TW379228B

TW379228B - Preparation of a stable zinc insulin analog crystals

Info

Publication number: TW379228B
Application number: TW083105905A
Authority: TW
Inventors: Jeffrey Clayton Baker; Nancy Delores Carter; Bruce Hill Frank
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1994-06-29
Publication date: 2000-01-11
Also published as: IL114152A; KR100369951B1; PL309099A1; CZ286066B6; HUT73495A; CN1128271A; CO4410205A1; DE69529708D1; AU697794B2; ZA954942B; HU9501715D0; IL114152A0; FI952930A0; ES2188637T3; EP0692489B1; PL180968B1; MY130551A; AU2168195A; RU2156257C2; CN1184234C

Description

第83105905號專利申請案中文説明書修正頁(86年10月） A7 B7 8G. 10. 29 .fi 年 M '

J 五、發明説明（醋酸中加入冰醋酸，可確萣pH值低於3.5 ·再加人10微升的液態酚及6微升的氯化鋅溶液（20¾重量/體積，在水中）到每個樣品中，藉由加人湄氫氧化銨、氫氧化納（10¾溶液體積/½量）或氫氧化鉀（10¾溶液體積/重量）調整pH值到 6.0 ，搜拌此溶液約15分鐘，然後使其在室溫下靜置、覆蓋之，在大約2小時後，在所有三個溶液中，可觀察到理想的六晶體，若加入氫氧化鉀到溶液中，則形成晶體的速率為最-快。管例4 將大約42毫克的LysB2eProB2°—hI溶在含有1.2毫升冰醋酸的20毫升Mi 1 Π-Q水中•再將44微升的液態酚加到第一個樣品中，34微升的液態酚加入k二涸樣品中 > 在兩樣 '#»·· 品中加入濃氫氧化銨，調整pH值到6 ，接著加入45微升的氯化鋅溶液（20¾重量/體積，在水中），將溶液攪拌约5分鐘後，在室溫下靜置、覆蓋之，在大約2 4小時後，就可K 觀察到理想的六面體结晶了。 g Μ 5 ‘ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 '(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將LysB28ProB2e—人體胰島素（222毫克）溶在100毫升的 Milli-Q水中，溶液用HPLC分析來測定每毫升溶液中含有 2.0毫克的LysB28Proe2°—hi，藉10¾鹽酸調整pH值到大约 3.0 ，使溶液澄清，取出4個5毫升/蝥数的溶液，並加入冰醋酸使在醋酸中成1當量濃度，pH值可確定低於3.5，再加入間苯酚（1 . 2微升）、酚（10微升）、間苯二酚（100毫克/毫升水溶疲中含2.1微升）或對一羥基苯甲酸甲酯（10毫克/毫 -12- 本纸張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐）五、發明説明（本發明係關於一種，本發明係關於一種法對 LysB2aProB2S — LysB2>*ProB2e—人體 A7 B7 人體膜島素的單體類似物。更明確地製備晶體胰島素類Μ物之方法，此方人鱧胰島素的純化和製造非常有用。胰島素對糖尿病的治療是非常有用的經濟部中央標準局員工消費合作社印製自從1920年代胰島素開始被引用Μ來，不斷的發展已經使糖尿病的治療予Κ改良，絕大部分的進步是針對胰島素的純度及利用性，各種不同作用時間的配方也已經被發展出來。雖然有瑄些改良*但是皮下注射療法仍然不足於提供病患方便的定期治療和正常化的血糖控制，在病患的一生中若血糖含量經常偏離正常值則會導致低血糖或高血糖症及長期的併發症，包括：視網膜疾病、神經系統疾病、 a»k.