的嫫皙根據本發明之組合物也包含一種皮膚病學上/化粧上可接受的媒質以作為該活性、c9 11 1異構物加濃之CLA之一種稀釋劑，分散劑或載體。該媒質可以包含常用於皮膚照

第11頁 1250025

五、發明說明（6) 護產品中之材料諸如水，液體或固體潤滑藥，化劑，溶劑，彡濕物，增稠劑，粉末，推進兩:_油’乳該媒質將通常形成該組合物之自5至99 9=T。 2 5至8 0重ϊ %，及可以，在沒有其他化粧添加且疋自形成該組合物之其餘部份。 ^之情況’ 星__擇性皮·廑有.益材_|及化粧添加劑除該活性c9 U 1異構物加濃之CLA外，也可以包豆特殊皮膚有益活性物諸如防晒劑，皮膚漂白匕〃他劑。 W，皮膚晒黑 δ亥媒為也可以另包括添加劑諸如香料，抗氧化劑，不明化劑，防腐劑…，著色劑及緩衝劑。 η 、 I吾製備方法，形錐，使用及包裝 ,

製備根據本發明之局部組合物，可以使用製備皮膚照護產品之習用方式。通常將該活性成分以習用方式加入至一種皮膚病學上可接受的載體中。可以首先將該活性成分適當地溶解或分散在欲予加入至該組合物之水或其他溶劑S 液體之一部分中。較可取的組合物是水包油型或油包水刑乳液。土該組合物可以是以習用皮膚照護產品之形態，諸如一種言’凝膠或洗液或類似物。該組合物也可以以一種所謂，，洗除”產品之形態，例如一種沐浴或淋浴凝膠，可能含一種供該活性成分之輸送系統以在沖洗期間促進附著至皮膚。該產品最宜是一種"留置”產品，一種施用至皮膚之產品不需要緊接在其施用至皮膚之後作有計劃的沖洗步

第12頁 1250025 五、發明說明（7) 驟。該組合物可以以習個壸，一個瓶營可以進膚。3至6 皮膚情況之組合物或施用器膚，及使皮膚。可作為一種為使可證，而不實例說明姐行本發明之個月後，皮，用於本發之量及其施如L用小量之用手或手指以選擇性繼 ”留置’’抑或以更便捷明限制本發明用方式以任 ’轉動球，方法每天一膚外觀方面明之方法中用頻率而定該組合物，或一種適當以一個沖洗一種”沖除” 瞭本發明，之範圍。何適當形或類似物或多次至之改進時之活性成。通常，例如自0 · 工具公布步驟，視產品而定舉列以次悲包裝’諸如在中〇需要治療之皮常成為可見，視分之濃度，使用自一個適當容器 1至5毫升至皮於及/或擦入至該組合物是配製〇之例，僅作為例

以例例證CLA之合成方法，包含（丨）c9，ti 1異構物及 tl 0 ’ c 1 2之異構物以1 : 1比之一種混合物；（2 )總cla分之 93重量％c9 til異構物，包括於本發明之組合物中之一種化合物，及（3)總CLA分之80.5重量％tlO cl2異構物，本發明之範圍之外之一種化合物。藉紅花油之高溫鹼處理製備CLA之混合異構物，產生CLA 有等量之C9，tl 1及tlO，cl2 CLA異構物。以月桂醇使用地絲菌屬念珠菌素（G e 〇 t r i c h u m C a n d i d u m )作催化劑選擇性酯化作用自該混合物分離加濃c9，11 1之CLA。水解該加

第13頁 1250025 五、發明說明（8) ，之c9 11 1 CLA及轉化成甘油三酯。於酯化作用及仗該餘留CLA自由酸是加滚u〇，cl2之cu。離 ——[LA之混合異；〆藉作匕6及加熱至8〇〜85〇c溶解，Analar Reagent，（AR)氣氧化鈉（0 · 6公斤）於6公斤之藥物級丙二醇中。冷卻該試樣及加入2公斤之紅花油。使用標準試驗規模裝置以高速攪掉於1 7 0 C迴流該混合物3小時。冷卻該反應混合物至約9 5 C ’降低該攪拌器至中間速率，及使用丨· 28〇升之35. 5%鹽酸溶解於除礦質水（8升）中和該混合物，保持溫度於約9 0 °C。任由該反應混合物沉降及除去水相。以2 χ 1升之5%AR 鹽及藉2 X 1升之除礦質水於9 〇洗滌該油相，棄除任何肥-皂狀材料。在真空下於1 〇〇。(：乾燥後CLΑ加濃之油後，排他於約5 0 C及經由貯一個ψ h a t m a η過濾器及一薄層石夕藻土助濾劑（c e 1 i f e - h y f 1 〇 - f i 11 e r a i d )之瓷漏斗系統過濾。在氣氣下於-25 C儲存該混合異構物CLA油至需用時。雜此方法製造之油之組成列於以下表1中：

