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TW202530405A - 傳訊核糖核酸及用以預防或治療癌症之包括其的醫藥組成物、對其進行編碼的脫氧核糖核酸建構物以及預防或治療癌症的方法 - Google Patents

傳訊核糖核酸及用以預防或治療癌症之包括其的醫藥組成物、對其進行編碼的脫氧核糖核酸建構物以及預防或治療癌症的方法

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TW202530405A
TW202530405A TW113136829A TW113136829A TW202530405A TW 202530405 A TW202530405 A TW 202530405A TW 113136829 A TW113136829 A TW 113136829A TW 113136829 A TW113136829 A TW 113136829A TW 202530405 A TW202530405 A TW 202530405A
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TW
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mrna
seq
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TW113136829A
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金燐婀
卞珠娟
申勝顯
李知熹
林昌奎
韓泳辰
許容豪
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南韓商韓美藥品股份有限公司
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Abstract

提供一種包括5'非轉譯區（5'UTR）、對p53蛋白質進行編碼的序列及3'非轉譯區（3'UTR）的傳訊核糖核酸（mRNA）、一種包含所述傳訊核糖核酸的用於將所述傳訊核糖核酸或p53遞送至受試者的組成物、以及一種用於預防或治療癌症的組成物及方法。

Description

用以預防或治療癌症之包括核酸建構物編碼P53蛋白質的醫藥組成物
本揭露是有關於一種對p53蛋白質進行編碼的核酸建構物及其應用。
在癌症免疫治療及基於幹細胞的生物醫學研究領域中經常將核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）（例如，傳訊RNA（messenger RNA））用作基因遞送分子作為質體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的替代物。作為基因產物的直接來源，mRNA具有若干優點，包括不需要進入核，而此會對DNA遞送構成顯著障礙，特別是在非分裂細胞（non-dividing cell）中。此外，藉由避免由異常轉錄及插入誘變（insertional mutagenesis）引起的癌基因表達，mRNA不太可能整合至宿主基因組中。
對於給定的基因，包括5'非轉譯區（untranslated region，UTR）及3'UTR的基因的UTR是參與調控表達（regulating expression）的區。5'UTR是在蛋白質編碼序列的5'末端處的DNA調控區，且被轉錄成mRNA，但不被轉譯成蛋白質。5'UTR可包括各種調控元素，例如5'-帽結構（5'-cap structure）、G-四鏈體結構（G4）、莖環（stem-loop）結構及內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES），且此種調控元素在控制轉譯起始中起重要作用。已知定位於蛋白質編碼序列的下游的3'UTR參與諸多調控過程，所述調控過程包括轉錄切割（transcript cleavage）、穩定性及聚腺苷酸化（polyadenylation）、轉譯及mRNA定位。3'UTR用作諸多調控蛋白質與小的非編碼RNA（例如，微小RNA）的結合位點。
p53是一種在人體中由TP53基因編碼的腫瘤抑制蛋白質。p53作為腫瘤抑制因子在多細胞生物體的細胞週期（cell cycle）中對癌症預防至關重要。
大體而言，目前的mRNA療法並非組織特異性的或者依賴於提供低水準蛋白質表達的天然或標準UTR序列。就此而言，需要可使mRNA療法穩定並增加p53蛋白質的合成的新穎UTR及其組合。
[技術問題] 一態樣提供分離的mRNA，所述mRNA包含對非天然5'非轉譯區（5'UTR）進行編碼的核苷酸序列、對p53或其功能片段進行編碼的核苷酸序列以及對3'UTR進行編碼的核苷酸序列，該些核苷酸序列中的每一者以可操作的方式彼此連結。
另一態樣提供一種獲得p53或其功能片段的方法，所述方法包括對mRNA進行轉譯。
另一態樣提供一種包含mRNA作為有效成分（active ingredient）的組成物。
另一態樣提供一種用於預防或治療受試者的癌症的組成物，所述組成物包含mRNA作為有效成分。
另一態樣提供一種利用mRNA的方法，所述方法包括將mRNA導入至宿主細胞。
另一態樣提供對mRNA進行編碼的DNA。
另一態樣提供一種獲得RNA的方法，所述方法包括藉由使用DNA作為模板對RNA進行轉錄。
[技術解決方案] 本說明書中所使用的「5'非轉譯區（5'-UTR）」是指不編碼多肽的mRNA區，直接位於待由核糖體轉譯的mRNA轉錄本（transcript）的第一個密碼子（即，起始密碼子）的上游（即5'）。
本說明書中所使用的「3'非轉譯區（3'-UTR）」是指不編碼多肽的mRNA區，直接位於對轉譯終結進行傳訊的mRNA轉錄本的終止密碼子（即，終結密碼子）的下游（即3'）。
本說明書中所使用的「開讀框（open reading frame，ORF）」或「對多肽進行編碼的序列」是指DNA的以起始密碼子（例如，甲硫胺酸密碼子（ATG））開始並以終止密碼子（例如，TAA、TAG或TGA）結束且對多肽進行編碼的連續區。
本說明書中所使用的「聚腺苷酸序列（polyadenylate sequence）」、「聚(A)」或「聚(A)尾」是指包含多個連續腺嘌呤核苷酸、位於3'-UTR的下游（例如，直接位於3'-UTR的下游（即3'））的mRNA區。聚(A)尾可包括1,000個、500個、400個或者300個或小於300個腺嘌呤核苷酸。舉例而言，聚(A)尾可包括10個至300個腺嘌呤核苷酸。舉例而言，聚(A)尾可包括10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、190個、200個、210個、220個、230個、240個、250個、260個、270個、280個、290個或300個核苷酸。聚(A)尾可包括例如50個至250個腺嘌呤核苷酸。活體（例如，細胞或受試者）中的聚(A)尾可用於保護mRNA免受酶（例如，細胞質酶）的攻擊，並有助於轉錄的終結、mRNA自細胞核的輸出以及轉譯。3'聚(A)尾是指腺嘌呤核苷酸的一個區（一段），且通常添加至在mRNA加工期間轉錄的mRNA或不成熟的mRNA。
本說明書中所使用的用語「以可操作的方式連結」是指單個核酸片段上核苷酸序列的連接，使得一種功能受到另一種功能的影響。舉例而言，當啟動子能夠影響編碼序列的表達時（即，當編碼序列的轉錄受啟動子調控時），啟動子以可操作的方式連結至編碼序列（例如，ORF）。編碼序列可在有義方向（sense direction）或反義方向（anti-sense direction）上以可操作的方式連結至調控序列。除非在本說明書中另有說明，否則所主張的mRNA或DNA中所包括的每一核酸序列以可操作的方式彼此連結。
除非另外指明核苷酸序列的位置，否則本說明書中所使用的核苷酸序列自5'-末端連接至3'-末端或位於5'-末端至3'-末端。
本說明書中所使用的用語「載體」或「核酸建構物」是指能夠攜帶基因、ORF或DNA片段進入至細胞中的任何核酸。載體可為例如可在細胞中複製的載體。載體可為病毒、噬菌體、前病毒、質體、噬菌粒、轉位子（transposon）或人造染色體（例如，人造酵母染色體（yeast artificial chromosome，YAC）、人造細菌染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）、人造植物染色體（plant artificial chromosome，PLAC））等。
