TW298603B

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Publication number: TW298603B
Application number: TW081102311A
Authority: TW
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1991-03-28
Filing date: 1992-03-26
Publication date: 1997-02-21
Also published as: US5591614A; CA2106675C; CA2106675A1; IL101388A0; MX9201357A; NZ242139A; IE75350B1; EP0577705A1; WO1992017491A1; AU1552192A; JP3199734B2; HK1008023A1; JPH06506350A; FR2674539B1; GR3020151T3; IE921000A1; IL101388A; ATE138934T1; DE69211340D1; FR2674539A1

Description

A6 B6 0

0 五、發明説明（）本發明係闢於巨內酯之生物轉化·及更特定言之，係關於巨内醱之酵素製備方法。本發明提供一種製備式⑴化合物之方法 (1) 其包括K一種鍵嫌菌微生物或衍生I該微生物之一種非细胞製劑處理式⑵之巨內酯 {請先閎讀紮面之注意事項再填寫本页) •打. 0

〇 (2) .線· 該微生物或製-劑能氧化A族鏈徽殺陽菌素之多不飽和巨内酸之D -脯胺酸基之2 - 3鍵成為去氫脯胺酸基。式⑴及⑵之巨内酯視其來源有不同的名稱（見表）。甲 4(210X297公沒) 經濟部中夬標準局員工消費合作杜印裝么2 :Π 1號專利申請案中文說明書修正頁（8 4年7月）Α7 Β7 五、發明説明（）年月日！正f 84 7. 11 補充| 式 ⑴ 式（2) 普利斯汀藏素普利斯汀阖素

(P r i s t i n a m y c i η ) P I I A (pristinamycin) I I B

米加嚴素·（ m i k a m y c i n ) A

牡蠣爾素（o s t r e o g r y c i n > A 牡蠣菌素G

鏈徽殺陽爾素（streptogramin) A 協同素（synergistine) Al 春徵素(vernainycin) A 佛吉尼亞簿素（v i r* g i n i amy c i n ) M 1佛吉尼亞黴素 M2 這些分子具有多不飽和巨内酯之一般结構，其出現在鏈徽殺陽閑素族之抗生素中。這呰抗生素由一種多不飽和巨内酯（A族之成分）及一種縮酸肽（B族之成分）之相乘組合所姐成。這呰抗生素之作用方式及抗微生物之活性已經由多位作者研究（T a n a k a等人* A n t i b i o t, i c s v o i . II[ P. 487, Springer Berlin, 1975 ; Vasquez 等人， Antibiotics v o i . I l I p. 521, Springer Berlin, 1 9 7 5 ). 這呰不同的研究已經示知只有K式⑴之巨内酯作為A族之成分時，才能獲得較佳的相乘作用。

此A族_徽殺陽Μ素之多不飽和巨内酯之一項特點是R 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2W公釐） 83. 3. 10,000 (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 一衣· --° A6 _B6 五、發明说明（）稍溶於水性媒霣中。此為埴些化合物藥理學開發方面之主要阻力•由於其投藥方式因而受限制。為克眼此缺點•已經發展出新穎水可溶的半合成衍生物（EP 135410 ; EP 19166 2; US 47757 5 3 :)。用於製備這些衍生物之半合成途徑主要包括加硫酵至此巨内酯去氫脯胺酸之2-3不飽和鍵。因此，僅式⑴之巨内酯可K用於此半合成途徑中。然而，在現行的生產糸统中，式⑴及⑵之巨內酯係同時製得·且與其他鐽徽殺陽菌素成份混合。因此，要能夠在生產培養基中增加式⑴化合物對式⑵化合物之比例有其重要性。要能夠轉化與式⑴之化肯物同時製得之式⑵化合物成為式⑴之化合物，及同時自醱酵培養t中分離，也有其重要性。最近，Purvis等人教示在式⑴巨內酯之生物合成中，式⑵之巨内酯是中間物（J. Amer. Chem. Soc., 1989, 111, 5931)。然而，在此文獻中，未描述或提出利用此反應機制之方法。申請人k發現可藉一種鐽徽菌微生物或由其衍生之一種非细胞製劑y能Μ高產率轉化式（2)之巨内酯成為式（1)之巨內酯。、·-_ 根據本發明，在一種鏈嫌菌微生物或衍生自此微生物之一棰非细.胞製劑之存在下*處埋式⑵之化合物Μ製備式⑴ 之化合物•該微生物或製劑能氧化Α族鍵徽殺陽菌素之多不飽和巨内酯之D -脯胺酸基之2 - 3鍵成為去氫脯胺酸甲 4 (210X297 公沒） {請先聞讀背面之注意事項再填窝本百) _装· •打· •線· 第8 1 1_ Ο 2 3 1 1號專利由請案中文說明書修正百（《 4年7月）Α7 Β7 五、發明説明（