第14頁 1250025 五、發明說明（9) 表1 混合CLA脂肪酸之成分(重量％) 總脂肪酸脂之相對百分率 c9，til 34.1(總 CLA 之 47%) tlO，cl—2 34.1(總 CLA 之 47%) c9，ell & clO，cl2 2.3 t9，tllt&tlO，12t 0.7 其他CLA 1.4 總CLA 72.6 16:0 7.0 16:1 0.8 18:0 2.5 18:1 13.3 —18:2(非 CLA) 3.3 其他脂肪酸 0.5

2. c9 tl 1異構物加濃之CLA之製造 (I)月桂基酯之製備

加入自紅花油（2. 0公斤）製備之CLA至2莫耳當量之月桂醇（1 —h 二醇；98%，Aldrich Chemicals 產品）連同 5· 96 公斤之除礦質水中。調節溫度至2 5 °C及加入1 % (重量/重量）之地絲菌屬念珠菌素（日本Amano Pharmaceuticals產品）與少量之水預混合，及劇烈混合。於44小時停止反應。加熱該容器至80〜90 t，排泄該水層及以除礦質水洗務該油及在真空下於100 t乾燥30分鐘。冷卻該油至5〇 t及經由貯一個Whatman過濾器及一薄層矽藻土助濾劑之曼漏斗系統過濾。 μ (I I )該加濃C 9，11 1之C L Α酯之分離

第15頁 1250025 五、發明說明（10) 藉分子蒸餾法於1 3 0 °C以每分鐘2 5〜3 5毫升移除殘餘月桂醇。該殘留物藉於1 5 8 °C以每分鐘2 5〜3 5毫升之流量蒸發粗略分離成為該月桂酯（c9，tll加濃之CLA)及自由酸（tl〇， cl 2加濃之CLA)。在該月桂基酯殘留物中任何餘留的自由酸是藉於1 7 1 °C以每分鐘3 0〜4 0毫升之流量進一步蒸餾降低。2 790克之月桂基酯殘留物是於90。〇使用33〇毫升之4M AR氩氧化鈉中和，繼以自該水相分離該油，在熱除礦質水中洗滌該油三次，另一次〇 · 1 Μ鹼洗及兩次熱水洗。如以前乾燥該加濃之月桂基酯油試樣。

(I I I )c9，tl 1加濃之CLA月桂基酯之皂化

使用AR氩氧化鈉/96%食品級乙醇皂化“，111加濃之CLA 之月桂基酯及使用AR濃鹽酸再酸化。含該加濃之cla自命脂肪酸之反應混合物是於1 0 0 °C乾燥及如以前於約5 〇 °c過濾。於1 3 2 °C以每分鐘2 5〜3 0毫升蒸發去月桂醇。為移除任何殘留月桂醇’使用S P 3 9 2米黑毛徽菌脂酶（5 %，批1 u χ 0 11 0 Ν ο ν ο Ν o r d i s k產品）酯化在在於該反應混合物中之自由醇成為脂肪酸。使用分子蒸餾法於真空1 5 5 °C下以每分鐘15〜2 0毫升將含c9 til加濃之CLA之脂肪酸自月桂基酯分離。藉以上方法製造之c9 tl 1 CLA之組成列於以下表2中：

