TW202600606A - 抗體連接子結合物 - Google Patents

Abstract

本文描述新穎連接子，用於免疫結合物以將靶向部分連結至放射性螯合劑部分而不損害其中任一者之功能。本發明之連接子可提供在循環中穩定的連接，允許快速全身清除(包括自器官，諸如肝臟)、高腫瘤吸收，及高腫瘤與正常器官輻射暴露比(例如在肝臟及腎臟中)。該等免疫結合物可用於遞送包括α及β發射體之放射同位素以治療腫瘤或癌症。

Description

抗體連接子結合物

抗體(諸如IgG)對其抗原之強烈特異性使抗體成為治療學之首要靶向平台；然而，IgG的至少三週之典型血清半衰期，特別是由於長期暴露及慢性脫靶毒性而不利於放射性同位素的遞送，包括諸如錒-225 (²²⁵Ac)之α發射同位素以及諸如鎦-177 (¹⁷⁷Lu)及釔-90 (⁹⁰Y)之β發射同位素。經工程改造之較小抗體形式(例如單體scFv、僅重鏈抗體或單域抗體片段)的出現，以較小形式(例如15至30 kDa)提供完整尺寸抗體(例如IgG (約150 kDa))之強烈特異性及明顯更短之血清半衰期(例如30分鐘至2小時)。不幸的是，由於保留及腫瘤吸收不良，此等較短的半衰期可能無法提供足夠的時間進行有效目標結合，且此外，腎臟系統對此等小抗體形式之血漿清除可導致同位素在腎臟組織中積累及難以解決之脫靶毒性。

使用包含與Fc或重鏈恆定區(例如60至110 kDa)偶聯之抗原結合區的免疫結合物允許調節藥物動力學(PK)特性以實現腫瘤吸收與滲透之理想平衡，同時避免快速腎臟排泄、高腎臟吸收且降低其他全身放射毒性，諸如骨髓抑制。使用與重鏈恆定區偶聯之抗原結合區可將免疫結合物之分解代解及消除自腎臟轉移至肝臟。儘管此可增加活性之全身清除以減少由免疫結合物引起的全身放射性暴露，但此亦可將放射性暴露轉移至肝臟，而肝臟係已知的抗體清除及分解代解之主要部位。

仍需要這樣一類免疫結合物，其可藉由修飾將抗原結合區及免疫球蛋白重鏈恆定區連結至放射性螯合劑之連接子而進一步最佳化及調節其PK特性，由此將治療水平之放射同位素選擇性遞送至癌細胞。意外且出乎意料的是，與先前技術中用於免疫結合物之習知連接子系統相比較，本文所描述之連接子將靶向部分連結至放射性螯合劑部分而不損害其中任一者之功能性，提供在循環中穩定的連接，實現快速全身清除、高腫瘤吸收及高腫瘤與正常器官輻射暴露比(例如在肝臟及腎臟中)且促進更快肝臟清除。本文所描述之免疫結合物實現了將治療水平之放射同位素選擇性遞送至目標受體表現量較高及較低的癌細胞。

本發明係關於免疫結合物或放射性免疫結合物、包含其之組合物以使用此等免疫結合物及組合物之方法。本發明之免疫結合物及組合物具有許多用途，例如用於遞送放射性同位素以殺死目標細胞(例如表現放射性免疫結合物所結合之目標抗原的癌細胞)；用於偵測及表徵個體內之惡性細胞(例如目標抗原表現)；以及用於診斷及治療多種疾病及病況，諸如癌症、腫瘤及涉及抗原表現細胞之其他生長異常。

本發明透過特定遞送平台組分之選擇及特定組合解決在活體內靶向遞送α粒子及β粒子發射體時固有的許多難題。本發明的發射α粒子及β粒子之放射性同位素遞送平台提供比傳統IgG短的半衰期，但比較小單體抗體片段形式長的半衰期。此種半衰期允許降低由α或β發射體引起之毒性，同時使抗體片段在體內保持足夠長的時間以發揮治療活性。舉例而言，本揭露的發射α粒子及β粒子之放射性同位素遞送平台展現出增強之腫瘤靶向以及在諸如骨髓及腎臟之放射敏感性組織中減少之積累。另外，與先前技術中用於免疫結合物之習知連接子系統相比，含有本文所描述之連接子的本發明之發射α粒子及β粒子之放射性同位素遞送平台可提供在循環中穩定的連接，允許更快的全身清除、高腫瘤吸收及高腫瘤與正常器官輻射暴露比(例如在肝臟及腎臟中)以及自肝臟更快的清除。

另外且意外的是，本發明的發射α粒子及β粒子之放射性同位素遞送平台對具有不同抗原密度之腫瘤展現出優良的腫瘤結合及標記特性，此可能限制一些免疫結合物之某些用途。

在一個態樣中，本文描述一種免疫結合物，其包含：a)抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)螯合劑；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。在某些實施例中，該抗原結合區包含scFv多肽或VHH多肽。在某些實施例中，該抗原結合區包含scFv多肽。在某些實施例中，該抗原結合區包含VHH多肽。在某些實施例中，該抗原結合區經人源化。

在一個態樣中，本文描述一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽：式(I)其中：至少一個三級醯胺存在於將R¹連結至R⁸之線性鏈中；R¹係放射性核種螯合部分或其放射性核種錯合物；X¹不存在，或為-O-、-S-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-；m係1、2、3、4、5或6；x係0或1；R²係氫、鹵素、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)、-NR^a-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)，或者經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基)、-NR^a-(經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基)或C₄-C₂₀聚乙二醇；X²不存在，或為-O-、-S-、-S(=O)₂-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-；L¹不存在，或為C₁-C₁₀伸烷基、C₂-C₁₀伸烯基或C₁-C₁₀伸雜烷基，其中伸雜烷基係一個內部碳原子經以下置換的伸烷基：-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)₂-、-S(=O)(=NH)-、-S(=O)(=NR^b)-、-NR^b-、-P(=O)OR^b-、-NR^bC(=O)-、-C(=O)NR^b-、-OC(=O)NR^b-、-NR^bC(=O)NR^b-、-NR^bC(=N-CN)NR^b-、-NR^bC(=N-R^b)NR^b-或-NR^bC(=O)O-；L²不存在，或為、或；Y¹不存在，或為、或；n係0或1；各R³及R⁶獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-C(=O)NH₂、-C(=O)OH或選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸及甲基刀豆胺酸，其中R³或R⁶之何游離胺(-NH₂)獨立地視情況經-C(=O)(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)-C₄-C₂₀聚乙二醇取代；其中R³或R⁶之任何游離羧酸(-CO₂H)獨立地視情況經-C(=O)NH-(2,4,6-三甲基-3-溴苯基)、-C(=O)NH-(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)NH-(C₄-C₂₀聚乙二醇)置換；y係0或1；L³不存在，或為-(CH₂)_p-或；X³不存在，或為-CH₂-、-O-、-S-或-NR^d-；p係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；Y²係或；t係0或1；各R^a、R^b、R^c、R^d、R²、R⁴、R^4a、R⁵、R⁷及R^7a獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃、-L^a-(R^e)或R³；各u獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；各L^a獨立地不存在或為C₁-C₆伸烷基；R^e係經取代或未經取代之C₃-C₁₂環烷基、經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基、經取代或未經取代之苯基，或者經取代或未經取代之吡啶基；或R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基；或R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基；X⁴不存在，或為-CH₂-、-O-、-S-或-NR^c-；q係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；R⁸係能夠與生物靶向部分(R^B)共價結合之部分；且其中不為：或。

在一個態樣中，本文描述一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽：式(I)其中：至少一個三級醯胺存在於將R¹連結至R⁸之線性鏈中；R¹係放射性核種螯合部分或其放射性核種錯合物；X¹不存在，或為-O-、-S-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-；m係1、2、3、4、5或6；x係0或1；R²係氫、鹵素、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)、-NR^a-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)，或者經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基)、-NR^a-(經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基)或C₄-C₂₀聚乙二醇；X²不存在，或為-O-、-S-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-；L¹不存在，或為C₁-C₁₀伸烷基或C₁-C₁₀伸雜烷基，其中伸雜烷基係一個內部碳原子經以下置換的伸烷基：-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)₂-、-S(=O)(=NH)-、-S(=O)(=NR^b)-、-NR^b-、-P(=O)OR^b-、-NR^bC(=O)-、-C(=O)NR^b-、-OC(=O)NR^b-、-NR^bC(=O)NR^b-、-NR^bC(=N-CN)NR^b-、-NR^bC(=N-R^b)NR^b-或-NR^bC(=O)O-；L²不存在，或為、或；Y¹不存在，或為、或；n係0或1；各R³及R⁶獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-C(=O)NH₂、-C(=O)OH或選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸及甲基刀豆胺酸，其中R³或R⁶之任何游離胺(-NH₂)獨立地視情況經-C(=O)(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)-C₄-C₂₀聚乙二醇取代；其中R³或R⁶之任何游離羧酸(-CO₂H)獨立地視情況經-C(=O)NH-(2,4,6-三甲基-3-溴苯基)、-C(=O)NH-(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)NH-(C₄-C₂₀聚乙二醇)置換；y係0或1；L³不存在，或為-(CH₂)_p-或；X³不存在，或為-CH₂-、-O-、-S-或-NR^d-；p係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；Y²係或；t係0或1；各R^a、R^b、R^c、R^d、R²、R⁴、R^4a、R⁵、R⁷及R^7a獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃、-L^a-(R^e)或R³；各u獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；各L^a獨立地不存在或為C₁-C₆伸烷基；R^e係經取代或未經取代之C₃-C₁₂環烷基、經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基，或者經取代或未經取代之苯基；或R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基；或R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基；X⁴不存在，或為-CH₂-、-O-、-S-或-NR^c-；q係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；R⁸係能夠與生物靶向部分(R^B)共價結合之部分；且其中不為：或。

在一些實施例中，R^B係抗體或其片段、肽、核酸或小分子。在一些實施例中，R^B係抗體或其片段。在一些實施例中，R⁸係能夠與抗體或其片段之胺(-NH₂)或硫醇基(-SH)結合的部分。

在一些實施例中，式(I)化合物具有式(Ia)、(Ib)、(Ic)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(Ia)，式(Ib)或式(Ic)其中：X⁵係不存在、-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)_2-、-NR⁹-、-C(=O)-、-NR⁹C(=O)-、-C(=O)NR⁹-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-OC(=O)NR⁹-、-NR⁹C(=O)NR⁹-、-NR⁹C(=S)NR⁹-、-NR⁹C(=O)O-；且各R⁹獨立地選自氫及C₁-C₄烷基。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(Id)、(Ie)、(If)或(Ig)之結構、其醫藥學上可接受之鹽：式(Id)，式(Ie)，式(If)或式(Ig)其中X⁶係-NR⁹-或-(CH₂)_g-NR⁹-；且g係1、2、3或4。

在一些實施例中，R¹係1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸(DO3A)；1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,7-二乙酸(DO2A)；α,α',α'',α'''-四甲基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTMA)；1,4,7,10-肆(胺甲醯基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(DOTAM)；1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四丙酸(DOTPA)；2,2',2''-(10-(2-胺基-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三基)三乙酸；6,6'-(((吡啶-2,6-二基雙(亞甲基))雙((羧基甲基)氮二基))-雙(亞甲基))-二吡啶甲酸(H₄pypa)；6,6',6'',6'''-(((吡啶-2,6-二基雙(亞甲基))-雙-(氮三基))-肆(亞甲基))四吡啶甲酸(H₄py4pa)；2,2',2''-(1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三基)-三乙酸(NOTA)；6,6'-((乙-1,2-二基雙((羧基甲基)-氮二基))-雙(亞甲基))二吡啶甲酸(H₄octapa)；或3,6,9,12-肆(羧基甲基)-3,6,9,12-四氮雜十四烷二酸(TTHA)或其放射性核種錯合物。

在一些實施例中，R¹係：、、、、、、、、、、或；或其放射性核種錯合物。在一些實施例中，R¹係或；或其放射性核種錯合物。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(II)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(I)。

在一些實施例中，該式(II)化合物具有式(III)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(III)其中：X²不存在，或為-CH₂-或-O-；且X³不存在，或為-CH₂-或-O-。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(V)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(V)。

在一些實施例中，該式(V)化合物具有式(VI)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(VI)其中：X²不存在，或為-CH₂-或-O-；且X³不存在，或為-CH₂-或-O-。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(VII)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(VII)其中：X²不存在，或為-CH₂-或-O-；X³不存在，或為-CH₂-或-O-；且R¹⁰係、、、或。

在一些實施例中，R¹係；或其放射性核種錯合物。

在一些實施例中，R¹係；或其放射性核種錯合物。

在一些實施例中，該放射性核種係鑭系元素或錒系元素。在一些實施例中，該放射性核種係診斷性或治療性放射性核種。在一些實施例中，該放射性核種係發射鄂惹電子之放射性核種、發射α之放射性核種、發射β之放射性核種或發射γ之放射性核種。在一些實施例中，該放射性核種係發射α之放射性核種。在一些實施例中，該放射性核種係225-錒(²²⁵Ac)、213-鉍(²¹³Bi)、223-鐳(²²³Ra)、212-鉛(²¹²Pb)、111-銦(¹¹¹In)、67-鎵(⁶⁷Ga)、68-鎵(⁶⁸Ga)、99m-鎝(^99mTc)、90-釔(⁹⁰Y)、177-鎦(¹⁷⁷Lu)、186-錸(¹⁸⁶Re)、188-錸(¹⁸⁸Re)、64-銅(⁶⁴Cu)、67-銅(⁶⁷Cu)、153-釤(¹⁵³Sm)、89-鍶(⁸⁹Sr)、198-金(¹⁹⁸Au)、169-鉺(¹⁶⁹Er)、165-鏑(¹⁶⁵Dy)、99m-鎝(^99mTc)、89-鋯(⁸⁹Zr)或52-錳(⁵²Mn)。在一些實施例中，該放射性核種係225-錒(²²⁵Ac)。在一些實施例中，靶向部分係包含抗原結合區及免疫球蛋白重鏈恆定區之多肽，其中該多肽之分子量在60與110 kDa之間。在一些實施例中，靶向部分結合至δ樣蛋白質3(DLL3)、葉酸受體α(FOLR1)、葉酸受體α(FRα)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、表皮生長因子受體(EGFR)、類胰島素生長因子1(IGF-1)受體、血管內皮生長因子(VEGF)或腫瘤相關鈣信號轉導蛋白2(TROP2)、血管生成素、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD25 (IL2-R)、CD30、CD33、CD37、CD38、CD52、CD56、CD123 (IL-3R)、cMET、DLL/Notch、EpCAM、FGF/FGF-R、GD2、間皮素、連結蛋白細胞黏附分子-4、PDGFRα、RANKL、SLAMF7、密連蛋白18.2或DKK1。

在另一態樣中，本文提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，該醫藥組合物經調配用於藉由靜脈內投與來向哺乳動物投與。

在另一態樣中，本文提供一種治療哺乳動物之癌症的方法，其包含向該哺乳動物投與本文所描述之化合物，該化合物與靶向部分結合。在一些實施例中，該哺乳動物係人類。在一些實施例中，該癌症包含神經膠質瘤、甲狀腺癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、肝癌、胰臟癌、腎癌、前列腺癌、睪丸癌、乳癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌或黑色素瘤。

在另一態樣中，本文提供一種用於鑑別哺乳動物體內具有腫瘤之組織或器官的方法，其包含：i)向該哺乳動物投與本文所描述之免疫結合物的放射性核種錯合物；及ii)進行正電子發射斷層掃描(PET)分析、單光子發射電腦化斷層掃描(SPECT)或磁共振成像(MRI)；其中該腫瘤表現作為靶向部分之目標的受體；其中該放射性核種係診斷性放射性核種。在一些實施例中，步驟(ii)係在步驟(i)後某一時間量之後起始，該時間量足以使本文所描述之免疫結合物的放射性核種錯合物之間相互作用。

關於以下描述及所附申請專利範圍將更好地理解本發明之此等及其他特徵、態樣及優勢。本發明之前述要素可以自由地單獨組合或移除，以便得到本發明之其他實施例，下文中不作任何反對此類組合或移除的申明。

交叉參考本申請案主張2024年2月21日申請之美國臨時申請案第63/556,300號之權益，該案以全文引用的方式併入本文中。

序列表本申請案含有序列表，該序列表已以XML格式以電子方式提交且特此以全文引用之方式併入。該XML複本創建於2025年2月18日，命名為60924-729.851_SL.xml且大小為40,960個位元組。

下文將使用說明性非限制性實施例更充分地描述本發明。然而，本發明可以許多不同形式體現且不應被解釋為限於下文中所闡述之實施例。實際上，提供此等實施例係為了使本揭露更全面且向熟習此項技術者傳達本發明之範圍。為了使本發明可更易於理解，在下文將對某些術語進行定義。其他定義可見於本發明之實施方式內。

特定言之，在實施例中，本發明透過特定免疫結合物及放射性免疫結合物組分之選擇及特定組裝解決在活體內靶向遞送放射性同位素時所固有的許多難題。本發明之放射性同位素遞送平台提供比傳統IgG短的半衰期，但比較小單體抗體片段形式長的半衰期。在一些實施例中，主題放射性同位素遞送平台具有足夠大的分子大小(例如60 kDa至110 kDa)以實質上降低脫靶毒性，尤其是腎臟損傷(例如由發射α或發射β之同位素運載物引起)，且相較於傳統IgG，其大小足夠小以增加組織穿透，且維持目標特異性並增加目標組織中首次衰變事件的機率。在一些實施例中，主題放射性同位素遞送平台可用於安全且有效地活體內靶向遞送放射性同位素(諸如α或β發射體)，此係部分藉由降低由半衰期超過5天及/或分子量低於60 kDa之平台引起之某些不利影響來實現。在一些實施例中，主題放射性同位素遞送平台可用於安全且有效地活體內靶向遞送放射性同位素(諸如α或β發射體)，此係部分藉由相較於其他可能之遞送平台展現出減少的由放射分解引起之靶向能力損失來實現。在一些實施例中，主題放射性同位素遞送平台可用於安全且有效地活體內靶向遞送放射性同位素(諸如α或β發射體)，此係部分藉由相較於使用抗體片段的其他可能之遞送平台，在某些放射性標記過程(例如用某些螯合劑進行之高溫螯合)所需之溫度下展現出增加之製造穩定性來實現。免疫結合物

在一個態樣中，本發明提供以高親和力特異性結合至目標抗原的免疫結合物。在一些實施例中，本發明提供一種特異性結合至癌細胞之細胞表面抗原的免疫結合物。在一些實施例中，該免疫結合物包含三個、四個、五個、六個或更多個CDR或HVR (Kabat)。在一些實施例中，該免疫結合物以特徵為K_D≤1 μ M、＜100 nM、＜10 nM、＜1 nM、＜0.1 nM、＜0.01 nM或＜0.001 nM(例如10^{- 8}M或更低，例如10^{- 8}M至10^{- 13}M，例如10^{- 9}M至10^{- 13}M)之親和力結合特定抗原及/或抗原決定基。

本文所描述之免疫結合物可充當放射性同位素遞送之平台。本文所提供的放射性同位素遞送平台具有相對較短的半衰期(例如小於一週或兩週但大於兩小時至八小時)。

在一個實施例中，本揭露之免疫結合物包含：a)抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)螯合部分或其放射性核種錯合物。在一個實施例中，本揭露之免疫結合物包含：a)抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)螯合部分或其放射性核種錯合物；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。

在一個實施例中，本揭露之免疫結合物包含：a) VHH抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)螯合部分或其放射性核種錯合物。在一個實施例中，本揭露之免疫結合物包含：a) VHH抗原結合區；b)免疫球蛋白重鏈恆定區；及c)螯合部分或其放射性核種錯合物；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。

在一個實施例中，本揭露之免疫結合物包含：a)VHH抗原結合區；b)免疫球蛋白Fc區，一起稱為VHH-Fc；及c)螯合部分或其放射性核種錯合物。在一個實施例中，本揭露之免疫結合物包含：a) VHH抗原結合區；b)免疫球蛋白Fc區；及c)其螯合部分或放射性核種錯合物；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。

在一個實施例中，本揭露之免疫結合物包含：a) VHH抗原結合區；b)變異型免疫球蛋白Fc區；及c)螯合部分或其放射性核種錯合物。在一個實施例中，本揭露之免疫結合物包含：a) VHH抗原結合區；b)變異型免疫球蛋白Fc區；及c)螯合部分或其放射性核種錯合物；其中該免疫結合物之分子量在60與110 kDa之間。在某些實施例中，變異型免疫球蛋白Fc區包含一或多個胺基酸改變以減小免疫結合物之血清或血漿半衰期。

在一些實施例中，放射性同位素遞送平台具有大於約60 kDa之大小，以避免發射α之同位素運載物引起之某些毒性，諸如脫靶腎臟毒性。在一些實施例中，放射性同位素遞送平台具有小於約110 kDa之大小以便改良腫瘤穿透。在一些實施例中，放射性同位素遞送平台之大小在60與110 kDa之間，此係由於其具有兩個個別抗原結合臂形成之二聚結構，各抗原結合臂具有與鉸鏈區及野生型或變異型恆定區融合之VHH多肽。在一些實施例中，相對於野生型Fc區，變異型恆定區具有特定胺基酸取代以便減小半衰期及/或消除Fc效應功能。

在一個實施例中，免疫結合物之抗體構築體係由彼此共價連接(例如經由締合之重鏈恆定區或免疫球蛋白鉸鏈區之間的二硫鍵)的兩個抗原結合臂組成。該等抗原結合臂各獨立地由抗原結合區、鉸鏈區及變異型恆定區組成。在各抗原結合臂內，該臂之抗原結合區共價連接至該臂之鉸鏈區且該臂之鉸鏈區共價連接至該臂之變異型恆定區，使得鉸鏈區插入抗原結合臂內抗原結合區與變異型恆定區之間且由此連接抗原結合區與變異型恆定區。

在一較佳實施例中，免疫結合物中兩個抗原結合區中之至少一者係由一個或兩個僅重鏈可變(VHH)多肽組成。在一較佳實施例中，該兩個抗原結合區中之至少一者由一個VHH多肽組成。在一較佳實施例中，免疫結合物中兩個抗原結合區各由一個VHH多肽組成，該等VHH多肽相同或不同。

在一個實施例中，免疫結合物之抗原結合區結合至同一抗原。在一個實施例中，免疫結合物之抗原結合區結合至不同抗原。在一個實施例中，免疫結合物之抗原結合區相同。在一個實施例中，免疫結合物之抗原結合區不同。在一個實施例中，各抗原結合臂之抗原結合區由一個或兩個VHH多肽組成。

在一個實施例中，一個抗原結合臂之抗原結合區由兩個VHH多肽組成，且另一抗原結合臂之抗原結合區不包含VHH多肽。在一個實施例中，兩個抗原結合臂結合同一抗原。在一個實施例中，兩個抗原結合臂結合不同抗原。在一個實施例中，兩種VHH多肽相同。在一個實施例中，兩個VHH多肽不同。在一個實施例中，免疫結合物係雙特異性的。

在一個實施例中，一個抗原結合臂之抗原結合區由一個VHH多肽組成且另一個抗原結合臂之抗原結合區由兩個VHH多肽組成。在一個實施例中，兩個抗原結合臂結合同一抗原。在一個實施例中，兩個抗原結合臂結合不同抗原。在一個實施例中，三個VHH多肽相同。在一個實施例中，三個VHH多肽中之兩者相同且與第三個VHH多肽不同。在一個實施例中，三個VHH多肽不同。在一個實施例中，免疫結合物係雙特異性的。

在一個實施例中，免疫結合物中各抗原結合臂之抗原結合區由一個VHH多肽組成。在一個實施例中，VHH多肽結合至同一抗原。在一個實施例中，VHH多肽結合至不同抗原。在一個實施例中，VHH多肽相同。在一個實施例中，VHH多肽不同。在一個實施例中，免疫結合物係雙特異性的。抗原結合區

抗原結合區賦予免疫結合物特異性且可適當地包含小抗原結合多肽。此等小抗原結合多肽賦予多個優勢，諸如降低免疫結合物分子之總體大小，從而允許腫瘤穿透及標記。小抗原結合多肽可缺少某些對於結合可有可無之區域，諸如輕鏈恆定區、重鏈恆定區、CH1區或鉸鏈區。在某些實施例中，抗原結合區可缺少輕鏈可變區。在某些實施例中，小抗原結合區可具有10 kDa與40 kDa之間的分子量。

在一些實施例中，小抗原結合區具有約10 kDa至約40 kDa之分子量。在一些實施例中，小抗原結合區具有約10 kDa至約15 kDa、約10 kDa至約20 kDa、約10 kDa至約25 kDa、約10 kDa至約30 kDa、約10 kDa至約35 kDa、約10 kDa至約40 kDa、約15 kDa至約20 kDa、約15 kDa至約25 kDa、約15 kDa至約30 kDa、約15 kDa至約35 kDa、約15 kDa至約40 kDa、約20 kDa至約25 kDa、約20 kDa至約30 kDa、約20 kDa至約35 kDa、約20 kDa至約40 kDa、約25 kDa至約30 kDa、約25 kDa至約35 kDa、約25 kDa至約40 kDa、約30 kDa至約35 kDa、約30 kDa至約40 kDa或約35 kDa至約40 kDa之分子量。在一些實施例中，小抗原結合區具有約10 kDa、約15 kDa、約20 kDa、約25 kDa、約30 kDa、約35 kDa或約40 kDa之分子量。在一些實施例中，小抗原結合區具有至少約10 kDa、約15 kDa、約20 kDa、約25 kDa、約30 kDa或約35 kDa之分子量。在一些實施例中，小抗原結合區具有至多約15 kDa、約20 kDa、約25 kDa、約30 kDa、約35 kDa或約40 kDa之分子量。

抗原結合區可包含VHH多肽、scFv多肽或VNAR多肽。在某些實施例中，該抗原結合區包含VHH多肽。在某些實施例中，該抗原結合區包含ScFv多肽。在某些實施例中，該抗原結合區包含VNAR多肽。在某些實施例中，該抗原結合區經人源化。

抗原區可包含對熟習此項技術者所選抗原之特異性以達成所需功能，諸如靶向適合用所描述之免疫結合物或放射性免疫結合物治療之特定癌症、腫瘤或細胞類型。如本文所描述，抗原結合區可為此項技術中已知之抗體的片段或形式。完整抗體可經工程改造以符合本文所描述之各種小抗原結合區形式(例如scFv)。抗原結合區可特異性結合至腫瘤抗原(例如在癌細胞中特異性表現或富集之抗原)。在某些實施例中，腫瘤抗原包含Her2、Trop2、CEA、NaPi2b、uPAR、CDCP1、MUC-1、MUC-16、CEACAM-5、MR-1、Fn14、MAGE-3、NY-ESO-1、EGFR、PDGFR、IGF1R、CSF-1R、PSMA、PSCA、STEAP-1、FAP、TEM8、5T4、VEGFR、NRP1、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD39、CD44、CD47、CD52、CD70、CD71、CD74、CD79b、CD132、CD133、CD138、CD166、CD205、CD276、ROR1、ROR2、磷脂醯肌醇蛋白聚醣3、Trail受體2 (DR5)、PD-L1、間皮素、鈴蟾素、EpCAM、DARPP、CSPG4、半乳糖凝集素-3、整合素αvβ1、整合素αvβ3、整合素αvβ5、整合素αvβ6、整合素α5β1、整合素α-3、整合素α-5、整合素β-6、連結蛋白細胞黏附分子-4、Wnt活化抑制因子1、DLL3、轉鐵蛋白受體、葉酸受體α、組織因子、BCMA、c-Met、LIV-1、AXL、AFP、ENPP3、CLDN6/9、DPEP3、RNF43、LRRC15、PTK7、P-鈣黏蛋白、FLT3、EphA2、MTI-MMP、CXCR6、GD2或平滑抗原(Smoothened antigen，Smo)。在某些實施例中，腫瘤抗原包含人類表皮生長因子受體2 (HER2)、δ樣配體3 (DLL3)、葉酸受體α (FOLR1)或Wnt活化抑制因子1 (WAIF1)。在某些實施例中，腫瘤抗原包含HER2。在某些實施例中，腫瘤抗原包含DLL3。在某些實施例中，腫瘤抗原包含FOLR1。在某些實施例中，腫瘤抗原包含WAIF1。在某些實施例中，腫瘤抗原包含TROP2。在某些實施例中，腫瘤抗原包含EGFR。在某些實施例中，腫瘤抗原包含PSA。在某些實施例中，腫瘤抗原包含MUC-1。在某些實施例中，腫瘤抗原包含CEA。在某些實施例中，腫瘤抗原包含NY-ESO-1。

在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含與SEQ ID NO: 20中所示之序列至少85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致且結合至HER2的序列。

在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含：a) CDR1，其包含SEQ ID NO: 21中所示之胺基酸序列；b) CDR2，其包含SEQ ID NO: 22中所示之胺基酸序列；及c) CDR3，其包含SEQ ID NO: 23中所示之胺基酸序列。

在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含與SEQ ID NO: 30中所示之序列至少85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致且結合至DLL3的序列。

在某些實施例中，免疫結合物之抗原結合區包含：a) CDR1，其包含SEQ ID NO: 31中所示之胺基酸序列；b) CDR2，其包含SEQ ID NO: 32中所示之胺基酸序列；及c) CDR3，其包含SEQ ID NO: 33中所示之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明之免疫結合物包含以合成方式工程改造之抗體衍生物，諸如包含以下之蛋白質或多肽：自主VH域(諸如來自駱駝科、鼠類或人類來源)，單域抗體域(sdAb)、來源於駱駝科之重鏈抗體域(V_HH片段或V_H域片段)、來源於駱駝科V_HH片段或V_H域片段之重鏈抗體域、來源於軟骨魚之重鏈抗體域、免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR)、V_NAR片段、單鏈可變(scFv)片段、奈米抗體、包含V_H域之「駱駝化(camelized)」或「駱駝化(camelised)」支架、由重鏈及C_H1域組成的Fd片段、單鏈Fv-C_H3微型抗體、Fc抗原結合域(Fcab)、scFv-Fc融合物、多聚化scFv片段(雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體)、二硫鍵穩定之抗體可變(Fv)片段(dsFv)、由V_L、V_H、C_L及C_H1域組成的二硫鍵穩定之抗原結合(Fab)片段、包含二硫鍵穩定之重鏈及輕鏈的scFv(sc-dsFv)、二價奈米抗體、二價微型抗體、二價F(ab')₂片段(Fab二聚體)、雙特異性串聯V_HH片段、雙特異性串聯scFv片段、雙特異性奈米抗體、雙特異性微型抗體以及保留互補位及目標抗原結合功能的上述之任何基因操作之對應物。

在一些實施例中，免疫結合物為單價的。在其他實施例中，免疫結合物為多價的，諸如例如二價的。在一些其他實施例中，免疫結合物為二價且二聚的。在一些其他實施例中，二價免疫結合物為同二聚的。

在一個態樣中，本發明提供抗體構築體(單獨或在免疫結合物、放射性免疫結合物或靶向成像複合物之背景中，本發明中之每一者)，其包含VHH片段，該VHH片段包括含三個來源於駱駝科之重鏈CDR的重鏈可變區，該三個重鏈CDR以特異性及高親和力結合至抗原。

在一些實施例中，抗體構築體、免疫結合物、放射性免疫結合物或靶向成像複合物特異性結合至細胞表面上表現之抗原的至少一個細胞外部分。在一些實施例中，免疫結合物特異性結合至由目標細胞(諸如腫瘤細胞)表現之抗原的至少一個細胞外部分。

在一些實施例中，本揭露提供特異性結合至抗原之免疫結合物。在一些實施例中，免疫結合物包括含重鏈可變區(HVR-H)之抗體構築體，該重鏈可變區包含三個CDR：hCDR1、hCDR2及hCDR3，其諸如來源於駱駝科抗體或IgNAR。在一些實施例中，免疫結合物包含：(a)輕鏈可變區(HVR-L)，其包含三個CDR：lCDR1、lCDR2及lCDR3；及(b)重鏈可變區(HVR-H)，其包含三個CDR：hCDR1、hCDR2及hCDR3。在一些實施例中，抗體構築體係嵌合或人源化的。

在一些實施例中，本發明之免疫結合物包括含抗原結合域之抗體構築體，該抗原結合域係抗體片段，包括(但不限於)例如Fv、Fab、Fab'、scFv、HcAb片段、VHH片段、sdAb片段、雙功能抗體或F(ab')2片段。在一些其他實施例中，本發明之免疫結合物包含兩個或更多個抗體片段之多聚體，諸如包含兩個抗體片段之同二聚體或異二聚體，其各自能夠以特異性及高親和力結合至抗原且各自包含重鏈可變區(HVR-H)，該重鏈可變區包含三個CDR：hCDR1、hCDR2及hCDR3。重鏈恆定區

本文所描述之免疫結合物的抗原結合區可包含Fc或重鏈恆定區。抗原結合分子可藉由適合連接子或藉由IgG鉸鏈區直接與Fc或重鏈恆定區偶聯。包括重鏈恆定區或Fc區賦予諸如以下之優勢：允許最佳化及調諧血清半衰期、添加額外位點以結合螯合劑或細胞毒性劑，及允許使用標準程序及方法純化免疫結合物。添加重鏈恆定區亦將增加大小，由此可使免疫結合物之分解代謝及消除自腎臟轉移至肝臟。此可尤其賦予放射性免疫結合物安全優勢，因為腎臟比肝臟對輻射更敏感。可以對重鏈恆定區中存在的負責結合新生兒Fc受體(FcRn)之殘基進行影響效應功能或血清半衰期的改變。與FcRn結合通常會促成包含免疫球蛋白Fc之分子的半衰期增加，因此減少與FcRn的結合可縮短包含Fc之分子的半衰期。減少FcRn結合可賦予諸如縮短免疫結合物半衰期且因此減小後續由細胞毒性劑或放射性同位素引起之毒性的優勢。在某些實施例中，免疫球蛋白恆定區包含Fc區或由Fc區組成。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白之CH2域、免疫球蛋白之CH3域或免疫球蛋白之CH2及CH3域。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白之CH2及CH3域。對於人類個體之治療或成像，免疫球蛋白重鏈恆定區可為人類免疫球蛋白重鏈恆定區，防止或減少針對免疫結合物之內源性免疫反應。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區係人類免疫球蛋白重鏈恆定區。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區係IgA、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區係IgG1同型。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區係IgG4同型。

免疫球蛋白重鏈恆定區可為變異型恆定區，其包含一或多個胺基酸殘基之改變，由此賦予本文所描述之免疫結合物額外效用及有利特性。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的改變，該改變將降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能或改變該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的改變，該改變降低該免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能或減少該免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的改變，該改變降低免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能且減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的改變，該改變降低免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能。在某些實施例中，免疫球蛋白重鏈恆定區包含一或多個胺基酸殘基的改變，該改變減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。

免疫結合物重鏈恆定區之改變可降低與重鏈恆定區相關之效應功能，諸如固定補體、促進吞噬作用或將其他免疫效應細胞(例如NK細胞)募集至重鏈恆定區之能力。在某些實施例中，降低免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能的一或多個胺基酸殘基之改變係降低補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用ADCP或其組合的改變。在某些實施例中，根據EU編號，降低免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能的一或多個胺基酸殘基之改變係選自由以下組成之清單：(a) 297A、297Q、297G或297D；(b) 279F、279K或279L；(c) 228P；(d) 235A、235E、235G、235Q、235R或235S；(e) 237A、237E、237K、237N或237R；(f) 234A、234V或234F；(g) 233P；(h) 328A；(i) 327Q或327T；(j) 329A、329G、329Y或329R；(k) 331S；(l) 236F或236R；(m) 238A、238E、238G、238H、238I、238V、238W或238Y；(n) 248A；(o) 254D、254E、254G、254H、254I、254N、254P、254Q、254T或254V；(p) 255N；(q) 256H、256K、256R或256V；(r) 264S；(s) 265H、265K、265S、265Y或265A；(t) 267G、267H、267I或267K；(u) 268K；(v) 269N或269Q；(w) 270A、270G、270M或270N；(x) 271T；(y) 272N；(z) 292E、292F、292G或292I；(aa) 293S；(bb) 301W；(cc) 304E；(dd) 311E、311G或311S；(ee) 316F；(ff) 328V；(gg) 330R；(hh) 339E或339L；(ii) 343I或343V；(jj) 373A、373G或373S；(kk) 376E、376W或376Y；(ll) 380D；(mm) 382D或382P；(nn) 385P；(oo) 424H、424M或424V；(pp) 434I；(qq) 438G；(rr) 439E、439H或439Q；(ss) 440A、440D、440E、440F、440M、440T或440V；(tt) K322A；(uu) L235E；(vv) L234A及L235A；(ww) L234A、L235A及G237A；(xx) L234A、L235A及P329G；(yy) L234F、L235E及P331S；(zz) L234A、L235E及G237A；(aaa) L234A、L235E、G237A P331S；(bbb) L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S及P331S；(ccc) L234A、L235A及P329A；(ddd) G236R及L328R；(eee) G237A；(fff) F241A；(ggg) V264A；(hhh) D265A；(iii) D265A及N297A；(jjj) D265A及N297G；(kkk) D270A；(lll) A330L；(mmm) P331A或P331S或；(nnn) E233P；(ooo) L234A、L235E、G237A、A330S及P331S；或(ppp) (a) - (ooo)之任何組合。在某些實施例中，根據EU編號，降低免疫球蛋白重鏈恆定區之效應功能的一或多個胺基酸殘基之改變包含L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。

免疫結合物重鏈恆定區之改變可縮短免疫結合物之血清半衰期。在某些實施例中，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的胺基酸改變將縮短免疫結合物之血清半衰期。在某些實施例中，根據EU編號，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的改變係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：251、252、253、254、255、288、309、310、312、385、386、388、400、415、433、435、436、439、447及其組合。在某些實施例中，根據EU編號，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的改變係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：253、254、310、435、436及其組合。在某些實施例中，根據EU編號，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的改變係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：I253A、I253D、I253P、S254A、H310A、H310D、H310E、H310Q、H435A、H435Q、Y436A及其組合。在某些實施例中，根據EU編號，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的改變係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：I253A、S254A、H310A、H435Q、Y436A及其組合。在某些實施例中，根據EU編號，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的改變係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：I253A、H310A、H435Q及其組合。在某些實施例中，根據EU編號，改變或減少免疫結合物與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的改變係針對選自由以下組成之清單的胺基酸殘基：H310A、H435Q及其組合。

在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO:1中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 1一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 1中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中根據EU編號，重鏈恆定區包含I253A取代。

在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO:2中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 2一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 2中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中根據EU編號。重鏈恆定區包含S254A取代。

在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO:3中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 3一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 3中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中根據EU編號，重鏈恆定區包含H310A取代。

在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO:4中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 4一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 4中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中根據EU編號，重鏈恆定區包含H435Q取代。

在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO:5中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 5一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 5中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中根據EU編號，重鏈恆定區包含Y436A取代。

在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 6中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 6一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 6中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中根據EU編號，重鏈恆定區包含H310A/H435Q取代。

在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 7中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 7一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 7中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列，其中根據EU編號，重鏈恆定區包含L234A、L235E、G237A、A330S及P331S取代。

在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 8中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 8一致的序列，其中根據EU編號，重鏈恆定區包含L234A、L235E、G237A、H310A、A330S及P331S取代。

在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 9中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 9一致之序列。在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 9一致的序列，其中根據EU編號，重鏈恆定區包含L234A、L235E、G237A、H435Q、A330S及P331S取代。

在某些實施例中，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 10中所示之序列至少90%、95%、97%、98%或99%一致的序列。在某些實施例中，根據EU編號，免疫結合物重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 10一致之序列。

在一個實施例中，兩個變異型恆定區各具有至少一個FcRn結合突變。在一個實施例中，兩個變異型恆定區各具有相同的FcRn結合突變。在一個實施例中，兩個變異型恆定區各具有不同的FcRn結合突變。

在一個實施例中，免疫結合物中變異型恆定區中之至少一者具有至少一個FcRn結合突變。在一個較佳實施例中，免疫結合物之兩個變異型恆定區各具有至少一個FcRn結合突變，該等FcRn結合突變相同或不同。

實現FcRn結合之改變可縮短免疫結合物之血清半衰期，因此允許熟習此項技術者選擇適合特定成像或治療目標之半衰期。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約12小時至約120小時。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約12小時至約24小時、約12小時至約36小時、約12小時至約48小時、約12小時至約60小時、約12小時至約72小時、約12小時至約84小時、約12小時至約96小時、約12小時至約108小時、約12小時至約120小時、約24小時至約36小時、約24小時至約48小時、約24小時至約60小時、約24小時至約72小時、約24小時至約84小時、約24小時至約96小時、約24小時至約108小時、約24小時至約120小時、約36小時至約48小時、約36小時至約60小時、約36小時至約72小時、約36小時至約84小時、約36小時至約96小時、約36小時至約108小時、約36小時至約120小時、約48小時至約60小時、約48小時至約72小時、約48小時至約84小時、約48小時至約96小時、約48小時至約108小時、約48小時至約120小時、約60小時至約72小時、約60小時至約84小時、約60小時至約96小時、約60小時至約108小時、約60小時至約120小時、約72小時至約84小時、約72小時至約96小時、約72小時至約108小時、約72小時至約120小時、約84小時至約96小時、約84小時至約108小時、約84小時至約120小時、約96小時至約108小時、約96小時至約120小時或約108小時至約120小時。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時、約96小時、約108小時或約120小時。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為至少約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時、約96小時或約108小時。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為至多約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時、約96小時、約108小時或約120小時。

在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約1天至約10天。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約1天至約2天、約1天至約3天、約1天至約4天、約1天至約5天、約1天至約6天、約1天至約7天、約1天至約8天、約1天至約9天、約1天至約10天、約2天至約3天、約2天至約4天、約2天至約5天、約2天至約6天、約2天至約7天、約2天至約8天、約2天至約9天、約2天至約10天、約3天至約4天、約3天至約5天、約3天至約6天、約3天至約7天、約3天至約8天、約3天至約9天、約3天至約10天、約4天至約5天、約4天至約6天、約4天至約7天、約4天至約8天、約4天至約9天、約4天至約10天、約5天至約6天、約5天至約7天、約5天至約8天、約5天至約9天、約5天至約10天、約6天至約7天、約6天至約8天、約6天至約9天、約6天至約10天、約7天至約8天、約7天至約9天、約7天至約10天、約8天至約9天、約8天至約10天或約9天至約10天。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為至少約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天或約9天。在某些實施例中，免疫結合物之血清半衰期為至多約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天。

在某些實施例中，重鏈恆定區具有約10 kDa至約25 kDa之分子量。在某些實施例中，重鏈恆定區具有約10 kDa至約15 kDa、約10 kDa至約20 kDa、約10 kDa至約25 kDa、約15 kDa至約20 kDa、約15 kDa至約25 kDa或約20 kDa至約25 kDa之分子量。在某些實施例中，重鏈恆定區具有約10 kDa、約15 kDa、約20 kDa或約25 kDa之分子量。在某些實施例中，重鏈恆定區具有至少約10 kDa、約15 kDa或約20 kDa之分子量。在某些實施例中，重鏈恆定區具有至多約15 kDa、約20 kDa或約25 kDa之分子量。

在一些實施例中，本發明之免疫結合物包含連接子或鉸鏈區，其為本發明中將抗原結合區連接至重鏈恆定區或變異型恆定區的多肽。連接免疫球蛋白各組分的天然存在之鉸鏈區及合成鉸鏈區係此項技術中熟知的且可用於本發明中。舉例而言，參見US 8,067,548及其中之參考文獻。

在一個實施例中，免疫結合物之鉸鏈區相同。在一個實施例中，免疫結合物之鉸鏈區不同。

抗原結合區及重鏈恆定區(具有或不具有改變之胺基酸序列)可藉由適合的鉸鏈或連接子序列連結。在某些實施例中，抗原結合區藉由連接子胺基酸序列或人類IgG鉸鏈區與免疫球蛋白重鏈恆定區偶聯。適當IgG鉸鏈區包含且包括IgG1或IgG4鉸鏈區。在某些實施例中，鉸鏈區係IgG1鉸鏈區。在某些實施例中，鉸鏈區係根據EU編號具有C220S取代之IgG1鉸鏈區。適合鉸鏈區包括以下中所描述之鉸鏈區：Wu等人, 「Multimerization of a chimeric anti-CD20 single-chain Fv-Fc fusion protein is mediated through variable domain exchange」,Protein Engineering,Design and Selection, 第14卷, 第12號, 2001年12月, 第1025-1033頁；Shu等人, 「Secretion of a single-gene-encoded immunoglobulin from myeloma cells.」Proceedings of the National Academy of Sciences1993年9月, 90 (17) 7995-7999；Davis等人, 「Abatacept binds to the Fc receptor CD64 but does not mediate complement-dependent cytotoxicity or antibody-dependent cellular cytotoxicity.」J Rheumatol. 2007年11月;34(11):2204-10。適當的鉸鏈亦可包括基於非IgG之多肽連接子。連接子胺基酸序列可主要包括以下胺基酸殘基：Gly、Ser、Ala或Thr。連接子肽的長度應足以連接兩個分子，其連接方式使得兩個分子相對於彼此呈現正確構形，並使得其保留所需活性。在一個實施例中，連接子為約1至50個胺基酸長，或約1至30個胺基酸長。在一個實施例中，可使用長度為1至20個胺基酸之連接子。有用的連接子包括甘胺酸-絲胺酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n及(GGGS)n，其中n係至少一之整數；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；及其他可撓性連接子。用於連接抗體片段或單鏈可變片段之例示性連接子可包括AAEPKSS (SEQ ID NO: 256)、AAEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 257)、GGGG (SEQ ID NO: 258)或GGGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 259)。或者，多種非蛋白質性聚合物可用作連接子，包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇及聚丙二醇之共聚物，亦即，可能用作連接子。

免疫結合物之總大小可使其促進組織穿透、穩定性及/或清除。在某些實施例中，免疫結合物具有約60 kDa至約120 kDa之分子量。在某些實施例中，免疫結合物之分子量為約60 kDa至約65 kDa、約60 kDa至約70 kDa、約60 kDa至約75 kDa、約60 kDa至約80 kDa、約60 kDa至約90 kDa、約60 kDa至約100 kDa、約60 kDa至約110 kDa、約60 kDa至約120 kDa、約65 kDa至約70 kDa、約65 kDa至約75 kDa、約65 kDa至約80 kDa、約65 kDa至約90 kDa、約65 kDa至約100 kDa、約65 kDa至約110 kDa、約65 kDa至約120 kDa、約70 kDa至約75 kDa、約70 kDa至約80 kDa、約70 kDa至約90 kDa、約70 kDa至約100 kDa、約70 kDa至約110 kDa、約70 kDa至約120 kDa、約75 kDa至約80 kDa、約75 kDa至約90 kDa、約75 kDa至約100 kDa、約75 kDa至約110 kDa、約75 kDa至約120 kDa、約80 kDa至約90 kDa、約80 kDa至約100 kDa、約80 kDa至約110 kDa、約80 kDa至約120 kDa、約90 kDa至約100 kDa、約90 kDa至約110 kDa、約90 kDa至約120 kDa、約100 kDa至約110 kDa、約100 kDa至約120 kDa或約110 kDa至約120 kDa。在某些實施例中，免疫結合物之分子量為約60 kDa、約65 kDa、約70 kDa、約75 kDa、約80 kDa、約90 kDa、約100 kDa、約110 kDa或約120 kDa。在某些實施例中，免疫結合物之分子量為至少約60 kDa、約65 kDa、約70 kDa、約75 kDa、約80 kDa、約90 kDa、約100 kDa或約110 kDa。在某些實施例中，免疫結合物之分子量為至多約65 kDa、約70 kDa、約75 kDa、約80 kDa、約90 kDa、約100 kDa、約110 kDa或約120 kDa。

在一些實施例中，免疫結合物之分子量大於60 kDa、70 kDa、75 kDa、80 kDa、82 kDa、83 kDa、85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa或89 kDa。在一些實施例中，免疫結合物具有小於110 kDa、100 kDa、95 kDa、93 kDa、91 kDa、90 kDa、89 kDa、88 kDa、87 kDa、86 kDa、85 kDa、84 kDa、83 kDa、82 kDa、81 kDa或80 kDa之分子量。在一些實施例中，免疫結合物之分子量大於60 kDa、65 kDa、70 kDa、71 kDa、72 kDa、73 kDa、74 kDa、75 kDa、76 kDa、77 kDa、78或79 kDa且小於110 kDa、100 kDa、95 kDa、93 kDa、91或90 kDa。

本文中所描述之免疫結合物及/或重鏈恆定區變異體的大小使得本文中所包括之免疫結合物的安全概況或治療指數增加。此類安全概況可反映在諸如腎臟及骨髓之放射敏感性主要組織中輻射積累之減少及/或在目標組織(亦即，腫瘤或癌組織)或諸如肝臟之更具放射耐受性之器官中輻射積累之增加。

在某些實施例中，本揭露之免疫結合物每次治療引起總輻射暴露，以戈雷(Gy)量測。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於20 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於19 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於18 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於17 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於16 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於15 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於14 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於13 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於12 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於11 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於10 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於9 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於8 Gy或更低。在某些實施例中，腎臟每次治療將暴露於5 Gy或更低。

在某些實施例中，本揭露之免疫結合物每次治療引起總輻射暴露，以戈雷(Gy)量測。在某些實施例中，骨髓每次治療將暴露於4 Gy或更低。在某些實施例中，骨髓每次治療將暴露於3 Gy或更低。在某些實施例中，骨髓每次治療將暴露於2 Gy或更低。在某些實施例中，骨髓每次治療將暴露於1.5 Gy或更低。在某些實施例中，骨髓每次治療將暴露於1.0 Gy或更低。在某些實施例中，骨髓每次治療將暴露於0.5 Gy或更低。

在某些實施例中，當以每公克的注射劑量百分比量測時，本揭露之免疫結合物使得腫瘤中的輻射量相較於腎臟中的輻射量增加。在某些實施例中，每公克之腫瘤注射劑量百分比與每公克之腎臟注射劑量百分比的比率大於2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

在某些實施例中，當以每公克的注射劑量百分比量測時，本揭露之免疫結合物使得腫瘤中的輻射量相較於血液中的輻射量增加。在某些實施例中，每公克之腫瘤注射劑量百分比與每公克之血液注射劑量百分比的比率大於2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

在某些實施例中，當以每公克的注射劑量百分比量測時，本揭露之免疫結合物使得腫瘤中的輻射量相較於骨髓中的輻射量增加。在某些實施例中，每公克之腫瘤注射劑量百分比與每公克之骨髓注射劑量百分比的比率大於2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

在某些實施例中，當以每公克的注射劑量來量測時，本揭露之免疫結合物使得肝臟中的輻射量相較於腎臟中的輻射量增加。在某些實施例中，每公克之腫瘤注射劑量百分比與每公克之骨髓注射劑量百分比的比率大於3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

在一些實施例中，本發明涵蓋包含一種包含Fc區的本發明之免疫結合物之變異體，其中該變異體具有部分但並非全部效應功能，由此使其成為免疫結合物活體內半衰期至關重要而某些效應功能(諸如補體及ADCC)不必要或有害之應用的期望候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/耗盡。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保免疫結合物缺少FcγR結合能力(因此可能缺少ADCC活性)但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之主要細胞，即NK細胞僅表現FcγγRIIII，而單核球表現FcγγRI、FcγγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet之Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)第464頁上的表3中。評估感興趣分子之ADCC活性的活體外分析之非限制性實例描述於US 5,500,362(參見例如Hellstrom, I.等人, Proc Natl Acad Sci USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人, Proc Natl Acad Sci USA 82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見Bruggemann, M.等人, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))中。或者，可以採用非放射性分析方法(參見例如用於流式細胞分析技術的ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96^®非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。可用於此等分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地或另外，可在活體內，例如在動物模型中，諸如Clynes等人Proc Natl Acad Sci USA 95:652-656 (1998)中所揭露之動物模型中評定感興趣分子之ADCC活性。亦可進行Clq結合分析以確認免疫結合物不能結合Clq且因此缺乏CDC活性(參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之Clq及C3c結合ELISA)。為了評定補體活化，可執行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J. Immunol. Methods202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人, Blood101:1045-1052 (2003)；Cragg, M.S.及M.J. Glennie,Blood103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法測定FcRn結合及活體內清除率/半衰期(參見例如Petkova, S.B.等人, Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006))。

具有降低之效應功能的免疫結合物包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的免疫結合物(US 6,737,056)。此等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更兩者處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(US 7,332,581)。

免疫結合物可根據EU編號，藉由包含以下改變而具有改變之效應功能：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S，該等改變減少Fc受體結合。參見例如US 8,613,926；或Andersson C, Wenander等人, 「Rapid-onset clinical and mechanistic effects of anti-C5aR treatment in the mouse collagen-induced arthritis model.」Clin Exp Immunol. 2014年7月;177(1):219-33。

與FcR之結合改良或減少的某些免疫結合物變異體已有描述(參見例如US 6,737,056；WO 2004/056312；Shields等人,J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001))。

在一些實施例中，在Fc區中產生使Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即，改良或降低)的改變，例如US 6,194,551；WO 1999/051642；Idusogie等人,J . Immunol .164: 4178-4184 (2000)中所描述。

具有延長之半衰期及改良的與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)之結合的抗體(Guyer等人, J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等人, J. Immunol. 24:249 (1994))描述於US2005/0014934中。該等抗體包含具有一或多個改善Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此等Fc變異體包括在以下一或多個Fc區殘基處具有取代之變異體：434或435，例如Fc區殘基N434A或R435A之取代(US 7,371,826)。關於Fc區變異體之其他實例亦參見Duncan及Winter, Nature 322:738-40 (1988)；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 1994/029351。

為了延長抗體之血清半衰期，可以將救助受體結合抗原決定基併入抗體(尤其是抗體片段)中，如例如美國專利5,739,277中所描述。如本文所使用，術語「救助受體結合抗原決定基」係指負責延長IgG分子之活體內血清半衰期的IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc區之抗原決定基。

一般熟習此項技術者將認識到，本文中某些教示適用於本發明之抗體構築體、靶向成像複合物、免疫結合物及放射性免疫結合物，但本文中提及僅一種或兩種此類組合物(例如免疫結合物)作為非限制性實例。本發明包含所有此類申請案。螯合劑

如本文所描述，在一些實施例中，螯合劑(亦即，R¹)與靶向腫瘤之部分(例如包含本文所描述之抗原結合區及免疫球蛋白重鏈恆定區之多肽)偶聯。螯合部分使靶向腫瘤之部分能夠裝載適當放射性同位素，諸如β發射體或α發射體。螯合劑可與抗原結合區、重鏈恆定區、免疫球蛋白Fc區或其任何組合偶聯。此類偶聯可適當地藉由共價連接至免疫結合物、抗原結合區、重鏈恆定區、免疫球蛋白Fc區或其任何組合之一或多個胺基酸來進行。

在一些實施例中，螯合劑在預定的多肽(亦即，抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定)與螯合劑比率下結合。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑係以1:1至8:1之比率與抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區偶聯。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑以1:1至6:1之比率與抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區偶聯。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑以2:1至6:1之比率與抗原結合區及/或免疫球蛋白重鏈恆定區偶聯。

在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含DOTA或DOTA衍生物。在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含DOTAGA。在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含macropa或macropa衍生物。在一個實施例中，放射性同位素螯合組分包含Py4Pa或Py4Pa衍生物。

在一個實施例中，螯合劑包含DOTA或DOTA衍生物。在一個實施例中，螯合劑包含DOTAGA。在一個實施例中，螯合劑包含macropa或macropa衍生物。在一個實施例中，螯合劑包含Py4Pa或Py4Pa衍生物。在一個實施例中，螯合劑包含噬鐵蛋白(siderocalin)或噬鐵蛋白衍生物。

在某些實施例中，螯合劑係放射性同位素螯合劑。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑係選自由以下組成之清單：四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、α-(2-羧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTAGA)或(Py4Pa)。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑係DOTA。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑係DOTAGA。在某些實施例中，放射性同位素螯合劑係Py4Pa。

螯合劑之實例係1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)及前述之相關類似物。此類螯合劑適用於配位金屬離子，如發射α及發射β之放射性核種。

在一些實施例中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物的螯合劑係選自包含以下之群：雙官能螯合劑、DOTA、DO3A、DOTAGA、Bn-DOTA、Bn-DTPA、Bn-CHX-A''-DTPA、Bn-TCMC、macropa(Thiele NA等人, Angew. Chem. Int. Ed. 56:1 (2017))、crown (Yang H等人, Chem. Eur. J. 26:11435 (2020))、P-SCN-Ph-Et-Py4Pa (Li L等人, Bioconjugate Chem. ASAP (2020))、3,2-HOPO (Wickstroem K等人, Int. J. Rad. Onc. Biol. Phys. 105:410 (2019))(關於此等及其他雙官能螯合劑之評述，參見例如Price EW及Orvig C Chem. Soc. Rev., 2014, 43:260 (2014)；以及Brechbiel MWQ. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 52:166 (2008))。

對於²²⁵Ac免疫結合物，此項技術中已知多種非環狀及環狀配位體作為適合螯合劑(參見例如Davis I等人,Nucl Med Biol26: 581 (1999)；Chappell L等人,Bioconjug Chem11: 510 (2000)；Chappell, L等人,Nucl Med Biol30: 581 (2003)；McDevitt M等人,Appl Radiat Isot57: 841 (2002)；Gouin S等人,Org Biomol Chem3: 453 (2005)；Thiele N等人,Angew Chem Int Ed Engl56: 14712 (2017))。

在某些實施例中，螯合劑係適合於α發射體螯合之螯合劑。一些適於α發射體之螯合劑描述於Yang的人, 「Harnessing α-Emitting Radionuclides for Therapy: Radiolabeling Method Review.」J Nucl Med.2022年1月;63(1):5-13中。

在某些實施例中，適合於α發射體螯合之螯合劑係選自由以下組成之清單：1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；1,4,7-參(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(DO3A)；α-(2-羧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTAGA)；6,6',6'',6'''-(((吡啶-2,6-二基雙(亞甲基))雙(氮三基))-肆(亞甲基))四吡啶甲酸(Py4Pa)；2,2',2'',2'''-(1,10-二氧雜-4,7,13,16-四氮雜環-十八烷-4,7,13,16-四基)四乙酸(Crown)；6,6'-((1,4,10,13-四氧雜-7,16-二氮雜環十八烷-7,16-二基)雙(亞甲基))-二吡啶甲酸(Macropa)；1,4,7,10,13,16-六氮雜環十六烷-1,4,7,10,13,16-六乙酸(HEHA)；6,6'-[(1R,2R)-1,2-環己烷二基雙[[(羧基甲基)亞胺基]亞甲基]]雙[2-吡啶甲酸] (CHXoctapa)；3,7-二氮雜聯環[3.3.1]壬烷-1,5-二甲酸、7-[(6-羧基-2-吡啶基)甲基]-9-羥基-3-甲基-2,4-二-2-吡啶基-,1,5-二甲酯(Bispa)；6,6'-(((氧基雙(乙-2,1-二基))雙((羧基甲基)氮二基))雙(亞甲基))-二吡啶甲酸(Noneunpa)；及其組合。

在某些實施例中，螯合劑係適合於β或γ發射體螯合之螯合劑。在某些實施例中，適合於β或γ發射體螯合之螯合劑係選自由以下組成之清單：(1R,4R,7R,10R)-a,a',a",a"'-四甲基-1,4,7,10-四氮雜-環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTMA)；(1,4,7,10-肆(胺甲醯基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷) (DOTAM)；1,4,7,10-四氮雜環-十二烷-1,4,7,10-四丙酸(DOTPA)；(2-(4,7,10-參(2-胺基-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環-十二烷-1-基)乙酸) (DO3AM-乙酸)；1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-肆(亞甲基膦酸) (DOTP)；1,4,6,10-四氮雜環癸烷-1,4,7,10-四亞甲基膦酸(DOTMP)；1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-肆(乙醯胺基-亞甲基膦酸) (DOTA-4AMP)；(1,4,8,11-四氮雜聯環[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸) (CB-TE2A)；1,4,7-三氮雜-環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)；1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三(亞甲基膦酸) (NOTP)；1,4,8,11-四氮雜環-十四烷-1,4,8,11-四丙酸(TETPA)；1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)；1,4,7,10,13-五氮雜環十五烷-N,N',N'',N'",N""-五乙酸(PEPA)；N,N'-雙(6-羧基-2-吡啶基甲基)-乙二胺-N,N'-二乙酸(H4Octapa)；1,2-[[6-(羧基)-吡啶-2-基]-甲基胺基]乙烷(H2Dedpa)；N,N'-(亞甲基膦酸酯)-N,N'-[6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基]-甲基-1,2-二胺基乙烷(H6phospa)；三伸乙基-四胺-N,N,N',N'',N'",N"'-六乙酸(TTHA)；四氮雜環-十二烷二甲烷-膦酸(DO2P)；羥丙基四氮雜環十二烷三乙酸(HP-DO3A)；乙二胺四乙酸(EDTA)；二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)；二伸乙基三胺五乙酸-雙甲基醯胺(DTPA-BMA)；八齒羥基吡啶酮(HOPO)；N,N'-(丁烷-1,4-二基)雙(1-羥基-N-(3-(1-羥基-6-側氧基-1,6-二氫-吡啶-2-甲醯胺基)丙基)-6-側氧基-1,6-二氫吡啶-2-甲醯胺) (3,2,3-LI(HOPO))；N,N'-(((2-(4-胺基苯甲基)-3-((2-(3-羥基-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲醯胺基)乙基)(2-(3-羥基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲醯胺基)乙基)胺基)-丙基)氮二基)雙(乙烷-2,1-二基))雙(3-羥基-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲醯胺) (3,2-HOPO)；6,6'-(((氮二基雙(乙烷-2,1-二基))雙((羧基甲基)-氮二基))雙(亞甲基))二吡啶甲酸(neunpa)；6,6'-((乙-1,2-二基雙((羧基甲基)-氮二基))雙(亞甲基))二吡啶甲酸(octapa)；2,2'-(乙-1,2-二基雙(((8-羥基-喹啉-2-基)甲基)氮二基))二乙酸(octox)；6,6'-(((吡啶-2,6-二基雙(亞甲基))-雙((羧基甲基)氮二基))-雙(亞甲基))-二吡啶甲酸(PyPa)；21,22,23,24-四氮雜-五環[16.2.1.13,6.18,11.113,16]二十四碳-1,3,5,7,9,11(23),12,14,16,18(21),19-十一烯(卟啉)；30-胺基-3,14,25-三羥基3,9,14,20,25-五氮雜三十烷-2,10,13,21,24-五酮(去鐵胺)；N1-[5-(乙醯基羥基胺基)-戊基]-N26-(5-胺基戊基)-N26,5,16-三羥基-4,12,15,23-四側氧基-5,11,16,22-四氮雜二十六烷-二醯胺(DFO*)；及其組合。

在一些實施例中，R¹包含選自由以下組成之清單的螯合部分：DOTA、DO3A、DO3Apic、DOTAGA、Py4Pa、Py4Pa-NCS、Crown、Macropa、HEHA、CHXoctapa、Bispa及Noneunpa；或其放射性核種錯合物。

在一些實施例中，R¹包含選自由以下組成之清單的螯合部分：DOTMA、DOTPA、DO3Apic、DO3AM-乙酸、DOTP、DOTMP、DOTA-4AMP、CB-TE2A、NOTA、NOTP、TETPA、TETA、PEPA、H4Octapa、H2Dedpa、DO2P、EDTA、DTPA-BMA、3,2,3-LI(HOPO)、3,2-HOPO、Neunpa、Octapa、PyPa、卟啉及去鐵胺；或其放射性核種錯合物。

在一些實施例中，R¹係選自由以下組成之清單的螯合部分：1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸(DO3A)；1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,7-二乙酸(DO2A)；α,α',α'',α'''-四甲基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTMA)；1,4,7,10-肆(胺甲醯基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(DOTAM)；1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四丙酸(DOTPA)；2,2',2''-(10-(2-胺基-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三基)三乙酸；10-((6-羧基吡啶-2-基)甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸(DO3Apic)；6,6'-(((吡啶-2,6-二基雙(亞甲基))雙((羧基甲基)氮二基))-雙(亞甲基))二吡啶甲酸(H₄pypa)；6,6',6'',6'''-(((吡啶-2,6-二基雙(亞甲基))雙(氮三基))肆(亞甲基))-四吡啶甲酸(H₄py4pa)；及3,6,9,12-肆(羧基甲基)-3,6,9,12-四氮雜十四烷二酸(TTHA)；或其放射性核種錯合物。

在一些實施例中，R¹包含具有以下結構之一的螯合部分：(DO2A)、(DO3A)、(DOTA)、(DOTP)、(CB-DO2A)、(DOTAM)、(DOTMA)、(DOTA-4AMP)、(DOTPA)、(DOTMP)、(DO3Apic)、(L^py)、、(TETA)、(NOTP)、(NOTA)、(CB-TE2A)、(DiAmSar)、(SarAr，R = p-NH₂-Bn；AmBaSar，R= p-CO₂H-Bn)、(HEHA)、(EDTA)、(DTPA)、(TTHA)、(HBED)、(HBED-CC)、(PEPA)、(H₄pypa)、( t-Bu-杯[4]芳烴-四甲酸)、(CHX-A''-DTPA)、(H₆phospha)、(H₄octox)、(H₄octapa)、(H₄CHXoctapa)、、(macropa)、(macropid)、、、或。

在一些實施例中，R¹包含具有以下結構之一的螯合部分：、、、、、、、、、、或；或其放射性核種錯合物。

在一些實施例中，R¹包含DOTA且在所示位置處連接至腫瘤靶向部分：或。

在一些實施例中，R¹包含DOTA且在所示位置處連接至腫瘤靶向部分：。

在一些實施例中，R¹包含DOTA且在所示位置處連接至腫瘤靶向部分：。

應理解，本文所描述之免疫結合物包含一或多個R¹部分。在一些實施例中，本文所描述之免疫結合物包含一個或超過一個R¹部分，其中各R¹部分相同。連接子

在一個實施例中，免疫結合物之螯合劑共價連接至抗原結合區、重鏈恆定區、免疫球蛋白Fc區或其任何組合。在一個實施例中，螯合劑直接共價連接至抗原結合區、重鏈恆定區、免疫球蛋白Fc區或其任何組合。在一個實施例中，螯合劑透過連接子共價連接至抗原結合臂，該連接子共價連接至螯合劑且共價連接至抗原結合臂。在一個實施例中，連接子係親水性的(例如PEG鏈)。在一個實施例中，連接子係疏水性的(例如烷基或烯烴鏈)。螯合劑可與免疫結合物連接或偶聯，如Sadiki, A.等人, 「Site-specific conjugation of native antibody.」Antibody Therapeutics2020, 3, 271-284中所描述。

在一些實施例中，免疫結合物係以位點特異性方式透過螯合劑-連接子連接至特定胺基酸或聚醣殘基中而形成。在一些實施例中，位點特異性結合涉及用螯合劑-連接子對構架區中之特定離胺酸殘基進行定向官能化。在其他實施例中，此殘基可經不同反應性官能基官能化，接著在第二步驟中與螯合劑-連接子反應，得到免疫結合物。

在一些實施例中，非天然半胱胺酸殘基經工程改造至抗體構架中作為硫醇引導之結合以得到免疫結合物的位點。在一些實施例中，其他非天然胺基酸或胺基酸序列經工程改造至構架中以充當螯合劑-連接子或第二反應性基團之連接位點，接著結合螯合劑-連接子以得到免疫結合物。

在一些實施例中，螯合劑-連接子透過轉麩醯胺酸酶之作用連接至麩醯胺酸殘基。在其他實施例中，第二反應性基團係藉由轉麩醯胺酸酶連接，接著添加螯合劑-連接子，得到免疫結合物。

在一些實施例中，藉由糖苷酶作用，用反應性官能基修飾一或多個N-聚醣連接螯合劑-連接子，接著使螯合劑-連接子與該位點結合。在一些實施例中，聚醣係透過β-半乳糖苷酶之作用修飾。

在一個實施例中，免疫結合物包含超過一種相同或不同的螯合劑。

在一個實施例中，具有超過一種螯合劑之免疫結合物具有超過一種螯合劑連接至同一抗原結合臂。

在一個實施例中，具有超過一種螯合劑且少於十一種螯合劑之免疫結合物具有超過兩種螯合劑、超過三種螯合劑、超過四種螯合劑、超過五種螯合劑、超過六種螯合劑、超過七種螯合劑、超過八種螯合劑或超過九種螯合劑。在一個實施例中，螯合劑相同。在一個實施例中，各抗原結合臂直接地或間接地連接至超過一種螯合劑。

在一個實施例中，螯合劑包含放射性同位素螯合組分及允許共價連接至抗原結合臂之官能基。在一個實施例中，螯合劑進一步包含官能基與放射性同位素螯合組分之間的連接子。

連接子考慮因素包括對所得放射性免疫結合物之物理或藥物動力學特性的作用，諸如溶解性、親脂性、親水性、疏水性、穩定性(或多或少穩定以及計劃的降解)、剛性、可撓性、免疫原性、抗體結合調節及其類似特性。

最佳連接子應將載體抗體連接至放射性螯合劑而不損害任一者之官能度，在循環中提供穩定的連接且在特定條件下降解。在循環中之穩定性已證實為構成使用此策略取得成功的特別重要之因素。

在惡性腫瘤中，腫瘤細胞之可接近性能夠藉由特定抗體靶向。在腫瘤細胞上表現但不在正常健康細胞上表現之抗原允許選擇性靶向腫瘤細胞，同時避開非腫瘤細胞。用發射短程高線性能量轉移粒子之短半衰期放射性核種標記之mAb表示一種有吸引力的治療腫瘤之方式。此等短程粒子能夠殺死單細胞，同時避開旁觀者。用於放射免疫療法之高能α-發射體包括²¹¹At (砹-211)、²¹²Bi、²¹³Bi及²²⁵Ac。此後一同位素係活體內同位素發生器，其中其具有較長(10天)半衰期且經由三個半衰期較短原子之α-發射性衰變，其中各者產生α粒子。

在一些情況下，對靶向腫瘤之²²⁵Ac放射免疫療法之普遍使用的限制係放射性免疫結合物對正常組織之過量輻射。除靶向白血病之抗體外，大部分(＞99%)所注射抗體劑量在血液中保持循環或不與目標腫瘤相關聯。延長未靶向抗體之循環時間(通常數天至數週)引起分解代謝或保留蛋白質及肽之正常器官(主要為肝臟及腎臟)的輻射暴露。

在α-發射體活體內衰變的情況下，其安全使用之額外主要潛在障礙係在初始放射性核種之初始衰變之後依序釋放三個未螯合的發射α之子原子。吸收至諸如腎臟或肝臟之器官中可誘發毒性。最佳連接子應將載體mAb連接至放射性螯合劑而不損害任一者之官能度，在循環中提供穩定的連接且在特定條件下降解。在循環中之穩定性已證實為構成使用此策略取得成功的特別重要之因素。例示性結合物

在一個態樣中，本文描述一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽：式(I)其中：至少一個三級醯胺存在於將R¹連結至R⁸之線性鏈中；R¹係放射性核種螯合部分或其放射性核種錯合物；X¹不存在，或為-O-、-S-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-；m係1、2、3、4、5或6；x係0或1；R²係氫、鹵素、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)、-NR^a-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)，或者經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基)、-NR^a-(經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基)、或C₄-C₂₀聚乙二醇；X²不存在，或為-O-、-S-、-S(=O)₂-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-；L¹不存在，或為C₁-C₁₀伸烷基、C₂-C₁₀伸烯基或C₁-C₁₀伸雜烷基，其中伸雜烷基係一個內部碳原子經以下置換的伸烷基：-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)₂-、-S(=O)(=NH)-、-S(=O)(=NR^b)-、-NR^b-、-P(=O)OR^b-、-NR^bC(=O)-、-C(=O)NR^b-、-OC(=O)NR^b-、-NR^bC(=O)NR^b-、-NR^bC(=N-CN)NR^b-、-NR^bC(=N-R^b)NR^b-或-NR^bC(=O)O-；L²不存在，或為、或；Y¹不存在，或為、或；n係0或1；各R³及R⁶獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-C(=O)NH₂、-C(=O)OH或選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸及甲基刀豆胺酸，其中R³或R⁶之任何游離胺(-NH₂)獨立地視情況經-C(=O)(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)-C₄-C₂₀聚乙二醇取代；其中R³或R⁶之任何游離羧酸(-CO₂H)獨立地視情況經-C(=O)NH-(2,4,6-三甲基-3-溴苯基)、-C(=O)NH-(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)NH-(C₄-C₂₀聚乙二醇)置換；y係0或1；L³不存在，或為-(CH₂)_p-或；X³不存在，或為-CH₂-、-O-、-S-或-NR^d-；p係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；Y²係或；t係0或1；各R^a、R^b、R^c、R^d、R²、R⁴、R^4a、R⁵、R⁷及R^7a獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃、-L^a-(R^e)或R³；各u獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；各L^a獨立地不存在或為C₁-C₆伸烷基；R^e係經取代或未經取代之C₃-C₁₂環烷基、經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基、經取代或未經取代之苯基，或者經取代或未經取代之吡啶基；或R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基；或R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基；X⁴不存在，或為-CH₂-、-O-、-S-或-NR^c-；q係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；R⁸係能夠與生物靶向部分(R^B)共價結合之部分；且其中不為：或。

在一個態樣中，本文描述一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽：式(I)其中：至少一個三級醯胺存在於將R¹連結至R⁸之線性鏈中；R¹係放射性核種螯合部分或其放射性核種錯合物；X¹不存在，或為-O-、-S-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-；m係1、2、3、4、5或6；x係0或1；R²係氫、鹵素、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)、-NR^a-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)，或者經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基)、-NR^a-(經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基)、或C₄-C₂₀聚乙二醇；X²不存在，或為-O-、-S-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)₂-；L¹不存在，或為C₁-C₁₀伸烷基或C₁-C₁₀伸雜烷基，其中伸雜烷基係一個內部碳原子經以下置換的伸烷基：-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)₂-、-S(=O)(=NH)-、-S(=O)(=NR^b)-、-NR^b-、-P(=O)OR^b-、-NR^bC(=O)-、-C(=O)NR^b-、-OC(=O)NR^b-、-NR^bC(=O)NR^b-、-NR^bC(=N-CN)NR^b-、-NR^bC(=N-R^b)NR^b-或-NR^bC(=O)O-；L²不存在，或為、或；Y¹不存在，或為、或；n係0或1；各R³及R⁶獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-C(=O)NH₂、-C(=O)OH或選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸及甲基刀豆胺酸，其中R³或R⁶之任何游離胺(-NH₂)獨立地視情況經-C(=O)(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)-C₄-C₂₀聚乙二醇取代；其中R³或R⁶之任何游離羧酸(-CO₂H)獨立地視情況經-C(=O)NH-(2,4,6-三甲基-3-溴苯基)、-C(=O)NH-(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)NH-(C₄-C₂₀聚乙二醇)置換；y係0或1；L³不存在，或為-(CH₂)_p-或；X³不存在，或為-CH₂-、-O-、-S-或-NR^d-；p係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；Y²係或；t係0或1；各R^a、R^b、R^c、R^d、R²、R⁴、R^4a、R⁵、R⁷及R^7a獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃、-L^a-(R^e)或R³；各u獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；各L^a獨立地不存在或為C₁-C₆伸烷基；R^e係經取代或未經取代之C₃-C₁₂環烷基、經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基，或者經取代或未經取代之苯基；或R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基；或R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基；X⁴不存在，或為-CH₂-、-O-、-S-或-NR^c-；q係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；且R⁸係能夠與生物靶向部分(R^B)共價結合之部分。

在一些實施例中，不為：或。

在一些實施例中，R^B係抗體或其片段、肽、核酸或小分子。

在一些實施例中，R^B係抗體或其片段。

在一些實施例中，R⁸係能夠與抗體或其片段之胺(-NH₂)或硫醇基(-SH)結合的部分。

在一些實施例中，R⁸係能夠與抗體或其片段之胺(-NH₂)結合的部分且選自：、、、、、、、、、、、、、、或；X⁵不存在，或為-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)_2-、-NR⁹-、-C(=O)-、-NR⁹C(=O)-、-C(=O)NR⁹-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-OC(=O)NR⁹-、-NR⁹C(=O)NR⁹-、-NR⁹C(=S)NR⁹-、-NR⁹C(=O)O-；且各R⁹獨立地選自氫及C₁-C₄烷基。

在一些實施例中，R⁸係。

在一些實施例中，R¹⁰係、、、或。在一些實施例中，R¹⁰係、或。在一些實施例中，R¹⁰係或。在一些實施例中，R¹⁰係。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(Ia)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(Ia)。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(Ib)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(Ib)。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(Ic)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(Ic)。

在一些實施例中，R⁸係能夠與抗體或其片段之硫醇基(-SH)結合的部分且選自：、、、、、、、、、、、、或；m係0、1、2、3、4或5；X⁶不存在，或為-NR⁹-或-(CH₂)_g-NR⁹-；且g係1、2、3或4。