基。在備此巨於能直接產率轉於中之混將一種之一種在 _微生 _基中在一榷衍因化合物! 及當使 _酵製程内酷。醱酵後，精製之巨化此巨内 _酵期間合物中之 IS徽菌微非细胞製本發明之物或自其期間及醱酵製程之後均可使用本發明以製本發明使得Μ 内I旨（2>產製巨酉旨（2>成為一'種 •本發巨内酯生物或劑直接一個特衍生之明使能 ⑵Μ增自此微加入此定具體非细胞自醱酵内酯⑴ 半合成夠直接加巨内生物衍巨内g旨實施例製劑至個較佳具賴實拖例本發明之生自鏈徽菌微生物之非細胞製比，本發明使能夠K 一種簡單 (2)之轉化程度當使用完整的徽甩衍生自這些微生物之非細胞培養液中分離出且不。本發明使能夠K高反應之基質。耗用衍生自醱酵製程酯⑴之量。確貿能夠生且具所需氧化活性產製培養基中。中，是直接加人鏈Μ 此巨内酯⑵之產製培中，此化合物（2)是Κ 劑處理。方式產製巨内酯⑴，生物時，高達5 0 96，製備時，超過90%。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中夬標隼局員工消費合作社印裝可Κ用於太發明之鏈徽菌微生物可Κ Κ數種方式選擇。特定言之，木發明提供一榑試驗，其可鑑定具所需酵素活性之微生物及估計所獲之活性。此試驗包括進行下列步驟： -在標記之化合物⑵之存在下，培養受試之_羝閑微生物或自其衍生之非細胞製劑之培養液， -6 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 83. 3. 10,000 u A6 _B6 五、發明説明（> -於一段期間內取出此培養基樣品* -分離化合物⑴及⑵· -測定化合物⑴中併入之檷記，及 -計算此標記對導人之標記之比例。由如此獲得之比例得以測定轉化為化合物⑴之量*及因此得K測定被培養之微生物之酵素活性程度。需知微生物之選擇可以藉任何其他能偵測是否有酵素活性之方法進行，且較佳的計量方式是視情況選用的。使用此選擇方法*已經鑑定出許多種具有高酵素活性之鐽徽菌微生物。特別是，產生鐽徽殺陽菌素及巨内酯⑴之鐽徽菌通常可適用本發明：?：方法。特定言之·產生鍵徽殺陽菌素之isr生物通常適合用於本發明之方法中，產生巨内酯⑴之微生物亦然。在這些微生物中•可以特別提及下列菌株：始旋结徽菌（S t r e p t 〇 a y c e s p r i s t i n a e s f> ί r a 1 i s) 亞伯鏈徽菌（Streptomyces alborectus) 艰粉酶鍵徽菌（S t r e p t o m y c e s d i a s t a t i c u s ) 禾生鐽嫌菌（S t r e p t o m y c e s g r a m i η o f a c i e n s ) 三鏖鏈徽菌（Streptoeyces mitakaensis 勞意德鍵徽菌（Streptomyces loidensis 概攬.色结雀菌（Streptomyces olivaceus) 奥斯特鍵徽菌（Streptonyces ostre.ogriseus)，及弗吉尼亞雄徽菌（Streptormycsa virginial)。』 (請先《讀背面之注意事項再填寫本页) •装· •打. •線· 甲 4 (210X297 父沒) A6 _B6 五、發明説明（) 埴些微生物可K在檷準需氧醱酵條件下培養。特定言之 *此營養培養基通常一種碳來源、一種氮來源及無機鹽類所姐成。作為碳來源•特別可K使用糖類、油類、有櫬酸類、糊精類、澱粉類、甘油等。作為氮來源*可K是胺基酸類、植物粗粉及萃取物（麥芽、大豆、棉籽、蕃茄、玉米等）、內臓、各種水解物（酪蛋白、酵母等）及工業副產物•諸如”酒廠乏可溶物”。作為礦物質來源，可K使用納、鉀、銨或鈣之氯化物、硝酸邇、碳酸鹽、硫酸鹽及磷酸鹽或微量元素，諸如鎂、鐵、銅、鋅、錳或姑。此外，使用上述之選擇試驗，申請人巳示知所需之酵素活性是由受試之多種微生物短暫地@現。已進行此酵素活性表現之動力學•其使得以界定受試微生物·ρ-素活性之表現是類客峰之生長期。於是*使本發明方法之產率有相當程度的改良·。在本發明之一個較佳具體實施例中，使用一種鏈徽菌微生物或衍生自一種微生物之非细胞製劑，其係處於酵素活性之額峰最佳產生階段。根據本發明，堪可以在第一選擇階段之後•使用具所需酵素活性之避擞菌微生物Μ製備衍生之菌株，其表現更佳的催化潛力及/或可使卫樂利用更有效率。此類菌株可Μ 藉使用多種突變方法而獲得•諸如： -_現作用-物：X射線、紫外線， -化學作用物：烷基化（甲烷磺酸乙酯、亞硝基胍、 NQO等）、雙官能烷基化或嵌入劑，甲 4(210X2971'沒) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •Κ.. •打. .線.

