TW457089B - Pharmaceutical composition for treating or inhibiting the growth of tumors or cancers susceptible to treatment - Google Patents

Description

A7 B7 457089 五 '發明説明（!) 技術範圊 本發明係醫藥組合物，其抑制在哺乳類，特別地在人和 溫血動物中癌症和腫瘤之生長。本組合物含（1)N-氣苯基 胺甲酸酯或N-氯苯基硫胺甲酸酯及（2)N-膦酸基甘胺酸衍 生物之混合物’其係系統性除草劑。此组合物亦可用以治 療病毒感染。 發明背景 癌症在動物和人中為領先之死因。癌症之正確致因係未 知’但某些活性如抽煙或暴露於誘癌劑與某些類型之癌症 和腫瘤之發生間之連結已由許多研究者所示。 許多類型之化學治療劑已顯示有效對抗癌症和腫瘤細 胞’但並非所有類型之癌症和腫瘤對此些劑反應。不幸 地’許多此些劑亦破壞正常細胞.此些化學治療劑之作用 之正確機制則常未知。 雖然在癌症治療領域之進展，但目前引導之療法為外科 手術、照射和化學療法。化學治療之途徑據說對抗轉移之 癌症或特別具攻擊性者。如此殺細胞或制細胞之劑與大生 長因子對癌症作用良好，即其細胞快速分裂者。目前，激 素特別地動情素、黃體素和睪固酮及一些由多種微生物所 產生之抗生素、烷化劑和抗代謝劑形成癌學者可得之大部 分療法。對癌症和腫瘤細胞具特異性，而不影響正常細胞 之理想細胞毒性劑應為極必要的不幸地，沒有一個被發 現’而是使用瞒準特別快速分裂細胞（腫瘤和正常兩者）之 替代劑。 0:W3V43M5.D0C 4 , 本紙張尺度適用中國國家榡準·（ CNS Μ4規格（210X297公釐） -----------^------1T-----^ (請先閲讀背面之注^'項再填寫本f ) 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 A7 B7 457089 五、發明説明（2 ) 清楚地，由於其一些獨特之特異性而瞄準腫瘤細胞之物 質之發展應為一項突破。可替代地，對腫瘤細胞具細胞毒 性而對正常細胞引起溫和作用之物質應為所要的。 因此，本發明之目標係在提供醫藥組合物，其係有效於 抑制在哺乳類中腫瘤和癌症之生長，而對正常細胞具溫和 或無作用。 更特別地，本發明之目標係在提供抗癌組合物，包括醫 藥載體和N-氣苯基胺甲酸酯或N-氣苯基硫胺甲酸酯衍生物 與如在此所界定之N-膦酸基甘胺酸衍生物合併，與治療如 此癌症之方法一起。 此些組合物亦有效對抗病毒。因此，本發明之再一個目 標係在提供治療病毒感染之組合物和方法，如⑴疹' ΗIV、流行性感冒和鼻病毒。 此些和其他目標將自本發明之以下詳細描述變得明白。 發明簡要 治療哺乳類，及特別地溫血動物和人之醫藥组合物，包 括醫藥載體和有效量抗癌化合物，選自一群包括（1)下式 之Ν-膦酸基甘胺酸衍生物： I I n I I I —訂 ϋ 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ο μη R——

X-C-CH2-N-CH2-P-OY 0Ζ 其中X係選自一群包括羥基、多至12個碳原子之烷氧基或 氣烷氧基；低碳烯氧基、環己氧基、嗎啉基、吡咯啶基、

0:\43\43^5,D0C -5· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X 297公釐） 457089 經濟部t央標準局貝工消費合作社印装 Α7 Β7 五、發明説明（3 ) 六氫吡啶基及NHR’ ； Y和Z各獨立選自氫和低碳烷基；及尺 係選自一群包括氮、甲酿基、乙酿基、字酿基、硝基爷酿 基及氣化苄醯基；及R'係選自一群包括氫、低碳烷基和低 碳烯基 '環己基、多至8個碳原子之笨烷基、苯基、氣化 苯基及大茴香基；及此些化合物之某些鹽，其鹽係選自一 群包括具原子數多至3〇之第I和II屬金屬、氫氯鹽、乙酸 鹽、柳酸鹽、吡啶、銨、低碳脂族烴胺、低碳烷醇胺和苯 胺；及（2)下式之N-氣苯基胺甲酸酯或N-氣苯基硫胺甲酸 酯之混合物： C η N-C-X-R - Η 其中X為氧或硫；η為自1至3 ; R係選自一群包括氫、低碳 燒基和低碳烯基、環己基、多至8個碳原子之苯烷基和苯 基及其在醫藥上可接受之有機和無機酸鹽。 