在一些實施例中，R⁸係或；X⁵不存在，或為-C(=O)-、-O-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-；L³不存在，或為C₁-C₁₀伸烷基、或；u係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；X⁶不存在，或為-NR⁹-或-(CH₂)_g-NR⁹-；且R¹¹係Cl、Br或I；且g係1、2、3或4。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(Id)之結構、其醫藥學上可接受之鹽：式(Id)。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(Ie)之結構、其醫藥學上可接受之鹽：式(Ie)。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(If)之結構、其醫藥學上可接受之鹽：式(If)。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(Ig)之結構、其醫藥學上可接受之鹽：式(Ig)。

在一些實施例中，X¹不存在。在一些實施例中，X¹係-O-、-S-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-。在一些實施例中，X¹係-O-、-S-或-NR^a-。在一些實施例中，X¹係-O-。在一些實施例中，X¹係-S-。在一些實施例中，X¹係-NR^a-，其中R^a係氫或C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X¹係-NR^a-，其中R^a係氫。在一些實施例中，X¹係-NR^a-，其中R^a係C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X¹係-C(=O)N(R^a)-，其中R^a係氫或C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X¹係-C(=O)N(R^a)-，其中R^a係氫。在一些實施例中，X¹係-C(=O)N(R^a)-，其中R^a係C₁-C₆烷基。

在一些實施例中，X⁵不存在，或為-NR⁹-、-C(=O)-、-NR⁹C(=O)、-C(=O)NR⁹-、在一些實施例中，X⁵不存在或為-NR⁹-。在一些實施例中，X⁵係-NR⁹-，其中R⁹係氫。在一些實施例中，X⁵係-NR⁹-，其中R⁹係C₁-C₄烷基。在一些實施例中，X⁵不存在。

在一些實施例中，X⁶係-NR⁹-，其中R⁹係氫。在一些實施例中，X⁶係-NR⁹-，其中R⁹係C₁-C₄烷基。在一些實施例中，X⁶係-(CH₂)_g-NR⁹-；且g係1、2、3或4。

在一些實施例中，x係0。在一些實施例中，x係1。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(II)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(II)。

在一些實施例中，該式(II)化合物具有式(III)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(III)其中：X²不存在，或為-CH₂-或-O-；且X³不存在，或為-CH₂-或-O-。

在一些實施例中，該式(II)化合物具有式(IV)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(IV)其中：X²不存在，或為-CH₂-或-O-；X³不存在，或為-CH₂-或-O-；且R¹⁰係、、、或。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(V)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(V)。

在一些實施例中，該式(V)化合物具有式(VI)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(VI)其中，X²不存在，或為-CH₂-或-O-；且X³不存在，或為-CH₂-或-O-。

在一些實施例中，該式(I)化合物具有式(VII)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(VII)其中，X²不存在，或為-CH₂-或-O-；且X³不存在，或為-CH₂-或-O-；R¹⁰係、、、或。

在一些實施例中，該式(II)化合物具有式(V)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(V)其中，係、、、、、、、、、、、，、或；且R¹係或或其放射性核種錯合物。

在一些實施例中，該式(II)化合物具有式(V)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(V)其中，係或；且R¹係或或其放射性核種錯合物。在一些實施例中，係、、、、或。在一些實施例中，係或。在一些實施例中，係或。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係、、、、或。在一些實施例中，係、或。

在一些實施例中，p係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。在一些實施例中，p係1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，p係1、2、3、4、5、6、7、8或9。在一些實施例中，p係1、2、3、4、5、6、7或8。在一些實施例中，p係1、2、3、4、5、6或7。在一些實施例中，p係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，p係1、2、3、4或5。在一些實施例中，p係1、2、3或4。在一些實施例中，p係1、2或3。在一些實施例中，p係1或2。在一些實施例中，p係5或10。在一些實施例中，p係1。在一些實施例中，p係2。在一些實施例中，p係3。在一些實施例中，p係4。在一些實施例中，p係5。在一些實施例中，p係6。在一些實施例中，p係7。在一些實施例中，p係8。在一些實施例中，p係9。在一些實施例中，p係10。在一些實施例中，p係11。在一些實施例中，p係12。

在一些實施例中，Y¹係、或；且L³係-(CH₂)_p-或。在一些實施例中，Y¹係或；且L³係-(CH₂)_p-或。在一些實施例中，Y¹係；且L³係-(CH₂)_p-或。

在一些實施例中，Y¹係或。在一些實施例中，Y¹係。在一些實施例中，Y¹係。在一些實施例中，Y¹係。在一些實施例中，Y¹不存在。

在一些實施例中，Y²係。在一些實施例中，Y²係。

在一些實施例中，L¹係C₁-C₁₀伸烷基且X¹不存在或為-O-。在一些實施例中，L¹係C₁-C₁₀伸烷基且X¹不存在。在一些實施例中，L¹係C₁-C₁₀伸烷基且X¹係-O-。在一些實施例中，L¹係C₂-C₁₀伸烯基且X¹不存在或為-O-。

在一些實施例中，X²係-O-、-S-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-。在一些實施例中，X²係-O-、-S-或-NR^a-。在一些實施例中，X²係-O-。在一些實施例中，X²係-S-。在一些實施例中，X²係-NR^a-，其中R^a係氫，或者經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X²係-NR^a-，其中R^a係氫。在一些實施例中，X²係-NR^a-，其中R^a係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X²係-C(=O)N(R^a)-，其中R^a係氫，或者經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X²係-C(=O)N(R^a)-，其中R^a係氫。在一些實施例中，X²係-C(=O)N(R^a)-，其中R^a係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X²不存在。

在一些實施例中，L¹係C₁-C₁₀伸烷基或C₁-C₁₀伸雜烷基，其中伸雜烷基係一個內部碳原子經以下置換的伸烷基：-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)₂-、-S(=O)(=NH)-、-S(=O)(=NR^b)-、-NR^b-、-P(=O)OR^b-、-NR^bC(=O)-、-C(=O)NR^b-、-OC(=O)NR^b-、-NR^bC(=O)NR^b-、-NR^bC(=N-CN)NR^b-、-NR^bC(=N-R^b)NR^b-或-NR^bC(=O)O-。在一些實施例中，L¹係C₁-C₁₀伸烷基。在一些實施例中，L¹係-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-或-CH₂(CH₂)₂CH₂-。在一些實施例中，L¹係-CH₂-。在一些實施例中，L¹係-CH₂CH₂-。在一些實施例中，L¹係-CH₂CH₂CH₂-。在一些實施例中，L¹係-CH₂(CH₂)₂CH₂-。在一些實施例中，L¹係C₁-C₁₀伸雜烷基，其中伸雜烷基係一個內部碳原子經以下置換的伸烷基：-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)₂-、-S(=O)(=NH)-、-S(=O)(=NR^b)-、-NR^b-、-P(=O)OR^b-、-NR^bC(=O)-、-C(=O)NR^b-、-OC(=O)NR^b-、-NR^bC(=O)NR^b-、-NR^bC(=N-CN)NR^b-、-NR^bC(=N-R^b)NR^b-或-NR^bC(=O)O-。在一些實施例中，L¹係C₁-C₁₀伸雜烷基，其中伸雜烷基係一個內部碳原子經以下置換的伸烷基：-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)₂-、-S(=O)(=NH)-、-S(=O)(=NR^b)-、-NR^b-或-P(=O)OR^b-。

在一些實施例中，L¹不存在。

在一些實施例中，L²係。在一些實施例中，L²係。在一些實施例中，L²係。在一些實施例中，L²不存在。

在一些實施例中，L²係、、、、或。在一些實施例中，L²係、或。在一些實施例中，L²係或。在一些實施例中，L²係。

在一些實施例中，R³獨立地為氫、-C(=O)NH₂、-C(=O)OH或選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸及甲基刀豆胺酸，其中R³或R⁶之任何游離胺(-NH₂)獨立地視情況經-C(=O)(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)-C₄-C₂₀聚乙二醇取代；其中R³或R⁶之任何游離羧酸(-CO₂H)獨立地視情況經-C(=O)NH-(2,4,6-三甲基-3-溴苯基)、-C(=O)NH-(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)NH-(C₄-C₂₀聚乙二醇)置換。在一些實施例中，R³獨立地為選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸及甲基刀豆胺酸。在一些實施例中，R³獨立地為氫、-C(=O)NH₂或-C(=O)OH。在一些實施例中，R³獨立地為-C(=O)NH₂。在一些實施例中，R³獨立地為-C(=O)OH。在一些實施例中，R³獨立地為氫。

在一些實施例中，係、、、、、、、、、、、、、或。

在一些實施例中，係、、、、、、、、、、或。

在一些實施例中，係、、、、、、、、、、或。

在一些實施例中，係或。

在一些實施例中，係或。

在一些實施例中，係。

在一些實施例中，L³係-(CH₂)_p-或。在一些實施例中，L³係。在一些實施例中，L³係-(CH₂)_p-。

在一些實施例中，L³不存在。

在一些實施例中，p係1。在一些實施例中，p係2。在一些實施例中，p係3。在一些實施例中，p係4。在一些實施例中，p係5。在一些實施例中，p係6。在一些實施例中，p係7。在一些實施例中，p係8。在一些實施例中，p係9。在一些實施例中，p係10。在一些實施例中，p係11。在一些實施例中，p係12。

在一些實施例中，X³係-CH₂-、-O-、-S-或-NR^d-。在一些實施例中，X³係-CH₂-。在一些實施例中，X³係-O-。在一些實施例中，X³係-S-。在一些實施例中，X³係-NR^d-，其中R^d係氫，或者經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X³係-NR^d-，其中R^d係氫。在一些實施例中，X³係-NR^d-，其中R^d係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X³不存在。

在一些實施例中，L³係-CH₂-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₂-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₃-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₄-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₅-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₆-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₇-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₈-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₉-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₁₀-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₁₁-。在一些實施例中，L³係-(CH₂)₁₂-。

在一些實施例中，L³係。在一些實施例中，p係1。在一些實施例中，p係2。在一些實施例中，p係3。在一些實施例中，p係4。在一些實施例中，p係5。在一些實施例中，p係6。在一些實施例中，p係7。在一些實施例中，p係8。在一些實施例中，p係9。在一些實施例中，p係10。在一些實施例中，p係11。在一些實施例中，p係12。

在一些實施例中，係、、,,、、、,,、或。

在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。

在一些實施例中，係、、、、、、、、、、、、、或。在一些實施例中，係、、、、、、、、、、或。在一些實施例中，係、、、、、、或。在一些實施例中，係、、、或。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係、或。

在一些實施例中，q係0。在一些實施例中，q係1。在一些實施例中，q係2。在一些實施例中，q係3。在一些實施例中，q係4。在一些實施例中，q係5。在一些實施例中，q係6。在一些實施例中，q係7。在一些實施例中，q係8。在一些實施例中，q係9。在一些實施例中，q係10。在一些實施例中，q係11。在一些實施例中，q係12。

在一些實施例中，X⁴係-CH₂-、-O-、-S-或-NR^d-。在一些實施例中，X⁴係-CH₂-。在一些實施例中，X⁴係-O-。在一些實施例中，X⁴係-S-。在一些實施例中，X⁴係-NR^d-，其中R^d係氫，或者經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X⁴係-NR^d-，其中R^d係氫。在一些實施例中，X⁴係-NR^d-，其中R^d係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，X⁴不存在。

在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。

在一些實施例中，係、、、、、、、、、、、、、或。在一些實施例中，係、、、、、、、、、、或。在一些實施例中，係、或。

在一些實施例中，X³係-CH₂-且X⁴係-O-；或X³係-O-且X⁴係-CH₂-。在一些實施例中，X³係-CH₂-且X⁴係-O-。在一些實施例中，X³係-O-且X⁴係-CH₂-。

在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。

在一些實施例中，R⁴及R^4a獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃或-L^a-(R^e)。在一些實施例中，R⁴及R^4a獨立地為經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，R⁴及R^4a獨立地為-CH₃、-CH₂CH₃、-C(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH₂C(CH₃)₃。在一些實施例中，R⁴及R^4a獨立地為-CH₃。在一些實施例中，R⁴及R^4a獨立地為-CH₂CH₃。在一些實施例中，R⁴及R^4a獨立地為-C(CH₃)₂。在一些實施例中，R⁴及R^4a獨立地為經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，R⁴及R^4a獨立地為C₄-C₂₀聚乙二醇。在一些實施例中，R⁴及R^4a獨立地為-(CH₂CH₂O)_u-CH₃。在一些實施例中，R⁴及R^4a獨立地為-L^a-(R^e)。

在一些實施例中，R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基。在一些實施例中，R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₆雜環烷基。在一些實施例中，R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₇雜環烷基。在一些實施例中，R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₆雜環烷基。在一些實施例中，R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₅雜環烷基。

在一些實施例中，R⁷及R^7a獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃或-L^a-(R^e)。在一些實施例中，R⁷及R^7a獨立地為經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，R⁷及R^7a獨立地為-CH₃、-CH₂CH₃、-C(CH₃)₃、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH₂C(CH₃)₃。在一些實施例中，R⁷及R^7a獨立地為-CH₃。在一些實施例中，R⁷及R^7a獨立地為-CH₂CH₃。在一些實施例中，R⁷及R^7a獨立地為-C(CH₃)₂。在一些實施例中，R⁷及R^7a獨立地為經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，R⁷及R^7a獨立地為C₄-C₂₀聚乙二醇。在一些實施例中，R⁷及R^7a獨立地為-(CH₂CH₂O)_u-CH₃。在一些實施例中，R⁷及R^7a獨立地為-L^a-(R^e)。

在一些實施例中，R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基。在一些實施例中，R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₆雜環烷基。在一些實施例中，R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₇雜環烷基。在一些實施例中，R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₆雜環烷基。在一些實施例中，R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₅雜環烷基。

在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃或-L^a-(R^e)。在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基或-L^a-(R^e)。在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為-CH₃、-CH₂CH₃、-C(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH₂C(CH₃)₃。在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為-CH₃。在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為-CH₂CH₃。在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為-C(CH₃)₂。在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為-L^a-(R^e)。

在一些實施例中，R⁴係氫；且R⁷係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃或-L^a-(R^e)。在一些實施例中，R⁴係氫；且R⁷係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基或-L^a-(R^e)。在一些實施例中，R⁴係氫；且R⁷係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，R⁴係氫；且R⁷係-L^a-(R^e)。

在一些實施例中，R⁴係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃或-L^a-(R^e)；且R⁷係氫。在一些實施例中，R⁴係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基或-L^a-(R^e)；且R⁷係氫。在一些實施例中，R⁴係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基；且R⁷係氫。在一些實施例中，R⁴係-L^a-(R^e)；且R⁷係氫。

在一些實施例中，各R^e獨立地選自環丙基、環丁基、環戊基、環己基、雙環[1.1.1]戊烷基、雙環[2.1.1]己烷基、雙環[3.1.1]庚烷基、雙環[2.2.2]辛烷基、氧雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、2-氧雜雙環[1.1.1]戊烷基、2-氧雜雙環[2.1.1]己烷基、2-氧雜雙環[2.2.2]辛烷基、氮呾基、吡咯啶基、哌啶基、苯基、吡啶基及金剛烷基，其中各R^e獨立地視情況經取代。

在一些實施例中，各R^e獨立地選自環丙基、環丁基、環戊基、環己基、雙環[1.1.1]戊烷基、雙環[2.1.1]己烷基、雙環[3.1.1]庚烷基、雙環[2.2.2]辛烷基、氧雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、2-氧雜雙環[1.1.1]戊烷基、2-氧雜雙環[2.1.1]己烷基、2-氧雜雙環[2.2.2]辛烷基、氮呾基、吡咯啶基、哌啶基、苯基及金剛烷基，其中各R^e獨立地視情況經取代。

在一些實施例中，各R^e獨立地選自、、、、、、、、、、、、、、、及，其中各R^e獨立地視情況經取代。在一些實施例中，各R^e獨立地選自、、、、及，其中各R^e獨立地視情況經取代。

在一些實施例中，各R^e獨立地選自、、、、、、、、、、、、、、及，其中各R^e獨立地視情況經取代。在一些實施例中，各R^e獨立地選自、、、、及，其中各R^e獨立地視情況經取代。

在一些實施例中，各L^a獨立地不存在，或為-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-或-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-。在一些實施例中，各L^a獨立地為-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-或-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-。在一些實施例中，各L^a獨立地不存在，或為-CH₂-、-CH₂CH₂-或-CH₂CH₂CH₂-。在一些實施例中，各L^a獨立地不存在。

在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為氫、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、-(CH₂CH₂O)-CH₂CH₂CH₃、-(CH₂CH₂O)-CH₃、-(CH₂CH₂O)₂-CH₃、-(CH₂CH₂O)₃-CH₃、-(CH₂CH₂O)₄-CH₃、-(CH₂CH₂O)₅-CH₃、-(CH₂CH₂O)₆-CH₃、-(CH₂CH₂O)₇-CH₃、-(CH₂CH₂O)₈-CH₃、-(CH₂CH₂O)₉-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₁-CH₃或-(CH₂CH₂O)₁₂-CH₃。

在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為氫、、、、、、、、、、、、、、、、、、-(CH₂CH₂O)-CH₃、-(CH₂CH₂O)₂-CH₃、-(CH₂CH₂O)₃-CH₃、-(CH₂CH₂O)₄-CH₃、-(CH₂CH₂O)₅-CH₃、-(CH₂CH₂O)₆-CH₃、-(CH₂CH₂O)₇-CH₃、-(CH₂CH₂O)₈-CH₃、-(CH₂CH₂O)₉-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₁-CH₃或-(CH₂CH₂O)₁₂-CH₃。

在一些實施例中，各R⁴及R⁷獨立地為、或。在一些實施例中，各R⁴及R⁷係。在一些實施例中，各R⁴及R⁷係。在一些實施例中，各R⁴及R⁷係。

在一些實施例中，R⁴或R⁷不為氫。在一些實施例中，R⁴與R⁷相同。在一些實施例中，R⁴與R⁷不同。

在一些實施例中，R⁴係氫、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、-(CH₂CH₂O)-CH₂CH₂CH₃、-(CH₂CH₂O)-CH₃、-(CH₂CH₂O)₂-CH₃、-(CH₂CH₂O)₃-CH₃、-(CH₂CH₂O)₄-CH₃、-(CH₂CH₂O)₅-CH₃、-(CH₂CH₂O)₆-CH₃、-(CH₂CH₂O)₇-CH₃、-(CH₂CH₂O)₈-CH₃、-(CH₂CH₂O)₉-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₁-CH₃或-(CH₂CH₂O)₁₂-CH₃。

在一些實施例中，R⁴係氫、、、、、、、、、、、、、、、-(CH₂CH₂O)-CH₃、-(CH₂CH₂O)₂-CH₃、-(CH₂CH₂O)₃-CH₃、-(CH₂CH₂O)₄-CH₃、-(CH₂CH₂O)₅-CH₃、-(CH₂CH₂O)₆-CH₃、-(CH₂CH₂O)₇-CH₃、-(CH₂CH₂O)₈-CH₃、-(CH₂CH₂O)₉-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₁-CH₃或-(CH₂CH₂O)₁₂-CH₃。在一些實施例中，R⁴係氫、、、、、、、-(CH₂CH₂O)-CH₃、-(CH₂CH₂O)₂-CH₃、-(CH₂CH₂O)₃-CH₃、-(CH₂CH₂O)₄-CH₃、-(CH₂CH₂O)₅-CH₃、-(CH₂CH₂O)₆-CH₃、-(CH₂CH₂O)₇-CH₃、-(CH₂CH₂O)₈-CH₃、-(CH₂CH₂O)₉-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₁-CH₃或-(CH₂CH₂O)₁₂-CH₃。在一些實施例中，R⁴係氫、、、、、或。在一些實施例中，R⁴係氫、或。在一些實施例中，R⁴係氫、或。

在一些實施例中，R⁷係氫、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、-(CH₂CH₂O)-CH₂CH₂CH₃、-(CH₂CH₂O)-CH₃、-(CH₂CH₂O)₂-CH₃、-(CH₂CH₂O)₃-CH₃、-(CH₂CH₂O)₄-CH₃、-(CH₂CH₂O)₅-CH₃、-(CH₂CH₂O)₆-CH₃、-(CH₂CH₂O)₇-CH₃、-(CH₂CH₂O)₈-CH₃、-(CH₂CH₂O)₉-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₁-CH₃或-(CH₂CH₂O)₁₂-CH₃。

在一些實施例中，R⁷係氫、、、、、、、、、、、、、、、-(CH₂CH₂O)-CH₃、-(CH₂CH₂O)₂-CH₃、-(CH₂CH₂O)₃-CH₃、-(CH₂CH₂O)₄-CH₃、-(CH₂CH₂O)₅-CH₃、-(CH₂CH₂O)₆-CH₃、-(CH₂CH₂O)₇-CH₃、-(CH₂CH₂O)₈-CH₃、-(CH₂CH₂O)₉-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₁-CH₃或-(CH₂CH₂O)₁₂-CH₃。在一些實施例中，R⁷係氫、、、、、、、-(CH₂CH₂O)-CH₃、-(CH₂CH₂O)₂-CH₃、-(CH₂CH₂O)₃-CH₃、-(CH₂CH₂O)₄-CH₃、-(CH₂CH₂O)₅-CH₃、-(CH₂CH₂O)₆-CH₃、-(CH₂CH₂O)₇-CH₃、-(CH₂CH₂O)₈-CH₃、-(CH₂CH₂O)₉-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₁-CH₃或-(CH₂CH₂O)₁₂-CH₃。在一些實施例中，各R⁷獨立地為氫、、、、、或。在一些實施例中，R⁷係氫、或。在一些實施例中，R⁷係氫或。

在一些實施例中，係、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、或。

在一些實施例中，各R⁶獨立地為氫、-C(=O)NH₂、-C(=O)OH或選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸及甲基刀豆胺酸，其中R³或R⁶之任何游離胺(-NH₂)獨立地視情況經-C(=O)(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)-C₄-C₂₀聚乙二醇取代；其中R³或R⁶之任何游離羧酸(-CO₂H)獨立地視情況經-C(=O)NH-(2,4,6-三甲基-3-溴苯基)、-C(=O)NH-(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)NH-(C₄-C₂₀聚乙二醇)置換。在一些實施例中，R⁶獨立地為選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸及甲基刀豆胺酸。在一些實施例中，R⁶獨立地為氫、-C(=O)NH₂或-C(=O)OH。在一些實施例中，R⁶獨立地為-C(=O)NH₂。在一些實施例中，R⁵獨立地為-C(=O)OH。在一些實施例中，R⁶獨立地為氫。

在一些實施例中，係或。在一些實施例中，係。在一些實施例中，係。

在一些實施例中，係：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、，、、、、、、或。

在一些實施例中，R²係氫、鹵素、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)或C₄-C₂₀聚乙二醇。在一些實施例中，R²係鹵素。在一些實施例中，R²係-Cl、-F或-Br。在一些實施例中，R²係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，R²係-CH₃、-CH₂CH₃或-C(CH₃)₂。在一些實施例中，R²係-CH₃。在一些實施例中，R²係-CH₂CH₃。在一些實施例中，R²係-C(CH₃)₂。在一些實施例中，R²係-O-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)。在一些實施例中，R²係-OCH₃。在一些實施例中，R²係C₄-C₂₀聚乙二醇。在一些實施例中，R²係C₄-C₁₈聚乙二醇。在一些實施例中，R²係C₄-C₁₆聚乙二醇。在一些實施例中，R²係C₄-C₁₂聚乙二醇。在一些實施例中，R²係C₄-C₁₀聚乙二醇。在一些實施例中，R²係C₄-C₆聚乙二醇。在一些實施例中，R²係氫。

在一些實施例中，各R⁵獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，各R⁵獨立地為經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，各R⁵獨立地為-CH₃、-CH₂CH₃或-C(CH₃)₂。在一些實施例中，各R⁵獨立地為經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，各R⁵獨立地為C₄-C₂₀聚乙二醇。在一些實施例中，各R⁵獨立地為-(CH₂CH₂O)_u-CH₃。在一些實施例中，各R⁵獨立地為-L^a-(R^e)。在一些實施例中，各R⁵獨立地為R³。在一些實施例中，各R⁵獨立地為氫

在一些實施例中，m係1、2、3或4。在一些實施例中，m係1。在一些實施例中，m係2。在一些實施例中，m係3。在一些實施例中，m係4。

在一些實施例中，各R^a獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，各R^a獨立地為經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，各R^a獨立地為-CH₃、-CH₂CH₃或-C(CH₃)₂。在一些實施例中，各R^a獨立地為經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，各R^a獨立地為C₄-C₂₀聚乙二醇。在一些實施例中，各R^a獨立地為-(CH₂CH₂O)_u-CH₃。在一些實施例中，各R^a獨立地為-L^a-(R^e)。在一些實施例中，各R^a獨立地為R³。在一些實施例中，各R^a係氫。

在一些實施例中，各R^b獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，各R^b獨立地為經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，各R^b獨立地為-CH₃、-CH₂CH₃或-C(CH₃)₂。在一些實施例中，各R^b獨立地為經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，各R^b獨立地為C₄-C₂₀聚乙二醇。在一些實施例中，各R^b獨立地為-(CH₂CH₂O)_u-CH₃。在一些實施例中，各R^b獨立地為-L^a-(R^e)。在一些實施例中，各R^b獨立地為R³。在一些實施例中，各R^b係氫。

在一些實施例中，各R^c獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，各R^c獨立地為經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，各R^c獨立地為-CH₃、-CH₂CH₃或-C(CH₃)₂。在一些實施例中，各R^a獨立地為經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，各R^c獨立地為C₄-C₂₀聚乙二醇。在一些實施例中，各R^c獨立地為-(CH₂CH₂O)_u-CH₃。在一些實施例中，各R^c獨立地為-L^a-(R^e)。在一些實施例中，各R^c獨立地為R³。在一些實施例中，各R^c獨立地為氫。

在一些實施例中，各R^d獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，各R^d獨立地為經取代或未經取代之C₁-C₆烷基。在一些實施例中，各R^d獨立地為-CH₃、-CH₂CH₃或-C(CH₃)₂。在一些實施例中，各R^d獨立地為經取代之C₁-C₆雜烷基。在一些實施例中，各R^d獨立地為C₄-C₂₀聚乙二醇。在一些實施例中，各R^d獨立地為-(CH₂CH₂O)_u-CH₃。在一些實施例中，各R^d獨立地為-L^a-(R^e)。在一些實施例中，各R^d獨立地為R³。在一些實施例中，各R^d獨立地為氫。

用於製備本文所描述之免疫結合物的例示性化合物包括表 A中所描繪之化合物。表 A

化合物編 號	m	R2		R8
1-1	1	H
1-2	1	H
1-3	1	H
1-4	1	H
1-5	1	H
1-6	1	H
1-7	1	H
1-8	3	H
1-9	1	H
1-10	1	H
1-11	1	H
1-12	1	H
1-13	1	H
1-14	1	H
1-15	1	H
1-16	1	H
1-17	1	H
1-18	1	H
1-19	3	H
1-20	1	H
1-21	1	H
1-22	1	H
1-23	1	H
1-24	3	-OCH2-(CH2OCH2)n-CH2OCH3
1-25	1	H
1-26	1	H
1-27	1	H
1-28	1	H
1-29	3	H
1-30	1	H
1-31	1	H
1-32	1	H
1-33	1	H
1-34	1	H
1-35	1	H
1-36	1	H
1-37	1	H
1-38	1	H
1-39	1	H
1-40	1	H
1-41	1	H
1-42	1	H
1-43	1	H
1-44	1	H
1-46	1	H
1-47	1	H
1-48	1	H
1-49	1	H
1-50	1	H
1-51	1	H
1-52	1	H
1-53	1	H
1-54	1	H
1-55	1	H
1-56	1	H

用於製備本文所描述之免疫結合物的例示性化合物包括表 B中所描繪之化合物。表 B

化合物編 號	m		R8
2-1	0
2-2	0
2-3	0
2-4	0
2-5	0
2-6	0
2-6	0
2-7	0
2-8	0
2-9	0
2-10	0
2-11	0
2-12	0
2-13	0
2-14	0
2-15	0
2-16	0
2-17	0
2-18	0
2-19	0
2-20	0
2-21	0
2-22	0
2-23	0
2-24	0
2-25	0
2-26	0
2-27	0
2-28	0
2-29	0
2-30	0
2-31	0
2-32	0
2-33	0
2-34	0
2-35	0
2-36	0
2-37	0
2-38	0
2-39	0
2-40	0
2-41	0

在表A及表B中，係。

在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。

在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經、置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。在一些實施例中，表A及/或表B中之經置換。

本文所描述之額外化合物描繪於表 C中。表 C.

化合物編 號	結 構
4-4
4-5
4-6
4-7
4-8
4-9
4-10
4-11
4-12
4-13
4-15
4-16
4-17
4-18
4-19
4-20
4-21
4-22
4-23
4-24
4-25
4-26
4-27
4-28
4-29
4-30
4-31
4-32
4-33

放射性核種

在一些實施例中，本文所描述之免疫結合物中之放射性核種係發射鄂惹電子之放射性核種。在一些實施例中，該放射性核種係發射α之放射性核種。在一些實施例中，該放射性核種係發射β之放射性核種。在一些實施例中，該放射性核種係發射γ之放射性核種。在一些實施例中，非肽靶向治療性化合物中所使用的放射性核種之類型可根據具體癌症類型、靶向部分(例如非肽配體)之類型等來定製。經歷α衰變之放射性核種自其核發射α粒子(具有+2電荷之氦離子)。由於α衰變，子核種比母核種少2個質子及2個中子。此意謂在α衰變過程中，質子數減少2，而核子數減少4。經歷β衰變之放射性核種自其核發射β粒子(電子)。在β衰變期間，一個中子變成質子及電子。質子保留在核中，而電子以β粒子形式發射。此意謂在β衰變過程中，核失去一個中子，但獲得一個質子。在γ衰變過程中，處於激發態(較高能態)之核發射γ射線光子，變成較低能態。在γ衰變期間，質子數及核子數無變化。γ射線之發射通常伴隨α粒子及β粒子之發射。

鄂惹電子(AE)係極低能量電子，其係由電子捕獲(EC)而衰變的放射性核種(例如¹¹¹In、鎵-67 (⁶⁷Ga)、鎝-99m (^99mTc)、鉑-195m (^195mPt)、碘-125 (¹²⁵I)及碘-123 (¹²³I)發射。此能量在奈米-微米距離內沉積，產生高線性能量轉移，由此強效引起癌細胞之致死性損傷。因此，發射AE之放射性治療劑具有極大的癌症治療潛力。

β粒子係自核發射之電子。其通常在組織中具有較長射程(大約1至5 mm)且為最常使用的。

α粒子係自放射性原子之核發射的氦核(兩個質子及兩個中子)。取決於發射能量，其可在組織中行進50-100 µm。其帶正電且比電子大幾個數量級。行進的單位路徑長度沉積的α粒子之能量(稱為「線性能量轉移」)的量比電子大約400倍。與電子引起之破壞相比，此沿其路徑引起實質上更大之破壞。α粒子徑跡引起大量複雜且幾乎無法修復之DNA雙股斷裂。實現細胞毒性所需之吸收劑量與橫過細胞核之α粒子的數目有關。在使用此作為量度之情況下，可在細胞核之1至20個α粒子橫越範圍內實現細胞毒性。所得高效力與α粒子短程(其降低正常器官毒性)的組合已在開發發射α粒子之藥劑方面引起大量關注。通常使用之α粒子發射體包括²¹²Bi、²¹²Pb、²¹³Bi、²²⁵Ac、²²³Ra及²²⁹Th。

在一些實施例中，放射性核種係診斷性或治療性放射性核種。代表性放射性核種

同位素	t1/2 ( 小時)	衰變模式
66Ga	9.5	β+ (56%)，EC (44%)
67Ga	78.2	EC (100%)
68Ga	1.1	β+ (90%)，EC (10%)
111In	67.2	EC (100%)
114mIn	49.5 d	EC (100%)
114In (子核種)	73 s	β- (100%)
177Lu	159.4	β- (100%)
89Zr	78.5	β+ (23%)，EC (77%)
212Bi	1.1	α (36%)，β- (64%)
213Bi	0.76	α (2.2%)，β- (97.8%)
212Pb (子核種係212Bi)	10.6	β- (100%)
225Ac	240	α (100%)

在一些實施例中，放射性核種可為發射鄂惹電子之放射性核種。在一些實施例中，放射性核種係發射鄂惹電子之放射性核種，亦即¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、9^99mTc或^195mPt。在一些實施例中，放射性核種係發射鄂惹電子之放射性核種，亦即¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga或^99mTc。

在一些實施例中，放射性核種係發射α之放射性核種。在一些實施例中，放射性核種係發射α之放射性核種，亦即²²⁵Ac、²¹³Bi、²²³Ra或²¹²Pb。在一些實施例中，放射性核種係發射α之放射性核種，亦即²²⁵Ac。在一些實施例中，放射性核種係發射β之放射性核種。在一些實施例中，放射性核種係發射β之放射性核種，亦即⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、錸-186 (¹⁸⁶Re)、錸-188 (¹⁸⁸Re)、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、¹⁵³Sm、⁸⁹Sr、金-198 (¹⁹⁸Au)、鉺-169 (¹⁶⁹Er)、鏑-165 (¹⁶⁵Dy)、^99mTc、⁸⁹Zr或錳-52 (⁵²Mn)。在一些實施例中，放射性核種係發射β之放射性核種，亦即⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、^99mTc或⁸⁹Zr。

在一些實施例中，放射性核種係發射γ之放射性核種。在一些實施例中，放射性核種係發射γ之放射性核種，亦即鈷-60 (⁶⁰Co)、鈀-103 (¹⁰³Pd)、銫-137 (¹³⁷Cs)、鐿-169 (¹⁶⁹Yb)、銥-192 (¹⁹²Ir)、²¹²B1、²¹³Bi或²²⁶Ra。放射性免疫結合物

在一個實施例中，本發明提供免疫結合物。在一個實施例中，在標記、連接或裝載α發射體時，免疫結合物能夠活體內遞送α發射體。在一個實施例中，在標記、連接或裝載其他放射性同位素(β發射體及/或γ發射體)及/或其他原子時，免疫結合物亦能夠活體內遞送其他放射性同位素(β發射體及/或γ發射體)及/或其他原子。在一個實施例中，在標記、連接或裝載成像金屬(例如¹¹¹In、⁸⁹Zr、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga或¹³4Ce)時，免疫結合物能夠活體內遞送該等成像金屬。

本揭露之免疫結合物可裝載有放射性同位素以實現治療或診斷作用。在某些實施例中，螯合劑可進一步包含放射性同位素。在某些實施例中，放射性同位素係α發射體。在某些實施例中，放射性同位素係選自由以下組成之清單的α發射體：²²⁵Ac、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、²¹²Pb、²¹²Bi及²¹³Bi。在某些實施例中，放射性同位素係²²⁵Ac。在某些實施例中，放射性同位素係β發射體。在某些實施例中，放射性同位素係選自以下之β發射體：¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、⁶⁷Cu及¹⁵³Sm。

本文亦描述一種製備放射性免疫結合物之方法，其包含將本揭露之免疫結合物裝載放射性同位素或與放射性同位素錯合。在某些實施例中，放射性同位素係α發射體。在某些實施例中，放射性同位素係選自由以下組成之清單的α發射體：²²⁵Ac、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、²¹²Pb、²¹²Bi及²¹³Bi。在某些實施例中，放射性同位素係²²⁵Ac。在某些實施例中，放射性同位素係β發射體。在某些實施例中，放射性同位素係選自以下之β發射體：¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、⁶⁷Cu及¹⁵³Sm。

在一個態樣中，本發明提供一種放射性免疫結合物，其包含本發明之免疫結合物及發射α之放射性同位素。在一個實施例中，放射性免疫結合物的發射α之放射性同位素係選自包含以下之群：²²⁵Ac、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、²¹²Pb、²¹²Bi及²¹³Bi。在一個實施例中，放射性免疫結合物的發射α之放射性同位素係選自由以下組成之群：²²⁵Ac、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、²¹²Pb、²¹²Bi及²¹³Bi。在一個實施例中，放射性免疫結合物的發射α之放射性同位素係²²⁵Ac。在一個實施例中，放射性免疫結合物的發射α之放射性同位素係²²³Ra。在一個實施例中，放射性免疫結合物的發射α之放射性同位素係²²⁴Ra。在一個實施例中，放射性免疫結合物的發射α之放射性同位素係²²⁷Th。在一個實施例中，放射性免疫結合物的發射α之放射性同位素係²¹²Pb。在一個實施例中，放射性免疫結合物的發射α之放射性同位素係²¹²Bi。在一個實施例中，放射性免疫結合物的發射α之放射性同位素係²¹³Bi。

在一些實施例中，本發明之免疫結合物與放射性同位素組合以提供本發明之放射性免疫結合物。在一些實施例中，放射性同位素係²²⁵Ac、⁸⁶Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、²¹³Bi、²¹³Po、²¹²Bi、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、¹⁴⁹Tb、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁹Zr、¹³⁷Cs、²¹²Pb或¹⁰³Pd。在一些實施例中，放射性同位素係α發射體，諸如²²⁵Ac、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、²¹²Pb、²¹²Bi及²¹³Bi。在一些實施例中，放射性同位素係β粒子發射體，諸如¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、¹⁵³Sm。在一些實施例中，放射性同位素係α粒子發射體與β及/或γ粒子發射體兩者。在一些實施例中，放射性同位素係β粒子發射體與γ粒子及/或光子發射體兩者。在一些實施例中，放射性免疫結合物經標記、連接或裝載α發射體與β發射體且因此包含α發射體與β發射體兩者。在一些實施例中，選擇放射性同位素以用於放射性成像，諸如自⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、⁸⁹Zr、¹¹¹In及¹³⁴Ce之中選擇。

本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物除包含放射性同位素以外，可包含其他運載物或有效負載，包括各種細胞毒性劑，諸如小分子化學治療劑、細胞毒性抗生素、烷基化劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑及/或微管蛋白抑制劑。舉例而言，本發明之免疫結合物可用於將非放射性同位素細胞毒素遞送至目標細胞。細胞毒性劑之非限制性實例包括氮丙啶(aziridine)、順鉑(cisplatin)、四𠯤(tetrazine)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、長春花生物鹼(vinca alkaloids)、紫杉烷(taxane)、喜樹鹼(camptothecin)、依託泊苷(etoposide)、小紅莓(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、替尼泊苷(teniposide)、新生黴素(novobiocin)、阿克拉黴素(aclarubicin)、蒽環黴素(anthracycline)、放射菌素(actinomycin)、博萊黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin)、絲裂黴素(mitomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、艾達黴素(idarubicin)、海兔毒素(dolastatins)、美登素(maytansine)、多西他賽(docetaxel)、阿德力黴素(adriamycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、奧瑞他汀(auristatin)、吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)、卡鉑、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(capecitabine)、絲裂黴素C、紫杉醇(paclitaxel)、1,3-雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(BCNU)、立複黴素(rifampicin)、順鉑、甲胺喋呤(methotrexate)及吉西他濱(gemcitabine)。

在一些實施例中，本發明之放射性免疫結合物包含選自包含以下之群的放射性同位素：²²⁵Ac、⁸⁶Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、²¹³Bi、²¹³Po、²¹¹At、²¹²Bi、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、¹⁴⁹Tb、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁹Zr、¹³⁷Cs、²¹²Pb及¹⁰³Pd。

在一些實施例中，本發明之放射性免疫結合物包含選自由以下組成之群的放射性同位素：²²⁵Ac、⁸⁶Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、²¹³Bi、²¹³Po、²¹¹At、²¹²Bi、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、¹⁴⁹Tb、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁹Zr、¹³⁷Cs、²¹²Pb及¹⁰³Pd。

在一些實施例中，放射性同位素係發射α粒子之放射性同位素，其包含²²⁵Ac、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、²¹²Pb、²¹²Bi或²¹³Bi。

在一些實施例中，放射性同位素係選自由以下組成之群的發射α粒子之放射性同位素：²²⁵Ac、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、²¹²Pb、²¹²Bi及²¹³Bi。

免疫結合物、抗原結合區及重鏈可變區之其他實施例描述於下。

在一些實施例中，免疫結合物包含二聚化域或模體。在一些其他實施例中，二聚化域或模體係在變異型恆定區、連接子或鉸鏈區中。

習此相關技藝之人士可使用此項技術中已知之做法及方法對本發明之多聚免疫結合物進行工程改造。舉例而言，經工程改造之半胱胺酸殘基可形成共價鍵，由此使自發組裝之多聚結構穩定(參見例如Glockshuber R等人,Biochemistry29: 1362-7(1990))。舉例而言，在特定位置處引入半胱胺酸殘基可用於產生經二硫鍵穩定之結構，如Cys-雙功能抗體、scFv'多聚體、VHH多聚體、VNAR多聚體及IgNAR多聚體，諸如藉由添加以下胺基酸殘基：GGGGC(SEQ ID NO:260)及SGGGGC(SEQ ID NO:261)(Tai M等人,Biochemistry29: 8024-30 (1990)；Caron P等人,J Exp Med176: 1191-5 (1992)；Shopes B, J Immunol 148: 2918-22 (1992)；Adams G等人,Cancer Res53: 4026-34 (1993)；McCartney J等人,Protein Eng18: 301-14 (1994)；Perisic O等人,Structure2: 1217-26 (1994)；George A等人,Proc Natl Acad Sci USA92: 8358-62 (1995)；Tai M等人,Cancer Res (Suppl)55: 5983-9 (1995)；Olafsen T等人,Protein Eng Des Sel17: 21-7 (2004))。

或者，兩個或更多個多肽鏈可使用自締合或彼此多聚化之多肽域連接在一起(參見例如US 6,329,507)。舉例而言，添加羧基末端多聚化域已用於構築包含免疫球蛋白域之多價蛋白質，該等免疫球蛋白域為諸如scFv、自主V_H域、V_HH、V_NAR及IgNAR。習此相關技藝之人士已知的自締合域之實例包括免疫球蛋白恆定域(諸如孔中節(knobs-into-holes)、靜電轉向及IgG/IgA股交換)；免疫球蛋白Fab鏈(例如(Fab-scFv)₂及(Fab'scFv)₂)；免疫球蛋白Fc域(例如(sc雙功能抗體-Fc)₂、(scFv-Fc)₂及scFv-Fc-scFv)；免疫球蛋白CHX域；免疫球蛋白CH1-3區；免疫球蛋白CH3域(例如(sc雙功能抗體-CH3)₂、LD微型抗體及可撓性微型抗體(Flex-minibody))；免疫球蛋白CH4域；CHCL域；兩親性螺旋束(例如scFv-HLX)；螺旋-轉角-螺旋域(例如scFv-dHlx)；捲曲螺旋結構，包括白胺酸拉鏈及軟骨寡聚基質蛋白(例如scZIP)；cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)二聚化及對接域(DDD)與A激酶錨定蛋白(AKAP)錨定域(AD)之組合(亦稱為「對接與鎖定」或「DNL」)；鏈黴抗生物素蛋白；維羅毒素B (verotoxin B)多聚化域；來自p53之四聚化區；及芽孢桿菌RNA酶(barnase)-barstar相互作用域(Pack P, Plückthun A,Biochemistry31: 1579-84 (1992)；Holliger P等人,Proc Natl Acad Sci USA90: 6444-8 (1993)；Kipriyanov S等人,Hum Antibodies Hybridomas6: 93-101 (1995)；de Kruif J, Logtenberg T,J Biol Chem271: 7630-4 (1996)；Hu S等人,Cancer Res56: 3055-61 (1996)；Kipriyanov S等人,Protein Eng9: 203-11 (1996)；Rheinnecker M等人,J Immunol157: 2989-97 (1996)；Tershkikh A等人,Proc Natl Acad Sci USA94: 1663-8 (1997)；Müller K等人,FEBS Lett422: 259-64 (1998)；Cloutier S等人,Mol Immunol37: 1067-77 (2000)；Li S等人,Cancer Immunol Immunother49: 243-52 (2000)；Schmiedl A等人,Protein Eng13: 725-34 (2000)；Schoonjans R等人,J Immunol165: 7050-7 (2000)；Borsi L等人,Int J Cancer102: 75-85 (2002)；Deyev S等人,Nat Biotechnol21: 1486-92 (2003)；Wong W, Scott J,Nat Rev Mol Cell Biol5: 959-70 (2004)；Zhang J等人,J Mol Biol335: 49-56 (2004)；Baillie G等人,FEBS Letters579: 3264-70 (2005)；Rossi E等人,Proc Natl Acad Sci USA103: 6841-6 (2006)；Simmons D等人,J Immunol Methods315: 171-84 (2006)；Braren I等人,Biotechnol Appl Biochem47: 205-14 (2007)；Chang C等人,Clin Cancer Res13: 5586-91s (2007)；Liu M等人,Biochem J406: 237-46 (2007)；Zhang J等人,Protein Expr Purif65: 77-82 (2009)；Bell A等人,Cancer Lett289: 81-90 (2010)；Iqbal U等人,Br J Pharmacol160: 1016-28 (2010)；Asano R等人,FEBS J280: 4816-26 (2013)；Gil D, Schrum A,Adv Biosci Biotechnol4: 73-84 (2013))。

習此相關技藝之人士可使用此項技術中已知的各種基於scFv之多肽相互作用，諸如基於scFv之二聚複合物、三聚複合物、四聚複合物等對本發明之多聚免疫結合物進行工程改造。舉例而言，scFv中連接子之長度可影響基於非共價、多聚、多價結構之自發組裝。一般而言，具有十二個胺基酸或更少胺基酸之連接子(包括不存在任何連接子)經由相對於鏈內域配對而有利於分子間域置換來促進包含scFv之多肽或蛋白質多聚化成更高分子量物種(參見例如Dolezal O等人,Protein Eng16: 47-56(2003))。然而，根本不具有連接子或具有例示性長度為15個胺基酸殘基之連接子的scFv可多聚化(Whitlow M等人,Protein Eng6: 989-95 (1993)；Desplancq D等人,Protein Eng7: 1027-33 (1994)；Whitlow M等人,Protein Eng7, 1017-26 (1994)；Alfthan K等人,Protein Eng8: 725-31 (1995))。習此相關技藝之人士可使用此項技術中已知及/或本文所描述之技術鑑別所產生及/或純化的多聚結構。

在一些實施例中，考慮本文所描述之免疫結合物的胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良本發明之免疫結合物的結合親和力、穩定性及/或其他生物特性(例如改變半衰期或治療窗、降低免疫原性或增加製造的便利性)。免疫結合物之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼免疫結合物之核苷酸序列中，或藉由合成所需免疫結合物或多肽來製備。此類修飾包括例如免疫球蛋白域或多肽序列之融合；鉸鏈、連接子及/或螯合劑組分之取代；放射性同位素之取代。此類修飾包括例如免疫結合物之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代。可進行融合、缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，只要最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合之特定結合親和力水平、特定K_D水平及/或特定Koff水平。

本文提供抗原結合抗體片段及CDR組。此等片段可在N末端或C末端處截短，或可缺少內部殘基，例如當與全長天然抗體(例如全長駱駝科VHH IgG2或IgG3)相比時。某些片段可缺少對於抗體之所需生物活性或減小本發明之免疫結合物之總大小並非必需的胺基酸殘基或域。

在一些實施例中，藉由併入額外結構使本發明之免疫結合物之變異體變大。在一些實施例中，免疫結合物連接至異源部分或易於偵測之部分。在一些其他實施例中，連接包含蛋白質融合。在一些其他實施例中，異源部分係細胞毒性劑。在一些實施例中，添加羧基末端離胺酸殘基以提供位點特異性連接位點。胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基末端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之免疫結合物。免疫結合物分子之其他插入變異體包括免疫結合物之N末端或C末端與酶(例如對於ADEPT而言)或增加免疫結合物之血清半衰期之多肽的融合。

編碼本發明之免疫結合物的核酸可經修飾以產生嵌合或融合免疫結合物多肽，例如藉由取代人類重鏈及輕鏈恆定域(針對同源鼠類序列之CH及CO序列(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人,Proc Natl Acad Sci USA81: 6851 (1984))，或藉由使免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)之全部或部分編碼序列融合。非免疫球蛋白多肽序列可取代免疫結合物之恆定域，或取代免疫結合物之一個抗原組合位點的可變域以產生嵌合二價免疫結合物，該嵌合二價免疫結合物包含一個對抗原具有特異性之抗原組合位點及另一個對不同抗原具有特異性之抗原組合位點。

在本文所描述之本發明中用作抗原結合域的抗體構築體之變異可例如使用例如美國專利第5,364,934號中所闡述的用於保守性及非保守性突變之任何技術及指南進行。變異可為編碼免疫結合物或多肽之一或多個密碼子的取代、缺失或插入，其造成胺基酸序列相較於天然序列抗體或多肽之變化。視情況，該變異係藉由在免疫結合物之一或多個域中至少一個胺基酸用任何其他胺基酸取代。藉由比較免疫結合物之序列與同源已知蛋白質分子之序列且使高同源性區域中所產生之胺基酸序列變化之數目最少，可以發現用於確定可插入、取代或缺失何種胺基酸殘基而不會不利地影響所需活性之指導。胺基酸取代可為一個胺基酸經具有類似結構及/或化學特性之另一胺基酸置換的結果，諸如白胺酸經絲胺酸置換，亦即保守性胺基酸置換。插入或缺失可視情況在約1至5個胺基酸之範圍內。所允許之變異可藉由在序列中系統性地進行胺基酸插入、缺失或取代且測試所得變異體之全長或成熟天然序列所展現的活性來確定。

在特定實施例中，感興趣之保守取代示於表B及表C中，包括在較佳取代之標題下。若此等取代造成生物活性之變化，則引入表 D中命名為例示性取代或如下文關於胺基酸類別進一步描述的更實質性之變化，且篩選產物。表 D

原始殘基	例示性取代	較佳取代
Ala (A)	val；leu；ile	val
Arg (R)	lys；gln；asn	lys
Asn (N)	gln；his；lys；arg	gln
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gln (Q)	asn	asn
Glu (E)	asp	asp
Gly (G)	pro；ala	ala
His (H)	asn；gln；lys；arg	arg
Ile (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸	leu
Leu (L)	正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	ile
Lys (K)	arg；gln；asn	arg
Met (M)	leu；phe；ile	leu
Phe (F)	leu；val；ile；ala；tyr	leu
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr；phe	tyr
Tyr (Y)	trp；phe；thr；ser	phe
Val (V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸	leu

藉由選擇在對維持以下之影響方面有顯著不同的取代來實現本發明之免疫結合物之功能或免疫學特性的實質性改變：(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如呈片狀或螺旋狀構形；(b)目標位點處該分子之電荷或疏水性；或(c)側鏈之體積。基於常見側鏈特性將天然存在之殘基分成以下各組：(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：asn、gln、his、lys、arg；(5)影響鏈取向之殘基：gly、pro；及(6)芳族：trp、tyr、phe。

非保守取代將需要此等類別之一之成員與另一類別之交換。此等經取代之殘基亦可引入保守性取代位點中或更佳地引入其餘(非保守性)位點中。

可以使用此項技術中已知之方法產生變異，諸如寡核苷酸介導(定點)之突變誘發、丙胺酸掃描及PCR突變誘發。可對經選殖之DNA上進行定點突變誘發(Carter等人,Nucl . Acids Res ., 13:4331 (1986)；Zoller等人,Nucl . Acids Res ., 10:6487 (1987))、卡匣突變誘發(Wells等人,Gene, 34:315 (1985))、限制選擇突變誘發(Wells等人,Philos . Trans . R . Soc . London SerA, 317:415 (1986))或其他已知技術以產生編碼本發明之免疫結合物變異體的DNA分子。

在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之免疫結合物變異體。用於取代型突變誘發的感興趣位點包括免疫球蛋白可變域以及免疫球蛋白恆定域內之HVR及FR。胺基酸取代可引入感興趣免疫結合物中且針對所需活性，例如改善/保留之抗原結合、降低/保留之免疫原性、改善/保留之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、改善/保留之補體依賴性細胞毒性(CDC)、改善/保留之目標抑制及/或改善/保留之抗體依賴性細胞介導的吞噬作用(ADCP)來篩選產物。類似地，可以將胺基酸取代引入感興趣免疫結合物中且針對活性(例如ADCC、CDC、目標抑制及/或ADCP)之降低或消除來篩選產物。

一種類型之取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人源化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得一或多個變異體將在某些生物特性方面相對於親本抗體具有改變(例如改善) (例如親和力提高、免疫原性降低)及/或將實質上保持親本抗體之某些生物特性。一種示例性取代型變異體係親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(諸如本文所描述之技術)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上展示變異抗體且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。

可在HVR中進行改變(例如取代)以例如改善免疫結合物親和力。此類改變可在HVR「熱點(hotspot)」中，亦即，由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子所編碼的殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol . Biol. 207:179-196(2008))及/或SDR (a-CDR)中進行，並測試所得變異VH或VL之結合親和力。藉由自二級文庫構築及再選擇進行親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人, Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編輯, Human Press, Totowa, NJ, (2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)中之任一者將多樣性引入選擇用於成熟之可變基因中。接著，建立二級文庫。隨後，篩選該文庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變異體。另一種引入多樣性之方法涉及HVR定向之方法，在該等方法中，將數個HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。參與抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化進行特異性鑑別。具體言之， CDR-H3及CDR-L3常常作為目標。

在一些實施例中，取代、插入或缺失可在一或多個HVR內發生，只要此等改變實質上不會降低免疫結合物結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不會實質上降低結合親和力之保守改變(例如本文所提供之保守取代)。此等改變可在HVR「熱點」或SDR外。在上文所提供之變異型VH及VL序列的某些實施例中，各HVR不變或者含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。

用於鑑別可作為突變誘發之目標的抗體之殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989)Science, 244:1081-1085所描述。在此方法中，鑑別一殘基或一組目標殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且用中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互相用是否受到影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。

替代地或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構用於鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物進行靶向或消除。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。

在一些實施例中，本發明之免疫結合物包括含人源化免疫球蛋白域之抗體構築體(用作本文中之抗原結合區)。

非人類(例如駱駝科、鼠類或兔)抗體之人源化形式係含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)。人源化抗體包括人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之互補決定區(CDR)的殘基經來自具有所需特異性、親和力及能力的諸如駱駝科、小鼠、大鼠或兔之非人類物種(供體抗體)之CDR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架殘基經相應的非人類殘基置換。人源化抗體亦可包含既未在接受者抗體中發現，亦未在所輸入之CDR或構架序列中發現的殘基。一般而言，人源化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上所有CDR區與非人類免疫球蛋白之CDR區對應且所有或實質上所有FR區係人類免疫球蛋白共有序列之FR區。人源化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之至少一部分(Jones等人, Nature, 321: 522-5 (1986)；Riechmann等人, Nature, 332: 323-9 (1988)；及Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-6 (1992))。

用於使非人類抗體人源化之方法係此項技術中熟知的。一般而言，人源化抗體具有一或多個自非人類來源引入的胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其通常自「輸入」可變域獲取。人源化可基本上遵循Winter及同事之方法(Jones等人,Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人,Science, 239:1534-1536 (1988))，藉由用嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之對應序列來進行。因此，此類「人源化」抗體係嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中實質上小於完整人類可變域已經來自非人類物種之對應序列取代。實際上，人源化抗體通常為一些CDR殘基且可能一些FR殘基經來自嚙齒動物抗體中類似位點之殘基取代的人類抗體。

根據另一方法，可透過選擇經修復之高變區在抗體人源化期間恢復抗原結合(參見例如2005年2月18日提交之美國申請案序列號11/061,841)。該方法包括將非人類高變區併入受體構架上且進一步在一或多個高變區中引入一或多個胺基酸取代而不修飾受體構架序列。或者，一或多個胺基酸取代之引入可伴隨受體構架序列中之修飾。

不參與維持本發明之免疫結合物之適當構形的任何半胱胺酸殘基一般亦可經絲胺酸取代，以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。反之，可在本發明之免疫結合物中添加一或多個半胱胺酸鍵以改良其穩定性(尤其是在抗體係諸如Fv片段或VHH片段之抗體片段的情況下)。

在一些實施例中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造之免疫結合物，其中免疫結合物之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在一些實施例中，經取代之殘基存在於免疫結合物之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代該等殘基，由此將反應性硫醇基安置於免疫結合物之可及位點處且可用於使免疫結合物與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合。在一些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。經半胱胺酸工程改造之抗體可如例如US 7,521,541中所描述來產生。

熟習此項技術者應瞭解，胺基酸變化可改變免疫結合物之轉譯後過程，諸如變化糖基化位點之數目或位置，或改變膜錨定特徵。

在一些實施例中，使本文所提供之免疫結合物改變以增加或減少免疫結合物糖基化之程度及/或變化醣基化模式。「改變天然醣基化模式」在本文中意欲指缺失在本發明之親本免疫結合物中可見的一或多個碳水化合物部分(藉由移除潛在醣基化位點或藉由化學及/或酶方式使醣基化缺失)，及/或添加不存在於本發明之天然序列免疫結合物中之一或多個醣基化位點。另外，該片語包括天然蛋白質之醣基化的定性變化，其涉及所存在之各種碳水化合物部分之性質及比例的變化。

抗體及其他多肽之醣基化通常為N-連接或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸係用於將碳水化合物部分經酶連接至天冬醯胺側鏈之識別序列，其中X係除脯胺酸外的任何胺基酸。因此，在多肽中存在此等三肽序列中之任一者將產生潛在醣基化位點。O-連接之醣基化係指糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸的連接，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。

免疫結合物中添加或缺失醣基化位點宜藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個醣基化位點來實現。宜藉由改變胺基酸序列以使其含有上述三肽序列中之一或多者，向本發明之免疫結合物中添加醣基化位點(用於N-連接之醣基化位點)。亦可藉由在本發明之原始免疫結合物序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或者用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代本發明之原始免疫結合物序列來產生改變(用於O-連接之醣基化位點)。本發明之免疫結合物胺基酸序列可視情況透過DNA層面上的變化來改變，特別是藉由使編碼本發明之免疫結合物之DNA在預先選擇之鹼基處突變，使得產生將轉譯為所需胺基酸之密碼子。

在免疫結合物包含Fc區之情況下，可改變其所連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，其一般藉由N-鍵聯與Fc區CH2域之Asn297連接(參見例如Wright等人,TIBTECH15:26-32 (1997))。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹(stem)」中之GlcNAc的岩藻醣。在一些實施例中，可對本發明之免疫結合物中之寡醣進行修飾以便產生具有某些改良之特性的免疫結合物變異體。

增加本發明之免疫結合物上碳水化合物部分之數目的另一方式係藉由糖苷與多肽之化學或酶法偶聯。此類方法描述於此項技術中，例如1987年9月11日公開之WO 87/05330；以及Aplin及Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 第259-306頁(1981)。

移除存在於本發明之免疫結合物上的碳水化合物部分可以化學或酶方式或藉由編碼充當醣基化目標之胺基酸殘基之密碼子的突變取代來實現。化學去醣基化技術係此項技術中已知的且描述於例如Hakimuddin等人, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)；以及Edge等人, Anal. Biochem., 118:131 (1981)。多肽上碳水化合物部分之酶裂解可如Thotakura等人, Meth. Enzymol., 138:350 (1987)所描述，藉由使用多種內醣苷酶及外醣苷酶來實現。

在一些實施例中，提供具有碳水化合物結構的免疫結合物變異體，該碳水化合物結構缺乏連接(直接或間接)至Fc區之岩藻醣。舉例而言，此類免疫結合物中岩藻醣之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如例如WO 2008/077546中所描述，岩藻醣之量係藉由相對於經MALDI-TOF質譜法所量測的連接至Asn297之所有醣結構(例如複合物、混合物及高甘露糖結構)的總和，計算Asn297處糖鏈內岩藻醣之平均量來測定。Asn297係指位於Fc區中約297位(Fc區殘基之Eu編號)處的天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體之微小序列變化，Asn297亦可位於297位上游或下游約±3個胺基酸處，亦即，在294位與300位之間。此類岩藻醣基化變異體可具有改良之ADCC功能(參見例如US 2003/0157108；US 2004/0093621)。關於「去岩藻醣基化」或「缺乏岩藻醣」之抗體變異體的公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/01 15614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/01 10704；US 2004/01 10282；US 2004/0109865；WO 2003/0851 19；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031 140；Okazaki等人,J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech. Bioeng.87:614 (2004)。能夠產生去岩藻醣基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之Lecl3 CHO細胞(Ripka等人,Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；WO 2004/056312；Adams等人，尤其是實例11)及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻醣基轉移酶基因FUT8剔除之CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人,Biotechnol. Bioeng.,94(4):680-688 (2006)；WO2003/085107))。

免疫結合物變異體進一步具有平分寡醣，例如其中連接至抗體Fc區之雙觸角寡醣經GlcNAc平分。此類免疫結合物變異體可具有減少之岩藻醣基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878；US 6,602,684；US 2005/0123546。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基連接至Fc區之免疫結合物變異體。此類免疫結合物變異體可具有改良之CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/030087；WO 1998/058964；及WO 1999/022764。免疫結合物衍生物及其他修飾

本發明之免疫結合物的共價修飾包括在本發明之範圍內。一種類型的共價修飾包括使本發明之免疫結合物的目標胺基酸殘基與有機衍生化劑反應，該有機衍生化劑能夠與免疫結合物之所選側鏈或者N末端或C末端殘基反應。用雙官能試劑衍生化可用於例如使本發明之免疫結合物與不溶於水之支撐基質或表面交聯以用於純化本發明之免疫結合物的方法，且反之亦然。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀醯亞胺酯，例如與4-疊氮基柳酸之酯；同型雙官能醯亞胺酯，包括二琥珀醯亞胺基酯，諸如3,3'-二硫代雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)；雙官能順丁烯二醯亞胺，諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺基-1,8-辛烷；及諸如3-[(對疊氮苯基)二硫基]丙亞胺酸甲酯之試劑。

其他修飾包括麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基分別脫醯胺為相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基；脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基的磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 第79-86頁(1983))；N末端胺之乙醯化；及任何C末端羧基之醯胺化。

在一些實施例中，本文中所提供之免疫結合物可經進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白質部分。適合免疫結合物衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚1,3-二氧雜環戊烷、聚1,3,6-三㗁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其於水中之穩定性而在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支或未分支的。連接至免疫結合物之聚合物的數目可變化，且若連接超過一個聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物的數目及/或類型可基於包括(但不限於)以下考慮因素來確定：待改良免疫結合物之特定特性或功能；免疫結合物衍生物是否將在限定條件下用於療法等。

本發明的經PEG衍生化之免疫結合物可包括含一或多個-CH₂CH₂O-之連接子且可用於改變免疫結合物之生物分佈及藥物動力學。PEG可以製備為聚合形式或離散寡聚物形式。此等聚合物之雙官能化型式可將免疫結合物與螯合劑連接及/或使整個分子具有額外的大小及/或溶解度。在一些實施例中，經PEG衍生化之免疫結合物與其未經衍生化之親本分子相比展現降低之免疫原性。產生本發明之免疫結合物之方法

本發明提供一種組合物，其包含根據以上實施例中任一者或本文中所描述之免疫結合物中的一或多者。在另一態樣中，本發明提供一種經分離之核酸，其編碼本文所描述之放射性同位素遞送平台。本文亦提供編碼本發明之免疫結合物之蛋白質組分的核酸、包含前述核酸之表現載體及包含前述表現載體之宿主細胞。

在另一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含本文所提供之核酸及/或載體。在一些實施例中，本發明之宿主細胞經分離或經純化。在一些實施例中，本發明之宿主細胞係在細胞培養基中。本發明之核酸、表現載體及宿主細胞可用於產生包含本發明之免疫結合物中之一或多者的組合物。在一些實施例中，宿主細胞係真核細胞。在一些實施例中，宿主細胞係哺乳動物細胞。在一些實施例中，宿主細胞係中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一些實施例中，宿主細胞係原核細胞。在一些實施例中，宿主細胞係大腸桿菌細胞。

以下描述用於產生本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物的說明性技術，以根據本發明之方法使用。在一些實施例中，本發明提供一種用於製備本發明之免疫結合物的方法，該方法包含在適合於編碼放射性同位素遞送平台之表現載體的條件下培養本文所提供之宿主細胞，及回收或純化該放射性同位素遞送平台。在一些實施例中，該方法進一步包含用適當同位素(諸如α或β粒子發射體)對該放射性同位素遞送平台進行放射性標記。抗原結合域、免疫結合物及核酸之產生及鑑別

可用作本文中之抗原結合區的抗原結合域可在抗體中鑑別，該等抗體係單株抗體及/或多株抗體。編碼單株抗體之DNA易於使用習知程序分離及定序。分離後，即可將DNA置放於表現載體中，接著將該等表現載體轉染至不另外產生抗體蛋白質之宿主細胞，諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞中，以在重組宿主細胞中合成單株抗體(參見例如Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)；及Plückthun,Immunol Revs. 130:151-188 (1992))。

在一些實施例中，本發明之免疫結合物的抗原結合域或其片段係藉由篩選含有噬菌體之噬菌體文庫來分離，該噬菌體文庫展示與噬菌體外殼蛋白融合的抗體可變區(Fv、scFv或VHH)之各種片段。針對與所需目標抗原或抗原決定基之結合篩選此等噬菌體文庫。表現能夠結合至所需抗原之Fv片段、scFv或VHH之純系經吸附至抗原且因此與文庫中之非結合純系分離。接著，將結合純系自抗原溶離，且可藉由額外抗原吸附/溶離循環進一步富集。

在一些實施例中，將抗體或其抗體片段自使用McCafferty等人,Nature, 348:552-554 (1990)中所描述之技術產生的抗體噬菌體文庫中分離。Clackson等人,Nature, 352:624-628 (1991)及Marks等人,J Mol Biol., 222:581-597 (1991)分別描述使用噬菌體文庫分離鼠類及人類抗體。後續出版物描述藉由鏈改組來產生高親和力(nM範圍)人類抗體(Marks等人,Bio / Technology, 10:779-783 (1992))以及組合感染與活體內重組作為用於構築極大型噬菌體文庫之策略(Waterhouse等人,Nuc Acids Res, 21:2265-2266 (1993))。可變域可以單鏈Fv (scFv)片段形式(其中VH與VL透過可撓性短肽共價連接)或Fab片段形式(其中Fab片段各自與恆定域融合且非共價相互作用)功能性展示於噬菌體上，如例如Winter等人,Ann . Rev . Immunol ., 12: 433-455 (1994)中所描述。

VH及VL基因譜系可分別藉由聚合酶連鎖反應(PCR)選殖且在噬菌體文庫中隨機重組，接著可針對抗原結合純系搜尋該等文庫，如Winter等人,Ann . Rev . Immunol ., 12: 433-455 (1994)中所描述。用於篩選之天然文庫可由未免疫來源構築以提供針對抗原之高親和力抗體(參見例如Griffiths等人,EMBO J, 12: 725-734 (1993))。另一實例係藉由選殖來自幹細胞的未經重排之V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高變CDR3區並如例如Hoogenboom及Winter,J . Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992)所描述實現活體外重排，以合成方式構築天然文庫。

可藉由此項技術中已知的多種技術實現文庫之篩選。舉例而言，可使用目標抗原塗佈吸附盤各孔，在附於吸附盤上或用於細胞分選之宿主細胞上表現，或與生物素結合以用塗有鏈黴抗生物素蛋白之珠粒捕獲，或用於任何其他淘選展示文庫之方法中。可藉由使用長時間洗滌及單價噬菌體展示(如Bass等人,Proteins, 8: 309-314 (1990)及WO 1992/09690中所描述)以及低抗原塗佈密度(如Marks等人,Biotechnol., 10: 779-783 (1992)中所描述)來促進具有慢解離動力學(及強結合親和力)之抗體的選擇。

用於篩選cDNA文庫之技術係此項技術中熟知的。可用經設計用於鑑別感興趣基因或由其編碼之蛋白質的探針(諸如具有至少約20-80個鹼基之寡核苷酸)篩選文庫。使用所選探針篩選cDNA或基因體文庫可使用標準程序進行，諸如Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所描述。分離編碼本發明之免疫結合物之基因的替代方式係使用PCR方法(Sambrook等人, 前述；Dieffenbach等人,PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995))。

編碼本發明之免疫結合物的DNA可獲自cDNA文庫，該cDNA文庫係由咸信具有本發明之免疫結合物mRNA且以可偵測水平表現該mRNA的組織製備。因此，本發明之人類免疫結合物DNA可便利地自人類組織製備之cDNA文庫獲得。編碼本發明之免疫結合物的基因亦可自基因體文庫或藉由已知合成程序(例如自動化核酸合成)獲得。對於一些實施例，所需的編碼抗體之聚核苷酸序列可自例如抗體產生細胞(諸如融合瘤細胞)分離且定序。

可將在此等文庫篩選方法中鑑別的序列與諸如GenBank之公共資料庫中或其他私人序列資料庫保藏且可獲得的其他已知序列相比較及比對。可使用此項技術中已知且如本文所描述之方法測定分子之限定區域內或全長序列內之序列一致性(在胺基酸或核苷酸層面上)。本發明之任何抗體CDR或重鏈可變片段可藉由以下方式獲得：設計適合的抗原篩選程序來選擇感興趣之噬菌體純系，隨後使用來自感興趣之噬菌體純系的可變域及/或CDR序列以及描述於前述Kabat等人(1991)中之適合恆定區(Fc)序列來構築抗體純系。免疫結合物產生 ； 本發明之宿主細胞及表現載體

以下描述主要係關於藉由培養用含有編碼本發明之免疫結合物之核酸的載體轉形或轉染之細胞產生本發明之抗體構築體。當然，經考慮，可以利用此項技術中熟知之替代方法製備本發明之抗體構築體。舉例而言，適當胺基酸序列或其部分可以藉由使用固相技術進行直接肽合成來產生(例如Stewart等人., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J,Am. Chem. Soc., 85: 2149-54 (1963))。活體外蛋白質合成可使用人工技術或自動化進行。自動化合成可例如使用Applied Biosystems肽合成儀(Foster City, CA)，使用製造商說明書實現。本發明之免疫結合物的各種部分可以用化學方式分開合成且使用化學或酶方法組合以產生所需的本發明之免疫結合物。

可使用例如US 4,816,567中所描述之重組方法及組合物製備抗體構築體。在一個實施例中，提供編碼本文所描述之抗體的經分離之核酸。此核酸可編碼包含抗體VH及/或包含VL胺基酸序列(例如抗體輕鏈及/或重鏈)的胺基酸序列。在另一實施例中，提供包含此類核酸的一或多種載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含(例如已用以下轉形)：(1)包含編碼構成抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體。在一些其他實施例中，宿主細胞包含：(1)包含編碼構成抗體VL之胺基酸序列及構成抗體VH之胺基酸序列的核酸之載體；或(2)第一載體，其包含編碼構成抗體VL之胺基酸序列的核酸，及第二載體，其包含編碼構成抗體VH之胺基酸序列的核酸。在一個實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如YO、NSO、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製備本發明之免疫結合物的方法，其中該方法包含在適於表現抗體的條件下培養上文所提供的包含編碼抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

對於重組產生本發明之免疫結合物，將編碼抗體構築體之核酸(例如上文所描述)分離且將其插入一或多個載體中以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該核酸可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體重鏈及/或輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離且定序。編碼本發明之免疫結合物之胺基酸序列(包括序列變異體)的核酸分子可藉由習此相關技藝之人士已知的多種方法來製備。此等方法包括(但不限於)自天然來源(在天然存在之胺基酸序列變異體的情況下)分離或藉由抗體構築體的更早製備之變異體或非變異體型式的寡核苷酸介導(或定點)之突變誘發、PCR突變誘發及卡匣突變誘發來製備。用於免疫結合物產生之宿主細胞的操作

將宿主細胞用本文所描述之表現載體或選殖載體轉染或轉形以便產生本發明之免疫結合物，且在習知營養培養基中培養，該營養培養基在適當時經改良以誘導啟動子、選擇轉形體或擴增編碼所需序列之基因。熟習此項技術者不經過度實驗即可選擇培養條件，諸如培養基、溫度、pH及其類似條件。一般而言，用於使細胞培養物生產力最大化的原理、方案及實際技術可見於Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler編輯(IRL Press, 1991)；及Sambrook等人, 同上文。

適合選殖或表現編碼免疫結合物之核酸及載體的宿主細胞包括本文所描述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，尤其是在不需要醣基化及Fc效應功能時亦如此。對於細菌中抗體片段及多肽之表現，參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523；及Charlton,Methods in Molecular Biology, 第248卷(B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 第245-254頁，其描述大腸桿菌中抗體片段之表現)。在表現之後，免疫結合物可以自細菌細胞糊狀物中以可溶性部分分離且可進一步經純化。

除原核生物之外，真核微生物，諸如絲狀真菌或酵母係適合編碼免疫結合物之載體的選殖或表現宿主，包括醣基化路徑經「人源化」以產生具有部分或完全人類醣基化模式之抗體的真菌及酵母菌株(參見例如Gerngross,Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)；Li等人,Nat. Biotech. 24:210-215 (2006))。

用於表現醣基化免疫結合物之適合宿主細胞亦來源於多細胞生物體(例如無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出許多適合與昆蟲細胞結合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主(參見例如US 5,959,177；US 6,040,498；US 6,420,548；US 7,125,978；及US 6,417,429。

脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為有用的。有用的哺乳動物宿主細胞株之其他實例係經SV40 (COS-7)轉形之猴腎CV1細胞株；人類胚腎細胞株(如例如在Graham等人,J . Gen Virol .36:59 (1977)中所描述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse Sertoli cell) (如例如Mather,Biol . Reprod .23:243-251 (1980)中所描述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MOCK；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell；BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep 02)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；如例如Mather等人,Annals N . Y . Acad . Sci. 383:44-68 (1982)中所描述之TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFK CHO細胞(Urlaub等人,Proc Natl Acad Sci USA77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NSO及Sp2/0。有關適於免疫結合物產生之某些哺乳動物宿主細胞株的評述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology, 第248卷(B.K.C. Lo,編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁(2003)。

真核細胞轉染及原核細胞轉形之方法係熟習此項技術者已知的，意謂將DNA引入宿主中以使得DNA可作為染色體外或藉由染色體整合體複製，例如CaCl₂、CaPO₄、脂質體介導、聚乙二醇(polyethylene-gycol)/DMSO及電穿孔。取決於所用宿主細胞，轉形係使用適於此類細胞之標準技術進行。如Sambrook等人(見上文)中所描述，採用氯化鈣進行的鈣離子處理或電穿孔通常用於原核生物。用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感染被用於轉形某些植物細胞，如Shaw等人, Gene, 23:315 (1983)及1989年6月29日公開之WO 89/05859中所描述。對於不含此等細胞壁之哺乳動物細胞，可使用Graham及van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)之磷酸鈣沉澱方法。哺乳動物細胞宿主系統轉染之一般態樣已描述於美國專利第4,399,216號中。轉形至酵母中通常係根據Van Solingen等人, J. Bact., 130:946 (1977)及Hsiao等人,Proc Natl Acad Sci USA76:3829 (1979)之方法進行。然而，亦可使用其他用於將DNA引入細胞中之方法，諸如藉由細胞核顯微注射、電穿孔、細菌原生質體與完整細胞之融合或聚陽離子(例如凝聚胺、聚鳥胺酸)。有關用於轉形哺乳動物細胞之各種技術，參見Keown等人, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及Mansour等人, Nature, 336:348-352 (1988)。原核宿主細胞

適合之原核生物包括(但不限於)古細菌及真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科(Enterobacteriaceae)，諸如大腸桿菌。各種大腸桿菌菌株係公開可獲得的，諸如K12菌株MM294 (ATCC 31,446)；X1776 (ATCC 31,537)；W3110 (ATCC 27,325)；及K5 772 (ATCC 53,635)。其他適合之原核宿主細胞包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌屬(Serratia)(例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans))及志賀桿菌屬(Shigella)，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)(諸如枯草芽孢桿菌(B . subtilis)及地衣芽孢桿菌(B . licheniformis)，例如1989年4月12日公開之DD 266,710中所揭露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(諸如綠膿桿菌(P . aeruginosa))、根瘤菌屬(Rhizobia)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、副球菌屬(Paracoccus)及鏈黴菌屬(Streptomyces)。此等實例係說明性而非限制性的。大腸桿菌菌株W3110係一種有利的宿主或親本宿主，因為其係用於重組DNA產物醱酵之常用宿主菌株。較佳地，宿主細胞分泌極少量之蛋白水解酶。舉例而言，菌株W3110(Bachmann, Cellular and Molecular Biology, 第2卷(Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 第1190-1219頁；ATCC保藏編號27,325)可經修飾以在編碼宿主內源蛋白之基因中產生基因突變，其中此等宿主之實例包括大腸桿菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大腸桿菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大腸桿菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanr；大腸桿菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr；大腸桿菌W3110菌株40B4，其為具有非卡那黴素(kanamycin)抗性degP缺失突變之菌株37D6；具有基因型W3110 ∆fhuA(∆tonA)ptr3 lac Iq lacL8∆ompT∆(nmpc-fepE)degP41 kanR之大腸桿菌W3110菌株33D3(美國專利第5,639,635號)；及1990年8月7日發佈之美國專利第4,946,783號中揭露的具有突變周質蛋白酶之大腸桿菌菌株。其他菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294 (ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ 1776 (ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308 (ATCC 31,608)亦為適合的。此等實例係說明性而非限制性的。用於構築具有限定基因型的上述細菌中之任一者之衍生物的方法係此項技術中已知的且描述於例如Bass等人,Proteins, 8:309-314 (1990)中。考慮到複製子在細菌細胞中之可複製性，通常需要選擇適合的細菌。舉例而言，當使用熟知質體，諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410供應複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌或沙門氏菌物種可適當地用作宿主。通常，宿主細胞應分泌極少量的蛋白水解酶，且宜將額外蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。或者，活體外選殖方法係適合的，例如PCR或其他核酸聚合酶反應。

