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TW202539738A - 適體及聚乙基噁唑啉之共軛物 - Google Patents

適體及聚乙基噁唑啉之共軛物

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TW202539738A
TW202539738A TW114103572A TW114103572A TW202539738A TW 202539738 A TW202539738 A TW 202539738A TW 114103572 A TW114103572 A TW 114103572A TW 114103572 A TW114103572 A TW 114103572A TW 202539738 A TW202539738 A TW 202539738A
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TW
Taiwan
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aforementioned
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polyethyloxazoline
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Application number
TW114103572A
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English (en)
Inventor
山下皓平
安達健朗
Original Assignee
日商力博美科股份有限公司
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Publication date
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Abstract

本發明提供提高適體的血中安定性之方法及藉由此方法經提高安定性之適體之共軛物。藉由提供適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽，可解決上述課題。

Description

適體及聚乙基噁唑啉之共軛物
本發明係有關適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽及含有此等之組成物。本發明亦有關具有經延長之血中半衰期之適體的製造方法及適體之安定化方法。
近年來，RNA適體於治療藥、診斷藥、試藥之應用廣受注目。有數種RNA適體己進入臨床階段或是實用化階段。於2004年12月，美國已核准世界第一個RNA適體醫藥之Macugen作為老年性黃斑部病變症之治療藥。RNA適體為特異性結合於蛋白質等標的物質之RNA，可使用SELEX法(指數富集的配體系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment))製作(參照專利文獻1至3)。SELEX法為從具有約1014個不同核苷酸序列之RNA池選擇特異性結合於標的物質之RNA之方法。使用之RNA為將約40殘基之隨機序列以引子序列挾持之構造。將此RNA池與標的物質會合，使用過濾器等只將結合於標的物質之RNA回收。將回收之RNA以RT-PCR擴增，將此作為下一回合之模板使用。有藉由將此作業重複操作約10次，可取得特異性結合於標的物質之適體的情況。
如此，RNA適體有希望作為治療藥、診斷藥、試藥，由於分子量小，具有可容易從體內排出之特性。因此，尤其是作為治療藥使用時必需將RNA適體之血中半衰期延長。
至今，作為用於延長使用之醫藥物質血中半衰期之技術已報告使用聚乙二醇(以下，稱為「PEG」)之技術。例如，於非專利文獻1記載將PEG結合於RNA適體，顯著改善RNA適體之體內動態特性(延長血中半衰期)。[先前技術文獻][專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第91/19813號[專利文獻2]國際公開第94/08050號[專利文獻3]國際公開第95/07364號[非專利文獻]
[非專利文獻1]宮川伸、藤原將壽、西山道久，使用RNA適體之分子標的醫藥之開發、Drug Delivery System、2008、23卷、5號、p.534-543
[發明欲解決之課題]如上所述，PEG雖為於體内之血中半衰期的延長顯示優越效果之物質，惟有產生過敏之情況，此點仍有改善的空間。
此處，本發明以提供不使用PEG之提高適體之血中安定性之方法及藉由此方法之血中安定性經提高之適體之共軛物為目的。[解決課題之手段]
本發明人等為了解決上述課題進行深入研究之結果發現藉由將聚乙基噁唑啉(亦稱為「PEOZ」)結合於適體，血中半衰期延長。本發明人等又於上述態樣藉由使用直鏈狀之聚乙基噁唑啉結合於分岐型之連結基之分岐型聚乙基噁唑啉(以下，亦只稱為「分岐型聚乙基噁唑啉」)，發現血中半衰期更延長，顯示與加成PEG時同等或同等以上優越之血中半衰期，因而完成本發明。
