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TWI243851B - Method of detecting ligand or ligand-like low-molecular weight compound - Google Patents

Method of detecting ligand or ligand-like low-molecular weight compound Download PDF

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TWI243851B
TWI243851B TW090102624A TW90102624A TWI243851B TW I243851 B TWI243851 B TW I243851B TW 090102624 A TW090102624 A TW 090102624A TW 90102624 A TW90102624 A TW 90102624A TW I243851 B TWI243851 B TW I243851B
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TW
Taiwan
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ligand
low
receptor gene
gene
human
Prior art date
Application number
TW090102624A
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English (en)
Inventor
Tadayoshi Taniyama
Tadahiro Nishimura
Koji Kusano
Shinji Ebara
Koichi Tachibana
Original Assignee
Hisamitsu Medical Co Ltd
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Publication date
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Description

1243851 A7 B7 五、發明説明（彳) 技術領域 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於，以導入配位體受體基因的配位體依賴 性細胞株之細胞增殖能作爲指標，檢測出配位體或擬配位 體低分子化合物之方法。 過去技術 有關免疫系統、造血系統、以及神經系統的多種配位 體（生理活性物質），已知結合於存在各功能細胞的細胞 膜上之特定受體。介著此結合，由細胞膜外的刺激傳達至 細胞內，誘發細胞的增殖或分化，維持生體的高級功能。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 至今有30種的細胞分裂素、成長因子等定性作爲配位 體。例如顆粒球群體-刺激因子（G-CSF )係由單球•巨噬 細胞、纖維芽細胞、內皮細胞等生產之成長因子。此因子 已知作用於嗜中性白血球系統前驅細胞，誘導其增殖、分 化、功能亢進，其結果可防禦生物體的病原體，且具有抗 腫瘤活性（淺野們、「實驗醫學」、7 ( 15 )，1 859- 1 865 ，1 989 )。因此期待不僅可應用於嗜中性白血球減少症、 難治性感染症、骨髓功能降低症，亦可應用於AIDS上。 又，已知間白素10 ( IL-10 )係爲由Th2細胞產生可抑 制由Th 1細胞產生的細胞分裂素之因子（石田們，「臨床 免疫」，27〔Sup pi. 16〕，97-106，1995)。又，近年 判斷此IL-1 0係由活性型B細胞、巨噬細胞、角質細胞、肥 滿細胞等種種細胞所產生。已知此可抑制單球/巨噬細胞的 MHC階級II抗原、B7 ( CD80，CD86 )之表現，對細胞連 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4- 1243851 Α7 Β7 五、發明説明（2 ) 接分子（ICAM-1 )的表現亦具有抑制作用（de Waal Malefyt et al.M J. Exp. Med.", 177, 915,1991 )。又，同時具 有抑制T細胞增殖、活性化B細胞的作用（石田們，「臨 床免疫」，27〔 Suppl. 16〕，97-106，1995)。經由此 作用IL-1 0可期待應用於自身免疫疾病（慢性關節風濕等） 、臟器移植準備、移植後的炎症性細胞分裂素引起的臟器 功能障礙、炎症性疾病等之臨床上。 