全長抗體、抗體片段及抗體融合蛋白可在細菌中產生，尤其是在不需要醣基化及Fc效應功能時。全長抗體在循環中具有較長的半衰期。在大腸桿菌中產生更快且更有成本效益。關於細菌中抗體片段及多肽之表現，參見例如U.S. 5,648,237；U.S. 5,789,199及U.S. 5,840,523，其描述用於最佳化表現及分泌之轉譯起始區(TIR)及信號序列。在表現之後，將免疫結合物以可溶性部分自大腸桿菌細胞糊漿中分離且其可根據同型，透過例如蛋白質A或G管柱純化。最終純化可按與純化例如CHO細胞中表現之抗體之方法類似的方法進行。真核宿主細胞

除原核生物以外，真核微生物，諸如絲狀真菌或酵母亦為編碼本發明之免疫結合物之載體的適合選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)係常用的低級真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach及Nurse, Nature, 290: 140 (1981)；1985年5月2日公開之EP 139,383)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國專利第4,943,529號；Fleer等人,Bio / Technology, 9: 968-75 (1991))，諸如乳酸克魯維酵母(K . lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574；Louvencourt等人,J . Bacteriol ., 154(2):737-742 (1983))、脆壁克魯維酵母(K . fragilis)((ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K . bulgaricus) (ATCC 16,045)、威克克魯維酵母(K . wickeramii) (ATCC 24,178)、瓦提克魯維酵母(K . waltii) (ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K . drosophilarum) (ATCC 36,906；Van den Berg等人,Bio / Technology, 8:135 (1990))、耐溫克魯維酵母(K . thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母(K . marxianus)；耶氏酵母屬(yarrowia) (EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183,070；Sreekrishna等人, J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988))；念珠菌屬(Candida)；里氏木黴(Trichoderma reesia) (EP 244,234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa) (Case等人,Proc Natl Acad Sci USA76:5259-5263 (1979))；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis) (1990年10月31日公開之EP 394,538)；及絲狀真菌，諸如e.g., 脈孢菌屬(Neurospora)、青黴菌屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium) (1991年1月10日公開之WO 91/00357)及麴黴屬(Aspergillus)宿主，諸如構巢麴黴(A . nidulans) (Ballance等人, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983)；Tilburn等人, Gene, 26:205-221 (1983)；Yelton等人,Proc Natl Acad Sci USA81: 1470-1474 (1984))及黑麴黴(A. niger) (Kelly及Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985))。甲基營養型酵母在本文中係適合的且包括(但不限於)選自由漢森酵母屬(Hansenula)、念珠菌屬、克勒克酵母屬(Kloeckera)、畢赤酵母屬、酵母菌屬、球擬酵母屬(Torulopsis)及紅酵母屬(Rhodotorula)組成之屬的能夠在甲醇上生長之酵母。作為此類別酵母菌之示例的特定物種之清單可見於C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)中。

用於表現本發明之醣基化免疫結合物的適合宿主細胞來源於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括昆蟲細胞，諸如果蠅S2及夜蛾Sf9；以及植物細胞，諸如棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及菸草之細胞培養物。已鑑別出多種桿狀病毒株及變異株以及來自諸如以下之宿主的相應容許之昆蟲宿主細胞：草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori)。用於轉染之多種病毒株係公開可得的，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)NPV之L-1變異株及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且根據本發明，此類病毒可用作本文中之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。

然而，脊椎動物細胞最受關注，且在培養物(組織培養物)中之繁殖脊椎動物細胞已成為常規程序。有用的哺乳動物宿主細胞株之實例係經SV40轉形之猴腎CV1細胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(經次選殖以在懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人, J. Gen Virol. 36:59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO；Urlaub等人,Proc . Natl . Acad . Sci . USA77:4216 (1980))；小鼠塞特利氏細胞(TM4，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人, Annals N. Y.Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤細胞株(Hep G2)。

宿主細胞經以上描述之表現或選殖載體轉形以便產生本發明之免疫結合物，且在習知營養培養基中培養，該營養培養基在適當時經改良以誘導啟動子、選擇轉形體或擴增編碼所需序列之基因。可複製載體之選擇及使用

為重組產生本發明之放射性同位素遞送平台，將編碼該遞送平台之核酸(例如cDNA或基因體DNA)分離且插入可複製載體中用於進一步選殖(DNA擴增)或表現。編碼免疫結合物之DNA可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)容易地分離且定序。許多載體係可用的。載體之選擇部分地取決於所使用之宿主細胞。通常，適合的宿主細胞為原核或真核(通常哺乳動物)來源的。

載體可例如呈質體、黏質體、病毒粒子或噬菌體形式。適當核酸序列可藉由多種程序插入載體中。一般而言，DNA係使用此項技術中已知之技術插入適當限制性內切核酸酶位點中。載體組分一般包括(但不限於)以下中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。含有此等組分中一或多者之適合載體的構築採用熟習此項技術者已知之標準連接技術。

本發明之免疫結合物不僅可直接以重組方式產生，而且亦可以與異源多肽之融合多肽形式產生，該異源多肽係信號序列或在成熟蛋白或多肽之N末端處具有特定裂解位點之其他多肽。一般而言，信號序列可為載體之組分，或其可為插入載體中的編碼本發明之免疫結合物之DNA的一部分。信號序列可為選自例如鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定性腸毒素II前導序列之群的原核信號序列。對於酵母分泌，信號序列可為例如酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列(包括酵母菌屬及克魯維酵母α因子前導序列，後者描述於美國專利第5,010,182號中)或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌(C . albicans)澱粉酶前導序列(1990年4月4日公開之EP 362,179)或1990年11月15日公開之WO 90/13646中所描述之信號。在哺乳動物細胞表現中，哺乳動物信號序列可用於引導蛋白質之分泌，諸如來自相同或相關物種之分泌多肽的信號序列，以及病毒分泌前導序列。培養產生放射性同位素遞送平台之宿主細胞

用於產生本發明之免疫結合物的宿主細胞可在多種培養基及培養條件中培養。原核宿主細胞培養

用於產生本發明之多肽的原核細胞在此項技術中已知且適於培養所選宿主細胞的培養基中生長。適合培養基之實例包括魯利亞培養液(Luria broth；LB)與必需的營養補充劑。在一些實施例中，培養基亦含有基於構築表現載體選擇之選擇劑，以選擇性允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將安比西林(ampicillin)添加至培養基中以供表現安比西林抗性基因之細胞生長。

除碳、氮及無機磷酸鹽源以外，亦可包括適當濃度的任何必需補充劑，該等補充劑係單獨引入或以與諸如複合氮源之另一補充劑或培養基之混合物形式引入。視情況，培養基可含有一或多種選自由以下組成之群之還原劑：麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇。

原核宿主細胞係在適合溫度下培養。對於大腸桿菌生長，例如，較佳溫度在約20℃至約39℃範圍內，更佳在約25℃至約37℃範圍內，甚至更佳為約30℃。培養基之pH可為在約5至約9範圍內之任何pH，此主要取決於宿主生物體。對於大腸桿菌，pH較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約7.0。

若本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適於活化啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一個態樣中，使用PhoA啟動子控制多肽之轉錄。因此，經轉形之宿主細胞在用於誘導的磷酸鹽限制性培養基中培養。在一些實施例中，磷酸鹽限制性培養基係C.R.A.P培養基(參見例如Simmons等人,J. Immunol. Methods(2002), 263: 133-47)。根據所採用之載體構築體，可使用多種其他誘導劑，此係此項技術中所知的。

在一個實施例中，所表現的本發明之多肽係分泌至宿主細胞之周質中且自宿主細胞之周質中回收。蛋白質回收通常涉及破壞微生物，一般藉由諸如滲壓衝擊、音波處理或溶解之方式進行破壞。在細胞破壞後，可藉由離心或過濾來移除細胞碎片或全細胞。蛋白質可進一步純化，例如藉由親和樹脂層析純化。或者，可將蛋白質轉運至培養基中且自其中分離。可自培養物移除細胞，且過濾並且濃縮培養物上清液以進一步純化所產生之蛋白質。經表現之多肽可使用通常已知的方法，諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點分析法(Western blot assay)進一步分離及鑑別。

在本發明之一個態樣中，藉由醱酵方法產生大量免疫結合物。可使用各種大規模分批饋料醱酵程序來產生重組蛋白。大規模醱酵具有至少1000公升容量，較佳約1,000至100,000公升容量。此等醱酵器使用攪拌器葉輪來分配氧氣及營養物，尤其是葡萄糖(一種較佳的碳/能量源)。小規模醱酵一般係指在體積容量不超過約100公升且可在約1公升至約100公升範圍內的醱酵罐中進行之醱酵。

在醱酵過程中，通常在細胞已在適合條件下生長至所需密度(例如約180-220之OD550)之後開始誘導蛋白質表現，在此階段，細胞處於早期固定相。根據所採用之載體構築體，可使用多種誘導劑，如此項技術中所知及上文所描述。細胞在誘導之前可生長較短的時段。細胞通常誘導約12至50小時，但可使用更長或更短的誘導時間。

為了提高本發明多肽之產量及品質，可改變各種醱酵條件。舉例而言，為了改良所分泌之免疫結合物多肽之正確組裝及摺疊，可使用過度表現伴護蛋白，諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及或DsbG)或FkpA (具有伴護蛋白活性之肽基脯胺醯基順,反-異構酶)之其他載體對宿主原核細胞進行共轉形。經證實，伴護蛋白可促進細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白的正確摺疊及溶解性。Chen等人(1999)J Bio Chem274: 19601-5；美國專利第6,083,715號；美國專利第6,027,888號；Bothmann及Pluckthun (2000)J. Biol. Chem. 275:17100-5；Ramm及Pluckthun (2000)J. Biol. Chem. 275:17106-13；Arie等人(2001)Mol. Microbiol. 39:199-210。

為了使所表現之異源蛋白(尤其是對蛋白水解敏感之異源蛋白)的蛋白水解減到最少，本發明可使用缺乏蛋白水解酶之某些宿主菌株。舉例而言，宿主細胞株可經修飾以在編碼已知細菌蛋白酶(諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)之基因中實現基因突變。一些缺乏大腸桿菌蛋白酶之菌株係可獲得的且描述於例如Joly等人(1998)，同上文；美國專利第5,264,365號；美國專利第5,508,192號；Hara等人,Microbial Drug Resistance, 2 :63-72 (1996)。

在一個實施例中，缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或多種伴護蛋白之質體轉形的大腸桿菌菌株被用作本發明之表現系統中的宿主細胞。真核宿主細胞培養物

市售培養基，諸如哈姆氏F10 (Ham's F10) (Sigma)、最低必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及杜貝克氏改良型伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM，Sigma)適合培養宿主細胞。另外，可使用以下中所描述之培養基中的任一種作為宿主細胞之培養基：Ham等人,Meth . Enz. 58:44 (1979)；Barnes等人,Anal . Biochem.102:255 (1980)；美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國再審專利第30,985號。此等培養基中的任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN™藥物)、痕量元素(定義為通常以微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可包括熟習此項技術者已知之適合濃度的任何其他必要之補充劑。培養條件，諸如溫度、pH及類似條件係先前用於經選擇用於表現之宿主細胞的培養條件，且對於一般熟習此項技術者將為顯而易見的。本發明之免疫球蛋白源性結構之純化

本發明之免疫結合物的形式可自培養基或自宿主細胞溶解產物回收。若為膜結合的，則可使用適合之清潔劑溶液(例如Triton-X 100)或藉由酶裂解將其自膜中釋放。在表現本發明之免疫結合物時所採用的細胞可藉由各種物理或化學方式破壞，諸如冷凍-解凍循環、音波處理、機械破壞或細胞溶解劑。

可能需要自重組細胞蛋白質或多肽純化本發明之免疫結合物。以下程序係適合純化程序之示例：藉由在離子交換管柱上分級分離；乙醇沉澱；逆相HPLC；在二氧化矽或陽離子交換樹脂上進行之層析，諸如DEAE層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉澱；使用例如Sephadex G-75進行之凝膠過濾；用以移除諸如IgG之污染物的蛋白質A瓊脂糖管柱；及用以結合本發明之免疫結合物之經抗原決定基標記形式的金屬螯合管柱。可採用各種蛋白質純化方法，且此類方法係此項技術中已知的且描述於例如Deutscher,Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)中。所選純化步驟將取決於例如所使用之製造方法的性質及所產生的本發明之特定免疫結合物。

當使用重組技術時，免疫結合物可在細胞內、周質空間中產生或直接分泌至培養基中。若免疫結合物係在細胞內產生，則作為第一步驟，移除微粒碎片，即宿主細胞或溶解片段，例如藉由離心或超濾移除。Carter等人,Bio/Technology10: 163-7 (1992)描述一種用於分離分泌至大腸桿菌周質空間之抗體的程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下經約30分鐘將細胞糊解凍。可藉由離心來移除細胞碎片。在免疫結合物分泌至培養基中之情形下，通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自此等表現系統之上清液。在任何前述步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。

由細胞製備之免疫結合物組合物可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析進行純化，其中親和層析係較佳的純化技術。蛋白質A作為親和配體之適合性取決於免疫結合物中存在的任何免疫球蛋白Fc域之物種及同型。蛋白質A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人,J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。建議蛋白質G用於所有小鼠同型及人類γ3(Guss等人,EMBO J. 5: 15671575 (1986))。親和配體所連接之基質最常為瓊脂糖，但亦可利用其他基質。與瓊脂糖所能達到的流動速率及處理時間相比，機械穩定性基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允許較快的流動速率及較短的處理時間。在免疫結合物包含CH3結構域的情況下，Bakerbond ABX™樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)可用於純化。取決於待回收之免疫結合物，亦可利用其他蛋白質純化技術，諸如在離子交換管柱上進行之分級分離、乙醇沉澱、逆相HPLC、在二氧化矽上進行之層析、在肝素SEPHAROSE™上進行之層析、在陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)上進行之層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沉澱。

在任何初始純化步驟之後，可使用pH在約2.5-4.5之間的溶離緩衝液且一般在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)下，可使包含感興趣免疫結合物及污染物之混合物經歷低pH疏水相互作用層析。免疫結合物 ( 包括抗體藥物結合物 (ADC))

在本發明之另一態樣中，根據以上實施例中任一者或本文所描述的本發明之免疫結合物與異源部分或藥劑(諸如下文所描述且包括本文所描述之任何額外的外源材料)結合。

在一個實施例中，本發明提供包含本發明之抗體構築體與一或多種治療劑或放射性同位素結合的免疫結合物。

在一些實施例中，免疫結合物包含與放射性原子結合形成放射性結合物的本文所描述之抗體構築體。如本文所描述，多種放射性同位素可用於產生本發明之放射性結合物。

可使用多種雙官能蛋白質偶聯劑製備免疫結合物或抗體構築體之結合物，該等雙官能蛋白質偶聯劑係諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二亞胺酸二甲酯H)、活性酯(諸如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鹽衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,Science238: 1098 (1987)中所描述來製備。經碳-14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係將放射性核苷酸與抗體結合之說明性螯合劑(參見例如WO 1994/11026)。連接子可為有助於細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩性連接子、二甲基連接子或含二硫鍵之連接子(參見例如Chari等人,Cancer Res.52:127-131 (1992)；US 5,208,020)。

本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用交聯試劑製備之此等結合物，交聯試劑包括(但不限於) BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，以及SVSB (琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，該等交聯試劑為市售的(例如可獲自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.)。

一般熟習此項技術者應認識到，以上某些方法亦可用於製備放射性免疫結合物及靶向成像複合物(儘管本文僅提及免疫結合物或抗體構築體)，且此等製備方法亦包含在本發明內。使用螯合劑及 / 或連接子進行之免疫結合

用於將放射性同位素附連至免疫結合物或抗體構築體(亦即，用放射性同位素「標記」抗體)之方法係熟習此項技術者熟知的。某些此等方法描述於例如WO 2017/155937中。

雙官能螯合劑，諸如DOTA、DTPA及相關類似物適合於配位金屬離子，如發射α及發射β之放射性核種。舉例而言，此等螯合分子可藉由在抗體構築體上之胺(例如離胺酸殘基之官能基)與DOTA/DTPA上之羧酸酯之間形成新的醯胺鍵而連接至目標分子。在肽合成之情況下，連接子添加之表徵及純化可為用於放射性同位素結合之抗體平台或免疫結合物的總體合成之一部分。

對於一些實施例，產生免疫結合物之方法涉及Poty, S等人,Chem Commun. (Camb) 54: 2599 (2018)所描述之點擊化學步驟。

對於一些實施例，肽可經生物合成或可藉由化學胺基酸合成，使用適合胺基酸前驅體(涉及例如氟-19替代氫)來合成。在一些實施例中，放射性標記可併入肽中。在一些實施例中，放射性標記可連接至肽。IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem . Biophys . Res . Commun. 80: 49-57)可用於併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」 (Chatal, CRC Press 1989)詳細描述其他方法。本發明之免疫結合物的表徵

可藉由此項技術中已知之各種分析針對物理/化學特性及/或生物活性對本發明之免疫結合物進行鑑別、篩選或表徵。可藉由此項技術中已知之各種分析來表徵本發明之免疫結合物及抗體構築體的物理/化學特性及/或生物活性。本發明之免疫結合物可藉由一系列分析來表徵，包括(但不限於)多肽序列測定、胺基酸分析、非變性尺寸排阻高壓液相層析(HPLC)、質譜法、離子交換層析及番木瓜蛋白酶消化。抗原結合

可藉由此項技術中已知之方法，例如ELISA、西方墨點法等來測試本發明之免疫結合物的抗原結合活性。抗體之結合親和力可例如藉由Munson等人,Anal Biochem. 107: 220 (1980)中所描述之史卡查分析(Scatchard analysis)來測定。此外，可使用此項技術中已知之方法來定量本發明之免疫結合物的抗原結合能力，例如定量ELISA、定量西方墨點法、表面電漿子共振分析及/或史卡查分析。

在一個實施例中，使用以免疫結合物進行的經放射性標記之抗原ELISA來量測免疫結合物之K_D。根據另一實施例，藉由使用表面電漿子共振分析，使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000儀器(BIAcore, Inc.,Piscataway, N.J.)，例如在25℃及10個反應單位下使用固定抗原CM5晶片來量測K_D。

在另一態樣中，可使用結合競爭分析鑑別競爭結合至相同抗原或其抗原決定基之免疫結合物。在一些實施例中，此類競爭抗體與本發明之免疫結合物結合至相同抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基) (參見例如Harlow及Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual, 第14章(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))。

可使用熟習此項技術者已知之方法鑑別或定位抗原內本發明之免疫結合物所結合的抗原決定基及/或接觸殘基。用於定位抗體所結合之抗原決定基的詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology(第3版, Humana Press, Totowa, NJ)。本發明之醫藥組合物及調配物

一般熟習此項技術者應認識到，下文中之某些教示內容適用於本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物，但本文具體提及本發明之一種類型，且此等應用完整包含在本發明內。

在另一態樣中，本發明提供一種組合物，其包含本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物。本發明進一步提供醫藥組合物及調配物，其包含至少一種本發明之免疫結合物及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。在一些實施例中，醫藥調配物包含(1)本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物及(2)醫藥學上可接受之載劑。

免疫結合物或放射性免疫結合物係調配為任何適於遞送至目標細胞/組織的形式。藉由將具有所需純度之此等免疫結合物與一或多種視情況選用的醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑(Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A.編(1980))混合來製備呈凍乾調配物或水溶液形式的本發明之免疫結合物的醫藥調配物。醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及賦形劑在所用之劑量及濃度下一般對接受者無毒，且包括(但不限於)：無菌水；緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。

擬用於活體內投與之醫藥調配物一般為無菌的。此容易藉由經無菌過濾膜過濾來完成。

經凍乾之抗體調配物的實例描述於US 6,267,958中。水性抗體調配物包括US 6,171,586及WO 2006/044908中所描述之調配物，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。

本文中之醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX®，Baxter International, Inc.)。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種額外醣胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。

本文中之調配物亦可含有多於一種如所治療之特定適應症所需的活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之補充性活性的活性成分。此等活性成分宜以有效達成預定目的之量組合存在。

亦可將活性成分包覆於以下中：微膠囊，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)；或巨乳液。此類技術揭露於中Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A.編(1980)。

在一些實施例中，免疫結合物可調配為免疫脂質體。「脂質體」係由各種類型之脂質、磷脂及/或可用於將藥物遞送至哺乳動物之界面活性劑構成的小囊泡。脂質體之組分通常佈置為雙層形式，類似於生物膜之脂質佈置。含有免疫結合物之脂質體係藉由此項技術中已知之方法製備，諸如Epstein等人,Proc . Natl Acad . Sci . USA, 82: 3688 (1985)；Hwang等人,Proc . Natl Acad . Sci . USA, 77: 4030 (1980)；美國專利第4,485,045號及第4,544,545號；以及1997年10月23日公開之WO1997/38731中所描述之方法。特別有用的脂質體可藉由逆相蒸發法，用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。脂質體透過限定孔徑之過濾器擠出，以產生具有所需直徑之脂質體。脂質體內視情況包含化學治療劑(參見Gabizon等人,J. National Cancer Inst. 81: 1484 (1989))。具有延長之循環時間的脂質體揭露於美國專利第5,013,556號中。

可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透性基質，該等基質呈成形物品形式，例如呈膜或微膠囊形式。使用免疫結合物及放射性免疫結合物以及其組合物之方法

在一個態樣中，本發明提供一種治療有需要之患者之疾病、病症或病況的方法，該方法包含向有需要之個體投與醫藥學上有效量的本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物。對於一些其他實施例，該方法係用於抑制癌細胞或腫瘤之生長及/或殺死癌細胞或腫瘤。在另一態樣中，本發明提供本文所描述之免疫結合物用於製備及/或製造供治療個體之疾病、病症或病況(例如癌症)用之藥劑的用途。

本發明之醫藥組合物可以適於待治療(或預防)疾病之方式投與。投與的數量及頻率將由諸如患者之病況以及患者疾病之類型及嚴重程度之因素決定，但適當劑量可藉由臨床試驗測定。

在一個實施例中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物可用於結合患有與目標抗原表現及/或活性增加相關之病症的個體之目標抗原的方法中，該方法包含向該個體投與免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物以使得該個體之目標抗原得以結合。在一個實施例中，目標抗原係人類目標抗原，且個體係人類個體。本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物可投與人類以達到治療目的。此外，出於獸醫學目的或作為人類疾病之動物模型，可將本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物投與表現目標抗原之非人類哺乳動物，該免疫結合物或放射性免疫結合物(例如靈長類動物、豬、大鼠或小鼠)將與該目標抗原交叉反應。對於作為人類疾病之動物模型，此等動物模型可用於評估本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物之治療功效(例如測試投與之劑量及時程)。

本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物(及任何額外治療劑或佐劑)可以藉由任何適合的方式投與，包括腸胃外、皮下、腹膜內、肺內及鼻內投與，及在需要局部治療時，病灶內投與。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。另外，抗體宜藉由脈衝式輸注投與，特別是以遞減抗體劑量投與。部分取決於投藥係短期的抑或長期的，可藉由任何適合途徑，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射給予。

本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物將以符合良好醫學實務的方式調配、給予及投與。在此情形下，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床狀況、病症之病因、藥劑之遞送部位、投與方法、投與時程及醫學從業者已知之其他因素。可根據已知方法向人類患者投與本發明之免疫結合物，諸如靜脈內投與，例如以彈丸形式靜脈內投與，或藉由經一段時間連續輸注，藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、表面或吸入途徑投與。對於一些實施例，靜脈內或皮下投與本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物係較佳的。

為了預防或治療疾病，投與之劑量及模式將由醫師根據已知準則來選擇。本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物之適當劑量將取決於上文所定義的待治療之疾病類型、疾病的嚴重程度及過程、本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物係出於預防抑或治療目的投與、先前療法、患者之臨床病史及對本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物的反應，以及主治醫師之判斷。本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物宜一次性或經一系列治療向患者投與。較佳地，免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物係藉由靜脈內輸注或藉由皮下注射投與。取決於疾病之類型及嚴重程度，每公斤體重約1 μg至約50 mg (例如每劑約0.1-15 mg/kg)之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物可為向患者投與之初始候選劑量，無論例如藉由一或多次分開投藥抑或藉由連續輸注投與。給藥方案可包含投與約4 mg/kg之初始裝載劑量，隨後為約2 mg/kg之每週維持劑量的本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物。然而，其他劑量方案亦可為有用的。取決於上文所提及之因素，一種典型的日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高劑量之範圍內。對於經數天或更長時間重複投與，取決於病況，治療將持續直至出現對疾病症狀之所需抑制為止。此療法之進展可容易地藉由習知方法及分析且基於醫師或其他熟習此項技術者已知之準則監測。

劑量及投與時程可基於個體之疾病水平或耐受性進行選擇及調整，該疾病水平或耐受性可在治療過程期間監測。本發明之結合物可每天一次、每週一次、每週多次但少於每天一次、每月多次但少於每天一次、每月多次但少於每週一次、每月一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次或間歇地投與以減輕或緩解疾病症狀。投與可以任何所揭露之時間間隔繼續，直至腫瘤或所治療癌症的症狀好轉。投與可在實現症狀好轉或減輕之後繼續，其中該好轉或減輕因該繼續投與而延長。

對於一些實施例，免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物之有效量可以單次劑量提供。

本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物可與習知及/或新穎治療方法或療法組合使用或作為單藥療法分開使用。在一些實施例中，本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物可與一或多種輻射敏化劑一起使用。此等敏化劑包括可增加癌細胞對輻射療法之敏感性的任何藥劑。在其他實施例中，本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物可與能加強輻射療法之生物作用的新穎及/或習知藥劑組合使用。照射腫瘤可引起多種生物學後果，其可藉由將本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物與靶向相關途徑之藥劑組合來利用。在一些實施例中，此等藥劑可減少腫瘤血管生成，或抑制局部侵襲及癌轉移，或預防再增生，或增強免疫反應，或解除對細胞能量的調控，或減少種群，或改變腫瘤代謝，或增加腫瘤損傷，或減少DNA修復。在某些實施例中，與本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物組合使用的藥劑可包含DDR抑制劑，例如PARP、ATR、Chk1或DNA-PK；或生存信號傳導抑制劑，例如mTOR、PI3k、NF-kB；或抗缺氧劑，例如HIF-1-α、CAP或UPR；或代謝抑制劑，例如MCT1、MCT4抑制劑；或免疫治療劑，例如抗CTLA4、抗PD-1；或生長因子信號轉導抑制劑，例如EGFR或MAPK抑制劑；或抗侵襲劑，例如激酶抑制劑、趨化因子抑制劑或整合素抑制劑；或抗血管生成劑，例如VEGF抑制劑。

本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物可(i)抑制其所結合之細胞的生長或增殖；(ii)誘導其所結合之細胞的死亡；(iii)抑制其所結合之細胞的分層；(iv)抑制其所結合之細胞的轉移；或(v)抑制包含其所結合之細胞之腫瘤的血管形成。在此情形下，「抑制細胞生長或增殖」意謂使細胞之生長或增殖減少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，且包括誘導細胞死亡。

舉例而言，抑制腫瘤細胞生長之免疫結合物係引起腫瘤細胞(例如癌細胞)之可量測生長抑制的免疫結合物。在一個實施例中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物能夠抑制展示該免疫結合物或放射性免疫結合物所結合之抗原之癌細胞的生長。相較於適當對照，較佳的生長抑制性免疫結合物或放射性免疫結合物將表現抗原之腫瘤細胞生長抑制超過20%，較佳約20%至約50%，且甚至更佳超過50%(例如約50%至約100%)，該對照通常為未用所測試之免疫結合物或放射性免疫結合物處理之腫瘤細胞。

對於一些實施例，投與個體之大多數免疫結合物或放射性免疫結合物或組合物通常由未標記之免疫結合物組成，其中少數為經標記之放射性免疫結合物。經標記之放射性免疫結合物與未標記之免疫結合物的比率可使用已知方法調整。因此，根據本發明之某些態樣，免疫結合物/放射性免疫結合物可以至多100 mg之總蛋白質量來提供，諸如小於60 mg，或5 mg至45 mg，或在每公斤患者體重0.1 µg至1 mg之間的總蛋白質量，諸如每公斤患者體重1 µg至1 mg，或每公斤患者體重10 µg至1 mg，或每公斤患者體重100 µg至1 mg，或每公斤患者體重0.1 µg至100 µg，或每公斤患者體重0.1 µg至50 µg，或每公斤患者體重0.1 µg至10 µg，或每公斤患者體重0.1 µg至40 µg，或每公斤患者體重1 µg至40 µg，或每公斤患者體重0.1 mg至1.0 mg，諸如每公斤患者體重0.2 mg至每公斤患者體重0.6 mg。

在某些實施例中，免疫結合物/放射性免疫結合物可以約0.5 mg/kg至約30 mg/kg投與。在某些實施例中，免疫結合物/放射性免疫結合物之投與量可為約0.5 mg/kg至約1 mg/kg、約0.5 mg/kg至約2 mg/kg、約0.5 mg/kg至約5 mg/kg、約0.5 mg/kg至約10 mg/kg、約0.5 mg/kg至約3 mg/kg、約0.5 mg/kg至約4 mg/kg、約0.5 mg/kg至約5 mg/kg、約0.5 mg/kg至約10 mg/kg、約0.5 mg/kg至約20 mg/kg、約0.5 mg/kg至約30 mg/kg、約1 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約3 mg/kg、約1 mg/kg至約4 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約20 mg/kg、約1 mg/kg至約30 mg/kg、約2 mg/kg至約5 mg/kg、約2 mg/kg至約10 mg/kg、約2 mg/kg至約3 mg/kg、約2 mg/kg至約4 mg/kg、約2 mg/kg至約5 mg/kg、約2 mg/kg至約10 mg/kg、約2 mg/kg至約20 mg/kg、約2 mg/kg至約30 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約5 mg/kg至約3 mg/kg、約5 mg/kg至約4 mg/kg、約5 mg/kg至約5 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約5 mg/kg至約20 mg/kg、約5 mg/kg至約30 mg/kg、約10 mg/kg至約3 mg/kg、約10 mg/kg至約4 mg/kg、約10 mg/kg至約5 mg/kg、約10 mg/kg至約10 mg/kg、約10 mg/kg至約20 mg/kg、約10 mg/kg至約30 mg/kg、約3 mg/kg至約4 mg/kg、約3 mg/kg至約5 mg/kg、約3 mg/kg至約10 mg/kg、約3 mg/kg至約20 mg/kg、約3 mg/kg至約30 mg/kg、約4 mg/kg至約5 mg/kg、約4 mg/kg至約10 mg/kg、約4 mg/kg至約20 mg/kg、約4 mg/kg至約30 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約5 mg/kg至約20 mg/kg、約5 mg/kg至約30 mg/kg、約10 mg/kg至約20 mg/kg、約10 mg/kg至約30 mg/kg或約20 mg/kg至約30 mg/kg。在某些實施例中，免疫結合物/放射性免疫結合物之投與量可為約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約20 mg/kg或約30 mg/kg。在某些實施例中，免疫結合物/放射性免疫結合物之投與量可為至少約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg或約20 mg/kg。在某些實施例中，免疫結合物/放射性免疫結合物的投與量可為至多約1 mg/kg、約2 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約20 mg/kg或約30 mg/kg。

在一些實施例中，該方法包含投與有效量的包含²²⁵Ac之放射性免疫結合物，該有效量為0.01 mCi至0.1 mCi，或0.1 mCi至1.0 mCi，或1.0 mCi至2.0 mCi，或2.0 mCi至4.0 mCi。

在一些實施例中，該方法包含投與有效量的包含²²⁵Ac之放射性免疫結合物，該有效量為每公斤個體之體重0.1 µCi至2.0 µCi，或每公斤個體之體重0.1 µCi至1.0 µCi，或每公斤個體之體重1.0 µCi至3.0 µCi，或每公斤個體之體重3.0 µCi至10.0 µCi，或每公斤個體之體重10.0 µCi至20.0 µCi，或每公斤個體之體重10.0 µCi至30.0 µCi。

在某些實施例中，²²⁵Ac之有效量係約0.1微居里(microcurie)至約20微居里。在某些實施例中，²²⁵Ac之有效量係約0.1微居里至約0.2微居里、約0.1微居里至約0.5微居里、約0.1微居里至約1微居里、約0.1微居里至約2微居里、約0.1微居里至約3微居里、約0.1微居里至約4微居里、約0.1微居里至約5微居里、約0.1微居里至約10微居里、約0.1微居里至約20微居里、約0.2微居里至約0.5微居里、約0.2微居里至約1微居里、約0.2微居里至約2微居里、約0.2微居里至約3微居里、約0.2微居里至約4微居里、約0.2微居里至約5微居里、約0.2微居里至約10微居里、約0.2微居里至約20微居里、約0.5微居里至約1微居里、約0.5微居里至約2微居里、約0.5微居里至約3微居里、約0.5微居里至約4微居里、約0.5微居里至約5微居里、約0.5微居里至約10微居里、約0.5微居里至約20微居里、約1微居里至約2微居里、約1微居里至約3微居里、約1微居里至約4微居里、約1微居里至約5微居里、約1微居里至約10微居里、約1微居里至約20微居里、約2微居里至約3微居里、約2微居里至約4微居里、約2微居里至約5微居里、約2微居里至約10微居里、約2微居里至約20微居里、約3微居里至約4微居里、約3微居里至約5微居里、約3微居里至約10微居里、約3微居里至約20微居里、約4微居里至約5微居里、約4微居里至約10微居里、約4微居里至約20微居里、約5微居里至約10微居里、約5微居里至約20微居里或約10微居里至約20微居里。在某些實施例中，²²⁵Ac之有效量係約0.1微居里、約0.2微居里、約0.5微居里、約1微居里、約2微居里、約3微居里、約4微居里、約5微居里、約10微居里或約20微居里。在某些實施例中，²²⁵Ac之有效量係至少約0.1微居里、約0.2微居里、約0.5微居里、約1微居里、約2微居里、約3微居里、約4微居里、約5微居里或約10微居里。在某些實施例中，²²⁵Ac之有效量係至多約0.2微居里、約0.5微居里、約1微居里、約2微居里、約3微居里、約4微居里、約5微居里、約10微居里或約20微居里。根據放射性免疫結合物之放射性同位素係¹¹¹In之態樣，有效量低於例如15.0 mCi (亦即，其中投與個體之¹¹¹In的量遞送低於15.0 mCi之全身輻射劑量)。

根據放射性免疫結合物之放射性同位素係¹¹¹In之態樣，有效量低於15.0 mCi、低於14.0 mCi、低於13.0 mCi、低於12.0 mCi、低於11.0 mCi、低於10.0 mCi.、低於9.0 mCi、低於8.0 mCi、低於7.0 mCi、低於6.0 mCi、低於5.0 mCi、低於4.0 mCi、低於3.5 mCi、低於3.0 mCi、低於2.5 mCi、低於2.0 mCi、低於1.5 mCi、低於1.0 mCi、低於0.5 mCi、低於0.4 mCi、低於0.3 mCi、低於0.2 mCi或低於0.1 mCi。

根據放射性免疫結合物之放射性同位素為¹¹¹In之態樣，有效量係0.1 mCi至1.0 mCi、0.1 mCi至2.0 mCi、1.0 mCi至2.0 mCi、1.0 mCi至3.0 mCi、1.0 mCi至4.0 mCi、1.0 mCi至5.0 mCi、1.0 mCi至10.0 mCi、1.0 mCi至15.0 mCi、1.0 mCi至20.0 mCi、2.0 mCi至3.0 mCi、3.0 mCi至4.0 mCi、4.0 mCi至5.0 mCi、5.0 mCi至10.0 mCi、5.0 mCi至15.0 mCi、5.0 mCi至20.0 mCi、6.0 mCi至14.0 mCi、7.0 mCi至13.0 mCi、8.0 mCi至12.0 mCi、9.0 mCi至11.0 mCi或10.0 mCi至15.0 mCi。

根據放射性免疫結合物之放射性同位素係¹¹¹In之態樣，有效量係15.0 mCi、14.0 mCi、13.0 mCi、12.0 mCi、11.0 mCi、10.0 mCi、9.0 mCi、8.0 mCi、7.0 mCi、6.0 mCi、5.0 mCi、4.0 mCi、3.5 mCi、3.0 mCi、2.5 mCi、2.0 mCi、1.5 mCi、1.0 mCi、0.5 mCi、0.4 mCi、0.3 mCi、0.2 mCi或0.1 mCi。

根據放射性免疫結合物之放射性同位素係²²⁵Ac之態樣，有效量低於例如30.0 µCi/kg (亦即，其中投與該個體之²²⁵Ac的量遞送每公斤個體之體重低於30.0 µCi之輻射劑量)。

根據放射性免疫結合物之放射性同位素係²²⁵Ac之態樣，有效量低於30 µCi/kg、25 µCi/kg、20 µCi/kg、17.5 µCi/kg、15.0 µCi/kg、12.5 µCi/kg、10.0 µCi/kg、9 µCi/kg、8 µCi/kg、7 µCi/kg、6 µCi/kg、5 µCi/kg、4.5 µCi/kg、4.0 µCi/kg、3.5 µCi/kg、3.0 µCi/kg、2.5 µCi/kg、2.0 µCi/kg、1.5 µCi/kg、1.0 µCi/kg、0.9 µCi/kg、0.8 µCi/kg、0.7 µCi/kg、0.6 µCi/kg、0.5 µCi/kg、0.4 µCi/kg、0.3 µCi/kg、0.2 µCi/kg、0.1 µCi/kg或0.05 µCi/kg。

根據放射性免疫結合物之放射性同位素係²²⁵Ac之態樣，有效量係0.05 µCi/kg至0 .1 µCi/kg、0 .1 µCi/kg至0.2 µCi/kg、0.2 µCi/kg至0.3 µCi/kg、0.3 µCi/kg至0.4 µCi/kg、0.4 µCi/kg至0.5 µCi/kg、0.5 µCi/kg至0.6 µCi/kg、0.6 µCi/kg至0.7 µCi/kg、0.7 µCi/kg至0.8 µCi/kg、0.8 µCi/kg至0.9 µCi/kg、0.9 µCi/kg至1.0 µCi/kg、1.0 µCi/kg至1.5 µCi/kg、1.5 µCi/kg至2.0 µCi/kg、2.0 µCi/kg至2.5 µCi/kg、2.5 µCi/kg至3.0 µCi/kg、3.0 µCi/kg至3.5 µCi/kg、3.5 µCi/kg至4.0 µCi/kg、4.0 µCi/kg至4.5 µCi/kg或4.5 µCi/kg至5.0 µCi/kg。

根據放射性免疫結合物之放射性同位素係²²⁵Ac之態樣，有效量係0.05 µCi/kg、0.1 µCi/kg、0.2 µCi/kg、0.3 µCi/kg、0.4 µCi/kg、0.5 µCi/kg、0.6 µCi/kg、0.7 µCi/kg、0.8 µCi/kg、0.9 µCi/kg、1.0 µCi/kg、1.5 µCi/kg、2.0 µCi/kg、2.5 µCi/kg、3.0 µCi/kg、3.5 µCi/kg、4.0 µCi/kg或4.5 µCi/kg、5.0 µCi/kg、6.0 µCi/kg、7.0 µCi/kg、8.0 µCi/kg、9.0 µCi/kg、10.0 µCi/kg、12.5 µCi/kg、15.0 µCi/kg、17.5 µCi/kg、20.0 µCi/kg、25 µCi/kg或30 µCi/kg。

在放射性免疫結合物之放射性同位素係¹⁷⁷Lu的某些實施例中，有效量係每平方公尺體表面積0.1 µCi至100 mCi。

在放射性免疫結合物之放射性同位素係¹⁷⁷Lu的某些實施例中，有效量係每平方公尺體表面積1 mCi至100 mCi。在某些實施例中，有效量係每平方公尺約1至每平方公尺約100。在某些實施例中，有效量係每平方公尺約1至每平方公尺約5、每平方公尺約1至每平方公尺約10、每平方公尺約1至每平方公尺約15、每平方公尺約1至每平方公尺約20、每平方公尺約1至每平方公尺約25、每平方公尺約1至每平方公尺約75、每平方公尺約1至每平方公尺約100、每平方公尺約5至每平方公尺約10、每平方公尺約5至每平方公尺約15、每平方公尺約5至每平方公尺約20、每平方公尺約5至每平方公尺約25、每平方公尺約5至每平方公尺約75、每平方公尺約5至每平方公尺約100、每平方公尺約10至每平方公尺約15、每平方公尺約10至每平方公尺約20、每平方公尺約10至每平方公尺約25、每平方公尺約10至每平方公尺約75、每平方公尺約10至每平方公尺約100、每平方公尺約15至每平方公尺約20、每平方公尺約15至每平方公尺約25、每平方公尺約15至每平方公尺約75、每平方公尺約15至每平方公尺約100、每平方公尺約20至每平方公尺約25、每平方公尺約20至每平方公尺約75、每平方公尺約20至每平方公尺約100、每平方公尺約25至每平方公尺約75、每平方公尺約25至每平方公尺約100，或每平方公尺約75至每平方公尺約100。在某些實施例中，有效量係每平方公尺約1、每平方公尺約5、每平方公尺約10、每平方公尺約15、每平方公尺約20、每平方公尺約25、每平方公尺約75或每平方公尺約100。在某些實施例中，有效量係每平方公尺至少約1、每平方公尺約5、每平方公尺約10、每平方公尺約15、每平方公尺約20、每平方公尺約25或每平方公尺約75。在某些實施例中，有效量係每平方公尺至多約5、每平方公尺約10、每平方公尺約15、每平方公尺約20、每平方公尺約25、每平方公尺約75或每平方公尺約100。

根據本發明之某些態樣，本發明之放射性免疫結合物的製劑或其組合物(例如醫藥組合物)可包含放射性標記部分(放射性免疫結合物)及未標記部分(免疫結合物)，其中標記部分:未標記部分之比率可為約1: 1000至1: 1。

此外，該等醫藥組合物可以針對特定患者定製之單次劑量組合物形式提供，亦即，以患者特異性治療組合物形式提供，其中組合物中經標記及未標記之免疫結合物(為清楚起見，經標記之免疫結合物與本文中之放射性免疫結合物相同)的量可至少取決於患者的體重、身高、體表面積、年齡、性別及/或疾病狀態或健康狀況。因此，患者特異性治療組合物之總體積可提供於小瓶中，該小瓶經組態以在一個療程中完全投與患者，使得在投與後小瓶中幾乎沒有組合物殘留。

目前，取決於癌症之階段，癌症治療涉及以下療法中之一者或組合：手術移除癌組織、輻射療法及化學療法。使用本發明之放射性免疫結合物(可互換地，「放射性標記之免疫結合物」)的療法可尤其適合無法良好耐受化學療法之毒性及副作用的老年患者中及輻射療法之效用有限的轉移性疾病。對於一些實施例，使用本發明之放射性標記之免疫結合物的療法可用於使表現目標抗原之癌症在疾病最初診斷後或在復發期間好轉。

在一些實施例中，確定癌症是否適合於藉由本文所揭露之方法治療涉及偵測個體中或來自個體之樣品中目標抗原的存在。為測定癌症中目標抗原之表現，可使用各種偵測分析。在一個實施例中，目標抗原過度表現係藉由免疫組織化學(IHC)分析。石蠟包埋的來自腫瘤生物檢體之組織切片經歷IHC分析且符合目標抗原染色強度準則。或者或另外，可對經福馬林固定、石蠟包埋之腫瘤組織進行FISH分析，諸如INFORM® (由Ventana(AZ，U.S.A.)出售)或PATHVISION®(Vysis, IL, U.S.A.)，以確定腫瘤中目標抗原過度表現之程度(若存在)。

目標抗原過度表現或擴增可以使用活體內偵測分析來評估，例如藉由投與結合待偵測分子且用可偵測標記(例如放射性同位素或螢光標記)標記之分子(諸如本發明之抗體構築體或免疫結合物)且在外部掃描患者以定位標記。 使用本發明之免疫結合物及放射性免疫結合物以殺死細胞

本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物可用於例如活體外、離體及活體內方法中。在一個態樣中，本發明提供用於在活體內或活體外抑制細胞生長或增殖之方法，該方法包含在允許本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物結合至目標抗原的條件下使細胞暴露於該免疫結合物或放射性免疫結合物。本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物亦可(i)抑制其所結合之細胞的生長或增殖；(ii)誘導其所結合之細胞的死亡；(iii)抑制其所結合之細胞的分層；(iv)抑制其所結合之細胞的轉移；或(v)抑制包含其所結合之細胞之腫瘤的血管形成。

在一個態樣中，本發明提供一種殺死表現抗原之細胞的方法，該方法包含使該細胞與本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物(或其組合物)接觸。此方法可用於例如殺死、耗盡或消除混合細胞群中表現目標抗原之細胞。此方法可用於例如殺死、耗盡或消除混合細胞群中表現目標抗原之細胞作為純化其他細胞之步驟。此方法可在活體外或活體內(包括離體)對初代患者細胞或組織組合物進行以製備此等組合物用於移植。

在一個態樣中，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物係用於治療或預防細胞增殖性病症。在某些實施例中，細胞增殖性病症包含實體腫瘤癌症。實體腫瘤癌症係包含異常組織塊之癌症，例如癌瘤及肉瘤。在某些其他實施例中，細胞增殖性病症包含液體腫瘤癌症或血液系統癌症(液體腫瘤癌症與血液系統癌症可互換使用)，諸如體液中存在之癌症，例如白血病及淋巴瘤。在某些實施例中，細胞增殖性病症與目標抗原之表現及/或活性增加相關。舉例而言，在某些實施例中，細胞增殖性病症與細胞表面上目標抗原之表現增加相關。在某些實施例中，細胞增殖性病症係腫瘤或癌症。在某些實施例中，細胞增殖性病症包含實體腫瘤癌症。實體腫瘤癌症係包含異常組織塊之癌症，例如癌瘤及肉瘤。在某些其他實施例中，細胞增殖性病症包含液體腫瘤癌症或血液系統癌症(液體腫瘤癌症與血液系統癌症可互換使用)，諸如體液中存在之癌症，例如白血病及淋巴瘤。

在一個態樣中，本發明提供治療細胞增殖性病症的方法，其包含向個體投與有效量的本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物。

除了直接殺死表現由本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物特異性結合之細胞表面抗原的目標細胞之外，本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物視情況亦可用於將額外運載物遞送至目標細胞附近或內部。遞送額外的外源性材料可用於例如細胞毒性、細胞生長抑制、資訊收集及/或診斷功能。本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物之非細胞毒性變異體，或視情況存在之毒性變異體可以用於將運載物遞送至表現目標抗原之細胞的內部及/或標記表現目標抗原之細胞的內部。運載物之非限制性實例包括細胞毒性劑、偵測促進劑及小分子化學治療劑。使用本發明之抗體構築體、免疫結合物、放射性免疫結合物及靶向成像複合物進行抗原偵測、活體內成像、診斷及預後

如本文所描述，在一些實施例中，本發明之抗體構築體、免疫結合物、放射性免疫結合物及靶向成像複合物具有各種非治療應用。在一些實施例中，本發明之組合物可用於鑑別預測會得益於特定治療方法或方式(諸如用本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物治療)的患者群體。在一些實施例中，本發明之組合物可用於對表現目標抗原之癌症進行分期(例如藉由放射成像)或作為疾病進展之預後指標。在一些實施例中，組合物亦可用於在活體外，例如在ELISA或西方墨點法中偵測及定量目標抗原決定基，以及對來自細胞或組織樣品之目標抗原進行純化或免疫沉澱。

對於一些實施例，將本發明之免疫結合物或放射性免疫結合物用於偵測抗原之存在或含量的方法中，諸如在生物樣品中活體外偵測或使用成像技術活體內偵測。免疫結合物及放射性免疫結合物偵測可經由習此相關技藝之人士已知且如本文所描述之不同技術來達成，例如IHC及PET成像。當使用本發明之免疫結合物或放射性標記之免疫結合物進行偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如99m-Tc或111-In。

本發明之經標記之免疫結合物可用作生物醫學及分子成像之各種方法及技術的成像生物標記物及探針，諸如：(i)磁共振成像(MRI)；(ii)電腦化斷層掃描(MicroCT)；(iii)單光子發射電腦斷層掃描(SPECT)；(iv)正電子發射斷層掃描(PET)，Chen等人,Bioconjugate Chem. 15: 41-9 (2004)；(v)生物發光；(vi)螢光；及(vii)超音波。免疫閃爍攝影術係一種成像程序，其中向動物或人類患者投與經放射性物質標記之抗體且拍攝抗體所處身體部位之照片(US 6528624)。成像生物標記物可以作為正常生物過程、致病過程或對治療干預之藥理學反應的指標進行客觀量測及評估。

本發明之另一態樣係一種確定疑似含有目標抗原之樣品中目標抗原之存在的方法，其中該方法包含使樣品暴露於結合至該目標抗原之免疫結合物及確定免疫結合物與樣品中目標抗原之結合，其中此類結合之存在指示樣品中存在目標抗原。視情況，樣品可含有疑似表現目標抗原之細胞(其可為癌細胞)。該方法中所用之免疫結合物可視情況經可偵測地標記、連接至固體支撐物或類似處理。

本發明之另一實施例係針對一種診斷個體體內腫瘤之存在的方法，其中該方法包含(a)使包含獲自哺乳動物之組織細胞的測試樣品與結合至目標抗原之免疫結合物接觸，及(b)偵測免疫結合物與測試樣品中之目標抗原之間複合物的形成，其中形成複合物指示哺乳動物中存在腫瘤。視情況，免疫結合物經可偵測地標記、連接至固體支撐物或其類似處理，及/或組織細胞之測試樣品係自疑似患有癌性腫瘤之個體獲得。

在一些實施例中，本發明之免疫結合物，包括包含前述及/或本文所提供之組合物，可用於偵測例如活體內或生物樣品中目標抗原之存在。本發明之免疫結合物可用於多種不同分析，包括(但不限於) ELISA、基於珠粒之免疫分析及質譜法。

在一些實施例中，本發明之免疫結合物可用於定量樣品中之目標抗原量。在一些實施例中，生物樣品係生物流體，諸如全血或全血組分，包括紅血球、白血球、血小板、血清及血漿；腹水、玻璃體液、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰、淚液、汗液、黏液、腦脊髓液、尿液及可含有感興趣目標抗原之其他身體成分。在各種實施例中，樣品係來自任何動物之身體樣品。在一些實施例中，樣品係來自哺乳動物。在一些實施例中，樣品係來自人類個體。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品係生檢材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之生檢材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品係初代細胞培養材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之初代細胞培養材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者或用一或多種結合相同目標抗原之治療抗體治療的患者。

在一些實施例中，樣品係來自哺乳動物。在一些實施例中，樣品係來自人類個體，例如當在臨床樣品中量測抗原表現時。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者或經療法/治療劑(例如靶向相同目標抗原之抗體療法)治療之患者。在一些實施例中，生物樣品係血清或血漿。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品係生檢材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之生檢材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品係初代細胞培養材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之初代細胞培養材料。

在一些實施例中，提供包含「經標記」之免疫結合物的組合物。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)，以及間接偵測(例如透過酶反應或分子相互作用)之部分(諸如酶或配體)。例示性標記包括(但不限於)螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯基(dansyl)；傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶；螢光素；2,3-二氫呔𠯤二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；J3-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫來氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶聯；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基，及其類似標記。

習知方法可用於使此等標記與蛋白質或多肽共價結合。舉例而言，可使用偶聯劑，諸如二醛、碳化二亞胺、二順丁烯二醯亞胺、雙醯亞胺酯、雙重氮化聯苯胺及其類似物，用以上描述之螢光標記、化學發光標記及酶標記來對本發明之免疫結合物或抗體構築體加標籤(參見例如US 3,645,090 (酶)；US 3,940,475 (螢光測定法)；Hunter等人,Nature, 144:945 (1962)；David等人,Biochemistry, 13:1014-1021 (1974)；Pain等人,J. Immunol. Methods, 40:219-230 (1981)；Nygren, J.Histochem and Cytochem, 30:407-412 (1982)。

此類標記(包括酶)與免疫結合物或抗體構築體之結合係一般熟習免疫分析技術者之標準操作程序(參見例如O'Sullivan等人, 「Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay」,Methods in Enzymology, J. Langone及H. Van Vunakis編, 第73卷(Academic Press, New York, New York, 1981), 第147-166頁)。亦可使用適合的市售經標記抗體。

在添加最後的經標記之免疫結合物後，藉由洗滌移除過量的未結合之經標記免疫結合物，且接著使用適於該標記之偵測方法量測所連接之標記的量，且將所量測之量與生物樣品中感興趣免疫結合物之量相關聯來測定所結合之免疫結合物的量。舉例而言，在酶之情況下，所顯現及量測之顏色量將為存在之感興趣免疫結合物之量的直接量度。特定言之，若HRP係標記，則可使用受質TMD，使用450 nm讀取波長及620或630 nm參考波長來偵測顏色。

在一個實例中，在自固定相洗滌針對未標記之免疫結合物的經酶標記之第二抗體之後，顯現顏色或化學發光且藉由將固定之捕捉試劑與酶受質一起培育來量測。接著，藉由與並行操作的感興趣免疫結合物所產生之顏色或化學發光相比較來計算感興趣抗體之濃度。

在一些實施例中，該方法涉及基於珠粒之免疫分析、ELISA分析或質譜技術。此等質譜儀之質量分析器包括(但不限於)四極桿(Q)、飛行時間(TOF)、離子阱、扇形磁場或傅立葉變換離子迴旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance，FT-ICR)或其組合。質譜儀之離子源應主要產生樣品分子離子或假分子離子，及某些可表徵之碎片離子。此等離子源之實例包括大氣壓游離源，例如電噴灑游離(ESI)及大氣壓化學游離(APCI)及基質輔助雷射脫附游離(MALDI)。ESI及MALDI係用於使蛋白質游離以進行小分子之質譜分析的兩種最常用方法，諸如藉由液相層析質譜法(LC/MS)進行(Lee, M.,LC / MS Applications in Drug Development(2002) J. Wiley & Sons, New York)。另一實例係表面增強雷射脫附游離(SELDI)。SELDI係一種基於表面之游離技術，其允許進行高通量質譜法。通常，使用SELDI分析蛋白質與其他生物分子之複雜混合物。SELDI採用化學反應性表面，諸如「蛋白質晶片」與溶液中之分析物(例如蛋白質)相互作用。此類表面選擇性與分析物相互作用且將分析物固定於表面上。因此，本發明之分析物可在晶片上部分純化且接著在質譜儀中快速分析。藉由在基質表面上之不同位點處提供多個反應性部分，可增加通量。

在另一態樣中，本發明提供一種用於偵測生物樣品中之抗原的方法，該方法包含：(a)使生物樣品與本文所描述之免疫結合物接觸以允許形成免疫複合物；(b)偵測或量測與樣品結合之免疫結合物的水平。在一些實施例中，將免疫結合物固定至固體支撐物。在一些實施例中，經固定之免疫結合物與生物素結合且與塗有鏈黴抗生物素蛋白之微量滴定盤結合。本發明之套組及製品

本發明之另一態樣係一種製品，其含有可用於治療、預防及/或診斷以表現目標抗原之細胞(例如癌細胞)為特徵之疾病及病症的材料。本發明之製品包含容器及在容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器容納有效治療、預防及/或診斷癌症病況之組合物且可具有無菌接取口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針可刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑係本發明之免疫結合物。標籤或藥品說明書指示該組合物係用於治療癌症。標籤或藥品說明書將進一步包含有關向癌症患者投與免疫結合物組合物之說明書。另外，製品可以進一步包含第二容器，該第二容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。該製品可進一步包括自商業及使用者觀點看合乎需要的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。

在另一態樣中，本發明提供一種套組，其包含本文所描述之任一免疫結合物及額外試劑或醫藥裝置。在一些其他實施例中，該套組包含本文所提供之組合物(例如醫藥組合物或診斷組合物)。本發明之另一態樣係一種套組，其可用於各種目的，例如殺死表現目標抗原之細胞；偵測表現目標抗原之細胞；細胞中目標抗原之定量、純化或免疫沉澱。

在一些實施例中，本發明之套組係一種用於特異性偵測生物樣品中之抗原的免疫分析套組，其包含：(a)本文所描述之免疫結合物及/或其組合物；及(b)有關偵測該免疫結合物之說明書。本發明之目標抗原偵測分析可以套組形式提供。在一些實施例中，此類套組包含本發明之免疫結合物，或包含前述之組合物，諸如本文所描述之組合物。該套組可進一步包含用於捕捉試劑之固體支撐物，其可作為獨立元件提供或捕捉試劑已固定至該固體支撐物。對於目標抗原之分離及純化，該套組可含有與珠粒(例如瓊脂糖珠粒)偶聯的本發明之免疫結合物。本發明提供之套組含有用於例如在ELISA或西方墨點法中活體外偵測及/或定量目標抗原的抗體。在一些實施例中，將捕捉試劑(例如本發明之免疫結合物)塗佈於固體材料上或連接至固體材料(例如珠粒、微量滴定盤或梳狀物)。可偵測抗體可為直接偵測之經標記抗體或藉由針對未標記抗體之經標記抗體偵測的未標記抗體，諸如例如在不同物種中產生的抗體。在標記係酶的情況下，該套組通常將包括酶所需之基質及輔因子；在標記係螢光團的情況下，將包括提供可偵測發色團之染料前驅體；且在標記係生物素的情況下，將包括抗生物素蛋白，諸如抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白或經MUG與HRP或β-半乳糖苷酶結合之鏈黴抗生物素蛋白。

如同本發明之製品一樣，本發明之套組包含容器及在容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。容器容納包含至少一種本發明之免疫結合物的組合物。可包括其他容器，其含有例如稀釋劑及緩衝劑、對照免疫結合物或抗體。標籤或藥品說明書可提供對組合物之描述以及有關預定活體外或偵測用途之說明書。該套組通常亦含有用於進行分析方法之添加劑，諸如穩定劑、洗滌及培育緩衝液，及其類似物。該套組之組分將以預定比率提供，其中各種試劑之相對量適當地變化以提供實質上使分析靈敏度達到最大的試劑溶液濃度。特定言之，試劑可以乾粉形式(通常為凍乾的)提供，包括賦形劑，其在溶解時將提供具有適當濃度的試劑溶液，以與待測試樣品組合。

本發明藉由以下包含前述結構及功能之免疫結合物的非限制性實例進一步說明，特定言之具有VHH多肽、分子量在60與110kDa之間且血清半衰期小於96小時的平台，在一些實施例中，相對於其他抗體片段平台，其在某些放射性標記過程所需的溫度期間展現出增強的穩定性，且在一些實施例中，與其他可能之遞送平台相比，由於放射分解，其展現出減小的靶向能力損失。某些定義

在本說明書中，闡述某些特定細節以便提供對各個實施例之透徹理解。然而，熟習此項技術者將理解，所提供之實施例可在無此等細節下實施。除非上下文另有要求，否則在本說明書及以下申請專利範圍中，詞語「包含(comprise)」及其變化形式(諸如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」應視為開放式的包容性含義，亦即，視為「包括(但不限於)」。除非內容另外明確規定，否則如在本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一個(種)(a)」、「一個(種)(an)」及「該(the)」包括複數個(種)指示物。亦應注意，除非內容明確指示，否則術語「或」一般採用其包括「及/或」之含義。另外，本文所提供之標題僅為方便起見，而不解釋所主張之實施例之範圍或含義。

除非另外指示，否則本發明之實施將採用在此項技術之技能範圍內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術。此類技術於文獻中有完整解釋，諸如「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第二版(Sambrook等人, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」 (M. J. Gait編, 1984)；「Animal Cell Culture」 (R. I. Freshney編, 1987)；「Methods in Enzymology」 (Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」 (F. M. Ausubel等人編, 1987及定期更新)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis等人編, 1994)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」 (Perbal Bernard V., 1988)；「Phage Display: A Laboratory Manual」 (Barbas等人, 2001)。熟習此項技術者應認識到與本文所描述之方法及材料類似或等效的許多方法及材料，其可用於本發明之實踐中。實際上，本發明決不限於所描述之方法及材料。出於本發明之目的，下文定義一些術語。

除非上下文另外明確地規定，否則如說明書及隨附申請專利範圍中所使用，術語「一個(種) (a)」、「一個(種) (an)」及「該(the)」包括單數及複數個(種)提及物。

在本說明書通篇，術語「包括」用於意謂「包括(但不限於)」。「包括」與「包括(但不限於)」可互換使用。

如本文所使用，術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉的各別值之常見誤差範圍。本文中提到的「約」一值或參數包括(且描述)關於該值或參數本身之實施例。當在例如數值溫度、時間、量或濃度之數值名稱(包括範圍)之前使用時，術語「約」指示可能有± 10%、±5%或±1%之變化的近似值。

術語「胺基酸殘基」或「胺基酸」包括提及併入蛋白質、多肽及/或肽中之胺基酸。術語「多肽」包括胺基酸或胺基酸殘基之任何聚合物。術語「多肽序列」係指在物理上構成多肽之一系列胺基酸或胺基酸殘基。「蛋白質」係包含一或多個多肽或多肽「鏈」之大分子。「肽」係大小為2至20個胺基酸殘基之小型多肽。術語「胺基酸序列」係指取決於長度而在物理上構成肽或多肽的一系列胺基酸或胺基酸殘基。除非另外指示，否則本文所揭露之多肽及蛋白質序列係自左至右書寫，表示其自胺基末端至羧基末端之次序。

術語「胺基酸」、「胺基酸殘基」、「胺基酸序列」或多肽序列包括天然存在之胺基酸(包括L及D立體異構物(isosteriomer))，且除非另外限制，否則亦包括可以與常見天然胺基酸類似之方式起作用的天然胺基酸之已知類似物，諸如硒代半胱胺酸、吡咯離胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、γ-羧基麩胺酸、羥基脯胺酸羥丁離胺酸(hydroxyprolinehypusine)、焦麩胺酸及硒代甲硫胺酸(參見例如Ho J等人,ACS Synth Biol5: 163-71 (2016)；Wang Y, Tsao M,Chembiochem17: 2234-9 (2016))。

如本文所使用，術語「放射性同位素」包括(但不限於)發射α之同位素(alpha emitting isotope)(可互換地稱為發射α之同位素(α-emitting isotope))、發射β之同位素(beta-emitting isotope)(可互換地稱為發射β之同位素(β-emitting isotope))及/或發射γ之同位素(gamma-emitting isotope)(可互換地稱為發射γ之同位素(ɣ-emitting isotope))，諸如以下中之任一者：⁸⁶Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁸⁹Sr、¹⁵³Sm、²²⁵Ac、²¹³Bi、²¹³Po、²¹²Bi、²²³Ra、²²⁴Ra、²²⁷Th、¹⁴⁹Tb、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁹Zr、¹³⁷Cs、²¹²Pb及¹⁰³Pd。

如本文所使用，術語「放射性免疫結合物」係指這樣一種分子複合物，其包含(1)根據本發明之免疫結合物及(2)放射性同位素。在一較佳實施例中，放射性同位素係發射α之放射性同位素。在另一實施例中，放射性同位素係發射β之放射性同位素。在另一實施例中，放射性同位素係發射ɣ之同位素。在另一實施例中，本發明提供包含α-發射及β-發射放射性同位素之放射性免疫結合物。術語「放射性結合物」在本文中可與術語「放射性免疫結合物」互換使用。在一個實施例中，放射性同位素係與放射性免疫結合物之螯合劑締合。在一個實施例中，放射性同位素係與免疫結合物直接連接。

如本文所使用，術語「免疫結合物」係指這樣一種分子複合物，其包含至少一個來源於抗體之抗原結合區(例如可變區或互補決定區)，該抗原結合區進一步與諸如螯合劑或細胞毒性劑的至少一個非抗體來源之分子偶聯。非抗體來源之分子可例如結合至抗原結合區之一或多個離胺酸或半胱胺酸殘基或結合至與抗原結合區偶聯(藉由肽鍵或以其他方式偶聯)之恆定區。在一些實施例中，免疫結合物進一步包含螯合劑(chelating agent) (可互換地稱為「螯合劑(chelator)」)。在一個實施例中，免疫結合物包含直接或間接連接至細胞毒性劑或放射性同位素的本發明之抗體構築體。

本文所描述之免疫結合物及放射性免疫結合物包含抗原結合區。此等抗原結合區可來源於「抗體」。術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且包括單株抗體，且包括完整抗體及其功能性(抗原結合)抗體片段，包括抗原結合片段(Fab)片段、F(ab')₂片段、Fab'片段、Fv片段、重組IgG (rIgG)片段；單鏈抗體片段，包括單鏈可變片段(sFv或scFv)；及單域抗體(例如sdAb、sdFv、奈米抗體)片段。該術語涵蓋免疫球蛋白的經基因工程改造及/或以其他方式修飾之形式，諸如胞內抗體、肽體、嵌合抗體、完全人類抗體、人源化抗體以及異型結合抗體、多特異性(例如雙特異性)抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體、串聯雙scFv及串聯三scFv。除非另有說明，否則術語「抗體」應理解為涵蓋其功能性抗體片段。該術語亦涵蓋完整或全長抗體，包括任何種類或子類之抗體，包括IgG及其子類、IgM、IgE、IgA及IgD。抗體可包含人類IgG1恆定區。抗體可包含人類IgG4恆定區。

與「高變區」或「HVR」同義之術語「互補決定區」及「CDR」係此項技術中已知的，意思指抗體可變區內之非連續胺基酸序列，其賦予抗原特異性及/或結合親和力。一般而言，各重鏈可變區中存在三個CDR (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，且各輕鏈可變區中存在三個CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。「構架區」及「FR」係此項技術中已知的，意思指重鏈及輕鏈可變區的非CDR部分。一般而言，各全長重鏈可變區中存在四個FR (FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4)，且各全長輕鏈可變區中存在四個FR (FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4)。給定CDR或FR之精確胺基酸序列邊界可使用多種熟知方案中之任一者容易地確定，包括以下所描述之編號方案：Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人, (1997) JMB 273,927-948 (「Chothia」編號方案)；MacCallum等人，J. Mol . Biol. 262:732-745 (1996),「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,」J . Mol . Biol. 262, 732-745.(「Contact」編號方案)；Lefranc MP等人,「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」, Dev CompImmunol, 2003年1月;27(1):55-77 (「IMGT」編號方案)；Honegger A及Plückthun A,「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool」,J Mol Biol, 2001年6月8日;309(3):657-70, (「Aho」編號方案)；以及Whitelegg NR及Rees AR, 「WAM: an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB」,Protein Eng. 2000年12月;13(12):819-24 (「AbM」編號方案)。在某些實施例中，本文所描述之抗體的CDR可由選自Kabat、Chothia、IMGT、Aho、AbM或其組合之方法定義。

給定CDR或FR之邊界可取決於用於鑑別之方案而變化。舉例而言，Kabat方案係基於結構比對，而Chothia方案係基於結構資訊。Kabat與Chothia方案之編號均基於最常見之抗體區序列長度，其中在一些抗體中出現由插入字母(例如「30a」)表示之插入及缺失。兩種方案將某些插入及缺失(「indel」)置於不同位置，產生不同編號。Contact方案係基於對複雜晶體結構之分析，且在多個方面與Chothia編號方案類似。

術語「可變區」或「可變域」係指參與抗體與抗原之結合的抗體重鏈或輕鏈域。天然抗體之重鏈及輕鏈可變域(分別為V_H及V_L)一般具有類似結構，其中各域包含四個保守構架區(FR)及三個CDR(參見例如Kindt等人, KubyImmunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁(2007))。單一V_H或V_L域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體的V_H或V_L域分別篩選互補V_L或V_H域之文庫而分離(參見例如Portolano等人,J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人,Nature352:624-628 (1991))。

本文所描述之免疫結合物的抗原結合區可經人源化。關於免疫結合物之「人源化」係指全部或實質上全部CDR胺基酸殘基均來源於非人類CDR且全部或實質上全部FR胺基酸殘基均來源於人類FR的抗原結合區。人源化免疫結合物視情況可包括來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。

所提供之免疫結合物為人類免疫結合物。「人類免疫結合物」係具有一抗原結合區之免疫結合物，該抗原結合區之胺基酸序列對應於由人類或人類細胞或者利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列(包括人類抗體文庫)之非人類來源所產生的抗體之胺基酸序列。該術語不包括含非人類抗原結合區的非人類抗體之人源化形式，諸如全部或實質上全部CDR皆為非人類CDR之抗體。

如本文所使用，片語「抗原結合臂」係指單一多肽鏈，其包含「抗原結合區」、鉸鏈區及變異型恆定區。其他元素(例如螯合劑；成像金屬)可直接或透過本發明之組合物中的一或多個連接子連接至抗原結合臂。本發明之免疫結合物包含共價連接在一起的兩條抗原結合臂。在一個實施例中，抗原結合臂係透過鉸鏈區連接。在一個實施例中，抗原結合臂係透過免疫球蛋白重鏈恆定區連接。在一個實施例中，抗原結合臂係透過變異型恆定區連接。在一個實施例中，抗原結合臂係經由二硫鍵聯(例如經由鉸鏈區中之半胱胺酸殘基)連接。

如本文所使用，片語「抗原結合區」係指免疫結合物中負責特異性結合至抗原之區域，此區域的一或多個抗原結合域包含互補決定區、可變區及構架區，如一般熟習此項技術者所知，其可來源於抗體或其片段、在抗體或其片段上模型化或可以模仿抗體或其片段。在一個實施例中，抗原結合臂之「抗原結合區」含有一個或兩個抗原結合域。在一較佳實施例中，抗原結合臂之「抗原結合區」係由單一抗原結合域組成，該抗原結合域較佳為VHH多肽。在一較佳實施例中，免疫結合物之兩個抗原結合臂的抗原結合區獨立地由單一抗原結合域組成，該抗原結合域較佳為VHH多肽，該等VHH多肽相同或不同。

如本文所使用，術語「VHH多肽」涵蓋天然及合成組合物且係指構成此項技術中所知之VHH片段的多肽，亦即構成僅單域重鏈之可變域片段的多肽，或在結構及功能上類似VHH片段的多肽，因為此類結構在下文進一步描述且具有特異性結合抗原之能力(在下文描述)，且兩者均為此項技術中熟知的。在較佳實施例中，VHH多肽包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含三個重鏈CDR；在一個實施例中，VHH多肽來源於駱駝科；在另一實施例中，VHH多肽來源於文庫；VHH多肽以特異性及高親和力結合至抗原。在一較佳實施例中，VHH多肽係包含以下佈置之單一重鏈可變域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。VHH多肽可例如作為活體內(例如在駱駝科中)產生之僅重鏈抗體之抗原結合片段獲得。VHH多肽亦可自合成文庫，例如噬菌體展示文庫獲得。舉例而言，參見McMahon等人, Nature Structural & Molecular Biology | 第25卷|2018年3月| 289-296Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies；Moutel等人, eLife 2016;5:e16228 NaLi-H1:A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. De Genst E, Saerens D, Muyldermans S, Conrath K. Antibody repertoire development in camelids. Dev Comp Immunol. 2006;30(1-2):187-98. doi: 10.1016/j.dci.2005.06.010. PMID: 16051357. Vincke C, Gutiérrez C, Wernery U, Devoogdt N, Hassanzadeh-Ghassabeh G, Muyldermans S. Generation of single domain antibody fragments derived from camelids and generation of manifold constructs. Methods Mol Biol. 2012; 907:145-76. doi: 10.1007/978-1-61779-974-7_8. PMID: 22907350. Arbabi Ghahroudi M, Desmyter A, Wyns L, Hamers R, Muyldermans S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 1997年9月15日;414(3):521-6. doi: 10.1016/s0014-5793(97)01062-4. PMID: 9323027。

關於VHH人源化，參見例如Vincke C, Loris R, Saerens D, Martinez-Rodriguez S, Muyldermans S, Conrath K. General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold. J Biol Chem. 2009年1月30日;284(5):3273-84. doi: 10.1074/jbc.M806889200. Epub 2008年11月14日. PMID: 19010777。

有關VHH穩定性，參見例如Kunz P, Flock T, Soler N, Zaiss M, Vincke C, Sterckx Y, Kastelic D, Muyldermans S, Hoheisel JD. Exploiting sequence and stability information for directing nanobody stability engineering. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2017年9月;1861(9):2196-2205. doi: 10.1016/j.bbagen.2017.06.014. Epub 2017年6月20日. PMID: 28642127; PMCID: PMC5548252；Kunz P, Zinner K, Mücke N, Bartoschik T, Muyldermans S, Hoheisel JD. The structural basis of nanobody unfolding reversibility and thermoresistance. Sci Rep. 2018年5月21日;8(1):7934. doi: 10.1038/s41598-018-26338-z. PMID: 29784954; PMCID: PMC5962586。

「連接子」在本文中亦稱為「連接子序列」、「間隔子」、「繫栓序列」或其文法等效表述。本文中所提及之「連接子」連結兩個不同分子，其自身具有目標結合、催化活性，或天然表現且組裝為單獨多肽形式或包含相同多肽之單獨域。舉例而言，兩個不同結合部分或重鏈/輕鏈對或抗原結合區及免疫球蛋白重鏈恆定區。許多策略可用於將分子共價連接在一起。本文所描述之連接子可用於接合scFv分子中之輕鏈可變區及重鏈可變區；或可用於將scFv或其他抗原結合片段繫栓於抗體重鏈之N末端或C末端上。此等包括(但不限於)蛋白質或蛋白質域之N末端與C末端之間的多肽連接、經由二硫鍵之連接及經由化學交聯試劑之連接。在此實施例之一個態樣中，連接子係藉由重組技術或肽合成產生之肽鍵。

「結合」感興趣抗原或抗原決定基的抗體係以與非特異性相互作用明顯不同之足夠親和力結合抗原或抗原決定基的抗體。特異性結合可例如藉由測定分子之結合，與對照分子之結合相比較來量測，對照分子一般為結構類似且不具有結合活性的分子。

「特異性結合」係指抗體或免疫結合物能夠以足夠親和力結合抗原以使得該抗體可用作靶向該抗原之診斷劑及/或治療劑。在一些實施例中，經例如藉由放射免疫分析所量測，抗體與不相關蛋白質之結合程度比抗體與其抗原之結合低約10%。如本文所使用，「抗原特異性」抗體或免疫結合物係以足夠特異性及親和力特異性結合至抗原以用於靶向治療、靶向診斷或偵測來自個體之生物樣品中之抗原的方法中之抗體或免疫結合物。在一些實施例中，結合至其目標抗原之免疫結合物或抗體構築體或目標成像複合物或放射性免疫結合物的解離常數(K_D)係≤ 1 μM、＜ 100 nM、＜ 10 nM、＜ 1 nM、＜ 0.1 nM、＜ 0.01 nM或＜ 0.001 nM (例如10^-8M或更低，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。在一些實施例中，本發明之免疫結合物或抗體構築體或目標成像複合物或放射性免疫結合物結合至多種抗原，諸如在來自不同物種之同源物中保守的抗原決定基，諸如其中抗原決定基之胺基酸一致性在不同物種中不相同。

如本文所使用，術語「變異型恆定區」係指包含免疫球蛋白重鏈恆定區之一部分的多肽，該部分已自天然免疫球蛋白胺基酸序列，較佳在一個至數個胺基酸位置處修飾。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所描述。出於各種目的對Fc區之修飾係此項技術中熟知的。舉例而言，參見Kevin O. Saunders, Frontiers in Immunology, 2019年6月|第10卷| Article 1296, 題為「Conceptual Approaches to Modulating Antibody Effector Functions and Circulation Half-Life」。

相對於參考多肽序列之序列一致性百分比(%)係在比對序列且必要時引入空位以達到最大序列一致性百分比之後，且不將任何保守性取代視為序列一致性之部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可使用可用的電腦軟體，以多種方式實現。用於比對序列之適當參數能夠經測定，包括在所比較序列之全長內獲得最大比對所需之演算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech, Inc.編寫，且原始程式碼已隨使用者文件一起提交於美國版權局(U.S. Copyright Office, Washington D.C.,20559)，在其中其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可公開購自Genentech, Inc.(South San Francisco, California)或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX作業系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數係由ALIGN-2程式設定且不變化。

在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情況下，給定胺基酸序列A相對於、與或針對給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性% (其可替代性地表述為相對於、與或針對給定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性%的給定胺基酸序列A)係計算如下：100乘以分數X/Y，其中X係藉由序列比對程式ALIGN-2對A與B進行程式比對時評為一致匹配的胺基酸殘基之數目，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等的情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%不相等。除非另外具體陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值係如剛剛前段中所描述，使用ALIGN-2電腦程式獲得。

如本文所使用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、依託泊苷)、小紅莓、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素或其他插入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；以及本文中所描述之各種細胞毒性劑。

術語「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原或抗原決定基)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則如本文所使用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原或抗原決定基)成員之間之1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(K_D)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所描述之方法)來量測。用於量測結合親和力之特定說明性實施例描述於本文中。

術語「拮抗劑」係以最廣泛意義使用，且包括部分或完全阻斷、抑制或中和抗原之生物活性的任何分子。適合的拮抗劑分子特定地包括拮抗劑抗體或者其抗體片段或衍生物。

「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體係抑制或降低其所結合之抗原或包含該抗原之蛋白質複合物之生物活性的抗體。較佳的阻斷抗體或拮抗劑抗體實質上或完全抑制抗原或包含該抗原之蛋白質複合物的生物活性。

