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TW202542303A - 經工程改造之ｔ細胞 - Google Patents

經工程改造之ｔ細胞

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TW202542303A
TW202542303A TW113150064A TW113150064A TW202542303A TW 202542303 A TW202542303 A TW 202542303A TW 113150064 A TW113150064 A TW 113150064A TW 113150064 A TW113150064 A TW 113150064A TW 202542303 A TW202542303 A TW 202542303A
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TW
Taiwan
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cells
engineered
nucleic acid
modification
cell
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TW113150064A
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克立絲多福 魯杜羅
史蒂芬妮 科里斯特卡
Original Assignee
美商英特利亞醫療公司
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Publication date
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Abstract

本揭示案係關於T細胞，該等T細胞經工程改造以包含處於啟動子序列控制下的編碼雙重突變體轉型生長因子β1 (dmTGFB1)之異源核酸序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾，例如敲低。在某些實施例中，該等細胞進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾，例如敲低；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾，例如敲低；及插入編碼調控性T細胞促進分子之序列；以及其組合物及用途。

Description

經工程改造之T細胞
適應性免疫係一種防禦機制，身體藉由該機製能夠消除外來病原體。T細胞係能夠介導此免疫反應之免疫細胞。T細胞受體(TCR)係T細胞表面上能夠識別抗原之蛋白質複合物。T細胞多樣性源於TCR α及β基因座之重排。
適應性免疫之一個特徵為能夠區分「自身」與「非自身」抗原。自體免疫及自體發炎性病症之特徵在於針對「自身」抗原之致病性免疫反應。TCR α及β基因座之一些重排產生自身反應性T細胞。Owen等人，Regulatory T Cell Development in the Thymus, J Immunol 203(8) (2019)。許多自身反應性T細胞因胸腺中之純系缺失而消除，但其他T細胞可逃避純系缺失且引發有害免疫反應。出處同上。稱為調控性T細胞(Treg)之專門T細胞用於「自身」耐受性。出處同上。Treg能夠抑制過度免疫反應、自體免疫反應及不期望之免疫反應，例如在移植物抗宿主病中。出處同上。Treg之失調(例如，若Treg之數量不足或若Treg功能不正常)可導致自體免疫反應。出處同上。
目前治療自體免疫性病症之療法旨在抑制適應性免疫過程或免疫細胞之活化。雖然該等療法可抑制有害免疫反應，例如自體免疫反應，但其亦可抑制有益免疫反應。Treg療法已用於抑制不同疾病中之抗原特異性免疫反應，包括移植物抗宿主病(GvHD)，其中供體細胞介導造血幹細胞移植後宿主組織之免疫攻擊。Pierini等人，T Cells Expressing Chimeric Antigen Receptor Promoter Immune Tolerance, JCI Insight 2(20) (2017)。然而，「基於Treg之療法的臨床實施仍存在重大挑戰」。出處同上。因此，業內仍需要用於抑制免疫反應(包括發炎及自體免疫)之有效T細胞療法，包括Treg療法。
本揭示案之一個態樣係關於經工程改造之T細胞，其包含i)處於啟動子序列控制下的編碼雙重突變體轉型生長因子β1 (dmTGFB1)之異源核酸序列；及ii)對編碼轉型生長因子β受體2 (TGFBR2)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低TGFBR2之表現。
在一些實施例中，相對於野生型人類TGFB1，dmTGFB1包含位於選自以下之兩個或更多個胺基酸處之突變：F198、D199、V200、L208、F217、L219、R218、H222、C223及C225。在一些實施例中，相對於野生型人類TGFB1，dmTGFB1包含位於選自以下之兩個或更多個胺基酸處之突變：R218、H222、C223及C225。在一些實施例中，相對於野生型人類TGFB1，dmTGFB1包含兩個或更多個選自以下之胺基酸突變：R218C/H、H222D、C223S/R/G及C225R。在一些實施例中，相對於野生型人類TGFB1，dmTGFB1包含胺基酸突變R218C/H及C225R。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞為CD4+ T細胞。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞進一步包含：i)對編碼腫瘤壞死因子α (TNFA)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低TNFA之表現；ii)對編碼干擾素-γ (IFNG)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低IFNG之表現；或iii)處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞包含：i)對編碼腫瘤壞死因子α (TNFA)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低TNFA之表現；ii)對編碼干擾素-γ (IFNG)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低IFNG之表現；及iii)處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
在一些實施例中，調控性T細胞促進分子係選自介白素-10 (IL10)、細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)、具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、吲哚胺2,3-雙加氧酶1 (IDO1)、胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1 (ENTPD1)、胞外5'-核苷酸酶(NT5E)、介白素-22 (IL-22)、雙調蛋白(AREG)、介白素-35 (IL35)、GARP、CD274分子(CD274)、叉頭盒P3 (FOXP3)、IKAROS家族鋅指2 (IKZF2)、家族性嗜酸性球增多(EOS)、干擾素調控因子4 (IRF4)、淋巴樣增強結合因子1 (LEF1)、BTB結構域及CNC同系物2 (BACH2)以及介白素2受體亞單元α (IL2RA)。
在一些實施例中，調控性T細胞促進分子為IL10或CTLA4。
在一些實施例中，調控性T細胞促進分子為第一調控性T細胞促進分子，且進一步包含處於啟動子序列控制下的編碼第二調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。在一些實施例中，第一及第二調控性T細胞促進分子為IL10及CTLA4。
在一些實施例中，相對於成熟野生型人類IL10，IL10包含位於選自D25、E96、N21及R104之一或多個胺基酸處之突變。在一些實施例中，相對於成熟野生型人類IL10，IL10包含一或多個選自D25A/K、E96A、N21A及R104A之胺基酸突變。在一些實施例中，相對於成熟野生型人類IL10，IL10包含選自D25K、D25A、D25A/E96A、D25K/E96A、N21A/R104A、D25A/N21A/R104A、D25K/N21A/R104A之胺基酸突變之組合。在一些實施例中，其中IL10包含成熟野生型人類IL10。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞包含對編碼T細胞受體、MHC I類分子或MHC II類分子中之至少一者的內源核酸序列之修飾。在一些實施例中，經工程改造之T細胞包含對編碼選自TRAC、HLA-A、HLA-B及CIITA之蛋白質的內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低蛋白質之表現。在一些實施例中，蛋白質為TRAC，且修飾敲低TRAC之表現。在一些實施例中，蛋白質為HLA-A，且修飾敲低HLA-A之表現。在一些實施例中，蛋白質為HLA-B，且修飾敲低HLA-B之表現。在一些實施例中，蛋白質為CIITA，且修飾敲低CIITA之表現。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞進一步包含：a) 對編碼TRAC之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低TRAC之表現；b) 對編碼HLA-A之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低HLA-A之表現；c)對編碼HLA-B之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低HLA-B之表現；及d)對編碼CIITA之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低CIITA之表現。
本揭示案之另一態樣係關於經工程改造之T細胞，其包含：i)對編碼腫瘤壞死因子α (TNFA)之第一內源核酸序列之修飾，其中對該第一內源核酸之該修飾敲低TNFA之表現；ii)對編碼干擾素-γ (IFNG)之第二內源核酸序列之修飾，其中對該第二內源核酸之該修飾敲低該IFNG之表現；iii)對編碼選自TRAC、HLA-A、HLA-B及CIITA之蛋白質的第三內源核酸序列之修飾，其中對該第三內源核酸之該修飾敲低該蛋白質之表現；及iv)處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
在一些實施例中，蛋白質為TRAC，且第三修飾敲低TRAC之表現。在一些實施例中，蛋白質為HLA-A，且第三修飾敲低HLA-A之表現。在一些實施例中，蛋白質為HLA-B，且第三修飾敲低HLA-B之表現。在一些實施例中，蛋白質為CIITA，且第三修飾敲低CIITA之表現。
本揭示案之另一態樣係關於經工程改造之T細胞，其包含：i)對編碼腫瘤壞死因子α (TNFA)之第一內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低TNFA之表現；ii)對編碼干擾素-γ (IFNG)之第二內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低該IFNG之表現；iii)對編碼TRAC之第三內源核酸序列之修飾，其中對該第三內源核酸序列之該修飾敲低TRAC之表現；iv)對編碼HLA-A之第四內源核酸序列之修飾，其中對該第四內源核酸序列之該修飾敲低HLA-A之表現；v)對編碼HLA-B之第五內源核酸序列之修飾，其中對該第五內源核酸序列之該修飾敲低HLA-B之表現；vi)對編碼CIITA之第六內源核酸序列之修飾，其中對該第六內源核酸序列之該修飾敲低CIITA之表現；及vii)處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
在一些實施例中，調控性T細胞促進分子係選自介白素-10 (IL10)、細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)、具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、吲哚胺2,3-雙加氧酶1 (IDO1)、胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1 (ENTPD1)、胞外5'-核苷酸酶(NT5E)、介白素-22 (IL-22)、雙調蛋白(AREG)、介白素-35 (IL35)、GARP、CD274分子(CD274)、叉頭盒P3 (FOXP3)、IKAROS家族鋅指2 (IKZF2)、家族性嗜酸性球增多(EOS)、干擾素調控因子4 (IRF4)、淋巴樣增強結合因子1 (LEF1)、BTB結構域及CNC同系物2 (BACH2)以及介白素2受體亞單元α (IL2RA)。
在一些實施例中，調控性T細胞促進分子為IL10或CTLA4。
在一些實施例中，調控性T細胞促進分子為第一調控性T細胞促進分子，且進一步包含處於啟動子序列控制下的編碼第二調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
在一些實施例中，第一及第二調控性T細胞促進分子為IL10及CTLA4。在一些實施例中，相對於成熟野生型人類IL10，IL10包含位於選自D25、E96、N21及R104之一或多個胺基酸處之突變。在一些實施例中，相對於成熟野生型人類IL10，IL10包含一或多個選自D25A/K、E96A、N21A及R104A之胺基酸突變。在一些實施例中，相對於成熟野生型人類IL10，IL10包含選自D25K、D25A、D25A/E96A、D25K/E96A、N21A/R104A、D25A/N21A/R104A、D25K/N21A/R104A之胺基酸突變之組合。在一些實施例中，IL10包含成熟野生型人類IL10。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞進一步包含對編碼介白素17A (IL17A)、介白素-2 (IL2)、介白素6 (IL6)、穿孔蛋白1 (PRF1)、顆粒酶A (GZMA)、顆粒酶B (GZMB)、天然殺手細胞顆粒蛋白7 (NKG7)、Fas配位體(FASL，NF超家族，成員6)、雷諾丁受體2 (ryanodine receptor 2, RYR2)及群落刺激因子2 (CSF2)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾分別敲低該IL17A、該IL2、該IL6、該PRF1、該GZMA、該GZMB、該FASL、該RYR2或該CSF2之表現。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞進一步包含對編碼內源T細胞受體(TCR)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低該內源TCR之表現。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞進一步包含處於啟動子序列控制下的針對靶向受體之異源編碼序列。在一些實施例中，靶向受體靶向選自以下之配位體：黏膜血管位址素細胞黏著分子1 (MADCAM1)、腫瘤壞死因子α (TNFA)、CD70分子(CD70)、CEA細胞黏著分子6 (CEACAM6)、血管細胞黏著分子1 (VCAM1)、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNF (配位體)超家族成員7 (TNFSF7)、TNF受體超家族成員17 (TNFRSF17)、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)及MHC I類HLA-A (HLA-A*02)。
在一些實施例中，靶向受體包含嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
在一些實施例中，將編碼靶向受體之異源核酸序列併入至表現構築體中。在一些實施例中，編碼靶向受體之異源核酸序列所在之表現構築體不包含編碼調控性T細胞促進分子之核酸序列。在一些實施例中，編碼靶向受體之異源核酸序列所在之表現構築體包含編碼調控性T細胞促進分子之核酸序列。
在一些實施例中，將編碼第一調控性T細胞促進分子之異源核酸序列併入至表現構築體中，且將編碼第二調控性T細胞促進分子之異源核酸序列併入至表現構築體中。在一些實施例中，將編碼第一調控性T細胞促進分子之異源核酸序列及編碼第二調控性T細胞促進分子之異源核酸序列併入至單獨的表現構築體中。在一些實施例中，將編碼第一調控性T細胞促進分子之異源核酸序列及編碼第二調控性T細胞促進分子之異源核酸序列併入至單一表現構築體中。
在一些實施例中，至少一個異源編碼序列係在游離型表現構築體中。在一些實施例中，將至少一個異源核酸序列插入至基因體中。在一些實施例中，插入至基因體中為非靶向插入。在一些實施例中，插入為靶向插入。在一些實施例中，靶向插入係在選自以下之位點中：TCR基因座、TNF基因座、IFNG基因座、IL17A基因座、IL6基因座、IL2基因座、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)基因座。在一些實施例中，TCR基因座為T細胞受體α恆定(TRAC)基因座。
在一些實施例中，敲低基因表現之修飾包含插入、缺失或取代中之一或多者。在一些實施例中，經工程改造之T細胞為CD4+ T細胞。
本揭示案之另一態樣係關於經工程改造之T細胞群體，其包含如本文所闡述之經工程改造之T細胞。在一些實施例中，經工程改造之T細胞群體包含如本文所闡述之經工程改造之T細胞，其中該群體中至少30%或至少40%之細胞包含處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源核酸序列；且該群體中至少50%或至少70%之細胞包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾。在一些實施例中，經工程改造之T細胞群體包含如本文所闡述之經工程改造之T細胞，其中該群體中至少50%或至少70%之細胞包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾；該群體中至少50%或至少70%之細胞包含對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾；或該群體中至少30%或至少40%之細胞包含處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。在一些實施例中，經工程改造之T細胞群體包含如本文所闡述之經工程改造之T細胞，包含插入或修飾之細胞百分比係由根據次世代定序(NGS)之讀段百分比來確定。
本揭示案之一態樣係關於醫藥組合物，其包含如本文所闡述之經工程改造之T細胞或經工程改造之T細胞群體。
本揭示案之另一態樣係關於向個體投與如本文所闡述之經工程改造之T細胞、經工程改造之T細胞群體或醫藥組合物的方法或用途。在一些實施例中，個體需要免疫抑制。在一些實施例中，本文所闡述之方法或用途用於治療免疫病症。在一些實施例中，本文所闡述之方法或用途用於治療自體免疫性疾病。
在一些實施例中，自體免疫性疾病係選自潰瘍性結腸炎、克隆氏病(Crohn's disease)、類風濕性關節炎、牛皮癬、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡及1型糖尿病。在一些實施例中，本文所闡述之方法或用途用於治療移植物抗宿主病(GvHD)。
在一些實施例中，個體接受移植或輸血。在一些實施例中，個體將接受移植或輸血。在一些實施例中，個體正在接受移植或輸血。在一些實施例中，個體已接受移植或輸注。在一些實施例中，移植或輸血包含實體器官或細胞群體。在一些實施例中，移植或輸血包含來自非個體之供體之細胞。
在一些實施例中，在接受移植或輸血之前，向個體投與如本文所闡述之經工程改造之T細胞、經工程改造之T細胞群體或醫藥組合物。在一些實施例中，在接受移植或輸血的同時，向個體投與如本文所闡述之經工程改造之T細胞、經工程改造之T細胞群體或醫藥組合物。在一些實施例中，在接受移植或輸血之後，向個體投與本文所闡述之經工程改造之T細胞、經工程改造之T細胞群體或醫藥組合物。
相關申請案本申請案主張2023年12月20日提出申請之美國臨時申請案第63/612,847號及2024年12月3日提出申請之美國臨時申請案第63/727,648號之權益及優先權，該等臨時申請案各自之全部內容係以全文引用方式明確地併入本文中。
序列表本申請案與呈電子格式之序列表一起提出申請。該序列表檔案之標題為12793_0041-00304_SL，創建於2024年12月18日，且大小為800,521個位元組。該序列表之電子格式中之資訊係以全文引用的方式併入本文中。
現將詳細參考本揭示案態樣之某些實施例，該等實施例之實例在附圖中予以闡釋。儘管將結合所闡釋之實施例來闡述本揭示案，但應理解，該等實施例並不意欲將本揭示案限於彼等實施例。與之相反，本揭示案意欲涵蓋如隨附實施例所界定的可包括在本揭示案內之所有替代方案、修改及等效形式。
本文所用之章節標題僅用於組織目的，而不應解釋為以任何方式限制期望標的物。倘若以引用方式併入之任何材料與本說明書中所定義之任何術語或本說明書之任何其他表現內容衝突，則以本說明書為準。
I. 定義
在詳細地闡述本發明教示內容之前，應理解，本揭示案並不限於具體組合物或製程步驟，此乃因此等要素可變化。應注意，除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及隨附實施例中所用，單數形式「一種/個(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，對「結合物」之提及包括複數種結合物，且對「細胞」之提及包括複數個細胞或細胞群體，及諸如此類。如本文所用，術語「包括」及其文法變化形式意欲為非限制性的，使得對清單中項目之列舉不排除可替代或添加至所列項目之其他類似項目。
數值範圍包括界定該範圍之數值。考慮到有效數位及與量測相關之誤差，量測值及可量測值應理解為近似值。同樣，「包含(comprise、comprises、comprising)」、「含有(contain、contains、containing)」、「包括(include、includes及including)」之使用並不意欲具有限制性。應理解，前述一般說明及詳細說明二者均僅為例示性及解釋性的，且並不限制教示內容。
除非在本說明書中明確註明，否則亦將本說明書中列舉「包含」各種組分之實施例考慮為「由所列舉組分組成」或「基本上由所列舉組分組成」；亦將本說明書中列舉「由各種組分組成」之實施例考慮為「包含所列舉組分」或「基本上由所列舉組分組成」；且亦將本說明書中列舉「基本上由各種組分組成」之實施例考慮為「由所列舉組分組成」或「包含所列舉組分」(此可互換性並不適用於該等術語在申請專利範圍中之使用)。
除非上下文另外明確指示，否則術語「或」係以包括性含義使用，亦即等同於「及/或」。
術語「約」在清單或範圍前使用時修飾清單中之每一成員或範圍中之每一端點。術語「約」或「大約」意指由熟習此項技術者所測定之特定值之可接受誤差，其部分地取決於該值之量測或測定方式。術語「約」在本文中用於意指在此項技術中之典型公差範圍內。舉例而言，「約」可理解為距平均值約2個標準偏差。在某些實施例中，約意指+/-10%。在某些實施例中，約意指+/-5%。
在一些實施例中，細胞群體係指至少10^3、10^4、10^5或10^6個細胞之群體，例如至少10^7、2 × 10^7、5 × 10^7或10^8個細胞。
如自上下文中清晰可見，一個數值或一系列數值之前的術語「至少」應理解為包括與術語「至少」毗鄰之數值，以及邏輯上可包括在內之所有後續數值或整數。舉例而言，核酸分子中核苷酸之數值必須為整數。舉例而言，「20個核苷酸之核酸分子中之至少17個核苷酸」意指17、18、19或20個核苷酸具有所指示之性質。當至少出現在一系列數值或範圍之前時，應理解，「至少」可修飾該系列或範圍內之每一數值。
如本文所用，「不超過」或「小於」應理解為與該片語毗鄰之值及自上下文來看合乎邏輯之邏輯較低值或整數直至零。舉例而言，「不超過2個核苷酸鹼基對」之雙鏈體區域具有2、1或0個核苷酸鹼基對。當「不超過」或「小於」出現在一系列數值或範圍之前時，應理解，該系列或範圍中之每一數值經修飾。
如本文所用，範圍包括上限及下限。
如本文所用，應理解，當值之最大量由100%表示時(例如100%抑制或100%囊封)，該值受偵測方法限制。舉例而言，100%抑制應理解為抑制至低於分析偵測水準之水準，且100%囊封應理解為在囊泡外不能偵測到意欲用於囊封之材料。
倘若本申請案中之序列與指示登錄號或登錄號中之位置發生衝突，則以本申請案中之序列為準。
除非另有說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義。
如本文所用，「敲低」係指藉由基因編輯使例如細胞、細胞群體、組織或器官中特定基因產物(例如全長或野生型mRNA、蛋白質或兩者)之表現減少。在一些實施例中，基因編輯可藉由序列、例如次世代定序(NGS)來評價。與適宜對照(例如，其中基因序列未經修飾)相比，表現可減少至少70%、75%、80%、85%、90%、95%，或減少至低於分析之偵測水準。蛋白質之敲低可藉由偵測來自所關注之組織、細胞群體或流體之蛋白質之量來量測。量測mRNA敲低之方法係已知的，且包括對自所關注組織或細胞群體分離之mRNA進行定序。流式細胞術分析係用於量測蛋白質表現敲低之已知方法。對於分泌蛋白，可在流體(諸如組織培養基或血液或源自血液之血清或血漿)中評價敲低。在一些實施例中，「敲低」可指特定基因產物之一些表現損失，例如轉錄或轉譯成全長蛋白質之全長野生型mRNA之量的減少，或由細胞群體所表現之蛋白質之量的減少。眾所周知，mRNA序列中之哪些變化將導致野生型或全長蛋白質之表現減少。在一些實施例中，「敲低」可指特定基因產物(例如體液或組織培養基中之TGFBR2、IFNG或TNFA基因產物)之一些表現損失。對例如編碼TGFBR2、IFNG或TNFA之內源核酸序列之修飾可導致敲低。
如本文所用，「T細胞受體」或「TCR」係指T細胞中之受體。一般而言，TCR為含有兩條TCR多肽鏈α及β之異二聚體受體分子。α及β鏈TCR多肽可與各種CD3分子複合且在抗原結合後引發免疫反應，包括發炎及自體免疫。如本文所用，TCR之敲低係指任何TCR基因之部分或全部敲低，例如TRBC1基因之部分缺失單獨或與其他TCR基因之部分或全部敲低之組合。
「TRAC」用於指T細胞受體α鏈。人類野生型TRAC序列可在NCBI Gene ID：28755；Ensembl：ENSG00000277734獲得。T細胞受體α恆定區、TCRA、IMD7、TRCA及TRA係TRAC之基因同義詞。
「TRBC」用於指T細胞受體β鏈，例如TRBC1及TRBC2。「TRBC1」及「TRBC2」係指編碼T細胞受體β鏈之兩個同源基因，其為TRBC1或TRBC2基因之基因產物。
人類野生型TRBC1序列可在NCBI Gene ID：28639；Ensembl：ENSG00000211751獲得。T細胞受體β恆定區、V_區段轉譯產物、BV05S1J2.2、TCRBC1及TCRB係TRBC1之基因同義詞。
人類野生型TRBC2序列可在NCBI Gene ID：28638；Ensembl：ENSG00000211772獲得。T細胞受體β恆定區、V_區段轉譯產物及TCRBC2係TRBC2之基因同義詞。
如本文所用，「免疫反應」係指一或多種免疫系統反應，例如，與未受刺激之對照免疫系統相比，免疫系統細胞之產生或活性增加，該等細胞諸如(但不限於) T細胞、B細胞、天然殺手細胞、單核球、嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、肥胖細胞、紅血球、樹突細胞、抗原呈遞細胞、巨噬細胞或吞噬細胞。免疫系統暴露於抗原可引起免疫反應，該抗原例如為外來或自體抗原，諸如(但不限於)病原體(微生物、病毒、普里昂蛋白(prion)、真菌等)、過敏原(灰塵、花粉、塵蟎等)、毒素(化學物質、藥物等)或生理變化(高膽固醇血症、肥胖症、器官移植等)。免疫反應亦可包括在GvHD中造血幹細胞移植後，供體細胞介導宿主組織免疫攻擊之反應。免疫反應可導致發炎。或者或另外，免疫反應亦可包括在實體器官移植或藉助移植或輸血引入其他非宿主細胞後，宿主細胞介導供體組織免疫攻擊之反應。免疫反應可靶向、攻擊、去除或中和抗原，例如外來抗原或自體抗原。免疫反應可能合意或可能不合意。免疫反應可為急性的或慢性的。免疫反應可損害免疫反應所針對之細胞、組織或器官。
如本文所用，「自體免疫反應」係指對例如由個體自身細胞、組織或器官產生之自體抗原之一或多種免疫系統反應。自體免疫反應可導致與適宜對照(例如健康對照)相比，免疫系統細胞之產生或活性增加，該等細胞諸如(但不限於) T細胞、B細胞、天然殺手細胞、單核球、嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、肥胖細胞、紅血球、樹突細胞、抗原呈遞細胞、巨噬細胞或吞噬細胞。自體免疫反應可導致發炎，例如長期發炎，或導致自體免疫性疾病。自體免疫反應可靶向、攻擊、去除或中和由個體自身細胞、組織或器官產生之自體抗原，此可導致自體免疫性疾病。
如本文所用，「抑制」免疫反應係指與適宜對照(例如，未用本文所闡述之經工程改造之T細胞處理或在用本文所闡述之經工程改造之T細胞處理之前)相比，降低或抑制一或多種免疫系統反應(例如免疫系統細胞之產生或活性)之水準。「抑制」免疫反應可指與適宜對照(例如，未用本文所闡述之經工程改造之T細胞處理或在用本文所闡述之經工程改造之T細胞處理之前)相比，免疫系統細胞之產生或活性降低。「抑制」免疫反應可指提高免疫耐受性。舉例而言，免疫系統細胞之產生或活性可藉由以下來量測：細胞計數，例如淋巴球計數或脾臟細胞計數；細胞活性，例如T細胞分析；或基因或蛋白質表現，例如生物標記物表現；其中與適宜對照(例如，未用本文所闡述之經工程改造之T細胞處理或在用本文所闡述之經工程改造之T細胞處理之前)相比，該產生或活性降低50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，或低於分析之偵測水準。
如本文所用，「自體免疫性疾病」或「自體免疫性病症」係指特徵在於對個體自身抗原、細胞、組織或器官之病理性免疫反應之疾患。自體免疫性疾病及病症之實例包括(但不限於)：潰瘍性結腸炎、克隆氏病、類風濕性關節炎、牛皮癬、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡及1型糖尿病。在一些實施例中，經工程改造之T細胞具有自體或同種異體用途。
如本文所用，「免疫病症」應理解為特徵在於個體之病理性或不期望免疫反應之疾病或疾患。在某些實施例中，免疫病症為自體免疫性疾病。在某些實施例中，免疫病症為GvHD。在某些實施例中，患有免疫病症之個體需要抑制免疫反應。在某些實施例中，患有免疫病症之個體需要提高免疫耐受性。
「T細胞」在暴露於抗原後之免疫反應中起核心作用。T細胞可為天然存在的或非天然的，例如，當T細胞藉由工程改造(例如自幹細胞)或藉由轉分化(例如使體細胞再程式化)形成時。T細胞可由細胞表面上T細胞受體之存在而與其他淋巴球區分開。此定義包括習知適應性T細胞，包括輔助性CD4+ T細胞、細胞毒性CD8+ T細胞、記憶性T細胞及調控性CD4+ T細胞，以及先天樣T細胞，包括天然殺手T細胞、黏膜相關不變T細胞及γδ T細胞。在一些實施例中，T細胞為CD4+。在一些實施例中，T細胞為CD3+/CD4+。在一些實施例中，T細胞為CD8+。在一些實施例中，T細胞可進一步表徵為幹細胞樣記憶性T細胞(Tscm) (；CD62L+CD45RO-)、中樞記憶性T細胞(Tcm；) (CD62L+CD45RO+)、效應記憶性T細胞(Tem；) (CD62L-CD45RO+)及末端效應T細胞(Tte；) (CD62L-CD45RO-)；T細胞群體可包含該等T細胞亞型中之任一或多者。
「調控性T細胞」或「Treg」係指在抑制過度免疫反應(包括發炎及自體免疫)中起核心作用之特化T細胞。Treg可為天然存在的(在本文中可互換地稱為天然Treg (「nTreg」)及胸腺Treg (「tTreg」))或非天然的，例如當Treg藉由工程改造(包括藉由插入編碼dmTGFB1分子之序列)形成時。當藉由工程改造形成時，Treg可包括其他修飾，例如藉由對編碼TGFBR2、IFNG及TNFA之內源核酸序列進行修飾(例如敲低)，及插入至少一個編碼調控性T細胞促進分子之序列。天然存在之Treg或天然Treg或nTreg有時亦稱為胸腺Treg或tTreg，其為通常在胸腺中發育且藉由抑制過度免疫反應起作用之特化T細胞。在一些實施例中，可藉由插入編碼dmTGFB1分子之序列，且視情況進一步修飾編碼例如TGFBR2、TNFA及IFNG之內源核酸序列，例如敲低編碼TGFBR2、TNFA及IFNG之核酸序列，且將編碼調控性T細胞促進分子之序列插入至細胞中以展現調控性T細胞之表型特徵及抑制功能來工程改造細胞，諸如習知T細胞或習知T細胞群體，例如不富集所存在之nTreg細胞 之T細胞群體，且該等細胞可稱為經轉導或「經工程改造」之T細胞。在一些實施例中，經工程改造之T細胞包含編碼dmTGFB1分子之插入序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾、對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾及對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾；及插入異源調控性T細胞促進分子，諸如IL10及CTLA4。對內源核酸序列之修飾(例如敲低內源基因表現之修飾)可包含基因體序列中之一或多個插入缺失或取代突變或由其組成。
如本文所用，dmTGFB1係基於來自任何物種(包括例如人類、小鼠、大鼠或食蟹猴TGFB1)之野生型TGFB1之突變型TGFB1。在某些實施例中，dmTGFB1為人類dmTGFB1，亦即相對於野生型人類TGFB1之突變型TGFB1。野生型TGFB1之編碼序列及胺基酸序列可容易地在包括NCBI在內之序列資料庫中獲得，且例示性序列可參見登錄號NM_000660.7及NP_000651.3 (人類)、NM_011577.2及NP_035707.1 (小鼠)、NM_021578.2及NP_067589.1 (大鼠)，以及XM_005589339.3及XP_005589396.1 (食蟹猴)。每一登錄號係以引用方式併入截至本申請案之申請日可獲得之版本中。將突變定位至野生型序列上之能力完全在熟習此項技術者之能力範圍內。
轉型生長因子β-1 (TGFB1)合成為大的前驅體分子。TGFB1前體蛋白含有29個胺基酸之信號肽，其係以蛋白水解方式裂解。TGFB1在胺基酸278之後進一步裂解以形成潛伏相關肽(LAP)及活性TGFB1。LAP在C223及C225處用鏈間二硫鍵二聚化。TGFB1可分泌為無活性之小潛在複合物，其由成熟TGF-β1同二聚體在LAP殘基I53-L59處與LAP同二聚體非共價締合組成。LAP屏蔽成熟TGFB1中之II型受體結合位點。大多數細胞將TGFB1分泌為TGF-β1/LAP之大潛在複合物(LLC)，其在LAP鏈中之C33與潛在TGFB結合蛋白(LTBP)之間共價結合。LTBP有助於TGFB1摺疊、分泌，且可能靶向細胞外基質。LLC之活化經由LTBP之N末端結構域與細胞外基質結合而發生。
卡穆拉蒂-恩格爾曼病(Camurati-Engelmann Disease, CED)係由染色體19q13上之轉型生長因子-β-1基因(TGFB1；OMIM條目190180，以引用方式併入在本申請案之申請日可獲得之版本中)中之結構域特異性異型合子突變引起。卡穆拉蒂-恩格爾曼病家族中報導之突變包括(Janssen等人，2006. J Med Genet.43:1.)：
外顯子 DNA 突變 蛋白質突變
1 28_36重複 L10-L12重複
1 241T → C Y81H
2 463C → T R156C
4 652C → T R218C
4 653G → A R218H
4 664C → G H222D
4 ? C223S
4 667T → C C223R
4 667T → G C223G
4 673T → C C225R
如表中所示，患有CED之個體中的大多數致病變異體在TGFB1潛伏相關肽(LAP)之羧基末端產生單一胺基酸取代。取代靠近LAP同二聚體之間的鏈間二硫鍵位點。該等致病變異體破壞LAP之二聚化及與活性TGFB1之結合(Walton等人，2010. J Biol Chem. 285:17029-37)，此導致活性TGFB1自細胞中之釋放增加。Walton等人進一步證明，所得大潛在複合物之穩定性依賴於LAP之共價二聚化，該共價二聚化由二聚體界面處之關鍵殘基(F198、D199、V200、L208、F217及L219)來促進。與正常纖維母細胞相比，來自患有CED之個體的R218H突變之纖維母細胞顯示細胞培養基中活性TGFB1增加(Saito等人，2001. J Biol Chem. 276:11469-72)。R218C、H222D及C225R突變構築體之活體外分析亦顯示在經轉染細胞之培養基中活性TGF-β1增加。相比之下，Leu11_Leu13dup及Tyr81His致病變異體使得TGFB1分泌量減少。然而，在對TGFB1誘導之轉錄反應具有特異性之螢光素酶報導基因分析中，突變細胞顯示螢光素酶活性增加，此表明受體之細胞內活化(Janssens等人，2003. J Biol Chem. 278:7718-24)。
如本文所用，在某些實施例中，dmTGFB1係相對於野生型TGFB1在兩個或更多個胺基酸位置處包含突變之TGFB1，該等突變降低所得大潛在複合物之穩定性，該穩定性依賴於LAP相對於單獨之每一TGFB1單一突變體之共價二聚化。相對於野生型人類TGFB1，兩個或更多個胺基酸位置處之突變可包括選自以下位置處之突變：F198、D199、V200、L208、F217、L219、R218、H222、C223及C225。
在某些實施例中，dmTGFB1係相對於野生型TGFB1在兩個或更多個胺基酸位置處包含突變之TGFB1，該等突變位於相對於野生型人類TGFB1選自以下之位置處：F198、D199、V200、L208、F217、L219、R218、H222、C223及C225，其中當產生dmTGFB1時，其自通常表現TGFB1之細胞分泌。在一些實施例中，dmTGFB1包含天然存在之突變，例如天然存在於CED中。在一些實施例中，dmTGFB1包含非天然存在之突變，例如非天然存在於CED中。
在某些實施例中，相對於野生型人類TGFB1，人類dmTGFB1包含位於選自R218、H222、C223及C225之2個或更多個胺基酸位置處之突變。
在某些實施例中，相對於野生型人類TGFB1，人類dmTGFB1包含2個或更多個選自R218C/H、H222D、C223S/R/G及C225R之突變。
在某些實施例中，相對於野生型人類TGFB1，人類dmTGFB1包含2個或更多個選自R218C/H及C225R之突變，視情況R218H及C225R。
本文所提供之dmTGFB1較任一單獨之單一突變體具有更多之游離活性dmTGFB1。在某些實施例中，與單一突變體單獨之活性相比，活性dmTGFB1之增加至少為累加性的。在某些實施例中，與單一突變體單獨之活性相比，活性dmTGFB1之增加顯著大於累加。使用市售套組(例如LEGEND MAX總TGF-β1 ELISA套組(BioLegend，目錄號436707)及LEGEND MAX游離活性TGF-β1 ELISA套組)且如下文實例中所提供，測定總TGFB1及活性TGFB1水準之方法為此項技術中所已知。
如本文所用，「調控性T細胞促進分子」係指促進習知T細胞轉化為調控性T細胞之分子，包括免疫抑制分子及Treg轉錄因子。此外，調控性T細胞促進分子亦指賦予習知T細胞調控活性之分子，包括Treg相關之免疫抑制分子及轉錄因子。調控性T細胞促進分子可與dmTGFB1結合使用，以促進習知T細胞轉化為調控性T細胞或賦予習知T細胞調控活性。欲與dmTGFB1組合使用之免疫抑制分子之實例包括(但不限於)介白素-10 (IL10)、細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)、具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、吲哚胺2,3-雙加氧酶1 (IDO1)、胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1 (ENTPD1)、胞外5'-核苷酸酶(NT5E)、介白素-22 (IL22)、雙調蛋白(AREG)、介白素-35 (Il35)、含富含白胺酸之重複序列32 (GARP)、CD274分子(CD274)、叉頭盒P3 (FOXP3)、IKAROS家族鋅指2 (IKZF2)、家族性嗜酸性球增多(EOS)、干擾素調控因子4 (IRF4)、淋巴樣增強結合因子1 (LEF1)、BTB結構域及CNC同系物2 (BACH2)以及介白素2受體亞單元α (IL2RA、CD25)。在一些實施例中，調控性T細胞促進分子可按特定組合來使用，例如IL10與CTLA4、ENTPD1與NT5E以及IL22與AREG。特定而言，本文提供與dmTGFB1結合使用之IL10及CTLA4組合。在一些實施例中，免疫抑制分子之表現可藉由諸如FoxP3、Helios、Eos、IRF4、Lef1或BACH2等轉錄因子之表現來促進。
在一些實施例中，習知T細胞可經工程改造以修飾、插入或缺失基因體中之序列，且「經工程改造」之T細胞展現天然調控性T細胞之一或多種表型特徵及抑制功能。舉例而言，「經工程改造」之T細胞在如下文實例2.4中所提供之混合淋巴球反應分析中展現出抑制活性，或可能能夠抑制下文實例3.2中所呈現之小鼠模型中之移植物抗宿主病，例如，以統計學上顯著之方式(例如，亦參見Parmar等人，Ex vivo fucosylation of third-party human regulatory T cells enhances anti–graft-versus-host disease potency in vivo, Blood 125(9) (2015))。在一些實施例中，「經工程改造」之T細胞為習知T細胞，其已藉由插入調控性T細胞促進分子之編碼序列且藉由修飾(例如敲低)促炎性細胞介素(例如TNFA與IFNG及IL17A中之一者或兩者之組合)之表現來進行修飾。在一些實施例中，用於工程改造之起始T細胞群體不富集所存在之天然Treg，例如起始T細胞群體具有少於20%之天然Treg。
如本文所用，「促炎性」分子(例如細胞介素)增加如本文所闡述之免疫反應，例如以劑量反應性方式降低實例3.2中所呈現之移植物抗宿主病小鼠模型中Treg之功效。促炎性分子之實例包括(但不限於) IFNG、TNFA、IL17A、IL6、IL2、穿孔蛋白1 (PRF1)、顆粒酶A (GZMA)、顆粒酶B (GZMB)、天然殺手細胞顆粒蛋白7 (NKG7)、Fas配位體(FasL，NF超家族，成員6)、雷諾丁受體2 (RYR2)及群落刺激因子2 (CSF2)。
如本文所用，「靶向受體」係指存在於細胞(例如T細胞)表面上，以允許細胞結合至靶位點(例如生物體中之特定細胞或組織)之受體。靶向受體包括(但不限於)嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)及細胞表面分子之受體，該細胞表面分子經由內部信號傳導結構域中之至少一個跨膜結構域可操作地連接，該內部信號傳導結構域在結合蛋白質之細胞外受體部分後能夠活化T細胞，例如黏膜位址素細胞黏著分子-1 (MADCAM-1)、TNFA、CD70、CEA細胞黏著分子6 (CEACAM6)、血管細胞黏著分子1 (VCAM1)、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNF (配位體)超家族成員7 (TNFSF7)、TNF受體超家族成員17 (TNFRSF17)、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)及MHC I類HLA-A (HLA-A*02)。
如本文所用，「嵌合抗原受體」係指可操作地連接至細胞內信號傳導結構域之細胞外抗原識別結構域，例如scFv、VHH、奈米抗體，其在結合抗原時活化T細胞。CAR由四個區域構成：抗原識別結構域、細胞外鉸鏈區、跨膜結構域及細胞內T細胞信號傳導結構域。此類受體為此項技術中所熟知(例如，參見WO2020092057、WO2019191114、WO2019147805、WO2018208837，其各自內容之相應部分係以引用方式併入本文中)。亦考慮經由銜接分子促進免疫細胞與靶細胞結合之反向通用CAR (例如，參見WO2019238722，其內容係以全文引用的方式併入本文中)。CAR可靶向任何可產生抗體之抗原，且通常針對展示於待靶向之細胞或組織表面上之分子。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向胃腸道，例如，CAR靶向MAdCAM-1。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向經活化之免疫細胞(例如表現上調靶標之T細胞或B細胞)，例如，CAR靶向CD70。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向包含內皮細胞之組織，例如，CAR靶向VCAM-1，例如用於抑制諸如克隆氏病及多發性硬化症等病症中之免疫反應。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向內皮細胞，例如，CAR靶向CEACAM6，例如用於抑制諸如克隆氏病等病症中之免疫反應。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向前B細胞，例如，CAR靶向CD19，例如用於抑制諸如多發性硬化症及全身性紅斑狼瘡等病症中之免疫反應。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向B淋巴球，例如，CAR靶向CD20，例如用於抑制諸如多發性硬化症及全身性紅斑狼瘡等病症中之免疫反應。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向發炎性組織，例如，CAR靶向TNFA，例如用於抑制諸如類風濕性關節炎、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克隆氏病等病症中之免疫反應。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向發炎性組織，例如，CAR靶向TGF-b1，例如用於抑制諸如發炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克隆氏病等病症中之免疫反應。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向神經組織，例如，CAR靶向MBP、MOG或PLP1，例如用於抑制諸如多發性硬化症等病症中之免疫反應。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向表現TNFSF7之免疫細胞，包括(但不限於)經活化之T淋巴球、B淋巴球、樹突細胞及/或NK細胞，例如，CAR靶向TNFSF7，例如用於抑制諸如克隆氏病、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑狼瘡或多發性硬化症等病症中之免疫反應。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向包含成熟B淋巴球之組織，例如，CAR靶向TNFRSF17，例如用於抑制諸如全身性紅斑狼瘡等病症中之免疫反應。在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向滑膜組織，例如，CAR靶向瓜胺酸化波形蛋白，例如用於抑制諸如類風濕性關節炎等病症中之免疫反應。在一些實施例中，CAR靶向二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02)。其他CAR靶標(例如發炎性抗原)為此項技術中所已知。例如，參見WO2020092057A1，其內容係以全文併入本文中。
如本文所用，「治療」係指針對個體之疾病或病症進行任何投與或施加治療劑，且包括抑制疾病，阻止其發展，減輕疾病之一或多種症狀，治癒疾病，預防疾病之一或多種症狀或預防疾病之一或多種症狀之復發。治療自體免疫或發炎性反應或病症可包括緩和與特定病症相關之發炎，此使得疾病特異性症狀緩和。用本文所闡述之經工程改造之T細胞進行的治療可在用於治療自體免疫性病症之其他治療劑(例如抗炎劑、免疫抑制劑或生物製劑，例如Remicade、Humira)之前、之後或與其組合使用。
「啟動子」係指一種調控區，其控制與該調控區連接之基因之表現。
「多核苷酸」及「核酸」在本文中用於指包含核苷或核苷類似物之多聚體化合物，其具有沿主鏈連接在一起之含氮雜環鹼基或鹼基類似物，包括習知RNA、DNA、混合RNA-DNA及作為其類似物之聚合物。核酸「主鏈」可由多種鍵聯組成，包括糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯中之一或多者或其組合。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖或具有取代(例如2'甲氧基、2'鹵化物或2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)取代)之類似化合物。含氮鹼基可為習知鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如經修飾尿苷，諸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷，或其他尿苷)；肌苷；嘌呤或嘧啶之衍生物(例如N4-甲基去氧鳥苷、去氮嘌呤或氮雜嘌呤、去氮嘧啶或氮雜嘧啶、在5位或6位具有取代基之嘧啶鹼基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2位、6位或8位具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲基胺基嘌呤、O6-甲基鳥嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O4-烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。關於一般論述，參見The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36，Adams等人編輯，第11版，1992)。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈不包括針對聚合物位置之含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習知RNA或DNA糖、鹼基及鍵聯，或可包括習知組分及取代二者(例如具有2'甲氧基鍵聯之習知鹼基，或含有習知鹼基及一或多種鹼基類似物之聚合物)。核酸包括「鎖核酸」(LNA)，其為一種含有一或多個LNA核苷酸單體之類似物，二環呋喃糖單元鎖定於模擬RNA之糖構形中，此增強對互補RNA及DNA序列之雜交親和力(Vester及Wengel，2004,Biochemistry43(42):13233-41)。核酸包括「解鎖核酸」或UNA。RNA及DNA可具有不同的糖部分，且可因RNA中存在尿嘧啶或其類似物且DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物而不同。
如本文所用之「多肽」係指包含胺基酸殘基之多聚體化合物，其可採用三維構形。多肽包括(但不限於)酶、酶前驅體蛋白、調控性蛋白質、結構蛋白質、受體、核酸結合蛋白、抗體等。多肽可(但不一定)包含轉譯後修飾、非天然胺基酸、輔基及諸如此類。