且，紅血球生成素（EPO )主要由腎盂細管內皮細胞 生產，作用於前期紅血球母細胞前驅細胞、後期紅血球母 細胞前驅細胞，促進紅血球母細胞分化增殖，介由血紅素 合成的mRNA誘導，可具有促進紅血球生產等效用（平嶋 們，「實驗醫學」，7 ( 1 5), 1 85 2- 1 85 8，1 989 )，現今應用 於腎臟性貧血、難治性貧血（再生不良性貧血、不應性貧 血等）的臨床上。另一方面，血小板生成素（TP〇）主要 係由肝臟類洞內皮細胞產生，作用巨核芽系統前驅細胞、 巨核芽細胞，具有誘發由巨核細胞中生產血小板的作用（ 寺村們，「癌與化學治療法」，26(4)，42 1 -428，1 999 )， 現今期待應用於對抗癌劑投與、放射線照射、伴隨骨髓移 植的血小板減少的血小板抑制效果以及回復促進作用、急 性骨髓性白血病、再生不良性貧血、骨髓異形形成症候群 等之臨床上。 又，胰島素爲由胰臟/3細胞產生與糖尿病有深刻關連 之生理活性物質，因可與細胞膜的胰島素受體結合，使膜 透過性亢進，促進糖或胺基酸進入細胞內，抑制脂肪組織 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -5- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243851 A7 __B7_ 五、發明説明（3 ) 的脂肪分解，肌肉、肝臟中可促進肝醣、蛋白的合成（ Zawalich, W. s. et al.n Endocrinology", 1 03, 2027-2034, 1 978 )。現今日本有將近28萬人的糖尿病患正接受胰島素治療 法，其數目每年繼續增加中。 神經成長因子（NGF )係由大腦皮質與海馬所合成， 作用於交感神經或知覺神經等的末稍神經細胞，具有功能 維持或生存維持等效用（美馬們，「醫學雜誌」，26 ( 2 )，245-249，1 990 )。對於此現今被期待應用於對阿氏 癡呆型癡呆、腦缺血性疾病、末稍神經損傷等之臨床上。 對於如上述的配位體（生理活性物質），最近其基因 陸續被單離出得到基因重組型，大多數被定義爲作爲配位 體（生理活性物質）功用之肽類。 然而，對於這些肽類，極少作爲醫藥品利用，僅G-CSF或干擾素α等作臨床應用。肽類作爲醫藥品較爲困難 的原因爲，蛋白質較易被代謝，保存時間較爲短，又抗體 較易形成且較易被中和等。 欲解決這些問題，正進行篩選取代蛋白質的配位體（ 生理活性物質），可引起與此相同作用之低分子化合物（ 以下稱爲「擬配位體低分子化合物」）。然而，過去已知 的篩選方法因係使用配位體（生理活性物質）的功能細胞 者，對配位體結合於受體的訊息必須作複雜之追蹤，有著 檢測困難之問題。即，例如必須測定由功能細胞產生的物 質，或測定功能細胞內之訊息等，此極爲複雜之測定成爲 問題。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-6 - 1243851 A7 B7 五、發明説明（4 ) 因此，本發明之目的爲提供-種篩選方法，其可以簡 單方法正確地篩選配位體（生理活性物質）或與此相同功 用之低分子化合物。 發明的揭示 本發明者對於配位體（生理活性物質）的檢測方法， 進行種種的檢討結果，發現代替過去方法使用的配位體的 功能細胞，使用對於只在配位體存在下可增殖的細胞即可 ，經調查此細胞的增殖，可容易得知配位體或擬配位體物 質是否存在，便完成本發明。 即，本發明係提供一種檢測方法，其由他細胞株中分 離，導入配位體受體基因之配位體依賴性細胞株，將此於 被驗化合物的存在下進行培養，由調查此細胞增殖能力， 由被驗化合物中可檢測出配位體或擬配位體低分子化合物 〇 又，本發明又提供一種檢測方法，對於上述方法而言 ，配位體依賴性細胞株的培養，於被驗化合物與還原劑以 及/或間白素3 ( IL-3 )存在下進行，可檢測被驗化合物中 的配位體或擬配位體低分子化合物。 本發明另外又提供使用上述兩方法的試藥以及套組。 圖面簡單說明 圖1表示實施例1中對培養基中的hG-CSF濃度，與導 入hG-CSF受體基因的細胞株增殖程度之關係作調查結果圖 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243851 A7 -^^ __- ___ 五、發明説明（5 ) 〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 2表示實施例2中對培養基中的hIL-10濃度，與導入 hlL、1 0受體基因的細胞株增殖程度之關係作調查結果圖。 _ 3表示對G-CSF對依賴性細胞株增殖之還原劑的影 響。 圖4表示對G-CSF對依賴性細胞株增殖之IL-3的影響 〇 圖5表示對擬G-CSF低分子物質的G-CSF依賴性細胞株 增殖之還原劑與IL-3的影響。 圖6表示對IL-1 0依賴性細胞株增殖之還原劑的影響。 圖7表示對IL-10依賴性細胞株增殖之IL-3的影響。 圖8表示實施例8中培養基中的hEPO濃度，與導入 hEP〇受體基因的細胞株增殖程度之關係調查結果圖。 圖9表示對EP0依賴性細胞株增殖之還原劑的影響。 