第8 1 1 Ο 2 :U 1號專利申請第中文說明書修正頁（8 4年7月）A7 B7 五、發明说明（ -用於突變性插入至D N A中之糸统··基因轉移子、整合質體、噬菌體或前噬菌體等，戎熟諸此技_者所知之任何其他技_。根據本發明，i署可K在眾多具有所需酵素活性之_徽菌細胞族群中，選擇在本發明方法中具有最佳酵素活性及/ 或得到最佳產率者。在本發.明之一個特定具體簧施例中，使用一種產生鏈徽殺陽菌素之微生物或一種衍生自產生鏈徽殺陽菌素微生物之激生物。較佳使用選自下列之微生物： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,衣-

、1T 始旋鏈徵菌輿斯特鏈徽菌三魔璉徵閑橄欖色鍵黴菌勞意德鍵黴菌 ATCC 25486 ATCC 27455 A T C C 1 5 2 9 7 ATCC 12019 ATCC 11415 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裝或自其衍生之微生物。此酵素轉化反應可K在醱酵培養基或在經過緩衝之水性培養*中進行，視使用完整的微生物抑或非细胞製劑，及此程序是直接在巨内酯生產培養基中進行抑制或使用自醱酵培養基中分離出之化合物⑵而定。當使用非细胞製劑時，加入一或多穐酵素輔因子至此反應培養基中可能是有利的。特定言之，下列因子可能可改良 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨ΟΧ297公釐） 83. 3. 10,000 A6 B6 五、發明説明（） (請先《讀背面之注意事項再填寫本页) 反應產率：NAD 、NADP、 HADH、 NADPH、 FAD 及 FMH。熟諸此技藝者可以根據所使用之條件調節其他反懕參數 0 本發明之另一俚主題係翮於此衍生自鏈徽菌微生物之非细胞製劑•其具一種酵素活性•能氧化A族鐽徽殺限菌素之多不飽和巨内酯之D -脯胺酸之2 - 3鍵成為去篚脯胺酸。可K藉許多種^法獲得這些非细胞製劑。特別是藉（ω斷裂上述之微生物及（b)選擇性移除细胞碎屑而獲·得。可Μ使用多種方法斷裂此微生物，及特別是物理、化學或酵素方法。可Κ提及之$理方法如超音波、使用玻璃珠或法國壓機研磨，及酵素方法，如溶菌酶。 •打· ♦線· 可以直接在细胞醱酵培養基中進行斷裂。然而，此程序 Κ在垤媛衝之水性培養基中進行為佳。就此而言，可Κ使用無機級衝液（磷酸鉀等）或有機緩衝液（Bis-Tris, Bis-Tris丙烷）。此外*此反應在堪原劑之存在下進行為佳。#別是可K使用二硫蘇糖酵。視靼始的微生物及斷裂條件•可以調節此非细胞製劑之出至介於由5.0及出 8.0·及Μ介於6及7為佳。當需要時，可Κ以多種方式移除此细胞碎屑，最簡單的方式包括將此於斷裂後獲得之懋浮液離心及溶解上澄液。為檢定此非细胞製劑確具所箱之酵索活性或為選揮活性最佳的非佃胞製劑，可Μ使用上述之試驗選擇微生物。 _ - 10 - 甲 4 (210X297公潘） A6 B6 λ ί得具額峰活性之非细胞製劑，可以在斷裂階段之前，測定整體微生物對應於酵索活性之最高表現之階段。特別是可Μ使用由上述試驗所得之動力學曲線。在產製本發明之非细胞製劑之方法中，較佳是在酵素活性顔峰生產階段斷裂微生物。述，於實㈣2所描述之情況，橄欖色鏈嫌菌培養菌之⑴在養基中鍵徽殺陽菌素A效價及⑵以如簧例2所述製得之非细胞製劑將化合物⑵轉化成·化合物⑴之百分比間之關係。 Μ下列實例說明本發明。奮例1 * 此實例描述碳14-放射性標記之巨内酯⑵之製備方法。將[II-14C]-L-脯胺酸（750微居里）加至始旋鏈》菌培養物中，其已在錐形燒瓶中之生產培養基上培餐17小時（參看實例3 )。當此培養物逹24小時，將其收集及賴Μ下列程序萃魬巨内酯⑴及⑵。加入0·'1Μ磷酸鹽媛衝液（ρΗ2.9，55奄升）及乙腈（25奄 .V ·. 升）至此培肩物（30奄升）中，及攪拌此混合物•再離心處理。於上涅液部分蒸發之後，以二氛甲烷（3 X 1體積）萃取及將3個二氛甲烷相合併及乾堍。Μ含甲酵（2%)之氛仿溶解残.留物及然後注入至一支矽凝膠管柱中•及Κ含甲酵（5%)之氯仿溶離化合物⑵。藉薄層層析法在矽凝膠上純化化合物⑵，係使用含甲酵（8%)之氯仿作溶離劑。 {請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) -装. •打. .