此些組合物可用以抑制在人或動物中癌症和其他惡性腫 瘤之生長，由將有效量之Ν-膦酸基甘胺酸衍生物及Ν-氣 苯基胺甲酸酯和Ν -氣苯基硫胺甲酸酯口服、直腸、局部 或腸外、靜脈内施藥’或由直接注射近或入腫瘤中。此些 组合物係有效於殺死或延緩腫瘤之生長，其在正常之健康 細胞上較亞得里亞黴素更安全。 此些組合物亦有效對抗病毒，如HIV、⑴疹 '流行性感 冒及其類似物。 0：W\43665.D0C β 本紙乐尺度適用中圉國家梯準（CNS>A4麟（210χ297公瘦） ---------袭------ΐτ-----ά. (請先W讀背面之注項再填寫本頁) 457089 地 A7 B7 五、發明説明（4 ) 發明之詳細說明 A .定義： 如在此所用，"在醫藥上可接受之"成份為適宜於用於人 和/或動物者’而無不當之逆副作用（如毒性、刺激性和過 敏反應），相對應於合理之利益/冒險比值。 如在此所用安全和有效量"一詞係指成份之量，其係 足以產生所要之醫療反應，而無不當之逆副作用（如毒 性、刺激性或過敏反應），當在本發明之方式下使用時， 相對應於合理之利益/冒險比值。特定"安全和有效量將 明顯地依如此因子如所治療之特別病狀、病人之物理狀 態、所治療之哺乳類型、治療之持續期間、共同療法之本 質（若有時）及採用之特定調配物和化合物或其衍生物之結 構而變化。 如在此所用’"醫藥加成鹽"包括抗癌化合物之在醫藥上 可接受之鹽。此些包括胺之酸鹽及羧酸之鹼或鹼土金屬 鹽- 如在此所用，"醫藥載體”為在醫藥上可接受之溶劑、懸 浮劑或媒劑，供傳送抗癌劑至動物或人。載體可為液體或 固體及係依心中計劃之施藥方式選定= 如在此所用’"癌症"係指在哺乳類中所見之所有類型之 癌或贅癌或腫瘤。 如在此所用，”抗癌化合物••為N-膦酸基甘胺酸與N-氣苯 基胺甲酸酯和N-氣苯基硫胺甲酸酯合併。 如在此所用，"病毒"包括在溫血動物中致病（病毒感染） OA43\4M65.DOC - 7 - ............................... 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（2!0X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項真填寫冬 裴· 經濟部中央標準局員工消費合作社印袈. 457 8 9 90. A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印装 五、發明説明（5 ) 之病毒，例如HIV、⑴疹、流行性感冒、鼻病毒及其類似 物。 B .抗癌化合物 抗癌化合物為（1) N-膦叙基甘胺酸及（2) N -氯苯基胺甲酸 醋或N-氣基硫胺甲酸酯之組合物，其係已知其除草活性。 其係系統性除草劑’用以防止和根絕某些植物或雜草，或 以調節生長。胺曱酸酯具以下之結構 cn Η 其中η為自1至3，R係選自一群包括氨、低竣燒基和低碳 烯基、環己基、多至8個碳原子之苯烷基、苯基，及X為 硫或氧；及此些化合物之醫藥加成鹽。 較佳之化合物係該等，其中R為具1至4個碳之烷基，較 佳地異丙基及X為氧。 此些化合物係由發予Witman (1954)之美國專利2,695,225 號和發予Strain (1956)之美國專利第2,734,911號中所述之 方法製備。 N-膦酸基甘胺酸具下式：

O:\43\43665-OOC - A 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） I.--^-----I------ΐτ-----ά. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 457089 A7 B7 ο = R—— 五、發明説明（6 )