第16頁 1250025 表2 五、發明說明（li) 典型製備方法製備之c9，til CLA 加濃之脂肪酸之組成(重量％) 總脂肪酸脂之相對百分率 c9 ， til 66.1(總 CLA 之 93%) tlO，cl2 4.1 c9，ell & clO，cl2 0.3 t9，tllt&tlO，12t 0.4 其他CLA 0.2 總CLA 71.1 16:0 1.6 16:1 _ 18:0 0.4 18:1 22.3 18:2(非 CLA) 4.5 其他脂肪酸 0.1 h_tj_Q_^cl 2異槿化加濃之CLA之分離自以上步驟（Π)之CLA自由酸是於160〜165 °C及20〜30毫升/分鐘再蒸餾以降低酯含量。藉於131它及25〜30毫升/分鐘流量蒸餾進一步降低殘留月桂醇。藉如以上步驟（丨！！）中所述供用於C9，tl 1之再酯化作用，使用SP392米黑毛黴菌脂酶’消除任何殘留月桂醇。藉如描述供用於c 9，11 1 之蒸德法移除任何月桂基酯，產生該11 〇，c 1 2加濃之 C L A ’其組成到於以下表3中：

第17頁 1250025 五、發明說明（12) 表3 典型製備方法製備之tio，C12 CLA脂肪酸之組成(重量％) 總脂肪酸脂之相對百分率 c9 ， til 一 8T~ tlO ， cl2 53.9(總 CLA 之 80.5%) c9，ell &clO，cl2 2.9 t9，tllt&tlO，12t 1.1 其他CLA 0.7 總CLA 66.9 16:0 13.6 16:1 18:0 4.6 18:1 10.3 18:2(非 CLA) 3.1 其他脂肪酸 1.5 例2 c9，tl 1 CLA甘油三酯之製備：根據例1製備之c9，tl 1加濃之CLA(55克）與5· 55克 (10.1%)之甘油（Pricerine 90 83 glycerine CP，自 Ellis and Everards)混合及加入3克（約5%)之SP392米黑毛黴菌非特異性脂酶（毛黴菌屬Meihie Ex，Novo Nordisk產品 Batch Lux 0110)。於真空下在一個迴轉蒸發器中於6〇以微小氮流失授拌該混合材料。於24小時後該自由脂肪酸量降低至12. 7%及另加入0. 15 克之甘油。於48小時後該自由脂肪酸量降低至3 · 4%及藉過濾該混合物經一薄層矽藻土超晶胞助濾劑在一個收集該 CLA甘油三酯油相之瓷漏斗過濾器上停止該反應，其組成

1250025 五、發明說明（13) 表4 甘油三酯之脂肪酸組成總脂肪酸酯之相對百分率 c9 ， til 64.9(CLA 之 93%) tlO，cl2 3.9 c9，ell & clO，cl2 0.4 t9，tllt&tlO，12t 0.6 其他CLA - 總CLA 69.8 16:0 1.7 16:1 0.9 18:0 0.5 18:1 22.4 18:2(非 CLA) 4.5 其他脂肪酸 0.2 例3

此例證明一種c9 111異構物加濃之CLA之抗老化利益。活體皮膚繼_局部視黃酸治#之後前膠原！及I可因孤 (D e c 〇 r i η )調升之域認供比較目的膠原，該主要的基質皮膚蛋白質是被知為賦予皮膚抗張強度。狄可因是一種蛋白多糖是被知為對膠原在皮膚之細胞外基質之受控及正確沉積有重要性。在此技藝中也知道膠原是狄可因在皮膚中之量隨老化及/或光損害之皮膚而顯著降低。很多研究已示知在皮膚中膠原之量是隨年齡及 /或隨增加之光損害而降低，（例如，Lavker, R.J· Ιην· Derm., (1979), 73,79-66； Griffiths et al· N. Eng. J· med.(1993) 329，530〜535)。在狄可因之情況，已示

第19頁 1250025 五、發明說明 (14)

知mRNA表現及蛋白多糖之表現在先損傷之皮膚在活體外是大為降低（BernsteUet, al. Lab. Invest.(i 99 5 ) 72， 662〜669)。這些皮膚蛋白質之量之降低於是關連皮膚之抗張強度之降低造成皺紋及鬆弛。在此技藝中，視黃酸是一種強效的抗老化活性物及誘發光損害之皮膚之皮膚修補是為所熟知。已示知皮膚以視黃