緣. 肀 4(210X297 父沒) 11 A6 B6 五、發明説明（）於使用前藉HPLC在Nucleosil C8管柱（實例3中描述之系统）中再純化。若為非细胞製劑（參看圈1 )*加入標記之脯胺酸之時間選擇對獲得高比活性值很重要。奮俐2 此實例描述一種試驗*供選擇可Μ用於本發明之微生物 >其也說明酵素活座視開始生產鏈徽殺陽菌素後移出培養液之時間而定。1 受試驗之微生物是橄欖色鏈徽菌ATCC 12019，其培養於實例6之條件下。於不同的時間，Μ下列方式自此培養液試樣製備一種非细胞製劑：一粒離心小九（5克）•以出 7.2且含10%體積/體積之甘油〇. Π厂销酸鹽緩街液洗滌，混入100 mM Bis-tris丙烷媛衝液中•其出6.8 (10奄升 )含二碲蘇糖酵（5 )及溶菌酶（0.2奄克/升）。於 27 ΐ：培養此懸浮液30分鐘及然後K30,0 00 g離心30分鏟。將含ίέ蛋白（50微克）（衍生自K上所得之製劑）之非细胞萃取物Κ缌體積500微升在50 mH Bis-tris丙烷緩衝 » V ·. 液中•其出-6.8且含NADH(0.25微莫耳）、FMN ( 1奄微莫耳）及K碳14依照實例t方法標記（即55毫微居里）之化合物⑵（3.65微克）》於27勺下培養1小時。此反應藉加入乙聘（$00微-升）及0.1N鹽酸（500微升）停止。於均質化及離心處理後，將上澄液注入一支1 5公分5以 Nucleosil C8分析管柱中，MCH3CH(34%)及0.1Μ磷酸邇 _- 12- 甲 4(210X297 公发） {請先Μ讀背面之注意事項再蜞寫本页) .装. .打. .綠· 五、發明説明（） A6 B6 緩衝液之混合物，由2.9 (66%)K0.8奄升/分鐘溶離。此化合物⑴及⑵藉分光光度計於206奄微米偵測，及藏放射化學偵测加以测定。所得之结果列於圖1中。它們示知S. olivaceus具所需之酵素活性。它們也示知此^性是短暫地表現，顚峰生產階段是在培養21小時左右。最後，它們也示知活性開始於鏈徽殺陽菌素生凑階段開始•但活性非细胞萃取物可Μ 在鏈徽殺陽菌素生產開始之前製備。 g锎3 此實例說明當使用一種完整微生物之本發明方法。於無菌條件下加入始旋0黴菌ATCC 25486孢子之懸浮液 (0. 5毫升）至一種接種培養基（40畜D中，其係在一偭 300奄升之錐形燒瓶中。此接種培養基由玉米漿（10克/ 升）；蔗糖（15克 / 升）；（HH4)2S04(10克 / 升）；K2HP〇4( 1 克 / 升）；NaCI(3 克 / 升）；MgSCU· 7H2〇 (0.2克 / 升 );CaC〇3 (1.25克/升）姐成。在導人碳酸鈣之前，MS 氧化納讀節cH至6.9 。在一台迴轉搖動機上，以速率325 轉/分鐘'在27X：下搖動此錐形燒瓶46小時30分鐘。 χ . V ·. 將以上已指養46小時30分鐘之培養物在無菌條件下加入至生產培養基（30毫升）中：，其係在一個300毫升之錐形燒瓶中。此生產培養基由大豆餅（25克/升）；澱粉（7.5克/ 升）；《莓糖（-22.5克/升）；圓釀母（3.5克/升）；硫酸鋅 (0.5克/升）；及碳酸鈣（6克/升）姐成。在加入碳酸鈣之前* K鹽酸調節出至6。此錐形焼瓶於271CT *在一 {請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •打· •線· 甲 4(210X297 公沒) 13 五，發明説明（） Α6 Β6 台迴轉搖動櫬上以325轉/分鐘搖動24小時。於時間0及 17小時30分鐘時，加入依照實例1方法製備之碳14-檷記之化合物⑵（10毫/升）（即每錐形燒瓶5.2微居里之14C) 至這些錐形燒瓶中。於時間24小時，藉加入CH3CN (34% ) 及0.1 Μ瞵酸鹽媛衝液cH2.9(66%)之混合物（2容積）停止反懕。於均質化及離心處理锋，將上澄液（200微升）注入至 5w Nucleosil C8 管柱中：MCH3CN(34%)及 0.1 Μ磷酸鹽媛衝液出2.9(66%)之混合物溶離，以测定自放射性化合物⑵生成之化合物⑴°計算化合物⑵’轉化為化合物⑴之程度是從化合物⑴中發現之放射性對導入至錐形燒瓶中之放射性（錐形燒瓶;|)Π蓋有空氣循環：空氣流量1升 /分鐮）。 '^ 结果如下：化合物⑵添加時間轉化程度 {% ) 殘留化合物⑵ (% ) 0. 17小時30分鐘 36 ' ；45 11 29

