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TW202536172A - 改變型ｒｎａ聚合酶、多核苷酸、載體、重組宿主細胞、製造ｒｎａ聚合酶之方法、試劑、ｒｎａ合成方法、以及合成ｒｎａ醫藥之方法 - Google Patents

改變型ｒｎａ聚合酶、多核苷酸、載體、重組宿主細胞、製造ｒｎａ聚合酶之方法、試劑、ｒｎａ合成方法、以及合成ｒｎａ醫藥之方法

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TW202536172A
TW202536172A TW113150822A TW113150822A TW202536172A TW 202536172 A TW202536172 A TW 202536172A TW 113150822 A TW113150822 A TW 113150822A TW 113150822 A TW113150822 A TW 113150822A TW 202536172 A TW202536172 A TW 202536172A
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TW
Taiwan
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amino acid
sequence number
sequence
acid sequence
sequence corresponding
Prior art date
Application number
TW113150822A
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English (en)
Inventor
大地健介
Original Assignee
日商東洋紡股份有限公司
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Publication date
Application filed by 日商東洋紡股份有限公司 filed Critical 日商東洋紡股份有限公司
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Abstract

本發明之課題在於提供一種新穎的改變型RNA聚合酶。本發明係藉由在預定位置中之至少1個胺基酸經改變之改變型RNA聚合酶來解決上述課題。

Description

改變型RNA聚合酶、多核苷酸、載體、重組宿主細胞、製造RNA聚合酶之方法、試劑、RNA合成方法、以及合成RNA醫藥之方法
本發明係關於一種改變型RNA(ribonucleic acid；核醣核酸)聚合酶。
DNA(deoxyribonucleic acid；去氧核糖核酸)依賴性RNA聚合酶係識別DNA中之啟動子序列並將DNA作為模板(template)來合成RNA之酵素，由於在生物體內承擔從基因體DNA合成mRNA(messenger RNA；傳訊核糖核酸)之轉錄反應，故進行過許多研究。其中，源自噬菌體的RNA聚合酶係由於具有相較單純的結構並以單一個次單元發揮功能，故自古以來就成為生化學上、結構生物學上的研究對象。這些RNA聚合酶亦泛用於在活體外(in vitro)合成RNA之用途中，藉由RNA聚合酶所合成之RNA係被利用來作為分子生物學上的手法所用之RNA探針或各式各樣的功能性RNA、或作為在細胞內之蛋白質表現或無細胞蛋白質合成系統所使用之模板RNA。
此外，使用RNA聚合酶之從模板DNA合成多數的RNA之性質，開發了如NASBA(nucleic acid sequence-based amplification；基於核酸序列之增幅)法、TMA(transcription-mediated amplification；轉錄媒介增幅)法之類的恆溫增幅反應(isothermal amplification reaction)，這些手法被應用於臨床診斷。
近年來，藉由RNA聚合酶所合成之RNA亦被應用於以mRNA疫苗為首之mRNA醫藥，RNA聚合酶亦被廣泛用在醫藥品製造之領域中。作為在mRNA醫藥之製造製程中會成為問題的雜質之一，可列舉dsRNA(double-stranded RNA；雙股核醣核酸)。由於dsRNA在生物體內會引起發炎反應，故在mRNA醫藥中期望盡力去除dsRNA。非專利文獻1中記載了一種可減少轉錄反應中之dsRNA的生成之改變型T7 RNA聚合酶。[先前技術文獻][非專利文獻]
[非專利文獻1] Dousis, A., Ravichandran, K., Hobert, E.M. et al., Nat. Biotechnol., 41:560-568, 2023。
[發明所欲解決之課題]如同上述，在RNA聚合酶之用途擴展中，針對RNA聚合酶的性能期望更進一步的改良。於是，本發明之課題在於提供一種新穎的改變型RNA聚合酶。[用以解決課題之手段]
本案發明人為了解決上述課題而重複精心探討的結果，發現藉由在野生型RNA聚合酶的胺基酸序列中，將預定位置中之至少1個胺基酸予以改變，可減少轉錄反應中之dsRNA的生成。本案發明人根據如此見解，進一步重複精心研究的結果，達到完成本發明。
亦即，本發明包含下列項目所記載之態樣。[項1] 一種RNA聚合酶，係具有與序列編號1的胺基酸序列有著90%以上之一致性並且選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個、第156個、第189個、第165個、以及第661個之位置的胺基酸所組成之群組中之至少1個胺基酸經改變之胺基酸序列。[項2] 一種RNA聚合酶，係具有與序列編號1的胺基酸序列有著90%以上之一致性並且滿足選自由下列(i)至(v)所組成之群組中之至少1者之胺基酸序列：(i) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、甘胺酸、或脯胺酸；(ii) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(iii) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(iv) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸、麩胺酸、精胺酸、或脯胺酸；以及(v) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸。[項3] 如項1或項2所記載之RNA聚合酶，其中前述RNA聚合酶具有與序列編號1的胺基酸序列有著90%以上之一致性的胺基酸序列，並且前述胺基酸序列係：(1) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、甘胺酸、或脯胺酸；(2) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(3) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(4) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸、麩胺酸、精胺酸、或脯胺酸；(5) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(6) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(7) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(8) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(9) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(10) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(11) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(12) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(13) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(14) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(15) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(16) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(17) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(18) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(19) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(20) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(21) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(22) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(23) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；或者(24) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸。[項4] 一種多核苷酸，係編碼如項1至項3中任一項所記載之RNA聚合酶。[項5] 一種載體，係含有如項4所記載之多核苷酸。[項6] 一種重組宿主細胞，係已藉由如項5所記載之載體而轉形(transformation)。[項7] 一種製造RNA聚合酶之方法，係使用如項4所記載之多核苷酸、如項5所記載之載體、以及/或者如項6所記載之重組宿主細胞來製造RNA聚合酶。[項8] 一種試劑，係含有如項1至項3中任一項所記載之RNA聚合酶、如項4所記載之多核苷酸、如項5所記載之載體、以及/或者如項6所記載之重組宿主細胞。[項9] 一種RNA合成方法，係包含使如項1至項3中任一項所記載之RNA聚合酶作用於模板DNA。