如本文所用，基因之「開放閱讀框」或「ORF」係指由一系列密碼子組成之序列，該等密碼子指定該基因所編碼之蛋白質之胺基酸序列。ORF通常以起始密碼子(例如在DNA中為ATG或在RNA中為AUG)開始，且以終止密碼子(例如在DNA中為TAA、TAG或TGA，或在RNA中為UAA、UAG或UGA)結束。
「嚮導RNA」、「gRNA」及「嚮導」在本文中可互換使用，以指crRNA (亦稱為CRISPR RNA)，或crRNA與trRNA之組合(亦稱為tracrRNA)。crRNA與trRNA可締合為單一RNA分子(單一嚮導RNA，sgRNA)，或為兩個單獨的RNA分子(雙嚮導RNA，dgRNA)。「嚮導RNA」或「gRNA」係指每一類型。trRNA可為天然存在之序列或與天然存在之序列相比具有修飾或變化之trRNA序列。
如本文所用，「嚮導序列」或「嚮導區」或「靶向序列」或「間隔體」或「間隔體序列」及諸如此類係指gRNA內與靶序列互補之序列，且用於將gRNA引導至靶序列以藉由RNA引導之切口酶進行結合或修飾(例如裂解)。嚮導序列之長度可為20個核苷酸，例如在釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (亦即Spy Cas9 (亦稱為SpCas9))及相關Cas9同系物/直向同源物之情形下。亦可使用較短或較長序列作為嚮導，例如長度為15、16、17、18、19、21、22、23、24或25個核苷酸。嚮導序列之長度可為20-25個核苷酸，例如在Nme Cas9之情形下，例如長度為20、21、22、23、24或25個核苷酸。舉例而言，長度為24個核苷酸之嚮導序列可與Nme Cas9 (例如Nme2 Cas9)一起使用。
在一些實施例中，靶序列位於例如基因體基因座中或在染色體上，且與嚮導序列互補。在一些實施例中，嚮導序列與其相應靶序列之間的互補性或一致性程度可為約75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，嚮導序列與靶區可為100%互補或一致的。在其他實施例中，嚮導序列及靶區可含有至少一個錯配。舉例而言，嚮導序列及靶序列可含有1、2、3或4個錯配，其中靶序列之總長度為至少17、18、19、20或更多個鹼基對。在一些實施例中，嚮導序列及靶區可含有1-4個錯配，其中嚮導序列包含至少17、18、19、20或更多個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及靶區可含有1、2、3或4個錯配，其中嚮導序列包含20個核苷酸。在一些實施例中，例如當嚮導序列包含24個鄰接核苷酸之序列時，嚮導序列與其相應靶序列之間的互補性或一致性程度為至少80%、85%、90%或95%。在一些實施例中，嚮導序列與靶區可為100%互補或一致的。在其他實施例中，嚮導序列及靶區可含有至少一個錯配，亦即一個核苷酸不一致或不互補，此取決於參考序列。舉例而言，嚮導序列及靶序列可含有1-2個錯配，例如不超過1個錯配，其中靶序列之總長度為19、20、21、22、23或24個或更多個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及靶區可含有1-2個錯配，其中嚮導序列包含至少24個或更多個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及靶區可含有1-2個錯配，其中嚮導序列包含24個核苷酸。錯配位置為此項技術中所已知，如例如對PAM遠端錯配之容忍度往往優於PAM近端匹配所提供。其他位置處之錯配容忍度(mismatch tolerance)為此項技術中所已知(例如，參見Sternberg等人，2015, Nature:527:110-113)
如本文所用，「靶序列」或「基因體靶序列」係指正股或負股中靶基因基因體基因座中之核酸序列，其與gRNA之嚮導序列具有互補性，亦即與gRNA之嚮導序列充分互補，以允許嚮導序列與靶序列特異性結合。靶序列與嚮導序列之相互作用引導RNA引導之DNA結合劑在靶序列內結合且潛在地進行切口或裂解(取決於該劑之活性)。靶序列之具體長度以及靶序列與嚮導序列之間可能的錯配數取決於例如由gRNA引導之Cas9核酸酶之屬性(identity)。Cas蛋白之靶序列包括基因體DNA之正股及負股二者(亦即給定序列及該序列之反向互補序列)，此乃因Cas蛋白之核酸受質為雙股核酸。因此，在嚮導序列稱為「與靶序列互補」之情形下，應理解，嚮導序列可引導RNA引導之DNA結合劑(例如dCas9或受損Cas9)結合至靶序列之反向互補序列。因此，在一些實施例中，在嚮導序列結合靶序列之反向互補序列之情形下，嚮導序列與靶序列(例如不包括PAM之靶序列)之某些核苷酸一致，唯在嚮導序列中使用U取代T。
RNA引導之DNA結合劑之靶序列包括基因體DNA之正股及負股(亦即給定序列及該序列之反向互補序列)，此乃因RNA引導之DNA結合劑之核酸受質為雙股核酸。因此，在嚮導序列稱為「與靶序列互補」之情形下，應理解，嚮導序列可引導嚮導RNA結合至靶序列之反向互補序列。因此，在一些實施例中，在嚮導序列結合靶序列之反向互補序列之情形下，嚮導序列與靶序列(例如不包括PAM之靶序列)之某些核苷酸一致，唯在嚮導序列中使用U取代T。
如本文所用，「RNA引導之DNA結合劑」意指具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物，或此一複合物之DNA結合亞單元，其中DNA結合活性為序列特異性的，且取決於RNA之序列。術語RNA引導之DNA結合劑亦包括編碼此類多肽之核酸。例示性RNA引導之DNA結合劑包括Cas裂解酶/切口酶。例示性RNA引導之DNA結合劑可包括其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)，例如，若彼等劑例如經由與FokI裂解酶結構域融合進行修飾以允許DNA裂解。如本文所用，「Cas核酸酶」涵蓋Cas裂解酶及Cas切口酶。Cas裂解酶及Cas切口酶包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亞單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3亞單元及2類Cas核酸酶。如本文所用，「2類Cas核酸酶」係具有RNA引導之DNA結合活性之單鏈多肽。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A變異體)，其進一步具有RNA引導之DNA裂解酶或切口酶活性，以及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性係不活化的，例如若彼等劑經修飾以允許DNA裂解，或具有C至T去胺酶或A至G去胺酶活性。Cas切口酶包括其中Cas蛋白之RuvC或HNH結構域中之一者，使得僅單股被核酸酶裂解之核酸酶。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含去胺酶區及RNA引導之DNA切口酶，諸如Cas9切口酶。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白質及其修飾形式。Cpf1蛋白(Zetsche等人，Cell, 163: 1-13 (2015)) 亦含有RuvC樣核酸酶結構域。Zetsche之Cpf1序列係以整體引用的方式併入。例如，參見Zetsche，表S1及表S3。例如，參見Makarova等人，Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人，Molecular Cell,60:385-397 (2015)。如本文所用，遞送RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶、Cas9核酸酶或釀膿鏈球菌Cas9核酸酶或腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis) Cas9核酸酶)包括遞送多肽或mRNA。
如本文所用，術語「編輯器」或「鹼基編輯器」係指包含能夠在核酸序列(例如DNA或RNA)內對鹼基(例如A、T、C、G或U)進行修飾之多肽的劑。在一些實施例中，編輯器能夠使核酸內之鹼基去胺基。在一些實施例中，編輯器能夠使DNA分子內之鹼基去胺基。在一些實施例中，編輯器能夠使DNA中之胞嘧啶(C)去胺基。在一些實施例中，編輯器為融合蛋白，其包含與胞苷去胺酶結構域融合之RNA引導之切口酶。在一些實施例中，編輯器為融合蛋白，其包含與APOBEC3A去胺酶(A3A)融合之RNA引導之切口酶。在一些實施例中，編輯器包含與APOBEC3A去胺酶(A3A)融合之Cas9切口酶。在一些實施例中，編輯器為融合蛋白，其包含與胞苷去胺酶結構域融合之酶無活性RNA引導之DNA結合蛋白。
如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」係指嚮導RNA連同RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA結合劑(例如Cas9)。在一些實施例中，嚮導RNA將RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas9)引導至靶序列，且嚮導RNA與該靶序列雜交且該劑與該靶序列結合；在該劑為裂解酶或切口酶之情形下，結合後可進行裂解或切口。
如本文所用，術語「尿嘧啶糖苷酶抑制劑」、「尿嘧啶-DNA糖苷酶抑制劑」或「UGI」係指能夠抑制尿嘧啶-DNA糖苷酶(UDG)鹼基切除修復酶之蛋白質(例如UniPROT ID：P14739；MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFESPKKKRKVE (SEQ ID NO: 226)；或TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML (SEQ ID NO: 227))。
下文提供Cas9分子之例示性核苷酸及多肽序列。用於鑑別編碼Cas9多肽序列之替代性核苷酸序列(包括替代性天然存在變異體)之方法為此項技術中所已知。亦考慮與本文所提供之任何Cas9核酸序列或編碼胺基酸序列之核酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列。在某些實施例中，編碼Cas9胺基酸序列之核苷酸序列不為天然存在之Cas9核苷酸序列。亦考慮與本文所提供之任何Cas9胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列。在某些實施例中，Cas9胺基酸序列不為天然存在之Cas9序列。
Spy Cas9之例示性開放閱讀框AUGGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUGA (SEQ ID NO: 218)
Spy Cas9之例示性胺基酸序列MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV (SEQ ID NO: 219)
Spy Cas9之例示性開放閱讀框AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG (SEQ ID NO: 116)
帶有Hibit標籤之Spy Cas9之例示性開放閱讀框AUGGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUGA (SEQ ID NO: 117)
帶有Hibit標籤之Spy Cas9之例示性胺基酸序列MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKVSESATPESVSGWRLFKKIS (SEQ ID NO: 118)
Spy Cas9切口酶之例示性胺基酸序列MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLTGGGGSVDVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV (SEQ ID NO: 220)
Nme2Cas9之例示性開放閱讀框atgGACGGCTCCGGCGGCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCTCCGGCGGCGGCgccgccttcaagcccaaccccatcaactacatcctgggcctggacatcggcatcgcctccgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggaggagaaccccatccggctgatcgacctgggcgtgcgggtgttcgagcgggccgaggtgcccaagaccggcgactccctggccatggcccggcggctggcccggtccgtgcggcggctgacccggcggcgggcccaccggctgctgcgggcccggcggctgctgaagcgggagggcgtgctgcaggccgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagtccctgcccaacaccccctggcagctgcgggccgccgccctggaccggaagctgacccccctggagtggtccgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccggggctacctgtcccagcggaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggcgccctgctgaagggcgtggccaacaacgcccacgccctgcagaccggcgacttccggacccccgccgagctggccctgaacaagttcgagaaggagtccggccacatccggaaccagcggggcgactactcccacaccttctcccggaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgtccggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcggcccgccctgtccggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagcccgccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcggttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcggatcctggagcagggctccgagcggcccctgaccgacaccgagcgggccaccctgatggacgagccctaccggaagtccaagctgacctacgcccaggcccggaagctgctgggcctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcggtacggcaaggacaacgccgaggcctccaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatctcccgggccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagtcccccctgaacctgtcctccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttctccctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccggctgaaggaccgggtgcagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatctccttcgacaagttcgtgcagatctccctgaaggccctgcggcggatcgtgcccctgatggagcagggcaagcggtacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgccccccatccccgccgacgagatccggaaccccgtggtgctgcgggccctgtcccaggcccggaaggtgatcaacggcgtggtgcggcggtacggctcccccgcccggatccacatcgagaccgcccgggaggtgggcaagtccttcaaggaccggaaggagatcgagaagcggcaggaggagaaccggaaggaccgggagaaggccgccgccaagttccgggagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagtccaaggacatcctgaagctgcggctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtactccggcaaggagatcaacctggtgcggctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttctcccggacctgggacgactccttcaacaacaaggtgctggtgctgggctccgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaactcccgggagtggcaggagttcaaggcccgggtggagacctcccggttcccccggtccaagaagcagcggatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagtgcaacctgaacgacacccggtacgtgaaccggttcctgtgccagttcgtggccgaccacatcctgctgaccggcaagggcaagcggcgggtgttcgcctccaacggccagatcaccaacctgctgcggggcttctggggcctgcggaaggtgcgggccgagaacgaccggcaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgctccaccgtggccatgcagcagaagatcacccggttcgtgcggtacaaggagatgaacgccttcgacggcaagaccatcgacaaggagaccggcaaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgggtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcggaccctgctggccgagaagctgtcctcccggcccgaggccgtgcacgagtacgtgacccccctgttcgtgtcccgggcccccaaccggaagatgtccggcgcccacaaggacaccctgcggtccgccaagcggttcgtgaagcacaacgagaagatctccgtgaagcgggtgtggctgaccgagatcaagctggccgacctggagaacatggtgaactacaagaacggccgggagatcgagctgtacgaggccctgaaggcccggctggaggcctacggcggcaacgccaagcaggccttcgaccccaaggacaaccccttctacaagaagggcggccagctggtgaaggccgtgcgggtggagaagacccaggagtccggcgtgctgctgaacaagaagaacgcctacaccatcgccgacaacggcgacatggtgcgggtggacgtgttctgcaaggtggacaagaagggcaagaaccagtacttcatcgtgcccatctacgcctggcaggtggccgagaacatcctgcccgacatcgactgcaagggctaccggatcgacgactcctacaccttctgcttctccctgcacaagtacgacctgatcgccttccagaaggacgagaagtccaaggtggagttcgcctactacatcaactgcgactcctccaacggccggttctacctggcctggcacgacaagggctccaaggagcagcagttccggatctccacccagaacctggtgctgatccagaagtaccaggtgaacgagctgggcaaggagatccggccctgccggctgaagaagcggccccccgtgcggtag (SEQ ID NO: 221)
Nme2Cas9切口酶之例示性mRNAGGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG (SEQ ID NO: 222)
Nme2Cas9之例示性胺基酸序列MDGSGGGSPKKKRKVEDKRPAATKKAGQAKKKKGGSGGGAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVANNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSSELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLVRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKECNLNDTRYVNRFLCQFVADHILLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGKVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGAHKDTLRSAKRFVKHNEKISVKRVWLTEIKLADLENMVNYKNGREIELYEALKARLEAYGGNAKQAFDPKDNPFYKKGGQLVKAVRVEKTQESGVLLNKKNAYTIADNGDMVRVDVFCKVDKKGKNQYFIVPIYAWQVAENILPDIDCKGYRIDDSYTFCFSLHKYDLIAFQKDEKSKVEFAYYINCDSSNGRFYLAWHDKGSKEQQFRISTQNLVLIQKYQVNELGKEIRPCRLKKRPPVR (SEQ ID NO: 223)
編碼UGI之例示性mRNAGGGAGACCCAAGCUGGCUAGCUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUGUGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCGCCACCAUGGGACCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGGAGGAGGAAGCACAAACCUGUCGGACAUCAUCGAAAAGGAAACAGGAAAGCAGCUGGUCAUCCAGGAAUCGAUCCUGAUGCUGCCGGAAGAAGUCGAAGAAGUCAUCGGAAACAAGCCGGAAUCGGACAUCCUGGUCCACACAGCAUACGACGAAUCGACAGACGAAAACGUCAUGCUGCUGACAUCGGACGCACCGGAAUACAAGCCGUGGGCACUGGUCAUCCAGGACUCGAACGGAGAAAACAAGAUCAAGAUGCUGUGAUAGUCUAGACAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAACCUCGAGUCUAG (SEQ ID NO: 224)
UGI之開放閱讀框AUGGGACCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGGAGGAGGAAGCACAAACCUGUCGGACAUCAUCGAAAAGGAAACAGGAAAGCAGCUGGUCAUCCAGGAAUCGAUCCUGAUGCUGCCGGAAGAAGUCGAAGAAGUCAUCGGAAACAAGCCGGAAUCGGACAUCCUGGUCCACACAGCAUACGACGAAUCGACAGACGAAAACGUCAUGCUGCUGACAUCGGACGCACCGGAAUACAAGCCGUGGGCACUGGUCAUCCAGGACUCGAACGGAGAAAACAAGAUCAAGAUGCUGUGA (SEQ ID NO: 225)
UGI之例示性胺基酸序列MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSKRTADGSEFESPKKKRKVE (SEQ ID NO: 226)
UGI之例示性胺基酸序列TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML (SEQ ID NO: 227)
如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」係指嚮導RNA連同RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA結合劑(例如Cas9)。在一些實施例中，嚮導RNA將RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas9)引導至靶序列，且嚮導RNA與該靶序列雜交且該劑與該靶序列結合；在該劑為裂解酶或切口酶之情形下，結合後可進行雙股DNA裂解或單股DNA裂解。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示整個第二序列中X%或更多之位置與第一序列匹配，則第一序列視為「包含與第二序列具有至少X%一致性之序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，此乃因由於與第二序列之所有三個位置均匹配，故比對將得到100%一致性。RNA與DNA之間的差異(通常將尿苷交換為胸苷，或反之亦然)及核苷類似物(諸如經修飾尿苷)之存在不會在多核苷酸中造成一致性或互補性差異，只要相關核苷酸(諸如胸苷、尿苷或經修飾尿苷)具有相同的互補序列即可(例如對於所有胸苷、尿苷或經修飾尿苷均為腺苷；另一實例為胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，二者均使用鳥苷或經修飾鳥苷作為互補序列)。因此，舉例而言，序列5'-AXG (其中X為任何經修飾尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)視為與AUG 100%一致，此乃因兩者均與同一序列(5'-CAU)完全互補。例示性比對算法為此項技術中所熟知之Smith-Waterman及Needleman-Wunsch算法。熟習此項技術者將理解何種算法及參數設置適用於欲比對之給定序列對；對於通常具有類似長度及預期一致性(對於胺基酸而言＞50%或對於核苷酸而言＞75%)之序列，由EBI在www.ebi.ac.uk網路伺服器上提供的具有Needleman-Wunsch算法介面之默認設置之Needleman-Wunsch算法通常係適當的。
如本文所用，若第一序列之X%鹼基與第二序列鹼基配對，則第一序列視為與第二序列「X%互補」。舉例而言，第一序列5'AAGA3'與第二序列3'TTCT5'100%互補，且該第二序列與該第一序列100%互補。在一些實施例中，第一序列5'AAGA3'與第二序列3'TTCTGTGA5'100%互補，而該第二序列與該第一序列50%互補。
如本文所用，「mRNA」在本文中用於指完全或主要為RNA或經修飾之RNA且包含可轉譯成多肽之開放閱讀框(亦即，可作為核糖體及胺基醯化tRNA之轉譯受質)的多核苷酸。mRNA可包含磷酸酯-糖主鏈，包括核糖殘基或其類似物，例如2'-甲氧基核糖殘基。在一些實施例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈之糖基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。
如本文所用，「插入缺失」係指由多個核苷酸組成之插入/缺失突變，該等核苷酸在靶核酸中之雙股斷裂(DSB)位點處插入或缺失。如本文所用，當插入缺失形成導致插入時，該插入係在雙股斷裂位點處之隨機插入，且不由模板序列引導或不基於模板序列。
如本文所用，「靶序列」係指靶基因中與gRNA之嚮導序列具有互補性之核酸序列。靶序列與嚮導序列之相互作用引導RNA引導之DNA結合劑在靶序列內結合且潛在地進行切口或裂解(取決於該劑之活性)。
如本文所用，「多肽」係指野生型或變異體蛋白質(例如突變體、片段、融合物或其組合)。變異體多肽可具有野生型多肽之至少或約5%、10%、15%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之功能活性。在一些實施例中，變異體與野生型多肽之序列至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，變異體多肽可為過度活躍之變異體。在某些情況下，變異體具有野生型多肽之約80%至約120%、140%、160%、180%、200%、300%、400%、500%或更多之功能活性。如本文所用，「異源基因」係指作為外源性來源引入細胞內之基因(例如插入基因體基因座處，諸如安全港基因座，包括TCR基因座)。亦即，所引入之基因就其插入位點而言為異源的。自此異源基因表現之多肽稱為「異源多肽」。異源基因可為天然存在的或經工程改造的，且可為野生型或變異體。異源基因可包括不同於編碼異源多肽之序列的核苷酸序列(例如內部核糖體進入位點)。異源基因可為作為野生型或變異體(例如突變體)天然存在於基因體中之基因。舉例而言，儘管細胞含有所關注之基因(作為野生型或作為變異體)，但相同基因或其變異體可作為外源性來源引入，以例如在高度表現之基因座處表現。異源基因亦可為基因體中非天然存在之基因，或基因體中表現非天然存在之異源多肽之基因。「異源基因」、「外源基因」及「轉殖基因」可互換使用。在一些實施例中，異源基因或轉殖基因包括外源核酸序列，例如對於接受者細胞而言不為內源之核酸序列。在一些實施例中，異源基因或轉殖基因包括外源核酸序列，例如並非天然存在於接受者細胞中之核酸序列。舉例而言，異源基因就其插入位點及就其接受者細胞而言可為異源的。
「安全港」基因座為基因體內之基因座，其中可插入基因而不會對細胞造成顯著有害效應。核酸酶所靶向之供本文使用之安全港基因座的非限制性實例包括AAVS1 (PPP1 R12C)、TCR、B2M及本文所闡述之靶向敲低之基因座中之任一者，例如TNFA、IFNG、IL17A及IL6基因體基因座。在一些實施例中，在靶向敲低之一或多個基因座處之插入(諸如TRC基因，例如TRAC基因)對於同種異體細胞係有利的。其他適宜安全港基因座為此項技術中所已知。
II. 組合物 A. 靶向受體在一些實施例中，包含編碼dmTGFB1分子之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)的經工程改造之T細胞進一步包含向細胞中插入編碼靶向受體之異源序列，視情況進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)及/或向細胞中插入編碼調控性T細胞促進分子之異源序列，其各自處於啟動子序列之控制下。編碼靶向受體之序列處於啟動子序列(例如內源啟動子或異源啟動子)之控制下。在某些實施例中，調控性T細胞促進分子包含IL10或CTLA4。在某些實施例中，調控性T細胞促進分子包含IL10及CTLA4。
在一些實施例中，靶向受體為嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)或細胞表面分子之受體，該細胞表面分子經由內部信號傳導結構域中之至少一個跨膜結構域可操作地連接，該內部信號傳導結構域在結合細胞外受體部分後能夠活化T細胞。在一些實施例中，靶向受體可為存在於細胞(例如T細胞)表面上，以允許細胞結合至靶位點(例如生物體中之特定細胞或組織)之受體。靶向受體無需為抗原受體，例如，靶向受體可為能夠靶向整聯蛋白之RGD肽。在一些實施例中，靶向受體靶向選自由以下組成之群的分子：MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)及MHC I類HLA-A (HLA-A*02)。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；編碼以下各項之插入序列：dmTGFB1、IL10、CTLA4及靶向受體(例如CAR，例如靶向MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02)之CAR)。
在一些實施例中，將編碼靶向受體之序列併入至表現構築體中。在一些實施例中，包含編碼靶向受體之序列的表現構築體進一步包含編碼調控性T細胞促進分子之序列，例如編碼靶向受體之序列及編碼調控性T細胞促進分子之序列併入至同一表現構築體中。在一些實施例中，包含編碼靶向受體之序列的表現構築體並不進一步包含編碼調控性T細胞促進分子之序列，例如編碼調控性T細胞促進分子之序列併入至單獨的表現構築體中。在一些實施例中，包含編碼靶向受體之序列的表現構築體為游離型表現構築體。在一些實施例中，將編碼靶向受體之序列插入至基因體中，例如靶向或非靶向插入。
在一些實施例中，可將編碼靶向受體之序列插入至選自以下之位點中：TCR基因座(例如TRAC基因座)、TNF基因座、IFNG基因座、IL17A基因座、IL6基因座、IL2基因座或腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)基因座。
在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，經工程改造之T細胞包含藉由基因編輯插入之編碼靶向受體之序列。
在一些實施例中，T細胞群體包含經工程改造以包含以下之T細胞：編碼dmTGFB1之插入序列、對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；編碼調控性T細胞促進分子之插入序列，及編碼靶向受體(例如CAR)之插入序列。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞經工程改造以包含編碼靶向受體之插入序列。應理解，可使用此項技術中已知之選擇方法自具有靶向受體之細胞群體中富集T細胞群體。
在一些實施例中，本文揭示藉由使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑及包含靶向受體(例如CAR)核酸以例如製備經工程改造之T細胞的構築體(例如供體構築體或模板)，在T細胞內(例如在T細胞或T細胞群體之基因體基因座內)引入或插入靶向受體(例如CAR)核酸而進行工程改造之T細胞。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑及包含靶向受體(例如CAR)核酸之構築體(例如供體)，自T細胞或T細胞群體之基因體基因座表現靶向受體(例如CAR)而進行工程改造之T細胞。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)在T細胞或T細胞群體之基因體內誘導斷裂(例如雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(切口))以供插入靶向受體(例如CAR)而進行工程改造之T細胞。亦提供藉由該等方法製得之細胞及細胞群體。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠將靶向特異性賦予包含該靶向受體(例如CAR)之經工程改造之T細胞，例如特定細胞、組織或器官。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向胃腸系統，例如靶向受體為靶向MAdCAM-1之CAR，例如用於抑制諸如發炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克隆氏病等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向發炎組織，例如靶向受體為靶向TNFA之CAR，例如用於抑制諸如發炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克隆氏病等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向發炎組織及/或經活化之免疫細胞，例如靶向受體為靶向CD70之CAR，例如用於抑制諸如發炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克隆氏病等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向內皮細胞，例如靶向受體為靶向CEACAM6之CAR，例如用於抑制諸如克隆氏病等病症中之免疫反應，包括發炎。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向包含內皮細胞之組織，例如靶向受體為靶向VCAM-1之CAR，例如用於抑制諸如克隆氏病及多發性硬化症等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，CAR能夠使經工程改造之T細胞靶向滑膜組織，例如靶向受體為靶向瓜胺酸化波形蛋白之CAR，例如用於抑制諸如類風濕性關節炎等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向神經組織，例如靶向受體為靶向MBP、MOG或PLP1之CAR，例如用於抑制諸如多發性硬化症等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向B細胞，例如靶向受體為靶向CD19之CAR，例如用於抑制諸如多發性硬化症及全身性紅斑狼瘡等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向B細胞，例如靶向受體為靶向CD20之CAR，例如用於抑制諸如多發性硬化症及全身性紅斑狼瘡等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向表現TNFSF7之免疫細胞，包括(但不限於)經活化之T淋巴球、B淋巴球、樹突細胞及/或NK細胞，例如CAR靶向TNFSF7，例如用於抑制諸如克隆氏病、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑狼瘡或多發性硬化症等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向包含成熟B淋巴球之組織，例如靶向受體為靶向TNFRSF17之CAR，例如用於抑制諸如全身性紅斑狼瘡等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)靶向SCL2A2。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)靶向DPP6。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)靶向GAD2。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)靶向DSG3。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)靶向MHC I類HLA-A (HLA-A*02)。
其他CAR靶標(例如發炎性抗原)為此項技術中所已知。例如，參見WO2020092057A1，其內容係以全文併入本文中。在一些實施例中，可藉由偵測經工程改造之T細胞、經工程改造之T細胞群體、所關注組織、體液或包含經工程改造之T細胞之組織培養基中蛋白質或mRNA之量來評價插入。在一些實施例中，藉由基因編輯之插入可藉由序列、例如次世代定序(NGS)來評價。靶向受體(例如CAR)之蛋白質及mRNA表現之分析在本文中予以闡述，且為此項技術中所已知。
在靶向受體(例如CAR)之靶標亦存在於細胞(例如免疫細胞或T細胞)之表面上的本文所揭示之實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體可進一步包含對編碼該靶標之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。
在某些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含兩種或更多種處於啟動子控制下之異源編碼序列，例如dmTGFB1、調控性T細胞促進分子及靶向受體。在某些實施例中，每一異源編碼序列處於單獨啟動子之控制下。在某些實施例中，兩種異源編碼序列處於同一啟動子之控制下。在某些實施例中，兩種或更多種異源編碼序列處於同一啟動子之控制下。在某些實施例中，當經工程改造之T細胞或T細胞群體包含三種或更多種處於啟動子控制下之異源編碼序列(例如dmTGFB1、調控性T細胞促進分子及靶向受體)時，每一異源序列各自獨立地處於單獨啟動子之控制下或處於控制一種以上異源編碼序列之表現的啟動子之控制下。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體不包括異源靶向受體。
B. 經工程改造之T細胞本文提供經工程改造以包含修飾之T細胞及T細胞群體，該修飾包含向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，包含處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)的T細胞經進一步工程改造，以包含對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)及/或向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列，以及其組合物及用途。在一些實施例中，調控性T細胞促進分子係選自IL10、CTLA4、TIGIT、IDO1、ENTPD1、NT5E、IL22、AREG、IL35、GARP、CD274、FOXP3、IKZF2、EOS、IRF4、LEF1、BACH2及IL2RA。
在一些實施例中，包含處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1分子之異源序列的T細胞或T細胞群體經進一步工程改造，以包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)及向細胞中插入各自處於啟動子序列控制下的編碼兩種或更多種調控性T細胞促進分子之異源序列。舉例而言，經工程改造之T細胞包含處於第一啟動子控制下的編碼第一調控性T細胞促進分子之第一異源序列及處於第二啟動子控制下的編碼第二調控性T細胞促進分子之第二異源序列。第一啟動子及第二啟動子可為相同啟動子或不同啟動子。在某些實施例中，編碼dmTGFB1分子之異源序列處於控制調控性T細胞促進分子之表現的啟動子序列之控制下。在某些實施例中，編碼dmTGFB1分子之異源序列不處於控制調控性T細胞促進分子之表現的啟動子序列之控制下。在某些實施例中，編碼dmTGFB1分子之異源序列處於控制靶向受體之表現的啟動子序列之控制下。在某些實施例中，編碼dmTGFB1分子之異源序列不處於控制靶向受體之表現的啟動子序列之控制下。
在一些實施例中，包含處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)的T細胞或T細胞群體經進一步工程改造，以包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼IL10之異源序列；及向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼CTLA4之異源序列。
在一些實施例中，包含處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)的T細胞或T細胞群體經進一步工程改造，以包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼IL10之異源序列；及向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼CTLA4之異源序列，且展現出天然存在之調控性T細胞(nTreg)的至少一種抑制活性，例如在活體外或活體內分析(例如GvHD之動物模型)中抑制免疫反應或生物標記物。
在一些實施例中，將編碼dmTGFB1或一或多種調控性T細胞促進分子之異源序列併入至表現構築體中。在一些實施例中，可將編碼兩種或更多種分子之異源序列併入至兩種或更多種單獨的表現構築體中。舉例而言，編碼dmTGFB1之第一異源序列提供於第一表現構築體中，編碼調控性T細胞促進分子之第二異源序列提供於第二單獨的表現構築體中，且編碼調控性T細胞促進分子之第三異源序列提供於第三單獨的表現構築體中。在替代性實例中，編碼dmTGFB1之第一異源序列與編碼調控性T細胞促進分子之第二異源序列及編碼調控性T細胞促進分子之第三異源序列提供於同一表現構築體中。在一些實施例中，一或多種表現構築體為游離型表現構築體。在一些實施例中，將一或多種異源序列插入至基因體中，例如靶向或非靶向插入。
在某些實施例中，對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)包括對TGFBR2之修飾。在某些實施例中，對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)包括對IFNG之修飾。在某些實施例中，對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)包括對TNFA之修飾。
在一些實施例中，可將編碼dmTGFB1或調控性T細胞促進分子之序列插入至選自以下之位點中：TCR基因座，例如TRAC基因座；TNF基因座、IFNG基因座、IL17A基因座、IL6基因座、IL2基因座或腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)基因座。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體經工程改造以包含修飾(例如插入編碼dmTGFB1之序列)，例如藉由基因編輯，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼dmTGFB1分子之插入序列。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞群體包含對例如藉由基因編輯所產生的編碼dmTGFB1之插入序列之修飾，且例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼dmTGFB1分子之插入序列，進一步包含藉由基因編輯在TGFBR2序列中之修飾(例如敲低)，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞在內源TGFBR2序列中包含插入、缺失或取代。在一些實施例中，如例如藉由ELISA或流式細胞術所測定，與適宜對照(例如其中TGFBR2基因未經修飾)相比，TGFBR2 (全長野生型蛋白質或mRNA)之表現減少至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，或減少至低於分析之偵測極限。針對例如T細胞群體中之TGFBR2蛋白及mRNA表現之分析為此項技術中所已知。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞群體包含對例如藉由基因編輯所產生的編碼dmTGFB1之插入序列之修飾，且例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼dmTGFB1分子之插入序列，進一步包含藉由基因編輯在TNFA序列中之修飾(例如敲低)，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞在內源TNFA序列中包含插入、缺失或取代。在一些實施例中，如例如藉由ELISA或流式細胞術所測定，與適宜對照(例如其中TNFA基因未經修飾)相比，TNFA (全長野生型蛋白質或mRNA)之表現減少至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，或減少至低於分析之偵測極限。針對例如T細胞群體中之TNFA蛋白及mRNA表現之分析為此項技術中所已知。在某些實施例中，如例如使用定製U-PLEX生物標記物套組(Meso Scale Diagnostics，目錄號K15067L-2)根據製造商說明書所測定，敲低TNFA使得TNFA水準為2500 pg/ml或更低。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞群體包含修飾(例如插入編碼dmTGFB1之序列)，例如藉由基因編輯，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼dmTGFB1分子之插入序列，進一步包含藉由基因編輯在IFNG序列中之修飾(例如敲低)，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞在內源IFNG序列中包含插入、缺失或取代。在一些實施例中，如例如藉由ELISA或流式細胞術所測定，與適宜對照(例如其中IFNG基因未經修飾)相比，IFNG (全長野生型蛋白質或mRNA)之表現減少至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，或減少至低於分析之偵測極限。針對例如T細胞群體中之IFNG蛋白及mRNA表現之分析為此項技術中所已知。在某些實施例中，如例如使用定製U-PLEX生物標記物套組(Meso Scale Diagnostics，目錄號K15067L-2)根據製造商說明書所測定，敲低IFNG使得IFNG水準為300,000 pg/ml或更低。
在一些實施例中，敲低基因(例如TGFBR2、TNFA或IFNG)之表現的修飾為插入、缺失或取代中之一或多者。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含修飾(例如插入編碼dmTGFB1之序列)，例如藉由基因編輯，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼dmTGFB1分子之插入序列，進一步包含編碼調控性T細胞促進分子之插入序列，例如藉由基因編輯，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼調控性T細胞促進分子之插入序列。在一些實施例中，如例如藉由ELISA或流式細胞術所測定，與適宜對照(例如，其中未插入調控性T細胞促進分子基因)相比，插入之調控性T細胞促進分子(例如IL10)使得蛋白質或mRNA之表現在統計學上顯著增加。在一些實施例中，經工程改造之T細胞包含藉由基因編輯插入之編碼IL10之序列，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼IL10之插入序列。在一些實施例中，與適宜對照(例如其中調控性T細胞促進分子)相比，編碼IL10之插入序列使得蛋白質或mRNA之表現在統計學上顯著增加。針對例如T細胞群體中IL10蛋白及mRNA表現之分析為此項技術中所已知，例如ELISA及流式細胞術。在某些實施例中，如例如使用定製U-PLEX生物標記物套組(Meso Scale Diagnostics，目錄號K15067L-2)根據製造商說明書所測定，IL10之水準為至少300 pg/ml。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含修飾(例如插入編碼dmTGFB1之序列)，例如藉由基因編輯，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼dmTGFB1分子之插入序列，進一步包含編碼CTLA4之插入序列，例如藉由基因編輯，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼CTLA4之插入序列。在一些實施例中，與適宜對照(例如其中調控性T細胞促進分子)相比，編碼CTLA4之插入序列使得蛋白質或mRNA之表現在統計學上顯著增加。針對例如T細胞群體中CTLA4蛋白及mRNA表現之分析在本文中予以闡述且為此項技術中所已知，例如ELISA及流式細胞術。