奮例4· 重覆實例3中所述之程序•使用奥斯特鍵徽菌ATCC 甲 4(210X297 公》) {請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) .装· •打· •線· -14 ~

6 6 A B 五、發明说明（） 2 445 5孢子之懸浮液。獲得之结果如下：化合物⑵添加時間轉化程度（％ ) 殘留化合物⑵（％ ) 1 7小時3 0分鐘 44 19

g m fS 重覆實例3中所述之程序•使用三鹰鐽徽菌ATCC 15297¾子之懋浮液。所得之结果如下： (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) _装· 化合物⑵添加時間轉化程度（％ ) 殘留化合物⑵（％ ) 0 34 10 17小時30分鐘 43 18 •打· •線· 窗例ft 、：重覆實例3中所述之程序*使用橄欖色鏈徽菌ATCC 12019孢.子之-懸浮液。所得之结果如下： -15-甲 4 (210X297 父沒）

6 6 A B 五、發明説明（）化合物⑵添加時間轉化程度（％ ) 殘留化合物⑵（％ ) 0 39 14 1 7小時3 0分鐘 50 16 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) *装* 啻例7 重覆實例3中所述之程@，使用勞意德鏈徽菌ATCC 11415孢子懸浮液。獲得之结果如下化合物⑵添加時間轉化程度（％ ) 殘留化合物⑵（％ ) 0 46 11 1 7小時3*0分鐘 53 16 ,打· 管例R . - 將在實例6中之條件下獲得之培養22小時30分鐘之橄欖色鐽徽菌ATCC 120 19培養物之一粒離心小九（5克），以含甲 4(210X297 公《) -16 - 五、發明说明（） A6 B6 甘油（10%體積/體積）之0.1 Μ磷酸盥緩衡液出7.2洗滌後，置於50mM Bis-tris丙烷媛衝液pH 6.8 (10毫升）中 Ο 與依照實例1方法Μ碳14 (55毫微居里）標記之化合物 ⑵（3. 65微克）培養此製備物（500微升），於27C為時2小時。於培餐終了時*加人0.1 Μ磷酸鹽緩衝液pH 2.9(66% ) 及乙腈（34% )之混合物（1奄升）。於均質化及離心處理後 *藉HPLC (實例3)分析此上澄液（200微升）以测定放射性化合物⑴。化合物⑵轉化為化合物⑴之程度是30%。啻俐9 在實例7中之條件下獲得之培養ΊΤ小時30分鐘之勞意德鐽徽菌ATCC 1141 5培養物之一粒離心小九（5克），以含甘油（10%體積/體積）之0.1M磷酸鹽緩衝液出7.2洗滌後，置於50mM Bis-tris丙烷緩衝液pH 6.8 (10奄升）中。與依照實例1方法以碳14 (5 5毫微居里）標記之化合物 ⑵（3.65'微克）培養此製備物（500微升）·於27C為時2小時。於培養終了時加入0.1 Μ磷酸鹽緩衡液rH 2.9(66% ) « - ν * - 及乙腈（34¾ )之混合物（1毫升）°於均質化及離心處理後，藉HPLC (實例3 )分析、此上澄液（200微升）K测定放射性化合物⑴。化令物.⑵轉-化為化合物⑴之程度是53%。奮例1 0 (請先聞讀背面之注竞事項再填寫本頁) ·( .装· •打. .緣· _-17 - 甲 4 (210X297 乂沒） A6 B6 五、發明説明（）在實例3中之條件下獲得之培甭19小時之始旋鐽徽菌培養物之一粒離心小丸（5克），以含甘油（10%體積/ 體積 )之0.1 Μ磷酸鹽緩衝液出7.2洗滌後•置於含二硫蘇糖酵（5aM)及溶菌酶（0.2奄克/升）之lOOffiM Bis-trU丙烷緩街液出6.8 (10奄升）中。於27 t：培養此懸浮液30分鐘及然後於30,00 0g離心30分鐘。