· 醫臓疾病、和微血管及大血管疾病。為了避免過份血糖值的偏離，糖尿病患者經常使用多次注射治療，藉由在每一餐中加人胰島素，可是這種治療不是很好的，商業上可利用而且作用最快的胰島素注射後太慢達到最高值而且時間又太長不能適當地控制葡萄糖的含量，目前許多人致力在創造胰島素的調配物和胰島素類似物的調配物來改變皮下吸收製程的動力學。因為所有商業的胰島素之趑藥調配物包含自身聪合狀態和主要形成鋅一六合物形式的胰島/素，咸信從皮下注射補給至血液之胰島素吸收的速·率決定步驟是自身聚集的胰島素六合物的解離，為了要加速此吸收程序，單分子胰島素類似物已經被發展出來。這些單分子類似物具有比胰島素 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本'K ) --I裝訂線本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格< 210 X 297公釐） :祕,他2保補充j 第八三一〇五九〇五號專利申請案 — 中文補充説明書（八十六年十月）實例8 : 類似實例1中的方法，結晶反應係進行於以液態的間苯二酚、間甲酚或對羥基苯甲酸曱酯或此等酚類之任何調配物取代液態酚。其形成小結晶或非晶形沈殿。 U:\ΤΪΡΕ\Μ?VXMFY-2 31.DOC\9 1 A7 B7五'發明説明（2 ) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製更快的起步作用，同時保i天然人類胰島素之生物活性。它們提供快速的吸收，μ使胰島素注射時間和到達最高值的作用•而使在每一餐食用後葡萄糖的偏離不致太大。本皆明提供了一種製備特定軍分子類似物LysB28ProB2e —人體胰島素（LysB2eProB2e— hi)结晶的新穎方法’ LysB2eProB2e— hi揭示在美國專利申請案第07/388,201 (EPO公告號碼383,472)。可是美國專利申請案號碼 07/38 8,201並沒有揭示一種商業上實際可行製備晶趙的 LysB2eProB2e— hi之方法。胰島素的结晶作用在此項技藝中是热知的，最初發現的時間要追溯至1926年，亞伯（Abel)從一涸Μ馬錢子驗、吡啶和醋酸铵缓衝的溶液中，在等電位的區域中結晶出胰島素 > Abel J . J . , Prof；· N a t ' 1 A e a d . Sci. U . S . L2_: 1 3 2 (1926)，皮特森（Peterson)等人，在美國專利2,920,104 號敘述胰島素晶體。製劑及製造彼等之方法，在今日，结晶胰島素的商業上之方法包括Μ鹼，宜為氫氧化銨調整胰島素溶液的鹼性至ΡΗ5.9至6.0 *該溶液包括0.25Ν醋酸、約 2克 / 升膜島素和 2¾鲜。Jens Brange, Galenics of In-—. _ sulin, Springer-Verlag(1987) * 意義最重大的是當 Lyse2SProB2S — hi置於允許乂體胰島素形成鋅结晶的情況下，沒有此類的结晶反應發生。.^ 本發明提供一種结晶對分子獨異之LysB2aPr〇B2e之方法，那就是說，此狀況下不會结晶出人體胰島素，此法可製備出大量高品質、高產率的鋅晶體，此晶體提供了一種穩 -5 - -------- I 裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T -線本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）附表1 實例編號 1 2 3 4 5 6 7 鋅（毫克/ 126 40-160 120 215 120 40 126 克胰島素）有機酸 1N 1M 1N 1N 1N 1N 醋酸醋酸醋酸醋酸醋酸檸檬酸酚類 0.2% 0.25% 0.2% 0.22% 0.24% 0.2% U:\TYPH\MFY\MFY-231.DOC\9 五、發明説明（） A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製定的、固趙形式的分子*结晶之固髓是特別有益處的*因為它們比非结晶的固體更容易定性、純化而且也是較好的藥劑，根據上述*此法是適合於商業上的應用。