圖10表示對EP0依賴性細胞株增殖之IL-3的影響。 實施發明的型態 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明說明書中，所謂配位體依賴性細胞株係爲’培 養基中僅以配位體或擬配位體低分子化合物（以下稱「配 位體類」）存在時’可生長、增殖的細胞株。又’作爲擬 配位體低分子化合物，其具有任一或複數個’與表現於細 胞表面上受體作專一性結合之特性、可活性化受體之特性 ，或對於細胞內作爲訊息之特性，對於生物體具有如配位 體作用之低分子化合物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） -8 - 1243851 A7 B7 五、發明説明（6 ) 本發明所使用的配位體依賴性細胞株，於培養的細胞 株中，對應必須檢測出的配位體類，經由導入配位體受體 基因以及耐抗生素基因而調製出。 具體而言，使培養的細胞株懸濁於適當的緩衝液中後 ，加入溶解於適當溶煤的配位體受體基因與耐抗生素基因 嵌入之DNA，以公知的方法將此導入而調製。 作爲本發明所使用的培養細胞株的例子，有間白素-3 (IL-3 )依賴性老鼠細胞、例如可舉出BAF/B03(Palac1〇s， R.，et al."Cell”，41，727-734; Shi，Y·，et al·” J. Immunol·，，， 1 5 9, 5 3 1 8-5 328，1 997)。作爲懸濁此細胞的緩衝液可舉出[ PBS(30.8mM NaCl, 120.7mM KC1, 8.1mM Na2HP〇4, 1.46mM KH2P〇4, 5mM MgCh)。 又，嵌入此細胞的配位體受體基因，例如可利用下式 文獻記載的方法所得到者。 人類顆粒球群體刺激因子受體：
Larsen，Β· A·，et al.” J· Exp. Med. ”，172，1 5 5 9- 1 570， 1990 人類間白素1 0受體：
Liu, Y.，et al.” J· Immunol.”，152，1821-1829，1994” 人類紅血球生存素受體：
Jones，S，S·，et al. “ Blood，’，76，3 卜35，1990 人類血小板生成素受體：
Mignotte，V. et al.，” Genomics”，20，5-12,1994 人類胰島素受體： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -1^^. 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -9- 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 1243851 A7 ______B7_ 五、發明説明（7 )
Ebina，Y·，et al. ’’Cell，，，40，74 7-75 8，1985 人類神經成長因子受體：
Johson，D.，et al.，，Ce 11，，，47，5 45 -5 54，1986 另一方面，嵌入相同細胞的耐抗生素基因，係爲使容 易篩選出導入此配位體受體基因的細胞者，作爲此例子可 使用耐嘌哈黴素（puromycin)基因、耐潮黴素（ hygromycin)基因、耐新黴素（neomycin)基因等。這些 耐抗生素基因分別可使用由公知文獻中所記載的方法而獲 得者，但已有提供嵌入這些耐抗生素基因的質體，這些質 體中嵌入上述配位體受體基因，可作爲嵌入配位體受體基 因以及耐抗生素基因之DNA而利用。 作爲如此質體的例子，可舉出PCDNA3.1、 pcDNA3. 1/Zeo、pcDNA3. 1/Hygro、pIRESpuro 等。 嵌入此配位體受體基因以及耐抗生素基因的DNA經溶 解、導入時，使用可溶解一般DNA的溶煤，例如較佳可使 用 TE 緩衝液（10mM Tris-HCl、1 mM EDTA/pH8·0 )。 作爲培養細胞株中導入配位體受體基因以及耐抗生素 基因的方法，可利用電穿透法、EDAE葡聚糖法、脂質法、 顯微注射法等公知方法，若爲簡便且能高效率地導入基因 的方法可利用電穿透法爲佳。 此電穿透法爲，經由編碼培養細胞株與配位體受體基 因的DNA所懸濁的溶液中施於高壓脈衝，細胞株的細胞壁 上開微孔，由此可將配位體受體基因導入細胞內的方法。 具體的電穿透法之條件而言，電壓爲260至300V程度，電 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-10· 1243851 A7 B7 五、發明説明（9 ) 又，對上述配位體依賴性細胞株的培養，被檢驗化合 物之外，有還原劑以及因應必須有間白素3 ( IL-3 )存在 於培養基中爲佳。其中還原劑具有可上升培養細胞的活性 ’且促進其增殖之作用。 作爲此還原劑，雖無特別限定，但由作用面來看使用 2-氫硫乙醇、α -硫甘油等的還原劑爲佳。