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TW202536171A - 用於治療ｎｇｆ相關病症之主動疫苗接種 - Google Patents

用於治療ｎｇｆ相關病症之主動疫苗接種

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TW202536171A
TW202536171A TW114107678A TW114107678A TW202536171A TW 202536171 A TW202536171 A TW 202536171A TW 114107678 A TW114107678 A TW 114107678A TW 114107678 A TW114107678 A TW 114107678A TW 202536171 A TW202536171 A TW 202536171A
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TW
Taiwan
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cmv
seq
antigen
amino acid
pain
Prior art date
Application number
TW114107678A
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English (en)
Inventor
勞倫特 伯納德 費雪
安德烈 加利
Original Assignee
德商百靈佳殷格翰獸藥股份有限公司
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Publication date
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Abstract

本發明係關於包含NGF抗原連接於經修飾之黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP）、特別係連接於包含嵌合CMV多肽之經修飾CMV VLP的獸醫學組成物，其用於治療犬科動物之NGF相關病症，特別是用於治療疼痛，諸如犬類與骨關節炎（OA）相關之疼痛。

Description

用於治療NGF相關病症之主動疫苗接種
本發明係關於包含NGF抗原連接於黃瓜嵌紋病毒（Cucumber Mosaic Virus；CMV）病毒樣粒子（virus-like particle；VLP）、特別是連接於包含嵌合CMV多肽之經修飾CMV VLP的組成物，其用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中，特別是用於治療疼痛（諸如傷害感受性疼痛、發炎相關疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（osteoarthritis；OA）相關疼痛）之方法中。疼痛可為急性或慢性疼痛。此外，本發明提供高度免疫原性疫苗組成物，其包含NGF抗原連接於黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP）、特別是連接於包含嵌合CMV多肽之經修飾CMV VLP，其用於對犬科動物進行針對NGF相關疾病，尤其是針對疼痛之主動免疫。
神經生長因子（Nerve Growth Factor；NGF）最初被發現係發育中的神經系統中之感覺及交感神經神經元之發育及維持的關鍵因素。事實上，在產前及產後早期，NGF係感覺及交感神經元存活所必需的。然而，在成年人中，NGF在外周的主要作用自對感覺及交感神經元的營養支援轉變為對傷害感受性神經元活動的調節。過去幾十年的臨床前及臨床研究已清楚地證明NGF在包括OA疼痛之多種急性及慢性疼痛狀態中的傷害感受器敏化中的重要作用。
骨關節炎（OA）相關疼痛會導致活動性下降及改變，其又會導致肌肉骨骼系統局部及遠端的退化。此外，OA的病理性過程，諸如關節囊增厚及纖維化，會加速影響運動能力之肌肉骨骼變化。最後，持續不斷的傷害感受性輸入CNS會導致軀體感覺系統變化及中樞敏化，其亦有助於疼痛之感知。在人類中，疼痛、中樞敏化及活動障礙之組合作用可能會對情感狀態產生負面影響，加劇焦慮、抑鬱、睡眠障礙及認知功能不全。患有OA的狗亦會出現非常相似的後果。
骨關節炎（OA）係一種緩慢進展的退行性關節疾病，其特徵為整個關節結構變化，包括關節軟骨、滑膜、軟骨下骨及關節周圍組分，經常導致疼痛及關節功能喪失。在犬科動物（狗）中，其被認為主要影響髖關節、膝關節及肘關節，儘管尚未進行過關於犬科動物OA在整個骨骼中的患病率的全面前瞻性研究。OA早年通常由發育疾病（例如髖關節發育不良）引發，但許多其他因素亦在其發展中發揮作用，包括飲食、遺傳、環境（包括創傷）、肥胖及年齡。OA與很大一部分犬科動物群體的臨床徵象有關，估計最少有20%至30%的狗受到臨床影響。該疾病目前無法治癒，會帶來與疼痛、行動障礙及生命品質下降有關之負面後果。
目前，疼痛之藥理學治療以非類固醇抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drug；NSAID）為中心。其等用於緩解疼痛及促進功能改善。全球範圍內，有數種NSAID被批准用於狗。儘管NSAID用途廣泛且在許多情況下具有明顯的益處，但其作為單一療法並不總是足夠有效。此外，持續進行的治療通常會產生副作用，包括嚴重的胃腸道及腎臟毒性。
最近，已提出使用抗NGF治療性mAb來緩解犬科動物OA患者的疼痛（WO2022/076712）。然而，儘管mAb治療有益處，但仍存在與mAb治療相關之某些挑戰(例如，成本高、抗藥物抗體（anti-drug antibodie；ADA）之風險、由於每劑含有大量蛋白質而導致的過敏反應及局部反應的風險）。此外，由於mAb的退化及有限生物可用性，其顯示出功效持續時間有限。
病毒樣粒子（VLP）已被提出且用作疫苗技術，尤其是用作誘導針對結合抗原之免疫反應的免疫學載劑（Zeltins A, Mol Biotechnol (2013) 53:92-107；Jennings GT及Bachmann MF, Annu Rev Pharmacol Toxicol (2009) 49:303-26, Jennings GT及Bachmann MF, Biol Chem (2008) 389:521-536）。最近，已使用化學連接子偶合技術（WO2016/062720）或融合技術（WO2020/128037）描述黃瓜嵌紋病毒（CMV，雀麥花葉病毒科（family Bromoviridae），黃瓜花葉病毒屬（genus Cucumovirus））病毒樣粒子（CMV VLP）在其表面呈遞包括自體抗原之抗原且引發針對某些目標之中和抗體反應。
然而，尚未證明可以有效治療犬類疼痛，尤其是藉由使用CMV VLP針對內源性NGF進行主動免疫。此類有效治療必須確保（i）達到足夠的抗體水平，以及（ii）尤其是在針對內源性NGF蛋白之治療的情況下，誘導之抗體反應是係可控且不可逆的。不存在關於NGF相關疾病，尤其是疼痛，例如與退行性關節病相關之疼痛，諸如OA相關疼痛，可藉由使用含有NGF之VLP，尤其是使用含有NGF之CMV VLP進行主動治療來控制的資訊。
儘管如此，藥物開發仍需要考慮挑戰及要求，特別是臨床試驗測試、產品註冊、市場推出及商業供應需求。在此，特別要提及的係控制產品特徵，諸如穩定性、儲放時限、溶解度、可製造性（包括可擴展性）、安全性、效力、生物可用性及其他藥理學特性，且其等係化學、製造及控制（CMC）過程的關鍵要素，該等要素對於具成本效益之方式提供足夠數量之此等產品以滿足此類最終需求係必需的（Pham NG, Int J Pharm, 2020, 585:119523）。即使在高效CMC製程所需的各種條件下，基於VLP疫苗之穩定性具有關聯性。不利地影響產物特徵的另一個非預期事件及問題分別為生物藥劑及疫苗的聚集（Roberts CJ, Current Opinion in Biotechnology, 2014, 30:211-217）。雖然聚集的疫苗在保持其天然結構的情況下仍可能引發免疫反應，儘管其因此可能仍然適用於一些實驗室研究，但對於為了臨床研究及市場而生產的GMP產品而言，其可接受度較低。
因此，基於目前在控制NGF相關病症（例如疼痛）方面的侷限性，特別是控制OA相關疼痛（無論是急性疼痛還是慢性疼痛），在提供有效的療法來控制出現的NGF相關病症以及滿足最終產品註冊對齊市場發佈的要求方面存在尚未滿足的需求。
本發明提供用於治療NGF相關病症，尤其用於治療犬科動物疼痛之組成物。特定言之，本發明提供用於對犬科動物進行主動免疫之組成物，該主動免疫係針對內源性NGF蛋白對此類經免疫犬科動物進行，以在此類犬科動物中產生針對此內源性NGF蛋白之高水平及持久的中和抗體，用於主動疼痛管理。特定言之，該疼痛選自以下之群：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地急性、慢性及/或難治性（refractory）相關疼痛。
已出人意料地發現，與先前技術的治療相比，使用本文所描述之組成物，特別是呈對犬科動物進行針對內源性NGF蛋白的主動免疫之形式係有利的。例如，本文所提供之治療藉由暫時克服自然免疫耐受性來誘導持久的中和抗NGF抗體力價。此外，此等長效中和抗NGF抗體無需頻繁投予更昂貴的重組單株抗體（mAb）以及藥劑。
此外，本文所使用的動物模型不僅表明投予本文所提供的含有NGF之黃瓜病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP）組成物可在活體內產生高力價之持久中和抗NGF抗體，而且提供了證據表明，用含有NGF之CMV VLP組成物進行主動免疫出人意料地減輕NGF相關病症，特別是急性以及慢性疼痛。甚至更出人意料的是，與抗體治療及NSAID治療相比，使用含有NGF之CMV VLP組成物的治療在疼痛管理方面更好。此外，即使治療針對的係自身蛋白（NGF蛋白），針對自身NGF蛋白誘導的免疫反應亦不會在犬科動物中引起任何副作用，同時可有效管理NGF相關疾病，尤其是疼痛。
因此，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
特定言之，NGF相關病症為疼痛，較佳地疼痛係選自由以下組成之群：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛。數據顯示，此類治療可以減輕急性、慢性及難治性疼痛。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地其中此類疼痛為OA相關疼痛。
本文所提供之動物數據顯示，含有NGF之CMV VLP組成物能夠治療，尤其是緩解急性、慢性以及難治性疼痛。根據另一態樣，急性疼痛為與退化性關節疾病相關之急性疼痛，較佳為急性OA相關疼痛。根據另一態樣，慢性疼痛為與退化性關節疾病相關之慢性疼痛，較佳為慢性OA相關疼痛。根據另一態樣，慢性疼痛為與退化性關節疾病相關之難治性慢性疼痛，較佳為難治性慢性OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為與退化性關節疾病相關之疼痛，較佳選自與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛及與退化性關節疾病相關之難治性慢性疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為OA相關疼痛，較佳選自急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛及難治性慢性OA相關疼痛。
含有NGF之CMV VLP組成物在重複或多次給藥後能夠增強中和性抗NGF抗體，且不會引起任何免疫耐受性，從而不會產生任何副作用或減弱輔助劑對內源性NGF蛋白的作用。重複投予後針對CMV VLP以及連接的NGF抗原缺乏免疫耐受性進一步改良在管理NGF相關病症方面，較佳地在管理疼痛方面之治療效益。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係以一個或數個劑量向該犬科動物投予。
在重複給藥的情況下，第一劑與第二劑之間的時間間隔較佳地為至少7天，較佳為至少14天，更佳為7至21天，更佳為14至21天係有益的。進一步追加投予通常以較長時間間隔提供。例如，若提供第三次投予，所選擇的第二次與第三次投予之間的時間間隔一般為二至六個月，例如三個月。對於任何進一步的追加投予，所選擇的時間間隔為至少三個月，較佳為三至六個月，較佳為四至六個月。
為緩解急性疼痛，一般投予一個或兩個劑量的含有NGF之CMV VLP組成物。若投予兩個劑量，通常選擇一至三週，較佳地兩至三週的時間間隔，以獲得最大治療效果。
為了緩解慢性疼痛，多次投予可增強治療效果。若投予三至四個劑量，則第一劑量與第二劑量之間的時間間隔通常為一至三週，較佳為二至三週，第二次與第三次投予之間的時間間隔為二至六個月，例如二至三個月，且任何第四次投予與第三次投予之間的時間間隔經選擇為三至六個月，較佳為四至六個月。
一般而言，含有NGF之CMV VLP組成物係全身性投予，較佳地皮下、肌肉內或經皮投予。在所選動物模型中，已選擇皮下投予。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係全身性投予，較佳皮下、肌肉內或經皮投予，較佳皮下投予。
CMV VLP與NGF抗原之間存在不同的鍵聯方式。NGF抗原可經由附著位點，藉由肽鍵，較佳地藉由基因融合與CMV VLP連接。例如，編碼NGF抗原之核苷酸序列可在編碼CMV VLP之核苷酸序列內框內選殖。或者，NGF抗原可經由附著位點之間的化學偶合，例如藉由至少一個非肽鍵連接至CMV VLP。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價肽鍵以融合方式連接。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。
CMV VLP典型地為由病毒外殼蛋白構成之大分子組裝體，其典型地包含每個VLP有180個蛋白質次單元。典型地且較佳地，此等次單元之相互作用導致具有固有重複組織之VLP的形成，從而允許呈遞NGF抗原之多個複本。此類外殼蛋白為例如由胺基酸序列SEQ ID NO: 39編碼或與SEQ ID NO: 39具有至少75%序列一致性之外殼蛋白。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   CMV VLP，其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該CMV VLP包含至少一個CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO: 39具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該NGF抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。較佳地，該NGF抗原及該CMV VLP透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。
如本文所描述之含有NGF之CMV VLP組成物的免疫原性可藉由添加輔助性T（Th）細胞抗原決定基來進一步增加。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基為來源於破傷風毒素之輔助性T細胞抗原決定基或為PADRE序列。此類輔助性T細胞抗原決定基較佳包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列或由其組成。此類輔助性T細胞抗原決定基可引入、較佳引入CMV VLP中，尤其引入CMV多肽中且較佳引入CMV VLP之外殼蛋白序列中。根據此等含有輔助性T細胞抗原決定基之CMV VLP的較佳具體實例，輔助性T細胞抗原決定基，較佳地來源於破傷風毒素或PADRE序列之輔助性T細胞抗原決定基置換CMV多肽之N端區。較佳地，輔助性T細胞抗原決定基，較佳地來源於破傷風毒素或PADRE序列之輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中較佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO: 39之胺基酸殘基2-12。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；及（c）   輔助性T細胞抗原決定基；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；及（c）   輔助性T細胞抗原決定基，其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列或由其組成；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；及（c）   輔助性T細胞抗原決定基，較佳為來源於破傷風毒素或PADRE序列之輔助性T細胞抗原決定基，較佳包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42或由其組成，置換CMV多肽之N端區，較佳地對應於SEQ ID NO:39之胺基酸殘基2-12的N端區；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個經修飾之CMV多肽，其中該至少一個經修飾之CMV多肽包含CMV多肽，較佳由CMV多肽組成，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO: 39具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該NGF抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。較佳地，該NGF抗原及該經修飾之CMV VLP透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。在較佳具體實例中，該經修飾之CMV多肽包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 48之胺基酸序列、較佳由其組成。
除了免疫原性特性之外或作為其替代，CMV VLP之物理化學特性可藉由插入一段連續的帶負電胺基酸來進一步改良，其中該等帶負電之胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸。此類CMV VLP在高溫及較高離子強度下顯示出經改良之穩定性。此外，當與NGF抗原結合時，此類CMV VLP-NGF抗原結合物不會形成聚集體，且在連接NGF抗原後在溶液中保持穩定，而先前技術的CMV VLP會形成一定量的聚集體及沉澱物。此類經改良（非聚集型）CMV VLP-NGF抗原結合物係藥物開發及產品註冊高度需要的。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電之胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，其中該多肽插入（i）之CMV多肽中；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點，較佳經由至少一個共價非肽鍵連接。
較佳地，獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸之該段連續的帶負電胺基酸插入該CMV多肽中與SEQ ID NO: 39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間。
該段連續的帶負電胺基酸通常具有3至10個胺基酸之長度，且根據另一態樣，可僅由麩胺酸組成。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸（較佳3至10個胺基酸殘基）、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電之胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，其中該多肽插入該CMV多肽中與SEQ ID NO: 39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點，較佳經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸序列、較佳由其組成。
根據另一態樣，該段連續的帶負電胺基酸進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子位於該段連續的帶負電胺基酸之N端處，且該第二胺基酸連接子位於該段連續的帶負電胺基酸之C端處，且其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地選自由以下組成之群：i）聚甘胺酸連接子（G-連接子），其具有長度n=2至10的胺基酸序列(Gly)n；ii）甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；及iii）胺基酸連接子（GS*-連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。
根據另一態樣，包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽由SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 51組成。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症（較佳疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點且進一步包含至少一個輔助性T細胞抗原決定基，且其中此類CMV VLP包含SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 12之胺基酸序列、較佳由其組成；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點，較佳藉由至少一個非肽鍵連接。
在用於本文所描述之治療犬科動物之NGF相關病症的方法中的任何含有NGF之CMV VLP組成物中所使用的NGF抗原可為在犬科動物中表現出所需技術效果的任何NGF抗原。較佳地，NGF抗原為犬科動物NGF抗原（cNGF）。根據另一態樣，在用於根據本發明之治療犬科動物之NGF相關病症的方法中的含有NGF之CMV VLP組成物中所使用的NGF抗原包含以下或較佳由以下組成：選自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者的胺基酸序列，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者具有至少90%、較佳至少95%序列一致性的胺基酸序列。
根據另一態樣，在用於根據本發明之治療犬科動物之NGF相關病症的方法中的含有NGF之CMV VLP組成物中所使用的NGF抗原包含以下或較佳由以下組成：選自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:55中之任一者的胺基酸序列，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:55中之任一者具有至少90%、較佳至少95%序列一致性的胺基酸序列。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域中具有通常知識者通常所理解相同之含義。本文所描述及所揭示之具體實例、較佳具體實例及/或極佳具體實例應適用於所有態樣及其他具體實例、較佳具體實例及/或極佳具體實例，不論是否再次具體提及或不論是否為了簡潔而避免其重複。如本文所使用，冠詞「一（a）」及「一（an）」係指冠詞之文法對象中之一個或多於一個（亦即，至少一個）。除非上下文另有明確指示，否則如本文所使用之術語「或」應理解為意謂「及/或」。
病毒樣粒子（VLP）：如本文所使用，術語「病毒樣粒子（VLP）」係指無複製性或無感染性的粒子，較佳為無複製性及無感染性的病毒粒子，或係指無複製性或無感染性的結構，較佳為類似於病毒粒子的無複製性及無感染性結構，較佳為病毒殼體。如本文所使用，術語「無複製性」係指不能複製VLP所含的基因體。如本文所使用，術語「無感染性」係指不能輸入宿主細胞內。根據本發明之病毒樣粒子由於缺乏病毒基因體或基因體功能的全部或一部分而無複製性且無感染性。根據本發明之病毒樣粒子可含有不同於其基因體之核酸。重組產生的病毒樣粒子典型地含有宿主細胞源RNA。根據本發明之病毒樣粒子的典型及較佳具體實例為由本發明之多肽構成的病毒殼體。病毒樣粒子典型地為由病毒外殼蛋白構成的大分子組裝體，其典型地包含每個病毒樣粒子有60、120、180、240、300、360或超過360個蛋白質次單元。典型地且較佳地，此等次單元的相互作用引起具有內在重複性組織之病毒殼體或病毒樣蛋白殼結構的形成。病毒樣粒子的一個特徵為其高度有序及其次單元的重複性排列。
黃瓜嵌紋病毒（CMV）之病毒樣粒子：術語「CMV病毒樣粒子」或「CMV VLP」係指包含至少一種CMV多肽或較佳基本上由其組成或較佳由其組成的病毒樣粒子。較佳地，CMV病毒樣粒子包含該CMV多肽作為殼體結構之主要蛋白質組分，且甚至更佳地作為殼體結構之唯一蛋白質組分。典型地且較佳地，CMV病毒樣粒子類似於CMV之殼體結構。CMV病毒樣粒子無複製性及/或無感染性，且至少缺乏編碼CMV複製機制的一或多種基因，且典型地亦缺乏編碼負責病毒附著至宿主或進入宿主中之一或多種蛋白質的一或多種基因。此定義亦包括病毒樣粒子，其中前述一或多種基因仍存在，但無活性。使CMV病毒樣粒子無複製性及/或無感染性的較佳方法係藉由物理或化學滅活（例如UV照射、甲醛處理）進行。較佳地，CMV VLP缺少編碼CMV複製機制之一或多種基因，且亦缺少編碼負責病毒附著至宿主或進入宿主之一或多種蛋白質的一或多種基因。再次更佳地，無複製性及/或無感染性病毒樣粒子係藉由重組基因技術獲得。根據本發明之CMV之重組產生的病毒樣粒子典型地且較佳地不包含病毒基因體。較佳地，CMV VLP為由CMV外殼蛋白或CMV多肽組成之大分子組裝體，其典型地包含每個VLP有180個外殼蛋白或CMV多肽次單元。典型地且較佳地，如本文所使用，CMV之VLP包含至少一種CMV多肽、基本上由其組成或替代地由其組成，該至少一種CMV多肽包含以下或較佳由以下組成：（i）CMV外殼蛋白之胺基酸序列；或（ii）突變胺基酸序列，其中該突變胺基酸序列與該CMV外殼蛋白具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%、且再更佳至少99%之序列一致性。
經修飾之CMV病毒樣粒子（VLP）：術語「經修飾之CMV病毒樣粒子」係指包含如本文所定義及所描述之至少一種經修飾之CMV多肽、至少一個嵌合CMV多肽或至少一種抗原CMV融合多肽的病毒樣粒子。典型地且較佳地，經修飾之CMV VLP類似於CMV之殼體結構。經修飾之CMV VLP無複製性及/或無感染性，且至少缺乏編碼CMV複製機制的一或多種基因，且典型地亦缺乏編碼負責病毒附接至宿主或進入宿主中之一或多種蛋白質的一或多種基因。此定義亦包括經修飾之病毒樣粒子，其中前述一或多種基因仍存在，但無活性。較佳地，無複製性及/或無感染性的經修飾之病毒樣粒子係藉由重組基因技術獲得，且典型地且較佳地不包含病毒基因體。較佳地，經修飾之CMV VLP為由如本文所描述之經修飾CMV多肽構成的大分子組裝體，且其典型地且較佳地包含180個此類蛋白質次單元，每個VLP分別包括經修飾之CMV多肽、嵌合多肽或抗原性CMV融合多肽。因此，在一較佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含180個經修飾之CMV多肽，較佳由其組成。在另一具體較佳實例中，該經修飾之CMV VLP包含180個嵌合CMV多肽，較佳由其組成。在另一較佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP為包含至少一種、較佳複數種抗原性CMV融合多肽之嵌紋性融合CMV VLP。
嵌紋性融合CMV VLP：術語「嵌紋性融合CMV VLP」係指如本文所定義且包含如本文所定義之至少一種、較佳複數種抗原性CMV融合多肽的經修飾之CMV VLP。包含超過一種物種及種類的多肽之病毒樣粒子稱為嵌紋性VLP。因此，在另一較佳具體實例中，該組成物包含該嵌紋性融合CMV VLP，較佳由其組成，其中該嵌紋性融合CMV VLP包含如本文所定義之至少一種，較佳複數種抗原性CMV融合多肽，且進一步包含選自全部如本文所定義的CMV多肽、經修飾CMV多肽及CMV蛋白質之多肽。
多肽：如本文所使用，術語「多肽」係指由胺基酸單體構成的聚合物，該等胺基酸單體藉由醯胺鍵（亦稱為肽鍵）呈線性連接。其指胺基酸分子鏈，而非指特定長度的產物。因此，多肽的定義內包括肽、二肽、三肽、寡肽及蛋白質。如本文所使用，典型地且較佳地，術語「多肽」亦應指如之前所定義的多肽，且涵蓋修飾，諸如轉譯後修飾，包括但不限於醣基化。在一較佳具體實例中，如本文所使用，該術語「多肽」應指如之前所定義之多肽且不涵蓋修飾，諸如轉譯後修飾，諸如醣基化。特定言之，具有生物活性的該等肽隨後甚至可在活體內發生該等修飾，諸如該等醣基化，例如藉由細菌發生。
黃瓜嵌紋病毒（CMV）多肽，CMV多肽：如本文所使用，術語「黃瓜嵌紋病毒（CMV）多肽」係指包含以下或較佳由以下組成之多肽：（i）黃瓜嵌紋病毒（CMV）之外殼蛋白的胺基酸序列；或（ii）突變胺基酸序列，其中該突變胺基酸序列及該CMV外殼蛋白顯示至少90%、較佳至少91%、92%、93%或94%、更佳至少95%的序列一致性，再更佳至少98%且進一步更佳至少99%的序列一致性。典型地且較佳地，CMV多肽能夠在表現後藉由自組裝形成CMV病毒樣粒子。
黃瓜嵌紋病毒（CMV）的外殼蛋白（CP）：如本文所使用，術語「黃瓜嵌紋病毒（CMV）的外殼蛋白（CP）」係指自然界中存在的黃瓜嵌紋病毒之外殼蛋白。由於黃瓜嵌紋病毒的宿主範圍極其廣泛，因此CMV的許多不同病毒株及分離株係已知的。該等病毒株及分離株的外殼蛋白序列已被確定且已為所屬技術領域中具有通常知識者所知。該等CMV外殼蛋白（CP）的序列描述於且可擷取於已知數據庫中，諸如Genbank，www.dpvweb.net，或www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/。CMV之CP的特定實例描述於WO 2016/062720第12頁第8行至第13頁第25行中，其揭示內容以引用的方式明確併入本文中。CMV外殼蛋白的極佳實例及具體實例提供於SEQ ID NO:39中。因此，較佳地，如本文所使用，術語「黃瓜嵌紋病毒（CMV）之外殼蛋白」係指CMV外殼蛋白之胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO: 39或與SEQ ID NO: 39具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、再更佳至少90%、再更佳至少91%、92%、93%或94%、再更佳至少95%、仍更佳至少96%或97%、仍更佳至少98%及仍再進一步更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列。
值得注意的是，此等病毒株及分離株在不同蛋白域（包括外殼蛋白的N端）具有高度相似的外殼蛋白序列。特定言之，完整定序的所有CMV分離株中98.1%在其外殼蛋白序列的前28個胺基酸共用超過85%序列一致性，且完整定序的所有CMV分離株中仍有79.5%在其外殼蛋白序列的前28個胺基酸內共用超過90%序列一致性。
經修飾之CMV多肽：如本文所使用，術語「經修飾之CMV多肽」係指包含CMV多肽及輔助性T細胞抗原決定基或較佳由CMV多肽及輔助性T細胞抗原決定基組成的CMV多肽。典型地，經修飾之CMV多肽能夠在表現後藉由自組裝形成CMV病毒樣粒子。較佳地，經修飾之CMV多肽為重組修飾的CMV多肽且能夠在大腸桿菌中表現後藉由自組裝形成CMV病毒樣粒子。
嵌合CMV多肽：如本文所使用，術語「嵌合CMV多肽」係指如本文所定義且根據本發明的多肽，且包含CMV多肽、較佳由CMV多肽組成，其中該CMV多肽如本文所定義及描述經修飾以包含多肽，該多肽包含一段帶負電之獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸的連續胺基酸、較佳由該段連續的帶負電胺基酸組成，且該CMV多肽視需要經進一步修飾以包含輔助性T細胞抗原決定基，所有組分如本文所定義及描述。典型地且較佳地，嵌合CMV多肽能夠在表現後藉由自組裝形成經修飾之CMV病毒樣粒子。因此，在一較佳具體實例中，該嵌合CMV多肽能夠藉由自組裝形成經修飾之CMV病毒樣粒子，典型地且較佳地在表現後藉由自組裝形成。較佳地，嵌合CMV多肽為重組修飾的CMV多肽且能夠在大腸桿菌中表現後藉由自組裝形成CMV病毒樣粒子。典型地且較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區，其中該CMV多肽的該經置換之N端區係由5至15個連續胺基酸組成。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區，且其中該CMV多肽的該經置換之N端區係由5至15個連續胺基酸組成，較佳由9至14個、9至13個或10至13個連續胺基酸組成，更佳由11至13個連續胺基酸組成，且最佳由11、12或13個連續胺基酸組成。
抗原性CMV融合多肽：如本文所使用，術語「抗原性CMV融合多肽」係指包含CMV多肽，較佳由CMV多肽組成的多肽，其中該CMV多肽經修飾以包含如本文所定義及描述的抗原性多肽，且視需要進一步經修飾以包含輔助性T細胞抗原決定基。典型地且較佳地，抗原性CMV多肽能夠在表現後藉由自組裝形成經修飾的CMV病毒樣粒子。因此，在較佳具體實例中，該抗原性CMV融合多肽能夠藉由自組裝，典型地且較佳地藉由在表現後（典型地且較佳在大腸桿菌中表現後）自組裝來形成經修飾之CMV病毒樣粒子。在另一較佳具體實例中，該抗原性CMV融合多肽與選自如本文所定義之經修飾之CMV多肽、CMV多肽及CMV蛋白的多肽共表現，以藉由自組裝，典型地且較佳地藉由在表現後（典型地且較佳在大腸桿菌中表現後）自組裝來形成嵌紋性融合CMV CMV。典型地且較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區，其中該CMV多肽的該經置換之N端區係由5至15個連續胺基酸組成。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區，且其中該CMV多肽的該經置換之N端區係由5至15個連續胺基酸組成，較佳由9至14個、9至13個或10至13個連續胺基酸組成，更佳由11至13個連續胺基酸組成，且最佳由11、12或13個連續胺基酸組成。
CMV多肽的N端區：如本文所使用，術語「CMV多肽的N端區」係指該CMV多肽的N端，且特別係指CMV外殼蛋白的N端，或該CMV多肽或該CMV外殼蛋白的N端區，但若該CMV多肽或該外殼蛋白包含N端甲硫胺酸殘基，則該N端區始於該CMV多肽或該CMV外殼蛋白之N端的第二個胺基酸。較佳地，在該CMV多肽或該外殼蛋白包含N端甲硫胺酸殘基之情況下，自實用視角看，編碼甲硫胺酸之起始密碼子通常將缺失且添加至輔助性T(Th)細胞抗原決定基之N端。更佳地，所闡述甲硫胺酸與輔助性T細胞抗原決定基之間可視需要插入一個、兩個或三個其他胺基酸，較佳插入一個胺基酸，用於選殖目的。
重組多肽：在本發明之上下文中，術語「重組」當在多肽之上下文中使用時，係指藉由包含重組DNA技術之至少一個步驟的方法獲得的多肽。典型地且較佳地，重組多肽係在原核表現系統中產生。對於技術人員顯而易見的是，原核表現系統（諸如大腸桿菌）中表現的重組產生之多肽可包含N端甲硫胺酸殘基。在重組多肽成熟期間，N端甲硫胺酸殘基典型地使重組多肽在表現宿主中分裂。然而，N端甲硫胺酸的分裂可能不完全。因此，重組多肽的製備可包含具有N端甲硫胺酸殘基與不具有N端甲硫胺酸殘基的在其他方面相同之多肽的混合物。典型地且較佳地，重組多肽製劑包含小於10%、更佳小於5%且仍更佳小於1%的具有N端甲硫胺酸殘基之重組多肽。
重組修飾的病毒樣粒子：在本發明之上下文中，術語「重組修飾的病毒樣粒子」係指藉由包含重組DNA技術之至少一個步驟的方法獲得的經修飾之病毒樣粒子（VLP）。
突變胺基酸序列：術語「突變胺基酸序列」係指藉由將一組經定義之突變引入待突變之胺基酸序列中而獲得的胺基酸序列。在本發明之上下文中，待突變的該胺基酸序列典型地且較佳地為CMV外殼蛋白的胺基酸序列。因此，突變胺基酸序列與CMV外殼蛋白的胺基酸序列存在至少一個胺基酸殘基的差異，其中該突變胺基酸序列與待突變的該胺基酸序列顯示至少90%的序列一致性。典型地且較佳地，該突變胺基酸序列與待突變的該胺基酸序列顯示至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。較佳地，該突變胺基酸序列與待突變的該序列存在至多11、10、9、8、7、6、4、3、2或1個胺基酸殘基的差異，其中更佳地，該差異係選自插入、缺失及胺基酸交換。較佳地，突變胺基酸序列與CMV外殼蛋白的胺基酸序列存在至少一個胺基酸的差異，其中較佳地，該差異為胺基酸交換。
術語「對應(corresponding/correspond/corresponds)」當在本文中用於分別描述多肽及胺基酸序列內之胺基酸殘基之特定位置的關係時，係指胺基酸序列內的胺基酸殘基位置對應於另一胺基酸序列中指定的特定胺基酸殘基，此可藉由序列比對加以鑑別，典型地且較佳地藉由使用BLASTP演算法、最佳使用標準設定來鑑別。典型且較佳的標準設定為：期望臨限值：10；字長：3；查詢範圍內的最大匹配：0；矩陣：BLOSUM62；空位成本：存在11，延伸1；組成性調整：有條件的組成性評分矩陣調整。
序列一致性：所指定之兩個胺基酸序列的序列一致性係基於兩個序列的比對來測定。用於測定序列一致性的演算法可供技術人員使用。較佳地，兩個胺基酸序列的序列一致性係使用可公開獲得的電腦同源性程式測定，諸如「BLAST」程式（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）或「CLUSTALW」（http://www.genome.jp/tools/clustalw/），且在此較佳藉由NCBI主頁http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi所提供的「BLAST」程式、使用其中所提供的預設設定來測定。典型且較佳的標準設定為：期望臨限值：10；字長：3；查詢範圍內的最大匹配：0；矩陣：BLOSUM62；空位成本：存在11，延伸1；組成性調整：有條件的組成性評分矩陣調整。
胺基酸交換：術語「胺基酸交換」係指胺基酸序列中之指定胺基酸殘基與具有不同化學結構之任何其他胺基酸殘基、較佳與另一個蛋白型胺基酸殘基交換。因此，與胺基酸的插入或缺失相比，胺基酸交換不改變該胺基酸序列的胺基酸總數。
如本文所使用，縮寫為pI的術語「等電點」係指分子不攜帶淨電荷或經由統計方式呈電中性時的pH。特定言之，術語「等電點」在本文中用於指本發明中所用且由胺基酸構成之抗原不攜帶淨電荷或經由統計方式呈電中性時的pH。在pH低於其pI時，此類抗原攜帶淨正電荷；在pH高於其pI時，其攜帶淨負電荷。典型地且較佳地，當提及pI值時，且特別當提及本發明之抗原及本揭示案之抗原的pI值時，該等pI值係藉由將特定蛋白質及抗原的一級胺基酸序列分別輸入Gasteiger等人所述的ExPASy Compute pI/MW工具中來測定（Gasteiger, E.、Hoogland, C.、Gattiker, A.、Duvaud, S.、Wilkins, M. R., Appel, R. D., & Bairoch, A., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, （存在於）John M. Walke（編）: The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)）。因此，本文中提及的ExPASy Compute pI/MW工具係指Gasteiger等人所述的工具。該工具計算所指明之Swiss-Prot/TrEMBL條目或使用者輸入之胺基酸序列的理論等電點pI及Mw。蛋白質pI係利用Bjellqvist等人所述的胺基酸pK值計算，其藉由檢查多肽在含有9.2M及9.8M尿素之固定pH梯度凝膠環境中、在pH 4.5至7.3之間、在15℃或25℃下的遷移來定義（Bjellqvist, B.等人，1993, Electrophoresis 14:1023-1031；Bjellqvist, B.等人，1994, Electrophoresis 15:529-539）。
抗原決定基：術語「抗原決定基」係指多肽或抗原的連續或不連續部分，其中該等部分可被抗體或被MHC分子之背景內的T細胞受體特異性結合。就抗體而言，特異性結合排除非特異性結合，但不一定排除交叉反應性。抗原決定基典型地在抗原位點獨有的空間構形中包含5至20個胺基酸。
輔助性T（Th）細胞抗原決定基：如本文所使用且可互換使用的術語「輔助性T細胞抗原決定基或Th細胞抗原決定基」係指能夠被輔助Th細胞識別的抗原決定基。典型地且較佳地，如本文所使用，術語「Th細胞抗原決定基」係指能夠結合至至少一種、較佳超過一種II類MHC分子的Th細胞抗原決定基。測定肽序列是否為Th細胞抗原決定基的最簡單方式係量測該肽結合至個別II類MHC分子的能力。此可根據肽與已知Th細胞抗原決定基肽競爭結合II類MHC分子的能力來量測。HLA-DR分子的代表性選擇描述於例如Alexander J等人, Immunity (1994) 1:751-761中。Th細胞抗原決定基對II類MHC分子的親和力應為至少10-5M。存在於不同個體中的一組代表性II類MHC分子提供於Panina-Bordignon P等人, Eur J Immunol (1989) 19:2237-2242中。因此，如本文所使用，術語「Th細胞抗原決定基」較佳係指在免疫及追加免疫後產生可量測之T細胞反應的Th細胞抗原決定基。此外，且又更佳地，如本文所使用，術語「Th細胞抗原決定基」較佳係指能夠以至少500 nM的親和力結合於至少一種、較佳至少兩種且甚至更佳至少三種DR對偶基因的Th細胞抗原決定基，該等DR對偶基因選自DR1、DR2w2b、DR3、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DR52a、DRw53、DR2w2a；且較佳選自DR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a（如Alexander J等人, Immunity (1994) 1:751-761及其中所引用的參考文獻中所述）；評估該等親和力的較佳結合分析係Sette A等人, J Immunol (1989) 142:35-40所述的結合分析。在甚至又更佳的方式中，如本文所使用，術語「Th細胞抗原決定基」係指能夠以至少500 nM的親和力結合於至少一種、較佳至少兩種且甚至更佳至少三種DR對偶基因的Th細胞抗原決定基，該等DR對偶基因選自DR1、DR2w2b、DR4w4、DR4w14、DR5、DR7、DRw53、DR2w2a（如Alexander J等人, Immunity (1994) 1:751-761及其中引用的參考文獻中所述）；評估該等親和力的較佳結合分析係Sette A等人, J Immunol (1989) 142:35-40所述的結合分析。Th細胞抗原決定基已有描述且已為所屬技術領域中具有通常知識者所知，諸如Alexander J等人, Immunity (1994) 1:751-761；Panina-Bordignon P等人, Eur J Immunol (1989) 19:2237-2242；Calvo-Calle JM等人, J Immunol (1997) 159:1362-1373；及Valmori D等人, J Immunol (1992) 149:717-721。
胺基酸連接子：如本文所使用，術語「胺基酸連接子」係指完全由胺基酸殘基組成的連接子。胺基酸連接子的胺基酸殘基係由此項技術中已知的全L型或全D型天然存在之胺基酸或非天然胺基酸或其混合物構成。胺基酸連接子的胺基酸殘基較佳為全L型或全D型天然存在之胺基酸或其混合物。在一較佳具體實例中，該胺基酸連接子係由天然存在之α胺基酸（皆呈其L-組態）組成。