[項10] 如項9所記載之方法，其中所合成之RNA中之dsRNA的比例係相對於在同一條件下使用對應的野生型RNA聚合酶所合成之RNA中之dsRNA的比例為未達90%。[項11] 如項9或項10所記載之方法，其中所合成之RNA的量係相對於在同一條件下使用對應的野生型RNA聚合酶所合成之RNA的量為110%以上。[項12] 如項9至項11中任一項所記載之方法，其中前述RNA合成為mRNA合成。[項13] 如項12所記載之方法，其中所合成之mRNA中之dsRNA的比例係相對於在同一條件下使用對應的野生型RNA聚合酶所合成之mRNA中之dsRNA的比例為未達90%。[項14] 如項12或項13所記載之方法，其中所合成之mRNA的量係相對於在同一條件下使用對應的野生型RNA聚合酶所合成之mRNA的量為110%以上。[項15] 如項9至項11中任一項所記載之方法，其中前述RNA合成為非編碼RNA合成。[項16] 如項15所記載之方法，其中前述非編碼RNA為選自由microRNA(微小核糖核酸)、siRNA(small interfering RNA；短小干擾核醣核酸)、piRNA(piwi-interacting RNA；piwi蛋白-互動型核醣核酸)、rRNA(ribosomal RNA；核糖體核醣核酸)、tRNA(transfer RNA；傳遞核糖核酸)、snRNA(small nuclear RNA；核小核糖核酸)、snoRNA(small nucleolar RNA；核仁小核糖核酸)、SLRNA(spliced leader RNA；剪接引導核糖核酸)、SRPRNA(signal recognition particle RNA；訊息辨識顆粒核糖核酸)、類mRNA之非編碼RNA(mRNA-like noncoding RNA)、以及寡核苷酸所組成之群組中之至少1種。[項17] 一種合成基因編輯用的嚮導RNA(guide RNA)之方法，係使用如項1至項3中任一項所記載之RNA聚合酶來合成基因編輯用的嚮導RNA。[項18] 一種合成RNA醫藥之方法，係使用如項1至項3中任一項所記載之RNA聚合酶來合成RNA醫藥。[項19] 如項9所記載之方法，其中藉由恆溫增幅反應來進行前述RNA合成。[項20] 一種進行基因檢查之方法，係使用如項1至項3中任一項所記載之RNA聚合酶來進行基因檢查。[項21] 一種進行在活體內之蛋白質表現或在活體外進行無細胞蛋白質合成之方法，係使用如項1至項3中任一項所記載之RNA聚合酶來進行在活體內之蛋白質表現或在活體外進行無細胞蛋白質合成。[發明功效]
若依據本發明，則可提供一種新穎的改變型RNA聚合酶。
以下，顯示本發明之實施形態，並且針對本發明更進一步詳細說明，但本發明並不限定於這些實施形態。另外，本說明書中所記載之非專利文獻以及專利文獻全部皆以參考的形式而援用於本說明書中，前述非專利文獻以及專利文獻整體被納入本說明書中。此外，本說明書中之「至」係意指「以上至以下」，例如在本說明書中若記載為「X至Y」則表示「X以上至Y以下」。本說明書中之「以及/或者」係意指所列出的要素中之任一個或二個以上之可能的組合。本說明書中之「含有」係包含「實質上由…所構成」以及「僅由…所構成」之概念。
本發明係提供一種經改變的RNA聚合酶作為本發明之一態樣。本說明書中，所謂「改變」係指胺基酸殘基之突變亦即取代、缺失、插入、或附加。所謂經改變的RNA聚合酶(以下，亦稱為「改變型RNA聚合酶」)係指在野生型RNA聚合酶的胺基酸序列中至少1個胺基酸殘基經突變亦即取代、缺失、插入、或附加的RNA聚合酶。
本說明書中，所謂「野生型RNA聚合酶」(以下，亦稱為「野生型」或「WT(wild type；野生型)」)係指未經人為導入突變的RNA聚合酶。就野生型RNA聚合酶而言，可列舉：T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、K11 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、Syn5 RNA聚合酶、KP34 RNA聚合酶、VSW-3 RNA聚合酶等。就較佳的野生型RNA聚合酶而言，可列舉例如由序列編號1的胺基酸序列所構成之野生型T7 RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶係如同該技術領域中具有通常知識者所周知，意指源自T7噬菌體的RNA聚合酶。
本發明之RNA聚合酶可為在與對應的野生型RNA聚合酶相比下，比活性經提升的RNA聚合酶。在此，所謂「比活性」係指例如在20℃至100℃之溫度下測定酵素活性時之每單位蛋白質重量的酵素活性。此外，所謂「對應的野生型RNA聚合酶」係意指相對於某改變型RNA聚合酶而言，與該某改變型RNA聚合酶為同種類的RNA聚合酶之野生型。例如，針對改變型T7 RNA聚合酶之「對應的野生型RNA聚合酶」係野生型T7 RNA聚合酶。此外，例如，針對改變型T3 RNA聚合酶之「對應的野生型RNA聚合酶」係野生型T3 RNA聚合酶。
本發明之RNA聚合酶具有與以往已知的野生型RNA聚合酶不同的胺基酸序列。因此，本說明書中，有將本發明之RNA聚合酶稱為突變型RNA聚合酶或改變型RNA聚合酶之情形。本說明書中，在稱為「突變型RNA聚合酶」或「改變型RNA聚合酶」時之「突變型」或「改變型」係可互換地使用，意味著具備與以往已知的野生型RNA聚合酶不同的胺基酸序列，而非區別藉由人為突變所得或藉由自然界中之突變所得。因此，本發明之突變型RNA聚合酶係在顯示野生型T7 RNA聚合酶序列之序列編號1的胺基酸序列中至少1個胺基酸經改變而具有與序列編號1的胺基酸序列不同的胺基酸序列之RNA聚合酶，而不問該突變型RNA聚合酶係藉由人為突變所得之RNA聚合酶、或藉由自然界中之突變所得之RNA聚合酶。
本說明書中，針對鹼基序列、胺基酸序列以及其各自的構成因子，有使用藉由字母標記而為之簡化的記號之情形，但皆為依循分子生物學以及基因工程學領域中之慣例。此外，本說明書中，為了簡潔地顯示胺基酸序列之突變，使用例如「A61E」等標記。「A61E」係顯示胺基酸序列之第61個的丙胺酸(A)取代為麩胺酸(E)。亦即，顯示取代前之胺基酸殘基的種類、胺基酸序列中之經取代的胺基酸的位置、取代後之胺基酸殘基的種類。此外，在無特別註明的情況下，序列編號係對應於序列表所記載之序列編號。此外，關於多重突變體之情形，可將上述標記以「/」連結來表示(例如，能以A61E/D156N/N165S之方式標記)。
在一實施形態中，突變型RNA聚合酶的胺基酸序列可為在序列編號1的胺基酸序列中以一定比例具有改變的胺基酸序列。在一實施形態中，突變型RNA聚合酶的胺基酸序列較佳係相對於序列編號1的胺基酸序列有著90%以上之一致性。只要在不失去RNA聚合酶活性的情況下，則突變型RNA聚合酶無特別限制，例如由與序列編號1的胺基酸序列之一致性為例如90%以上之胺基酸序列所構成，較佳係由與序列編號1的胺基酸序列之一致性為95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上之胺基酸序列所構成。在此，胺基酸序列之一致性可由該領域中周知的任意手段來評價。例如，可使用市售之分析工具或能通過電信線路(網際網路)而利用之分析工具來計算出，就一例而言，可藉由在美國國家生物技術資訊中心(NCBI)之相同性演算法BLAST(Basic local alignment search tool；基本區域比對搜尋工具)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/中使用預設(初始設定)之參數，來計算出胺基酸序列之一致性。更且，突變型RNA聚合酶的胺基酸序列可為在序列編號1的胺基酸序列中，1個或複數個胺基酸經缺失、取代、插入、以及/或者附加所得之胺基酸序列。在此，所謂「1個或複數個」係指只要在不失去RNA聚合酶活性的情況下，則無特別限制，例如為1個至30個，較佳係1個至20個、1個至10個、1個至5個、或1個至3個。如前所述之胺基酸序列例如可為藉由基因工程學的手法而人為製作的胺基酸序列，亦可為源自天然之蛋白質的胺基酸序列。
在一實施形態中，突變型RNA聚合酶在序列編號1的胺基酸序列中具有取代時，該取代較佳係在結構上以及/或者化學上類似的胺基酸間的取代(所謂的保留性取代)。就保留性取代之例而言，可列舉例如：在鹼性胺基酸(H,K,R)間的取代、在酸性胺基酸(D,E)間的取代、在中性非極性胺基酸(A,G,V,L,I,P,F,M,W)間的取代、在中性極性胺基酸(N,Q,S,T,Y,C)間的取代、在芳香族胺基酸(W,F,H,Y)間的取代、在含氮胺基酸(K,R,N,Q,P)間的取代、在含硫胺基酸(C,M)間的取代、在含氧胺基酸(S,T)間的取代、在β支鏈胺基酸(V,L,I)間的取代、在具有直鏈烷基或氫之側鏈的胺基酸(A,G)間的取代，但不限定於這些例子。
在特定的實施形態中，本發明之RNA聚合酶亦可在N末端側、C末端側中之任一者或兩者含有RNA聚合酶以外的胜肽。就上述胜肽之一例而言，可列舉：細胞外分泌訊息、蛋白質精製用標籤(His標籤、Flag標籤、Strep標籤、GST(glutathione S-transferase；麩胺基硫S-轉移酶)標籤、MBP(Maltose-binding protein；麥芽糖結合蛋白)標籤等)、具有其他功能的蛋白質、連接胜肽等，但不特別限定。
本發明之RNA聚合酶可由含有如上所述胺基酸殘基之胺基酸序列所構成。該發明所屬技術領域中具有通常知識者可藉由該領域周知的任意的基因工程學的手法，例如可藉由適當地設計編碼出目標胺基酸序列之鹼基序列並將該鹼基序列插入任意的表現載體等中所得者轉形到宿主細胞並進行表現等程序，來製造目標胺基酸序列之RNA聚合酶蛋白質。
在較佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶係與序列編號1的胺基酸序列有著例如90%以上之一致性，較佳係有著95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上之一致性，例如相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸經改變的RNA聚合酶，較佳係相當於第61個之位置的胺基酸經取代成其他胺基酸的RNA聚合酶。相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為丙胺酸，就要取代相當於第61個之位置的丙胺酸殘基之胺基酸而言，可列舉例如：甘胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸，較佳係麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、甘胺酸、或脯胺酸，更佳係麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、甘胺酸、或脯胺酸。雖非意圖拘束於特定理論，但認為相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸突變係有助於減少藉由使用改變型RNA聚合酶之轉錄反應所產生之RNA中之dsRNA的比例。