酸之内部治療後皺紋抹消及皮膚修補經由新膠原沉櫝及在皮膚中合成而發生（例如，Griffiths al. N. Eng J 託d. ( 1 993 )，32 9， 530〜535 )。藉指用視黃酸增加皮膚中膠原之量以強化皮膚基質提供抗老化/皮膚修補利益是廣被接受。前膠原I是膠原之前體。對回應一種試驗化合物施用前膠原！之增產是增加膠原膠之指標。 ΰ 一 —召募在每一外前臂有相等或接近相等程度之溫和至中度光損傷之兩組婦女。對她們提供〇 · 〇 5 %視黃酸在一種濕潤化基中（Ret inova®)及還有一種色澤相同的濕潤化膏有、相似觸感特性（Dermacare®洗液）但是沒有活性成分作為一種兼效對照劑。兩組之每一位參加者施用Re t丨n〇va®至一外如臂承無效劑（D e r m a c a r e ® )至另一外前臂。第一級每天施用這些產品至其外前臂為時14週及第二組每天施用這些^ 品至其外前臂為時28週。在這些研究終結時自每—前^之文處理區域採取兩個全厚度4毫米鈷取活組織檢查。對自參加者取下之活組織免疫組織化學分析以確證視黃峻處理對皮膚細胞外基質成分狄可因及前膠原！之表現之致應&或以然效劑處理之前臂作比較。循遵以次之程序：

第20頁 1250025 五、發明說明（15) 材料用於蠟部分之抗體稀釋緩衝劑是由三羥甲基胺基甲烷緩衝鹽溶液（TBS)，3%牛血清清蛋白，〇·〇5°/〇 Triton X - 1〇〇及0.05 %疊氮化鈉組成。用於前膠原[(胺基終端）之主要抗體疋自Chemicon International Inc. (cat# MAB 1912， rat I gGl )獲得及以稀釋1 : 800於4 t：用於蠟部分過夜，於該部分已受胰蛋白酶預處理（〇· 5毫克/毫升，25分鐘，37 °C)之後。用於狄可因之主要抗體是自Bi〇genesis(多純系兔）獲得及以稀釋1 : 8 0 0於4 °C用於蠟部分過夜。抗鼠生物素基化第二抗體是自DAK0(cat# E0 468，多純系兔）獲得，以稀釋1 : 4 0 0施用至蝶部分。抗兔生物素基化第二抗體是自Amersham(cat# RPN 1 0 04，多純系猴）獲得，以稀釋-: 1:400施用至堪部分。自Zymed (cat# 43-4322)獲得鏈黴卵白素共軛鹼性磷酸酯酶及以1 : 2 5 0 0之濃度使用。自 DAK0(cat# K597)獲得堅牢紅色原。自Sigma (cat# GHS-3)獲得Gills #3 Haemotoxylin核子對比染，過濾及不經稀釋使用。自Sigma(cat# T-7186)獲得騰蛋白酶，且載物片被置以來自DAK0(cat# C56 3 )之甘油凝膠。方法置活組織檢查之蠟部分在矽烷塗覆之載物片上及於5 5 °C 烘1 8小時。這些載物片經二甲苯及醇脫蠟及置於水中及然後移送至TBS。使用DAK0®等以圈該部分。如有需要，如為每種抗體指示，使用胰蛋白酶處理該部分以回收抗原。在需要回收抗原之情況，以胰蛋白素於0· 5毫克/毫升（S i gma

第21頁 1250025

五、發明說明（i6)

Cat# T 7186)於35 C培養該載物片25分鐘。隨後以TBS沖除（2X2分鐘）该蛋白画每。繼回收抗原後，如有需要，或否則於圈該部分後1特異性抗體結合是在-個濕室中於至/皿以第一抗體宿主血清在tbs/〇· 5%溶:^封阻溶液封阻至少2Q分鐘。排泄過量封阻溶液 :::Γ該部分乾燥 '然後以該主要抗體如以上所指示適 s地稀^在一個濕室中於4 〇c培育。隨後抗體自該部分排 T ’但未容許其乾燥。然後以TBS洗滌載物片以移除未結口之，要抗肢夂1分鐘沖繼以3次5分鐘洗-及然後與適田的第抗體（如以上指出適當地稀釋）在一個渴室中於室溫培育1:]、時。隨後自載物片排泄該抗體溶液但不容許該邛刀乾蚝。然後以TBS洗滌載物片，一次i分鐘沖繼以4X5 ^鐘洗，以移除該未結合之第二抗體。為該生物素基化以弟一抗體該部是隨後與鏈黴卵白素軛合物於37培育45分釦及然後在TBS中洗滌以移除未結合之鏈黴卵白素軛合物。添加色原後觀察顏色之發展以免過分染色。然後對比染色及裝置該部分。使用光顯微鏡檢查法藉免疫組織化學染色部分之視評估測定視黃酸（1^1：丨11(^3@)及無效劑（1)61<11^(^1^@)受處理之位置間剷膠原-I及狄可因之表現之差異。此分析確證.在局部施用視黃酸（Ret inova@)之後光損傷之皮膚中前膠原-I及狄可因兩者顯著調升，如列於以下表 5中。表5