亦即，本發明之一態樣係有關下列。[1]一種適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽。[2]如[1]所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉形成分岐鏈。[3]如[1]或[2]所述之共軛物或其鹽，其中，於前述適體之5’末端結合前述聚乙基噁唑啉。[4]如[1]至[3]中任一項所述之共軛物或其鹽，其中，2種前述聚乙基噁唑啉係經由連結基形成分岐鏈。[5]如[2]至[4]中任一項所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉之分岐鏈各個之分子量為20至60kDa。[6]如[4]所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉與前述連結基以偶極環加成反應結合。[7]如[6]所述之共軛物或其鹽，其中，前述偶極環加成反應為前述聚乙基噁唑啉側之疊氮化物與前述連結基側之二苯并環辛炔之偶極環加成反應。[8]如[1]所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉係經由連結基結合於前述適體之5’末端。[9]如[8]所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉-連結基部分之構造為下列者：
[式1]
(此處，l表示聚合度。l為200至600)。[10]如[4]所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉-連結基部分之構造為下列者：
[式2]
(此處，m及n各個表示聚合度。m為200至600，n為200至600)。[11]如[1]至[10]中任一項所述之共軛物或其鹽，其中，前述適體為抗FGF2適體或抗自分泌運動因子(autotaxin)適體。[12]如[1]至[9]中任一項所述之共軛物或其鹽，其中，前述適體為由下式(1)表示之鹼基序列構成之適體：tC(M)U(M)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(M)cC(M)U(M)cG(M)G(M)A(M)_idT　(1)(大寫表示RNA，小寫表示DNA，於核苷酸之括弧表示核糖2’位之修飾，F表示氟原子，M表示O-甲基。又，於序列末端之idT表示經由反向-dT修飾，序列中之s表示將核苷酸之間連結之磷酸基經硫代磷酸酯化)。[13]一種組成物，為含有[1]至[12]中任一項所述之共軛物或其鹽。[14]一種具有經延長之血中半衰期的適體之製造方法，包含將聚乙基噁唑啉結合於適體之步驟。[15]如[14]所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉形成分岐鏈。[16]如[14]或[15]所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉結合於前述適體之5’末端。[17]如[14]至[16]中任一項所述之製造方法，其中，經由連結基將分岐之前述聚乙基噁唑啉結合於前述適體。[18]如[15]至[17]中任一項所述之製造方法，其中，分岐鏈各個分子量為20至60kDa之前述聚乙基噁唑啉結合於前述適體。[19]如[17]或[18]所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉及連結基以偶極環加成反應進行結合。[20]如[19]所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉及連結基以前述聚乙基噁唑啉側之疊氮化物及前述連結基側之二苯并環辛炔之偶極環加成反應進行結合。[21]如[14]至[20]中任一項所述之製造方法，其中，經由連結基將分岐之前述聚乙基噁唑啉以前述連結基側之馬來醯亞胺基及前述適體側之硫醇基之邁克爾加成反應(Michael addition reaction)結合於前述適體。[22]如[14]至[21]中任一項所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉經由連結基結合於前述適體之5’末端。[23]如[22]所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉-連結基部分之構造為下列者：
[式3]
(此處，l表示聚合度。l為200至600)。[24]如[17]所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉-連結基部分之構造為下列之構造式者：
[式4]
(此處，m及n各個表示聚合度。m為200至600，n為200至600)。[25]一種適體之安定化方法，以聚乙基噁唑啉結合於適體為特徴。[發明之效果]
根據本發明可提供不使用PEG之之血中安定性經提高之適體之共軛物。因此，本發明可於回避經由PEG之過敏問題，同時有用於使用此適體之種種治療。
以下，對於本發明實施形態之一例加以詳細説明，惟本發明不限定於此等。
(1.定義)於本說明書，「適體」係指對於特定標的分子具有結合活性之核酸分子。適體對於特定標的分子藉由結合，可阻礙此標的分子之活性。
於本說明書，「聚乙基噁唑啉」係指於此技術領域野為通常使用者，以聚(2-乙基-2-噁唑啉)表述。
於本說明書，「共軛物」係指由2種以上之物質構成之複合體。於本發明，共軛物為至少由適體及聚乙基噁唑啉構成。