在一些實施例中，T細胞群體包含經工程改造以包含修飾(例如插入編碼dmTGFB1之序列)的T細胞，例如藉由基因編輯，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼dmTGFB1分子之插入序列，經進一步工程改造以包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)； 對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及編碼調控性T細胞促進分子之插入序列。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% (例如在所用分析之偵測極限內)之T細胞經工程改造以包含異源調控性T細胞促進分子。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞經工程改造以包含對編碼TGFBR2之序列之修飾(例如敲低)。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少50%、55%、60%、65%, 至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞經工程改造以包含對編碼TNFA之序列之修飾(例如敲低)。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞經工程改造以包含對編碼IFNG之序列之修飾(例如敲低)。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞經工程改造以包含編碼調控性T細胞促進分子之插入序列。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞經工程改造以包含編碼IL10之插入序列。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞經工程改造以包含編碼CTLA4之插入序列。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體經工程改造以包含修飾(例如插入編碼dmTGFB1之序列)，例如藉由基因編輯，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含編碼dmTGFB1分子之插入序列，進一步包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及插入之處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列，進一步包含對編碼以下各項之內源核酸序列之修飾：介白素17A (IL17A)、介白素6 (IL6)、介白素2 (IL2)、穿孔蛋白1 (PRF1)、顆粒酶A (GZMA)、顆粒酶B (GZMB)、天然殺手細胞顆粒蛋白7 (NKG7)、Fas配位體 (FasL，NF超家族，成員6)、雷諾丁受體2 (RYR2)及群落刺激因子2 (CSF2)，其中該修飾分別敲低該IL17A、該IL6、該IL2、該PRF1、該GZMA、該GZMB、該NKG7、該FASL、該RYR2或該CSF2之表現，對內源核酸序列之進一步修飾包含對IL17A之修飾。
在一些實施例中，使用基因編輯系統、例如使用RNA引導之DNA結合劑對T細胞或T細胞群體進行工程改造。在一些實施例中，使用CRISPR/Cas基因編輯系統對T細胞進行工程改造。在一些實施例中，使用CRISPR/Cas II型基因編輯系統、例如使用Cpf1對T細胞進行工程改造。在一些實施例中，使用CRISPR/Cas9基因編輯系統、例如使用SpyCas9對T細胞進行工程改造。本文提供例示性Cas9序列。
在一些實施例中，使用特異性靶向TGFBR2、IFNG及TNFA基因內之位點的嚮導RNA對T細胞或T細胞群體進行工程改造，以提供對TGFBR2、IFNG及TNFA基因之敲低。表1及表2中分別提供用於敲低IFNG及TNFA之例示性序列，以及每一所列示嚮導序列之靶標之基因體坐標。表3中提供用於敲低TGFBR2之例示性序列，以及每一所列示嚮導序列之靶標之基因體坐標。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含使用本文所揭示之嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑敲低之TGFBR2、IFNG及TNFA基因。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用本文所揭示之嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)在T細胞之TGFBR2、IFNG及TNFA基因內誘導斷裂(例如雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(切口))而進行工程改造之T細胞。該等方法可活體外或離體使用，例如用於製造用以抑制免疫反應(包括發炎及自體免疫)之細胞產品。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA介導RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)在TGFBR2基因內本文所闡述之位點處進行的靶標特異性切割。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA介導RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)在IFNG基因內本文所闡述之位點處進行的靶標特異性切割。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA介導RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)在TNFA基因內本文所闡述之位點處進行的靶標特異性切割。應瞭解，在一些實施例中，嚮導RNA包含結合至該等區域或能夠結合至該等區域之嚮導序列。
提供在選自表1中所列示之彼等基因體坐標處包含遺傳修飾的經工程改造之T細胞或T細胞群體，例如，在IFNG內之任何所列示之基因體範圍內包含插入缺失或取代突變之細胞。亦提供在選自表2中所列示之彼等基因體坐標處包含遺傳修飾的經工程改造之T細胞，例如，在TNFA內之任何所列示之基因體範圍內包含插入缺失或取代突變之細胞。在一些實施例中，經工程改造之T細胞將包含在選自表1之基因體坐標區域內之修飾及在選自表2之基因體坐標區域內之修飾。提供在選自表3中所列示之彼等基因體坐標處包含遺傳修飾的經工程改造之T細胞或T細胞群體，例如，在TGFBR2內之任何所列示之基因體範圍內包含插入缺失或取代突變之細胞。
在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含與選自表1、表2或表3中之序列之群的序列95%、90%、85%、80%或75%一致之嚮導序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含與選自表1、表2或表3中之序列之群的序列95%、90%、85%、80%或75%一致之嚮導序列。
在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含具有選自由以下組成之群的序列之至少15、16、17、18、19或20個鄰接核苷酸之嚮導序列：與選自表1中之序列之群的序列95%、90%、85%、80%或75%一致之序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含具有選自表1中之序列之群的序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸之嚮導序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含與選自表1中之序列之群的序列95%、90%、85%、80%或75%一致之嚮導序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含作為選自表1中之序列之群的序列之17、18、19或20個鄰接核苷酸之嚮導序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含選自表1中之序列之群的嚮導序列。
在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含具有選自由以下組成之群的序列之至少15、16、17、18、19或20個鄰接核苷酸之嚮導序列：與選自表2中之序列之群的序列95%、90%、85%、80%或75%一致之序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含具有選自表2中之序列之群的序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸之嚮導序列在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含與選自表2中之序列之群的序列95%、90%、85%、80%或75%一致之嚮導序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含作為選自表2中之序列之群的序列之17、18、19或20個鄰接核苷酸之嚮導序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含選自表2中之序列之群的嚮導序列。
在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含具有選自由以下組成之群的序列之至少15、16、17、18、19或20個鄰接核苷酸之嚮導序列：與選自表3中之序列之群的序列95%、90%、85%、80%或75%一致之序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含具有選自表3中之序列之群的序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸之嚮導序列在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含與選自表2中之序列之群的序列95%、90%、85%、80%或75%一致之嚮導序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含作為選自表3中之序列之群的序列之17、18、19或20個鄰接核苷酸之嚮導序列。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含選自表3中之序列之群的嚮導序列。
除非另有註明，否則基因體坐標始終係根據人類參考基因體hg38。
在某些實施例中，包括含有靶向IFNG之嚮導序列之嚮導RNA及含有靶向TNFA之嚮導序列之嚮導RNA。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞可為經工程改造之自體T細胞或經工程改造之同種異體T細胞。在自體T細胞療法中，T細胞可自源於將用經工程改造之T細胞治療的同一患者之T細胞工程改造。在一些實施例中，經工程改造之自體T細胞可藉由自患者中提取T細胞且根據本文所闡述之修飾對該等T細胞進行修飾來產生，且將該等經工程改造之自體T細胞重新引入同一患者中。在一些實施例中，可為每一個別患者產生經工程改造之自體T細胞，且在逐個患者之基礎上投與。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞可為經工程改造之同種異體T細胞。在同種異體T細胞療法中，T細胞可自供體細胞工程改造而來，且接著使用「現成(off-the-shelf)」方法投與給一或多名患者。
經工程改造之同種異體T細胞在一些實施例中，本文所闡述之經工程改造之T細胞為經工程改造之同種異體T細胞。因此，本文提供用於以下之組合物及方法：改變(例如抑制或降低)基因靶標或由基因靶標編碼之蛋白質的表現及/或功能(例如功能形式之表現水準)，藉此改良移植細胞、例如如本文所闡述之經工程改造之T細胞、例如用於免疫療法之同種異體經工程改造之T細胞之功效(例如藉由減少或消除不期望之免疫原性(諸如宿主抗移植物反應或移植物抗宿主反應))、功能、增殖、刺激或存活，以產生「現成」T細胞。
使用供體(同種異體)細胞之「現成」療法消除回收並修飾患者自身淋巴球之需要。然而，同種異體T細胞可引起不期望之免疫反應，或壽命較短。通常，同種異體細胞之免疫排斥係由供體與接受者之間的主要組織相容性複合物(MHC)分子之錯配引起。例如，個體之間的MHC等位基因之輕微差異可導致接受者中之T細胞活化。在T細胞發育期間，個體之T細胞譜系對自身MHC分子耐受，但識別另一個體之MHC分子之T細胞可在循環中持續存在且稱為同種異體反應性T細胞。同種異體反應性T細胞可例如因體內存在表現MHC分子之另一個體細胞而活化，從而引起例如移植物抗宿主病及移植排斥。例如，亦參見WO/2023/245108，其內容在此係以全文引用的方式併入。
在一些實施例中，基因靶標為同種異體T細胞蛋白，諸如HLA-A、HLA-B、TRAC或CIITA。不受理論束縛，據信抑制或消除同種異體T細胞靶標之水準或同種異體T細胞靶基因靶標之表現水準(例如，經由改變基因)可藉由減少或消除移植物抗宿主反應、宿主抗移植物反應來改良細胞(例如移植細胞，例如經工程改造之同種異體T細胞)之功能，或將使該移植細胞對免疫抑制療法產生抗性。
在一些實施例中，本文所闡述之組合物及方法可藉由改變主要組織相容性複合物之組分(例如HLA蛋白，例如HLA-A及/或HLA-B)之基因而用於改良細胞(例如本文所闡述之同種異體經工程改造之T細胞)之功能(例如藉由減少或消除不期望之免疫原性(諸如宿主抗移植物反應或移植物抗宿主反應))、存活、增殖及/或功效。儘管不希望受理論束縛，但認為減少錯配(例如與接受細胞療法之個體類型不匹配之錯配) HLA蛋白(或組分)之表現或不表現該蛋白因消除宿主T細胞受體對錯配(例如同種異體)移植物組織之識別及反應而減少或消除宿主抗移植物病。因此，此方法可用於產生「現成」T細胞(Torikai等人，2012 Blood 119, 5697-5705)。
在一些實施例中，本文所闡述之組合物及方法可藉由改變T細胞受體(TCR)之組分(例如TRAC)之基因而用於改良細胞(例如本文所闡述之同種異體經工程改造之T細胞)之功能(例如藉由減少或消除不期望之免疫原性(諸如宿主抗移植物反應或移植物抗宿主反應))、存活、增殖及/或功效。儘管不希望受理論束縛，但認為減少功能性T細胞受體組分之表現或不表現該等組分減少或消除該細胞表面上存在之TCR，從而藉由消除T細胞受體對宿主組織之識別及反應來減少或預防移植物抗宿主病。因此，此方法可用於產生「現成」T細胞。
在一些實施例中，本文所闡述之組合物及方法可藉由改變編碼調控主要組織相容性複合體之一或多種組分(例如CIITA)之表現的蛋白質之基因而用於改良細胞(例如本文所闡述之同種異體經工程改造之T細胞)之功能(例如藉由減少或消除不期望之免疫原性(諸如宿主抗移植物反應或移植物抗宿主反應))、存活、增殖及/或功效。儘管不希望受理論束縛，但據信，減少或消除MHC II類表現調控子(例如CIITA)之表現將減少或消除同種異體細胞上MHC II類分子之表現，從而減少或消除錯配(例如與接受細胞療法之個體類型不匹配之錯配) MHC II類蛋白(或組分)之表現，從而藉由例如消除宿主T細胞受體對錯配(例如同種異體)移植物組織(例如如本文所闡述之同種異體經工程改造之T細胞)之識別及反應來減少或消除宿主抗移植物病。因此，此方法可用於產生「現成」T細胞。
在一些實施例中，減少或消除一或多種MHC I類分子及一或多種MHC II分子例如在T細胞中、例如在如本文所闡述之同種異體經工程改造之T細胞中之表現，以進一步減少或消除投與細胞後之宿主抗移植物病反應可能是有益的。因此，在本揭示案之細胞及方法之實施例中，可使細胞與包含針對HLA-A或HLA-B之gRNA分子(例如如本文所闡述)之本揭示案組合物(例如包含gRNA及Cas9分子之組合物)接觸(例如，使得該細胞中一或多種MHC I類分子之表現減少或消除)，及與包含針對CIITA之gRNA分子(例如如本文所闡述)之本揭示案組合物(例如包含gRNA及Cas9分子之組合物)接觸(例如，使得一或多種MHC II類分子之表現減少或消除)。在本揭示案之細胞及方法之實施例中，亦可使細胞與包含針對TCR之組分(例如針對TRAC)之gRNA分子(例如如本文所闡述)之本揭示案組合物(例如包含gRNA及Cas9分子之組合物)接觸(例如，使得T細胞受體(例如TCR之一或多種組分)之表現減少或消除)。在一些實施例中，本揭示案細胞之TCR表現減少或消除(例如，如藉由流式細胞術所偵測)、一或多種MHC I類分子之表現減少或消除(例如，如藉由流式細胞術所偵測)，且一或多種MHC II類分子之表現減少或消除(例如，如藉由流式細胞術所偵測)。
在一些實施例中，「現成」同種異體T細胞及同種異體T細胞群體經工程改造以包含修飾，該修飾包含：向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼IL10之異源序列；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼CTLA4之異源序列；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼HLA-A之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼HLA-B之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼CIITA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及對編碼TRAC之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。在一些實施例中，「現成」同種異體T細胞及同種異體T細胞群體進一步包含如本文所闡述之靶向受體。
在一些實施例中，「現成」同種異體T細胞及同種異體T細胞群體經工程改造以包含修飾，該修飾包含：向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼IL10之異源序列；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼CTLA4之異源序列；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼HLA-A之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼HLA-B之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼CIITA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及對編碼TRAC之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。在一些實施例中，「現成」同種異體T細胞及同種異體T細胞群體進一步包含如本文所闡述之靶向受體。
在一些實施例中，「現成」同種異體T細胞及同種異體T細胞群體經工程改造以包含修飾，該修飾包含：向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼IL10之異源序列；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼CTLA4之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼HLA-A之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼HLA-B之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼CIITA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及對編碼TRAC之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。在一些實施例中，「現成」同種異體T細胞及同種異體T細胞群體進一步包含如本文所闡述之靶向受體。
在一些實施例中，「現成」同種異體T細胞及同種異體T細胞群體為CD3+細胞。在一些實施例中，「現成」同種異體CD3+ T細胞及同種異體CD3+ T細胞群體可首先經工程改造以包含修飾，該修飾包含以下中之一或多者：對編碼HLA-A之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼HLA-B之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼CIITA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及對編碼TRAC之內源核酸序列之修飾(例如敲低)，接著針對CD4+ T細胞或CD8+ T細胞對該等修飾進行選擇，且接著進一步經修飾以產生本文所闡述之經工程改造之T細胞。對不同修飾進行工程改造之順序可變化，例如，使得「現成」同種異體CD3+ T細胞及同種異體CD3+ T細胞群體經工程改造以包含諸如以下等修飾：(a) 向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼IL10之異源序列；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼CTLA4之異源序列；及對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；(b) 向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼IL10之異源序列；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼CTLA4之異源序列；及對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；或(c) 向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼IL10之異源序列；向細胞中插入處於啟動子控制下的編碼CTLA4之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)，且隨後經工程改造以包含靶向受體。
在其他實施例中，「現成」同種異體CD3+ T細胞及同種異體CD3+ T細胞群體經工程改造以包含靶向受體，且接著隨後經工程改造以包含上文所闡述之修飾(a)、(b)或(c)。
表1：用於敲低IFNG之人類嚮導序列及染色體坐標
例示性基因體坐標(hg38) 外顯子 股 嚮導序列(5'至3') SEQ ID NO
chr12:68155336-68155356 4 + GCAGGCAGGACAACCAUUAC 1
chr12:68155337-68155357 4 + CAGGCAGGACAACCAUUACU 2
chr12:68155374-68155394 4 - AGGAGUCAGAUGCUGUUUCG 3
chr12:68155394-68155414 4 - CUAAAACAGGGAAGCGAAAA 4
chr12:68155398-68155418 4 + CGCUUCCCUGUUUUAGCUGC 5
chr12:68155406-68155426 4 - UGUCGCCAGCAGCUAAAACA 6
chr12:68155407-68155427 4 - CUGUCGCCAGCAGCUAAAAC 7
chr12:68155420-68155440 4 + GCGACAGUUCAGCCAUCACU 8
chr12:68155435-68155455 4 - ACAUGAACUCAUCCAAGUGA 9
chr12:68155447-68155467 4 + GUUCAUGUAUUGCUUUGCGU 10
chr12:68157972-68157992 3 + GACAUUCAUGUCUUCCUUGA 11
chr12:68157989-68158009 3 + UGAUGGUCUCCACACUCUUU 12
chr12:68157989-68158009 3 - AAAGAGUGUGGAGACCAUCA 13
chr12:68158001-68158021 3 - CCAGAGCAUCCAAAAGAGUG 14
chr12:68158215-68158235 2 - GAUAAUGGAACUCUUUUCUU 15
chr12:68158230-68158250 2 - CAUUCAGAUGUAGCGGAUAA 16
chr12:68158237-68158257 2 - UGCAGGUCAUUCAGAUGUAG 17
chr12:68159524-68159544 1 + CUUCUUUUACAUAUGGGUCC 18
chr12:68159559-68159579 1 - UGCAUCGUUUUGGGUUCUCU 19
chr12:68159568-68159588 1 - UUUCAGCUCUGCAUCGUUUU 20
chr12:68159569-68159589 1 - UUUUCAGCUCUGCAUCGUUU 21
表2：用於敲低TNFA之人類嚮導序列及染色體坐標
例示性基因體坐標(hg38) 外顯子 股 嚮導序列(5'至3') SEQ ID NO
chr6:31575742-31575762 1 + UGAGCACUGAAAGCAUGAUC 22
chr6:31575749-31575769 1 + UGAAAGCAUGAUCCGGGACG 23
chr6:31575755-31575775 1 + CAUGAUCCGGGACGUGGAGC 24
chr6:31575781-31575801 1 - CUUCUUGGGGAGCGCCUCCU 25
chr6:31575783-31575803 1 + GAGGCGCUCCCCAAGAAGAC 26
chr6:31575784-31575804 1 + AGGCGCUCCCCAAGAAGACA 27
chr6:31575785-31575805 1 + GGCGCUCCCCAAGAAGACAG 28
chr6:31575786-31575806 1 + GCGCUCCCCAAGAAGACAGG 29
chr6:31575794-31575814 1 + CAAGAAGACAGGGGGGCCCC 30
chr6:31575794-31575814 1 - GGGGCCCCCCUGUCUUCUUG 31
chr6:31575796-31575816 1 - CUGGGGCCCCCCUGUCUUCU 32
chr6:31575813-31575833 1 - AAGCACCGCCUGGAGCCCUG 33
chr6:31575814-31575834 1 - CAAGCACCGCCUGGAGCCCU 34
chr6:31575823-31575843 1 - GCUGAGGAACAAGCACCGCC 35
chr6:31575842-31575862 1 + CCUCUUCUCCUUCCUGAUCG 36
chr6:31575846-31575866 1 + UUCUCCUUCCUGAUCGUGGC 37
chr6:31575853-31575873 1 - GGCGCCUGCCACGAUCAGGA 38
chr6:31575857-31575877 1 - UGGUGGCGCCUGCCACGAUC 39
chr6:31575888-31575908 1 + CUGCUGCACUUUGGAGUGAU 40
chr6:31575890-31575910 1 - CGAUCACUCCAAAGUGCAGC 41
chr6:31575898-31575918 1 + UUGGAGUGAUCGGCCCCCAG 42
chr6:31575899-31575919 1 + UGGAGUGAUCGGCCCCCAGA 43
chr6:31575917-31575937 1 - AGGCACUCACCUCUUCCCUC 44
chr6:31576538-31576558 2 - UGAUUAGAGAGAGGUCCCUG 45
chr6:31576539-31576559 2 - CUGAUUAGAGAGAGGUCCCU 46
chr6:31576540-31576560 2 - GCUGAUUAGAGAGAGGUCCC 47
chr6:31576544-31576564 2 + CCUCUCUCUAAUCAGCCCUC 48
chr6:31576547-31576567 2 - CCAGAGGGCUGAUUAGAGAG 49
chr6:31576550-31576570 2 + UCUAAUCAGCCCUCUGGCCC 50
chr6:31576562-31576582 2 - UACUGACUGCCUGGGCCAGA 51
chr6:31576563-31576583 2 - UUACUGACUGCCUGGGCCAG 52
chr6:31576570-31576590 2 - GAGACACUUACUGACUGCCU 53
chr6:31576571-31576591 2 - GGAGACACUUACUGACUGCC 54
chr6:31576785-31576805 3 - GGGCUACAGGCUUGUCACUC 55
chr6:31576786-31576806 3 - UGGGCUACAGGCUUGUCACU 56
chr6:31576798-31576818 3 - UUACCUACAACAUGGGCUAC 57
chr6:31576805-31576825 3 - AGAGCUCUUACCUACAACAU 58
chr6:31576806-31576826 3 - CAGAGCUCUUACCUACAACA 59
chr6:31577110-31577130 4 + UCCAGCAAACCCUCAAGCUG 60
chr6:31577112-31577132 4 + CAGCAAACCCUCAAGCUGAG 61
chr6:31577122-31577142 4 - GGAGCUGCCCCUCAGCUUGA 62
chr6:31577123-31577143 4 - UGGAGCUGCCCCUCAGCUUG 63
chr6:31577136-31577156 4 + AGCUCCAGUGGCUGAACCGC 64
chr6:31577137-31577157 4 + GCUCCAGUGGCUGAACCGCC 65
chr6:31577143-31577163 4 - UGGCCCGGCGGUUCAGCCAC 66
chr6:31577152-31577172 4 + CCGCCGGGCCAAUGCCCUCC 67
chr6:31577155-31577175 4 - CCAGGAGGGCAUUGGCCCGG 68
chr6:31577159-31577179 4 + GCCAAUGCCCUCCUGGCCAA 69
chr6:31577163-31577183 4 - GCCAUUGGCCAGGAGGGCAU 70
chr6:31577164-31577184 4 + UGCCCUCCUGGCCAAUGGCG 71
chr6:31577170-31577190 4 - GCUCCACGCCAUUGGCCAGG 72
chr6:31577173-31577193 4 - UCAGCUCCACGCCAUUGGCC 73
chr6:31577178-31577198 4 - AUCUCUCAGCUCCACGCCAU 74
chr6:31577185-31577205 4 + GGAGCUGAGAGAUAACCAGC 75
chr6:31577188-31577208 4 + GCUGAGAGAUAACCAGCUGG 76
chr6:31577200-31577220 4 + CCAGCUGGUGGUGCCAUCAG 77
chr6:31577201-31577221 4 + CAGCUGGUGGUGCCAUCAGA 78
chr6:31577216-31577236 4 - AUGAGGUACAGGCCCUCUGA 79
chr6:31577227-31577247 4 - CCUGGGAGUAGAUGAGGUAC 80
chr6:31577237-31577257 4 + UACUCCCAGGUCCUCUUCAA 81
chr6:31577245-31577265 4 - CUUGGCCCUUGAAGAGGACC 82
chr6:31577295-31577315 4 - GGCGAUGCGGCUGAUGGUGU 83
chr6:31577296-31577316 4 - CGGCGAUGCGGCUGAUGGUG 84
chr6:31577301-31577321 4 - GGAGACGGCGAUGCGGCUGA 85
chr6:31577308-31577328 4 - UCUGGUAGGAGACGGCGAUG 86
chr6:31577311-31577331 4 + CGCCGUCUCCUACCAGACCA 87
chr6:31577322-31577342 4 - GAGGUUGACCUUGGUCUGGU 88
chr6:31577331-31577351 4 - GGCAGAGAGGAGGUUGACCU 89
chr6:31577349-31577369 4 + CCAUCAAGAGCCCCUGCCAG 90
chr6:31577350-31577370 4 + CAUCAAGAGCCCCUGCCAGA 91
chr6:31577362-31577382 4 - CUGGGGUCUCCCUCUGGCAG 92
chr6:31577363-31577383 4 - UCUGGGGUCUCCCUCUGGCA 93
chr6:31577397-31577417 4 - GAUGGGCUCAUACCAGGGCU 94
chr6:31577401-31577421 4 + CUGGUAUGAGCCCAUCUAUC 95
chr6:31577402-31577422 4 - AGAUAGAUGGGCUCAUACCA 96
chr6:31577402-31577422 4 + UGGUAUGAGCCCAUCUAUCU 97
chr6:31577403-31577423 4 - CAGAUAGAUGGGCUCAUACC 98
chr6:31577406-31577426 4 + AUGAGCCCAUCUAUCUGGGA 99
chr6:31577407-31577427 4 + UGAGCCCAUCUAUCUGGGAG 100
chr6:31577414-31577434 4 - AAGACCCCUCCCAGAUAGAU 101
chr6:31577437-31577457 4 - GUCGGUCACCCUUCUCCAGC 102
chr6:31577454-31577474 4 + GACUCAGCGCUGAGAUCAAU 103
chr6:31577455-31577475 4 - GAUUGAUCUCAGCGCUGAGU 104
chr6:31577480-31577500 4 - UCGGCAAAGUCGAGAUAGUC 105
chr6:31577481-31577501 4 - CUCGGCAAAGUCGAGAUAGU 106
chr6:31577483-31577503 4 + UAUCUCGACUUUGCCGAGUC 107
chr6:31577484-31577504 4 + AUCUCGACUUUGCCGAGUCU 108
chr6:31577488-31577508 4 + CGACUUUGCCGAGUCUGGGC 109
chr6:31577498-31577518 4 + GAGUCUGGGCAGGUCUACUU 110
chr6:31577499-31577519 4 + AGUCUGGGCAGGUCUACUUU 111
chr6:31577499-31577519 4 - AAAGUAGACCUGCCCAGACU 112
chr6:31577532-31577552 4 - GGAUGUUCGUCCUCCUCACA 113
表3：用於敲低TGFBR2之人類嚮導序列及染色體坐標
例示性基因體坐標(hg38) 嚮導序列(5'至3') SEQ ID NO
chr3:30672267-30672287 ACAGUGAUCACACUCCAUGU 235
chr3:30644743-30644763 UAUCAUGUCGUUAUUAACUG 236
chr3:30671764-30671784 GCAGAAGCUGAGUUCAACCU 237
chr3:30672177-30672197 ACCUACAGGAGUACCUGACG 238
chr3:30606958-30606978 CCCGACUUCUGAACGUGCGG 239
chr3:30606870-30606890 AGCGGGGUCUGCCAUGGGUC 240
chr3:30606961-30606981 UCACCCGACUUCUGAACGUG 241
chr3:30606911-30606931 GGCCGCUGCACAUCGUCCUG 242
chr3:30606909-30606929 GGACGAUGUGCAGCGGCCAC 243
chr3:30606954-30606974 CCCACCGCACGUUCAGAAGU 244
chr3:30606865-30606885 CGAGCAGCGGGGUCUGCCAU 245
chr3:30606947-30606967 AACGUGCGGUGGGAUCGUGC 246
chr3:30606864-30606884 ACGAGCAGCGGGGUCUGCCA 247
chr3:30606916-30606936 GUCCACAGGACGAUGUGCAG 248
chr3:30606871-30606891 GCGGGGUCUGCCAUGGGUCG 249
chr3:30606930-30606950 UGCUGGCGAUACGCGUCCAC 250
chr3:30606957-30606977 CCGACUUCUGAACGUGCGGU 251
chr3:30623239-30623259 UGGGCAGUCCUAUUACAGCU 252
chr3:30623238-30623258 GGGCAGUCCUAUUACAGCUG 253
chr3:30623240-30623260 AUGGGCAGUCCUAUUACAGC 254
chr3:30623263-30623283 GAUACUUUACUAUGUCUCAG 255
chr3:30644843-30644863 AGUUGCUCAUGCAGGAUUUC 256
chr3:30644757-30644777 AUGAUAGUCACUGACAACAA 257
chr3:30650418-30650438 AUUGCACUCAUCAGAGCUAC 258
chr3:30650323-30650343 CCCCUACCAUGACUUUAUUC 259
chr3:30650327-30650347 UCCAGAAUAAAGUCAUGGUA 260
chr3:30650317-30650337 AGUCAUGGUAGGGGAGCUUG 261
chr3:30650326-30650346 CCAGAAUAAAGUCAUGGUAG 262
chr3:30650318-30650338 AAGUCAUGGUAGGGGAGCUU 263
chr3:30650319-30650339 AAAGUCAUGGUAGGGGAGCU 264
chr3:30650393-30650413 CACAUGAAGAAAGUCUCACC 265
chr3:30672152-30672172 AUCACCGCCUUCCACGCCAA 266
chr3:30672410-30672430 GUGGAUGACCUGGCUAACAG 267
chr3:30672296-30672316 CUGUGCACGAUGGGCAUCUU 268
chr3:30671871-30671891 GUUGAUGUUGUUGGCACACG 269
chr3:30672193-30672213 AGCUGAUGACAUGCCGCGUC 270
chr3:30671791-30671811 CGGCAAGACGCGGAAGCUCA 271
chr3:30672024-30672044 CCAAGAGGCAUACUCCUCAU 272
chr3:30671784-30671804 CCGCGUCUUGCCGGUUUCCC 273
chr3:30672322-30672342 CGAGGAUAUUGGAGCUCUUG 274
chr3:30672192-30672212 UGACGCGGCAUGUCAUCAGC 275
chr3:30672270-30672290 GUGAUCACACUCCAUGUGGG 276
chr3:30671941-30671961 UCGCUUUGCUGAGGUCUAUA 277
chr3:30671752-30671772 GCUUCUGCUGCCGGUUAACG 278
chr3:30672387-30672407 CAGAGUAGGGUCCAGACGCA 279
chr3:30671929-30671949 CAAAGCGACCUUUCCCCACC 280
chr3:30672266-30672286 CACAGUGAUCACACUCCAUG 281
chr3:30672295-30672315 CAAGAUGCCCAUCGUGCACA 282
chr3:30672021-30672041 CCUAUGAGGAGUAUGCCUCU 283
chr3:30671932-30671952 GGGGAAAGGUCGCUUUGCUG 284
chr3:30671835-30671855 GCGGUCAUCUUCCAGGAUGA 285
chr3:30672023-30672043 CAAGAGGCAUACUCCUCAUA 286
chr3:30671908-30671928 GCCCAUUGAGCUGGACACCC 287
chr3:30672212-30672232 UGGGAGGACCUGCGCAAGCU 288
chr3:30671854-30671874 ACGUGGAGCUGAUGUCAGAG 289
chr3:30671701-30671721 UGGCAACUCCCAGUGGUGGC 290
chr3:30672294-30672314 CCAAGAUGCCCAUCGUGCAC 291
chr3:30672193-30672213 GACGCGGCAUGUCAUCAGCU 292
chr3:30671821-30671841 CGAGCACUGUGCCAUCAUCC 293
chr3:30672268-30672288 CACAUGGAGUGUGAUCACUG 294
chr3:30672250-30672270 UGUGGAGGUGAGCAAUCCCC 295
chr3:30672421-30672441 UUACCUGCCCACUGUUAGCC 296
chr3:30672400-30672420 UACUCUGUCUGUGGAUGACC 297
chr3:30672249-30672269 GUGGAGGUGAGCAAUCCCCC 298
chr3:30672196-30672216 GCGGCAUGUCAUCAGCUGGG 299
chr3:30672340-30672360 AGGUUAGGUCGUUCUUCACG 300
chr3:30671842-30671862 UGUCAGAGCGGUCAUCUUCC 301
chr3:30671739-30671759 UCUACUGCUACCGCGUUAAC 302
chr3:30674221-30674241 ACAUCUCGCUGUAAUGCAGU 303
chr3:30674178-30674198 GCAGACCGAUGUCUACUCCA 304
chr3:30674085-30674105 CUGUCUGUUUUUGCUAUAGG 305
chr3:30674136-30674156 CCUAGAAUCCAGGAUGAAUU 306
chr3:30674220-30674240 GACAUCUCGCUGUAAUGCAG 307
chr3:30674184-30674204 CGAUGUCUACUCCAUGGCUC 308
chr3:30688451-30688471 GACAACGUGUUGAGAGAUCG 309
chr3:30688403-30688423 CGCACCUUGGAACCAAAUGG 310
chr3:30688434-30688454 GUCCUUCAUGCUUUCGACAC 311
chr3:30688432-30688452 CCUUCAUGCUUUCGACACAG 312
chr3:30688402-30688422 UCCAUUUGGUUCCAAGGUGC 313
chr3:30688388-30688408 AAAGAUUAUGAGCCUCCAUU 314
chr3:30688429-30688449 CCCCUGUGUCGAAAGCAUGA 315
chr3:30688510-30688530 GUAAACACUCACUCCUUACC 316
chr3:30688416-30688436 ACAGGGGUGCUCCCGCACCU 317
chr3:30691489-30691509 GAAGCGUUCUGCCACACACU 318
chr3:30691522-30691542 AUCUGGACAGGCUCUCGGGG 319
chr3:30691427-30691447 UCAACGUCUCACACACCAUC 320
chr3:30691519-30691539 AGCAUCUGGACAGGCUCUCG 321
chr3:30691435-30691455 GUGAGACGUUGACUGAGUGC 322
chr3:30691594-30691614 CCUGCCCCAGAAGAGCUAUU 323
chr3:30691409-30691429 CCCGCUACAGGGCAUCCAGA 324
chr3:30691463-30691483 UGAGACGGGCCUCUGGGUCG 325
chr3:30606962-30606982 ACGUUCAGAAGUCGGGUGAG 326
chr3:30606974-30606994 CGGGUGAGUGGUCCCCAGCC 327
chr3:30606975-30606995 GGGUGAGUGGUCCCCAGCCC 328
chr3:30644885-30644905 GAAGCCACAGGAAGUCUGUG 329
chr3:30644893-30644913 AGGAAGUCUGUGUGGCUGUA 330
chr3:30650250-30650270 CCUAGAGUGAAGAGAUUCAU 331
chr3:30671618-30671638 UCUGAUGGGGAAACAAAACA 332
chr3:30671763-30671783 AGCAGAAGCUGAGUUCAACC 333
chr3:30671983-30672003 UUCAGAGCAGUUUGAGACAG 334
chr3:30672088-30672108 GAACAUACUCCAGUUCCUGA 335
chr3:30672094-30672114 ACUCCAGUUCCUGACGGCUG 336
chr3:30672099-30672119 AGUUCCUGACGGCUGAGGAG 337
chr3:30674083-30674103 UAUAGCAAAAACAGACAGUG 338
chr3:30674198-30674218 UUCCCAGAGCACCAGAGCCA 339
chr3:30688476-30688496 GACCAGAAAUUCCCAGCUUC 340
chr3:30688481-30688501 AGCCAGAAGCUGGGAAUUUC 341
chr3:30688490-30688510 UGGUGGUUGAGCCAGAAGCU 342
chr3:30688491-30688511 CUGGUGGUUGAGCCAGAAGC 343
chr3:30688507-30688527 AACACUCACUCCUUACCUGG 344
chr3:30691396-30691416 UAGCGGGAAAGAGAUCCAAA 345
chr3:30691397-30691417 GUAGCGGGAAAGAGAUCCAA 346
chr3:30691412-30691432 CCAUCUGGAUGCCCUGUAGC 347
chr3:30691413-30691433 ACCAUCUGGAUGCCCUGUAG 348
chr3:30691582-30691602 GAGCUAUUUGGUAGUGUUUA 349
chr3:30691583-30691603 AGAGCUAUUUGGUAGUGUUU 350
用於敲低TNFA之非限制性經修飾之嚮導序列如下所示(hg38坐標chr12:68158001-68158021，G019757)：mC*mC*mA*GAGCAUCCAAAAGAGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 119)，其中m為2'-OMe修飾之核苷酸/核苷殘基，*指示殘基之間的硫代磷酸酯鍵聯，大寫字母指示殘基，例如包含核糖之殘基。
用於敲低IFNG之非限制性經修飾之嚮導序列如下所示(hg38坐標chr6:31576805-31576825，G019753)：mA*mG*mA*GCUCUUACCUACAACAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 120)。
用於敲低IL17A之非限制性經修飾之嚮導序列如下所示(hg38坐標chr6:52189069-52189089)：mU*mC*mA*CAGAGGGAUAUCUCUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 217)。
例示性經修飾之模擬嚮導如下所示(hg38坐標chr1:0-20)：mG*mA*mU*CACGUCGGCCGUUGGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 121)。
用於敲低TGFBR2之非限制性經修飾之嚮導序列如下所示(hg38坐標chr3:30671941-30671961)：mU*mC*mG*CUUUGCUGAGGUCUAUAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU (SEQ ID NO: 351)。
用於敲低HLA-A之非限制性經修飾之嚮導序列如下所示(hg38坐標chr6:29942891-29942915，G034202)：mG*mC*mU*mCmUAUmCmCAmCGmGCGCCmCGCGmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 366)，其中m為2'-OMe修飾之核苷酸/核苷殘基，*指示殘基之間的硫代磷酸酯鍵聯，大寫字母指示殘基，例如包含核糖之殘基。
用於敲低HLA-B之非限制性經修飾之嚮導序列如下所示(hg38坐標chr6:31355222-31355246，G034208)：mU*mC*mU*mGmGGAmAmAGmGAmGGGGAmAGAUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 367)，其中m為2'-OMe修飾之核苷酸/核苷殘基，*指示殘基之間的硫代磷酸酯鍵聯，大寫字母指示殘基，例如包含核糖之殘基。