1250025 五、發明說明（17) 視黃酸處理對活體皮盧一歷原-1久可因之表現之效應參與者總人數參與者示前膠之表現顯著增加之人數參與者示狄可因之表現顯著增加之人數第1組14週後 16 '9 10 第2組28週後 15 10 15 ------ 細胞外的基質成分前膠原-1及狄可因因此顯然是視黃酸誘發之電壓修補之可確認之指標。里於測定狄可固一在人類皮膚因纖維纟@中合成之程序主膚因纖維細胞調節之嫫皙之製備接種於通道2 (P2)之原生人類包皮母纖維細胞至12—井板中以1 0 0 0細胞/立方公分及維持於5 %二氧化碳及4 %氧之大氣中在Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)補助以1 0%胎小牛血清中為時24小時。於此時間後，以不含血清之DMEM洗滌這些細胞及然後在新鮮的不含血清之ΜΕΜ中培養為時另60小時。然後再以不含血清之隨.洗滌該母纖雉細胞>單層。加入試驗試劑及媒劑對照至這些細胞以三份在0· 4毫升/井新鮮的不含血清之⑽龍之最終容積中及培養另2 4小時。立即分析此母纖維細胞調節之媒質或在液態氮中心東及儲存供以後分析。然後數細胞數目及隨後將自小點 >可痕分析之數據標準化至細胞數目。數可Θ—•蛋白負在纖維細胞調節之媒質中之小點污為對照）或試驗試劑處理之受皮膚

1250025 五、發明說明（18) 母纖維細胞調節之媒質（m e d i u m)之試樣，是補充以2 0毫莫耳二硫蘇糖醇（2 0 0毫莫耳儲液之1 : 1 〇稀釋）及〇 . 1 %十二烷基硫酸鈉（1 0 %儲液之1 : 1 0 0稀釋），均勻混合及然後於7 5 °C 培養2分鐘。淨母纖維細胞調節之媒質，自母纖維細胞接種於10000細胞/立方公分在一個175立方公分瓶中及保持於如以上所述之不含血清之DMEM中，之一系列稀釋產生用於試驗之標準。隨後施加試驗試樣以三份至Imm〇bilon-P 輸送膜之預濕潤張，使用自Bio-Rad如製造廠商描述於說明書中之96 -井Bio-Dot Apparatus。每一井施用約200微升之媒質。任由該媒質於重力下（30分鐘）濾經該膜及在此之後以PBS( 2 0 0微升）洗滌該膜兩次。容許這些PBS洗滌於重力下（2X1 5分鐘）濾經該膜。然後連接該Bi〇-D〇t裝置至一真空歧管及於吸濾下進行一次第三及最終PBS洗滌。拆開該裝置’移出該膜及如所需快速切割然後置於封阻緩衝劑中於4 °C過夜。製備供狄可因分析之膜是以3% (w/v) BSA/0· l%(v/v)Tween 2 0在PBS中封阻。次日，該膜是以對人類狄可因之原發抗體（多純系兔；B i 〇 g e n e s i s )之1 : 1 0 0 0 0稀釋於室溫探測2小時。隨後以TBS/0· 05% Tween 2 0 ( 3 X 5分鐘）洗滌該膜及然後以抗兔ρ ( a b，）2片段 (Amersham)之1 : 1 0 0 0稀釋於室溫培養i小時。在此之後再以TBS/Tween 20(3 X 5分鐘）洗滌該Immobi ι〇η帶然後任由其在空氣中於室溫乾燥。將該經乾燥之膜包括玻璃紙中及暴硌至Molecular Dynamics storage phosphor screen 為時1 6〜1 8小時。於此時間終結時藉一台磷光影像儀