又，作爲培養基 中的還原劑之添加量，雖無特別限定，以1〇_6〜1(Τ3Μ程度 ，特別爲10 5〜10 4Μ程度爲佳。 又，IL-3亦具有提高培養細胞活性之作用，於本發明 方法的實施上，具有促進培養細胞增殖之效果。 作爲此IL-3，可利用除老鼠重組IL-3等的IL-3之外， 可利用含有此而爲已知的培養基亦佳，其添加量而言，作 爲IL-3爲0.01至100ng/ml程度、特別爲0.1至10ng/ml程度 爲佳。 對於配位體依賴性細胞是否增殖，例如可將配位體依 賴性細胞株於一定時間內，於存在被檢驗化合物的培養基 中進行培養，由測定此培養後的細胞數可判斷出。作爲較 佳的培養條件，5 % CCh的恆溫培養槽內，可舉出37 °C、 48小時的培養條件。又，由測定培養後的細胞數，作爲發 色基質可使用還原劑發色試劑，但其中使用雙偶氮鹽類爲 佳’特別爲 WST-1 ( 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2|^-tetrazolium monosodium salt )爲佳。 另一方面，作爲雙偶氮鹽系的電子載體，以吩嗪甲基 硫酸鹽系的電子載體爲佳，特別以組合1 -甲氧基PMS ( 1 · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -12- 1243851 A7 B7 五、發明説明（10 ) methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate )爲佳。組合這 些WST-1與1-甲氧基PMS的判斷細胞增殖用試藥套組係由 (股）同仁化學硏究所以「C e 11 c 〇 u n t i n g k i t」的形式販賣 ο 實施本發明方法時，例如利用含有下述成分（a )〜（ d )的配位體或擬配位體低分子化合物檢測用試藥或其套組 爲佳。 (a )導入配位體受體基因以及耐抗生素基因的配位 體依賴性細胞株、 (b )培養上述配位體依賴性細胞株的培養基、 (c )發色基質、 (d )電子載體 其中，成分（a )以及成分（b )係爲本發明方法所使 用的細胞株以及使其增殖的培養基，成分（c )以及成分 (d )爲檢測細胞株增殖之試藥。其中成分（b )中因應必 要可含有還原劑或IL-3亦可。 調製配位體等檢測用套組時，可適宜地含有單獨或2 種以上的上述各成分作爲試藥，最後組合而成即可。且如 上述，組合發色基質的WST-1與電子載體的1-甲氧基PMS 作爲判斷細胞增殖之試藥套組已被販賣，故可利用其代替 成分（c)以及成分（d)。 產業上可利用性 過去的檢測配位體或擬配位體低分子物質之方法，係 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -13- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243851 A7 ΒΊ___ 五、發明説明（n ) 使用配位體（生理活性物質）的功能細胞者’檢測出配位 體（生理活性物質）已與該物質的受體結合之訊息 '或其 生成物係爲必要之操作。 對於此，本發明的方法中，使用細胞中導入配位體受 體基因，使細胞表面上的生理活性物質之受體進行表現的 細胞株，但使此受體進行表現的細胞，必須有由受體的訊 息才可增殖。即，配位體（生理活性物質）或其替代化合 物必須與表現於細胞表面之受體結合才可生存。 如上述，測定系統中是否存在著配位體或擬配位體低 分子化合物，可由該細胞是否生存而作判斷，因此與過去 方法作比較，由極容易判定的細胞株之增殖，可進一步定 量地篩選大量之低分子化合物。 因此，本案發明中取代與免疫系統、造血系統、內分 泌系統、以及神經系統等相關之配位體（生理活性物質） 的低分子化合物可迅速且容易地被檢測出，因可直接作用 於系統、內分泌系統、以及神經系統中，故作爲免疫補強 劑等醫藥品的開發係極爲有用的。 實施例 下述舉出的實施例對本發明作更詳細的說明，但這些 實施例對本發明不會造成任何之限制。 實施例1 人類G - C S F依賴性細胞株的構築： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公羡） ------— -14- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 1243851 A7 ____ B7_ 五、發明説明（14 ) 嘌呤黴素（2 a g/mL )之DMEM培養基（（+ ) 1〇 % FCS 、20ng/mL重組人類G-CSF ( rh IL-10 ))，調製出細胞。 檢討細胞增殖能力時，回收導入人類IL-1 0受體基因的 細胞株（BAF/h IL-10R )，以P B S (-)洗淨後，懸濁於 DMEM培養基（（-)FCS )中，於96格培養皿中調製出5 X 104cells/well的細胞。