第一態樣提供包括非天然5'UTR、對多肽進行編碼的序列以及非天然3'UTR的mRNA， 其中5'UTR不形成二級結構， 對多肽進行編碼的序列是對p53或p53的功能片段進行編碼的序列，且 3'UTR具有：由以下點-括號記法（dot-bracket notation）表示的二級結構： .(((((...........(((...(((((.(((....))).)))))...)))..(((((((..((((....((((((.(((((.......)))))..))).)))))))...))))))).......(((....)))............(((.........(((....))))))..)))))；或者 由以下點-括號記法表示的二級結構： ((((((((((((...(((((.((........((((((((.........))))))))))))))).....(((...))).....))))))))))))..((((((((((((....))))))...)))))).....((((((...))))))........... 其中，在點-括號記法中，點表示序列中的不成對鹼基，且「（」及「）」表示序列中的成對鹼基。本說明書中所使用的用語「二級結構」是指成對鹼基之間的結合。
包括非天然5'UTR的mRNA可具有式1的序列： 式1：AGN aGCCACC 其中N為A、U、G或C，每一N彼此等同或不同，且a表示N的重複數且為42或62。
包括3'UTR的mRNA可具有-0.1千卡/莫耳至-0.3千卡/莫耳的用於RNA折疊的平均自由能（mean free energy）， （a）由.(((((...........(((...(((((.(((....))).)))))...)))..(((((((..((((....((((((.(((((.......)))))..))).)))))))...))))))).......(((....)))............(((.........(((....))))))..)))))表示的包括3'UTR的mRNA的二級結構具有為178個核苷酸（nucleotide，nt）的長度及為40%至50%的GC含量（GC%），且 （b）由((((((((((((...(((((.((........((((((((.........))))))))))))))).....(((...))).....))))))))))))..((((((((((((....))))))...)))))).....((((((...))))))...........表示的包括3'UTR的mRNA的二級結構具有為158個核苷酸的長度及為30%至50%的GC%。
5'UTR可包括序列識別號（SEQ ID NO）：1至9中的任一者的核苷酸序列。
此外，3'UTR可包括序列識別號：10至17中的任一者的核苷酸序列。具有（a）所示二級結構的3'UTR可包括序列識別號：10至14中的任一者的核苷酸序列。具有（b）所示二級結構的3'UTR可包括序列識別號：15至17中的任一者的核苷酸序列。
對p53或其功能片段進行編碼的序列可以可操作的方式連結至5'UTR及3'UTR，且因此可被轉譯成p53或其功能片段。
p53或其功能片段可具有預防或治療癌症的活性。p53或其功能片段可具有作為腫瘤抑制因子的活性。舉例而言，腫瘤抑制因子可參與調控癌細胞自身的細胞週期，且因此可具有抗癌活性。此外，具有抗癌活性的p53或其功能片段可抑制癌細胞的增殖。p53或其功能片段可為包含融合蛋白質（fusion protein）的重組的p53或其功能片段。
p53在包括細胞週期調控及凋亡控制的若干過程中起重要作用。p53突變經常發生於腫瘤細胞中，且與癌症進展以及對化學療法及放射療法的抗性發展有關。體外及體內的臨床前研究已表明，野生型p53功能的恢復可誘導癌細胞的凋亡。在具有逆轉錄病毒或腺病毒的野生型p53建構物的動物模型中，腫瘤內注射使得包括非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、白血病、神經膠質母細胞瘤（glioblastoma）、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、結腸癌及腎癌在內的各種不同腫瘤組織出現腫瘤退化。
對多肽進行編碼的序列可藉由對p53或其功能片段進行編碼來進行密碼子最佳化。密碼子最佳化可依據被導入序列的宿主細胞而變化。此外，所述序列可對多肽進行編碼且可包括簡併序列（degenerate sequence）。
對p53多肽進行編碼的核苷酸序列可包括對序列識別號：25的胺基酸序列進行編碼的序列，例如序列識別號：22的核苷酸序列。
當3'UTR與5'UTR組合時，RNA的產率可協同提高。當3'UTR與對多肽進行編碼的序列及5'UTR組合時，RNA的產率可協同提高。在mRNA中，為了提高p53或其功能片段的表達，具有序列識別號：1至9中的任一者的核苷酸序列的5'UTR可與具有序列識別號：10至17中的任一者的核苷酸序列的3'UTR組合。舉例而言，5'UTR與3'UTR的組合可如下所示：序列識別號：1的5'UTR與序列識別號：10至17中的任一者的3'UTR；序列識別號：2的5'UTR與序列識別號：10至17中的任一者的3'UTR；序列識別號：3的5'UTR與序列識別號：10至17中的任一者的3'UTR；序列識別號：4的5'UTR與序列識別號：10至17中的任一者的3'UTR；序列識別號：5的5'UTR與序列識別號：10至17中的任一者的3'UTR；序列識別號：6的5'UTR與序列識別號：10至17中的任一者的3'UTR；序列識別號：7的5'UTR與序列識別號：10至17中的任一者的3'UTR；序列識別號：8的5'UTR與序列識別號：10至17中的任一者的3'UTR；以及序列識別號：9的5'UTR與序列識別號：10至17中的任一者的3'UTR。相較於包括序列識別號：18或19的C3 3'UTR或P450 2E1 3'UTR的mRNA，mRNA可顯示轉錄或轉譯的良率增加。相較於包括序列識別號：26的C3 5'UTR的mRNA，mRNA可顯示轉錄或轉譯的良率增加。
mRNA可更包括表達調控序列。表達調控序列可能涉及轉譯調控或mRNA穩定性。表達調控序列可為科紮克（Kozak）序列或聚(A)序列。
對5'UTR進行編碼的核苷酸序列、對多肽進行編碼的序列、對3'UTR進行編碼的核苷酸序列及表達調控序列可在體外或體內轉錄，且可形成共用轉錄本。
對5'UTR進行編碼的核苷酸序列、對多肽進行編碼的序列、對3'UTR進行編碼的核苷酸序列及表達調控序列可以可操作的方式彼此連結。
相較於使用天然5'UTR及/或天然3'UTR的情形，5'UTR或3'UTR可具有提高轉譯良率、RNA的穩定性或其組合的活性。
在實施例中，mRNA可包括「5'-帽」，例如帽0（Cap0）、帽1（Cap1）或帽2（Cap2）。用語「5'-帽」是指在mRNA分子的5'-末端處發現的帽結構。5'-帽通常是經由5'至3'鏈中的第一個核苷酸的5'位置處的5'三磷酸連接至mRNA的7-甲基鳥嘌呤核糖核苷酸。在帽0中，mRNA的第一個帽近端核苷酸及第二個帽近端核苷酸處的核糖二者可包括2'-羥基。在帽1中，mRNA的第一個帽近端核苷酸及第二個帽近端核苷酸處的核糖可分別包括2'-甲氧基及2'-羥基。在帽2中，mRNA的第一個帽近端核苷酸及第二個帽近端核苷酸處的核糖二者可包括2'-甲氧基。7-甲基鳥嘌呤核糖核苷酸可進一步被修飾。舉例而言，在經修飾的7-甲基鳥嘌呤核糖核苷酸中，7-甲基鳥嘌呤3'-甲氧基（7-methylguanine 3'-methoxy，7mG(3'OMe)）或2'-羥基及3'-羥基可各自獨立地經含磺醯基的基團取代，所述含磺醯基的基團選自由甲磺醯基（mesyl group）、乙磺醯基（esyl group）、三氟甲磺醯基（triflyl group）、三氟乙基磺醯基（tresyl group）、甲苯磺醯基（tosyl group）、對溴苯基磺醯基（brosyl group）、對硝基苯磺醯基（nosyl group）及丹磺醯基（dansyl group）組成的群組。經含磺醯基的基團取代的經修飾的7-甲基鳥嘌呤核糖核苷酸可為例如7-甲基鳥嘌呤3'-甲磺醯基（7mG(3'OMs)）。包括哺乳動物mRNA（例如，人類mRNA）的較高真核生物中的大多數內源性mRNA可具有帽1或帽2。帽0及不同於帽1及帽2的其他帽結構在哺乳動物（例如，人類）中可為免疫性的。