用於敲低CIITA之非限制性經修飾之嚮導序列如下所示(hg38坐標chr16:10906643-10906667，G034619)：mA*mG*mC*mUmGCCmGmUUmCUmGCCCAmGUCCmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 368)，其中m為2'-OMe修飾之核苷酸/核苷殘基，*指示殘基之間的硫代磷酸酯鍵聯，大寫字母指示殘基，例如包含核糖之殘基。
用於敲低TRAC之非限制性經修飾之嚮導序列如下所示(hg38坐標Chr14: 22547524- 22547544，G025420)：mC*mU*mC*UCAGCUGGUACACGGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU (SEQ ID NO: 369)，其中m為2'-OMe修飾之核苷酸/核苷殘基，*指示殘基之間的硫代磷酸酯鍵聯，大寫字母指示殘基，例如包含核糖之殘基；或mC*mU*mC*UCAGCUGGUACACGGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 370)，其中m為2'-OMe修飾之核苷酸/核苷殘基，*指示殘基之間的硫代磷酸酯鍵聯，大寫字母指示殘基，例如包含核糖之殘基。
在一些實施例中，本文揭示藉由使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑及包含異源dmTGFB1核酸(例如，以製造經工程改造之T細胞)之構築體(例如供體構築體或模板)，將異源dmTGFB1核酸引入或插入T細胞或T細胞群體之基因體基因座內而進行工程改造之T細胞。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑及包含異源dmTGFB1核酸之構築體(例如供體)，自T細胞或T細胞群體之基因體基因座表現異源dmTGFB1而進行工程改造之T細胞。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)在T細胞或T細胞群體之基因體內誘導斷裂(例如雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(切口))以供插入dmTGFB1基因而進行工程改造之T細胞。亦提供藉由該等方法製得之細胞及細胞群體。
在一些實施例中，本文揭示藉由將異源dmTGFB1核酸引入或插入T細胞之基因體基因座內而進行工程改造之T細胞，該等T細胞藉由使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑及包含異源IL10核酸(例如，以製造經工程改造之T細胞)之構築體(例如供體構築體或模板)，將異源IL10核酸引入或插入T細胞或T細胞群體之基因體基因座內而進行進一步工程改造。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑及包含異源IL10核酸之構築體(例如供體)，自T細胞或T細胞群體之基因體基因座表現異源IL10而進行工程改造之T細胞。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)在T細胞或T細胞群體之基因體內誘導斷裂(例如雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(切口))以供插入IL10基因而進行工程改造之T細胞。亦提供藉由該等方法製得之細胞及細胞群體。
在一些實施例中，本文揭示藉由將異源dmTGFB1核酸引入或插入T細胞之基因體基因座內而進行工程改造之T細胞，該等T細胞藉由使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑及包含異源CTLA4核酸(例如，以製造經工程改造之T細胞)之構築體(例如供體構築體或模板)，將異源CTLA4核酸引入或插入T細胞或T細胞群體之基因體基因座內而進行進一步工程改造。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑及包含異源CTLA4核酸之構築體(例如供體)，自T細胞或T細胞群體之基因體基因座表現異源CTLA4而進行工程改造之T細胞。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)在T細胞或T細胞群體之基因體內誘導斷裂(例如雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(切口))以供插入CTLA4基因而進行工程改造之T細胞。亦提供藉由該等方法製得之細胞及細胞群體。
在一些實施例中，本文揭示藉由將異源dmTGFB1核酸引入或插入T細胞之基因體基因座內而進行工程改造之T細胞，該等T細胞藉由使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑以及包含異源CTLA4核酸及異源IL10核酸(例如，以製造經工程改造之T細胞)之一或多種構築體(例如供體構築體或模板)，將異源CTLA4核酸及異源IL10核酸引入或插入T細胞或T細胞群體之基因體基因座內而進行進一步工程改造。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑以及包含異源CTLA4核酸及異源IL10核酸之構築體(例如供體構築體或模板)，自T細胞或T細胞群體之基因體基因座表現異源CTLA4及異源IL10而進行工程改造之T細胞。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)在T細胞或T細胞群體之基因體內誘導斷裂(例如雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(切口))以供插入CTLA4基因及IL10基因而進行工程改造之T細胞。在一些實施例中，嚮導RNA介導RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)在本文所闡述位點處之靶標特異性切割，以供插入編碼兩種或更多種調控性T細胞促進分子(例如IL10及CTLA4)之序列。應瞭解，在一些實施例中，嚮導RNA包含結合至該等區域或能夠結合至該等區域之嚮導序列。亦提供藉由該等方法製得之細胞及細胞群體。
下文提供調控性T細胞促進分子之例示性核苷酸及多肽序列。用於鑑別編碼多肽序列之替代性核苷酸序列(包括替代性天然存在之變異體及非人類同系物)之方法為此項技術中所已知。下文提供編碼dmTGFB1、IL10及CTLA4之例示性核酸序列。其他適宜之dmTGFB1、IL10及CTLA4序列為此項技術中所已知，或可基於本文所提供之揭示內容來設計。例如，參見Gorby等人，Engineered IL-10 variants elicit potent immuno-modulatory activities at therapeutic low ligand doses, BioRxiv (2020)；Saxton等人，Structure-based decoupling of the pro- and anti-inflammatory functions of interleukin-10, Science, (2021)371:eabc8433 (doi: 10.1126/science.abc8433)，WO2021243057；及Xu等人，Affinity and cross-reactivity engineering of CTLA4-Ig to modulate T cell costimulation, J Immunol (2012)，該等文獻之內容、變異體(特定而言IL-10變異體) 及序列在此係以引用的方式併入。用於鑑別替代性IL10及CTLA4序列之方法亦為此項技術中所已知。例如，參見同上。舉例而言，Gorby揭示IL-10之抗炎及促細胞毒性活性。除抗炎活性以外，近期研究亦已顯示，IL-10可增加CD8 T細胞之細胞毒性功能，從而提高其靶向腫瘤之能力並增強抗癌反應(Oft, 2019)。此似乎自相矛盾，此乃因腫瘤微環境中之IL-10與腫瘤逃避免疫反應有關，最有可能係由於IL-10對抗原呈遞之抑制效應(Mannino等人，2015；Yue等人，1997)。儘管存在此矛盾，但若干項研究已充分證明IL-10可在活體外及活體內提高CD8效應分子顆粒酶B及干擾素γ之產生(Emmerich等人，2012；Mumm等人，2011；Mumm及Oft，2013)。目前，有若干項臨床試驗測試IL-10之抗腫瘤性質，已取得初步有希望之結果(Naing等人，2019)。該等試驗中使用高劑量之聚乙二醇化IL-10 (培伊洛介白素(Pegilodekakin))，此使得IL-10在循環中之滯留延長以確保功效，再次強調有效的IL-10活體內反應需要高濃度及持續水準之IL-10。Saxton等人使用基於酵母展示之定向演化來工程改造IL-10變異體。IL-10係具有抗炎及免疫刺激性質之免疫調控性細胞介素，且在疾病中經常失調。在機制上，IL-10作為分泌型同二聚體起作用，其接合兩個拷貝之異二聚體受體複合物，該複合物包含專用受體亞單元IL-10Rα及共用亞單元IL-10Rβ。IL-10Rα及IL-10Rβ之IL-10依賴性二聚化進而起始轉錄因子STAT3之活化，其介導IL-10之眾多種生物效應。Saxton等人教示具有一系列IL-10Rβ結合強度之IL-10變異體，揭示免疫細胞群體之間反應臨限值之實質性差異，此提供操縱IL-10細胞類型選擇性之手段。Saxton等人已鑑別出對IL-10Rβ具有增強親和力之「超級10」變異體(D25A/E96A，基於SEQ ID NO: 231之胺基酸編號)，使得能夠組裝六聚體IL-10-IL-10Rα-IL-10Rβ複合物。其他變異體(例如D25K、D25A、N21A/R104A及D25A/N21A/R104A，基於SEQ ID NO: 231之胺基酸編號)藉由抑制巨噬細胞活化而不刺激發炎性CD8+ T細胞展示出骨髓樣偏向活性，藉此解偶聯IL-10之主要相反功能。在某些實施例中，本文所提供之經工程改造之T細胞中使用具有受損免疫刺激性質之IL-10變異體(在本文中稱為「抑制性IL-10變異體」)，例如藉由抑制巨噬細胞活化而保持骨髓樣偏向活性且展示對發炎性CD8+ T細胞之刺激受損之變異體。在某些實施例中，本文所提供之經工程改造之T細胞中使用的抑制性IL-10變異體包括選自D25K、D25A、D25A/E96A、N21A/R104A及D25A/N21A/R104A之取代，例如D25A/E96A。Saxton等人之結果為調節IL-10之多效性作用提供機制藍圖。WO2021243057中提供其他抑制性IL-10變異體，該案係以引用方式併入本文中，其提供多種IL-10序列，包括與缺少該一或多個胺基酸取代之參考IL-10多肽之結合親和力相比對IL-10Rβ之結合親和力改變之多肽，以及表徵活性之方法。揭示其他變異體(包括抑制性IL-10變異體)且預測其藉由抑制巨噬細胞活化而不刺激發炎性CD8+ T細胞來展示骨髓樣偏向活性，類似於D25K、D25A、D25A/E96A、N21A/R104A及D25A/N21A/R104A變異體。其中所提供之實施例包括在對應於選自D25、H14、N18、R24、D28、E74、H90、N92、E96、T100及R104之胺基酸殘基之位置處具有一或多個胺基酸取代之抑制性IL-10變異體，視情況包括位於選自N21、M22、R32及S93之一或多個胺基酸處之進一步取代。在某些實施例中，D25經選自K、A、N、H、I、K或V之胺基酸取代。在某些實施例中，E96經選自A、N、D、Q、H、K或S之胺基酸取代。取代之例示性組合可包括a) N18Y/N92Q/T100D/R104W；(b) N18Y/N21H/N92Q/E96D/T100V/R104W；(c) N18Y/N21H/E96H/T100V/R104W；(d) N18Y/D25A/N92Q/T100D/R104W；(e) N18Y/D25K/N92Q/T100D/R104W；及(f) N18Y/D25A/N92Q/E96A/T100D/R104W。例示性取代包括(a) D25A；(b) D25K；(c) E96A；(d) E96K；(e) D25A/E96A；(f) N21A/R104A；(g) N21A/D25A；(h) N21A/D25A/E96A；及(i) N21A/M22A/D25A。亦考慮例如由於突變或截短而與本文所闡述之核酸序列、胺基酸序列或編碼胺基酸序列之核酸序列中之任一者具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列。在一些實施例中，亦提供編碼本文所提供之任一胺基酸序列之核酸序列。
提供編碼TGFB1之非限制性例示性核酸序列：野生型TGFB1Atgccgccctccgggctgcggctgctgctgctgctgctaccgctgctgtggctactggtgctgacgcctggccggccggccgcgggactatccacctgcaagactatcgacatggagctggtgaagcggaagcgcatcgaggccatccgcggccagatcctgtccaagctgcggctcgccagccccccgagccagggggaggtgccgcccggcccgctgcccgaggccgtgctcgccctgtacaacagcacccgcgaccgggtggccggggagagtgcagaaccggagcccgagcctgaggccgactactacgccaaggaggtcacccgcgtgctaatggtggaaacccacaacgaaatctatgacaagttcaagcagagtacacacagcatatatatgttcttcaacacatcagagctccgagaagcggtacctgaacccgtgttgctctcccgggcagagctgcgtctgctgaggctcaagttaaaagtggagcagcacgtggagctgtaccagaaatacagcaacaattcctggcgatacctcagcaaccggctgctggcacccagcgactcgccagagtggttatcttttgatgtcaccggagttgtgcggcagtggttgagccgtggaggggaaattgagggctttcgccttagcgcccactgctcctgtgacagcagggataacacactgcaagtggacatcaacgggttcactaccggccgccgaggtgacctggccaccattcatggcatgaaccggcctttcctgcttctcatggccaccccgctggagagggcccagcatctgcaaagctcccggcaccgccgagccctggacaccaactattgcttcagctccacggagaagaactgctgcgtgcggcagctgtacattgacttccgcaaggacctcggctggaagtggatccacgagcccaagggctaccatgccaacttctgcctcgggccctgcccctacatttggagcctggacacgcagtacagcaaggtcctggccctgtacaaccagcataacccgggcgcctcggcggcgccgtgctgcgtgccgcaggcgctggagccgctgcccatcgtgtactacgtgggccgcaagcccaaggtggagcagctgtccaacatgatcgtgcgctcctgcaagtgcagc (SEQ ID NO: 204)
雙重突變體(dm) TGFB1 (R218H、C225R)AtgccgccctccgggctgcggctgctgctgctgctgctaccgctgctgtggctactggtgctgacgcctggccggccggccgcgggactatccacctgcaagactatcgacatggagctggtgaagcggaagcgcatcgaggccatccgcggccagatcctgtccaagctgcggctcgccagccccccgagccagggggaggtgccgcccggcccgctgcccgaggccgtgctcgccctgtacaacagcacccgcgaccgggtggccggggagagtgcagaaccggagcccgagcctgaggccgactactacgccaaggaggtcacccgcgtgctaatggtggaaacccacaacgaaatctatgacaagttcaagcagagtacacacagcatatatatgttcttcaacacatcagagctccgagaagcggtacctgaacccgtgttgctctcccgggcagagctgcgtctgctgaggctcaagttaaaagtggagcagcacgtggagctgtaccagaaatacagcaacaattcctggcgatacctcagcaaccggctgctggcacccagcgactcgccagagtggttatcttttgatgtcaccggagttgtgcggcagtggttgagccgtggaggggaaattgagggctttCACcttagcgcccactgctccAGAgacagcagggataacacactgcaagtggacatcaacgggttcactaccggccgccgaggtgacctggccaccattcatggcatgaaccggcctttcctgcttctcatggccaccccgctggagagggcccagcatctgcaaagctcccggcaccgccgagccctggacaccaactattgcttcagctccacggagaagaactgctgcgtgcggcagctgtacattgacttccgcaaggacctcggctggaagtggatccacgagcccaagggctaccatgccaacttctgcctcgggccctgcccctacatttggagcctggacacgcagtacagcaaggtcctggccctgtacaaccagcataacccgggcgcctcggcggcgccgtgctgcgtgccgcaggcgctggagccgctgcccatcgtgtactacgtgggccgcaagcccaaggtggagcagctgtccaacatgatcgtgcgctcctgcaagtgcagc (SEQ ID NO: 208)
人類TGFB1之非限制性例示性胺基酸序列野生型MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (SEQ ID NO: 210)
dmTGFB1 R218C, C225RMPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFHLSAHCSRDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (SEQ ID NO: 214)
提供編碼IL10之非限制性例示性核酸序列：野生型IL10：ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAAC (SEQ ID NO: 122)
高親和力IL10 (N36I、N110I、K117N、F129L)：ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCATCCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGatcTCCCTGGGGGAGAACCTGAATACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGActcCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAAC (SEQ ID NO: 123)
提供IL10之非限制性例示性胺基酸序列：野生型IL10：MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 124)
高親和力IL10 (N36I、N110I、K117N、F129L)：MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGILPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVISLGENLNTLRLRLRRCHRLLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 125)
成熟野生型IL10SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 231)
IL10 (D25K)SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN  (SEQ ID NO: 232)
IL10 (D25E)SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRELRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 233)
IL10 (D25K/E96A)SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRKLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGANLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 234)
提供編碼TGFB1之非限制性例示性核酸序列：野生型TGFB1 (參見上文段落[000145]及SEQ ID NO: 204)雙重突變體TGFB1 (R218C、C225R)AtgccgccctccgggctgcggctgctgctgctgctgctaccgctgctgtggctactggtgctgacgcctggccggccggccgcgggactatccacctgcaagactatcgacatggagctggtgaagcggaagcgcatcgaggccatccgcggccagatcctgtccaagctgcggctcgccagccccccgagccagggggaggtgccgcccggcccgctgcccgaggccgtgctcgccctgtacaacagcacccgcgaccgggtggccggggagagtgcagaaccggagcccgagcctgaggccgactactacgccaaggaggtcacccgcgtgctaatggtggaaacccacaacgaaatctatgacaagttcaagcagagtacacacagcatatatatgttcttcaacacatcagagctccgagaagcggtacctgaacccgtgttgctctcccgggcagagctgcgtctgctgaggctcaagttaaaagtggagcagcacgtggagctgtaccagaaatacagcaacaattcctggcgatacctcagcaaccggctgctggcacccagcgactcgccagagtggttatcttttgatgtcaccggagttgtgcggcagtggttgagccgtggaggggaaattgagggctttTGCcttagcgcccactgctccAGAgacagcagggataacacactgcaagtggacatcaacgggttcactaccggccgccgaggtgacctggccaccattcatggcatgaaccggcctttcctgcttctcatggccaccccgctggagagggcccagcatctgcaaagctcccggcaccgccgagccctggacaccaactattgcttcagctccacggagaagaactgctgcgtgcggcagctgtacattgacttccgcaaggacctcggctggaagtggatccacgagcccaagggctaccatgccaacttctgcctcgggccctgcccctacatttggagcctggacacgcagtacagcaaggtcctggccctgtacaaccagcataacccgggcgcctcggcggcgccgtgctgcgtgccgcaggcgctggagccgctgcccatcgtgtactacgtgggccgcaagcccaaggtggagcagctgtccaacatgatcgtgcgctcctgcaagtgcagc (SEQ ID NO: 352)
雙重突變體TGFB1 (R218H、C225R) (參見上文段落[000347]及SEQ ID NO: [214])。
提供編碼CTLA4之非限制性例示性核酸序列：野生型CTLA4：ATGGCCTGCTTGGGCTTCCAAAGGCATAAAGCCCAGCTTAATCTTGCTACTCGCACGTGGCCCTGCACATTGCTCTTTTTCCTCCTGTTCATTCCCGTGTTTTGCAAGGCGATGCATGTGGCACAACCTGCCGTCGTTCTGGCATCATCAAGAGGTATTGCTAGCTTCGTTTGTGAGTACGCCTCCCCTGGAAAAGCGACGGAGGTGCGCGTCACTGTATTGCGGCAAGCCGACAGCCAAGTTACTGAAGTCTGCGCGGCAACGTATATGATGGGCAATGAGCTGACATTCCTTGACGATTCAATCTGCACGGGAACAAGTAGTGGTAACCAGGTGAATCTCACTATTCAAGGTCTGAGAGCCATGGACACCGGCCTCTACATTTGTAAGGTGGAGCTGATGTATCCTCCCCCATATTATCTGGGGATCGGAAATGGGACACAGATATATGTTATTGATCCCGAGCCATGTCCCGATAGTGACTTCCTCTTGTGGATACTTGCCGCTGTGAGCAGTGGTTTGTTTTTTTATTCATTCCTCCTTACGGCAGTATCACTTTCAAAAATGCTCAAGAAGCGAAGTCCTTTGACAACTGGCGTATATGTCAAAATGCCACCAACAGAGCCCGAATGTGAGAAACAGTTCCAGCCGTACTTTATTCCTATAAAC (SEQ ID NO: 126)
高親和力CTLA4 (貝拉西普(belatacept)；結合結構域：A29Y、L104E)：ATGGCCTGCTTGGGCTTCCAAAGGCATAAAGCCCAGCTTAATCTTGCTACTCGCACGTGGCCCTGCACATTGCTCTTTTTCCTCCTGTTCATTCCCGTGTTTTGCAAGGCGATGCATGTGGCACAACCTGCCGTCGTTCTGGCATCATCAAGAGGTATTGCTAGCTTCGTTTGTGAGTACGCCTCCCCTGGAAAATACACGGAGGTGCGCGTCACTGTATTGCGGCAAGCCGACAGCCAAGTTACTGAAGTCTGCGCGGCAACGTATATGATGGGCAATGAGCTGACATTCCTTGACGATTCAATCTGCACGGGAACAAGTAGTGGTAACCAGGTGAATCTCACTATTCAAGGTCTGAGAGCCATGGACACCGGCCTCTACATTTGTAAGGTGGAGCTGATGTATCCTCCCCCATATTATGAGGGGATCGGAAATGGGACACAGATATATGTTATTGATCCCGAGCCATGTCCCGATAGTGACTTCCTCTTGTGGATACTTGCCGCTGTGAGCAGTGGTTTGTTTTTTTATTCATTCCTCCTTACGGCAGTATCACTTTCAAAAATGCTCAAGAAGCGAAGTCCTTTGACAACTGGCGTATATGTCAAAATGCCACCAACAGAGCCCGAATGTGAGAAACAGTTCCAGCCGTACTTTATTCCTATAAAC (SEQ ID NO: 127)
高親和力CTLA4 (結合結構域：A29H)：ATGGCCTGCTTGGGCTTCCAAAGGCATAAAGCCCAGCTTAATCTTGCTACTCGCACGTGGCCCTGCACATTGCTCTTTTTCCTCCTGTTCATTCCCGTGTTTTGCAAGGCGATGCATGTGGCACAACCTGCCGTCGTTCTGGCATCATCAAGAGGTATTGCTAGCTTCGTTTGTGAGTACGCCTCCCCTGGAAAACATACGGAGGTGCGCGTCACTGTATTGCGGCAAGCCGACAGCCAAGTTACTGAAGTCTGCGCGGCAACGTATATGATGGGCAATGAGCTGACATTCCTTGACGATTCAATCTGCACGGGAACAAGTAGTGGTAACCAGGTGAATCTCACTATTCAAGGTCTGAGAGCCATGGACACCGGCCTCTACATTTGTAAGGTGGAGCTGATGTATCCTCCCCCATATTATCTGGGGATCGGAAATGGGACACAGATATATGTTATTGATCCCGAGCCATGTCCCGATAGTGACTTCCTCTTGTGGATACTTGCCGCTGTGAGCAGTGGTTTGTTTTTTTATTCATTCCTCCTTACGGCAGTATCACTTTCAAAAATGCTCAAGAAGCGAAGTCCTTTGACAACTGGCGTATATGTCAAAATGCCACCAACAGAGCCCGAATGTGAGAAACAGTTCCAGCCGTACTTTATTCCTATAAAC (SEQ ID NO: 128)
高親和力CTLA4 (結合結構域：K28H、A29H)：ATGGCCTGCTTGGGCTTCCAAAGGCATAAAGCCCAGCTTAATCTTGCTACTCGCACGTGGCCCTGCACATTGCTCTTTTTCCTCCTGTTCATTCCCGTGTTTTGCAAGGCGATGCATGTGGCACAACCTGCCGTCGTTCTGGCATCATCAAGAGGTATTGCTAGCTTCGTTTGTGAGTACGCCTCCCCTGGACATCACACGGAGGTGCGCGTCACTGTATTGCGGCAAGCCGACAGCCAAGTTACTGAAGTCTGCGCGGCAACGTATATGATGGGCAATGAGCTGACATTCCTTGACGATTCAATCTGCACGGGAACAAGTAGTGGTAACCAGGTGAATCTCACTATTCAAGGTCTGAGAGCCATGGACACCGGCCTCTACATTTGTAAGGTGGAGCTGATGTATCCTCCCCCATATTATCTGGGGATCGGAAATGGGACACAGATATATGTTATTGATCCCGAGCCATGTCCCGATAGTGACTTCCTCTTGTGGATACTTGCCGCTGTGAGCAGTGGTTTGTTTTTTTATTCATTCCTCCTTACGGCAGTATCACTTTCAAAAATGCTCAAGAAGCGAAGTCCTTTGACAACTGGCGTATATGTCAAAATGCCACCAACAGAGCCCGAATGTGAGAAACAGTTCCAGCCGTACTTTATTCCTATAAAC (SEQ ID NO: 129)
提供CTLA4之非限制性例示性胺基酸序列：野生型CTLA4：MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 130)
高親和力CTLA4 (貝拉西普；結合結構域：A29Y、L104E)：MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 131)
高親和力CTLA4 (結合結構域：A29H)：MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKHTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 132)
高親和力CTLA4 (結合結構域：K28H、A29H)：MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGHHTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 133)
在一些實施例中，包含處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列的經工程改造之T細胞或T細胞群體展現出天然存在之調控性T細胞(nTreg)的至少一種抑制活性，例如在活體外或活體內分析(例如GvHD之動物模型)中抑制免疫反應或生物標記物。舉例而言，在小鼠GvHD模型中，與對照(例如接受PBMC之小鼠)相比，接受包含以下各項之經工程改造之T細胞的小鼠展現出改良之存活期：處於啟動子控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。在某些實施例中，調控性T細胞促進分子包含IL10或CTLA4。在某些實施例中，調控性T細胞促進分子包含IL10及CTLA4。
在某些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含兩種或更多種處於啟動子控制下之異源編碼序列，例如dmTGFB1及調控性T細胞促進分子。在某些實施例中，每一異源編碼序列處於單獨啟動子之控制下。在某些實施例中，兩種異源編碼序列處於同一啟動子之控制下。在某些實施例中，兩種或更多種異源編碼序列處於同一啟動子之控制下。在某些實施例中，當經工程改造之T細胞或T細胞群體包含三種或更多種處於啟動子控制下之異源編碼序列(例如dmTGFB1及調控性T細胞促進分子)時，每一異源序列各自獨立地處於單獨啟動子之控制下或處於控制一種以上異源編碼序列之表現的啟動子之控制下。
C. T 細胞受體(TCR)在一些實施例中，包含修飾(例如向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子之異源序列)、進一步包含對編碼TCR基因序列之內源核酸序列之修飾(例如敲低)及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)的經工程改造之T細胞或T細胞群體進一步包含對編碼TCR基因序列之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，包含含有向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及/或向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列之修飾的經工程改造之T細胞或T細胞群體進一步包含對編碼TCR基因序列之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入各自處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子及調控性T細胞促進分子之異源序列，進一步包含對編碼TCR基因序列之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，包含含有向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子之異源序列的修飾之經工程改造之T細胞或T細胞群體進一步包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；向細胞中插入各自處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子及調控性T細胞促進分子之異源序列、向細胞中插入編碼靶向受體之異源序列；進一步包含對編碼TCR基因序列之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。
通常，TCR為含有兩條TCR多肽鏈(亦即α及β)之異二聚體受體分子。靶向敲低之適宜α及β基因體序列或基因座為此項技術中所已知。在一些實施例中，經工程改造之T細胞包含對TCR α鏈基因序列(例如TRAC)之修飾(例如敲低)。例如，參見NCBI基因ID：28755；Ensembl：ENSG00000277734 (T細胞受體α恆定)、US 2018/0362975及WO2020081613。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含含有插入編碼dmTGFB1之序列之修飾。
在一些實施例中，包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)的經工程改造之T細胞或T細胞群體進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；插入編碼選自IL10、CTLA4、TIGIT、IDO1、ENTPD1、NT5E、IL22、AREG、IL35、GARP、CD274、FOXP3、IKZF2、EOS、IRF4、LEF1、BACH2及IL2RA之調控性T細胞促進分子之序列；及對編碼TCR基因序列之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子之異源序列及 對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)的經工程改造之T細胞或T細胞群體進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低) 與對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)的組合；插入編碼選自IL10、CTLA4、TIGIT、IDO1、ENTPD1、NT5E、IL22、AREG、IL35、GARP、CD274、FOXP3、IKZF2、EOS、IRF4、LEF1、BACH2及之調控性T細胞促進分子之序列；及對編碼TCR基因序列之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)的經工程改造之T細胞或T細胞群體進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；插入編碼IL10或CTLA4之序列，及對編碼TCR基因序列之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；插入編碼dmTGFB1、IL10及CTLA4之序列，及對編碼TCR基因序列之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；插入編碼dmTGFB1分子之序列、插入編碼調控性T細胞促進分子之序列及對內源TCR基因(例如TRAC基因序列)之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；插入編碼dmTGFB1分子之序列；插入編碼選自IL10、CTLA4、TIGIT、IDO1、ENTPD1、NT5E、IL22、AREG、IL35、GARP、CD274、FOXP3、IKZF2、EOS、IRF4、LEF1、BACH2及IL2RA之調控性T細胞促進分子之序列；及對內源TCR基因(例如TRAC基因序列)之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；插入編碼dmTGFB1分子之序列、插入編碼IL10或CTLA4之序列及對TCR基因(例如TRAC基因序列)之修飾(例如敲低)。
在該等實施例中之任一者中，經工程改造之T細胞或T細胞群體可進一步包含編碼如本文所闡述之靶向受體之插入序列，該靶向受體例如為CAR，例如靶向以下之CAR：MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02)。
在一些實施例中，包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子之異源序列的經工程改造之T細胞或T細胞群體進一步包含藉由基因編輯對TRC基因序列之修飾(例如敲低)，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，其中至少50%、55%、60%、65%, 至少70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞在內源TRC基因序列中包含插入、缺失或取代。在一些實施例中，與適宜對照(例如，其中TRC基因未經修飾)相比，TRC減少至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或減少至低於分析之偵測極限。針對TRC蛋白及mRNA表現之分析為此項技術中所已知。
在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，經工程改造之T細胞或T細胞群體包含藉由基因編輯插入之編碼靶向受體之序列。
在一些實施例中，T細胞群體包含含有向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子之異源序列的T細胞，該等T細胞經進一步工程改造以包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。在一些實施例中，T細胞群體包含進一步包含以下之T細胞：對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼插入序列之內源核酸序列之修飾(例如敲低)，該(等)插入序列編碼調控性T細胞促進分子，及/或對至少一個TCR基因序列之修飾(例如敲低)。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞經工程改造以包含對至少一個TCR基因序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，T細胞群體包含含有向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1分子之異源序列及 對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)的T細胞，該等T細胞經進一步工程改造以包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；插入編碼調控性T細胞促進分子之序列，及對至少一個TCR基因序列之修飾(例如敲低)。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞經工程改造以包含對至少一個TCR基因序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，使用特異性靶向TCR基因(例如TRAC基因)內之位點的嚮導RNA來提供對TCR基因之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑來修飾(例如敲低) T細胞中之TCR基因。在一些實施例中，本文揭示藉由例如使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)在T細胞之TCR基因內誘導斷裂(例如雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(切口))而進行工程改造之T細胞。該等方法可活體外或離體使用，例如用於製造用以抑制免疫反應之細胞產品。
在一些實施例中，嚮導RNA介導RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)在TCR基因內本文所闡述之位點處進行的靶標特異性切割。應瞭解，在一些實施例中，嚮導RNA包含結合至該等區域或能夠結合至該等區域之嚮導序列。
D. 嚮導RNA在本文之任一實施例中，嚮導RNA可進一步包含trRNA。在本文所闡述之每一組合物及方法實施例中，crRNA及trRNA可締合為單一RNA (sgRNA)或可在單獨RNA (dgRNA)上。在sgRNA之背景下，crRNA及trRNA組分可共價連接，例如，經由磷酸二酯鍵或其他共價鍵。在一些實施例中，sgRNA在核苷酸之間包含一或多個不為磷酸二酯鍵聯之鍵聯。
在本文所闡述之組合物、用途及方法實施例中之每一者中，嚮導RNA可包含兩個作為「雙重嚮導RNA」或「dgRNA」之RNA分子。dgRNA包含含有crRNA (包含例如本文所示之嚮導序列)之第一RNA分子及含有trRNA之第二RNA分子。第一RNA分子與第二RNA分子可不共價連接，但可經由crRNA與trRNA之部分之間的鹼基配對形成RNA雙鏈體。
在本文所闡述之組合物、用途及方法實施例中之每一者中，嚮導RNA可包含作為「單一嚮導RNA」或「sgRNA」之單一RNA分子。sgRNA可包含與trRNA共價連接之crRNA (或其一部分)，該crRNA (或其一部分)包含本文所示之嚮導序列。sgRNA可包含本文所示嚮導序列之15、16、17、18、19或20個鄰接核苷酸。在一些實施例中，crRNA與trRNA經由連接體共價連接。在一些實施例中，sgRNA經由crRNA及trRNA之部分之間的鹼基配對形成莖環結構。在一些實施例中，crRNA與trRNA經由一或多個不為磷酸二酯鍵之鍵來共價連接。
在一些實施例中，trRNA可包含源自天然存在之CRISPR/Cas系統之trRNA序列的全部或一部分。在一些實施例中，trRNA包含截短或經修飾之野生型trRNA。trRNA之長度取決於所用之CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，trRNA包含55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或100個以上之核苷酸，或由其組成。在一些實施例中，trRNA可包含某些二級結構，諸如一或多個髮夾或莖環結構，或一或多個凸起結構。
在一些實施例中，靶序列或區域可與嚮導RNA之嚮導序列互補。在一些實施例中，嚮導RNA之嚮導序列與其相應靶序列之間的互補性或一致性程度可為75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，靶序列與gRNA之嚮導序列可100%互補或一致。在其他實施例中，靶序列與gRNA之嚮導序列可含有一個錯配。舉例而言，靶序列與gRNA之嚮導序列可含有1、2、3、4或5個錯配，其中嚮導序列之總長度為約20或為20。在一些實施例中，靶序列與gRNA之嚮導序列可含有1-4個錯配，其中嚮導序列為約20或為20個核苷酸。在一些實施例中，例如當嚮導序列包含24個鄰接核苷酸之序列時，嚮導序列與其相應靶序列之間的互補性或一致性程度為至少80%、85%、90%或95%。在一些實施例中，嚮導序列與靶區可為100%互補或一致的。在其他實施例中，嚮導序列及靶區可含有至少一個錯配，亦即一個核苷酸不一致或不互補，此取決於參考序列。舉例而言，嚮導序列及靶序列可含有1-2個、例如不超過1個錯配，其中靶序列之總長度為19、20、21、22、23或24個或更多個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及靶區可含有1-2個錯配，其中嚮導序列包含至少24個或更多個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及靶區可含有1-2個錯配，其中嚮導序列包含24個核苷酸。
在本文之任一實施例中，本文之每一嚮導序列可進一步包含額外核苷酸以形成crRNA或嚮導RNA，例如在嚮導序列3'端後具有以下例示性核苷酸序列：GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 134)，按5'至3'定向。
在sgRNA之情形下，上述嚮導序列可進一步包含額外核苷酸以形成sgRNA，例如在嚮導序列3'端後具有以下例示性核苷酸序列：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 135)；GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 136)；GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 200)；GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 201)；GUUGUAGCUCCCUUUCUCAUUUCGGAAACGAAAUGAGAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCUUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUA (SEQ ID NO: 202)；GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 203)。
在任何實施例中，本文所揭示之嚮導RNA結合至原型間隔子毗鄰模體(PAM)之上游區域。如熟習此項技術者將理解，PAM序列出現在與含有靶序列之股相對之股上，且隨CRISPR/Cas系統而變化。亦即，PAM序列位於靶股(含有嚮導RNA所結合之靶序列之股)的互補股上。在一些實施例中，PAM係選自NGG、NNGRRT、NNGRR(N)、NNAGAAW、NNNNG(A/C)TT及NNNNRYAC，例如，當Cas系統包括SpyCas9時。在其他實施例中，PAM序列包括NCC、N4GAYW、N4GYTT、N4GTCT、NNNNCC(a)、NNNNCAAA (其中N定義為任何核苷酸，W定義為A或T，且R定義為A或G；且(a)為第二個C後之較佳、但非必需之A)，例如，當Cas系統包括NmeCas9時。
在一些實施例中，本文所提供之嚮導RNA序列與毗鄰PAM序列之序列互補。
在一些實施例中，嚮導RNA序列包含根據人類參考基因體hg38中之坐標，與選自本文表格之基因體區域內之序列互補之序列。在一些實施例中，嚮導RNA序列包含如下序列，該序列與包含來自選自本文表格之基因體區域內的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續核苷酸之序列互補。在一些實施例中，嚮導RNA序列包含如下序列，該序列與包含跨越選自本文表格之基因體區域的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續核苷酸之序列互補。
本文所揭示之嚮導RNA介導產生雙股斷裂(DSB)之靶標特異性切割。本文所揭示之嚮導RNA介導產生單股斷裂(SSB或切口)之靶標特異性切割。
E. 經化學修飾之gRNA在一些實施例中，gRNA經化學修飾。包含一或多個經修飾核苷或核苷酸之gRNA稱為「經修飾之」gRNA或「經化學修飾之」gRNA，以描述一或多種非天然或天然存在之組分或構形之存在，該等組分或構形用於代替或補充規範A、G、C及U殘基。在一些實施例中，用非規範核苷或核苷酸合成經修飾之gRNA，在此稱為「經修飾」。經修飾之核苷及核苷酸可包括以下中之一或多者：(i)改變(例如替換)磷酸二酯主鏈鍵聯中之一或兩個非連接性磷酸酯氧或一或多個連接性磷酸酯氧(例示性主鏈修飾)；(ii)改變(例如替換)核糖之組分(例如核糖上之2'羥基) (例示性糖修飾)；(iii)修飾或替換天然核鹼基，包括利用非規範核鹼基(例示性鹼基修飾)； 及(iv)修飾寡核苷酸之3'端或5'端以提供外核酸酶穩定性，例如經2' O-me、2'鹵化物或2'去氧取代之核糖修飾；或反向無鹼基末端核苷酸，或用硫代磷酸酯替換磷酸二酯。
化學修飾(諸如上文所列示之彼等修飾)可經組合以提供經修飾之gRNA，其包含可具有兩個、三個、四個或更多個修飾之核苷及核苷酸(統稱為「殘基」)。舉例而言，經修飾之殘基可具有經修飾之糖及經修飾之核鹼基。在一些實施例中，gRNA之每個鹼基均經修飾，例如，所有鹼基均具有經修飾之磷酸酯基團，諸如硫代磷酸酯基團。在某些實施例中，gRNA分子之所有或實質上所有磷酸酯基團經硫代磷酸酯基團替換。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之5'端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之3'端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。某些gRNA在RNA之5'端及3'端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。