於本說明書，「共軛物之鹽」係指以經中和之鹽形態存在之共軛物(複合體)。於本發明，共軛物之鹽為至少由適體及聚乙基噁唑啉構成之共軛物之鹽。於本發明之一實施形態，共軛物之鹽亦可為藥學上容許之共軛物之鹽。於本說明書，「藥學上容許」係指於醫學上無過度之毒性、刺激、過敏等，適合用於與人類或其他哺乳動物之組織接觸使用之鹽。藥學上容許之鹽可列舉例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；乙酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽等有機酸鹽；鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽等鹼土族金屬鹽；鋁鹽；鋅鹽；銨鹽、四甲銨鹽；嗎啉、哌啶、賴胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸等加成鹽等。
於本說明書，「連結基」係指連結2種以上之物質之連結部分。於本發明，連結基係連結適體及聚乙基噁唑啉。
於本說明書，「抗FGF2適體」係指對於FGF2具有結合活性，可阻礙FGF2與FGF受體結合之適體。亦即，抗FGF2適體具有對於FGF2之阻礙活性。
FGF2為於發生初期或分化、增殖、再生時強力表現之蛋白質，例如為具有以Accession code EAX05222或NP001997表示之胺基酸序列之蛋白質。FGF2亦稱為bFGF(basic FGF)、FGFB或HBGF-2。
對於FGF2之阻礙活性係指對於FGF2保有之任意活性之阻礙能力。例如FGF2於FGF受體表現細胞作用，活化信號傳達，誘導各種細胞增殖因子或其受體之産生。因此，對於FGF2之阻礙活性可為阻礙經由FGF受體之細胞内信號傳達之活性。又，此等各種細胞增殖因子或其受體之表現，由於其結果誘導細胞增殖活性或遊走活性亢進，FGF2之阻礙活性係指阻礙此等之活性。
於本說明書，「抗自分泌運動因子適體」係指對於自分泌運動因子具有結合活性，可阻礙自分泌運動因子之酵素活性之適體。亦即，抗自分泌運動因子適體對於自分泌運動因子具有阻礙活性。
自分泌運動因子為存在於血液中之糖蛋白質，為將溶血磷脂醯膽鹼(LPC)分解為溶血磷脂酸(LPA)及膽鹼之酵素。
對於自分泌運動因子之阻礙活性係指對於自分泌運動因子保有之任意活性之阻礙能力。自分泌運動因子具有藉由水解將磷酸二酯鍵切斷之磷酸二酯酶活性，也就是說阻礙該活性。作為對於酵素活性之基質所容許者不限定於存在於生體内之含有磷酸二酯鍵之物質(例如ATP等)，包含於含有此等之化合物經加成發色物質或螢光物質之基質。發色物質或螢光物質於該業者為公知。又，自分泌運動因子具有溶血磷脂酶D活性。此活性係切斷溶血磷脂之磷酸二酯之甘油骨架相對側之鍵，主要產生溶血磷脂酸(LPA)，抑制此之產生亦包含於阻礙自分泌運動因子活性。
於本說明書，「血中半衰期」為於該技術領域通常使用之意思，係指生體内之物質或藥成分之血中濃度減至一半為止之時間。血中半衰期可藉由例如實施例中所示之血中滯留性進行評估。於本發明，藉由將適體與聚乙基噁唑啉結合，延長血中半衰期。血中半衰期之延長亦可釋義為血中滯留性增大、血中安定性增大等。
(2.適體及聚乙基噁唑啉之共軛物)於本發明之一實施形態提供適體及聚乙基噁唑啉之共軛物(以下，亦稱為「本共軛物」)或其鹽。本共軛物藉由與聚乙基噁唑啉結合，發揮血中半衰期延長之效果。又，由於未使用PEG，可迴避經由PEG引起之過敏問題。
於本共軛物，聚乙基噁唑啉亦可結合於適體之5’末端或3’末端之任一者。
於本共軛物，聚乙基噁唑啉可直接結合於適體，亦可經由連結基結合於適體。較佳為經由連結基結合。
連結基無特別限定，可列舉例如烷基鏈、不飽和脂肪酸鏈、膽固醇、聚乙二醇、聚丙二醇、多糖、多肽、類多肽等。
聚乙基噁唑啉可為直鏈或分岐鏈之形態。於本發明之一實施形態，本共軛物為直鏈聚乙基噁唑啉經由經分岐之連結基結合於適體之共軛物(亦稱為「分岐型聚乙基噁唑啉加成適體」)。又，於本發明之其他一實施形態，本共軛物為直鏈型聚乙基噁唑啉經由未分岐之連結基結合於適體之共軛物(亦稱為「直鏈型聚乙基噁唑啉加成適體」)。由於藉由於適體之加成，更延長血中半衰期，因此，實施之形態較佳為分岐型。
聚乙基噁唑啉之分子量較佳為20至60kDa。於分岐型聚乙基噁唑啉加成適體時，前述聚乙基噁唑啉分岐鏈之各個分子量較佳為20至60kDa。
於聚乙基噁唑啉經由連結基結合於適體時，聚乙基噁唑啉與連結基之結合樣式無特別限定，可列舉例如藉由偶極環加成反應(亦稱為「偶極環化反應」)、酯交換反應、邁克爾加成反應、SN2反應、脫水縮合反應等結合。
於以偶極環加成反應結合時，較佳為藉由將聚乙基噁唑啉側之疊氮化物與連結基側之二苯并環辛炔之偶極環加成反應進行結合。
於聚乙基噁唑啉經由連結基結合於適體時，聚乙基噁唑啉-連結基部分之構造較佳為下列之構造。
[式5]
於上述構造，m及n各個表示聚合度。m及n較佳為200至600，更佳為220至550，再較佳為250至500。
適體較佳為抗FGF2適體或抗自分泌運動因子適體。抗FGF2適體無特別限定，可列舉例如國際公開第2015/147017號、國際公開第2011/099576號等所記載之適體。又，抗自分泌運動因子適體無特別限定，可列舉例如國際公開第2015/163458號、國際公開第2015/147290號等所記載之適體。抗自分泌運動因子適體較佳為由以下列表示之序列編號1表示之鹼基序列構成之適體之改變體(亦即，由式(1)表示之鹼基序列構成之適體)。序列編號1：5’-tCUGAGGgAAACAggUUUUGCUcCUcGGA-3’(大寫表示RNA，小寫表示DNA)。又，於序列表之序列編號1為了方便，選擇「RNA」作為「分子型」。式(1)：tC(M)U(M)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(M)cC(M)U(M)cG(M)G(M)A(M)_idT(大寫表示RNA，小寫表示DNA，於核苷酸之括弧表示核糖2’位之修飾，F表示氟原子，M表示O-甲基。又，於序列末端之idT表示藉由反向-dT修飾，序列中之s表示連結核苷酸之間之磷酸基經硫代磷酸酯化。又，C及c表示胞嘧啶，U表示尿嘧啶，G及g表示鳥嘌呤，A表示丙胺酸，t表示胸腺嘧啶)。