第24頁 1250025 五、發明說明（19) ~ (Molecular Dynamics Phosphorimager SF)使用 I mage Qua n tTM軟體掃描該暴露之幕。藉電腦補助之影像分析使用在ImageQuantTM中之量化工具評估點強度，標準化至細胞數目’及測定各種試劑時狄可因合成之影響與丨〇〇任思早位之媒質處理之對照值作比較。試驗以下表6示藥劑其是用於評估在人類皮膚母纖維細胞中其對狄可因合成之影響，及其施用量。為將結果正規化相對一種1 0 0任意單位之媒質處理之對照值測定該試驗物質之影響。在該表中’ ’f CLA c9，11 1，，指CLA在其中總CLA之93重量％-是c9，11 1異構物，是即，一種活性劑其是在本發明之範圍内。此是如描述於上例1中製備。在該表中，nCLA tl〇，C12"指CLA在其中總CLA之80.5重量％是1:10，cl2異構物其具結構式2如下：此劑因此是在本發明之範圍之外。其是如描述於例1中製備。 < 在該表中，” CLA混合物指該C9，tl 1異構物與該t! 〇， c 1 2異構物1 : 1比之一種混合物，在其中每種異構物是以該總CLA之47重量％存在。其是如描述於例1中製備。以’’ CLA 11 0，cl 2”及” CLA混合物”進行試驗是作為比較目的。

1250025 五、發明說明（20) 也供作比較，以視黃酸進行試驗以評估其對在人類皮膚母纖維細胞中狄可因合成作用之影響。用於這些試驗中之試劑之濃度對細胞活力沒有影響。表6 藉母纖維細胞回應以各種試驗4匕合物處理對D e c〇r i η合成處理狄可因對照(媒質） 100 CLAc9，til (10//M) 151.6±22.4(p=0.01，n=3) CLA 混合物（10//Μ) 81.5 土 4·3 CLAtlO，cl2(10//M) 99.3 士 24.8 表6中之結果指示該c9，11 1異構物加濃之CLA較該對照及較該11 0，c 1 2 C L A及該C L A在人類母纖維細胞中顯著調. 升狄可因之合成作用。 —；皮膚中狄可因之量是與皮膚之改進狀況及外觀相關連。增加皮膚中狄可因之量對膠原之受控制及正確沉積是具重要性其是與多種皮膚利益諸如皺紋消失及光損傷之皮膚之皮膚修補相關連。以視黃酸（1 # m)之比較試驗示狄可因之調升，1 3 8 土 1 4 · 0 ( p = 0 . 0 3 5，η = 4 )，如測定相對一種媒質處理之對照之 1 0 0任意單位值。出奇地，該資據因此進一步示在人類母纖維細胞中藉共軛亞油酸之c 9，11 1異構物實現之狄可因合成作用之調升之幅度超過該抗老化皮膚修補活性視黃酸者。 . 例4

O:\61\61731.ptd 第26頁 1250025 五、發明說明（21) 此例測計各種試驗化合物對十二炫基硫酸鈉（S D S )之角化細胞毒性之影響。角化細胞SDS活力試驗方法在96井板在角化細胞生長媒質（KGM)中生長角化細胞至約8 0%匯合，然後以不含氫可的松之KGM替代生長24〜48小時。然後這些細胞以十二烷基硫酸鈉（SDS)之濃度其將產生約5 0 % ( 5微克/毫升）之細胞活力者。然後加試驗化合物至這些細胞，其使用之濃度示於以下表7中。在表7中之試驗化合物nc9，tll CLA”及"tlO，C12 CLA，，是如描述於例3 中之相同化合物。該對照不含任何試驗化合物。於培養2 4 小時後移除媒質及藉Neutral Red法測定活力。以此方法: 這些細胞是在含25微克/毫升中性紅之KGM申培養3小時，在此之後移除該媒質及然後以1毫升之1%(ν/ν)乙酸，50% (v/v)乙醇萃取30分鐘單元。測定該萃取物於m2毫微米之吸收度及藉參照不含SDS或不含試驗化合物之井評估活力。獲得之結果摘錄於以下表7中：表7 試驗化合物(濃度） SDS對照之％平均 sd η SDS 5 // g/ml 對照 100.0 16.6 8 50/zMCLA c9tll + SDS 5 // g/ml 134.8 27.2 ~ ---- 8 50//MCLAtl0cl2 η- SDS 5 β g/ml 69~ —---- 16.3