其次各格子添加〇、o.oooi、 0.0010.01、0.1、1、10、100、l〇〇〇ng/mL 的 rh IL-10， 於5 % C〇2、37 °C下培養48小時。培養後，各格子中添加 \^丁-1/1-甲氧基？1^溶液（最終濃度爲511^，（股）同仁 化學硏究所），於CCh恆溫槽中進行呈色反應。反應後， 以4 5 0 n m波長進行測定。 其結果，導入人類IL -1 0受體基因的細胞株（b A F / h IL-10R )，添加 rh IL-10 濃度爲 0.1 至 l〇〇〇ng/mL 時，對應 添加量確認其細胞增殖.（圖2 )。即，可知本發明方法可 定量性檢測出h IL-10或擬h IL-10低分子化合物。 實施例3 對G - C S F依賴性細胞株增殖的還原劑之影響： 對於實施例1所得之導入人類G-CSF受體基因的細胞 株（BAF/hGCSFR )，於還原劑（2-氫硫乙醇）存在下對宫帛 選之影響作如下之檢討。首先’調製DMEM培養基（（—） FCS )中添加5 X 1(Τ5Μ的2-氫硫乙醇之培養基、與無添加 之培養基。這些培養基倒入96格培養皿中，以PBS (.)洗 淨的BAF/hG-CSFR，分別作5 X l〇4cell/well量作懸濁。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -17- 1243851 A7 _ _B7 五、發明説明（15 ) 再各格子中添加0、0.025、0.1、0.4、1.6、 6.4ng/mL 之 rhG-CSF，於 5 % CO:、37 t：下培養 48 小時。 培養後，各格子中添加WST-1/1-甲氧基PMS溶液（最終濃 度爲5mM，（股）同仁化學硏究所），於C〇2恆溫槽中進 行呈色反應。其結果，細胞培養時因培養基中添加還原劑 2-氫硫乙醇，使得藉由rhG-CSF的BAF/hG-CSFR的細胞增殖 呈現亢進現象。又，確認rhG-CSF濃度爲0.1、0.4、1.6、 6.4ng/mL下顯示有意差。其結果如圖3所示。 實施例4 對G-CSF依賴性細胞株增殖的IL-3之影響： 對於實施例1所得之導入人類G-CSF受體基因的細胞 株（BAF/hGCSFR )，於IL-3存在下對篩選之影響作如下 之檢討。首先，調製DMEM培養基（（-)FCS、添加2-氫 硫乙醇至最終濃度爲5 X 1(Τ5Μ )中添加老鼠重組IL-3成最 終濃度爲〇.5ng/ml之培養基、含有相同老鼠IL-3的老鼠細 胞株添加WEHI-3B培養液（WEHIsup )至最終濃度爲1.25 %之培養基、以及無添加之3種培養基。 這些培養基倒入96格培養皿中，以PBS (-)洗淨的 BAF/hG-CSFR，分別作5 X 104cell/well量作懸濁後。再各 格子中添加 〇、0.025、0.1、0.4、1·6、6.4ng/mL 之 rhG-CSF，於5 % C〇2、37 °C下培養48小時。 培養後，各格子中添加WST-1/1-甲氧基PMS溶液（最 終濃度爲5mM，（股）同仁化學硏究所），於C〇2恆溫槽 本紙張尺度適用中®國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -18 - 1243851 A7 B7 五、發明説明（16 ) 中進行呈色反應。其結果’老鼠重組IL-3、WEHLsup於細 胞培養時添加於培養基中’使得藉由r h G - C S F的B A F / h G -CSFR的細胞增殖呈現亢進現象。又’添加老鼠重組IL-3以 及WEHI-3B時比較其細胞增殖狀況時，確認rhG-CSF濃度 爲1.6、6.4 n g / m L下呈現顯著的差異。其結果如圖4所不。 實施例5 對於擬G-CSF低分子物質之G-CSF依賴性細胞株增殖的還 原劑與IL-3之影響： 對於實施例1所得之導入人類G-CSF受體基因的細胞 株（BAF/hGCSFR )，於IL-3存在下對篩選之影響作如下 之檢討。首先，調製DMEM培養基（（-)FCS、添加2-氫 硫乙醇至最終濃度爲5 X 1(Τ5Μ )中添加老鼠細胞株WEHI-3Β培養液（WEHIsup )至最終濃度爲1.25 %之培養基、以 及無添加之2種培養基。 這些培養基倒入96格培養皿中，以PBS (-)洗淨的 BAF/hG-CSFR，懸濁至 5 X 丨c e 11 / we 11 後，添加 S B 24 7 4 64 (參考史密斯•比強（股）報告的G-CSF所取代之低分子 化合物，Science，28 1 (5 374) : 25 7-9 1 998 )至 0、1〇_10、 10·9、10_8、ΙΟ·7、10·6Μ，於 5 % C〇2、37 °C 下培養 48 小 時。 培養後，各格子中添加WST-1/1-甲氧基PMS溶液（最 終濃度爲5mM，（股）同仁化學硏究所），於C〇2恆溫槽 中進行呈色反應。其結果，因添加WEHL -3B於培養基中， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -19 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243851 A7 _B7_ 五、發明説明（17 ) 使得藉由SB247464的BAF/hG-CSFR之細胞增殖產生亢進現 象。