本說明書中，所謂「相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置」係意指野生型T7 RNA聚合酶的胺基酸序列(序列編號1)中之第61個、或突變型RNA聚合酶的胺基酸序列中之相當於野生型T7 RNA聚合酶的胺基酸序列(序列編號1)之第61個之位置。突變型RNA聚合酶的胺基酸序列中之「相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置」可藉由例如以周知的任意手段進行該野生型T7 RNA聚合酶的胺基酸序列(序列編號1)與該突變型RNA聚合酶的胺基酸序列之比較以及比對(alignment)來容易地特定。例如，胺基酸序列之比較以及比對可使用市售之分析工具或能通過電信線路(網際網路)而利用之分析工具來進行，就一例而言，可藉由使用在歐洲生物資訊研究所(EMBL)所提供之多重序列比對程式Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa/clustalo)中使用預設(初始設定)之參數，來進行胺基酸序列之比對。本說明書中，在記載相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個以外之任意位置的胺基酸之位置之情形亦同。
在較佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶係與序列編號1的胺基酸序列有著例如90%以上之一致性，較佳係有著95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上之一致性，例如相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸經改變的RNA聚合酶，較佳係經取代成其他胺基酸的RNA聚合酶。相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬胺酸，就要取代相當於第156個之位置的天冬胺酸殘基之胺基酸而言，可列舉例如：甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、或麩胺酸，但無特別限定。在更佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶係相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸經改變成鹼性胺基酸或中性胺基酸的RNA聚合酶。就鹼性胺基酸或中性胺基酸而言，可列舉例如天冬醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、組胺酸、或離胺酸，較佳係天冬醯胺酸或麩醯胺酸，更佳係天冬醯胺酸。雖非意圖拘束於特定理論，但認為相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸突變係有助於減少藉由使用改變型RNA聚合酶之轉錄反應所產生之RNA中之dsRNA的比例。
在較佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶係與序列編號1的胺基酸序列有著例如90%以上之一致性，較佳係有著95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上之一致性，例如相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸經改變的RNA聚合酶，較佳係經取代成其他胺基酸的RNA聚合酶。相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，就要取代相當於第165個之位置的天冬醯胺酸殘基之胺基酸而言，可列舉例如：甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸，其中較佳係絲胺酸、麩胺酸、精胺酸、或脯胺酸，更佳係絲胺酸。雖非意圖拘束於特定理論，但認為相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸突變係有助於減少藉由使用改變型RNA聚合酶之轉錄反應所產生之RNA中之dsRNA的比例。
在較佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶係與序列編號1的胺基酸序列有著例如90%以上之一致性，較佳係有著95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上之一致性，例如相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸經改變的RNA聚合酶，較佳係經取代成其他胺基酸的RNA聚合酶。相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬胺酸，就要取代相當於第189個之位置的天冬胺酸殘基之胺基酸而言，可列舉例如：甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、或麩胺酸，但無特別限定。在更佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶較佳係相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸經鹼性胺基酸或中性胺基酸取代，就鹼性胺基酸或中性胺基酸而言，可列舉例如：甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、組胺酸、或離胺酸，較佳係經天冬醯胺酸或麩醯胺酸取代，更佳係經天冬醯胺酸取代。雖非意圖拘束於特定理論，但認為相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸突變係有助於減少藉由使用改變型RNA聚合酶之轉錄反應所產生之RNA中之dsRNA的比例。
在較佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶係與序列編號1的胺基酸序列有著例如90%以上之一致性，較佳係有著95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上之一致性，例如相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸經改變的RNA聚合酶，較佳係經取代成其他胺基酸的RNA聚合酶。相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為絲胺酸，就要取代相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的絲胺酸之胺基酸而言，可列舉例如：甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、蘇胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸，較佳係經天冬醯胺酸或麩醯胺酸取代，更佳係經天冬醯胺酸取代。雖非意圖拘束於特定理論，但認為相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸突變係有助於減少藉由使用改變型RNA聚合酶之轉錄反應所產生之RNA中之dsRNA的比例。
在較佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶係與序列編號1的胺基酸序列有著例如90%以上之一致性(較佳係有著95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上之一致性)並且選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個、第156個、第189個、第165個、以及第661個之位置的胺基酸所組成之群組中之至少1個胺基酸經改變的RNA聚合酶。
在較佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶可為具有與序列編號1的胺基酸序列有著例如90%以上之一致性(較佳係有著95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上之一致性)並且滿足選自由下列(i)至(v)所組成之群組中之至少1者之胺基酸序列的RNA聚合酶；(i) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、甘胺酸、或脯胺酸；(ii) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(iii) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(iv) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸、麩胺酸、精胺酸、或脯胺酸；以及(v) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸。