G-連接子：如本文所使用，術語「G-連接子」係指僅由甘胺酸胺基酸殘基組成的胺基酸連接子。根據本發明的G-連接子包含至少兩個甘胺酸殘基及至多十個甘胺酸殘基。
GS-連接子：如本文所使用，術語「GS-連接子」係指僅由甘胺酸及絲胺酸胺基酸殘基組成的胺基酸連接子。根據本發明的GS-連接子包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸殘基。典型地且較佳地，GS-連接子的長度為至多30個胺基酸。
GS*-連接子：如本文所使用，術語「GS*-連接子」係指胺基酸連接子，其包含至少一個甘胺酸、至少一個絲胺酸及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸殘基。典型地且較佳地，GS*-連接子的長度為至多30個胺基酸。
如本文所使用，術語「胺基酸」係指含有官能基胺（-NH2）及羧酸（-COOH）及其兩性離子且典型地且較佳地，含有各胺基酸所特有之側鏈的有機化合物。術語「胺基酸」典型地且較佳地包括天然存在之胺基酸，諸如蛋白型胺基酸（藉由RNA轉譯產生）、非蛋白型胺基酸（藉由其他代謝機制產生，例如轉譯後修飾）、標準或典型胺基酸（直接由遺傳密碼的密碼子編碼）及非標準或非典型胺基酸（不直接由遺傳密碼編碼）。天然存在之胺基酸包括非真核及真核胺基酸。如本文所使用，術語「胺基酸」亦包括化學合成的非天然胺基酸；alpha-（α-）、beta-（β-）、gamma-（γ-）及delta-（δ-）等胺基酸以及任何比率的其混合物；以及若適用，諸如alpha-（α-）胺基酸、胺基酸的任何異構體形式，亦即，其D-立體異構體及L-立體異構體（替代地根據(R)及(S)命名法闡述）以及任何比率（包括1:1的外消旋比率）的其混合物。術語「D-立體異構體」、「L-立體異構體」、「D-胺基酸」或「L-胺基酸」係指胺基酸的手性α碳。在一較佳具體實例中，術語胺基酸係指α胺基酸，較佳係指天然存在之α胺基酸，更佳係指天然存在之呈L-組態的α胺基酸。
相關：如本文所使用，術語「相關（associated）」或「相關性（association）」係指兩個分子藉以接合在一起的所有可能方式，較佳為化學相互作用。化學相互作用包括共價及非共價相互作用。非共價相互作用之典型實例為離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價相互作用例如基於共價鍵，諸如酯、醚、磷酸酯、碳-磷鍵、碳-硫鍵，諸如硫醚，或醯亞胺鍵。
第一附著位點：如本文所使用，「第一附著位點」一詞係指天然存在於病毒樣粒子或人工添加至病毒樣粒子中且可與第二附著位點連接的元件。第一附著位點較佳為蛋白質、多肽、胺基酸、肽、糖、聚核苷酸、天然或合成聚合物、次級代謝物或化合物，諸如生物素、螢光素、視黃醇、地高辛（digoxigenin）、金屬離子、苯基甲基磺醯氟，或化學反應性基團，諸如胺基、羧基、硫氫基、羥基、胍基、組胺醯基或其組合。作為第一附著位點之化學反應性基團的一較佳具體實例為胺基酸殘基的胺基，較佳為離胺酸殘基之側鏈的胺基。在另一較佳具體實例中，該第一附著位點為該VLP中天然存在之胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，該第一附著位點為該VLP中非天然存在之胺基酸殘基。第一附著位點典型地位於表面上，且較佳位於VLP的外表面上。多個第一附著位點存在於表面上，較佳存在於VLP的外表面上，典型地呈重複性組態。在一較佳具體實例中，第一附著位點經由至少一個共價鍵、較佳經由至少一個肽鍵與VLP締合。在另一較佳具體實例中，第一附著位點天然存在於VLP。或者，在一較佳具體實例中，第一附著位點係人工添加至VLP中。在一極佳具體實例中，該第一附著位點係該VLP多肽之胺基酸序列之離胺酸殘基的胺基。在另一極佳具體實例中，該第一附著位點為該VLP多肽之胺基酸序列之離胺酸殘基的胺基，其中該離胺酸殘基天然存在於該VLP多肽中。在另一極佳具體實例中，該第一附著位點為該VLP多肽之胺基酸序列的離胺酸殘基之胺基，其中該離胺酸殘基並非天然存在於該VLP多肽中但經人工添加，其藉由例如添加至該VLP多肽或藉由取代該VLP多肽中天然存在之胺基酸達成。在另一極佳具體實例中，該第一附著位點為該VLP多肽中天然存在之胺基酸殘基。在另一極佳具體實例中，該第一附著位點為該VLP多肽中非天然存在但經人工添加之胺基酸殘基，該人工添加係藉由例如添加至該VLP多肽中或藉由取代該VLP多肽中天然存在之胺基酸達成。
第二附著位點：如本文所使用，「第二附著位點」一詞係指天然存在於抗原或人工添加至抗原中且可與第一附著位點連接的元件。抗原的第二附著位點較佳為蛋白質、多肽、肽、胺基酸、肽、糖、聚核苷酸、天然或合成聚合物、次級代謝物或化合物，諸如生物素、螢光素、視黃醇、地高辛、金屬離子、苯基甲基磺醯氟，或化學反應性基團，諸如胺基、羧基、硫氫基、羥基、胍基、組胺醯基或其組合。作為第二附著位點之化學反應性基團的一較佳具體實例為硫氫基，較佳為半胱胺酸殘基中的硫氫基。在另一較佳具體實例中，該第二附著位點為該抗原中天然存在之胺基酸殘基。在另一較佳具體實例中，該第二附著位點為該抗原中非天然存在之胺基酸殘基。因此，術語「具有至少一個第二附著位點的抗原」係指包含抗原及至少一個第二附著位點的構築體。然而，特別是對於非天然存在於抗原內的第二附著位點而言，此類構築體典型地且較佳地進一步包含「連接子」。在另一較佳具體實例中，第二附著位點經由至少一個共價鍵、較佳經由至少一個肽鍵與抗原締合。在另一具體實例中，第二附著位點天然存在於抗原內。在另一更佳具體實例中，第二附著位點經由連接子人工添加至抗原中，其中該連接子包含半胱胺酸或替代地由半胱胺酸組成。較佳地，連接子與抗原藉由肽鍵融合。在一極佳實施例中，第二附著位點為硫氫基，較佳為半胱胺酸殘基之硫氫基。較佳地，連接子與抗原藉由肽鍵融合。在另一極佳具體實例中，該第二附著位點為天然存在於該抗原中之胺基酸殘基。在另一極佳具體實例中，該第二附著位點為非天然存在於該抗原中但經人工添加之胺基酸殘基，該人工添加例如藉由添加至該抗原或藉由取代天然存在於抗原中之胺基酸達成。
連接：如本文所使用，術語「連接（linked）」或「鍵聯（linkage）」係指至少一個第一附著位點與至少一個第二附著位點藉以接合在一起的所有可能方式，較佳為化學相互作用。化學相互作用包括共價及非共價相互作用。非共價相互作用之典型實例為離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價相互作用例如基於共價鍵，諸如酯、醚、磷酸酯、碳-磷鍵、碳-硫鍵，諸如硫醚，或醯亞胺鍵。在某些較佳具體實例中，第一附著位點與第二附著位點係透過至少一個共價鍵、較佳透過至少一個非肽鍵且甚至更佳經由獨有的非肽共價鍵連接。在其他較佳具體實例中，第一附著位點及第二附著位點係透過至少一個共價鍵、較佳透過至少一個肽鍵且甚至更佳透過獨有的肽共價鍵連接。然而，如本文所使用，術語「連接」不僅應指至少一個第一附著位點與至少一個第二附著位點的直接鍵聯，而且替代地且較佳地係指至少一個第一附著位點與至少一個第二附著位點透過中間分子且在此典型地且較佳地藉由使用至少一個、較佳一個異雙官能交聯劑達成的間接鍵聯。在其他較佳具體實例中，第一附著位點及第二附著位點係透過至少一個共價鍵、較佳透過至少一個肽鍵且甚至更佳透過獨有的肽鍵連接。在一較佳具體實例中，第一附著位點及第二附著位點係透過一個代表第一附著位點與第二附著位點之直接肽鍵聯的肽鍵連接。在另一較佳具體實例中，第一附著位點及第二附著位點係透過代表第一附著位點與第二附著位點之肽鍵聯的獨有肽鍵、藉助於如本文所描述之胺基酸連接子連接。倘若抗原，較佳地抗原性多肽藉助於融合插入VLP多肽內，藉助於如本文所描述之一或兩個相同或不同胺基酸連接子，要麼出現第一附著位點及第二附著位點之兩個直接肽鍵聯，要麼出現第一附著位點及第二附著位點之一或兩個肽鍵聯。
連接子：如本文所使用，「連接子」使第二附著位點與抗原締合或已包含第二附著位點或由第二附著位點組成。較佳地，如本文所使用，「連接子」已包含第二附著位點，典型地且較佳地作為一個胺基酸殘基，較佳地作為半胱胺酸殘基。較佳連接子為含有至少一個胺基酸殘基的連接子，或甚至更佳為完全由胺基酸殘基組成的連接子。連接子的胺基酸殘基較佳地由此項技術中已知的全L型或全D型天然存在之胺基酸或非天然胺基酸或其混合物構成。根據本發明之連接子的更佳具體實例為包含硫氫基或半胱胺酸殘基的分子且因此，本發明內亦涵蓋此類分子。適用於本發明的其他連接子為包含C1-6烷基-、環烷基（諸如環戊基或環己基）、環烯基、芳基或雜芳基部分的分子。此外，較佳包含C1-C6烷基-、環烷基-(C5、C6)、芳基-或雜芳基-部分及其他胺基酸的連接子亦可用作本發明的連接子且應涵蓋於本發明之範圍內。連接子與抗原較佳藉助於至少一個共價鍵、更佳藉助於至少一個肽鍵締合。
抗原：本發明之抗原為神經生長因子（NGF）抗原。因此，如本文所使用，術語「抗原」係指典型地且較佳地能夠在MHC分子呈遞時由抗體或T細胞受體（TCR）結合的神經生長因子（NGF）抗原。
抗原性多肽：如本文所使用，術語「抗原性多肽」係指如本文所定義之神經生長因子（NGF）抗原，且其為如本文所定義之抗原性CMV融合多肽中所包含的多肽。術語「抗原性多肽」及「抗原性NGF多肽」可在本文中互換使用。
有序及重複性抗原陣列：如本文所使用，術語「有序及重複性抗原陣列」係指抗原的一種重複模式，典型地且較佳地，其特徵為抗原的空間排列相對於經修飾之CMV VLP而言呈高階均一性。在本發明之一個具體實例中，重複模式可為幾何模式。本發明之某些具體實例（諸如與經修飾之CMV VLP連接的抗原）為適合的有序及重複性抗原陣列之典型及較佳實例，此外，其具有嚴格重複的抗原副晶序，較佳地，間距為1至30奈米、較佳為2至15奈米、甚至更佳為2至10奈米、甚至又更佳為2至8奈米且進一步更佳為1.6至7奈米。
偶合效率：病毒樣粒子與特定抗原的偶合效率係藉由對偶合反應進行SDS-PAGE來測定。與偶合反應之組分對應的庫馬斯藍染色譜帶強度係藉由密度測定法測定且用於計算偶合效率。偶合效率定義為（i）與該抗原偶合之VLP多肽之量相對於（ii）VLP多肽之總量的比率。典型地且較佳地，該偶合效率為至少5%、10%、較佳為至少15%、更佳為至少20%、25%或至少30%，且又更佳為至少35%或至少40%。偶合效率亦可用與經修飾之CMV VLP連接之抗原的總數目表示。偶合效率可依賴於抗原的性質，且與經修飾之CMV VLP連接之抗原的總數典型地且較佳地為至少5個、至少7個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個及至少50個抗原。
神經生長因子（NGF）抗原：如本文所使用，術語「神經生長因子（NGF）抗原」係指包含生物活性之NGF抗原。如本文所使用，生物活性NGF抗原一般係指與NGF高親和力受體TrkA結合及/或活化NGF受體信號傳導路徑的能力。當以本發明組成物形式向犬科動物投予時，該NGF抗原典型地且較佳地能夠誘導該犬科動物產生抗NGF抗體，其中該等抗NGF抗體較佳能夠在試管內分析中中和神經生長因子（NGF）之生物活性，較佳如本文所描述（參見實施例6）。如本文所使用及當提及NGF抗原時，術語「生物活性」係指NGF抗原在細胞增殖分析中的活性，其中較佳地，該細胞增殖分析係基於NGF依賴性人類紅白血病TF-1細胞株，其中仍更佳地，該細胞增殖分析係在基本上如本文實施例6中所描述的條件下進行。此外，NGF抗原典型地係指顯示生物活性的包含以下、較佳由以下組成之多肽：犬科動物或貓科動物神經生長因子之胺基酸序列或來自任何其他物種、較佳來自非人類動物的相應異種同源物。特定言之，其係指包含犬科動物或貓科動物神經生長因子之胺基酸序列或來自任何其他物種、較佳來自非人類動物之相應異種同源物、較佳由該胺基酸序列或相應異種同源物組成的多肽，或係指與犬科動物或貓科動物神經生長因子之胺基酸序列或來自任何其他物種、較佳來自非人類動物之相應異種同源物具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%及再更佳至少98%序列一致性的多肽。來自各種動物物種的較佳NGF抗原為犬科動物NGF（cNGF）、貓科動物NGF（fNGF）、馬科動物NGF（eNGF）、牛科動物NGF（bNGF）及豬科動物NGF（pNGF），較佳為犬科動物NGF（cNGF）或貓科動物NGF（fNGF），且該等NGF抗原包含以下、較佳由以下組成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58的多肽，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%且再更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列。
內源性或自身NGF蛋白：如本文所使用，術語「內源性或自身NGF蛋白」係指接受根據本發明之治療的動物之NGF蛋白。在此上下文中，術語「自身NGF」及「內源性NGF」可互換使用。
含有NGF之CMV VLP組成物：如本文所使用之術語「含有NGF之CMV VLP組成物」係指一種包含以下之組成物：（a）包含至少一個附著位點之CVM VLP及（b）包含至少一個第二附著位點之至少一個NGF抗原，且其中（a）及（b）經由該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
佐劑：如本文所使用，術語「佐劑」係指免疫反應的刺激劑及/或典型地允許在宿主中產生儲槽的物質，其當與本發明之組成物、疫苗或醫藥組成物分別組合時，可達成更強的免疫反應。具有不同作用機制的不同類型之佐劑已有描述且能夠增強抗原特異性抗體反應（Pulendran B等人, 2021, Nature Reviews Drug Discovery 20:454-475）。典型且較佳的佐劑為礦物鹽（例如氫氧化鋁、磷酸鋁）、微晶酪胺酸、乳液、微粒、皂素（Quil A）、細胞介素、免疫增強劑、微生物組分/產品、脂質體、複合物及黏膜佐劑，其係已知的且描述於例如Adjuvant Compendium NIAID and VAC（nih.gov）或Aguilar等人（Aguilar JC等人, 2007, Vaccine 25:3752-3762）、Gerdts（Gerdts V, 2015, Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 128:456-463)及Pasquale等人（Pasquale等人, 2015, Vaccines 3:320-343）。如本文所使用，術語「佐劑」亦可包含佐劑之混合物。病毒樣粒子有時描述為佐劑。然而，如本申請案之上下文內所用，術語「佐劑」係指並非本發明之經修飾之病毒樣粒子的佐劑。相反，「佐劑」係指本發明組成物、疫苗或醫藥組成物中的另一種不同組分。
免疫刺激物質：如本文所使用，術語「免疫刺激物質」係指能夠誘導及/或增強免疫反應的物質。如本文所使用，免疫刺激物質包括但不限於類鐸受體活化物質及誘導細胞介素分泌的物質。類鐸受體活化物質包括但不限於免疫刺激核酸、肽聚醣、脂多醣、脂胞壁酸、咪唑并喹啉化合物、鞭毛蛋白及免疫刺激有機物質，諸如紫杉醇。
免疫刺激核酸（ISS-NA）：如本文所使用，術語「免疫刺激核酸」係指能夠誘導及/或增強免疫反應的核酸。免疫刺激核酸包含核糖核酸，特別是去氧核糖核酸，其中核糖核酸與去氧核糖核酸均可為雙股或單股的。較佳的ISS-NA為去氧核糖核酸，其中更佳地，該去氧核糖核酸為單股的。較佳地，免疫刺激核酸含有至少一個包含未甲基化C的CpG模體。極佳的免疫刺激核酸包含至少一個CpG模體，其中該至少一個CpG模體包含至少一個、較佳一個CG二核苷酸或較佳由其組成，其中C未甲基化。較佳但非必要地，該CG二核苷酸為回文序列之一部分。術語免疫刺激核酸亦指含有經修飾之鹼基（較佳為4-溴-胞嘧啶）的核酸。在本發明之上下文中，特別較佳為能夠刺激樹突狀細胞產生IFN-α的ISS-NA。適用於本發明之目的的免疫刺激核酸描述於例如WO2007/068747A1中。
寡核苷酸：如本文所使用，術語「寡核苷酸」係指包含兩個或更多個核苷酸、較佳約6至約200個核苷酸且更佳20個至約100個核苷酸且最佳20至40個核苷酸的核酸序列。寡核苷酸為聚核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸且較佳選自（a）未修飾之RNA或DNA，及（b）經修飾之RNA或DNA。修飾可包含主鏈或核苷酸類似物。寡核苷酸較佳選自由以下組成之群：（a）單股及雙股DNA；（b）作為單股與雙股區之混合物的DNA；（c）單股及雙股RNA；（d）單股與雙股區之混合物的RNA；及（e）包含DNA及RNA的雜交分子，該DNA及RNA為單股的或更佳為雙股的或單股與雙股區之混合物。較佳的核苷酸修飾/類似物選自由以下組成之群：（a）肽核酸、（b）肌苷、（c）三苯甲基化鹼基、（d）硫代磷酸酯、（e）烷基硫代磷酸酯、（f）5-硝基吲哚去氧核糖呋喃酮醯基、（g）5-甲基去氧胞嘧啶及（h）5,6-二氫-5,6-二羥基去氧胸苷。硫代磷酸酯化核苷酸受保護以防止在細胞或生物體中降解且因此為較佳的核苷酸修飾。完全由磷酸二酯結合之核苷酸組成的未修飾之寡核苷酸典型地比經修飾之核苷酸具有更大活性且因此在本發明之上下文中通常較佳。最佳為完全由磷酸二酯結合之寡核苷酸組成的寡核苷酸，其中更佳地，該等寡核苷酸為單股的。更佳為能夠刺激細胞、較佳樹突狀細胞產生IFN-α的寡核苷酸。能夠刺激細胞產生IFN-α的極佳寡核苷酸係選自A型CpG及C型CpG。更佳為不具有Cap的RNA分子。
CpG模體：如本文所使用，術語「CpG模體」係指核苷酸的一種模式，包括未甲基化的中心CpG，亦即，未甲基化的CpG二核苷酸，其中C未甲基化；該中心CpG被側接於中心CpG（側接於該中心CpG的3'及5'側）的至少一個鹼基（較佳一或兩個核苷酸）包圍。典型地且較佳地，如本文所使用，CpG模體包含以下或替代地由以下組成：未甲基化CpG二核苷酸及位於其5'及3'端的兩個核苷酸。不受理論束縛，側接CpG的鹼基將活性的有效部分賦予CpG寡核苷酸。
含有未甲基化CpG之寡核苷酸：如本文所使用，術語「含有未甲基化CpG之寡核苷酸」或「CpG」係指含有至少一個CpG模體的寡核苷酸，較佳係指寡去氧核苷酸。因此，CpG含有至少一個未甲基化胞嘧啶、鳥嘌呤二核苷酸。較佳的CpG刺激/活化脊椎動物骨髓衍生細胞，例如對其具有促有絲分裂作用，或誘導或增加其細胞介素表現。舉例而言，CpG可適用於活化B細胞、NK細胞及抗原呈遞細胞，諸如樹突狀細胞、單核球及巨噬細胞。較佳地，CpG係指含有未甲基化胞嘧啶及其3'後之鳥苷的寡去氧核苷酸，較佳係指單股寡去氧核苷酸，其中該未甲基化胞嘧啶與該鳥苷藉由磷酸酯鍵連接，其中較佳地，該磷酸酯鍵為磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵，且其中更佳地，該磷酸酯鍵為磷酸二酯鍵。CpG可包括核苷酸類似物，諸如含有硫代磷酸酯鍵的類似物，且可為雙股或單股的。一般而言，雙股分子在活體內更穩定，而單股分子具有增強的免疫活性。較佳地，如本文所使用，CpG為長度至少約十個核苷酸且包含至少一個CpG模體的寡核苷酸，其中更佳地，該CpG的長度為10至60個、更佳15至50個、仍更佳20至40個、仍更佳約30個且最佳恰好30個核苷酸。CpG可由甲基化核苷酸及/或未甲基化核苷酸組成，其中該至少一個CpG模體包含至少一個CG二核苷酸，其中C未甲基化。CpG亦可包含甲基化及未甲基化序列段，其中該至少一個CpG模體包含至少一個CG二核苷酸，其中C未甲基化。極佳地，CpG係指單股寡去氧核苷酸，其含有未甲基化胞嘧啶及其3'後的鳥苷，其中該未甲基化胞嘧啶與該鳥苷藉由磷酸二酯鍵連接。CpG可包括核苷酸類似物，諸如含有硫代磷酸酯鍵的類似物，且可為雙股或單股的。一般而言，磷酸二酯CpG為如下文所示的A型CpG，而硫代磷酸酯穩定化CpG為B型CpG。在本發明之上下文中，較佳的CpG寡核苷酸為A型CpG。
A型CpG：如本文所使用，術語「A型CpG」或「D型CpG」係指包含至少一個CpG模體的寡去氧核苷酸（ODN）。A型CpG優先刺激T細胞活化及樹突狀細胞成熟且能夠刺激IFN-α產生。在A型CpG中，至少一個CpG模體的核苷酸係藉由至少一個磷酸二酯鍵連接。A型CpG包含至少一個經磷酸二酯鍵CpG模體，該CpG模體可藉由硫代磷酸酯鍵結的核苷酸側接於其5'端及/或較佳側接於其3'端。較佳地，CpG模體，及在此較佳地，包含至少一個、較佳兩個核苷酸的CG二核苷酸及其緊鄰側接區，係由磷酸二酯核苷酸構成。較佳的A型CpG完全由磷酸二酯（PO）鍵核苷酸組成。典型地且較佳地，聚G模體包含以下或替代地由以下組成：至少一個鳥苷（G），較佳為至少三個、至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個G，最佳為至少10個G。較佳地，本發明之A型CpG包含回文序列或替代地由回文序列組成。
封裝：如本文所使用，術語「封裝」係指聚陰離子巨分子或免疫刺激物質分別相對於核心粒子及VLP而言的狀態。如本文所使用，術語「封裝」包括可為共價的（例如藉由化學偶合）或非共價（例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等）的結合。該術語亦包括聚陰離子巨分子的圍封或部分圍封。因此，聚陰離子巨分子或免疫刺激物質可在實際結合不存在的情況下、尤其是共價結合不存在的情況下被VLP圍封。在較佳具體實例中，VLP內部封裝至少一種聚陰離子巨分子或免疫刺激物質，最佳以非共價方式。在該等免疫刺激物質為核酸（較佳為DNA）的情況下，術語封裝意指該核酸係核酸酶水解不可及的，較佳係去氧核糖核酸酶水解（例如去氧核糖核酸酶I或全能核酸酶（Benzonase））不可及的，其中較佳地，該可及性係如WO2003/024481A2之實施例11-17中所述加以分析。
有效量：如本文所使用，術語「有效量」係指實現所需生物作用所必需的量或足以實現所需生物作用的量。組成物（或替代地，醫藥組成物）的有效量將為達成此選擇結果的量，且此類量可由所屬技術領域中具有通常知識者按常規測定。有效量可依據所投予的特定組成物及個體的體型而變化。所屬技術領域中具有通常知識者憑經驗而無需過度實驗便可確定本發明之特定組成物的有效量。較佳地，術語「有效量」係指一種量，其（i）治療或預防本文所描述之特定疾病或病症；（ii）減輕、改善或消除本文所描述之特定疾病或病症的一或多種症狀；或（iii）預防或延遲本文所描述之特定疾病或病症之一或多種症狀的發作。
犬科動物：如本文所使用，術語「犬科動物」係指家狗（狗）。
獸醫組成物：如本文所使用，術語「獸醫組成物」係指適用於非人類動物的組成物。
NGF相關病症：如本文所使用，術語「NGF相關病症」係指由NGF/TrkrA受體路徑之任何功能不全或調節異常引起之任何病症。NGF相關病症包括但不限於疼痛，諸如傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳病症（諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、僵直性脊柱炎、血清反應陰性（非類風濕性）關節病、非關節風濕病及關節周圍病症）相關之疼痛、與退化性關節疾病（例如關節炎或骨關節炎）相關之疼痛。此類疼痛可具有急性、慢性及/或難治性性質。
疼痛：如本文所使用，術語「疼痛」係指任何病因之疼痛，包括急性及慢性疼痛，及任何具有發炎性組分之疼痛。疼痛之實例包括傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳病症（諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、僵直性脊柱炎、血清反應陰性的（非類風濕性）關節病、非關節風濕病及關節周圍病症）相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛（例如關節炎或骨關節炎相關疼痛）。
急性疼痛：如本文所使用，術語「急性疼痛」係指突然或緊急疼痛。急性疼痛例如可由手術或急性發炎引起。
慢性疼痛：如本文所使用，術語「慢性疼痛」係指持續存在且通常持續超過六個月之疼痛。慢性疼痛不僅僅是急性疼痛的時間連續。在持續性損傷的情況下，CNS之神經迴路的功能及結構重組會導致感知及行為的長期變化。此類疼痛在受傷或生病後仍會持續，疼痛信號會在神經系統中活躍數週、數月或數年。
難治性疼痛：如本文所使用，術語「難治性疼痛」係指無法藉由習知止痛藥（包括抗炎化合物，諸如NSAID、皮質類固醇及類鴉片鎮痛劑）緩解的疼痛。
傷害感受性疼痛：如本文所使用，術語「傷害感受性疼痛」係指由於損傷、手術或影響組織的疾病（例如關節炎）而刺激疼痛受體而引起的疼痛。傷害感受性疼痛亦包括慢性疼痛。較佳類型之傷害感受性疼痛為骨關節炎相關疼痛、類風濕性關節炎疼痛。
發炎性疼痛或發炎性相關疼痛：如本文所使用，術語「發炎性疼痛或發炎性相關疼痛」係指因組織損傷及炎症（例如術後疼痛、創傷、關節炎）而出現的自發性疼痛過敏。發炎性疼痛係一種傷害感受性疼痛，係由發炎介體活化敏化的傷害感受器引起的。通常當炎症消退時疼痛就會改善。
手術後疼痛：如本文所使用，術語「手術後疼痛」係指由於外部創傷（諸如個體組織的割傷、穿刺、切開、撕裂或傷口）而引起或導致的疼痛（包括由於所有外科手術而引起的疼痛，無論是侵入性還是非侵入性的）。如本文所使用，手術後疼痛不包括沒有外部身體創傷而發生（出現或起源）的疼痛。
與肌肉骨胳疾病相關之疼痛：如本文所使用，術語「與肌肉骨骼疾病相關之疼痛」係指與肌肉骨胳病症（諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、僵直性脊柱炎、血清反應陰性（非類風濕性）關節病、非關節風濕病）相關之疼痛。
與退化性關節疾病相關之疼痛：如本文所使用，術語「與退化性關節疾病相關之疼痛」係指與關節炎相關之疼痛或骨關節炎相關疼痛。
骨關節炎（OA）相關疼痛：如本文所使用，術語「骨關節炎（OA）相關疼痛或OA相關疼痛）」係指一種慢性關節疾病，其特徵為關節軟骨損失、關節囊增厚及關節周圍新骨形成（骨贅形成），最終導致疼痛及肢體功能不全。在犬科動物中，OA的症狀通常不具有特異性且包括：i）活動障礙、不願運動、整體活動減少、僵硬、跛行、無法跳躍、步態改變（諸如「兔子跳」），ii）操作時感到疼痛、行為變化（諸如攻擊性或不適跡象）。
慢性難治性OA相關疼痛：如本文所使用，術語「慢性難治性OA相關疼痛」係指對習知治療（包括NSAID、皮質類固醇及類鴉片）無反應或僅有輕微反應的慢性疼痛。
治療：如本文所使用，術語「治療（treatment）」、「治療（treat）」、「治療（treated）」或「治療（treating）」係指療法。治療係指獲得有益或所需臨床結果之方法。出於本發明之目的，有益或所需臨床結果包括但不限於以下中之一或多者：改善或緩解NGF相關病症之任何態樣，特別是選自由以下組成之群的疼痛：急性、慢性、難治性疼痛、傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳病症（諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、僵直性脊柱炎、血清反應陰性（非類風濕性）關節病、非關節風濕病及關節周圍病症）相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛（諸如關節炎或骨關節炎相關疼痛）。出於本發明之目的，有益或所需臨床結果包括但不限於以下中之一或多者：包括減輕NGF相關病症之嚴重程度、發病率、緩解與該NGF相關病症相關之一或多種症狀，較佳為疼痛，包括疼痛之任何態樣（諸如縮短NGF相關病症（較佳為疼痛）之持續時間，減少NGF相關病症，較佳地疼痛敏感性或疼痛感覺）。例如，用以量測與OA相關之疼痛的嚴重程度、發生率或緩解的減輕的一個參數係與未經治療的動物相比，經治療動物之跛行的減少。治療方法：
本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
根據其他具體實例，用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物為免疫原性組成物，且其中此類治療包含以下、較佳由以下組成：對該犬科動物進行針對內源性NGF蛋白的主動免疫。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該治療在於對該犬科動物進行針對該犬科動物之內源性NGF蛋白的主動免疫。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法，該方法包含向該犬科動物投予組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
根據另一態樣，本發明提供一種用於對犬科動物進行針對NGF相關病症之主動免疫的方法，該方法包含向該犬科動物投予組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
在較佳具體實例中，NGF相關病症為疼痛，較佳為選自以下之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地其中此類疼痛為OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為傷害感受性疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為發炎性疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為手術後疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為與肌肉骨胳疾病相關之疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為與退化性關節疾病相關之疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為骨關節炎（OA）相關疼痛。
各別NGF相關病症，較佳疼痛，更佳選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳此類OA相關疼痛，屬於急性、慢性或難治性病因。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為急性NGF相關病症。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為急性疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為選自由以下組成之群的急性疼痛：急性傷害感受性疼痛、急性發炎性疼痛、急性手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之急性疼痛及/或急性骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地其中此類疼痛為與退化性關節疾病相關之急性疼痛，甚至更佳為急性OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為慢性NGF相關病症。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為慢性疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為選自由以下組成之群的慢性疼痛：慢性傷害感受性疼痛、慢性發炎性疼痛、慢性手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之慢性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛及/或慢性骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地其中此類慢性疼痛為與退化性關節疾病相關之慢性疼痛，甚至更佳地為慢性OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為難治性NGF相關病症。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為難治性疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為選自由以下組成之群的難治性疼痛：難治性傷害感受性疼痛、難治性發炎性疼痛、難治性手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之難治性疼痛、與退化性關節疾病相關之難治性疼痛及/或難治性骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地其中此類難治性疼痛為與退化性關節疾病相關之難治性疼痛，甚至更佳地為難治性OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為慢性難治性NGF相關病症。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為慢性難治性疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為選自由以下組成之群的慢性難治性疼痛：慢性難治性傷害感受性疼痛、慢性難治性發炎性疼痛、慢性難治性手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之慢性難治性疼痛及/或慢性難治性骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地其中此類慢性難治性疼痛為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，甚至更佳地為慢性難治性OA相關疼痛。給藥 ：
根據本發明使用之組成物通常係以有效劑量投予，以治療NGF相關病症，較佳為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛，或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
根據本發明之較佳具體實例，用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物向該犬科動物投予的量為至少50 µg/劑，該量較佳為50至300 µg/劑，該量較佳為該量較佳為50至275 µg/劑，該量較佳為50至250 µg/劑，該量較佳為50至200 µg/劑，該量較佳為50至175 µg/劑，該量較佳為50至150 µg/劑，該量較佳為62.5至300 µg/劑，該量較佳為該量較佳為62.5至275 µg/劑，該量較佳為62.5至250 µg/劑，該量較佳為62.5至200 µg/劑，該量較佳為62.5至175 µg/劑，該量較佳為62.5至150 µg/劑，該量較佳為75至300 µg/劑，該量較佳為該量較佳為75至275 µg/劑，該量較佳為75至250 µg/劑，該量較佳為75至200 µg/劑，該量較佳為75至175 µg/劑，該量較佳為75至150 µg/劑，該量較佳為100至300 µg/劑，該量較佳為該量較佳為100至275 µg/劑，該量較佳為100至250 µg/劑，該量較佳為100至200 µg/劑，該量較佳為100至175 µg/劑，該量較佳為100至150 µg/劑。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該NGF相關病症為疼痛，較佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛，或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛；且其中該組成物向該犬科動物投予的量為至少50 µg/劑，該量較佳為50至300 µg/劑，該量較佳為該量較佳為50至275 µg/劑，該量較佳為50至250 µg/劑，該量較佳為50至200 µg/劑，該量較佳為50至175 µg/劑，該量較佳為50至150 µg/劑，該量較佳為62.5至300 µg/劑，該量較佳為該量較佳為62.5至275 µg/劑，該量較佳為62.5至250 µg/劑，該量較佳為62.5至200 µg/劑，該量較佳為62.5至175 µg/劑，該量較佳為62.5至150 µg/劑，該量較佳為75至300 µg/劑，該量較佳為該量較佳為75至275 µg/劑，該量較佳為75至250 µg/劑，該量較佳為75至200 µg/劑，該量較佳為75至175 µg/劑，該量較佳為75至150 µg/劑，該量較佳為100至300 µg/劑，該量較佳為該量較佳為100至275 µg/劑，該量較佳為100至250 µg/劑，該量較佳為100至200 µg/劑，該量較佳為100至175 µg/劑，該量較佳為100至150 µg/劑。投予方案 ：
含有NGF之CMV VLP組成物能夠在重複或多次給藥後增強中和抗NGF抗體且不會引起任何長期免疫耐受性（亦即不會永久規避免疫耐受性），其將引起嚴重的副作用且減輕針對內源性NGF蛋白之增強效果。此暫時突破免疫耐受性而不會在重複投予後完全破壞針對內源性NGF蛋白的免疫耐受性係管理NGF相關疾病、較佳管理NGF相關疼痛的關鍵。此外，進一步的要求是，呈遞NGF抗原之載體（亦即CMV VLP）本身不會引起針對此類載體的中和免疫反應，因為其將削弱任何重複給藥後的增強效果。已出人意料地發現，含有NGF之CMV VLP高度適用於管理犬科動物之NGF相關病症，特別適用於管理疼痛。含有NGF之CMV VLP出人意料地介導暫時突破針對內源性NGF蛋白之免疫耐受性，且活化及增強抗體介導的對NGF與TrkA高親和力受體結合的抑制，從而防止後續的級聯活化，而不會永久破壞針對內源性NGF蛋白的免疫耐受性。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係以一個或數個劑量向該犬科動物投予。
在另一態樣中，含有NGF之CMV VLP組成物係以至少兩個劑量投予，較佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳14至21天。第一劑量與第二劑量之間的此類較佳時間間隔可為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，較佳14、15、16、17、18、19、20或21天。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係以至少兩個劑量向該犬科動物投予，較佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳14至21天，更佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，較佳14、15、16、17、18、19、20或21天。
在重複給藥之情況下，第一劑量與第二劑量之間的時間間隔較佳為至少7天，更佳至少14天，甚至更佳為7至21天，甚至更佳為14至21天。進一步的追加投予通常與前一次投予間隔更長的時間間隔。例如，若提供第三次投予，一般而言，第二次投予與第三次投予之間的時間間隔為二至六個月。對於任何進一步的追加投予，前一次追加投予後（例如第三次投予後）的時間間隔較佳為至少三個月，較佳為三至六個月。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係以重複劑量向該犬科動物投予。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係以重複劑量向該犬科動物投予，且其中第一劑量與第二劑量之間的時間間隔較佳為至少7天，較佳為至少14天，更佳為7至21天，更佳為14至21天。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係以重複劑量向該犬科動物投予，且其中第一劑量與第二劑量之間的時間間隔較佳為至少7天，較佳為至少14天，更佳為7至21天，更佳為14至21天，且其中任何後續投予距前一次投予的時間間隔為至少二至六個月。任何後續投予距前一次投予的此時間間隔可為例如2、3、4、5或6個月，或者2至6個月內的任何其他時間間隔。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係以重複劑量向該犬科動物投予，且其中第一劑量與第二劑量之間的時間間隔較佳為兩至三週（14至21天），且其中任何後續投予距前一次投予的時間間隔為約六個月。
為了治療急性NGF相關病症，較佳急性疼痛，一般而言投予一個或兩個劑量之含有NGF之CMV VLP組成物。若投予兩個劑量，通常選擇一至三週，較佳地兩至三週的時間間隔，以獲得最大增強效果。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之急性NGF相關病症（較佳急性疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係以至少兩個劑量，較佳以兩個劑量向該犬科動物投予，較佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳14至21天（兩至三週），更佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，更佳14、15、16、17、18、19、20、或21天。此類急性NGF相關病症，較佳地此類急性疼痛係選自由以下組成之群：急性傷害感受性疼痛、急性發炎性疼痛、急性手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之急性疼痛及/或急性骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地此類急性疼痛為與退化性關節疾病相關之急性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛。較佳地，含有NGF之CMV VLP的投予量為50至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為50至275 µg/劑，較佳地該量為50至250 µg/劑，較佳地該量為50至200 µg/劑，較佳地該量為50至175 µg/劑，較佳地該量為50至150 µg/劑，較佳地該量為62.5至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為62.5至275 µg/劑，較佳地該量為62.5至250 µg/劑，較佳地該量為62.5至200 µg/劑，較佳地該量為62.5至175 µg/劑，較佳地該量為62.5至150 µg/劑，較佳地該量為75至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為75至275 µg/劑，較佳地該量為75至250 µg/劑，較佳地該量為75至200 µg/劑，較佳地該量為75至175 µg/劑，較佳地該量為75至150 µg/劑，較佳地該量為100至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為100至275 µg/劑，較佳地該量為100至250 µg/劑，較佳地該量為100至200 µg/劑，較佳地該量為100至175 µg/劑，較佳地該量為100至150 µg/劑。