此種帽可以共轉錄的方式導入。舉例而言，5'-帽或5'-帽類似物可在起始處被導入至RNA，同時在5'-帽或5'-帽類似物的存在下對DNA模板進行體外轉錄。此外，此種帽可以後轉錄的方式導入。5'-帽或5'-帽類似物可藉由加帽酶（例如，來自牛痘病毒的加帽酶）進行後轉錄而被導入至RNA。所形成的具有5'-末端帽結構的5'-末端序列可包括例如7mG(5')ppp(5')ApG、m7G(3'OMe)(5')ppp(5')ApG、m7G(3'OMe)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G (3'OMs)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、或者m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。
在實施例中，mRNA可包括經修飾的核苷酸。在實施例中，mRNA可具有經N1-甲基-假尿苷取代的至少一個U。在mRNA中，所形成的具有5'-末端帽結構的5'-末端序列可具有m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG的帽結構或m7(3'OMsG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG的帽結構。在mRNA中，所有的U皆可經N1-甲基-假尿苷取代。在mRNA中，所有的U皆可經N1-甲基-假尿苷取代，且所形成的具有5'-末端帽結構的5'-末端序列可具有m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG的帽結構或m7(3'OMsG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG的帽結構。
mRNA可包括序列識別號：1至9中的任一者的5'UTR的核苷酸序列、對p53進行編碼的核苷酸序列（例如對序列識別號：25的胺基酸序列進行編碼的核苷酸序列）、以及序列識別號：10至17中的任一者的3'UTR的核苷酸序列。mRNA可在序列中包括經N1-甲基-假尿苷取代的至少一個U。在mRNA中，5'-末端序列可具有m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG的帽結構或m7(3'OMsG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG的帽結構。在mRNA中，所有的U可經N1-甲基-假尿苷取代。在mRNA中，所有的U可經N1-甲基-假尿苷取代，且5'-末端序列可具有m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG的帽結構或m7(3'OMsG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG的帽結構。然而，mRNA的5'-帽結構不限於此種結構，且可經天然5'-帽結構或本領域中已知的5'-帽類似物取代。
第二態樣提供一種獲得p53或其功能片段的方法，所述方法包括對mRNA進行轉譯。
所述方法可包括藉由培養包含所述mRNA的細胞來產生p53或其功能片段。
第三態樣提供一種包含mRNA作為有效成分的組成物。
所述組成物可用於向受試者遞送mRNA或者由mRNA表達的p53或其功能片段。遞送可用於預防或治療受試者的癌症。
第四態樣提供一種用於預防或治療受試者的癌症的組成物，所述組成物包含mRNA作為有效成分。
癌症可包括p53突變。癌症可由突變的p53引起。所述癌症可為可藉由補充野生型p53或其功能片段來治療、減輕、抑制、改善及/或預防的癌症及/或其轉移。
所述組成物可用於治療、減輕、抑制、改善及/或預防受試者的癌症及/或其轉移。受試者可為包括人在內的哺乳動物。
可將所述組成物施用至受試者，且然後可在體內轉譯RNA（例如，mRNA）以產生治療性多肽（即，p53或其功能片段）。
組成物可以「有效量」的mRNA與細胞、組織或受試者接觸。
有效量可基於靶組織、靶細胞、施用方式、RNA的物理性質（例如，RNA的大小及經修飾核苷的量）以及組成物的其他組分來確定。
組成物可藉由肌內、皮下、皮內、鼻內或肺部施用的方式施用。
組成物可包括至少一種藥學上可接受的載體或賦形劑。在所述組成物中，RNA可與載體或賦形劑一起配製或複合配製。載體或賦形劑可為本領域中已知者。
組成物中所包含的有效成分、藥學上可接受的載體、賦形劑及/或其他附加組分的相對量可依據待醫治對象的身份、大小及/或狀況、及/或施用途徑而變化。舉例而言，組成物可包含0.1%至100%、例如0.5%至50%、1.0%至30%、5.0%至80%、或者80%（w/w）或大於80%的有效成分。
組成物可被配製為奈米顆粒。奈米顆粒可為本領域中已知的用於將多核苷酸（例如，mRNA）遞送至細胞中的奈米顆粒。舉例而言，奈米顆粒可為已知在RNA疫苗中使用的奈米顆粒。奈米顆粒可為脂質奈米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）。組成物可被配製為或結合至LNP。結合可包括與LNP結合或結合至LNP的表面。舉例而言，組成物可在脂質聚陽離子複合物內配製，或者可結合至脂質聚陽離子複合物。脂質聚陽離子複合物亦被稱為陽離子脂質奈米顆粒。聚陽離子可包括MC3、脂質319、C12-200、5A2-SC8、306Oi10、莫德納脂質5（Moderna Lipid 5）、奧克塔斯（Acuitas）A9、SM-102、ALC-0315、角星脂質（Arcturus Lipid）2,2 (8,8) 4C CH3、蓋納萬（Genevant）CL1或陽離子多肽（例如，聚離胺酸、聚鳥胺酸及/或聚精胺酸）。此外，組成物可與LNP一起配製或結合至LNP，所述LNP包括1,2二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（1,2distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC）、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC）、甾醇（例如，膽固醇）、或者非陽離子脂質（例如，二油醯磷脂醯乙醇胺（dioleoylphosphatidylethanolamine，DOPE））。此外，組成物可與包括聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）-脂質（例如，1,2-二肉豆蔻醯-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（PEG2000-DMG）、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-雙十四烷基乙醯胺（ALC-0159）及聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG-DMA））的LNP一起配製或結合至所述LNP。
LNP製劑可包括陽離子脂質、磷脂、甾醇（例如，膽固醇）、PEG-脂質或其組合。LNP製劑可包括例如陽離子脂質、磷脂、甾醇（例如，膽固醇）及PEG-脂質。此外，LNP可包括經PEG修飾的脂質、非陽離子脂質、甾醇、可電離的脂質或其組合。LNP可包括0.5莫耳%至15莫耳%的經PEG修飾的脂質、5莫耳%至25莫耳%的非陽離子脂質、25莫耳%至55莫耳%的甾醇及20莫耳%至60莫耳%的可電離脂質。經PEG修飾的脂質可為PEG2000-DMG，非陽離子脂質可為DSPC，甾醇可為膽固醇，且可離子化的陽離子脂質可為具有以下結構的化合物1： （化合物1）。
經PEG修飾的脂質可為具有以下結構的化合物2（ALC-0159），非陽離子脂質可為DSPC，甾醇可為膽固醇，且可離子化的陽離子脂質可為具有以下結構的化合物3（ALC-0315）： （化合物2）；以及 （化合物3）。
組成物可為用於預防或治療受試者的癌症的組成物，包括mRNA及LNP作為有效成分。
第五態樣提供一種利用mRNA的方法，所述方法包括將mRNA導入至宿主細胞。
在所述方法中，宿主細胞可為源自受試者的任何細胞。受試者可為包括人在內的哺乳動物。所述細胞可為例如任何癌細胞。
所述方法可包括將mRNA施用於受試者。施用可為腸胃外施用或口服施用。施用可為肌內、皮下、皮內、鼻內或肺部施用。受試者可為包括人在內的哺乳動物。