在較佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶可為具有與序列編號1的胺基酸序列有著例如90%以上之一致性，較佳係有著95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上之一致性，例如下列(1)至(24)之胺基酸序列的RNA聚合酶：(1) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、甘胺酸、或脯胺酸；(2) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(3) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(4) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸、麩胺酸、精胺酸、或脯胺酸；(5) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(6) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(7) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(8) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(9) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(10) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(11) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(12) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(13) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(14) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(15) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(16) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(17) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(18) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(19) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(20) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(21) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(22) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(23) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；或(24) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；較佳係可為具有(10) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸之胺基酸序列的RNA聚合酶。
在一實施形態中，本發明之RNA聚合酶係以可減少轉錄反應中之dsRNA的生成這點作為特點。本發明之RNA聚合酶可為在與對應的野生型RNA聚合酶相比下，轉錄反應後之RNA中之dsRNA的比例為約90%以下之RNA聚合酶，較佳係可為轉錄反應後之RNA中之dsRNA的比例為約80%以下、約70%以下、約60%以下、約50%以下、約40%以下、約30%以下、約20%以下、或約10%以下之RNA聚合酶。
[轉錄反應後之RNA中之dsRNA的比例之測定方法]轉錄反應後之RNA中之dsRNA的比例具體而言可藉由以下測定方法來確認。將1μL的RNA聚合酶(50U/μL)添加於49μL的反應液(以下，顯示酵素添加後之反應液50μL中之最終濃度)(40mM Tris-HCl(Tris(hydroxymethyl)aminomethane Hydrochloride；參(羥甲)胺甲烷鹽酸鹽)(pH 8.0)、50mM NaCl、8mM MgCl2、5mM DTT(Dithiothreitol；二硫蘇糖醇)、10ng/μL 模板DNA、0.4mM ATP(adenosine triphosphate；三磷酸腺苷)、0.4mM CTP(cytidine triphosphate；三磷酸胞苷)、0.4mM GTP(guanosine triphosphate；三磷酸鳥苷)、0.4mM UTP(uridine triphosphate；三磷酸尿苷)、0.4U/μL RNase(ribonuclease；核糖核酸酶)抑制劑)中之後，以加熱塊在37℃中進行反應1小時。模板DNA係使用自5’末端起依序含有對應於要測定的RNA聚合酶之啟動子(T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子等中之任一種)、5’UTR(untranslated region；非轉譯區)、3’UTR、poly-A(polyadenylic acid；多腺苷酸)(100nt)，且在5’UTR、3’UTR之間含有螢火蟲螢光素酶基因(Fluc)作為編碼序列(CDS)之dsDNA。反應後添加2.5μL的Turbo(註冊商標)DNase(2U/μL)(賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司製造)，進一步在37℃進行反應15分鐘。將此反應液使用Monarch(註冊商標)RNA Cleanup Kit(NEB公司製造)予以精製，得到精製RNA。測定所得之精製RNA之260nm的吸光度(A260)，假定A260為1時RNA濃度為40ng/μL來計算出RNA濃度。使用雙股RNA(dsRNA)ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay；酵素結合免疫吸附分析法)套組(基於K1)(Exalpha Biologicals公司)，從針對所附的dsRNA對照組進行ELISA所得之測定值來製作檢量線。將精製RNA稀釋為100ng/μL，進一步稀釋為複數種濃度後，以雙股RNA(dsRNA)ELISA套組(基於K1)進行ELISA，使用所得之測定值中會成為檢量線範圍內之測定值，從上述所製作之檢量線來計算出dsRNA濃度。藉由進一步將dsRNA濃度除以RNA濃度，可計算出RNA中之dsRNA的比例(%)(w/w)。
在一實施形態中，本發明之RNA聚合酶可具有高的比活性。本發明之RNA聚合酶可具有在與對應的野生型RNA聚合酶相比下，約1.1倍以上之比活性，較佳係約1.2倍以上、約1.3倍以上、約1.4倍以上、約1.5倍以上、約1.6倍以上、約1.7倍以上、或約1.8倍以上之比活性。比活性具體而言可藉由以下測定方法來確認。
[活性測定方法]RNA聚合酶的活性可藉由以下操作來測定。該發明所屬技術領域中具有通常知識者可適當地設定測定條件，例如酵素活性過高時，將含有測定對象之樣品適當地稀釋並進行測定即可。首先，將45μL的反應液(以下，顯示酵素添加後之反應液50μL中之最終濃度)(40mM Tris-HCl(pH 8.0)、50mM NaCl、8mM MgCl2、5mM DTT、10ng/μL 模板DNA、0.4mM ATP、0.4mM CTP、0.4mM GTP、0.4mM UTP)添加於0.2mL的PCR(polymerase chain reaction；聚合酶鏈鎖反應)管之後，進一步添加5μL的已知活性的野生型RNA聚合酶，以加熱塊在37℃進行反應10分鐘。10分鐘後，藉由添加10μL的1M EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid；乙二胺四乙酸)來停止反應。製作RNA聚合酶之稀釋系列並進行此反應。然後，使用Qubit(註冊商標)RNA BR(Broad Range；廣範圍)分析套組(賽默飛世爾科技製造)來定量各自的反應液中的RNA量，從在各稀釋系列中添加的RNA聚合酶的活性值以及所定量之RNA量來製作檢量線。針對測定對象之RNA聚合酶亦進行同樣的反應，依據所得之RNA量，使用上述所製作之檢量線來計算出活性。
[比活性之測定]測定280nm的吸光度(A280)，假定A280為1時酵素濃度為1mg/mL來計算出酵素濃度。藉由將如上述方式所計算出之活性值除以酵素濃度來計算出比活性。
在一實施形態中，本發明之RNA聚合酶可在與對應的野生型RNA聚合酶相比下，顯示高的熱穩定性。在較佳的實施形態中，本發明之RNA聚合酶例如可為在以50℃熱處理5分鐘時顯示大於50%的殘留活性率的RNA聚合酶，可為顯示60%以上的殘留活性率的RNA聚合酶，可為顯示70%以上的殘留活性率的RNA聚合酶，或可為顯示80%以上的殘留活性率的RNA聚合酶。在特定實施形態中，本發明之RNA聚合酶可為在以50℃熱處理5分鐘時顯示90%以上的殘留活性率的RNA聚合酶。
從再另一觀點而言，本發明之RNA聚合酶例如可為在預定條件下熱處理時，在與對應的野生型RNA聚合酶的殘留活性率相比下，顯示高的殘留活性率的突變型RNA聚合酶。具體而言，例如可為在以50℃熱處理5分鐘時，在與對應的野生型RNA聚合酶的殘留活性率相比下，顯示約1.1倍以上之高的殘留活性率的RNA聚合酶，較佳係可為顯示約1.2倍以上、約1.3倍以上、約1.4倍以上、約1.5倍以上、約1.6倍以上、約1.7倍以上、約1.8倍以上、或約1.9倍以上之高的殘留活性率的RNA聚合酶。
[熱穩定性(熱處理後之殘留活性率)之測定]熱穩定性具體而言可藉由以下測定方法來確認。首先，將會成為測定對象之各突變型RNA聚合酶藉由保存緩衝液(20mM KPO4(pH 7.7)、100mM NaCl、50%甘油、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.01% Triton(註冊商標)X-100)而稀釋為50U/μL後，依據前述活性測定方法所記載之程序，測定保存前的活性值。其次，將已稀釋於上述保存緩衝液中之測定對象之各突變型RNA聚合酶，在50℃的保溫箱(incubator)內保存5分鐘。保存後，與保存前同樣地依據前述活性測定方法所記載之程序，測定保存後的活性值。其次，如以下之式I所記載，可藉由將保存後的活性值除以保存前的活性值來計算出殘留活性率。殘留活性率(%)＝(保存後的活性值/保存前的活性值)×100…(式I)