對於慢性或慢性難治性NGF相關病症，較佳慢性疼痛或慢性難治性疼痛的治療，重複投予可進一步增強治療效果。若投予三至四個劑量，則第一劑量與第二劑量之間的時間間隔通常為7至21天，較佳為14至21天（兩至三週），更佳為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，更佳為14、15、16、17、18、19、20或21天，然後任何後續投予與前一次投予的時間間隔為兩至六個月。例如，第二次投予與第三次投予之間的時間間隔可為兩個月、三個月、四個月、五個月或六個月（或其間的任何其他時間間隔），且任何第四次投予與第三次投予的時間間隔為三個月、四個月、五個月或六個月（或其間的任何其他時間間隔）。一般而言，高度符合需要的是初次投予（其較佳由一個或兩個劑量組成）與任何後續投予且任何後續投予與前一次投予之間有六個月時間間隔。此外，在一次或兩次初次投予之後的任何進一步追加投予的準確時間間隔可以由所屬技術領域中具有通常知識者根據在經預治療之動物（經預治療之犬科動物）中偵測到的抗NGF力價來確定。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之慢性NGF相關病症（較佳慢性疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係以重複劑量向該犬科動物投予，其中重複給藥包含投予一個或兩個初打劑量或由其組成，較佳地投予兩個初打劑量，其中第一初打劑量與第二初打劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳為14至21天（兩至三週），更佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，更佳為14、15、16、17、18、19、20或21天；且其中該重複給藥包含後續追加投予或由後續追加投予組成，其較佳地與任何前一次投予的時間間隔為二至六個月，較佳三個月、四個月、五個月或六個月，更佳四至六個月。此類慢性NGF相關病症，較佳地此類慢性疼痛係選自由以下組成之群：慢性傷害感受性疼痛、慢性發炎性疼痛、慢性手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之慢性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛及/或慢性骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地此類慢性疼痛為與退化性關節疾病相關之慢性疼痛，更佳為慢性OA相關疼痛。根據另一具體實例，此類慢性NGF相關病症可為選自由以下組成之群的慢性難治性疼痛：慢性難治性傷害感受性疼痛、慢性難治性發炎性疼痛、慢性難治性手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之慢性難治性疼痛及/或慢性難治性骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地此類慢性疼痛為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為慢性難治性OA相關疼痛。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物的投予量為50至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為50至275 µg/劑，較佳地該量為50至250 µg/劑，較佳地該量為50至200 µg/劑，較佳地該量為50至175 µg/劑，較佳地該量為50至150 µg/劑，較佳地該量為62.5至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為62.5至275 µg/劑，較佳地該量為62.5至250 µg/劑，較佳地該量為62.5至200 µg/劑，較佳地該量為62.5至175 µg/劑，較佳地該量為62.5至150 µg/劑，較佳地該量為75至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為75至275 µg/劑，較佳地該量為75至250 µg/劑，較佳地該量為75至200 µg/劑，較佳地該量為75至175 µg/劑，較佳地該量為75至150 µg/劑，較佳地該量為100至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為100至275 µg/劑，較佳地該量為100至250 µg/劑，較佳地該量為100至200 µg/劑，較佳地該量為100至175 µg/劑，較佳地該量為100至150 µg/劑。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之慢性NGF相關病症（較佳慢性疼痛）之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係以重複劑量向該犬科動物投予，其中該重複給藥包含以下或由以下組成：投予兩個初打劑量，其中第一初打劑量與第二初打劑量之間的時間間隔為二至三週；及投予至少兩次後續追加投予，較佳地第二次初打投予與第一次追加投予之間的時間間隔為二至三個月；以及至少一次進一步的追加投予，其與任何前一次追加投予的時間間隔為四至六個月。此類慢性NGF相關病症，較佳地此類慢性疼痛係選自由以下組成之群：慢性傷害感受性疼痛、慢性發炎性疼痛、慢性手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之慢性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛及/或慢性骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地此類慢性疼痛為與退化性關節疾病相關之慢性疼痛，較佳為慢性OA相關疼痛。根據另一具體實例，此類慢性NGF相關病症可為選自由以下組成之群的慢性難治性疼痛：慢性難治性傷害感受性疼痛、慢性難治性發炎性疼痛、慢性難治性手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之慢性難治性疼痛及/或慢性難治性骨關節炎（OA）相關疼痛，較佳地此類慢性疼痛為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，較佳為慢性難治性OA相關疼痛。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物的投予量為50至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為50至275 µg/劑，較佳地該量為50至250 µg/劑，較佳地該量為50至200 µg/劑，較佳地該量為50至175 µg/劑，較佳地該量為50至150 µg/劑，較佳地該量為62.5至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為62.5至275 µg/劑，較佳地該量為62.5至250 µg/劑，較佳地該量為62.5至200 µg/劑，較佳地該量為62.5至175 µg/劑，較佳地該量為62.5至150 µg/劑，較佳地該量為75至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為75至275 µg/劑，較佳地該量為75至250 µg/劑，較佳地該量為75至200 µg/劑，較佳地該量為75至175 µg/劑，較佳地該量為75至150 µg/劑，較佳地該量為100至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為100至275 µg/劑，較佳地該量為100至250 µg/劑，較佳地該量為100至200 µg/劑，較佳地該量為100至175 µg/劑，較佳地該量為100至150 µg/劑。投予方式 ：
一般而言，含有NGF之CM VLP組成物係全身性投予，較佳地皮下、肌肉內或經皮投予。在較佳具體實例中，含有NGF之CM VLP組成物係皮下投予。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接，且其中該組成物係全身性投予，較佳皮下、肌肉內或經皮投予。在較佳具體實例中，該含有NGF之CMV VLP組成物係皮下投予。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該組成物係皮下投予。較佳地，NGF相關病症為疼痛，較佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛，或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。根據另一較佳具體實例，全身性、較佳皮下投予之組成物的投予量為50至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為50至275 µg/劑，較佳地該量為50至250 µg/劑，較佳地該量為50至200 µg/劑，較佳地該量為50至175 µg/劑，較佳地該量為50至150 µg/劑，較佳地該量為62.5至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為62.5至275 µg/劑，較佳地該量為62.5至250 µg/劑，較佳地該量為62.5至200 µg/劑，較佳地該量為62.5至175 µg/劑，較佳地該量為62.5至150 µg/劑，較佳地該量為75至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為75至275 µg/劑，較佳地該量為75至250 µg/劑，較佳地該量為75至200 µg/劑，較佳地該量為75至175 µg/劑，較佳地該量為75至150 µg/劑，較佳地該量為100至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為100至275 µg/劑，較佳地該量為100至250 µg/劑，較佳地該量為100至200 µg/劑，較佳地該量為100至175 µg/劑，較佳地該量為100至150 µg/劑。根據另一較佳具體實例，該組成物係以至少兩個劑量向犬科動物全身性投予，較佳皮下投予，較佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳為14至21天，更佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天、更佳地在14、15、16、17、18、19、20及21天。在該組成物的任何進一步投予之情況下，此類第三、視需要的第四及任何進一步視需要投予包含以下或由以下組成：全身性投予，較佳皮下投予該第三、視需要的第四及視需要的另一劑量，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為二至六個月，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為四至六個月。根據本發明待使用之 NGF 抗原 ：
在另一較佳具體實例中，該抗原/NGF抗原為神經生長因子（NGF），其選自人類NGF（hNGF）、犬科動物NGF（cNGF）、貓科動物NGF（fNGF）、馬科動物NGF（eNGF）、牛科動物NGF（bNGF）及豬科動物NGF（pNGF），較佳選自犬科動物NGF（cNGF）或貓科動物NGF（fNGF），且其中更佳地，該抗原為犬科動物NGF（cNGF）。在一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：選自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者的胺基酸序列，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%、再更佳至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列。在另一具體實例中，該NGF抗原包含至少兩個連續且至多12個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。在另一較佳具體實例中，該NGF抗原包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含4、6、8或10個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含4個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含4個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含由SEQ ID NO:34組成之6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含由SEQ ID NO:34組成之6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含8個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含8個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含10個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。
在一替代性具體實例中，該抗原為人類NGF。在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:54或與SEQ ID NO:54具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:54。在另一中，該抗原由SEQ ID NO:54組成。
在另一極佳具體實例中，該抗原為犬科動物NGF。在一極佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或與SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SED ID NO:33具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33。在另一較佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33組成。在另一極佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30組成。在另一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:31或與SEQ ID NO:31具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:31。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:31組成。在另一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:33或與SEQ ID NO:33具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:33。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:33組成。
在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含至少兩個連續且至多12個連續組胺酸殘基、較佳4、6、8或10個連續組胺酸殘基、更佳6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且在此較佳地位於NGF抗原的C端或N端，更佳地位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含4、6、8或10個連續組胺酸殘基、較佳6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且在此較佳地位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且較佳位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且位於NGF抗原的N端。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30，且其中該NGF抗原進一步包含至少兩個連續且至多12個連續組胺酸殘基、較佳4、6、8或10個連續組胺酸殘基、更佳6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且在此較佳地位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30，且其中該NGF抗原進一步包含6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且較佳位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30，且其中該NGF抗原進一步包含6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且位於NGF抗原的N端。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30組成。
在另一具體實例中，該抗原為貓科動物NGF。在另一極佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:55或與SEQ ID NO:55具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性且再更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:55。在另一較佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:55組成。
在另一具體實例中，該抗原為馬科動物NGF。在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:56或與SEQ ID NO:56具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性且再更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:56。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:56組成。
在另一具體實例中，該抗原為牛科動物NGF。在另一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:57或與SEQ ID NO:57具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性且再更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:57。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:57組成。
在另一具體實例中，該抗原為豬科動物NGF。在另一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:58或與SEQ ID NO:58具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性且再更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:58。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:58組成。根據本發明待使用之組成物 ：
適用於本發明之黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP）包括所屬技術領域中具有通常知識者已知之CMV VLP，例如來自WO2016/062720及WO2020/128037，及其中所引用之參考文獻。由於黃瓜嵌紋病毒的宿主範圍極其廣泛，因此CMV的許多不同病毒株及分離株係已知的，且該等病毒株及分離株的外殼蛋白的序列已被確定且因此已為所屬技術領域中具有通常知識者所知。該等CMV外殼蛋白（CP）的序列描述於且可擷取於已知數據庫中，諸如Genbank, www.dpvweb.net，或www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/。實例在WO2016/062720的第12至14頁中進行描述，該揭示內容以引用之方式併入本文中。本發明之CMV VLP包含至少一種CMV多肽，典型地CMV VLP包含該CMV多肽之180個複本，從而形成殼體結構。較佳地，CMV之VLP包含該CMV多肽作為其殼體結構之主要蛋白質組分，且甚至更佳地作為其殼體結構之唯一蛋白質組分。
較佳地，CMV之VLP包含以下或由以下組成：CMV多肽之至少一個、典型地且較佳地180個複本，該CMV多肽包含以下或較佳由以下組成：（i）CMV外殼蛋白之胺基酸序列；或（ii）與該CMV外殼蛋白具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%且再更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白的胺基酸序列或突變胺基酸序列、較佳由其等組成，其中該突變胺基酸序列與該CMV外殼蛋白顯示出至少90%、較佳至少91%、92%、93、94%或95%、更佳至少96%、97%或98%且再更佳至少99%的序列一致性；其中較佳地，該突變胺基酸序列與待突變的該胺基酸序列存在至少一個且至多11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個胺基酸殘基的差異，且其中更佳地，此等差異係選自（i）插入、（ii）缺失、（iii）胺基酸交換，及（iv）（i）至（iii）之任何組合。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列。
因此，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病病毒（CMV）之病毒樣粒子，其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；且其中該CMV VLP包含至少一種CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；且（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少85%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少92%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少93%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少96%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少97%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少98%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；且其中該CMV VLP包含至少一種CMV多肽，其中該CMV多肽包含SEQ ID NO: 39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少85%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少92%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少93%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少96%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少97%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少98%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白，較佳由其組成。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；且其中該CMV VLP包含至少一種CMV多肽，其中該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性之胺基酸序列；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
如本文所描述之含有NGF之CMV VLP組成物的免疫原性可藉由添加輔助性T細胞抗原決定基來進一步增加。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基為來源於破傷風毒素之輔助性T細胞抗原決定基或為PADRE序列。此類輔助性T細胞抗原決定基較佳包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列或由其組成。此類輔助性T細胞抗原決定基可引入、較佳引入CMV VLP中，尤其引入CMV多肽中且較佳引入CMV VLP之外殼蛋白序列中。根據此等含有輔助性T細胞抗原決定基之CMV VLP的較佳具體實例，輔助性T細胞抗原決定基，較佳地來源於破傷風毒素或PADRE序列之輔助性T細胞抗原決定基置換CMV多肽之N端區。較佳地，輔助性T細胞抗原決定基，較佳地來源於破傷風毒素或PADRE序列之輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中較佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸殘基2-12。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且（c）   輔助性T細胞抗原決定基；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且（c）   輔助性T細胞抗原決定基，其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列或由其組成；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；且其中該CMV VLP包含至少一個CMV多肽；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；及（c）   輔助性T細胞抗原決定基，較佳地來源於破傷風毒素或PADRE序列之輔助性T細胞抗原決定基，較佳包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42或由其組成，其中該輔助性T細胞抗原決定基置換CMV多肽之N端區，較佳為對應於SEQ ID NO:39之胺基酸殘基2-12的胺基酸；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之黃瓜嵌紋病毒（CMV）VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個經修飾CMV多肽，其中該至少一個經修飾CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：CMV外殼蛋白與該外殼蛋白具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少92%、更佳至少95%、更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   輔助性T細胞抗原決定基，其中較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換CMV多肽之N端區，較佳為對應於SEQ ID NO:39之胺基酸殘基2-12的胺基酸；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO: 39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO: 39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO: 39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少85%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少92%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少93%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少96%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少97%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少98%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白，較佳由其組成。
在本發明之另一具體實例中，輔助性T細胞抗原決定基選自TT 830-843（SEQ ID NO:41）、PADRE（SEQ ID NO:42）、HA 307-319（SEQ ID NO:43）、HBVnc 50-69（SEQ ID NO:44）、CS 378-398（SEQ ID NO:45）、MT 17-31（SEQ ID NO:46）及TT 947-967（SEQ ID NO:47）。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基為來源於破傷風毒素之輔助性T細胞抗原決定基或為PADRE序列。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基來源於人類疫苗。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基為來源於破傷風毒素之輔助性T細胞抗原決定基。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基為PADRE序列。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基由SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基由SEQ ID NO:41之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基由SEQ ID NO:42之胺基酸序列組成。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之黃瓜嵌紋病毒（CMV）VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個經修飾CMV多肽，其中該至少一個經修飾CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含以下，較佳由以下組成：SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白，或與該外殼蛋白具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、再更佳至少90%、再更佳至少92%、再更佳至少95%、再更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   輔助性T細胞抗原決定基，較佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，更佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12，更佳地，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，甚至更佳地，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列，更佳由其組成；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%且再更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列，且其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之黃瓜嵌紋病毒（CMV）VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個經修飾CMV多肽，其中該至少一個經修飾CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：i.    CMV多肽，其中該CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白，或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%、再更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列；及ii.   輔助性T細胞抗原決定基，其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12，且其中較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，其中極佳地，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列，再更佳由其組成；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
在較佳具體實例中，該經修飾之CMV多肽包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 48之胺基酸序列、較佳由其組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列、較佳由其組成。
較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
CMV VLP與NGF抗原之間存在不同的鍵聯方式。NGF抗原可經由附著位點，藉由肽鍵，較佳地藉由基因融合與CMV VLP連接。例如，編碼NGF抗原之核苷酸序列可在編碼CMV VLP之核苷酸序列內框內選殖。或者，NGF抗原可經由附著位點之間的化學偶合，例如藉由至少一個非肽鍵連接至CMV VLP。
在一較佳具體實例中，該CMV VLP及該至少一個NGF抗原透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價鍵連接。在一較佳具體實例中，該CMV VLP及該至少一個NGF抗原透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由專有共價鍵連接。
在另一較佳具體實例中，該CMV VLP及該至少一個NGF抗原透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價肽鍵連接。在另一較佳具體實例中，該CMV VLP及該至少一個NGF抗原透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由獨有共價鍵連接。
在另一較佳具體實例中，該CMV VLP及該至少一個NGF抗原透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。在另一較佳具體實例中，該CMV VLP及該至少一個NGF抗原透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由專有共價非肽鍵連接。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個非肽共價鍵、較佳藉助於融合連接。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含經修飾之CMV VLP，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一種抗原性CMV融合多肽，其中該至少一種抗原性CMV融合多肽包含以下，較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39之該外殼蛋白具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少92%、更佳至少95%、更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   抗原性NGF多肽，其中該抗原性NGF多肽插入該CMV多肽中，其中較佳地，該抗原性NGF多肽之該插入係在該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置84及位置85之胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間；及（iii）  視需要地，輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中更佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含經修飾之CMV VLP，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一種抗原性CMV融合多肽，其中該至少一種抗原性CMV融合多肽包含以下，較佳由以下組成：（a）   CMV多肽，其中該CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39之該外殼蛋白具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少92%、更佳至少95%、更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列；及（b）   抗原性NGF多肽，其中該抗原性NGF多肽插入該CMV多肽中，其中較佳地，該抗原性NGF多肽之該插入係在該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置84及位置85之胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間；及（c）   輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中更佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。
較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含經修飾之CMV VLP，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一種抗原性CMV融合多肽，其中該至少一種抗原性CMV融合多肽包含以下，較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39之該外殼蛋白具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少92%、更佳至少95%、更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   抗原性NGF多肽，其中該抗原性NGF多肽插入該CMV多肽中，其中該抗原性NGF多肽之該插入係在該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置84及位置85之胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間；及（iii）  視需要地，輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中更佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含經修飾之CMV VLP，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一種抗原性CMV融合多肽，其中該至少一種抗原性CMV融合多肽包含以下，較佳由以下組成：（a）   CMV多肽，其中該CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39之該外殼蛋白具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少92%、再更佳至少95%、更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列；及（b）   抗原性NGF多肽，其中該抗原性NGF多肽插入該CMV多肽中，其中該抗原性NGF多肽之該插入係在該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置84及位置85之胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間；及（c）   輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中更佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。
較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。