如本文所使用，術語「腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增生(無論惡性抑或良性)，以及所有癌前及癌細胞及組織。

術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物的通常以不受調控之細胞生長為特徵的生理狀況。「腫瘤」包含一或多個癌細胞。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性腫瘤。更特定言之，此類癌症之實例包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、皮膚癌、黑色素瘤、包括小細胞肺癌及非小細胞肺癌(「NSCLC」)在內之肺癌、肺腺癌及肺鱗癌、腹膜癌症、肝細胞癌、包括胃腸癌在內之胃或胃部癌、胰臟癌(例如胰管腺癌)、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌(例如高級別漿液性卵巢癌)、肝癌(例如肝細胞癌(HCC))、膀胱癌(例如尿道上皮膀胱癌)、睪丸(生殖細胞腫瘤)癌症、肝細胞瘤、乳癌、腦癌(例如星形細胞瘤)、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎臟或腎癌(例如腎細胞癌、腎母細胞瘤或威爾姆斯氏瘤(Wilms' tumor))、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌以及頭頸癌。癌症之額外實例包括(但不限於)視網膜母細胞瘤、卵泡膜細胞瘤、男性細胞瘤、肝細胞瘤、包括非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma，NHL)在內之血液系統惡性疾病、多發性骨髓瘤及急性血液系統惡性疾病、子宮內膜或子宮癌、子宮內膜異位、纖維肉瘤、絨毛膜癌、唾液腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、食道癌瘤、肝臟癌瘤、肛門癌、陰莖癌、鼻咽癌、喉部癌瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、黑色素瘤、皮膚癌瘤、神經鞘瘤、少突神經膠質瘤、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、成骨性肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌瘤、多形性星形細胞瘤、基底細胞癌(基底細胞上皮瘤)、膽管癌、小細胞膀胱癌、轉移性乳癌、轉移性結腸直腸癌、上皮卵巢癌、輸卵管癌、胃腺癌、多形性膠質母細胞瘤(GBM)、復發性多形性膠質母細胞瘤(GBM)、神經膠質瘤、神經膠質肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、復發性頭頸癌鱗狀細胞癌、惡性胸膜間皮瘤頭頸癌、何傑金氏淋巴瘤、轉移性腎細胞癌、轉移性腎透明細胞癌、鱗狀非小細胞肺癌、肺鱗癌、復發性或難治性小細胞肺癌、耐治性黑色素瘤、轉移性黑色素瘤、梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)、神經內分泌癌、大細胞神經內分泌癌、神經內分泌腫瘤(NETS)、卵巢癌、乳頭狀癌、腹膜癌、神經內分泌前列腺癌、激素難治性前列腺癌、去勢抵抗性前列腺癌、軟組織肉瘤及鱗狀細胞癌。

術語「轉移癌」意謂一種癌症狀態，其中原發組織之癌細胞藉由血管或淋巴管自原始部位轉移至體內一或多個其他部位，在除原發組織以外的一或多個器官中形成一或多個繼發性腫瘤。一個主要的實例係轉移性乳癌。

術語「細胞增殖性病症」及「增殖性病症」係指與某種程度的異常細胞增殖相關之病症。在一個實施例中，細胞增殖性病症係癌症。

關於所主張之本發明，術語「締合的(associated)」、「締合(associating)」、「連接的(linked)」或「連接(linking)」係指接合、附接、連結或以其他方式偶聯形成單分子(或單分子複合物)的分子之兩種或更多種組分的狀態或藉由在兩個分子之間產生締合、連接、附接及/或任何其他連結方式使兩個分子彼此締合形成單分子(或單分子複合物)之操作。舉例而言，術語「連接」可指兩種或更多種組分藉由一或多種原子相互作用締合以使得形成單分子，且其中個別原子相互作用可為共價或非共價的。兩種組分之間的共價締合之非限制性實例包括肽鍵及半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵。兩種分子組分之間的非共價締合之非限制性實例包括離子鍵。

出於本發明之目的，術語「融合」係指兩種或更多種蛋白質組分藉由至少一個共價鍵(其為肽鍵)締合，無論肽鍵涉及參與羧酸基之一個碳原子抑或涉及另一碳原子，諸如α-碳、β-碳、γ-碳、σ-碳等。融合在一起之兩種蛋白質組分的非限制性實例包括例如經由肽鍵與多肽融合的胺基酸、肽或多肽，使得所得分子為單一連續多肽。出於本發明之目的，術語「融合」係指產生上文所描述之融合分子的操作，諸如由基因區域重組融合產生之融合蛋白，其在轉譯時產生單一蛋白質分子。

「雙特異性」抗體係指對至少兩個不同抗原決定基具有結合特異性的抗體，無論該複數個抗原決定基係在同一分子中及/或部分重疊。在一些實施例中，本發明之雙特異性免疫結合物結合至本文所描述之單一抗原的兩個不同抗原決定基。

如本文所使用，術語「表現的(expressed)」、「表現(expressing)」或「表現(expresses)」及其語法變化形式係指聚核苷酸或核酸轉譯成蛋白質。所表現之蛋白質可保留在細胞內，成為細胞表面膜之一種組分或分泌於細胞外空間中。

出於本發明之目的，當提及多肽或多肽區域時，片語「來源於」意謂該多肽或多肽區域包含最初在「親本」蛋白質中可見的高度相似之胺基酸序列且現相對於原始多肽或多肽區域可包含某些胺基酸殘基添加、缺失、截短、重排或其他改變，只要「親本」分子之某種功能(例如抗原結合親和力)及結構實質上得到保留。熟習此項技術者將能夠使用此項技術中已知之技術(例如蛋白質序列比對軟體)鑑別作為多肽或多肽區域(例如VHH多肽、CDR、HVR、V_H及/或V_L)來源之親本分子(例如抗體序列)。

如本文所使用，在至少一個細胞表面上表現細胞外目標生物分子或抗原之細胞係「目標陽性細胞」或「目標+細胞」，且為在物理上與指定細胞外目標生物分子偶聯之細胞。額外目標生物分子描述提供於下。一般熟習此項技術者根據使用情形將認識到，「目標生物分子」、「目標抗原分子」、「目標抗原」、「感興趣抗原」以及語法變化形式及等效物在本文中可互換使用，且包括抗體結合之分子決定子。本文所描述之免疫結合物可透過該免疫結合物之抗原結合區或抗原結合臂結合此等抗原。

關於分子之細胞毒性活性，術語「選擇性細胞毒性」係指生物分子目標陽性細胞群(例如目標細胞類型)與非目標旁觀者細胞群(例如生物分子目標陰性細胞類型)之間的相對細胞毒性水平，其可以表示為目標細胞類型之半數最大細胞毒性濃度(CD₅₀)與非目標細胞類型之CD₅₀的比率，由此提供細胞毒性選擇性之度量或相對於未目標細胞而優先殺死目標細胞的指示。

術語「醫藥調配物」或「醫藥組合物」係指呈允許其中所含活性成分之生物活性有效之形式且不含有對投與該調配物之個體具有不可接受毒性之額外組分的製劑。

「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外的對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

「經分離」抗體或免疫結合物或放射性免疫結合物係已與其天然環境或人工生產之組分分開的抗體或免疫結合物或放射性免疫結合物。在一些實施例中，抗體經純化至大於95%或99%之純度，純度係藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)測定。用於評估組合物中抗體純度之常規方法係習此相關技藝之人士已知的，參見例如Flatman等人,J. Chromatogr.B848:79-87 (2007)。特定言之，待純化除去的不想要組分(污染物)係會干擾抗體之所需用途(諸如治療用途)的該等組分，且其可尤其包括細菌因子、酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。

「經分離」核酸係指已與其天然環境之組分分開之核酸分子。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所包含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外位置或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指引入了外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉形體」及「轉形細胞」，其包括初代轉形細胞及由其得到的後代，不考慮繼代次數。後代在核酸含量方面可能與親本細胞不完全相同，但可能含有突變。本文包括具有與原始轉形細胞中篩選或選擇的相同功能或生物活性之突變型後代。

如本文所使用，關於免疫結合物或其組合物(例如放射性免疫結合物、醫藥組合物或診斷性組合物)，術語「投與」意謂經由適於遞送免疫結合物或其組合物之任何已知方法向個體之身體遞送免疫結合物或其組合物。具體投與模式包括(但不限於)靜脈內、經皮、皮下、腹膜內及鞘內投與。

藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必要劑量且持續必要時段有效實現所需治療或預防結果之量。

如本文所使用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床干預，且其可以出於預防目的或在臨床病理學過程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及減輕或改善預後。在一些實施例中，本發明之放射性免疫結合物被用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。

「治療有效量」至少為實現特定病症之可量測改善或預防所需之最小濃度。本文中之治療有效量可根據諸如以下因素而變化：患者之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及本發明之組合物在個體中引發所需反應之能力。治療有效量亦為治療有利作用超過本發明之組合物之任何有毒或有害作用的量。

如本文所使用，術語「預測」與「預後」係可互換的。自某種意義上看，用於預測或預後之方法係允許實施本發明之預測/預後方法的人選擇被認為(通常在治療之前，但不一定)更有可能對本發明之免疫結合物或上述組合物(例如醫藥組合物)治療起反應的患者。

術語「偵測」係以最廣泛的意義使用，包括目標抗原分子之定性與定量量測兩者。在一個態樣中，使用本文所描述之偵測方法僅僅鑑別生物樣品中感興趣抗原的存在。在另一態樣中，該方法用於測試樣品中感興趣抗原是否以可偵測水平存在。在又一態樣中，該方法可用於對樣品中感興趣抗原之量進行定量且進一步比較來自不同樣品之抗原含量。在另一態樣中，該方法可在活體內使用以測定目標細胞之位置，例如使用本發明之靶向成像複合物。

術語「生物樣品」係指可含有感興趣抗原之任何生物物質。樣品可為生物流體，諸如全血或全血組分，包括紅血球、白血球、血小板、血清及血漿；腹水、玻璃體液、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰、淚液、汗液、黏液、腦脊髓液及可能含有感興趣抗原之其他身體成分。在各種實施例中，樣品係來自任何動物之生物樣品。在一些實施例中，樣品係來自哺乳動物。在一些實施例中，樣品係來自人類個體。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品係生檢材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之生檢材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之血清。在一些實施例中，生物樣品係初代細胞培養材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者之初代細胞培養材料。在一些實施例中，生物樣品係來自臨床患者或者經本發明之組合物(例如放射性免疫結合物)治療或經不同治療劑(諸如靶向感興趣抗原之抗體-藥物結合物或β照射或小分子治療劑)治療的患者。

術語「藥品說明書」用於指通常包括在治療性產品之商業包裝中的說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告之資訊。

如本文所使用，術語「載體」係指這樣一種核酸分子，該核酸分子能夠繁殖其所連接之另一核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因體中的載體。某些載體能夠引導其可操作地連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。

如本文所使用，C₁-C_x包括C₁-C₂、C₁-C₃……C₁-C_x。僅舉例而言，表示為「C₁-C₆」之基團指示該部分中存在一至六個碳原子，亦即，含有1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子或4個碳原子之基團。因此，僅舉例而言，「C₁-C₄烷基」指示烷基中存在一至四個碳原子，亦即，該烷基係選自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基及三級丁基。

「烷基」係指脂族烴基。烷基係分支鏈或直鏈。在一些實施例中，「烷基」具有1至10個碳原子，亦即C₁-C₁₀烷基。每當出現在本文中時，諸如「1至10」之數值範圍係指給定範圍中的每個整數；例如，「1至10個碳原子」意謂烷基由1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子等至多並包括10個碳原子組成，但本定義亦涵蓋未指定數值範圍的術語「烷基」之存在。在一些實施例中，烷基係C₁-C₆烷基。在一個態樣中，烷基係甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。典型烷基包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、戊基、新戊基或己基。

「伸烷基」基團係指二價烷基。上述單價烷基中之任一者均可為藉由自烷基去除第二個氫原子而形成的伸烷基。在一些實施例中，伸烷基係C₁-C₆伸烷基。在其他實施例中，伸烷基係C₁-C₄伸烷基。典型伸烷基包括(但不限於)-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂-及其類似基團。在一些實施例中，伸烷基係-CH₂-。

「烷氧基」基團係指(烷基)O-基團，其中烷基如本文中所定義。

術語「烷基胺」係指-N(烷基)_xH_y基團，其中x係0且y係2，或其中x係1且y係1，或其中x係2且y係0。

「羥烷基」係指一個氫原子經羥基置換之烷基。在一些實施例中，羥烷基係C₁-C₄羥烷基。典型羥烷基包括(但不限於)-CH₂OH、-CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₂OH、-CH₂CH₂CH₂CH₂OH及其類似基團。

「胺基烷基」係指一個氫原子經胺基置換之烷基。在一些實施例中，胺基烷基係C₁-C₄胺基烷基。典型胺基烷基包括(但不限於)-CH₂NH₂、-CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂及其類似基團。

術語「烯基」係指存在至少一個碳-碳雙鍵的一類烷基。在一個實施例中，烯基具有式-C(R)=CR₂，其中R係指烯基之其餘部分，其可以相同或不同。在一些實施例中，R係H或烷基。在一些實施例中，烯基係選自乙烯基(ethenyl) (亦即，乙烯基(vinyl))、丙烯基(亦即，烯丙基)、丁烯基、戊烯基、戊二烯基及其類似基團。烯基之非限制性實例包括-CH=CH₂、-C(CH₃)=CH₂、-CH=CHCH₃、-C(CH₃)=CHCH₃及-CH₂CH=CH₂。

術語「炔基」係指存在至少一個碳-碳參鍵的一類烷基。在一個實施例中，炔基具有式-C≡C-R，其中R係指炔基之其餘部分。在一些實施例中，R係H或烷基。在一些實施例中，炔基係選自乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基及其類似基團。炔基之非限制性實例包括-C≡CH、-C≡CCH₃、-C≡CCH₂CH₃、-CH₂C≡CH。

術語「雜烷基」係指烷基之一或多個骨架原子係選自除碳外之原子，例如氧、氮(例如-NH-、-N(烷基)-)、硫或其組合的烷基。雜烷基在雜烷基之碳原子處連接至分子之其餘部分。在一個態樣中，雜烷基係C₁-C₆雜烷基。

術語「芳族」係指具有含4n+2個π電子之非定域π電子系統的平面環，其中n係整數。術語「芳族基」包括碳環芳基(「芳基」，例如苯基)及雜環芳基(或「雜芳基」或「雜芳族基」)基團(例如吡啶)兩者。該術語包括單環或稠合環多環(亦即，共用相鄰碳原子對之環)基團。

術語「碳環基(carbocyclic)」或「碳環(carbocycle)」係指形成環主鏈之原子全為碳原子之環或環系統。因此，該術語將碳環與環主鏈含有至少一個非碳原子之「雜環的」環或「雜環」區分開。在一些實施例中，雙環碳環之兩個環中的至少一者係芳族環。在一些實施例中，雙環碳環之兩個環均為芳族環。碳環包括芳基及環烷基。

如本文所使用，術語「芳基」係指形成環之每個原子皆為碳原子之芳族環。在一個態樣中，芳基係苯基或萘基。在一些實施例中，芳基係苯基。在一些實施例中，芳基係苯基、萘基、二氫茚基、茚基或四氫萘基。在一些實施例中，芳基係C₆-C₁₀芳基。取決於結構，芳基係單價基團或二價基團(亦即，伸芳基)。

術語「環烷基」係指單環或多環脂族基、非芳族基團，其中形成環的各原子(亦即，骨架原子)均為碳原子。在一些實施例中，環烷基係螺環或橋接化合物。在一些實施例中，環烷基視情況與芳族環稠合，且連接點在非芳族環碳原子之碳處。環烷基包括具有3至10個環原子之基團。在一些實施例中，環烷基係選自環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環庚基、環辛基、螺[2.2]戊基、降𦯉基及雙環[1.1.1]戊基。在一些實施例中，環烷基係C₃-C₆環烷基。

術語「鹵基(halo)」，或替代地，「鹵素」或「鹵基(halide)」意謂氟、氯、溴或碘。在一些實施例中，鹵基係氟、氯或溴。

術語「氟烷基」係指一或多個氫原子經氟原子置換之烷基。在一個態樣中，氟烷基係C₁-C₆氟烷基。

術語「雜環(heterocycle)」或「雜環基(heterocyclic)」係指在環中含有一至四個雜原子之雜芳族環(亦稱為雜芳基)及雜環烷基環，其中環中各雜原子係選自O、S及N，其中各雜環基在其環系統中具有3至10個原子，且限制條件為任何環不含兩個相鄰O或S原子。非芳族雜環基(又稱為雜環烷基)包括在環系統中具有3至10個原子之環，且芳族雜環基包括在環系統中具有5至10個原子之環。雜環基團包括苯并稠合環系統。非芳族雜環基之實例為吡咯啶基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、㗁唑啶酮基、四氫哌喃基、二氫哌喃基、四氫硫代哌喃基、哌啶基、𠰌啉基、硫代𠰌啉基、硫氧雜環己烷基、哌𠯤基、氮雜環丙烷基、氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基、硫雜環丁烷基、高哌啶基、氧雜環庚烷基、硫雜環庚基、㗁氮呯基、二氮呯基、噻氮呯基(thiazepinyl)、1,2,3,6-四氫吡啶基、吡咯啉-2-基、吡咯啉-3-基、吲哚啉基、2H-哌喃基、4H-哌喃基、二㗁烷基、1,3-二氧雜環戊烷基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫㖦基、二氫哌喃基、二氫噻吩基、二氫呋喃基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、3-氮雜雙環[3.1.0]己基、3-氮雜雙環[4.1.0]庚基、3H-吲哚基、吲哚啉-2-酮基、異吲哚啉-1-酮基、異吲哚啉-1,3-二酮基、3,4-二氫異喹啉-1(2H)-酮基、3,4-二氫喹啉-2(1H)-酮基、異吲哚啉-1,3-二硫酮基、苯并[d]㗁唑-2(3H)-酮基、1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮基、苯并[d]噻唑-2(3H)-酮基及喹 基。芳族雜環基之實例為吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡𠯤基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異㗁唑基、噻唑基、㗁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、㖕啉基、吲唑基、吲哚𠯤基、呔𠯤基、嗒𠯤基、三𠯤基、異吲哚基、喋啶基、嘌呤基、㗁二唑基、噻二唑基、呋呫基、苯并呋呫基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并㗁唑基、喹唑啉基、喹喏啉基、㖠啶基及呋喃并吡啶基。在可能之情況下，前述基團係C-附接(或C-連接的)或N-附接的。舉例而言，衍生自吡咯之基團包括吡咯-1-基(N-附接)或吡咯-3-基(C-附接)兩者。另外，衍生自咪唑之基團包括咪唑-1-基或咪唑-3-基(兩者N-附接)或者咪唑-2-基、咪唑-4-基或咪唑-5-基(均為C-附接的)。雜環基團包括苯并稠合環系統。非芳族雜環視情況經一個或兩個側氧基(=O)部分取代，諸如吡咯啶-2-酮。在一些實施例中，雙環雜環之兩個環中的至少一者係芳族環。在一些實施例中，雙環雜環之兩個環均為芳族環。

術語「雜芳基」或替代地「雜芳族基」係指包括一或多個選自氮、氧及硫之環雜原子的芳基。雜芳基之說明性實例包括單環雜芳基及雙環雜芳基。單環雜芳基包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡𠯤基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異㗁唑基、噻唑基、㗁唑基、異噻唑基、吡咯基、嗒𠯤基、三𠯤基、㗁二唑基、噻二唑基及呋呫基。單環雜芳基包括吲 、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹 、喹啉、異喹啉、㖕啉、呔𠯤、喹唑啉、喹喏啉、1,8-㖠啶及喋啶。在一些實施例中，雜芳基在環中含有0-4個N原子。在一些實施例中，雜芳基在環中含有1-4個N原子。在一些實施例中，雜芳基在環中含有0-4個N原子、0-1個O原子及0-1個S原子。在一些實施例中，雜芳基在環中含有1-4個N原子、0-1個O原子及0-1個S原子。在一些實施例中，雜芳基係C₁-C₉雜芳基。在一些實施例中，單環雜芳基係C₁-C₅雜芳基。在一些實施例中，單環雜芳基係5員或6員雜芳基。在一些實施例中，雙環雜芳基係C₆-C₉雜芳基。

「雜環烷基」基團係指包括至少一個選自氮、氧及硫之雜原子的環烷基。在一些實施例中，雜環烷基與芳基或雜芳基稠合。在一些實施例中，雜環烷基係㗁唑啶酮基、吡咯啶基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫哌喃基、四氫硫代哌喃基、哌啶基、𠰌啉基、硫代𠰌啉基、哌𠯤基、哌啶-2-酮基、吡咯啶-2,5-二硫酮基、吡咯啶-2,5-二酮基、吡咯啶酮基、咪唑啶基、咪唑啶-2-酮基或噻唑啶-2-酮基。術語雜環烷基亦包括碳水化合物之所有環形式，包括(但不限於)單醣、雙醣及寡醣。在一個態樣中，雜環烷基係C₂-C₁₀雜環烷基。在另一態樣中，雜環烷基係C₄-C₁₀雜環烷基。在一些實施例中，雜環烷基在環中含有0-2個N原子。在一些實施例中，雜環烷基在環中含有0-2個N原子、0-2個O原子及0-1個S原子。

術語「鍵」或「單鍵」係指當藉由鍵接合之原子被視為較大子結構之一部分時，兩個原子或兩個部分之間的化學鍵。在一個態樣中，在本文所描述之基團為一鍵時，所提及之基團不存在，由此允許在其餘所鑑別基團之間形成一鍵。

術語「部分」係指分子之特定區段或官能基。化學部分係嵌入分子中或附接至分子的通常公認之化學實體。

術語「視情況經取代」或「經取代」意謂所提及基團視情況經一或多個額外基團取代，該一或多個額外基團個別且獨立地選自鹵素、-CN、-NH₂、-NH(烷基)、-N(烷基)₂、-OH、-CO₂H、-CO₂烷基、-C(=O)NH₂、-C(=O)NH(烷基)、-C(=O)N(烷基)₂、-S(=O)₂NH₂、-S(=O)₂NH(烷基)、-S(=O)₂N(烷基)₂、烷基、環烷基、氟烷基、雜烷基、烷氧基、氟烷氧基、雜環烷基、芳基、雜芳基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷基亞碸、芳基亞碸、烷基碸及芳基碸。在一些其他實施例中，視情況存在之取代基係獨立地選自：鹵素、-CN、-NH₂、-NH(CH₃)、-N(CH₃)₂、-OH、-CO₂H、-CO₂(C₁-C₄烷基)、-C(=O)NH₂、-C(=O)NH(C₁-C₄烷基)、-C(=O)N(C₁-C₄烷基)₂、-S(=O)₂NH₂、-S(=O)₂NH(C₁-C₄烷基)、-S(=O)₂N(C₁-C₄烷基)₂、C₁-C₄烷基、C₃-C₆環烷基、C₁-C₄氟烷基、C₁-C₄雜烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄氟烷氧基、-SC₁-C₄烷基、-S(=O)C₁-C₄氟烷基及-S(=O)₂C₁-C₄烷基。在一些實施例中，視情況存在之取代基獨立地選自鹵素、-CN、-NH₂、-OH、-NH(CH₃)、-N(CH₃)₂、-CH₃、-CH₂CH₃、-CF₃、-OCH₃及-OCF₃。在一些實施例中，經取代之基團經一個或兩個前述基團取代。在一些實施例中，脂族碳原子(非環狀或環狀)上視情況選用之取代基包括側氧基(=O)。實例

此等程序中使用之試劑係購自Macrocyclics、Millipore Sigma、CombiBlocks、Chem-Impex、LabNetwork、Ambeed、ArkPharm及Broadpharm。在一些部分中，此項技術已知之高級中間物係根據文獻製備。除非另外指示，否則所有溶劑均獲自VWR、Thermo Fisher及LabNetwork且按原樣使用。在氮氣氛圍下進行之反應使用無水溶劑。質譜係用具有C18逆相管柱及乙腈/水(+0.1%甲酸)梯度之Agilent 1260 Infinity HPLC-MS或Waters HPLC-MS取得。急驟層析係使用具有適當大小之正相矽膠濾筒的Biotage IsoleraOne儀器進行，且在254 nm處收集溶離份。最終化合物係藉由Agilent製備型HPLC (Agilent, Hanover, CT)，使用乙腈/水(+ 0.1% TFA或0.1% FA)梯度純化。NMR譜圖係用Bruker 400或600 MHz NMR儀器獲取且用MestReNova v.14處理。可用時，使用手動模式下之多重分析功能編譯詳細NMR資料。

本實驗中所用之縮寫包括 ( 但不限於 ) ： DCM - 亞甲基氯/二氯甲烷TFA - 三氟乙酸HATU - 六氟磷酸1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠3-氧化物HBTU - 六氟磷酸3-[雙(二甲基胺基)甲基鎓]-3H-苯并三唑-1-氧化物HOAt - 3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇EDC/EDCI/EDC.HCl - 3-{[(乙基亞胺基)亞甲基]胺基}-N,N-二甲基丙-1-胺DCC -N , N '-二環己基甲烷二亞胺ACN/MeCN - 乙腈EtOAc - 乙酸乙酯EtOH - 乙醇Et2O - (二乙基)醚DMF - N,N-二甲基甲醯胺DIPEA - N,N-二異丙基乙胺MeOH - 甲醇OTFP - 四氟苯酚(如四氟苯基酯中所使用)TBABr - 溴化四丁基銨實例 1. 中間物 A 之 合成 (S)-2- 胺基 -3-(4-( 苯甲氧基 ) 苯基 ) 丙酸甲酯鹽酸鹽之製備

在0℃下，向((S)-3-(4-(苯甲氧基)苯基)-2-((三級丁氧基羰基)胺基)丙酸(50.0 g，136 mmol)於甲醇(200 mL)中之溶液中添加亞硫醯氯(19.2 g，162 mmol)。使反應升溫至25℃並攪拌16小時，且在真空中濃縮至乾，得到呈白色固體狀之粗(S)-2-胺基-3-(4-(苯甲氧基)苯基)丙酸甲酯鹽酸鹽(43.0 g，100%產率)。此粗產物不經純化即直接用於下一步驟。m/z實驗值= 286.3 (M+H)。 (S)-3-(4-( 苯甲氧基 ) 苯基 )-2-((2- 甲氧基 -2- 側氧基乙基 ) 胺基 ) 丙酸甲酯之製備

向(S)-2-胺基-3-(4-(苯甲氧基)苯基)丙酸甲酯鹽酸鹽(43.0 g，134 mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(200 mL)中之溶液中添加2-溴代乙酸甲酯(45.0 g，294 mmol)及三乙胺(40.6 g，401 mmol)。在25℃下攪拌反應16小時且在真空中濃縮。使殘餘物在乙酸乙酯(200 mL)與水(200 mL)之間分配。將分離之有機層用鹽水(50 mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥並濃縮至乾。將殘餘物藉由管柱層析法(矽膠，100-200目，石油醚中之0 - 40%乙酸乙酯)純化，得到呈黃色油狀之(S)-3-(4-(苯甲氧基)苯基)-2-((2-甲氧基-2-側氧基乙基)胺基)丙酸甲酯(42.0 g，87.9%產率)。m/z實驗值= 358.2 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 7.45 - 7.37 (m, 5H), 7.13 - 7.11 (m, 2H), 6.93 - 6.91 (m, 2H), 5.05 (s, 2H), 3.69 (s, 3H), 3.67 (s, 3H), 3.57 - 3.55 (m, 1H), 3.46 - 3.33 (m, 2H), 2.98 - 2.93 (m, 2H)。 (S)-3-(4-( 苯甲氧基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -2,6- 二酮之製備

在氮氣氛圍下，在75℃下將(S)-3-(4-(苯甲氧基)苯基)-2-((2-甲氧基-2-側氧基乙基)胺基)丙酸甲酯(5.00 g，14.0 mmol)、N'-(2-胺基乙基)乙烷-1,2-二胺(1.44 g，14.0 mmol)及2,3,4,6,7,8-六氫-1H-嘧啶並[1,2-a]嘧啶(487 mg，3.50 mmol)於四氫呋喃(140 mL)中之溶液攪拌16小時。冷卻至室溫後，過濾反應混合物。將所收集之固體乾燥，得到呈白色固體狀之(S)-3-(4-(苯甲氧基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2,6-二酮(2.50 g，45%產率)。m/z實驗值= 397.0 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ 7.79 (s, 1H), 7.45 - 7.32 (m, 5H), 7.12 - 7.10 (m, 2H), 7.92 - 6.90 (m, 2H), 5.05 (s, 2H), 3.37 - 2.74 (m, 13H), 2.52 - 2.49 (m, 3H)。 (S)-2-(4-( 苯甲氧基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷之製備

在0℃下，向鋁氫化鋰(5.74 g，151 mmol)於四氫呋喃(180 mL)中之懸浮液中添加(S)-3-(4-(苯甲氧基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2,6-二酮(10.00 g，25.2 mmol)。在氮氣氛圍下，將反應混合物升溫至25℃並攪拌16小時。藉由在氮氣氛圍下添加氫氧化鈉(15%水溶液，6 mL)及水(18 mL)淬滅反應。將所得混合物攪拌30分鐘且透過短矽藻土墊過濾。減壓移除所有揮發性物質，且將殘餘物用甲醇及二氯甲烷(甲醇/二氯甲烷= 1:10，400 mL)稀釋並過濾。濃縮濾液，得到呈黃色固體狀之粗(S)-2-(4-(苯甲氧基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(8.6 g，95%產率)。m/z實驗值= 397.0 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ) δ = 7.45 - 7.32 (m, 5H), 7.11 - 7.09 (m, 2H), 6.91 - 6.89 (m, 2H), 5.05 (s, 2H), 3.38 - 2.59 (m, 7H), 2.36 - 1.99 (m, 14H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-( 苯甲氧基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 四 - 三級丁酯之製備

向(S)-2-(4-(苯甲氧基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(4.0 g，10.9 mmol)於乙腈(120 mL)中之混合物中添加碳酸鉀(14.3 g，103 mmol)及2-溴代乙酸三級丁酯(10.6 g，54.27 mmol)。將反應混合物在50℃下攪拌16小時。冷卻至室溫後，將反應混合物透過短矽藻土墊過濾。在真空中濃縮濾液。將殘餘物藉由管柱層析法(Al₂O₃，二氯甲烷中之0~3%甲醇)純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(4.0 g，33.5%產率)。m/z實驗值= 825.5 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.43 - 7.36 (m, 5H), 7.23 - 7.02 (m, 2H), 6.92 - 6.89 (m, 2H), 5.04 - 5.02 (m, 2H), 3.45 - 2.53 (m, 22H), 1.48 - 1.42 (m, 36H)。 化合物 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4- 羥基苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

在氫氣氛圍(50 psi)下，在50℃下將(S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(苯甲氧基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酸四-三級丁酯(10.0 g，12.12 mmol)、20%氫氧化鈀/碳(8.5 g，12.12 mmol)及10%鈀/碳(12.9 g，12.12 mmol)於甲醇(300 mL)中之混合物攪拌24小時。將反應混合物透過短矽藻土墊過濾。在真空中濃縮濾液至乾，得到呈白色固體狀之(S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-羥基苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酸四-三級丁酯(8.2 g，92.1%產率)。m/z實驗值= 735.5 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ = 7.14 - 6.90 (m, 2H), 6.86 - 6.79 (m, 2H), 5.04 - 5.03 (m, 1H), 3.67 - 2.67 (m, 23H), 1.53 - 1.42 (m, 36H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(2-( 苯甲氧基 )-2- 側氧基乙氧基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-羥基苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酸四-三級丁酯(1.00g，1.36mmol)於DMF (15 mL)中之混合物中添加碳酸鉀(0.47 g，3.40 mmol)及2-溴代乙酸苯甲酯(0.62 g，2.72 mmol)。將反應混合物在80℃下攪拌16小時並過濾。將濾液濃縮至乾且將殘餘物藉由管柱層析法(矽膠，100-200目，二氯甲烷中之0-5%甲醇)純化，得到呈黃色油狀之2,2',2'',2'''-(2-(4-(2-(苯甲氧基)-2-側氧基乙氧基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酸四-三級丁酯(1.0g，80.7%產率)。m/z實驗值= 883.5 (M+H)。 2-(4-((1,4,7,10- 肆 (2-( 三級丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -2- 基 ) 甲基 ) 苯氧基 ) 乙酸之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(2-(苯甲氧基)-2-側氧基乙氧基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酸四-三級丁酯(1.00 g，1.13 mmol)於甲醇(20 mL)中之溶液中添加10%鈀/碳(1.19 g，1.13 mmol)及20%氫氧化鈀/碳(0.80 g，1.13 mmol)。在氫氣氛圍(50 psi)下，將反應混合物在50℃下攪拌16小時並過濾。將濾液濃縮至乾，得到呈白色固體狀之2-(4-((1,4,7,10-肆(2-(三級丁氧基)-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基)甲基)苯氧基)乙酸( 中間體 A)(0.50 g，55.7%產率)。m/z實驗值= 793.4 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.28 (s, 1H), 7.15 - 7.10 (m, 2H), 4.37 (s, 2H), 3.69 - 3.38 (m, 9H), 2.95 - 2.67 (m, 15H), 3.38 - 2.33 (m, 1H), 1.44 - 1.35 (m, 36H)。實例 2. 化合物 1-8 之合成 N¹,N¹⁷- 二 乙基 -3,6,9,12,15- 五 氧雜十七烷 -1,17- 二胺之製備

在0℃下，向溴-PEG5-溴化物(500 mg，1.23 mmol)於水(1.75 mL)中之溶液中添加K₂CO₃(847 mg，6.13 mmol，5 eq.)、TBABr (18.9 mg，123 µmol，0.1 eq.)及乙胺(627 mg，13.9 mmol，11 eq.)。30分鐘後，移除冰浴，並攪拌反應18小時。將溶液用鹽水稀釋，接著用CH₂Cl₂萃取六次。將有機層用鹽水洗滌，用無水Na₂SO₄乾燥，過濾，並濃縮，得到呈無色油狀之標題化合物(412 mg，定量)。m/z = 337.2 (M+H)。¹H (DMSO-d₆ ): d 3.54-3.49 (m, 18H), 3.44 (t, J=5.8 Hz, 4H), 2.64 (t, J=5.8 Hz, 4H), 2.64 (q, J=7.1 Hz, 4H), 0.99 (t, J=7.2Hz, 6H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-((3- 乙基 -2- 側氧基 -6,9,12,15,18- 五氧雜 -3,21- 二氮雜二十三烷基 ) 氧基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

將中間體 A(96.1 mg，121 µmol)及N¹,N¹⁷-二乙基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二胺(122 mg，364 µmol，3 eq.)溶解於無水DMF (4.7 mL)中。在惰性氛圍下，添加HATU (92.2 mg，242 mmol，2 eq.)及N-乙基雙(異丙基)胺(84.4 mL，485 mmol，4 eq.)。將所得黃色溶液在室溫下攪拌1小時30分鐘，此後LC-MS分析顯示起始物質完全消耗。將混合物濃縮並使其通過二氧化矽塞管柱，得到156 mg粗物質，其不經進一步純化即使用。m/z實驗值= 1111.6 (M+H)。 雙 -TFP- 己二酸酯之製備

將己二酸(1.00 g，6.84 mmol)及EDC (3.28 g，17.1 mmol)溶解於20 mL DCM中且在冰浴中冷卻至0℃，接著添加2,3,5,6-四氟苯酚於20 mL DCM中之溶液。藉由TLC (R_f= 0.5；75% DCM/己烷)觀察到轉化成產物。將反應混合物在真空中濃縮且藉由急驟層析法(0-100% DCM/己烷)純化，得到呈結晶白色粉末狀之標題化合物(2.48 g，82%)。¹H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 7.03 (tt,J= 9.9, 7.0 Hz, 2H), 3.00 - 2.63 (m, 4H), 1.95 (t,J= 3.3 Hz, 4H)。經LCMS測定，此化合物具有弱信號。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-((3,21- 二乙基 -2,22,27- 三側氧基 -27-(2,3,5,6- 四氟 - 苯氧基 )-6,9,12,15,18- 五氧雜 -3,21- 二氮雜二十七烷基 ) 氧基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 ( 化合物 1-8) 之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-((3-乙基-2-側氧基-6,9,12,15,18-五氧雜-3,21-二氮雜二十三烷基)氧基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(156 mg，140 mmol)於DMF (10.4 mL)中之溶液中添加己二酸二-2,3,5,6-四氟苯酯(146 mg，421 mmol，3 eq.)及NEt₃(157 mmol，1.12 mmol，8 eq.)。將溶液在室溫下攪拌1小時，此後觀察到起始物質完全消耗。將混合物真空濃縮且不經純化即用於脫保護步驟。m/z實驗值= 1387.7 (M+H)。

將以上粗混合物溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (2 mL)。將紅褐色溶液攪拌12小時，此後脫保護完成。使用製備型HPLC純化所需產物，得到呈白色粉末狀之標題化合物(14.3 mg，經三個步驟7%)。m/z實驗值= 1163.4 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.94 (tt, J = 10.9, 7.4 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.83 (dd, J = 10.9, 8.3 Hz, 2H), 4.78 (d, J = 21.5 Hz, 2H), 3.83 - 3.46 (m, 52H), 2.79 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 2.35 (dt, J = 9.5, 7.3 Hz, 2H), 1.76 - 1.53 (m, 4H), 1.18 - 0.94 (m, 7H)。實例 3. 中間體 B 之合成 (S)-2- 胺基 -3-(4- 溴苯基 ) 丙酸甲酯鹽酸鹽之製備

向(S)-2-胺基-3-(4-溴苯基)丙酸(30.0 g，122.91 mmol)於甲醇(500 mL)中之溶液中添加亞硫醯氯(29.2 g，246 mmol)。在氮氣氛圍下，將反應混合物在80℃下攪拌2小時並濃縮，得到呈黃色固體狀之粗(S)-2-胺基-3-(4-溴苯基)丙酸甲酯鹽酸鹽(36.2 g，100%產率)。m/z實驗值= 260.0 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ = 7.53 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 7.20 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 4.35 - 4.31 (m, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.23 - 3.14 (m, 2H)。 (S)-2- 胺基 -3-(4- 溴苯基 ) 丙酸甲酯鹽酸鹽之製備

向(S)-2-胺基-3-(4-溴苯基)丙酸甲酯鹽酸鹽(20.0 g，77.5 mmol)及三乙胺(23.5 g，232 mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(250 mL)中之溶液中添加2-溴代乙酸甲酯(29.6 g，194 mmol)。在氮氣氛圍下，將反應混合物在25℃下攪拌16小時。冷卻後，將反應混合物用乙酸乙酯(500 mL)稀釋並過濾。將濾液用水(2 × 200 mL)、鹽水(200 mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥並濃縮至乾。將殘餘物藉由管柱層析法(10-20%乙酸乙酯/石油醚)純化，得到呈蒼白色油狀之標題化合物(17 g，66.5%產率)。m/z實驗值= 331.7 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, MeOH -d₄ ) δ = 7.43 (d,J= 8.8 Hz, 2H), 7.13 (d,J= 8.8 Hz, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.65 - 3.61 (m, 4H), 3.44 - 3.37 (m, 2H), 2.96 (d,J= 7.2 Hz, 2H)。 (S)-3-(4- 溴苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -2,6- 二酮之製備

向(S)-2-胺基-3-(4-溴苯基)丙酸甲酯鹽酸鹽(1.70 g，5.15 mmol)及N'-(2-胺基乙基)乙烷-1,2-二胺(637.0 mg，6.18 mmol,)於四氫呋喃(30 mL)中之溶液中添加3,4,6,7,8,9-六氫-2H-嘧啶並[1,2-a]嘧啶(215.0 mg，1.54 mmol)。在氮氣氛圍下，將混合物在75℃下攪拌12小時。冷卻後，將混合物用乙酸乙酯(30 mL)稀釋並過濾。將所收集之固體用甲醇(10 mL)洗滌並乾燥，得到呈白色固體狀之粗(S)-3-(4-溴苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2,6-二酮(1.02 g，52%產率)。m/z實驗值= 370.9 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.45 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.17 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 3.54 (d,J= 16.4 Hz, 1H), 3.50 - 3.37 (m, 2H), 3.27 - 3.17 (m, 2H), 3.02 - 2.94 (m, 3H), 2.83 - 2.74 (m, 3H), 2.66 - 2.57 (m, 2H)。 (S)-2-(4- 溴苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷之製備

向化合物(S)-3-(4-溴苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2,6-二酮(1.0 g，2.71 mmol)於四氫呋喃(200 mL)中之溶液中緩慢添加BH₃-Me₂S (10 M，8.1 mL，81.3 mmol)。在氮氣氛圍下，將混合物在80℃下攪拌16小時。冷卻後，藉由甲醇(15 mL)淬滅反應並濃縮。將殘餘物用水(30 mL)及濃鹽酸(30 mL)稀釋。將混合物在100℃下攪拌14小時且接著藉由添加飽和碳酸鈉水溶液調至pH = 7。減壓移除所有揮發性物質。將殘餘物用甲醇及二氯甲烷(甲醇/二氯甲烷= 1:10，100 mL)稀釋並過濾。濃縮濾液，得到呈白色固體狀之粗化合物(S)-2-(4-溴苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(0.86 g，80%產率)。將粗產物不經純化即用於下一步驟中。m/z實驗值= 342.8 (M+H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4- 溴苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向(S)-2-(4-溴苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(2.0 g，5.86 mmol)及2-溴代乙酸三級丁酯(6.86 g，35.2 mmol)於乙腈(50 mL)中之溶液中添加碳酸鉀(9.72 g，70.3 mmol)。在氮氣氛圍下，將反應混合物在50℃下攪拌16小時。冷卻後，使反應混合物在乙酸乙酯(200 mL)與水(200 mL)之間分配。將分離之有機層用鹽水(50 mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥並濃縮至乾。將殘餘物進一步藉由製備型HPLC (30%-60% MeCN/水+ 0.2%甲酸)純化，得到呈黃色固體狀之標題化合物(2.1 g，44.9%產率)。m/z實驗值= 799.4 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.46 (d,J= 7.6 Hz, 2H), 7.21 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 4.19 - 3.44 (m, 11H), 3.13 - 2.53 (m, 13H), 1.53 - 1.40 (m, 36H)。實例 4. 中間體 C 之合成 丙 -2- 炔酸苯甲酯之製備

在0℃下，將4-二甲基胺基吡啶(3.5 g，28.55 mmol)及二環己基碳化二亞胺(58.9 g，0.29 mmol)於二氯甲烷(200 mL)中之溶液經1小時緩慢添加至丙-2-炔酸(20.0 g，0.29 mmol)及苯甲醇(31.5 g，0.29 mmol)於二氯甲烷(200 mL)中之溶液中。將懸浮液在20℃下攪拌12小時並濃縮至乾。使殘餘物在乙酸乙酯(500 mL)與水(200 mL)之間分配。將分離之有機層用鹽水(200 mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥並濃縮至乾。將殘餘物藉由管柱層析法(5%-30%乙酸乙酯/石油醚)純化，得到呈無色油狀之丙-2-炔酸苯甲酯(20.0 g，43.7%產率)。 (E)-3-(4,4,5,5- 四甲基 -1,3,2- 二氧雜硼雜環戊烷 -2- 基 ) 丙烯酸苯甲酯之製備

向氯化亞銅(278 mg，2.81 mmol)及三級丁醇(540 mg，5.62 mmol)、(9,9-二甲基-9H-𠮿 -4,5-二基)雙(二苯基膦) (1.63 g，2.81 mmol)及三級丁醇鈉(540 mg，5.62 mmol)於四氫呋喃(100 mL)中之混合物中添加雙(頻哪醇基)二硼(23.8 g，93.70 mmol)，隨後添加丙-2-炔酸苯甲酯(15.0 g，93.70 mmol)及甲醇(50 mL)。將反應混合物在20℃下攪拌12小時並濃縮至乾。使殘餘物在乙酸乙酯(100 mL)與水(100 mL)之間分配。將分離之有機層用鹽水(50 mL)洗滌，經無水硫酸鈉乾燥並濃縮至乾。將殘餘物藉由管柱層析法(5%-30%乙酸乙酯/石油醚)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(10.5 g，38.9%產率)。 (E)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(3-( 苯甲氧基 )-3- 側氧基丙 -1- 烯 -1- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

在氮氣氛圍下，將中間體 B(200.0 mg，0.25 mmol)、(E)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)丙烯酸苯甲酯(108.0 mg，0.38 mmol)、Pd(dppf)Cl₂(18.3 mg，0.03 mmol)及碳酸鈉(79.7 mg，0.75 mmol)於二㗁烷(3 mL)及水(0.5 mL)中之混合物在80℃下攪拌4小時並濃縮。將殘餘物藉由管柱層析法(1%-8%甲醇/二氯甲烷)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(150.0 mg，68.1%產率)。m/z實驗值= 879.4 (M+H)。 3-(4-((1,4,7,10- 肆 (2-( 三級丁氧基 )-2- 側氧基乙基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -2- 基 ) 甲基 ) 苯基 ) 丙酸之製備

在氫氣氛圍(15 Psi)下，將化合物(E)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(3-(苯甲氧基)-3-側氧基丙-1-烯-1-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)四乙酸四-三級丁酯(150.0 mg，0.17 mmol)、10%鈀/碳(6.0 mg，0.05 mmol)及10%氫氧化鈀/碳(6.2 mg，0.05 mmol)於四氫呋喃(10 mL)中之混合物在20℃下攪拌16小時並過濾。濃縮濾液，得到呈褐色固體狀之標題化合物(120.0 mg，88.9%產率)。m/z實驗值= 791.5 (M+H)。實例 5. 中間體 D 之合成 己二酸苯甲酯 2,3,5,6- 四氟苯酯之製備

向5-(苯甲氧基羰基)戊酸(0.5 g，2.12 mmol)於DCM (93.6 mL)中之溶液中添加己二酸苯甲酯2,3,5,6-四氟苯酯(557 mg，1.45 mmol)、EDC (609 mg，1.5 eq.，3.17 mmol)及DIPEA (410 mg，1.5 eq.，3.17 mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌12小時，濃縮至乾，且使用矽膠管柱層析法(己烷中之20% EtOAc)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(557 mg，68%產率)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.42 - 7.31 (m, 4H), 7.00 (tt,J= 9.9, 7.1 Hz, 1H), 5.14 (s, 2H), 2.75 - 2.65 (m, 2H), 2.50 - 2.39 (m, 2H), 1.90 - 1.73 (m, 4H)。 (S)-6-[5-( 苯甲氧基羰基 ) 戊醯基胺基 ]-2-[( 三級丁基 )( 氧基羰基胺基 )] 己酸三級丁酯之製備

向(S)-6-胺基-2-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]己酸三級丁酯(0.2 g，661 µmol)於DCM (3.24 mL)及DMF (3.24 mL)中之溶液中添加己二酸苯甲酯2,3,5,6-四氟苯酯(254 mg，661 µmol)及三乙胺(461 µL，5 eq.，3.31 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌18小時，濃縮至乾，且使用矽膠管柱層析法(己烷中之80% EtOAc)純化，得到呈無色油狀之所需物質(319 mg，93%產率)。m/z實驗值= 421.1 (M+H-Boc), 543.1 (M+Na)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.37 - 7.24 (m, 5H), 5.89 (s, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.09 (m, 1H), 3.19 (dt,J= 11.1, 6.7 Hz, 2H), 2.35 (td,J= 5.7, 3.3 Hz, 2H), 2.18 - 2.10 (m, 2H), 1.78 - 1.68 (m, 1H), 1.64 (p,J= 3.5 Hz, 3H), 1.60 - 1.45 (m, 4H), 1.42 (d,J= 7.4 Hz, 18H), 1.39 - 1.29 (m, 2H)。 5-{N-(S)-5- 三級丁氧基羰基 -5-[( 三級丁基 )( 氧基羰基胺基 )] 戊基胺甲醯基 } 戊酸之製備

向(S)-6-[5-(苯甲氧基羰基)戊醯基胺基]-2-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]己酸三級丁酯(382 mg，734 µmol)於MeOH (3 mL)中之溶液中添加10% w/w Pd/C (78.1 mg，0.1 eq.，73.4 µmol)。經由氣球將氫氣引入反應中並將混合物在室溫下攪拌18小時，經矽藻土過濾，並濃縮至乾，得到呈無色油狀之所需產物，其不經進一步純化即使用。m/z實驗值= 331.2 (M+H-Boc), 453.2 (M+Na)。 (S)-2-[( 三級丁基 )( 氧基羰基胺基 )]-6-[5-(2,3,5,6- 四氟苯氧基羰基 ) 戊醯基胺基 ] 己酸三級丁酯 ( 中間體 D) 之製備

向5-{N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基}戊酸(202 mg，469 µmol)於DCM (10 mL)中之溶液中添加2,3,5,6-四氟苯酚(117 mg，1.5 eq.，704 µmol)、EDC (135 mg，1.5 eq.，704 µmol)及DIPEA (123 µL，1.5 eq.，704 µmol)。將反應混合物攪拌1小時，濃縮至乾，且使用矽膠管柱層析法(己烷中之75% EtOAc)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(208 mg，77%產率)。m/z實驗值= 479.1 (M+H-Boc), 601.1 (M+Na)。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 6.99 (1H, td,J= 8.6, 1.6 Hz), 5.65 (1H, s), 5.07 (1H, d,J= 8.2 Hz), 4.13-4.15 (1H, m), 3.25 (2H, m), 2.70 (2H, t,J= 6.6 Hz), 2.23 (2H, t,J= 6.5 Hz), 1.79 (4H, m), 1.51-1.63 (4H, 與水峰重疊), 1.46 (20H, m)。¹⁹F NMR (CHCl₃-d, 376 MHz): δ -139.0, -153.0。實例 6. 中間體 E 之合成 2- 乙基 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(1 g，2.9 mmol)於乙腈(30 mL，574 mmol)中之溶液中添加乙胺(484 µL，3 eq.，8.69 mmol)及三乙胺(1.21 mL，3 eq.，8.69 mmol)。向反應燒瓶裝備冷凝器且在80℃下攪拌隔夜。將反應物冷卻，接著在真空中濃縮，隨後添加甲醇(6.66 mL，164 mmol)、三級丁基-三級丁基(氧基羰氧基)甲酸酯(1.9 g，3 eq.，8.69 mmol)及三乙胺(400 μL，2.9 mmol，1 eq.)。攪拌1小時後，將反應混合物在真空中濃縮且使用管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-20% MeOH)純化粗殘餘物，得到呈無色油狀之所需產物(980 mg，83%產率)。m/z實驗值= 427.1 (M+NH₄), 432.1 (M+Na)。 乙基 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

向2-乙基2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(980 mg，2.39 mmol)於二氯甲烷(23.9 mL，374 mmol)中之溶液中添加三乙胺(0.5 mL，1.5 eq.，3.59 mmol)及(氯磺醯基)甲烷(278 µL，1.5 eq.，3.59 mmol)。將反應混合物攪拌16小時，在真空中濃縮並使用管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-10% MeOH)純化粗物質，得到呈油狀之所需化合物(980 mg，84%產率)。m/z實驗值= 505.1 (M+NH₄), 510.1 (M+Na)。 2- 乙基 2,3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯 ( 中間體 E) 之製備

向乙基(2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(50 mg，103 µmol)於乙腈(1.03 mL，19.6 mmol)中之溶液中添加乙胺(137 µL，3 eq.，2.46 mmol)及三乙胺(42.9 µL，3 eq.，308 µmol)。將反應混合物在80℃下攪拌20小時，減壓濃縮，且使用KP-胺基管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-15% MeOH)純化粗物質，得到呈無色油狀之標題化合物(322 mg，90%產率)。m/z實驗值= 437.2 (M+H)。實例 7. 中間體 F 之合成 2- 溴 -3-(4- 溴苯基 ) 丙酸之製備

在-5℃下，向氫溴酸(48%，41.7 mL，4.5 eq.，369.0 mmol)於H₂O (500 mL)中之溶液中添加溴化鉀(39.0 g，4 eq.，328.0 mmol)、亞硝酸鈉(11.3 g，2 eq.，164.0 mmol)及2-胺基-3-(4-溴苯基)丙酸(20.0 g，81.9 mmol)。將反應混合物在-5℃下攪拌2.5小時且接著使其在EtOAc (500 mL)與H₂O (300 mL)之間分配。將分離之有機層用鹽水(200 mL)洗滌，經無水NaSO₄乾燥並濃縮至乾。將殘餘物藉由矽膠管柱層析法(石油醚中之0 - 30% EtOAc)純化，得到呈黃色固體狀之2-溴-3-(4-溴苯基)丙酸(18.0 g，71.3%產率)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.48 - 7.44 (m, 2H), 7.15 - 7.11 (m, 2H), 4.43 - 4.34 (m, 1H), 3.46 - 3.38 (m, 1H), 3.24 - 3.19 (m, 1H)。 3-(4- 溴苯基 )-2-(1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1- 基 ) 丙酸之製備

在0℃下，向2-溴-3-(4-溴苯基)丙酸(18.0 g，58.5 mmol)及1,4,7,10-四氮雜環十二烷(12.1 g，1.2 eq.，70.1 mmol)於H₂O (60 mL)中之混合物中添加LiOH H₂O (3.2 g，1.3 eq.，76.0 mmol)。將反應混合物在25℃下攪拌16小時且藉由添加1M HCl將其調至pH = 7。將反應混合物濃縮至乾。將殘餘物藉由製備型HPLC (H₂O + FA中之30% ACN)純化，得到呈白色固體狀之3-(4-溴苯基)-2-(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基)丙酸(9.2 g，39.4%產率)。m/z實驗值= 399.0 (M+H)。 3-(4- 溴苯基 )-2-(1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1- 基 ) 丙酸甲酯之製備

向3-(4-溴苯基)-2-(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基)丙酸(9.2 g，23.0 mmol)於DCM (120 mL)及MeOH (15 mL)中之溶液中添加重氮甲基(三甲基)矽烷(2.0 M，17.3 mL，1.5 eq.，34.6 mmol)。將反應混合物在45℃下攪拌16小時並減壓濃縮。將殘餘物藉由製備型HPLC (H₂O + TFA中之30% ACN)純化，得到呈黃色固體狀之3-(4-溴苯基)-2-(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基)丙酸甲酯(5.7 g，59.9%產率)。m/z實驗值= 415.0 (M+H)。 2,2',2''-(10-(3-(4- 溴苯基 )-1- 甲氧基 -1- 側氧基丙 -2- 基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7- 三基 ) 三乙酸三 - 三級丁酯 ( 中間體 F) 之製備

向3-(4-溴苯基)-2-(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基)丙酸甲酯(5.7 g，13.8 mmol)於ACN (60 mL)中之溶液中添加K₂CO₃(11.4 g，6 eq.，82.7 mmol)及2-溴代乙酸三級丁酯(10.8 g，4 eq.，55.2 mmol)。將反應混合物在50℃下攪拌16小時並過濾。減壓濃縮濾液並將殘餘物藉由矽膠管柱層析法(DCM中之0 - 5% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之2,2',2''-(10-(3-(4-溴苯基)-1-甲氧基-1-側氧基丙-2-基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三-三級丁酯(3.6 g，34.54%產率)。m/z實驗值= 757.4 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 8.55 (s, 1H), 7.47 - 7.42 (m, 2H), 7.26 - 7.19 (m, 2H), 3.83 - 3.68 (m, 5H), 3.65-3.63 (m, 3H), 3.31 - 3.30 (m, 1H), 3.08 - 2.84 (m, 18H), 1.49 - 1.48 (m, 27H)。實例 8. 中間體 G 之合成 (E)-3-( 對 -{[(S)-1,4,7,10- 肆 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -2- 環十二烷基 ] 甲基 } 苯基 ) 丙烯酸 ( 中間體 G) 之製備

將中間體 B(50 mg，54.8 µmol，1 eq.)、Pd(amphos)₂Cl₂(3.9 mg，5.48 µmol，0.1 eq.)、Na₂CO₃(29 mg，274 µmol，5 eq.)及水(0.7 mL)添加至(E)-乙氧基羰基乙烯基硼酸頻哪醇酯(37 mg，164 µmol，3 eq.)於1,4-二㗁烷(0.7 mL)中之經攪拌溶液中。將反應物置放於在80℃預先加熱之油浴中並攪拌1小時。接著，添加LiOH (7.9 mg，329 µmol)，並在80℃下再攪拌反應1小時。冷卻後，用NH₄Cl調至pH 6-7來淬滅反應並用水稀釋。將水相萃取至CH₂Cl₂(×3)中，接著將合併之有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾且減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至100% CH₂Cl₂至80:20 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈白色固體狀之標題化合物(40 mg，93%產率)。m/z實驗值= 789.2 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.69 - 7.53 (m, 3H), 7.33 - 7.19 (m, 2H), 6.48 (dd,J= 16.0, 9.5 Hz, 1H), 3.68 - 3.35 (m, 5H), 3.30 - 1.35 (m, 60H)。實例 9. 化合物 1-1 之合成 2,2',2'',2'''-(2-(4-(21- 乙基 -22- 側氧基 -6,9,12,15,18- 五氧雜 -3,21- 二氮雜二十四烷 -24- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

將3-(4-((1,4,7,10-肆(2-(三級丁氧基)-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基)甲基)苯基)丙酸(100 mg，0.126 mmol)溶解於DMF (3 mL)中且置於在氮氣氛圍下。接著，將DIPEA (96.9 µL，556 µmol)及HATU (130 mg，328 µmol)添加至溶液中，隨後添加以上中間體(196 mg，582 µmol)於DMF (2 mL)中之溶液。在室溫下1小時後，SM仍明顯可見，但主要峰為所需產物。將反應混合物在50℃下攪拌2小時，將其倒至水上，用EtOAc萃取，經無水Na₂SO₄乾燥，過濾並減壓濃縮。接著，將粗殘餘物用Et₂O濕磨三次並減壓濃縮，得到呈橙色油狀之標題化合物(108 mg，77%產率)。m/z實驗值= 1109.6 (M+H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,22- 二乙基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向中間體1 (0.1 g，90.1 µmol)於二甲基甲醯胺(9.01 mL，116 mmol)中之溶液中添加三乙胺(105 µL，750 µmol)，隨後添加己二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(140 mg，3.5 eq.，315 µmol)。在室溫下攪拌反應1小時20分鐘並減壓濃縮，得到呈褐色油狀之粗TFP酯中間體。m/z = 693.5 (M+2H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,22- 二乙基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 ( 化合物 1-1) 之製備

將來自上述之TFP酯中間體溶解於二氯甲烷(1 mL)中且添加三氟乙酸(2 mL)。攪拌反應18小時，濃縮，且藉由製備型HPLC (40-60% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈白色粉末狀之標題化合物(化合物 1-1) (12.5 mg，12%產率)。m/z實驗值= 1161.4 (M+H)。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 7.94 (tt,J= 10.8, 7.3 Hz, 1H), 7.18 (d,J= 5.5 Hz, 4H), 4.11 - 3.81 (m, 9H), 3.50 (m, 28H), 2.79 (m, 8H), 2.66 - 2.55 (m, 5H), 2.36 (dt,J= 12.6, 7.3 Hz, 4H), 1.69 (h,J= 7.6 Hz, 3H), 1.60 (p,J= 7.6 Hz, 3H), 1.13 - 0.96 (m, 8H)。實例 10. 化合物 2-1 之合成 4-[ 乙基 (3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷 -1- 基 ) 胺甲醯基 ]-2-{4,7,10- 參 [2-( 三級丁氧基 )-2- 側氧基乙基 ]-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1- 基 } 丁酸三級丁酯之合成

向5-(三級丁氧基)-5-側氧基-4-{4,7,10-參[2-(三級丁氧基)-2-側氧基乙基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基}戊酸DOTA-GA(tBu)₄-OH) (91.4 mg，0.130 mmol)於DMF (3 mL)中之溶液中添加DIPEA (100 µL，0.574 mmol)及HATU (63 mg，0.166 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌5分鐘。一次性添加N¹,N¹⁷-二乙基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1,17-二胺(200 mg，0.594 mmol)於DMF (2 mL)中之溶液中，並將反應混合物在室溫下攪拌1小時，溶解於EtOAc中並用2份水洗滌，經Na₂SO₄乾燥，過濾，且在真空中濃縮。將殘餘物溶於Et₂O (4 mL)中且音波處理3分鐘，傾析出Et₂O並丟棄。將此程序再重複兩次，得到經保護之中間體(44 mg，33%產率)，其不經進一步純化即使用。m/z實驗值= 1019.8 (M+H)。 4-[ 乙基 ({17-[N- 乙基 -6- 側氧基 -6-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 ) 己醯胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷 -1- 基 }) 胺甲醯基 ]-2-[4,7,10- 參 ( 羧基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1- 基 ] 丁酸 ( 化合物 2-1) 之合成

向4-[乙基(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷-1-基)胺甲醯基]-2-{4,7,10-參[2-(三級丁氧基)-2-側氧基乙基]-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基}丁酸三級丁酯(44 mg，0.043 mmol)及Et₃N (50 µL，0.358 mmol)於CH₂Cl₂(4.4 mL)中之溶液中添加己二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(60 mg，0.136 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時20分鐘並減壓濃縮，得到所需化合物。m/z實驗值= 1295.9 (M+H)。此物質直接用於脫保護。向反應混合物中添加TFA (4 mL)，並使混合物在室溫下靜置60小時。藉由N₂流濃縮反應混合物，得到粗產物，將其藉由製備型HPLC純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(14 mg，28%產率)。m/z實驗值= 1071.6 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.28 - 7.14 (m, 1H), 3.85 (m, 4H), 3.77 - 2.78 (m, 45H), 2.78 - 2.50 (m, 3H), 2.39 (dq,J= 7.3, 3.8 Hz, 2H), 2.00 - 1.77 (m, 4H), 1.76 - 1.50 (m, 4H), 1.23 - 1.11 (m, 1H), 1.10 - 1.02 (m, 3H), 0.96 (q,J= 6.9 Hz, 3H)。實例 11. 化合物 1-12 之合成 甲烷磺酸 2,2- 二甲基 -4- 側氧基 -3,8,11,14,17- 五氧雜 -5- 氮雜十九烷 -19- 基酯之製備

向2-甲基-2-丙烷胺基甲酸17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷酯(150 mg，393 µmol)於CH₂Cl₂(3.93 mL)中之溶液中添加(氯磺醯基)甲烷(45.7 µL，590 µmol，1.5 eq.)及NEt₃(82.2 µL，590 µmol，1.5 eq.)。將混合物攪拌隔夜，用CH₂Cl₂稀釋，接著用1 M HCl洗滌。再用CH₂Cl₂萃取水層兩次，合併有機層，經無水MgSO₄乾燥，並濃縮，得到黃色油狀物。此粗物質不經進一步純化即使用。m/z實驗值= 404.1 (M+H-tBu), 477.2 (M+NH₄), 482.1 (M+Na)。 (6,9,12,15- 四氧雜 -3- 氮雜十七烷 -17- 基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

向甲烷磺酸2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜十九烷-19-基酯(175 mg，381 µmol)於水(1 mL)中之溶液中添加K₂CO₃(263 mg，1.9 mmol，5 eq.)及TBABr (12.3 mg，38.1 µmol，0.1 eq.)。將混合物冷卻至0℃並添加70% v/v乙胺(344 µL，4.32 mmol，11 eq.)。攪拌隔夜後，將混合物用鹽水稀釋，且用乙酸乙酯萃取三次。收集有機層，經無水MgSO₄乾燥，過濾，並濃縮。藉由急驟管柱層析法(己烷中之30% - 100% EtOAc)純化，得到呈無色油狀之產物(122 mg，78%產率)。m/z實驗值= 409.2 (M+H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(23- 乙基 -2,2- 二甲基 -4,24- 二側氧基 -3,8,11,14,17,20- 六 氧雜 -5,23- 二氮雜二十六烷 -26- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向中間體 C(0.1 g，126 µmol)於DMF (4.86 mL)中之溶液中添加HATU (96.1 mg，253 µmol，2 eq.)及N-乙基雙(異丙基)胺(88.1 µL，506 µmol，4 eq.)。攪拌10分鐘後，將(6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十七烷-17-基)胺基甲酸三級丁酯(155 mg，379 µmol，3 eq.)於微量DMF中之溶液添加至該溶液中。將混合物在室溫下攪拌1小時，此時LC-MS顯示起始物質完全消耗及對應於產物質量之新主要峰。減壓移除溶劑且使產物通過矽膠管柱塞，得到粗物質，其不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 1181.6 (M+H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(1- 胺基 -18- 乙基 -19- 側氧基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一烷 -21- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

將粗2,2',2'',2'''-(2-(4-(23-乙基-2,2-二甲基-4,24-二側氧基-3,8,11,14,17,20-六氧雜-5,23-二氮雜二十六烷-26-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (100 mL)。將混合物攪拌30分鐘，此後Boc脫保護完成。將溶液蒸發至乾且不經純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 1081.6 (M+H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(4- 乙基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 ( 化合物 1-12) 之製備

將2,2',2'',2'''-(2-(4-(1-胺基-18-乙基-19-側氧基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一烷-21-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(137 mg，127 µmol)溶解於DMF (9.38 mL)中且添加雙-TFP-己二酸酯(196 mg，443 µmol，3.5 eq.)及三乙胺(147 µL，1.05 mmol，8.3 eq.)。攪拌反應1小時30分鐘，此後LC-MS指示完全偶聯。將溶液減壓濃縮且再溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中，隨後添加TFA (2 mL)。將所得混合物攪拌24小時，濃縮，且使用製備型HPLC純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(14.9 mg，經4個步驟7%產率)。m/z實驗值= 1133.4 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.01 - 7.85 (m, 2H), 7.28 - 7.15 (m, 4H), 4.06 (d,J= 68.7 Hz, 31H), 3.83 (d,J= 18.9 Hz, 2H), 3.58 (s, 1H), 3.47 (m, 11H), 3.42 - 3.35 (m, 4H), 3.31 (dd,J= 12.9, 6.8 Hz, 1H), 3.19 (q,J= 5.8 H, 3H), 2.78 (t,J= 7.0 Hz, 4H), 2.59 (dt,J= 10.7, 7.8 Hz, 1H), 2.12 (t,J= 6.9 Hz, 2H), 1.70 - 1.52 (m, 4H), 1.02 (dt,J= 21.3, 7.0 Hz, 3H)。實例 12. 化合物 1-9 之合成 N¹,N¹⁴- 雙 (3,3,3- 三氟丙基 )-3,6,9,12- 四 氧雜十四烷 -1,14- 二胺之製備

向1,17-二溴-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷(250 mg，0.6 mmol)於水(1 mL)中之溶液中添加K₂CO₃(423 mg，3.0 mmol，5 eq.)及TBABr (9.44 mg，61.3 mmol，0.1 eq.)。將混合物冷卻至0℃且逐滴添加三氟丙胺(186 μL，1.84 mmol，3 eq.)。攪拌48小時後，移除溶劑且使用逆相管柱純化(C18，H₂O + 0.1% TFA中之20% ACN)粗物質，得到呈紅褐色油狀之標題化合物(310 mg，72%產率)。m/z實驗值= 473.2 (M+H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(25,25,25- 三氟 -3- 側氧基 -4-(3,3,3- 三氟丙基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十五烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向中間體 C(0.1 g，126 µmol)於DMF (4.86 mL)中之溶液中添加HATU (96.1 mg，253 µmol，2 eq.)及N-乙基雙(異丙基)胺(88.1 µL，506 µmol，4 eq.)。攪拌10分鐘後，添加N¹,N¹⁴ -雙(3,3,3-三氟丙基)-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1,14-二胺(89.6 mg，1.5 eq.，190 µmol)於微量DMF中之溶液且攪拌反應1小時。減壓移除溶劑且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之25% MeOH)純化粗物質，得到呈褐色油狀之目標化合物(154 mg，98%產率)。m/z實驗值= 623.5 (M+2H), 416.0 (M+3H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-4,22- 雙 (3,3,3- 三氟丙基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 ( 化合物 1-9) 之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(25,25,25-三氟-3-側氧基-4-(3,3,3-三氟丙基)-7,10,13,16,19-五氧雜-4,22-二氮雜二十五烷基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(154 mg，124 µmol)於DMF (2.9 mL)及CH₂Cl₂(2.9 mL)中之溶液中添加三乙胺(144 µL，1.03 mmol，8.3 eq.)及己二酸二-2,3,5,6-四氟苯酯(164 mg，372 µmol，3 eq.)。攪拌反應2.5小時，此後起始物質完全消耗。減壓移除溶劑且將粗物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中，隨後添加TFA (2 mL)。將褐色溶液攪拌12小時，濃縮，且使用製備型HPLC (H₂O + 0.1%甲酸中之50% ACN)純化，得到呈白色粉末狀之化合物 1-9(12 mg，經兩個步驟7.5%產率)。m/z實驗值= 1297.4 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.36 (ddd,J= 17.9, 10.5, 7.3 Hz, 1H), 7.26 (s, 4H), 4.21 - 3.89 (m, 3H), 3.85- 3.49 (m, 45H), 3.25 (d,J= 14.0 Hz, 1H), 3.10 (t,J= 11.8 Hz, 1H), 2.94 (d,J= 6.6 Hz, 3H), 2.86 - 2.72 (m, 4H), 2.64 (d,J= 10.5 Hz, 1H), 2.58 - 2.40 (m, 6H), 1.82 - 1.73 (m, 5H)。實例 13. 化合物 1-2 之合成 二甲烷磺酸 3,6,9,12,15,18,21,24,27,30- 十 氧雜三十二烷 -1,32- 二基酯之製備

在0℃下，向3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜-1,32-三十二烷二醇(250 mg，497 mmol)及三乙胺(308 mL，2.21 mmol，4.4 eq.)於CH₂Cl₂(4.97 mL)中之溶液中添加氯磺醯基甲烷(171 mL，2.21 mmol，4.4 eq.)。將混合物在室溫下攪拌12小時，用CH₂Cl₂稀釋，且用1 M HCl洗滌。接著，用CH₂Cl₂萃取水層兩次。將有機層合併，經無水Na₂SO₄乾燥，並濃縮至乾，得到呈無色油狀之標題化合物(398.2 mg，97%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 659.2 (M+H)。 N¹,N³²- 二乙基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30- 十 氧雜三十二烷 -1,32- 二胺之製備

向二甲烷磺酸3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷-1,32-二基酯(328 mg，498 µmol)於水(1.31 mL)中之溶液中添加K₂CO₃(344 mg，2.49 mmol，5 eq.)、TBABr (16.1 mg，49.8 µmol，0.1 eq.)。將混合物冷卻至0℃並添加70% v/v乙胺(450 µL，5.66 mmol，11 eq.)，且在室溫下攪拌隔夜。減壓移除溶劑並將粗物質使用KP-胺基管柱層析法(CH₂Cl₂/MeOH)純化，得到標題化合物(332 mg，85%產率)。m/z實驗值= 557.3 (M+H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(36- 乙基 -37- 側氧基 -6,9,12,15,18,21,24,27,30,33- 十氧雜 -3,36- 二氮雜三十九烷 -39- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向中間體 C(70 mg，88.5 µmol)及N¹,N³² -二乙基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-十氧雜三十二烷-1,32-二胺(98.5 mg，177 µmol，2 eq.)於二甲基甲醯胺(3.4 mL)中之溶液中添加N-乙基雙(異丙基)胺(67.8 µL，389 µmol，4.4 eq.)及HATU (43.7 mg，115 µmol，1.3 eq.)。在室溫下在60℃下攪拌反應隔夜。減壓移除溶劑且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之20-25% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物。m/z實驗值= 665.6 (M+2H), 444.1 (M+3H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,37- 二乙基 -3,38,43- 三側氧基 -43-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19,22,25,28,31,34- 十氧雜 -4,37- 二氮雜四十三烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 ( 化合物 1-2) 之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(36-乙基-37-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧雜-3,36-二氮雜三十九烷-39-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(118 mg，88.7 μmol)於DMF (5.58 mL)中之溶液中添加己二酸二-2,3,5,6-四氟苯酯(106 mg，239 μmol，2.7 eq.)。將反應混合物攪拌2小時，濃縮，且再溶解於二氯甲烷(1 mL)中，隨後添加TFA (2 mL)。將褐色溶液在室溫下攪拌12小時。移除溶劑且將混合物使用製備型HPLC (ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(13.3 mg，經三個步驟11%產率)。m/z實驗值= 1381.5 (M+H), 691.5 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.25 (tt,J= 10.5, 7.3 Hz, 1H), 7.19 - 7.11 (m, 4H), 3.83 (t,J= 19.0 Hz, 2H), 3.69 - 3.48 (m, 51H), 3.47 - 3.22 (m, 6H), 2.97 (t,J= 11.0 Hz, 1H), 2.83 (t,J= 7.0 Hz, 3H), 2.73 (dt,J= 7.1, 3.5 Hz, 2H), 2.69 - 2.59 (m, 2H), 2.41 (td,J= 7.3, 3.8 Hz, 2H), 1.78 - 1.55 (m, 5H), 1.09 (t,J= 7.1 Hz, 2H), 1.04 - 0.89 (m, 5H)。實例 14. 化合物 1-13 之合成 (20- 甲基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一烷基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

向甲烷磺酸2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17,20-六氧雜-5-氮雜二十二烷-22-基酯(0.2 g，435 µmol)於水(1.14 mL)中之溶液中添加K₂CO₃(301 mg，2.18 mmol，5 eq.)、TBABr (14 mg，43.5 µmol，0.1 eq.)、異丁胺鹽酸鹽(477 mg，4.35 mmol，10 eq.)及碘化鉀(21.7 mg，131 µmol，0.3 eq.)。在80℃下攪拌12小時，濃縮，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10-15% MeOH)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(101 mg，53%產率)。m/z實驗值= 473.2 (M+H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(23- 異丁基 -2,2- 二甲基 -4,24- 二側氧基 -3,8,11,14,17,20- 六 氧雜 -5,23- 二氮雜二十六烷 -26- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向中間體 C(51.5 mg，50.6 µmol)於CH₂Cl₂(2 mL)及DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (38.5 mg，101 µmol，2 eq.)及N-乙基雙(異丙基)胺(35.2 µL，202 µmol，4 eq.)。攪拌10分鐘後，將(20-甲基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一烷基)胺基甲酸三級丁酯(33.1 mg，75.8 µmol，1.5 eq.)添加於微量DMF中。在室溫下攪拌反應45分鐘，濃縮，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10-20% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(50 mg，82%產率)。m/z實驗值= 1209.6 (M+H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(1- 胺基 -18- 異丁基 -19- 側氧基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一烷 -21- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

將2,2',2'',2'''-(2-(4-(23-異丁基-2,2-二甲基-4,24-二側氧基-3,8,11,14,17,20-六氧雜-5,23-二氮雜二十六烷-26-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(50.1 mg，41.4 µmol)溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.1 mL)。將混合物在室溫下攪拌30分鐘，此後LC-MS分析顯示SM消失。將溶液減壓濃縮且不經純化以粗物質形式用於下一合成步驟。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(4- 異丁基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 ( 化合物 1-13) 之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(1-胺基-18-異丁基-19-側氧基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一烷-21-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(46 mg，41.5 µmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加己二酸二-2,3,5,6-四氟苯酯(55 mg，124 µmol，3 eq.)及三乙胺(28.9 µL，207 µmol，5 eq.)。攪拌2小時後，將反應物濃縮且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之25% MeOH)純化。收集含有產物之溶離份，濃縮，並溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中，隨後添加TFA (2 mL)。將所得褐色溶液在室溫下攪拌12小時，濃縮，且使用製備型HPLC (50% ACN/H₂O + 0.1%甲酸)純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(4.4 mg，經三個合成步驟9%產率)。m/z實驗值= 1161.2 (M+H), 581.3 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.36 (ddd,J= 17.8, 10.5, 7.3 Hz, 1H), 7.31 - 7.21 (m, 4H), 3.95 (t,J= 18.5 Hz, 3H), 3.82 - 3.57 (m, 25H), 3.56 - 3.44 (m, 2H), 3.43 - 3.23 (m, 11H), 3.19 - 3.04 (m, 9H), 3.00 - 2.90 (m, 3H), 2.86 - 2.72 (m, 4H), 2.63 (s, 2H), 2.34 (dd,J= 7.1, 2.6 Hz, 2H), 1.97 - 1.83 (m, 1H), 1.83 - 1.68 (m, 4H), 0.85 (dd,J= 6.8, 2.6 Hz, 3H), 0.79 (t,J= 5.8 Hz, 3H)。實例 15. 化合物 1-5 之合成 (17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )( 苯乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(150 mg，435 µmol)於水(1.14 mL)中之溶液中添加K₂CO₃(301 mg，2.18 mmol，5 eq.)、TBABr (14 mg，43.5 µmol，0.1 eq.)、苯乙胺(274 µL，2.18 mmol，5 eq.)及碘化鉀(21.7 mg，131 µmol，0.3 eq.)。將混合物在80℃下攪拌隔夜，隨後將其濃縮且再溶解於MeOH (1 mL)中。接著，將Boc₂O (104 mg，0.479 mmol，1.1 eq.)添加至反應物中。在室溫下攪拌2小時後，減壓移除揮發性物質且經由矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之20% MeOH)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(189 mg，89%產率)。m/z實驗值= 486.2 (M+H), 386.2 (M+H-Boc), 503.2 (M+NH₄)。 甲烷磺酸 2,2- 二甲基 -4- 側氧基 -5- 苯乙基 -3,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5- 氮雜二十二烷 -22- 基酯之製備