所述方法可用於誘導預防或治療受試者的癌症。癌症與如上所述者相同。
在所述方法中，施用可為肌內、皮下、皮內、鼻內或肺部施用。
可以用於預防或治療癌症的「有效量」來施行施用。
第六態樣提供對mRNA進行編碼的DNA。
DNA可更包括用於導入可轉錄核苷酸序列的序列。用於導入可轉錄核苷酸序列的序列可以可操作的方式連結至對3'UTR進行編碼的核苷酸上游的3'UTR。用於導入可轉錄核苷酸序列的序列可為克隆位點。克隆位點可為多克隆位點。克隆位點可包括限制酶的辨別位點、切割位點或其組合。
DNA可更包括啟動子序列。啟動子可以可操作的方式連結至對5'UTR進行編碼的核苷酸上游的5'UTR。
當在體外或體內發生轉錄時，啟動子、對5'-UTR進行編碼的核苷酸序列、對多肽進行編碼的序列或用於導入可轉錄核苷酸的核苷酸序列、以及對3'UTR進行編碼的核苷酸序列可彼此連結以形成共用轉錄本。
DNA可為核酸建構物或載體。DNA可為表達載體或克隆載體。
第七態樣提供一種獲得RNA的方法，所述方法包括藉由使用DNA作為模板來對RNA進行轉錄。轉錄可包括體外轉錄、離體轉錄或體內轉錄。體內轉錄可包括在受試者中發生的轉錄。
用語「體外轉錄（ in vitrotranscription）」或「RNA體外轉錄」是指在非細胞系統中、即在體外合成包括mRNA的RNA的過程。包括質體DNA載體的克隆載體DNA可用作用於產生RNA轉錄本的模板。一般而言，該些克隆載體亦被稱為轉錄載體。RNA可利用合適的DNA模板藉由依賴DNA的體外轉錄而獲得。DNA模板可為線性化的質體DNA模板。對RNA體外轉錄進行控制的啟動子可為依賴DNA的RNA聚合酶的任何啟動子。依賴DNA的RNA聚合酶可為T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或其組合。用於RNA體外轉錄的DNA模板可藉由對核酸進行克隆並將其導入至用於RNA體外轉錄的載體來獲得。DNA可包括與待進行體外轉錄的每一RNA對應的互補DNA（complementary DNA，cDNA）。用於RNA體外轉錄的載體可為環狀質體DNA。cDNA可藉由mRNA的逆轉錄或藉由化學合成而獲得。
轉錄載體可包括啟動子、對5'-UTR進行編碼的核苷酸序列、對多肽進行編碼的序列（例如ORF）、對3'-UTR進行編碼的核苷酸序列及聚(A)尾。轉錄載體亦可包括複製起點（例如，大腸桿菌（ E. coli）複製起點ColE1 ori）、選擇標記基因或其組合。啟動子可為T7啟動子。選擇標記可為抗生素抗性酶（例如，康黴素（kanamycin）抗性酶）。
體外轉錄可包括藉由將轉錄載體導入至宿主細胞（例如大腸桿菌）獲得經轉化的宿主細胞，並藉由培養宿主細胞來增殖宿主細胞，所述宿主細胞包括成為mRNA模板的質體DNA。體外轉錄可包括自增殖的宿主細胞（例如大腸桿菌）分離質體DNA。質體DNA的分離可包括自培養物分離細胞層及自細胞層分離質體DNA。細胞層的分離可藉由離心、分隔、沈澱（precipitation）或其組合來實行。自細胞分離質體DNA可藉由例如鹼提取法、親和層析法（affinity chromatography）、高效液相層析法（high performance liquid chromatography，HPLC）、電泳或其組合等本領域中已知的方法來實行。
RNA的獲得可包括藉由培養包含DNA的細胞來產生DNA的RNA轉錄本。
[有利的效果] 根據一態樣的mRNA相對穩定且具有高產率，且因此可用於高效地轉錄及轉譯mRNA。
根據依據另一態樣的獲得多肽的方法，可高效地獲得p53及其功能片段。
根據另一態樣，用於將mRNA或由mRNA表達的p53遞送至受試者的組成物可用於將mRNA或由mRNA表達的p53遞送至受試者。
根據另一態樣，用於預防或治療癌症的組成物可用於高效地使受試者免疫或治療受試者。
根據另一態樣的利用RNA的方法可用於預防或治療受試者的癌症。
根據另一態樣的DNA可用於獲得mRNA。
根據依據另一態樣的獲得RNA的方法，可高效地獲得RNA。
在下文中，將藉由實例更詳細地闡述本揭露。然而，該些實例旨在對本揭露進行例示，且本揭露的範圍不限於該些實例。 實例 1 ： 增加基因 的 良率的未建構的 5'UTR 非天然序列
在此實例中，選擇增加基因的良率的5'UTR序列。5'UTR序列是自然界中不存在的非天然序列，且為不形成二級結構的序列。相較於天然序列，5'UTR序列具有增加基因的良率的活性。
首先，選擇長度為50個鹼基對（base pair，bp）或70個鹼基對且平均自由能為0的隨機非天然序列，且選擇在鹼基之間不形成二級結構的序列。
將所選擇的mRNA序列設計成以用於加帽最佳化而保護5'-末端的「AG」開始，並以作為用於穩定基因表達的科紮克序列的「GCCACC」結束。
首先選擇具有增加基因的良率的優異活性的序列。基於該些序列，一些鹼基序列被替換以提高增加基因的良率的活性，且因此最終選擇了9個非天然序列（表1）。
[表1]
序列識別號（SEQ ID NO）： 5'UTR序列
1 AGCCGUCUUCCAUCGUUACAGUCACCGUUUUCGCAUUCUGUCUAGCCACC
2 AGAAUCCAGUCAACGCAUAUCCACGUAUACCCGAACACAUCACAGCCACC
3 AGCCCCCCAACACUGACUUAAUCGCUUUAAGUUCCUCCAAACGAGCCACC
4 AGAGCAGAACGCGUAACCACACCAUCGCAACAUCCCACUUGAUAGCCACC
5 AGACCAGACACCUAACAGACUAGACAUUUUACCGAAAUCCGCAUUAACCAUUCUAACUCGUAUAGCCACC
6 AGAUCACUAACACCAUAUAACGCUAUCUUCCUCCUUCUCCGACAUUCCAGUACUCAUUCCACAAGCCACC
7 AGUACCCACUCCAGAUAAACUGACAACCAUACGCGAACAACGACGAAUCGUAUCACACGCAGAAGCCACC
8 AGCGAGAUAACUUACAAGGAGAGAGAAGACGAGGAGAGAUAAAUUAGAGAGAAAACGAGUAAGAGCCACC
9 AGUAAACUAACCACUCCAUCACGUAUAUAUUCCUCUUUCACACCUUUCCAUUCUCGAACUAACCGCCACC
序列識別號：1至9的核苷酸序列中的每一核苷酸可自天然存在的核苷酸進行修飾。舉例而言，序列中的至少一個U可經N1-甲基-假尿苷取代。在序列中，所有的U皆可經N1-甲基-假尿苷取代。 實例 2 ： 增加基因 的 良率 的 特定結構的 3 'UTR 非天然序列
在此實例中，選擇非天然3'UTR序列，所述非天然3'UTR序列形成相似於具有增加基因的良率的優異活性的天然3'UTR結構的結構，且相較於天然3'UTR結構具有增加基因的良率的活性。
作為天然3'UTR，使用已知具有增加基因的良率的優異活性的人補體組分3（complement component 3，C3）3'UTR（序列識別號：18）或人細胞色素P450 2E1 3'UTR（序列識別號：19）。具體而言，構建與人C3 3'UTR或人細胞色素P450 2E1 3'UTR具有相同長度的隨機序列組合，並選擇二級結構與人C3 3'UTR或細胞色素P450 2E1 3'UTR相似的序列。
關於所選擇的mRNA序列，實行移除能夠導致mRNA不穩定的潛在富AU元素（在下文中被稱為「ARE」）序列的過程，且然後，最終選擇8個非天然3'UTR序列（表3）。
天然C3 3'UTR序列（序列識別號：18-長度178個核苷酸）： 115CCACACCCCCAUUCCCCCACUCCAGAUAAAGCUUCAGUUAUAUCUCACGUGUCUGGAGUUCUUUGCCAAGAGGGAGAGGCUGAAAUCCCCAGCCGCCUCACCUGCAGCUCAGCUCCAUCCUACUUGAAACCUCACCUGUUCCCACCGCAUUUUCUCCUGGCGUUCGCCUGCUAGUGUG
天然C3 3'UTR序列的二級結構（由點-括號記法表示）： .(((((...........(((...(((((.(((....))).)))))...)))..(((((((..((((....((((((.(((((.......)))))..))).)))))))...))))))).......(((....)))............(((.........(((....))))))..)))))