X-C-CH2-N-CH2-P-OY oz 其中X係選自一群包括羥基、多至12個碳原子之烷氧基或 氯烷氧基；低碳烯氧基、環己氧基、嗎啉基、吡咯啶基、 六氫0比症基及NHR1; Y和Z各獨立選自氫和低碳坑基；及 R係選自一群包括氫、甲醯基、乙酿基、爷醢基、硝基爷 醯基和氣化苄醯基；及11_係選自一群包括氫、低碳烷基 和低碳烯基、環己基、多至8個碳原子之苯烷基、苯基、 氣化苯基和大茴香基；及此些化合物之某些鹽，其鹽係選 自一群具原子數多至之第I和II屬金屬、氫氯鹽、乙酸 鹽、柳酸鹽、吡啶、銨、低碳脂族烴胺、低碳烷醇胺和苯 胺。 N-膦酸基甘胺酸化合物係根據發予Franz (1974)之美國專 利第3,799,758號中所見之方法製備。 (1) N-膦酸基甘胺酸和（2) N-氣苯基胺甲酸酯或N-氣苯基 硫胺甲酸酯化合物之混合物係以相對彼此在莫耳重量基準 下之10:1至約1:10之比值。較佳地，使用5:1至1:5之比值及 最佳地1 : I混合物。 C.劑量 任何合適之劑量可給定於本發明之方法中。化合物和載 體之類型和量將根據溫血動物之物種或人、體重和所要治 療之腫瘤而廣泛地變化。通常每公斤體重在約2毫克至每公 O:\43\43665.DCK： - 9 · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐} n -- - - -- - - - - - - - - . n n ^^1----- ^w . . I 1^1 ^^1 n. 0¾ 务 (请先閱讀背面之注意事項存填寫本萸) 經濟部中央標準局員工消费合作社印装 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 457089 A7 B7 五、發明説明（7) 斤體重約400毫克間之劑量係合適的。較佳地，使用自15毫 克至約150毫克/公斤體重。通常，在人之劑量係低於少溫 血哺乳類者’如小鼠。劑量單位可包括單一化合物或其與 其他化合物或其他癌抑制化合物之混合物。劑量單位亦可 包括稀釋劑、廷展劑、載體及其類似物。單位可為固體或 膠型式如丸、錠、膠囊及其類似物或為液體型式，適於口 服、直腸、局部或腸外施藥或靜脈注射或由注射入或近腫 瘤部位。 D.劑量傳送型式 抗癌化合物典型地與在醫藥上可接受之載體混合。此載 體可為固體或液體及類型通常根據所使用之施藥類型而選 擇。活性劑可以錠或膠囊之型式，或如結塊之粉末或以液 體型式共同施藥。合適之固體載體之實例包括乳糖、蔗 糖、明膠和瓊脂《膠囊或錠劑可容易地調配及可製成易於 呑食或咀嚼；其他固體型式包括粒劑和容積粉末。錠劑可 含合適之結合劑、潤滑劑、稀釋劑、分解劑、著色劑、香 味劑、流動誘生劑和熔化劑。合適之液體劑量型式之實例 包括水溶液、溶液或懸浮液在水、在醫藥上可接受之油 脂、醇或其他有機溶劑，包括酯、特效藥、糖漿、乳化 液、懸浮液、溶液和/或自非起泡性粒劑復水之懸浮液和自 起泡性粒劑復水之起泡性製備物。如此之液體劑量型式可 含，例如合適之溶劑' 防腐劑、乳化劑、懸浮劑、稀釋 劑、甜味劑和熔化劑。口服劑量型式應含香味劑和著色 劑。腸外和靜脈内型式亦應包括礦物質和其他物質，以使 O W43665加C · 1 〇 本紙伕尺度適用中國國家橾準（CNS )八4说格（2Ι0Χ297公釐） ^ n I [ H ϋ. "線 (請先閱讀背面之注^^項再填寫本頁) 457089 Α7 Β7 五、發明说明（8 ) 其相容於注射或所選之傳送系統之類型。 在醫藥上可接受之載體和賦形劑之特定實例可用以調配 本發明之口服劑量型式，係描述於1975年9月2日發予Robert 之美國專利第3汐03,297號。製備有用於本發明之劑量型式 之技術和組合物係描述於以下文獻:7現代辑華學，第9和10 章（Banker和 Rhodes，編者 ’ 1979) ; Lieberman等人，# ^ 劑量型式：錢费L( 198 1) ; &Ansel ,醫藥濟丨黃型式之簡介，第 2版f1976)。 E.治療之方法 治療之方法可為任何合適之方法’其係有效於治療所要 治療之特殊病毒、癌症或腫瘤類型。