向(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)(苯乙基)胺基甲酸三級丁酯(189 mg，389 µmol)於二氯甲烷(3.89 mL)中之溶液中添加三乙胺(81.3 µL，583 µmol，1.5 eq.)，隨後逐滴添加(氯磺醯基)甲烷(45.2 µL，583 µmol，1.5 eq.)。將溶液在50℃下攪拌隔夜，減壓濃縮且不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 464.1 (M+H-Boc), 508.1 (M+H-tBu), 581.1 (M+NH₄)。 苯乙基 (1- 苯基 -6,9,12,15,18- 五氧雜 -3- 氮雜二十烷 -20- 基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，向苯乙胺(54.8 mg，452 µmol，1 eq.)及三乙胺(189 µL，1.36 mmol，3 eq.)於DMF (1 mL)中之溶液中逐滴添加甲烷磺酸2,2-二甲基-4-側氧基-5-苯乙基-3,8,11,14,17,20-六氧雜-5-氮雜二十二烷-22-基酯(255 mg，452 µmol)於DMF (4 mL)中之溶液。在升溫至室溫後，在50℃下攪拌反應12小時。減壓移除溶劑且經由矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之15% MeOH)純化粗物質，得到呈無色油狀之標題化合物(177 mg，經兩個合成步驟67%產率)。m/z實驗值= 589.2 (M+H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(22- 側氧基 -21- 苯乙基 -1- 苯基 -6,9,12,15,18- 五氧雜 -3,21- 二氮雜二十四烷 -24- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向中間體 C(51.5 mg，50.6 µmol)於二氯甲烷(2 mL)及DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (38.5 mg，101 µmol，2 eq.)及DIPEA (35.2 µL，202 µmol，4 eq.)。攪拌10分鐘後，添加微量DMF中之苯乙基(1-苯基-6,9,12,15,18-五氧雜-3-氮雜二十烷-20-基)胺基甲酸三級丁酯(24.5 mg，50.6 µmol，1 eq.)。攪拌反應12小時，減壓濃縮，且經由矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之15% MeOH)純化，得到呈褐色油狀的經Boc保護之醯胺。m/z實驗值= 631.4 (M+2H-Boc)。接著，將殘餘物再溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.5 mL)。攪拌1小時後，將反應物減壓濃縮且不經進一步純化即用於下一步驟。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(3,23,28- 三側氧基 -4,22- 二 苯乙基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 ( 化合物 1-5) 之製備

向粗2,2',2'',2'''-(2-(4-(22-側氧基-21-苯乙基-1-苯基-6,9,12,15,18-五氧雜-3,21-二氮雜二十四烷-24-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(63.8 mg，50.6 μmol)於DMF (5 mL)中之溶液中添加己二酸二-2,3,5,6-四氟苯酯(67.1 mg，152 μmol，3 eq.)及三乙胺(21.1 μL，152 μmol，3 eq.)。在室溫下攪拌12小時後，將溶液減壓濃縮且再溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中。添加TFA (2 mL)且將混合物在室溫下攪拌12小時。移除揮發性物質，且將粗物質使用製備型HPLC (H₂O + 0.1% TFA中之45% ACN)純化。m/z實驗值= 1313.2 (M+H), 657.3 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.94 (tt,J= 10.8, 7.4 Hz, 1H), 7.33 - 7.14 (m, 12H), 7.10 (d,J= 7.8 Hz, 2H), 4.08 (dd,J= 152.7, 58.4 Hz, 30H), 3.58 (s, 4H), 3.49 - 3.36 (m, 17H), 3.10 (d,J= 13.9 Hz, 8H), 2.86 - 2.68 (m, 10H), 2.67 - 2.59 (m, 1H), 2.54 (s, 2H), 2.37 (d,J= 7.2 Hz, 2H), 2.15 (t,J= 7.2 Hz, 1H), 1.66 (q,J= 7.4 Hz, 1H), 1.57 (q,J= 7.5 Hz, 2H), 1.47 (t,J= 7.5 Hz, 1H)。實例 16. 化合物 1-3 之合成 2- 異丁基 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(250 mg，724 µmol)於H₂O (1.9 mL)中之溶液中添加K₂CO₃(0.5 g，5 eq.，3.62 mmol)、TBABr (23.3 mg，0.1 eq.，72.4 µmol)、KI (36.1 mg，0.3 eq.，217 µmol)及氯化氫—異丁基胺(1/1) (397 mg，5 eq.，3.62 mmol)。將混合物在80℃下攪拌隔夜，隨後將其濃縮至乾，得到取代產物。m/z實驗值= 338.1 (M+H)。接著，將此粗物質溶解於MeOH (1.66 mL)中且添加Boc₂O (174 mg，1.1 eq.，797 µmol)。攪拌45分鐘後，減壓蒸發溶劑，且將粗殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到呈無色油狀之產物(188 mg，經2個步驟59%產率)。m/z實驗值= 438.2 (M+H), 455.2 (M+NH₄), 460.2 (M+Na)。 2- 異丁基 2-20- 甲基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向2-異丁基2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(188 mg，430 µmol)於DCM (4.3 mL)中之溶液中添加三乙胺(89.9 µL，1.5 eq.，645 µmol)，隨後在0℃下逐滴添加(氯磺醯基)甲烷(49.9 µL，1.5 eq.，645 µmol)。使混合物升溫至室溫且接著加熱至50℃以攪拌隔夜。藉由添加1M HCl淬滅反應，且用DCM萃取三次。收集有機層，經無水Na₂SO₄乾燥，並將濾液濃縮至乾，得到甲磺酸化產物，其不經進一步純化即使用。m/z實驗值= 533.2 (M+NH₄), 538.1 (M+Na)。接著，將此粗物質溶解於DMF (4 mL)中，隨後在0℃下逐滴添加氯化異丁基銨(149 mg，3 eq.，1.36 mmol)及三乙胺(283 µL，4.5 eq.，2.03 mmol)於DMF (1 mL)中之溶液。將反應混合物升溫至室溫且接著加熱至80℃。攪拌隔夜後，減壓移除溶劑且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(228 mg，定量)。m/z實驗值= 493.2 (M+H)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-2-[( 對 -{2-[( 異丁基 )(20- 甲基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一烷基 ) 胺甲醯基 ] 乙基 } 苯基 ) 甲基 ]-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

向中間體 C(50 mg，63.2 µmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (48.1 mg，2 eq.，126 µmol)及DIPEA (44 µL，4 eq.，253 µmol)。攪拌5分鐘後，添加2-異丁基2-20-甲基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(46.7 mg，1.5 eq.，94.8 µmol)於CH₂Cl₂(3 mL)中之溶液。將反應混合物攪拌2小時，減壓濃縮，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到偶聯產物。m/z實驗值= 633.0 (M+2H), 583.4 (M+2H-Boc)。接著，將此粗醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.5 mL)。將溶液攪拌3小時並濃縮至乾，得到作為褐色殘餘物之標題化合物，其不經進一步純化即用於下一步驟。 [(S)-4,7,10- 參 ( 羧基甲基 )-2-[( 對 -{2-[( 異丁基 )(17-{( 異丁基 )[4-(2,3,5,6- 四氟苯氧基羰基 ) 丁基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 乙基 } 苯基 ) 甲基 ]-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸 ( 化合物 1-3) 之製備

向[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-[(對 -{2-[(異丁基)(20-甲基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一烷基)胺甲醯基]乙基}苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(70 mg，60.1 µmol)於DMF (4.45 mL)中之溶液中添加雙-TFP-己二酸酯(79.7 mg，3 eq.，180 µmol)及三乙胺(69.6 µL，8.3 eq.，0.5 mmol)。攪拌1小時後，將混合物濃縮至乾，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到偶聯產物。m/z實驗值= 721.4 (M+2H)。接著，將此物質溶解於CH₂Cl₂(445 µL)中且添加TFA (890 µL)。將混合物攪拌隔夜，減壓濃縮且將殘餘物使用製備型HPLC (65% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(4 mg，經4個步驟5%)。m/z實驗值= 1217.2 (M+H), 609.3 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.95 (ddd,J= 18.3, 10.9, 7.4 Hz, 1H), 7.15 (s, 4H), 6.55 (s, 2H), 3.75 (d,J= 153.3 Hz, 18H), 3.56 - 3.43 (m, 26H), 3.40 (s, 2H), 3.12 (q,J= 8.4 Hz, 4H), 2.99 (s, 1H), 2.79 (dt,J= 7.3, 4.0 Hz, 4H), 2.73 - 2.61 (m, 1H), 2.56 (d,J= 12.0 Hz, 1H), 2.42 (t,J= 7.2 Hz, 1H), 2.36 - 2.30 (m, 1H), 1.96 - 1.79 (m, 1H), 1.69 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 1.60 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 0.91 - 0.75 (m, 14H)。¹⁹F NMR (377 MHz, DMSO-d₆) δ -139.76 (dd,J= 23.4, 9.9 Hz), -154.05 (dt,J= 23.2, 9.2 Hz)。實例 17. 化合物 2-25 之合成 (E)-3-( 對 -{2- 甲氧基羰基 -2-[4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙基 } 苯基 ) 丙烯酸之製備

向{4-[2-(對 -溴苯基)-1-甲氧基羰基乙基]-7-10-雙(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基}乙酸三級丁酯(中間體 F，42.8 g，56.5 µmol)於1,4-二㗁烷(755 μL)中之溶液中添加(E)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)丙烯酸苯甲酯(49 mg，3 eq.，170 µmol)、Pd(dppf)₂Cl₂(4.6 mg，0.1 eq.，5.66 µmol)、Na₂CO₃(18 mg，3 eq.，170 µmol)及H₂O (755 μL)。將混合物加熱至80℃，保持1小時，隨後將其濃縮至乾。將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之14% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(34.4 mg，73%產率)。m/z實驗值= 837.3 (M+H)。 3-( 對 -{2- 甲氧基羰基 -2-[4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙基 } 苯基 ) 丙酸之製備

在氮氣流下，向(E)-3-(對-{2-甲氧基羰基-2-[4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙基}苯基)丙烯酸(76.6 mg，103 µmol)於THF (4.99 mL)中之溶液中添加20%w/w Pd(OH)₂(7.2 mg，0.1 eq.，10.3 µmol)及10%w/w Pd/C (10.9 mg，0.1 eq.，10.3 µmol)。接著，經由氣球將氫氣引入反應中。將混合物攪拌隔夜，接著透過矽藻土過濾，用ACN及EtOH洗滌，並減壓濃縮，得到呈黃色油狀之標題化合物(70.2 mg，91%產率)，其不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 749.3 (M+H), 375.2 (M+2H)。 [4,10- 雙 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-7-(2-{ 對 -[2-({17-[( 三級丁基 )( 乙基 )( 氧基羰基胺基 )]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 }-N- 乙基胺甲醯基 ) 乙基 ] 苯基 }-1- 甲氧基羰基乙基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

向3-(對 -{2-甲氧基羰基-2-[4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙基}苯基)丙酸(130 mg，174 µmol)於DMF (3 mL)中之溶液中添加HATU (132 mg，2 eq.，348 µmol)及DIPEA (60.6 µL，2 eq.，348 µmol)。攪拌10分鐘後，添加2-乙基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(152 mg，2 eq.，348 µmol)於微量DMF中之溶液。攪拌1小時後，移除溶劑且將粗混合物使用矽膠管柱層析法(DCM中之15-20% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(166 mg，82%產率)。m/z實驗值= 1167.4 (M+H), 534.4 (M+2H-Boc)。 3-{ 對 -[2-(N- 乙基 -N-3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基胺甲醯基 ) 乙基 ] 苯基 }-2-[4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 丙酸之製備

向[4,10-雙(三級丁氧基羰基甲基)-7-(2-{對 -[2-({17-[(三級丁基)(乙基)(氧基羰基胺基)]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}-N-乙基胺甲醯基)乙基]苯基}-1-甲氧基羰基乙基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(166 mg，143 μmol)於1,4-二㗁烷(2.5 mL)及H₂O (2.5 mL)中之溶液中添加LiOH (17.1 mg，5 eq.，713 μmol)。將混合物攪拌隔夜並濃縮至乾。接著，將粗物質懸浮於MeOH中且過濾以移除鹽。m/z實驗值= 1153.4 (M+H), 527.4 (M+2H-Boc)。濃縮濾液且將其溶解於CH₂Cl₂(2 mL)中，隨後添加TFA (0.5 mL)。攪拌1小時後，減壓移除溶劑且所得胺不經純化即用於下一步驟。 3-( 對 -{2-[(17-{N- 乙基 [4-(2,3,5,6- 四氟苯氧基羰基 ) 丁基 ]- 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )-N- 乙基胺甲醯基 ] 乙基 } 苯基 )-2-[4,7,10- 參 ( 羧基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 丙酸 ( 化合物 2-25) 之製備

向3-{對 -[2-(N-乙基-N-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基胺甲醯基)乙基]苯基}-2-[4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]丙酸(204 mg，194 µmol)於DMF (5 mL)中之溶液中添加雙-TFP-己二酸酯(171 mg，2 eq.，387 µmol)及三乙胺(81 µL，3 eq.，581 µmol)。將所得溶液攪拌隔夜並濃縮至乾，得到粗醯胺。m/z實驗值= 665.3 (M+2H), 443.0 (M+3H)。接著，將粗物質溶解於DCM (1 mL)中且添加TFA (2 mL)。攪拌72小時後，將溶液濃縮至乾且將粗混合物使用製備型HPLC (55% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(15.7 mg，經4個步驟7%產率)。m/z實驗值= 1161.2 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.21 (d,J= 7.6 Hz, 3H), 7.11 (d,J= 5.9 Hz, 2H), 4.74 (s, 14H), 4.67 (s, 6H), 4.21 (s, 1H), 3.81 (s, 4H), 3.67 - 3.46 (m, 23H), 3.43 (s, 1H), 3.40 - 3.15 (m, 3H), 3.08 (s, 1H), 2.96 (s, 2H), 2.79 (t,J= 7.0 Hz, 2H), 2.71 (s, 1H), 2.60 (d,J= 6.0 Hz, 2H), 2.38 (s, 2H), 2.31 (d,J= 16.8 Hz, 1H), 1.68 (s, 2H), 1.60 (s, 3H), 1.50 (s, 1H), 1.06 (t,J= 7.3 Hz, 2H), 0.93 (ddd,J= 26.7, 13.8, 7.1 Hz, 4H)。¹⁹F NMR (377 MHz, D₂O) δ -140.02 (dt,J= 18.0, 10.2 Hz), -154.30 - -154.41 (m)。實例 18. 化合物 1-20 之合成 1-{2-[2-(2- 疊氮基乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 }-2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙烷之製備

將17-疊氮基-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(100 mg，325 μmol)溶解於CH₂Cl₂(3.25 mL)中且添加三乙胺(90.7 μL，2 eq.，651 μmol)及MsCl (50.4 μL，2 eq.，651 μmol)。將反應混合物攪拌1.5小時，濃縮至乾，且將粗殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之20% MeOH)純化，得到標題化合物(125 mg，定量)。m/z實驗值= 358.0 (M+H-N₂), 408.0 (M+Na), 403.1 (M+NH₄)。 1-17- 疊氮基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 1- 乙基苯基甲烷胺基甲酸酯之製備

向1-{2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙烷(256 mg，664 µmol)於ACN (10 mL)中之溶液中添加三乙胺(278 µL，3 eq.，1.99 mmol)。在冰-水浴中冷卻混合物，隨後添加70%v/v乙胺(602 µL，11 eq.，7.57 mmol)。將溶液在75℃下攪拌隔夜並濃縮至乾，得到所需取代產物。m/z實驗值= 335.1 (M+H)。將此粗物質溶解於CH₂Cl₂(10 mL)中且在0℃下添加三乙胺(185 µL，2 eq.，1.33 mmol)及氯甲酸苯基甲酯(190 µL，2 eq.，1.33 mmol)。接著，濃縮反應混合物且藉由矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10-15% MeOH)純化，得到呈無色油狀之產物(283 mg，經2個步驟91%產率)。m/z實驗值= 469.1 (M+H)。 1-17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 1- 丙基苯基甲烷胺基甲酸酯之製備

向1-17-疊氮基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基1-乙基苯基甲烷胺基甲酸酯(283 mg，604 µmol)於無水THF (2.05 mL)中之溶液中添加PPh₃(190 mg，1.2 eq.，725 µmol)。攪拌2小時後，添加H₂O (54.4 µL，5 eq.，3.02 mmol)且將混合物升溫至55℃。將溶液在此溫度下攪拌2小時，隨後移除溶劑且使用胺基官能化管柱層析法(DCM中之7% MeOH)純化所得殘餘物，得到標題化合物(265 mg，定量)。m/z實驗值= 443.2 (M+H)。 [(S)-2-{[ 對 -(2-{N-17-[( 苯甲基 )( 乙基 )( 氧基羰基胺基 )]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 } 乙基 ) 苯基 ] 甲基 }-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

向3-(對 -{[(S)-1,4,7,10-肆(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-2-環十二烷基]甲基}苯基)丙酸(中間體 C，50 mg，63.2 µmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (48.1 mg，2 eq.，126 µmol)及DIPEA (44 µL，4 eq.，253 µmol)。攪拌5分鐘後，添加1-17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基1-丙基苯基甲烷胺基甲酸酯(43.3 mg，1.5 eq.，94.8 µmol)於CH₂Cl₂(3 mL)中之溶液。攪拌2小時後，將溶液濃縮至乾，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10-20% MeOH)純化，得到標題化合物(63.2 mg，82%產率)。m/z實驗值= 1215.6 (M+H)。 [(S)-2-({ 對 -[2-(N-17-{N- 乙基 [4-(2,3,5,6- 四氟苯氧基羰基 ) 丁基 ] 羰基胺基 )-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 ) 乙基 ] 苯基 } 甲基 )-4,7,10- 參 ( 羧基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸 ( 化合物 1-20) 之製備

向[(S)-2-{[對 -(2-{N-17-[(苯甲基)(乙基)(氧基羰基胺基)]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基胺甲醯基}乙基)苯基]甲基}-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(88.2 mg，72.6 µmol)於THF (726 µL，8.92 mmol)中之溶液中添加10%w/w Pd/C (11.6 mg，0.15 eq.，10.9 µmol)及氨—甲酸(1/1) (22.9 mg，5 eq.，363 µmol)。將混合物攪拌隔夜，透過矽藻土過濾，並濃縮至乾。將此物質溶解於DMF (5.38 mL)中且添加己二酸二-2,3,5,6-四氟苯酯(46.4 mg，1.5 eq.，105 µmol)及三乙胺(29.3 µL，3 eq.，210 µmol)。將混合物攪拌3小時並濃縮至乾，得到完全保護之中間體。m/z實驗值= 679.5 (M+2H)。將粗物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (2 mL)。將溶液濃縮至乾，且將殘餘物使用製備型HPLC (40% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈白色固體狀之產物(13.7 mg，經3個步驟17%)。m/z實驗值= 1133.4 (M+H)及567.4 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.24 (p,J= 9.0 Hz, 1H), 7.15 (s, 4H), 4.11 - 3.77 (m, 5H), 3.75 - 3.47 (m, 27H), 3.47 - 3.33 (m, 3H), 3.33 - 3.09 (m, 9H), 3.00 (t,J= 12.0 Hz, 6H), 2.82 (t,J= 7.0 Hz, 3H), 2.73 (s, 2H), 2.43 (dt,J= 26.3, 7.3 Hz, 6H), 1.67 (dq,J= 30.7, 7.6 Hz, 5H), 1.14 - 1.04 (m, 2H), 1.04 - 0.95 (m, 1H)。¹⁹F NMR (377 MHz, D₂O) δ -139.99 (dt,J= 21.2, 10.0 Hz), -154.35 (dd,J= 22.1, 9.8 Hz)。實例 19. 化合物 1-21 之合成 5,8,11,14,17- 五氧雜 -2- 氮雜十九烷 -19- 醇之製備

將溴-PEG6-醇(3.03 g，8.77 mmol)及甲胺(1.64 mL，30 eq.，263 mmol)混合在一起並在100℃下攪拌16小時。冷卻至室溫後，在真空中移除溶劑，得到呈油狀之粗品，將其溶解於MeCN (10 mL)中並添加K₂CO₃。將所得混合物在室溫下攪拌1小時，經矽藻土過濾，且減壓濃縮濾液，得到標題化合物(2.59 g，定量產率)。m/z實驗值= 296.2 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.72 - 3.69 (m, 4 H), 3.63-3.62 (m, 17H), 3.60 - 3.57 (m. 3H), 2.93 (t,J= 5.01 Hz, 2H), 2.54 (s, 3H)。 N-(17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )-N-( 甲基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

將Boc₂O (3.08 mL，1.5 eq.,13.2 mmol)於EtOH (10 mL)中之溶液添加至5,8,11,14,17-五氧雜-2-氮雜十九烷-19-醇(2.59 g，8.77 mmol)及三乙胺(1.85 mL，1.5 eq.，13.2 mmol)於EtOH (65 mL)中之溶液中。將反應混合物攪拌5小時，減壓濃縮，且將粗物質藉由正相管柱層析法(3/1己烷/EtOAc中之15-60% EtOH-2% NH₄OH)純化，得到呈透明油狀之標題產物(1.41 g，41%產率)。m/z實驗值= 418.3 (M+Na), 296.2 (M+H-Boc)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3.48 - 3.45 (m, 21H), 3.27 (m, 2H), 2.78 (br. S, 3H), 2.52 (d,J= 4.66 Hz, 1H), 1.76 (s, 1H), 1.37 (s, 9H)。 甲基 (5,8,11,14,17- 五氧雜 -2- 氮雜十九烷 -19- 基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，將甲烷磺醯氯(88.3 μL，1.8 eq.，1.14 mmol)逐滴添加至N-(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)-N-(甲基)胺基甲酸三級丁酯(250 mg，0.632 mmol)及三乙胺(264 μL，3 eq.，1.90 mmol)於CH₂Cl₂(11 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物升溫至室溫並攪拌1小時，用NaHCO₃飽和水溶液洗滌且用CH₂Cl₂萃取兩次。將合併之有機層經無水Na₂SO₄乾燥，過濾且減壓移除溶劑，得到甲磺酸酯。m/z實驗值= 497.2 (M+Na), 374.2 (M+H-Boc)。將粗甲磺酸酯溶解於甲胺(2.36 mL，30 eq.，18.9 mmol)中並將混合物加熱至80℃，保持16小時。冷卻至室溫後，在真空中移除揮發性物質，得到呈油狀之粗品，將其懸浮於MeCN (5 mL)中且添加K₂CO₃。將所得混合物在室溫下攪拌1小時，經矽藻土過濾且減壓濃縮濾液。將所得混合物藉由正相管柱層析法(於3/1己烷/ EtOAc中之15-40% EtOH-2% NH₄OH)純化，得到呈油狀之標題化合物(150 mg，2個步驟58%產率)。m/z實驗值= 409.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.63 - 3.55 (m, 20H), 3.36 (br. s, 2H), 2.88 (s, 3H), 2.72 (t,J= 5.16 Hz, 2H), 2.42 (s, 3H), 1.63 (br. s, 1H), 1.43 (s, 9H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(2,2,5,23- 四甲基 -4,24- 二側氧基 -3,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5,23- 二氮雜二十六烷 -26- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

在氮氣下，向(S)-3-(4-((1,4,7,10-肆(2-(三級丁氧基)-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基)甲基)苯基)丙酸(中間體 C，225 mg，256 µmol)於DMF (3 mL)中之溶液中添加HATU (140 mg，1.4 eq.，358 µmol)及DIPEA (180 µL，4 eq.，1.03 mmol)。將混合物在氮氣下攪拌20分鐘，隨後將甲基(5,8,11,14,17-五氧雜-2-氮雜十九烷-19-基)胺基甲酸三級丁酯(120 mg，1.15 eq.，294 µmol)於DMF (3 mL)中之溶液中緩慢添加至混合物中。在氮氣下，將反應混合物在室溫下攪拌1小時，隨後將水(2 mL)及DCM (10 mL)添加至反應混合物中。對有機相進行萃取，用水(15 mL × 2)及鹽水(15 mL × 2)洗滌，經無水NaSO₄乾燥，過濾並減壓濃縮。將粗物質藉由正相管柱層析法(DCM中之0-15% MeOH)純化，得到呈黏性褐色油狀之標題化合物(190 mg，63%產率)。m/z實驗值= 541.5 (M+2H-Boc)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,22- 二甲基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(2,2,5,23-四甲基-4,24-二側氧基-3,8,11,14,17,20-六氧雜-5,23-二氮雜二十六烷-26-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(190 mg，161 µmol)於DCM (6 mL)中之溶液中添加TFA (600 µL，48 eq.，7.75 mmol)。在氮氣下，將溶液在室溫下攪拌1小時，隨後減壓移除溶劑，得到呈褐色油狀之粗胺且不經進一步純化即直接用於下一步驟中。m/z實驗值= 541.5 (M+2H), 361.4 (M+3H)。將此粗物質溶解於DMF (4 mL)中且添加己二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(213 mg，3 eq.，483 µmol)及DIPEA (140 µL，5 eq.，800 µmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，減壓濃縮，且將殘餘物用正相管柱層析法(DCM中之0-10% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(200 mg，經2個步驟92%產率)。m/z實驗值= 679.5 (M+2H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,22- 二甲基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 --2,2,2- 三氟乙酸 (1/2) ( 化合物 1-21)

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,22-二甲基-3,23,28-三側氧基-28-(2,3,5,6-四氟苯氧基)-7,10,13,16,19-五氧雜-4,22-二氮雜二十八烷基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(200 mg，147 µmol)於DCM (2.50 mL)中之溶液中添加TFA (5.00 mL)。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜，減壓濃縮，且將殘餘物使用製備型HPLC (水-0.1% TFA中之10-100% ACN-0.1% TFA)純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(29.0 mg，14%產率)。m/z實驗值= 567.3 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.92 (tt,J= 10.9, 7.5 Hz, 1H), 7.17 (d,J= 4.7 Hz, 4H), 3.94 (br. s, 3H), 3.65 (br. s, 6H), 3.55 - 3.33 (m, 32H), 3.04 (s, 3H), 2.95 (d,J= 9.7 Hz, 9H), 2.84 - 2.70 (m, 9H), 2.67 - 2.50 (m, 2H), 2.41 - 2.30 (m, 2H), 1.67 (h,J= 6.9 Hz, 2H), 1.56 (p,J= 7.2 Hz, 2H)。¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) δ -73.6, -139.3, -153.6。實例 20. 化合物 1-37 之合成 2,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5- 氮雜二十二烷 -22- 醇之製備

在氮氣下，向溴-PEG6-醇(2.00 g，5.79 mmol)於DMF (29 mL)中之溶液中添加三乙胺(2.43 mL，3 eq.，17.4 mmol)及2-甲氧基乙胺(2.57 mL，5 eq.，29.0 mmol)。將反應物加熱至80℃隔夜，減壓濃縮，且再懸浮於MeCN (5 mL)中。將K₂CO₃(5 g) 添加至溶液中，並將混合物在室溫下攪拌2小時，隨後透過矽藻土過濾，減壓濃縮，且將產物使用正相管柱層析法(DCM中之0-80% MeOH-1%NH₄OH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(1.40 g，71%產率)。m/z實驗值= 340.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 3.68 - 3.64 (m, 21H), 3.66 - 3.55 (m, 4H), 3.39 (s, 3H), 3.06 (td,J= 5.2, 2.7 Hz, 4H)。 (17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )(2- 甲氧基乙基 ) 胺基甲酸苯甲酯之製備

在氮氣下，在0℃下經20分鐘向2,8,11,14,17,20-六氧雜-5-氮雜二十二烷-22-醇(1.40 g，4.12 mmol)於EtOH (21 mL)中之溶液中逐滴添加三乙胺(2.31 mL，4 eq.，16.5 mmol)及氯甲酸苯甲酯(900 µL，1.5 eq.，6.15 mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌1小時，隨後使其升溫至室溫。攪拌1小時後，將水(5 mL)添加至反應混合物中並攪拌15分鐘，減壓濃縮，且將其再懸浮於DCM中，用NaHCO₃飽和水溶液、H₂O及鹽水洗滌。將有機層合併，經無水NaSO₄乾燥，過濾並減壓濃縮。將殘餘物藉由正相管柱層析法(DCM中之0-30% MeOH)純化，得到呈黃色液體狀之標題化合物(1.45 g，74%產率)。m/z實驗值= 474.2 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.35 (m, 5H), 5.13 (s, 2H), 3.73 - 3.49 (m, 29H), 3.31 (d,J= 16.5 Hz, 3H)。 (2,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5- 氮雜二十二烷 -22- 基 )(2- 甲氧基乙基 ) 胺基甲酸苯甲酯之製備

向(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)(2-甲氧基乙基)胺基甲酸苯甲酯(1.45 g，3.06 mmol)於DCM (30 mL)中之溶液中添加三乙胺(1.30 mL，3 eq.，9.28 mmol)及甲烷磺醯氯(400 µL，1.7 eq.，5.21 mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌30分鐘，隨後使其升溫至室溫，再保持一小時。將反應混合物用飽和碳酸氫鈉水溶液/水(1/1，v/v)之混合物稀釋且用DCM萃取兩次。將合併之有機相用鹽水洗滌，經NaSO₄乾燥，過濾並在真空中濃縮，得到呈褐色固體及褐色液體之混合物形式的甲磺酸酯。m/z實驗值= 552.5 (M+H), 574.3 (M+Na)。將粗甲磺酸酯溶解於DMF (30 mL)中且添加三乙胺(1.30 mL，3 eq.，9.28 mmol)及2-甲氧基乙胺(1.36 mL，5 eq.，15.3 mmol)。將反應混合物在80℃下攪拌過夜，減壓濃縮，且將殘餘物藉由正相管柱層析法(於DCM中之0-20% MeOH-1% NH₄OH)純化。將所收集之產物與K₂CO₃(2 g)在MeCN (10 mL)中攪拌2小時，透過矽藻土過濾，減壓濃縮，得到呈透明黃色油狀之標題化合物(1.10 g，68%產率)。m/z實驗值= 531.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.37 - 7.31 (m, 5H), 5.12 (s, 2H), 3.63 - 3.49 (m, 32H), 3.35 - 3.30 (m, 2H), 2.78 - 2.75 (t,J= 5.3 Hz, 4HH)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(5-(( 苯甲氧基 ) 羰基 )-23-(2- 甲氧基乙基 )-24- 側氧基 -2,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5,23- 二氮雜二十六烷 -26- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向(S)-3-(4-((1,4,7,10-肆(2-(三級丁氧基)-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基)甲基)苯基)丙酸(中間體 C，300 mg，341 µmol)及HATU (268 mg，2 eq.，683 µmol)於DMF (8 mL)中之溶液中添加DIPEA (239 µL，4 eq.，1.37 mmol)以及(2,8,11,14,17,20-六氧雜-5-氮雜二十二烷-22-基)(2-甲氧基乙基)胺基甲酸苯甲酯(208 mg，1.15 eq.，393 µmol)於DMF (8 mL)中之溶液。在氮氣下，將反應混合物在室溫下攪拌1.5小時，接著藉由添加H₂O (5 mL)及DCM (10 mL)淬滅。將有機相用H₂O及鹽水洗滌，經無水NaSO₄乾燥，過濾並減壓濃縮。將粗物質藉由矽膠管柱層析法(DCM中之0-15% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(319 mg，72%產率)。m/z實驗值= 652.5 (M+2H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(23-(2- 甲氧基乙基 )-24- 側氧基 -2,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5,23- 二氮雜二十六烷 -26- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(5-((苯甲氧基)羰基)-23-(2-甲氧基乙基)-24-側氧基-2,8,11,14,17,20-六氧雜-5,23-二氮雜二十六烷-26-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(319 mg，245 µmol)於THF (2.45 mL)中之溶液中添加Pd/C (10% w/w，38.9 mg，0.15 eq.，36.7 µmol)。經由氣球將氫氣添加至反應物中且將溶液攪拌40小時。將反應混合物透過矽藻土過濾，減壓濃縮，得到呈褐色油狀之標題化合物，其不經進一步純化即用於下一步驟(220 mg，77%產率)。m/z實驗值= 585.5 (M+2H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(23-(2- 甲氧基乙基 )-24- 側氧基 -5-(6- 側氧基 -6-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 ) 己醯基 )-2,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5,23- 二氮雜二十六烷 -26- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(23-(2-甲氧基乙基)-24-側氧基-2,8,11,14,17,20-六氧雜-5,23-二氮雜二十六烷-26-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(200 mg，171 µmol)於DMF (4.2 mL)中之溶液中添加己二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(227 mg，3 eq.，513 µmol)及DIPEA (150 µL，5 eq.，855 µmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，濃縮至乾，且用正相管柱層析法(DCM中之0-10% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(84.0 mg，34%產率)。m/z實驗值= 723.5 (M+2H), 482.9 (M+3H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(23-(2- 甲氧基乙基 )-24- 側氧基 -5-(6- 側氧基 -6-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 ) 己醯基 )-2,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5,23- 二氮雜二十六烷 -26- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 --2,2,2- 三氟乙酸 (1/1) ( 化合物 1-37) 之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(23-(2-甲氧基乙基)-24-側氧基-5-(6-側氧基-6-(2,3,5,6-四氟苯氧基)己醯基)-2,8,11,14,17,20-六氧雜-5,23-二氮雜二十六烷-26-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(84.0 mg，58.1 µmol)於DCM (2.00 mL)中之溶液中添加TFA (4.00 mL)。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜，減壓濃縮，且將殘餘物使用製備型HPLC (水-0.1% TFA中之10-100% ACN-0.1% TFA)純化，得到呈灰白色固體狀之標題化合物(33.0 mg，43%產率)。m/z實驗值= 611.4 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.92 (ddd,J= 18.3, 10.9, 7.4 Hz, 1H), 7.12 (s, 4H), 3.88 (s, 4H), 3.53 - 3.34 (m, 29H), 3.31 (s, 20H), 3.23 (s, 1H), 3.20 (s, 5H), 2.99 (d,J= 27.5 Hz, 4H), 2.76 (q,J= 8.0 Hz, 4H), 2.60 (t,J= 7.1 Hz, 2H), 2.37 (q,J= 7.4 Hz, 2H), 1.66 (p,J= 7.1 Hz, 2H), 1.57 (q,J= 7.4 Hz, 2H), 1.22 (s, 1H)。¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) δ -73.4, -139.3, -153.6。實例 21. 化合物 1-38 之合成 3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一碳 -20- 烯 -1- 醇之製備

在氮氣下，向溴-PEG6-醇(2.00 g，5.79 mmol)及三乙胺(2.40 mL，3 eq.，17.1 mmol)於無水DMF (29.0 mL)中之溶液中添加烯丙基胺(2.17 mL，5 eq.，29.0 mmol)。將反應混合物加熱至80℃，攪拌隔夜，並減壓濃縮。將殘餘物再懸浮於MeCN (10 mL)中且將K₂CO₃(5 g)添加至燒瓶中。將混合物在室溫下攪拌2小時，透過矽藻土過濾並減壓濃縮。將粗物質使用正相管柱層析法(DCM中之0-80% MeOH-1%NH₄OH)純化，得到呈深褐色油狀之3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一碳-20-烯-1-醇(1.25 g，67%產率)。m/z實驗值= 322.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 5.92 (ddt,J= 17.2, 10.3, 6.5 Hz, 1H), 5.40 - 5.30 (m, 2H), 3.68 - 3.64 (m, 21H), 3.56 (t,J= 4.8 Hz, 2H), 3.46 (d,J= 6.5 Hz, 2H), 2.97 (t,J= 5.2 Hz, 2H)。 烯丙基 (17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺基甲酸苯甲酯之製備

在氮氣下，在0℃下經20分鐘向3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一碳-20-烯-1-醇(1.24 g，1 eq.，3.86 mmol)及三乙胺(2.16 mL，4 eq.，15.4 mmol)於EtOH (20 mL)中之溶液中逐滴添加氯甲酸苯甲酯(850 µL，1.5 eq.，5.79 mmol)。接著，將反應混合物在0℃下攪拌1小時，隨後使其升溫至室溫。在室溫下再攪拌1小時後，將H₂O (5 mL)添加至反應混合物中並攪拌15分鐘。接著，減壓濃縮反應混合物，且將粗物質藉由矽膠管柱層析法(DCM中之0-10% MeOH)純化，得到呈黃色液體狀之烯丙基(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺基甲酸苯甲酯(1.14 g，65%產率)。m/z實驗值= 456.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.36 - 7.32 (m, 5H), 5.87 - 5.77 (m, 1H), 5.18 - 5.13 (m, 4H), 3.99 (d,J= 5.3 Hz, 2H), 3.67 - 3.54 (m, 23H), 3.45 (t,J= 5.6 Hz, 2H)。 烯丙基 (3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一碳 -20- 烯 -1- 基 ) 胺基甲酸苯甲酯之製備

在氮氣下，在0℃下向烯丙基(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺基甲酸苯甲酯(1.14 g，2.50 mmol)於DCM (25 mL)中之溶液中添加三乙胺(1.05 mL，3 eq.，7.51 mmol)、甲烷磺醯氯(330 µL，1.7 eq.，4.25 mmol)。將反應混合物在0℃下攪拌30分鐘，隨後使其升溫至室溫。再經過一小時後，將反應混合物用NaHCO₃飽和水溶液稀釋且用DCM萃取兩次。將合併之有機相用鹽水洗滌，用無水NaSO₄乾燥，過濾並減壓濃縮，得到呈白色固體與褐色液體之混合物形式的甲磺酸酯。m/z實驗值= 534.3 (M+H)。將此粗甲磺酸酯溶解於DMF (25 mL)中，隨後添加三乙胺(1.06 mL，3 eq.，7.53 mmol)及烯丙基胺(950 µL，5 eq.，12.7 mmol)。將反應混合物在80℃下攪拌隔夜，減壓濃縮且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(DCM中之0-10% MeOH-1% NH₄OH)純化，得到呈黃色液體狀之烯丙基(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一碳-20-烯-1-基)胺基甲酸苯甲酯(750 mg，經2個步驟60%產率)。m/z實驗值= 495.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.36 - 7.31 (m, 5H), 5.97 - 5.77 (m, 2H), 5.39 - 5.29 (m, 2H), 5.15 - 5.12 (m, 4H), 3.99 (d,J= 5.5 Hz, 2H), 3.67 - 3.56 (m, 21H), 3.45 (t,J= 5.6 Hz, 4H), 2.96 (t,J= 5.0 Hz, 2H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,22- 二烯丙基 -3,23- 二側氧基 -1- 苯基 -2,7,10,13,16,19- 六氧雜 -4,22- 二氮雜二十五烷 -25- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

在氮氣下，向(S)-3-(4-((1,4,7,10-肆(2-(三級丁氧基)-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基)甲基)苯基)丙酸(中間體 C，500 mg，569 µmol)及HATU (446 mg，2 eq.，1.14 mmol)於DMF (5 mL)中之溶液中添加DIPEA (398 µL，4 eq.，2.28 mmol)。在氮氣下，將混合物攪拌20分鐘，隨後在氮氣下將烯丙基(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一碳-20-烯-1-基)胺基甲酸苯甲酯(324 mg，1.15 eq.，654 µmol)於DMF (5 mL)中之溶液中緩慢添加至該混合物中。在氮氣下，將反應混合物在室溫下攪拌2小時，接著將水(5 mL)及DCM (10 mL)添加至反應混合物中。將有機相再用水(20 mL × 2)及鹽水(20 mL × 2)洗滌，經無水NaSO₄乾燥，過濾並減壓濃縮。將粗物質藉由矽膠管柱層析法(DCM中之0-15% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(494 mg，69%產率)。m/z實驗值= 634.6 (M+H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(4- 烯丙基 -3- 側氧基 -7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十五碳 -24- 烯 -1- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

在氮氣下，向2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,22-二烯丙基-3,23-二側氧基-1-苯基-2,7,10,13,16,19-六氧雜-4,22-二氮雜二十五烷-25-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(494 mg，390 µmol)於DMA (1.56 mL)中之溶液中添加K₃PO₄(331 mg，4 eq.，1.56 mmol)及2-巰基乙醇(55.2 µL，2 eq.，779 µmol)。將反應混合物在70℃下攪拌24小時，冷卻至室溫且藉由添加H₂O (5 mL)淬滅。將產物用DCM萃取，且將合併之有機相用水(10 mL × 2)及鹽水(10 mL × 2)洗滌，經無水NaSO₄乾燥，過濾並減壓濃縮。將粗物質使用矽膠管柱層析法(DCM中之0-20% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(140 mg，32%產率)。m/z實驗值= 567.5 (M+2H), 378.7 (M+3H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,22- 二烯丙基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(4-烯丙基-3-側氧基-7,10,13,16,19-五氧雜-4,22-二氮雜二十五碳-24-烯-1-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(185 mg，163 µmol)於無水DMF (4 mL)中之溶液中添加己二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(217 mg，3 eq.，490 µmol)及DIPEA (143 µL，5 eq.，816 µmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，濃縮至乾，且將殘餘物用正相管柱層析法(DCM中之0-10% MeOH)純化，得到呈透明褐色油狀之標題化合物(141 mg，61%產率)。m/z實驗值= 705.5 (M+2H), 470.8 (M+3H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,22- 二烯丙基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 --2,2,2- 三氟乙酸 (1/1) ( 化合物 1-38) 之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(4,22-二烯丙基-3,23,28-三側氧基-28-(2,3,5,6-四氟苯氧基)-7,10,13,16,19-五氧雜-4,22-二氮雜二十八烷基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(141 mg，100 µmol)於DCM (2.00 mL)中之溶液中添加TFA (4.00 mL)。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜，減壓濃縮且使用製備型HPLC (水-0.1% TFA中之10-100% ACN-0.1% TFA)純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(28.0 mg，22%產率)。m/z實驗值= 593.4 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.92 (tt,J= 10.9, 7.4 Hz, 1H), 7.13 (d,J= 5.4 Hz, 4H), 5.90 - 5.61 (m, 1H), 5.17 - 4.97 (m, 5H), 3.93 (dd,J= 16.6, 8.5 Hz, 6H), 3.54 - 3.45 (m, 21H), 3.44 - 3.15 (m, 28H), 2.96 (s, 4H), 2.77 (td,J= 7.1, 3.5 Hz, 4H), 2.64 (dd,J= 8.7, 6.0 Hz, 1H), 2.56 - 2.50 (m, 1H), 2.42 (t,J= 7.2 Hz, 1H), 2.30 (t,J= 7.0 Hz, 1H), 1.73 - 1.54 (m, 4H)。¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) δ -73.5, -139.3, -153.6。實例 22. 化合物 1-39 之合成 1- 苯基 -5,8,11,14,17- 五氧雜 -2- 氮雜十九烷 -19- 醇之製備

在氮氣下，向溴-PEG6-醇(2.00 g，5.79 mmol)及三乙胺(2.40 mL，3 eq.，17.1 mmol)於無水DMF (29.0 mL)中之溶液中添加苯甲胺(3.20 mL，5 eq.，29.0 mmol)。將反應混合物加熱至80℃且在冷凝器存在下攪拌隔夜。減壓移除溶劑，且將殘餘物再懸浮於10 mL MeCN中。將約5 g碳酸鉀添加至燒瓶中，且將混合物在室溫下攪拌2小時，隨後透過矽藻土過濾。減壓濃縮濾液，且將產物使用正相管柱層析法(先用DCM中之0-80% MeOH且接著用3:1己烷:EtOAc中之10-90% EtOH-2%NH₄OH)純化，得到呈透明油狀之標題化合物(1.08 g，50%產率)。m/z實驗值= 372.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ 7.30 - 7.27 (m, 4H), 7.22 (s, 1H), 4.60 (s, 1H), 3.69 (s, 2H), 3.49 - 3.45 (m, 21H), 3.40 (t,J= 5.4 Hz, 2H), 2.62 (t,J= 5.7 Hz, 2H), 2.01 (br s, 1H)。 苯甲基 (17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

將Boc₂O (1.03 mL，1.5 eq.，4.38 mmol)於EtOH (10 mL)中之溶液中添加至1-苯基-5,8,11,14,17-五氧雜-2-氮雜十九烷-19-醇(1084 mg，1.5 eq.，2.92 mmol)及三乙胺(616 μL，1.5 eq.，4.38 mmol)於EtOH (15 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌5小時，接著減壓移除溶劑。將粗物質藉由正相管柱層析法(3:1己烷:EtOAc中之10-50% EtOH-2% NH₄OH)純化且得到呈透明油狀之標題產物(1.12 g，82%產率)。m/z實驗值= 489.6 (M+NH₄), 372.5 (M+H-Boc)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.31-7.21 (m, 5H), 4.50 (s, 2H), 3.70 (m, 2H), 3.63 - 3.58 (m, 19H), 3.41 (s, 1H), 3.30 (s, 1H), 2.81 (s, 1H), 2.19 (s, 1H), 1.45 (d,J= 24.5 Hz, 9H)。 苯甲基 (6,9,12,15,18- 五氧雜 -3- 氮雜二十烷 -20- 基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，將甲烷磺醯氯(332 μL，1.8 eq.，4.28 mmol)逐滴添加至苯甲基(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺基甲酸三級丁酯(1.12 g，2.38 mmol)及三乙胺(995 μL，3 eq.，7.14 mmol)於DCM(41 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物升溫至室溫並攪拌1小時。接著，將反應物用NaHCO₃飽和水溶液(40 mL)洗滌，且將水層用DCM (2×20 mL)萃取兩次。將有機層合併，經無水Na₂SO₄乾燥，過濾且減壓移除溶劑，得到甲磺酸酯。m/z實驗值= 567.4 (M+NH₄)。將粗甲磺酸酯溶解於MeOH (2 mL)中且添加乙胺(5.77 mL，30 eq.，71.5 mmol)。將反應物在80℃下加熱16小時，冷卻至室溫，且在真空中移除揮發性物質，得到呈油狀之粗品。將此粗混合物再懸浮於MeCN (10 mL)中，接著添加K₂CO₃。將反應混合物攪拌1小時，經矽藻土墊過濾且減壓蒸發濾液，得到標題化合物，其不經進一步純化即使用(1.19 g，100%產率)。m/z實驗值= 499.6 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.31 - 7.21 (m, 5H), 4.50 (s, 2H), 3.63 - 3.56 (m, 20H), 3.40 (s, 1H), 3.30 (s, 1H), 2.78 (t,J= 5.22 Hz, 2H), 2.65 (q,J= 7.15 Hz, 2H), 1.48-1.42 (m, 9H), 1.10 (t,J= 7.14 Hz, 3H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(5- 苯甲基 -23- 乙基 -2,2- 二甲基 -4,24- 二側氧基 -3,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5,23- 二氮雜二十六烷 -26- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

在氮氣下，向(S)-3-(4-((1,4,7,10-肆(2-(三級丁氧基)-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基)甲基)苯基)丙酸(中間體 C，300 mg，303 µmol)及HATU (167 mg，1.4 eq.，425 µmol)於無水DMF (4 mL)中之溶液中添加DIPEA (210 µL，4 eq.，1.20 mmol)。攪拌20分鐘後，在氮氣下將苯甲基(6,9,12,15,18-五氧雜-3-氮雜二十烷-20-基)胺基甲酸三級丁酯(174 mg，1.15 eq.，349 µmol)於無水DMF (4 mL)中之溶液中緩慢添加至混合物中。在氮氣下，將反應混合物在室溫下攪拌1小時，隨後將H₂O (5 mL)及DCM (15 mL)添加至反應混合物中。收集有機相且用水(15 mL × 2)及鹽水(15 mL × 2)洗滌，經無水NaSO₄乾燥，過濾並減壓濃縮。將粗品藉由正相管柱層析法(DCM中之0-20% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(203 mg，53%產率)。m/z實驗值= 586.5 (M+2H-Boc)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(22- 苯甲基 -4- 乙基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(5-苯甲基-23-乙基-2,2-二甲基-4,24-二側氧基-3,8,11,14,17,20-六氧雜-5,23-二氮雜二十六烷-26-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(203 mg，160 µmol)於DCM (6 mL)中之溶液中添加TFA (600 µL，49 eq.，7.75 mmol)。在氮氣下，將溶液在室溫下攪拌1小時，隨後減壓移除溶劑，得到呈黃色黏性油狀之產物。m/z實驗值= 586.5 (M+2H), 391.4 (M+3H)。將此粗產物溶解於無水DMF (4.5 mL)中及己二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(212 mg，3 eq.，479 µmol)及DIPEA (140 µL，5.1 eq.，800 µmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，濃縮至乾，且將殘餘物用正相管柱層析法(DCM中之0-10% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(200 mg，經2個步驟87%產率)。m/z實驗值= 724.5 (M+2H), 483.4 (M+3H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(22- 苯甲基 -4- 乙基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 --2,2,2- 三氟乙酸 (1/2) ( 化合物 1-39) 之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(22-苯甲基-4-乙基-3,23,28-三側氧基-28-(2,3,5,6-四氟苯氧基)-7,10,13,16,19-五氧雜-4,22-二氮雜二十八烷基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(200 mg，145 µmol)於CH₂Cl₂(2.0 mL)中之溶液中添加TFA (4.00 mL)。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜，減壓濃縮，且使用製備型HPLC (水-0.1% TFA中之10-100% ACN-0.1% TFA)純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(46.0 mg，23%產率)。m/z實驗值= 612.4 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.92 (ddd,J= 18.3, 10.9, 7.5 Hz, 1H), 7.34 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 7.28 (dd,J= 8.1, 6.6 Hz, 2H), 7.19 (dt,J= 11.7, 5.9 Hz, 7H), 4.63 (s, 1H), 4.55 (s, 1H), 3.93 (s, 2H), 3.83 - 3.49 (m, 20H), 3.49 - 3.33 (m, 30H), 3.27 (q,J= 8.8 Hz, 2H), 2.99 (d,J= 39.7 Hz, 3H), 2.75 (dq,J= 21.0, 7.0 Hz, 5H), 2.66 - 2.51 (m, 2H), 2.42 - 2.16 (m, 1H), 1.65 (ddd,J= 29.7, 14.5, 6.9 Hz, 4H), 0.99 (dt,J= 20.3, 7.0 Hz, 3H)。¹⁹F NMR (DMSO-d₆, 376 MHz) δ -73.7, -139.3, -153.6。實例 23. 1-40 之合成 1-(3-( 苯甲氧基 ) 苯基 )-5,8,11,14,17- 五氧雜 -2- 氮雜十九烷 -19- 醇之製備

在圓底燒瓶中添加無水DMF (21.7 mL)中之(3-(苯甲氧基)苯基)甲胺鹽酸鹽(5.71 g，5 eq.，21.7 mmol)及三乙胺(1.83 mL，3 eq.，13.0 mmol)。將溶液在室溫下攪拌15分鐘，隨後將溴-PEG6-醇(1.50 g，4.34 mmol)添加至混合物中。將反應物加熱至80℃並攪拌18小時。在真空中移除溶劑，得到呈油狀之粗品，將其再懸浮於MeCN (5 mL)中，隨後添加K₂CO₃且將所得混合物在室溫下攪拌2小時。接著，將混合物經矽藻土過濾，減壓濃縮，且將殘餘物藉由矽膠管柱層析法(3/1己烷/EtOAc中之10-50% EtOH-2% NH₄OH)純化，得到呈油狀之所需產物(1.07 g，52%產率)。m/z實驗值= 478.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ  7.45 - 7.40 (m, 2H), 7.39 - 7.34 (m, 2H), 7.33 - 7.28 (m, 1H), 7.25 - 7.20 (m, 1H), 7.09 (s, 1H), 7.02 - 6.94 (m, 1H), 6.88 - 6.84 (m, 1H), 5.07 (s, 2H), 4.88 - 4.60 (br s, 2H), 3.93 (d,J= 7.23 Hz, 1H), 3.88 (s, 2H), 3.71-3.64 (m, 4H), 3.59 (m, 17H), 2.85 (t,J= 5.03 Hz, 2H)。 (3-( 苯甲氧基 ) 苯甲基 )(17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

將Boc₂O (748 mg，1.5 eq.，3.36 mmol)於EtOH (7 mL)中之溶液添加至1-(3-(苯甲氧基)苯基)-5,8,11,14,17-五氧雜-2-氮雜十九烷-19-醇(1.07 g，2.24 mmol)及三乙胺(473 μL，1.5 eq.，3.36 mmol)於EtOH (12 mL)中之溶液中。攪拌2小時後，將反應混合物減壓濃縮且使用矽膠管柱層析法(3/1己烷/EtOAc中之10-60% EtOH-2% NH₄OH)純化粗物質，得到呈褐色油狀之標題化合物(670 mg，52%產率)。m/z實驗值= 595.6 (M+NH₄)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.44 - 7.30 (m, 5H), 7.22 (t,J= 7.88 Hz, 1H), 6.85 (m, 3H), 5.04 (s, 2H), 4.48 (d,J= 8.95 Hz, 2H), 3.73 - 3.69 (m, 2H), 3.63 - 3.57 (m, 20H), 3.39 (s, 1H), 3.29 (s, 1H), 2.70 (s, 1H), 1.46 (m, 9H)。 (3-( 苯甲氧基 ) 苯甲基 )(6,9,12,15,18- 五氧雜 -3- 氮雜二十烷 -20- 基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，將甲烷磺醯氯(160 μL，1.8 eq.，2.06 mmol)逐滴添加至(3-(苯甲氧基)苯甲基)(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺基甲酸三級丁酯(660 mg，1.14 mmol)及三乙胺(478 μL，2.9 eq.，3.43 mmol)於DCM(20 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物升溫至室溫並攪拌1小時。接著，將反應物用NaHCO₃飽和水溶液洗滌，且將水層用CH₂Cl₂萃取兩次。將合併之有機層經無水Na₂SO₄乾燥，過濾，且減壓移除溶劑，得到粗甲磺酸酯。m/z實驗值= 673.5 (M+NH₄)。接著，將此粗物質溶解於MeOH (1 mL)中且添加乙胺(2.76 mL，30 eq.，34.3 mmol)。將反應混合物在80℃下攪拌6小時，冷卻至室溫，且在真空中移除揮發性物質，得到油狀物。將此粗油狀物再懸浮於MeCN (10 mL)中，接著添加K₂CO₃，且將所得混合物在室溫下攪拌1小時，隨後將其經矽藻土過濾且減壓蒸發濾液，得到所需產物(645 mg，93%產率)。m/z實驗值= 605.6 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.44 - 7.30 (m, 5H), 7.21 (t,J= 7.88 Hz, 1H), 6.85 (m, 3H), 5.04 (s, 2H), 4.48 (m, 2H), 3.63 - 3.56 (m, 20 H), 3.39 (s, 1H), 3.29 (s, 1H), 2.78 (t,J= 5.21 Hz, 2H), 2.65 (q,J= 7.15 Hz, 2H), 1.46 (m, 9H), 1.10 (t,J= 7.13 Hz, 3H)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(5,23- 雙 (3-( 苯甲氧基 ) 苯甲基 )-2,2- 二甲基 -4,24- 二側氧基 -3,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5,23- 二氮雜二十六烷 -26- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

將(S)-3-(4-((1,4,7,10-肆(2-(三級丁氧基)-2-側氧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-2-基)甲基)苯基)丙酸(中間體 C，300 mg，303 µmol)及HATU (178 mg，1.5 eq.，455 µmol)溶解於無水DMF (2.5 mL)中，隨後在氮氣氛圍下添加DIPEA (212 µL，4 eq.，1.21 mmol)。在氮氣下，將混合物攪拌10分鐘，隨後添加(3-(苯甲氧基)苯甲基)(1-(3-(苯甲氧基)苯基)-5,8,11,14,17-五氧雜-2-氮雜十九烷-19-基)胺基甲酸三級丁酯(211 mg，1.15 eq.，349 µmol)於無水DMF (2.5 mL)中之溶液。將反應混合物攪拌1小時，隨後添加水(10 mL)及DCM (15 mL)。收集有機相，用水(15 mL × 2)及鹽水(15 mL × 2)洗滌，經無水NaSO₄乾燥，過濾且在真空中濃縮。將粗品藉由矽膠管柱層析法(DCM中之0-20% MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(350 mg，75%產率)。m/z實驗值= 639.6 (M+2H-Boc)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(20-(3-( 苯甲氧基 ) 苯甲基 )-1-(3-( 苯甲氧基 ) 苯基 )-21- 側氧基 -5,8,11,14,17- 五氧雜 -2,20- 二氮雜二十三烷 -23- 基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

將2,2',2'',2'''-(2-(4-(5,23-雙(3-(苯甲氧基)苯甲基)-2,2-二甲基-4,24-二側氧基-3,8,11,14,17,20-六氧雜-5,23-二氮雜二十六烷-26-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(350 mg，229 µmol)溶解於DCM (3mL)中，隨後添加TFA (300 µL)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時並在真空中濃縮，得到呈褐色油狀之標題化合物(300 mg，92%產率)。m/z實驗值= 639.6 (M+2H), 583.5 (M+2H-tBu), 527.4 (M+2H-2tBu)。 2,2',2'',2'''-(2-(4-(22-(3-( 苯甲氧基 ) 苯甲基 )-4- 乙基 -3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 )(S)- 四乙酸四 - 三級丁酯之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(20-(3-(苯甲氧基)苯甲基)-1-(3-(苯甲氧基)苯基)-21-側氧基-5,8,11,14,17-五氧雜-2,20-二氮雜二十三烷-23-基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(300 mg，235 µmol)於無水DMF (5 mL)中之溶液中添加己二酸雙(2,3,5,6-四氟苯基)酯(312 mg，3 eq.，704 µmol)及DIPEA (206 µL，5 eq.，1.17 µmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1.5小時，濃縮至乾，且使用矽膠管柱層析法(DCM中之0-5% MeOH)純化粗物質，得到呈褐色油狀之標題化合物(350 mg，96%產率)。m/z實驗值= 777.0 (M+2H), 518.8 (M+3H)。 (S)-2,2',2'',2'''-(2-(4-(4- 乙基 -22-(3- 羥基苯甲基 )-3,23,28- 三側氧基 -28-(2,3,5,6- 四氟苯氧基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22- 二氮雜二十八烷基 ) 苯甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜環十二烷 -1,4,7,10- 四基 ) 四乙酸 --2,2,2- 三氟乙酸 (1/2) ( 化合物 1-40) 之製備

向2,2',2'',2'''-(2-(4-(22-(3-(苯甲氧基)苯甲基)-4-乙基-3,23,28-三側氧基-28-(2,3,5,6-四氟苯氧基)-7,10,13,16,19-五氧雜-4,22-二氮雜二十八烷基)苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)(S)-四乙酸四-三級丁酯(350 mg，225 µmol)於DCM (3 mL)中之溶液中添加TFA (6.00 mL)。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜，此後在40℃下再攪拌反應48小時。將反應混合物濃縮至乾且將產物藉由使用製備型HPLC (H₂O-0.1% TFA中之10-100% ACN-0.1% TFA)純化。將經純化之產物在真空中濃縮且再溶解於8 mL H₂O-0.1% TFA中。將溶液過濾，再用8 mL H₂O-0.1% TFA洗滌並凍乾，得到呈白色固體狀之標題化合物(5.3 mg，1.6%)。m/z實驗值= 620.4 (M+2H), 414.0 (M+3H)。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 11.49 (s, 1H), 9.43 (s, 1H), 9.32 (s, 1H), 7.99 - 7.90 (m, 1H), 7.28 - 7.12 (m, 8H), 7.12 - 7.05 (m, 1H), 6.68 - 6.56 (m, 3H), 4.55 (d,J= 8.6 Hz, 1H), 3.95 (s, 5H), 3.54 - 3.43 (m, 30H), 3.01 (s, 4H), 2.85 - 2.72 (m, 5H), 2.58 (dt,J= 15.1, 8.0 Hz, 2H), 2.44 (s, 1H), 2.37 - 2.31 (m, 2H), 2.27 (d,J= 7.1 Hz, 2H), 2.23 (s, 1H), 2.17 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 1.76 - 1.59 (m, 4H), 1.54 (s, 1H), 1.48 (s, 1H), 1.01 (ddd,J= 24.8, 8.4, 6.1 Hz, 5H)。實例 24. 化合物 1-41 之合成 [(S)-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-2-{[ 對 -({N-17-[ 三級丁基 ( 氧基羰基胺基 )]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 } 甲氧基 ) 苯基 ] 甲基 }-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

向中間體 A(0.1 g，126 µmol)於DMF (4.85 mL)中之溶液中添加17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(144 mg，3 eq.，378 µmol)、HATU (95.9 mg，2 eq.，252 µmol)及DIPEA (87.9 µL，4 eq.，504 µmol)。將混合物攪拌3小時，在真空中濃縮，且將粗物質使用矽膠管柱層析法(於CH₂Cl₂中之14% MeOH)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(132.6 mg，91%產率)。m/z實驗值= 1155.2 (M+H)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-2-({ 對 -[(N-17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 ) 甲氧基 ] 苯基 } 甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

向[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-{[對-({N-17-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基胺甲醯基}甲氧基)苯基]甲基}-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(133 mg，115 µmol)於DCM (2.05 mL)中之溶液中添加TFA (0.3 mL)。將混合物攪拌3小時，減壓濃縮且不經純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 1055.2 (M+H)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 羧基甲基 )-2-{[ 對 -({N-17-[5-(2,3,5,6- 四氟苯氧基羰基 ) 戊醯基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 } 甲氧基 ) 苯基 ] 甲基 }-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸之製備

向[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-({對 -[(N-17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基胺甲醯基)甲氧基]苯基}甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(121 mg，115 µmol)及雙-TFP-己二酸酯(119 mg，3 eq.，344 µmol)於DMF (1 mL)及DCM (7 mL)之混合物中之溶液中添加三乙胺(128 µL，8 eq.，917 µmol)。將混合物攪拌1小時，濃縮至乾，且使用矽膠管柱層析法(於DCM中之10-15% MeOH)純化，得到完全保護之中間體。m/z實驗值= 1331.2 (M+H), 666.3 (M+2H)。接著，將該醯胺溶解於DCM (817 µL)中且添加TFA (2 mL)。將反應混合物攪拌過夜，濃縮至乾且使用製備型HPLC (40% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈白色固體之產物(23.6 mg，3個步驟19%產率)。m/z實驗值= 1107.0 (M+H), 554.2 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.09 (s, 1H), 8.02 - 7.85 (m, 2H), 7.25 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 6.93 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 4.46 (s, 2H), 4.06 - 3.49 (m, 44H), 3.48 - 3.38 (m, 3H), 3.30 (d,J= 5.9 Hz, 1H), 3.20 (q,J= 5.8 Hz, 3H), 2.79 (t,J= 6.9 Hz, 1H), 2.68 (p,J= 1.9 Hz, 1H), 2.54 (d,J= 6.8 Hz, 1H), 2.33 (p,J= 1.9 Hz, 1H), 2.17 - 2.04 (m, 2H), 1.68 - 1.57 (m, 3H)。¹⁹F NMR (377 MHz, DMSO-d₆) δ -139.76 (dd,J= 23.3, 10.0 Hz), -154.02 (dd,J= 23.1, 10.0 Hz)。實例 25. 化合物 4-1 之合成 (S)-2- 胺基 -6-[3-( 對 -{[1,4,7,10- 肆 ( 羧基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -2- 環十二烷基 ] 甲基 } 苯基 ) 硫脲基 ] 己酸 ( 化合物 4-1) 之製備

將DIPEA (40 µL，227 µmol，5 eq.)添加至化合物3-1(25 mg，45.3 µmol，1 eq.)及(S)-6-胺基-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]己酸三級丁酯(21 mg，68 µmol，1.5 eq.)於DMF (1.5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌30分鐘，接著減壓移除溶劑。將所得殘餘物溶解於TFA (1.5 mL)中並攪拌16小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% TFA)-ACN (0.1% TFA) 90:10-30:70)，得到呈白色固體狀之標題化合物4-1(21 mg，經2個步驟66%產率)。m/z實驗值= 698.1 (M+H)。¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ 7.38 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 7.32 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 4.30 - 3.38 (m, 17H), 3.30 - 2.57 (m, 11H), 2.09 - 1.86 (m, 2H), 1.77 - 1.66 (m, 2H), 1.64 - 1.44 (m, 2H)。實例 26. 化合物 4-2 之合成 [(S)-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-2-[( 對 -{2-[N- 乙基 (17-{N- 乙基 [3-( 對碘苯基 ) 丙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 乙基 } 苯基 ) 甲基 ]-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

將HATU (33 mg，85.6 µmol，1.4 eq.)添加至4-(對碘苯基)丁酸(25 mg，85.6 µmol，1.4 eq.)及DIPEA (43 µL，245 µmol，4 eq.)於EtOAc (2.5 mL)中之經攪拌溶液中。在室溫下攪拌反應10分鐘，接著添加[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-({對-[2-(N-乙基-N-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基胺甲醯基)乙基]苯基}甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(74 mg，61.2 µmol，1 eq.)於EtOAc (2.5 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌1小時。接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(50 mg，59%產率)。m/z實驗值= 691.3 (M+2H), 461.4 (M+3H)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 羧基甲基 )-2-[( 對 -{2-[N- 乙基 (17-{N- 乙基 [3-( 對碘苯基 ) 丙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 乙基 } 苯基 ) 甲基 ]-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸 ( 化合物 4-2) 之製備

將TFA (1.8 mL)添加至[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-[(對-{2-[N-乙基(17-{N-乙基[3-(對碘苯基)丙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺甲醯基]乙基}苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸酯(50 mg，36.2 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(1.2 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌16小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% TFA)-ACN (0.1% TFA) 90:10-65:45-10:90)，得到呈白色固體狀之標題化合物4-2(6.8 mg，16%產率)。m/z實驗值= 1157 (M+H), 579.2 (M+2H), 386.5 (M+3H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.63 (d,J= 8.3 Hz, 2H), 7.25 (s, 4H), 7.03 (d,J= 8.2 Hz, 2H), 4.29 - 3.36 (m, 42H), 3.27 - 2.81 (m, 11H), 2.77 - 2.55 (m, 6H), 2.42 (dt,J= 18.4, 7.3 Hz, 2H), 1.97 - 1.85 (m, 2H), 1.13 (dtd,J= 15.8, 7.2, 1.3 Hz, 6H)。實例 27. 化合物 4-3 之合成 (S)-2- 胺基 -6-{5-[N- 乙基 (17-{N- 乙基 [2-( 對 -{[(S)-1,4,7,10- 肆 ( 羧基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -2- 環十二烷基 ] 甲基 } 苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-3) 之製備

將DIPEA (27 µL，155 µmol，10 eq.)添加至化合物 1-2(18 mg，15.5 µmol，1 eq.)及(S)-6-胺基-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]己酸三級丁酯(7 mg，23.3 µmol，1.5 eq.)之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌30分鐘，接著減壓移除溶劑。將所得殘餘物溶解於TFA (2 mL)中且在室溫下攪拌3.5小時。減壓移除溶劑，接著對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% TFA)-ACN (0.1% TFA) 90:10-30:70)，得到呈白色固體狀之標題化合物4-3(12 mg，經2個步驟68%產率)。m/z實驗值1141.5 (M+H)及571.5 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.26 (s, 4H), 4.38 - 3.38 (m, 50H), 3.26 - 3.18 (m, 4H), 2.95 - 2.89 (m, 2H), 2.76 - 2.66 (m, 2H), 2.44 (dt,J= 14.1, 6.8 Hz, 2H), 2.25 - 2.19 (m, 2H), 2.08 - 1.85 (m, 2H), 1.71 - 1.42 (m, 9H), 1.37 - 1.30 (m, 1H), 1.25 - 1.07 (m, 6H)。實例 28. 化合物 1-16 之合成 2- 環己基 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將環己胺(250 µL，2.17 mmol，3 eq.)添加至17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(250 mg，724 µL，1 eq.)及TEA (303 µL，2.17 mmol，3 eq.)於無水DMF (8 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物加熱至90℃並攪拌24小時。減壓移除溶劑，接著將所得殘餘物溶解於EtOH (3 mL)中。添加TEA (151 µL，1.09 mmol，1.5 eq.)，隨後添加Boc₂O (237 mg，1.09 mmol，1.5 eq.)於EtOH (3 mL)中之溶液。將反應混合物攪拌2小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至95:5 - 90:10 EtOAc-MeOH)，得到呈黃色油狀之標題化合物(經2個步驟85%產率)。m/z實驗值= 486.1 (M+Na), 481.2 (M+NH₄)及464.4 (M+H)。 環己基 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，將甲烷磺醯氯(71 µL，922 µmol，1.5 eq.)添加至2-環己基2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(285 mg，615 µmol，1 eq.)及TEA (260 µL，1.84 mmol，3 eq.)於無水CH₂Cl₂(6 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物升溫至室溫並攪拌1小時，接著用水洗滌有機相。用CH₂Cl₂萃取水層兩次，接著將合併之有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾且減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至95:5 EtOAc-丙酮)，得到呈無色油狀之標題化合物(311 mg，93%產率)。m/z實驗值= 564.1 (M+Na), 559.1 (M+NH₄)。 環己基 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 環己基胺基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

將環己基胺(200 µL，1.72 mmol，3 eq.)添加至環己基(2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(311 mg，574 µmol，1 eq.)及TEA (240 µL，1.72 mmol，3 eq.)於無水DMF中之經攪拌溶液中。將反應混合物加熱至80℃並攪拌16小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(KP-胺基，80:20己烷-EtOAc至100% EtOAc)，得到呈無色油狀之標題化合物(221 mg，71%產率)。m/z實驗值= 545.2 (M+H)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-2-({ 對 -[2-({17-[ 三級丁基環己基 ( 氧基羰基胺基 )]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 }-N- 環己基胺甲醯基 ) 乙基 ] 苯基 } 甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備 將HATU (41 mg，106 µM, 1.4 eq.)添加至中間體 C(60 mg，75.8 µmol，1 eq.)及DIPEA (106 µL，607 µmol 8 eq.)於EtOAc (2.5 mL)中之經攪拌溶液中。在室溫下攪拌反應10分鐘，接著添加環己基(2-{2-[2-(2-{2-[2-(環己基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(41 mg，75.8 µmol，1 eq.)於EtOAc (2.5 mL)中之溶液。1小時後，用水洗滌反應物，接著用EtOAc萃取水相一次，接著將合併之有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾且減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(91 mg，91%產率)。m/z實驗值= 609.4 (M+2H-Boc)及406.6 (M+3H-Boc)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-2-[( 對 -{2-[N- 環己基 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 環己基胺基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺甲醯基 ] 乙基 } 苯基 ) 甲基 ]-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

將TFA (250 µL)添加至[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-({對-[2-({17-[三級丁基環己基(氧基羰基胺基)]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}-N-環己基胺甲醯基)乙基]苯基}甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(91 mg，69.1 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(2.5 mL)中之經攪拌溶液中。1小時後，用CH₂Cl₂稀釋反應物，接著在30℃下減壓移除溶劑。任何殘留TFA藉由與CH₂Cl₂共沸移除，得到呈油狀之標題化合物(84 mg，100%產率)。m/z實驗值= 1218.0 (M+H)。 5-[N- 環己基 (17-{N- 環己基 [2-( 對 -{[(S)-1,4,7,10- 肆 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -2- 環十二烷基 ] 甲基 } 苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊酸 2,3,5,6- 四氟苯酯之製備

將DIPEA (144 µL，828 µmol，12 eq.)添加至[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-[(對-{2-[N-環己基(2-{2-[2-(2-{2-[2-(環己基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺甲醯基]乙基}苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(84 mg，69 µmol，1 eq.)及己二酸二-2,3,5,6-四氟苯酯(91.5 mg，207 µmol，3 eq.)於DMF (4 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物攪拌2小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至100% CH₂Cl₂至95:5 DCM-MeOH)，得到呈無色油狀之產物。假定100%產率，且將產物用於下一步驟。m/z實驗值= 747.4 (M+2H), 498.6 (M+3H)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 羧基甲基 )-2-[( 對 -{2-[N- 環己基 (17-{N- 環己基 [4-(2,3,5,6- 四氟苯氧基羰基 ) 丁基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 乙基 } 苯基 ) 甲基 ]-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸 ( 化合物 1-16 之製備 )

將TFA (3 mL)添加至5-[N-環己基(17-{N-環己基[2-(對-{[(S)-1,4,7,10-肆(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-2-環十二烷基]甲基}苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺甲醯基]戊酸2,3,5,6-四氟苯酯(103 mg，68.9 µL，1 eq.)於CH₂Cl₂(2 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物攪拌16小時。接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% TFA)-ACN (0.1% TFA) 90:10-40:60)，得到呈白色固體狀之標題化合物1-16(29 mg，33%產率)。m/z實驗值= 1269.1 (M+H), 635.3 (M+2H), 423.9 (M+3H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.02 - 7.86 (m, 1H), 7.18 (s, 4H), 4.09 - 3.47 (m, 30H), 3.29 - 2.57 (m, 25H), 2.39 (t,J= 7.3 Hz, 2H), 1.78 - 1.01 (m, 26H)。實例 29. 化合物 1-42 之合成 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，將甲烷磺醯氯(53 µL，682 µmol，1.3 eq.)添加至17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(200 mg，524 µmol，1 eq.)及TEA (219 µL，1.57 mmol，3 eq.)於無水CH₂Cl₂(7 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物升溫至室溫並攪拌1小時，接著用水洗滌有機相。用CH₂Cl₂萃取水層兩次，接著將合併之有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾且減壓移除溶劑。假定100%產率(241 mg，100%產率)，且將粗殘餘物不經純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 460.1 (M+H), 477.1 (M+NH₄)。 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 環丁基胺基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

將環丁胺(135 µL，1.57 mmol，3 eq.)添加至(2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(241 mg，524 µmol，1 eq.)及TEA (219 µL，1.57 mmol，3 eq.)於無水DMF中之經攪拌溶液中。將反應混合物加熱至80℃並攪拌16小時。減壓移除溶劑，將粗殘餘物在高真空下乾燥且不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 435.2 (M+H)。 5-({17-[ 三級丁基 ( 氧基羰基胺基 )]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 }-N- 環丁基胺甲醯基 ) 戊酸 2,3,5,6- 四氟苯酯之製備

將DIPEA (200 µL，1.15 mmol，5 eq.)添加至(2-{2-[2-(2-{2-[2-(環丁基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(100 mg，230 µmol，1 eq.)及雙-TFP-己二酸酯(305 mg，693 µmol，3 eq.)於EtOAc (5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物攪拌16小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(110 mg，經2個步驟67%產率)。m/z實驗值= 711.1 (M+H), 728.1 (M+NH₄)及733.1 (M+Na)。 5-[(17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )-N- 環丁基胺甲醯基 ] 戊酸 2,3,5,6- 四氟苯酯之製備

將TFA (250 µL)添加至5-({17-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}-N-環丁基胺甲醯基)戊酸2,3,5,6-四氟苯酯(110 mg，155 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(2.5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌1小時。接著減壓移除溶劑。將產物在高真空下乾燥且不經進一步純化即用於下一步驟(112 mg，100%產率)。m/z實驗值= 611.1 (M+H)。 5-(N- 環丁基 {17-[3-( 對 -{[(S)-1,4,7,10- 肆 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -2- 環十二烷基 ] 甲基 } 苯基 ) 丙醯基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 } 胺甲醯基 ) 戊酸 2,3,5,6- 四氟苯酯之製備

將HATU (71 mg，186 µmol，1.2 eq.)添加至中間體 C(147 mg，186 µmol，1.2 eq.)及DIPEA (110 µL，619 µmol，4 eq.)於EtOAc (3 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌15分鐘，接著添加5-[(17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)-N-環丁基胺甲醯基]戊酸2,3,5,6-四氟苯酯(112 mg，155 µmol，1 eq.)及2,3,5,6-四氟苯酚(77 mg，464 µmol，3 eq.)於EtOAc (5 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌2小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之不純標題化合物。假定100%產率(214 mg，100%產率)且將該物質用於下一步驟。m/z實驗值= 692.3 (M+2H)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 羧基甲基 )-2-({ 對 -[2-(N-17-{N- 環丁基 [4-(2,3,5,6- 四氟苯氧基羰基 ) 丁基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 ) 乙基 ] 苯基 } 甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸 ( 化合物 1-42) 之製備

將TFA (6 mL)添加至5-(N-環丁基{17-[3-(對-{[1,4,7,10-肆(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-2-環十二烷基]甲基}苯基)丙醯基胺基]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}胺甲醯基)戊酸2,3,5,6-四氟苯酯(214 mg，155 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(4 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌16小時。接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% TFA)-ACN (0.1% TFA) 90:10-60:40-5:95)，得到呈白色固體狀之標題化合物1-42(27 mg，15%產率)。m/z實驗值= 1159.1 (M+H), 580.2 (M+2H), 387.2 (M+3H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.02 - 7.86 (m, 2H), 7.15 (s, 4H), 6.55 (s, 1H), 4.11 - 2.65 (m, 55H), 2.45 - 2.29 (m, 4H), 2.19 - 1.99 (m, 4H), 1.74 - 1.51 (m, 4H)。實例 30. 化合物 1-43 之合成 [(S)-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-2-({ 對 -[(E)-2-({17-[ 三級丁基乙基 ( 氧基羰基胺基 )]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 }-N- 乙基胺甲醯基 ) 乙烯基 ] 苯基 } 甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