適體可為RNA適體，亦可為DNA適體。尤其是製造成本高之RNA適體，由於根據本發明賦予血中安定性，成為更有用。
(3.組成物)於本發明之一實施形態提供含有本共軛物或其鹽之組成物(以下，亦稱為「本組成物」)。
本組成物可對應所包含之適體之種類於例如各種醫藥用途使用。以下，以本組成物用途之一例，說明醫藥用途使用之情況。
本組成物所包含之適體為抗FGF2適體時，本組成物可作為例如伴隨血管新生之疾病、骨/軟骨疾病或疼痛之治療或預防用醫藥使用。更佳本組成物可作為老年性黃斑部病變症等伴隨血管新生之疾病、骨質疏鬆症、風濕性關節炎、變形性關節症、骨折等骨/軟骨疾病、疼痛之治療用或預防用醫藥使用。
本組成物所包含之適體為抗自分泌運動因子適體時，本組成物可作為參予例如臓器或組織纖維化之疾病，尤其是可作為伴隨種種組織纖維症之疾病之治療或預防用醫藥使用。更佳，本組成物可作為肺纖維症、前列腺肥大、心肌纖維化、心肌纖維症、肌骨格纖維症、骨髓纖維症、子宮肌瘤、硬皮症、外科手術後之沾黏、手術後之疤痕、熱傷性疤痕、肥厚性疤痕、瘢瘤、異位性皮膚炎、腹膜硬化症、氣喘、肝硬化、慢性胰臟炎、硬性胃癌、肝纖維症、腎纖維症、纖維性血管病、經由為糖尿病合併症之纖維性微小血管炎之視網膜症、神經症、腎症、腎絲球腎炎、尿小管間質性腎炎、遺傳性腎疾病、動脈硬化末梢動脈炎、增殖性玻璃體視網膜症之治療用或預防用醫藥使用。
本組成物亦可含有本共軛物或其鹽以外之成分。此等成分可列舉例如藥學上容許之載體。藥學上容許之載體無特別限定，可列舉例如蔗糖、澱粉、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纖維素、滑石粉、磷酸鈣、碳酸鈣等賦形劑，纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚丙基吡咯啶酮、明膠、阿拉伯樹膠、聚乙二醇、蔗糖、澱粉等黏合劑，澱粉、羧甲基纖維素、羥丙基澱粉、鈉-乙二醇-澱粉、碳酸氫鈉、磷酸鈣、檸檬酸鈣等崩解劑，硬脂酸鎂、Aerosil(氣相二氧化矽)、滑石、月桂基硫酸鈉等潤滑劑，檸檬酸、薄荷醇、甘胺醯甘胺酸/銨鹽、甘胺酸、橘子粉等芳香劑，苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、對羥基苯甲酯、對羥基苯丙酯等保存劑，檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸等安定劑，甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、硬脂酸鋁等懸濁劑，界面活性劑等分散劑，水、生理食鹽水、柳橙汁等稀釋劑，可可脂、聚乙二醇、白煤油等底蠟等。
本組成物之投予路徑無特別限定，可列舉例如經口投予、非經口投予等。適用於經口投予之製劑為將有效量之配位體溶解於如水、生理食鹽水、柳橙汁之稀釋液之液劑、將有效量之配位體作為固體或顆粒含有之膠囊劑、小袋劑或錠劑、將有效量之有效成分懸濁於適當之分散介質中之懸濁液劑、經溶解有效量之有效成分之溶液分散於適當之分散介質中予以乳化之乳劑等。
作為非經口投予(例如靜脈内投予、皮下投予、肌肉内投予、局部投予、腹腔内投予、經鼻投予、經肺投予等)之較佳製劑為水性及非水性之等張無菌之注射液劑，此等中亦可含有抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑、等張化劑等。
本組成物之投予量根據有效成分之種類/活性、病情之嚴重度、投予對象之動物種類、投予對象之藥物耐受性、體重、年齡等而異，通常，成人每1日之有效成分量為約0.0001至約100mg/kg，例如約0.0001至約10mg/kg，較佳為約0.005至約1mg/kg。
(4.具有血中半衰期經延長之適體之製造方法)於本發明之一實施形態提供包含將聚乙基噁唑啉結合於適體之步驟之具有血中半衰期經延長之適體之製造方法(以下，亦稱為「本製造方法」)。於本製造方法，藉由將聚乙基噁唑啉結合於適體，形成適體及聚乙基噁唑啉之共軛物，可製造具有血中半衰期經延長之適體。
為分岐型聚乙基噁唑啉加成適體時，藉由例如於適體5’末端以邁克爾加成反應加成連結基，接著，以偶極環加成反應加成分岐型聚乙基噁唑啉製造之。更具體而言，例如可以實施例記載之方法製造。
為直鏈型聚乙基噁唑啉加成適體時，可藉由例如使用NHS酯與一級胺之交聯反應將連結基結合於適體之5’末端，接著，以偶極環加成反應加成直鏈型聚乙基噁唑啉製造之。更具體而言，例如可以實施例記載之方法製造。
(5.適體之安定化方法)於本發明之一實施形態提供以聚乙基噁唑啉結合於適體為特徴之適體之安定化方法(以下，亦稱為「本安定化方法」)。本安定化方法藉由將聚乙基噁唑啉結合於適體，形成適體及聚乙基噁唑啉之共軛物，可延長血中半衰期。製作共軛物之方法可使用例如上述(4.具有血中半衰期經延長之適體之製造方法)中記載之方法。
(6.其他)於本發明之一實施形態提供使用適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽之以下之發明。(1)含有適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽作為有效成分之任意疾病之治療或預防用醫藥。(2)包含於對象投予治療上有效量之適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽之任意疾病之治療或預防方法。(3)於製造用於治療或預防任意疾病之醫藥之適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽的用途。(4)於用於預防或治療任意疾病使用適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽。