將結構相似於天然C3序列的結構的非天然序列（序列識別號：10至14）設計成具有40%至50%的GC%及-0.1千卡/莫耳至-0.3千卡/莫耳的用於RNA折疊的平均自由能。
天然細胞色素P450 2E1 3'UTR序列（序列識別號：19-長度158個核苷酸）： GUGUGUGGAGGACACCCUGAACCCCCCGCUUUCAAACAAGUUUUCAAAUUGUUUGAGGUCAGGAUUUCUCAAACUGAUUCCUUUCUUUGCAUAUGAGUAUUUGAAAAUAAAUAUUUUCCCAGAAUAUAAAUAAAUCAUCACAUGAUUAUUUUAACUAU
天然細胞色素P450 2E1 3'UTR序列的二級結構 ((((((((((((...(((((.((........((((((((.........))))))))))))))).....(((...))).....))))))))))))..((((((((((((....))))))...)))))).....((((((...))))))...........
將結構相似於天然人細胞色素P450 2E1 3'UTR序列的結構的非天然序列（序列識別號：15至17）設計成具有30%至40%的GC%及-0.1千卡/莫耳至-0.3千卡/莫耳的用於RNA折疊的平均自由能。
[表2]
序列識別號 （SEQ ID NO）： 3'UTR序列
10 ACCACCAAGACAAAAACCACGAAUUUACGCCAAAAGUGGAGUAAGGAGGUGCGUCCCUUACGCAACACGACAGCCGGGAUCUAACAAUAGGGUUAAUGGACUGGUUGAGAUAAGGGGCAUUAAAACCAAACGGUCUACACAUAAAACGAAUGAAAACUUCCUAAAGGAUCGACGGUGG
11 CAUACCAUAAAACCAAACAUAUACCCGAGGUCCUUCGGCAUUGGGAGGAUGAUACGCAAGAAGCAUGAUUCCCCACCAGACCGAAUGCAGGUUUAAGUGAGGGGUGCAAACUUGUGUCACUAACCAUUAUUAUGAAGAAAAAAACAGCCAAAAAAAGAGCCACAAGGCGGCGCGGUAU
12 GCCGCUAAAUAAACGAACACGUACCUACGCUUUGACAGGAGUGGGCAAGUGGGAAGGUUACCGGAACUACGAGGACCACCAGGCAAGUAUUGGUUAGUCACUCUUCCAACUAAUCUUAAUAAAACGAGACAUCGAAAAAAAAAAAAGGCAAAAACAAGUCCAGAAGGAGCCAGGGUGG
13 AGAGUAAAAUUAAUAUACGGUAUAGAACUCACCAUUGUGCGUUCUACCUCGAGGUGUCAUGACGACAGUGUCCCAUAUCAACCCGAGAAGUUGGAAAUGCGGAGUCGAACGUGACGCCAAUAAGGCCAAAAGGUAAAUAAUGAAACGUACAACCGAAUGCCAAAAGGCUACGCUGCUC
14 GUACAUGCUACAAACCAUGCGGAACCUACAAGACACUUUAUGGGUAAAGCAACAAACCCACUUGUAAAGUUACCACACCGGUCCCAUCUGCCGGCCGUGAGUAUAUGAUCUGGGUUUAUAAUCUCGAAAUAUCGCGAAACAAUAUGCCCUUAGAAUAAGCACCCAUGCGGGCAAUGUA
15 UCUUUAUGAGAAUUACUCAUUCUGAUUUUUAACAUAGCAUUUUUUUUCUGUUGUGUAGAUGGGCCAAAGGACAUUCCAUAACUUUUCAUAAGGACAAACGAUUACCGACGGAUUGGUACUAGUUGUUAAUUAACAUCUGGGGGAUGUAAACAUUUUUU
16 UACGAACUGAAAUAAUCAAGUGAUAGUUAUCAAUUAAAAGCUUUAUAAUUUUAGUUUCCUUGGGCCACGGAAUUUCCACAAUUUUUAGUUCGUAAACCGGUCAUCCAAUCUAUUGGGUUGAGGCUGGAAUAUGCACCUUAUGGGUGUCUUUGUAUAAA
17 AACACAGAAAACUACCACUAUACUUCUAUUUAGAAAGCACUUAUUAAUUGCUUUUUGUUAGUGAAACAUGCAAGGCACCCAUGUUUUCUGUGUUAACCAAGCCAGUUGAUAUUAGCUGUAUGCUUGGAUUCUAUACAUAAAAUGUAUUUAAGCAGCUC
RNA折疊能（RNA folding energy）提供對二級結構及其穩定性的見解。舉例而言，最小自由能可用於預測3'UTR的二級結構及其穩定性，而此可能影響轉譯良率。 實例 3 ： 使用非天然 5'-UTR 序列 及 3'-UTR 序列製備模板載體
在本實例中，藉由以可操作的方式連結以下序列來製備載體：對包括在實例1及實例2中獲得的序列識別號：1至9或者序列識別號：26的C3 5'UTR的核苷酸序列的非天然5'UTR核苷酸序列進行編碼的序列中的一者；對包括序列識別號：10至17或序列識別號：18或19的C3 3'UTR或P450 2E1 3'UTR的核苷酸序列的3'UTR核苷酸序列進行編碼的序列中的一者；以及對多肽進行編碼的基因（野生型p53蛋白質，序列識別號：25）。
具體而言，載體是其中啟動子、對5'-UTR進行編碼的核苷酸序列、對多肽進行編碼的開讀框（ORF）、對3'-UTR進行編碼的核苷酸序列及聚(A)尾的載體。
載體亦可包括大腸桿菌複製起點ColE1 ori及選擇標記基因。啟動子可為T7啟動子。選擇標記可為康黴素抗性酶。 3-1. 製備用於轉錄天然 p53 及 p53 mRNA 的 模板載體
製備天然p53 mRNA及/或其蛋白質表達載體，包括對所設計的非天然5'UTR序列進行編碼的核苷酸中的一者、作為ORF的對天然p53蛋白質進行編碼的核苷酸序列、對非天然3'UTR進行編碼的核苷酸序列中的一者及聚(A)。將此載體導入至微生物細胞，並藉由培養微生物細胞以產生克隆載體。藉由利用所產生的載體作為模板的體外轉錄，產生mRNA。
具體而言，自pUC57-Amp R載體（艾德基因（Addgene））產生載體pUC57-Kan R，在載體pUC57-Kan R中抗生素抗性基因經康黴素抗性基因取代。利用限制酶HindIII及EcoRI對所產生的pUC57-Kan R載體進行處理及切割，並藉由使用連接酶將經切割的載體連接至合成產生的對天然p53蛋白質進行編碼的多核苷酸，以插入對天然p53蛋白質進行編碼的序列。由於插入的對天然p53蛋白質進行編碼的多核苷酸包括對5'UTR進行編碼的核苷酸序列及對天然p53蛋白質進行編碼的序列，且限制酶辨別序列位於天然p53核苷酸序列的3'-末端，因此對限制酶辨別序列進行切割以導入對所設計的3'UTR進行編碼的核苷酸序列。
[表3]
序列識別號（SEQ ID NO）： 用於轉錄天然p53 mRNA的模板載體的基因序列（DNA）