將HATU (35 mg，92.3 µmol，1.4 eq.)添加至(E)-3-(對-{[(S)-1,4,7,10-肆(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-2-環十二烷基]甲基}苯基)丙烯酸(52 mg，65.9 µmol，1 eq.)及DIPEA (46 µL，264 µmol，4 eq.)於EtOAc (3 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著添加2-乙基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(29 mg，65.9 µmol，1 eq.)於EtOAc (3 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌1小時。接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(75 mg，94%產率)。m/z實驗值615.3 (M+H+Na)及554.3 (M+2H-Boc)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-2-({ 對 -[(E)-2-(N- 乙基 -N-3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基胺甲醯基 ) 乙烯基 ] 苯基 } 甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

將TFA (250 µL)添加至[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-({對-[(E)-2-({17-[三級丁基乙基(氧基羰基胺基)]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}-N-乙基胺甲醯基)乙烯基]苯基}甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(75 mg，62.1 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(2.5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌1小時, 接著減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(69 mg，100%產率)。m/z實驗值554.3 (M+2H)。 5-[N- 乙基 (17-{N- 乙基 [(E)-2-( 對 -{[(S)-1,4,7,10- 肆 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -2- 環十二烷基 ] 甲基 } 苯基 ) 乙烯基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊酸 2,3,5,6- 四氟苯酯之製備

將DIPEA (65 µL，374 µmol，6 eq.)添加至[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-({對-[(E)-2-(N-乙基-N-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基胺甲醯基)乙烯基]苯基}甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸酯(69 mg，62.3 µmol，1 eq.)及雙-TFP-己二酸酯(83 mg，187 µmol，3 eq.)於EtOAc (6.5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌4小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(22 mg，25%產率)。m/z實驗值692.3 (M+2H), 703.3 (M+H+Na), 461.9 (M+3H)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 羧基甲基 )-2-({ 對 -[(E)-2-[N- 乙基 (17-{N- 乙基 [4-(2,3,5,6- 四氟苯氧基羰基 ) 丁基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 乙烯基 ] 苯基 } 甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸 ( 化合物 1-43) 之製備

將TFA (1.5 mL)添加至5-[N-乙基(17-{N-乙基[(E)-2-(對-{[(S)-1,4,7,10-肆(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-2-環十二烷基]甲基}苯基)乙烯基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺甲醯基]戊酸2,3,5,6-四氟苯酯(22 mg，15.9 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(1 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物攪拌16小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% TFA)-ACN (0.1% TFA) 90:10-10:90)，得到呈白色固體狀之標題化合物1-43(7.5 mg，38%產率)。m/z實驗值1159.1 (M+H), 580.2 (M+2H)及387.4 (M+3H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.02 - 7.87 (m, 1H), 7.72 - 7.04 (m, 7H), 4.02 - 3.39 (m, 37H), 3.24 - 2.59 (m, 18H), 2.38 - 2.32 (m, 2H), 1.74 - 1.54 (m, 4H), 1.17 - 0.96 (m, 6H)。實例 31. 化合物 1-44 之合成 2- 環丁基 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將環丁胺(186 µL，2.17 mmol，3 eq.)添加至17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(250 mg，724 µmol，1 eq.)及TEA (300 µL，2.17 mmol，3 eq.)於無水DMF (8 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物加熱至90℃並攪拌24小時。減壓移除溶劑，接著將所得殘餘物溶解於EtOH (6 mL)中。添加TEA (151 µL，1.09 mmol，1.5 eq.)，隨後添加Boc₂O (237 mg，1.09 mmol，1.5 eq.)於EtOH (3 mL)中之溶液。將反應混合物攪拌2小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至95:5 - 90:10 EtOAc-MeOH)，得到呈黃色油狀之標題化合物(經2個步驟65%產率)。m/z實驗值= 436.2 (M+H)。 環丁基 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，將甲烷磺醯氯(47 µL，609 µmol，1.3 eq.)添加至 2- 環丁基2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(204 mg，468 µmol，1 eq.)及TEA (196 µL，1.41 mmol，3 eq.)於無水CH₂Cl₂(6 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物升溫至室溫並攪拌1小時，接著用水洗滌有機相。用CH₂Cl₂萃取水層兩次，接著將合併之有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾且減壓移除溶劑。將所得殘餘物(241 mg，100%產率)不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 531.2 (M+NH₄)。 環丁基 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 環丁基胺基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

將環丁胺(123 µL，1.43 mmol，3 eq.)添加至環丁基(2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(245 mg，477 µmol，1 eq.)及TEA (200 µL，1.43 mmol，3 eq.)於無水DMF中之經攪拌溶液中。將反應混合物加熱至80℃並攪拌16小時。減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(191 mg，82%產率)。m/z實驗值= 489.2 (M+H)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-2-({ 對 -[2-({17-[ 三級丁基環丁基 ( 氧基羰基胺基 )]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 }-N- 環丁基胺甲醯基 ) 乙基 ] 苯基 } 甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

將HATU (27 mg，70.8 µmol，1.4 eq.)添加至中間體 C(40 mg，50.6 µmol，1 eq.)及DIPEA (35 µL，202 µmol)於EtOAc (2.5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著添加環丁基(2-{2-[2-(2-{2-[2-(環丁基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(30 mg，60.7 µmol，1.2 eq.)於EtOAc (2.5 mL)中之溶液。將反應混合物攪拌1小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(64 mg，100%)。m/z實驗值= 642.3 (M+Na+H)。 [(S)-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-2-[( 對 -{2-[N- 環丁基 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 環丁基胺基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺甲醯基 ] 乙基 } 苯基 ) 甲基 ]-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

將TFA (200 µL)添加至[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-({對-[2-({17-[三級丁基環丁基(氧基羰基胺基)]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}-N-環丁基胺甲醯基)乙基]苯基}甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸酯(64 mg，50.7 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(1.8 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，接著用CH₂Cl₂稀釋反應物，且減壓移除溶劑。將標題化合物(59 mg，100%產率)在高真空下乾燥隔夜，接著將其不經進一步純化即用於下一步驟。581.3 (M+2H), 387.9 (M+3H)。 5-[N- 環丁基 (17-{N- 環丁基 [2-( 對 -{[1,4,7,10- 肆 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -2- 環十二烷基 ] 甲基 } 苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊酸 2,3,5,6- 四氟苯酯之製備

將DIPEA (44 µL，254 µmol，5 eq.)添加至[(S)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-2-[(對-{2-[N-環丁基(2-{2-[2-(2-{2-[2-(環丁基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺甲醯基]乙基}苯基)甲基]-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸酯(59 mg，50.8 µmol，1 eq.)及雙-TFP-己二酸酯(67.4 mg，152 µmol，3 eq.)於EtOAc (3.5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌4小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(40 mg，55%產率)。m/z實驗值719.3 (M+2H), 480.0 (M+3H) [(S)-4,7,10- 參 ( 羧基甲基 )-2-[( 對 -{2-[N- 環丁基 (17-{N- 環丁基 [4-(2,3,5,6- 四氟苯氧基羰基 ) 丁基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 乙基 } 苯基 ) 甲基 ]-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸 ( 化合物 1-44) 之製備

將TFA (1.2 mL)添加至5-[N-環丁基(17-{N-環丁基[2-(對-{[1,4,7,10-肆(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-2-環十二烷基]甲基}苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺甲醯基]戊酸2,3,5,6-四氟苯酯(40 mg，27.8 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(0.8 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌16小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% TFA)-ACN (0.1% TFA) 90:10-10:90)，得到呈白色固體狀之標題化合物1-44(23 mg，68%產率)。m/z實驗值= 1213.1 (M+H)及607.2 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.01 - 7.88 (m, 1H), 7.14 (s, 4H), 4.46 (s, 1H), 4.29 (dq,J= 14.9, 8.3 Hz, 1H), 3.99 - 3.38 (m, 32H), 3.24 - 2.53 (m, 22H), 2.44 - 2.29 (m, 3H), 2.17 - 1.94 (m, 8H), 1.72 - 1.46 (m, 8H)。實例 32. 化合物 1-46 之合成 [(S)-2-{[ 對 -(2-{N-17-[( 三級丁基 )( 氧基羰基胺基 )]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 } 乙基 ) 苯基 ] 甲基 }-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

向中間體 C(152 mg，0.19 mmol)於DMF (12.8 mL)中之溶液中添加HATU (161.8 mg，0.43 mmol，2.2 eq.)及N-乙基雙(異丙基)胺(0.2 mL，1.16 mmol，6 eq.)。攪拌10分鐘後，將17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(143.6 mg，0.38 mmol，2.0 eq.)於微量DMF中之溶液添加至該溶液中。在室溫下攪拌14小時後，減壓移除溶劑且再溶解於EtOAc中。將溶液用鹽水洗滌，經無水Na₂SO₄乾燥，過濾，並濃縮至乾。用乙醚濕磨且使用逆相管柱層析法(C18，45% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(178 mg，80%產率)。m/z實驗值= 1153.6 (M+H), 527.5 (M+2H)。 [(S)-2-({ 對 -[2-(N-17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 ) 乙基 ] 苯基 } 甲基 )-4,7,10- 參 ( 三級丁氧基羰基甲基 )-1,4,7,10- 四氮雜 -1- 環十二烷基 ] 乙酸三級丁酯之製備

向[(S)-2-{[對-(2-{N-17-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基胺甲醯基}乙基)苯基]甲基}-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(178 mg，0.15 mmol)於CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液中添加三氟乙酸(1 mL)並攪拌20分鐘。將反應物濃縮至乾，得到呈褐色油狀之標題化合物(162 mg，99.5%產率)，其不經純化即用於下一步驟。 [(S)-2-{[ 對 -(2-{N-17-[5-(2,3,5,6- 四氟苯氧基羰基 ) 戊醯基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 ( 化合物 1-46) 之製備

向[(S)-2-({對-[2-(N-17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基胺甲醯基)乙基]苯基}甲基)-4,7,10-參(三級丁氧基羰基甲基)-1,4,7,10-四氮雜-1-環十二烷基]乙酸三級丁酯(55 mg，52.2 mmol)於DMF (3.28 mL)中之溶液中添加己二酸二-2,3,5,6-四氟苯酯(62.3 mg，141 mmol，2.7 eq.)及三乙胺(72.8 mL，0.52 mmol，10 eq.)。攪拌2小時後，將反應混合物濃縮至乾且再溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中。添加三氟乙酸(2 mL)且將反應混合物在室溫下攪拌12小時。接著，將粗混合物濃縮至乾且使用製備型HPLC (40% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈白色粉末狀之化合物 1-46(17.7 mg，31%產率)。m/z實驗值= 1105.3 (M+H), 553.3 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.21 (tt,J= 10.5, 7.3 Hz, 1H), 7.15 - 7.07 (m, 4H), 4.21 - 3.83 (m, 11H), 3.59 - 3.48 (m, 25H), 3.39 (dd,J= 6.0, 4.4 Hz, 2H), 3.26 (t,J= 5.3 Hz, 3H), 3.18 (t,J= 5.3 Hz, 4H), 3.01 (s, 2H), 2.79 (t,J= 7.3 Hz, 3H), 2.69 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 2.43 (t,J= 7.3 Hz, 3H), 2.19 (t,J= 6.8 Hz, 3H), 1.62 (dtdd,J= 8.9, 7.3, 4.4, 1.9 Hz, 5H)。實例 33. p -SCN-Bn-DOTA ( 化合物 3-1)

在一些實例中，螯合劑-連接子係S-2-(4-異硫氰基苯甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷四乙酸(p-SCN-Bn-DOTA)，其來源於Macrocyclics (Plano, TX；目錄號：B-205)。實例 34. DOTA ( 化合物 3-2)

在一些實例中，螯合劑係1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)，其來源於Macrocyclics (Plano, TX；目錄號：M140)。實例 35. 化合物 4-4 之合成 N- 乙基 -N-(3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(50 mg，304 µmol)於DMF (1.92 mL)中之溶液中添加HATU (232 mg，2 eq.，609 µmol)及DIPEA (106 µL，2 eq.，609 µmol)。攪拌10分鐘後，添加2-乙基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(133 mg，304 µmol)於CH₂Cl₂(8.05 mL)中之溶液。攪拌反應隔夜，減壓濃縮，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之2% MeOH)純化，得到胺取代之產物。m/z實驗值= 583.4 (M+H)。接著，將醯胺溶解於CH₂Cl₂(2 mL)中且將TFA (1 mL)添加至反應物中。攪拌30分鐘後，將反應混合物減壓濃縮且不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 483.3 (M+H)。 (S)-6-{5-[(17-{N- 乙基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )-N- 乙基胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 }-2- 胺基己酸 ( 化合物 4-4) 之製備

向N-乙基-N-(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基)3-(對甲苯基)丙醯胺(150 mg，311 µmol)及(S)-2-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(180 mg，311 µmol)於DMF (8 mL)中之溶液中添加三乙胺(130 µL，3 eq.，932 µmol)。攪拌反應2小時，透過矽藻土過濾，並減壓濃縮，得到完全保護之中間體。接著，將此粗物質再溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中，隨後添加TFA (1 mL)。將溶液攪拌隔夜，減壓濃縮，且使用製備型HPLC (50% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈無色油狀之產物(77.9 mg，經4個步驟34%產率)。m/z實驗值= 739.3 (M+H), 370.2 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.78 (d,J= 5.4 Hz, 1H), 7.08 (qd,J= 8.1, 3.6 Hz, 4H), 3.48 (pd,J= 5.4, 2.1 Hz, 19H), 3.41 - 3.18 (m, 8H), 3.08 (dd,J= 7.2, 5.1 Hz, 1H), 2.99 (q,J= 6.5 Hz, 2H), 2.75 (q,J= 7.6 Hz, 2H), 2.62 - 2.50 (m, 5H), 2.32 - 2.24 (m, 5H), 2.09 - 2.00 (m, 2H), 1.75 - 1.62 (m, 1H), 1.56 (q,J= 7.2 Hz, 1H), 1.47 (d,J= 7.7 Hz, 4H), 1.34 (d,J= 9.7 Hz, 5H), 1.06 (dd,J= 19.0, 7.0 Hz, 3H), 0.99 (tt,J= 7.0, 3.5 Hz, 3H)。實例 36. 化合物 4-5 之合成 5-{N-(S)-5- 三級丁氧基羰基 -5-[( 三級丁基 )( 氧基羰基胺基 )] 戊基胺甲醯基 } 戊酸之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(30 mg，183 µmol)於CH₂Cl₂(2.25 mL)中之溶液中添加HATU (153 mg，2.2 eq.，402 µmol)及DIPEA (70 µL，2.2 eq.，402 µmol)。攪拌10分鐘後，添加20-甲基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(79.8 mg，183 µmol)於DMF (750 µL)中之溶液。將混合物攪拌1小時，濃縮至乾，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之35% MeOH)純化，得到偶聯產物。m/z實驗值= 583.2 (M+H)。接著，將此物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.3 mL)。將所得褐色混合物攪拌2小時，隨後將其濃縮且不經純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 483.2 (M+H)。 (S)-6-[5-(N-170{( 異丁基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 ) 戊醯基胺基 ]-2- 胺基己酸 ( 化合物 4-5) 之製備

向5-{N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基}戊酸(62.4 mg，145 µmol)於CH₂Cl₂(3.59 mL)及DMF (897 µL)中之溶液中添加HATU (110 mg，2 eq.，290 µmol)及DIPEA (50.5 µL，2 eq.，290 µmol)。攪拌10分鐘後，添加微量DMF中之N-(17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)-N-異丁基3-(對甲苯基)丙醯胺(105 mg，1.5 eq.，218 µmol)。攪拌反應隔夜，且接著加熱至50℃，保持1小時。移除溶劑且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之15% MeOH)純化，得到完全保護之中間體。m/z實驗值= 895.4 (M+H)。將粗物質溶解於CH₂Cl₂(897 µL)中，隨後添加TFA (1 mL)。將混合物攪拌3小時，此後減壓移除溶劑且將粗物質使用製備型HPLC (H₂O + 0.1% TFA中之47% ACN)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(39.4 mg，經4個步驟37%產率)。m/z實驗值= 739.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.16 (s, 3H), 7.83 (t,J= 5.6 Hz, 1H), 7.73 (t,J= 5.6 Hz, 1H), 7.13 - 7.02 (m, 4H), 3.88 (s, 1H), 3.52 - 3.43 (m, 22H), 3.40 (dt,J= 11.4, 4.8 Hz, 3H), 3.17 (q,J= 5.8 Hz, 2H), 3.10 (dd,J= 9.5, 7.5 Hz, 2H), 3.01 (q,J= 6.5 Hz, 2H), 2.80 - 2.71 (m, 2H), 2.62 (t,J= 7.7 Hz, 1H), 2.54 (d,J= 7.9 Hz, 1H), 2.25 (s, 3H), 2.09 - 2.00 (m, 4H), 1.86 (dp,J= 20.2, 6.8 Hz, 1H), 1.75 (d,J= 6.0 Hz, 1H), 1.41 (d,J= 20.5 Hz, 1H), 1.31 (d,J= 11.9 Hz, 2H), 0.79 (dd,J= 11.9, 6.6 Hz, 6H)。實例 37. 化合物 4-6 之合成 N-(17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )-N- 乙基 3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(40 mg，244 µmol)於CH₂Cl₂(3 mL)及DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (204 mg，2.2 eq.，536 µmol)及DIPEA (93.4 µL，2.2 eq.，536 µmol)。攪拌10分鐘後，將微量DMF中之2-甲基-2-丙烷胺基甲酸3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷酯(99.5 mg，244 µmol)添加至該溶液中。將混合物在室溫下攪拌1小時，減壓濃縮，且將所得殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之23% MeOH)純化，得到經Boc保護之胺(70.8 mg，52%產率)。m/z實驗值= 555.2 (M+H)及455.2 (M+H-Boc)。將此物質(70.8 mg，128 µmol)溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.5 mL)。攪拌1小時後，減壓移除溶劑，且所得胺不經純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 455.2 (M+H)。 (S)-6-[5-(N-17-{N- 乙基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 ) 戊醯基胺基 ]-2- 胺基己酸 ( 化合物 4-6) 之製備

向5-{N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基}戊酸(54.9 mg，128 µmol)於CH₂Cl₂(3.16 mL)及DMF (789 µL)中之溶液中添加HATU (97 mg，2 eq.，255 µmol)及DIPEA (44.4 µL，2 eq.，255 µmol)。攪拌10分鐘後，添加微量DMF中之N-(17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)-N-乙基3-(對甲苯基)丙醯胺(58 mg，128 µmol)。在室溫下攪拌反應隔夜，隨後減壓移除溶劑，得到完全保護之中間體。接著，將此粗物質溶解於CH₂Cl₂(789 µL)中且添加TFA (1 mL)。攪拌3小時後，濃縮反應物，且將殘餘物使用製備型HPLC (50% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(17.3 mg，經2個步驟19%產率)。m/z實驗值= 711.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.16 (s, 3H), 7.83 (t,J= 5.7 Hz, 1H), 7.73 (t,J= 5.6 Hz, 1H), 7.14 - 7.03 (m, 4H), 3.92 - 3.84 (m, 4H), 3.52 - 3.43 (m, 16H), 3.37 (d,J= 5.7 Hz, 4H), 3.29 (p,J= 7.3 Hz, 2H), 3.17 (q,J= 5.8 Hz, 2H), 2.80 - 2.67 (m, 3H), 2.62 - 2.52 (m, 2H), 2.25 (s, 3H), 2.04 (dd,J= 6.9, 3.4 Hz, 4H), 1.74 (d,J= 9.1 Hz, 2H), 1.41 (d,J= 19.4 Hz, 6H), 1.01 (dt,J= 17.9, 7.1 Hz, 3H)。實例 38. 化合物 4-7 之合成 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 異丁基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(250 mg，724 µmol)於H₂O (1.9 mL)中之溶液中添加K₂CO₃(0.5 g，5 eq.，3.62 mmol)、TBABr (23.3 mg，0.1 eq.，72.4 µmol)、KI (36.1 mg，0.3 eq.，217 µmol)及氯化氫—異丁基胺(1/1) (397 mg，5 eq.，3.62 mmol)。將混合物在80℃下攪拌隔夜，減壓濃縮，得到胺取代之產物。m/z實驗值= 338.1 (M+H)。將此物質溶解於MeOH (1.66 mL)中且添加Boc₂O (174 mg，1.1 eq.，797 µmol)。將溶液攪拌45分鐘，減壓濃縮，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到呈無色油狀之產物(188 mg，經2個步驟59%產率)。m/z實驗值= 438.2 (M+H), 455.2 (M+NH₄)。 2- 異丁基 2-20- 甲基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-異丁基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(188 mg，430 µmol)於CH₂Cl₂(4.3 mL)中之溶液中添加三乙胺(89.9 µL，1.5 eq.，645 µmol)，隨後在0℃下逐滴添加(氯磺醯基)甲烷(49.9 µL，1.5 eq.，645 µmol)。將混合物加熱至50℃並在此溫度下攪拌隔夜。用1M HCl淬滅反應並用DCM萃取三次。收集有機層，經無水Na₂SO₄乾燥，過濾，且將濾液濃縮至乾，得到粗甲磺酸酯。m/z實驗值= 533.2 (M+NH₄), 538.1 (M+Na)。在0℃下，向氯化異丁基銨(149 mg，3 eq.，1.36 mmol)及三乙胺(283 µL，4.5 eq.，2.03 mmol)於DMF (1 mL)中之溶液中逐滴添加粗甲磺酸酯(233 mg，452 µmol)於DMF (4 mL)中之溶液。將反應混合物加熱至80℃並攪拌1小時，隨後添加KI (60 mg，0.8 eq.，361 µmol)。40小時後，減壓移除溶劑且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到標題化合物(228 mg，定量)。m/z實驗值= 493.2 (M+H)。 N- 異丁基 -N-(20- 甲基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一烷基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(30 mg，183 µmol)於CH₂Cl₂(2 mL)及DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (208 mg，3 eq.，548 µmol)及DIPEA (95.5 µL，3 eq.，548 µmol)。攪拌10分鐘後，添加2-甲基-2-丙烷胺基甲酸2-異丁基2-20-甲基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一烷酯(162 mg，1.8 eq.，329 µmol)於微量DMF中之溶液。將混合物攪拌1小時，濃縮至乾且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂/MeOH)純化粗物質，得到偶聯產物。m/z實驗值= 639.3 (M+H), 539.3 (M+H-Boc)。接著，將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (200 μL)。攪拌2小時後，將溶液濃縮至乾，且將所得殘餘物不經純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 539.3 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[( 異丁基 )(17-{( 異丁基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-7) 之製備

向5-{N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基}戊酸(60 mg，139 µmol)於CH₂Cl₂(1 mL)中之溶液中添加HATU (106 mg，2 eq.，279 µmol)及DIPEA (48.5 µL，2 eq.，279 µmol)。攪拌10分鐘後，N-異丁基-N-(20-甲基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一烷基)3-(對甲苯基)丙醯胺(90.1 mg，1.2 eq.，167 µmol)於CH₂Cl₂(1.87 mL)及DMF (860 µL)中之溶液。將混合物攪拌隔夜，濃縮至乾，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10-15% MeOH)純化，得到醯胺。m/z實驗值= 951.4 (M+H), 476.4 (M+2H)。向此中間體中添加CH₂Cl₂(1 mL)及TFA (1 mL)且將所得溶液攪拌3小時，減壓濃縮且將殘餘物使用製備型HPLC (65% ACN/H₂O + 0.1%甲酸)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(7.3 mg，經4個步驟7%產率)。m/z實驗值= 795.4 (M+H), 398.3 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 8.36 (s, 1H), 7.08 (d,J= 4.5 Hz, 4H), 3.62 (t,J= 6.2 Hz, 1H), 3.59 - 3.49 (m, 24H), 3.44 (dt,J= 11.4, 5.1 Hz, 2H), 3.39 (d,J= 4.9 Hz, 1H), 3.17 - 2.98 (m, 5H), 2.80 (td,J= 7.3, 4.1 Hz, 2H), 2.67 - 2.59 (m, 2H), 2.35 (dt,J= 13.9, 6.9 Hz, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.19 - 2.10 (m, 2H), 1.94 - 1.69 (m, 4H), 1.56 - 1.41 (m, 5H), 1.39 - 1.26 (m, 2H), 0.83 - 0.67 (m, 12H)。實例 39. 化合物 4-8 之合成 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2-3,3,3- 三氟丙基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(0.2 g，579 µmol)於H₂O (1.52 mL)中之溶液中添加3,3,3-三氟丙胺(284 µL，5 eq.，2.9 mmol)、K₂CO₃(0.4 g，5 eq.，2.9 mmol)、TBABr (18.7 mg，0.1 eq.，57.9 µmol)及KI (28.9 mg，0.3 eq.，174 µmol)。將混合物加熱至80℃且攪拌隔夜。減壓移除溶劑，得到取代產物。m/z實驗值= 378.1 (M+H)。將此粗物質溶解於MeOH (1.33 mL)中且添加Boc₂O (139 mg，1.1 eq.，637 µmol)。將反應混合物攪拌2小時，減壓濃縮且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之20% MeOH)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(183 mg，經2個步驟66%產率)。m/z實驗值= 378.1 (M+H-Boc), 495.1 (M+NH₄)。 2-21,21,21- 三氟 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一烷基 2-3,3,3- 三氟丙基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-3,3,3-三氟丙基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(183 mg，383 µmol)於CH₂Cl₂(3.83 mL)中之溶液中添加三乙胺(160 µL，3 eq.，1.15 mmol)，隨後在0℃下逐滴添加(氯磺醯基)甲烷(88.9 µL，3 eq.，1.15 mmol)。將混合物加熱至80℃並攪拌36小時。將溶液用CH₂Cl₂稀釋且用1 M HCl洗滌。將有機相經無水NaSO₄乾燥，過濾，且將濾液濃縮至乾，得到甲磺酸酯，其不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 573.1 (M+NH₄), 578.1 (M+Na)。在0℃下，向3,3,3-三氟丙胺(150 µL，3 eq.，1.53 mmol)、KI (84.8 mg，511 µmol)及三乙胺(214 µL，3 eq.，1.53 mmol)於DMF (1.73 mL)中之溶液中逐滴添加粗甲磺酸酯(284 mg，511 µmol)於DMF (4 mL)中之溶液。將反應物加熱至80℃且攪拌隔夜。將溶液減壓濃縮且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之11% MeOH)純化，得到標題化合物(245.2 mg，經2個步驟84%)。m/z實驗值= 573.2 (M+H)。 N-(21,21,21- 三氟 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一烷基 )-N-3,3,3- 三氟丙基 3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(30 mg，183 µmol)於DMF (749 µL)中之溶液中添加HATU (153 mg，2.2 eq.，402 µmol)及DIPEA (70 µL，2.2 eq.，402 µmol)。將溶液攪拌5分鐘，直至觀察到顏色自無色變為黃/褐色。接著，添加2-21,21,21-三氟-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一烷基2-3,3,3-三氟丙基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(157 mg，1.5 eq.，274 µmol)於CH₂Cl₂(2.28 mL)中之溶液中且將反應混合物攪拌1小時。減壓移除溶劑，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之50% EtOAc)純化，得到偶聯產物。m/z實驗值= 719.2 (M+H), 619.2 (M+H-Boc), 736.2 (M+NH₄), 741.1 (M+Na)。將粗物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中，隨後添加TFA (1 mL)。攪拌2小時後，將溶液減壓濃縮且不經純化即用於下一步驟(92 mg，經2個步驟81%產率)。m/z實驗值= 619.2 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[(3,3,3- 三氟丙基 )(17-{(3,3,3- 三氟丙基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-8) 之製備

向5-{N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基}戊酸(60 mg，139 µmol)於DCM (1 mL)中之溶液中添加HATU (106 mg，2 eq.，279 µmol)及DIPEA (48.5 µL，2 eq.，279 µmol)。攪拌10分鐘後，N-(21,21,21-三氟-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一烷基)-N-3,3,3-三氟丙基3-(對甲苯基)丙醯胺(86.2 mg，139 µmol)於CH₂Cl₂(1.87 mL)及DMF (860 µL)中之溶液。將混合物在室溫下攪拌隔夜，濃縮至乾，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之15% MeOH)純化，得到所需偶聯產物。m/z實驗值= 1031.3 (M+H)。將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。將混合物攪拌3小時，濃縮至乾且將殘餘物使用製備型HPLC (65% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(7.6 mg，經2個步驟6%產率)。m/z實驗值= 875.2 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.77 (s, 1H), 7.15 - 7.03 (m, 4H), 6.61 (s, 1H), 3.60 - 3.40 (m, 25H), 3.08 (t,J= 6.2 Hz, 1H), 3.03 - 2.95 (m, 2H), 2.76 (q,J= 7.2 Hz, 2H), 2.65 - 2.57 (m, 2H), 2.45 (s, 9H), 2.35 - 2.29 (m, 2H), 2.25 (s, 3H), 2.03 (d,J= 7.3 Hz, 2H), 1.70 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 1.60 - 1.41 (m, 5H), 1.35 (d,J= 8.8 Hz, 4H)。¹⁹F NMR (377 MHz, DMSO) δ -73.88。實例 40. 化合物 4-9 之合成 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 苯乙基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(150 mg，435 µmol)於H₂O (1.14 mL)中之溶液中添加K₂CO₃(301 mg，5 eq.，2.18 mmol)、TBABr (14 mg，0.1 eq.，43.5 µmol)、苯乙胺(274 µL，5 eq.，2.18 mmol)及KI (21.7 mg，0.3 eq.，131 µmol)。將混合物在80℃下攪拌隔夜並減壓濃縮，得到取代產物。m/z實驗值= 386.2 (M+H)。接著，將粗物質溶解於MeOH (1 mL)中且添加Boc₂O (104 mg，1.1 eq.，479 µmol)。攪拌2小時後，減壓移除溶劑且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之20% MeOH)純化。m/z實驗值= 486.2 (M+H), 386.2 (M+H-Boc), 503.2 (M+NH₄)。 2- 苯乙基 2-20- 苯基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-苯乙基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(189 mg，389 µmol)於CH₂Cl₂(3.89 mL)中之溶液中添加三乙胺(81.3 µL，1.5 eq.，583 µmol)，隨後逐滴添加(氯磺醯基)甲烷(45.2 µL，1.5 eq.，583 µmol)。在50℃下攪拌反應3小時，用DCM稀釋且用1M HCl洗滌。將有機相用無水NaSO₄乾燥，過濾，且濃縮濾液，得到甲磺酸酯，其不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 464.1 (M+H-Boc), 508.1 (M+H-tBu), 581.1 (M+NH₄)。在0℃下，向苯乙胺(54.8 mg，452 µmol)及三乙胺(189 µL，3 eq.，1.36 mmol)於DMF (1 mL)中之溶液中逐滴添加粗甲磺酸酯(255 mg，452 µmol)於DMF (4 mL)中之溶液。使反應物升溫至室溫且攪拌隔夜。接著，將混合物加熱至80℃，再保持5小時。減壓移除溶劑，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之17% MeOH)純化，得到呈紅褐色油狀之標題化合物(177 mg，經2個步驟67%產率)。m/z實驗值= 589.2 (M+H)。 N- 苯乙基 -N-(20- 苯基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(30 mg，183 µmol)於CH₂Cl₂(2.25 mL)中之溶液中添加HATU (153 mg，2.2 eq.，402 µmol)及DIPEA (70 µL，2.2 eq.，402 µmol)。攪拌10分鐘後，添加2-苯乙基2-20-苯基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(108 mg，183 µmol)於DMF (750 µL)中之溶液。將混合物攪拌1小時，減壓濃縮，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(己烷中85% EtOAc之)純化，得到所需醯胺。m/z實驗值= 735.3 (M+H), 635.3 (M+H-Boc), 757.2 (M+Na)。接著，將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.1 mL)。在室溫下攪拌2小時後，濃縮溶液，得到呈褐色油狀之標題化合物，其不經純化即用於下一步驟(111 mg，經2個步驟96%產率)。m/z實驗值= 635.2 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[( 苯乙基 )(17-{( 苯乙基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-9) 之製備

向5-{N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基}戊酸(50 mg，116 µmol)於CH₂Cl₂(1 mL)中之溶液中添加HATU (88.3 mg，2 eq.，232 µmol)及DIPEA (40.5 µL，2 eq.，232 µmol)。攪拌10分鐘後，N-苯乙基-N-(20-苯基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基)3-(對甲苯基)丙醯胺(111 mg，1.5 eq.，174 µmol)於CH₂Cl₂(1.87 mL)及DMF (717 µL)中之溶液。將混合物攪拌隔夜，減壓濃縮且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之15% MeOH)純化粗物質，得到醯胺中間體。m/z實驗值= 1047.3 (M+H), 524.3 (M+2H)。接著，將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。將溶液攪拌隔夜，濃縮至乾，且將殘餘物使用製備型HPLC (65% ACN/H₂O + 0.1%甲酸)純化，得到呈蠟樣固體狀之標題化合物(23 mg，經2個步驟22%)。m/z實驗值= 891.3 (M+H), 446.3 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.33 - 6.96 (m, 15H), 3.97 (t,J= 5.9 Hz, 1H), 3.69 - 3.61 (m, 1H), 3.61 - 3.47 (m, 24H), 3.44 (dtd,J= 13.3, 6.0, 2.8 Hz, 2H), 3.34 (d,J= 5.3 Hz, 1H), 3.20 (q,J= 6.6 Hz, 2H), 2.99 (s, 1H), 2.93 - 2.85 (m, 3H), 2.80 (ddd,J= 17.7, 9.5, 5.1 Hz, 2H), 2.70 (q,J= 7.8 Hz, 3H), 2.44 (t,J= 6.7 Hz, 1H), 2.34 (t,J= 7.6 Hz, 1H), 2.28 (d,J= 7.2 Hz, 3H), 2.21 (t,J= 6.6 Hz, 1H), 2.13 (dt,J= 12.4, 6.6 Hz, 2H), 1.94 (ddt,J= 15.6, 10.5, 5.2 Hz, 1H), 1.68 - 1.39 (m, 9H)。實例 41. 化合物 4-10 之合成 1-{2-[2-(2- 疊氮基乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 }-2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙烷之製備

將1-{2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙烷(100 mg，325 μmol)溶解於CH₂Cl₂(3.25 mL)中且添加三乙胺(90.7 μL，2 eq.，651 μmol)及(氯磺醯基)甲烷(50.4 μL，2 eq.，651 μmol)。攪拌1.5小時後，濃縮混合物且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(DCM中之20% MeOH)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(125 mg，定量)。m/z實驗值= 358.0 (M+H-N₂), 408.0 (M+Na), 403.1 (M+NH₄)。 1-17- 疊氮基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 1- 乙基苯基甲烷胺基甲酸酯之製備

向1-{2-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙烷(256 mg，664 µmol)於ACN (10 mL)中之溶液中添加三乙胺(278 µL，3 eq.，1.99 mmol)。在冰浴中冷卻混合物，隨後添加70%v/v乙胺(602 µL，11 eq.，7.57 mmol)。2小時後，將混合物升溫至75℃且攪拌隔夜。減壓移除溶劑，得到粗取代產物。m/z實驗值= 335.1 (M+H)。接著，將此粗物質溶解於CH₂Cl₂(10 mL)中，隨後在冰-水浴中添加三乙胺(185 µL，2 eq.，1.33 mmol)及氯甲酸苯甲酯(190 µL，2 eq.，1.33 mmol)。使混合物升溫至室溫且攪拌隔夜，隨後對其進行濃縮且藉由矽膠管柱層析法(DCM中之10-15% MeOH)純化，得到呈無色油狀之產物(283 mg，經2個步驟91%)。m/z實驗值= 469.1 (M+H)。 1-17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 1- 乙基苯基甲烷胺基甲酸酯之製備

向1-17-疊氮基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基1-乙基苯基甲烷胺基甲酸酯(283 mg，604 µmol)於無水THF (2.05 mL)中之溶液中添加PPh₃(190 mg，1.2 eq.，725 µmol)。將混合物攪拌2小時，此後添加H₂O (54.4 µL，5 eq.，3.02 mmol)。使反應升溫至55℃且在此溫度下攪拌2小時。減壓移除溶劑且將殘餘物使用胺基官能化之管柱層析法(溶劑系統)純化，得到呈黃色油狀之所需胺(267 mg，定量)。m/z實驗值= 443.2 (M+H)。 1- 乙基 1-17-[3-( 對甲苯基 ) 丙醯基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基苯基甲烷胺基甲酸酯之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(25 mg，152 µmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (116 mg，2 eq.，304 µmol)及DIPEA (53 µL，2 eq.，304 µmol)。攪拌5分鐘後，添加1-17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基1-乙基苯基甲烷胺基甲酸酯(80.9 mg，1.2 eq.，183 µmol)於CH₂Cl₂(3 mL)中之溶液。將褐色混合物在室溫下攪拌1小時，接著在壓力下濃縮且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(DCM中之10-15% MeOH)純化，得到呈深黃色油狀之所需產物(83 mg，93%產率)。m/z實驗值= 589.2 (M+H)。 (S)-6-[5-(N- 乙基 {17-[3-( 對甲苯基 ) 丙醯基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 } 胺甲醯基 ) 戊醯基胺基 ]-2-[( 三級丁基 )( 氧基羰基胺基 )] 己酸三級丁酯之製備

在氮氣氛圍下，向1-乙基1-17-[3-(對甲苯基)丙醯基胺基]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基苯基甲烷胺基甲酸酯(89.6 mg，152 µmol)於EtOH (3 mL)中之溶液中添加Pd(OH)₂(13 mg)。經由氣球將氫氣引入反應中。接著，將混合物攪拌隔夜，透過矽藻土過濾，並濃縮至乾，得到胺，其不經純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 455.2 (M+H)。將粗胺溶解於DMF (2.89 mL)中且添加(S)-2-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(87.8 mg，152 µmol)及三乙胺(63.5 µL，3 eq.，455 µmol)。攪拌3小時後，將混合物濃縮至乾且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10-15% MeOH)純化，得到呈無色油狀之產物(81 mg，經2個步驟62%產率)。m/z實驗值= 867.3 (M+H), 434.2 (M+2H)。 (S)-6-[5-(N- 乙基 {17-[3-( 對甲苯基 ) 丙醯基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 } 胺甲醯基 ) 戊醯基胺基 ]-2- 胺基己酸 ( 化合物 4-10) 之製備

向(S)-6-[5-(N-乙基{17-[3-(對甲苯基)丙醯基胺基]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}胺甲醯基)戊醯基胺基]-2-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]己酸三級丁酯(81 mg，93.4 µmol)於CH₂Cl₂(1 mL)中之溶液中隨後添加TFA (1 mL)。將混合物攪拌2小時，濃縮至乾，且將粗混合物使用製備型HPLC (H₂O + 0.1%甲酸中之45% ACN)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(42.6 mg，64%產率)。m/z實驗值= 711.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.27 (s, 1H), 7.94 (q,J= 6.3 Hz, 1H), 7.81 (q,J= 5.4 Hz, 1H), 7.07 (s, 4H), 3.55 - 3.48 (m, 18H), 3.47 - 3.40 (m, 1H), 3.37 (t,J= 5.9 Hz, 3H), 3.34 - 3.23 (m, 1H), 3.18 (q,J= 5.8 Hz, 2H), 3.12 (dd,J= 7.1, 5.0 Hz, 1H), 3.05 - 2.95 (m, 2H), 2.75 (dd,J= 8.8, 6.8 Hz, 2H), 2.34 (dd,J= 8.8, 6.8 Hz, 2H), 2.25 (s, 5H), 2.05 (dq,J= 7.2, 3.6 Hz, 2H), 1.70 (dd,J= 9.3, 5.3 Hz, 1H), 1.57 (p,J= 7.7 Hz, 1H), 1.47 (s, 4H), 1.35 (d,J= 8.7 Hz, 4H), 1.03 (dt,J= 40.4, 7.0 Hz, 3H)。實例 42. 化合物 4-11 之合成 21-[( 三級丁基 )( 氧基羰基胺基 )]-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4- 氮雜二十一烷酸苯甲酯之製備

將17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(0.5 g，1.31 mmol)及丙烯酸苯甲酯(155 µL，0.8 eq.，1.05 mmol)一起混合於EtOH (2.11 mL)中且攪拌隔夜。減壓移除溶劑，且將所得粗物質使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10-20% MeOH)純化，得到標題化合物(378 mg，53%產率)。m/z實驗值= 543.2 (M+H)。 3-[(17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )( 苯甲基 )( 氧基羰基胺基 )] 丙酸苯甲酯之製備

將21-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]-7,10,13,16,19-五氧雜-4-氮雜二十一烷酸苯甲酯(378 mg，0.69 mmol)溶解於CH₂Cl₂(4.5 mL)中且添加三乙胺(100 μL，1.1 eq.，0.73 mmol)。在冰-水浴中冷卻燒瓶，接著在氮氣氛圍下逐滴添加Cbz-Cl (100 μL，1 eq.，0.69 mmol)。將所得溶液攪拌隔夜，減壓濃縮，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之20% MeOH)純化，得到Cbz保護之胺。m/z實驗值= 677.2 (M+H), 699.2 (M+Na)。將此物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (200 μL)。2小時後，減壓移除溶劑，且將殘餘物使用胺基官能化之管柱層析法(CH₂Cl₂中之4% MeOH)純化，得到標題化合物(401 mg，定量)。m/z實驗值= 577.2 (M+H)。 21-{( 苯甲基 )[2-( 苯甲氧基羰基 ) 乙基 ]( 氧基羰基胺基 )}-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4- 氮雜二十一烷酸苯甲酯之製備

將3-[(17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)(苯甲基)(氧基羰基胺基)]丙酸苯甲酯(401 mg，696 µmol)及丙烯酸苯甲酯(82.1 µL，0.8 eq.，557 µmol)一起混合於EtOH (1.12 mL)中且在室溫下攪拌1小時。接著，將混合物濃縮至乾，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之6% MeOH)純化，得到標題化合物(190 mg，37%產率)。m/z實驗值= 739.2 (M+H)。 3-[( 苯甲基 )17-{[2-( 苯甲氧基羰基 ) 乙基 ][2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 )-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )( 氧基羰基胺基 )] 丙酸苯甲酯之製備

向對甲苯基丙酸(10 mg，122 μmol)於DMF (0.5 mL)中之溶液中添加HATU (92.6 mg，2 eq.，244 μmol)及DIPEA (42.4 μL，2 eq.，244 μmol)。攪拌10分鐘後，添加21-{(苯甲基)[2-(苯甲氧基羰基)乙基](氧基羰基胺基)}-7,10,13,16,19-五氧雜-4-氮雜二十一烷酸苯甲酯(90 mg，122 µmol)於CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液。在室溫下攪拌混合物。將溶液攪拌2小時，減壓濃縮且使用矽膠管柱層析法(100% EtOAc)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(51.5 mg，47%產率)。m/z實驗值= 885.2 (M+H)。 21-{(2- 羧基乙基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4- 氮雜二十一烷酸之製備

在氮氣氛圍下，將3-[(苯甲基)17-{[2-(苯甲氧基羰基)乙基][2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基)-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)(氧基羰基胺基)]丙酸苯甲酯(237 mg，268 μmol)溶解於無水THF (6.47 mL)中。接著添加Pd/C (10% w/w，28.5 mg，0.1 eq.，26.8 μmol)，隨後經由氣球添加氫氣。將反應混合物攪拌隔夜，透過矽藻土過濾，接著用EtOH洗滌，得到所需二酸(30.9 mg，20%產率)。m/z實驗值= 571.2 (M+H)。 3-[(17-{(2- 羧基乙基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )(4-{N-(S)-5- 三級丁氧基羰基 -5-[( 三級丁基 )( 氧基羰基胺基 )] 戊基胺甲醯基 } 丁基 ) 羰基胺基 ] 丙酸之製備

向21-{(2-羧基乙基)[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-7,10,13,16,19-五氧雜-4-氮雜二十一烷酸(45 mg，78.9 µmol)及(S)-2-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(45.6 mg，78.9 µmol)於DMF (1.5 mL)中之溶液中添加三乙胺(33 µL，3 eq.，237 µmol)。將溶液攪拌1小時，濃縮至乾，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之50-75% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(28.4 mg，37%產率)。m/z實驗值= 983.3 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[(2- 羧基乙基 )(17-{(2- 羧基乙基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 ] 己酸 ( 化合物 4-11) 之製備

向3-[(17-{(2-羧基乙基)[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)(4-{N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基}丁基)羰基胺基]丙酸(28.4 mg，28.9 μmol)於CH₂Cl₂(1.5 mL)中之溶液中添加TFA (750 μL)且將所得溶液攪拌隔夜。減壓移除溶劑，得到粗物質，將其使用製備型HPLC (35% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(5.8 mg，24%產率)。m/z實驗值= 827.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.14 - 7.03 (m, 4H), 3.50 (d,J= 8.4 Hz, 11H), 3.43 (s, 12H), 3.02 (s, 1H), 2.74 (s, 2H), 2.63 (s, 1H), 2.61 - 2,56 (m, 1H), 2.34 (s, 2H), 2.25 (s, 2H), 2.03 (q,J= 10.6 Hz, 4H), 1.46 (s, 5H), 1.24 (s, 16H), 0.86 (t,J= 6.6 Hz, 3H)。實例 43. 化合物 4-12 之合成 3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一碳 -20- 烯 -1- 醇氫溴酸鹽之製備

在密封管中將溴-PEG6-醇(500 mg，1.45 mmol)及三乙胺(610 µL，3 eq.，4.34 mmol)溶解於DMF (7 mL)中，攪拌5分鐘，隨後在氮氣氛圍下緩慢添加烯丙基胺(543 µL，5 eq.，7.24 mmol)。接著，將管密封，且將反應混合物加熱至90℃並攪拌隔夜。減壓移除溶劑且將產物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之5-40% MeOH-1% NH₄OH)純化，得到呈深褐色油狀之3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一碳-20-烯-1-醇氫溴酸鹽(451 mg，77%產率)。m/z實驗值= 322.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 5.91-6.01 (m, 1H), 5.49-5.57 (m, 2H), 3.62-3.76 (m, 23H), 3.57 (t,J= 4.7 Hz, 2H), 3.23 (t,J= 4.9 Hz, 2H)。 N- 烯丙基 -N-(17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )-3-( 對甲苯基 ) 丙烯醯胺之製備

醯氯之製備 ：在火焰乾燥之RBF中，將3-(對甲苯基)丙酸(166 mg，1.01 mmol)溶解於含數滴無水DMF之CH₂Cl₂(3 mL)中。在氮氣下，將溶液攪拌5分鐘，隨後將其放入冰浴中。在氮氣下，將草醯氯(100 µL，1.05 eq.，1.18 mmol)添加至燒瓶中，且在0℃下將反應混合物攪拌15分鐘，隨後使其升溫至室溫。攪拌2小時後，將反應混合物減壓濃縮且再懸浮於無水CH₂Cl₂(2 mL)中。

醯胺偶聯程序：在火焰乾燥之RBF中，將3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一碳-20-烯-1-醇氫溴酸鹽(451 mg，1.12 mmol)及三乙胺(628 µL，4.48 mmol，4.0 eq.)溶解於無水CH₂Cl₂(2 mL)中。在氮氣下，在室溫下將混合物攪拌15分鐘，隨後將其置放於冰浴中。在0℃下，經15分鐘將醯氯於CH₂Cl₂中之溶液逐滴添加至胺溶液中，且將反應混合物在此溫度下攪拌30分鐘，隨後使其升溫至室溫。再攪拌1.5小時後，用NaHCO₃飽和水溶液淬滅反應，用CH₂Cl₂萃取，用水及鹽水洗滌。將有機相用無水NaSO₄乾燥，過濾並減壓濃縮。將產物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-15% MeOH)純化，得到呈黃色液體狀之N-烯丙基-N-(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)-3-(對甲苯基)丙烯醯胺(425 mg，81%產率)。m/z實驗值= 468.4 (M+H), 485.5 (M+NH₄)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.08-7.12 (m, 4H), 5.75-5.79 (m, 1H), 5.04-5.17 (m, 2H), 4.01 (t,J= 6.5 Hz, 2H), 3.46-3.66 (m, 24H), 2.84-2.90 (m, 2H), 2.75 (t,J= 7.7 Hz, 1H), 2.61 (t,J= 7.7 Hz, 1H), 2.29 (s, 3H)。 甲烷磺酸 18-(3-( 對甲苯基 ) 丙醯基 )-3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一碳 -20- 烯 -1- 基酯之製備

在氮氣氛圍下，在0℃下向N-烯丙基-N-(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)-3-(對甲苯基)丙烯醯胺(425 mg，909 µmol)及三乙胺(260 µL，2 eq.，1.85 mmol)於無水CH₂Cl₂(9 mL)中之溶液中添加甲烷磺醯氯(127 µL，1.8 eq.，1.64 mmol)。將反應混合物在此溫度下攪拌30分鐘，隨後使其升溫至室溫。攪拌1.5小時後，用NaHCO₃飽和水溶液與水之混合物(5 mL，1/1 v/v)萃取反應混合物。用CH₂Cl₂萃取水相，且將有機層用鹽水洗滌，用無水NaSO₄乾燥，過濾並減壓濃縮，得到呈白色固體及黃色液體之混合物形式的標題化合物，其不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 546.3 (M+H), 568.3 (M+Na)。 N- 烯丙基 -N-(3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十一碳 -20- 烯 -1- 基 )-3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向甲烷磺酸18-(3-(對甲苯基)丙醯基)-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一碳-20-烯-1-基酯(524 mg，0.93 mmol)於無水DMF (9 mL)中之溶液中添加三乙胺(390 µL，3 eq.，2.78 mmol)及烯丙基胺(480 µL，7 eq.，6.40 mmol)。接著，將管密封，且將反應混合物在80℃下攪拌隔夜，濃縮至乾。減壓移除溶劑，且將粗混合物藉由矽膠管柱層析法(DCM/MeOH 100:0至40:60 v:v)純化，得到呈褐色液體狀之N-烯丙基-N-(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一碳-20-烯-1-基)-3-(對甲苯基)丙醯胺(266 mg，經2個步驟58%產率)。m/z實驗值= 507.4 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 7.07-7.11 (m, 4H), 5.72-5.95 (m, 2H), 5.42-5.52 (m, 2H), 5.04-5.17 (m, 2H), 3.97-4.02 (m, 2H), 3.72 (q,J= 5.0 Hz, 2H), 3.47-3.67 (m, 23H), 3.14-3.16 (m, 2H), 2.87 (q,J= 7.5 Hz, 2H), 2.75 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 2.61 (t,J= 7.7 Hz, 1H), 2.28 (s, 3H)。 (S)-22- 烯丙基 -34-(( 三級丁氧基羰基 ) 胺基 )-23,28- 二側氧基 -4-(3-( 對甲苯基 ) 丙醯基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22,29- 三氮雜三十五碳 -1- 烯 -35- 酸三級丁酯之製備

在氮氣下，在0℃下經20分鐘向N-烯丙基-N-(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十一碳-20-烯-1-基)-3-(對甲苯基)丙醯胺(266 mg，525 µmol)及三乙胺(600 µL，8.2 eq.，4.28 mmol)於無水CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液中逐滴添加N² -(三級丁氧基羰基)-N⁶ -(6-側氧基-6-(2,3,5,6-四氟苯氧基)己醯基)-L-離胺酸三級丁酯(中間體 D，365 mg，1.2 eq.，630 µmol)於無水CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液。將反應混合物升溫至室溫，在氮氣下攪拌隔夜，並減壓濃縮。將所得殘餘物再懸浮於10 mL CH₂Cl₂中且用NaHCO₃飽和水溶液、水及鹽水洗滌。將合併之有機相用無水NaSO₄乾燥，過濾且減壓濃縮濾液。將產物藉由矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-70% MeOH)，隨後藉由逆相管柱層析法(H₂O中之40-100% ACN)純化，得到呈黃色油狀之(S)-22-烯丙基-34-((三級丁氧基羰基)胺基)-23,28-二側氧基-4-(3-(對甲苯基)丙醯基)-7,10,13,16,19-五氧雜-4,22,29-三氮雜三十五碳-1-烯-35-酸三級丁酯(333 mg，69 %產率)。m/z實驗值= 919.8 (M+H), 936.8 (M+NH₄), 941.8 (M+Na)。¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.09-7.05 (m, 4H), 5.88-5.68 (m, 2H), 5.19-5.01 (m, 4H), 4.06 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 4.00-3.97 (m, 3H), 3.90 (dd, J = 8.9, 5.0 Hz, 1H), 3.59-3.41 (m, 25H), 3.13 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.84 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 2.73 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 2.59 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 2.47 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.34 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.17-2.14 (m, 2H), 1.75-1.26 (m, 31H)。 (S)-22- 烯丙基 -34- 胺基 -23,28- 二側氧基 -4-(3-( 對甲苯基 ) 丙醯基 )-7,10,13,16,19- 五氧雜 -4,22,29- 三氮雜三十五碳 -1- 烯 -35- 酸 ( 化合物 4-12) 之製備

向(S)-22-烯丙基-34-((三級丁氧基羰基)胺基)-23,28-二側氧基-4-(3-(對甲苯基)丙醯基)-7,10,13,16,19-五氧雜-4,22,29-三氮雜三十五碳-1-烯-35-酸三級丁酯(266 mg，289 µmol)於無水CH₂Cl₂(3.0 mL)中之溶液中添加TFA (665 µL，30 eq.，8.68 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌隔夜，且接著減壓濃縮。將粗物質溶解於8 mL H₂O及1 mL MeCN中，過濾，再用1 mL H₂O洗滌並凍乾，得到呈黃色液體狀之(S)-22-烯丙基-34-胺基-23,28-二側氧基-4-(3-(對甲苯基)丙醯基)-7,10,13,16,19-五氧雜-4,22,29-三氮雜三十五碳-1-烯-35-酸(270 mg，77%產率，呈3.9×TFA鹽形式)。m/z實驗值= 763.5 (M+H), 382.3 (M+2H)。¹H NMR (DMSO-d ₆, 400 MHz): δ 8.18 (s, 3H), 7.75 (t,J= 5.5 Hz, 1H), 7.05-7.11 (m, 4H), 5.65-5.87 (m, 2H), 5.02-5.16 (m, 4H), 3.88-3.96 (m, 5H), 3.46-3.50 (m, 21H), 3.38 (m, 4H), 3.01 (d,J= 6.9 Hz, 2H), 2.74 (m, 2H), 2.63-2.67 (m, 1H), 2.54 (與DMSO-d峰重疊, 2H), 2.34 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.25 (s, 4H), 2.03-2.09 (m, 2H), 1.75 (m, 2H), 1.42-1.39 (m, 7H)。實例 44. 化合物 4-13 之合成 2,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5- 氮雜二十二烷 -22- 醇之製備

將溴-PEG6-醇(1 g，2.90 mmol)及三乙胺(1.20 mL，3 eq.，8.57 mmol)以及2-甲氧基乙胺(1.28 mL，5 eq.，14.5 mmol)溶解於無水DMF (29.0 mL)中。將反應器密封且在80℃下攪拌隔夜。18小時後，將反應混合物冷卻至室溫且減壓移除溶劑。將產物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之5-40% MeOH-1% NH₄OH)純化，得到呈褐色油狀之2,8,11,14,17,20-六氧雜-5-氮雜二十二烷-22-醇(740 mg，75%產率)。m/z實驗值= 340.2 (M+H)。¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 3.75 (t,J= 5.0 Hz, 2H), 3.68-3.60 (m, 21H), 3.55 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 3.39 (s, 3H), 3.24 (q, J = 5.2 Hz, 4H)。 N-(17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )-N-(2- 甲氧基乙基 )-3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

醯氯之製備：將3-(對甲苯基)丙酸(322 mg，0.9 eq.，1.96 mmol)溶解於含數滴無水DMF之無水CH₂Cl₂(4 mL)中。在氮氣下，將溶液攪拌5分鐘，隨後將其置放於冰浴中。在氮氣下，將草醯氯(200 µL，1.1 eq.，2.35 mmol)添加至燒瓶中，且將反應混合物在0℃下攪拌15分鐘，隨後使其升溫至室溫。在室溫下攪拌2小時後，將反應混合物減壓濃縮且使其再懸浮於無水CH₂Cl₂(2 mL)中。醯胺偶聯程序：將2,8,11,14,17,20-六氧雜-5-氮雜二十二烷-22-醇(740 mg，2.18 mmol)及三乙胺(1.22 mL，4 eq.，8.72 mmol)溶解於無水CH₂Cl₂(2 mL)中。在氮氣下，在室溫下將混合物攪拌15分鐘，隨後將其置放於冰浴中。在0℃下，將醯氯於CH₂Cl₂中之溶液逐滴添加至胺溶液中，保持15分鐘，且將反應混合物在0℃下攪拌30分鐘，隨後使其升溫至室溫。將反應混合物在室溫下再攪拌1.5小時，隨後使用飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應。接著，將反應混合物用CH₂Cl₂萃取，用水及鹽水洗滌。將有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。將產物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-10% MeOH)純化，得到呈油狀之N-(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)-N-(2-甲氧基乙基)-3-(對甲苯基)丙醯胺(570 mg，54%產率)。m/z實驗值= 486.4 (M+H), 503.4 (M+NH₄)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 7.06-7.11 (m, 4H), 3.44-3.66 (m, 29H), 3.31 (2H, 與溶劑峰重疊), 2.86 (t,J= 7.3 Hz, 2H), 2.71 (q,J= 9.0 Hz, 2H), 2.29 (s, 3H)。 N-(2,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5- 氮雜二十二烷 -22- 基 )-N-(2- 甲氧基乙基 )-3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

將N-(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)-N-(2-甲氧基乙基)-3-(對甲苯基)丙醯胺(570 mg，1.17 mmol)及三乙胺(329 µL，2 eq.，2.35 mmol)溶解於無水CH₂Cl₂(11.7 mL)中且用氮氣吹掃5分鐘。在氮氣下，在0℃下將甲烷磺醯氯(164 µL，1.8 eq.，2.11 mmol)添加至反應混合物中。將反應混合物在0℃下攪拌30分鐘，隨後使其升溫至室溫。再過1.5小時後，將反應混合物用飽和碳酸氫鈉水溶液與水之混合物(1/1，v/v)萃取。將水相用CH₂Cl₂萃取兩次且將合併之有機層用鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮，得到1.1 g的白色固體與黃色液體之混合物。將此粗混合物溶解於無水DMF (12 mL)中且添加三乙胺(494 µL，3.52 mmol，3.0 eq.)。在氮氣下，將2-甲氧基乙-1-胺(521 µL，5 eq.，5.87 mmol)引入反應中且將反應混合物加熱至80℃隔夜。減壓移除溶劑，且將殘餘物藉由矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-60% MeOH)純化，得到呈透明油狀之N-(2,8,11,14,17,20-六氧雜-5-氮雜二十二烷-22-基)-N-(2-甲氧基乙基)-3-(對甲苯基)丙醯胺(330 mg，經2個步驟52%產率)。m/z實驗值= 543.4 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.09 (dd,J= 11.7, 7.8 Hz, 4H), 3.74 (q,J= 5.2 Hz, 2H), 3.66-3.40 (m, 30H), 3.31 (與溶劑峰重疊, 2H), 3.24-3.18 (m, 4H), 2.86 (t,J= 7.0 Hz, 2H), 2.74-2.67 (m, 2H), 2.28 (s, 3H)。 (S)-35-(( 三級丁氧基羰基 ) 胺基 )-23-(2- 甲氧基乙基 )-24,29- 二側氧基 -5-(3-( 對甲苯基 ) 丙醯基 )-2,8,11,14,17,20- 六氧雜 -5,23,30- 三氮雜三十六烷 -36- 酸三級丁酯之製備

在氮氣氛圍下，在0℃下經20分鐘向N-(2,8,11,14,17,20-六氧雜-5-氮雜二十二烷-22-基)-N-(2-甲氧基乙基)-3-(對甲苯基)丙烯醯胺(330 mg，608 µmol)及三乙胺(600 µL，7 eq.，4.26 mmol)於無水CH₂Cl₂(3 mL)中之溶液中逐滴添加N² -(三級丁氧基羰基)-N⁶ -(6-側氧基-6-(2,3,5,6-四氟苯氧基)己醯基)-L-離胺酸三級丁酯(387 mg，1.1 eq.，669 µmol)於無水CH₂Cl₂(3 mL)中之溶液。將反應物升溫至室溫並攪拌18小時，隨後對其進行減壓濃縮。將所得殘餘物懸浮於CH₂Cl₂中，用飽和碳酸氫鈉水溶液、水及鹽水洗滌。將合併之有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾並減壓濃縮。將產物藉由矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-70% MeOH)且接著藉由逆相管柱層析法(水-0.1%碳酸氫銨中之15-100% ACN)純化，得到呈褐色油狀之(S)-35-((三級丁氧基羰基)胺基)-23-(2-甲氧基乙基)-24,29-二側氧基-5-(3-(對甲苯基)丙醯基)-2,8,11,14,17,20-六氧雜-5,23,30-三氮雜三十六烷-36-酸三級丁酯(360 mg，62%產率)。m/z實驗值= 478.4 (M+2H), 428.4 (M+2H-Boc)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.71 (m, 1H), 7.09-7.01 (m, 5H), 3.71 (m, 1H), 3.48-3.37 (m, 32H), 3.23-3.20 (m, 6H), 2.97 (q,J= 6.4 Hz, 2H), 2.72 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 2.59-2.56 (m, 2H), 2.29 (t,J= 6.6 Hz, 2H), 2.23 (s, 3H), 2.01 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 1.43-1.22 (m, 28H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[(2- 甲氧基乙基 ){17-[(2- 甲氧基乙基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 } 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-13) 之製備

向(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-{5-[(2-甲氧基乙基){17-[(2-甲氧基乙基)[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}胺甲醯基]戊醯基胺基}己酸三級丁酯(48.8 mg，51.1 μmol)於CH₂Cl₂(1 mL)中之溶液中添加TFA (1 mL)。將溶液攪拌隔夜，在真空中濃縮，且將殘餘物使用製備型HPLC (H₂O + 0.1% TFA中之50% ACN)純化，得到呈白色固體狀之產物(40.7 mg，定量)。m/z實驗值= 799.2 (M+H), 400.2 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.17 (s, 3H), 7.79 - 7.73 (m, 1H), 7.13 - 7.03 (m, 4H), 3.89 (s, 1H), 3.54 - 3.34 (m, 27H), 3.28 - 3.20 (m, 8H), 3.02 (q,J= 6.3 Hz, 2H), 2.75 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 2.61 (td,J= 8.5, 6.7 Hz, 2H), 2.31 (q,J= 6.2 Hz, 2H), 2.26 (s, 3H), 2.05 (dd,J= 14.0, 7.3 Hz, 2H), 1.81 - 1.70 (m, 2H), 1.53 - 1.35 (m, 8H)。實例 45. 化合物 4-14 之合成 (S)-2- 胺基 -6-[3-( 對甲苯基 ) 硫脲基 ] 己酸 ( 化合物 4-14) 之製備

向對異硫氰基甲苯(75 mg，503 μmol)及(S)-6-胺基-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]己酸三級丁酯(228 mg，1.5 eq.，754 μmol)於DMF (16.6 mL)中之溶液中添加DIPEA (438 μL，5 eq.，2.51 mmol)。攪拌30分鐘後，將混合物濃縮至乾，再溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中，且添加TFA (1.5 mL)。將溶液攪拌隔夜，濃縮至乾，且將殘餘物使用製備型HPLC (30% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(58.8 mg，經2個步驟40%產率)。m/z實驗值= 296.0 (M+H)。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 9.52 (s, 1H), 8.26 (d,J= 4.9 Hz, 3H), 7.78 (t,J= 5.4 Hz, 1H), 7.30 - 7.22 (m, 2H), 7.16 - 7.09 (m, 2H), 3.91 (q,J= 5.7 Hz, 1H), 3.45 (q,J= 6.9 Hz, 2H), 1.88 - 1.72 (m, 2H), 1.60 - 1.50 (m, 2H), 1.49 - 1.29 (m, 2H)。實例 46. 化合物 4-15 之合成 N- 乙基 -N-(3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 )( 對甲苯氧基 ) 乙醯胺之製備

向(對甲苯氧基)乙酸(25 mg，150 µmol)於DMF (2 mL)中之溶液中添加HATU (114 mg，2 eq.，301 µmol)及DIPEA (105 µL，4 eq.，602 µmol)。攪拌5分鐘後，添加2-乙基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(65.7 mg，150 µmol)於CH₂Cl₂(3.8 mL)中之溶液。攪拌反應1小時，在真空中濃縮且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化粗物質，得到所需偶聯產物。m/z實驗值= 585.2 (M+H)。接著，將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。攪拌1小時後，減壓移除溶劑且所得粗產物不經純化即用於下一步驟(73.5 mg，定量)。m/z實驗值= 485.1 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[N- 乙基 (17-{N- 乙基 [( 對甲苯氧基 ) 甲基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-15) 之製備

向N-乙基-N-(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基)(對甲苯氧基)乙醯胺(70 mg，144 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(83.6 mg，144 µmol)於CH₂Cl₂(3 mL)中之溶液中添加三乙胺(60.4 µL，3 eq.，433 µmol)。攪拌反應隔夜，在真空中濃縮，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之15% MeOH)純化，得到呈無色油狀的完全保護之中間體。m/z實驗值= 897.2 (M+H)。接著，將此中間體溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (2 mL)。攪拌1小時後，移除溶劑且將殘餘物使用製備型HPLC (40% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(46.5 mg，經2個步驟43%產率)。m/z實驗值= 741.2 (M+H)。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.17 (d,J= 5.4 Hz, 3H), 7.77 (q,J= 5.4 Hz, 1H), 7.07 (t,J= 7.8 Hz, 2H), 6.82 - 6.73 (m, 2H), 4.79 (s, 1H), 4.73 (s, 1H), 3.90 (q,J= 5.8 Hz, 1H), 3.51 - 3.22 (m, 29H), 3.02 (q,J= 6.4 Hz, 2H), 2.28 (q,J= 7.6 Hz, 2H), 2.22 (d,J= 2.6 Hz, 3H), 2.11 - 2.01 (m, 3H), 1.83 - 1.68 (m, 2H), 1.51 - 1.44 (m, 5H), 1.39 (d,J= 6.7 Hz, 3H), 1.14 (t,J= 7.1 Hz, 1H), 1.08 (t,J= 7.0 Hz, 1H), 1.00 (dt,J= 18.9, 7.0 Hz, 3H)。實例 47. 化合物 4-16 之合成 N-(17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )( 對甲苯氧基 ) 乙醯胺之製備

向(對甲苯氧基)乙酸(25 mg，150 µmol)於DMF (2 mL)中之溶液中添加HATU (114 mg，2 eq.，301 µmol)及DIPEA (105 µL，4 eq.，602 µmol)。攪拌5分鐘後，添加17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(57.2 mg，150 µmol)於CH₂Cl₂(3.8 mL)中之溶液。將反應混合物攪拌1小時，濃縮至乾，且將殘餘物使用管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到呈油狀之所需偶聯產物。m/z實驗值= 529.1 (M+H)。接著，將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。將混合物在室溫下攪拌1小時並濃縮至乾，得到呈TFA鹽形式的所需胺(86.4 mg，定量)。m/z實驗值= 429.1 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-[5-(N-17-{[( 對甲苯氧基 ) 甲基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 ) 戊醯基胺基 ] 己酸之製備

向N-(17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)(對甲苯氧基)乙醯胺(109 mg，202 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(117 mg，202 µmol)於CH₂Cl₂(4.19 mL)中之溶液中添加三乙胺(84.3 µL，3 eq.，605 µmol)。攪拌反應隔夜，在真空中濃縮，且將殘餘物使用管柱層析法(CH₂Cl₂中之15% MeOH)純化，得到呈油狀的完全保護之中間體。m/z實驗值= 841.2 (M+H)。將中間體溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (2 mL)。攪拌隔夜後，將混合物濃縮且使用製備型HPLC (H₂O + 0.1% TFA中之40% ACN)純化，得到呈無色油狀之產物(72.2 mg，經2個步驟52%)。m/z實驗值= 685.2 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.32 - 8.10 (m, 3H), 8.03 (t,J= 5.7 Hz, 1H), 7.85 (t,J= 5.7 Hz, 1H), 7.75 (t,J= 5.7 Hz, 1H), 7.10 (d,J= 8.1 Hz, 2H), 6.85 (d,J= 8.1 Hz, 2H), 4.42 (s, 2H), 3.92 - 3.85 (m, 2H), 3.48 - 3.35 (m, 16H), 3.30 (t,J= 5.9 Hz, 2H), 3.18 (q,J= 5.8 Hz, 2H), 3.02 (q,J= 6.4 Hz, 2H), 2.24 (s, 3H), 2.05 (dd,J= 12.3, 5.9 Hz, 5H), 1.75 (s, 3H), 1.53 - 1.22 (m, 9H)。實例 48. 化合物 4-17 之合成 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2-(4- 吡啶基 ) 甲基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(0.5 g，1.45 mmol)於ACN (15 mL)中之溶液中添加[(4-吡啶基)甲基]胺(157 mg，1.45 mmol)及三乙胺(606 µL，3 eq.，4.34 mmol)。將燒瓶裝備冷凝器且加熱至80℃。在此溫度下攪拌16小時後，將混合物真空濃縮，得到經取代之產物。m/z實驗值= 373.1 (M+H)。將此粗物質溶解於MeOH (3.33 mL)中且添加Boc₂O (948 mg，3 eq.，4.34 mmol)。將所得深紅色溶液攪拌1小時，在真空中濃縮，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(DCM中之20% MeOH)純化，得到產物(360 mg，經2個步驟53%產率)。m/z實驗值= 473.1 (M+H)。 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 )[(4- 吡啶基 ) 甲基 ] 胺基甲酸三級丁酯之製備

向2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-(4-吡啶基)甲基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(360 mg，762 µmol)於CH₂Cl₂(7.62 mL)中之溶液中添加(氯磺醯基)甲烷(88.4 µL，1.5 eq.，1.14 mmol)及三乙胺(159 µL，1.5 eq.，1.14 mmol)。將混合物攪拌12小時，在真空中濃縮且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之2-10% MeOH)純化，得到呈油狀之標題化合物(180 mg，43%產率)。m/z實驗值= 551.1 (M+H) 2-3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 2-(4- 吡啶基 ) 甲基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向(2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)[(4-吡啶基)甲基]胺基甲酸三級丁酯(180 mg，327 μmol)於ACN (3.27 mL)中之溶液中添加70% v/v乙胺(54.6 μL，3 eq.，981 μmol)及DIPEA (171 μL，3 eq.，981 μmol)。將混合物在80℃下攪拌16小時，在真空中濃縮，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之38% MeOH)純化，得到呈油狀之標題化合物(71.4 mg，44%產率)。m/z實驗值= 500.1 (M+H)。 N- 乙基 -N-[19-(4- 吡啶基 )-3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜十九烷基 ]3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺— 2,2,2- 三氟 -1,1- 乙二醇之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(20 mg，122 µmol)於DMF (1.62 mL)中之溶液中添加HATU (92.6 mg，2 eq.，244 µmol)及DIPEA (84.9 µL，4 eq.，487 µmol)。攪拌5分鐘後，將2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-(4-吡啶基)甲基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(60.9 mg，122 µmol)於CH₂Cl₂(3.08 mL)中之溶液中添加至反應中。將混合物攪拌隔夜，濃縮至乾，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之4% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之醯胺(69 mg，86%產率)。m/z實驗值= 646.2 (M+H)。將此物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。將溶液攪拌隔夜並真空濃縮，得到標題化合物，將其不經純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 546.2 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[(17-{N- 乙基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )[(4- 吡啶基 ) 甲基 ] 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-17) 之製備

向N-乙基-N-[19-(4-吡啶基)-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜十九烷基]3-(對甲苯基)丙醯胺—2,2,2-三氟-1,1-乙二醇(1/1) (81.2 mg，123 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(71 mg，123 µmol)於CH₂Cl₂(5 mL)中之溶液中添加三乙胺(51.3 µL，3 eq.，368 µmol)。攪拌隔夜後，將混合物濃縮至乾且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之15-20% MeOH)純化，得到呈無色油狀的完全保護之中間體。m/z實驗值= 958.2 (M+H)。接著，將此物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。將溶液攪拌隔夜，濃縮至乾且使用製備型HPLC (H₂O + 0.1% TFA中之35% ACN)純化，得到呈無色油狀之產物(10.1 mg，經2個步驟10%產率)。m/z實驗值= 802.1 (M+H)。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.59 (s, 2H), 8.17 (s, 2H), 7.77 (t,J= 5.6 Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.14 - 7.03 (m, 4H), 4.63 (s, 1H), 3.89 (s, 1H), 3.62 - 3.43 (m, 26H), 3.29 (dt,J= 9.4, 7.0 Hz, 2H), 3.01 (dd,J= 13.8, 6.8 Hz, 2H), 2.75 (q,J= 8.4 Hz, 2H), 2.61 - 2.51 (m, 2H), 2.48 (s, 2H), 2.25 (d,J= 2.0 Hz, 2H), 2.19 (d,J= 6.9 Hz, 2H), 1.99 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 1.76 (d,J= 8.9 Hz, 2H), 1.53 - 1.48 (m, 2H), 1.39 (d,J= 6.4 Hz, 4H), 1.01 (dt,J= 21.7, 7.0 Hz, 3H)。實例 49. 化合物 4-18 之合成 N- 乙基 -N-(3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 ) 丁醯胺之製備

向丁酸(15.6 µL，170 µmol)於DMF (2.26 mL)中之溶液中添加HATU (129 mg，2 eq.，340 µmol)及DIPEA (119 µL，4 eq.，681 µmol)。攪拌5分鐘後，添加2-乙基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(74.3 mg，170 µmol)於DCM (4.3 mL，67.2 mmol)中之溶液。將反應混合物攪拌2小時，在真空中濃縮，並使用管柱層析法(CH₂Cl₂中之11% MeOH)純化粗物質，得到呈黃色油狀之產物。m/z實驗值= 507.2 (M+H)。將此物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。將反應混合物攪拌2.5小時並濃縮至乾，得到呈黃色固體狀之產物，其不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 407.2 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-(5-{N- 乙基 [17-(N- 乙基丁醯基胺基 )-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ] 胺甲醯基 } 戊醯基胺基 ) 己酸 ( 化合物 4-18) 之製備

向N-乙基-N-(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基)丁醯胺(88.6 mg，218 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(126 mg，218 µmol)於CH₂Cl₂(4.53 mL)中之溶液中添加三乙胺(91.1 µL，3 eq.，654 µmol)。攪拌反應4.5小時，此後將反應物濃縮至乾且將粗物質使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之17% MeOH)純化，得到呈無色油狀之所需中間體。m/z實驗值= 819.2 (M+H)。接著，將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)及TFA (1 mL)中且攪拌隔夜。移除溶劑，且將殘餘物使用製備型HPLC (50% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到無色油狀物(36.4 mg，經4個步驟25%產率)。m/z實驗值= 663.2 (M+H)。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.17 (s, 2H), 7.77 (q,J= 5.4 Hz, 1H), 3.90 (d,J= 7.0 Hz, 1H), 3.55 - 3.48 (m, 15H), 3.48 - 3.40 (m, 2H), 3.38 (d,J= 6.2 Hz, 1H), 3.34 - 3.24 (m, 14H), 3.02 (q,J= 6.5 Hz, 2H), 2.27 (dq,J= 10.6, 7.5 Hz, 4H), 2.10 - 2.01 (m, 2H), 1.75 (td,J= 11.7, 5.7 Hz, 2H), 1.50 (dtd,J= 18.0, 9.1, 6.1 Hz, 5H), 1.39 (d,J= 6.7 Hz, 2H), 1.31 (d,J= 13.7 Hz, 1H), 1.09 (t,J= 7.1 Hz, 3H), 0.99 (td,J= 7.0, 1.2 Hz, 2H), 0.87 (td,J= 7.4, 6.3 Hz, 3H)。實例 50. 化合物 4-19 之合成 2- 乙基 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(1 g，2.9 mmol)於ACN (30 mL)中之溶液中添加70% v/v乙胺(484 µL，3 eq.，8.69 mmol)及三乙胺(1.21 mL，3 eq.，8.69 mmol)。將反應燒瓶裝備冷凝器且加熱至80℃。攪拌隔夜後，將反應物冷卻並在真空中濃縮，得到取代產物。m/z實驗值= 310.1 (M+H)。將所得粗油狀物用MeOH (6.66 mL)稀釋，隨後添加Boc₂O (1.9 g，3 eq.，8.69 mmol)及三乙胺(400 μL，1 eq.，2.9 mmol)。在室溫下攪拌2小時後，將反應混合物在真空中濃縮且將粗殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之20% MeOH)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(980 mg，經2個步驟83%)。m/z實驗值= 310.1 (M+H-Boc), 427.2 (M+NH₄), 432.1 (M+Na)。 乙基 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，向2-乙基2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(980 mg，2.39 mmol)於CH₂Cl₂(23.9 mL)中之溶液中添加三乙胺(0.5 mL，1.5 eq.，3.59 mmol)及(氯磺醯基)甲烷(278 µL，1.5 eq.，3.59 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌16小時，在真空中濃縮並使用管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-10% MeOH)純化粗物質，得到呈無色油狀之標題化合物(980 mg，84%產率)。m/z實驗值= 388.1 (M+H-Boc), 505.1 (M+NH₄), 510.0 (M+Na)。 2- 乙基 2-3,6,9,12,15,21,24,27,30,33,36- 十一氧雜 -18- 氮雜三十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向乙基(2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(50 mg，103 µmol)於ACN (1.03 mL)中之溶液中添加3,6,9,12,15,18-六氧雜-1-十九烷胺(90.9 mg，3 eq.，308 µmol)及三乙胺(42.9 µL，3 eq.，308 µmol)。將反應混合物加熱至80℃且攪拌隔夜，隨後將其濃縮至乾。將粗殘餘物使用胺基官能化之管柱層析法(己烷中之50% CH₂Cl₂)純化，得到呈無色油狀之產物(35.8 mg，51%產率)。m/z實驗值= 687.2 (M+H)。 N-3,6,9,12,15,18- 六氧雜十九烷基 -N-(3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(10 mg，60.9 µmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (46.3 mg，2 eq.，122 µmol)及DIPEA (42.4 µL，4 eq.，244 µmol)。攪拌5分鐘後，將2-乙基2-3,6,9,12,15,21,24,27,30,33,36-十一氧雜-18-氮雜三十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(41.8 mg，60.9 µmol)於CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液中添加至溶液中。將反應混合物攪拌隔夜，在真空中濃縮，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化粗物質，得到偶聯產物。m/z實驗值= 833.2 (M+H), 855.2 (M+Na)。將此物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.5 mL)。攪拌隔夜後，移除溶劑，且將所得粗物質不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 733.2 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[N- 乙基 (17-{N-3,6,9,12,15,18- 六氧雜十九烷基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-19) 之製備