在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含WO2018107028中所揭示之修飾模式之一，該案之內容在此係以引用的方式併入相關部分中。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含US20170114334中所揭示之結構/修飾模式之一，該案在此係以引用的方式併入。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包含WO2017136794、WO2017004279、WO2019237069、US2018187186、US2019048338、WO2021119275或WO2022125968中所揭示之結構/修飾模式之一，該等案件在此係以引用的方式併入。
F. 編碼RNA引導之DNA結合劑之mRNA在一些實施例中，細胞或方法包含含有編碼RNA引導之DNA結合劑(諸如如本文所闡述之Cas核酸酶)之開放閱讀框(ORF)的mRNA。本文中提供Cas9 ORF，且其為此項技術中所已知。作為一個實例，Cas9 ORF可為密碼子最佳化的，使得編碼序列包括一或多個胺基酸之一或多個替代密碼子。如本文所用之「替代密碼子」係指給定胺基酸之密碼子使用之變化，且可為或可不為給定表現系統之較佳或最佳化密碼子(密碼子最佳化的)。較佳之密碼子使用或在給定表現系統中容忍度良好之密碼子為此項技術中所已知。WO2013/176772、WO2014/065596、WO2016/106121、WO2019/067910及WO2022/125968之Cas9編碼序列、Cas9 mRNA及Cas9蛋白序列在此係以引用的方式併入。特定而言，WO2019/067910段落[0449]中表格之ORF及Cas9胺基酸序列，以及WO2019/067910段落[0214]-[0234]中之Cas9 mRNA及ORF在此係以引用的方式併入。
在一些實施例中，經修飾之ORF可至少在一個、複數個或所有尿苷位置處包含經修飾之尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷為在5位例如經鹵素、甲基或乙基修飾之尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷為在1位例如經鹵素、甲基或乙基修飾之假尿苷。經修飾之尿苷可為例如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其組合。在一些實施例中，經修飾之尿苷為5-甲氧基尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷為5-碘尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷為假尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷為N1-甲基-假尿苷。在一些實施例中，經修飾之尿苷為假尿苷與N1-甲基-假尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾之尿苷為假尿苷與5-甲氧基尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾之尿苷為N1-甲基假尿苷與5-甲氧基尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾之尿苷為5-碘尿苷與N1-甲基-假尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾之尿苷為假尿苷與5-碘尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾之尿苷為5-碘尿苷與5-甲氧基尿苷之組合。
在一些實施例中，本文所揭示之mRNA包含5'帽，諸如帽0、帽1或帽2。5'帽通常為7-甲基鳥嘌呤核糖核苷酸(其可經進一步修飾，例如ARCA (抗反向帽類似物；Thermo Fisher Scientific目錄號AM8045)為包含7-甲基鳥嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸之帽類似物，其連接至鳥嘌呤核糖核苷酸之5'位)，其經由5'-三磷酸連接至mRNA之5'至3'鏈之第一核苷酸之5'位，亦即第一帽近端核苷酸。在帽0中，mRNA之第一及第二帽近端核苷酸二者之核糖均包含2'-羥基。在帽1中，mRNA之第一及第二轉錄核苷酸之核糖分別包含2'-甲氧基及2'-羥基。例如，參見CleanCapTMAG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink Biotechnologies，目錄號N-7113)或CleanCapTMGG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLink Biotechnologies，目錄號N-7133)。在帽2中，mRNA之第一及第二帽近端核苷酸二者之核糖均包含2'-甲氧基。例如，參見Katibah等人(2014)Proc Natl Acad Sci USA111(33):12025-30；Abbas等人(2017)Proc Natl Acad Sci USA114(11):E2106-E2115。
在一些實施例中，mRNA進一步包含多聚腺苷酸化(聚A)尾。在一些實施例中，聚A尾包含20、30、40、50、60、70、80、90或100個腺嘌呤(SEQ ID NO: 147)，視情況高達300個腺嘌呤(SEQ ID NO: 148)。在一些實施例中，聚A尾包含95、96、97、98、99或100個腺嘌呤核苷酸(SEQ ID NO: 149)。
G. 用於工程改造之T細胞本文所提供之經工程改造之細胞係自富含T細胞之細胞群體中製備。在一些實施例中，T細胞為CD4+ T細胞。CD4+ T細胞可為自體或同種異體細胞。此類細胞可容易地自新鮮leukopak樣品中獲得，該等樣品可自各種來源(包括例如StemCell Technologies)商業獲得。CD4+ T細胞可使用市售套組使用常規方法來分離，例如使用人類CD4+ T細胞分離套組藉由負向選擇來分離。然而，自其他來源製備CD4+ T細胞之方法亦為此項技術中所已知。舉例而言，諸如造血幹細胞(HSC，諸如自骨髓或臍帶血中分離之彼等細胞)、造血祖細胞(例如淋巴樣祖細胞)或間葉幹細胞(MSC)等多潛能細胞可用於獲得CD4+ T細胞。多潛能細胞能夠發育成一種以上之細胞類型，但在分化寬度上較富潛能細胞更有限。多潛能細胞可源自已確立之細胞株，或自人類骨髓或臍帶中分離。舉例而言，可在G-CSF誘導之動員、普樂沙福(plerixafor)誘導之動員或其組合之後自患者或健康供體中分離HSC。為自血液或骨髓中分離HSC，可用結合不期望細胞之抗體淘選血液或骨髓中之細胞，諸如針對CD4及CD8 (T細胞)、CD45 (B細胞)、GR-I (顆粒球)及Iad (分化抗原呈遞細胞)之抗體(例如，參見Inaba等人(1992) J Exp Med. 176: 1693-1702)。促進分化成CD4+ T細胞之方法為此項技術中所已知。與根據此項技術中已知之方法擴增tTreg相比，如例如在編輯第一天后8、9、10、11、12、13、14、15天所量測，自如本文所闡述之CD4+ T細胞工程改造之T細胞可產生例如多500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上或1000倍以上之細胞。
在一些實施例中，經工程改造者為富含CD8+ T細胞之細胞群體。CD8+ T細胞可為自體或同種異體細胞。與CD4+ T細胞一樣，CD8+ T細胞可自樣品(例如市售樣品或患者樣品)分離，或可根據此項技術中已知之方法自其他來源製備。舉例而言，來源可包括多潛能細胞，諸如造血幹細胞(HSC，諸如自骨髓或臍帶血中分離之彼等細胞)、造血祖細胞(例如淋巴樣祖細胞)或間葉幹細胞(MSC)。促進分化成CD8+ T細胞之方法為此項技術中所已知。與根據此項技術中已知之方法擴增tTreg相比，如例如在編輯第一天后8、9、10、11、12、13、14、15天所量測，自如本文所闡述之CD8+ T細胞工程改造之T細胞可產生例如多500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上或1000倍以上之細胞。
III. 遞送方法本文所揭示之嚮導RNA、RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)及核酸序列可使用此項技術中可獲得之各種已知及適宜方法在活體外或離體遞送至細胞或細胞群體，以供產生經工程改造之T細胞，該等細胞包含編碼dmTGFB1之插入序列；視情況進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、對編碼IFNG或IL17A之內源核酸序列之修飾(例如敲低)、編碼調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)之插入序列；且視情況進一步包含編碼靶向受體(例如CAR)之插入序列，且視情況進一步包含對TCR序列之修飾(例如敲低)。嚮導RNA、RNA引導之DNA結合劑及核酸構築體可個別地或以任何組合一起遞送，視情況使用相同或不同之遞送方法。
可使用習知基於病毒及非病毒之基因遞送方法將嚮導RNA以及RNA引導之DNA結合劑及供體構築體引入細胞(例如哺乳動物細胞)及靶組織中。如本文進一步提供，非病毒載體遞送系統核酸諸如非病毒載體、質體載體及例如裸核酸，以及與遞送媒劑(諸如脂質體、脂質奈米顆粒(LNP)或泊洛沙姆(poloxamer))複合之核酸。病毒載體遞送系統包括DNA及RNA病毒。
用於核酸之非病毒遞送之方法及組合物包括電穿孔、脂質轉染、顯微注射、基因槍、病毒體、脂質體、免疫脂質體、LNP、聚陽離子或脂質:核酸結合物物、裸核酸(例如裸DNA/RNA)、人工病毒粒子及劑增強之DNA攝取。使用例如Sonitron 2000系統(Rich-Mar)之聲致穿孔亦可用於遞送核酸。
亦可將含有嚮導RNA、RNA引導之DNA結合劑及供體構築體之各種遞送系統(例如載體、脂質體、LNP)單獨或組合投與給離體細胞或細胞培養物。藉由通常用於引入分子以與血液、流體或細胞最終接觸之任何途徑進行投與，該等途徑包括(但不限於)注射、輸注、外用施加及電穿孔。投與此類核酸之適宜方法係可獲得的，且為熟習此項技術者所熟知。
在某些實施例中，本揭示案提供DNA或RNA載體，該等載體編碼本文所揭示之任一組合物，例如包含本文所闡述之任一或多種嚮導序列之嚮導RNA，例如用於修飾(例如敲低) TGFBR2、IFNG及TNFA，或供體構築體，該供體構築體包含編碼dmTGFB1分子之序列、編碼以下各項之序列：調控性T細胞促進分子，例如IL10或CTLA4，或靶向受體，例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR。在一些實施例中，載體亦包含編碼RNA引導之DNA結合劑之序列。在某些實施例中，DNA或RNA載體編碼本文所闡述之任一或多種組合物或其任何組合。在一些實施例中，載體進一步包含例如啟動子、增強子及調控序列。在一些實施例中，包含含有本文所闡述之任一或多種嚮導序列之嚮導RNA的載體亦包含如本文所揭示之編碼crRNA、trRNA或crRNA與trRNA之一或多種核苷酸序列。
在某些實施例中，本揭示案提供編碼調控性T細胞促進分子及靶向受體之DNA或RNA載體。此類載體容許基於亦含有調控性T細胞促進分子之編碼序列之細胞中受體之存在來選擇細胞。基於細胞表面分子之存在的正向及負向選擇方法為此項技術中所已知。
在一些實施例中，載體包含編碼本文所闡述之嚮導RNA之核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含嚮導RNA之一個拷貝。在其他實施例中，載體包含嚮導RNA之一個以上拷貝。在具有一種以上嚮導RNA之實施例中，嚮導RNA可為非一致的，使得其靶向不同的靶序列，或可為一致的，此乃因其靶向相同的靶序列。在載體包含一種以上嚮導RNA之一些實施例中，每一嚮導RNA可具有其他不同性質，諸如在具有RNA引導之DNA核酸酶的複合物(諸如Cas RNP複合物)內之活性或穩定性。在一些實施例中，可將編碼嚮導RNA之核苷酸序列可操作地連接至至少一種轉錄或轉譯控制序列，諸如啟動子、3' UTR或5' UTR。在一個實施例中，啟動子可為tRNA啟動子，例如tRNALys3，或tRNA嵌合體。參見Mefferd等人，RNA. 2015 21:1683-9；Scherer等人，Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628。在一些實施例中，啟動子可由RNA聚合酶III (Pol III)識別。Pol III啟動子之非限制性實例包括U6及H1啟動子。在一些實施例中，可將編碼嚮導RNA之核苷酸序列可操作地連接至小鼠或人類U6啟動子。在其他實施例中，可將編碼嚮導RNA之核苷酸序列可操作地連接至小鼠或人類H1啟動子。在具有一種以上嚮導RNA之實施例中，用於驅動表現之啟動子可為相同或不同的。在一些實施例中，編碼嚮導RNA之crRNA的核苷酸及編碼嚮導RNA之trRNA的核苷酸可在同一載體上提供。在一些實施例中，編碼crRNA之核苷酸及編碼trRNA之核苷酸可由相同啟動子驅動。在一些實施例中，crRNA及trRNA可轉錄成單一轉錄物。舉例而言，crRNA及trRNA可由單一轉錄物加工形成雙分子嚮導RNA。或者，crRNA及trRNA可轉錄成單分子嚮導RNA (sgRNA)。在其他實施例中，crRNA及trRNA可由其在同一載體上之相應啟動子驅動。在其他實施例中，crRNA及trRNA可由不同載體編碼。
在一些實施例中，編碼嚮導RNA之核苷酸序列可位於包含編碼RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白)之核苷酸序列的同一載體上。在一些實施例中，嚮導RNA及RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白)之表現可由其自身相應啟動子驅動。在一些實施例中，嚮導RNA之表現可由驅動RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白)之表現的相同啟動子驅動。在一些實施例中，嚮導RNA及RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白)轉錄物可含於單一轉錄物內。舉例而言，嚮導RNA可在RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白)轉錄物之非轉譯區(UTR)內。在一些實施例中，嚮導RNA可在轉錄物之5' UTR內。在其他實施例中，嚮導RNA可在轉錄物之3' UTR內。在一些實施例中，轉錄物之細胞內半衰期可藉由在其3' UTR內含有嚮導RNA且藉此縮短其3' UTR之長度來減少。在其他實施例中，嚮導RNA可在轉錄物之內含子內。在一些實施例中，可在嚮導RNA所位於之內含子處添加適宜剪接位點，使得嚮導RNA正確地自轉錄物中剪接出。在一些實施例中，來自同一載體的RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白)及嚮導RNA在時間上非常接近之表現可促進更有效地形成CRISPR RNP複合物。
在一些實施例中，編碼嚮導RNA或RNA引導之DNA結合劑的核苷酸序列可位於包含如下構築體之同一載體上，該構築體包含編碼以下各項之序列：dmTGFB1分子；調控性T細胞促進分子，例如IL10、CTLA4；或靶向受體，例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR。在一些實施例中，包含編碼以下各項之序列的構築體與嚮導RNA (或RNA引導之DNA結合劑)在同一載體上之鄰近性可促進更有效地將該構築體插入至由該嚮導RNA/RNA引導之DNA結合劑產生的插入位點中：dmTGFB1分子；調控性T細胞促進分子，例如IL10、CTLA4；或靶向受體，例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR。
在某些實施例中，DNA及RNA載體可包括在單一啟動子下表現之一個以上開放閱讀框，該啟動子存在於載體中或存在於基因體插入位點處。在此類實施例中，自裂解肽之編碼序列可包括在開放閱讀框之間。自裂解肽可為例如2A肽，例如P2A肽、E2A肽、F2A肽或T2A肽。
在一些實施例中，載體包含編碼sgRNA及mRNA之一或多種核苷酸序列，該mRNA編碼RNA引導之DNA結合劑，其可為Cas蛋白，諸如Cas9或Cpf1。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA及mRNA之一或多種核苷酸序列，該mRNA編碼RNA引導之DNA結合劑，其可為Cas蛋白，諸如Cas9或Cpf1。在一個實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(亦即Spy Cas9)。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自腦膜炎雙球菌之Cas9核酸酶(亦即Nme Cas9，例如Nme1、Nme2或Nme3 Cas9)。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA與trRNA (其可為sgRNA)之核苷酸序列包含嚮導序列或由嚮導序列組成，該嚮導序列側接來自天然存在之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分。包含crRNA、trRNA或crRNA與trRNA或由其組成之核酸可進一步包含載體序列，其中該載體序列包含或由不與crRNA、trRNA或crRNA與trRNA一起天然發現之核酸組成。
在一些實施例中，crRNA及trRNA由一個載體內之非鄰接核酸編碼。在其他實施例中，crRNA及trRNA可由鄰接核酸編碼。在一些實施例中，crRNA及trRNA由單一核酸之相對股編碼。在其他實施例中，crRNA及trRNA由單一核酸之同一股編碼。
在一些實施例中，如本文所揭示，載體包含供體構築體，該供體構築體包含編碼以下各項之序列：dmTGFB1分子；調控性T細胞促進分子，例如IL10或CTLA4；或靶向受體，例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR。在一些實施例中，除本文所揭示之供體構築體以外，載體可進一步包含編碼本文所闡述之嚮導RNA之核酸或編碼RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶，諸如Cas9)之核酸。在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸各自或兩者均位於與包含本文所揭示之供體構築體之載體不同的載體上。在任一實施例中，如本文所闡述，載體可包括其他序列，包括(但不限於)啟動子、增強子、調控序列。在一些實施例中，啟動子不驅動供體構築體之調控性T細胞促進分子(例如IL10或CTLA4)或靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR)之表現。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA或crRNA與trRNA之一或多種核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼sgRNA及mRNA之一或多種核苷酸序列，該mRNA編碼RNA引導之DNA核酸酶，其可為Cas核酸酶(例如Cas9)。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA及mRNA之一或多種核苷酸序列，該mRNA編碼RNA引導之DNA核酸酶，其可為Cas核酸酶，諸如Cas9。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(亦即Spy Cas9)。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自腦膜炎雙球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA與trRNA (其可為sgRNA)之核苷酸序列包含嚮導序列或由嚮導序列組成，該嚮導序列側接來自天然存在之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分。包含crRNA、trRNA或crRNA與trRNA或由其組成之核酸可進一步包含載體序列，其中該載體序列包含或由不與crRNA、trRNA或crRNA與trRNA一起天然發現之核酸組成。
在一些實施例中，載體可為環狀的。在其他實施例中，載體可為線性的。在一些實施例中，載體可封裝在脂質奈米顆粒、脂質體、非脂質奈米顆粒或病毒衣殼中。非限制性例示性載體包括質體、噬粒、黏粒、人工染色體、微型染色體、轉位子、病毒載體及表現載體。
在一些實施例中，載體可為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體可自其野生型對應物進行遺傳修飾。舉例而言，病毒載體可包含一或多個核苷酸之插入、缺失或取代，以促進選殖或使得載體之一或多種性質發生改變。此類性質可能包括包裝容量、轉導效率、免疫原性、基因體整合、複制、轉錄及轉譯。在一些實施例中，可缺失病毒基因體之一部分，使得病毒能夠包裝大小更大之外源序列。在一些實施例中，病毒載體可具有增強之轉導效率。在一些實施例中，病毒誘導之免疫反應可降低。在一些實施例中，可使促進病毒序列整合至基因體中之病毒基因(諸如整合酶)突變，使得病毒變得不具整合性。在一些實施例中，病毒載體可為複制缺陷的。在一些實施例中，病毒載體可包含外源轉錄或轉譯控制序列，以驅動載體上編碼序列之表現。在一些實施例中，病毒可為輔助依賴性的。舉例而言，病毒可能需要一或多種輔助病毒來提供將載體擴增且包裝成病毒顆粒所需之病毒組分(諸如病毒蛋白)。在此一情形下，可將一或多種輔助組分(包括一或多種編碼病毒組分之載體)與本文所闡述之載體系統一起引入至細胞或細胞群體中。在其他實施例中，病毒可為無輔助的。舉例而言，病毒可能能夠在無輔助病毒之情形下擴增並包裝載體。在一些實施例中，本文所闡述之載體系統亦可編碼病毒擴增及包裝所需之病毒組分。
非限制性例示性病毒載體包括腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體、腺病毒載體、輔助依賴性腺病毒載體(HDAd)、單純疱疹病毒(HSV-1)載體、噬菌體T4、桿狀病毒載體及反轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體可為AAV載體。在其他實施例中，病毒載體可為慢病毒載體。
在一些實施例中，「AAV」係指所有血清型、亞型及天然存在之AAV以及重組AAV。「AAV」可用於指病毒自身或其衍生物。術語「AAV」包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10及其雜合體、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV及綿羊AAV。在某些實施例中，可接受AAV用於人類細胞之離體應用。在某些實施例中，AAV為AAV6。AAV之各種血清型之基因體序列，以及天然末端重複序列(TR)、Rep蛋白及衣殼亞單元之序列為此項技術中所已知。此類序列可在文獻或公共資料庫(諸如GenBank)中找到。如本文所用之「AAV載體」係指包含非AAV起源之異源序列(亦即與AAV異源之核酸序列)的AAV載體，其通常包含編碼所關注異源多肽之序列。構築體可包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10及其雜合體、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV及綿羊AAV衣殼序列。一般而言，異源核酸序列(轉殖基因)側接至少一個、且通常兩個AAV反向末端重複序列(ITR)。AAV載體可為單股的(ssAAV)或自身互補的(scAAV)。
在一些實施例中，慢病毒可為整合性的。在一些實施例中，慢病毒可為非整合性的。在一些實施例中，病毒載體可為腺病毒載體。在一些實施例中，腺病毒可為高選殖能力或「無腸(gutless)」腺病毒，其中除了5'及3'反向末端重複序列(ITR)及包裝信號(『I』)之外的所有編碼病毒區域均自病毒中缺失，以增加其包裝能力。在其他實施例中，病毒載體可為HSV-1載體。在一些實施例中，基於HSV-1之載體為輔助依賴性的，且在其他實施例中，其為輔助非依賴性的。舉例而言，僅保留包裝序列之擴增子載體需要具有用於包裝之結構組分的輔助病毒，而移除非必需病毒功能之30 kb缺失之HSV-1載體則不需要輔助病毒。在其他實施例中，病毒載體可為噬菌體T4。在一些實施例中，當病毒之頭部被清空時，噬菌體T4可能能夠包裝任何線性或環狀DNA或RNA分子。在其他實施例中，病毒載體可為桿狀病毒載體。在其他實施例中，病毒載體可為反轉錄病毒載體。在使用具有較小選殖能力之AAV或其他載體之實施例中，可使用一種以上載體來遞送如本文所揭示之載體系統之所有組分。舉例而言，一種AAV載體可含有編碼RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白(例如Cas9))之序列，而第二AAV載體可含有一或多種嚮導序列。
在一些實施例中，載體系統可能能夠驅動一或多種核酸酶組分在細胞中之表現。在一些實施例中，載體不包含在整合至細胞中後即驅動一或多種編碼序列之表現的啟動子(例如，如本文所例示，使用細胞之內源啟動子，諸如當插入細胞之特定基因體基因座時)。驅動不同類型細胞(例如CD4+ T細胞)中之表現的適宜啟動子為此項技術中所已知。在一些實施例中，啟動子可為野生型的。在其他實施例中，啟動子可經修飾以獲得更高效或有效之表現。在其他實施例中，啟動子可經截短，但保留其功能。舉例而言，啟動子可具有正常大小，或適於將載體正確包裝至病毒中之減小的大小。
在一些實施例中，載體可包含編碼本文所闡述之RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白(例如Cas9))之核苷酸序列。在一些實施例中，由載體編碼之核酸酶可為Cas蛋白。在一些實施例中，載體系統可包含編碼核酸酶之核苷酸序列之一個拷貝。在其他實施例中，載體系統可包含編碼核酸酶之核苷酸序列之一個以上拷貝。在一些實施例中，可將編碼核酸酶之核苷酸序列可操作地連接至至少一種轉錄或轉譯控制序列。在一些實施例中，可將編碼核酸酶之核苷酸序列可操作地連接至至少一個啟動子。
在一些實施例中，載體可包含任一或多種構築體，該(等)構築體包含編碼以下各項之序列：dmTGFB1分子；調控性T細胞促進分子，例如IL10、CTLA4；或靶向受體，例如CAR，例如如本文所闡述之MAdCAM-1 CAR。在一些實施例中，可將dmTGFB1分子、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR)之序列可操作地連接至至少一個轉錄或轉譯控制序列。在一些實施例中，可將dmTGFB1分子、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR)之序列可操作地連接至至少一個啟動子。在一些實施例中，dmTGFB1分子、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR)之序列不與驅動異源基因表現之啟動子連接。
在一些實施例中，啟動子可為組成型、誘導型或組織特異性的。在一些實施例中，啟動子可為組成型啟動子。非限制性例示性組成型啟動子包括巨細胞病毒立即早期啟動子(CMV)、猿猴病毒(SV40)啟動子、腺病毒主要晚期(MLP)啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV)啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、延伸因子-α (EF1a)啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子、微管蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、其功能片段，或上述任一者之組合。在一些實施例中，啟動子可為CMV啟動子。在一些實施例中，啟動子可為經截短之CMV啟動子。在其他實施例中，啟動子可為EF1a啟動子。在一些實施例中，啟動子可為誘導型啟動子。非限制性例示性誘導型啟動子包括可藉由熱休克、光、化學品、肽、金屬、類固醇、抗生素或醇誘導之彼等啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子可為具有低基礎(非誘導)表現水準之啟動子，諸如Tet-On®啟動子(Clontech)。
在某些實施例中，可接受啟動子用於人類細胞之離體應用。
在一些實施例中，啟動子可為組織特異性啟動子，例如，對於在T細胞中表現具有特異性之啟動子。
在一些實施例中，組合物包含載體系統。在一些實施例中，載體系統可包含一種單一載體。在其他實施例中，載體系統可包含兩種載體。在其他實施例中，載體系統可包含三種載體。當不同的嚮導RNA用於多工處理時，或當使用多個嚮導RNA拷貝時，載體系統可包含三種以上之載體。
在一些實施例中，載體系統可包含誘導型啟動子以僅在其遞送至靶細胞後才開始表現。非限制性例示性誘導型啟動子包括可藉由熱休克、光、化學品、肽、金屬、類固醇、抗生素或醇誘導之彼等啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子可為具有低基礎(非誘導)表現水準之啟動子，諸如Tet-On®啟動子(Clontech)。
在其他實施例中，載體系統可包含組織特異性啟動子。
下文提供非限制性例示性病毒載體序列：CTLA4插入(核苷酸序列)ATGGCCTGCTTGGGCTTCCAAAGGCATAAAGCCCAGCTTAATCTTGCTACTCGCACGTGGCCCTGCACATTGCTCTTTTTCCTCCTGTTCATTCCCGTGTTTTGCAAGGCGATGCATGTGGCACAACCTGCCGTCGTTCTGGCATCATCAAGAGGTATTGCTAGCTTCGTTTGTGAGTACGCCTCCCCTGGAAAAGCGACGGAGGTGCGCGTCACTGTATTGCGGCAAGCCGACAGCCAAGTTACTGAAGTCTGCGCGGCAACGTATATGATGGGCAATGAGCTGACATTCCTTGACGATTCAATCTGCACGGGAACAAGTAGTGGTAACCAGGTGAATCTCACTATTCAAGGTCTGAGAGCCATGGACACCGGCCTCTACATTTGTAAGGTGGAGCTGATGTATCCTCCCCCATATTATCTGGGGATCGGAAATGGGACACAGATATATGTTATTGATCCCGAGCCATGTCCCGATAGTGACTTCCTCTTGTGGATACTTGCCGCTGTGAGCAGTGGTTTGTTTTTTTATTCATTCCTCCTTACGGCAGTATCACTTTCAAAAATGCTCAAGAAGCGAAGTCCTTTGACAACTGGCGTATATGTCAAAATGCCACCAACAGAGCCCGAATGTGAGAAACAGTTCCAGCCGTACTTTATTCCTATAAACTGA (SEQ ID NO: 137)
CTLA4插入(胺基酸序列)MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN (SEQ ID NO: 130)
IL10插入(核苷酸序列)ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACTGA (SEQ ID NO: 138)
IL10插入(胺基酸序列)MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO: 124)
空的慢病毒載體ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGATGGCCGCCCCCTTCACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGTCTTCTTTTTTGAAGACACTTCGGACTGTAGAACTCTGAACCTCGAGCAATTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTCTGCGTTGTTGTCGGTGCTCGTTCTCTGCTCTTCACGCTACTGAATTCATCACCGGTTCTTCGAAGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTCTAGACGCCACCATGAGCGGGGGCGAGGAGCTGTTCGCCGGCATCGTGCCCGTGCTGATCGAGCTGGACGGCGACGTGCACGGCCACAAGTTCAGCGTGCGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCGACTACGGCAAGCTGGAGATCAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTCTGCTACGGCATCCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGAGCACATGAAGATGAACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACATCCAGGAGCGCACCATCCAGTTCCAGGACGACGGCAAGTACAAGACCCGCGGCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCAAGGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAGCTTCAACAGCCACAACGTGTACATCCGCCCCGACAAGGCCAACAACGGCCTGGAGGCTAACTTCAAGACCCGCCACAACATCGAGGGCGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGACCAACGTGCCCCTGGGCGACGGCCCCGTGCTGATCCCCATCAACCACTACCTGAGCACTCAGACCAAGATCAGCAAGGACCGCAACGAGGCCCGCGACCACATGGTGCTCCTGGAGTCCTTCAGCGCCTGCTGCCACACCCACGGCATGGACGAGCTGTACAGGGGATCCGAGGGCAGAGGAAGCCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTTCCGGGATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAATCTAGGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTCCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCTCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGACTTTTGCAGAGACCAAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTG (SEQ ID NO: 141)
空的慢病毒載體GCGATCGCAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTGGCTCCCGATCGTTGCGTTACACACACAATTACTGCTGATCGAGTGTAGCCTTCGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGATAGCTGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCTGATCATTGTCGATCCTACCATCCACTCGACACACCCGCCAGGGCCCTGCCAAGCTTCCGAGCTCTCGATATCAAAGGAGGTACCCAACATGGTCAGCAAGGGCGAGGAACTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGTACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAATGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAACTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGAAGTTGTCTCCTCCTGCACTGACTGACTGATACAATCGATTTCTGGATCCGCAGGCCTCTGCTAGAAGTTGTCTCCTCCTGCACTGACTGACTGATACAATCGATTTCTGGATCCGCAGGCCTCTGCTAGCTTGACTGACTGAGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTCCTGGCCAACGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATATCGTTAAGCTGGAGCCTGGGAGCCGGCCTGGCCCTCCGCCCCCCCCACCCCCGCAGCCCACCCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGAGTGGCCGACAGTGCCCGTGGAGTTCTCGTGACCTGAGGTGCAGGGCCGGCGCTAGGGACACGTCCGTGCACGTGCCGAGGCCCCCTGTGCAGCTGCAAGGGACAGGCCTAGCCCTGCAGGCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCTCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGACGCTTTTTTGGAGGCCGAGGCTTTTGCAAAGATCGAACAAGAGACAGGACCTGCAGGTTAATTAAATTTAAATCATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCATTTAAATGGCCGGCCTGGCGCGCCGTTTAAACCTAGATATTGATAGTCTGATCGGTCAACGTATAATCGAGTCCTAGCTTTTGCAAACATCTATCAAGAGACAGGATCAGCAGGAGGCTTTCGCATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCGCGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGCTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTATTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATTGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACCTTGCGTAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAGTTGATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACCGATTCTAGGTGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAAGATCCCGAATCGTTTAAAC (SEQ ID NO: 142)
其他序列在整個說明書及下表中提供；且與本文一起提交之序列表形成說明書之一部分。
序列表格在下表中，術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」用於表示經2'-O-Me修飾之核苷酸。
在下表中，每一「N」用於獨立地表示任何核苷酸(例如A、U、T、C、G)。在某些實施例中，核苷酸為未經修飾之RNA核苷酸殘基，亦即核糖及磷酸二酯主鏈。
在下表中，「*」用於表示PS修飾。在本申請案中，術語A*、C*、U*或G*可用於表示以PS鍵與下一(例如3')核苷酸連接之核苷酸。
應理解，若關於RNA提及DNA序列(包含T)，則T應經U (其可端視背景為經修飾或未經修飾的)替換，且反之亦然。
在下表中，使用單一胺基酸字母代碼提供肽序列。
表4：序列表
SEQ ID 描述 序列
204 編碼TGFB1之核酸序列 atgccgccctccgggctgcggctgctgctgctgctgctaccgctgctgtggctactggtgctgacgcctggccggccggccgcgggactatccacctgcaagactatcgacatggagctggtgaagcggaagcgcatcgaggccatccgcggccagatcctgtccaagctgcggctcgccagccccccgagccagggggaggtgccgcccggcccgctgcccgaggccgtgctcgccctgtacaacagcacccgcgaccgggtggccggggagagtgcagaaccggagcccgagcctgaggccgactactacgccaaggaggtcacccgcgtgctaatggtggaaacccacaacgaaatctatgacaagttcaagcagagtacacacagcatatatatgttcttcaacacatcagagctccgagaagcggtacctgaacccgtgttgctctcccgggcagagctgcgtctgctgaggctcaagttaaaagtggagcagcacgtggagctgtaccagaaatacagcaacaattcctggcgatacctcagcaaccggctgctggcacccagcgactcgccagagtggttatcttttgatgtcaccggagttgtgcggcagtggttgagccgtggaggggaaattgagggctttcgccttagcgcccactgctcctgtgacagcagggataacacactgcaagtggacatcaacgggttcactaccggccgccgaggtgacctggccaccattcatggcatgaaccggcctttcctgcttctcatggccaccccgctggagagggcccagcatctgcaaagctcccggcaccgccgagccctggacaccaactattgcttcagctccacggagaagaactgctgcgtgcggcagctgtacattgacttccgcaaggacctcggctggaagtggatccacgagcccaagggctaccatgccaacttctgcctcgggccctgcccctacatttggagcctggacacgcagtacagcaaggtcctggccctgtacaaccagcataacccgggcgcctcggcggcgccgtgctgcgtgccgcaggcgctggagccgctgcccatcgtgtactacgtgggccgcaagcccaaggtggagcagctgtccaacatgatcgtgcgctcctgcaagtgcagc
205 編碼TGFB1 R218H之核酸序列 atgccgccctccgggctgcggctgctgctgctgctgctaccgctgctgtggctactggtgctgacgcctggccggccggccgcgggactatccacctgcaagactatcgacatggagctggtgaagcggaagcgcatcgaggccatccgcggccagatcctgtccaagctgcggctcgccagccccccgagccagggggaggtgccgcccggcccgctgcccgaggccgtgctcgccctgtacaacagcacccgcgaccgggtggccggggagagtgcagaaccggagcccgagcctgaggccgactactacgccaaggaggtcacccgcgtgctaatggtggaaacccacaacgaaatctatgacaagttcaagcagagtacacacagcatatatatgttcttcaacacatcagagctccgagaagcggtacctgaacccgtgttgctctcccgggcagagctgcgtctgctgaggctcaagttaaaagtggagcagcacgtggagctgtaccagaaatacagcaacaattcctggcgatacctcagcaaccggctgctggcacccagcgactcgccagagtggttatcttttgatgtcaccggagttgtgcggcagtggttgagccgtggaggggaaattgagggctttCACcttagcgcccactgctcctgtgacagcagggataacacactgcaagtggacatcaacgggttcactaccggccgccgaggtgacctggccaccattcatggcatgaaccggcctttcctgcttctcatggccaccccgctggagagggcccagcatctgcaaagctcccggcaccgccgagccctggacaccaactattgcttcagctccacggagaagaactgctgcgtgcggcagctgtacattgacttccgcaaggacctcggctggaagtggatccacgagcccaagggctaccatgccaacttctgcctcgggccctgcccctacatttggagcctggacacgcagtacagcaaggtcctggccctgtacaaccagcataacccgggcgcctcggcggcgccgtgctgcgtgccgcaggcgctggagccgctgcccatcgtgtactacgtgggccgcaagcccaaggtggagcagctgtccaacatgatcgtgcgctcctgcaagtgcagc
206 編碼TGFB1 R218C之核酸序列 atgccgccctccgggctgcggctgctgctgctgctgctaccgctgctgtggctactggtgctgacgcctggccggccggccgcgggactatccacctgcaagactatcgacatggagctggtgaagcggaagcgcatcgaggccatccgcggccagatcctgtccaagctgcggctcgccagccccccgagccagggggaggtgccgcccggcccgctgcccgaggccgtgctcgccctgtacaacagcacccgcgaccgggtggccggggagagtgcagaaccggagcccgagcctgaggccgactactacgccaaggaggtcacccgcgtgctaatggtggaaacccacaacgaaatctatgacaagttcaagcagagtacacacagcatatatatgttcttcaacacatcagagctccgagaagcggtacctgaacccgtgttgctctcccgggcagagctgcgtctgctgaggctcaagttaaaagtggagcagcacgtggagctgtaccagaaatacagcaacaattcctggcgatacctcagcaaccggctgctggcacccagcgactcgccagagtggttatcttttgatgtcaccggagttgtgcggcagtggttgagccgtggaggggaaattgagggctttTGCcttagcgcccactgctcctgtgacagcagggataacacactgcaagtggacatcaacgggttcactaccggccgccgaggtgacctggccaccattcatggcatgaaccggcctttcctgcttctcatggccaccccgctggagagggcccagcatctgcaaagctcccggcaccgccgagccctggacaccaactattgcttcagctccacggagaagaactgctgcgtgcggcagctgtacattgacttccgcaaggacctcggctggaagtggatccacgagcccaagggctaccatgccaacttctgcctcgggccctgcccctacatttggagcctggacacgcagtacagcaaggtcctggccctgtacaaccagcataacccgggcgcctcggcggcgccgtgctgcgtgccgcaggcgctggagccgctgcccatcgtgtactacgtgggccgcaagcccaaggtggagcagctgtccaacatgatcgtgcgctcctgcaagtgcagc
207 編碼TGFB1 C225R之核酸序列 atgccgccctccgggctgcggctgctgctgctgctgctaccgctgctgtggctactggtgctgacgcctggccggccggccgcgggactatccacctgcaagactatcgacatggagctggtgaagcggaagcgcatcgaggccatccgcggccagatcctgtccaagctgcggctcgccagccccccgagccagggggaggtgccgcccggcccgctgcccgaggccgtgctcgccctgtacaacagcacccgcgaccgggtggccggggagagtgcagaaccggagcccgagcctgaggccgactactacgccaaggaggtcacccgcgtgctaatggtggaaacccacaacgaaatctatgacaagttcaagcagagtacacacagcatatatatgttcttcaacacatcagagctccgagaagcggtacctgaacccgtgttgctctcccgggcagagctgcgtctgctgaggctcaagttaaaagtggagcagcacgtggagctgtaccagaaatacagcaacaattcctggcgatacctcagcaaccggctgctggcacccagcgactcgccagagtggttatcttttgatgtcaccggagttgtgcggcagtggttgagccgtggaggggaaattgagggctttcgccttagcgcccactgctccAGAgacagcagggataacacactgcaagtggacatcaacgggttcactaccggccgccgaggtgacctggccaccattcatggcatgaaccggcctttcctgcttctcatggccaccccgctggagagggcccagcatctgcaaagctcccggcaccgccgagccctggacaccaactattgcttcagctccacggagaagaactgctgcgtgcggcagctgtacattgacttccgcaaggacctcggctggaagtggatccacgagcccaagggctaccatgccaacttctgcctcgggccctgcccctacatttggagcctggacacgcagtacagcaaggtcctggccctgtacaaccagcataacccgggcgcctcggcggcgccgtgctgcgtgccgcaggcgctggagccgctgcccatcgtgtactacgtgggccgcaagcccaaggtggagcagctgtccaacatgatcgtgcgctcctgcaagtgcagc