於本實施形態之(1)至(4)，為治療或預防之對象之疾病可根據所使用之適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽之種類適當設定。亦即，於成為治療或預防對象之疾病，藉由所使用之適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽可治療或預防之疾病即可，無特別限定。
於本發明之其他一實施形態提供以下之發明。(1)含有抗FGF2適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽作為有效成分之伴隨血管新生之疾病、骨/軟骨疾病或疼痛之治療或預防用醫藥。(2)包含於對象投予治療上有效量之抗FGF2適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽之伴隨血管新生之疾病、骨/軟骨疾病或疼痛之治療或預防方法。(3)於製造用於治療或預防伴隨血管新生之疾病、骨/軟骨疾病或疼痛之醫藥，抗FGF2適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽的用途。(4)於治療或預防伴隨血管新生之疾病、骨/軟骨疾病或疼痛之使用抗FGF2適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽。又，於本實施形態中伴隨血管新生之疾病、骨/軟骨疾病或疼痛可為例如上述(3.組成物)中所記載者。
於本發明之其他一實施形態提供以下之發明。(1)含有抗自分泌運動因子適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽作為有效成分，於參與臓器或組織纖維化之疾病，尤其是伴隨於種種組織之纖維症之疾病之治療或預防用醫藥。(2)包含於對象投予治療上有效量之抗自分泌運動因子適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽，於參與臓器或組織纖維化之疾病，尤其是伴隨於種種組織之纖維症之疾病之治療或預防方法。(3)於製造用於治療或預防參與臓器或組織纖維化之疾病，尤其是伴隨於種種組織之纖維症之疾病之醫藥，抗自分泌運動因子適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽的用途。(4)於為了治療或預防於參與臓器或組織纖維化之疾病，尤其是伴隨於種種組織之纖維症之疾病使用之抗自分泌運動因子適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽。又，於本實施形態中參與臓器或組織纖維化之疾病可為例如上述(3.組成物)中記載者。[實施例]
以下，藉由使用實施例將本發明加以詳細説明，惟本發明之範圍不限定於此等。又，通過本專利申請說明書全體引用之文獻經由參照，將其全體編入本專利申請說明書中。
(1.分岐型PEOZ、直鏈型PEOZ及PEG加成適體之合成)分岐型PEOZ加成適體係於到達適體5’末端之硫醇 C6連結基以邁克爾加成反應加成Mal-bis-PEG3-DBCO連結基(CP-2070，Conju-Probe公司製造)。本連結基於2分岐PEG鏈之末端各個具有DBCO，以偶極環加成反應結合聚(2-乙基-2-噁唑啉)疊氮化物(HR12.0500/05.04A(分子量50,000)或HR12.0250/05.04A(分子量25,000)，AVROXA公司製造)於兩DBCO合成之。直鏈型PEOZ加成適體為將DBCO-PEG4-NHS連結基(CP-2028，Conju-Probe公司製造)使用NHS酯與一級胺之交聯反應結合於到達適體5’末端之胺基C6連結基，再以偶極環加成反應加成聚(2-乙基-2-噁唑啉)疊氮化物(HR12.0500/05.04A，AVROXA公司製造)合成之。PEG加成適體係於到達適體5’末端之胺基C6連結基加成分子量40,000之聚乙二醇(SUNBRIGHT GL2-400TS01，日油公司製造)合成之。又，於以下，只於(4.分岐型PEOZ、直鏈型PEOZ及PEG加成抗FGF2適體之血中滯留性評估)使用25kDa之PEOZ(一部分)，於其他之試驗使用50kDa之PEOZ。
(2.分岐型PEOZ加成抗FGF2適體對於FGF2之結合活性評估)使用抗FGF2適體，將分岐型PEOZ加成適體對於FGF2之結合活性使用表面等離子體共振進行評估。測定使用BIAcore(註冊商標) T200(cytiva公司製造)。依照cytiva公司之協定將人類FGF2(AF-100-18B，Peprotech公司製造)於S系列感測器晶片 CM4(29104989，cytiva公司製造)以約1000RU固定化。使用300mmol/l氯化鈉、5.4mmol/l氯化鉀、0.8mmol/l氯化鎂、1.8mmol/l氯化鈣、20mmol/l Tris(pH7.6)、0.05% Tween20調製電泳緩衝液及分析物用之適體溶液。適體溶液調製成2μg/mL及125μg/mL作為遊離型寡核酸濃度，予以注射。於感測器晶片之再生使用2mol/l NaCl溶液。圖1表示測定之結果獲得之感測圖。與為陽性對照之PEG加成適體(圖2)相同，看到濃度依賴之信號上昇，明瞭分岐型PEOZ加成適體結合於FGF2。