本士明提供了一種製造晶體的LysB28ProB2e—人體胰島素的方法，其中包括從含有Use28Pr*oB2e —人體胰島素、鋅、至少0 . 3當量濃度的有機酸及酚類pH值大約5 . 5到大約 6.5溶液中結晶出LysB28Pr〇B2e—人體胰島素，有機酸則選自包括醋酸系、擰樺酸系、或胺基醋酸系。如前述，此發明提供了一種製備晶體的LysB28ProB2e — 人體胰島素的方法，此術語” LysB2ePr〇e2e—人體胰島素 "或”LysB23Pr〇B2e— hi”是一種快速作用而且不易雙分子化或自身聯合的胰島素類似物，LysB28Pr〇B2e— hi是人體胰鳥素，其中脯氨酸B鍵上的B28位置被離氨酸所取代，而離氨酸B鏈上的B29位置被脯氨酸所取代，正如在美國專利公告號碼07/388,2OUEP0公告號碼383,472)所描述的，在此編入文獻中。所有在本發明中使用的胺基酸之縮寫是被美國專利和商標局（t h e U n i t e d S t a t e s P a t e n t & T r a d e m a r k 0 f f i c e) 所接受並宣佈在37 C.F.R.和1.822(b)(2)中。術語”酚系”或”酚糸衍生物；’是一涸集合名詞，意思是酚、間苯二酚、間甲酚或對羥基苯甲/酸甲酯或其混合物。術語"结晶化”在這裡的意思是指LysB2aPr〇e2e—人體胰島素晶體的生成作用。術語”生理上可容忍之鹼”在此技藝中是熟知的，生理上 -6 - ---------^ |>衣------訂-----1 ·線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（）可容忍的鹼包括氫氧化納：氫氧化鉀和氫氧化銨，較佳的驗則是氫氧化銨。晶體的胰島素之生成已廣泛地被研究•在商業上，人體胰島#是在含有0.25當量濃度的醋酸，1.6至2. 1克/升胰島素和2S!鋅在pH值5.95至6.05的情況下結晶。此结晶反應是從酸液中開始反應，藉加入驗慢慢形成结晶，典型上使用氫氧化钠。最無法預期乃可溶性的LysB28ProB2e— hi無在已知製髂胰島素晶體的狀況下结晶出。LysB2ePr〇B2e — hi是設計來使自身聯合和聚集作用減到最低，布瑞斯 (Rfpms)茸之蛋白皙τ稈，H 527-533 ( 1992)首先提出他們觀察到LysB28Pr〇B2e— hi不會產生聚集。造成類似物單分子化之最少自身聯合及聚集作用被認為對應在為胰島 #k·· 素發展的將況下無法结晶而負責％本發明所敘述的狀況係指Lyse2aProB2e~hI與鋅及一種酚糸的化合物结晶形成毽定的结晶固體者，較佳的酚糸乃選自包括酚、間苯二酚或其混合物，鋅和酚糸兩者對達成結晶反應是很重要的。 . LysB28ProB2e— hi溶液是將胰島素類似物溶於水相的稀_ _ 釋液製備而成，LysB2aProB2e—hI的濃度是約1.8克/升至約2.5克/升，最佳的類似物邊度是大約2克/升。解離作用可用通常已知與生理上可容忍酸較/佳的是使用鹽酸，將pH 值降至3.0至3.5之酸解離作用來完成。其他的生理上可容忍之酸包括醋酸、擰攆酸和磷酸。選自含有醋酸糸、檸攆酸糸或胺基醋酸系的有櫬酸濃度 -7- I -冰衣訂 ^ 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐）五、發明説明（） A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝最少要0 . 3當量濃度，小於0 . 3當量濃度則會有大量的非结晶產物生成。較佳的是將Use2ePr〇B29 一 “溶解在約0.8 至約1.2當量的醋酸中，最佳的是1當量濃度的醋酸。所#入鋅的濃度是其最後濃度是每克的胰島素類似物中大约含有40毫克至大約400毫克的鋅，鋅是Μ加入鋅鹽為較佳，代表性的鋅鹽實例包括醋酸鋅、溴化鋅、氛化鋅、氟化鉾、碘化鋅和硫酸鋅，熟諳此藝者知道還有其他許多鋅鹽亦可甩^在此發明的方法中。