在更進一步的實施形態中，本發明係提供一種編碼如前所述之本發明之RNA聚合酶的多核苷酸。此種多核苷酸可適合使用於本發明之RNA聚合酶之表現以及/或者表現用載體之製作以及/或者經轉形的細胞之製作等。在此，所謂編碼RNA聚合酶的多核苷酸係指例如藉由常規方法使該多核苷酸表現時可得到本發明之RNA聚合酶的蛋白質之多核苷酸。亦即，係指由對應於本發明之RNA聚合酶的蛋白質的胺基酸序列之鹼基序列所構成之多核苷酸。該發明所屬技術領域中具有通常知識者可依照該領域周知的密碼子表等，來容易地決定對應於預定的胺基酸序列之鹼基序列。此外，編碼本發明之RNA聚合酶的多核苷酸亦包含因密碼子的簡併而導致相異的多核苷酸。就多核苷酸而言，可為DNA、RNA等任意核酸，較佳係DNA。多核苷酸可藉由例如人工基因合成來合成。就藉由人工基因合成來合成DNA之方法而言，作為一例，可列舉：藉由化學合成來合成具有部分性重疊序列之2個以上的10nt至100nt之寡DNA後，藉由PCA(polymerase chain assembly；聚合酶鏈鎖組裝)法、或使用了其他酵素之方法等而連結後，在最終目標序列的兩端設計引子，藉由進行PCR來得到雙股DNA之方法，但無特別限定。藉由人工基因合成來合成RNA時，就一例而言，可藉由在上述雙股DNA合成時以在5’末端含有任意啟動子(T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子等)序列之形式合成雙股DNA，並以此DNA為模板利用特異性識別任意啟動子之RNA聚合酶(T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶等)進行活體外轉錄反應來合成RNA。
在更進一步的實施形態中，本發明係提供一種含有前述多核苷酸之載體。此種載體可適合使用於本發明之RNA聚合酶之表現以及/或者經轉形的細胞之製作等。上述載體可藉由將編碼上述RNA聚合酶的多核苷酸導入載體(例如表現載體、選殖載體等)來製作。可藉由任意方法進行多核苷酸導入載體，可列舉例如藉由限制酵素處理以及連接(ligation)來進行、藉由吉氏組裝(Gibson assembly)等無縫選殖(Seamless Cloning)來進行等。在特定實施形態中，本發明之載體可更含有會在宿主細胞發揮功能之啟動子、終止子、核糖體結合部位、以及抗藥性基因等要素。就抗藥性基因而言，可列舉例如對於胺苄青黴素(ampicillin)、康黴素(kanamycin)、四環素(tetracycline)等藥劑之抗性基因。在特定實施形態中，本發明之載體亦可含有使得與宿主細胞的基因體之同源重組能進行之要素。該載體若為使得本發明之RNA聚合酶之選殖以及/或者表現等能進行之載體，則任何載體均可，可列舉例如質體。就質體而言，可列舉pUC118、pUC18、pBR322、pBluescript、pLED-M1、p73、pGW7、pkk223-3等，但不限定於此。
在更進一步的實施形態中，本發明係提供一種藉由前述載體而轉形的細胞。此種細胞可適合使用於使編碼本發明之RNA聚合酶的基因表現。在特定的較佳的實施形態中，本發明之重組宿主細胞係可藉由使用上述表現載體將宿主細胞轉形而得。就該宿主細胞而言，可列舉大腸桿菌、酵母等，特佳係大腸桿菌。就大腸桿菌而言，可列舉例如大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5α、JM109、HB101、XL1Blue、PR1、BL21等。亦即，本發明中，較佳係將編碼上述RNA聚合酶的基因插入上述載體來作為表現載體，進一步藉由該表現載體將宿主細胞轉形。
在更進一步的實施形態中，亦提供一種製造前述RNA聚合酶之方法，係使用前述多核苷酸、前述載體、前述重組宿主細胞、以及/或者前述多核苷酸、前述載體、前述重組宿主細胞中的1種以上來製造前述RNA聚合酶。在特定實施形態中，使用前述載體將宿主細胞轉形後，將所得之重組宿主細胞使用任意培養裝置進行培養。就培養裝置而言，可列舉例如試管、燒瓶、缸式發酵槽等，但無特別限定。就培養所使用之培養基而言，可列舉例如：LB(Lysogeny broth；溶源性肉湯)培養基、2×YT(Yeast extract tryptone；酵母萃取物胰腖)培養基、TB(Terrific broth；極品肉湯)培養基等，但無特別限定。培養條件可適當地設定，就培養溫度而言，可為10℃至40℃，就培養時間而言，可為1小時至100小時。培養時可進行通氣以及/或者攪拌，亦能以批式培養、饋料批式培養中之任一者來培養。培養後，藉由離心分離等來回收細胞，藉由將回收的細胞破碎或溶解來萃取粗酵素液。就將細胞破碎或溶解之方法而言，使用周知之任何手法均可。就破碎方法而言，可列舉例如超音波處理、法式壓碎機或玻璃珠破碎之類的物理性破碎法，就溶解之方法而言，可列舉使用溶菌酶之類的酵素之方法，但無特別限定。從所得之粗酵素液取得精製RNA聚合酶之方法，係使用任何手法均可，可藉由供給至例如離心分離、超離心分離、超過濾、除核酸處理、鹽析、透析、各種管柱層析(離子交換管柱層析、疏水層析、親和層析、凝膠過濾管柱層析等)來單離本發明之RNA聚合酶。
在更進一步的實施形態中，亦提供一種試劑，係含有前述RNA聚合酶、前述多核苷酸、前述載體、前述重組宿主細胞、以及/或者前述RNA聚合酶、前述多核苷酸、前述載體、前述重組宿主細胞中的1種以上。在特定實施形態中，上述試劑可為液體，亦可為藉由冷凍乾燥等手法而去除了水分之固體。在特定實施形態中，上述試劑可置入任意容器中。在特定實施形態中，上述試劑亦可被分成1個以上之任意個數。在特定實施形態中，上述試劑可含有使得從前述多核苷酸、前述載體、前述重組宿主細胞能進行前述RNA聚合酶之表現的物質。就前述物質之一例而言，可列舉無細胞蛋白質合成試劑等，但無特別限定。就無細胞蛋白質合成試劑而言，可列舉使用細胞萃取液之無細胞蛋白質合成試劑、以及將參與轉譯反應之因子精製並混合後之重建型無細胞蛋白質合成系統，但無特別限定。就無細胞蛋白質合成試劑所含之物質而言，可列舉：細胞萃取液、或經精製之參與轉譯反應之各因子、以及20種胺基酸、ATP、GTP、磷酸肌酸、肌酸激酶、緩衝液(托立斯緩衝劑(Tris buffer)、磷酸緩衝劑、古德氏緩衝劑(Good’s buffer)等)、鹽類(乙酸鉀、乙酸鎂)、亞精胺、二硫蘇糖醇等，但無特別限定。就使用細胞萃取液之無細胞蛋白質合成試劑而言，可列舉例如大陽日酸公司之Musaibo Kun(註冊商標)等，可列舉源自兔網狀紅血球、小麥胚芽、昆蟲細胞、大腸桿菌、以及人細胞之各自的萃取液之無細胞蛋白質合成試劑，但無特別限定。就重建型無細胞蛋白質合成系統而言，可列舉例如GeneFrontier公司製造之PUREfrex(註冊商標)1.0等，但無特別限定。在特定實施形態中，上述試劑亦可含有活體外轉錄反應所需物質。就活體外轉錄反應所需物質而言，可列舉例如：緩衝液(托立斯緩衝劑、磷酸緩衝劑、古德氏緩衝劑等)、核糖核苷酸(ATP、CTP、GTP、UTP、修飾鹼基(受過去胺化、甲基化、甲氧基化、假尿苷化等修飾之鹼基)等)、帽類似物(ARCA(Anti-Reverse Cap Analog；抗反向帽類似物)、mCAP、CleanCap(註冊商標)Reagent AG、CleanCap(註冊商標)Reagent M6、CleanCap(註冊商標)Reagent AU(TriLink公司製造)等)、RNase抑制劑、焦磷酸酶、NaCl等鹽類、鎂離子等金屬離子、EDTA、二硫蘇糖醇、甘油、界面活性劑、亞精胺、直鏈狀或環狀DNA等，但無特別限定。在特定實施形態中，上述試劑亦可更含有轉錄後加帽(capping)所需物質。就轉錄後加帽所需物質而言，可列舉：加帽酵素與GTP、mRNA Cap 2’-O-甲基轉移酶、SAM(S-腺苷甲硫胺酸)、緩衝液(托立斯緩衝劑、磷酸緩衝劑、古德氏緩衝劑等)、NaCl、KCl等鹽類、鎂離子等金屬離子、EDTA、二硫蘇糖醇、甘油、界面活性劑等，但無特別限定。在特定實施形態中，上述試劑亦可更含有用來在RNA的3’末端附加poly-A所需物質。就附加poly-A所需物質而言，可列舉：ATP、poly-A聚合酶、緩衝液(托立斯緩衝劑、磷酸緩衝劑、古德氏緩衝劑等)、NaCl等鹽類、鎂離子、錳離子等金屬離子、EDTA、二硫蘇糖醇、甘油、界面活性劑等，但無特別限定。在特定實施形態中，上述試劑亦可更含有活體外轉錄反應之模板DNA的製備所需物質。就活體外轉錄反應之模板DNA的製備所需物質而言，可列舉：限制酵素、緩衝液(托立斯緩衝劑、磷酸緩衝劑、古德氏緩衝劑等)、NaCl等鹽類、鎂離子等金屬離子、EDTA、二硫蘇糖醇、甘油、界面活性劑、PCR酵素、寡DNA等，但無特別限定。在特定實施形態中，上述試劑亦可更含有活體外轉錄反應之模板DNA的精製所需物質。就模板DNA的精製所需物質而言，可列舉：DNA精製用珠、DNA精製用管柱等，但無特別限定。在特定實施形態中，上述試劑亦可更含有RNA的精製所需物質。就RNA的精製所需物質而言，可列舉：RNA精製用珠、RNA精製用管柱等，但無特別限定。
本發明係更提供一種RNA合成方法，係包含使前述RNA聚合酶作用於模板DNA。RNA合成係藉由活體外轉錄反應來進行。就活體外轉錄反應而言，可列舉：將直鏈狀或環狀DNA作為模板，使用前述RNA聚合酶來合成RNA之方法，但無特別限定。就活體外轉錄反應而言，可列舉：在緩衝液與核糖核苷酸存在下，將直鏈狀或環狀DNA作為模板，使用前述RNA聚合酶來合成RNA之方法，但無特別限定。就反應時添加的RNA聚合酶的濃度而言，例如能以0.1U/μL至20U/μL的範圍添加，但無特別限定。就直鏈狀或環狀DNA的濃度而言，例如能以1ng/μL至200ng/μL的範圍添加，但無特別限定。就活體外轉錄反應所使用之核糖核苷酸而言，除了ATP、CTP、GTP、UTP之外，還可列舉：受過去胺化、甲基化、甲氧基化、假尿苷化等修飾之修飾鹼基等，但無特別限定。就核糖核苷酸的濃度而言，例如能以0.1mM至20mM的範圍添加，但無特別限定。活體外轉錄反應時可更添加ARCA、mCAP、CleanCap(註冊商標)Reagent AG、CleanCap(註冊商標)Reagent M6、CleanCap(註冊商標)Reagent AU(TriLink公司製造)等帽類似物，但無特別限定。就帽類似物的濃度而言，例如能以0.1mM至20mM的範圍添加，但無特別限定。就活體外轉錄反應所使用之緩衝液而言，可列舉：托立斯緩衝劑、磷酸緩衝劑、古德氏緩衝劑等，但無特別限定。就緩衝液的濃度而言，例如能以5mM至500mM的範圍添加，但無特別限定。活體外轉錄反應時可更添加RNase抑制劑、焦磷酸酶等，但無特別限定。就RNase抑制劑的濃度而言，例如能以0.1U/μL至20U/μL的範圍添加，但無特別限定。就焦磷酸酶的濃度而言，例如能以0.0001U/μL至0.02U/μL的範圍添加，但無特別限定。活體外轉錄反應時可更添加NaCl等鹽類、鎂離子等金屬離子等，但無特別限定。就NaCl的濃度而言，例如能以1mM至200mM的範圍添加，但無特別限定。就鎂離子的濃度而言，例如能以0.1mM至20mM的範圍添加，但無特別限定。活體外轉錄反應時可更添加EDTA、二硫蘇糖醇、甘油、界面活性劑、亞精胺等，但無特別限定。就EDTA的濃度而言，例如能以0.0001mM至2mM的範圍添加，但無特別限定。就二硫蘇糖醇的濃度而言，例如能以0.1mM至20mM的範圍添加，但無特別限定。就甘油的濃度而言，例如能以0.1%至20%的範圍添加，但無特別限定。就界面活性劑的濃度而言，例如能以0.0001%至1%的範圍添加，但無特別限定。就亞精胺的濃度而言，例如能以0.1mM至20mM的範圍添加，但無特別限定。