(3.分岐型PEOZ加成抗FGF2適體於體外之阻礙活性評估)使用抗FGF2適體，比較分岐型PEOZ加成適體及PEG加成適體經由FGF2之細胞刺激阻礙活性。NIH3T3細胞經由FGF2刺激細胞，信號傳達系活化，則經由FRS2、Grb2、SOS之MAP激酶路徑或PIK3/AKT1路徑等被活化，最終誘導VEGF-A、VEGF-C、HGF、血管生成素-2、VEGFR、PDGFR-α等各種成長因子或受體基因表現。此時，己知ERK(細胞外訊號調節激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase)被磷酸化。NIH3T3細胞以人類FGF2(AF-100-18B，Peprotech公司製造)(1nmol/ml)刺激時，於培養基中加入適體，30分鐘後將經磷酸化之ERK藉由酵素連結免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)法進行測定。ELISA使用ERK1(phospho T202＋Y204)＋ERK2(phospho T185＋Y187)＋total ERK ELISA套組(ab176660，Abcam公司製造)。藉由使用微孔板讀數儀系統(SpectraMax(註冊商標)190，分子裝置股份有限公司(Molecular Devices Co.,Ltd.)製造)測定450nm之吸光度，可將試樣中磷酸化ERK(p-ERK)量及總ERK量定量。ERK之磷酸化量級以p-ERK之吸光度與總ERK吸光度之比(p-ERK/總ERK比)表示。於培養基未添加適體時之p-ERK/總ERK比(R0)作為100%，從於各濃度之p-ERK/總ERK比(R)藉由下述之式尋求經由FGF2刺激之ERK磷酸化阻礙率。又，R0及R為於培養基未添加適體及FGF2時之p-ERK/總ERK比作為基線減去之値。經由FGF2之ERK磷酸化率＝(R/R0)×100經由FGF2之ERK磷酸化阻礙率＝經由100-FGF2之ERK之磷酸化率
使用阻礙率數值，藉由非線性迴歸決定為了阻礙50%經由FGF2之ERK磷酸化之必要適體濃度(IC50)。於分析，使用GraphPad　Prism7(Graphpad Software公司製造)。圖3表示藉由添加分岐型PEOZ或PEG經加成之適體，於FGF2刺激後之細胞中ERK之磷酸化阻礙效果。添加任一種適體都顥示濃度依賴性阻礙活性。分岐型PEOZ及PEG之IC50値(平均±標準偏差)各自為112.5±25.9及127.1±22.5pmol/l，為同程度。從以上顯示，本發明之分岐型PEOZ加成適體對於生存之細胞，具有與PEG加成適體相同程度之機能阻礙活性。
(4.分岐型PEOZ、直鏈型PEOZ及PEG加成抗FGF2適體之血中滯留性評估)使用抗FGF2適體，比較分岐型PEOZ、直鏈型PEOZ及PEG加成適體於小鼠之血中滯留性。於6或7週齡之雄性C57BL/6J小鼠(日本SLC公司製造)將各適體經靜脈投予使成為0.5mg/kg。從投予起1、3、6、24、48、72小時後小鼠以異氟烷(008803998、Viatris公司製造)麻醉，以心採血採取小鼠之血液約500μL。將採取之血液放入卡皮傑特II(CapijectII)(EDTA・2K)(CJ-2DK，泰爾茂(Terumo)公司製造)，於微量高速冷卻離心機(MX-301，湯米精工(TOMY SEIKO)公司製造)以2,300×g，於4℃進行離心分離10分鐘，將獲得之上清液作為血漿回收。使用酵素連結寡核苷酸吸附測定法(Enzyme-Linked oligonucleotide sorbent assay(ELOSA)法測定獲得之血漿中之適體濃度。以下表示其方法。偵測探針使用於5’-末端以螢光素(FAM)標識之寡核酸及於3’末端以胺基標識之寡核酸。將以含有1w/v%SDS之PBS稀釋之血漿試樣及FAM標識偵測探針混合，於80℃、遮光條件下靜置10分鐘後於冰上急速冷卻，將FAM標識偵測探針及適體雜交。將此作為前處理液。將胺基標識偵測探針於經由活性酯塗覆之96孔(圓型)盤(住友電木(Sumitomo Bakelite)公司製造)固相化，於此添加前處理液，將此盤於60℃，於遮光條件振盪1小時後於冰上急速冷卻，將胺基標識偵測探針與體雜交。將盤以洗淨液(含有0.05v/v% Tween20之PBS)洗淨，辣根過氧化物酶(HRP)標識抗FITC抗體(6400-05、SouthernBiotech公司製造)之原液以PBS稀釋8000倍之溶液100μL處理，將抗體結合於FAM。之後，使用過氧化物酶用顯色套組(ML-1120T，住友電木公司製造)使發色，使用微孔板讀數儀系統(SpectraMax(註冊商標)M2，SpectraMax(註冊商標)190，分子裝置股份有限公司製造)測定450nm之吸光度。
圖4表示各適體之血中濃度推移。分岐型25kDa×2、分岐型50kDa×2、直鏈型50kDa之PEOZ加成適體及PEG加成適體之血中半衰期各個為5.55、18.05、6.35小時及7.70小時。由此，分岐型50kDa×2之PEOZ加成適體之血中滯留性與PEG加成適體為同等或更優越。又，分岐型25kDa×2及50kDa×2之PEOZ加成適體顯示與直鏈型50kDa為同等或更優越之血中滯留性，與任一種適體單獨(未加成)比較，血中滯留性大幅度增大。
(5.PEOZ加成抗自分泌運動因子適體之酵素阻礙活性評估)使用抗自分泌運動因子適體，比較分岐型PEOZ加成適體與PEG加成適體之自分泌運動因子之酵素阻礙活性。作為抗自分泌運動因子適體使用為由具有序列編號1表示之核苷酸序列之適體改變體之式(1)表示之鹼基序列構成之適體。式(1)：5’-tC(M)U(M)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(M)cC(M)U(M)cG(M)G(M)A(M)_idT-3’(大寫表示RNA，小寫表示DNA，於核苷酸之括弧表示核糖2’位之修飾，F表示氟原子，M表示O-甲基。又，於序列末端之idT表示藉由反向-dT修飾，序列中之s表示將連結核苷酸之間之磷酸基經硫代磷酸酯化。)