較佳地是使用醋酸鋅或氯化鋅*因為這兩種鹽在商業上可接受的方法中，不需苒加人新的化學離子。在结晶反應中，鋅的最適當濃度是每克 LysB2eProB2e— h I中含有約100至約300毫克的鉾。結晶反應的條件係對酚系、鹼和鋅的濃度是敏感的，也 ·»‘· 就是說，熟諳此藝者進行此法時會調整瑄些因素的變數來達成理想的晶體，對每一種酚糸一鹼结合的最適當的條件在所揭示之範圍内會改變。較佳的酚系是酚具濃度約0.15 至約0.25¾ (體積/體積，最後濃度），更佳的酚乃在濃度是 0 . 2 時。 . 溶解LysB28Pr〇B2e— hi到溶液中的方式或其加人酚系、鋅及LysB28Pr〇a2e— hi到溶液中的次序，在本發明法中是不重要的。可是，重要地係茬低於LysB28Proe2e—等電位點時，酚係會與LysB28ProB2e—起/交互作用。於是结晶反應可藉由加入鋅，或藉加入生理上可容忍之_來調整溶液的鹼性自酸性pH至約5.5至6.5，生理上可容忍之鹼包括氫氧化納、氫氧化鉀和氬氧化铵，較佳的鹼是氫氧化銨。 -8 - ---------f I裝-- (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 線本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7五、發明説明（6 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製结晶反應可藉生理上可蓉忍«(調整含有LysB28ProB2e — 人體胰島素、鋅、最少0.3當量濃度有機酸K及一種酚系之溶液之鯓性至pH約5. 5至約6.5而進行。有機酸選自醋酸糸、t#懞酸糸或胺基醋酸糸。較佳的pH值調整到大約5.9 至6 . 0，當p Η值調整，則使晶體形成。更佳的是將LysB2aPr〇B2a溶解在約1當量濃度的醋酸中 (如需要幫助其解雛*pH值可調至3.0-3.5)。然後加入酚系到溶液中·並使之平衡。溶液的p Η值則用生理上可容忍之鹼調整到pH約5.5至約6.5。較佳的是，鹸使用厘氧化銨，而P Η值調整到約5 . 9至6 . 2。结晶反應即可藉由加入鋅而開始。使用任何结晶方式*搅拌或不攪拌形成结晶，且晶體可收集和沖洗。較佳的是在攪拌下進行结晶。LysB2aProB29 —hi如果需要的話可K再结晶，Μ利過漶。此晶體亦可用熟知的方式收集和乾燥。如果其晶體是使用過滹法收集，額外的鋅可加入滹液或母液，使更進一步回收 LysB28Pr〇B2ii— hi。根據本發明所製備的晶體是高品質而且在商業尺度上來說是高產率的，此晶體提供了一種穩定_ 而大塊的藥劑物質之固體彤式，很適合把持或分配去供應 /完成操作，此结晶步驟不合改變物質的純度或聚集動力學。 ’ 结晶反應中之溫度是不重要的，可接受的溫度範圍從約 4D至大約26¾，較佳的溫度是大約22C至大約24D。 LysB28pr〇B2e__ U可由各種公認之肽合成技術製備，這 -9 - ^ 訂 J 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 些技術包括傳統的（溶液）ir法，固相法、半合成法及近來重組的DNA法。例如：成思（Chance)等之美國專利公告號碼07/388,201，£卩0公告號碼383,472揭示了1^5828卩「〇329 —人#胰島素的製備。 Μ下的實例僅供進一步的舉例說明胰島素類似物的製備和例證本發明，本發明的範圍則不能只解釋包含下列的實例。 - 管例1 將116升的醋酸媛衝溶液中346.5克的1^^28?「〇82$»—}11 製程液流用純水（260. 6升）及冰醋酸（19.44升）在一個不绣鋼鼓形容器中稀釋至最後濃度為1當量濃度的醋酸溶液，使其在276ηιη時有2.25的吸收度。加入2毫升/升的液化酚類至溶液中（總共為762升），此溶液的pH值需確定低於 PH3 ，再藉由加入24升氫氧化納，調整溶液的pH值至6.01 ，然後加熱至22¾，加熱後，再加入5 . 