治療可為口服、直 腸、局部、腸外、靜脈内或注射入或近腫瘤部位及其類似 方式。施用有效量之方法亦根據所要治療之腫瘤而變化， 確信地，由靜脈内或皮下或肌肉内施用與適當載體、附加 癌症抑制化合物或化合物類或促進施用之稀釋劑調配之腸 外治療將為施用化合物至溫血動物之較佳方法。 治療病毒感染之方法亦可為口服 '直腸、腸外、局部或 靜脈内施藥°真實時間和劑量施藥係根據病毒感染之類 型、施藥之類型和所要之血中含量而定。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注^κ項再填寫本頁) 以下之實施例係說明性的及不意於限制本發明。 結腸、轧居和肺腫瘤細胞試驗 以下之細胞培養物經進行，以測試Ν-氣苯基胺甲酸薛和 Ν -亂本·基硫胺甲酸Θ旨化合物在結腸、乳房和肺之人腫瘤細 胞上之毒性。細胞之生殖性由檢視在ΜΤΤ (3·[4,5-二甲基喧 O:\43\4J665.DOC -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 457089 A7 B7 五、發明説明（9 ) 唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物）還原反應而測試。MTT分 析法為已知之細胞生殖性測定。 結腸腫瘤細胞（自美國菌種培養收集中心（ATCC)之HT29) 和乳房細胞（自ATCC細胞系之MX1)在具10%牛胎兒血清之 伊哥氏（Eagle's)最小必要培養基中培養。肺腫瘤細胞（自 ATCC細胞系之A549)在具10%牛胎兒血清之漢姆(Ham，s) F12 培養基中培養。 腫瘤細胞經流通及以所要之細胞密度接種至培養燒瓶 中。培養基經傾倒及細胞層以磷酸鹽緩衝之鹽水（PBS)清洗 2次。細胞經胰蛋白酶處理及在接種燒瓶前粉碎化。除非另 有說明，培養物在37土 leC下在5±1 %二氧化碳在空氣之加 濕氣壓中培養。培養物經培養直到至其為50-80%融合。 細胞在燒瓶次融合時經次培養。培養基自燒瓶抽氣除去 及細胞層以PBS潤洗2次。接著，胰蛋白酶溶液經加入各燒 瓶中’以蓋過細胞層。胰蛋白酶溶液在30-60秒後除去及燒 瓶在室溫下培養2至6分。當90%之細胞變成脫離時，生長 培養基經加入。細胞由粉碎化除去及轉入無菌離心管。細 胞在懸浮液之濃度經決定’及製成適當之稀釋，以得到 5000個細胞/毫升之密度。細胞經培養入96井生物分析盤之 指定井中（每井200微升細胞懸浮液）。加入PBS至所有剩餘 之井’以維持濕度。盤然後在測試物體處理前培養過夜。 各劑量之測試物體由以各稀釋液1 〇〇微升處理四重覆井之 培養物而測試。指定為溶劑控制组之該等井接受附加之i〇〇 微升甲醇控制組：負控制組井接受附加之100微升處理培養 OM3W3665.DOC - 12 本紙張尺度制中關家鮮（CNS ) (210X297公釐) ' ----------裝------訂-----線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 457 089

Kill A7 B7 %控制组 -X 100 經濟部中央標準局負工消費合作社印装 五、發明説明（10) 基。PBS經加入未以測試物體或培養基處理之剩餘井中。盤 然後經培養約5天。 在5天培養之末期’各劑量組經鏡檢以評估毒性。〇 5毫克 /¾升之MTT稀釋液在處理培養基中製成，及稀釋液自0.45 微米爐紙過滤’以除去不溶之結晶。培養基自生物分析盤 之井傾倒。其後立即加入2000微升之過濾MTT溶液至所有 測式井’除了2個未處理之空白試驗井。2個空白井接受2 〇 〇 微升之處理培養基。盤回至培養箱約3小時。在培養後，含 MTT之培養經傾倒。過量之培養基經加入各井及盤在室溫 下振盛約2小時。 各井在550毫微米（〇D550 )之吸光值係以分子裝置（Meni0公 園，加州）VMax盤閱讀機測定。 溶劑控制组井之平均和各測試物體稀釋液者，及各 空白井和正控制组者經計算。空白井之平均〇D55〇係自溶劑 控制组井和測試物體井之平均扣除，以分別得到相對應之 平均OD550。 測試物禮稀釋液之修正平均〇D55q 溶劑控制組之修正平均〇D55() 劑量反應曲線經製備為本對數圖，具％控制组在縱座標 (線性）和測試物體濃度在橫座標（對數）。Ec5〇係自各測試物 體之作圖導出。 為在甲醇中施用之測試物體，分開之反應經製備以修正 甲醇數據。 亞得里亞黴素係用為正控制組。在所有例子中，其係較