酵素阻礙活性藉由下述之方法進行評估。作為自分泌運動因子之基質選擇含有磷酸二酯鍵合成基質對硝基苯基胸苷 5'-單磷酸酯(pNP-TMP)(T4510，SIGMA公司製造)(以下，稱為NPP2阻礙分析)。藉由水解將磷酸二酯鍵切斷，釋放對-硝基苯酚。此對基苯酚變黃色顯色，將此檢測。分析使用96孔盤(UV-Star 96孔微盤，平底，655801，格瑞納生物一號公司(Greiner BIO-ONE)製造，以反應液量100μL進行。又，反應液使用溶液A。此溶液A為145mmol/l NaCl、5.4mmol/l KCl、0.8mmol/l MgCl2、1.8mmol/l CaCl2、20mmol/l Tris(pH7.6)、0.05% Tween20之混合液。於以溶液A調製成各濃度之適體溶液50μL中添加以相同之溶液A調製成10mmol/l之pNP-TMP 10μL，充分混合後於37℃加溫5分鐘。另一方面準備將6ng之自分泌運動因子以溶液A稀釋者40μL，於37℃加溫5分鐘。加溫後將兩者混合，開始酵素反應。反應溶液中之最終自分泌運動因子濃度為0.3nM，最終基質濃度為1mM。將含有反應液之盤於37℃加溫6小時後，安裝於微孔板讀數儀系統SpectraMax(註冊商標)M2(分子裝置股份有限公司製造)，尋求於波長405nm之吸光度。將未放入適體時之吸光度(A0)作為100%，藉由下述式從於各濃度之吸光度(A)尋求酵素活性阻礙率。又，A0及A為將酵素反應剛開始(0小時)作為背景減去之値。酵素活性率＝(A/A0)×100酵素活性阻礙率＝100-酵素活性率
使用阻礙率數值，藉由非線性迴歸決定為了阻礙50%酵素活性之必要適體濃度(IC50)。於分析，使用GraphPad Prism7(Graphpad Software公司製造)。圖5表示經由分岐型PEOZ及PEG加成適體之酵素活性阻礙效果。任一種加成體都顯示濃度依賴性阻礙活性，分岐型PEOZ及PEG之IIC50値(平均±標準偏差)各自為943.1±105.0及634.2±31.5pmol/L，為同程度。從以上顯示本發明之分岐型PEOZ加成抗自分泌運動因子適體具有與PEG加成抗自分泌運動因子適體相同程度之酵素阻礙活性。
(6.分岐型PEOZ及PEG加成抗自分泌運動因子適體之血中滯留性評估)使用抗自分泌運動因子適體，比較分岐型PEOZ及PEG加成適體於小鼠之血中滯留性。於6或7週齡之雄性C57BL/6J小鼠(日本SLC公司製造)將各適體經靜脈投予使成為0.5mg/kg。從投予起1、3、6、24、48、72小時後將小鼠以異氟烷(008803998、Viatris公司製造)進行麻醉，以心採血採取小鼠之血液約500μL。將採取之血液放入卡皮傑特II(CapijectII)(EDTA・2K)(CJ-2DK，泰爾茂(Terumo)公司製造)，於微量高速冷卻離心機(MX-301，湯米精工(TOMY SEIKO)公司製造)以2,300×g，於4℃進行離心分離10分鐘，將獲得之上清液作為血漿回收。
使用酵素連結寡核苷酸吸附測定法(ELOSA)法測定獲得之血漿中之適體濃度。以下表示其方法。偵測探針使用為於5’-末端以螢光素(FAM)標識之序列：5’-U(M)C(M)C(M)G(M)A(M)G(M)G(M)A(M)G(M)C(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(M)-3’(序列編號2(1)：5’-UCCGAGGAGCAAAAC-3’(序列編號2)之變形，於核苷酸之括弧表示核糖2’位之修飾，M表示O-甲基)之寡核酸、及3’末端為以生物素標識之序列：5’-C(M)U(M)G(M)U(M)U(M)U(M)C(M)C(M)C(M)U(M)C(M)A(M)G(M)A(M)-3’(序列編號3(1)：5’-CUGUUUCCCUCAGA-3’(序列編號3)之變形，於核苷酸之括弧表示核糖2’位之修飾，M表示O-甲基)之寡核酸。將以1w/v%脫脂牛奶稀釋之血漿試樣與FAM標識偵測探針混合，於80℃，於遮光條件下靜置10分鐘後於冰上急速冷卻，將FAM標識偵測探針與適體雜交。將此作為前處理液。將生物素標識偵測探針於經鏈黴親和素塗覆之96孔盤(IMMOBILIZER STREPTAVIDIN F8 clear(436020，賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司製造))中固相化後以1w/v%脫脂牛奶進行阻塞。於此添加前處理液，將此盤於50℃，於遮光條件下振盪1小時後於冰上急速冷卻，將生物素標識偵測探針與適體進行雜交。將盤以洗淨液(含有0.05v/v% Tween20之PBS)洗淨，以將辣根過氧化物酶(HRP)標識抗FITC抗體(6400-05，SouthernBiotech公司製造)之原液以PBS稀釋8000倍之溶液100μL處理，將抗體結合於FAM。之後，使用過氧化物酶用顯色套組(ML-1120T、住友電木公司製造)使發色，使用微孔板讀數儀系統(SpectraMax(註冊商標)M2、分子裝置股份有限公司製造)測定450nm之吸光度。
圖6表示各適體之血中濃度推移。分岐型PEOZ加成及PEG加成適體之血中半衰期各自為6.30及3.75小時。由此明瞭分岐型PEOZ加成適體之血中滯留性比PEG加成適體優越。[産業上之利用可能性]