第27頁 1250025 五、發明說明（22) 這些結果以5微克/毫升SDS活力值之百分率表示。該c9，11 1 CLA(本發明之範圍内之一種試劑）較諸該5微克/毫升8 03值藉一次八叩¥八與3七11(16111:-^11職1111-1(11613多重比較測定，顯著增加活力，ρ<0· 05。該11 0，cl 2 CLA (本發明之範圍以外之一種試劑）較諸該S D S對照不提升細胞活力。此方法已示知一種刺激劑之角化細胞毒性關連該劑在活體内之刺激效應（Lawrence，JN，Starkey, S., Dickson， FM Benford, DJ. Use of human and rat keratinocyte cultures to assess skin irritation potential·

Toxicol· In vitro· 10，33 1 -340 ( 1 996 ))。於是在此處- 吾人示知以"c9，tl 1 CLA1’處理顯著降低SDS對角化細胞之毒性效應及因此其有抗刺激功能，而該” 11 〇，c 1 2 CL Aπ不顯著改變SDS在這些細胞之毒性及因此其不具有抗刺激效應。 5 此例例證試驗化合物在角化細胞中誘發分化作用之能力’該刀化作用疋該私序其是生成一種成熟角質層之基本之一部分。一層成熟的角質層對皮膚之阻隔功能是有重要性及有助於防止皮膚變成乾燥及粗糙。測計角化膜（CE )生成及轉穀醯胺酶酵素之活性作為分化作用之指標。角化膜負責角質層内角膜細胞之形狀、強度及結構完整性，及轉毅醯胺酶對角化膜之正確生成是具重要性。 j化細胞分化作用試驗

1250025 五、發明說明（23) 方法細胞培養使用習用技術自少年的包皮分離人類表皮及在不含血清之角化細胞生長媒質（nKGM"; Clonetics)中生長。在全部研究中，使用第三通道角化細胞，以4 0 0 0細胞/井播種於 96井板（Costar)。在於含30微莫耳Ca2+之KGM中處理之前角化細胞是於3 7 t生長3天。在採收之前，以試驗化合物或媒劑（二甲基亞楓）單獨處理細胞4 8小時。在表8中該試驗化合物n c9，tl 1 CLAf’及n tlO，cl2 CLA，，是與以上描述於例3中者相同。 DNA量化法繼處理之後，…細胞是在磷酸鹽緩衝之鹽水中洗滌（3 X )及然後在100微升之Triton X - 100，50毫莫耳Tris/HCl pfl 8 · 0含2 0微莫耳抑胃肽及2 〇微莫耳抗纖維蛋白溶酶劑中萃取。使用Pico Green 試驗（Molecular Probes, 4849 Pichford Avenue， Eugene, Oregon， USA)完全遵照製造廠商之描述試驗此萃取物之（DNA萃取緩衝液15微升之DNA 含量。粒狀轉穀醯胺酶（t g a s e )活性繼以DNA萃取緩衝液處理之後，在新鮮緩衝液中短暫洗務這些細胞及然後以螢光Tgase基質Texas red屍胺 (Molecular Probes)培養。細胞在 15 微莫耳Texas red 屍胺在50毫莫耳，Tris/HCl pH 8_0，150毫莫耳NaCl含5毫莫耳二硫蘇糖醇，50毫莫耳CaCl2中於37 °C處理1 6小時，在

O:\61\61731.ptd 第29頁 1250025 五、發明說明（24) 条德>水中洗；^(2χ)及使用一台Cyt〇f 1㈣厂熒光儀以激發於 590宅微米及發射於知町於6 4 5毫微米測定熒光。早位/毫微克之DNA表示 T g a s e活性以煢光角化膜生成 "平估角化膜生成是藉量化餘留於該2 4井板角化細胞培養之井中之SDS不溶蛋白質。於移除該Tr丨t〇n萃取緩衝液（以上f述）後’以碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液（Sigma)pH 9. 6洗條14些井。」然後每個井以N—羥基丁二醯胺偶合至生物素r $儲料以10，克/，升溶解於DMS0中）在碳酸鹽/碳酸氫鹽缓衝液於0.1毫克/毫升（200微升/井）培養。於室溫在攪動下培養這些板60分鐘。每一井加入5〇微升之i〇% sds，1〇〇毫莫耳DTT及這些板於60 C培養另60分鐘。使用一種點污跡裝置過濾該膜（以在TBS-Tween中洗滌）至膜上（以Tg 0.5% Tween預封阻）。以鏈黴抗生物素蛋白（Zymed)稀釋 1 / 1 0 0 0於室溫小心謹慎探測該膜6 〇分鐘，洗務 (TBS-Tween)及以ECL基質（Pierce)培養2分鐘。包裹該膜於π抗滑膜π中及暴露至X -射線底片以看到該蛋白質。藉才帝描及Phoret ix分析量化點強度。結果摘錄於以下表8中\〒對測定之每種參數其結果是以該對照值之百分率表示。