11 I 裝 I 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁J O:\4M665.DOC -13 LO 經濟部中央搮準局員工消費合作社印策 4 η p q ^ σ第85105604號專利申請案 π 一 中文說明書修正頁(9〇年7月） Α7 : ' Β7 五、發明説明（11 ) 任何測試物質更毒1或2個對數值。亞得里亞黴素為在目前 使用中較有效劑之一及具顯著副作用者。其他相當有效之 化學治療劑之尖峰血漿濃度可為10至50倍高於亞得里黴素 者。EC-50為其中一半細胞經殺死之濃度= 表1 測試物質 EC-5〇結果（ppm) HT29 HT29 MX1 MX1 A549 A549 亞得里亞黴素 0.003 0.006 0.02 0.001 0.03 0.009 氣甫范 13.3 11.4 91.8 108 12.6 92.5 (chloropropham®) 甘磷酸酯 5.41 3.73 36.5 14.6 25.9 22.3 (glyphosate®) 1:1混合液1 1.96 1.61 9.70 8.78 10.8 10.1 *氯甫范和甘磷酸醋（glyphosate®)之混合物。 在正常之健康細胞，以下之結果經得到: 表2 測試物質 支氣管細胞 EC-50 角質細胞 纖維胚母細胞 氣甫范 0.002 >15.2 3.9 13.0 >152 64.2 甘磷酸酯 1.59 3.54 3.09 3.21 86.1 35.8 (glyphosate®) 1:1混合液1 0.001 0.497 0.242 0.286 129 5.95 亞得里亞黴素 0.015 0.0020 0.0035 0.0093 0.065 0.10 I.--,------^------ΐτ-----k (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 氯甫范和甘鱗酸醋（glyphosate®)之混合物 此些實驗顯示此些化合物有效於殺死腫瘤細胞，而無顯 著影響健康之細胞。 O:\43\43665.DOC - 14 · 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X 297公釐） 457089 A7 B7 五、發明説明（12) 崔仑地，許多系統性除草劑單獨或與其他除草劑和殺真 菌劑合併將延緩此有利之抗腫瘤作用。 (1) N·膦酸基甘胺酸及（2) N氣苯基胺甲酸酯或Ν·氣苯基 石見胺甲酸酯之混合物亦有效對抗病毒，包括鼻病毒、mV、 ⑴疹和流行性感冒。 ______ _ _ _ am* ^^^^1 I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝

O:\43\45665.DOC 15 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. P Q 第85j〇56〇4號專利申請案 中文申請專利範圍修正本(90年7月） A8 B8 C8 D8 修正;補充 六、申請專利範圍 1- 一種治療或抑制對治療敏感之腫瘤或癌症生長之醫藥組 合物’包括（1 )與（2 )之混合物： (1)下式之N-氣苯基胺甲酸酯或N-氣苯基硫胺甲酸酯：