本發明由於可延長適體之血中半衰期，於使用適體之種種醫療用途為有用。本專利申請以於日本提出專利申請之特願2024-012285(申請日：2024年1月30日)為基礎，其内容全都包含於本說明書中。
無
圖1為表示分岐型PEOZ(50kDa×2)加成抗FGF2適體與人類FGF2結合之感測圖之圖。圖2為表示PEG加成抗FGF2適體與人類FGF2結合之感測圖之圖。圖3為表示經由添加分岐型PEOZ(50kDa×2)加成抗FGF2適體及PEG加成抗FGF2適體，FGF2刺激後之細胞的ERK磷酸化之阻礙效果圖。圖4為表示分岐型PEOZ(25kDa×2、50kDa×2)、直鏈型PEOZ(50kDa)及PEG加成抗FGF2適體及未加成之抗FGF2適體之血中滯留性評估之結果圖。圖5為表示分岐型PEOZ(50kDa×2)及PEG加成抗自分泌運動因子適體之酵素阻礙活性評估之結果圖。圖6為表示分岐型PEOZ(50kDa×2)及PEG加成抗自分泌運動因子適體之血中滯留性評估之結果之圖。
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Claims (25)

  1. 一種適體及聚乙基噁唑啉之共軛物或其鹽。
  2. 如請求項1所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉為形成分岐鏈。
  3. 如請求項1或2所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉結合於前述適體之5’末端。
  4. 如請求項1或2所述之共軛物或其鹽，其中，2種前述聚乙基噁唑啉經由連結基形成分岐鏈。
  5. 如請求項2所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉之分岐鏈各個之分子量為20至60kDa。
  6. 如請求項4所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉與前述連結基以偶極環加成反應結合。
  7. 如請求項6所述之共軛物或其鹽，其中，前述偶極環加成反應為前述聚乙基噁唑啉側之疊氮化物與前述連結基側之二苯并環辛炔之偶極環加成反應。
  8. 如請求項1所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉經由連結基結合於前述適體之5’末端。
  9. 如請求項8所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉-連結基部分之構造為下列者：此處，l表示聚合度，l為200至600。
  10. 如請求項4所述之共軛物或其鹽，其中，前述聚乙基噁唑啉-連結基部分之構造為下列者：此處，m及n各個表示聚合度，m為200至600，n為200至600。
  11. 如請求項1或2所述之共軛物或其鹽，其中，前述適體為抗FGF2適體或抗自分泌運動因子適體。
  12. 如請求項1或2所述之共軛物或其鹽，其中，前述適體為包含下列式(1)表示之鹼基序列之適體：tC(M)U(M)G(M)A(M)G(M)G(M)gA(M)AsA(M)C(F)A(M)ggU(F)U(F)U(F)U(F)G(M)C(F)U(M)cC(M)U(M)cG(M)G(M)A(M)_idT　(1)大寫表示RNA，小寫表示DNA，於核苷酸之括弧表示核糖2’位之修飾，F表示氟原子，M表示O-甲基；又，於序列末端之idT表示經由反向-dT修飾，序列中之s表示將核苷酸之間連結之磷酸基經硫代磷酸酯化。
  13. 一種組成物，含有如請求項1或2所述之共軛物或其鹽。
  14. 一種有血中半衰期經延長之適體的製造方法，包含將聚乙基噁唑啉結合於適體之步驟。
  15. 如請求項14所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉形成分岐鏈。
  16. 如請求項14或15所述之製造方法，其中，將前述聚乙基噁唑啉結合於前述適體之5’末端。
  17. 如請求項14或15所述之製造方法，其中，經由連結基將分岐之前述聚乙基噁唑啉結合於前述適體。
  18. 如請求項15所述之製造方法，其中，將分岐鏈各個分子量為20至60kDa之前述聚乙基噁唑啉結合於前述適體。
  19. 如請求項17所述之製造方法，其中，將前述聚乙基噁唑啉及連結基以偶極環加成反應結合。
  20. 如請求項19所述之製造方法，其中，將前述聚乙基噁唑啉及連結基以前述聚乙基噁唑啉側之疊氮化物及前述連結基側之二苯并環辛炔之偶極環加成反應結合。
  21. 如請求項14或15所述之製造方法，其中，經由連結基將分岐之前述聚乙基噁唑啉，以前述連結基側之馬來醯亞胺基及前述適體側之硫醇基之邁克爾加成反應(Michael addition reaction)結合於前述適體。
  22. 如請求項14所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉經由連結基結合於前述適體之5’末端。
  23. 如請求項22所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉-連結基部分之構造為下列者：此處，l表示聚合度，l為200至600。
  24. 如請求項17所述之製造方法，其中，前述聚乙基噁唑啉-連結基部分之構造為下列之構造式者：此處，m及n各個表示聚合度，m為200至600，n為200至600。
  25. 一種適體之安定化方法，以將聚乙基噁唑啉結合於適體為特徴。
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