又，對於SB247464濃度爲10 s、10·9、10·1ϋΜ而言， 確認顯示有意差。其結果如圖5所示。 實施例6 對於IL-1 0依賴性細胞株增殖的還原劑之影響： 對於實施例2所得之導入人類IL-1 0受體基因的細胞株 (BAF/hIL-10R )，於還原劑（2-氫硫乙醇）存在下對篩選 之影響作如下之檢討。首先，調製DMEM培養基（（-) FCS )中添加5 X 10_5M的2-氫硫乙醇之培養基、以及無添 加之培養基。這些培養基倒入96格培養皿中，以PBS (-) 洗淨的BAF/hIL-10R，分別以5 X 104cell/well量作懸濁。 再各格子中添加 〇、0.000 1、0.001、0.01、0.1、1 、10、100、1 000ng/mL 之 rhIL-10R，於 5%C〇2、37°C 下培養4 8小時。培養後’各格子中添加WST-1 /1 -甲氧基 PMS溶液（最終濃度爲5mM，（股）同仁化學硏究所）， 於C〇2恆溫槽中進行呈色反應。其結果，於細胞培養時因 添加還原劑的2-氫硫乙醇於培養基中’使得藉由rh IL-10 的BAF/h IL-10R的細胞增殖呈現亢進現象。又，確認rh IL-10R濃度爲10、1〇〇、l〇〇〇ng/mL下確認顯示有意差。其結 果如圖6所示。 實施例7 對於IL-1 0依賴性細胞株增殖的IL-3之影響： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 '~~' •20· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1243851 A7 ____ B7 五、發明説明（18 ) 對於實施例2所得之導入人類IL-1 0受體基因的細胞株 (BAF/h IL-10R )，於IL-3存在下對篩選之影響作如下之 檢討。首先，調製DMEM培養基（（·）FCS、添加2-氫硫 乙醇至最終濃度爲5 X 1 0 5 Μ )中添加老鼠重組IL - 3成最終 濃度爲2ng/ml之培養基、相同地添加老鼠細胞株WEHI-3B 培養液（WEHIsup )至最終濃度爲0.625 %之培養基、以及 無添加之3種培養基。 這些培養基倒入96格培養皿中，以PBS (-)洗淨的 BAF/h IL-10R，分別作5 X 1 04cell/well量之懸濁。再各格 子中添加 〇、0.025、0.1、0.4、1.6、6.4ng/mL 之 rhlL-10，於5 % CCh、37 t：下培養48小時。 培養後，各格子中添加WST-1/L·甲氧基PMS溶液（最 終濃度爲5mM，（股）同仁化學硏究所），於C〇2恆溫槽 中進行呈色反應。其結果，老鼠重組IL-3、WEHLsup於細 胞培養時添加於培養基中，使得藉由r IL-10的BAF/hlL-1 OR的細胞增殖呈現亢進現象。其結果如圖7所示。 實施例8 人類EPO依賴性細胞株的構築 使用由人類e r y t h r 〇 i d 1 e u k e m i a細胞株的c D N A基因庫中 製造出人類EP〇受體基因之引子，以RT-PCR法（Mullis， K., et al.M Cold Spring Harb Symp. Quant. Biol.M, 51, 263-273, 1 986 )進行人類EPO受體基因的純系化。將此人類 EP〇受體積基因插入表現載體（pIRESpuro )的多重純系化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -21 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243851 A7 ___B7 五、發明説明（20 ) 其結果，導入人類EPO受體基因的細胞株（ BAF/hEPOR )，於rhEPO濃度爲〇.8至50unit/mL的範圍得 到良好的直線（圖8 )。即，可知本發明方法可定量性檢 測出hEP〇或擬hEP〇低分子化合物。 實施例9 對於EP0依賴性細胞株增殖的還原劑之影響： 對於實施例8所得之導入人類EP0受體基因的細胞株 (BAF/hEPOR )，於還原劑（2·氫硫乙醇）存在下對篩選 之影響作如下之檢討。首先，調製DMEM培養基（（-) FCS )中添加5 X 1(TSM的2-氫硫乙醇之培養基、與無添加 之培養基。這些培養基倒入96格培養皿中，以PBS (-)洗 淨的BAF/hG-CSFR，分別作5 X 104cell/well量之懸濁。 再各格子中添加 〇、0.8、1.6、3.1、6.3、12.5、25 、50umt/mL 之 rhEPO，於 5 % C〇2、37 °C 下培養 48 小時。 培養後，各格子中添加WST-1/1-甲氧基PMS溶液（最終濃 度爲5mM，（股）同仁化學硏究所），於C〇2恆溫槽中進 行呈色反應。