此外，作為特定實施形態，本發明係更提供一種RNA合成方法，其中藉由前述RNA合成方法所合成之RNA中之dsRNA的比例係相對於在同一條件下使用對應的野生型RNA聚合酶所合成之RNA中之dsRNA的比例為未達90%。前述比例較佳係可為80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、13%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、或1%以下。前述比例係可藉由例如以[轉錄反應後之RNA中之dsRNA的比例之測定方法]所記載之方法，在同一條件下分別以對應的野生型RNA聚合酶與會成為測定對象之各突變型RNA聚合酶進行RNA合成並計算出RNA中之dsRNA的比例後，將數值進行比較來計算出。
此外，作為特定實施形態，本發明係更提供一種RNA合成方法，其中藉由前述RNA合成方法所合成之RNA的量(RNA產量)係相對於在同一條件下使用對應的野生型RNA聚合酶所合成之RNA的量為至少110%以上。前述比例較佳係可為120%以上、130%以上、140%以上、150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、或190%以上。前述比例係可藉由例如以[轉錄反應後之RNA中之dsRNA的比例之測定方法]所記載之方法，在同一條件下分別以對應的野生型RNA聚合酶與會成為測定對象之各突變型RNA聚合酶進行直到精製RNA的濃度測定為止的步驟，將精製RNA的液量與RNA濃度相乘而計算出RNA產量後，將這些RNA產量進行比較來計算出。
此外，作為特定實施形態，本發明亦更提供一種合成mRNA之方法，係使用前述RNA聚合酶來合成mRNA。亦即，在前述RNA合成方法中，RNA合成亦可為mRNA合成。就合成mRNA之方法而言，可列舉：在緩衝液與核糖核苷酸存在下，將直鏈狀或環狀DNA作為模板，使用前述RNA聚合酶來合成mRNA之方法，但無特別限定。就反應時添加的RNA聚合酶的濃度而言，例如能以0.1U/μL至20U/μL的範圍添加，但無特別限定。就直鏈狀或環狀DNA的濃度而言，例如能以1ng/μL至200ng/μL的範圍添加，但無特別限定。就mRNA合成所使用之核糖核苷酸而言，除了ATP、CTP、GTP、UTP之外，還可列舉：受過去胺化、甲基化、甲氧基化、假尿苷化等修飾之修飾鹼基等，但無特別限定。就核糖核苷酸的濃度而言，例如能以0.1mM至20mM的範圍添加，但無特別限定。就mRNA合成所使用之緩衝液而言，可列舉：托立斯緩衝劑、磷酸緩衝劑、古德氏緩衝劑等，但無特別限定。就緩衝液的濃度而言，例如能以5mM至500mM的範圍添加，但無特別限定。mRNA合成時可更添加RNase抑制劑、焦磷酸酶等，但無特別限定。就RNase抑制劑的濃度而言，例如能以0.1U/μL至20U/μL的範圍添加，但無特別限定。就焦磷酸酶的濃度而言，例如能以0.0001U/μL至0.02U/μL的範圍添加，但無特別限定。mRNA合成時可更添加NaCl等鹽類、鎂離子等金屬離子等，但無特別限定。就NaCl的濃度而言，例如能以1mM至200mM的範圍添加，但無特別限定。就鎂離子的濃度而言，例如能以0.1mM至20mM的範圍添加，但無特別限定。mRNA合成時可更添加EDTA、二硫蘇糖醇、甘油、界面活性劑、亞精胺等，但無特別限定。就EDTA的濃度而言，例如能以0.0001mM至2mM的範圍添加，但無特別限定。就二硫蘇糖醇的濃度而言，例如能以0.1mM至20mM的範圍添加，但無特別限定。就甘油的濃度而言，例如能以0.1%至20%的範圍添加，但無特別限定。就界面活性劑的濃度而言，例如能以0.0001%至1%的範圍添加，但無特別限定。就亞精胺的濃度而言，例如能以0.1mM至20mM的範圍添加，但無特別限定。在mRNA的5’末端含有帽結構，此時，就附加帽結構之方法而言，可列舉：轉錄後加帽、共轉錄加帽，但無特別限定。就轉錄後加帽而言，可列舉：使用加帽酵素、GTP、SAM來在mRNA的5’末端賦予Cap-0，進一步因應需要而使用mRNA Cap 2’-O-甲基轉移酶、SAM來將Cap-0轉換成Cap-1之方法等，但無特別限定。就共轉錄加帽而言，可列舉：使用ARCA、mCAP、CleanCap(註冊商標)Reagent AG、CleanCap(註冊商標)Reagent M6、CleanCap(註冊商標)ReagentAU(TriLink公司製造)等帽類似物之方法等，但無特別限定。就帽類似物的濃度而言，例如能以0.1mM至20mM的範圍添加，但無特別限定。就當在mRNA的3’末端存在poly-A但模板DNA不含poly-A時，在所合成之RNA的3’末端附加poly-A之方法而言，可列舉使用poly-A聚合酶之方法等，但無特別限定。
此外，作為特定實施形態，本發明係更提供一種mRNA合成方法，其中藉由前述mRNA合成方法所合成之mRNA中之dsRNA的比例係相對於在同一條件下使用對應的野生型RNA聚合酶所合成之mRNA中之dsRNA的比例為未達90%。前述比例較佳係可為80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、或10%以下。前述比例係可藉由例如以[轉錄反應後之RNA中之dsRNA的比例之測定方法]所記載之方法，在同一條件下分別以對應的野生型RNA聚合酶與會成為測定對象之各突變型RNA聚合酶進行mRNA合成並計算出mRNA中之dsRNA的比例後，將數值進行比較來計算出。
此外，作為特定實施形態，本發明係更提供一種mRNA合成方法，其中藉由前述mRNA合成方法所合成之mRNA的量(mRNA產量)係相對於在同一條件下使用對應的野生型RNA聚合酶所合成之mRNA的量為至少110%以上。前述比例較佳係可為120%以上、130%以上、140%以上、150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、或190%以上。前述比例係可藉由例如以[轉錄反應後之RNA中之dsRNA的比例之測定方法]所記載之方法，在同一條件下分別以對應的野生型RNA聚合酶與會成為測定對象之各突變型RNA聚合酶進行直到精製mRNA的濃度測定為止的步驟，將精製mRNA的液量與mRNA濃度相乘而計算出mRNA產量後，將這些mRNA產量進行比較來計算出。
此外，作為特定實施形態，本發明亦更提供一種合成非編碼RNA之方法，係使用前述RNA聚合酶來合成非編碼RNA。亦即，在前述RNA合成方法中，RNA合成亦可為非編碼RNA合成。就非編碼RNA而言，可列舉：microRNA、siRNA、piRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、SRPRNA、類mRNA之非編碼RNA、寡核苷酸等，但無特別限定。就非編碼RNA之合成方法而言，作為一例，可列舉：使用含有對應於目標非編碼RNA的DNA之模板DNA並藉由例如前述所記載之方法進行RNA合成之方法，但無特別限定。模板DNA係只要在含有對應於目標非編碼RNA的DNA的情況下，則任何模板DNA均可，較佳係在對應的DNA的上游含有本發明之RNA聚合酶會識別之啟動子(T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子等)序列。前述模板DNA係以任何方法來製備均可，可列舉例如：將質體進行限制酵素處理之方法、使用藉由人工基因合成所合成之DNA之方法，但無特別限定。就質體而言，若為含有對應於目標非編碼RNA的DNA之質體，則任何質體均可，亦可為含有上述所記載之啟動子序列、限制酵素位點、抗藥性基因等之質體。就上述質體之取得方法而言，作為一例，可列舉：將對應於目標非編碼RNA的DNA進行人工基因合成，並選殖於任意質體(該任意質體係在要插入上述DNA之部位的上游含有本發明之RNA聚合酶會識別之啟動子(T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子等)序列，在下游含有限制酵素位點，並因應需要而在任意位置含有抗藥性基因等)之後，將質體例如以任意方法轉形至任意宿主(較佳係大腸桿菌)，將所得之重組宿主細胞以任意方法培養後，萃取質體之方法，但無特別限定。可藉由將所得之質體以能使用上述質體所含之限制酵素位點的任意限制酵素進行限制酵素處理來製成直鏈狀，並藉由以任意方法進行精製來作為模板DNA。就使用藉由人工基因合成所合成之DNA之方法而言，可列舉例如：以含有對應於目標非編碼RNA的DNA以及在該DNA上游含有本發明之RNA聚合酶會識別之啟動子(T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子等)序列等之形式來人工基因合成雙股DNA，將進一步因應需要而藉由PCR等來增幅，並進一步因應需要而精製過的雙股DNA作為模板DNA之方法，但無特別限定。
此外，作為特定實施形態，本發明亦更提供一種合成基因編輯用的嚮導RNA之方法，係使用前述RNA聚合酶來合成基因編輯用的嚮導RNA。就基因編輯之方法而言，可列舉CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats；規律間隔短迴文重複序列簇)/Cas9(CRISPR associated protein 9；CRISPR關聯蛋白質9)系統等，但無特別限定。
此外，作為特定實施形態，本發明亦更提供一種將前述RNA聚合酶用於RNA醫藥的合成之方法。就RNA醫藥而言，可列舉：使用了mRNA、siRNA、microRNA、反義RNA、適體之RNA醫藥，但無特別限定。就將前述RNA聚合酶用於RNA醫藥的合成之方法之一例而言，可列舉：使用前述RNA聚合酶以及含有對應於RNA醫藥所用之任意RNA(mRNA、siRNA、microRNA、反義RNA、適體等)的DNA之模板DNA並藉由例如前述所記載之方法進行活體外轉錄反應之方法，但無特別限定。含有對應於任意RNA(mRNA、siRNA、microRNA、反義RNA、適體等)的DNA之模板DNA若為含有對應於任意RNA的DNA之DNA，則任何模板DNA均可，可為：在上述DNA的上游含有本發明之RNA聚合酶會識別之啟動子(T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子等)序列，因應需要而在上游含有5’UTR，在下游含有3’UTR以及poly-A、限制酵素位點等之模板DNA。前述模板DNA係以任何方法來製備均可，可使用該發明所屬技術領域中具有通常知識者所周知之方法，例如可將如上之針對非編碼RNA的合成所敘述之方法予以適當地變更來使用。