向N-3,6,9,12,15,18-六氧雜十九烷基-N-(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基)3-(對甲苯基)丙醯胺(44.6 mg，60.8 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(35.2 mg，60.8 µmol)於DCM (1.27 mL)中之溶液中添加三乙胺(25.4 µL，3 eq.，183 µmol)。將溶液在室溫下攪拌隔夜，濃縮至乾，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化粗物質，得到完全保護之中間體。m/z實驗值= 573.3 (2M+H), 1145.3 (M+H)。將此中間體溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。將溶液攪拌隔夜，在真空中濃縮，且將殘餘物使用製備型HPLC (55% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(4.8 mg，經4個步驟8%產率)。m/z實驗值= 989.2 (M+H), 495.3 (2M+H)。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.51 (s, 1H), 8.21 (s, 2H), 7.10 (s, 4H), 4.01 (d,J= 21.7 Hz, 1H), 3.82 - 3.44 (m, 49H), 3.39 (d,J= 1.5 Hz, 4H), 3.26 (d,J= 13.4 Hz, 1H), 2.90 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 2.69 (t,J= 7.5 Hz, 2H), 2.32 (s, 7H), 2.10 - 1.92 (m, 2H), 1.62 (d,J= 23.3 Hz, 7H), 1.18 (d,J= 6.6 Hz, 2H), 1.09 (q,J= 8.4 Hz, 1H)。實例 51. 化合物 4-20 之合成 三級丁基 -4-(17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )-1- 哌 𠯤 甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(250 mg，724 µmol)於ACN (7.5 mL，144 mmol)中之溶液中添加哌𠯤(178 mg，2.9 eq.，2.06 mmol)及三乙胺(303 µL，3 eq.，2.17 mmol)。將混合物在80℃下攪拌隔夜並濃縮至乾，得到取代產物。m/z實驗值= 351.1 (M+H)。將粗物質溶解於MeOH (1.66 mL)中，隨後添加Boc₂O (474 mg，3 eq.，2.17 mmol)。將混合物攪拌2小時，濃縮至乾且使用管柱層析法(CH₂Cl₂中之15% MeOH)純化，得到呈無色油狀之產物(249.4 mg，經2個步驟77%產率)。m/z實驗值= 451.1 (M+H)。 4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 )-1- 哌 𠯤 甲酸三級丁酯之製備

向三級丁基-4-(17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)-1-哌𠯤甲酸酯(326 mg，724 μmol)於CH₂Cl₂(7.24 mL)中之溶液中添加(氯磺醯基)甲烷(112 μL，2 eq.，1.45 mmol)及三乙胺(202 μL，2 eq.，1.45 mmol)。攪拌20小時後，將混合物在真空中濃縮且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到標題化合物。m/z實驗值= 529.1 (M+H)。 4-[17-(1- 哌 𠯤 基 )-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ]-1- 哌 𠯤 甲酸三級丁酯之製備

向4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)-1-哌𠯤甲酸三級丁酯(383 mg，724 µmol)於ACN (10 mL)中之溶液中添加哌𠯤(93.6 mg，1.5 eq.，1.09 mmol)及三乙胺(303 µL，3 eq.，2.17 mmol)。接著，將溶液在80℃下攪拌隔夜，在真空中濃縮，且將殘餘物使用胺基官能化之管柱層析法(CH₂Cl₂中之20% MeOH)純化，得到標題化合物(31.6 mg，經2個步驟8%產率)。m/z實驗值= 519.2 (M+H)。 1-{4-[17-(1- 哌 𠯤 基 )-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ]-1- 哌 𠯤 基 }-3-( 對甲苯基 )-1- 丙酮之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(10 mg，60.9 µmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (46.3 mg，2 eq.，122 µmol)及DIPEA (42.4 µL，4 eq.，244 µmol)。攪拌5分鐘後，將4-[17-(1-哌𠯤基)-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基]-1-哌𠯤甲酸三級丁酯(31.6 mg，60.9 µmol)於CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液添加至反應中。將溶液在室溫下攪拌隔夜，在真空中濃縮，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之21% MeOH)純化，得到所需醯胺。m/z實驗值= 665.2 (M+H)。接著，將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。將混合物在室溫下攪拌隔夜並真空濃縮，得到呈黃-褐色油狀之標題化合物，其不經純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 565.2 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5- 側氧基 -5-[4-(17-{4-[3-( 對甲苯基 ) 丙醯基 ]-2- 哌 𠯤 基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )-1- 哌 𠯤 基 ] 戊基羰基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-20) 之製備

向1-{4-[17-(1-哌𠯤基)-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基]-1-哌𠯤基}-3-(對甲苯基)-1-丙酮(35 mg，62 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(35.9 mg，62 µmol)於CH₂Cl₂(2 mL)及DMF (0.5 mL)中之溶液中添加三乙胺(25.9 µL，3 eq.，186 µmol)。將混合物在室溫下攪拌36小時且在真空中濃縮。將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之25% MeOH)純化，得到呈無色油狀的完全保護之中間體。m/z實驗值= 977.2 (M+H), 489.3 (2M+H)。接著，將油狀物溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。將溶液攪拌隔夜，在真空中濃縮，且使用製備型HPLC (ACN + 0.1% TFA中之35-40% H₂O)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(12 mg，經4個步驟24%產率)。m/z實驗值= 821.2 (M+H), 411.2 (2M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.20 (s, 3H), 7.78 (t,J= 5.6 Hz, 1H), 7.11 (q,J= 8.1 Hz, 4H), 4.40 (s, 1H), 4.02 - 3.88 (s, 2H), 3.75 (s, 4H), 3.64 - 3.43 (m, 22H), 3.33 - 3.17 (m, 8H), 3.10 - 2.91 (m, 5H), 2.77 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 2.71 - 2.60 (m, 2H), 2.40 - 2.31 (m, 2H), 2.26 (s, 2H), 2.06 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 1.75 (s, 2H), 1.44 (d,J= 34.0 Hz, 4H)。實例 52. 化合物 4-21 之合成 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2-(1- 甲基 -4- 哌啶基 ) 甲基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(300 mg，869 μmol)於ACN (9 mL)中之溶液中添加[(1-甲基-4-哌啶基)甲基]胺(134 mg，1.2 eq.，1.04 mmol)及三乙胺(364 μL，3 eq.，2.61 mmol)。將所得溶液在80℃下攪拌18小時並減壓濃縮。m/z實驗值= 393.2 (M+H)。將所得粗物質溶解於MeOH (2 mL)中且添加Boc₂O (228 mg，1.2 eq.，1.04 mmol)。將溶液攪拌1小時並減壓濃縮。將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到標題化合物(167.1 mg，經2個步驟49%產率)。m/z實驗值= 493.2 (M+H)。 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 )[(1- 甲基 -4- 哌啶基 ) 甲基 ] 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，向2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-(1-甲基-4-哌啶基)甲基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(336 mg，682 µmol)於CH₂Cl₂(11.2 mL)中之溶液中添加(氯磺醯基)甲烷(106 µL，2 eq.，1.36 mmol)及三乙胺(190 µL，2 eq.，1.36 mmol)。使反應物升溫至室溫並攪拌18小時。接著，將混合物在真空中濃縮且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之15% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(140 mg，經2個步驟36%產率)。m/z實驗值= 571.1 (M+H)。 2-(1- 甲基 -4- 哌啶基 ) 甲基 2-3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向(2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)[(1-甲基-4-哌啶基)甲基]胺基甲酸三級丁酯(187 mg，328 µmol)於ACN (3.39 mL，64.9 mmol)中之溶液中添加70% v/v乙胺(54.7 µL，3 eq.，983 µmol)及三乙胺(137 µL，3 eq.，983 µmol)。將混合物在80℃下攪拌36小時且在真空中濃縮。將殘餘物使用胺基官能化之管柱層析法(CH₂Cl₂中之0 - 15% MeOH)純化，得到所需產物(23.5 mg，14%產率)。m/z實驗值= 520.2 (M+H), 260.7 (M+2H)。 N- 乙基 -N-[19-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜十九烷基 ]3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(10 mg，60.9 µmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (46.3 mg，2 eq.，122 µmol)及DIPEA (42.4 µL，4 eq.，244 µmol)。攪拌5分鐘後，將2-(1-甲基-4-哌啶基)甲基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(31.7 mg，60.9 µmol)於CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液添加至反應中。將所得混合物在室溫下攪拌隔夜且在真空中濃縮。將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之12% MeOH)純化，得到醯胺。m/z實驗值= 665.2 (M+H)。將醯胺溶解於DCM (1 mL)中且TFA (0.5 mL)添加。攪拌隔夜後，將溶液在真空中濃縮，得到標題化合物，其不經純化即用於下一步驟(20.2 mg，經2個步驟59%)。m/z實驗值= 565.2 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-(5-{[(1- 甲基 -4- 哌啶基 ) 甲基 ](17-{N- 乙基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 } 戊醯基胺基 ) 己酸 ( 化合物 4-21) 之製備

向N-乙基-N-[19-(1-甲基-4-哌啶基)-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜十九烷基]3-(對甲苯基)丙醯胺(20 mg，35.3 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(20.5 mg，35.3 µmol)於CH₂Cl₂(1.5 mL)中之溶液中添加三乙胺(14.8 µL，3 eq.，106 µmol)。在室溫下攪拌反應隔夜且在真空中濃縮。將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之20% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之所需醯胺。m/z實驗值= 978.3 (M+H), 489.8 (2M+H)。接著，將此物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。將混合物攪拌1小時，濃縮至乾且使用製備型HPLC (H2O + 0.1% TFA中之40% ACN)純化，得到呈無色油狀之產物(4.1 mg，經2個步驟14%)。m/z實驗值= 822.2 (M+H)；411.7 (2M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.18 (s, 3H), 7.76 (t,J= 5.4 Hz, 1H), 7.15 - 7.04 (m, 4H), 3.88 (s, 1H), 3.54 - 3.44 (m, 17H), 3.38 (s, 0H), 3.30 (d,J= 10.4 Hz, 28H), 3.21 (d,J= 7.4 Hz, 1H), 3.02 (d,J= 6.4 Hz, 2H), 2.84 (s, 1H), 2.76 (q,J= 6.8 Hz, 4H), 2.70 - 2.66 (m, 1H), 2.64 - 2.53 (m, 1H), 2.33 (dt,J= 3.8, 1.9 Hz, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.06 (d,J= 14.3 Hz, 2H), 1.75 (t,J= 21.3 Hz, 4H), 1.46 (s, 4H), 1.39 (s, 0H), 1.26 (d,J= 14.1 Hz, 3H), 1.02 (dt,J= 17.7, 7.0 Hz, 3H)。實例 53. 化合物 4-22 之合成 2-2-( 二甲基胺基 ) 乙基 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(300 mg，869 μmol)於ACN (9 mL)中之溶液中添加2-(二甲基胺基)乙胺(113 μL，1.2 eq.，1.04 mmol)及三乙胺(364 μL，3 eq.，2.61 mmol)。將所得混合物升溫至80℃並攪拌20小時，隨後將其濃縮至乾。m/z實驗值= 353.1 (M+H)。接著,將粗物質溶解於MeOH (2 mL)中且添加Boc₂O (228 mg，1.2 eq.，1.04 mmol)。攪拌3小時後，將溶液濃縮至乾且將粗物質使用胺基官能化之管柱層析法(CH₂Cl₂中之19% MeOH)純化，得到標題化合物(128.5 mg，經2個步驟42%產率)。m/z實驗值= 453.1 (M+H)。 [2-( 二甲基胺基 ) 乙基 ](2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，向2-2-(二甲基胺基)乙基2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(267 mg，590 µmol)於CH₂Cl₂(9.69 mL)中之溶液中添加(氯磺醯基)甲烷(114 µL，2.5 eq.，1.48 mmol)及三乙胺(206 µL，2.5 eq.，1.48 mmol)。使溶液升溫至室溫且攪拌20小時，隨後對其進行減壓濃縮。接著，將粗物質使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10-15% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之產物(112.7 mg，36%產率)。m/z實驗值= 531.1 (M+H)。 2-2-( 二甲基胺基 ) 乙基 2-3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向[2-(二甲基胺基)乙基](2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(313 mg，590 µmol)於ACN (6.11 mL)中之溶液中添加70% v/v乙胺(98.5 µL，3 eq.，1.77 mmol)及三乙胺(247 µL，3 eq.，1.77 mmol)。將混合物加熱至80℃並攪拌36小時，隨後將其濃縮至乾。將粗物質使用胺基官能化之管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-15% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之所需產物。m/z實驗值= 480.2 (M+H), 240.6 (M+2H)。 N- 乙基 -N-(21- 甲基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18,21- 二氮雜二十二烷基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(10 mg，60.9 µmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (46.3 mg，2 eq.，122 µmol)及DIPEA (42.4 µL，4 eq.，244 µmol)。攪拌5分鐘後，將2-2-(二甲基胺基)乙基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(29.2 mg，60.9 µmol)於CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液添加至反應中。將所得混合物在室溫下攪拌18小時，隨後對其進行減壓濃縮。將粗物質使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之20% MeOH)純化，得到偶聯產物(30.2 mg，79%產率)。m/z實驗值= 626.2 (M+H), 313.7 (M+2H)。接著，將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.5 mL)。將所得混合物攪拌18小時，濃縮至乾且將粗物質不經純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 525.2 (M+H), 263.7 (M+2H)。 (S)-2- 胺基 -6-(5-{[2-( 二甲基胺基 ) 乙基 ](17-{N- 乙基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 } 戊醯基胺基 ) 己酸之製備

向N-乙基-N-(21-甲基-3,6,9,12,15-五氧雜-18,21-二氮雜二十二烷基)3-(對甲苯基)丙醯胺(25 mg，47.6 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(27.5 mg，47.6 µmol)於CH₂Cl₂(1 mL)中之溶液中添加三乙胺(19.9 µL，3 eq.，143 µmol)。將混合物在室溫下攪拌2.5小時，隨後將其濃縮至乾。將粗物質使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之5% MeOH)純化，得到呈無色油狀的完全保護之中間體。m/z實驗值= 938.2 (M+H), 469.8 (M+2H)。接著，將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (1 mL)。在室溫下攪拌1小時後，將溶液濃縮至乾且將粗物質使用製備型HPLC (45% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(7.7 mg，經2個步驟21%產率)。m/z實驗值= 782.2 (M+H), 391.7 (M+2H), 261.5 (M+3H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.77 (t,J= 5.4 Hz, 1H), 7.09 (qd,J= 8.0, 3.6 Hz, 4H), 3.81 (s, 1H), 3.61 (t,J= 6.6 Hz, 1H), 3.57 - 3.42 (m, 18H), 3.38 (s, 2H), 3.30 (d,J= 8.9 Hz, 10H), 3.18 (t,J= 6.6 Hz, 2H), 3.03 (t,J= 6.3 Hz, 2H), 2.82 - 2.71 (m, 8H), 2.52 (s, 2H), 2.33 (dt,J= 3.8, 1.8 Hz, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.07 (d,J= 12.0 Hz, 2H), 1.73 (s, 2H), 1.48 (d,J= 4.6 Hz, 4H), 1.39 (s, 3H), 1.02 (dt,J= 17.7, 7.0 Hz, 3H)。實例 54. 化合物 4-23 之合成 2-3-( 二甲基胺基 ) 丙基 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(300 mg，869 μmol)於ACN (9 mL)中之溶液中添加3-(二甲基胺基)-1-丙胺(107 mg，1.2 eq.，1.04 mmol)及三乙胺(364 μL，3 eq.，2.61 mmol)。將溶液升溫至80℃並攪拌18小時。在壓力下移除溶劑且將粗物質溶解於MeOH (2 mL)中，隨後添加Boc₂O (228 mg，1.2 eq.，1.04 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時，濃縮至乾，且將粗物質使用胺基官能化之管柱層析法(DCM中之30% MeOH)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(175 mg，經2個步驟57%產率)。m/z實驗值= 467.2 (M+H)。 [3-( 二甲基胺基 ) 丙基 ](2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，向2-3-(二甲基胺基)丙基2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(307 mg，657 µmol)於CH₂Cl₂(10.8 mL)中之溶液中逐滴添加三乙胺(183 µL，2 eq.，1.31 mmol)及(氯磺醯基)甲烷(102 µL，2 eq.，1.31 mmol)。使溶液升溫至室溫並攪拌4小時。接著，將混合物濃縮至乾且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之20-40% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(150 mg，42%產率)。m/z實驗值= 545.1 (M+H)。 2-3-( 二甲基胺基 ) 丙基 2-3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

向[3-(二甲基胺基)丙基](2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(358 mg，657 µmol)於ACN (6.8 mL)中之溶液中添加乙胺(110 µL，3 eq.，1.97 mmol)及三乙胺(275 µL，3 eq.，1.97 mmol)。將混合物加熱至80℃並攪拌36小時，隨後將反應物濃縮至乾是且將粗物質使用胺基官能化之管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-25% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之產物(56.8 mg，18%產率)。m/z實驗值= 494.2 (M+H), 247.7 (M+2H)。 N- 乙基 -N-(22- 甲基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18,22- 二氮雜二十三烷基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(10 mg，60.9 µmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加HATU (46.3 mg，2 eq.，122 µmol)及DIPEA (42.4 µL，4 eq.，244 µmol)。攪拌5分鐘後，將2-3-(二甲基胺基)丙基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(30.1 mg，60.9 µmol)於CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液添加至溶液中。接著，將混合物在室溫下攪拌5小時，濃縮至乾，且使用矽膠管柱層析法(DCM中之13% MeOH)純化，得到呈無色油狀之偶聯產物。m/z實驗值= 640.2 (M+H), 320.7 (M+2H)。接著，將所得油狀物溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.5 mL)。將溶液攪拌12小時，濃縮至乾且置放於高真空下，隨後不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 540.2 (M+H), 270.7 (M+2H)。 (S)-2- 胺基 -6-(5-{[3-( 二甲基胺基 ) 丙基 ](17-{N- 乙基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 } 戊醯基胺基 ) 己酸 ( 化合物 4-23) 之製備

向N-乙基-N-(22-甲基-3,6,9,12,15-五氧雜-18,22-二氮雜二十三烷基)3-(對甲苯基)丙醯胺(30 mg，55.6 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(32.2 mg，55.6 µmol)於二氯甲烷(1.17 mL)中之溶液中添加三乙胺(23.2 µL，3 eq.，167 µmol)。將混合物在室溫下攪拌18小時，減壓濃縮，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之15% MeOH)純化，得到呈無色油狀之產物。m/z實驗值= 952.3 (M+H), 476.8 (M+2H)。將醯胺溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中，並添加TFA (0.5 mL)。攪拌18小時後，將溶液減壓濃縮且將粗物質使用製備型HPLC (45% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈無色油狀之產物。m/z實驗值= 796.2 (M+H), 398.7 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.76 (d,J= 6.1 Hz, 1H), 7.15 - 7.03 (m, 4H), 3.83 (s, 1H), 3.56 - 3.43 (m, 17H), 3.38 (d,J= 2.3 Hz, 2H), 3.29 (d,J= 8.1 Hz, 7H), 3.02 (d,J= 6.2 Hz, 2H), 2.96 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 2.76 (d,J= 4.9 Hz, 8H), 2.63 - 2.51 (m, 7H), 2.33 (dt,J= 3.9, 1.9 Hz, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.07 (d,J= 12.0 Hz, 2H), 1.83 (q,J= 7.3 Hz, 1H), 1.74 (s, 2H), 1.51 - 1.44 (m, 4H), 1.39 (s, 3H), 1.02 (dt,J= 17.7, 7.0 Hz, 3H)。實例 55. 化合物 4-24 之合成 2-3,6,9,12,15,18- 六氧雜十九烷基 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

在0℃下，經30分鐘向溴-PEG6-醇(100 mg，275 µmol)於DMF (2.5 mL)中之溶液中逐滴添加間-PEG6-胺(249 mg，3 eq.，826 µmol)及三乙胺(116 µL，3 eq.，826 µmol)於DMF (2.5 mL)中之溶液。接著，使反應混合物升溫且在室溫下攪拌。54小時後，將反應物加熱至80℃且在冷凝器存在下再攪拌18小時。減壓移除溶劑，且將殘餘物再懸浮於ACN (10 mL)中且在室溫下與K₂CO₃(200 mg)一起攪拌。2小時後，將混合物透過矽藻土過濾，用MeOH洗滌並減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-20% MeOH-1%NH₄OH)純化，得到呈黃色油狀之不純產物(150 mg)。m/z實驗值= 560.4 (M+H)。將不純產物溶解於EtOH (2 mL)中且在氮氣流下添加三乙胺(57 µL，1.5 eq.，407 µmol)。接著，添加Boc₂O (96 µL，1.5 eq.，413 µmol)於EtOH (1 mL)中之溶液。攪拌1小時後，減壓移除溶劑且將反應混合物藉由矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-10% MeOH)純化，得到呈黃色液體狀之標題化合物(41 mg，經2個步驟23%)。m/z實驗值= 560.4 (M+H-Boc)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.72 (t,J= 4.5 Hz, 2H), 3.54-3.66 (m, 43H), 3.43 (m, 4H), 3.38 (s, 3H), 1.44 (s, 9H)。 2-3,6,9,12,15,18- 六氧雜十九烷基 2-2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

在冰-水浴中向2-3,6,9,12,15,18-六氧雜十九烷基2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(40 mg，60.6 μmol)於CH₂Cl₂(606 μL)中之溶液中添加三乙胺(16.9 μL，2 eq.，121 μmol)及(氯磺醯基)甲烷(9.38 μL，2 eq.，121 μmol)。將反應物升溫至室溫並攪拌24小時。接著，將混合物減壓濃縮且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化粗物質，得到呈無色油狀之標題化合物(37 mg，83%產率)。m/z實驗值= 638.1 (M+H-Boc), 755.1 (M+NH₄), 760 (M+Na)。 2-3,6,9,12,15,18- 六氧雜十九烷基 2-3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

在0℃下，將70%v/v乙胺(41.1 µL，10 eq.，516 µmol)添加至2-3,6,9,12,15,18-六氧雜十九烷基2-2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(37 mg，50.1 µmol)及K₂CO₃(34.7 mg，5 eq.，251 µmol)於H₂O (1 mL)中之經攪拌溶液中，隨後添加TBABr (1.37 mg，0.085 eq.，4.26 µmol)。將所得混合物在室溫下攪拌36小時，此後減壓移除溶劑且將粗物質使用胺基官能化之管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-10% MeOH)純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(27.2 mg，79%產率)。m/z實驗值= 687.2 (M+H)。 N- 乙基 -N-(3,6,9,12,15,21,24,27,30,33,36- 十一氧雜 -18- 氮雜三十七烷基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

向3-(對甲苯基)丙酸(6.5 mg，39.6 µmol)於DMF (0.5 mL)中之溶液中添加HATU (30.1 mg，2 eq.，79.2 µmol)、DIPEA (27.6 µL，4 eq.，158 µmol)。攪拌5分鐘後，添加2-3,6,9,12,15,18-六氧雜十九烷基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(27.2 mg，39.6 µmol)於CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液。將混合物攪拌18小時，接著減壓濃縮且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之3% MeOH)純化粗物質，得到所需醯胺。m/z實驗值= 733.2 (M+H-Boc), 855.2 (M+Na)。接著，將產物溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中，隨後添加TFA (0.5 mL)。攪拌1小時後，將溶液濃縮至乾，得到呈黃-褐色油狀之標題化合物，其不經純化即用於下一步驟(29.7 mg，經2個步驟78%產率)。m/z實驗值= 733.2 (M+H), 367.2 (M+2H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[N-3,6,9,12,15,18- 六氧雜十九烷基 (17-{N- 乙基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-24) 之製備

向N-乙基-N-(3,6,9,12,15,21,24,27,30,33,36-十一氧雜-18-氮雜三十七烷基)3-(對甲苯基)丙醯胺(29.7 mg，40.5 μmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(23.4 mg，40.5 μmol)於CH₂Cl₂(851 μL)及DMF (250 μL)中之溶液中添加三乙胺(16.9 μL，3 eq.，121 μmol)。將混合物攪拌18小時，濃縮至乾且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之8-10% MeOH)純化粗物質，得到完全保護之中間體。m/z實驗值= 1145.2 (M+H), 573.3 (M+2H)。接著，將此產物溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.5 mL)。攪拌18小時後，減壓蒸發溶劑。將粗產物使用製備型HPLC (50% ACN/H₂O + 0.1% TFA)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(23.5 mg，經2個步驟53%產率)。m/z實驗值= 989.2 (M+H), 495.3 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.76 (t,J= 5.6 Hz, 1H), 7.15 - 7.03 (m, 4H), 3.70 (s, 1H), 3.57 - 3.41 (m, 48H), 3.41 - 3.36 (m, 2H), 3.30 (d,J= 10.4 Hz, 2H), 3.24 (s, 3H), 3.02 (d,J= 6.4 Hz, 2H), 2.76 (q,J= 7.6 Hz, 2H), 2.62 - 2.52 (m, 3H), 2.35 - 2.28 (m, 2H), 2.25 (s, 2H), 2.05 (q,J= 7.5 Hz, 2H), 1.74 (dt,J= 16.1, 11.2 Hz, 2H), 1.55 - 1.23 (m, 8H), 1.01 (dt,J= 17.8, 7.0 Hz, 3H)。實例 56. 化合物 4-25 之合成 ( 對甲苯基硫基 ) 乙酸甲酯之製備

在氮氣流下，在反應小瓶中添加對溴甲苯(40 mg，234 µmol)、4,5-雙(二苯基膦基)-9,9-二甲基-9H-𠮿 (27.1 mg，0.2 eq.，46.8 µmol)、Pd(PPh₃)₄(27 mg，0.1 eq.，23.4 µmol)、DIPEA (81.5 µL，2 eq.，468 µmol)及1,4-二㗁烷(2.34 mL)。將所得黃-橙色溶液加熱至101℃並攪拌18小時，隨後將其冷卻至室溫，透過矽藻土過濾並濃縮至乾。接著使用矽膠管柱層析法(己烷中之2%-5% EtOAc)純化，得到呈無色油狀之產物(43.8 mg，95%產率)。m/z實驗值= 197.0 (M+H)。 ( 對甲苯基硫基 ) 乙酸之製備

向(對甲苯基硫基)乙酸甲酯(43.8 mg，223 µmol)於MeOH (1 mL)中之溶液中添加LiOH (223 μL，2M in H₂O)。攪拌4小時後，將溶劑蒸發至乾。將粗物質用H₂O稀釋並用EtOAc萃取三次。將有機層合併，經無水NaSO₄乾燥，並減壓濃縮，得到呈白色固體狀之產物。此物質不經進一步純化即使用。m/z實驗值= 183.0 (M+H)。 N- 乙基 -N-(3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 )3-( 對甲苯基 )-3- 硫代丙醯胺之製備

向(對甲苯基硫基)乙酸(40 mg，219 µmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加HBTU (125 mg，1.5 eq.，329 µmol)及DIPEA (57.3 µL，1.5 eq.，329 µmol)。攪拌5分鐘後，添加2-乙基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(95.8 mg，219 µmol)於CH₂Cl₂(1 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，隨後將溶劑蒸發至乾，且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之0-5% MeOH)純化粗物質，得到呈無色油狀之所需醯胺。m/z實驗值= 501.1 (M+H-Boc), 601.1 (M+H), 618.2 (M+NH₄)。將此物質再溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中，且添加TFA (1 mL)。攪拌1小時後，將溶液減壓濃縮，得到呈黃-褐色油狀之標題化合物(113.4 mg，經2個步驟84%產率)。將此物質不經進一步純化即使用。m/z實驗值= 501.1 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[N- 乙基 (17-{N- 乙基 [2-( 對甲苯基 )-2- 硫代乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 ) 己酸 ( 化合物 4-25) 之製備

向N-乙基-N-(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基)3-(對甲苯基)-3-硫代丙醯胺(50 mg，99.9 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(57.8 mg，99.9 µmol)於CH₂Cl₂(1.82 mL)中之溶液中添加三乙胺(41.8 µL，3 eq.，0.3 mmol)。將混合物在室溫下攪拌18小時，隨後對其進行減壓濃縮且使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到呈無色油狀的完全保護之偶聯中間體。m/z實驗值= 913.2 (M+H), 457.2 (2M+H)。接著，將此物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.5 mL)。攪拌12小時後，將溶劑蒸發至乾且將粗物質使用製備型HPLC (H₂O + 0.1% TFA中之35% ACN)純化，得到呈無色油狀之產物(25.4 mg，經2個步驟34%產率)。m/z實驗值= 757.1 (M+H), 379.2 (2M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.18 (s, 3H), 7.79 - 7.72 (m, 1H), 7.32 - 7.21 (m, 2H), 7.13 (dd,J= 8.1, 2.9 Hz, 2H), 3.96 (s, 1H), 3.89 (s, 2H), 3.55 - 3.50 (m, 19H), 3.48 - 3.40 (m, 4H), 3.33 - 3.25 (m, 5H), 3.02 (q,J= 6.3 Hz, 2H), 2.33 - 2.23 (m, 5H), 2.11 - 2.00 (m, 3H), 1.84 - 1.68 (m, 2H), 1.52 - 1.36 (m, 6H), 1.35 - 1.25 (m, 2H), 1.10 (dt,J= 14.5, 7.0 Hz, 2H), 0.99 (td,J= 7.0, 4.6 Hz, 3H)。實例 57. 化合物 4-26 之合成 甲苯磺醯基乙酸三級丁酯之製備

在氮氣流下，在反應小瓶中添加DABSO (105 mg，0.6 eq.，439 µmol)、Pd(OAc)₂(8.28 mg，0.05 eq.，36.5 µmol)及CataCXium A (20.2 mg，0.077 eq.，56.3 µmol)。接著，依序添加對溴甲苯(125 mg，0.73 mmol)、iPrOH (3.7 mL)及三乙胺(306 µL，3 eq.，2.19 mmol)。將混合物升溫至75℃並攪拌18小時。將溶液冷卻至室溫，且添加溴代乙酸三級丁酯(219 µL，2 eq.，1.46 mmol)於DMF (1.22 mL)中之溶液。攪拌3小時後，將混合物倒至水上且用EtOAc萃取三次。收集有機層，經無水NaSO₄乾燥，過濾，並濃縮。接著，使用矽膠管柱層析法(己烷中之50% EtOAc)純化，得到呈黃色油狀之標題化合物(45.2 mg，經2個步驟29%)。m/z實驗值= 215.0 (M+H-tBu), 288.0 (M+NH₄)。 甲苯磺醯基乙酸之製備

向甲苯磺醯基乙酸三級丁酯(21 mg，77.7 µmol)於CH₂Cl₂(259 µL)中之溶液中添加TFA (750 µL)。將混合物攪拌2.5小時，濃縮至乾，且不經進一步純化即用於下一步驟。m/z實驗值= 215.0 (M+H), 232.0 (M+NH₄)。 N- 乙基 -N-(3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜二十烷基 ) 甲苯磺醯基乙醯胺之製備

向甲苯磺醯基乙酸(50 mg，233 µmol)於DMF (1.06 mL)中之溶液中添加HBTU (133 mg，1.5 eq.，350 µmol)及DIPEA (61 µL，1.5 eq.，350 µmol)。攪拌5分鐘後，添加2-乙基2-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(102 mg，233 µmol)於CH₂Cl₂(1.06 mL)中之溶液。將反應混合物攪拌1小時，濃縮至乾，且將殘餘物使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之5% MeOH)純化，得到所需偶聯產物。m/z實驗值= 533.1 (M+H-Boc), 650.1 (M+NH₄)。接著，將無色油狀物溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中，隨後添加TFA (0.5 mL)。將所得混合物攪拌1小時，接著濃縮至乾，得到呈黃-褐色油狀之標題化合物，其不經進一步純化即使用(126.7 mg，經2個步驟84%產率)。m/z實驗值= 533.1 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-[5-(N- 乙基 {17-[N- 乙基 ( 甲苯磺醯基甲基 ) 羰基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 } 胺甲醯基 ) 戊醯基胺基 ] 己酸 ( 化合物 4-26) 之製備

向N-乙基-N-(3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜二十烷基)甲苯磺醯基乙醯胺(20 mg，37.5 µmol)及(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(2,3,5,6-四氟苯氧基羰基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(21.7 mg，37.5 µmol)於CH₂Cl₂(684 µL)中之溶液中添加三乙胺(15.7 µL，3 eq.，113 µmol)。攪拌4小時後，將混合物加熱至50℃，保持1小時，此後將混合物濃縮至乾。接著，將粗物質使用矽膠管柱層析法(CH₂Cl₂中之10% MeOH)純化，得到呈無色油狀之偶聯醯胺。m/z實驗值= 945.1 (M+H)。接著，將此物質溶解於CH₂Cl₂(1 mL)中且添加TFA (0.5 mL)。將溶液攪拌12小時，接著濃縮至乾且使用製備型HPLC純化(H₂O + 0.1% TFA中之30-35% ACN)，得到呈白色固體狀之標題化合物(11.2 mg，經2個步驟38%產率)。m/z實驗值= 789.1 (M+H), 395.2 (2M+H)。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.18 (s, 2H), 7.80 - 7.72 (m, 3H), 7.44 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 6.54 (s, 1H), 4.55 (d,J= 9.0 Hz, 2H), 3.89 (d,J= 5.7 Hz, 1H), 3.50 (ddd,J= 6.6, 4.7, 2.4 Hz, 21H), 3.31 - 3.19 (m, 5H), 3.02 (d,J= 6.3 Hz, 2H), 2.54 (d,J= 9.0 Hz, 3H), 2.42 (s, 2H), 2.39 - 2.21 (m, 3H), 2.11 - 1.97 (m, 2H), 1.76 (s, 2H), 1.47 (s, 4H), 1.40 (s, 3H), 1.24 (s, 1H), 1.08 (td,J= 7.1, 4.2 Hz, 2H), 0.96 (dt,J= 16.6, 7.0 Hz, 3H)。實例 58. 化合物 4-27 之合成 2-17-{N- 環丁基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 環丁基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將HATU (64 mg，169 µmol，1.1 eq.)添加至3-(對甲苯基)丙酸(28 mg，169 µmol，1.1 eq.)及DIPEA (80 µL，460 µmol，3 eq.)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物攪拌10分鐘，接著添加環丁基(2-{2-[2-(2-{2-[2-(環丁基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(75 mg，153 µmol，1 eq.)於DMF (3 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至95:5 EtOAc-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(57 mg，59%產率)。m/z實驗值= 635.3 (M+H), 657.2 (M+Na)。 N- 環丁基 -N-(2-{2-[2-(2-{2-[2-( 環丁基胺基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

將TFA (150 µL)添加至2-17-{N-環丁基[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-環丁基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(57 mg，89.8 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(1.1 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌90分鐘，接著減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(48 mg，100%產率)。m/z實驗值= 535.3 (M+H)。 (S)-2-[ 三級丁基 ( 氧基羰基胺基 )]-6-{5-[N- 環丁基 (17-{N- 環丁基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸三級丁酯之製備

將HATU (34.1 mg，89.8 µmol，1 eq.)添加至5-[N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[三級丁基(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基]戊酸(39 mg，89.8 µmol，1.1 eq.)及DIPEA (47 µL，269 µmol，3 eq.)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物攪拌10分鐘，接著添加N-環丁基-N-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(環丁基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)3-(對甲苯基)丙醯胺(48 mg，89.8 µmol，1 eq.)於DMF (2 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌2.5小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至95:5-90:10 EtOAc-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(85 mg，100%產率)。m/z實驗值= 947.4 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[N- 環丁基 (17-{N- 環丁基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-27) 之製備

將TFA (1.5 mL)添加至(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-{5-[N-環丁基(17-{N-環丁基[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺甲醯基]戊醯基胺基}己酸三級丁酯(85 mg，89.7 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(1.5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌4小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% TFA)-ACN (0.1% TFA) 90:10-10:90)，得到呈白色固體狀之標題化合物4-27(44 mg，62%產率)。m/z實驗值= 791.5 (M+H)及396.4 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.10 (s, 4H), 4.58 - 4.19 (m, 2H), 3.87 (t,J= 6.4 Hz, 1H), 3.68 - 3.42 (m, 24H), 3.22 (t,J= 6.5 Hz, 2H), 2.87 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 2.76 - 2.62 (m, 2H), 2.51 - 2.38 (m, 2H), 2.34 - 1.83 (m, 15H), 1.77 - 1.41 (m, 12H)。實例 59. 化合物 4-28 之合成 17-{N- 環丁基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將HATU (97 mg，253 µmol，1.1 eq.)添加至3-(對甲苯基)丙酸(42 mg，253 µmol，1.1 eq.)及DIPEA (12 µL，690 µmol，3 eq.)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物攪拌10分鐘，接著添加(2-{2-[2-(2-{2-[2-(環丁基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(100 mg，230 µmol，1 eq.)於DMF (2 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至95:5 EtOAc-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(134 mg，100%產率)。m/z實驗值= 581.2 (M+H)。 N-(17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )-N- 環丁基 3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

將TFA (150 µL)添加至17-{N-環丁基[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(134 mg，231 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(2.85 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌16小時，接著減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(111 mg，100%產率)。m/z實驗值= 481.2 (M+H)。 (S)-2-[ 三級丁基 ( 氧基羰基胺基 )]-6-[5-(N-17-{N- 環丁基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 ) 戊醯基胺基 ] 己酸三級丁酯之製備

將HATU (89 mg，231 µmol，1 eq.)添加至5-[N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[三級丁基(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基]戊酸(99 mg，231 µmol，1 eq.)及DIPEA (121 µL，693 µmol，3 eq.)於DMF (3 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物攪拌10分鐘，接著添加N-(17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)-N-環丁基3-(對甲苯基)丙醯胺(111 mg，231 µmol，1 eq.)於DMF (3 mL)中之溶液。將反應混合物攪拌90分鐘，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至95:5-80:20 EtOAc-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(104 mg，50%產率)。m/z實驗值= 893.3 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-[5-(N-17-{N- 環丁基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 ) 戊醯基胺基 ] 己酸 ( 化合物 4-28) 之製備

將TFA (1.5 mL)添加至(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-[5-(N-17-{N-環丁基[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基胺甲醯基)戊醯基胺基]己酸三級丁酯(75 mg，84 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(1.4 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物攪拌4小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% TFA)-ACN (0.1% TFA) 90:10-10:90)，得到呈白色固體狀之標題化合物4-28(61 mg，91%產率)。m/z實驗值= 737.3 (M+H)及369.2 (M+2H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.10 (s, 4H), 4.58 - 4.20 (m, 1H), 3.69 - 3.28 (m, 25H), 3.20 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 2.87 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 2.69 (dt,J= 21.2, 7.7 Hz, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.26 - 2.06 (m, 8H), 1.95 - 1.40 (m, 12H)。實例 60. 化合物 4-29 之合成 2- 環己基 2-17-{N- 環己基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將HATU (31 mg，80.8 µmol，1.1 eq.)添加至3-(對甲苯基)丙酸(13 mg，80.8 µmol，1.1 eq.)及DIPEA (38 µL，220 µmol，3 eq.)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著添加環己基(2-{2-[2-(2-{2-[2-(環己基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(40 mg，73.4 µmol，1 eq.)於DMF (1 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(51 mg，100%產率)。m/z實驗值= 691.3 (M+H)。 N- 環己基 -N-(2-{2-[2-(2-{2-[2-( 環己基胺基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

將TFA (0.3 mL)添加至2-環己基2-17-{N-環己基[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(51 mg，73.4 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(2.7 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌1小時。減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(43 mg，99%產率)。m/z實驗值= 591.3 (M+H)。 (S)-2-[ 三級丁基 ( 氧基羰基胺基 )]-6-{5-[N- 環己基 (17-{N- 環己基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸三級丁酯之製備

將HATU (30 mg，72.8 µmol，1 eq.)添加至5-[N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[三級丁基(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基]戊酸(31 mg，72.8 µmol，1 eq.)及DIPEA (38 µL，218 µmol，3 eq.)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著添加N-環己基-N-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(環己基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)3-(對甲苯基)丙醯胺(43 mg，72.8 µmol，1 eq.)於DMF (1 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌90分鐘，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至95:5 EtOAc-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(61 mg，84%產率)。m/z實驗值= 1003.4 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[N- 環己基 (17-{N- 環己基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-29) 之製備

將TFA (1 mL)添加至(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-{5-[N-環己基(17-{N-環己基[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺甲醯基]戊醯基胺基}己酸三級丁酯(61 mg，60.8 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(0.6 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌4小時。接著，減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% FA)-ACN (0.1% FA) 90:10-45:55)，得到呈白色固體狀之標題化合物4-29(29 mg，56%產率)。m/z實驗值= 874.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.11 (s, 4H), 4.19 - 4.07 (m, 1H), 3.68 - 3.35 (m, 26H), 3.21 (t,J= 7.1 Hz, 2H), 2.89 (td,J= 7.6, 3.1 Hz, 2H), 2.70 (dt,J= 14.5, 7.6 Hz, 2H), 2.46 (q,J= 9.1 Hz, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.27 - 2.19 (m, 2H), 1.94 - 1.06 (m, 30H)。實例 61. 化合物 4-30 之合成 20-[( 三級丁基 )( 氧基羰基胺基 )]-6,9,12,15,18- 五氧雜 -3- 氮雜二十烷酸三級丁酯之製備

在0℃下，將溴代乙酸三級丁酯(85 µL，578 µmol，1.1 eq.)添加至2-甲基-2-丙烷胺基甲酸17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷酯(200 mg，526 µmol. 1 eq.)及TEA (220 µL，1.58 mmol，3 eq.)於DMF (10 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌4小時，接著減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(260 mg，100%產率)。m/z實驗值= 495.2 (M+H)。 ({17-[( 三級丁基 )( 氧基羰基胺基 )]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 }[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 ) 乙酸三級丁酯之製備

將HATU (400 mg，1.05 mmol，2 eq.)添加至3-(對甲苯基)丙酸(173 mg，1.05 mmol，2 eq.)及DIPEA (460 µL，2.63 mmol，5 eq.)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物攪拌10分鐘，接著添加20-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]-6,9,12,15,18-五氧雜-3-氮雜二十烷酸三級丁酯(260 mg，526 µmol，1 eq.)於DMF (5 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至98:2 EtOAc-MeOH)，得到呈油狀之標題化合物(337 mg，100%產率)。m/z實驗值= 641.2 (M+H)及663.2 (M+Na)。 {(17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 } 乙酸三級丁酯之製備

將TFA (0.3 mL)添加至({17-[(三級丁基)(氧基羰基胺基)]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基)乙酸三級丁酯(337 mg，526 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(10 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌1小時。接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% FA)-ACN (0.1% FA) 90:10-10:90)，得到呈白色固體狀之標題化合物(112 mg，40%產率)。m/z實驗值= 541.2 (M+H)。 20-[( 三級丁氧基羰基甲基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 ]-6,9,12,15,18- 五氧雜 -3- 氮雜二十烷酸三級丁酯之製備

在0℃下，將溴代乙酸三級丁酯(37 µL，252 µmol，1.2 eq.)添加至{(17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}乙酸三級丁酯(112 mg，207 µmol，1 eq.)及TEA (144 µL，1.03 mmol，4.8 eq.)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物升溫至室溫並攪拌4小時。減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(136 mg，100%產率)。m/z實驗值= 655.5 (M+H)。 (S)-6-{5-[( 三級丁氧基羰基甲基 ){17-[( 三級丁氧基羰基甲基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 } 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 }-2-[ 三級丁基 ( 氧基羰基胺基 )] 己酸三級丁酯之製備

將HATU (79 mg，208 µmol，1 eq.)添加至5-[N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[三級丁基(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基]戊酸(89 mg，208 µmol，1 eq.)及DIPEA (109 µL，623 µmol，3 eq.)於DMF (2.5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著添加20-[(三級丁氧基羰基甲基)[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基]-6,9,12,15,18-五氧雜-3-氮雜二十烷酸三級丁酯(136 mg，208 µmol，1 eq.)於DMF (1 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌2小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(第1個管柱100% CH₂Cl₂至90:10 CH₂Cl₂-MeOH，第2個管柱100% EtOAc至95:5 EtOAc-MeOH)，得到呈油狀之標題化合物(97 mg，44%產率)。m/z實驗值= 1067.4 (M+H)及1089.4 (M+Na)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[( 羧基甲基 ){17-[( 羧基甲基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 } 胺甲醯基 ]- 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-30) 之製備

將TFA (1 mL)添加至(S)-6-{5-[(三級丁氧基羰基甲基){17-[(三級丁氧基羰基甲基)[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}胺甲醯基]戊醯基胺基}-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]己酸三級丁酯(97 mg，90.9 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(1 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物4小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% FA)-ACN (0.1% FA) 90:10-45:55)，得到呈白色固體狀之標題化合物4-30(52 mg，72%產率)。m/z實驗值799.2 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.17 - 7.05 (m, 4H), 4.13 (q,J= 6.0 Hz, 4H), 3.70 - 3.52 (m, 25H), 3.27 - 3.15 (m, 2H), 2.93 - 2.83 (m, 2H), 2.83 - 2.75 (m, 1H), 2.63 - 2.49 (m, 2H), 2.37 - 2.16 (m, 6H), 1.98 - 1.78 (m, 2H), 1.71 - 1.38 (m, 8H)。實例 62. 化合物 4-31 之合成 17-[3-( 對甲苯基 ) 丙醯基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將HATU (220 mg，578 µmol，1.1 eq.)添加至3-(對甲苯基)丙酸(95 mg，578 µmol，1.1 eq.)及DIPEA (275 µL，1.58 mmol，3 eq.)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫攪拌10分鐘，接著17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(200 mg，526 µmol，1 eq.)於DMF (3 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至1:1 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈油狀之標題化合物(277 mg，100%產率)。m/z實驗值= 526.7 (M+H)。 N-(17- 胺基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

將TFA (3 mL)添加至2-甲基-2-丙烷胺基甲酸17-[3-(對甲苯基)丙醯基胺基]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷酯(277 mg，526 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(7 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌20分鐘，接著減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(224 mg，100%產率)。m/z實驗值= 426.7 (M+H)。 (S)-2-[ 三級丁基 ( 氧基羰基胺基 )]-6-(5-{N-17-[3-( 對甲苯基 ) 丙醯基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 } 戊醯基胺基 ) 己酸三級丁酯之製備

將HATU (89 mg，234 µmol，1 eq.)添加至5-[N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[三級丁基(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基]戊酸(101 mg，234 µmol，1 eq.)及DIPEA (123 µL，703 µmol，3 eq.)於DMF (2.5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著添加N-(17-胺基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)3-(對甲苯基)丙醯胺(101 mg，234 µmol，1 eq.)於DMF (2.5 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌30分鐘，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(73 mg，37%產率)。m/z實驗值= 839.3 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-(5-{N-17-[3-( 對甲苯基 ) 丙醯基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基胺甲醯基 } 戊醯基胺基 ) 己酸 ( 化合物 4-31) 之製備

將(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-(5-{N-17-[3-(對甲苯基)丙醯基胺基]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基胺甲醯基}戊醯基胺基)己酸酯(77 mg，91.8 µmol，1 eq.)溶解於CH₂Cl₂-TFA (4 mL，1:1)中。將反應混合物在室溫下攪拌4小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% FA)-ACN (0.1% FA) 90:10-50:50)，得到呈白色固體狀之標題化合物4-31(44 mg，70%產率)。m/z實驗值= 683.2 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.08 (s, 4H), 3.66 - 3.43 (m, 22H), 3.37 - 3.32 (m, 3H), 3.18 (t,J= 6.8 Hz, 2H), 2.86 (dd,J= 8.4, 6.9 Hz, 2H), 2.46 (dd,J= 8.4, 7.0 Hz, 2H), 2.28 (s, 3H), 2.25 - 2.15 (m, 4H), 1.86 (ddt,J= 33.0, 13.4, 7.7 Hz, 2H), 1.67 - 1.39 (m, 8H)。實例 63. 化合物 4-32 之合成 19- 苯基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜 -1- 十九烷醇之製備

將碳酸鉀(120 mg，869 µmol，3 eq.)、TBAB (9.3 mg，29 µmol，0.1 eq.)、碘化鉀(4.8 mg，29 µmol，0.1 eq.)及苯甲胺(95 µL，869 µmol，3 eq.)添加至17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(100 mg，290 µmol，1 eq.)於水(2.5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物加熱至90℃並攪拌5小時。冷卻後，將水相萃取至9:1 CH₂Cl₂-MeOH (×6)中。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至1:1 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(88 mg，81%產率)。m/z實驗值= 372.1 (M+H)。 2- 苯甲基 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將Boc酐(57 mg，260 µmol，1.1 eq.)於CH₂Cl₂(2 mL)中之溶液添加至19-苯基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜-1-十九烷醇(88 mg，236 µmol，1 eq.)及TEA (99 µL，708 µmol，3 eq.)於CH₂Cl₂(2 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫攪拌2小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(84.5 mg，76%產率)。m/z實驗值= 489.2 (M+NH₄)。 ( 苯甲基 )(2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，將甲烷磺醯氯(42 µL，538 µmol，3 eq.)添加至2-苯甲基2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(84.5 mg，179 µmol，1 eq.)及TEA (75 µL，538 µmol，3 eq.)於CH₂Cl₂(2 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物升溫至室溫並攪拌2小時。接著，將反應混合物用CH₂Cl₂稀釋且用水洗滌。將水層萃取至CH₂Cl₂(×2)中，接著將合併之有機層經Na₂SO₄乾燥，過濾且減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(98.5 mg，100%產率)。m/z實驗值= 572.1 (M+Na)。 2- 苯甲基 2-19- 苯基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜十九烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將苯甲胺(80 µL，736 µmol，4 eq.)添加至(苯甲基)(2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸三級丁酯(100 mg，184 µmol，1 eq.)、碘化鉀(31 mg，184 µmol，1 eq.)及TEA (77 µL，552 µmol，3 eq.)於DMF (5 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物加熱至80℃並攪拌7小時。冷卻後，減壓移除溶劑且將所得殘餘物經由急驟層析法(KP-胺基，100% CH₂Cl₂至70:30 CH₂Cl₂-MeOH)純化，得到呈褐色油狀之標題化合物(92 mg，90%產率)。m/z實驗值= 561.2 (M+H)。 2- 苯甲基 2-17-{( 苯甲基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將HATU (69 mg，181 µmol，1.1 eq.)添加至3-(對甲苯基)丙酸(30 mg，181 µmol，1.1 eq.)及DIPEA (86 µL，495 µmol，3 eq,)於DMF (2 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著添加2-苯甲基2-19-苯基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜十九烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(92 mg，164 µmol，1 eq.)於DMF (2.7 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌2小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至95:5 EtOAc-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(35 mg，30%產率)。m/z實驗值= 707.2 (M+H)。 N- 苯甲基 -N-(19- 苯基 -3,6,9,12,15- 五氧雜 -18- 氮雜十九烷基 )3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

將TFA (0.8 mL)添加至2-苯甲基2-17-{(苯甲基)[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(34.6 mg，48.9 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(3.2 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，接著減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(29 mg，98%產率)。m/z實驗值= 607.2 (M+H)。 (S)-2-[ 三級丁基 ( 氧基羰基胺基 )]-6-{5-[N- 苯甲基 (17-{N- 苯甲基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸三級丁酯之製備

將HATU (18.3 mg，48.1 µmol，1 eq.)添加至5-[N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[三級丁基(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基]戊酸(20.7 mg，48.1 µmol，1 eq.)及DIPEA (25 µL，144 µmol，3 eq.)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著添加N-苯甲基-N-(19-苯基-3,6,9,12,15-五氧雜-18-氮雜十九烷基)3-(對甲苯基)丙醯胺(29.2 mg，48.1 µmol，1 eq.)於DMF (2 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌3小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(16.7 mg，34%產率)。m/z實驗值= 1019.3 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[N- 苯甲基 (17-{N- 苯甲基 [2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 ) 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-32) 之製備

將TFA (2 mL)添加至(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-{5-[N-苯甲基(17-{N-苯甲基[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基)胺甲醯基]戊醯基胺基}己酸三級丁酯(77 mg，75.6 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(3 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌5小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% FA)-ACN (0.1% FA) 90:10-10:90)，得到呈白色固體狀之標題化合物4-32(10 mg，15%產率)。m/z實驗值= 863.3 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.42 - 6.99 (m, 14H), 4.79 - 4.61 (m, 4H), 3.68 - 3.41 (m, 24H), 3.23 - 3.15 (m, 2H), 2.98 - 2.79 (m, 3H), 2.65 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 2.60 - 2.54 (m, 1H), 2.46 - 2.37 (m, 1H), 2.30 (d,J= 4.2 Hz, 3H), 2.28 - 2.13 (m, 2H), 2.00 - 1.78 (m, 2H), 1.68 (t,J= 3.7 Hz, 2H), 1.63 - 1.40 (m, 6H), 1.31 (s, 1H)。實例 64. 化合物 4-33 之合成 3,6,9,12,15,21- 六氧雜 -18- 氮雜 -1- 二十四烷醇之製備

將2-丙氧基乙胺(224 mg，2.17 mmol，3 eq.)添加至17-溴-3,6,9,12,15-五氧雜-1-十七烷醇(250 mg，724 µmol，1 eq.)、碘化鉀(12 mg，72.4 µmol，0.1 eq.)及TEA (303 µL，2.17 mmol，3 eq.)於DMF (12 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物加熱至90℃並攪拌6.5小時。冷卻後，減壓移除溶劑且將所得殘餘物經由急驟層析法(Biotage KP-胺基，100% CH₂Cl₂至50:50 CH₂Cl₂-MeOH)純化，得到呈無色油狀之標題化合物(240 mg，90%產率)。m/z實驗值368.2 (M+H)。 2-17- 羥基 -3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2-2- 丙氧基乙基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將Boc酐(157 mg，719 µmol，1.1 eq.)添加至3,6,9,12,15,21-六氧雜-18-氮雜-1-二十四烷醇(240 mg，654 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(15 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌2小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至90:10至80:20 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈油狀之標題化合物(256 mg，84%產率)。m/z實驗值= 485.2 (M+NH₄)。 (2-{2-[2-(2-{2-[2-( 甲磺醯基氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙基 )(2- 丙氧基乙基 ) 胺基甲酸三級丁酯之製備

在0℃下，將甲烷磺醯氯(127 µL，1.64 mmol，3 eq.)添加至2-17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-2-丙氧基乙基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(256 mg，548 µmol，1 eq.)及TEA (229 µL，1.64 mmol，3 eq.)於CH₂Cl₂(6 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物升溫至室溫並攪拌4小時。接著，將混合物用CH₂Cl₂稀釋且用水洗滌。將水層萃取至CH₂Cl₂(×2)中，接著將合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(299 mg，100%產率)。m/z實驗值563.2 = (M+NH₄)。 2-3,6,9,12,15,21- 六氧雜 -18- 氮雜二十四烷基 2-2- 丙氧基乙基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將2-丙氧基乙胺(271 mg，2.63 mmol，4 eq.)添加至(2-{2-[2-(2-{2-[2-(甲磺醯基氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙基)(2-丙氧基乙基)胺基甲酸三級丁酯(359 mg，658 µmol，1 eq.)、碘化鉀(109 mg，658 µmol，1 eq.)、TEA (275 µL，1.97 mmol，3 eq.)於DMF (13 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物加熱至80℃並攪拌16小時。冷卻後，減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至70:30至50:50 CH₂Cl₂-MeOH) ，得到呈黃色油狀之標題化合物(63 mg，17%產率)。m/z實驗值= 553.3 (M+H)。 2-2- 丙氧基乙基 2-17-{(2- 丙氧基乙基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 }-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 2- 甲基 -2- 丙烷胺基甲酸酯之製備

將HATU (47.7 mg，125 µmol，1.1 eq.)添加至3-(對甲苯基)丙酸(20.6 mg，125 µmol，1.1 eq.)及DIPEA (60 µL，342 µmol，3 eq,)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著添加2-3,6,9,12,15,21-六氧雜-18-氮雜二十四烷基2-2-丙氧基乙基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(63 mg，114 µmol，1 eq.)於DMF (2.2 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌16小時，接著減壓移除溶劑。對殘餘物進行急驟層析(100% EtOAc至70:30 EtOAc-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(75 mg，94%產率)。m/z實驗值= 699.3 (M+H)。 N-(3,6,9,12,15,21- 六氧雜 -18- 氮雜二十四烷基 )-N-2- 丙氧基乙基 3-( 對甲苯基 ) 丙醯胺之製備

將TFA (0.6 mL)添加至2-2-丙氧基乙基2-17-{(2-丙氧基乙基)[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基}-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基2-甲基-2-丙烷胺基甲酸酯(75 mg，107 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(2.4 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，接著減壓移除溶劑，得到呈油狀之標題化合物(64 mg，100%產率)。m/z實驗值= 599.4 (M+H)。 (S)-2-[ 三級丁基 ( 氧基羰基胺基 )]-6-{5-[(2- 丙氧基乙基 ){17-[(2- 丙氧基乙基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 } 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸三級丁酯之製備

將HATU (50 mg，132 µmol，1 eq.)添加至5-[N-(S)-5-三級丁氧基羰基-5-[三級丁基(氧基羰基胺基)]戊基胺甲醯基]戊酸(57 mg，132 µmol，1 eq.)及DIPEA (69 µL，396 µmol，3 eq.)於DMF (1 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著添加N-(3,6,9,12,15,21-六氧雜-18-氮雜二十四烷基)-N-2-丙氧基乙基3-(對甲苯基)丙醯胺(79 mg，132 µmol，1 eq.)於DMF (2 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌3小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行急驟層析(100% CH₂Cl₂至95:5至90:10 CH₂Cl₂-MeOH)，得到呈無色油狀之標題化合物(101 mg，76%產率)。m/z實驗值= 1011.6 (M+H)。 (S)-2- 胺基 -6-{5-[(2- 丙氧基乙基 ){17-[(2- 丙氧基乙基 )[2-( 對甲苯基 ) 乙基 ] 羰基胺基 ]-3,6,9,12,15- 五氧雜十七烷基 } 胺甲醯基 ] 戊醯基胺基 } 己酸 ( 化合物 4-33) 之製備

將TFA (2 mL)添加至(S)-2-[三級丁基(氧基羰基胺基)]-6-{5-[(2-丙氧基乙基){17-[(2-丙氧基乙基)[2-(對甲苯基)乙基]羰基胺基]-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷基}胺甲醯基]戊醯基胺基}己酸酯(101 mg，99.7 µmol，1 eq.)於CH₂Cl₂(2 mL)中之經攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌5小時，接著減壓移除溶劑。對所得殘餘物進行製備型HPLC (C-18管柱，H₂O (0.1% FA)-ACN (0.1% FA) 90:10-10:90)，得到呈白色固體狀之標題化合物4-33(58 mg，68%產率)。m/z實驗值= 855.5 (M+H)。¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 7.16 - 7.06 (m, 4H), 3.69 - 3.48 (m, 34H), 3.44 - 3.35 (m, 4H), 3.26 - 3.15 (m, 2H), 2.88 (td,J= 7.6, 2.3 Hz, 2H), 2.79 - 2.70 (m, 2H), 2.54 - 2.45 (m, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.26 - 2.18 (m, 2H), 1.87 (ddq,J= 36.7, 14.5, 6.5 Hz, 2H), 1.69 - 1.41 (m, 12H), 0.92 (m, 6H)。生物實例

以下實例描述大小在60與110 kDa之間的放射性同位素遞送平台，且與相比，該等平台具有比傳統IgG短的半衰期(例如4天或更短)，但比較小單體抗體片段形式長的半衰期(例如大於10小時)。此外，本文所提供之某些放射性同位素遞送平台展現活體外或活體內高穩定性、低免疫原性及適合治療窗。此等放射性同位素遞送平台較佳用於活體內靶向放射性同位素以便治療疾病。此等放射性同位素遞送平台尤其可用於安全且有效地在個體體內靶向遞送α發射體，此係藉由與具有超過4天之半衰期及/或低於60 kDa之分子量的抗體相比展現降低之不良作用來實現。

一般熟習此項技術者應理解，在下文的某些片語中，「Fc部分」用於指代變異恆定域，且「鉸鏈」用於指代「鉸鏈區」。實例 B-1. 抗體產生

藉由將具有鉸鏈及Fc部分(人類IgG1 CH2-CH3)之VHH序列選殖至哺乳動物表現載體中來產生VHH-Fc質體。在一些情況下，將突變引入Fc部分中。為產生重組VHH-Fc及其變異體，將質體轉染至HEK293.SUS細胞(ATUM或類似細胞)中。在分泌3至5天之後，藉由離心及無菌過濾清除含抗體上清液中之細胞。使用Mab Select SuRe PCC管柱(GE, 目錄號:11003495)純化抗體且將其緩衝液交換為PBS (pH 7.0)。使用A280或BCA定量蛋白質。藉由SDS-PAGE、毛細管電泳、HPLC-SEC及LC-MS，使用標準方案測試抗體之純度。關於VHH多肽，參見例如McMahon等人, Nature Structural & Molecular Biology |第25卷| 2018年3月| 289-296Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies；Moutel等人, eLife 2016;5:e16228 NaLi-H1:A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. De Genst E, Saerens D, Muyldermans S, Conrath K. Antibody repertoire development in camelids. Dev Comp Immunol. 2006;30(1-2):187-98. doi: 10.1016/j.dci.2005.06.010. PMID: 16051357。Vincke C, Gutiérrez C, Wernery U, Devoogdt N, Hassanzadeh-Ghassabeh G, Muyldermans S. Generation of single domain antibody fragments derived from camelids and generation of manifold constructs. Methods Mol Biol. 2012;907:145-76. doi: 10.1007/978-1-61779-974-7_8. PMID: 22907350。Arbabi Ghahroudi M, Desmyter A, Wyns L, Hamers R, Muyldermans S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Lett. 1997年9月15日;414(3):521-6. doi: 10.1016/s0014-5793(97)01062-4. PMID: 9323027。

關於VHH人源化，參見例如Vincke C, Loris R, Saerens D, Martinez-Rodriguez S, Muyldermans S, Conrath K. General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold. J Biol Chem. 2009年1月30日;284(5):3273-84. doi: 10.1074/jbc.M806889200. Epub 2008年11月14日. PMID: 19010777。

關於VHH穩定性，參見例如Kunz P, Flock T, Soler N, Zaiss M, Vincke C, Sterckx Y, Kastelic D, Muyldermans S, Hoheisel JD. Exploiting sequence and stability information for directing nanobody stability engineering. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2017年9月;1861(9):2196-2205. doi: 10.1016/j.bbagen.2017.06.014. Epub 2017年6月20日. PMID: 28642127; PMCID: PMC5548252；Kunz P, Zinner K, Mücke N, Bartoschik T, Muyldermans S, Hoheisel JD. The structural basis of nanobody unfolding reversibility and thermoresistance. Sci Rep. 2018年5月21日;8(1):7934. doi: 10.1038/s41598-018-26338-z. PMID: 29784954; PMCID: PMC5962586。

使用VHH序列，諸如抗DLL3純系hz10D9v7.251 VHH序列(參見例如W02020/07967) (SEQ ID NO: 30)及抗5T4純系L14B5 (參見例如WO202007/6992 A1) (SEQ ID NO: 255)對多種VHH-Fc原型及變異體進行工程改造，除非本文另外說明，否則所收集及展示之資料係使用此等純系之VHH抗原結合區獲得。表 1 - 構築體

VHH Fc 名稱	FcRn 突變體	Fc 效應物突變體	目標
D102	wt	wt	DLL3
D111	I253A	wt	DLL3
D112	S254A	wt	DLL3
D113	H310A	wt	DLL3
D114	H435Q	wt	DLL3
D115	Y463A	wt	DLL3
D134	wt	AEASS	DLL3
D136	H310A	AEASS	DLL3
D138	H435Q	AEASS	DLL3
T157	H435Q	AEASS	5T4
變異體係根據EU編號；AEASS= L234A、L235E、G237A、A330S及P331S

實例 B-2. 抗體結合特性 ： 用於目標蛋白及目標細胞之分析

根據標準方案，藉由ELISA評定VHH-Fc與目標可溶性蛋白(適當時，人類、鼠類及獼猴異種同源物)之結合。抗原係來自商業來源或藉由將已知抗原序列(Uniprot)選殖至帶有用於純化及偵測目的之HIS、FLAG或等效標籤的哺乳動物表現載體中來產生。包括市售對照抗目標IgG。用50至100 μL各感興趣目標蛋白以使塗佈最佳化之濃度塗佈各盤(96孔maxisorp，Corning 3368)。製備起始濃度為200至400 nM的純化之VHH-Fc及hIgG1同型對照(Sigma，目錄號I5154)且按1:4向下調定。將一次抗體在室溫(RT)下培育1小時且洗滌後，添加0.2 μg/ml經HRP標記之二次抗體且在室溫下培育1小時(山羊抗人類IgG-Fc-HRP；Jackson，目錄號109-035-098)。使用每孔50 μL之TMB (Neogen，目錄號308177)偵測反應。用1 M HCl (50 μl)停止顯色。使用Spectromax盤讀取器在450 nm下量測光密度(OD)且使用SoftMaxPro處理資料。資料顯示，抗目標VHH-Fc結合至人類、鼠類及獼猴目標蛋白。所使用之重組DLL3蛋白係人類DLL3.FLAG (Adipogen#AG-40B-0151，胺基酸27-466)或人類DLL3.HIS (abcam #ab255797，胺基酸27-492)或鼠類DLL3.HIS (IPA定製，胺基酸25-477)或獼猴DLL3.HIS (Acrobiosystems #，胺基酸27-490)。用於DLL3結合之對照抗體係洛伐妥珠單抗(Rovalpituzumab)(Creative Biolabs #TAB-216CL，陽性對照)及曲妥珠單抗(Trastuzumab)(DIN：02240692，ROCHE，陰性對照)。圖 1顯示抗DLL3 VHH-Fc在ELISA中特異性結合至可溶性目標抗原，亦測試了在Fc區中包含突變以降低效應功能及/或FcRn結合的額外VHH-Fc，但其未顯著影響與目標抗原之結合。

藉由流式細胞分析技術針對與一系列目標陽性癌細胞株之結合來篩選VHH-Fc。除非另外指出，否則所有細胞株均來源於ATCC，且根據製造商之說明書及推薦培養基培養。所測試之DLL3陽性細胞株包括SHP-77 (ATCC CRl-2195)、NCI-H82 (ATCC HTB-175)、NCI-H69 (ATCC HTB-119)、HEK-DLL3 (Creative Biogene # CSC-RO0531)。所測試之DLL3陰性細胞株包括HCT-116 (CCL-247)、BT-474及SKBR3。5T4陽性細胞株係H1975 (ATCC NCI-H1975)及BXPC3 (CRL-1687)。將以與用於ELISA相同之方式稀釋的一次抗體添加至細胞中且在冰上培育1小時。將細胞用含1% FBS之PBS洗滌兩次，以450G離心4分鐘且與2 μg/mL結合AlexaFluor 647之抗人類IgG (Jackson，目錄號109-605-098)或結合AlexaFluor 647之抗小鼠IgG (Jackson，目錄號115-605-164)及1:1000之DAPI (Biolegend，目錄號422801)一起在冰上培育30分鐘。再洗滌兩次之後，將細胞再懸浮，且在iQue篩選器平台(screener platform) (Intellicyt)上藉由流式細胞分析技術進行分析，且根據標準方案用Forecyt處理資料。圖 2A及圖 2B顯示與DLL3陽性細胞株(SHP-77)之結合且顯示結合對目標陽性細胞具有特異性(亦即，透過與陰性對照細胞BT-474之結合進行比較)。其他實驗表明，相較於野生型Fc，降低效應功能及/或FcRn結合之Fc突變不影響與癌細胞之結合。實例 B-3. 內化分析

使用與pH敏感性染料結合之二次抗體測試表現目標之細胞對DLL3 VHH-Fc之內化。根據製造商之說明書，使山羊抗hu IgG-Fc二次抗體與pH敏感性pHAb染料(Promega目錄號G9845)進行胺結合。pHAb染料在pH＞7下具有低螢光或沒有螢光，但在抗體內化後在酸性環境中發螢光。將目標陽性細胞及目標陰性細胞以1.0×106個/毫升塗鋪於96孔V形底盤中。將VHH-Fc及hIgG1同型對照在培養基中稀釋至75 nM。對細胞離心以移除上清液，用所製備之一次抗體使其再懸浮且在冰上培育1小時。自細胞洗掉過量的一次抗體且接著在冰上與經pHAb標記之二次抗體一起培育30分鐘。接著，洗掉過量的二次抗體且將細胞再懸浮於培養基中。將一組樣品置放於37℃之培育箱中以允許內化，而另一組留在冰(0℃)上作為僅結合之對照。在0至24小時範圍內的不同時間點對細胞取樣。將細胞用DAPI染色且用iQue篩選器平台，藉由流式細胞分析技術在572/28通道上讀取。VHH-Fc在目標陽性細胞上顯示出高於陰性對照(同型，緩衝液)之螢光。圖 3顯示D102經SHP-77細胞及HEK-DLL3細胞內化。

根據以下程序，藉由Incucyte量測5T4 VHH-Fc內化：

使用與pH敏感性染料結合之二次抗體測試表現目標之細胞NCI-H1975(ATCC；CRL-5908)對VHH-Fc之內化。根據製造商之說明書，用Fabfluor-pH橙(Sartorius；4812)對VHH-Fc進行標記。Fabfluor-pH橙試劑在pH＞7下具有低螢光或沒有螢光，但在抗體內化後在酸性環境中發螢光。將表現目標之細胞以3,000個細胞/孔接種於96孔盤(Falcon；353072)中且在37℃下於5% CO2中培育隔夜。在分析之前，將VHH-Fc及hu IgG1同型對照在含有150 nM Fabfluor-pH橙試劑之培養基中稀釋至50 nM。將VHH-Fc螢光團複合物在37℃下培育30分鐘。將相等體積的VHH-Fc Fabfluor-pH橙複合物添加至表現目標之細胞中，由此獲得25 nM最終濃度。使用Incucyte® SX5(Sartorius)，利用綠/橙/NIR光學模組以20×放大率進行成像。將Incucyte®容納於含5% CO2的37℃培育箱內。每小時使用Incucyte®貼附型細胞軟體模組(adherent Cell-by-Cell software module；Sartorius)獲得圖像，持續36小時的時段。使用每個圖像之Fabfluor-pH橙積分強度除以每個圖像的表現目標之細胞面積對內化進行定量。自所得圖式計算曲線下面積(AUC)。VHH-Fc在表現目標之細胞上顯示出比陰性對照(同型，緩衝液，僅Fabfluor-pH橙)更高的螢光。

結果：與同型對照未觀察到內化相比較，V157之AUC係4.875 (n-=2次實驗之平均值)。實例 B-4. 受體密度測定

為了測試DLL3免疫結合物結合對於目標密度之功效，量測目標陽性細胞株上之受體密度。使用抗體結合能力(Antibody Binding Capacity，ABC)分析來量測目標密度。用細胞解離緩衝液採集表現感興趣目標之癌細胞以及陰性對照細胞株，以每孔約5×104個細胞接種於96孔V形底盤中(Sarstedt 82.1583.001)。遵循製造商之說明書，使用QuantiBRITE PE珠粒(BD目錄號340495)及結合PE之抗hu IgG (Biolegend純系HP6017)或Bangs Lab珠粒(目錄號816B，批號16551)，以每種抗體30 µl珠粒懸浮液(200 nM)測試細胞中之受體表現情況。簡言之，基於先前的實驗，以適合的飽和濃度製備VHH-Fc及同型對照抗體。將抗體樣品稀釋液與一組細胞株一起在冰上培育1小時。將細胞用含1% FBS之1×PBS(FACS緩衝液)洗滌兩次，以400 G離心4分鐘。接著，將細胞與4 μg/mL結合小鼠PE之抗hu及DAPI (1:1000)一起在冰上培育30分鐘。將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，以400 G離心4分鐘且再懸浮於FACS緩衝液中。在iQue篩選器平台上量測PE通道上之螢光強度，且用ForeCyt軟體處理資料。接著，將由不同一次抗體產生之PE信號的量擬合至基於已知PE分子/Quantibrite珠粒樣品之標準曲線以測定每個細胞中抗體結合位點之數目。相對抗體結合位點與細胞表面上抗原或受體之數目相關。

為了測試5T4 VHH-Fc結合對於細胞上目標表現之功效，在表現目標之細胞株上量測受體密度。遵循製造商之說明書，使用Quantum™ Simply Cellular®抗人類IgG套組(Bangs Laboratories, Inc；816)及結合PE之抗人類IgG Fc純系JDC-10 (abcam；ab99761)定量目標受體表現。簡言之，使用細胞解離緩衝液(Sigma；C5789)採集表現目標之細胞NCI-H1975 (ATCC；CRL-5908)及BxPC-3 (ATCC；CRL-1687)，並將其以50,000個細胞/孔接種於96孔盤(Corning；3368)中。在單獨的孔中，將約50 µl各珠粒群體添加至該盤中。將細胞及珠粒用在PBS + 2% FBS (經熱滅活) +1 mM EDTA (FACS緩衝液)中稀釋至200 nM的VHH-Fc及hu IgG1同型再懸浮。將樣品在冰上在暗處培育60分鐘。接著，將細胞及珠粒用FACS緩衝液洗滌兩次，以400 G離心5分鐘。將細胞及珠粒與2 μg/mL結合PE之抗hu IgG Fc一起在冰上在暗處培育45分鐘。接著，將細胞及珠粒用FACS緩衝液洗滌兩次，以400 G離心5分鐘。將珠粒再懸浮於FACS緩衝劑中並將細胞再懸浮於含有10 μg/mL DAPI之FACS緩衝液(Millipore Sigma；D9542)中，且在冰上在暗處培育10分鐘。在iQue® 3 VBR平台上量測PE通道上之螢光強度且用第10版Forecyt®軟體處理資料。各珠粒群體可結合特定數目的VHH-Fc分子，該數目等於抗體結合能力(ABC)。將珠粒之幾何平均PE輸入QuickCal® (由Bangs Laboratories Inc提供之批次特異性分析模板)中以產生PE幾何平均值相對於ABC之標準曲線。使用珠粒標準曲線，將表現目標之細胞上VHH-Fc之幾何平均PE值轉換為ABC以測定細胞上之受體密度。

表 2顯示結合至一組癌細胞株之抗DLL3 VHH-Fc及抗5T4 VHH-Fc之受體密度數目且其範圍與文獻中所報導之範圍類似。表 2- 各結合劑及細胞株中估計的抗原決定基/細胞數目。

		SHP-77	HEK-DLL3	BxPC3	H82	H1975
抗DLL3	Rova	969	1679	-	936	-
D102	807	1734	-	794	-
抗5T4	T157		-	29221	-	29205

實例 B-5. 抗體對目標蛋白之親和力

使用Octet Red96e (ForteBio)評定抗體親和力。用抗hIgG Fc (AHC)捕捉生物感測器(Fortebio目錄號18-5063)，藉由生物層干涉術量測締合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)及親和力常數(KD)。各循環均在1,000 rpm之軌道振盪速度下進行。在動力學緩衝液(Fortebio，目錄號18-1105)中自適合起始濃度以1:2滴定抗原。將一組AHC生物感測器浸入動力學緩衝液中，基線步驟為60秒。將抗目標VHH-Fc (5 μg/mL，在動力學緩衝液中)裝載於生物感測器上，保持240秒，隨後為30秒之第二基線步驟。將捕捉IgG之感測器浸入緩衝液中用於單參考減除以補償捕捉IgG之自然解離。接著，將各生物感測器浸入相應濃度之目標蛋白(人類、鼠類或獼猴單體蛋白)中，保持600秒，隨後在動力學緩衝液或最佳化條件中進行1800秒之解離時間。每一VHH-Fc使用一套新的AHC生物感測器。對於締合及解離步驟，藉由全局擬合1:1模型分析資料(v11.0版Octet軟體)。表 3顯示結合親和力資料。表 3- D102及T157對目標蛋白之親和力