20 TAATACGACTCACTATA
21 AGTGCTCCCCATCCAACTAAACTGTCCCTCTGTCCGAACTAAACTGCACTGTCCCAGCACC
22 ATGGAAGAACCTCAGTCCGATCCGAGCGTCGAGCCTCCCCTGTCACAGGAAACTTTCAGTGACCTGTGGAAACTGCTGCCCGAGAATAATGTACTTTCGCCTCTGCCTAGCCAAGCAATGGATGATCTGATGCTGTCTCCAGATGACATCGAACAGTGGTTTACAGAGGATCCAGGGCCCGATGAGGCACCACGAATGCCAGAGGCGGCCCCACCTGTTGCACCCGCACCTGCGGCTCCAACACCCGCAGCCCCCGCCCCCGCTCCAAGCTGGCCTCTCAGTAGTTCCGTGCCATCACAGAAGACCTATCAAGGCAGCTACGGATTTCGCCTCGGATTTCTCCATTCAGGCACTGCCAAGTCCGTGACTTGTACGTACAGCCCCGCTCTGAACAAAATGTTCTGTCAGTTGGCGAAGACATGTCCTGTCCAGCTTTGGGTAGATTCTACCCCCCCGCCGGGGACACGGGTGCGAGCCATGGCCATTTATAAACAGTCTCAGCACATGACCGAGGTCGTGCGCAGGTGTCCTCACCATGAACGATGCTCCGACTCCGACGGCCTGGCCCCCCCACAGCACCTGATTCGCGTGGAAGGCAATCTTCGTGTGGAGTACCTCGATGATCGGAACACCTTCAGACATAGCGTGGTTGTGCCTTATGAGCCACCCGAAGTTGGAAGCGACTGTACCACCATCCATTACAACTATATGTGCAACAGTAGCTGCATGGGTGGCATGAATCGGCGGCCTATCTTGACAATAATCACTTTAGAGGACTCTTCCGGAAACCTGCTTGGCAGAAATTCATTCGAGGTCCGTGTCTGCGCCTGCCCGGGCAGGGACCGCAGAACCGAAGAGGAGAATTTACGGAAAAAGGGGGAACCCCACCACGAACTGCCACCGGGCAGTACCAAAAGGGCTCTCCCTAATAACACATCTTCATCGCCCCAGCCAAAGAAGAAACCCCTCGACGGAGAGTACTTTACTCTACAAATTAGGGGGAGAGAAAGATTTGAGATGTTCCGCGAATTGAACGAGGCCCTGGAGTTGAAAGACGCTCAAGCCGGAAAGGAACCAGGTGGGTCTAGGGCCCACTCAAGCCATCTGAAGAGTAAGAAAGGCCAGTCCACTTCCAGGCACAAAAAGTTAATGTTCAAGACGGAGGGTCCTGACTCTGAC
23 GTGTGTGGAGGACACCCTGAACCCCCCGCTTTCAAACAAGTTTTCAAATTGTTTGAGGTCAGGATTTCTCAAACTGATTCCTTTCTTTGCATATGAGTATTTGAAAATAAATATTTTCCCAGAATATAAATAAATCATCACATGATTATTTTAACTAT
24 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
表3顯示所製備的pUC57-Kan R載體中所包括的啟動子（序列識別號：20）、對5'UTR進行編碼的多核苷酸（序列識別號：21）、對天然p53蛋白質進行編碼的多核苷酸（序列識別號：22）、對3'UTR進行編碼的多核苷酸（序列識別號：23）、以及聚(A)序列（序列識別號：24）。在表3中，帶下劃線的序列識別號：20中的核苷酸表示參與mRNA轉錄起始的T7啟動子的一部分。此外，序列識別號：21的粗體核苷酸表示源自人C3天然5'UTR序列的5'UTR序列。此外，序列識別號：22是作為5'UTR下游的核苷酸序列的對天然p53蛋白質進行編碼的核苷酸序列。天然p53蛋白質具有序列識別號：25的胺基酸序列。此外，序列識別號：23是人細胞色素P450 2E1基因的天然3'UTR序列。 3-2. 非天然 5'UTR 序列與 對 天然 p53 蛋白質 進行編碼 的核苷酸序列的連接及克隆
為了利用對非天然5'UTR序列進行編碼的核苷酸序列取代所製備的模板載體的5'UTR序列，藉由聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應獲得含有對5'UTR進行編碼的核苷酸序列的DNA片段，所述PCR反應使用包括對非天然5'UTR序列進行編碼的核苷酸序列的引體與包括天然p53蛋白質的XhoI限制酶辨別序列的序列的引體的引體組，並使用模板載體作為模板。
利用限制酶HindIII及XhoI對含有藉由PCR反應固定的對5'-UTR進行編碼的核苷酸序列的DNA片段中的每一者及實例3-1中製備的模板載體進行處理及切割，並藉由使用連接酶來連接經切割的序列。因此，製備出對天然p53蛋白質進行編碼的載體，在所述天然p53蛋白質中，對5'UTR進行編碼的核苷酸序列經對序列識別號：1至9中的任一者的非天然5'UTR進行編碼的核苷酸序列取代。 3-3. 非天然 3'UTR 序列的克隆
在本實例中，對序列識別號：10至17的非天然3'UTR進行克隆，以提高表達水準並增加對mRNA進行編碼的基因的序列穩定性。3'UTR可包括分別位於上游5'-末端及下游3'-末端處的XhoI（CTCGAG）及NheI（GCTAGC）限制酶序列，用於核酸（例如，可轉錄的核酸序列或聚腺苷序列）的重組。可轉錄的核酸序列可為ORF。3'UTR序列可經由存在於可轉錄的核酸序列中的5'-末端處的XhoI限制酶連結至ORF的3'-末端。
藉由體外核酸合成方法來合成包括XhoI限制酶序列、非天然3'UTR序列及NheI限制酶序列的重組3'UTR序列。所獲得的重組3'UTR序列是DNA。利用限制酶XhoI及NheI對重組3'UTR序列中的每一者及模板載體進行處理及切割，並藉由使用連接酶連接兩個經切割的序列。為了用作模板載體，使用實例3-1及實例3-2中所使用的載體。
因此，製備出用於p53表達的載體，在所述載體中將T7啟動子-5'UTR編碼核苷酸序列-p53蛋白質編碼序列-3'UTR編碼核苷酸序列-聚(A)結構導入至pUC57-Kan R載體的骨架中。 實例 4 ：使用非天然 5'-UTR 序列 及 3'-UTR 序列產生基因產物
將實例3中所製備的具有T7啟動子-5'UTR編碼核苷酸序列-p53蛋白質編碼序列-3'UTR編碼核苷酸序列-聚(A)結構的載體導入至大腸桿菌中，並培養大腸桿菌以增殖包含質體DNA作為mRNA的模板的大腸桿菌。藉由高速離心自培養物分離增殖的大腸桿菌，並藉由使用本領域中已知的鹼提取法來固定細胞衍生的模板DNA。藉由使用位於聚(A)尾的末端的限制酶辨別序列將固定的模板DNA線性化。經由使用線性化的細胞衍生模板DNA的體外轉錄產生具有5'UTR-p53蛋白質編碼序列-3'UTR-聚(A)結構的核苷酸序列的mRNA。此處，5'UTR具有序列識別號：1至9中的任一者的序列或天然C3 5'UTR的序列，3'UTR具有序列識別號：10至17中的一者的序列或天然C3 3'UTR或天然CYP 2E1 3'UTR的序列，且對p53蛋白質進行編碼的序列具有序列識別號：22的序列。序列識別號：22的序列是對序列識別號：25的p53蛋白質進行編碼的核苷酸序列中的一者，且可使用可對p53蛋白質進行編碼的任何核苷酸序列。