35升的氛化锌溶液 (2¾重量/體積於水中），此溶液的pH值需再確認在所需的範圍内（5.9-6.1)，再攪拌此溶液12小時，將溶液冷卻至 8 t，停止攢拌，在2-8¾下讓晶體沈澱18個小時，结晶沈_ 1 澱後，慢慢傾倒出370升的上清液，殘餘的上清液及结晶床則移入較小的鼓肜容器內，再用一部分的上清液去沖洗原來的鼓形容器，使得額外的沉澱％再經過1 4小時的沈澱，慢慢倒出61升的上清液，留下大約9升潮溼的结晶床及殘留液。此體積的结晶是稀泥狀*把它放到6個1升的離心瓶中， -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（C.NS ) A4規格（210X297公釐） m nn —^m m ϋ fl^n fluf ^^^^1—-~^ Avu —HI— nfi I -¾. i J ^ 矣 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印装五、發明説明（）在DPR6000中使用4000>ρπΓ(大約4000 xG)離心45分鐘，需要兩次的操作才能使所有的晶體泥留在6個瓶中•慢慢倒出離心液，加入500π 1的純水到每瓶離心瓶中，使晶體（每瓶約2ί〇奄升）形成泥狀，在4000γ·ρβ下再離心45分鐘，每瓶中則再用大約500毫升的冰酒精（2-8C) (SD No.3A純酒精）混合晶體使成泥狀，在4000r pm下再離心15分鐘，慢慢倒出酒精離心液，並用酒精重覆洗兩次，在真空下乾燥此酒精沖洗過·的晶體（1 . 9公斤溼重）。管例2

將濃度大約2克/升的LysB28ProB2e溶液製成最後濃度為 1M的醋酸中（在280 nm有吸收度來測定），再加入液態酚 (3 . 3毫升/升溶液）到此溶液中，然後用濃氫氧化銨調整pH *4.· 值到5. 9-6. 2，最後加入2¾ (重量/體積）或20¾ (重量/體積 )的氯化鋅溶液|使其最後濃度為每克LysB28ProB2e中，含有40-160毫克的氯化鋅，將產生的晶體沈澱，並將母液慢慢倒出，然後離心，藉由連續的加水混合和離心來沖洗晶體，最後在真空乾燥前，再用絕對酒精沖洗，加入鋅到母液中，可產生二次结晶，但要限制鋅的濃度至每克 LysB2aProB2S— hi中含有160毫克的鋅。管Μ 3 將1^3828?^32°—人體胰島素（2/2 2毫克）溶在1〇〇毫升的 Mi II i_Q水中，用HPLC來測定每毫升溶液中含有2.0毫克的 LysB2aP「〇B2e— hi，加入10¾鹽酸調整pH值到大約3.0，可使溶液澄清，取出4個5毫升整數的溶液•並在1當量濃度的本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS )A4规格（210x297公釐） --------1 -裝------訂-----1 線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第83105905號專利申請案中文説明書修正頁(86年10月） A7 B7 8G. 10. 29 .fi 年 M '

J 五、發明説明（醋酸中加入冰醋酸，可確萣pH值低於3.5 ·再加人10微升的液態酚及6微升的氯化鋅溶液（20¾重量/體積，在水中）到每個樣品中，藉由加人湄氫氧化銨、氫氧化納（10¾溶液體積/½量）或氫氧化鉀（10¾溶液體積/重量）調整pH值到 6.0 ，搜拌此溶液約15分鐘，然後使其在室溫下靜置、覆蓋之，在大約2小時後，在所有三個溶液中，可觀察到理想的六晶體，若加入氫氧化鉀到溶液中，則形成晶體的速率為最-快。管例4 將大約42毫克的LysB2eProB2°—hI溶在含有1.2毫升冰醋酸的20毫升Mi 1 Π-Q水中•再將44微升的液態酚加到第一個樣品中，34微升的液態酚加入k二涸樣品中 > 在兩樣 '#»·· 品中加入濃氫氧化銨，調整pH值到6 ，接著加入45微升的氯化鋅溶液（20¾重量/體積，在水中），將溶液攪拌约5分鐘後，在室溫下靜置、覆蓋之，在大約2 4小時後，就可K 觀察到理想的六面體结晶了。 