VHH-Fc	分析物	KD (nM)
D102	人類DLL3-Flag	0.472
D102	小鼠DLL3-His	8.75
T157	人類5T4-His	2.76

實例 B-6. FcRn 及 Fc 效應物突變親和力測定

VHH-Fc之FcRn親和力一般可用於預測抗體血清清除之半衰期。(參見例如Datta-Mannan A等人, 「FcRn affinity-pharmacokinetic relationship of five human IgG4 antibodies engineered for improved in vitro FcRn binding properties in cynomolgus monkeys.」Drug Metab Dispos. 2012年8月;40(8):1545-55)。簡言之，使用Octet RED96e (Fortebio)，用SA生物感測器捕捉10 nM之生物素化hFcRn (Sino Biological，目錄號：CT071-H27H-B)。將塗佈hFcRN之生物感測器浸入具有一系列濃度之測試抗體之磷酸鈉緩衝液(100 mM Na2HPO4、150 mM NaCl、含0.05% Tween-20，pH 6.0)中之樣品溶液中，且量測締合。藉由將生物感測器浸入不含抗體之磷酸鈉緩衝液中來量測解離。使用Octet資料分析HT 11.0軟體測定KD值。分析中使用2:1(異質配體)結合模型。表 4顯示FCRN對野生型VHH-Fc之親和力，及Fc中之特定突變對突變體之親和力的影響。FcRn親和力之變化在所有目標間一致。僅具有Fc效應物突變之構築體對FcRn親和力沒有影響。將Fc效應物突變添加至FcRn突變構築體並不會影響FcRn親和力。表 4顯示VHH-Fc及Fc變異體對FcRn之親和力。表 4A. FcRn VHH-Fc 及 Fc 變異體對 FcRn 之親和力

VHH.Fc	FcRn 突變體	KD (nM)
D102	wt	3.8
D111	I253A	弱
D112	S254A	19
D113	H310A	不結合
D114	H435Q	弱
D115	Y463A	20
D116	H310A/H435Q	不結合
D134	wt	1.9
D136	H310A	不結合
D138	H435Q	弱
T157	H435Q	弱

亦使用Octet Red96e平台，藉由生物層干涉術測試VHH-Fc對FcγR之親和力。各循環均在1,000 rpm之軌道震盪速度下進行。使用動力學緩衝液(PBS + 0.1% BSA +0.02% Tween-20)使鏈黴抗生物素蛋白(SA)生物感測器(Sartorius 18-5019)再水合10分鐘。接著，將生物素化-FcγR (Acro Biosystems)以在PBS中稀釋的範圍在1-5 µg/mL之間的濃度裝載於SA生物感測器上，保持40-100秒。將VHH-Fc以1:2連續稀釋於樣品緩衝液(PBS + 0.02% Tween-20)中，其中起始濃度範圍在5000 nM至37.5 nM之間。接著，使裝載之生物感測器與VHH-Fc締合60-120秒。在樣品緩衝液中量測VHH-Fc解離，持續30-900秒。接著，使用3個5秒再生緩衝液(150 mM NaCl、300 mM檸檬酸鈉)及5秒樣品緩衝液的循環移除經結合之VHH-Fc。使用全局擬合1:1朗格繆爾結合模型(Langmuir binding model)(FcγRI)或穩態分析(Octet軟體HT v11.1版)分析資料。

分析顯示併入該等突變之構築體與FcγR之結合(由較高KD表示)減少，如表 4B中所示。表 4B. FcRn VHH-Fc 及 Fc 變異體對 Fc 受體之親和力

	Fc 突變	Fc γ RI nM KD	Fc γ RI Ia (H167) nM KD	Fc γ RI Ia (R167) nM KD	Fc γ RI Ib/c nM KD	Fc γ RI IIa (F176) nM KD	Fc γ RI IIa (V176) nM KD
曲妥珠單抗​	wt	0.92	270	520	3700	630	110
D102	wt	1.27	390	530	430	1200	730
D134	AEASS	-	弱	460	1100	-	-
D136	AEASS+ H310A	-	弱	570	2200	-	-
D138	AEASS+ H435Q		弱	520	770	-	-
(-)指示未偵測到結合

實例 B-7. Fc 變異體 有效地縮短 VHH - Fc 半衰期

在某些情況下，縮短α發射體之藥物半衰期對於安全性及避免與治療相關之不想要毒性至關重要。然而，抗體一般具有14天或更長之半衰期。因此，測試VHH-Fc變異體之半衰期以便觀察及量測半衰期之任何縮短。

將二十八(28)隻8週齡的雄性B6.Cg-Fcgrt^tm1DcrTg(FCGRT)32Dcr/DcrJ (Tg32 hom, JAX族群號014565)小鼠分成7組，每組具有4隻小鼠，如表中所概述。Tg32小鼠包含人源化FcRn，且與非人類靈長類動物相比時，一般被視為人類抗體藥物動力學的替代物。(參見例如Avery LB等人, 「Utility of a human FcRn transgenic mouse model in drug discovery for early assessment and prediction of human pharmacokinetics of monoclonal antibodies.」MAbs. 2016年8月至9月;8(6):1064-78)。在第0天，量測體重且向所有小鼠靜脈內投與3 mg/kg及5 ml/kg測試物。每隔一段時間自各小鼠收集25 µL血液樣品。將血液樣品收集至1 µL K₃EDTA中，處理成血漿，1/10稀釋於含50%甘油之PBS中，轉移至專門的96孔儲存盤中，且在-20℃下儲存。所有血漿樣品均經由選擇的hIgG ELISA進行評定，因為它對全部七種測試物均具有高靈敏度。表 5. 關於 DLL3 VHH - Fc 之 藥物動力學概述

	終末半衰期	清除率
	天	毫升/ 天
D111	10.2	10.8
SEM	4.4	10.5
D112	14.2	7.8
SEM	3.2	1.0
D113	1.1	254.8
SEM	0.2	27.0
D114	2.5	46.9
SEM	0.1	3.6
D115	11.0	6.9
SEM	13.2	1.1
D102	13.3	10.3
SEM	3.3	3.8
曲妥珠單抗	18.4	3.7
SEM	5.9	0.9

如表 5中所觀察到的，在FcRn內引入突變一般能夠縮短抗DLL3 VHH-Fc之半衰期。與公開之結果相反，並非全部Fc變異體皆顯示半衰期縮短，與先前公開的在文獻中發現之結果一致。實例 B-8. VHH - Fc 完整質量分析

在分析之前，在37℃下使用內部Endo-S酶(最終濃度為10 μg/mL)或市售Endo-S (New England BioLabs Inc.，目錄號：P0741L)將VHH-Fc抗體去醣基化，持續1小時。為了分析完整質量，將8 μL樣品注射於具有UPLC BEH200 SEC 1.7 µM 4.6 × 150 mm管柱的Waters Acquity UPLC-Q-TOF上。將此等樣品用含有0.1% TFA及0.1% FA(甲酸)之水/ACN(70/30，v/v)作為移動相以0.25 mL/min之流動速率溶離11分鐘。實例 B-9. 雙官能螯合劑之結合

結合可使用許多可用於製備IgG放射性結合物及IgG抗體-藥物結合物之方法進行。關於適用方法之範圍的資訊，參見PW Howard Antibody-Drug Conjugates (ADCs),Protein Therapeutics,第一版, 第9章, 第278-279頁(2017)。

根據典型的蛋白質表現系統及純化獲得VHH-Fc抗體(下文稱為抗體或mAb)：藉由將具有鉸鏈及Fc部分(人類IgG1 CH2-CH3)之VHH序列選殖至哺乳動物表現載體中，產生mAb質體。在一些情況下，將突變引入Fc部分中。為了產生重組mAb，將質體轉染至HEK293.SUS細胞(ATUM或類似細胞)中。在分泌3至5天之後，藉由離心及無菌過濾清除含抗體上清液中之細胞。使用Mab Select SuRe PCC管柱(GE, 目錄號:11003495)純化抗體且將其緩衝液交換為PBS (pH 7.0)。使用A280或BCA定量蛋白質。藉由SDS-PAGE、毛細管電泳、HPLC-SEC及LC-MS，使用標準方案測試抗體之純度。

對於典型的基於離胺酸之結合，藉由Microsep Advance離心裝置(Pall，10K MWCO，Omega改良型PES膜，目錄號：MCP010C41)、Amicon超速離心過濾單元(Millipore，40 Kda MWCO，再生纖維素膜，目錄號：UFC803096)或Vivaspin Turbo 4超濾單元(Sartorius，30kDa MWCO，高通量PES膜，目錄號VS04T21)將抗體緩衝液交換為0.1 M NaHCO₃(pH 9.0)，隨後使用0.22 μm之Costar Spin-X離心管(Corning，目錄號：8160)滅菌。藉由Pierce BCA分析(Thermo Scientific，目錄號：23225)或A280 (Unchained Labs，Lunatic)對經緩衝液交換之抗體進行定量。在一些情況下，抗體可經濃縮，由此可在緩衝液交換為0.1 M的NaHCO₃(pH 9.0)之後將其調至5 mg/mL之濃度；在大多數程序中，在緩衝液交換之後，藉由添加額外0.1 M NaHCO₃將抗體在0.1 M NaHCO₃(pH 9.0)中稀釋至2-5 mg/mL。

接下來，將適當莫耳過量(5-30當量)之螯合劑-連接子(20-50 mM於DMSO中)添加至mAb溶液中(2或5 mg/mL最終濃度)。在一些情況下，添加DMSO以使結合溶液符合2-10% DMSO。在25℃下，將反應物在埃彭道夫恆溫混合器C (Eppendorf thermomixer C)中培育隔夜(在300 rpm持續振盪下)。反應完成後，根據製造商之方案，使樣品通過Zeba離心脫鹽管柱(40 KDa MWCO，ThermoFisher，目錄號：87770)以移除未使用的螯合劑-連接子且將緩衝液交換為PBS (pH 7.4) (LifeTechnologies，目錄號：10010-023)。藉由MS分析抗體-螯合劑結合物(ACC)的適當CAR，接著藉由製備型SEC純化。將所有ACC在4℃下儲存直至分析及純化。在純化前進行之結合實驗的選定代表性結果呈現於表 6中。表 6. 在製備型 SEC 純化之前選定螯合劑 - 連接子與 VHH - Fc 抗體之結合的結果。

化合物	VHH	螯合劑 - 連接子 :Ab rxn 比率	DMSO (%)	結合蛋白濃度 (mg/mL)	MS-CAR	單體 (%)	結合 EC50 (nM)	結合細胞株
1-1	D138	6	5	5	3.74	97%	0.18	SHP77
D138	7.5	5	5	4.75	95%	-	-
D138	9	5	5	5.19	94%	-	-
3-1	D138	18	2	2	3.99	88%	0.20	SHP77
D138	18	2	2	4.65	92%	-	-
2-1	D102	4.6	2	2	2.05	97%	0.081	SHP77
D102	9	2	2	4.24	97%	0.11	SHP77
D102	17.7	2	2	7.67	96%	0.094	SHP77
3-1	T157	10	2	2	3.31	97%	-	-
3-1	T157	13.5	2	2	4.52	95%	-	-
1-1	T157	5	5	5	3.68	99%	5.1	H1975
T157	7	5	5	4.45	99%	5.1	H1975
T157	9	5	5	5.76	99%	7.8	H1975

實例 B-10. 藉由製備型 SEC 進行 之純化

為移除高分子量物種(HMWS)及低分子量物種(LMWS)，使用具有Cytiva HiLoad 16/600 Superdex 200pg管柱之AKTA Pure FPLC系統，藉由SEC純化VHH-Fc。使用TBS緩衝液(50 mM Tris、150mM NaCl、OmniTrace Ultra水[VWR，目錄號：CAWX0003-2]，pH 7.6)作為SEC緩衝液。將含有完整VHH-Fc之溶離份匯集在一起且使用Microsep Advance離心裝置(Pall 10k MWCO，目錄號：MCP010C41)進行濃縮。將經濃縮之樣品轉移至0.22 µm及0.5 mL之Ultrafree-MC GV離心過濾器(Millipore，目錄號：UFC30GV0S)中且以3,000×g離心3分鐘。實例 B-11. 蛋白質定量

對於一些樣品，使用經西妥昔單抗(LIST/E：094822，DIN 02271249，2 mg/mL)標準化之Pierce BCA蛋白質分析套組(Thermo，目錄號：23225)對VHH-Fc蛋白質或VHH-Fc結合物含量進行定量。

對於其他樣品，使用2 µL樣品，藉由用Lunatic UV/Vis分光光度計(Unchained Labs)量測溶液在280 nm下之吸光度及蛋白質在280 nm下之消光係數計算值對VHH-Fc蛋白質或VHH-Fc結合物含量進行定量。實例 B-12. 螯合劑 比 VHH - Fc 比率 ( CAR ) 分析

螯合劑裝載量(在此描述為CAR，即螯合劑-抗體比率)可以透過適用於抗體結合物領域從業者之方法進行分析。關於在ADC情況下此等方法之綜述，參見A Wakankar等人,mAbs3: 161(2011)。

在分析之前，在37℃下用市售Endo-S酶(New England BioLabs Inc.，目錄號：P0741L)對VHH-Fc抗體及結合物進行N-去醣基化，持續1小時。為了分析完整質量，注射8 μL近似濃度為1 mg/mL之樣品且藉由HPLC-Q-TOF-MS，使用連結至1260/190 Agilent BioInert Infinity II HPLC系統之Agilent AdvanceBio 6545XT LC/QTOF質譜儀進行分析。在25℃下，採用在Agilent AdvanceBio SEC保護管柱(I.D.：4.6 mm/長度：30 mm/粒度1.9 μm，孔徑200 Å，部件編號：PL1580-1201)之後連結的Agilent AdvanceBio SEC管柱(I.D.：4.6 mm/長度：150 mm/粒度1.9 μm，孔徑200 Å，部件編號：PL1580-3201)，用含有0.2%甲酸及0.1%三氟乙酸之MilliQ水(18.2 MOhm)中的30%乙腈等度移動相流以0.25 mL/min之恆定流動速率將樣品溶離20分鐘。在Agilent之MassHunter工作站上，使用Agilent之BioConfirm軟體(12.0版)進行原始資料之去卷積及CAR計算。實例 B-13. VHH - Fc 結合物與表現目標蛋白之細胞的結合

在一些情況下，結合可不利地影響VHH-Fc與目標蛋白之結合。因此，測試VHH-Fc結合物之結合。

藉由流式細胞分析技術針對與一系列目標陽性癌細胞株的結合來篩選結合物。除非另外指出，否則所有細胞株均來源於ATCC，且根據製造商之說明書及推薦培養基培養。使用SHP-77 (ATCC CRL-2195)細胞作為DLL3陽性細胞株(對於D102及D138結合物)。5T4陽性細胞株係H1975 (ATCC CRL-5908)(對於T157結合物)。將以與用於ELISA相同之方式稀釋的一次抗體添加至細胞中並在冰上培育1小時。將細胞用含1% FBS之PBS洗滌兩次，以450G離心4分鐘且與2 μg/mL結合AlexaFluor 647之抗人類IgG (Jackson，目錄號109-605-098)或結合AlexaFluor 647之抗小鼠IgG (Jackson，目錄號115-605-164)及1:1000之DAPI (Biolegend，目錄號422801)一起在冰上培育30分鐘。再洗滌兩次之後，將細胞再懸浮，且在iQue篩選器平台(Intellicyt)上藉由流式細胞分析技術進行分析，且根據標準方案，用Forecyt處理資料。

表 6及表 7包括VHH-Fc螯合劑結合物之細胞結合資料。結合不受所測試之所有結合物結合的顯著影響，不管所使用之連接子或該樣品之最終CAR如何。如下表 7中所示，所有經純化之結合物皆維持結合。實例 B-14. 完整免疫結合物 百分比 分析

藉由HPLC-SEC確定完整免疫結合物之百分比。將20 μL濃度為約1 mg/mL之結合物添加至標準HPLC小瓶中之玻璃小瓶插管中。將10 μL樣品注射至裝備有UV/VIS PDA偵測器(波長：280 nm/360 nm參考)以及Tosoh Bioscience TSKgel G3000SW XL (I.D. 7.8 mm/長度：300 mm/粒度：5 μm/孔徑：250 Å，部件編號：08541)管柱與保護管柱(TSKgel SWXL保護管柱I.D. 6.0 mm/長度：40 mm/粒度：7μm，部件編號：08543)之組合的Agilent 1260/1290 BioInert Infinity II HPLC系統上，使用等度溶離，其中移動相由78 mM KH2PO4、122 mM K2HPO4、250 mM KCl、15% 2-丙醇(pH 7.0)組成，經0.2 μm過濾，以0.50 mL/min之恆定流動速率經45分鐘溶離。

或者，用相同的HPLC系統設置，使用相同濃度的15 μL注射體積，在Sepax Technologies Zenix SEC-300 (I.D. 4.6 mm/長度：300 mm/粒度：3 μm/孔徑：300 Å，部件編號：213300-4630)管柱與保護管柱(Zenix SEC-300管柱I.D. 4.6 mm/長度：50 mm/粒度：3 μm/孔徑：300 Å，部件編號：213300-4605)之組合上，使用等度溶離進行相同分析，其中移動相由150 mM磷酸鈉、35 mM硫酸銨、130 mM氯化鈉(pH 6.8)組成，經0.2 μm過濾，以0.25 mL/min之恆定流動速率經30分鐘溶離。實例 B-15. 內毒素含量測定

根據製造商之說明書，使用Endosafe Nexgen-MCS讀取器(Charles River)及0.05或0.01 EU/ml濾筒(PTS2005F/PTS2001F)進行內毒素測試。

QC截止值係基於研究中計劃的各動物之最大注射劑量，同時遵循適當動物照護及FDA指南設定。表 7. 經 純化之螯合劑 - 連接子與 VHH - Fc 之結合物的資料

化合物	VHH	螯合劑 - 連接子 : Ab rxn 比率	濃度 (mg/mL)	MS-CAR	單體 (%)	內毒素 (EU/mg)	結合 EC50 (nM)	量 (mg)	產率 (%)
3-1	D102	18	5.79	4.62	100%	＜1	-	4.5	81%
2-1	D102	8.4	7.93	3.96	99%	0.107	0.094*	7.85	79%
3-1	D138	18	5.3	4.18	100%	＜1	0.2*	4.4	60%
1-1	D138	6	5.68	3.43	99%	-	0.179*	1.4	47%
3-1	T157	13.5	7.95	4.19	100%	0.018	16.71	5.0	71%
1-1	T157	5	6.45	3.59	100%	0.548	9.251	1.9	63%
1-46	D138	4.1	5.82	4.22	99.1%	4.82	0.13*	1.6	55%
1-12	D138	5.5	5.22	3.26	99.4%	0.06	ND	1.2	40%
1-20	D138	5.5	4.28	4.34	99.15%	1.89	0.23*	1.6	53.3%
2-1	D138	5.5	5.49	3.21	98.09%	2.58	0.62*	1	33.3%
1-2	D138	5.5	4.66	3.33	98.29%	1.84	0.33*	1.2	40%
1-8	D138	5.5	6.21	3.22	98.93%	1.85	0.59*	1.4	46.7%
1-3	D138	7.5	4.92	2.45	98.74%	＜0.223	0.39*	1.2	40%
1-13	D138	7.5	3.74	3.14	98.57%	＜0.171	3.14*	1.2	40%
2-25	D138	5.5	5.0	2.69	98.75%	2.15	0.59*	1	33.3%
1-9	D138	5.5	8.21	3.03	99.34%	5.72	0.48*	1.7	56.7%
1-44	D138	7	6.02	5.52	96.88%	2.61	ND	1.4	47%
1-43	D138	5.5	9.96	3.56	97.63%	2.25	0.58*	2.7	90%
1-42	D138	7.5	6.24	4.3	97.24%	2.67	0.281*	1.3	43%
1-39	D138	5.5	6.25	3.49	97.81%	17.7	0.87*	1.2	40%
1-16	D138	5.5	5.59	3.3	97.4%	3.74	1.42*	1.3	43%
1-21	D138	5.5	5.86	4.04	99.07%	1.42	0.16*	1.5	50%
1-37	D138	5.5	6.56	3.63	98.58%	1.85	0.23*	1.4	46.7%
1-38	D138	5.5	6.71	3.30	98.82%	10	0.11*	1.4	46.7%
1-40	D138	5.5	6	3.18	98.86%	13.2	1.02*	1.4	46.7%
1-41	D138	7.5	6.82	4.08	98.61%	14.2	0.65*	1.4	46.7%
1-5	D138	5.5	4.68	2.69	98.9%	6.7	0.76*	1.7	57%

*SHP77細胞¹H1975細胞實例 B-16. 用 ¹¹¹ In 放射性標記

在0.5-2 mL的lo-bind埃彭道夫管中，用0.1 M乙酸銨緩衝液(pH =5.5)將40-60 µg的4種測試物中之各者稀釋至50-100 µL，並添加2-25 μL(20-30 MBq)之[¹¹¹In]InCl₃且用移液管混合。將反應混合物在37℃、600 rpm之恆溫混合器中培育或在培育箱中培育1-2小時，且接著在室溫下，用50 mM DTPA溶液(pH =5.5)淬滅，保持15分鐘。反應之後，藉由使結合物通過經預調節之PD-10脫鹽管柱(Amersham.或Cytiva目錄號17-0851-01)對該等結合物進行純化。用表 8中指示之生理鹽水調配緩衝液或表 9中指示之20 mM乙酸鹽緩衝液溶離產物。將具有最高活性濃度之溶離份合併，且用iTLC及SEC-HPLC進行純度檢查。若在合成結束時之放射化學純度(EOS RCP%)≥95%，則將該等溶離份在4℃保持18-24小時，並藉由iTLC及SEC-HPLC評定經標記結合物之穩定性。

藉由在1.5×10 cm iTLC-SG條帶之起點處點樣0.5 μL樣品來測定放射性核種之併入量。接著，將該條帶置放於含有2 mL移動相(25 mM EDTA於pH 5之0.1 M乙酸鈉緩衝液或pH 5.2之0.1 M檸檬酸鈉緩衝液中)之50 mL法爾康管(Falcon tube)中，直至溶劑到達條帶之頂部。取出該條帶並使其暴露於磷光體成像盤，接著在Cyclone磷光體成像儀中掃描或直接在iTLC掃描儀(Bioscan-AR-2000，Eckert & Ziegler)上掃描。在與結合蛋白質及未結合之¹¹¹In之遷移相對應的點上繪製感興趣區域，且計算出各區域之比例。

亦藉由SEC-HPLC分析一些放射性結合物：將對應於0.1-1 MBq之體積的樣品用移液管移液至500 μL之lo-bind埃彭道夫管中且在游離室中量測放射性。將樣品抽取至注射器中且注射至HPLC系統上。用PBS溶離樣品。收集來自系統之溶離液且量測放射性以測定管柱之回收率(針對樣品管及注射器中剩餘之放射性進行校正)。表 8. 螯合劑 - 結合物 之 In - 111 放射性標記及穩定性資料

化合物	VHH	MS-CAR	單體 (%)	EOS (iTLC)	24 小時 PBS (iTLC)	單體 % (SEC)	HWMS (SEC)	LMWS (SEC)	24 小時 PBS (IRF)	24 小時血清 (IRF)
2-1	D102	3.96	99%	99%	99%	-	-	-	87%	72%
3-1	D102	4.62	100%	99%	100%	-	-	-	95%	88%
3-1	D138	3.99	88%	99%	100%	96%	3%	1%	95%	89%
1-1	D138	3.43	99%	99%	98%	97%	1%	2%	74%	81%
3-1	T157	3.05	99%	100%	99%1	99%	-	-	-	-
1-1	T157	3.67	99%	99%	97%1	96%	-	-	-	-

¹在PD10純化之後，在生理鹽水中培育24小時表 9. 螯合劑 - 結合物 之 In - 111 放射性標記及穩定性資料

化合 物	VHH	MS-CAR	2 小時RCY %	EOS RCP%	穩定性RCP%2	IRF 分析3
iTLC	HPLC1	iTLC	HPLC1	iTLC	HPLC1	經結合%
1-46	D138	4.22	96	90	98	97	-	97	-
1-20	D138	4.34	98	91	99	98	-	98	-
2-1	D138	3.21	99	84	99	98	-	98	-
1-12	D138	3.26	97	93	97	98	-	99	-
1-2	D138	3.33	95	91	99	97	-	96	-
1-13	D138	3.14	96	89	99	96	-	95	-
2-25	D138	2.69	99	92	99	96	-	87	-
1-8	D138	3.22	96	89	98	96	-	97	-
1-3	D138	2.45	98	81	100	89	-	88	-
1-9	D138	3.03	92	85	99	98	-	97	-
1-5	D138	2.69	88	80	99	98	-	97	-
1-43	D138	3.56	85	80	99	99	99	99	95
1-42	D138	4.3	82	77	99	98	99	96	93
1-16	D138	3.3	99	80	99	96	99	99	97
1-44	D138	5.52	99	81	99	93	99	99	95
1-39	D138	3.49	99	83	99	97	99	98	94
1-40	D138	3.18	98	96	99	98	99	95	94
1-41	D138	4.08	99	97	99	99	99	98	96
1-38	D138	3.30	99	96	99	98	99	98	96
1-37	D138	3.63	99	96	98	98	98	95	95
1-21	D138	4.04	99	90	99	95	98	94	94

¹HPLC報導結合物峰中之單體%²穩定性：在含有5 mM DTPA之0.9% NaCl(pH 5.5)中之20 mM NaOAc中24小時³在培育之前獲取的IRF實例 B-17. 用 ²²⁵ Ac 放射性標記

在500 μL之lo-bind埃彭道夫管中，用0.15-0.2 M乙酸銨緩衝液(pH 6-6.5)將200-1000 μg各測試物稀釋至100-500 μL，且添加2-2.5 μL(100-500 kBq)之氯化錒-225且用移液管進行混合(以達到0.5 kBq/μg蛋白質之最終比活性)。在培育箱或恆溫混合器(600 rpm)中，在37℃下將反應混合物培育2小時。在一些情況下，藉由使結合物通過8.3 ml之PD10脫鹽管柱(Amersham或Cytiva目錄號17-0851-01)且用表 9中指示之生理鹽水調配緩衝液溶離來純化該等結合物。若不進行純化，則用相同的調配緩衝液稀釋樣品。接著，將該等管轉移至4℃冰箱中。

藉由在1.5×10 cm iTLC條帶之起點處點樣0.5 μL樣品且使其乾燥幾分鐘來量測併入量。接著，將該條帶置放於含有2 mL移動相(25 mM EDTA於pH 5之0.1 M乙酸鈉緩衝液或pH 5.2之0.1 M檸檬酸鈉緩衝液中)之50 mL法爾康管中，直至溶劑到達條帶之頂部。取出條帶並使其平衡至少6小時，之後，使其暴露於磷光體成像盤，接著在Cyclone磷光體成像儀中掃描或直接在iTLC掃描儀(Bioscan-AR-2000, Eckert & Ziegler)上掃描。在與結合蛋白質及未結合之²²⁵Ac之遷移相對應的點上繪製感興趣區域，且計算出各區域之比例。

可藉由HPLC-SEC分析樣品：一些資料使用BioSEP SEC 5 µm s3000 3007.88 mm管柱，用含20%乙腈之PBS溶離；或使用Wyatt 050S5 5 µm 500Å 7.8 × 300 mm管柱，用含20%乙腈之PBS溶離。

或者，使用Tosoh Bioscience TSKgel G3000SW XL (I.D. 7.8 mm/長度：300 mm/粒度：5 μm/孔徑：250 Å，部件編號：08541)管柱與保護管柱(TSKgel SWXL保護管柱I.D. 6.0 mm/長度：40 mm/粒度：7 μm，部件編號：08543)之組合，使用等度溶離進行相同分析，其中移動相由78 mM KH2PO4、122 mM K2HPO4、250 mM KCl、15% 2-丙醇(pH 7.0)組成，經0.2 μm過濾，以0.5 mL/min之恆定流動速率經45分鐘溶離。

將50 μL各樣品抽取至Hamilton注射器中且注射至HPLC系統上。在注射後10至30分鐘，手動將30秒之溶離液部分(0.25 mL)收集至計數管中。使各部分達到長期平衡，持續24小時，且接著在γ計數器中量測。亦對5 μL各製劑樣品進行計數以便能計算HPLC系統之回收率。藉由測定18.5-22.5分鐘及19.5-23.5分鐘之峰下面積來測定放射化學純度，以總計數之百分比表示。如表 9中所示，所有螯合劑-連接子組合均顯示出良好的標記效率。表 10 -²²⁵Ac 放射性標記效率

化合物	VHH	MS-CAR	單體 (%)	EOS (iTLC)	單體 % (SEC)	HWMS (SEC)	LMWS (SEC)
3-1	D102	4.62	100%	99%	-	-	-
3-1	D138	4.59	100%	100%	98%	2.0%	-
1-1	D138	5.04	98%	71%	97%*	1.5%	1.5%

*在PD10純化後¹穩定性係在含5 mM DTPA、50 mM抗壞血酸鈉之生理鹽水中測試。實例 B-18 放射性結合物之穩定性

測試²²⁵Ac及¹¹¹In兩者放射性標記之免疫結合物的穩定性。如上文所描述，對VHH-Fc螯合劑-結合物進行放射性標記(¹¹¹In或²²⁵Ac)。對於在PBS中之穩定性，接著將50 μL各經標記之測試物添加至200 μL PBS (含¹¹¹In)或200 μL PBS/抗壞血酸鹽(含²²⁵Ac)中且在4℃下儲存。對於在生理鹽水及其他調配物中之穩定性，如實例 B - 15及實例 B - 16中所描述，在透過PD10管柱溶離之後，對樣品進行緩衝液交換，獲取1-1.5 mL溶離劑。在不同時間點獲取等分試樣，且如上文所描述使用iTLC及/或HPLC-SEC分析放射化學純度。此等穩定性實驗之結果示於表 8及表 9中。實例 B-19 VHH - Fc 放射性結合物之免疫反應性

透過SK Sharma等人在Nucl . Med . Biol. 2019,71,32-38中所描述之方法測定免疫反應性分率(IRF)。在活體內實驗之前，將樣品在PBS中於4℃下且在血清中於37℃下培育隔夜(24小時)以量測調配物之穩定性及適用性。對經培育之樣品進行下文所描述之IRF分析實例 B-20-22.

獲取In-111結合物之免疫反應性資料且合併於上表 8中。實例 B-20 用於 IRF 分析之珠粒塗佈

在室溫下，在管旋轉器上，將Dynabeads及抗原(0.15 nmol/0.125 µg珠粒)在B/W緩衝液/PBS-0.05% Tween-20 (PBST)(25-400 µL/0.125 μg珠粒)中培育30-90分鐘。將埃彭道夫管以100×g離心15秒且置放於磁架上，保持3分鐘。移除上清液且用PBSF/PBST洗滌珠粒。接著，將1 mg珠粒再懸浮於200 μL B/W緩衝液中且2 mg珠粒再懸浮於400 μL B/W緩衝液中。以相同方式製備對照珠粒，但在管中未添加抗原。實例 B-21. 免疫反應性分率 ( IRF ) 分析

將適當體積的以上產生之珠粒(25 μL/0.125 mg珠粒)添加至用0.4 mL PBSF或1 mL PBSF預先洗滌之微量離心管中。將放射性標記之VHH-Fc-結合物(10 ng)、阻斷劑(10或50 μg未結合之抗體；必要時)及PBSF添加至各反應中以達到350-400 μL之最終體積。在室溫下，在旋轉器上將樣品培育30分鐘。在此之後，將管以100×g離心15秒且置放於磁架上，保持3分鐘。將上清液收集於γ計數器管中。將珠粒用400 μL PBSF/PBST洗滌兩次且收集於單獨的γ計數器管中。最終，使珠粒再懸浮於500 μL PBSF中且轉移至γ計數器管中。用500 μL PBSF洗滌反應管且將其添加至含有珠粒之γ計數器管中。實例 B-22. 藉由 IRF 測定的結合物之穩定 性

使用以上呈現之IRF分析探測由新穎連接子形成之結合物的穩定性。使用免疫反應性量測結合至經固定之目標抗原的放射性%將允許經驗測定保持靶向結合抗原之放射性。放射性之中靶結合減少允許對不同螯合劑-連接子、不同靶向載體進行比較性分析，且顯示結合物溶液有效靶向所需抗原之能力隨時間降級。

簡言之，亦可將實例 B - 17(穩定性研究)之穩定性分析中溶液之等分試樣用於實例 B - 18(IRF分析)中所描述之IRF分析，且計算結合反應性%且在不同時間點進行比較。一般而言，在0、1天及3天時獲取樣品。實例 B-23. 在未接受過治療之 小鼠中用 ¹¹¹ In 進行 活體內成像實驗 以 使用不同結合物量測全身放射性清除率

成像(例如使用¹¹¹In)能夠收集藥物動力學及生物分佈資料，該等資料可用於進行治療計劃之劑量測定計算。(參見例如Sgouros G, Hobbs RF. 「Dosimetry for radiopharmaceutical therapy.」Semin Nucl Med.2014年5月;44(3):172-8)。不受理論束縛，用成像標記觀察到的靶向之定量論證指示用能夠引起目標細胞死亡之放射性標記(例如α發射體)進行靶向的能力。對各種組織中存在之放射性的比較性分析允許比較用不同螯合劑-連接子製備之結合物的相對效能及排泄型態。

簡言之，經由尾靜脈對雌性CD-1小鼠(n = 21)注射如上所述用比活性為0.5 MBq/μg之10 MBq In-111放射性標記(實例 B-15，針對研究按比例調整)的7種選定螯合劑-連接子結合物(7組)中之一者(n = 3隻/組)。在麻醉下對動物進行全身SPECT成像，隨後進行CT。選擇三個時間點(24小時、72小時及144小時)。分析資料以顯示全身ID%(注射劑量百分比)及清除率。隨後，可藉由繪製感興趣區域(ROI)對圖像進行再處理以測定在個別器官中分離之活性。

相關放射性結合物之全身清除率示於圖 4A和圖 4B中。圖 4A顯示D102之兩種結合物的總全身ID%。圖 4B顯示D138之兩種結合物的總全身ID%。兩者均指示，與已公開之對照螯合劑-連接子化合物 3 - 1相比較，新連接子降低總體保留活性。

在三個獨立的相同實驗(分組，示於下表 11中)中，對與D138結合之額外16種類似物重複此研究，與化合物 3-1之D138結合物相比較以顯示如何改變結構才能增強或消除新穎螯合劑-連接子之清除特性。製備放射性結合物之放射化學方法係相同的，其中每隻動物注射7-10 MBq且每組n = 2-3隻動物。圖 4C、圖 4E及圖 4G顯示所測試之第1組、第2組及第3組D138結合物之全身活性清除率(ID%)；各自參照化合物 3-1(呈¹¹¹In-D138-3-1形式)。圖 4D及圖 4F顯示第1組及第2組D138結合物之選定器官吸收值(ID%/g)。圖 4H顯示第3組在1天、3天及6天時代表性個別小鼠之活性分佈的最大強度投影。

表 11. 在用 D138 之新穎螯合劑 - 連接子結合物進行之三個追蹤實驗中測試的放射性結合物組

第 1 組	第 2 組	第 3 組
111In-D138-1-46	111In-D138-1-9	111In-D138-1-21
111In-D138-1-20	111In-D138-1-44	111In-D138-1-37
111In-D138-2-1	111In-D138-1-43	111In-D138-1-38
111In-D138-1-12	111In-D138-1-42	111In-D138-1-40
111In-D138-1-2	111In-D138-1-39	111In-D138-1-41
111In-D138-1-8	111In-D138-1-1	111In-D138-1-1
111In-D138-1-1	-	-

實例 B-24 使用 DLL3 腫瘤模型測定的具有新穎螯合劑 - 連接子之 VHH - Fc 放射性免疫結合物的生物分佈

與以上所描述之實驗類似，使用荷瘤小鼠，透過生物分佈實驗測試來自表 7之經純化結合物。本研究係用SHP77及H1975腫瘤異種移植物以類似群組大小及時間點執行。本研究之讀出結果表明哪些化合物形成相對於正常組織更有利於腫瘤吸收放射性之結合物，且證實新結合物仍然能適當靶向表現目標抗原之腫瘤。

簡言之，本研究係用SHP-77異種移植模型，以上述結合DLL3之螯合劑-連接子-VHH-Fc結合物執行。藉由注射將100 µL經PBS稀釋之50%基質膠中的6×10^6個SHP-77細胞接種至6-8週齡雌性無胸腺裸小鼠(n=30，6組n=5)之右下側腹中。當腫瘤達到125-400mm3之目標體積時，經由尾靜脈對小鼠注射如上所述用比活性為0.5 MBq/μg之10 MBq In-111放射性標記(實例 B - 16，針對研究按比例調整)的7種選定螯合劑-連接子結合物(7組)中之一者(n=5隻/組)。在麻醉下對各組四隻動物進行全身SPECT成像，隨後進行CT。選擇三個時間點(24小時、72小時及168小時)。在終末成像時間點之後，對各組四隻動物實施安樂死且將分析以下組織之殘餘活性以提供在168小時之時的離體生物分佈資料：腫瘤、血液、肝臟、腎臟、脾臟、腋窩淋巴結、股骨頭(膝)、骨髓及尾。

資料概述於圖 5A、圖 5B及圖 5C中。圖 5A顯示以上實例 B - 23中之全身ID%。圖 5B顯示含有化合物 1-1或化合物 3-1之D138結合物在1天、3天及6天時之器官分佈及腫瘤吸收，顯示化合物 1 - 1有更低的肝臟及腎臟吸收以及更高的腫瘤吸收。圖 5C顯示在終末時間點(6天)時之離體計數，顯示與藉由成像計算之值的對應關係。實例 B-25 使用 5T4 腫瘤模型測定的具有新穎螯合劑 - 連接子之 VHH - Fc 放射性免疫結合物的生物分佈

與以上實例 B - 24相同，本研究係用H1975異種移植模型，用以上結合5T4之螯合劑-連接子-VHH-Fc結合物執行。藉由注射將100 µL經PBS稀釋之50%基質膠中之5×10^6個H1975細胞接種至6-8週齡雌性無胸腺裸小鼠(n=20，4組n=5)之右下側腹中。當腫瘤達到125-400mm3之目標體積時，經由尾靜脈對小鼠注射如上所述用比活性為0.5 MBq/μg之10 MBq In-111放射性標記(實例 B - 16，針對研究按比例調整)的7種選定螯合劑-連接子結合物(7組)中之一者(n=5隻/組)。在麻醉下對各組四隻動物進行全身SPECT成像，隨後進行CT。選擇三個時間點(24小時、72小時及168小時)。在終末成像時間點之後，對各組四隻動物實施安樂死且將分析以下組織之殘餘活性以提供在168小時之時的離體生物分佈資料：腫瘤、血液、血漿、肝臟、腎臟、脾臟、腋窩淋巴結、股骨頭(膝)、骨髓及尾。

資料概述於圖 6A及圖 6B中。圖 6A顯示含有化合物 1 - 1或化合物 3 - 1之T157結合物在1天、3天及6天時之器官分佈及腫瘤吸收，顯示化合物 1 - 1有更低的肝臟及腎臟吸收以及更高的腫瘤吸收。圖 6B顯示在終末時間點(6天)時之離體計數，顯示與藉由成像計算之值的對應關係。實例 B-26 利用 ¹¹¹ In 及新螯合劑 - 連接子進行之活體內 BioD

動物給藥及組織中放射性之離體定量係精確監測在用放射性物質治療期間生物體可能經受之輻射劑量佈置的一種方式。

本研究之目的係觀察用不同連接子-螯合劑製備之結合物在未接受過治療之小鼠模型中的生物分佈，如上文所描述。經由尾靜脈對雌性CD-1小鼠(n = 45)注射如上所述用比活性為0.5 MBq/μg之3.0 MBq In-111放射性標記(實例 B - 16，針對研究按比例調整)的3種選定螯合劑-連接子結合物(3組，n=15)中之一者(n=5隻/組)。在5個不同時間點(10分鐘、24小時、3天、7天、14天；每個時間點n=3)將小鼠處死。自各組獲取相關組織且對所得放射性之劑量定量(組織清單：腫瘤、血液、血漿、肝臟、腎臟、脾臟、胰臟、骨骼肌、腋窩淋巴結、股骨頭(膝)、股骨幹(骨)、骨髓、尾、小腸)。藉由γ計數實現腫瘤及正常組織中之離體放射性定量。編譯結果以便觀測不同連接子之間放射性之排泄及器官積累的變化。

來自本研究之資料概述於圖 7中，顯示在10分鐘、24小時、72小時、168小時及336小時之時收集之各組織的總ID%/g。資料顯示腎臟吸收明顯減少，且在初始肝臟吸收之後快速清除，由此降低化合物 1-1之D138結合物於肝臟(已知的抗體清除及分解代解之主要部位)之輻射暴露量。實例 B-27 用 ¹⁷⁷ Lu 進行之 放射性標記

在500 µL之lo-bind埃彭道夫管中，用0.1 M乙酸銨緩衝液(pH 5.5)將50-60 µg測試物稀釋至57-100 µL，且添加51-54 MBq的1.45 µL-3.5 µL氯化鎦-177並用移液管混合。將反應混合物在培育箱中在37℃下培育2-3小時且在30分鐘以及1小時、2小時及3小時獲取樣品用於iTLC分析。表 12.¹⁷⁷Lu 放射性標記資料

化合物	VHH	在2小時的RCY%	在EOS的RCP%	在24小時的緩衝液穩定性
iTLC	SEC-HPLC	iTLC	SEC-HPLC	iTLC	SEC-HPLC
1-1	D138	99%	98%	99%	98%	99%	99%

在PBS/抗壞血酸鹽中稀釋且在4℃下儲存之後，如實例 B - 18中所述，藉由iTLC分析評定純度。

藉由以上在實例 B - 19中描述之IRF分析對¹⁷⁷Lu結合物進行分析。將此資料與用未經標記之結合物阻斷時的結合及未裝載抗原之對照珠粒相比較。實例 B-28 活體外血漿 / 血清穩定性分析

為評估新穎螯合劑-連接子在血流中循環時之穩定性，可製備測試物之片段且進行此項技術中已知的質量引導之分析。

根據Choi, T. A.等人,J . Pharm . Sci .,2015,104, 1832-1838，可藉由血漿/血清穩定性分析評估化合物。將小鼠及人類血漿/血清用PBS (pH 7.4，100 mL)以1:1稀釋。向198 μL此溶液中添加2 μL化合物(100 μM)且稀釋30×至15 µM之最終濃度。一式兩份，製備測試物。在所需時間點，即對於血清在至多60分鐘且對於血漿在至多120分鐘時，藉由將測試樣品之100 µL等分試樣添加至3×體積可含有內標(100 nM格列苯脲(glyburide)+0.1%甲酸)之冷乙腈中來淬滅該等等分試樣。藉由以4000g離心或使用0.2 µm膜式離心過濾器過濾且以3000g離心10分鐘來移除蛋白質。接著，將上清液注射於LC-MS/MS上進行分析以分析剩餘母化合物之量。藉由使用專門設計用於所分析各化合物之方法比較標準峰面積來計算剩餘百分比。或者，可使用內標可進行更精確量測。由此篩選得到的有關選定化合物之資料列於表 13中。實例 B-29. 肝臟 S9 代謝穩定性分析

為評估在投與放射性結合物過程中可能釋放之螯合劑-連接子片段之代謝特性的任何變化，包括肝臟清除率增加或降低，可根據習此相關技藝之人士已知的方法進行代謝穩定性分析，包括肝臟S9部分分析。

肝臟S9代謝穩定性可根據Richardson, S. J.等人之Drug Metabolism Letters,2016,10, 83-90進行。簡言之，人類及小鼠肝臟S9部分(按性別匯集)係市售產物且可取得。在磷酸鹽緩衝液(0.1 M，pH 7.4) 3 mM MgCl₂中製備人類或小鼠肝臟S9部分(1 mg/mL)。在DMSO中製備50 mM待分析化合物之儲備溶液。在即將用於dH2O之前，將此等儲備溶液稀釋至0.3 mM。在以上tris緩衝液中分別製備40 mM、20 mM及2 mM之NADPH、UDPGA及GSH溶液。在以上tris緩衝液中製備2 mg/mL PAPS。在即將使用之前，以1:1:1:1比率混合tris中之四種溶液。

對於該分析，在37℃下將各化合物(在dH2O中進一步稀釋至1 μM)與磷酸鹽緩衝液(250 μL，pH 7.4)中之小鼠或人類肝臟S9部分(1 mg/mL)一起於96孔盤之孔中預培育5分鐘。接下來，添加2 mM NADPH。在至多45分鐘之適當時間點，取出等分試樣，藉由添加三體積含有100 nM格列苯脲(IS)及0.1%甲酸之冰冷ACN將其淬滅。並行培育維拉帕米(Verapamil)作為該分析之陽性對照。將該盤以4000g離心10分鐘以使經沉澱之蛋白質沉降。將去蛋白化樣品之上清液注射於LC-MS/MS上進行分析以分析剩餘母化合物之量。藉由使用專門設計用於所分析各化合物之方法比較標準峰面積來計算剩餘百分比。由此篩選得到的有關選定化合物之資料列於表 13中。實例 B-30 ： 肝臟微粒體穩定性

為評估在投與放射性結合物過程中可能釋放之螯合劑-連接子片段之代謝特性的任何變化，包括肝臟清除率增加或降低，可根據習此相關技藝之人士已知的方法進行代謝穩定性分析，包括肝臟微粒體分析。

對於該分析，將各化合物(1 μM於DMSO中)與磷酸鹽緩衝液(0.1 M，pH 7.4)中之小鼠或人類肝臟微粒體(0.3-0.5 mg/mL)一起在37℃下預培育。在添加2 mM NADPH後即開始反應，且在各種時間點，藉由將等分試樣轉移至含有100 nM格列苯脲(IS)及0.1%甲酸之ACN溶液中來淬滅反應。包括缺少輔因子之對照培育，在45分鐘時取樣。將所有樣品混合且在4℃下以3500 rpm離心30分鐘。將樣品之上清液注射於UPLC-MS-MS上進行分析。藉由將受質耗盡針對時間作圖且測定線之梯度來計算各測試化合物之固有清除率(CL_int)及半衰期(t_{1 / 2})值。由此篩選得到的有關選定化合物之資料列於表 13 、 表 14及表 15中。實例 B-31  CACO - 2 滲透性分析

為評估在投與放射性結合物過程中可能釋放之螯合劑-連接子片段之代謝特性的任何變化，包括細胞滲透性或透過清除器官運輸之增加或降低，可根據習此相關技藝之人士已知的方法進行細胞滲透性分析。

可根據Richardson, S. J.等人之Drug Metabolism Letters,2016,10, 83-90進行CACO-2滲透性分析。Caco-2細胞之極化培養物可在來自ReadyCell之半滲透聚苯乙烯(PET)膜上獲得。此等培養物具有21天的細胞障壁。其他類似類型之地方可供購買。

漢克氏平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution，HBSS)係用於滲透性研究之運輸培養基。HBSS含有1.1 mM MgCl₂、1.3 mM CaCl₂及5 mM D-葡萄糖。在實驗之前，將各單層用預溫熱的新鮮HBBS培養基洗滌三次。使用100 µM螢光黃溶液檢查所有孔之單層完整性，且在各分析中使用另外兩種對照化合物用於評級目的(普萘洛爾及依那普利)。將測試樣品在HBSS緩衝液中稀釋至10 µM最終濃度且置放於頂部(0.25 mL；A-B)或基底外側(0.75 mL；B-A)中。將單層在標準細胞培養培育箱(5% CO₂，37℃)中培育2小時。在培育結束時，藉由添加兩體積含有0.1%甲酸及0.25 μM作為內標之格列苯脲的乙腈自單層之兩側萃取樣品。對樣品離心並透過0.2 mm膜過濾(必要時)，且藉由LC-MS分析。由此篩選得到的有關選定化合物之資料列於表 13中。表 13. 螯合劑 - 連接子片段之活體外分析資料

	人 類	小 鼠
化合 物	穩定性( 剩餘%)	流出 量	穩定性( 剩餘%)
血 清	微粒 體	肝臟S9	CACO-2 A 至B (cm/s)	CACO-2 B 至A (cm/s)	血 清	微粒 體	肝臟S9
4-4	149	117	97.7	8.80E-08	1.06E-07	110	83.1	72.7
4-31	126.6	104	74.6	2.42E-06	3.73E-08	67.6	68	77.8
4-10	106	107	102	2.30E-07	2.82E-08	91.9	100	79.7
4-6	115	131	92.1	1.65E-07	1.05E-07	108	107	81.2
4-5	114	79.9	75.3	1.04E-07	1.40E-07	125	80.6	71.5
4-11	94.5	85	145	2.90E-07	5.47E-08	119	95.4	80.9
4-9	106	0.5	0	1.80E-07	4.80E-08	104	＜0.5	0.3
4-8	114	9.3	6.7	3.57E-07	3.25E-08	104	40.3	40
4-7	107	10.4	8	3.49E-08	4.98E-08	110	9.6	14.6
4-27	135	4.2	7	5.90E-08	1.35E-07	101	12.8	17.3
4-14	54*	-	-	-	-	79*	-	-
4-15	57*	-	-	-	-	108*	-	-
4-4	108*	-	-	-	-	91*	-	-

* 在 120 分鐘之後血漿中的剩餘 % 表 14. 鼠類肝臟微粒體上螯合劑 - 連接子片段之活體外穩定性資料

化合物	CLint (µL/min/mg)	SE CLint	t1/2 (min)	剩餘% (45 分鐘後)	剩餘% ( 無輔因子)
4-32	922	31.7	2	0	149
4-33	98	4.6	14	11	101
4-28	19	6.1	72	57	109
4-30	0.2	9.7	8247	82	64
4-29	790	14	2	0	154
4-12	29	5.3	47	48	121
4-14	7	7.8	201	77	91
4-15	10	2.9	139	80	108
4-16	1	3.2	1255	96	128
4-13	9	7.7	160	72	109
4-20	4	3.8	359	87	101
4-17	49	1.7	28	34	122
4-18	＜5.21	2.3	NC	105	112
4-19	＜8.39	3	NC	110	117
4-21	0	1.8	3459	100	91
4-22	＜7.63	3.3	NC	115	122
4-23	＜7.75	2.9	NC	110	127
4-24	＜8.66	3.1	NC	107	125
4-25	9	2.4	158	84	99
4-26	＜8.81	2.8	NC	106	126

表 15. 人類肝臟微粒體上螯合劑 - 連接子片段之活體外穩定性資料

化合 物	CLint (µL/min/mg)	SE CLint	t1/2 (min)	剩餘% (45 分鐘後)	剩餘% ( 無輔因子)
4-32	982	46	1	0	101
4-33	145	11	10	5	125
4-28	17	4	81	23	66
4-30	20	24	71	48	93
4-29	727	19	2	0	116
4-12	91	20	15	22	76
4-14	34	10	40	54	147
4-15	5	17	279	79	79
4-16	1	5	989	101	137
4-13	7	2	210	84	111
4-20	3	4	552	92	111
4-17	54	4	26	30	108
4-18	＜14.06	5	NC	102	97
4-19	＜9.2	4	NC	115	114
4-21	NC	0	NC	107	103
4-22	＜8.58	4	NC	110	117
4-23	＜5.99	3	NC	110	116
4-24	NC	1	NC	123	92
4-25	8	4	176	88	146
4-26	2	4	752	96	116

實例 B-32. 血漿蛋白結合分析

為了評估螯合劑-連接子片段在血液中如何循環，無論為經結合還是未結合部分，均可根據習此相關技藝之人士已知之方法進行血漿蛋白結合(PPB)分析。

PPB分析使用快速平衡透析(RED)裝置，其由經可透過未結合藥物之透析膜隔開的兩個腔室組成。對於該分析，將測試化合物(10 mM於DMSO中)添加至血漿(200 μL；用400 μL透析緩衝液預調節至pH 7.4)中並使用RED裝置，在37℃下於5% CO₂環境中培育4小時。培育之後，用含有ACN及內標之溶液使蛋白質沉澱析出，並離心。使用UPLC-MS分析上清液，並針對基質匹配之校準標準對緩衝液及血漿隔室中存在之測試化合物的濃度進行定量。資料列於表 16中。表 16. 關於人類及小鼠血漿之 PPB 分析 資料

	小 鼠	人 類
化合 物	結合 %	fu	回收率 %	結合 %	fu	回收率 %
4-14	32.1	0.679	77.8	50.4	0.497	70.2
4-15	53.4	0.466	84.9	89	0.11	91
4-4	54.8	0.452	107.4	91	0.09	71.1

實例 B-33 ： 用 In - 111 標記連接子片段

將連接子片段(3 nmol，3 μL於水中之1 mM儲備溶液)稀釋於0.1 M NH4OAc緩衝液(pH =5.5)中，隨後在90℃、600 rpm下添加In-111(30 MBq)(總反應體積=200 μL；莫耳比活性係10 MBq/nmol，即約0.5 MBq/μg VHH-Fc生物結合物(CAR=4))，保持20分鐘。在室溫下，用含50 mM DTPA之反應緩衝液(20 μL)淬滅反應，持續10分鐘。用iTLC-SA (移動相：0.1 M檸檬酸鈉pH=5.2)及C18-HPLC (移動相：水/乙腈/0.1%甲酸)測定RCY%。藉由iTLC及HPLC測定，所有反應引起＞99%的放射化學純度。實例 B-34 用 Lu - 177 標記連接子片段

將連接子片段(3 nmol，3 μL於水中之1 mM儲備溶液)稀釋於0.1 M NH4OAc緩衝液(pH =5.5)中，隨後在90℃、600 rpm下添加Lu-177(60 MBq)(總反應體積=200 μL。莫耳比活性係20 MBq/nmol，即約1 MBq/μg VHH-Fc生物結合物(CAR=4))，保持20分鐘。用含50 mM DTPA之反應緩衝液(20 μL)淬滅反應，持續10分鐘。用iTLC-SA (移動相：0.1 M檸檬酸鈉pH=5.2)及C18-HPLC (移動相：水/乙腈/0.1%甲酸)測定RCY%。藉由iTLC及HPLC測定，所有反應引起＞99%的放射化學純度。實例 B-35 ： 使用經放射性標記之連接子片段進行之 PPB 分析將放射性標記化合物之等分試樣(80 kBq，1.3-2.6 μL稀釋於1 mL PBS中之經標記樣品)轉移至1.5 mL埃彭道夫管中。向各樣品管中摻加血漿/血清/白蛋白，達到200 μL之總樣品體積。將樣品(50 μL)用移液管移至樣品腔室中，以彩色扣環指示。將透析緩衝液(300 μL)用移液管移至緩衝液腔室中。各樣品應一式三份進行。將該單元用密封膠帶覆蓋且在回轉式震盪器上以約300 rpm培育4小時。自緩衝液及血漿腔室中取出相等體積(20 μL)，添加至單獨微量離心管中，用於在γ計數器中進行分析。結合蛋白質%=100%-未結合%。結果列於表 17中。表 17. 顯示蛋白質相關活性的對經放射性標記之連接子片段之血漿蛋白結合分析的結果。

( 蛋白質相關活性 %)	血清與緩衝液比率	血漿與緩衝液比率	白蛋白與緩衝液比率
經標記之連接子片段	人類	小鼠	人類	小鼠	人類	小鼠
111 In-3-2	-4.2 ± 8.6%	-	-	-	-	-
177 Lu-3-2	-8.2 ± 9.3%	-13.7 ± 3.9%	-9.2 ± 2.2%	-7.0 ± 5.7%	6.4 ± 2.3%	-2.4 ± 10.6%
111 In-4-1	41.3 ± 6.0%	-	-	-	-	-
177 Lu-4-1	44.4 ± 7.5%	31.4 ± 6.8%	39.2 ± 3.0%	42.4 ± 3.5%	36.1± 3.9%	37.0 ± 5.4%
111 In-4-3	78.5 ± 5.7%	-	-	-	-	-
177 Lu-4-3	79.8 ± 3.6%	79.3 ± 4.2%	81.5 ± 5.5%	78.1± 1.6%	81.1± 1.1%	80.5 ± 0.9%
111 In-4-2	98.3 ± 0.1%	-	-	-	-	-
177 Lu-4-2	98.7 ± 0.1%	98.1 ± 0.2%	99.7 ± 0.0%	98.2 ± 0.1%	66.3 ± 8.9%	66.5 ± 0.5%

雖然本文已展示及描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者將顯而易見的是，此等實施例僅藉助於實例提供。熟習此項技術者現將在不背離本發明之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文所描述的本發明實施例之各種替代方案均可用於實施本發明。

本說明書中所提及之所有出版物、專利申請案、頒予之專利及其他文獻均以引用之方式併入本文中，其引用程度就如同已特定地且個別地指示各個別出版物、專利申請案、頒予之專利或其他文獻以全文引用之方式併入一般。在以引用之方式併入的文本中所包含之定義若與本揭露中之定義矛盾，則將其排除在外。

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QVQLVQSGGGLVQAGDSLTLSCAVSERPFGTYAMGWFRQAPGRERDLVAAVSRNGGASQYGDSVKGRFSISRDNIKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAARSAAYSRSSEVYTGKDEYYYWGQGTQVTVKP

L14B5 CDR1 ERPFGTYA (SEQ ID NO: 262)

L14B5 CDR2 VSRNGGAS (SEQ ID NO: 263)

L14B5 CDR3 AARSAAYSRSSEVYTGKDEYYY (SEQ ID NO: 264)

圖 1顯示抗DLL3 VHH-Fc構築體之結合。

圖 2A及圖 2B顯示與DLL3陽性細胞株(SHP-77)之結合。

圖 3顯示D102經SHP-77細胞及HEK-DLL3細胞內化。

圖 4A及圖 4B分別顯示D102及D138之兩種In-111放射性結合物的總全身ID%。

圖 4C 、圖 4E及圖 4G顯示D138之16種In-111放射性結合物相對於化合物1-1之總全身ID%。

圖 4D及圖 4F顯示D138之11種In-111放射性結合物相對於化合物1-1的選定器官吸收值，以ID%/g表示。

圖 4H顯示D138之5種In-111放射性結合物相對於化合物1-1之代表性最大強度投影(MIP)。

圖 5A顯示總身體ID%。

圖 5B顯示各D138結合物在1天、3天及6天時的器官分佈及腫瘤吸收情況。

圖 5C顯示在終末時間點(6天)之離體計數，顯示與藉由成像計算之值的對應關係。

圖 6A顯示各T157結合物在1天、3天及6天時的器官分佈及腫瘤吸收情況。

圖 6B顯示在終末時間點(6天)之離體計數，顯示與藉由成像計算之值的對應關係。

圖 7顯示在10分鐘、24小時、72小時、168小時及336小時收集的各組織之總ID%/g。

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Claims (80)

1. 一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，；式(I)其中：至少一個三級醯胺存在於R¹連結至R⁸之線性鏈中；R¹係放射性核種螯合部分或其放射性核種錯合物；X¹不存在，或為-O-、-S-、-NR^a-或-C(=O)N(R^a)-；m係1、2、3、4、5或6；x係0或1；R²係氫、鹵素、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)、-NR^a-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)，或者經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基)、-NR^a-(經取代或未經取代之C₁-C₁₀雜烷基)，或C₄-C₂₀聚乙二醇；X²不存在，或為-O-、-S-、-S(=O)₂-、-NR^a-，或-C(=O)N(R^a)-；L¹不存在，或為C₁-C₁₀伸烷基、C₂-C₁₀伸烯基，或C₁-C₁₀伸雜烷基，其中伸雜烷基係伸烷基中一個內部碳原子經以下置換：-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)₂-、-S(=O)(=NH)-、-S(=O)(=NR^b)-、-NR^b-、-P(=O)OR^b-、-NR^bC(=O)-、-C(=O)NR^b-、-OC(=O)NR^b-、-NR^bC(=O)NR^b-、-NR^bC(=N-CN)NR^b-、-NR^bC(=N-R^b)NR^b-或-NR^bC(=O)O-；L²不存在，或為、或；Y¹不存在，或為、或；n係0或1；各R³及R⁶獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-C(=O)NH₂、-C(=O)OH，或選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸，及甲基刀豆胺酸，其中R³或R⁶之任何游離胺(-NH₂)獨立地視情況經-C(=O)(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)-C₄-C₂₀聚乙二醇取代；其中R³或R⁶之任何游離羧酸(-CO₂H)獨立地視情況經-C(=O)NH-(2,4,6-三甲基-3-溴苯基)、-C(=O)NH-(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)NH-(C₄-C₂₀聚乙二醇)置換；y係0或1；L³不存在，或為-(CH₂)_p-或；X³不存在，或為-CH₂-、-O-、-S-或-NR^d-；p係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；Y²係或；t係0或1；各R^a、R^b、R^c、R^d、R²、R⁴、R^4a、R⁵、R⁷及R^7a獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃、-L^a-(R^e)，或R³；各u獨立地為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；各L^a獨立地不存在或為C₁-C₆伸烷基；R^e係經取代或未經取代之C₃-C₁₂環烷基、經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基、經取代或未經取代之苯基，或者經取代或未經取代之吡啶基；或R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基；或R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基；X⁴不存在，或為-CH₂-、-O-、-S-或-NR^c-；q係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；R⁸係能夠與生物靶向部分(R^B)共價結合之部分；且其中不為：或。
2. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：X²不存在，或為-O-、-S-、-NR^a-，或-C(=O)N(R^a)-；且L¹不存在，或為C₁-C₁₀伸烷基或C₁-C₁₀伸雜烷基，其中伸雜烷基係伸烷基中一個內部碳原子經以下置換：-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)₂-、-S(=O)(=NH)-、-S(=O)(=NR^b)-、-NR^b-、-P(=O)OR^b-、-NR^bC(=O)-、-C(=O)NR^b-、-OC(=O)NR^b-、-NR^bC(=O)NR^b-、-NR^bC(=N-CN)NR^b-、-NR^bC(=N-R^b)NR^b-，或-NR^bC(=O)O-。
3. 如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R^B係抗體或其片段、肽、核酸，或小分子。
4. 如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R^B係抗體或其片段。
5. 如請求項1至4中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R⁸係能夠與抗體或其片段之胺(-NH₂)或硫醇基(-SH)結合的部分。
6. 如請求項1至4中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R⁸係能夠與抗體或其片段之胺(-NH₂)結合的部分且選自：、、、、、、、、、、、、、、或；X⁵係不存在、-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)_2-、-NR⁹-、-C(=O)-、-NR⁹C(=O)-、-C(=O)NR⁹-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-OC(=O)NR⁹-、-NR⁹C(=O)NR⁹-、-NR⁹C(=S)NR⁹-、-NR⁹C(=O)O-；且各R⁹獨立地選自氫及C₁-C₄烷基。
7. 如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R⁸係；且R¹⁰係、、、或。
8. 如請求項1至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該式(I)化合物具有式(Ia)、(Ib)、(Ic)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(Ia)，式(Ib)或式(Ic)；其中：X⁵係不存在、-O-、-S-、-S(=O)-、-S(=O)_2-、-NR⁹-、-C(=O)-、-NR⁹C(=O)-、-C(=O)NR⁹-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-OC(=O)NR⁹-、-NR⁹C(=O)NR⁹-、-NR⁹C(=S)NR⁹-、-NR⁹C(=O)O-；且各R⁹獨立地選自氫及C₁-C₄烷基。
9. 如請求項1至4中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R⁸係能夠與抗體或其片段之硫醇基(-SH)結合的部分且選自：、、、、、、、、、、、、或；m係0、1、2、3、4或5；X⁶不存在，或為-NR⁹-或-(CH₂)_g-NR⁹-；且g係1、2、3或4。
10. 如請求項1至4中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R⁸係或；X⁵不存在，或為-C(=O)-、-O-、-NR^a-，或-C(=O)N(R^a)-；L³不存在，或為C₁-C₁₀伸烷基、或；u係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；X⁶不存在，或為-NR⁹-或-(CH₂)_g-NR⁹-；且R¹¹係Cl、Br或I；且g係1、2、3或4。
11. 如請求項1至4中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該式(I)化合物具有式(Id)、(Ie)、(If)或(Ig)之結構、其醫藥學上可接受之鹽：式(Id)，式(Ie)，式(If)或式(Ig)其中X⁶係-NR⁹-或-(CH₂)_g-NR⁹-；且g係1、2、3或4。
12. 如請求項1至11中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R¹係1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)，1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三乙酸(DO3A)，1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,7-二乙酸(DO2A)，α,α',α'',α'''-四甲基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTMA)，1,4,7,10-肆(胺甲醯基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷(DOTAM)，1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四丙酸(DOTPA)，2,2',2''-(10-(2-胺基-2-側氧基(oxo)乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-三基)三乙酸，6,6'-(((吡啶-2,6-二基雙(亞甲基))雙((羧基甲基)氮二基))雙(亞甲基))-二吡啶甲酸(H₄pypa)，6,6',6'',6'''-(((吡啶-2,6-二基雙(亞甲基))雙(氮三基))-肆(亞甲基))-四吡啶甲酸(H₄py4pa)，2,2',2''-(1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三基)三乙酸(NOTA)，6,6'-((乙-1,2-二基雙((羧基甲基)氮二基))雙(亞甲基))二吡啶甲酸(H₄octapa)，或3,6,9,12-肆(羧基甲基)-3,6,9,12-四氮雜十四烷二酸(TTHA)，或其放射性核種錯合物。
13. 如請求項1至11中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R¹係、、、、、、、、、、或，或其放射性核種錯合物。
14. 如請求項1至11中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R¹係或；或其放射性核種錯合物。
15. 如請求項1至14中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該式(I)化合物具有式(II)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(II)。
16. 如請求項1至14中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該式(I)化合物具有式(V)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(V)。
17. 如請求項1至16中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Y¹係、或；且L³係-(CH₂)_p-或。
18. 如請求項17之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Y¹係或。
19. 如請求項17之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Y¹係；且R⁴及R^4a獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃或-L^a-(R^e)；或R⁴及R^4a與將R⁴連結至R^4a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基。
20. 如請求項1至16中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Y¹係不存在且L³不存在。
21. 如請求項1至20中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Y²係。
22. 如請求項1至20中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Y²係；且R⁷及R^7a獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃或-L^a-(R^e)；或R⁷及R^7a與將R⁷連結至R^7a之插入原子一起形成經取代或未經取代之C₂-C₁₂雜環烷基。
23. 如請求項15之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該式(II)化合物具有式(III)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(III)其中，X²不存在，或為-CH₂-或-O-；且X³不存在，或為-CH₂-或-O-。
24. 如請求項15之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該式(II)化合物具有式(IV)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(IV)其中，X²不存在，或為-CH₂-或-O-；X³不存在，或為-CH₂-或-O-；且R¹⁰係、、、或。
25. 如請求項15、23或24中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R¹係；或其放射性核種錯合物。
26. 如請求項16之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該式(V)化合物具有式(VI)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(VI)其中，X²不存在，或為-CH₂-或-O-；且X³不存在，或為-CH₂-或-O-。
27. 如請求項16之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該式(I)化合物具有式(VII)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(VII)其中，X²不存在，或為-CH₂-或-O-；X³不存在，或為-CH₂-或-O-；且R¹⁰係、、、或。
28. 如請求項16、26或27中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R¹係；或其放射性核種錯合物。
29. 如請求項23至28中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：X³係-CH₂-且X⁴係-O-；或X³係-O-且X⁴係-CH₂-。
30. 如請求項23至28中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係、、、、、、、、、、、、、或。
31. 如請求項23至28中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係、、、、、、、、、、或。
32. 如請求項23至28中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係、、、、、、、、、、、、、或。
33. 如請求項32之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係、或。
34. 如請求項32之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係、、、、、、、、、、或。
35. 如請求項1至34中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：L¹係C₁-C₁₀伸烷基，且X¹不存在或為-O-。
36. 如請求項1至34中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：L¹係C₂-C₁₀伸烯基，且X¹不存在或為-O-。
37. 如請求項1至36中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：L²係、或。
38. 如請求項1至37中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R³獨立地為氫、-C(=O)NH₂、-C(=O)OH，或選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸，及甲基刀豆胺酸，其中R³或R⁶之任何游離胺(-NH₂)獨立地視情況經-C(=O)(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)-C₄-C₂₀聚乙二醇取代；其中R³或R⁶之任何游離羧酸(-CO₂H)獨立地視情況經-C(=O)NH-(2,4,6-三甲基-3-溴苯基)、-C(=O)NH-(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)NH-(C₄-C₂₀聚乙二醇)置換。
39. 如請求項1至36中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：L²係、，或係、、、、或。
40. 如請求項1至36中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：L²不存在。
41. 如請求項1至34中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係、、、、、、、、、、、、、或。
42. 如請求項41之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係或。
43. 如請求項1至42中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：各R⁴及R⁷獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃或-L^a-(R^e)。
44. 如請求項43之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：各R⁴及R⁷獨立地為氫、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基，或-L^a-(R^e)。
45. 如請求項1至42中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R⁴係氫；且R⁷係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或者經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃或-L^a-(R^e)。
46. 如請求項45之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R⁴係氫；且R⁷係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基，或-L^a-(R^e)。
47. 如請求項1至42中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R⁴係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、經取代或未經取代之C₁-C₆雜烷基、C₄-C₂₀聚乙二醇、-(CH₂CH₂O)_u-CH₃或-L^a-(R^e)；且R⁷係氫。
48. 如請求項47之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R⁴係經取代或未經取代之C₁-C₆烷基，或-L^a-(R^e)；且R⁷係氫。
49. 如請求項1至48中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：各R^e獨立地選自環丙基、環丁基、環戊基、環己基、雙環[1.1.1]戊烷基、雙環[2.1.1]己烷基、雙環[3.1.1]庚烷基、雙環[2.2.2]辛烷基、氧雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、2-氧雜雙環[1.1.1]戊烷基、2-氧雜雙環[2.1.1]己烷基、2-氧雜雙環[2.2.2]辛烷基、氮呾基、吡咯啶基、哌啶基、吡啶基、苯基及金剛烷基，其中各R^e獨立地視情況經取代。
50. 如請求項1至48中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：各R^e獨立地選自、、、、、、、、、、、、、、、及，其中各R^e獨立地視情況經取代。
51. 如請求項1至50中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：各L^a獨立地為不存在，-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-或-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-。
52. 如請求項1至42中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：各R⁴及R⁷獨立地為氫、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、-(CH₂CH₂O)-CH₂CH₂CH₃、-(CH₂CH₂O)-CH₃、-(CH₂CH₂O)₂-CH₃、-(CH₂CH₂O)₃-CH₃、-(CH₂CH₂O)₄-CH₃、-(CH₂CH₂O)₅-CH₃、-(CH₂CH₂O)₆-CH₃、-(CH₂CH₂O)₇-CH₃、-(CH₂CH₂O)₈-CH₃、-(CH₂CH₂O)₉-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₁-CH₃或-(CH₂CH₂O)₁₂-CH₃。
53. 如請求項52之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：各R⁴及R⁷獨立地為氫、、、、、、、、、、、、、、、、、、、-(CH₂CH₂O)-CH₃、-(CH₂CH₂O)₂-CH₃、-(CH₂CH₂O)₃-CH₃、-(CH₂CH₂O)₄-CH₃、-(CH₂CH₂O)₅-CH₃、-(CH₂CH₂O)₆-CH₃、-(CH₂CH₂O)₇-CH₃、-(CH₂CH₂O)₈-CH₃、-(CH₂CH₂O)₉-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₀-CH₃、-(CH₂CH₂O)₁₁-CH₃或-(CH₂CH₂O)₁₂-CH₃。
54. 如請求項1至42中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R⁴或R⁷不為氫；或R⁴與R⁷相同；或R⁴與R⁷不同。
55. 如請求項23至38中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、,、、、或。
56. 如請求項1至55中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：各R⁶獨立地為氫、-C(=O)NH₂、-C(=O)OH，或選自由以下組成之群之胺基酸的側鏈：天冬胺酸、麩胺酸、羧基麩胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、離胺酸、高離胺酸、鳥胺酸、絲胺酸、高絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、甲基精胺酸、瓜胺酸、高精胺酸、甲基高精胺酸、正精胺酸、刀豆胺酸、甲基瓜胺酸、甲基正精胺酸，及甲基刀豆胺酸，其中R³或R⁶之任何游離胺(-NH₂)獨立地視情況經-C(=O)(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)-C₄-C₂₀聚乙二醇取代；其中R³或R⁶之任何游離羧酸(-CO₂H)獨立地視情況經-C(=O)NH-(2,4,6-三甲基-3-溴苯基)、-C(=O)NH-(未經取代或經取代之C₁-C₂₀伸烷基)或-C(=O)NH-(C₄-C₂₀聚乙二醇)置換。
57. 如請求項1至55中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係或。
58. 如請求項23或37中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、或。
59. 如請求項1至58中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R²係氫、鹵素、經取代或未經取代之C₁-C₆烷基、-O-(經取代或未經取代之C₁-C₆烷基)，或C₄-C₂₀聚乙二醇。
60. 如請求項1至59中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：m係1、2、3或4。
61. 如請求項60之化合物或其醫藥學上可接受之鹽；其中：m係1。
62. 如請求項15之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該式(II)化合物具有式(V)之結構或其醫藥學上可接受之鹽：式(V)其中，係、、、、、、、、、、、、、或；且R¹係或。
63. 如請求項62之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係、、、、、、、、、、或。
64. 如請求項62或63之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：係或；且R¹⁰係、、、或。
65. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物係： 、、、、、、、、、，或其醫藥學上可接受之鹽。
66. 如請求項1至65中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：該放射性核種係鑭系元素或錒系元素。
67. 如請求項1至65中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：該放射性核種係診斷性或治療性放射性核種。
68. 如請求項1至65中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：該放射性核種係發射鄂惹(Auger)電子之放射性核種、發射α之放射性核種、發射β之放射性核種，或發射γ之放射性核種。
69. 如請求項1至65中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：該放射性核種係發射α之放射性核種。
70. 如請求項1至65中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：該放射性核種係225-錒(²²⁵Ac)、213-鉍(²¹³Bi)、223-鐳(²²³Ra)、212-鉛(²¹²Pb)、111-銦(¹¹¹In)、67-鎵(⁶⁷Ga)、68-鎵(⁶⁸Ga)、99m-鎝(^99mTc)、90-釔(⁹⁰Y)、177-鎦(¹⁷⁷Lu)、186-錸(¹⁸⁶Re)、188-錸(¹⁸⁸Re)、64-銅(⁶⁴Cu)、67-銅(⁶⁷Cu)、153-釤(¹⁵³Sm)、89-鍶(⁸⁹Sr)、198-金(¹⁹⁸Au)、169-鉺(¹⁶⁹Er)、165-鏑(¹⁶⁵Dy)、99m-鎝(^99mTc)、89-鋯(⁸⁹Zr)，或52-錳(⁵²Mn)。
71. 如請求項1至65中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中：該放射性核種係225-錒(²²⁵Ac)。
72. 如請求項1至71中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該靶向部分係包含抗原結合區及免疫球蛋白重鏈恆定區之多肽，其中該多肽之分子量在60與110 kDa之間。
73. 如請求項1至71中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該靶向部分結合至δ樣蛋白質3 (DLL3)、DLL1、葉酸受體α (FOLR1)、葉酸受體α (FRα)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、HER3、表皮生長因子受體(EGFR)、類胰島素生長因子1 (IGF-1)受體、血管內皮生長因子(VEGF)，或腫瘤相關鈣信號轉導蛋白2 (TROP2)、血管生成素、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD25 (IL2-R)、CD30、CD33、CD37、CD38、CD52、CD56、CD123 (IL-3R)、cMET、DLL/Notch、EpCAM、FGF/FGF-R、GD2、間皮素、連結蛋白細胞黏附分子(Nectin)-4、PDGFRα、RANKL、SLAMF7、密連蛋白(Claudin) 18.2、DKK1、B7-H3、NaPi2B、GCC、GCP3、GD2、CLDN6、CLDN18.2、STEAP1、STEAP2、LIV1、MUC16、MUC1、SLC44A、TM4sF1、NTSR1、B7-H3、B7H7、KAAG1、GDPCP1、GD2、LAT1、整合素β 6、CAIX、Flt3、EphA2或TROP2。
74. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至73中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
75. 如請求項74之醫藥組合物，其中該醫藥組合物經調配用於藉由靜脈內投與來向哺乳動物投與。
76. 一種治療哺乳動物之癌症的方法，其包含向該哺乳動物投與結合至靶向部分的如請求項1至73中任一項之化合物。
77. 如請求項76之方法，其中該哺乳動物係人類。
78. 如請求項76或77之方法，其中該癌症包含神經膠質瘤、甲狀腺癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、肝癌、胰臟癌、腎癌、前列腺癌、睪丸癌、乳癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌，或黑色素瘤。
79. 一種用於鑑別哺乳動物體內具有腫瘤之組織或器官的方法，其包含：i)向該哺乳動物投與結合至靶向部分的如請求項1至73中任一項之化合物之放射性核種錯合物，及ii)進行正電子發射斷層掃描(PET)分析、單光子發射電腦化斷層掃描(SPECT)或磁共振成像(MRI)；其中該腫瘤表現該靶向部分所靶向的受體；其中該放射性核種係診斷性放射性核種。
80. 如請求項79中任一項之方法，其中：步驟(ii)係在步驟(i)後某一時間量之後起始，該時間量足以使結合至該靶向部分的如請求項1至66中任一項之化合物之放射性核種錯合物之間相互作用。