208 編碼TGFB1 R218H C225R之核酸序列 atgccgccctccgggctgcggctgctgctgctgctgctaccgctgctgtggctactggtgctgacgcctggccggccggccgcgggactatccacctgcaagactatcgacatggagctggtgaagcggaagcgcatcgaggccatccgcggccagatcctgtccaagctgcggctcgccagccccccgagccagggggaggtgccgcccggcccgctgcccgaggccgtgctcgccctgtacaacagcacccgcgaccgggtggccggggagagtgcagaaccggagcccgagcctgaggccgactactacgccaaggaggtcacccgcgtgctaatggtggaaacccacaacgaaatctatgacaagttcaagcagagtacacacagcatatatatgttcttcaacacatcagagctccgagaagcggtacctgaacccgtgttgctctcccgggcagagctgcgtctgctgaggctcaagttaaaagtggagcagcacgtggagctgtaccagaaatacagcaacaattcctggcgatacctcagcaaccggctgctggcacccagcgactcgccagagtggttatcttttgatgtcaccggagttgtgcggcagtggttgagccgtggaggggaaattgagggctttCACcttagcgcccactgctccAGAgacagcagggataacacactgcaagtggacatcaacgggttcactaccggccgccgaggtgacctggccaccattcatggcatgaaccggcctttcctgcttctcatggccaccccgctggagagggcccagcatctgcaaagctcccggcaccgccgagccctggacaccaactattgcttcagctccacggagaagaactgctgcgtgcggcagctgtacattgacttccgcaaggacctcggctggaagtggatccacgagcccaagggctaccatgccaacttctgcctcgggccctgcccctacatttggagcctggacacgcagtacagcaaggtcctggccctgtacaaccagcataacccgggcgcctcggcggcgccgtgctgcgtgccgcaggcgctggagccgctgcccatcgtgtactacgtgggccgcaagcccaaggtggagcagctgtccaacatgatcgtgcgctcctgcaagtgcagc
209 編碼GFP之核酸序列 atgtcgaagggagaagaactgttcacaggagtcgtcccgatcctggtcgaactggacggagacgtcaacggacacaagttctcggtcagaggagaaggagaaggagacgcaacaaacggaaagctgacactgaagttcatctgcacaacaggaaagctgccggtcccgtggccgacactggtcacaacactgacatacggagtccagtgcttttcgagatacccggaccacatgaagagacacgacttcttcaagtcggcaatgccggaaggatacgtccaggaaagaacaatctcgttcaaggacgacggaacatacaagacaagagcagaagtcaagttcgaaggagacacactggtcaacagaatcgaactgaagggaatcgacttcaaggaagacggaaacatcctgggacacaagctggaatacaacttcaactcgcacaacgtctacatcacagcagacaagcagaagaacggaatcaaggcaaacttcaagatcagacacaacgtcgaagacggatcggtccagctggcagaccactaccagcagaacacaccgatcggagacggaccggtcctgctgccggacaaccactacctgtcgacacagtcggtcctgtcgaaggacccgaacgaaaagagagaccacatggtcctgctggaattcgtcacagcagcaggaatcacacacggaatggacgaactgtacaagt
210 TGFB1之胺基酸序列 MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
211 TGFB1 R218H之胺基酸序列 MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFHLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
212 TGFB1 R218C之胺基酸序列 MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFCLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
213 TGFB1 C225R之胺基酸序列 MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSRDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
214 TGFB1 R218H C225R之胺基酸序列 MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFHLSAHCSRDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS
215 GFP之胺基酸序列 MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK
216 慢病毒載體 tatgagtaaacttggtctgacagTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagctgacgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgatttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttgctagaccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacaggctagctaggtggatccGAATAAGGCCTGCAACGACACACACACGAACAAGCAGAGCCGCTGGACGCCGACTGCGGGAcgaaaggcccggagatgaggaagaggagaacagcgcggcagacgtgcgcttttgaagcgtgcagaatgccgggcctccggaggaccttcgggcgcccgccccgcccctgagcccgcccctgagcccgcccccggacccaccccttcccagcctctgagcccagaaagcgaaggagcaaagctgctattggccgctgccccaaaggcctacccgcttccattgctcagcggtgctgtccatctgcacgagactagtgagacgtgctacttccatttgtcacgtcctgcacgacgcgagctgcggggcgggggggaacttcctgactaggggaggagtagaaggtggcgcgaaggggccaccaaagaacggagccggttggcgcctaccggtggatgtggaatgtgtgcgaggccagaggccacttgtgtagcgccaagtgcccagcggggctgctaaagcgcatgctccagactgccttgggaaaagcgcctcccctacccatcgatGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGTCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCC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119 G019753 mC*mC*mA*GAGCAUCCAAAAGAGUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
120 G019757 mA*mG*mA*GCUCUUACCUACAACAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
217 G027259 mU*mC*mA*CAGAGGGAUAUCUCUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
218 SpCas9之開放閱讀框 AUGGACAAGAAGUACUCCAUCGGCCUGGACAUCGGCACCAACUCCGUGGGCUGGGCCGUGAUCACCGACGAGUACAAGGUGCCCUCCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGCAACACCGACCGGCACUCCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGCGCCCUGCUGUUCGACUCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCUGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGUACACCCGGCGGAAGAACCGGAUCUGCUACCUGCAGGAGAUCUUCUCCAACGAGAUGGCCAAGGUGGACGACUCCUUCUUCCACCGGCUGGAGGAGUCCUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAGGUGGCCUACCACGAGAAGUACCCCACCAUCUACCACCUGCGGAAGAAGCUGGUGGACUCCACCGACAAGGCCGACCUGCGGCUGAUCUACCUGGCCCUGGCCCACAUGAUCAAGUUCCGGGGCCACUUCCUGAUCGAGGGCGACCUGAACCCCGACAACUCCGACGUGGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUGCAGACCUACAACCAGCUGUUCGAGGAGAACCCCAUCAACGCCUCCGGCGUGGACGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCCAAGUCCCGGCGGCUGGAGAACCUGAUCGCCCAGCUGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCUGUUCGGCAACCUGAUCGCCCUGUCCCUGGGCCUGACCCCCAACUUCAAGUCCAACUUCGACCUGGCCGAGGACGCCAAGCUGCAGCUGUCCAAGGACACCUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCCCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUGGCCGCCAAGAACCUGUCCGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGGGUGAACACCGAGAUCACCAAGGCCCCCCUGUCCGCCUCCAUGAUCAAGCGGUACGACGAGCACCACCAGGACCUGACCCUGCUGAAGGCCCUGGUGCGGCAGCAGCUGCCCGAGAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAACGGCUACGCCGGCUACAUCGACGGCGGCGCCUCCCAGGAGGAGUUCUACAAGUUCAUCAAGCCCAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACCGAGGAGCUGCUGGUGAAGCUGAACCGGGAGGACCUGCUGCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAACGGCUCCAUCCCCCACCAGAUCCACCUGGGCGAGCUGCACGCCAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUCUACCCCUUCCUGAAGGACAACCGGGAGAAGAUCGAGAAGAUCCUGACCUUCCGGAUCCCCUACUACGUGGGCCCCCUGGCCCGGGGCAACUCCCGGUUCGCCUGGAUGACCCGGAAGUCCGAGGAGACCAUCACCCCCUGGAACUUCGAGGAGGUGGUGGACAAGGGCGCCUCCGCCCAGUCCUUCAUCGAGCGGAUGACCAACUUCGACAAGAACCUGCCCAACGAGAAGGUGCUGCCCAAGCACUCCCUGCUGUACGAGUACUUCACCGUGUACAACGAGCUGACCAAGGUGAAGUACGUGACCGAGGGCAUGCGGAAGCCCGCCUUCCUGUCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCAUCGUGGACCUGCUGUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAGCAGCUGAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGCUUCGACUCCGUGGAGAUCUCCGGCGUGGAGGACCGGUUCAACGCCUCCCUGGGCACCUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAGGACAUCGUGCUGACCCUGACCCUGUUCGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGCGGCUGAAGACCUACGCCCACCUGUUCGACGACAAGGUGAUGAAGCAGCUGAAGCGGCGGCGGUACACCGGCUGGGGCCGGCUGUCCCGGAAGCUGAUCAACGGCAUCCGGGACAAGCAGUCCGGCAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGACGGCUUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACUCCCUGACCUUCAAGGAGGACAUCCAGAAGGCCCAGGUGUCCGGCCAGGGCGACUCCCUGCACGAGCACAUCGCCAACCUGGCCGGCUCCCCCGCCAUCAAGAAGGGCAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGGAUCGAGGAGGGCAUCAAGGAGCUGGGCUCCCAGAUCCUGAAGGAGCACCCCGUGGAGAACACCCAGCUGCAGAACGAGAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGCCGGGACAUGUACGUGGACCAGGAGCUGGACAUCAACCGGCUGUCCGACUACGACGUGGACCACAUCGUGCCCCAGUCCUUCCUGAAGGACGACUCCAUCGACAACAAGGUGCUGACCCGGUCCGACAAGAACCGGGGCAAGUCCGACAACGUGCCCUCCGAGGAGGUGGUGAAGAAGAUGAAGAACUACUGGCGGCAGCUGCUGAACGCCAAGCUGAUCACCCAGCGGAAGUUCGACAACCUGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCUGUCCGAGCUGGACAAGGCCGGCUUCAUCAAGCGGCAGCUGGUGGAGACCCGGCAGAUCACCAAGCACGUGGCCCAGAUCCUGGACUCCCGGAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGACAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUCAACAACUACCACCACGCCCACGACGCCUACCUGAACGCCGUGGUGGGCACCGCCCUGAUCAAGAAGUACCCCAAGCUGGAGUCCGAGUUCGUGUACGGCGACUACAAGGUGUACGACGUGCGGAAGAUGAUCGCCAAGUCCGAGCAGGAGAUCGGCAAGGCCACCGCCAAGUACUUCUUCUACUCCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAGAUCACCCUGGCCAACGGCGAGAUCCGGAAGCGGCCCCUGAUCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGAUCGUGUGGGACAAGGGCCGGGACUUCGCCACCGUGCGGAAGGUGCUGUCCAUGCCCCAGGUGAACAUCGUGAAGAAGACCGAGGUGCAGACCGGCGGCUUCUCCAAGGAGUCCAUCCUGCCCAAGCGGAACUCCGACAAGCUGAUCGCCCGGAAGAAGGACUGGGACCCCAAGAAGUACGGCGGCUUCGACUCCCCCACCGUGGCCUACUCCGUGCUGGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGCAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUGAAGGAGCUGCUGGGCAUCACCAUCAUGGAGCGGUCCUCCUUCGAGAAGAACCCCAUCGACUUCCUGGAGGCCAAGGGCUACAAGGAGGUGAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCCAAGUACUCCCUGUUCGAGCUGGAGAACGGCCGGAAGCGGAUGCUGGCCUCCGCCGGCGAGCUGCAGAAGGGCAACGAGCUGGCCCUGCCCUCCAAGUACGUGAACUUCCUGUACCUGGCCUCCCACUACGAGAAGCUGAAGGGCUCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAGUUCUCCAAGCGGGUGAUCCUGGCCGACGCCAACCUGGACAAGGUGCUGUCCGCCUACAACAAGCACCGGGACAAGCCCAUCCGGGAGCAGGCCGAGAACAUCAUCCACCUGUUCACCCUGACCAACCUGGGCGCCCCCGCCGCCUUCAAGUACUUCGACACCACCAUCGACCGGAAGCGGUACACCUCCACCAAGGAGGUGCUGGACGCCACCCUGAUCCACCAGUCCAUCACCGGCCUGUACGAGACCCGGAUCGACCUGUCCCAGCUGGGCGGCGACGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGUGA
219 SpCas9之胺基酸序列 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV
228 G021925 mU*mU*mC*UUUGUAGAACUUGAAGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
229 IL10 D25/E96A之胺基酸序列 MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRALRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGANLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
230 IL10 D25/E96A之核酸序列 ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGCTCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTcaaatgaaggatcagctggacaACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGCTAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACTGA
351 G029528 mU*mC*mG*CUUUGCUGAGGUCUAUAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU
個別或以任何組合形式包含嚮導RNA、RNA結合DNA結合劑或供體構築體之載體可藉由脂質體、奈米顆粒、外泌體或微泡來遞送，該供體構築體包含編碼dmTGFB1分子、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR)之序列。載體亦可藉由脂質奈米顆粒(LNP)來遞送。個別或呈任何組合形式的一或多種嚮導RNA、RNA結合DNA結合劑(例如mRNA)或包含編碼異源蛋白之序列之供體構築體可藉由LNP、脂質體、奈米顆粒、外泌體或微泡來遞送。個別或呈任何組合形式的一或多種嚮導RNA、RNA結合DNA結合劑(例如mRNA)或包含編碼異源蛋白之序列之供體構築體可藉由LNP來遞送。在一些實施例中，一或多種嚮導RNA及RNA引導之DNA結合劑 (例如mRNA)係藉由LNP來遞送。供體構築體可藉由病毒載體來遞送。
脂質奈米顆粒(LNP)係用於遞送核苷酸及蛋白質貨物之熟知方式，且可用於遞送本文所揭示之嚮導RNA、RNA引導之DNA結合劑或供體構築體中之任一者。
如本文所用，脂質奈米顆粒(LNP)係指包含複數個(亦即一個以上)藉由分子間力彼此物理締合之脂質分子的顆粒。LNP可為(例如)微球體(包括單層及多層囊泡，例如「脂質體」，亦即層狀相脂質雙層，其在一些實施例中實質上為球形，且在更特定實施例中可包含水性核心(例如包含RNA分子之大部分))、乳液中之分散相、微胞或懸浮液中之內部相(例如，參見WO2017173054，該案之內容在此係以全文引用的方式併入)。可利用熟習此項技術者已知能夠將核苷酸遞送至個體之任何LNP。例如，WO2021222287中提供用於將劑遞送至T細胞以進行修飾之例示性LNP調配物及方法。
在一些實施例中，本文提供用於將本文所闡述之任何嚮導RNA或本文所揭示之供體構築體單獨或組合遞送至細胞或細胞群體或個體之方法，其中該等組分中之任一或多者與LNP締合。在一些實施例中，該方法進一步包含RNA引導之DNA結合劑(例如Cas9或編碼Cas9之序列)。
在一些實施例中，本文提供組合物，該組合物包含單獨或呈組合形式之本文所闡述之任何嚮導RNA或本文所揭示之供體構築體以及LNP。在一些實施例中，組合物進一步包含RNA引導之DNA結合劑(例如Cas9或編碼Cas9之序列)。
在一些實施例中，LNP包含陽離子脂質。在一些實施例中，LNP包含(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯((9Z,12Z)-3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl octadeca-9,12-dienoate)，亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯(3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate))或另一可電離脂質。例如，參見WO2019067992、WO2017173054、WO2015095340及WO2014136086以及其中所提供之參考文獻之脂質。在一些實施例中，LNP包含莫耳比(N:P)為約4.5、5.0、5.5、6.0或6.5之陽離子脂質胺對RNA磷酸酯。在一些實施例中，術語陽離子及可電離在LNP脂質之背景中可互換，例如其中可電離脂質視pH而定為陽離子的。
在一些實施例中，與本文所揭示之構築體締合的LNP用於製備用以抑制免疫反應的基於細胞之藥劑。用於製備基於細胞之治療劑的方法及基於細胞之治療劑中所用的試劑為此項技術中所已知。
在一些實施例中，單獨或呈組合形式之本文所闡述之任何嚮導RNA、RNA引導之DNA結合劑或本文所揭示之供體構築體無論為裸的還是作為載體之一部分，均係以脂質奈米顆粒調配或經由脂質奈米顆粒來投與；例如，參見WO2019067992、WO2017173054或WO2021222287，該等案件之內容在此係以全文引用的方式併入。
在一些實施例中，LNP組合物包含：RNA組分及脂質組分，其中該脂質組分包含胺脂質，諸如生物可降解之可電離脂質。在一些情況下，脂質組分包含生物可降解之可電離脂質、膽固醇、DSPC (二硬脂醯基磷脂醯膽鹼)及PEG-DMG (1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000 (PEG2k-DMG))。在某些實施例中，脂質核酸組裝體含有可電離脂質A ((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯((9Z,12Z)-3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl octadeca-9,12-dienoate)，亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯(3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate))、膽固醇、DSPC (二硬脂醯基磷脂醯膽鹼)及PEG2k-DMG (1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000 (PEG2k-DMG))。在某些實施例中，組分分別以50脂質A:38膽固醇:9 DSPC:3 PEG-DMG莫耳比存在。在某些實施例中，組分分別以35脂質A:47.5膽固醇:15 DSPC:2.5 PEG-DMG莫耳比存在。可按脂質胺對RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比為約6且gRNA對mRNA之重量比為2:1、1:1或1:2來調配脂質核酸組裝體。
顯而易見的是，嚮導RNA、RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶或編碼Cas核酸酶之核酸)及包含編碼dmTGFB1分子、調控性T細胞促進分子(例如IL10)或靶向受體(例如CAR)之序列之供體構築體可使用相同或不同的系統來遞送。舉例而言，嚮導RNA、Cas核酸酶及構築體可由同一載體(例如AAV)攜帶。或者，Cas核酸酶(作為蛋白質或mRNA)或gRNA可由質體或LNP攜帶，而供體構築體可由載體(諸如AAV)攜帶。
不同的遞送系統可同時或以任何順序遞送。在一些實施例中，可同時遞送供體構築體、嚮導RNA及Cas核酸酶，例如，在一個載體、兩個載體、個別載體、一個LNP、兩個LNP、個別LNP或其組合中。在一些實施例中，在遞送作為載體或與LNP單獨或一起締合或作為核糖核蛋白(RNP)的嚮導RNA或Cas核酸酶之前(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天)，供體構築體可作為載體或與LNP締合遞送。作為另一實例，可在遞送作為載體或與LNP締合的構築體之前(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天)，遞送作為載體或與LNP單獨或一起締合或作為核糖核蛋白(RNP)的嚮導RNA及Cas核酸酶。
IV. 工程改造T細胞之方法本揭示案提供工程改造T細胞以包含修飾之方法，該等方法係藉由向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)來實施。本揭示案提供工程改造T細胞之方法，該等方法進一步包括對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及/或向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。本揭示案提供工程改造T細胞以包含修飾之方法，該等方法係藉由向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)來實施。本揭示案提供工程改造T細胞之方法，該等方法進一步包括對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及/或向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼IL10之異源序列。本揭示案提供工程改造T細胞之方法，以包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)及/或；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼CTLA4之異源序列。本揭示案提供工程改造T細胞以包含修飾之方法，該等方法係藉由向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)來實施。本揭示案提供工程改造T細胞之方法，該等方法進一步包括對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及/或向細胞中插入各自處於啟動子序列控制下的編碼IL10及CTLA4之異源序列。
在一些實施例中，該等方法包括工程改造T細胞，以包含藉由以下進行之修飾：向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列，及例如對編碼TGFBR2之內源核酸序列之敲低，及視情況對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及/或向細胞中插入編碼調控性T細胞促進分子(例如IL10或CTLA4)之異源序列，且進一步包含對TCR序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，該等方法包括工程改造T細胞，以包含藉由以下進行之修飾：向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列，對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；向細胞中插入編碼調控性T細胞促進分子(例如IL10或CTLA4)之異源序列，且進一步包含向細胞中插入編碼靶向受體(例如CAR)之異源序列。
在一些實施例中，該等方法包括工程改造T細胞，以包含藉由以下進行之修飾：向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列，對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；向細胞中插入編碼調控性T細胞促進分子(例如IL10或CTLA4)之異源序列、對TCR序列之修飾(例如敲低)及向細胞中插入編碼靶向受體(例如CAR)之異源序列。
在一些實施例中，該等方法包括藉由以下進行之修飾：向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列，對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；向細胞中插入編碼調控性T細胞促進分子之異源序列，視情況敲低TCR基因，且視情況向細胞中插入靶向受體(例如CAR)，其使用本文所揭示之CRISPR/Cas系統及嚮導RNA進行工程改造。
在該等實施例中，欲插入之調控性T細胞促進分子可經由供體構築體提供。經由供體構築體提供之調控性T細胞促進分子可選自IL10、CTLA4、TIGIT、IDO1、ENTPD1、NT5E、IL22、AREG、IL35、GARP、CD274、FOXP3、IKZF2、EOS、IRF4、LEF1、BACH2及IL2RA；及對TCR基因序列之修飾(例如敲低)。
在該等實施例中，欲插入之靶向受體可經由供體構築體提供。在一些實施例中，靶向受體可為嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)或細胞表面分子之受體，該細胞表面分子經由內部信號傳導結構域中之至少一個跨膜結構域可操作地連接，該內部信號傳導結構域能夠在細胞外受體部分與靶標結合後經活化。在一些實施例中，靶向受體可為存在於經工程改造之細胞(例如T細胞)表面上，以允許細胞結合至靶位點(例如生物體中之特定細胞或組織)之受體。在一些實施例中，靶向受體可允許經工程改造之T細胞與特定靶細胞結合，其中經工程改造之T細胞歸巢至疾病部位(例如發炎部位處之黏膜細胞)且直接作用於靶細胞(例如殺死或抑制靶細胞)；及/或靶向受體可允許經工程改造之T細胞與不為疾病部位所特有之特定靶細胞(例如淋巴系統之經活化之免疫細胞)結合，且直接作用於靶細胞(例如殺死或抑制靶細胞)。
在一些該等實施例中，靶向受體為能夠靶向以下之CAR：MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02)。
本文中揭示用於工程改造T細胞以包含插入及修飾(例如敲低)之適宜基因編輯系統，且該等系統為此項技術中所已知。在一些實施例中，基因編輯系統包括(但不限於) CRISPR/Cas系統；鋅指核酸酶(ZFN)系統；轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)系統。通常，基因編輯系統涉及使用經工程改造之裂解系統，以在靶DNA序列中誘導雙股斷裂(DSB)或切口(例如單股斷裂或SSB)。裂解或切口可經由使用特定核酸酶(諸如經工程改造之ZFN、TALEN)或使用具有經工程改造之嚮導RNA之CRISPR/Cas系統來引導靶DNA序列之特異性裂解或切口而發生，諸如CRISPR/Cas9系統。此外，正在開發基於Argonaute系統之靶向核酸酶(例如，來自嗜熱棲熱菌(T. thermophilus)，稱為『TtAgo』，參見Swarts等人(2014)Nature507(7491): 258-261)，其亦可能具有用於基因體編輯及基因療法中之潛力。
轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)係可經工程改造以切割特定DNA序列之限制酶。其係藉由將TAL效應子DNA結合結構域與DNA裂解結構域(切割DNA股之核酸酶)融合來製得。轉錄活化子樣效應子(TALE)可經工程改造以結合至期望DNA序列，從而促進特定位置處之DNA裂解(例如，參見Boch, TALEs of genome targeting Nature Biotech. 29:135-136 (2011))。可將限制酶引入至細胞中，用於基因編輯或用於基因體原位編輯，該技術稱為利用經工程改造之核酸酶進行基因體編輯。此類方法及其中使用之組合物為此項技術中所已知。例如，參見WO2019147805、WO2014040370、WO2018073393，該等案件之內容在此係以全文併入。
鋅指核酸酶(ZFN)係藉由將鋅指DNA結合結構域與DNA裂解結構域融合而產生之人工限制酶。鋅指結構域可經工程改造以靶向特定期望DNA序列，以使鋅指核酸酶能夠靶向複雜基因體內之獨特序列。來自IIs型限制性核酸內切酶FokI之非特異性裂解結構域通常用作ZFN中之裂解結構域。裂解由內源性DNA修復機制修復，從而容許ZFN精確地改變高等生物體之基因體。此類方法及其中使用之組合物為此項技術中所已知。例如，參見WO2011091324，該案之內容在此係以全文併入。
RNA干擾(RNAi)係一種生物過程，其中RNA分子藉由中和靶向mRNA分子來抑制基因表現或轉譯。小干擾RNA (siRNA)係RNA干擾之關鍵。RNA係基因之直接產物，且該等小RNA (通常每股長度為19-23個核苷酸，形成19-21個核苷酸之雙鏈體)可引導RNA誘導之沈默(RISC)複合物降解信使RNA (mRNA)分子，且因此經由轉錄後基因沈默阻止轉譯來降低mRNA分子之活性。短髮夾RNA (shRNA)係作為單股RNA之siRNA，其中形成雙鏈體區之股具有髮夾結構，通常藉由自表現載體轉錄而產生。RNAi亦可藉由稱為切丁酶(Dicer)受質分子之更長RNA雙鏈體結構來實現，該等分子在裝載至RISC中之前由切丁酶裂解以促進靶mRNA裂解。此類供使用之方法及組合物為此項技術中所已知。在本文所提供之組合物及方法中，較佳地，促進RNA干擾之RNA分子係作為持久性表現載體提供，參見例如WO2018208837，該案之內容在此係以全文併入。在一些實施例中，RNAi與表現載體一起使用。
應瞭解，本揭示案考慮在有或沒有本文所揭示之嚮導RNA的情形下進行插入之方法(例如，使用ZFN系統引起靶DNA序列中之斷裂，從而產生用於插入構築體之位點)。對於使用本文所揭示之嚮導RNA之方法，該等方法包括使用CRISPR/Cas系統來修飾(例如敲低)編碼TGFBR2、TNFA、IFNG或TCR之核酸序列。亦應瞭解，本揭示案考慮修飾(例如敲低) TGFBR2、TNFA、IFNG或TCR之方法，該等方法可在沒有本文所揭示之嚮導RNA的情形下進行(例如，使用ZFN系統引起靶DNA序列中之斷裂，從而產生用於插入構築體之位點)。
在一些實施例中，將包含用於插入之序列(例如編碼dmTGFB1或調控性T細胞促進分子(例如IL10或CTLA4)之序列)的供體構築體插入在靶向以供修飾(例如敲低)之序列(例如TCR基因)的基因體基因座處。
在一些實施例中，CRISPR/Cas系統(例如嚮導RNA及RNA引導之DNA結合劑)可用於在基因體內之期望基因座處產生插入位點，在該位點處，可插入包含編碼dmTGFB1、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR，例如本文所揭示之MAdCAM-1 CAR)之序列的供體構築體，以表現dmTGFB1、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或CAR (例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR)。靶向受體，例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR；或所插入之序列dmTGFB1或調控性T細胞促進分子(例如IL10或CTLA4)就其插入位點或基因座而言可為異源的，例如如本文所闡述，dmTGFB1、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02)  CAR)通常不在其中表現之安全港基因座或TCR基因座。在一些實施例中，本文所闡述之嚮導RNA可根據本發明方法與RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)一起使用以產生插入位點，在該位點處，可插入包含編碼dmTGFB1、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02)  CAR)之序列的供體構築體，以表現dmTGFB1、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或CAR (例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR)。本文中例示並闡述用於向特定基因體基因座中插入dmTGFB1、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR)之嚮導RNA。在替代性實施例中，靶向受體為TNFA靶向受體。
在一些實施例中，藉由利用gRNA (例如靶向TGFBR2、IFNG、TNFA或TCR以進行敲低之gRNA)、RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)、供體構築體進行轉導(例如使用病毒或非病毒遞送)來工程改造CD4+ T細胞。在一些實施例中，經工程改造之T細胞：1)用靶向編碼TGFBR2及視情況促炎性細胞介素(例如IFNG或TNFA)之核酸序列的gRNA、RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)轉導，及2)用供體構築體轉導，該供體構築體包含編碼以下各項之核酸序列：dmTGFB1及視情況調控性T細胞促進分子(例如IL10或CTLA4)及靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR)或TNFA靶向受體。在某些實施例中，選擇經工程改造之細胞用於表現靶向受體。
在一些實施例中，藉由利用gRNA (例如靶向TGFBR2、IFNG、TNFA或TCR以進行敲低之gRNA)、RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)及供體構築體進行轉導來工程改造CD4+ T細胞。在一些實施例中，經工程改造之T細胞：1)用供體構築體轉導，該供體構築體包含編碼以下各項之核酸序列：dmTGFB1及視情況調控性T細胞促進分子(例如IL10或CTLA4)及/或靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02)  CAR)，及2)用靶向編碼TGFBR2及視情況 促炎性細胞介素(例如IFNG或TNFA)之核酸序列的gRNA、RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)轉導。在某些實施例中，選擇經工程改造之細胞用於表現靶向受體。
在一些實施例中，藉由利用gRNA (例如靶向TGFBR2、IFNG、TNFA或TCR以進行敲低之gRNA)、RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)、供體構築體進行轉導來工程改造CD4+ T細胞。在一些實施例中，經工程改造之T細胞：1)用包含編碼以下各項之核酸序列的供體構築體轉導：dmTGFB1及視情況調控性T細胞促進分子(例如IL10或CTLA4)及/或靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02)  CAR)，及2)用靶向編碼TGFBR2及視情況促炎性細胞介素(例如IFNG或TNFA)之核酸序列的gRNA及RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)轉導。
如本文所闡述，包含編碼dmTGFB1、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR)之序列、嚮導RNA (例如靶向TGFBR2、IFNG、TNFA或TCR以進行敲低之gRNA)及RNA引導之DNA結合劑的供體構築體可使用此項技術中已知之任何適宜遞送系統及方法來遞送。在一些實施例中，嚮導RNA及Cas核酸酶與LNP締合，且係在遞送包含編碼dmTGFB1、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR)之序列的供體構築體之前遞送至細胞或細胞群體。在一些實施例中，嚮導RNA及Cas核酸酶與LNP締合，且係在遞送包含編碼dmTGFB1、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR)之序列的供體構築體之後遞送至細胞或細胞群體。
在一些實施例中，向天然存在之T細胞投與本文所闡述之gRNA、供體構築體及RNA引導之DNA結合劑能夠將該天然存在之T細胞(例如CD4+ T細胞)轉化為展現調控性T細胞之特徵(例如免疫反應抑制特徵)之細胞。
可將用於修飾(例如敲低) TGFBR2、IFNG、TNFA或TCR基因表現或插入編碼dmTGFB1、調控性T細胞促進分子(例如IL10、CTLA4)或靶向受體(例如CAR，例如MAdCAM-1、TNFA、CD70、CEACAM6、VCAM-1、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNFSF7、TNFRSF17、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)或MHC I類HLA-A (HLA-A*02) CAR)之序列的gRNA、供體構築體及RNA引導之DNA結合劑引入至習知T細胞或習知T細胞群體中，以產生本文所闡述之經工程改造之T細胞或T細胞群體。
使用各種RNA引導之DNA結合劑(例如核酸酶，諸如Cas核酸酶，例如Cas9)之方法亦為此項技術中所熟知。儘管本文例示CRISPR/Cas系統之使用，但應瞭解，亦可使用該系統之適宜變化形式。應瞭解，端視於上下文而定，RNA引導之DNA結合劑可作為核酸(例如DNA或mRNA，諸如編碼上文所提供之RNA引導之DNA結合劑的mRNA)或作為蛋白質提供。在一些實施例中，本發明方法可在已包含或表現RNA引導之DNA結合劑的細胞中實踐。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas9核酸酶)具有裂解酶活性，其亦可稱為雙股核酸內切酶活性。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑(諸如Cas9核酸酶)具有切口酶活性，其亦可稱為單股核酸內切酶活性。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含Cas核酸酶。Cas核酸酶之實例包括釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、腦膜炎雙球菌及其他原核生物之II型CRISPR系統之彼等Cas核酸酶(例如，參見下一段落中之清單)，以及其變異體或突變體(例如經工程改造、非天然存在、天然存在或其他變異體)型式。例如，參見US20160312198；US 20160312199。
可產生Cas核酸酶之非限制性例示性物種包括釀膿鏈球菌、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、鏈球菌屬(Streptococcus sp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、無害李斯特氏菌(Listeria innocua)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、新兇手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)、產琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogene)、華德薩特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ變形菌(Gammaproteobacterium)、腦膜炎雙球菌、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogene)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、達松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋鏈黴菌(Streptomyces pristinaespiralis)、綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogene)、綠色產色鏈黴菌、玫瑰鏈孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰鏈孢囊菌、酸熱脂環酸芽胞桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假真菌樣芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)、還原硒酸鹽芽孢桿菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亞微小桿菌(Exiguobacterium sibiricum)、戴白氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、海洋微顫菌(Microscilla marina)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales bacterium)、食萘極單胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、極胞菌屬(Polaromonas sp.)、海洋固氮藍藻(Crocosphaera watsonii)、藍桿藻屬(Cyanothece sp.)、銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻屬(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋鹽桿菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏製胺菌(Ammonifex degensii)、熱角軍纖維素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、礦菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)、難養芽胞梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈爾德菌(Finegoldia magna)、嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜熱丙酸降解發酵菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、嗜酸性喜溫硫桿菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色別樣著色菌(Allochromatium vinosum)、海桿菌屬(Marinobacter sp.)、嗜鹽亞消化球菌(Nitrosococcus halophilus)、亞硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纖線桿菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷鹽菌(Methanohalobium evestigatum)、魚腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫節球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻屬(Nostoc sp.)、極大螺旋藻(Arthrospira maxima)、鈍頂螺旋藻(Arthrospira platensis)、螺旋藻屬(Arthrospira sp.)、林氏藻屬(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、顫藻屬(Oscillatoria sp.)、石袍藻(Petrotoga mobilis)、非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏鏈球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari)、食清潔劑細小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)、胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium) ND2006及藻青菌(Acaryochloris marina)。