CMV VLP典型地為由病毒外殼蛋白構成之大分子組裝體，其典型地包含每個VLP有180個蛋白質次單元。典型地且較佳地，此等次單元之相互作用導致具有固有重複組織之VLP的形成，從而允許呈遞NGF抗原之多個複本。此類外殼蛋白為例如由胺基酸序列SEQ ID NO:39編碼或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性之外殼蛋白。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個CMV多肽，其中該至少一個CMV多肽包含CMV多肽，較佳由CMV多肽組成，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該NGF抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一種經修飾CMV多肽，其中該至少一種經修飾CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39之該外殼蛋白具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少92%、更佳至少95%、更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   視需要，輔助性T細胞抗原決定基；及（b）   其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該NGF抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（c）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一種經修飾CMV多肽，其中該至少一種經修飾CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39之該外殼蛋白具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少92%、更佳至少95%、更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   輔助性T細胞抗原決定基；及（d）   其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該NGF抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO: 39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO: 39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO: 39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少85%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少92%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少93%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少96%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少97%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少98%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之CMV外殼蛋白，較佳由其組成。在較佳具體實例中，輔助性T細胞抗原決定基選自TT 830-843（SEQ ID NO:41）、PADRE（SEQ ID NO:42）、HA 307-319（SEQ ID NO:43）、HBVnc 50-69（SEQ ID NO:44）、CS 378-398（SEQ ID NO:45）、MT 17-31（SEQ ID NO:46）及TT 947-967（SEQ ID NO:47）。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基為來源於破傷風毒素之輔助性T細胞抗原決定基或為PADRE序列。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基來源於人類疫苗。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基為來源於破傷風毒素之輔助性T細胞抗原決定基。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基為PADRE序列。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基由SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基由SEQ ID NO:41之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基由SEQ ID NO:42之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV多肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:48之胺基酸序列、較佳由其組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列、較佳由其組成。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一種經修飾CMV多肽，其中該至少一種經修飾CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39之該外殼蛋白具有至少75%、較佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%、更佳至少92%、更佳至少95%、更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中更佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12；及（b）   其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該NGF抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，較佳地其中該多肽插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間，及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
在一較佳具體實例中，該嵌合CMV多肽進一步包含輔助性T細胞抗原決定基，較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列，更佳地由其組成，且其中較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，較佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。在另一極佳具體實例中，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%且更佳至少98%序列一致性的胺基酸序列。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，及（iii）  輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列，更佳由其組成。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間，及（iii）  輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽的N端區；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列，更佳由其組成。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，及（iii）  輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中更佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間，及（iii）  輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中更佳地，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、較佳由其組成。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列，其中較佳地，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，較佳由其組成；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
因此，根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列，其中較佳地，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間，且其中該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、較佳由其組成；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列，其中較佳地，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列；（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，較佳由其組成；及（iii）  輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區及/或較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之該N端區，其對應於SEQ ID NO: 39之胺基酸2-12。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列，更佳由其組成。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列，其中較佳地，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列；（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間，且其中該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、較佳由其組成；及（iii）  輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區及/或較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之該N端區，其對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列，更佳由其組成。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端，且其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地選自由以下組成之群：（a.）聚甘胺酸連接子（G-連接子），其具有長度為n=2至10的胺基酸序列(Gly)n；（b.）甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；以及（c.）胺基酸連接子（GS*-連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端，且其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地選自：甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中該GS-連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；以及胺基酸連接子（GS*-連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸。在另一極佳具體實例中，該第一胺基酸連接子包含SEQ ID NO:8，較佳由其組成。在另一極佳具體實例中，該第二胺基酸連接子包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9，較佳由其組成。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51。在另一極佳具體實例中，該多肽係由SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51組成。在另一極佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置84及位置85之胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列，其中較佳地，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間，且其中該多肽包含SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51、較佳由其組成，且其中較佳地，該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置84及位置85的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列，其中較佳地，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列；（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽較佳係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間，且其中該多肽包含SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51，較佳由其組成；且其中較佳地，該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置84及位置85之胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間；（iii）  輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區及/或較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之該N端區，其對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列，更佳由其組成。
在另一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列、較佳由其組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間；及其中該CMV多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列、較佳由其組成，且其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
根據另一態樣，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列、較佳由其組成；（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸之多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88及位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84及位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86及位置87的胺基酸殘基之間；及（iii）  輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區及/或較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地，其中該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列、較佳由其組成；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之該N端區，其對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，較佳地，該輔助性T細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列，更佳由其組成。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
本文所描述及所揭示的具體實例、較佳具體實例及極佳具體實例應適用於所有態樣及其他具體實例、較佳具體實例及/或極佳具體實例，不論是否再次具體提及或不論是否為了簡潔而避免其重複。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白的胺基酸序列或突變胺基酸序列、較佳由其等組成，其中該突變胺基酸序列與該CMV外殼蛋白顯示出至少90%、較佳至少91%、92%、93、94%或95%、更佳至少96%、97%或98%且更佳至少99%的序列一致性；其中較佳地，該突變胺基酸序列與待突變的該胺基酸序列存在至少一個且至多11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個胺基酸殘基的差異，且其中更佳地，此等差異係選自（i）插入、（ii）缺失、（iii）胺基酸交換，及（iv）（i）至（iii）之任何組合。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少85%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少92%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少93%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少96%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少97%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少98%序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少80%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少85%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少92%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少93%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少96%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少97%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少98%序列一致性的胺基酸序列組成。在另一較佳具體實例中，該CMV多肽係由CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%、較佳85%序列一致性的胺基酸序列。在一較佳具體實例中，該CMV多肽為CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少90%、較佳95%序列一致性的胺基酸序列。在一較佳具體實例中，該CMV多肽為具有SEQ ID NO:39的CMV外殼蛋白。在一較佳具體實例中，該CMV外殼蛋白包含SEQ ID NO:39。在一較佳具體實例中，該CMV外殼蛋白係由SEQ ID NO:39組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白。在一較佳具體實例中，該CMV多肽由CMV外殼蛋白組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白，其中該CMV外殼蛋白包含SEQ ID NO:39。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白，其中該CMV外殼蛋白係由SEQ ID NO:39組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽由CMV外殼蛋白組成，其中該CMV外殼蛋白由SEQ ID NO:39組成。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區，其中該胺基酸序列區與SEQ ID NO:40具有至少75%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區，其中該胺基酸序列區與SEQ ID NO:40具有至少80%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區，其中該胺基酸序列區與SEQ ID NO:40具有至少85%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區，其中該胺基酸序列區與SEQ ID NO:40具有至少90%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區，其中該胺基酸序列區與SEQ ID NO:40具有至少95%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區，其中該胺基酸序列區與SEQ ID NO:40具有至少98%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區，其中該胺基酸序列區與SEQ ID NO:40具有至少99%序列一致性。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含以下或較佳由以下組成：（i）CMV外殼蛋白之胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含SEQ ID NO:39或較佳由其組成；或（ii）與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；且其中如（i）或（ii）中所定義的該胺基序列包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區，其中該胺基酸序列區與SEQ ID NO:40具有至少90%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含以下或較佳由以下組成：（i）CMV外殼蛋白之胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含SEQ ID NO:39或較佳由其組成；或（ii）與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；且其中如（i）或（ii）中所定義的該胺基序列包含SEQ ID NO:40或胺基酸序列區，其中該胺基酸序列區與SEQ ID NO:40具有至少95%序列一致性。在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含以下或較佳由以下組成：（i）CMV外殼蛋白之胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含SEQ ID NO:39或較佳由其組成；或（ii）與SEQ ID NO:39具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；且其中如（i）或（ii）中所定義的該胺基序列包含SEQ ID NO:40。
在一較佳具體實例中，該N端區的胺基酸置換數目等於或低於由該輔助性T細胞抗原決定基組成之胺基酸的數目。在一較佳具體實例中，該CMV多肽的該經置換的N端區由5至15個連續胺基酸組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽的該經置換的N端區由9至14個連續胺基酸組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽的該經置換的N端區由11至13個連續胺基酸組成。在一較佳具體實例中，該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。在一較佳具體實例中，該CMV多肽之該N端區包含SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。在一較佳具體實例中，該CMV多肽之該N端區由SEQ ID NO:39之胺基酸2-12組成。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基由至多20個胺基酸組成。
在本發明之一較佳具體實例中，Th細胞抗原決定基選自TT 830-843（SEQ ID NO:41）、PADRE（SEQ ID NO:42）、HA 307-319（SEQ ID NO:43）、HBVnc 50-69（SEQ ID NO:44）、CS 378-398（SEQ ID NO:45）、MT 17-31（SEQ ID NO:46）及TT 947-967（SEQ ID NO:47）。在一較佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基為來源於破傷風毒素的Th細胞抗原決定基或為PADRE序列。在一較佳具體實例中，該輔助性T細胞抗原決定基來源於人類疫苗。在一較佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基為來源於破傷風毒素的Th細胞抗原決定基。在一較佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基為PADRE序列。在一較佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基由SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列。在一較佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基由SEQ ID NO:41之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該Th細胞抗原決定基由SEQ ID NO:42之胺基酸序列組成。
在一較佳具體實例中，該CMV多肽包含CMV外殼蛋白之胺基酸序列或較佳由其組成，其中該胺基酸序列包含SEQ ID NO:39或與SEQ ID NO:39具有至少95%序列一致性之胺基酸序列或較佳由其組成；且其中該胺基序列包含SEQ ID NO:40，且其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，且其中該CMV多肽之該經置換的N端區由11至13個連續胺基酸組成、較佳由11個連續胺基酸組成，且其中更佳地該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。在一較佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列、較佳由其組成，其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間。在另一較佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列，其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間。
在一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3個且小於12個胺基酸。在一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3至10個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3至9個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3至8個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸具有4至9個胺基酸的長度。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4至8個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4、5、6、7或8。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4或8個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為5個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為6個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為7個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為8個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為9個胺基酸。
在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，其中該天冬胺酸或該麩胺酸在各場合中獨立地選自其L-組態或其D-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈L-組態或D-組態的天冬胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈L-組態的天冬胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈D-組態的天冬胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈L-組態或D-組態的麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈L-組態的麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈D-組態的麩胺酸。
在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個呈L-組態的天冬胺酸及至少一個呈L-組態的麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸由皆呈L-組態的天冬胺酸及麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸由皆呈L-組態的天冬胺酸或麩胺酸組成。
在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個天冬胺酸或至少一個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少兩個天冬胺酸或至少兩個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少三個天冬胺酸或至少三個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個天冬胺酸或至少四個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個天冬胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少五個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少六個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少七個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少八個麩胺酸。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸僅由天冬胺酸組成。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。
在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少一個天冬胺酸或至少一個麩胺酸，其中該至少一個天冬胺酸或該至少一個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少兩個天冬胺酸或至少兩個麩胺酸，其中至少兩個天冬胺酸或至少兩個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少三個天冬胺酸或至少三個麩胺酸，其中該至少三個天冬胺酸或該至少三個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個天冬胺酸或至少四個麩胺酸，其中該至少四個天冬胺酸或該至少四個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個天冬胺酸，其中該至少四個天冬胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少四個麩胺酸，其中該至少四個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少五個麩胺酸，其中該至少五個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少六個麩胺酸，其中該至少六個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少七個麩胺酸，其中該至少七個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含至少八個麩胺酸，其中該至少八個麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸僅由天冬胺酸組成，其中該天冬胺酸呈L-組態。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。
在一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3至10個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3至9個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3至8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4至9個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4至8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4、5、6、7或8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4至8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4、5、6、7或8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4或8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為5個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為6個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為7個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為9個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。
在一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3至10個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3至9個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3至8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4至9個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4至8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4、5、6、7或8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4至8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4、5、6、7或8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4或8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為3個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為4個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為5個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為6個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為7個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為8個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。在另一較佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸的長度為9個胺基酸，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成，其中該等麩胺酸呈L-組態。
在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2組成。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:1。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸由SEQ ID NO:1組成。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸包含SEQ ID NO:2。在另一極佳具體實例中，該段連續的帶負電胺基酸由SEQ ID NO:2組成。
在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端或C端。在一較佳具體實例中，該多肽進一步包含第一胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端。在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端。在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第二胺基酸連接子。在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端。
在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多30個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多20、19、18、17或16個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多15個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多14個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多13個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多12個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多11個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多10個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多9個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多8個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多7個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多6個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多5個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多4個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多3個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子的長度為至多2個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子由一個胺基酸組成。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多30個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多20、19、18、17或16個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多15個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多14個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多13個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多12個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多11個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多10個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多9個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多8個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多7個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多6個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多5個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多4個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多3個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子的長度為至多2個胺基酸。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子由一個胺基酸組成。
在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端或C端，且其中該第一胺基酸連接子選自由以下組成之群：（a.）長度為n=2至10的聚甘胺酸連接子(Gly)n；（b.）甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；以及（c.）胺基酸連接子（GS*-連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。
在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第二胺基酸連接子，其中該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端或C端，且其中該第二胺基酸連接子選自由以下組成之群：（a.）長度為n=2至10的聚甘胺酸連接子(Gly)n；（b.）甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；以及（c.）胺基酸連接子（GS*-連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸。在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端，且其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地選自由以下組成之群：（a.）聚甘胺酸連接子（G-連接子），其具有長度為n=2至10的胺基酸序列(Gly)n；（b.）甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；以及（c.）胺基酸連接子（GS*-連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸。