O:\61\61731.ptd 第30頁 1250025

五、發明說明（25) 表8 試驗化合物(濃度） TgasT^p^ 活性(％對照）對照 100Ό 10//M“c9tll CLA” 166^^ 10//M“tl0cl2 CLA” _ *p<0. 0 1 -——-—B ==== n CE生成 (%對照） sd T 100 30 6 卜6 515* 28 6 '6 107 6 該” c 9 ’ 11 1 CL Aπ (本發明之範圍内之一種試劑）較諸該對照（僅以DMS0處理）顯著（ρ< 〇 · 〇丨）增加轉穀醯胺酶活性及 CE生成。該” tlO，cl2 CLA，，（本發明之範圍以外之一種試_ 劑）較諸該對照不提升角化細胞分化作用之此兩參數之任.· 何其一。 / 於是吾人已示知” c 9，111 CL A"顯著辩加角 it^^^^a^^^;Λ^ ” 11 0，cl 2 CLA”不顯著改變角化細胞之八化功此，而具有—種分化作用增進效應^ " c9，刀况及因此不預防乾燥及粗糙皮膚狀況及可用於於是可用於及粗糙狀況之皮膚。千β及濕潤已經在乾燥例6 以下之配方描述加入本發明之級合一適合於根據本發明之方法及用途。由型貧其是之百分率是組合物之重量百分率。…況明者外，所示

第31頁 1250025 五、發明說明（26)

重量％礦油 4 根據例之製備之CLA甘油三酯(總 CLA分之93重量％是c9，til異 1.15 構物） Brij 56* 4 Alfol 16RD* 4 三乙醇胺 0.75 丁烷-1，3-二醇 3 黃原膠 0.3 香料 qS 丁基化羥基甲笨 o.oi 1 水配成100 II * Bri j 56 是鯨蠟醇Ρ0Ε (10) —

Alfol 16RD是鯨蠟醇例7 以下之配方描述加入本發明之組合物之一種油包水型乳液其是適合用於根據本發明之方法及用途。除另行說明者外，所示之百分率是組合物之重量百分率。

1250025 五、發明說明（27) 重量％完全氫化之椰子油 9.9 根據例之製作之CL A甘油三酯(總 2 CLA分之93重量％是c9，til異構物） Bnj 92* 5 Bentone 38 0.5 1 Mg S04 7¾ 0.5 丁基化之羥基甲苯 0.01 香料 qs 水配成100

* Brij 92 是聚氧乙烯（2)油基醚以上例6及7之局部組合物，當施用至已經由老化或光瀨傷衰敗之皮膚或當施用至青年皮膚以利助預防或延缓此類衰敗改變，以改進皺摺、老化、光損傷及/或刺激皮膚之外觀兩者均提供有效的化粧治療。可以以習用方式製作這些組合物。

第33頁

Claims

1250025 案號89103959 . 年月曰修正_ 六、申請專利範圍 1. 一種局部組合物，其包含： (a) 共輛亞油酸，及/或其衍生物含共輛亞油酸分，在其中該共軛亞油酸及/或分之至少5 0重量％是作為順9反1 1 異構物存在； (b) —或多種選自於香料、抗氧化劑、不透明化劑、防腐劑、著色劑或緩衝劑的化粧添加劑；及 (c) 一種皮膚病學上可接受的媒質。 2 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其含該共軛亞油酸及/或衍生物是該組合物之0 . 0 0 0 0 1至5 0重量％。 3 .根據申請專利範圍第1項之組合物，其含該共軛亞油酸及/或衍生物是該組合物之0 . 0 1至1 0重量％。

O:\61\61731-941004.ptc 第35頁