具體而言，向含有10奈克/微升的線性化質體DNA、4毫莫耳每升的加帽試劑（capping reagent）、5毫莫耳每升的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、5毫莫耳每升的胞苷三磷酸（cytidine triphosphate，CTP）、5毫莫耳每升的鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）、5毫莫耳每升的N1-甲基假尿苷-5'-三磷酸、20毫莫耳每升的鎂離子鹽、10毫莫耳每升的二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、0.01微克/微升的無機焦磷酸酶（pyrophosphatase，PPase）及1微克/微升的RNA酶抑制劑的水溶液添加5微克/微升的T7 RNA聚合酶，並將如此獲得的反應混合物在37℃下孵育至少一小時，以進行體外轉錄。使用在2023年10月10日公佈的10-2023-0141482中闡述的實例8的帽類似物化合物m7G(3'OMs)pppA(2'OMe)pG，以用作加帽試劑。
加帽試劑是用於mRNA轉錄及共轉錄加帽的試劑，並形成m7G(3'OMs)pppA(2'OMe)pG的5'-帽結構。此處，m7G表示7-甲基鳥苷，A表示腺苷，G表示鳥苷，p是-P(=O)(OH)O-，Ms表示甲磺醯基，且Me表示甲基。利用脫氧核糖核酸水解酶（deoxyribonuclease，DNase）對反應產物進行處理，並藉由使用蒙那奇RNA純化試劑盒（Monarch® RNA Cleanup Kit）（新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs））對RNA進行純化。
因此，製備出用於p53表達的載體，在所述載體中將T7啟動子-5'UTR編碼核苷酸序列-p53蛋白質編碼序列-3'UTR編碼核苷酸序列-聚(A)結構導入至pUC57-Kan R載體的骨架中。 實例 5 ： 確認對具有 p53 突變的癌細胞中細胞存活的影響
證實實例4中所製備的p53 mRNA對具有p53突變的癌細胞的影響。本文中所使用的p53 mRNA具有5'UTR（序列識別號：6）-p53蛋白質編碼序列（序列識別號：25）-3'UTR（序列識別號：11）-聚(A)（序列識別號：24）結構（序列識別號：27）。ES-2（ATCC，#CRL-1978）、米亞-帕卡-2（Mia-PaCa-2）（ATCC，#CRL-1420）、H1299（韓國細胞系庫（Korean cell line bank），#KCLB25803）及SNU-1066（韓國細胞系，#KCLB01066），以用作具有p53突變的癌細胞。ES-2是p53 S241F突變卵巢癌細胞系並顯示自患有透明細胞癌的黑人女性的卵巢分離的成纖維細胞樣形態。米亞-帕卡-2是p53 R248W突變胰腺癌細胞系，且為源自白人男性胰腺的腫瘤組織的上皮細胞系。H1299（NCI-H1299）為具有p53缺失突變的肺癌細胞系。所述H1299是一種自白人男性肺癌患者分離的上皮樣細胞，且可能屬於非小細胞肺癌的大細胞癌亞型。SNU-1066是作為突變型頭頸癌細胞系的p53 514_559del46，且是一種喉鱗狀細胞癌細胞系。
具體而言，藉由使用利珀菲克它敏（Lipofectamine™）傳訊麥克斯（MessengerMAX™）轉染試劑（賽默科技（Thermo Scientific™），目錄號LMRNA001），將p53 mRNA遞送至每一癌細胞系，並確認對細胞存活的影響。在96孔板中，分別以3×10 3細胞/200微升每孔、6×10 3細胞/200微升每孔、5×10 3細胞/200微升每孔及10×10 3細胞/200微升每孔來接種ES-2細胞、米亞-帕卡-2細胞、H1299細胞及SNU-1066。在接種之後24小時，將mRNA及0.2微升的利珀菲克它敏傳訊麥克斯轉染試劑添加至每一孔。然後，在8個濃度（自4微克/毫升開始並下降1/4）下對p53 mRNA進行測試。
藉由使用WST-8細胞活力測定試劑盒（貝曼姿（BIOMAX），目錄號QM5000）試劑來量測細胞活力。為了確定細胞生長，將藥物處理的日期設定為第0天，且在前一天單獨地接種的細胞中，將WST-8試劑與培養基以1:10的比例混合，且反應2小時，且然後量測450奈米波長下的吸光度。將經藥物處理的平板在37℃下培養3天。在培養完成之後，將WST-8試劑與細胞培養基以1:10的比例混合，並反應2小時。量測450奈米波長下的吸光度，並藉由使用格帕德稜鏡（Graphpad Prism TM）軟體來計算半最大生長抑制濃度（GI 50）值。相較於其中p53 mRNA未被處理的陰性對照組，藉由對第0天的值及空白OD值進行校正而得出相對細胞生長率。
作為確認每一細胞中p53 mRNA的生長抑制能力的結果，確認p53 mRNA抑制具有p53基因缺陷的卵巢癌、胰腺癌、肺癌及頭頸癌細胞系的生長（圖1）。 實例 6 ： 在卵巢癌異種移植模型中評估 p53 mRNA 抗癌候選劑的抗癌功效
為了評估根據本揭露的p53 mRNA的抗癌功效，將p53 mRNA施用至異種移植ES-2細胞的卵巢癌小鼠模型，並觀察腫瘤大小的改變。針對施用組，每週三次（7.5微克/頭、15微克/頭及30微克/頭）施用p53 mRNA抗癌治療劑持續4週。
具體而言，將ES-2細胞（ATCC）皮下注射至5週齡的BALB/c裸鼠的背側中。幾天後用肉眼觀察腫瘤，然後監測腫瘤的大小。在施用開始時，將6隻腫瘤大小相似的小鼠分配至每一組。此處，施用組以靜脈注射的方式施用。在實驗週期期間，每週對小鼠的體重及腫瘤大小進行量測達2次至3次。藉由利用數位卡尺量測最長長度及最長寬度，根據以下方程式來量測腫瘤大小。 腫瘤大小（立方公分）：寬度（毫米） × 寬度（毫米） × 長度（毫米） / T2
觀察每一組的腫瘤大小直至施用開始之日起的第21天，並以相同的方式計算在每一後續實驗中量測的腫瘤大小。
當向卵巢癌異種移植模型小鼠進行施用時，p53 mRNA抗癌治療劑不僅在ES-2異種移植模型中顯示出相較於對照組（以空LNP作為媒介施用）而言顯著的腫瘤生長抑制功效（圖2A），且在連續施用mRNA 3週後小鼠的體重亦沒有減少，在副作用方面似乎是安全的（圖2B）。在施用後第21天，計算出7.5微克、15微克及30微克施用組中的腫瘤抑制能力分別為54.8%、62.8%及78.9%，證實抗癌功效是劑量依賴性的。 實例 7 ：在 胰腺癌異種移植模型上評估 p53 mRNA 抗癌候選劑的抗癌功效
為了評估根據本揭露的p53 mRNA的抗癌功效，將p53 mRNA施用至其中米亞-帕卡-2細胞被異種移植的胰腺癌小鼠模型，並觀察腫瘤大小的改變。針對施用組，每週三次（總共6次，30微克/頭）施用p53 mRNA抗癌治療劑，持續4週。