   其中η係自1至3 ; X係選自一群包括氧和硫：R係選自一 群包括氫、低碳烷基和低碳婦基、環己基、多至8個藏 原子之苯烷基；或其醫藥上可接受之鹽；及 (2)下式之N-鳞酸基甘胺酸： (請先聞讀背面之注f項再填寫本頁} 訂 o y R—— ο MM 經濟部令央棣率局貝工消费合作社印U x-c-ch2-n-ch2-p-oy oz 其中X係選自一群包括羥基、多至12個碳原子之烷氧基 或氣烷氧基；低碳烯氧基、環己氧基；Y和z各獨立選 自氩和低碳烷基；及R係選自一群包括氫、甲醯基、乙 醯基、苄醯基、硝基笮醯基和氣化苄醯基；及其醫藥 上可接受鹽； 及其中（1)對（2)之比例為1〇 : 1至1 : 1 0之莫耳重基 準。 - 1 * 本紙張尺度適用中國國家揲率（CNS 规格（2丨0X297公釐） 5 翅濟部中央榡嗥局貝工消費合作社印裂 4 7 89 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 2. 根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，進一步包括在 醫藥上可接受之載體。 3. 根據申請專利範圍第2項之醫藥組合物，其中該鹽係選 自一群包括氫氣鹽、乙酸鹽、柳酸鹽及其混合物。 4. 根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，係製備成單位 劑量組合物β 5. 根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該組合物 包括甘鱗酸醋及氯甫范（chloropropham®)。 6. 根據申請專利範園第4項之醫藥組合物，其中該鹽係選 自一群包括氫氣鹽、乙酸鹽和柳酸鹽及其混合物。 7. 根據申請專利範園第4項之醫藥组合物，其包括2毫克 至400毫克之該混合物。 8·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物係為 固體型式JL其中該固體型式包括選自包括乳糖、厲 糖、明膠及洋菜之群之載體。 9. 根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該組合物係為 液體型式且其中該液體型式包括選自包括水溶液、乳 化液、懸浮液及自非起泡或起泡製劑重組之懸浮液之 群。 10. 根據申請專利範圍第i項之組合物，其中該腫瘤或癌症 為乳癌。 11. 根據申請專利範圍第i項之組合物，其中該腫瘤或癌症 為直腸癌。 12. 根據申請專利範圍第〗項之組合物，其中該腫瘤或癌症 OA43\43665.DOC -2- 本紙張尺度適用中囷國家標率（CNS ) ( 210><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ 457 089 AS B8 C8 D8 申請專利範圍 為肺癌。 13.根據申請專利範圍第4項之組合物，其中該腫瘤或癌症 為乳癌。 M-根據申請專利範圍第4項之组合物，其中該腫瘤或癌症 為直腸癌。 I5.根據申請專利範圍第4項之組人鉍 .,^ ^ ., <，'且Q物，其中該腫瘤或癌症 為肺癌。 請 先 閲 讀 背 1¾ 之 注 意 事 項 再 訂 經濟部中央標準局員工消费合作社印袈 -3- 0:Μ·似?<W5-D〇C 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ洗格（210X297公釐） 申請曰期 85. 5. 13. 案 號 85105604 類 别 hh\^Ab, (β上各棚由本局塡註）

   C4 (90年5月修 I) 正 WW 新型專利說明 曰 4570 9 8 中 文 發明 新型 名稱 英 文 姓 名 國 籍 治療或抑制對治療敏感之癌症或腫瘤生長之醫藥組合物 "PHARMACEUTICAL COMPOSmON FOR TREATING OR INHBITING1 GROWTH OF TUMORS OR CANCERS SUSCEPTIBLE TO TREATMENT" 詹姆士·伯格.