在一些實施例中，Cas核酸酶為來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自腦膜炎雙球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自胺基酸球菌屬之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自毛螺科菌ND2006之Cpf1核酸酶。在其他實施例中，Cas核酸酶為來自以下物種之Cpf1核酸酶：土倫病弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis) 、毛螺科菌、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)、佩萊格里尼菌科細菌(Peregrinibacteria bacterium)、帕庫菌科細菌(Parcubacteria bacterium)、史密斯氏菌(Smithella)、胺基酸球菌、候選白蟻甲烷枝原體(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真桿菌(Eubacterium eligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、稻田鉤端螺旋體(Leptospira inadai)、狗口腔卟啉單胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖腖普雷沃菌(Prevotella disiens)或獼猴卟啉單胞菌(Porphyromonas macacae)。在某些實施例中，Cas核酸酶為來自胺基酸球菌或毛螺科菌之Cpf1核酸酶。
在一些實施例中，gRNA與RNA引導之DNA結合劑一起稱為核糖核蛋白複合物(RNP)。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑為Cas核酸酶。在一些實施例中，gRNA與Cas核酸酶一起稱為Cas RNP。在一些實施例中，RNP包含I型、II型或III型組分。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自II型CRISPR/Cas系統之Cas9蛋白。在一些實施例中，gRNA與Cas9一起稱為Cas9 RNP。
野生型Cas9具有兩個核酸酶結構域：RuvC及HNH。RuvC結構域裂解非靶DNA股，且HNH結構域裂解靶DNA股。在一些實施例中，Cas9蛋白包含一個以上RuvC結構域或一個以上HNH結構域。在一些實施例中，Cas9蛋白為野生型Cas9。在組合物、用途及方法實施例中之每一者中，Cas誘導靶DNA中之雙股斷裂。
在一些實施例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白質之一個結構域或區域由不同蛋白質之一部分替換。在一些實施例中，Cas核酸酶結構域可經來自不同核酸酶(諸如Fok1)之結構域替換。在一些實施例中，Cas核酸酶可為經修飾之核酸酶。
在其他實施例中，Cas核酸酶可來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可為I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。在一些實施例中，Cas核酸酶可為Cas3蛋白。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑具有單股切口酶活性，亦即，可切割一條DNA股以產生單股斷裂，亦稱為「切口」。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含Cas切口酶。切口酶係在dsDNA中產生切口之酶，亦即，切割DNA雙螺旋之一股但不切割另一股。在一些實施例中，Cas切口酶為Cas核酸酶(例如，上文論述之Cas核酸酶)之一種形式，其中核酸內切活性位點(例如)因催化結構域中之一或多個改變(例如點突變)而不活化。關於Cas切口酶及例示性催化結構域改變之論述，參見例如美國專利第8889356號。在一些實施例中，Cas切口酶(諸如Cas9切口酶)具有不活化之RuvC或HNH結構域。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑經修飾以僅含有一個功能性核酸酶結構域。舉例而言，可修飾劑蛋白，使得核酸酶結構域中之一者突變或完全或部分缺失，以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性RuvC結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性HNH結構域之切口酶。
在一些實施例中，Cas蛋白核酸酶結構域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中之例示性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。例如，參見Zetsche等人(2015)Cell10月22日:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶結構域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。例如，參見Zetsche等人(2015)。其他例示性胺基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A (基於新兇手弗朗西斯氏菌U112 Cpf1 (FnCpf1)序列(UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN))。HNH或HNH樣核酸酶結構域或腦膜炎奈瑟菌之RuvC或RuvC樣結構域中之例示性胺基酸取代包括Nme2Cas9D16A (HNH切口酶)及Nme2Cas9H588A (RuvC切口酶)。
在一些實施例中，切口酶與一對分別同靶序列之有義股及反義股互補之嚮導RNA組合提供。在該實施例中，嚮導RNA將切口酶引導至靶序列，且藉由在靶序列之相對股上產生切口(亦即，雙切口)來引入DSB。在一些實施例中，切口酶與靶向相對DNA股之兩個單獨的嚮導RNA一起使用，以在靶DNA中產生雙切口。在一些實施例中，切口酶與兩個單獨的嚮導RNA一起使用，該兩個嚮導RNA經選擇為非常接近以在靶DNA中產生雙切口。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含一或多個異源功能結構域(例如，為或包含融合多肽)。
在一些實施例中，異源功能結構域可促進RNA引導之DNA結合劑轉運至細胞核中。舉例而言，異源功能結構域可為核定位信號(NLS)。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與1-5個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與2、3或4個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS融合。在使用一個NLS之情形下，NLS可連接在RNA引導之DNA結合劑序列之N末端或C末端。在一些實施例中，NLS不連接至C末端。其亦可插入在RNA引導之DNA結合劑序列內。在其他實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與一個以上之NLS融合。在某些情況下，至少兩個NLS係相同的(例如兩個SV40 NLS)。在某些實施例中，RNA引導之DNA結合劑存在至少兩個不同NLS。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑與在羧基末端連接之兩個SV40 NLS序列融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個連接在N末端且一個連接在C末端。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單組分序列，諸如SV40 NLS PKKKRKV (SEQ ID NO: 143)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 144)。在一些實施例中，NLS可為雙組分序列，諸如核質蛋白之NLS KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 145)。在具體實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 143) NLS可連接在RNA引導之DNA結合劑的C末端。一或多個連接體視情況包括在融合位點處。
V. 治療方法本揭示案提供抑制個體之免疫反應之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。該等經工程改造之T細胞可視情況進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；或向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。本揭示案提供抑制個體之免疫反應之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。本揭示案提供抑制個體之免疫反應之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼IL10之異源序列。本揭示案提供抑制個體之免疫反應之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼CTLA4之異源序列。本揭示案提供抑制個體之免疫反應之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入各自處於啟動子序列控制下的編碼IL10及CTLA4之異源序列。
本揭示案提供治療個體之自體免疫性病症之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。該等經工程改造之T細胞可視情況進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；或向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。本揭示案提供治療個體之自體免疫性病症之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。本揭示案提供治療個體之自體免疫性病症之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼IL10之異源序列。本揭示案提供治療個體之自體免疫性病症之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼CTLA4之異源序列。本揭示案提供治療個體之自體免疫性病症之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入各自處於啟動子序列控制下的編碼IL10及CTLA4之異源序列。
本揭示案提供治療個體之GvHD之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)。該等經工程改造之T細胞可視情況進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；或向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。本揭示案提供治療個體之GvHD之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。本揭示案提供治療個體之GvHD之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼INFG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼IL10之異源序列。本揭示案提供治療個體之GvHD之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼CTLA4之異源序列。本揭示案提供治療個體之GvHD之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼INFG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入各自處於啟動子序列控制下的編碼IL10及CTLA4之異源序列。
本揭示案提供治療正在接受移植或輸血之個體之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)，視情況該等方法係在接受該移植或輸血之前、同時或之後進行。該等經工程改造之T細胞可視情況進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；或向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。本揭示案提供治療正在接受移植或輸血之個體之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列，視情況該等方法係在接受該移植或輸血之前、同時或之後進行。本揭示案提供治療正在接受移植或輸血之個體之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼INFG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼IL10之異源序列，視情況該等方法係在接受該移植或輸血之前、同時或之後進行。本揭示案提供治療正在接受移植或輸血之個體之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼CTLA4之異源序列，視情況該等方法係在接受該移植或輸血之前、同時或之後進行。本揭示案提供治療正在接受移植或輸血之個體之方法，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列；對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼INFG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；及向細胞中插入各自處於啟動子序列控制下的編碼IL10及CTLA4之異源序列，視情況該等方法係在接受該移植或輸血之前、同時或之後進行。
在一些實施例中，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)，且進一步包含插入編碼靶向受體(例如CAR)之序列。該等經工程改造之T細胞可視情況進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；或向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。在一些實施例中，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；插入編碼調控性T細胞促進分子之序列，且進一步包含插入編碼靶向受體(例如CAR)之序列。
在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向胃腸系統，例如靶向受體為靶向MAdCAM-1之CAR，例如用於抑制諸如發炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克隆氏病等病症中之免疫反應，包括發炎。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向包含內皮細胞之組織，例如靶向受體為靶向VCAM-1之CAR，例如用於抑制諸如克隆氏病及多發性硬化症等病症中之免疫反應，包括發炎。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向內皮細胞，例如靶向受體為靶向CEACAM6之CAR，例如用於抑制諸如克隆氏病等病症中之免疫反應。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向B細胞，例如靶向受體為靶向CD19之CAR，例如用於抑制諸如多發性硬化症及全身性紅斑狼瘡等病症中之免疫反應。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向B細胞，例如靶向受體為靶向CD20之CAR，例如用於抑制諸如多發性硬化症及全身性紅斑狼瘡等病症中之免疫反應。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向發炎組織，例如靶向受體為靶向TNFA之CAR，例如用於抑制諸如發炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克隆氏病等病症中之免疫反應。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向神經組織，例如靶向受體為靶向MBP、MOG或PLP之CAR，例如用於抑制諸如多發性硬化症等病症中之免疫反應。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向表現TNFSF7之免疫細胞，包括(但不限於)經活化之T淋巴球、B淋巴球、樹突細胞及/或NK細胞，例如CAR靶向TNFSF7，例如用於抑制諸如克隆氏病、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑狼瘡或多發性硬化症等病症中之免疫反應。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向包含成熟B淋巴球之組織，例如靶向受體為靶向TNFRSF17之CAR，例如用於抑制諸如全身性紅斑狼瘡等病症中之免疫反應。在一些實施例中，靶向受體(例如CAR)能夠使經工程改造之T細胞靶向滑膜組織，例如靶向受體為靶向瓜胺酸化波形蛋白之CAR，例如用於抑制諸如類風濕性關節炎等病症中之免疫反應。
在一些實施例中，靶向受體為靶向CD70之CAR，例如用於抑制諸如GvHD等病症中之免疫反應。CD70係一種跨膜蛋白，其因應於免疫活化在CD4+及CD8+ T細胞、調控性T細胞(Treg)、B細胞、抗原呈遞細胞(諸如樹突細胞)及天然殺手(NK)細胞之表面上瞬時表現。不受理論束縛，CD70可在免疫細胞(諸如患有自體免疫性疾病之患者的T細胞)中升高。在一些實施例中，如本文所闡述之經工程改造之T細胞可抑制表現CD70之免疫細胞之活性及/或殺死該等細胞。
在一些實施例中，靶向受體為靶向DPP6、SCL2A2、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)及MHC I類HLA-A (HLA-A*02)之CAR。
在一些實施例中，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源序列及對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)，且進一步包含對TCR序列之修飾(例如敲低)。該等經工程改造之T細胞可視情況進一步包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；或向細胞中插入處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源序列。在一些實施例中，該等方法包括投與經工程改造之T細胞，該等經工程改造之T細胞包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾(例如敲低)；插入編碼調控性T細胞促進分子之序列，且進一步包含對TCR序列之修飾(例如敲低)。
在一些實施例中，將待插入序列插入至待修飾(例如敲低)之序列中，例如將CAR序列插入至TNFA基因體序列中，藉此修飾(例如)敲低TNFA序列。
在一些實施例中，該等方法包括投與包含如上文所闡述經工程改造之T細胞的T細胞群體。在一些實施例中，例如如藉由定序(例如NGS)所評價，T細胞群體中至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之T細胞經工程改造。
在一些實施例中，自體免疫性病症係選自潰瘍性結腸炎、克隆氏病、類風濕性關節炎、牛皮癬、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、1型糖尿病及移植物抗宿主病(GvHD)。在一些實施例中，經工程改造之T細胞具有自體或同種異體用途。
在一些實施例中，可在移植物抗宿主病之動物模型(例如小鼠模型)中，藉由量測在投與上述經工程改造之T細胞後動物之體重或存活(其中動物在體重大幅減輕(例如起始體重之20%)後處死)來評價使用該經工程改造之T細胞進行治療之有效性。在一些實施例中，與適宜對照(例如用PBMC治療之動物)相比，有效治療使得存活率在統計學上顯著增加。
實例提供以下實例以說明某些所揭示之實施例，且不應解釋為以任何方式限制本揭示案之範疇。
實例1. 一般方法 實例1.1 脂質奈米顆粒之製備一般而言，將脂質組分以不同莫耳比溶解於100%乙醇中。將RNA貨物(例如Cas9 mRNA及sgRNA)溶解於25 mM檸檬酸鹽緩衝液、100 mM NaCl，pH 5.0中，使得RNA貨物之濃度為大約0.45 mg/mL。
除非另有指定，否則脂質核酸組裝體含有可電離脂質A ((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯((9Z,12Z)-3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3- (diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl octadeca-9,12-dienoate)，亦稱為(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯(3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate))、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG，其莫耳比分別為35脂質A:47.5膽固醇:15 DSPC:2.5 PEG-DMG。以脂質胺對RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比為約6且gRNA對mRNA之重量比為1:1來調配脂質核酸組裝體。
使用交叉流技術，利用將乙醇中之脂質與兩體積之RNA溶液及一體積之水進行碰撞射流混合來製備LNP。首先，經由十字混合器來混合乙醇中之脂質與兩體積之RNA溶液。接著，第四水流經由線內T形管與十字混合器之出口流混合(參見WO2016010840，圖2)。將LNP在室溫下保持1小時，且用水(大約1:1 v/v)進一步稀釋。使用切向流過濾在平板盒(Sartorius，100 kD MWCO)上濃縮LNP，且使用PD-10去鹽管柱(GE)緩衝液交換至50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖，pH 7.5 (TSS)中。或者，視情況使用100 kDa Amicon旋轉過濾器濃縮LNP，且使用PD-10去鹽管柱(GE)緩衝液交換至TSS中。接著使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。將最終LNP儲存在4℃或-80℃下，直至進一步使用。
實例1.2. mRNA之活體外轉錄(「IVT」)藉由活體外轉錄使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶來產生含有N1-甲基假U之加帽及多聚腺苷酸化mRNA。藉由限制性核酸內切酶消化使含有T7啟動子及轉錄序列之線性化質體DNA線性化，之後使反應混合物熱不活化，且自酶及緩衝液鹽中純化。使用此項技術中已知之標準技術合成並純化信使RNA。
自編碼根據表4中之SEQ ID NO: 218之開放閱讀框的質體DNA產生信使RNA。當此段落中引用之序列在下文中關於RNA提及時，應理解，T應經U (其可為如上文所闡述之經修飾核苷)替換。實例中所用之信使RNA包括5'帽及3'多聚腺苷酸化序列，例如，多達100 nt。嚮導RNA係由商業供應商化學合成，或使用標準活體外合成技術利用經修飾之核苷酸化學合成。
實例2. 過表現Treg相關因子之經工程改造之T細胞之抑制活性 實例2.1. T細胞製備自新鮮leukopak (AllCells)製備人類PBMC，且藉由此項技術中已知之方法冷凍保存以供將來使用。使用人類CD4+ T細胞分離套組(Miltenyi；目錄號130-096-533)，遵循製造商之方案，藉由負向選擇自PBMC中分離CD4+ T細胞。藉由將CD4+ T細胞以5×10^6個細胞/mL之密度平鋪於OpTimizer基礎培養基中使其活化，該基礎培養基包括CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)、1%青黴素-鏈黴素、1× Glutamax、10 mM HEPES、含有200 U/mL IL-2、5 ng/mL IL-7、5 ng/mL IL-15及25 uL/mL ImmunoCult人類CD3/CD28 T細胞活化劑(Stemcell Technologies，目錄號10991)之2.5%人類AB血清(Gemini，目錄號100-512)，且在37℃下培養24小時，之後進行慢病毒轉導。
使用此項技術中已知之方法製備天然調控性T細胞(nTreg)，在本文中亦稱為胸腺Treg (tTreg)。已知CD4+ CD25+ T細胞群體富含天然Treg (nTreg)。根據製造商之說明書，使用人類CD25微珠II (Miltenyi；目錄號130-092-983)自CD4+ T細胞中分離CD25+細胞。將經分離之CD25+ CD4+ T細胞以每孔5×10^6個細胞之密度平鋪於含有30 ml OpTmizer基礎培養基(包括CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)、1%青黴素-鏈黴素、1× Glutamax、10 mM HEPES、2.5%人類AB血清(Gemini，目錄號100-512)，且每隔一天補充1000 U/mL重組人類介白素-2 (Miltenyi Biotec；目錄號130-097-746))之6孔Grex中。藉由添加25 uL/mL ImmunoCult人類CD3/CD28 T細胞活化劑(Stemcell Technologies，目錄號10991)使細胞活化，且在37℃下培養2天，直至慢病毒轉導。再過3天后，收穫經活化之CD25+ T細胞，且在4℃下用50 ug/mL生物素化之抗LAP抗體(Miltenyi；目錄號130-095-213)標記15 min。潛伏相關肽(LAP)係經活化之Treg細胞之標記物。將經標記之細胞洗滌兩次，且根據製造商之說明書，用抗生物素微珠(Miltenyi；目錄號130-090-485)進一步標記。使用LS管柱(Miltenyi；目錄號130-042-401)分離LAP+細胞。在含有30 mL OpTmizer基礎培養基(包括CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)、1%青黴素-鏈黴素、1× Glutamax、10 mM HEPES、2.5%人類AB血清(Gemini，目錄號100-512)，每隔一天補充1000 U/mL IL-2用於擴增)之6孔Grex板中培養經分離之天然Treg，直至注射日。
實例2.2. T細胞轉導及細胞分選為工程改造抑制性T細胞，如表5中所闡述，間隔一天用慢病毒構築體連續轉導經活化之CD4+ T細胞。一種慢病毒構築體編碼IL10DE (SEQ ID NO: 229)及CTLA4 (SEQ ID NO: 130)以及GFP及mScarlet作為標記物。第二種慢病毒構築體編碼組成型活性雙重突變體TGFB1 (caTGFB1；R218H C225R；SEQ ID NO: 214)。用編碼GFP之慢病毒構築體轉導CD25+ T細胞。對於轉導，將濃縮之病毒上清液添加至T細胞中，且使樣品在37℃下離心60 min。將T細胞重新懸浮於細胞/病毒上清液混合物中，且在OpTmizer培養基中培育。向經轉導之CD4+細胞樣品補充200 U/mL IL-2、5 ng/mL IL-7及5 ng/mL IL-15，且向經轉導之CD25+樣品補充1000 U/mL IL-2。細胞分裂，且定期補充培養基或細胞介素。
表5. T細胞編輯治療組。「LV」代表慢病毒，「DKI」代表雙敲入，「DKO」代表雙敲除，「TKI」代表三敲入且「TKO」代表三敲除。
組 起始細胞 LV GFP LV CTLA4及IL-10DE LV caTGFB1 LNP IFNg LNP TNFa LNP TGFBR2
nTreg CD4+ CD25+ + - - - - -
DKI DKO CD4+ - + - + + -
TKI DKO CD4+ - + + + + -
TKI TKO CD4+ - + + + + +
根據表5用LNP編輯T細胞。將每一LNP種類與編碼Cas9及嚮導之mRNA按以下劑量共調配：INF-γ (G019753)，0.67 ug/ml總RNA貨物；TNF-α (G019757)，0.67 ug/ml總RNA貨物；TGFBR2 (G029528)，1 ug/ml總RNA貨物。如實例1中所闡述，使用35脂質A/47.5膽固醇/15 DSPC/2.5 PEG2k-DMG之莫耳比產生LNP。以脂質胺對RNA磷酸酯(N:P)之莫耳比為約6來調配LNP。以gRNA對Cas9 mRNA貨物之重量比為1:1來製備LNP。
簡言之，將T細胞以1×10^6個細胞/mL之濃度重新懸浮於補充有1000 U/mL IL-2、10 ng/mL IL-7及10 ng/mL IL-15之無血清培養基中，之後將細胞轉移至T-75燒瓶中且在37℃下培育。使每一LNP製劑在補充有5 ug/ml重組人類ApoE3 (Peprotech，目錄號350-02)之T細胞基礎培養基中培育。使LNP混合物在37℃下培育15分鐘。向每一T細胞樣品中添加等體積之預培育LNP混合物，此使得原始體積加倍。
LNP處理後24小時，收集T細胞，洗滌，且懸浮於補充有500 U/mL重組人類IL-2、5 ng/ml重組人類IL-7及5 ng/ml重組人類IL-15之OpTmizer基礎培養基中。C細胞在6孔Grex板中擴增，每隔一天補充細胞介素。
實例2.3. 細胞工程改造之確認藉由流式細胞術對經工程改造之樣品進行分選，以獲得富集細胞群體。
藉由流式細胞術對經工程改造之T細胞進行評價，以確定表型、基因插入及破壞。洗滌細胞，且在FACS緩衝液(PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA)中染色。使經工程改造之T細胞與靶向CD4之抗體(Biolegend)或靶向TGFBR2之抗體(Miltenyi)一起培育。隨後洗滌T細胞，且在Cytoflex儀器(Beckman Coulter)上進行分析。使用FlowJo軟體包實施資料分析。基於大小、單細胞、CD4表現及標記物表現對T細胞進行門控。藉由流式細胞術驗證之目標TGFBR2表現示於表6中。所示值對應於TGFBR2表現陽性細胞之平均百分比，以及藉由每一細胞群體之中值螢光所量測之TGFBR2表現水準。
表6.經工程改造之CD4+ T細胞中TGFBR2表現之平均螢光強度
  TGFBR2  
組 TGFBR2+細胞之平均% 平均TGFBR2表現(MFI) n 
未經染色之CD4+ 0.5 108 2
未經編輯之CD4+ 84.4 1401 2
TKI DKO 74.8 1206 1
TKI TKO 2.8 217 2
實例2.4. 經工程改造之T細胞之抑制能力使用混合淋巴球反應(MLR)分析來分析所分選的經轉導之工程改造T細胞之抑制功能。MLR係由T細胞將另一白血球(同種異體白血球)識別為外來物所引起之發炎性反應。Treg藉由抑制發炎性T細胞之增殖來抑制MLR發炎性反應。藉由用細胞內螢光染料標記初始群體來量測細胞增殖，當細胞內螢光染料作為細胞內容物之一部分傳代至每一後繼世代時變稀釋。
MLR分析係在96孔U型底板中使用OpTmizer基礎培養基進行，該基礎培養基包括CTS OpTmizer T細胞擴增SFM (Gibco，目錄號A3705001)、1%青黴素-鏈黴素、1× Glutamax、10 mM HEPES及2.5%人類AB血清(Gemini，目錄號100-512)。使用與經轉導之T細胞來自相同供體之未經轉導之CD3+CD4+ T細胞(自體T細胞)作為反應細胞。根據製造商之說明書，用CellTrace Violet (CTV) (Thermofisher Scientific；目錄號C34557)標記該等未經轉導之細胞。使用相對於經轉導之T細胞來自同種異體供體之CD3耗盡之PBMC來刺激有反應的未經轉導之T細胞。藉由每孔組合50,000個CTV標記之自體T細胞、50,000個CD3耗盡之同種異體PBMC及大約50,000個(1:1)、16,666個(3:1)或5,555個(9:1)分選之經轉導之CD3+CD4+ T細胞來製備培養物。在37℃下培養5天后，將培養板離心。將細胞沈澱重新懸浮於含有APC/Fire 750抗CD4之FACS緩衝液中，且在4℃下放置30 min。隨後洗滌細胞，在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理，且使用FlowJo軟體包進行分析。首先藉由陽性CD4表現對細胞進行門控，之後藉由CTV信號進行門控，且最後對未稀釋之CTV群體進行門控。使用以下公式計算CTV稀釋之抑制：其中y =整個CTV標記群體之平均螢光強度/ CTV標記群體之未稀釋部分之平均螢光強度。資料示於圖1及表7中。
表7.經工程改造之T細胞對自體T細胞增殖之抑制的計算平均百分比
1:1 1:3 1:9 1:27
樣品 平均值 SEM 平均值 SEM 平均值 SEM 平均值 SEM
未經轉導之T細胞(Tconv) 2.74 2.20 3.86 3.86 1.92 1.92 6.09 0.69
tTreg 82.10 0.97 79.05 3.01 70.12 3.31 51.23 5.81
TKI DKO 80.41 2.02 75.64 0.57 46.80 7.56 39.34 3.16
TKI TKO 69.79 0.49 70.71 5.57 64.68 3.61 55.94 1.47
實例3. 經工程改造之抑制性T細胞之活體內功能表徵 實例3.1. GvHD模型中發炎性反應之活體內評價使用移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型評價經工程改造之T細胞的活體內抑制功能。
收穫所分選之用於活體內注射之T細胞，且以4×10^6個細胞/mL重新懸浮於CTS OpTmizer T細胞擴增培養基(Gibco，目錄號A1048501)中。將對於經工程改造之T細胞而言為自體之PBMC解凍，且將細胞密度調整至8×10^6個細胞/mL。將PBMC以0.5:1比率添加至每一分析群體中，且將細胞重新懸浮於補充有10 mM HEPES及2% FBS之RPMI中，達到6×10^6個細胞/100 μL。僅PBMC組以4×10^6個細胞/100 μL重新懸浮。
注射前一天，藉由使用X射線(RS-2000輻照器；Rad Source Technologies)之亞致死輻照(150拉德)對雌性NOG小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug /JicTac；Taconic，目錄號NOG-F)進行調理以進行細胞移植。向經輻照之NOG小鼠群組靜脈內注射100 μL上述每一測試細胞群體。八隻注射有注射介質之經輻照小鼠用作僅輻照對照(媒劑)。每天監測體重。體重減輕20%後，將小鼠處死，且對其脾臟細胞組成進行評價。存活資料繪製於表8及圖2中。
表8.每一群組中在注射後之每一時間點存活的小鼠之存活百分比。
N 8 7 8 8 8 8
天 媒劑 僅PBMC tTreg DKI DKO TKI DKO TKI TKO
12 100 85.7 100 100 100 100
13 100 71.4 100 100 100 100
16 100 57.1 100 100 87.5 100
17 87.5 42.9 100 100 87.5 100
19 87.5 28.6 100 100 87.5 100
22 87.5 14.3 100 100 87.5 100
23 87.5 0.0 100 100 87.5 100
24 87.5 0.0 100 87.5 62.5 100
26 87.5 0.0 100 87.5 50 100
28 87.5 0.0 100 75 50 100
28 87.5 0.0 100 75 37.5 100
35 87.5 0.0 100 75 37.5 87.5
44 87.5 0.0 100 62.5 37.5 87.5
49 87.5 0.0 100 62.5 25 87.5
52 87.5 0.0 100 50 25 87.5
55 87.5 0.0 75 37.5 12.5 75
62 87.5 0.0 62.5 37.5 12.5 75
63 87.5 0.0 62.5 37.5 12.5 75
實例3.2. 經工程改造之T細胞之持久性能力為確認經工程改造之T細胞之持久性，對脾臟組成進行評價。藉由評價安樂死後脾臟中Treg及總脾細胞之相對細胞計數來評估Treg持久性。在安樂死時，將每隻動物之脾臟收集於15 mL含有完全Optimizer培養基之錐形管中。使用1 ml注射器柱塞之橡膠側手動解離脾臟。經由70微米細胞過濾器(Corning，目錄號08-771-2)過濾細胞懸浮液，且使用Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience)對細胞進行計數。將脾細胞冷凍保存於CryoStor CS10培養基(Stemcell Technologies；目錄號07930)中。研究完成後，將所有脾細胞解凍且使用Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience)進行計數。將大約一百萬個活脾細胞重新懸浮於Optimizer培養基中，且將6×10^5個細胞在4℃下用包括APC抗人類CD45 (BD Pharmigen，目錄號561864)及APC-Fire 750抗人類CD4 (Biolegend，目錄號300560)在內之抗體組染色30 min。在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理脾細胞，且使用FlowJo軟體包進行分析。針對小鼠CD45-、人類CD45+對細胞進行門控。以GFP+對tTreg進行門控，且以mScarlet+GFP+對經工程改造之T細胞進行門控。為確定個別群體之細胞數目，將每一群體之百分比應用於所回收之人類脾細胞之總數目。資料示於表9及圖3中。
表9.小鼠脾臟中人類淋巴球之量化
  佔總人類淋巴球(CD45+)中之%
樣品 平均% SEM n
tTreg 5.21 3.39 8
DKI DKO 2.90 2.23 6
TKI DKO 0.54 0.28 3
TKI TKO 40.86 28.07 8
實例3.3. 經工程改造之T細胞的活體內細胞介素型態分析藉由心臟穿刺提取血液來分離用於細胞介素分析之血漿，經由添加EDTA來保存。將所收集之血液以1000×g離心10 min，且將血漿儲存在-80℃下直至進一步分析。
藉由MSD評價血漿樣品之細胞介素釋放水準。根據製造商之說明書，使用定製U-PLEX生物標記物套組(Meso Scale Diagnostics，目錄號K15067L-2)將血漿樣品解凍用於後續細胞介素量化。使用Meso Quickplex SQ120儀器(Meso Scale Discovery)讀取U-PLEX生物標記物板，且利用Discovery Workbench 4.0軟體包(Meso Scale Discovery)對資料進行分析。結果示於表10及圖4中。
表10. 血漿中之IL-10水準(pg/mL)
  IL10 (pg/mL)
樣品 平均值 SEM n
媒劑 0 0 1
PBMC 7 7 5
tTreg 11 10 8
DKI DKO 107 80 5
TKI DKO 31 24 6
TKI TKO 924 617 8
實例4. 使用xenoGvHD小鼠模型進行的synTreg之CD70-CAR靶向之活體內研究使用移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型評價經工程改造之T細胞的活體內抑制功能。特定而言，將CD70-CAR靶向及非靶向之三敲入(dmTGFB1/IL10DE/CTLA4)/三敲除(TGFBR2/IFNG/TNFA) synTreg與未經編輯之tTreg及對照進行比較。CD70由經活化之淋巴球上調，包括自體反應性T細胞及B細胞。
實例4.1 T細胞工程改造通常，如實例2中所闡述製備T細胞。使用市售套組(Miltenyi)遵循製造商之方案，自人類PBMC分離CD4+及CD4+ CD25+ T細胞。利用Immunocult使細胞活化，且根據表11進行編輯。
表11. T細胞編輯治療組。「LV」代表慢病毒。「AAV」代表腺相關病毒。
組 起始細胞 LNP IFNg及LNP TNFa LV CTLA4及IL-10DE LV dmTGFB1 AAV CD70-CAR；LNP TRAC、LNP CD70、LNP UGI LNP TGFBR2
tTreg CD4+ CD25+ - - - - -
synTreg CD4+ + + + - +
CD70 CAR-synTreg CD4+ + + + + +
在第0天，利用Immunocult使CD4+及CD4+CD25+細胞活化。用攜帶SpCas9 mRNA及靶向IFNg之gRNA G019753及靶向TNFa之gRNA G019757的LNP處理CD4+細胞，以破壞該等基因。第1天，收穫雙敲除細胞，重新懸浮且用編碼CTLA4及IL10DE之慢病毒處理。第2天，收穫所得雙敲除雙敲入細胞，重新懸浮且用編碼dmTGFB1之慢病毒處理。第3天，收穫一部分所得雙敲除三 敲入細胞，重新懸浮且用編碼CD70 CAR並與側接TRAC嚮導切割位點之序列具有大約500個核苷酸之同源臂的AAV、攜帶編碼SpCas9之mRNA及靶向TRAC之gRNA G013006的LNP處理，以將CAR插入至TRAC基因座中。相同的細胞亦用攜帶編碼NmeCas9鹼基編輯器(SEQ ID No.365)之mRNA及靶向CD70之gRNA G034199的LNP以及攜帶編碼UGI之mRNA的LNP處理，以破壞CD70基因。在第4天，收穫CD70編輯之細胞，重新懸浮且培養隔夜。在第5天，收穫雙敲除三敲入細胞及CD70 CAR靶向之雙敲除三敲入細胞，重新懸浮，且用攜帶SpCas9 mRNA及靶向TGFBR2之gRNA G029528的LNP處理，以破壞TGFBR2。在第6天，洗滌胸腺Treg、synTreg及CD70 CAR synTreg細胞，且定期添加細胞介素進行培養。
實例4.2 活體內功能表徵使用移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型評價經工程改造之T細胞的活體內抑制功能。收穫用於活體內注射之所分選T細胞及PBMC，且重新懸浮於培養基中。注射前一天，藉由使用X射線(RS-2000輻照器；Rad Source Technologies)之亞致死輻照(150拉德)對雌性NOG小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug /JicTac；Taconic，目錄號NOG-F)進行調理以進行細胞移植。如表11中所闡述，向經輻照之NOG小鼠群組靜脈內注射四百萬個PBMC細胞及四十萬個T細胞。八隻注射有注射介質之經輻照小鼠用作僅輻照對照(媒劑)。每天監測體重。體重減輕20%後，將小鼠處死，且對其脾臟細胞組成進行評價。存活資料繪製於表12及圖5中。
表12. 每一群組中在注射後之每一時間點存活的小鼠之存活百分比
天 媒劑 僅PBMC tTreg synTreg CAR-synTreg
0 100% 100% 100% 100% 100%
14 100% 88% 100% 100% 100%
23 100% 75% 100% 88% 100%
26 100% 75% 100% 88% 100%
34 100% 75% 88% 88% 100%
36 100% 63% 88% 88% 100%
39 100% 63% 75% 88% 100%
48 100% 50% 63% 88% 100%
50 100% 13% 63% 88% 100%
54 100% 0% 63% 75% 100%
56 100% 0% 50% 63% 100%
60 100% 0% 50% 50% 100%
63 100% 0% 38% 50% 100%
67 100% 0% 25% 38% 100%
Treg細胞之持久性通常如實例3中所闡述進行評價。表13及圖6顯示在處死時自小鼠脾臟回收之所有人類CD45+細胞中synTreg之平均百分比。在此實驗中未量測脾臟中tTreg之百分比，但在類似實驗中通常在1%-5%範圍內。
表13. 在處死時自小鼠脾臟回收之所有人類CD45+細胞中synTreg之平均百分比。
治療 平均值 SD n
僅PBMC 0.0 0.0 8
synTreg 10.0 6.7 7
CAR synTreg 37.2 16.6 8
基於Lai等人，Cell Transplantation. 2012;21(9):2033-2045中所闡述之方法，在處死時評價小鼠之表型體徵。對於每隻小鼠，如表14中所闡述將每一表型標準分級為0-2，且將單隻小鼠之等級相加以獲得GvHD評分。每一實驗條件之平均GvHD評分示於表15及圖7中。用非靶向tTreg或synTreg治療之小鼠的GvHD評分相較於僅PBMC對照在統計學上顯著改良。CD70-CAR synTreg治療之小鼠在整個實驗中無症狀，無法與媒劑對照樣品中之小鼠區分。CD70-CAR synTreg治療之小鼠的GvHD評分與僅PBMC對照及非靶向synTreg顯著區分。
表14.GvHD評分規準
標準 0級 1級 2級
體重減輕 ＜10% 10%-20% ＞20%
活動 正常 輕度至中度減少 靜止直至受到刺激
姿態 正常 僅在休息時駝背 嚴重步態，運動受損
毛皮紋理 正常 輕度至中度起皺 嚴重起皺/梳理不良
皮膚完整性 正常 爪及/或尾有鱗屑 裸露皮膚之區域明顯
表15.處死時之平均GvHD評分。
治療 平均值 SD n
僅PBMC 4.6 0.7 8
tTreg 3.4 2.2 8
synTreg 3.0 2.2 8
CAR synTreg 0.0 0.0 8
細胞介素型態通常如實例3中所闡述進行評價。表16及圖8顯示每一治療組中小鼠之平均IL-10血清水準。
表16. 處死時之平均IL-10水準，以pg/ml血清計。
治療 平均值 SD n
媒劑 0.3 0.6 7
僅PBMC 9.1 5.7 8
tTreg 7.0 3.7 7
synTreg 98.4 172.7 8
CAR synTreg 5.9 7.4 6
實例4.3. 自脾臟中分離之synTreg之抑制活性在此實例中，使用基於珠粒之抑制分析來分析自小鼠之冷凍脾臟樣品中分離的Treg之抑制功能。通常如實例2中所闡述且藉由此項技術中已知之方法使用同種異體APC、人類抗CD3/CD28珠粒進行T細胞刺激來實施抑制分析。自用於工程改造synTreg之同一供體之冷凍PBMC中分離出未經工程改造之CD4+及CD8+ T細胞(Tconv)以用作陰性對照。藉由流式細胞術基於螢光標記自脾臟樣品中分離Treg：GFP用於tTreg且GFP/mScarlet用於synTreg。使用Miltenyi Biotec套組自冷凍PBMC分離CD3+ T細胞以用作反應(Tresp)細胞。
Tconv對照細胞用CellTrace Yellow標記，且Tresp細胞用CellTrace Violet標記。使用抗人類CD3/CD28活化劑珠粒(Miltenyi Biotec，目錄號130-091-441)將Tresp及Treg細胞之共培養物刺激五天。收穫細胞且藉由流式細胞術進行分析。使用以下公式計算擴增抑制百分比：
對CTV標記之細胞擴增之所計算抑制示於表17及圖9中。脾臟分離之synTreg保持高度抑制性，超過脾臟分離之tTreg活性，尤其是在低Treg:Tresp比率下。與活體內持久性資料一致，離體synTreg存活優於tTreg。
表17.Tresp細胞擴增之平均抑制百分比
Treg:Tresp Tconv 對照 tTreg synTreg
平均值 SD n 平均值 SD n 平均值 SD n
1:1 66.7 11.5 3 88.4 3.5 3 99.4 1.0 3
1:3 41.2 9.9 2 82.3 4.0 3 94.8 3.5 2
1:9 29.0 8.8 3 48.2 0.6 2 87.6 4.8 2
1:27 0.0 0.0 3 6.3 10.9 3 56.5 12.9 3
經由CD3/CD28珠粒再刺激脾臟分離之synTreg及無Tresp細胞培養之Tconv細胞對照。根據製造商之方案，使用Meso Scale Discovery MSD-U-PLEX促炎性組合1人類套組分析上清液。如表18及圖10A-圖10D中所示，SynTreg不產生促炎性細胞介素，但在珠粒介導之刺激後仍分泌IL-10。
表18.細胞培養物上清液中之細胞介素水準(pg/ml)。
細胞介素 條件 Tconv synTreg
平均值 SD 平均值 SD
IFNγ 未受刺激 0 0 0 0
珠粒刺激 2829 1322 14 0
TFNα 未受刺激 0 0 0 0
珠粒刺激 3 1 0 0
IL-2 未受刺激 0 0 0 0
珠粒刺激 11 2 0 0
IL-10 未受刺激 0 0 4 0
珠粒刺激 1 0 26 3
實例5. 小鼠MAdCAM-1-CAR synTreg之表徵當活體外分析細胞活化及因應於活化之細胞介素分泌時，將小鼠MAdCAM-CAR靶向及非靶向之三敲入(dmTGFB1/IL10DE/CTLA4)/三敲除(TGFBR2/IFNG/TNFA) synTreg與習知T細胞對照進行比較。
實例5.1 T細胞工程改造通常，如實例2中所闡述製備T細胞。使用市售套組(Miltenyi)，遵循製造商之方案自人類PBMC中分離CD4+ T細胞。利用Immunocult使細胞活化，且根據表19進行編輯。
表19. T細胞編輯治療組。「LV」代表慢病毒。
組 起始細胞 第2天 第3天 第4天 第6天
LV CTLA4、IL-10DE、dmTGFB1 LV MECA CAR LNP IFNγ及LNP TNFα LNP TGFBR2及LNP TRAC
Tconv CD4+ - - - -
synTreg CD4+ + - + +
CAR synTreg CD4+ + + + +
在第1天，利用Immunocult使CD4+細胞活化。第2天，用編碼包括CTLA4、IL10DE及dmTGFB1之盒的慢病毒處理一部分CD4+。第3天，收穫經處理之細胞且重新懸浮於培養基中。用編碼基於單株抗小鼠MAdCAM-1、MECA-367抗體之嵌合抗原受體之慢病毒處理一部分三敲入之細胞。第4天，收穫細胞，重新懸浮且用攜帶SpCas9 mRNA以及靶向IFNg及TNF之gRNA的LNP處理，以破壞該等基因。洗滌細胞且重新懸浮於培養基中，以供第二天繼續培養。第6天，藉由流式細胞術分選細胞以分離1) Tconv群體、2)三敲入/雙敲除群體及3) CAR +三敲入/雙敲除細胞群體。分選後，用攜帶編碼SpCas9之mRNA及靶向TRAC之gRNA的LNP以及攜帶SpCas9 mRNA及靶向TGFBR2之gRNA的LNP進一步處理經編輯之細胞，以破壞該等基因。洗滌細胞，且在第二天重新懸浮。
實例5.2 活體外功能表徵經由與表現基因轉殖鼠類MAdCAM-1之鼠類SVEC4-10內皮靶細胞共培養或在用鼠類MAdCAM-1包覆之孔中評價細胞之活化。單獨培養之細胞用作陰性對照。24小時後，收穫細胞，且藉由流式細胞術評價T細胞活化標記物CD69之表現。如表20及圖11A-圖11C中所示，藉由暴露於鼠類MAdCAM-1使CAR-synTreg活化，但不使Tconv或非靶向之synTreg活化。
表20.CD69+ T細胞之平均百分比。「n.a」為「未分析」。
樣品 單獨培養 mMAdCAM-1 包覆 表現SVEC mMAdCAM-1之細胞
平均值 SD n 平均值 SD n 平均值 SD n
Tconv 3.9 0.3 3 4.2 0.4 3 n.a.
synTreg 2.1 0.2 3 2.1 0.1 3 n.a.