在一較佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的N端，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸的C端，且其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地選自：甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中該GS-連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；及胺基酸連接子（GS*-連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸。
在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為長度n=2至10的聚甘胺酸連接子(Gly)n。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子）。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），且其中該第一胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser。在另一較佳具體實例中，該GS-連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=1至5，t=1至5且u=0或1。在另一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），該GS-連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=3或4，t=1、2或3，且u=0或1。在另一較佳具體實例中，該GS-連接子的長度為至多15、14、13、12、11個、較佳10、9、8、7個胺基酸，且更佳地長度為至多6個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），且該GS-連接子具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子為胺基酸連接子（GS*-連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。
在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為長度n=2之10的聚甘胺酸連接子(Gly)n。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為由至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸組成的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子）。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），且其中該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser。在另一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），該GS-連接子具GS)r(GsS)t(GS)u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=3或4，t=1、2或3，u=0或1。在另一較佳具體實例中，該GS-連接子的長度為至多15、14、13、12、11個、較佳10、9、8、7個胺基酸，且更佳地長度為至多6個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），且該GS-連接子具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列。
在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸的胺基酸連接子（GS*-連接子）。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少Cys的胺基酸連接子（GS*-連接子）。在一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少Cys的胺基酸連接子（GS*-連接子），且該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser。在另一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子（GS*-連接子）的長度為至多15、14、13、12、11個、較佳10、9個胺基酸，且更佳地長度為至多7或6個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該第二胺基酸連接子為胺基酸連接子（GS*-連接子），且該GS*-連接子具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列。
在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地為長度n=2至10的聚甘胺酸連接子(Gly)n。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子）。在一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*-連接子），且其中該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser。在另一較佳具體實例中，該GS-連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=1至5，t=1至5且u=0或1。在另一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地為甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），該GS-連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u的胺基酸序列，其中r=0或1，s=2、3或4，t=1、2或3，u=0或1。
在另一較佳具體實例中，該第一胺基酸連接子及/或該第二胺基連接子包含選自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:9之胺基酸序列、較佳由其組成。在另一極佳具體實例中，該第一胺基酸連接子包含SEQ ID NO:8，較佳由其組成。在另一極佳具體實例中，該第二胺基酸連接子包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9，較佳由其組成。在另一極佳具體實例中，該第二胺基酸連接子包含SEQ ID NO:4，較佳由其組成。在另一極佳具體實例中，該第二胺基酸連接子包含SEQ ID NO:9，較佳由其組成。在另一極佳具體實例中，該第一胺基酸連接子包含SEQ ID NO:8，較佳由其組成，且該第二胺基酸連接子包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9，較佳由其組成。在另一極佳具體實例中，該第一胺基酸連接子包含SEQ ID NO:8，較佳由其組成，且該第二胺基酸連接子包含SEQ ID NO:4，較佳由其組成。在另一極佳具體實例中，該第一胺基酸連接子包含SEQ ID NO:8，較佳由其組成，且該第二胺基酸連接子包含SEQ ID NO:9，較佳由其組成。
在一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽的長度為至多30個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多25、24、23、22或21個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多20個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多19個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多18個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多17個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多16個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多15個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多14個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多13個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多12個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多11個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多10個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多9個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多8個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多7個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多6個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多5個胺基酸。在一較佳具體實例中，該多肽的長度為至多4個胺基酸。在另一較佳具體實例中，該多肽由該段連續的帶負電胺基酸組成。
在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51。在另一極佳具體實例中，該多肽係由SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51組成。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:49。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:50。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:51。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:49組成。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:50組成。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:51組成。
在另一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間。在另一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75及位置76的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。在另一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置76及位置77的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。在另一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置77及位置78的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。在另一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置78及位置79的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。在另一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置79及位置80的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。在另一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置80及位置81的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。在另一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75及位置81的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。在另一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置82及位置83的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。在另一較佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置83及位置84的胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。在另一極佳具體實例中，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成之該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置84及位置85之胺基酸殘基相對應的胺基酸殘基之間。
在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88（Ser）與位置89（Thr）的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84（Ser）與位置85（Thr）的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86（Ser）與位置87（Thr）的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由SEQ ID NO:5之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由SEQ ID NO:39之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由SEQ ID NO:48之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88（Ser）與位置89（Thr）的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84（Ser）與位置85（Thr）的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86（Ser）與位置87（Thr）的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:5之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:39之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:48之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。
在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列且包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入SEQ ID NO:5之胺基酸殘基88（Ser）與胺基酸殘基89（Thr）之間，且包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子）或包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*-連接子），其中該第一胺基酸連接子及/或該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser序列。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列且包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入SEQ ID NO:5之胺基酸殘基88（Ser）與胺基酸殘基89（Thr）之間，且包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子）或包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*-連接子），其中該第一胺基酸連接子及/或該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser序列。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列、較佳由其組成；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。
在具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含180個相同的嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列、較佳由其組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含180個相同的嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列、較佳由其組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含180個相同的嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列、較佳由其組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含180個相同的嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列、較佳由其組成。
本發明之經修飾之CMV VLP可表現於原核或真核表現系統中。較佳系統為大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞以及哺乳動物細胞株。極佳地，該經修飾之CMV VLP係藉由將該嵌合CMV多肽表現於大腸桿菌中而獲得，且其中較佳地，該表現係在10℃至25℃之間的溫度下、較佳在20℃的溫度下實現。如上文所指明，重組產生的多肽可包含N端甲硫胺酸殘基。在一個具體實例中，該嵌合CMV多肽因此包含N端甲硫胺酸殘基。然而，典型地且較佳地，該嵌合CMV多肽在該N端甲硫胺酸殘基處分裂。
在另一較佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP進一步包含至少一種免疫刺激物質。在一極佳具體實例中，該免疫刺激物質被封裝至本發明之經修飾VLP中。在另一較佳具體實例中，將免疫刺激物質與本發明之經修飾VLP混合。適用於本發明之免疫刺激性物質在此項技術中通常已知且尤其揭示於WO2003/024481中。
在本發明之另一具體實例中，該免疫刺激物質由非真核來源的DNA或RNA組成。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激物質係選自由以下組成之群：（a）免疫刺激核酸；（b）肽聚醣；（c）脂多醣；（d）脂磷壁酸；I咪唑并喹啉化合物；（f）鞭毛蛋白；（g）脂蛋白；以及（h）（a）至（g）中之至少一種物質的任何混合物。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激物質為免疫刺激核酸，其中該免疫刺激核酸選自由以下組成之群：（a）核糖核酸；（b）去氧核糖核酸；（c）嵌合核酸；以及（d）（a）、（b）及/或（c）之任何混合物。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激核酸為核糖核酸，且其中該核糖核酸為細菌源RNA。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激核酸為聚(IC)或其衍生物。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激核酸為去氧核糖核酸，其中該去氧核糖核酸為含有未甲基化CpG之寡核苷酸。
在一極佳具體實例中，該免疫刺激物質為含有未甲基化CpG之寡核苷酸。在另一較佳具體實例中，該含有未甲基化CpG之寡核苷酸為A型CpG。在另一較佳具體實例中，該A型CpG包含回文序列。在另一較佳具體實例中，該回文序列在其5'端及3'端側接鳥苷實體。在另一較佳具體實例中，該回文序列在其5'端側接至少3個且至多15個鳥苷實體，且其中該回文序列在其3'端側接至少3個且至多15個鳥苷實體。
在另一較佳具體實例中，該免疫刺激物質為含有未甲基化CpG之寡核苷酸，且其中較佳地，該含有未甲基化CpG之寡核苷酸包含回文序列，且其中更佳地，該含有未甲基化CpG之寡核苷酸的CpG模體為回文序列的一部分，且其中更佳地，該回文序列為SEQ ID NO:52。在另一較佳具體實例中，該免疫刺激核酸為由SEQ ID NO:53組成的含有未甲基化CpG之寡核苷酸，其中該含有未甲基化CpG之寡核苷酸僅由磷酸二酯結合的核苷酸組成。
在另一態樣中，本發明提供一種組成物，其包含（a）本文所定義的經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點；其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點，典型地且較佳地經由至少一個共價非肽鍵連接。經由該第一附著位點及該第二附著位點將該經修飾之VLP與該等抗原連接的方法描述於例如WO2002/056905、WO2004/084940及WO2016/062720中。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一個NGF抗原，其中該NGF抗原包含至少一個第二附著位點；（c）   視需要或甚至較佳地，輔助性T細胞抗原決定基，其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點，典型地且較佳地經由至少一個共價非肽鍵連接。較佳地，該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性之胺基酸序列；及（ii）較佳地，包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基。
在一極佳具體實例中，該至少一個第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，所有該等第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該至少一個第一附著位點不構成或不是該段連續的帶負電胺基酸的一部分。在一極佳具體實例中，所有該等第一附著位點不構成或不是該段連續的帶負電胺基酸的一部分。在一極佳具體實例中，該第一附著位點與該第二附著位點僅經由一或多個共價鍵連接。在一極佳具體實例中，該至少一種抗原與該經修飾之CMV VLP僅經由一或多個共價鍵連接。在一極佳具體實例中，所有該等抗原與該經修飾之CMV VLP僅經由一或多個共價鍵連接。
在另一較佳具體實例中，該第一附著位點與該第二附著位點經由至少一個共價非肽鍵連接。在另一較佳具體實例中，所有該等第一附著位點與該等第二附著位點經由至少一個共價非肽鍵連接。在另一極佳具體實例中，該第一附著位點為胺基，較佳為離胺酸之胺基。在另一極佳具體實例中，所有該等第一附著位點為胺基，較佳為離胺酸之胺基。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列、較佳由其組成；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接；且其中該至少一個第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分；且其中較佳地，該第一附著位點為胺基，在此較佳為離胺酸的胺基，且其中更佳地，該第二附著位點為硫氫基，較佳為半胱胺酸殘基的硫氫基或已化學連接至NGF抗原的硫氫基。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物的投予量為50至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為50至275 µg/劑，較佳地該量為50至250 µg/劑，較佳地該量為50至200 µg/劑，較佳地該量為50至175 µg/劑，較佳地該量為50至150 µg/劑，較佳地該量為62.5至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為62.5至275 µg/劑，較佳地該量為62.5至250 µg/劑，較佳地該量為62.5至200 µg/劑，較佳地該量為62.5至175 µg/劑，較佳地該量為62.5至150 µg/劑，較佳地該量為75至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為75至275 µg/劑，較佳地該量為75至250 µg/劑，較佳地該量為75至200 µg/劑，較佳地該量為75至175 µg/劑，較佳地該量為75至150 µg/劑，較佳地該量為100至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為100至275 µg/劑，較佳地該量為100至250 µg/劑，較佳地該量為100至200 µg/劑，較佳地該量為100至175 µg/劑，較佳地該量為100至150 µg/劑。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物係以至少兩個劑量向犬科動物全身性投予、較佳皮下投予，較佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳14至21天，更佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，更佳14、15、16、17、18、19、20或21天。在該組成物的任何進一步投予之情況下，此類第三、視需要的第四及任何進一步視需要投予包含以下或由以下組成：全身性投予，較佳皮下投予該第三、視需要的第四及視需要的另一劑量，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為二至六個月，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為四至六個月。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。
經修飾之病毒樣粒子與抗原之間藉由二硫鍵達成的連接典型地不穩定，特別是對於含有硫氫基部分的分子而言，且另外，在血清中的穩定性低於例如硫醚連接（Martin FJ.及Papahadjopoulos D. (1982) J. Biol. Chem. 257: 286-288）。因此，在本發明之另一極佳具體實例中，經修飾之CMV VLP與至少一種抗原的締合或鍵聯不包含雙硫鍵。在此，更佳地，至少一個第二附著位點包含或較佳為硫氫基。較佳地，所有該等第二附著位點包含或較佳為硫氫基。在另一較佳具體實例中，該至少一個第一附著位點不是或不包含硫氫基。在另一較佳具體實例中，所有該等第一附著位點不是或不包含硫氫基。在一較佳具體實例中，該至少一個第一附著位點不是或不包含半胱胺酸的硫氫基。在一較佳具體實例中，所有該等第一附著位點不是或不包含半胱胺酸的硫氫基。在另一極佳具體實例中，該第二附著位點為硫氫基，較佳為半胱胺酸的硫氫基。在另一極佳具體實例中，所有該等第二附著位點為硫氫基，較佳為半胱胺酸的硫氫基。
在一極佳具體實例中，至少一個第一附著位點為胺基，較佳為離胺酸殘基的胺基，且至少一個第二附著位點為硫氫基，較佳為半胱胺酸殘基的硫氫基或已化學連接至抗原的硫氫基。在一極佳具體實例中，所有該等第一附著位點為胺基，較佳為離胺酸殘基的胺基，且所有該等第二附著位點為硫氫基，較佳為半胱胺酸殘基的硫氫基或已化學連接至抗原的硫氫基。在另一較佳具體實例中，該等第二附著位點中僅有一個位點與該第一附著位點透過至少一個非肽共價鍵締合，從而使該抗原與該經修飾之CMV VLP的結合達成單一且均勻的類型，其中與該第一附著位點締合的該唯一第二附著位點為硫氫基，且其中該抗原與該經修飾之CMV VLP透過該締合發生相互作用以形成有序且重複的抗原陣列。
在本發明之一個較佳具體實例中，抗原與經修飾之CMV VLP藉由化學交聯達成連接，典型地且較佳地使用異雙官能交聯劑連接。
因此，在一較佳具體實例中，NGF抗原與經修飾之CMV VLP透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵、藉由化學交聯連接，典型地且較佳地藉由異雙官能交聯劑連接。在較佳具體實例中，異雙官能交聯劑含有可與經修飾之CMV VLP之較佳第一附著位點反應（較佳與胺基、更佳與離胺酸殘基的胺基反應）的官能基，以及可與較佳第二附著位點（亦即，硫氫基，較佳為抗原固有的半胱胺酸殘基之硫氫基，或人工添加至抗原中的硫氫基）反應且視需要亦可供還原反應用的另一官能基。若干異雙官能交聯劑在此項技術中已知。此等交聯劑包括較佳交聯劑丁二醯亞胺基-6-(b-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺)己酸酯（SMPH）（Pierce）、磺酸基-MBS、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMPB、磺酸基-SMCC、磺酸基-KMUS SVSB、SIA，及可獲自例如Pierce Chemical Company且具有一個對胺基具有反應性之官能基及一個對硫氫基具有反應性之官能基的其他交聯劑。與胺基反應且與硫氫基達成硫醚鍵聯之後，上述交聯劑皆引起醯胺鍵形成。在一極佳具體實例中，該異雙官能交聯劑為SMPH。因此，在一較佳具體實例中，抗原與經修飾之CMV VLP透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵、藉由化學交聯連接，典型地且較佳地藉由異雙官能交聯劑連接，且其中該異雙官能交聯劑為SMPH。適於實施本發明之另一類交聯劑的特徵為偶合後，抗原與經修飾之VLP之間引入二硫鍵聯。屬於此類別的較佳交聯劑包括例如SPDP及磺酸基-LC-SPDP（Pierce）。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列、較佳由其組成；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵、藉由異雙官能交聯劑連接，較佳地其中該異雙官能交聯劑為SMPH，且其中該至少一個第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分，且其中該至少一個第一附著位點為胺基，在此較佳為離胺酸的胺基，且其中該至少一個第二附著位點為硫氫基，在此較佳為半胱胺酸殘基的硫氫基或已化學連接至NGF抗原的硫氫基。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物的投予量為50至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為50至275 µg/劑，較佳地該量為50至250 µg/劑，較佳地該量為50至200 µg/劑，較佳地該量為50至175 µg/劑，較佳地該量為50至150 µg/劑，較佳地該量為62.5至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為62.5至275 µg/劑，較佳地該量為62.5至250 µg/劑，較佳地該量為62.5至200 µg/劑，較佳地該量為62.5至175 µg/劑，較佳地該量為62.5至150 µg/劑，較佳地該量為75至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為75至275 µg/劑，較佳地該量為75至250 µg/劑，較佳地該量為75至200 µg/劑，較佳地該量為75至175 µg/劑，較佳地該量為75至150 µg/劑，較佳地該量為100至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為100至275 µg/劑，較佳地該量為100至250 µg/劑，較佳地該量為100至200 µg/劑，較佳地該量為100至175 µg/劑，較佳地該量為100至150 µg/劑。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物係以至少兩個劑量向犬科動物全身性投予、較佳皮下投予，較佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳14至21天，更佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，更佳14、15、16、17、18、19、20或21天。在該組成物的任何進一步投予之情況下，此類第三、視需要的第四及任何進一步視需要投予包含以下或由以下組成：全身性投予，較佳皮下投予該第三、視需要的第四及視需要的另一劑量，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為二至六個月，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為四至六個月。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。
使用異雙官能交聯劑使抗原與經修飾之CMV VLP連接允許抗原與經修飾之CMV VLP以定向方式連接。使抗原與經修飾之CMV VLP連接的其他方法包括使用碳化二亞胺EDC及NHS使抗原與經修飾之CMV VLP交聯的方法。抗原亦可首先經由與SATA、SATP或亞胺基硫雜環戊烷的反應而發生硫醇化。抗原在必要時脫除保護基之後，接著可與經修飾之CMV VLP如下偶合。分離過量的硫醇化試劑之後，使抗原與經修飾之CMV VLP反應，該經修飾之CMV VLP預先經包含半胱胺酸反應性部分的異雙官能交聯劑活化且且因此呈現至少一個或數個對半胱胺酸殘基具有反應性的官能基，該等官能基可與硫醇化抗原發生反應，諸如上文所述。反應混合物中視需要包括少量的還原劑。在其他方法中，使用同雙官能交聯劑，諸如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3（Pierce）或其中官能基對經修飾之VLP之胺基或羧基具有反應性的其他已知同雙官能交聯劑，將抗原連接至經修飾之CMV VLP。
在本發明之極佳具體實例中，抗原經由已添加至抗原之N端或C端的半胱胺酸殘基或抗原內的天然半胱胺酸殘基連接至經修飾之CMV VLP的離胺酸殘基。在一較佳具體實例中，本發明之組成物進一步包含連接子，其中該連接子使該抗原與該第二附著位點締合，且其中較佳地，該連接子包含該第二附著位點或替代地由該第二附著位點組成。
在抗原上工程改造第二附著位點係藉由連接子的締合來達成，根據本發明之揭示內容，該連接子典型地且較佳地含有至少一個適用作第二附著位點的胺基酸。因此，在本發明之一較佳具體實例中，連接子與抗原藉由至少一個共價鍵締合，較佳藉由至少一個、較佳一個肽鍵締合。較佳地，連接子包含第二附著位點或替代地由第二附著位點組成。在另一較佳具體實例中，連接子包含硫氫基，較佳為半胱胺酸殘基的硫氫基。在另一較佳具體實例中，連接子包含或為半胱胺酸殘基。在本發明的另一較佳具體實例中，連接子由胺基酸組成，其中更佳地，連接子由至多15個胺基酸組成。在本發明之較佳具體實例中，此類胺基酸連接子含有1至10個胺基酸。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列、較佳由其組成；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）藉由異雙官能交聯劑、透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接，其中該異雙官能交聯劑為SMPH，且其中該至少一個第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分，且其中該至少一個第一附著位點為胺基，在此較佳為離胺酸的胺基，且其中該至少一個第二附著位點為硫氫基，在此較佳為已化學連接至NGF抗原的硫氫基。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物的投予量為50至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為50至275 µg/劑，較佳地該量為50至250 µg/劑，較佳地該量為50至200 µg/劑，較佳地該量為50至175 µg/劑，較佳地該量為50至150 µg/劑，較佳地該量為62.5至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為62.5至275 µg/劑，較佳地該量為62.5至250 µg/劑，較佳地該量為62.5至200 µg/劑，較佳地該量為62.5至175 µg/劑，較佳地該量為62.5至150 µg/劑，較佳地該量為75至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為75至275 µg/劑，較佳地該量為75至250 µg/劑，較佳地該量為75至200 µg/劑，較佳地該量為75至175 µg/劑，較佳地該量為75至150 µg/劑，較佳地該量為100至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為100至275 µg/劑，較佳地該量為100至250 µg/劑，較佳地該量為100至200 µg/劑，較佳地該量為100至175 µg/劑，較佳地該量為100至150 µg/劑。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物係以至少兩個劑量向犬科動物全身性投予、較佳皮下投予，較佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳14至21天，更佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，更佳14、15、16、17、18、19、20或21天。在該組成物的任何進一步投予之情況下，此類第三、視需要的第四及任何進一步視需要投予包含以下或由以下組成：全身性投予，較佳皮下投予該第三、視需要的第四及視需要的另一劑量，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為二至六個月，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為四至六個月。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含180個相同的嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列、較佳由其組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含180個相同的嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成。
在另一較佳具體實例中，該抗原為神經生長因子（NGF），其選自人類NGF（hNGF）、犬科動物NGF（cNGF）、貓科動物NGF（fNGF）、馬科動物NGF（eNGF）、牛科動物NGF（bNGF）及豬科動物NGF（pNGF），較佳選自犬科動物NGF（cNGF）或貓科動物NGF（fNGF），且其中更佳地，該抗原為犬科動物NGF（cNGF）。在一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：選自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者的胺基酸序列，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:58中之任一者具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%、更佳至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列。在另一具體實例中，該NGF抗原包含至少兩個連續且至多12個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含4、6、8或10個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含4個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含4個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含由SEQ ID NO:34組成之6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含由SEQ ID NO:34組成之6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含8個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含8個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的N端。在另一具體實例中，該NGF抗原包含10個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤較佳位於NGF抗原的C端或N端。
在一替代性具體實例中，該抗原為人類NGF。在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:54，或與SEQ ID NO:54具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:54。在另一具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:54組成。