此上澄液構成非细胞製劑。在第一實驗中· jit製劑（207微升）（1毫克蛋白）是Μ總體積500微升在50nM Bis-tris丙烷嫒衝液中於27*0培養1 小時，其出6,8含HADH (0.25微莫耳）；FMN (1 毫微莫耳 )及依照例1 Μ碳14 (55毫微居里）標記之化合物⑵（3.65微克）。在第二實驗中•使用此非细胞製11(414微升）（2奄克蛋白質）〇藉加入CH3CN (500微升）及0.1Ν鹽酸（500微升）停止此反應。於均質化及離心處理後*將上澄液（200微升）注人一支 5wHucleosil C8 管柱中 ’ WCHaCN (34%)及 0.1M 磷酸嫒1Ϊ液出2.9(66%)之混合物溶離Μ測定此放射性化合物⑵生成之化合物⑴。如實例3之方法計算化合物⑵轉化為化合物XI)之程度。所得之结果如下：〜：甲 4(210X297 公沒) ....................................~ ..............^..............................^.........一....................^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) 18 A6 B6 五、發明説明（）懸浮液體積轉化程度（％ ) 殘留化合物⑵（％ ) 207微升 63 29 414微升 76 17 {請先聞讀背面之注意事項再填弈本頁) •装_ 奮俐1 1 •打· 在實例6中之條件下獲f之培養21小時之橄欖色鐽嫌菌 ATCC 12019培養物之一粒離心小九飞节克）*以含甘油（10 %體積/體積）之0.1 Μ磷酸鹽嫒衝液出7.2洗滌後，置於含二硫蘇糖酵（5ηΗ)及溶菌酶（0.2奄克/升）之ΙΟΟηΜ Bis-tris丙烷緩衝液出6.8 (10¾升）中。於271C培養此懸浮液30分鐘及然後於30,000g維心30分鐘。此上澄液構成非细胞細劑。含蛋白'質（0.1奄克）之非细胞萃取物（22微升之Μ上製 •、 · · •線· 劑）以總體-積500微升在50«^8丨3-1^丨3丙烷緩街液出6.8 中於27TC培養1小時，其含KADH (0.25微其耳）；FMH ( 1奄微莫耳）及依照實例1方法以碳14 (55毫微居里）標記之化合物②.（3 . 65微克）。藉加入CH3CN(500微升）及0.1Ν强酸（500微升）停止此反應。於均質化及離心處理後，藉HPLC分析此上澄液（200微 _- 19 - 甲 4 (210X297 公沒）五、發明説明（） A6 B6 升）以測定此放射性化合物⑴。化合物⑵轉化為化合物⑴之程度是93%。當例1 2 在實例7中之條件下獲得之養17小時30分鐘之勞意德鐽徽菌ATCC 11415培養物之一粒離心小九（5克）* Μ含甘油（10%體積/賭積’）之0.1Μ磷酸鹽嫒衝液ΡΗ7.2洗滌後，置於含二硫蘇糖g (5mM)及溶菌_ (0.2奄克/升）之100mM Tris丙烷媛衝液出6.8(10毫升）中，於27C培養此懸浮液 30分鐘及然後於30,000s離心30分鐘。此上澄液構成非细胞製劑。此非细胞製劑（79微升），即0 . 2 克之蛋白質，是Μ缌體積500微升在50bM Bis-tris丙烷緩衝液出6.8中於271 培養1小時•其含HADH (0.25微莫耳）；FMN (1毫微莫耳 )及依照實例1方法Μ碳14 (5 5奄微居里）檷記之化合物⑵ 〇，-·. 加入cii3CN(500微升）及0.1Ν鹽酸（500微升）停止此反應。於均霣化及離心後，藉HPLC分析此上澄液以測定此放射性化合物⑴^ 化合物⑵轉化為化合物饵之程度是92%。 {請先«讀背面之注意事項再填奪本页) .装· •打· .線. 甲 4 (210X297 公沒） 20