具體而言，將米亞-帕卡-2細胞（ATCC）皮下注射至5週齡的BALB/c裸鼠的背側中。幾天後用肉眼觀察腫瘤，然後監測腫瘤的大小。在施用開始時，將7隻腫瘤大小相似的小鼠分配至每一組。此處，對施用組進行腫瘤內施用（瘤內注射（intratumoral，i.t），6微克/頭）或靜脈內施用（靜脈注射（intravenous，i.v），30微克/頭）。在實驗週期期間，每週對小鼠的體重及腫瘤大小進行量測達2次至3次，並監測每一組的腫瘤大小，直至自施用開始之日起的第29天。
當向胰腺癌異種移植模型小鼠進行施用時，p53 mRNA抗癌治療劑不僅在米亞-帕卡-2異種移植模型中顯示出相較於對照組（以空LNP作為媒介施用）顯著的腫瘤生長抑制功效（圖3A），且在連續施用mRNA 4週後小鼠的體重亦沒有減少，在副作用方面似乎是安全的（圖3B）。在施用後的第21天，計算出瘤內注射施用組及靜脈注射施用組中的腫瘤抑制能力分別為63.0%及50.2%，證實無論施用途徑如何均表現出抗癌功效。 實例 8 ：在 肺癌異種移植模型中評 估 p53 mRNA 抗癌候選劑的抗癌功效
為了評估根據本揭露的p53 mRNA的抗癌功效，將p53 mRNA施用至其中異種移植了H1299細胞的肺癌小鼠模型，並觀察腫瘤大小的改變。針對施用組，每週三次（總共6次，45微克/頭）施用p53 mRNA抗癌治療劑，持續3週。
具體而言，將H1299細胞（ATCC）皮下注射至5週齡的BALB/c裸鼠的背側中。幾天後用肉眼觀察腫瘤，然後監測腫瘤的大小。在施用開始時，將6隻腫瘤大小相似的小鼠分配至每一組。此處，對施用組進行腫瘤內施用（i.t，6微克/頭）或靜脈內施用（i.v，45微克/頭）。在實驗週期期間，每週對小鼠的體重及腫瘤大小進行量測達2次至3次，並監測每一組中的腫瘤大小，直至自施用開始之日起的第15天。
當向肺癌異種移植模型小鼠進行施用時，p53 mRNA抗癌治療劑不僅在H1299異種移植模型中顯示出相較於對照組（以空LNP作為媒介施用）顯著的腫瘤生長抑制功效（圖4A），且在連續施用mRNA 2週後小鼠的體重亦沒有減少，在副作用方面似乎是安全的（圖4B）。在施用後第13天，計算出瘤內注射施用組及靜脈注射施用組的腫瘤抑制能力分別為74.8%及32.8%，證實瘤內注射施用組顯示出高的腫瘤生長抑制效果。
無
圖1是顯示確認在每一癌細胞中產生的p53 mRNA對生長及發育的抑制能力的結果的圖。 圖2是顯示當向卵巢癌異種移植小鼠模型施用p53 mRNA抗癌候選物質時，腫瘤大小及體重的改變的圖。 圖3是顯示當向胰腺癌異種移植小鼠模型施用p53 mRNA抗癌候選物質時，腫瘤大小及體重的改變的圖。 圖4是顯示當向肺癌異種移植小鼠模型施用p53 mRNA抗癌候選物質時，腫瘤大小及體重的改變的圖。
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Claims (12)

  1. 一種傳訊核糖核酸，包括非天然5'非轉譯區（5'UTR）、對多肽進行編碼的序列以及非天然3'非轉譯區（3'UTR）， 其中所述5'非轉譯區不形成二級結構， 對多肽進行編碼的所述序列是對p53或p53的功能片段進行編碼的序列，且 所述3'非轉譯區具有：由以下點-括號記法表示的二級結構： .(((((...........(((...(((((.(((....))).)))))...)))..(((((((..((((....((((((.(((((.......)))))..))).)))))))...))))))).......(((....)))............(((.........(((....))))))..))))；或者 由以下點-括號記法表示的二級結構： ((((((((((((...(((((.((........((((((((.........))))))))))))))).....(((...))).....))))))))))))..((((((((((((....))))))...)))))).....((((((...))))))........... 其中，在所述點-括號記法中，點表示序列中的不成對鹼基，且「（」及「）」表示序列中的成對鹼基。
  2. 如請求項1所述的傳訊核糖核酸，其中包括所述非天然5'非轉譯區的所述傳訊核糖核酸具有式1的序列： 式1：AGN aGCCACC 其中N為A、U、G或C，每一N彼此等同或不同，且a表示N的重複數且為42或62。
  3. 如請求項1所述的傳訊核糖核酸，其中包括所述3'非轉譯區的所述傳訊核糖核酸具有-0.1千卡/莫耳至-0.3千卡/莫耳的用於核糖核酸折疊的平均自由能， （a）由.(((((...........(((...(((((.(((....))).)))))...)))..(((((((..((((....((((((.(((((.......)))))..))).)))))))...))))))).......(((....)))............(((.........(((....))))))..)))))表示的包括所述3'非轉譯區的所述傳訊核糖核酸的所述二級結構具有為178個核苷酸的長度及為40%至50%的GC含量（GC%），且 （b）由((((((((((((...(((((.((........((((((((.........))))))))))))))).....(((...))).....))))))))))))..((((((((((((....))))))...)))))).....((((((...))))))...........表示的包括所述3'非轉譯區的所述傳訊核糖核酸的所述二級結構具有為158個核苷酸的長度及為30%至50%的GC%。
  4. 如請求項1所述的傳訊核糖核酸，其中所述5'非轉譯區包括序列識別號：1至9中的任一者的核苷酸序列，且 所述3'非轉譯區包括序列識別號：10至17中的任一者的核苷酸序列。
  5. 如請求項4所述的傳訊核糖核酸，其中所述傳訊核糖核酸更包括科紮克序列或聚腺苷酸序列。
  6. 如請求項1所述的傳訊核糖核酸，其中所述傳訊核糖核酸具有一或多個經修飾的核苷酸。
  7. 如請求項1所述的傳訊核糖核酸，其中所述傳訊核糖核酸包括選自帽0、帽1及帽2的5'-帽。
  8. 一種脫氧核糖核酸，對如請求項1至7中任一項所述的傳訊核糖核酸進行編碼。
  9. 一種組成物，包含如請求項1至7中任一項所述的傳訊核糖核酸或對所述傳訊核糖核酸進行編碼的脫氧核糖核酸作為有效成分。
  10. 如請求項9所述的組成物，其中所述組成物是用於預防或治療癌症的醫藥組成物。
  11. 如請求項10所述的組成物，其中所述癌症由p53突變引起。
  12. 一種預防或治療受試者的癌症的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的如請求項1至7中任一項所述的傳訊核糖核酸。
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