其結果，細胞培養時因培養基中添加還原劑 2-氫硫乙醇，使得藉由rhEPO的BAF/hEP〇R的細胞增殖呈 現亢進現象。其結果如圖9所示。 實施例10 對EP0依賴性細胞株增殖的IL-3之影響： 對於實施例8所得之導入人類EP0受體基因的細胞株 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-23 - 1243851 A7 B7 五、發明説明（21 ) (BAF/hEPOR )，於IL-3存在下對篩選之影響作如下之檢 討。首先，調製DMEM培養基（（·）FCS、添加2-氫硫乙 醇至最終濃度爲5x 10_5M)中添加老鼠重組IL-3成最終濃 度爲0.5ng/ml之培養基、含有相同老鼠IL-3的老鼠細胞株 添加WEHI-3B培養液（WEHIsup )至最終濃度爲1.25 %之 培養基、以及無添加之3種培養基。 這些培養基倒入96格培養皿中，以PBS (-)洗淨的 BAF/hEP〇R，分S丨J作5 X 1 04cell/well量之懸濁。再各格子 中添力□ 0、0.8、 1.6、3.1 、6.3、 12.5、25、50unit/mL 之rhEPO，於5 % C〇2、37 °C下培養48小時。 培養後，各格子中添加WST-1/1-甲氧基PMS溶液（最 終濃度爲5mM，（股）同仁化學硏究所），於C〇2恆溫槽 中進行呈色反應。反應後，以波長45Onm進行測定。其結 果老鼠重組IL-3、WEHI-3B於細胞培養時添加於培養基時 ，使得藉由rhEPO的BAF/hEPOR細胞增殖呈亢進現象。又 ，添加老鼠重組IL-3以及WEHI-3B的細胞增殖作比較時， 確認rhEPO濃度爲3.1、6.3、12.5 uni t/mL時有顯示有意差 。其結果如1〇所示。 且，對於其他配位體受體基因亦以實施例1、2或8爲 準進行RT-PCR法的純系化，將此插入表現載體中，可構築 導入之基因。又，構築後的基因亦可依據實施例1、2或8 的電穿透法等以適當的目的導入細胞中，可構築對各配位 體或擬配位體低分子物質呈增殖現象之細胞株，且由實施 例3至7或9或1 0所記載，利用此可檢測出配位體或擬配 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -24- A7 1243851 B7 五、發明説明（22 ) 位體低分子化合物。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -25-

Claims (1)

  1. A8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 彳 第90 1 02624號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國93年7月5日修正 1 . 一種被驗化合物中的配位體或擬配位體低分子化 合之檢測方法’其特徵爲，將導入配位體受體基因以及耐 抗生素基因之配位體依賴性細胞株，於對應耐抗生素物質 基因的抗生物質存在下，與其他細胞株分離，將此培養於 被驗化合物及還原劑存在下，對其細胞的增殖能作調查者 〇 2 ·如申請專利範圍第1項的方法，其中還原劑爲 2 -氫硫乙醇或α -硫甘油。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中導入配位體 受體基因以及耐抗生素基因之配位體依賴性細胞株的培養 ，係於被驗化合物、還原劑以及間白素3的存在下進行。 4 ·如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法 ，其中配位體受體基因爲人類顆粒球群體刺激因子受體基 因，被驗化合物中的配位體或擬配位體低分子化合物爲人 類顆粒群體刺激因子或可取代其之低分子化合物。 5 .如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法 ，其中配位體受體基因爲人類間白素1〇受體基因，被驗 化合物中的配位體或擬配位體低分子化合物爲人類間白素 1 〇或代替其之低分子化合物。 6 ·如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1243851 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 2 ’其中配位體受體基因爲人類紅血球生成素受體基因，被 驗化合物中的配位體或擬配位體低分子化合物爲人類紅血 球生成素或可取代其之低分子化合物。 7 ·如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法 ’其中配位體受體基因爲人類血小板生成素受體基因，被 驗化合物中的配位體或擬配位體低分子化合物爲人類血小 板生成素或可取代其之低分子化合物。 