此外，作為特定實施形態，本發明亦更提供一種將前述RNA聚合酶用於恆溫增幅反應之方法。就恆溫增幅反應而言，可列舉NASBA法、TMA法等，但無特別限定。
此外，作為特定實施形態，本發明亦更提供一種進行基因檢查之方法，係使用前述RNA聚合酶來進行基因檢查。就進行基因檢查之方法而言，可列舉：藉由上述恆溫增幅反應等來將目標病原體之基因增幅並進行檢測，藉此來確認是否存在病原體之方法等，但無特別限定。
此外，作為特定實施形態，本發明亦更提供一種進行在活體內(in vivo)之蛋白質表現或在活體外進行無細胞蛋白質合成之方法，係使用前述RNA聚合酶來進行在活體內之蛋白質表現或在活體外進行無細胞蛋白質合成。就使用前述RNA聚合酶來進行在活體內之蛋白質表現之方法之一例而言，可列舉：將使用前述RNA聚合酶所合成之mRNA藉由任意方法轉染至任意細胞之方法，但無特別限定。在特定實施形態中，mRNA若為使得目標蛋白質表現能進行之mRNA，則任何mRNA均可，較佳係含有編碼目標蛋白質之RNA，亦可為在上游含有5’UTR並且在下游含有3’UTR以及poly-A等之mRNA。在特定實施形態中，就合成mRNA之方法而言，可藉由將含有編碼目標蛋白質之DNA之模板DNA作為模板，就一例而言，以前述所記載之方法進行活體外轉錄反應來合成，但無特別限定。前述模板DNA係以任何方法來製備均可，可使用該發明所屬技術領域中具有通常知識者所周知之方法，例如可將如上之針對非編碼RNA的合成所敘述之方法予以適當地變更來使用。在特定實施形態中，在進行蛋白質表現時，可在轉染後因應需要而進行培養等，但無特別限定。就使用前述RNA聚合酶進行在活體外之無細胞蛋白質合成之方法而言，作為一例，可列舉將前述RNA聚合酶、前述多核苷酸、前述載體、前述重組宿主細胞、以及/或者前述RNA聚合酶、前述多核苷酸、前述載體、前述重組宿主細胞中的1種以上添加於任意的無細胞蛋白質合成試劑之方法，但無特別限定。[實施例]
以下，依據實施例來具體說明本發明。但是，本發明不限定於下述實施例。
[實施例1　T7 RNA聚合酶表現用質體之製作]將編碼出在N末端附加有6×His標籤之野生型T7 RNA聚合酶之基因(序列編號2)進行人工合成，選殖於pkk223-3之EcoRI-PstI選殖位，製作成插入了編碼出在N末端附加有6×His標籤之野生型T7 RNA聚合酶之基因的質體。以後，將此表現用質體稱為pkk223-3-T7RNAP。藉由將pkk223-3-T7RNAP作為模板，使用表1所記載之引子以及KOD-Plus-Mutagenesis Kit(東洋紡製造)進行部位特異性突變導入，以製作各改變型T7 RNA聚合酶之表現用質體。複數個胺基酸經改變的各改變型T7 RNA聚合酶之表現用質體係藉由將經由部位特異性突變導入所得之改變型T7 RNA聚合酶之表現用質體作為模板並以同樣方法反復進行部位特異性突變導入來製作。
[表1]表1：突變導入所用之引子一覽
突變 正向引子 序列編號 反向引子 序列編號
A61E 3 4
A61D 5 4
A61S 6 4
A61G 7 4
A61P 8 4
D156N 9 10
N165S 11 12
N165E 13 12
N165R 14 12
N165P 15 12
D189N 16 17
S661N 18 19
所得之各質體具有編碼出在N末端附加有6×His標籤之改變型T7 RNA聚合酶之鹼基序列。
[實施例2　T7 RNA聚合酶之製備]在N末端附加有6×His標籤之野生型T7 RNA聚合酶以及各改變型T7 RNA聚合酶係全部皆以相同方法製備。以下，顯示野生型T7 RNA聚合酶之製備例作為一例。將pkk223-3-T7RNAP轉形至大腸桿菌JM109，在含有100μg/mL胺苄青黴素之LB洋菜培養基上，在37℃靜置培養20小時。將洋菜培養基上的單一菌落接種於含有100μg/mL胺苄青黴素之3mL的LB液體培養基中，於15mL試管中在37℃振盪培養20小時。將此培養液1mL接種於含有100μg/mL胺苄青黴素之80mL的TB液體培養基中，於500mL坂口燒瓶中在37℃振盪培養20小時後，藉由離心分離而從培養液回收菌體。將所得之菌體中的1g懸浮於10mL的破碎用緩衝劑(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、500mM NaCl、10% 甘油、1mM DTT、20mM 咪唑)中，使用超音波破碎機在冰上進行菌體破碎。將此菌體破碎液以20000×g在4℃離心分離20分鐘，回收上清液後，使用此上清液，以His GraviTrap(GE醫療(GE HealthCare)製造)進行精製。平衡化以及洗淨緩衝劑係使用(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、500mM NaCl、10%甘油、1mM DTT、20mM 咪唑)，溶析緩衝劑係使用(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、500mM NaCl、10% 甘油、1mM DTT、300mM 咪唑)。回收溶析流分(fraction)，取代成保存緩衝液(20mM KPO4(pH 7.7)、100mM NaCl、50% 甘油、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.01% Triton(註冊商標)X-100)，得到在N末端附加有6×His標籤之野生型T7 RNA聚合酶。上述製備例中，藉由在轉形時使用實施例1中所製作之各改變型T7 RNA聚合酶之表現用質體，來得到在N末端附加有6×His標籤之各改變型T7 RNA聚合酶。
[實施例3　T7 RNA聚合酶的比活性之測定]使用在N末端附加有His標籤之野生型T7 RNA聚合酶以及同樣在N末端附加有His標籤之各改變型T7 RNA聚合酶(A61E、A61D、A61S、A61P、D156N、N165S、D189N、S661N、A61E/D156N、A61E/N165S、A61E/D189N、A61E/S661N、A61P/N165S、A61P/D189N、A61P/S661N)，藉由前述活性測定方法來測定活性。就此時的模板DNA而言，使用含有T7啟動子序列之4kbp的dsDNA(序列編號20)。此dsDNA之T7啟動子下游的長度為約1kbp，所轉錄之RNA的長度成為約1kb。藉由測定A280的吸光度來計算出各改變型T7 RNA聚合酶的蛋白質濃度，並藉由以活性與蛋白質濃度進行除法來計算出比活性。將如此結果顯示於表2。
[表2]表2：各種突變體的比活性
比活性 (KU/mg) 相對於野生型之相對比活性
野生型 149 1.00
A61E 279 1.87
A61D 316 2.12
A61S 254 1.70
A61P 292 1.96
D156N 208 1.40
N165S 234 1.57
D189N 201 1.35
S661N 231 1.55
A61E/D156N 356 2.39
A61E/N165S 402 2.70
A61E/D189N 450 3.02
A61E/S661N 399 2.68
A61P/N165S 377 2.53
A61P/D189N 296 1.99
A61P/S661N 320 2.15
從表2的結果，確認了針對全部的改變型T7 RNA聚合酶，比起野生型，比活性提升。
[實施例4　T7 RNA聚合酶的耐熱性之測定]將在N末端附加有His標籤之野生型T7 RNA聚合酶以及同樣在N末端附加有His標籤之各改變型T7 RNA聚合酶(A61E、D156N、N165S、D189N、S661N)分別藉由保存緩衝液(20mM KPO4(pH 7.7)、100mM NaCl、50%甘油、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.01% Triton(註冊商標)X-100)而稀釋為50U/μL後，依據前述活性測定方法所記載之程序，測定保存前的活性值。將稀釋於前述保存緩衝液中之各T7 RNA聚合酶在50℃的保溫箱內熱處理5分鐘後，測定活性，從保存前後的活性值計算出殘留活性率。將如此結果顯示於表3。
[表3]表3：各種突變體的殘留活性率
在50℃熱處理5分鐘後之殘留活性率(%)
野生型 50
A61E 81
D156N 67
N165S 90
D189N 108
S661N 94
從表3的結果，確認了針對全部的改變型T7 RNA聚合酶，比起野生型，熱處理後之殘留活性率係變高。
[實施例5　轉錄反應後之dsRNA量之測定]以與實施例3同樣的活性測定方法來測定在N末端附加有His標籤之野生型T7 RNA聚合酶以及同樣在N末端附加有His標籤之各改變型T7 RNA聚合酶(A61E、A61D、A61S、A61G、A61P、D156N、N165S、N165E、N165R、N165P、D189N、S661N、A61E/D156N、A61E/N165S、A61E/D189N、A61E/S661N、A61P/N165S、A61P/D189N、A61P/S661N、A61E/D156N/N165S、A61E/N165S/D189N、A61E/N165S/S661N、A61P/D156N/N165S、A61P/N165S/D189N、A61P/N165S/S661N、A61E/D156N/N165S/D189N、A61E/N165S/D189N/S661N、A61P/D156N/N165S/D189N、A61P/N165S/D189N/S661N、A61E/D156N/N165S/D189N/S661N、A61P/D156N/N165S/D189N/S661N)的活性，分別藉由保存緩衝液(20mM KPO4(pH 7.7)、100mM NaCl、50%甘油、0.1mM EDTA、5mM DTT、0.01% Triton(註冊商標)X-100)而稀釋為50U/μL後，將1μL的各T7 RNA聚合酶(50U/μL)添加於49μL的反應液(以下，顯示酵素添加後之反應液50μL中之最終濃度)(40mM Tris-HCl(pH 8.0)、50mM NaCl、8mM MgCl2、5mM DTT、10ng/μL 模板DNA、0.4mM ATP、0.4mM CTP、0.4mM GTP、0.4mM UTP、0.4U/μL RNase抑制劑)中之後，以加熱塊在37℃進行反應1小時。模板DNA係使用含有T7啟動子、5’UTR、3’UTR、poly-A(100nt)且含有螢火蟲螢光素酶基因(Fluc)作為編碼序列(CDS)之dsDNA(序列編號21)。所生成之RNA係從5’側起由5’UTR、CDS(Fluc)、3’UTR、poly-A所構成之不具帽結構之約1.9kb的mRNA。在反應後添加2.5μL的Turbo(註冊商標)DNase(2U/μL)(賽默飛世爾科技公司製造)，進一步在37℃進行反應15分鐘。將此反應液使用Monarch(註冊商標)RNA Cleanup Kit(NEB公司製造)進行精製，得到精製RNA。測定所得之精製RNA之260nm的吸光度(A260)，假定A260為1時RNA濃度為40ng/μL來計算出RNA濃度。使用雙股RNA(dsRNA)ELISA套組(基於K1)(Exalpha Biologicals公司)，從針對所附的dsRNA對照組進行ELISA所得之測定值來製作檢量線。將各精製RNA稀釋為100ng/μL，進一步稀釋為複數種濃度後，以雙股RNA(dsRNA)ELISA套組(基於K1)進行ELISA，使用所得之測定值中會成為檢量線的範圍內之測定值，從上述所製作之檢量線來計算出dsRNA濃度。藉由進一步將dsRNA濃度除以RNA濃度，來計算出RNA中之dsRNA的比例(%)(w/w)。將如此結果顯示於表4。