g Μ 5 ‘ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 '(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將LysB28ProB2e—人體胰島素（222毫克）溶在100毫升的 Milli-Q水中，溶液用HPLC分析來測定每毫升溶液中含有 2.0毫克的LysB28Proe2°—hi，藉10¾鹽酸調整pH值到大约 3.0 ，使溶液澄清，取出4個5毫升/蝥数的溶液，並加入冰醋酸使在醋酸中成1當量濃度，pH值可確定低於3.5，再加入間苯酚（1 . 2微升）、酚（10微升）、間苯二酚（100毫克/毫升水溶疲中含2.1微升）或對一羥基苯甲酸甲酯（10毫克/毫 -12- 本纸張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐）五、發明説明（） Α7 Β7 經濟部中夬標準局員Η消費合作社印製升水溶液中含1 . 6毫升）到# 一個溶液中，以產生溶液具有類W肽對酚系的莫耳比的结晶，在每個樣品中，加入6微升的氯化鋅溶液（20%重量/體積，在水中），再用濃氫氧化銨調ipH值到6 ，攢拌溶液約丨5分鐘，然後在室溫下靜置、覆蓋之，大約24小時後，在含有酚的溶液中可觀察到理想的晶體，在含有對一羥基苯甲酸甲酯的溶液中，則產生較不好的平面型晶體，在此狀況下，含有間-苯酚和間-苯二酚的溶液-中，則沒有晶體產生。在類1M的過程中，用十分之一量的間-笨二酚•及氫氧化納調整（10¾重量/體積溶液），則產生理想的六面體晶體 ’這範例證明了在最佳的例行條件下使用酚系可形成理想的晶體。苜例將LysB28ProB2e—人體胰島素（222毫克）溶在100毫升的 Mi 1 1 ί-Q水中·溶液用HPLC分析來測定每毫升溶液中含有 2.0毫克的LysB28ProB2S~hI，藉10¾鹽酸調整pH值到大約 3.0 ，使溶液澄清，取出1個5毫升整數的樣品，並加入冰醋酸形成醋酸中0.25當量濃度，pH值可確定低於3.5 ，再__ 加入20微升的氯化鋅溶液（20¾重量/體積，在水中）到樣品中，再用濃氫氧化銨調整ΡΗΪ[到6 ，溶液攪拌15分鐘後，在室溫下靜置、覆篕之，在約2.4小/時後，溶液中則沒有覲察到晶體產生，但有非晶體的沈澱在容器的底部沈積。當做一種比照，另外取出5毫升整數•依照實例1中所描述的氫氧化銨程序•則有理想的六面體晶體產生，但當 -13- 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· 、1Τ 線 A7 B7 五、發明説明（11) 依照賁例1中所提到的狀说，也使用氫氧化銨’但是加入人體胰島素（2·3毫克/毫升，在1當量濃度的醋酸中）’在 7天内則無晶體產生。這^實驗證實在生物合成的胰島素结晶作用所使用的例行條件下，對LysB28Pr〇B2e —人體胰島素的结晶反應是不適用的，同樣的，前述對UsB2eProB2e— hi结晶作用條件，也將不能製造出人體胰島素的晶體。 - g俐7 類似實例1中的方法，若用1當量濃度的擰懞酸取代1當量濃度的醋酸進行结晶*结晶作用會產生理想的 LysB28ProB2°— hi 晶體。 ί -I I ~~-JI 11 n 訂 11 11 線 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 -14- 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） :祕,他2保補充j 第八三一〇五九〇五號專利申請案 — 中文補充説明書（八十六年十月）實例8 : 類似實例1中的方法，結晶反應係進行於以液態的間苯二酚、間甲酚或對羥基苯甲酸曱酯或此等酚類之任何調配物取代液態酚。其形成小結晶或非晶形沈殿。 U:\ΤΪΡΕ\Μ?VXMFY-2 31.DOC\9 1 附表1 實例編號 1 2 3 4 5 6 7 鋅（毫克/ 126 40-160 120 215 120 40 126 克胰島素）有機酸 1N 1M 1N 1N 1N 1N 醋酸醋酸醋酸醋酸醋酸檸檬酸酚類 0.2% 0.25% 0.2% 0.22% 0.24% 0.2% U:\TYPH\MFY\MFY-231.DOC\9