在另一極佳具體實例中，該抗原為犬科動物NGF。在一極佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或與SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SED ID NO:33具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一較佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33。在另一較佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33組成。在另一極佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30組成。在另一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:31，或與SEQ ID NO: 31具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且更佳至少98%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:31。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:31組成。在另一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:33，或與SEQ ID NO: 33具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且更佳至少98%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:33。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:33組成。
在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含至少兩個連續且至多12個連續組胺酸殘基、較佳4、6、8或10個連續組胺酸殘基、更佳6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且在此較佳地位於NGF抗原的C端或N端，更佳地位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含4、6、8或10個連續組胺酸殘基、較佳6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且在此較佳地位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且再更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且較佳位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一極佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少92%、更佳至少95%序列一致性且更佳至少98%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且其中該NGF抗原進一步包含6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且位於NGF抗原的N端。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30，且其中該NGF抗原進一步包含至少兩個連續且至多12個連續組胺酸殘基、較佳4、6、8或10個連續組胺酸殘基、更佳6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且在此較佳地位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30，且其中該NGF抗原進一步包含6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且較佳位於NGF抗原的C端或N端，更佳位於NGF抗原的C端。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30，且其中該NGF抗原進一步包含6個連續組胺酸殘基的聚組胺酸標籤，該標籤由SEQ ID NO:34組成且位於NGF抗原的N端。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30組成。
在另一具體實例中，該抗原為貓科動物NGF。在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:55，或與SEQ ID NO:55具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性，且更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:55。在另一具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:55組成。
在另一具體實例中，該抗原為馬科動物NGF。在另一極佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:56，或與SEQ ID NO:56具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性，且更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:56。在另一較佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:56組成。
在另一具體實例中，該抗原為牛科動物NGF。在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:57，或與SEQ ID NO:57具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性，且更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:57。在另一較佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:57組成。
在另一具體實例中，該抗原為豬科動物NGF。在另一具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:58，或與SEQ ID NO:58具有至少90%或至少91%、較佳至少92%、至少93%或至少94%、更佳至少95%、至少96%或至少97%序列一致性，且更佳至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在另一具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:58。在另一較佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:58組成。
在不受約束的情況下，吾等咸信對具有較高等電點的抗原而言且從而對處於用於結合之條件下將整體帶有正電荷的抗原而言，尤其可減少及避免所結合之CMV VLP發生非所需的聚集及形成聚集體。因此，在一較佳具體實例中，該抗原之等電點高於6.5。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點高於6.5且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點高於6.5，其藉由Gasteiger等人所述的ExPASy Compute pI/MW工具所測定（Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D.及Bairoch, A., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, （存在於）John M. Walker（編）: The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)）。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點高於6.5且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0，其藉由Gasteiger等人所述的ExPASy Compute pI/MW工具所測定（Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D.及Bairoch, A., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, （存在於）John M. Walker（編）: The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)）。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點高於6.6、6.7、6.8或6.9。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點高於6.6、6.7、6.8或6.9且低於13.0，較佳低於12.5，且更佳低於12.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點高於6.6、6.7、6.8或6.9，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點高於6.6、6.7、6.8或6.9且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.0且低於13.0，較佳低於12.5，且更佳低於12.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.0，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.0且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.1、7.2、7.3或7.4。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.1、7.2、7.3或7.4且低於13.0，較佳低於12.5，且更佳低於12.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.1、7.2、7.3或7.4，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.1、7.2、7.3或7.4且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.5。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.5且低於13.0，較佳低於12.5，且更佳低於12.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.5，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該抗原之等電點等於或高於7.5且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.6、7.7、7.8或7.9。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.6、7.7、7.8或7.9且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.6、7.7、7.8或7.9，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於7.6、7.7、7.8或7.9且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.0且低於13.0，較佳低於12.5，且更佳低於12.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.0，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.0且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.1、8.2、8.3或8.4。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.1、8.2、8.3或8.4且低於13.0，較佳低於12.5，且更佳低於12.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.1、8.2、8.3或8.4，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.1、8.2、8.3或8.4且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.5。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.5且低於13.0，較佳低於12.5，且更佳低於12.0。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.5，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。在一較佳具體實例中，該NGF抗原之等電點等於或高於8.5且低於13.0、較佳低於12.5且更佳低於12.0，其藉由ExPASy Compute pI/MW工具所測定。
在一極佳具體實例中，包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽包含SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51。在另一極佳具體實例中，該多肽係由SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51組成。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:49。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:50。在另一極佳具體實例中，該多肽包含SEQ ID NO:51。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:49組成。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:50組成。在另一極佳具體實例中，該多肽由SEQ ID NO:51組成。
在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88（Ser）與位置89（Thr）的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84（Ser）與位置85（Thr）的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86（Ser）與位置87（Thr）的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由SEQ ID NO:5之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由SEQ ID NO:39之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該CMV多肽由SEQ ID NO:48之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88（Ser）與位置89（Thr）的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84（Ser）與位置85（Thr）的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86（Ser）與位置87（Thr）的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:48之胺基酸序列組成，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入該SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間、SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間，或SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:5之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:5之位置88與位置89的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:39之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:39之位置84與位置85的胺基酸殘基之間。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:48之胺基酸序列組成，其中該多肽係插入SEQ ID NO:48之位置86與位置87的胺基酸殘基之間。
在一極佳具體實例中，該CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列且包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入SEQ ID NO:5之胺基酸殘基88（Ser）與胺基酸殘基89（Thr）之間，且包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子）或包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*-連接子），其中該第一胺基酸連接子及/或該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser序列。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列且包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽係插入SEQ ID NO:5之胺基酸殘基88（Ser）與胺基酸殘基89（Thr）之間，且包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地為包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸的甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子）或包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys之胺基酸的胺基酸連接子（GS*-連接子），其中該第一胺基酸連接子及/或該第二胺基酸連接子在其N端處具有Gly-Ser序列。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。
在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:10之胺基酸序列之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:11之胺基酸序列之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:12之胺基酸序列之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成之該嵌合CMV多肽的180個複本。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成之該嵌合CMV多肽的180個複本。
在另一極佳具體實例中，該抗原為犬科動物NGF。在一極佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列、較佳由其組成；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且且其中該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性，且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；及其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵、較佳藉由異雙官能交聯劑連接，其中該較佳異雙官能交聯劑為SMPH，且其中該至少一個第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分，且其中該至少一個第一附著位點為胺基，在此較佳為離胺酸的胺基，且其中該至少一個第二附著位點為硫氫基，在此較佳為已化學連接至NGF抗原的硫氫基。
在一極佳具體實例中，該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含180個相同的嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列、較佳由其組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含180個相同的嵌合CMV多肽，其中該嵌合CMV多肽由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成。
在另一較佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33。在另一較佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33組成。在另一極佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:30。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:30組成。在另一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:31，或與SEQ ID NO:31具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:31。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:31組成。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:33組成。在另一較佳具體實例中，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:33，或與SEQ ID NO:33具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。在另一極佳具體實例中，該抗原包含SEQ ID NO:33。在另一極佳具體實例中，該抗原由SEQ ID NO:33組成。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列的該嵌合CMV多肽的至少一個、較佳180個複本，且該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33，或與SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的該嵌合CMV多肽的至少一個、較佳180個複本，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的該嵌合CMV多肽的至少一個、較佳180個複本，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的該嵌合CMV多肽的至少一個、較佳180個複本，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:31，或與SEQ ID NO:31具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的該嵌合CMV多肽的至少一個、較佳180個複本，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:31，或與SEQ ID NO:31具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:12之胺基酸序列的該嵌合CMV多肽的至少一個、較佳180個複本，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:30，或與SEQ ID NO:30具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。在一極佳具體實例中，該經修飾之CMV VLP包含含有SEQ ID NO:12之胺基酸序列的該嵌合CMV多肽的至少一個、較佳180個複本，該抗原包含以下或較佳由以下組成：SEQ ID NO:31，或與SEQ ID NO:31具有至少90%、較佳至少91%或92%、更佳至少93%、94%或至少95%序列一致性且更佳至少96%、97%或至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的胺基酸序列，且較佳地，所有該等第一附著位點不構成或不是包含該段連續的帶負電胺基酸之多肽的一部分。
如本文所描述之經修飾之CMV VLP可在原核或真核表現系統中製備。較佳系統為大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞以及哺乳動物細胞株。極佳地，該經修飾之CMV VLP或該CMV VLP係藉由將該嵌合CMV多肽表現於大腸桿菌中而獲得，且其中較佳地，該表現係在10℃至35℃之間的溫度下實現。
因此，在另一態樣中，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   經修飾的黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成的多肽，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，且其中該多肽係插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、較佳經由至少一個共價非肽鍵連接，且其中該經修飾之CMV VLP係藉由將該嵌合CMV多肽表現於大腸桿菌中而獲得，且其中較佳地，該表現係在10℃至35℃之間的溫度下實現。
用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的該經修飾的黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP）係如下自表現該經修飾之CMV VLP的重組細菌宿主純化的：（a）溶解該細菌宿主；（b）澄清藉由該溶解獲得之溶解物；（c）藉由陰離子交換層析（anion exchange chromatography；AEX）自經澄清溶解物純化該經修飾之CMV VLP；其中該等步驟按給定次序進行。
在另一具體實例中，該含有NGF之CMV VLP組成物包含佐劑。典型且較佳的佐劑為礦物鹽（例如氫氧化鋁、磷酸鋁）、微晶酪胺酸、乳液、微粒、皂素（Quil A）、細胞介素、免疫增強劑、微生物組分/產品、脂質體、複合物及黏膜佐劑，其係已知的且描述於例如Adjuvant Compendium NIAID and VAC（nih.gov）或Aguilar等人（Aguilar JC等人, 2007, Vaccine 25:3752-3762）、Gerdts（Gerdts V, 2015, Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 128:456-463)及Pasquale等人（Pasquale等人, 2015, Vaccines 3:320-343）。在一較佳具體實例中，該組成物包含佐劑，其中該佐劑為氫氧化鋁。在另一較佳具體實例中，該組成物缺乏佐劑。
因此，本發明提供一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且（c）   視需要或甚至較佳地，輔助性T細胞抗原決定基；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接；且其中該組成物進一步包含佐劑。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物的投予量為50至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為50至275 µg/劑，較佳地該量為50至250 µg/劑，較佳地該量為50至200 µg/劑，較佳地該量為50至175 µg/劑，較佳地該量為50至150 µg/劑，較佳地該量為62.5至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為62.5至275 µg/劑，較佳地該量為62.5至250 µg/劑，較佳地該量為62.5至200 µg/劑，較佳地該量為62.5至175 µg/劑，較佳地該量為62.5至150 µg/劑，較佳地該量為75至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為75至275 µg/劑，較佳地該量為75至250 µg/劑，較佳地該量為75至200 µg/劑，較佳地該量為75至175 µg/劑，較佳地該量為75至150 µg/劑，較佳地該量為100至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為100至275 µg/劑，較佳地該量為100至250 µg/劑，較佳地該量為100至200 µg/劑，較佳地該量為100至175 µg/劑，較佳地該量為100至150 µg/劑。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物係以至少兩個劑量向犬科動物全身性投予、較佳皮下投予，較佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳14至21天，更佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，更佳14、15、16、17、18、19、20或21天。在該組成物的任何進一步投予之情況下，此類第三、視需要的第四及任何進一步視需要投予包含以下或由以下組成：全身性投予，較佳皮下投予該第三、視需要的第四及視需要的另一劑量，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為二至六個月，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為四至六個月。
在另一態樣中，本發明提供用於治療犬科動物之NGF相關病症之疫苗，較佳地該等疫苗為包含本文所描述之含有NGF之CMV VLP組成物或替代地由其組成的獸醫學疫苗。涵蓋用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的疫苗，其中該含有NGF之CMV VLP組成物包含單獨或以任何可能組合形式揭示於本文中之技術特徵中之任一者。在一具體實例中，疫苗進一步包含佐劑。在一較佳具體實例中，該疫苗包含佐劑，其中該佐劑為氫氧化鋁。較佳地，該NGF相關病症為疼痛，更佳為選自由以下組成之群的疼痛：傷害感受性疼痛、發炎性疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛，更佳為與退化性關節疾病相關之急性疼痛、與退化性關節疾病相關之慢性疼痛、或甚至為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，更佳為急性OA相關疼痛、慢性OA相關疼痛，或甚至為慢性難治性OA相關疼痛。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物的投予量為50至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為50至275 µg/劑，較佳地該量為50至250 µg/劑，較佳地該量為50至200 µg/劑，較佳地該量為50至175 µg/劑，較佳地該量為50至150 µg/劑，較佳地該量為62.5至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為62.5至275 µg/劑，較佳地該量為62.5至250 µg/劑，較佳地該量為62.5至200 µg/劑，較佳地該量為62.5至175 µg/劑，較佳地該量為62.5至150 µg/劑，較佳地該量為75至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為75至275 µg/劑，較佳地該量為75至250 µg/劑，較佳地該量為75至200 µg/劑，較佳地該量為75至175 µg/劑，較佳地該量為75至150 µg/劑，較佳地該量為100至300 µg/劑，較佳地該量為較佳地該量為100至275 µg/劑，較佳地該量為100至250 µg/劑，較佳地該量為100至200 µg/劑，較佳地該量為100至175 µg/劑，較佳地該量為100至150 µg/劑。較佳地，該（含有NGF之CMV VLP）組成物係以至少兩個劑量向犬科動物全身性投予、較佳皮下投予，較佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳14至21天，更佳地第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，更佳14、15、16、17、18、19、20或21天。在該組成物的任何進一步投予之情況下，此類第三、視需要的第四及任何進一步視需要投予包含以下或由以下組成：全身性投予，較佳皮下投予該第三、視需要的第四及視需要的另一劑量，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為二至六個月，較佳地與相對應的前一次投予的時間間隔為四至六個月。實施例實施例1構築及產生表面電荷經修飾之 CMV VLP
製備根據本發明的不同嵌合CMV多肽，且隨後加以表現，產生本發明的經修飾之CMV VLP。
為此，製備嵌合CMV多肽，其尤其包含連續的帶負電胺基酸的不同多肽，亦即，由4、8或12個麩胺酸殘基組成的多肽（「E4」 - SEQ ID NO:1；「E8」 - SEQ ID NO:2；「E12」 - SEQ ID NO: 3），以便將該等麩胺酸殘基插入經修飾之CMV多肽CMV-Ntt830（SEQ ID NO:5）的胺基酸殘基Ser(88)與Tyr(89)之間。該經修飾之CMV多肽CMV-Ntt830包含來源於破傷風類毒素TT830的輔助性T細胞抗原決定基（SEQ ID NO:6）。編碼該經修飾之CMV多肽CMV-Ntt830的相應核酸序列（SEQ ID NO:7）如WO2016/062720A1實施例3中所述製備。
所製備之嵌合CMV多肽進一步包含在兩端側接所引入之E4、E8及E12多肽的連接子。詳言之，該等所製備的嵌合CMV多肽包含直接位於所引入之E4、E8及E12多肽之N端的GGS-連接子或GGGS-連接子（SEQ ID NO:8），及直接位於所引入之E4、E8及E12多肽之C端的GGGSGS-連接子（SEQ ID NO:9）或CGGGSGS-連接子（SEQ ID NO:4）。
該等所製備之嵌合CMV多肽的所得胺基酸序列命名為「CMV-Ntt830-E4」、「CMV-Ntt830-E8」、「CMV-Ntt830-E8*」及「CMV-Ntt830-E12」且具有如下胺基酸序列：「CMV-Ntt830-E4」:    SEQ ID NO:10；「CMV-Ntt830-E8」:    SEQ ID NO:11；「CMV-Ntt830-E8*」:  SEQ ID NO:12；「CMV-Ntt830-E12」:  SEQ ID NO:13。
該等較佳嵌合CMV多肽之相應核苷酸序列如下：「CMV-Ntt830-E4」:    SEQ ID NO:14；「CMV-Ntt830-E8」:    SEQ ID NO:15；「CMV-Ntt830-E8*」:  SEQ ID NO:16；「CMV-Ntt830-E12」:  SEQ ID NO:17。
首先，製備嵌合CMV多肽CMV-Ntt830-E8*。在此及在第一步驟中，利用PCR誘變將包括側接型連接子之E8編碼序列併入經修飾之CMV中。使用以下寡核苷酸，利用兩步驟PCR擴增編碼E8序列的PCR片段，包括側接型連接子以及經修飾之CMV的3'端片段：正向：       E8*-1F（SEQ ID NO:18）正向：       E8*-2F（SEQ ID NO:19）反向：       CMcpR（SEQ ID NO:20）。
因此，使用E8*-1F/CMcpR寡核苷酸及pET-CMV-Ntt830質體作為模板來執行PCR反應。模板pET-CMV-Ntt830如WO2016/062720A1之實施例3中所述製備。使用寡核苷酸E8*-2F/CMcpR及來自第一次PCR的PCR產物進行第二次PCR之後，獲得目標PCR產物。將所得PCR產物選殖於輔助載體pTZ57（InsTAclone PCR選殖套組，Fermentas #K1214）中。在大腸桿菌XL1-Blue細胞中擴增含有PCR產物的質體，且將質體DNA純化且使用BigDye循環定序套組及ABI Prism 3100基因分析儀（Applied Biosystems）進行定序。結果，在PCR不出錯的情況下獲得輔助質體pTZ-CMV-E8*。
作為下一步驟，使用相同限制位點，將pTZ-CMV-E8*的BamHI/HindIII片段選殖回至pET-CMV-Ntt830B輔助載體中，得到表現載體pET-CMVB2-Ntt-E8C（圖1）。
輔助載體pET-CMV-Ntt830B係用於將編碼包含一段連續的帶負電胺基酸之多肽的DNA序列引入CMV-Ntt830的相應CMV DNA序列中，含有BamHI位點的序列係在相應位置引入以便隨後選殖。編碼CMV-Ntt830的核酸序列如WO2016/062720A1之實施例3中所述製備且對應於WO2016/062720A1之SEQ ID NO:14。
BamHI位點係藉由兩步PCR誘變、使用下文列舉的寡核苷酸及先前構築的pET-CMV-Ntt830作為模板來引入。如所指示，模板pET-CMV-Ntt830如WO2016/062720A1之實施例3中所述製備。第1次PCR：     正向 - pET-90引子（黏接pET28a+）（SEQ ID NO:21）反向 - RGSYrev（SEQ ID NO:22）第2次PCR         正向 - RGSYdir（SEQ ID NO:23）反向 - CMV-AgeR（SEQ ID NO:24）
兩種PCR產物均純化之後，執行下一次PCR以接合PCR片段（不使用引子進行5個循環，接著使用引子pET-90及CMV-AgeR進行25個循環）。
擴增基因之後，將所得PCR產物直接選殖於pTZ57R/T載體（InsTAclone PCR選殖套組，Fermentas #K1214）中。將大腸桿菌XL1-Blue細胞作為宿主用於選殖及質體擴增。
為了避免RT-PCR錯誤，使用BigDye循環定序套組及ABI Prism 3100基因分析儀（Applied Biosystems）對數個含有CMV-Ntt830基因的pTZ57質體純系進行定序。定序之後，使用NcoI及AgeI酶切割序列未出錯的pTZ-質體純系，該純系因所引入的BamHI位點而含有CMV-Ntt830B基因。接著將片段次選殖入pET-CMV-Ntt830的NcoI/AgeI位點，得到輔助載體pET-CMV-Ntt830B。
在大腸桿菌C2566細胞中產生CMV-Ntt830-E8* VLP（New England Biolabs, USA）。如下使用大腸桿菌細胞培養、生物質處理及純化方法產生VLP：1）將3 g生物質懸浮於20 ml的50 mM檸檬酸鈉、5 mM硼酸鈉、5 mM EDTA、5 mM巰基乙醇pH 9.0中，用超音波處理懸浮液（Hielscher音波處理器UP200S，16 min，波幅70%，循環0.5）；2）在+4℃下，以11000 rpm將溶解物離心20 min；3）在35 ml管中，在含有50 mM檸檬酸鈉、5 mM硼酸鈉、2 mM EDTA、0.5% TX-100之緩衝液中製備蔗糖梯度（20-60%）；4）將5 ml VLP樣本覆蓋於蔗糖梯度上；5）使用SW32轉子Beckman（25000 rpm，在+18℃下）離心6h；6）將各梯度管的內容物分成6 ml溶離份。合併相應溶離份；7）在SDS上分析梯度溶離份。
蔗糖梯度純化之後，對VLP進行的SDS-PAGE分析展現均質CMV-Ntt830-E8*外殼蛋白單體（圖2A）且電子顯微法顯示完整VLP（圖2B）。
相應地且如下製備嵌合CMV多肽CMV-Ntt830-E4、CMV-Ntt830-E8及CMV-Ntt830-E12。第一步驟係利用PCR誘變將包括側接型連接子的聚麩胺酸編碼序列併入經修飾之CMV中。使用以下各對寡核苷酸與質體pET-CMVB2-Ntt-E8*作為模板，藉由PCR擴增編碼聚麩胺酸序列的PCR片段，包括側接型連接子以及經修飾之CMV的3'端片段：1）正向：        E4-F（SEQ ID NO:25）反向：        CMcpR（SEQ ID NO:20）;2）正向：        E8-F（SEQ ID NO:26）反向：        CMcpR（SEQ ID NO:20）;3）正向：        E12-F（SEQ ID NO:27）反向：        CMcpR（SEQ ID NO:20）。
將所得PCR產物選殖於輔助載體pTZ57（InsTAclone PCR選殖套組，Fermentas #K1214）中。在大腸桿菌XL1-Blue細胞中擴增含有PCR產物的質體，且將質體DNA純化且使用BigDye循環定序套組及ABI Prism 3100基因分析儀（Applied Biosystems）進行定序。因此在PCR不出錯的情況下獲得輔助質體pTZ-CMV-E4、pTZ-CMV-E8及pTZ-CMV-E12。
接下來，利用相同的限制位點，將pTZ-CMV-E4、pTZ-CMV-E8及pTZ-CMV-E12的BamHI/HindIII消化片段選殖回至pET-CMV-Ntt830B（參見上文）。因此獲得表現載體pET-CMVB2-Ntt-E4（圖3）、pET-CMVB2-Ntt-E8（圖4）及pET-CMVB2-Ntt-E12（圖5）。將表現載體轉形為大腸桿菌C2566細胞（New England Biolabs, USA）。使用上文關於CMV-Ntt830-E8* VLP所述的大腸桿菌細胞培養、生物質處理及純化方法產生VLP。蔗糖梯度純化之後，對VLP進行的SDS-PAGE分析展現所有3種聚麩胺酸構築體均獲得近似均質的CMV外殼蛋白單體（圖6、圖7、圖8）。然而，瓊脂糖凝膠分析顯示，僅CMV-Ntt830-E4及CMV-Ntt830-E8形成完整粒子，而CMV-E12則未形成完整粒子（圖6、圖7、圖8）。電子顯微法顯示，CMV-Ntt830-E4及CMV-Ntt830-E8形成完整VLP（圖9、圖10）。實施例2相比於表面不帶電荷之 CMV VLP ，表面電荷經修飾之 CMV VLP 的穩定性熱穩定性
藉由量測先前技術CMV-Ntt830 VLP（如WO2016/062720A1之實施例3及實施例4中所述製備）及本發明CMV-Ntt830-E4 VLP隨著溫度升高而發生的變性且測定對應的解鏈溫度來證明本發明之表面電荷經修飾之CMV VLP的熱穩定性增加。