CAR-synTreg 2.4 0.4 3 47.2 4.4 3 67.5 3.0 3
對用小鼠MAdCAM-1或Immunocult再刺激後之細胞介素分泌進行評價。使細胞在包覆有鼠類MAdCAM-1或含有Immunocult之孔中培育48小時。藉由離心收穫細胞且保留上清液。根據製造商之方案，使用Meso Scale Discovery MSD-U-PLEX促炎性組合1人類套組分析上清液。如表21及圖12中所示，僅Tconv在刺激後產生促炎性細胞介素IFNg及TNFa。類似地，靶向及非靶向synTreg在適當刺激後產生IL-10及活性TGFB。
表21.再刺激後之細胞介素分泌(pg/ml)。用鼠類MAdCAM-1 (MC-1)或Immunocult (IC)刺激細胞。「n.a」為「未分析」。
細胞介素 條件 Tconv 對照 synTreg CAR-synTreg
平均值 SD n 平均值 SD n 平均值 SD n
IL-10 未受刺激 1 1 3 113 11 2 4 0 2
MC-1刺激 n.a. n.a. 2,336 488 3
IC刺激 510 68 3 642 57 3 868 137 3
TGF-β 未受刺激 0 0 2 98 4 2 0 0 2
MC-1刺激 n.d. n.d. 1,033 96 3
IC刺激 23 34 3 566 29 3 341 57 3
IFNγ 未受刺激 580 94 2 11 2 2 13 6 2
MC-1刺激 n.a. n.a. 2,363 190 3
IC刺激 188,353 8,367 3 1,581 91 3 970 165 3
TNFα 未受刺激 2 0 2 0 0 2 0 0 2
MC-1刺激 n.a. n.a. 3 1 3
IC刺激 321 98 3 2 1 3 1 1 3
實例6. SynTreg展示出對潰瘍性結腸炎患者源性T細胞之強效活體外抑制使用源自潰瘍性結腸炎患者之T細胞作為混合淋巴球反應中之反應細胞來評價synTreg之抑制能力。量測對反應細胞生長及對發炎性細胞介素分泌之抑制。
使用混合淋巴球反應(MLR)分析來量測Treg之抑制功能。通常如實例2中所闡述且藉由此項技術中已知之方法來實施MLR分析。使用市售套組(例如Miltenyi)，自來自一名健康供體(HD)及3名患有潰瘍性結腸炎(UC)之供體的PBMC中分離CD4+ T細胞(Tresp)。SynTreg通常經工程改造為實例4中之synTreg樣品，其中在編輯時間上略有變化。SynTreg細胞係自CD4+細胞工程改造而來，且經編輯以插入IL-10DE、CTLA4及dmTGFB1並破壞IFNg、TNFa及TGFBR2。為評價發炎性細胞介素向培養基中之分泌，在MLR分析中在72小時時間點收集上清液。根據製造商之方案，使用Meso Scale Discovery MSD-U-PLEX促炎性組合1人類套組分析上清液。SynTreg有效地抑制潰瘍性結腸炎患者源性T細胞之增殖(表22及圖13)及發炎性細胞介素釋放(表22及圖14A-圖14B)。
表22.在使用synTreg及源自潰瘍性結腸炎患者之T細胞的混合淋巴球反應中之平均細胞介素分泌及平均細胞增殖抑制百分比。HD，健康供體。UC，潰瘍性結腸炎。
分析 Treg: Tresp HD 1 號UC 2 號UC 3 號UC
平均值 SD n 平均值 SD n 平均值 SD n 平均值 SD n
TNFa (pg/ml) 1:1 29 7 3 51 8 3 30 6 3 31 2 3
1:3 41 2 3 74 10 3 64 13 3 62 16 3
1:9 60 12 3 84 3 3 54 7 3 65 12 3
IFNg (pg/ml) 1:1 23 6 3 62 21 3 24 10 3 9 2 3
1:3 31 9 3 53 16 3 23 0 3 14 2 3
1:9 22 2 3 66 16 3 20 4 3 13 1 3
抑制% 1:1 74 2 3 59 2 3 65 2 3 82 3 3
1:3 40 2 3 44 5 3 49 9 3 61 5 3
1:9 51 7 3 7 7 3 46 9 3 50 5 3
實例7. SynTreg在抑制小鼠結腸炎症狀方面優於tTreg通常藉由Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2019年5月9日;8(2):193-19中所闡述之方法，在結腸炎之人類化小鼠模型中測試SynTreg及tTreg對結腸炎之大體體徵及組織學體徵之抑制。通常如實例4中所闡述製備胸腺Treg及synTreg，但編輯時間可變化。使用CD4+起始材料、編碼與實例4中所用相同序列之慢病毒及相同LNP試劑對SynTreg進行工程改造。SynTreg細胞係自CD4+細胞工程改造而來，且經編輯以插入IL-10DE、CTLA4及dmTGFB1並破壞IFNg、TNFa及TGFBR2。
收穫用於活體內注射之T細胞，且重新懸浮於培養基中。向CD34+人類化NSG小鼠(Jackson Laboratory. 庫存編號705557)靜脈內注射200萬個來自表23中所闡述之每一測試細胞群體之細胞。每一測試組中治療七隻小鼠。細胞注射後兩小時，將小鼠麻醉且皮下注射含1% v/v 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS; Millipore Sigma, 92822)之PBS，以誘導針對此劑之免疫反應。首次治療後七天，經由直腸導管用250 ug TNBS再次攻擊小鼠以誘導結腸炎。在接下來的三天中，每天監測體重。在細胞注射後10天及結腸炎誘導後3天處死小鼠。收集結腸組織用於分析。記錄結腸長度，去除糞便，記錄組織重量。對石蠟包埋之結腸切片進行染色，且以盲化方式分析發炎、隱窩增生、潰瘍、腸壁增厚及水腫。每一組織學參數自0至1以0.25之增量進行評分，此使得可能的最大評分為5。結果示於表23及圖15-圖16中。如由synTreg之較低結腸重量:長度比及組織學評分所證明，多株synTreg抑制結腸炎之大體體徵及組織學體徵之能力優於tTreg。
表23.小鼠結腸炎模型中之組織分析。
結腸重量:長度(mg/mm) 組織學評分
樣品 平均值 SD n 平均值 SD n
未誘導之對照 2.7 0.3 5 0.4 0.2 5
結腸炎誘導之對照 4.7 1.1 5 2.8 1.1 6
tTreg 4.5 0.7 6 2.4 1.0 6
synTreg 3.3 0.7 6 1.1 1.1 6
實例8. 同種異體編輯在人類化結腸炎模型中增加synTreg之持久性通常藉由Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2019年5月9日;8(2):193-19中所闡述之方法，在結腸炎之人類化小鼠模型中測試具有及不具有額外基因破壞以防止同種異體性的CAR靶向之synTreg (如本文所闡述「現成」製得的)。
通常，如實例4中所闡述製備T細胞。使用市售套組(例如Miltenyi)，遵循製造商之方案自人類PBMC中分離CD4 T細胞。利用Immunocult使細胞活化，且根據表24進行編輯。所有synTreg細胞均經編輯以插入IL-10DE、CTLA4、dmTGFB1及抗小鼠MAdCAM-1 CAR (「MECA-CAR」)且破壞IFNg、TNFa、TGFBR2及TRAC。為避免被人類化小鼠之免疫系統排斥而經編輯之細胞亦經編輯以破壞HLA-A、HLA-B及CIITA。使用編碼SpCas9之mRNA且分別使用嚮導G019753、G019757及G013006來破壞IFNg、TNFa及TRAC。MECA-CAR AAV構築體包括側接TRAC嚮導切割位點之同源臂。使用編碼NmeCas9鹼基編輯器之mRNA且分別使用嚮導G034983、G034202、G034208及G034619以及編碼UGI之單獨mRNA來破壞TGFBR2、HLA-A、HLA-B及CIITA。
表24. T細胞編輯治療組。「LV」代表慢病毒。「AAV」代表腺相關病毒。
組 CAR-synTreg 同種異體CAR-synTreg
起始細胞 CD4+ CD4+
LV CTLA4及IL-10DE + +
LV dmTGFB 1 + +
LNP IFNg LNP TNFa + +
LNP TGFBR2 + +
LNP-HLA-B LNP UGI - +
AAV MECA-CAR LNP TRAC + +
LNP HLA-A LNP CIITA LNP UGI - +
收穫用於活體內注射之T細胞，且重新懸浮於培養基中。向CD34+人類化NSG小鼠(Jackson Laboratory. 庫存編號705557)靜脈內注射100萬個來自表25中所闡述之每一測試細胞群體之細胞。每一測試組中治療七隻小鼠。每天監測體重。細胞注射後兩小時，將小鼠麻醉且皮下注射100 uL含2% v/v 2,4-二硝基苯磺酸二水合物(DNBS; Sigma Aldrich, R750735)之PBS，以誘導針對此劑之免疫反應。首次治療後六天，經由直腸導管用2.5 mg DNBS再次攻擊小鼠以誘導結腸炎。在細胞注射後9天及結腸炎誘導後3天處死小鼠。收集脾臟、腸系膜淋巴結(MLN)及結腸組織用於分析。記錄結腸長度，去除糞便，記錄結腸重量。解離脾臟及MLN組織，且將殘餘細胞染色並藉由流式細胞術進行分析。結果示於表25及圖17-圖19中。如藉由與結腸炎誘導之對照相比結腸重量:長度減小所證明，CAR synTreg及同種異體編輯之CAR synTreg均保護小鼠免於結腸炎(表25，圖17)。同種異體編輯使脾臟及MLN樣品中的經工程改造之T細胞持久性增加(分別為表25、圖18及圖19)。
表25.小鼠結腸炎模型中之組織分析
樣品 結腸 脾臟 MLN
重量:長度(mg/mm) CD4+ 中之synTreg% CD4+ 中之synTreg%
平均值 SD n 平均值 SD n 平均值 SD n
未誘導之對照 4.1 0.4 7 0.01 0.01 7 0.00 0.00 7
結腸炎誘導之對照 4.9 0.5 7 0.00 0.00 7 0.00 0.00 7
CAR synTreg 4.2 0.3 6 0.07 0.06 7 0.04 0.04 7
同種異體CAR synTreg 4.1 0.4 7 0.22 0.10 7 0.14 0.09 7
實例9. SynTreg抑制慢性結腸炎模型中之症狀在慢性同基因小鼠結腸炎模型中測試多株synTreg抑制結腸炎誘導之能力。在此模型中，使用鼠類初始CD4+ T細胞之授受性細胞轉移來誘導結腸炎。將多株鼠類synTreg與包括天然Treg在內之主體鼠類T細胞就其抑制結腸炎症狀之能力進行比較。通常如實例4中所闡述製備SynTreg，但編輯時間可變化。使用市售套組(Miltenyi)，遵循製造商之方案自C57BL/6小鼠脾臟分離小鼠CD4+ T細胞。使用CD4+作為起始材料、編碼CTLA4、IL-10DE及dmTGFB1之反轉錄病毒用於基因插入以及LNP試劑用以破壞IFNg、TNFa及TGFBR2來工程改造SynTreg。
在小鼠注射當天，使用市售套組(Miltenyi)，遵循製造商之方案自C57BL/6小鼠脾臟分離初始CD4+及總CD4+小鼠T細胞。收穫用於活體內注射之T細胞，且重新懸浮於培養基中。如表26中所闡述，對免疫受損之RAGN12小鼠(Taconic Biosciences)進行腹膜注射。每一測試組中治療十隻小鼠。在細胞注射後約48天處死小鼠。收集腸系膜淋巴結(MLN)及結腸組織用於分析。記錄結腸長度，去除糞便，且記錄組織重量。對石蠟包埋之結腸切片進行染色，且由組織病理學家以盲化方式進行評分。用於分級之形態學標準係Fabrega等人(Front Microbiol. 2017年7月11日:8:1274)及Camuesco等人(Br J Pharmacol. 2012年2月;165(3):729-40.)所推薦之彼等形態學標準。以0-4量表對壞死及潰瘍進行分級。廣泛的評分區域為(1)黏膜上皮及固有層，(2)隱窩，(3)黏膜下層，及(4)肌肉層。結果示於表26及圖20-圖21中。如藉由與結腸炎誘導對照相比，用synTreg治療之小鼠的較低結腸重量:長度比及組織學評分所證明，SynTreg抑制結腸炎之大體體徵及組織學體徵。
表26.慢性小鼠結腸炎模型中之組織分析。
樣品 注射 結腸重量:長度(mg/mm) 組織學評分
平均值 SD n 平均值 SD n
未誘導之對照 媒劑(僅注射介質) 3.4 0.3 10 3.2 0.4 9
結腸炎誘導對照 1.5 M初始CD4+ 5.7 2.3 10 29.6 6.7 10
結腸炎抑制對照 1 M總CD4+ 3.3 0.2 10 16.1 1.2 10
synTreg 1.5 M初始CD4+ 0.5 M synTreg 4.1 0.8 10 22.7 2.5 10
亦評價發炎及結腸炎之其他標記物。解離間葉淋巴結(MLN)，且將細胞染色並藉由流式細胞術進行分析。如表27及圖22A-圖22D中所示，注射synTreg之小鼠在結腸引流淋巴結中產生發炎性細胞介素之CD4+ T細胞的百分比顯著降低。
表27.間葉淋巴結中表現每一發炎性細胞介素之CD4+細胞之平均百分比。
樣品 TNF IFNg IL-22 IL-17
平均值 SD n 平均值 SD n 平均值 SD n 平均值 SD n
結腸炎 誘導 對照 57.8 8.4 8 68.9 16.1 8 19.9 21.1 8 11.5 4.7 8
結腸炎 抑制對照 80.8 9.9 7 36.2 8.1 7 10.9 6.5 7 19.1 2.6 7
synTreg 39.7 16.5 9 48.6 13.2 10 8.5 7.1 10 4.8 4.2 10
結腸外植體分析評價結腸組織中所存在之免疫細胞之細胞介素產生。將1 cm新鮮收穫之結腸組織置於37℃下之培養基中5小時，之後對所收穫之培養基中的細胞介素水準進行定量。根據製造商之說明書，使用MSD-U-PLEX促炎性組合1鼠類套組量測細胞介素水準。如表28及圖23A-圖23B中所示，SynTreg治療減少由結腸駐留免疫細胞產生的促炎性細胞介素IFNg及TNF之量。脂質運載蛋白-2係由嗜中性球及結腸上皮細胞因應於發炎而產生之生物標記物。據報導，人類脂質運載蛋白-2 (NGAL)在患有活動性結腸炎之患者中增加。使用脂質運載蛋白-2 ELISA (Biolegend)評價糞便樣品中之脂質運載蛋白水準。如表28及圖24中所示，鼠類synTreg顯著地減少經治療小鼠之糞便中的脂質運載蛋白-2之量。
表28.結腸外植體培養後培養基中之平均細胞介素水準(pg/ml)以及糞便樣品中之平均脂質運載蛋白水準(ng/ml)。
樣品 IFNg (pg/ml) TNFa (pg/ml) 脂質運載蛋白(ng/ml)
平均值 SD n 平均值 SD n 平均值 SD n
未誘導之對照 2.3 3.5 8 10.9 6.2 9 2 1 9
結腸炎誘導對照 141.3 156.0 10 178.3 144.0 10 1589 2337 10
結腸炎抑制對照 1.9 2.0 8 16.5 7.4 10 2 1 10
synTreg 17.9 9.2 10 59.5 40.7 10 18 23 9
表29.序列
描述 序列 SEQ ID NO
G034199 mC*mU*mC*mAmGCUmAmCGmUCmCCACUmGGAAmGAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU 353
G013006 mC*mU*mC*UCAGCUGGUACACGGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 354
G025420 mC*mU*mC*UCAGCUGGUACACGGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU 355
G034983 mC*mG*mA*mGmAUGmUmCAmUUmUCCCAmGAGCmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU 356
G034208 mU*mC*mU*mGmGGAmAmAGmGAmGGGGAmAGAUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU 357
G034202 mG*mC*mU*mCmUAUmCmCAmCGmGCGCCmCGCGmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU 358
G034619 mA*mG*mC*mUmGCCmGmUUmCUmGCCCAmGUCCmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU 359
MECA-CAR ORF ATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGCCAGCGTGATCATGAGCCGGATGGCCGATATCCAGATGACCCAGTCCCCTAGCGTGCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACACTGTCCTGCAAGACAAGCCAGAACATCAATAAGAATCTGGACTGGTACCAGCAGAAGCTGGGCGAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTTTACCAATAATCTGCAGACCGGCATCCCCAGCAGATTTTCCGGCTCCGGCTCCGGAACCGATTACACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCTACCAGTACAATAGCGGCCCCACATTTGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAGAGGAGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCTGGAGGCGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGCAGCCATCTCAGACACTGAGCCTGACCTGTACCGTGTCCGGCTTCAGCATCACAAGCAACGGCGTGAGCTGGGTGAGACAGCCCCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGCCATCTGGAGCGGCGGCAGCAGAGACTACAATTCCGCCCTGAAGAGCAGGCTGTCCATCAGCAGGGACACAAGCAAGTCCCAGGTGTTCCTGAACCTGAATAGCCTGCAGACAGAGGACACCGCCATCTACTTTTGCACCAGATCCGATTACCACGATGGCACAAGCCTGTACTACTACGTGATGGATGCCTGGGGCCAGGGCGCCAGCGTGACAGTTAGCAGCACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTATATCTGGGCTCCTTTGGCCGGCACCTGCGGGGTGCTGCTGCTTTCCTTGGTGATCACTCTTTACTGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG 360
MECA-CAR胺基酸序列 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRMADIQMTQSPSVLSASVGDRVTLSCKTSQNINKNLDWYQQKLGEAPKLLIYFTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCYQYNSGPTFGAGTKLELRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSITSNGVSWVRQPPGKGLEWMGAIWSGGSRDYNSALKSRLSISRDTSKSQVFLNLNSLQTEDTAIYFCTRSDYHDGTSLYYYVMDAWGQGASVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 361
MECA-CAR胺基酸序列 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSVLSASVGDRVTLSCKTSQNINKNLDWYQQKLGEAPKLLIYFTNNLQTGIPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCYQYNSGPTFGAGTKLELRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSITSNGVSWVRQPPGKGLEWMGAIWSGGSRDYNSALKSRLSISRDTSKSQVFLNLNSLQTEDTAIYFCTRSDYHDGTSLYYYVMDAWGQGASVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 362
CD70-CAR ORF ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAGGTGCAGCTCCTGGAGAGTGGTGGAGGCCTGGTCCAGCCAGGGGGCTCCTTGCGTCTGTCTTGCGCCGCTAGCGGCTTCACTTTTTCTATCTACGCCATGAGTTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGTAAAGGCCTCGAGTGGGTCTCTGCCATCAGCGATTCTGGTGGACGCACCTACTTCGCGGACAGCGTACGTGGCCGCTTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAAGAACACGCTTAGCCTGCAGATGAATTCCCTCCGCGCGGAGGACACCGCAGTCTATTACTGTGCCAAGGTGGATTACAGCAACTACCTGTTCTTCGACTATTGGGGCCAGGGAACATTGGTGACCGTTTCCTCTGGTGGCGGGGGTTCCGGCGGCGGCGGCTCGGGGGGTGGGGGGTCCGAGATCGTGCTGACCCAGAGTCCTGGCACTCTTTCGCTGTCGCCGGGGGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGAGCTTCTCAGTCGATCTCGTCCTCTTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCGCCGAGGCTGTTGATTTACGGCGCATCCTCCCGCGCTACCGGCATCCCCGACAGATTTTCAGGCAGCGGCTCCGGAACCGACTTCACACTAACCATTTCTCGCCTGGAACCCGAGGACTTTGCCGTGTACTACTGTCAACAGTACGGTTCCAGCCCCTATACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCTCCACCACCACCCCTGCCCCTAGACCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGCGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA 363
CD70-CAR胺基酸序列 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKLEIKGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 364
NmeCas9鹼基編輯器 AGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGAGGCCUCCCCCGCCUCCGGCCCCCGGCACCUGAUGGACCCCCACAUCUUCACCUCCAACUUCAACAACGGCAUCGGCCGGCACAAGACCUACCUGUGCUACGAGGUGGAGCGGCUGGACAACGGCACCUCCGUGAAGAUGGACCAGCACCGGGGCUUCCUGCACAACCAGGCCAAGAACCUGCUGUGCGGCUUCUACGGCCGGCACGCCGAGCUGCGGUUCCUGGACCUGGUGCCCUCCCUGCAGCUGGACCCCGCCCAGAUCUACCGGGUGACCUGGUUCAUCUCCUGGUCCCCCUGCUUCUCCUGGGGCUGCGCCGGCGAGGUGCGGGCCUUCCUGCAGGAGAACACCCACGUGCGGCUGCGGAUCUUCGCCGCCCGGAUCUACGACUACGACCCCCUGUACAAGGAGGCCCUGCAGAUGCUGCGGGACGCCGGCGCCCAGGUGUCCAUCAUGACCUACGACGAGUUCAAGCACUGCUGGGACACCUUCGUGGACCACCAGGGCUGCCCCUUCCAGCCCUGGGACGGCCUGGACGAGCACUCCCAGGCCCUGUCCGGCCGGCUGCGGGCCAUCCUGCAGAACCAGGGCAACGGCACCAAGGACUCCACCAAGGACAUCCCCGAGACCCCCUCCAAGGACGCAGCGUUCAAACCAAAUCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGCCAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGCUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG 365
圖1顯示如藉由CTV稀釋所量測的經工程改造之T細胞對細胞增殖之抑制百分比。圖2顯示在向NOG小鼠注射經工程改造之T細胞後隨時間推移之存活百分比。圖3顯示經工程改造之T細胞之持久性型態。圖4顯示活體內IL-10產生(pg/ml)。圖5顯示在xenoGvHD小鼠模型中synTreg之CAR靶向之活體內研究結果，其繪示每一群組中在注射後之每一時間點存活的小鼠之存活百分比。圖6顯示在xenoGvHD小鼠模型中synTreg之CAR靶向之活體內研究結果，其繪示在處死時自小鼠脾臟回收之所有人類CD45+細胞中synTreg之平均百分比。圖7顯示在xenoGvHD小鼠模型中synTreg之CAR靶向之活體內研究結果，其繪示每一實驗條件之平均GvHD評分。圖8顯示在xenoGvHD小鼠模型中synTreg之CAR靶向之活體內研究結果，其繪示每一治療組中小鼠之平均IL-10血清水準。圖9顯示如藉由對Tresp增殖之抑制活性所量測，自脾臟中分離之synTreg之抑制活性。圖10A-圖10D顯示與synTreg相比，Tconv之促炎性細胞介素分泌(IFN-γ，圖10A；TNF-α，圖10B；IL-2，圖10C；IL-10，圖10D)。圖11A-圖11C顯示如在暴露於鼠類MAdCAM-1後藉由CD69水準所量測，Tconv (圖11A)、synTreg (圖11B)及靶向CAR synTreg (圖11C)之活化型態。圖12顯示在再刺激後，INFg、TNFa、IL-10及TFG-b之平均細胞介素分泌(pg/ml)。用鼠類MAdCAM-1 (MC-1)或Immunocult (IC)刺激細胞。圖13顯示在使用synTreg及源自潰瘍性結腸炎患者之T細胞的混合淋巴球反應中之平均細胞增殖抑制百分比。HD，健康供體。UC，潰瘍性結腸炎。圖14顯示在使用synTreg及源自潰瘍性結腸炎患者之T細胞的混合淋巴球反應中之IFNg (圖14A)及TNFa (圖14B)之平均細胞介素分泌。HD，健康供體。UC，潰瘍性結腸炎。圖15顯示在處死時之結腸重量:長度比。圖16顯示結腸樣品之平均組織學評分。圖17顯示在處死時之結腸重量:長度比。圖18顯示小鼠脾臟中synTreg在CD4+細胞群體中之平均百分比。圖19顯示小鼠腸系膜淋巴結(MLN)中synTreg在CD4+細胞群體中之平均百分比。圖20顯示在同基因結腸炎模型中治療後之結腸重量:長度比。圖21顯示在同基因結腸炎模型中治療後結腸切片之組織學評分。圖22A-圖22D分別顯示在同基因結腸炎模型中，在治療後，來自間葉淋巴結之CD4+細胞上TNFa (圖22A)、IFNg (圖22B)、IL-22 (圖22C)及IL-17 (圖22D)之細胞介素表現。圖23A-圖23B分別顯示在結腸外植體培養後所收穫之培養基中IFNg (圖23A)及TNFa (圖23B)之細胞介素水準。圖24顯示在同基因結腸炎模型中治療後糞便中之脂質運載蛋白水準。
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Claims (72)

  1. 一種經工程改造之T細胞，其包含：i) 處於啟動子序列控制下的編碼雙重突變體轉型生長因子β1 (dmTGFB1)之異源核酸序列；及ii) 對編碼轉型生長因子β受體2 (TGFBR2)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低TGFBR2之表現。
  2. 如請求項1之經工程改造之T細胞，其中相對於野生型人類TGFB1，該dmTGFB1包含位於選自以下之兩個或更多個胺基酸處之突變：F198、D199、V200、L208、F217、L219、R218、H222、C223及C225。
  3. 如請求項1或2之經工程改造之T細胞，其中相對於野生型人類TGFB1，該dmTGFB1包含位於選自以下之兩個或更多個胺基酸處之突變：R218、H222、C223及C225。
  4. 如請求項1、2或3之經工程改造之T細胞，其中相對於野生型人類TGFB1，該dmTGFB1包含兩個或更多個選自R218C/H、H222D、C223S/R/G及C225R之胺基酸突變。
  5. 如請求項1至4中任一項之經工程改造之T細胞，其中相對於野生型人類TGFB1，該dmTGFB1包含胺基酸突變R218C/H及C225R。
  6. 如請求項1至5中任一項之經工程改造之T細胞，其中該經工程改造之T細胞為CD4+ T細胞。
  7. 如請求項1至6中任一項之經工程改造之T細胞，其進一步包含：i) 對編碼腫瘤壞死因子α (TNFA)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低TNFA之表現；ii) 對編碼干擾素-γ (IFNG)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低該IFNG之表現；或iii) 處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之經工程改造之T細胞，其包含：i) 對編碼腫瘤壞死因子α (TNFA)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低TNFA之表現；ii) 對編碼干擾素-γ (IFNG)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低該IFNG之表現；及iii) 處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
  9. 如請求項7或8之經工程改造之T細胞，其中該調控性T細胞促進分子係選自介白素-10 (IL10)、細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)、具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、吲哚胺2,3-雙加氧酶1 (IDO1)、胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1 (ENTPD1)、胞外5'-核苷酸酶(NT5E)、介白素-22 (IL-22)、雙調蛋白(AREG)、介白素-35 (IL35)、GARP、CD274分子(CD274)、叉頭盒P3 (FOXP3)、IKAROS家族鋅指2 (IKZF2)、家族性嗜酸性球增多(EOS)、干擾素調控因子4 (IRF4)、淋巴樣增強結合因子1 (LEF1)、BTB結構域及CNC同系物2 (BACH2)以及介白素2受體亞單元α (IL2RA)。
  10. 如請求項9之經工程改造之T細胞，其中該調控性T細胞促進分子為IL10或CTLA4。
  11. 如請求項9或10之經工程改造之T細胞，其中該調控性T細胞促進分子為第一調控性T細胞促進分子，且進一步包含處於啟動子序列控制下的編碼第二調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
  12. 如請求項11之經工程改造之T細胞，其中該第一調控性T細胞促進分子及該第二調控性T細胞促進分子為IL10及CTLA4。
  13. 如請求項9至12中任一項之經工程改造之T細胞，其中相對於成熟野生型人類IL10，該IL10包含位於選自D25、E96、N21及R104之一或多個胺基酸處之突變。
  14. 如請求項9至13中任一項之經工程改造之T細胞，其中相對於成熟野生型人類IL10，該IL10包含一或多個選自D25A/K、E96A、N21A及R104A之胺基酸突變。
  15. 如請求項9至14中任一項之經工程改造之T細胞，其中相對於成熟野生型人類IL10，該IL10包含選自以下之胺基酸突變之組合：D25K、D25A、D25A/E96A、D25K/E96A、N21A/R104A、D25A/N21A/R104A、D25K/N21A/R104A。
  16. 如請求項9至12中任一項之經工程改造之T細胞，其中該IL10包含成熟野生型人類IL10。
  17. 如請求項1至16中任一項之經工程改造之T細胞，其進一步包含對編碼選自TRAC、HLA-A、HLA-B及CIITA之蛋白質的內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低該蛋白質之表現。
  18. 如請求項17之經工程改造之T細胞，其中該蛋白質為TRAC，且該修飾敲低TRAC之表現。
  19. 如請求項17或18之經工程改造之T細胞，其中該蛋白質為HLA-A，且該修飾敲低HLA-A之表現。
  20. 如請求項17至19中任一項之經工程改造之T細胞，其中該蛋白質為HLA-B，且該修飾敲低HLA-B之表現。
  21. 如請求項17至20中任一項之經工程改造之T細胞，其中該蛋白質為CIITA，且該修飾敲低CIITA之表現。
  22. 如請求項1至16中任一項之經工程改造之T細胞，其進一步包含：a) 對編碼TRAC之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低TRAC之表現；b) 對編碼HLA-A之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低HLA-A之表現；c) 對編碼HLA-B之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低HLA-B之表現；及d) 對編碼CIITA之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低CIITA之表現。
  23. 一種經工程改造之T細胞，其包含：i) 對編碼腫瘤壞死因子α (TNFA)之第一內源核酸序列之修飾，其中對該第一內源核酸之該修飾敲低TNFA之表現；ii) 對編碼干擾素-γ (IFNG)之第二內源核酸序列之修飾，其中對該第二內源核酸之該修飾敲低該IFNG之表現；iii) 對編碼選自TRAC、HLA-A、HLA-B及CIITA之蛋白質的第三內源核酸序列之修飾，其中對該第三內源核酸之該修飾敲低該蛋白質之表現；及iv) 處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
  24. 如請求項23之經工程改造之T細胞，其中該蛋白質為TRAC，且該第三修飾敲低TRAC之表現。
  25. 如請求項23或24之經工程改造之T細胞，其中該蛋白質為HLA-A，且該第三修飾敲低HLA-A之表現。
  26. 如請求項23至25中任一項之經工程改造之T細胞，其中該蛋白質為HLA-B，且該第三修飾敲低HLA-B之表現。
  27. 如請求項23至26中任一項之經工程改造之T細胞，其中該蛋白質為CIITA，且該第三修飾敲低CIITA之表現。
  28. 一種經工程改造之T細胞，其包含：i) 對編碼腫瘤壞死因子α (TNFA)之第一內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低TNFA之表現；ii) 對編碼干擾素-γ (IFNG)之第二內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低該IFNG之表現；iii) 對編碼TRAC之第三內源核酸序列之修飾，其中對該第三內源核酸序列之該修飾敲低TRAC之表現；iv) 對編碼HLA-A之第四內源核酸序列之修飾，其中對該第四內源核酸序列之該修飾敲低HLA-A之表現；v) 對編碼HLA-B之第五內源核酸序列之修飾，其中對該第五內源核酸序列之該修飾敲低HLA-B之表現；vi) 對編碼CIITA之第六內源核酸序列之修飾，其中對該第六內源核酸序列之該修飾敲低CIITA之表現；及vii) 處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
  29. 如請求項23至28中任一項之經工程改造之T細胞，其中該調控性T細胞促進分子係選自介白素-10 (IL10)、細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)、具有Ig及ITIM結構域之T細胞免疫受體(TIGIT)、吲哚胺2,3-雙加氧酶1 (IDO1)、胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶1 (ENTPD1)、胞外5'-核苷酸酶(NT5E)、介白素-22 (IL-22)、雙調蛋白(AREG)、介白素-35 (IL35)、GARP、CD274分子(CD274)、叉頭盒P3 (FOXP3)、IKAROS家族鋅指2 (IKZF2)、家族性嗜酸性球增多(EOS)、干擾素調控因子4 (IRF4)、淋巴樣增強結合因子1 (LEF1)、BTB結構域及CNC同系物2 (BACH2)以及介白素2受體亞單元α (IL2RA)。
  30. 如請求項29之經工程改造之T細胞，其中該調控性T細胞促進分子為IL10或CTLA4。
  31. 如請求項29或30之經工程改造之T細胞，其中該調控性T細胞促進分子為第一調控性T細胞促進分子，且進一步包含處於啟動子序列控制下的編碼第二調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
  32. 如請求項31之經工程改造之T細胞，其中該第一調控性T細胞促進分子及該第二調控性T細胞促進分子為IL10及CTLA4。
  33. 如請求項29至32中任一項之經工程改造之T細胞，其中相對於成熟野生型人類IL10，該IL10包含位於選自D25、E96、N21及R104之一或多個胺基酸處之突變。
  34. 如請求項29至33中任一項之經工程改造之T細胞，其中相對於成熟野生型人類IL10，該IL10包含一或多個選自D25A/K、E96A、N21A及R104A之胺基酸突變。
  35. 如請求項29至34中任一項之經工程改造之T細胞，其中相對於成熟野生型人類IL10，該IL10包含選自以下之胺基酸突變之組合：D25K、D25A、D25A/E96A、D25K/E96A、N21A/R104A、D25A/N21A/R104A、D25K/N21A/R104A。
  36. 如請求項29至35中任一項之經工程改造之T細胞，其中該IL10包含成熟野生型人類IL10。
  37. 如請求項1至36中任一項之經工程改造之T細胞，其進一步包含對編碼介白素17A (IL17A)、介白素-2 (IL2)、介白素6 (IL6)、穿孔蛋白1 (PRF1)、顆粒酶A (GZMA)、顆粒酶B (GZMB)、天然殺手細胞顆粒蛋白7 (NKG7)、Fas配位體(FASL，NF超家族，成員6)、雷諾丁受體2 (ryanodine receptor 2, RYR2)及群落刺激因子2 (CSF2)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾分別敲低該IL17A、該IL2、該IL6、該PRF1、該GZMA、該GZMB、該FASL、該RYR2或該CSF2之表現。
  38. 如請求項1至37中任一項之經工程改造之T細胞，其進一步包含對編碼內源T細胞受體(TCR)之內源核酸序列之修飾，其中該修飾敲低該內源TCR之表現。
  39. 如請求項1至38中任一項之經工程改造之T細胞，其進一步包含處於啟動子序列控制下的針對靶向受體之異源編碼序列。
  40. 如請求項39之經工程改造之T細胞，其中該靶向受體靶向選自以下之配位體：黏膜血管位址素細胞黏著分子1 (MADCAM1)、腫瘤壞死因子α (TNFA)、CD70分子(CD70)、CEA細胞黏著分子6 (CEACAM6)、血管細胞黏著分子1 (VCAM1)、瓜胺酸化波形蛋白、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)、MOG (髓磷脂寡樹突膠細胞糖蛋白)、蛋白脂質蛋白1 (PLP1)、CD19分子(CD19)、CD20分子(CD20)、TNF (配位體)超家族成員7 (TNFSF7)、TNF受體超家族成員17 (TNFRSF17)、二肽基肽酶樣6 (DPP6)、溶質載體家族2成員2 (SCL2A2)、麩胺酸去羧酶(GAD2)、橋粒芯蛋白3 (DSG3)及MHC I類HLA-A (HLA-A*02)。
  41. 如請求項39或40之經工程改造之T細胞，其中該靶向受體包含嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
  42. 如請求項39至41中任一項之經工程改造之T細胞，其中將編碼該靶向受體之該異源核酸序列併入至表現構築體中。
  43. 如請求項39至42中任一項之經工程改造之T細胞，其中該編碼靶向受體之異源核酸序列所在之表現構築體不包含編碼調控性T細胞促進分子之核酸序列。
  44. 如請求項39至42中任一項之經工程改造之T細胞，其中該編碼靶向受體之異源核酸序列所在之表現構築體包含編碼調控性T細胞促進分子之核酸序列。
  45. 如請求項11至22或31至44中任一項之經工程改造之T細胞，其中將編碼該第一調控性T細胞促進分子之該異源核酸序列併入至表現構築體中，且將編碼該第二調控性T細胞促進分子之該異源核酸序列併入表現構築體中。
  46. 如請求項11至22或31至45中任一項之經工程改造之T細胞，其中將編碼該第一調控性T細胞促進分子之該異源核酸序列及編碼該第二調控性T細胞促進分子之該異源核酸序列併入至單獨的表現構築體中。
  47. 如請求項11至22或31至46中任一項之經工程改造之T細胞，其中將編碼該第一調控性T細胞促進分子之該異源核酸序列及編碼該第二調控性T細胞促進分子之該異源核酸序列併入至單一表現構築體中。
  48. 如請求項1至47中任一項之經工程改造之T細胞，其中至少一種異源編碼序列處於游離型表現構築體中。
  49. 如請求項1至48中任一項之經工程改造之T細胞，其中至少一種異源核酸序列插入至基因體中。
  50. 如請求項49之經工程改造之T細胞，其中向基因體中之該插入為非靶向插入。
  51. 如請求項49之經工程改造之T細胞，其中該插入為靶向插入。
  52. 如請求項51之經工程改造之T細胞，其中該靶向插入係在選自以下之位點中：TCR基因座、TNF基因座、IFNG基因座、IL17A基因座、IL6基因座、IL2基因座、腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)基因座。
  53. 如請求項52之經工程改造之T細胞，其中該TCR基因座為T細胞受體α恆定(TRAC)基因座。
  54. 如請求項7至53中任一項之經工程改造之T細胞，其中敲低基因表現之該修飾包含插入、缺失或取代中之一或多者。
  55. 如請求項1至54中任一項之經工程改造之T細胞，其中該經工程改造之T細胞為CD4+ T細胞。
  56. 一種經工程改造之T細胞群體，其包含如請求項1至55中任一項之經工程改造之T細胞。
  57. 一種經工程改造之T細胞群體，其包含如請求項1至22或37至56中任一項之經工程改造之T細胞，其中該群體中至少30%或至少40%之細胞包含處於啟動子序列控制下的編碼dmTGFB1之異源核酸序列；且該群體中至少50%或至少70%之細胞包含對編碼TGFBR2之內源核酸序列之修飾。
  58. 如請求項56或57之經工程改造之T細胞群體，其中該群體中至少50%或至少70%之細胞包含對編碼TNFA之內源核酸序列之修飾；該群體中至少50%或至少70%之細胞包含對編碼IFNG之內源核酸序列之修飾；或該群體中至少30%或至少40%之細胞包含處於啟動子序列控制下的編碼調控性T細胞促進分子之異源核酸序列。
  59. 如請求項57或58之經工程改造之T細胞群體，其中包含插入或修飾之細胞百分比係由根據次世代定序 (NGS)之讀段百分比來確定。
  60. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至55中任一項之經工程改造之T細胞或如請求項56至59之經工程改造之T細胞群體。
  61. 一種向個體投與如請求項1至55中任一項之經工程改造之T細胞、如請求項56至59中任一項之經工程改造之T細胞群體或如請求項60之醫藥組合物的方法或用途。
  62. 如請求項61之方法或用途，其中該個體需要免疫抑制。
  63. 如請求項61或62之方法或用途，其用於治療免疫病症。
  64. 如請求項61至63中任一項之方法或用途，其用於治療自體免疫性疾病。
  65. 如請求項64之方法或用途，其中該自體免疫性疾病係選自潰瘍性結腸炎、克隆氏病(Crohn's disease)、類風濕性關節炎、牛皮癬、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡及1型糖尿病。
  66. 如請求項61至65中任一項之方法或用途，其用於治療移植物抗宿主病(GvHD)。
  67. 如請求項61、62或66中任一項之方法或用途，其中該個體接受移植或輸血。
  68. 如請求項67之方法或用途，其中該移植或輸血包含實體器官或細胞群體。
  69. 如請求項67或68之方法或用途，其中該移植或輸血包含來自非該個體之供體的細胞。
  70. 如請求項67至69中任一項之方法或用途，其中在接受該移植或輸血之前，向該個體投與如請求項1至55中任一項之經工程改造之T細胞、如請求項56至59中任一項之經工程改造之T細胞群體或如請求項60之醫藥組合物。
  71. 如請求項67至70中任一項之方法或用途，其中在接受該移植或輸血的同時向該個體投與如請求項1至55中任一項之經工程改造之T細胞、如請求項56至59中任一項之經工程改造之T細胞群體或如請求項60之醫藥組合物。
  72. 如請求項67至71中任一項之方法或用途，其中在接受該移植或輸血之後，向該個體投與如請求項1至55中任一項之經工程改造之T細胞、如請求項56至59中任一項之經工程改造之T細胞群體或如請求項60之醫藥組合物。
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