8 ·如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法 ，其中配位體受體基因爲人類胰島素受體基因，被驗化合 物中的配位體或擬配位體低分子化合物爲人類胰島素或可 取代其之低分子化合物。 9 .如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法 ，其中配位體受體基因爲人類神經成長因子受體基因，被 驗化合物中的配位體或擬配位體低分子化合物爲人類神經 成長因子或可取代其之低分子化合物。 1 0 ·如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方 法’其中耐抗生素基因爲，對具有蛋白質合成阻斷作用之 抗生素具有抵抗性之基因。 1 1 ·如申請專利範圍第1項或第3項中任一項之方 法，其中耐抗生素基因爲嘌呤黴素耐性基因、潮黴素耐性 基因或新黴素耐性基因。 1 2 ·如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方 法，其中細胞株的增殖能，由細胞株中使發色基質，與電 子載體起作用而測定者。 本^1張尺度適用中國國家標準（〇奶）八4規格（210父297公釐） ' ：-------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -2 - 1243851 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 3 1 3 .如申請專利範圍第1 2項之方法，其中發色基 質爲雙偶氮鹽類，電子載體爲吩嗪甲基硫酸鹽系的電子載 mm 體。 1 4 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中發色基 質爲WST-1，電子載體爲1-甲氧基PMS。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) *1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -3-
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8571621B2 (en) * 2009-09-24 2013-10-29 Covidien Lp Minimax filtering for pulse oximetry
CN102854231B (zh) * 2012-09-07 2014-05-14 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 促红细胞生成素受体修饰电极及其制备方法和应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5273962A (en) * 1990-11-30 1993-12-28 Kowa Co., Ltd. Human urinary thrombomodulin with a modified glycosaminoglycan (GAG) binding site
AU2882992A (en) * 1991-11-06 1993-06-07 Arthur A. Axelrad Cell culture medium
US5707798A (en) * 1993-07-13 1998-01-13 Novo Nordisk A/S Identification of ligands by selective amplification of cells transfected with receptors
US5932546A (en) * 1996-10-04 1999-08-03 Glaxo Wellcome Inc. Peptides and compounds that bind to the thrombopoietin receptor
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates

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Mesa-Núñez et al. Preclinical safety and efficacy of lentiviral-mediated gene therapy for leukocyte adhesion deficiency type I
Wong et al. Assessment of chimeric antigen receptor T cytotoxicity by droplet microfluidics in vitro

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