Claims

弟8310·5號專利申請案中文申請專利範圍修正本(86年10月） A8 B8 C8 D8 補兄經濟部中央標準局負工消費合作社印製申請專利範i 1 _ 一種製備晶—體的Ly^WB29 -人體胰島素的方法，其包括：從含有LysB28ProB29 -人體胰島素、每毫克 Lys 28ΡΓ〇Β29 -人體胰島素中含4〇至2i5mg之鋅鹽，1當量濃度的係選自醋酸或檸檬酸所組合之群之有機酸及〇.2 %至〇.5 〇/〇選自酚、間苯二酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯或其混合物所組合之群之酚系之溶液在pH値5 · 5 至6.5時結晶出LysB28Pr〇B29 —人體胰島素。 2 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中LysB28pr〇B29 一人. 體姨島素的濃度1.8到2·5克/升，酚系係酚；而鋅的濃度是4〇毫克/克LySB28Pr〇B29 -人體胰島素至215毫克/克 LysB28pr〇B29 _人體胰島素。 3.根據申请專利範圍第2項之方法，其中驗的濃度以體積爲基.準〇.2%到0_25%。 4 .根據申請專利範圍第3項之方法’其pH値5 9至6.2。 5 · 一種製備晶體的Ι^Β28ΡγοΒ29 -人體胰島素的方法，其包括： (a) 添加以終體積爲基準的〇.2 %至〇 25 %酚到於1當量醋酸之1.8至2.5克/升LysB28Pr〇B29 —人體胰島素的溶液中； (b) 用氫氧化銨調整pH値到5.9至6.2 ;及 (c) 加入鋅鹽溶液，使其最後濃度爲每克LysB28pr〇B29 —人體胰島素中4〇至215毫克的氣化鋅。本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --------「裝-----—訂------^ ^ (·請先閱讀背面之注意事項再填寫本肓) 弟8310·5號專利申請案中文申請專利範圍修正本(86年10月） A8 B8 C8 D8 補兄經濟部中央標準局負工消費合作社印製申請專利範i 1 _ 一種製備晶—體的Ly^WB29 -人體胰島素的方法，其包括：從含有LysB28ProB29 -人體胰島素、每毫克 Lys 28ΡΓ〇Β29 -人體胰島素中含4〇至2i5mg之鋅鹽，1當量濃度的係選自醋酸或檸檬酸所組合之群之有機酸及〇.2 %至〇.5 〇/〇選自酚、間苯二酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯或其混合物所組合之群之酚系之溶液在pH値5 · 5 至6.5時結晶出LysB28Pr〇B29 —人體胰島素。 2 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中LysB28pr〇B29 一人. 體姨島素的濃度1.8到2·5克/升，酚系係酚；而鋅的濃度是4〇毫克/克LySB28Pr〇B29 -人體胰島素至215毫克/克 LysB28pr〇B29 _人體胰島素。 3.根據申请專利範圍第2項之方法，其中驗的濃度以體積爲基.準〇.2%到0_25%。 4 .根據申請專利範圍第3項之方法’其pH値5 9至6.2。 5 · 一種製備晶體的Ι^Β28ΡγοΒ29 -人體胰島素的方法，其包括： (a) 添加以終體積爲基準的〇.2 %至〇 25 %酚到於1當量醋酸之1.8至2.5克/升LysB28Pr〇B29 —人體胰島素的溶液中； (b) 用氫氧化銨調整pH値到5.9至6.2 ;及 (c) 加入鋅鹽溶液，使其最後濃度爲每克LysB28pr〇B29 —人體胰島素中4〇至215毫克的氣化鋅。本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --------「裝-----—訂------^ ^ (·請先閱讀背面之注意事項再填寫本肓)