出於此目的，使用涉及溫度誘導變性及螢光染料SYPRO® Orange（Sigma，Saint Louis, USA）的熱轉移分析。該染料天然地在溶液中中止，但隨著VLP在溫度升高時變性，SYPRO® Orange與暴露的疏水性胺基酸及核心發生相互作用且發射螢光信號，該螢光信號藉由螢光測定法量測。根據所得解鏈曲線（螢光信號相對於溫度）確定解鏈峰值曲gfv'線及解鏈溫度。使用即時PCR系統MJ Mini（Bio-Rad, Hercules, USA），利用DNA解鏈點溫度測定程式，對含有0.5 mg/ml經蔗糖密度梯度純化（如以上實施例1中所述）之CMV-Ntt830 VLP或CMV-Ntt830-E4 VLP於5 mM磷酸鈉、2 mM EDTA pH 7.5中的溶液進行分析。使用Opticon監測軟體分析數據且在四參數的平滑設置下處理解鏈曲線。圖11顯示經純化之CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP的解鏈峰值曲線。
對應的解鏈溫度經估算為51℃及57℃，證明根據本發明之表面電荷經修飾之CMV VLP的熱穩定性相比於先前技術CMV-Ntt830 VLP增加。離子強度/鹽穩定性
離子強度對殼體穩定性具有重要作用。溶液中的鹽與外殼蛋白及VLP表面上帶電荷殘基發生相互作用，影響水殼層且不利於疏水性暴露，且從而影響總體VLP穩定性。
藉由在室溫下在不同的NaCl濃度下培育經純化之VLP（0.5 mg/ml，於5 mM磷酸鈉、2 mM EDTA中，pH 7.5）來測試CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP對NaCl的相對穩定性。在20 mM NaCl存在下經歷2小時之後，CMV-Ntt830 VLP變得相對不穩定且形成眼睛可見且天然凝膠電泳可展現的大比例聚集體（圖12）。相比之下，CMV-Ntt830-E4 VLP即使在高達0.4 M的NaCl濃度下，亦無聚集體形成的證據（圖12）。
本發明之經修飾之CMV VLP的表面電荷修飾在較高鹽溶液中引起的穩定性改良對如實施例3中所述之離子交換層析的可處理性具有重要作用。實施例3相比於表面不帶電荷之 CMV VLP ，表面電荷經修飾之 CMV VLP 的純化潛力
如先前技術中（諸如WO2016/062720A1之實施例2-4中）所述用於實驗室規模CMV VLP製造方法中以及用於製備如以上實施例1中所述之本發明經修飾之CMV VLP的蔗糖梯度/緩衝超離心純化步驟提供適合產量及純度的CMV VLP，用於後續結合、疫苗製造及臨床前評估。然而，此方法無法簡單地以及成本有效地用於產生供商業目的用的疫苗。
離子交換層析（IEX）典型地可容易擴大且在下游製程中用於生物製劑的商業生產。其係基於溶液中帶電荷的分子/大分子與固定的帶相反電荷之層析樹脂之間的可逆離子相互作用。實例為陰離子交換層析（AEX），其中固定相（樹脂）係帶正電及帶負電的分子，諸如所結合的蛋白質。樹脂與樣本的相互作用可藉由施加相對離子（諸如Cl-）來破壞。IEX通常以結合/溶離方式使用，以提供所需樣本的快速捕捉、高解析度純化及濃縮。其可在下游製程的初始階段（例如溶解物澄清之後）、中間階段或次末階段中使用。
為了IEX有效地結合及溶離CMV VLP，CMV VLP在結合及溶離階段期間所遇到的離子環境中必需穩定。離子交換樹脂與溶離鹽上的電荷均促成離子環境。
先前技術的CMV-Ntt830 VLP以及本發明的經修飾之CMV VLP（諸如CMV-Ntt830-E4、CMV-Ntt830-E8及CMV-Ntt830-E8*）在約pH 9及更低pH下帶有淨負電荷，如其在NAGE中向帶正電的電極遷移所表明。因此，陰離子交換層析（AIX）為預期已對兩種CMV VLP粒子發揮作用的技術。
然而，情況並非如此，原因在於如上文在實施例2中所述的CMV-Ntt830 VLP在溶液中、在已達20 mM的NaCl存在下相對不穩定且形成聚集體而沉澱。相比之下，本發明的經修飾之CMV VLP，諸如CMV-Ntt830-E4 VLP，在高達0.4 M的NaCl濃度下不形成聚集體（圖12，圖塊B）。對VLP進行表面電荷修飾而引起的在較高鹽溶液中之穩定性改良係離子交換層析法對其的可處理性必不可少的。藉由陰離子交換層析（AEX）純化。
為了測試陰離子交換層析（AEX）對先前技術CMV-Ntt830 VLP的可處理性，如WO2016/062720A1的實施例2-4中所述製備蔗糖梯度純化的VLP。將5 ml的CMV-Ntt830 VLP（1 mg/ml）在5 mM硼酸鈉pH 9中緩衝交換且負載至經相同緩衝液平衡的1.0 ml Macro-Prep DEAE Bio-Rad陰離子交換料筒上。負載步驟之後，逐步增加溶離緩衝液中的NaCl濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0及2.0 M）。收集溶離份且使用量測蛋白質的Nanodrop分光光度計、在260 nm量測，且進行天然瓊脂糖凝膠電泳（NAGE）。
針對相應溶離份繪製的蛋白質溶離及NaCl濃度之所得層析圖（圖13，圖塊A）顯示CMV-Ntt830 VLP不作為單峰溶離，此為AIX所特有的。相反，CMV-Ntt830 VLP在負載（在0 M NaCl下）及後續溶離步驟（在一系列NaCl濃度下，主要為0.2至0.8 M）期間以寬泛的非特異性方式溶離。關鍵是，自管柱溶離之後，含有VLP的溶離份為混濁的且含有顯著比例的VLP聚集體，如NAGE之後、負載孔中存在溴化乙錠染色的VLP所表明（圖13，圖塊B）。CMV-Ntt830 VLP以非離散方式聚集且溶離的傾向妨礙此方法隨時用於按比例擴大的製造。
相比之下，使用AEX可容易自粗溶解物純化非聚集的CMV-Ntt830-E4 VLP。將由表現CMV-Ntt830-E4 VLP之大腸桿菌製備的經澄清溶解物（如實施例1中所述）於50 mM檸檬酸鹽、5 mM硼酸鹽緩衝液pH 9.0中負載至經相同緩衝液平衡之XK 26/20管柱中的60 ml Fracto-DEAE（Merck）上，且藉由在相同緩衝液中施加0至1.0 M之連續NaCl梯度進行溶離。在A260 nm監測溶離液以量測蛋白質且量測電導率以監測鹽濃度。收集經澄清的溶解物、流過物及溶離份且進行NAGE及SDS-PAGE。
所得層析圖、SDS-PAGE及NAGE分析（圖14）顯示，CMV-Ntt830-E4 VLP不存在於流過物中且完全結合至Fracto-DEAE。隨後在0.2至0.5M NaCl的相對較窄濃度範圍內溶離VLP。此外，沒有證據表明，天然瓊脂糖凝膠的負載孔中存在VLP聚集體。庫馬斯藍染色的SDS-聚丙烯醯胺凝膠顯示，自粗細菌溶解物獲得高純度VLP外殼蛋白。實施例4重組成熟 NGF 的選殖、表現及純化重組NGF的選殖
重新合成cDNA構築體（SEQ ID NO:28）且選殖於pBHA載體（BIONEER公司）中，該cDNA構築體由貓科動物全長NGF前肽序列、犬科動物成熟NGF序列及C端甘胺酸-半胱胺酸-甘胺酸模體組成。對犬科動物NGF序列進行密碼子最佳化。貓科動物全長NGF前肽的所得胺基酸序列提供於包含SEQ ID NO:30之犬科動物成熟NGF序列的SEQ ID NO:29中。與該C端甘胺酸-半胱胺酸-甘胺酸模體連接的犬科動物成熟NGF之胺基酸序列提供於SEQ ID NO:31中。
類似地，重新合成cDNA構築體（SEQ ID NO:32）且選殖於pBHA載體（BIONEER公司）中，該cDNA構築體由貓科動物全長NGF前肽序列、犬科動物成熟NGF序列、C端甘胺酸-半胱胺酸-甘胺酸模體及his標籤組成。所包括的his標籤未實現用於純化的任何作用，但其存在增加了下游製程中的再摺疊效率。所得胺基酸序列提供於包含SEQ ID NO:30之犬科動物成熟NGF序列以及His6-標籤（SEQ ID NO:34）的SEQ ID NO:33中。
藉由PCR將構築體次選殖於表現載體中。簡言之，NGF-pBHA質體用作模板，其中NGF正向引子（SEQ ID NO:35）及NGF反向引子（SEQ ID NO:36）分別含有XbaI及HindIII位點。
NGF PCR產物在TAE緩衝液中進行1%瓊脂糖凝膠電泳且接著使用GeneJet DNA溶離套組（Thermo Fisher Scientific）、根據製造商方案萃取NGF片段。根據製造商方案，在1× FastDigest緩衝液中、在+37℃下用FastDigest XbaI及HindIII（Thermo Fisher Scientific）限制酶消化NGF片段30 min。以相同方式消化pET42a質體（Novagen）。利用瓊脂糖凝膠電泳對NGF及載體消化的DNA片段進行分析且如上所述萃取。根據製造商方案，在室溫下，利用T4連接酶使NGF片段在pET42a載體中接合隔夜。
藉由熱休克方法將NGF-pET42a構築體轉形於化學勝任型大腸桿菌DH5α細胞中。將細胞懸浮於1 ml LB培養基中且在+37℃下、在振盪下培育1小時且接種於含有60 μg/ml康黴素（kanamycin）的LB瓊脂上且在37℃下培育隔夜。將個別群落接種於含有30 μg/ml卡那黴素的LB培養基中且在+37℃下、在振盪下培育隔夜。使用GeneJet質體小規模純化套組（Thermo Fisher Scientific），根據製造商方案自個別純系培養物中萃取DNA。
使用BigDye Terminator v3.1循環定序套組（Thermo Fisher Scientific），根據製造商方案，藉由桑格定序來證實SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:32之NGF構築體的正確序列。重組犬科動物成熟NGF的表現及純化
將NGF-pET42a質體轉形於化學勝任型大腸桿菌BL21-DE3（Sigma-Aldrich）細胞中。將細胞懸浮於1 ml LB培養基中且在+37℃下、在振盪下培育1小時。將細胞接種於含有60 μg/ml卡那黴素的LB瓊脂上且在37℃下培育隔夜。將NGF-pET42轉形之BL21-DE3細胞的數個群落接種於含有30 μg/ml卡那黴素的LB培養基中且在37℃下培育隔夜，且接著添加至含有30 μg/ml卡那黴素的2× TY培養基中且在37℃下、在振盪下培養直至達到0.7個單位的OD540nm為止。藉由添加IPTG直至最終濃度為1 mM來誘導重組蛋白質表現且在37℃下、在振盪下再培養細胞4小時。藉由以5000 g離心15分鐘來收集生物質，將其冷凍且儲存於-70℃。
將生物質懸浮於溶解緩衝液（40 mM Tris-HCl（pH 8.0）、200 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM DTT及1% Triton X-100）中且使用UP200S（Hielscher）超音波裝置、藉由超音波處理溶解細胞。所得音波處理物以15557 g離心40 min。捨棄上清液且將溶解緩衝液添加至沉澱中，藉由音波處理再次懸浮。將懸浮液以15557 g離心15 min且再次捨棄上清液。此洗滌步驟重複三次以上。最後用50%溶解緩衝液及3.5 M尿素洗滌沉澱。再懸浮及離心之後，用8 M鹽酸胍及0.1 M二硫蘇糖醇溶解沉澱。將懸浮液藉由音波處理均質化10分鐘，接著以15557 g離心25 min。收集上清液（含有溶解的變性NGF）且使用45 μm過濾器過濾，接著在7℃下、在恆定攪拌下逐滴添加至再摺疊緩衝液（0.75 M L-精胺酸、0.1 M Tris、1 mM EDTA、5 mM還原麩胱甘肽及0.5 mM氧化麩胱甘肽pH 9.5）中，直至最終濃度為每100 ml再摺疊緩衝液有5 ml NGF溶液。隔夜培育之後，將再摺疊溶液以10000 g離心10分鐘，且收集上清液且在+7℃下培育一週。將溶液用去離子水稀釋三倍，升溫至室溫，且用乙酸將pH調節至6.8。隨後將溶液在室溫下以7000 g離心10分鐘以移除沉澱物且負載於預先經50 mM磷酸鈉緩衝液（pH 6.5）平衡的5 ml Capto S陽離子交換管柱上。接著在50 mM磷酸鈉緩衝液（pH 6.5）中，經由0-1 M NaCl的梯度溶離蛋白質。使用SDS-PAGE分析所溶離的溶離份且將含有proNGF的溶離份混合且經由超濾濃縮至2-3 mg/ml。將複性的proNGF在室內、以30:1體積比、用TrypZean（Sigma-Aldrich，目錄號T3449）胰蛋白酶溶液消化4小時。藉由添加PMSF直至最終濃度為1 mM來終止反應，接著負載於經0.5 M NaCl及30 mM磷酸鹽（pH 6.8）平衡的Superdex 200 10/300 GL尺寸排阻管柱上。
收集溶離份且使用SDS-PAGE進行分析（圖15A；圖示為SEQ ID NO:28之cDNA構築體及SEQ ID NO:29之貓科動物全長NGF前肽的所得胺基酸序列）且將含有成熟NGF的溶離份混合且藉由超濾濃縮至2 mg/ml之濃度。
使用生物分析法來證實犬科動物重組成熟NGF的純正性，其顯示犬科動物成熟NGF與小鼠成熟NGF（由R&D systems商業生產）具有相似的誘導神經突之活性（圖15B：圖示為SEQ ID NO:28的cDNA構築體及SEQ ID NO:29之貓科動物全長NGF前肽的所得胺基酸序列）；即正確摺疊且具有生物活性之成熟NGF的已知功能。實施例5犬科動物重組成熟 NGF 與經修飾之 CMV VLP 的偶合
使包含犬科動物成熟NGF（SEQ ID NO:30）的各種NGF抗原共價連接至如上文所述製備的各種經修飾之CMV VLP。根據Schmitz N等人, J Exp Med (2009) 206: 1941-1955中所述之方法實現連接。
簡言之，將經純化的CMV-Ntt830、CMV-Ntt830-E4、CMV-Ntt830-E8或CMV-Ntt830-E8* VLP稀釋至1.5 mg/ml且在室溫（RT）下與異雙官能化學交聯劑丁二醯亞胺基-6-(b-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺)己酸酯（SMPH）反應1小時。SMPH含有與VLP表面上的離胺酸反應的NHS酯。SMPH的添加量相較於一個VLP外殼蛋白單體過量約5倍莫耳濃度。與VLP不反應的交聯劑係使用Amicon-Ultra-0.5, 100K離心過濾器（Merck-Millipore，#UFC910024）、藉由離心移除。接著用5 mM Na2HPO4、2 mM EDTA（pH 7.5）洗滌SMPH衍生化的VLP 3次。
詳言之，且針對具有SEQ ID NO:33之cNGF抗原與CMV-Ntt830-E4 VLP的偶合所述：使用蛋白質濃度為7.43 mg/ml的BCA蛋白質分析套組（TFS，目錄號23225），在50 ml管（Sarstedt，無菌，目錄號62.559.001）中，使用5 mM NaHPO4pH 7.5、2 mM EDTA pH 8.0、以3× 44 ml樣品體積將CMV-Ntt830-E4 VLP於5 mM NaHPO4 pH 7.5、2 mM EDTA中的溶液稀釋至1.5 mg/ml的工作濃度，因此，用於衍生化的總體積為132 ml。50 mM（19 mg/ml）SMPH於DMSO中之溶液在臨用前製備。
為了用SMPH對CMV-Ntt830-E4 VLP進行衍生化，將264 μl 50 mM SMPH於DMSO中之溶液添加至先前製備之三個管中的每一者中，該等管含有44 ml CMV-Ntt830-E4 VLP。將混合物渦轉混合5秒且在RT下培育1h。為了去除過量SMPH，將混合物在Eppendorf 5810R離心機中、在Amicon-Ultra-15 100K單元（Merck-Millipore，目錄號UFC910024）上、以3214 g進一步離心7 min。藉由3次以上的離心運作，使用相同參數將緩衝液與5 mM NaHPO4pH 7.5、2 mM EDTA進行交換。最後一次離心運作之後，將總體積調節至132 ml（與衍生化之前相同）。量測260nm處的UV吸收且所衍生的CMV-Ntt830-E4 VLP之濃度經估算為1.5 mg/ml。
接下來且簡言之，在振盪的同時，在RT下，典型地歷時3小時將cNGF抗原以約0.5:1至1:1莫耳比添加至VLP（相對於各別嵌合CMV多肽單體、相對於預先經SMPH衍生化的表面電荷經修飾之CMV VLP）。cNGF抗原的工程化自由半胱胺酸與結合至VLP之交聯劑SMPH中的順丁烯二醯亞胺發生反應以形成穩定的共價鍵聯。
詳言之且針對具有SEQ ID NO:33之cNGF抗原與CMV-Ntt830-E4 VLP的偶合所述：在六個50 ml管（Sarstedt，無菌，目錄號62.559.001）中進行偶合反應。在各管中，將22 ml衍生化CMV-Ntt830-E4 VLP（1.5 mg/ml，60 μM，相對於CMV單體）與3.82 ml SEQ ID NO:33之經緩衝液交換的cNGF（2.33 mg/ml，172.6 μM）混合。由此產生CMV單體:NGF單體 = 1:0.5的莫耳比。在RT下藉由用DSG Titertek（Flow Laboratories）翻滾旋轉來培育反應混合物。在Superdex 200管柱上藉由凝膠過濾（運作緩衝液20 mM NaHPO4pH 7.5、2 mM EDTA）來去除未偶合的cNGF。將10 ml包含cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的溶液負載於經20 mM NaHPO4pH 7.5、2 mM EDTA平衡的HiLoad 26/600 Superdex 200製備級管柱上。將含有cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的溶離份混合且經由0.2 μm過濾器（Sarstedt，目錄號83.1826.001）過濾。凝膠過濾之後收集的樣本體積為280 ml。藉由Amicon-Ultra-15, 100K（Merck-Millipore，目錄號UFC910024）將樣本進一步濃縮至230 ml且經由0.2 μm過濾器（Sarstedt，目錄號83.1826.001）過濾。藉由Qubit量測濃度且用無菌的20 mM NaHPO4pH 7.5、2 mM EDTA緩衝液將最終濃度調節至0.7 mg/ml。量測260 nm處之UV吸光度（A230=6.628及A260=3.722）。
為了展現cNGF抗原與VLP共價結合，藉由SDS-PAGE分析偶合反應。在cNGF與CMV-Ntt830、CMV-Ntt830-E4、CMV-Ntt830-E8及CMV-Ntt830-E8* VLP發生化學偶合之後，觀測到顯著的結合譜帶（圖16A及圖16B）。然而，cNGF-CMV-Ntt VLP形成大聚集體（1400-1700 nm）（圖16C）且自溶液中快速且完全沉澱。
相比之下，在cNGF與CMV-Ntt830-E4、CMV-Ntt830-E8及CMV-Ntt830-E8* VLP共價結合之後，所得經修飾之VLP結合物保持可溶性且不會自溶液中沉澱。藉由動態光散射（DLS）（圖16D、圖16E及圖16F）及電子顯微法（圖16G及圖16H）的分析顯示，經修飾之VLP結合物在溶液中不聚集且具有穩定性。實施例6藉由用犬科動物成熟 NGF 與經修飾之 CMV VLP 偶合的各種本發明結合物免疫來誘導中和抗體狗之免疫
將首次給藥時年齡為22至26個月的六隻雄性比格犬（Beagles）（獲自Marshall US）隨機分成2組（n=3/組）。第一組免疫接種1.0 ml於磷酸鈉緩衝液pH 7.5中調配至250 µg/ml濃度的cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP三次。第二組類似地用在磷酸鈉緩衝液pH 7.5中調配至250 µg/ml濃度之cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP及100 µg/ml Quil-A®佐劑（vivoGen vac-quil）處理。第一次（第0天）、第二次（第21天）及第三次（第42天）免疫接種之前的24小時，使用一次性針及注射器自各動物抽取血液樣品（specimen）。亦在第63天、第84天及第105天抽血。將6 ml血液樣本收集於惰性管中且置於環境溫度下。凝血塊形成後，將管離心，且將血清收集至惰性管中且儲存於約-20℃，直至進行IgG純化及/或分析為止。
在另一研究中，將納入時9月齡的10隻成年比格犬分成2組。免疫接種係使用包含SEQ ID NO:33之cNGF抗原的cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP。因此，第一組的5隻狗用與1.7 mg氫氧化鋁一起調配的每劑250 µg cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP處理，而第二組的5隻狗用不含氫氧化鋁的每劑250 µg cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP處理。在研究第0天及第21天對狗進行兩次皮下投予。在整個研究期間，在第42天、第71天及第91天，亦收集血清樣本。量測NGF及CMV-VLP特異性IgG抗體
對於免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP之狗而言，藉由ELISA量測血清中的抗NGF-及CMV-Ntt830-E8*-VLP特異性IgG抗體。對於免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的狗而言，藉由ELISA量測血清中的抗NGF特異性IgG抗體。
如關於免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP所詳述，Maxisorp ELISA盤在4℃下用濃度為1 μg/ml的於0.1 M碳酸鈉緩衝液pH 9.6中的犬科動物重組成熟NGF蛋白質或CMV-Ntt830-E8*-VLP塗佈隔夜。洗滌培養盤且在RT下歷時2小時添加SuperBlockTM（PBS）阻斷緩衝液（Thermo Fisher/Life Technologies Europe），接著再次洗滌。將血清樣本在含有2% BSA、0.05% Tween 20的PBS中1:9或1:100預稀釋，轉移至ELISA盤中且進行十次3倍連續稀釋。在RT下培育2小時且洗滌之後，添加經辣根過氧化酶（HRP）標記的具有Fcγ片段特異性的山羊抗小鼠IgG（Jackson ImmunoResearch歐洲有限公司）或經HRP標記的兔抗狗IgG（H+L）-HRP（Jackson ImmunoResearch歐洲有限公司），其分別在含有2% BSA、0.05% Tween-20的PBS（PBS pH 7.4（1x）Gibco）中以1:2000或1:2500稀釋。培育及洗滌之後，使用PierceTMTMB受質套組（Thermo Fisher/Life Technologies歐洲公司）進行比色顯影。藉由添加5% H2SO4終止酶反應且使用ELISA讀取器（Tecan Spark 10）、藉由分光光度法量測450 nm處之吸光度。OD50力價描述稀釋度的倒數，其達到最大OD值的一半。TF-1細胞的中和分析法
使用生物活性分析法測定免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP及cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP之狗之血清的中和能力，該生物活性分析法涉及量測TF-1紅血球母細胞瘤細胞株（美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）, Manassas, VA）的增殖。
為了免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP，收集TF-1細胞，用PBS（PBS pH 7.4（1x）Gibco）洗滌三次且在饑餓培養基（補充有熱滅活10% FBS、1× A/A的RPMI 1640培養基（ATCC修飾））中以105個細胞/ml的細胞密度培養隔夜。將104個TF-1細胞接種於平底96孔盤的每孔總共100 µl分析培養基（不含苯酚紅的RPMI，該RPMI含有10% FBS、2 mM GlutaMax、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500 mg/L葡萄糖、1500 mg/L碳酸氫鈉、100 U/mL青黴素、100 µg/mL鏈黴素、25 µg/mL兩性黴素B）中。
為了測試藉由用cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫而產生之抗體的試管內中和活性，收集經免疫之狗的血清且使用用於小鼠IgG純化的Invitrogen DynabeadsTM蛋白質G（Thermo Fisher/Life Technologies Europe）及用於狗的Pierce蛋白質A磁珠（Thermo Fisher/Life Technologies Europe），根據製造商說明書純化總IgG。藉由將恆定濃度的5 ng/ml人類成熟NGF（R&D，256-GF-100/CF）與濃度增加的經純化之狗總IgG（625-20000 ng/mL）、人類成熟NGF多株抗體（R&D AF-256-NA）或人類成熟NGF單株抗體（R&D MAB256-500）一起在室溫下培育1小時來測試經純化之總IgG中和NGF生物活性的能力。接著將NGF-抗體溶液添加至饑餓隔夜的104個TF-1細胞中且使用基於BrdU的細胞增殖ELISA（Roche）定量總共72小時培育時間之最後24小時時段內的細胞增殖。遵循製造商說明書且使用5%硫酸終止顯色。使用690 nm的參照波長，量測450 nm處之吸光度。
根據針對感染前基線（第0天）收集的血清中純化之IgG所量測的增殖，計算針對各IgG稀釋度之增殖百分比。數據表示為增殖百分比對IgG濃度。使用GraphPad Prism（Windows 8.0.0版, GraphPad Software, San Diego, California USA, www.graphpad.com）擬合反曲4PL曲線，以測定為了對增殖達成50%抑制所需之IgG濃度（50%中和力價NT50）。
在用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP免疫之後，如下測定狗中的NGF中和抗體：收集TF-1細胞且用PBS洗滌3次，隨後以2×105個細胞/mL的細胞密度再懸浮於饑餓培養基（不含苯酚紅的RPMI（Sigma），該RPMI含有10% HI-FBS、2 mM GlutaMax（Gibco）、10 mM HEPES（Sigma）、1 mM丙酮酸鈉（Sigma）、4500 mg/L葡萄糖（Gibco）、1500 mg/L碳酸氫鈉、100 U/mL青黴素、100 µg/mL鏈黴素、25 µg/mL兩性黴素B（100×抗-抗Gibco））。將血清樣本在56℃下熱滅活30分鐘，接著在饑餓培養基中1:25稀釋（1:100最終濃度的4倍）且進行2倍連續稀釋。將hNGF稀釋至20 ng/mL（5 ng/mL最終濃度的4倍）且添加25 µL至含有25 µL預稀釋血清或25 µL饑餓培養基的孔（陽性對照孔）中。代替hNGF，將50 µL饑餓培養基添加至陰性對照孔中。將hNGF-血清/抗體混合物在室溫下培育1小時。收集血清饑餓的TF-1細胞，且以平底96孔盤每孔1×104個細胞的細胞密度添加50 µL細胞懸浮液。每個盤的最終樣本體積為每孔100 µL。將細胞培養盤在5% CO2細胞培育箱中、在+37℃下培育約68小時。藉由Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution細胞增殖分析法（Promega）定量細胞生存力。每孔添加20 µL CellTiter 96® Aqueous One Solution試劑。將培養盤在加濕的5% CO2培育箱中、在+37℃下培育7小時。以700 nm為參照波長，記錄490 nm處之吸光度。為了測定IC50值，藉由使用GraphPad prism軟體（Windows的GraphPad Prism 8版及9版，GraphPad Software, San Diego, California USA）將血清樣本的OD值相對於稀釋因數作圖來生成調定曲線。使用4-PL回歸曲線擬合模型測定IC50值，即對應於半最大OD值的稀釋因數。定義樣本在不同時間點的血清力價且描繪為曲線擬合的IC50值。結果犬科動物實驗
就接受cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP但未接受佐劑之動物而言，在單次投予疫苗之後的第21天（圖17A）收集的血清中觀測到可偵測的抗NGF IgG力價。第42天（第二次投予疫苗之後的第3週）血清中的NGF特異性IgG力價最高。第42天進行第三次注射之後，所有動物的力價一致保持高位直至第63天，且此後逐漸下降。抗CMV IgG力價的量值類似於針對犬科動物成熟NGF所量測的彼等量值，但反應動力學存在略微差異（圖17C）。抗CMV IgG抗體存在某種程度的延遲且唯一明確的係可在第二次免疫之後第42天起偵測到，且在第三次免疫之後的第63天血清中量測到峰值力價，隨後力價下降。
對於用cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP與佐劑Quil A之組合免疫的動物，首先在第0天單次投予疫苗之後的第21天血清中偵測到抗NGF IgG抗體（圖17B）。第二次及第三次劑量的疫苗使三隻動物中之兩隻的力價增加，其中在第63天收集的血清中量測到峰值力價。第三隻動物在第42天達到其峰值力價，表明第三次劑量的疫苗可能不增加抗體反應。抗CMV IgG抗體力價的動力學及量值類似於針對犬科動物成熟NGF所量測的彼等值（圖17D）。
就接受cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP、但未接受佐劑之動物而言，在5隻研究動物的4隻中，在單次投予疫苗之後的第21天（圖18E）收集的血清中觀測到可偵測的抗NGF IgG力價。在第42天投予第二次劑量之後的第21天觀測到最高力價。
對於用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP與氫氧化鋁組合免疫的動物，在第0天單次投予疫苗之後的第3週偵測到所有動物出現抗NGF IgG抗體（圖17F）。第二次劑量的疫苗增加平均群組力價。
使用生物分析法，基於NGF介導之TF-1細胞增殖來分析作為對用cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP疫苗接種的反應而誘導之抗NGF IgG抗體的中和能力。自經免疫之狗純化的IgG抗體以濃度依賴性方式抑制成熟NGF誘導的增殖，而自相同動物之免疫前血清純化的IgG抗體則不然（圖18A）。用cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP疫苗接種會誘導高中和力價，疫苗與Quil A佐劑共投予可進一步增加中和力價（圖18B）。此觀測結果反映上述此等狗中的抗NGF ELISA IgG力價。觀測到抗NGF力價與中和能力之間明確相關（圖18C）。相對於對NGF介導之TF-1細胞增殖的抑制，自具有高疫苗特異性力價之血清純化的IgG具有增加的效力。
用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP疫苗接種會誘導中和性抗NGF抗體力價。第42天，在自兩次免疫接種cNGF-CMV-Ntt830-E4（在氫氧化鋁存在下）之狗收集的血清中觀測到高含量的中和性抗NGF抗體（圖18D）。
此等結果顯示，犬科動物成熟NGF與根據本發明之包含嵌合CMV多肽之經修飾之VLP偶合的結合物在狗（目標物種）中能夠克服針對內源目標抗原的免疫耐受性且誘導NGF特異性IgG抗體。此外，此等抗體能夠有效地在試管內中和犬科動物成熟NGF活性。實施例7實驗用犬急性發炎性疼痛之實驗高嶺土模型的功效評定研究目標
該研究之主要目標為（1）使用陽性（非類固醇抗炎藥-NSAID）及陰性（安慰劑）對照，測試根據本發明之較佳組成物及疫苗候選物（亦即實施例5中製備的cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP）在狗發炎性疼痛高嶺土模型中減輕疼痛的功效，以及（2）在同一模型中比較本發明組成物及疫苗後續與先前技術的單株抗體mAb（名為貝汀維單抗）（商業化為Librela®）的功效。
該研究之次要目標係確認疫苗接種階段完成後血清中抗NGF抗體的動力學特徵，以確保在各模式之循環力價峰值處評定本發明之疫苗候選物及貝汀維單抗的功效。研究設計：
使用二十八（28）隻狗來研究本發明之疫苗在實驗用比格犬的高嶺土模型中克服與發炎相關之疼痛的能力。抵達時狗的年齡為8個月。平均（±SD）體重為12.36±1.63 kg。基於獸醫進行的全面臨床檢查以及生化及血液學分析，所有狗均被視為健康的。沒有動物被自研究中去除。
將狗分配至四組（每組七隻狗）：Librela®組（第1組）、疫苗組（第2組）、Inflacam®組（狗用NSAID）（第3組）及安慰劑組（第4組）。-    對於Librela®組，在35天（D35）對狗進行一次頸後皮下治療，對於體重在5.0至10.0 kg之間的狗，劑量為5 mg貝汀維單抗/狗，且對於體重在10.1至20 kg之間的狗，劑量為10 mg貝汀維單抗/狗。貝汀維單抗的實際投予劑量範圍為0.52-0.97 mg/kg，符合上市許可的產品資訊。-    對於疫苗組，狗在第0天（D0）及第21天（D21）在頸後經皮下接受本發明之疫苗候選物cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP兩次，劑量為250 μg VLP-NGF/狗。第一次及第二次投予的CMV VLP-NGF實際投予劑量範圍為0.02-0.03 mg/kg。-    對於Inflacam®組，狗在第43天（D43）在頸後經皮下接受Inflacam®一次，劑量為0.2 mg美洛昔康/kg，符合上市許可之產品資訊。-    對於安慰劑組，狗在D0及21在頸後經皮下接受1毫升注射用水兩次。
實現兩種模式（亦即疫苗候選物cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP與先前技術的mAb貝汀維單抗）之不同投予日期及方案，以確保在攻擊時（D42）達到其各別峰值力價。此意謂CMV VLP-NGF疫苗候選物係在D0及D21給予，而mAb係在D35投予，因為其藥物動力學特徵不同。
在D0、D21、D70、D84、D105及D119之以下時間點收集僅疫苗組及安慰劑組的血液樣本以供血清學檢查，在D35收集僅Librela®組之血液樣本，在D42及D56收集三個組的血液樣本。將血液樣本離心，且將血清傾析成每樣本三個等分試樣。
基於「Paw inflammation model in dogs for preclinical pharmacokinetic/pharmacodynamic investigations of nonsteroidal anti-inflammatory drugs」（Jeunesse等人，2011, J Pharmacol Exp Ther., 338(2):548-58）中所描述之模型，進行高嶺土誘發之後爪炎症實驗。簡言之，藉由靜脈內投藥異丙酚（Propovet, 6.5 mg/kg, Zoetis, France）對狗進行麻醉，且在其一隻腳爪上經皮下注射高嶺土。在D42，對所有狗的右後爪進行注射。
跛行評分係根據每隻狗的典型病程，使用最初由Giraudel 等人（Giraudel JM等人，2005, Br J Pharmacol 146:642-653；Giraudel JM等人，2005, J Vet Pharmacol Ther 28:275-285）針對貓開發且由Jeunesse等人（Jeunesse等人，2011, J Pharmacol Exp Ther., 338(2):548-58）改編之數值評定量表來進行評定。用於評估發炎腳爪跛行之數值評定量表係基於檢查者之感覺且評分係如下確定的：（0）無跛行；（1）在大部分觀測期內幾乎偵測不到跛行；（2）輕度跛行，負重最大；（3）中度跛行，負重最小；（4）重度跛行，動物使用爪子（開始行走運動及/或輕輕接觸地面）但不負重；（5）動物跛行程度最大，拒絕移動及/或避免發炎的爪子與地面有任何接觸。跛行評分由不同的操作員在現場及經視訊分別進行評定。然後，對評分進行比較，若有分歧，則由對狗之治療不知情的操作員做出最終決定。
在D34及D36誘導炎症之前、在自D43（投予高嶺土後1天）至D52（投予高嶺土後10天）以及自D55（投予高嶺土後13天）至D56（投予高嶺土後14天）每天一次誘導炎症之後，量測所有狗的跛行評分。血清學方法：
藉由 ELISA 量測之抗 NGF 及抗 CMV VLP 總 IgG 抗體反應 ：藉由ELISA量測血清中之NGF-及cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP總特異性IgG抗體。ELISA盤塗有重組產生的犬科動物NGF蛋白（1.0 µg/mL）或cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP（2.0 µg/mL）。將血清樣本1:100預稀釋，轉移至ELISA盤中，且進行3倍連續稀釋步驟的連續稀釋，其中各血清樣本共測試11個稀釋度。培育後，添加辣根過氧化酶（HRP）標記之山羊抗狗IgG（Jackson ImmunoResearch，目錄號304-035-008，批次156911）。在室溫下培育2小時後，用1×PBS/0.05%（v/v）Tween 20洗滌培養盤4次。將根據製造商說明（OPD錠劑（Sigma目錄號P6912，批次SLBW6989及SLCJ3691）、磷酸檸檬酸鹽緩衝液錠劑（Sigma目錄號P4809，批次SLCH5937）、30% H2O2（Sigma目錄號H1009，批次STBJ6341）製備之每孔100 µL OPD受質用於比色顯影。藉由每孔添加50 µL 2 M H2SO4來終止酶促反應，且使用ELISA讀取器，藉由分光光度法量測490 nm處之吸光度。藉由將血清樣本的OD490nm值相對於稀釋因數作圖來生成調定曲線。使用4參數邏輯回歸曲線擬合模型測定EC50值，即對應於半最大OD490nm值的稀釋因數。定義樣本在不同時間點的血清力價且描繪為曲線擬合的EC50值。低於分析法之偵測極限之力價針對抗CMV IgG及抗NGF IgG分別設定為100及50，即分析法中使用之最低稀釋倍數（1:200或1:100）的一半。貝汀維單抗被用作NGF IgG ELISA之標準。藉由將血清之EC50值與針對貝汀維單抗標準物測定的EC50值相乘來計算血清中抗NGF IgG抗體之相對濃度（µg/mL）。低於分析法之偵測極限的中和力價設定為等效單株抗體濃度，即EC50值為50。
藉由非基於細胞之分析法量測的 NGF 中和抗體力價 ：在4℃用PBS中之100 μl/孔的0.5 μg/mL TrkA（SinoBio11073-H08H）塗佈ELISA盤隔夜。用PBST洗滌後，使用200 μL/孔SuperBlock（ThermoScientific 37518）在室溫下封閉盤1小時。將血清樣本或陽性對照抗體（狗源化單株抗犬科動物NGF抗體貝汀維單抗，Zoetis）稀釋於2% BSA/PBST中，且與1.25 ng/mL hNGF（R&D 256-GF）一起培育1小時。在洗滌ELISA盤之後，向該等盤中添加血清/NGF溶液。將盤在室溫下培育1小時，洗滌，且添加濃度為1.5 µg/mL的HRP標記之兔抗NGF抗體（SinoBio 11050-RP02-H）。用1×PBS/0.05%（v/v）Tween 20、TMB受質（ThermoScientific 3401）作為HRP受質洗滌盤4次後，藉由添加2M H2SO4終止顯影反應。用微量盤式讀取器（TecanSpark）量測450 nm處之OD值。藉由將血清樣本的OD 450 nm值相對於稀釋因數作圖來生成調定曲線。使用4參數邏輯回歸曲線擬合模型測定IC50值，即對應於半最大OD 450 nm值的稀釋因數。定義樣本在不同時間點的血清力價且描繪為曲線擬合的IC50值。將低於分析法之偵測極限的中和力價設定為50，對應於分析法中所用之最低稀釋因數（1:100）的一半。藉由將血清之IC50值與針對貝汀維單抗標準物測定的IC50值相乘來計算血清中的中和抗體之相對濃度（µg/mL）。低於分析法之偵測極限的中和力價設定為等效單株抗體濃度，即IC50值為50。
藉由基於 TF1 細胞之分析法量測的 NGF 中和抗體力價 ：將熱滅活（56℃ 30 min）、連續稀釋之血清或抗體標準物（經典化單株抗狗NGF抗體貝汀維單抗，Zoetis）與5 ng/mL人類β-NGF在室溫下培育1小時。然後將NGF血清/抗體溶液添加至生長因子饑餓隔夜之104個TF-1細胞中。使用CellTiter 96 AQueous One Solution細胞增殖分析試劑（Promega），對總共72小時培育期的最後7小時時段的細胞生存力進行定量。使用微定量盤式讀取器（TecanSpark），在490 nm波長及700 nm參考波長下量測吸光度。藉由將血清樣本的吸光度差值（490 nm-700 nm）相對於稀釋因數作圖來生成調定曲線。使用4參數邏輯回歸曲線擬合模型測定IC50值，即對應於半最大OD值的稀釋因數。定義樣本在不同時間點的血清力價且描繪為曲線擬合的IC50值。將低於分析法之偵測極限的中和力價設定為50，即分析法中所用之最低稀釋因數（1:100）的一半。高於分析法之偵測極限但又太低而無法可靠測定中和力價的力價設定為100。藉由將血清之IC50值與針對貝汀維單抗標準物測定的IC50值相乘來計算血清中的中和抗體之相對濃度（µg/mL）。低於分析法之偵測極限的中和力價設定為等效單株抗體濃度，即IC50值為50。高於分析法之偵測極限但又太低而無法可靠測定中和力價的力價設定為等效單株抗體濃度，即IC50值為100。狗血清中之NGF IgG抗體係以EC50力價或抗體標準等效力價表現。血清學結果：
在用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP治療的第2組動物中，在第一次劑量之後3週可偵測到NGF結合IgG抗體，且作為在研究第21天第二次投予的反應而增加。該組中的所有動物均對治療有反應。在第42天觀測到峰值力價，GMT為25.6 μg/ mL（95% CI：36.7, 17.9）。第42天亦係選擇將高嶺土注入腳掌的時間點。抗體反應分兩個階段下降。首先在第42天與第84天之間出現快速下降階段，其中抗體半衰期相對較短，隨後在研究第84天與第119天之間觀測到持續更穩定的階段，其中抗體半衰期較長。觀測到的NGF IgG反應的雙相動力學係疫苗接種後的典型抗體反應。第1組（貝汀維單抗治療組）之NGF特異性IgG GMT亦在第42天達到其峰值，亦即注射後7天及第一次注射高嶺土的當天（3.68 μg/ mL；（95% CI：11.3、1.197），然而，該值明顯低於接受本發明疫苗之疫苗治療組（第2組）誘導的相應抗NGF特異性抗體力價（圖19A及圖19B）。
總體而言，藉由基於TrkA之NGF結合ELISA測定的NGF中和抗體之動力學與NGF結合IgG之動力學特徵相當。首次給予CMV VLP-NGF疫苗後21天，7隻狗中有7隻觀測到中和抗體，且該組所有動物的中和抗體均保持高於分析法之偵測水平。與NGF結合IgG力價相比，在第2次劑量後21天（第42天）量測到峰值NGF中和力價（16.0 μg/mL（95% CI：24.0, 10.6）），此後逐漸減弱。CMV VLP-NGF疫苗誘導之標準等效力價超過或達到貝汀維單抗注射後7天觀測到的峰值血清力價的相當水平（圖20A及圖20B）。
總體而言，藉由基於TF-1細胞之生物分析法量測之中和力價與藉由基於TrkA之NGF結合ELISA量測之力價相似。儘管基於細胞之分析法偵測中和抗體的臨限值水平略高，但一旦超過該臨限值水平，該分析法就會量測到更高的力價。由於基於TF-1細胞之分析法中偵測NGF中和抗體的臨限值水平較高，因此在第21天未偵測到第2組中的中和抗體。然而，在第二次投予VLP-NGF後21天，7隻動物中有7隻偵測到該等中和抗體（圖21A及圖21B）。
在接受貝汀維單抗（研究組1）的狗中，在研究第42天（第一次高嶺土攻擊當天）觀測到峰值力價為3.93 μg/mL（95%CI：6.90，2.24）。在所分析的任何其他時間點，均未在一隻狗身上觀測到NGF中和抗體。投予後21天（研究第56天），7隻狗中有6隻的貝汀維單抗水平低於基於TF-1之NGF中和分析法之偵測極限。
綜上所述，CMV VLP-NGF疫苗誘導之血清中和抗NGF抗體力價高於可藉由根據上市許投予貝汀維單抗獲得的中和抗NGF抗體力價。藥效學結果（高嶺土模型中疼痛緩解）：
因此，比較不同治療組之間藥效學終點量測的AUC（曲線下面積）隨時間的變化。高嶺土誘發炎症之前及之後每天的平均跛行評分。沒有狗在高嶺土誘發炎症之前出現跛行。使用RStudio（R 4.1.0，R開發核心團隊，R統計計算基金會，Vienna，Austria）進行統計分析（正態分佈數據使用t檢驗，其他數據使用Mann-Whitney（非參數）），以檢驗使用CMV VLP-NGF疫苗候選物治療的疫苗組及安慰劑（注射用水）組各終點的AUC差異的顯著性。對貝汀維單抗組及INFLACAM®組進行描述性分析及比較。