[表4]表4：各種突變體所產生之RNA中之dsRNA的比例
RNA濃度 (ng/μL) dsRNA濃度 (ng/μL) RNA中之dsRNA的比例 (%)(w/w) 突變體的dsRNA量相對於野生型的dsRNA量的比例(%)
野生型 100 0.157 0.157 100
A61E 100 0.018 0.018 11
A61D 100 0.020 0.020 13
A61S 100 0.039 0.039 25
A61G 100 0.020 0.020 13
A61P 100 0.002 0.002 1
D156N 100 0.051 0.051 32
N165S 100 0.043 0.043 27
N165E 100 0.040 0.040 25
N165R 100 0.081 0.081 52
N165P 100 0.008 0.008 5
D189N 100 0.044 0.044 28
S661N 100 0.093 0.093 59
A61E/D156N 100 0.015 0.015 10
A61E/N165S 100 0.006 0.006 4
A61E/D189N 100 0.010 0.010 6
A61E/S661N 100 0.014 0.014 9
A61P/N165S 100 0.001 0.001 1
A61P/D189N 100 0.002 0.002 1
A61P/S661N 100 0.003 0.003 2
A61E/D156N/N165S 100 0.013 0.013 8
A61E/N165S/D189N 100 0.024 0.024 15
A61E/N165S/S661N 100 0.018 0.018 11
A61P/D156N/N165S 100 0.001 0.001 1
A61P/N165S/D189N 100 0.002 0.002 1
A61P/N165S/S661N 100 0.001 0.001 1
A61E/D156N/N165S/D189N 100 0.017 0.017 11
A61E/N165S/D189N/S661N 100 0.032 0.032 20
A61P/D156N/N165S/D189N 100 0.001 0.001 1
A61P/N165S/D189N/S661N 100 0.001 0.001 1
A61E/D156N/N165S/D189N/S661N 100 0.016 0.016 10
A61P/D156N/N165S/D189N/S661N 100 0.001 0.001 1
從表4的結果，確認了針對全部的改變型T7 RNA聚合酶，比起野生型，轉錄反應後之dsRNA量相對於RNA量的比例減少。[產業可利用性]
本發明可適合利用於各式各樣的目的之RNA合成。
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Claims (13)

  1. 一種核醣核酸聚合酶，係具有與序列編號1的胺基酸序列有著90%以上之一致性並且選自由相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個、第156個、第189個、第165個、以及第661個之位置的胺基酸所組成之群組中之至少1個胺基酸經改變之胺基酸序列。
  2. 一種核醣核酸聚合酶，係具有與序列編號1的胺基酸序列有著90%以上之一致性並且滿足選自由下列(i)至(v)所組成之群組中之至少1者之胺基酸序列：(i) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、甘胺酸、或脯胺酸；(ii) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(iii) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(iv) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸、麩胺酸、精胺酸、或脯胺酸；以及(v) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸。
  3. 如請求項1或2所記載之核醣核酸聚合酶，其中前述核醣核酸聚合酶具有與序列編號1的胺基酸序列有著90%以上之一致性的胺基酸序列，並且前述胺基酸序列係：(1) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、甘胺酸、或脯胺酸；(2) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(3) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(4) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸、麩胺酸、精胺酸、或脯胺酸；(5) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(6) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(7) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(8) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(9) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(10) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(11) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(12) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(13) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(14) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(15) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(16) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸；(17) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(18) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(19) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(20) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(21) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(22) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；(23) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為麩胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸；或者(24) 相當於序列編號1的胺基酸序列之第61個之位置的胺基酸為脯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第156個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，相當於序列編號1的胺基酸序列之第165個之位置的胺基酸為絲胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第189個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸，且相當於序列編號1的胺基酸序列之第661個之位置的胺基酸為天冬醯胺酸。
  4. 一種多核苷酸，係編碼如請求項1所記載之核糖核酸聚合酶。
  5. 一種載體，係含有如請求項4所記載之多核苷酸。
  6. 一種重組宿主細胞，係經使用如請求項5所記載之載體而轉形。
  7. 一種製造核糖核酸聚合酶之方法，係使用如請求項4所記載之多核苷酸、如請求項5所記載之載體、以及/或者如請求項6所記載之重組宿主細胞來製造核糖核酸聚合酶。
  8. 一種試劑，係含有如請求項1所記載之核糖核酸聚合酶、如請求項4所記載之多核苷酸、如請求項5所記載之載體、以及/或者如請求項6所記載之重組宿主細胞。
  9. 一種核糖核酸合成方法，係包含使如請求項1所記載之核糖核酸聚合酶作用於模板去氧核糖核酸(DNA)。
  10. 如請求項9所記載之核糖核酸合成方法，其中所合成之核糖核酸中之雙股核醣核酸(dsRNA)的比例係相對於在同一條件下使用對應的野生型核糖核酸聚合酶所合成之核糖核酸中之雙股核醣核酸的比例為未達90%。
  11. 如請求項9或10所記載之核糖核酸合成方法，其中前述核糖核酸合成為傳訊核糖核酸(mRNA)合成。
  12. 如請求項11所記載之核糖核酸合成方法，其中所合成之傳訊核糖核酸中之雙股核醣核酸的比例係相對於在同一條件下使用對應的野生型核糖核酸聚合酶所合成之傳訊核糖核酸中之雙股核醣核酸的比例為未達90%。
  13. 一種合成核糖核酸醫藥之方法，係使用如請求項1所記載之核糖核酸聚合酶來合成核糖核酸醫藥。
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