卡登 美國 裝 發明 創作> 住、居所 美國俄亥俄州西契斯特市查特杯巷7339號 -1° 姓 名 (名稱） 美商寶鹼公司 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 線 三、申請人 國 籍 住、居所 (事務所) 代表人 姓 名 美國 美國俄亥俄州辛辛那提市寶鹼廣場1號 傑可巴斯·西·雷瑟 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS) A4规格（210 X 297公笼） 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 457089 A7 B7 五、發明説明（9 ) 唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物）還原反應而測試。MTT分 析法為已知之細胞生殖性測定。 結腸腫瘤細胞（自美國菌種培養收集中心（ATCC)之HT29) 和乳房細胞（自ATCC細胞系之MX1)在具10%牛胎兒血清之 伊哥氏（Eagle's)最小必要培養基中培養。肺腫瘤細胞（自 ATCC細胞系之A549)在具10%牛胎兒血清之漢姆(Ham，s) F12 培養基中培養。 腫瘤細胞經流通及以所要之細胞密度接種至培養燒瓶 中。培養基經傾倒及細胞層以磷酸鹽緩衝之鹽水（PBS)清洗 2次。細胞經胰蛋白酶處理及在接種燒瓶前粉碎化。除非另 有說明，培養物在37土 leC下在5±1 %二氧化碳在空氣之加 濕氣壓中培養。培養物經培養直到至其為50-80%融合。 細胞在燒瓶次融合時經次培養。培養基自燒瓶抽氣除去 及細胞層以PBS潤洗2次。接著，胰蛋白酶溶液經加入各燒 瓶中’以蓋過細胞層。胰蛋白酶溶液在30-60秒後除去及燒 瓶在室溫下培養2至6分。當90%之細胞變成脫離時，生長 培養基經加入。細胞由粉碎化除去及轉入無菌離心管。細 胞在懸浮液之濃度經決定’及製成適當之稀釋，以得到 5000個細胞/毫升之密度。細胞經培養入96井生物分析盤之 指定井中（每井200微升細胞懸浮液）。加入PBS至所有剩餘 之井’以維持濕度。盤然後在測試物體處理前培養過夜。 各劑量之測試物體由以各稀釋液1 〇〇微升處理四重覆井之 培養物而測試。指定為溶劑控制组之該等井接受附加之i〇〇 微升甲醇控制組：負控制組井接受附加之100微升處理培養 OM3W3665.DOC - 12 本紙張尺度制中關家鮮（CNS ) (210X297公釐) ' ----------裝------訂-----線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 457 089 Kill A7 B7 %控制组 -X 100 經濟部中央標準局負工消費合作社印装 五、發明説明（10) 基。PBS經加入未以測試物體或培養基處理之剩餘井中。盤 然後經培養約5天。 在5天培養之末期’各劑量組經鏡檢以評估毒性。〇 5毫克 /¾升之MTT稀釋液在處理培養基中製成，及稀釋液自0.45 微米爐紙過滤’以除去不溶之結晶。培養基自生物分析盤 之井傾倒。其後立即加入2000微升之過濾MTT溶液至所有 測式井’除了2個未處理之空白試驗井。2個空白井接受2 〇 〇 微升之處理培養基。盤回至培養箱約3小時。在培養後，含 MTT之培養經傾倒。過量之培養基經加入各井及盤在室溫 下振盛約2小時。 各井在550毫微米（〇D550 )之吸光值係以分子裝置（Meni0公 園，加州）VMax盤閱讀機測定。 溶劑控制组井之平均和各測試物體稀釋液者，及各 空白井和正控制组者經計算。空白井之平均〇D55〇係自溶劑 控制组井和測試物體井之平均扣除，以分別得到相對應之 平均OD550。 測試物禮稀釋液之修正平均〇D55q 溶劑控制組之修正平均〇D55() 劑量反應曲線經製備為本對數圖，具％控制组在縱座標 (線性）和測試物體濃度在橫座標（對數）。Ec5〇係自各測試物 體之作圖導出。 為在甲醇中施用之測試物體，分開之反應經製備以修正 甲醇數據。 亞得里亞黴素係用為正控制組。在所有例子中，其係較 11 I 裝 I 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁J O:\4M665.DOC -13