Claims

A8 B8 第M102311號專利甶請荼中文_ 修正本（84年7月）cs D8 申請專利範圍

種製備式（1)化合物之方法公告衣 0

0 0

.0 ⑴ 其包括Μ —種_黴菌屬微生物或衍生自該微生物之一種非細胞製劑鏟埋式（2)化合物，該微生物或製劑能氧化Α族鏈徵殺陽之多不飽和巨内酯之D -脯胺酸基之2 - 3鍵成為去氫脯胺酸基， ⑵ 而得到式< 1 '>化合物。 2 根搏申請專利範圍第1項之方法，其中該微生物或非細胞製劑是直接加至化合物（2)之產製培養基中。 3. 根撺申請專利範園第1項之方法，其中該反懕是在一搏绳緩衝之水性培養基中進行。 -1 衣纸張尺度適用中國國家標準·ΚΝ5)Α4規格(210 X 297公釐） ------------^ ---------訂 ~ 線 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局®工消費合作社印¾ 申請專利範圍 Α8 Β8 C8 D8 之. ⑵ 式中其法方。之得項而 3 理或箢 2 劑、製 03 1胞第細圍非範種利 1 專K 請是申物據合根化其自 ’生法衍方或之物項生 3 微或該 2 的、段 1 階第製。圍產劑範峰製利輯胞專性细請活非申素種搏酵一根於的其衍 ’或法物方生之微項素 3 菌或陽 2 殺、黴 m- 1鍵第生圍產範種利一專是請物申生撺微根菌

自選是物生微此中 0 其物，生法微方之之物項生 6 Μ 微第徽素圍鏈菌範旋陽利始 ¾專：徽請株鏈申菌生撺列產根下 0 fl 鍵伯亞菌徽is 粉0 ί兩 m 鍵生禾菌β 鏈0 三 00 德意勞 m 鍵色欖橄菌0 特斯奥菌徵鏈亞尼吉弗及 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製素酵種多或一在係〇其物’ 生法衍方之之。株項應 t囷 4 反些第行這圍進及範 f , 利在專存請之申子搏因根輔本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2丨0 X 297公釐）