Inflacam®組：高嶺土誘發炎症一天後，與安慰劑組相比，Inflacam®組的平均跛行評分降低（圖22）。然後，Inflacam®組的跛行評分增加，且隨著時間的推移，其演變得與陰性對照組相似，且在炎症後10天跛行得到解決。此等結果驗證了以美洛昔康作為陽性對照的炎症模型（圖22）。高嶺土誘發炎症後3天，兩組的跛行評分相似係因為NSAID的作用持續時間不超過48小時。
對於疫苗組（CMV VLP-NGF疫苗），在高嶺土誘發炎症後第3天仍可偵測到一些跛行，但在偵測期內顯著下降。早在炎症後6天，CMV VLP-NGF疫苗之疫苗組就未觀測到跛行（圖22）。
貝汀維單抗組的跛行比疫苗組更明顯。自高嶺土誘發炎症後第3天開始，CMV VLP-NGF疫苗組之平均跛行評分在整個偵測期內均顯著低於貝汀維單抗組，直至第14天（圖22）。
第一期的跛行評分之平均AUC分別為貝汀維單抗組、CMV VLP-NGF疫苗組、Inflacam®組及安慰劑組15.36、7.80、18.87及19.34。據報告，疫苗組與安慰劑組在跛足模型中有顯著的治療效果。此外，CM VLP-NGF疫苗組與貝汀維單抗治療組之間的AUC跛足評分均有顯著改良（圖23），其均凸顯CMV VLP-NGF疫苗在整個期間對所有狗的高功效。值得注意的是，貝汀維單抗組、Inflacam®組及安慰劑組的AUC跛足評分比CMV VLP-NGF疫苗組的變化大得多，其進一步證明NGF疫苗之優異功效（數據未示出）。實施例8實驗用犬之慢性疼痛手術實驗模型的功效評定研究目標
本研究之目的係評估CMV VLP-NGF疫苗在犬科動物前十字韌帶橫斷面及部分內側半月板切除術（ACLT+PMM）模型中減輕骨關節炎（OA）疼痛的功效。
使用緩慢進展的疼痛實驗模型揭示出不同的疼痛機制以時間依賴性的方式運作。由於狗OA具有慢性進行性，因此預計此種犬類疾病早期及晚期的疼痛機制可能有所不同。因此，在適當模型化疾病慢性期的條件下確認CMV VLP-NGF疫苗之藥效學非常重要。其尤其重要，因為有證據表明NGF在與非發炎性疼痛相關之傷痛覺中發揮作用。
基於先前在嚙齒動物中發現的內側半月板不穩定（DMM）實驗模型的證據，有理由使用導致膝關節不穩定的手術模型來模擬實驗條件下狗初始發炎性疼痛及其隨後演變為非發炎性慢性疼痛。
在對前十字韌帶橫斷面及部分內側半月板切除術（ACLT+PMM）後狗的慢性疼痛進行縱向臨床評定的同時，進行縱向血清學檢測，以研究抗NGF抗體之循環力價與藥效學評定之間的相關性。
使用與實施例7中所述完全相同的分析方法進行血清學研究，以評定其在實驗用犬之急性發炎性疼痛的實驗高嶺土模型中的功效。研究設計：
24隻成年比格犬（研究納入時年齡超過12個月）被分配至3個研究組。用CMV VLP-NGF疫苗（cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP，劑量為250 μg/劑）對研究組A的狗進行治療，用Librela®（貝汀維單抗，基準產品）對研究組B的動物進行治療，且研究組C的狗未經治療。Librela®（Zoetis）係一種市售的重組表現之抗NGF（貝汀維單抗）犬科動物單株抗體（mAb），其註冊用於治療狗的與骨關節炎相關之疼痛，且自手術之日起根據製造商的說明每月進行皮下投予。CMV VLP-NGF疫苗在研究的第0、21、91及203天進行四次皮下投予。自研究第42天至第47天，所有納入該研究的動物均進行了前十字韌帶切除術及右後膝部分半月板切除術。手術後12天（研究日（SD）54-59）以及第84天、第133天、第182天、第203天及第217天進行疼痛評分及臨床跛行評估。對用A組cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP（CMV VLP-NGF 疫苗）治療的動物進行血清學分析。亦對B組（貝汀維單抗）之動物在研究第203天的樣本進行血清學檢查，以確認存在抗NGF抗體。血清學方法：
本研究中使用的血清學方法與實施例7中針對實驗用犬之高嶺土模型描述的方法相同。血清學結果：
藉由 ELISA 量測之抗 NGF 及抗 CMV VLP 總 IgG 抗體反應 ：在A組（CMV VLP-NGF疫苗）中，所有動物均對CMV VLP-NGF治療有反應（圖24A及圖24B）。第二次、第三次與第四次投予後2至3週觀測到峰值力價。在手術一週後（第42天），GMT為27.2 μg/mL（95% CI：51.9、14.2）。正如預期，NGF特異性IgG抗體隨後逐漸減弱，到第三次劑量當天（研究第91天）下降至2.25 μg/mL（95% CI：4.25、1.19）的水平。此時，一隻動物的NGF IgG力價仍高於或接近貝汀維單抗報告的峰值平均NGF GMT（亦即6.1 μg/ mL）在第三次注射CMV VLP-NGF疫苗使得第105天量測之力價提高之後，抗體反應分兩個階段下降。在第105天與第161天（t½ 17天）之間快速下降階段，其中抗體半衰期相對較短，隨後，在研究的第161天與第203天（t½ 96天）之間是持續更穩定階段，其中抗體半衰期較長。在CMV VLP-NGF治療後觀測到的NGF IgG反應的雙相動力學係疫苗接種後的典型抗體反應。重要的是，在第91天進行第三次注射後3個月（第203天），每月投予一次的貝汀維單抗之抗體力價仍高於或接近峰值水平（亦即6.1 μg/mL）。-. 然而，作為第四次疫苗接種的反應，抗體力價增加至6.1 μg/mL（貝汀維單抗治療）之水平以上。B組動物（貝汀維單抗治療）第203天血清中量測之NGF特異性IgG GMT為10.9 μg/mL（95% CI：14.9、8.02）；略高於預期範圍（數據未示出）。該組中的所有動物均為起反應者且平均力價為1 μg/mL（虛線，圖24B）。
藉由非基於細胞之分析法量測的 NGF 中和抗體力價 ：總體而言，藉由基於TrkA之NGF結合ELISA測定的NGF中和抗體之動力學與藉由ELISA量測之總NGF結合IgG之動力學特徵相當。在第42天，所有8隻被投予CMV VLP-NGF疫苗的狗中均觀測到中和抗體。在整個研究過程中，所有動物均保持高於分析法之偵測水平（圖25A及圖25B）。與NGF結合IgG力價相比，在第42天（15.9 μg/mL（95% CI：37.3、6.78））、第105天（57.6 μg/mL（95% CI：87.7、37.9））及第217天（37.6 μg/mL（95% CI：54.5、25.9）），第2、3及4次劑量之後量測到峰值NGF中和力價。在第203天，貝汀維單抗治療B組的NGF中和抗體力價為7.85 μg/mL（95% CI：10.4、5.95），且因此在貝汀維單抗投予後6天處於預期範圍內（數據未示出）。此外，在初次投予階段後共同投予NSAID及CMV VLP-NGF疫苗不會影響NGF抗體力價的維持及增強（數據未示出）。
藉由基於 TF1 細胞之分析法量測的 NGF 中和抗體力價 ：總體而言，藉由基於TF-1細胞之生物分析法量測之中和力價與藉由基於TrkA之NGF結合ELISA量測之力價相似（圖26A及圖26B）。儘管基於細胞之分析法偵測中和抗體的臨限值水平略高，但一旦超過該臨限值水平，該分析法就會量測到更高的力價。中和抗體係由CMV VLP-NGF疫苗誘導，且在整個研究期間均係可偵測的。與平均力價為6.1 μg/mL的貝汀維單抗治療相比，CMV VLP NGF疫苗可以誘導顯著更高的中和抗體峰值水平（虛線，圖26B）。手術方法
手術自D42開始一直進行至D47，每個手術日每天對隨機分組來源的動物進行手術（每個手術日每組至少一隻動物）。在手術前及手術期間，外科醫生不知道動物被分配至哪些組。在全身麻醉下，對右膝內側進行標準的微創關節切開術。使用手術刀（N°11）對前十字韌帶（ACL）的顱內側部分在其大約中點處進行橫斷面切割。使用咬骨鉗進行部分內側半月板切除術。然後用無菌0.9% NaCl徹底沖洗關節，且使用單絲2-0以簡單的間斷方式封閉關節囊。皮膚及皮下組織單層閉合。藥效學結果 （ 手術模型中疼痛緩解 ）：
在各組之間的疼痛及跛行評定中觀測到顯著差異。
藉由觸診手術致殘的膝關節、使用機械性異常疼痛之半定量評分法來量測疼痛水平。手術後不久（D84）觀測到的顯著疼痛水平被認為與手術相關之炎症有關。此疼痛水平係暫時的，且在D105時減弱至基線水平（圖27A）。隨後，由於手術引起的生物力學不穩定性導致關節結構損傷，未治療之對照組C自D133開始出現慢性疼痛，平均評分穩定在1.25至1.75之間。在接種疫苗的A組中，在D133及D161時均觀測到慢性疼痛顯著減輕，甚至低於偵測水平，該兩個時間點均對應於高水平的抗NGF循環抗體（圖27B）。在時間點D182及D203（第三次疫苗注射後91及113天之後），接種疫苗的狗出現一定程度的疼痛，但水平明顯低於未接種疫苗的安慰劑組C。根據疫苗接種方案，接種疫苗的A組可能會出現一些疼痛，因為抗NGF循環抗體在此等時間點已緩慢減弱。在D217第四次注射疫苗後，抗NGF循環抗體再次顯著增強（圖27B）（達到貝汀維單抗治療無法達到的水平），其與CMV VLP-NGF疫苗接種的A組與對照組C相比量測的疼痛水平顯著降低相關。
此數據表明，本發明之NGF VLP疫苗不僅使得急性OA疼痛模型中之疼痛顯著減輕，而且會使慢性環境中之疼痛顯著減輕。其亦說明抗NGF誘導之抗體力價與疼痛減輕之間的相關性，為疫苗誘導之抗NGF自身抗體介導的作用機制提供了明確的證據。此外，在D217時，當與模型相關之關節內病變完全發展時，對行走及小跑時的跛行進行評估，為CMV VLP-NGF疫苗組A與未治療之對照組C相比疼痛減輕提供明確的證據（圖27C）。
總體而言，支援手術後慢性疼痛建立階段觸診時疼痛減輕的數據（疼痛及跛行評分）及表明D217時跛行減輕的數據證明CMV VLP-NGF疫苗能夠有效控制狗的與骨關節炎相關之慢性疼痛。
當與貝汀維單抗治療的B組進行疼痛及跛行評分比較時，CMV VLP-NGF自研究第133天開始直至研究第207天結束，獲得較低的疼痛及跛行評分，明確支援CMV VLP-NGF疫苗相對於貝汀維單抗治療的有益治療效果（圖28A及圖28B）。
無
[圖1]：具有單切限制酶位點之pET-CMVB2-Ntt-E8*質體圖譜的描述。[圖2A]：對衍生自CMV-Ntt830-E8*之表現之VLP進行純化的SDS-PAGE凝膠分析。M - 蛋白質尺寸標記PageRuler（Thermo Fisher Scientific，#26620）；S - 大腸桿菌C2566之細胞萃取物中的可溶性蛋白質/pET-CMVB2-Ntt-E8*；P - 細胞萃取物中的不溶性蛋白質；1 - 蔗糖梯度之後的不溶性蛋白質（管底部）；2 - 6-蔗糖梯度溶離份（管底部之60%至頂部之0%）。圖內的星號（*）表示相應CMV-Ntt830-E8*嵌合CMV多肽在SDS/PAGE凝膠中的相對位置。[圖2B]：經純化之CMV-Ntt830-E8* VLP的電子顯微影像。水平條柱對應於500 nm。[圖3]：具有單切限制酶位點之pET-CMVB2-Ntt-E4質體圖譜的描述。[圖4]：具有單切限制酶位點之pET-CMVB2-Ntt-E8質體圖譜的描述。[圖5]：具有單切限制酶位點之pET-CMVB2-Ntt-E12質體圖譜的描述。[圖6]：對衍生自CMV-Ntt830-E4之表現之VLP進行純化的SDS-PAGE（左）及瓊脂糖凝膠（右）分析。M1 - 蛋白質尺寸標記PageRuler（Thermo Fisher Scientific，#26620）；M2 - DNA尺寸標記（Thermo Fisher Scientific，# SM0311）；T - 在20℃下培養18小時之後，大腸桿菌C2566細胞中的總蛋白質；S - 細胞破裂之後，蔗糖梯度（20-60%）之前，細胞萃取物中的可溶性蛋白質；P - 不溶性蛋白質；1-6 - 蔗糖梯度溶離份（管底部之60%至頂部之0%）。圖內的星號（*）表示相應CMV-Ntt830-E4嵌合CMV多肽在SDS/PAGE凝膠中的相對位置及典型VLP信號在瓊脂糖凝膠中的相對位置。[圖7]：對衍生自CMV-Ntt830-E8之表現之VLP進行純化的SDS-PAGE（左）及瓊脂糖凝膠（右）分析。M1 - 蛋白質尺寸標記PageRuler（Thermo Fisher Scientific，#26620）；M2 - DNA尺寸標記（Thermo Fisher Scientific，# SM0311）；T - 在20℃下培養18小時之後，大腸桿菌C2566細胞中的總蛋白質；S - 細胞破裂之後，蔗糖梯度（20-60%）之前，細胞萃取物中的可溶性蛋白質；P - 不溶性蛋白質；1-6 - 蔗糖梯度溶離份（管底部之60%至頂部之0%）。圖內的星號（*）表示相應CMV-Ntt830-E8嵌合CMV多肽在SDS/PAGE凝膠中的相對位置及典型VLP信號在瓊脂糖凝膠中的相對位置。[圖8]：對衍生自CMV-Ntt830-E12之表現之VLP進行純化的SDS-PAGE（左）及瓊脂糖凝膠（右）分析。M1 - 蛋白質尺寸標記PageRuler（Thermo Fisher Scientific，#26620）；M2 - DNA尺寸標記（Thermo Fisher Scientific，# SM0311）；T - 在20℃下培養18小時之後，大腸桿菌C2566細胞中的總蛋白質；S - 細胞破裂之後，蔗糖梯度（20-60%）之前，細胞萃取物中的可溶性蛋白質；P - 不溶性蛋白質；1-6 - 蔗糖梯度溶離份（管底部之60%至頂部之0%）。圖內的星號（*）表示相應CMV-Ntt830-E12嵌合CMV多肽在SDS/PAGE凝膠中的相對位置。在瓊脂糖凝膠中未觀測到與完整VLP對應的清楚明晰譜帶。[圖9]：經純化之CMV-Ntt830-E4 VLP的電子顯微影像。水平條柱對應於200 nm。[圖10]：經純化之CMV-Ntt830-E8 VLP的電子顯微影像。水平條柱對應於200 nm。[圖11]：CMV-Ntt830 VLP與CMV-Ntt830-E4 VLP之熱穩定性的比較。使用DNA解鏈溫度測定程式及即時PCR系統，監測CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP在寶石橙染料（Sypro-Orange dye）存在下的結構變化。曲線1為CMV-Ntt830-E4 VLP，曲線2為CMV-Ntt830 VLP且曲線3為緩衝液對照（5 mM磷酸鈉、2 mM EDTA，pH 7.5）。對應的57℃及51℃解鏈溫度用箭頭指示。[圖12]：CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP在溶液中在不同濃度之NaCl存在下的穩定性。0.5 mg/ml CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP樣本在5 mM磷酸鈉、2 mM EDTA（pH 7.5）中、在不同濃度之NaCl（各樣本中的NaCl莫耳濃度指示於凝膠底部）存在下、在室溫下培育長達2小時。藉由天然瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙錠染色來分析樣本。圖A及B分別顯示CMV-Ntt830 VLP及CMV-Ntt830-E4 VLP樣本的NAGE分析。M顯示負載有GeneRuler 1kb DNA梯（SM0311，TFS）的泳道。黑色箭頭指示凝膠內之負載孔的位置以及各孔及凝膠內之VLP的位置。電泳之後的負載孔中存在CMV-Ntt830 VLP（圖塊A）係由於形成了VLP聚集體，該等聚集體太大而無法進入凝膠。未聚集的完整VLP遷移至凝膠中。[圖13]：對經歷陰離子交換層析之CMV-Ntt830 VLP的分析。將5 ml含有1 mg/ml CVMtt-VLP的5 mM硼酸鈉緩衝液pH 9.0負載至經5 mM硼酸鈉緩衝液平衡的1.0 ml Macro-Prep DEAE Bio-Rad陰離子交換濾筒上且在濃度遞增的NaCl（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0及2.0 M）存在下逐步溶離。收集溶離份且藉由nanodrop 260 nm（針對蛋白質濃度）及天然瓊脂糖凝膠電泳加以分析。A圖顯示針對各別溶離份（1-25）繪製的NaCl濃度及260 nm吸光度值。B圖為含有最高蛋白質濃度之主要溶離份的NAGE分析（溴化乙錠染色）。M顯示負載有GeneRuler 1kb DNA梯（SM0311，TFS）的泳道。黑色箭頭指示凝膠內之負載孔的位置以及各孔及凝膠內之VLP的位置。電泳之後的負載孔中存在CMV-Ntt830 VLP係由於形成了VLP聚集體，該等聚集體太大而無法進入凝膠。未聚集的完整VLP遷移至凝膠中。[圖14]：對經歷陰離子交換層析之CMV-Ntt830-E4 VLP的分析。將表現CMV-Ntt830-E4 VLP之大腸桿菌細胞的生物質再懸浮於50 mM檸檬酸鹽、5 mM硼酸鹽緩衝液pH 9.0中，且使用微流化床LM-20溶解細胞。藉由離心澄清可溶性部分且負載至60 ml Fracto-DEAE（XK 26/20）上。以連續梯度方式施加包含50 mM檸檬酸鹽、5 mM硼酸鹽及1 M NaCl的溶離緩衝液，以將所結合的VLP溶離。A圖顯示分別藉由A260nm（mAU）及電導率（mS/cm）量測的蛋白質溶離及NaCl濃度梯度。X軸顯示溶離體積及溶離份編號（4-11）。自Fracto-DEAE管柱收集的溶離份係藉由NAGE（圖塊B）及SDS-PAGE（圖塊C）分析。在圖塊B中，M指示負載有GeneRuler 1kb DNA梯（SM0311，TFS）的泳道，L為負載至Fracto DEAE上之前的大腸桿菌溶解物樣本，FT為自0至150 ml收集的流過物且4-10代表溶離期間所收集的溶離份編號。黑色箭頭自上而下分別指示負載孔的位置、完整CMV-Ntt830-E4 VLP在凝膠內的位置及來自經澄清之細菌溶解物之污染核酸的位置。在圖塊C中，FT為自0至150 ml收集的流過物且4-10代表溶離份編號。黑色箭頭顯示庫馬斯藍（Coomassie blue）染色之CMV-Ntt830-E4外殼蛋白的位置。[圖15A]：重組犬科動物成熟NGF之純化及純正性。對NGF純化過程的SDS-PAGE分析。M - 標記，其譜帶分子量以kDa顯示；A - 表現之後的總細胞溶解物；B - 再摺疊及部分純化之後，含有pro-NGF的池化溶離份；C - 胰蛋白酶消化及最終純化之後的成熟NGF。箭頭指示泳道A及B中的pro-NGF及泳道C中的成熟NGF。[圖15B]：PC12細胞與小鼠骨髓瘤細胞中所產生的重組人類成熟NGF（R&D systems）（黑色正方形）一起或與如本文所描述之大腸桿菌中所產生的犬科動物成熟NGF一起（灰色圓形）培養5天。細胞在100、50、25、12.5及6.25 ng/ml重組NGF存在下培養且測定出現所定義之神經突過度生長之細胞的百分比。[圖16A]：Seq ID NO:31之重組成熟犬科動物NGF（cNGF）與CMV-Ntt830及CMV-Ntt830-E8* VLP偶合的SDS-PAGE分析。M - PageRuler™ Plus預染色蛋白質梯，10至250 kDa（Thermo Fisher Scientific，# 26620）蛋白質尺寸標記；1 - 相應的經純化之CMV-Ntt830及CMV-Ntt830-E8* VLP；2 - 用5 × SMPH衍生化且移除SMPH之後的CMV VLP；3 - 與等莫耳量之cNGF偶合的CMV VLP；4 - CMV-Ntt830-E8*與cNGF在未發生SMPH衍生化之情況下的混合樣本；5 - 經純化之cNGF。星號表示可觀測到的CMV VLP-NGF結合物譜帶的定位。[圖16B]：SEQ ID NO:31之重組成熟犬科動物NGF（cNGF）與CMV-Ntt830-E4及CMV-Ntt830-E8 VLP偶合的SDS-PAGE分析。M - PageRuler™ Plus預染色蛋白質梯，10至250 kDa（Thermo Fisher Scientific，# 26620）蛋白質尺寸標記；1 - 相應的經純化之CMV-Ntt830-E4及CMV-Ntt830-E8 VLP；2 - 用5 × SMPH衍生化且移除SMPH之後的CMV VLP；3 - 與等莫耳量之cNGF偶合的CMV VLP；4 - CMV-Ntt830-E4或CMV-Ntt830-E8與cNGF在不發生SMPH衍生化之情況下的混合樣本；5 - 經純化之cNGF。星號表示可觀測到的CMV VLP-cNGF結合物譜帶的定位。[圖16C]：cNGF-CMV-Ntt830 VLP的動態光散射分析。由於疫苗沉澱，因此無法進行EM分析。[圖16D]：包含SEQ ID NO:31之cNGF抗原之cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的動態光散射分析。[圖16E]：包含SEQ ID NO:33之cNGF抗原之cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的動態光散射分析。[圖16F]：cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP的動態光散射分析。[圖16G]：cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP的電子顯微法。[圖16H]：cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP的電子顯微法。[圖17A]：評估用cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫的狗血清中的抗NGF IgG抗體。接受疫苗但未接受佐劑之第1組狗的抗NGF IgG力價。箭頭指示第0天、第21天及第42天注射所投予疫苗。[圖17B]：評估用cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫的狗血清中的抗NGF IgG抗體。接受疫苗與佐劑QuilA®之第2組3隻狗的抗NGF IgG力價。箭頭指示第0天、第21天及第42天注射所投予疫苗。[圖17C]：評估用cNGF-CMV-Ntt830-E8*VLP免疫的狗血清中的抗CMV IgG力價。接受疫苗但未接受佐劑之第1組狗的抗CMV IgG力價。箭頭指示第0天、第21天及第42天注射所投予疫苗。[圖17D]：評估用cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP免疫的狗血清中的抗CMV IgG力價。接受疫苗與佐劑QuilA®之第2組狗的抗CMV IgG力價。箭頭指示第0天、第21天及第42天注射所投予疫苗。[圖17E]：評估在佐劑不存在下用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP免疫之狗血清中的抗NGF IgG抗體。5隻狗在第0天及第21天給予cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP。藉由ELISA評估第0天、第21天、第42天、第71天及第91天所收集之血清中的NGF特異性抗體。[圖17F]：評估在氫氧化鋁存在下用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP免疫之狗血清中的抗NGF IgG抗體。5隻狗在第0天及第21天給予cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP與氫氧化鋁。藉由ELISA測定第0天、第21天、第42天、第71天及第91天的NGF特異性抗體。[圖18A]：接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP誘導狗產生NGF中和抗體。在第0天、第21天及第42天，在佐劑QuilA存在或不存在下，用250 μg cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP對狗進行免疫（每組3隻狗）。收集血清且使用基於TF-1的NGF生物活性分析來測試中和抗體是否存在。一隻狗之滴定曲線圖示，用以測定狗血清的中和能力及50%中和力價（NT50）。將5 ng/mL人類成熟NGF與自疫苗首次投予之後的指定日期所收集的血清中純化的濃度遞增的IgG一起預培育。使用4PL S形曲線擬合模型測定NT50值，亦即，導致細胞增殖50%抑制的IgG濃度。[圖18B]：接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP誘導狗產生NGF中和抗體。在第0天、第21天及第42天，在佐劑QuilA存在或不存在下，用250 μg cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP對狗進行免疫（每組3隻狗）。收集血清且使用基於TF-1的NGF生物活性分析來測試中和抗體是否存在。自狗血清純化總IgG。利用生物分析評估20 μg/mL經純化之總IgG中和5 ng/mL人類成熟NGF的能力。條柱代表群組平均值與標準差且符號代表個別狗（雙重複分析的平均值）。使用GraphPad Prism進行雙因子變異數分析及杜凱氏多重比較檢驗（Tukey's multiple comparisons test），以比較群組平均值。* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001，**** p＜0.0001。[圖18C]：接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP誘導狗產生成熟NGF中和抗體。在第0天、第21天及第42天，在佐劑QuilA存在或不存在下，用250 μg cNGF-CMV-Ntt830-E8* VLP對狗進行免疫（每組3隻狗）。收集血清且使用基於TF-1的NGF生物活性分析來測試中和抗體是否存在。將NT50值相對於抗NGF IgG血清力價的OD50值作圖。自具有較高濃度之NGF特異性抗體的血清中純化的總IgG比自具有較低抗NGF力價的狗的血清中純化的總IgG更有效地抑制NGF介導之TF-1細胞增殖。符號代表個別狗及取樣時間點。不同符號賦予不同狗。閉合的符號代表在佐劑存在下接種疫苗的動物，而空心符號代表在佐劑不存在下接種疫苗的動物。[圖18D]：接種疫苗cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP誘導狗產生NGF中和抗體。第0天及第21天，將cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP與氫氧化鋁投予5隻狗。第42天收集血清且使用基於TF-1的NGF生物活性分析來測試中和抗體是否存在。條柱代表群組平均值與標準差且符號代表個別狗。點線指示分析的偵測極限。[圖19A]：急性發炎性疼痛之高嶺土模型：將使用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP（正方形）對狗進行疫苗接種與使用先前技術單株抗體貝汀維單抗（bedinvetmab）（菱形）及安慰劑（三角形）治療進行比較 - 研究組的cNGF特異性IgG力價（GMT）圖示為EC50值。誤差條代表GMT之95% CI。低於LoD之分析結果設定為50，對應於分析中使用的最低稀釋因數（亦即1:100）的0.5倍（點線）。GMT等同於幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖19B]：急性發炎性疼痛之高嶺土模型：將使用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP（正方形）對狗進行疫苗接種與使用先前技術單株抗體貝汀維單抗（三角形）及安慰劑（圓形）治療進行比較——研究組的cNGF特異性IgG力價（GMT）被圖示為標準等效濃度。誤差條代表GMT之95% CI。高於LoD但低於LoQ的力價設定為100。此前有報告稱，投予貝汀維單抗之後血清中的峰值抗體力價為6.1 μg/mL（點線）。GMT等同於幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖20A]：急性發炎性疼痛之高嶺土模型：將使用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP（正方形）對狗進行疫苗接種與使用先前技術單株抗體貝汀維單抗（三角形）及安慰劑（圓形）治療進行比較——藉由基於TrkA之NGF結合ELISA測定NGF中和力價。研究組的NGF中和GMT被圖示為EC50值。誤差條代表GMT之95% CI。低於LoD之分析結果設定為50，對應於分析中使用的最低稀釋因數（亦即1:100）的0.5倍（點線）。GMT等同於幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖20B]：急性發炎性疼痛之高嶺土模型：將使用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP（正方形）對狗進行疫苗接種與使用先前技術單株抗體貝汀維單抗（三角形）及安慰劑（圓形）治療進行比較--藉由基於TrkA之NGF結合ELISA測定NGF中和力價。研究組的NGF中和GMT被圖示為標準等效濃度。誤差條代表GMT之95% CI。高於LoD但低於LoQ的力價設定為100。此前有報告稱，投予貝汀維單抗之後血清中的峰值抗體力價為6.1 μg/mL（點線）。GMT等同於幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖21A]：急性發炎性疼痛之高嶺土模型：將使用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP（正方形）對狗進行疫苗接種與使用先前技術單株抗體貝汀維單抗（三角形）及安慰劑（圓形）治療進行比較 - 藉由基於TF-1細胞之NGF生物分析測定NGF中和GMT。研究組的NGF中和GMT被圖示為EC50值。誤差條代表GMT之95% CI。低於LoD之分析結果設定為50，對應於分析中使用的最低稀釋因數（亦即1:100）的0.5倍（點線）。GMT等同於幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖21B]：急性發炎性疼痛之高嶺土模型：將使用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP（正方形）對狗進行疫苗接種與使用先前技術單株抗體貝汀維單抗（三角形）及安慰劑（圓形）治療進行比較--藉由基於TF-1細胞之NGF生物分析測定NGF中和GMT。研究組的NGF中和GMT被圖示為標準等效濃度。誤差條代表GMT之95% CI。高於LoD但低於LoQ的力價設定為100。此前有報告稱，投予貝汀維單抗之後血清中的峰值抗體力價為6.1 μg/mL（點線）。GMT等同於幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖22]：急性疼痛之手術模型：將4組7隻狗分別用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP疫苗、單株貝汀維單抗（Librela™）、美洛昔康（meloxicam）（Inflacam™）及安慰劑（注射用水）治療。分別在實施發炎性/急性疼痛實驗模型前21及42天以及7天、21天及42天進行治療，該實驗模型係由在所有狗的右後爪注射高嶺土化學物質而產生。使用經過驗證的數值評分量表，根據每隻狗的典型病程來評估跛行評分。用於評估發炎腳爪跛行之數值評定量表係基於檢查者之感覺且評分係如下確定的：（0）無跛行；（1）在大部分觀測期內幾乎偵測不到跛行；（2）輕度跛行，負重最大；（3）中度跛行，負重最小；（4）重度跛行，動物使用爪子（開始行走運動及/或輕輕接觸地面）但不負重；（5）動物跛行程度最大，拒絕移動及/或避免發炎的爪子與地面有任何接觸。在高嶺土攻擊之後的2週之時段內，量測所有狗之跛行評分。[圖23]：在高嶺土攻擊後14天之時段內，計算分別用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP疫苗、單株貝汀維單抗（Librela™）、美洛昔康（Inflacam™）及安慰劑（注射用水）治療的狗的跛行評分的曲線下面積（AUC）。[圖24A]：慢性疼痛之手術實驗模型：用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP對狗進行疫苗接種（A組）- 研究組的cNGF特異性IgG力價（GMT）被圖示為EC 50值。誤差條代表GMT之95% CI。低於LoD之分析結果設定為50，對應於分析中使用的最低稀釋因數（亦即1:100）的0.5倍（點線）。GMT等同於幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖24B]：慢性疼痛之手術實驗模型：用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP對狗進行疫苗接種（B 組）- 研究組的cNGF特異性IgG力價（GMT）被圖示為標準等效濃度。誤差條代表GMT之95% CI。高於LoD但低於LoQ的力價設定為100。此前有報告稱，投予貝汀維單抗之後血清中的峰值抗體力價為6.1 μg/mL（點線）。GMT等同於幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖25A]：藉由基於TrkA之NGF結合ELISA測定的幾何平均NGF中和力價。研究組的NGF中和GMT被圖示為EC50值。誤差條代表GMT之95% CI。低於LoD之分析結果設定為50，對應於分析中使用的最低稀釋因數（亦即1:100）的0.5倍（點線）。高於LoD但低於LoQ的力價設定為100。GMT等同於幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖25B]：藉由基於TrkA之NGF結合ELISA測定的幾何平均NGF中和力價。研究組的NGF中和GMT被圖示為標準等效濃度。誤差條代表GMT之95% CI。有報告稱，投予貝汀維單抗之後血清中的峰值抗體力價為6.1 μg/mL（點線）。GMT幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖26A]：藉由基於TF-1細胞之NGF生物分析測定的NGF中和GMT。研究組的NGF中和GMT被圖示為EC50值。誤差條代表GMT之95% CI。低於LoD之分析結果設定為50，對應於分析中使用的最低稀釋因數（亦即1:100）的0.5倍（點線）。高於LoD但低於LoQ的力價設定為100。GMT等同於幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖26B]：藉由基於TF-1細胞之NGF生物分析測定的NGF中和GMT。研究組的NGF中和GMT被圖示為標準等效濃度。誤差條代表GMT之95% CI。有報告稱，投予貝汀維單抗之後血清中的峰值抗體力價為6.1 μg/mL（點線）。GMT幾何平均力價；LoD = 偵測極限；LoQ = 定量極限。[圖27A]：慢性疼痛之手術模型：將2組7隻狗分別用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP疫苗及安慰劑（注射用水）治療。治療分別在實施因手術導致右側僵硬關節不穩定而導致的慢性疼痛實驗模型前約21天及42天進行。藉由觸診評估所治療關節的局部疼痛，且根據經改良格拉斯哥綜合疼痛量（Modified Glasgow Composite Pain Scale）表得出的預定義的疼痛觸診分級標準（範圍為0至4）進行評分。自研究的第84天（SD84）至SD217，在預定時間點量測所有狗的觸診反應（觸摸痛）評分。[圖27B]：慢性疼痛之手術實驗模型：用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP對狗進行疫苗接種（B組）- 研究組的cNGF特異性IgG力價（GMT）被圖示為標準等效濃度。誤差條代表GMT之95% CI。[圖27C]：慢性疼痛之手術模型：將2組7隻狗分別用cNGF-CMV-Ntt830-E4 VLP疫苗及安慰劑（注射用水）治療。治療分別在實施因手術導致右側僵硬關節不穩定而導致的慢性疼痛實驗模型前約21天及42天進行。使用經過驗證的數值評分量表，根據每隻狗的典型病程來評估跛行評分。用於評估跛行之數值評定量表係基於檢查者之感覺且如下確定評分：（0）無跛行；（1）在大部分觀測期內幾乎偵測不到跛行；（2）輕度跛行，負重最大；（3）中度跛行，負重最小；（4）重度跛行，動物使用爪子（開始行走運動及/或輕輕接觸地面）但不負重；（5）動物跛行程度最大，拒絕移動及/或避免發炎的爪子與地面有任何接觸。在研究之第217天，亦即手術後約175天，對所有狗的跛行評分進行量測。[圖28A]：各組之間的疼痛評估比較。A組：疫苗候選物物，B組：貝汀維單抗，C組：在SD54-SD59（手術時）、SD84、SD133、SD182、SD203及SD217時，未治療。採用Kruskal-Wallis統計分析及Dunn事後檢定。[圖28B]：各組之間的跛行評估比較。A組：疫苗候選物物，B組：貝汀維單抗，C組：在SD54-SD59（手術時）、SD84、SD133、SD182、SD203及SD217時，未治療。採用Kruskal-Wallis統計分析及Dunn事後檢定。
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Claims (27)

  1. 一種用於治療犬科動物之NGF相關病症之方法中的組成物，該方法包含向該犬科動物投予該組成物，其中該組成物包含：（a）   黃瓜嵌紋病毒（CMV）病毒樣粒子（VLP），其中該CMV VLP包含至少一個第一附著位點；及（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（nerve growth factor；NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
  2. 如請求項1之組成物，其係如請求項1所使用，其中該NGF相關病症為疼痛。
  3. 如請求項2之組成物，其係如請求項2所使用，其中該疼痛選自由以下組成之群：傷害感受性疼痛、發炎相關疼痛、手術後疼痛、與肌肉骨胳疾病相關之疼痛、與退化性關節疾病相關之疼痛及/或骨關節炎（OA）相關疼痛。
  4. 如請求項2或3之組成物，其係如請求項2或3所使用，其中該疼痛為與退化性關節疾病相關之疼痛，較佳為OA相關疼痛。
  5. 如請求項2至4之組成物，其係如請求項2至4所使用，其中該疼痛為與退化性關節疾病相關之急性疼痛，較佳為急性OA相關疼痛。
  6. 如請求項2至4之組成物，其係如請求項2至4所使用，其中該疼痛為與退化性關節疾病相關之慢性疼痛，較佳為慢性OA相關疼痛。
  7. 如請求項2至4之組成物，其係如請求項2至4所使用，其中該疼痛為與退化性關節疾病相關之難治性（refractory）疼痛，較佳為難治性OA相關疼痛。
  8. 如請求項6或7之組成物，其係如請求項6或7所使用，其中該慢性OA相關疼痛為與退化性關節疾病相關之慢性難治性疼痛，較佳為慢性難治性OA相關疼痛。
  9. 如請求項1至8之組成物，其係如請求項1至8所使用，其中該組成物係以一個或數個劑量向該犬科動物投予。
  10. 如請求項9之組成物，其係如請求項9所使用，其中該組成物係以至少兩個劑量向該犬科動物投予，其中第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為至少7天，較佳至少14天。
  11. 如請求項9或10之組成物，其係如請求項9或10所使用，其中該組成物係以至少兩個劑量、較佳以兩個劑量向該犬科動物投予，其中第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為7至21天，較佳為14至21天。
  12. 如請求項9至11之組成物，其係如請求項9至11所使用，其中該組成物係以至少三個劑量、較佳以四個劑量向該犬科動物投予，其中第一劑量與第二劑量之間的時間間隔為一至三週，較佳為二至三週，第二劑量與第三劑量之間的時間間隔為二至六個月，且任何其他劑量與前一次劑量之間的時間間隔為三至六個月。
  13. 如請求項1至12之組成物，其係如請求項1至12所使用，其中該組成物係以50至300 µg/劑之量向該犬科動物投予。
  14. 如請求項1至13之組成物，其係如請求項1至13所使用，其中該組成物係經皮下、肌肉內或經皮、較佳經皮下向該犬科動物投予。
  15. 如請求項1至14之組成物，其係如請求項1至14所使用，其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價非肽鍵連接。
  16. 如請求項1至14之組成物，其係如請求項1至14所使用，其中該VLP包含抗原性VLP融合多肽，且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點、經由至少一個共價肽鍵以融合方式連接。
  17. 如請求項1至16之組成物，其係如請求項1至16所使用，其中包含該至少一個第一附著位點之該CMV VLP包含CMV多肽、較佳由其組成，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性之胺基酸序列。
  18. 如請求項1至17之組成物，其係如請求項1至17所使用，其中該組成物包含：（a）   經修飾之CMV VLP，其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個第一附著位點，且其中該經修飾之CMV VLP包含至少一個嵌合CMV多肽，其中該至少一個嵌合CMV多肽包含以下、較佳由以下組成：（i）    CMV多肽，其中該CMV多肽包含CMV外殼蛋白或與SEQ ID NO:39具有至少75%序列一致性的胺基酸序列；及（ii）   多肽，其包含一段連續的帶負電胺基酸、較佳由其組成，其中該等帶負電胺基酸獨立地選自天冬胺酸或麩胺酸，其中該多肽較佳插入該CMV多肽中與SEQ ID NO:39之位置75與位置85之間的任何胺基酸殘基相對應的任何胺基酸殘基之間；（b）   至少一種抗原，其中該抗原包含至少一個第二附著位點，且其中該抗原為神經生長因子（NGF）抗原；且其中（a）與（b）透過該至少一個第一附著位點及該至少一個第二附著位點連接。
  19. 如請求項1至18之組成物，其係如請求項1至18所使用，其中該CMV VLP進一步包含輔助性T細胞抗原決定基。
  20. 如請求項19之組成物，其係如請求項19所使用，其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列。
  21. 如請求項19或20之組成物，其係如請求項19或20所使用，其中該CMV VLP進一步包含輔助性T細胞抗原決定基，較佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基來源於破傷風毒素或為PADRE序列，更佳地其中該輔助性T細胞抗原決定基為破傷風毒素，其包含SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之胺基酸序列或由其組成，且其中該輔助性T細胞抗原決定基置換該CMV多肽之N端區，其中該CMV多肽之該N端區對應於SEQ ID NO:39之胺基酸2-12。
  22. 如請求項18至21之組成物，其係如請求項18至21所使用，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽進一步包含第一胺基酸連接子及第二胺基酸連接子，其中該第一胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸之N端處，且該第二胺基酸連接子定位於該段連續的帶負電胺基酸之C端處，且其中該第一胺基酸連接子及該第二胺基酸連接子獨立地選自由以下組成之群：（a.）  聚甘胺酸連接子（G-連接子），其具有長度n=2至10的胺基酸序列(Gly)n；（b.）  甘胺酸-絲胺酸連接子（GS-連接子），其包含至少一個甘胺酸及至少一個絲胺酸，其中較佳地，該GS連接子具有(GS)r(GsS)t(GS)u之胺基酸序列，其中r=0或1，s=1-5，t=1-5且u=0或1；及（c.）  胺基酸連接子（GS*-連接子），其包含至少一個Gly、至少一個Ser及至少一個選自Thr、Ala、Lys及Cys的胺基酸。
  23. 如請求項22之組成物，其係如請求項22所使用，其中該段連續的帶負電胺基酸僅由麩胺酸組成。
  24. 如請求項23之組成物，其係如請求項23所使用，其中包含該段連續的帶負電胺基酸之該多肽由SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51組成。
  25. 如請求項1至24之組成物，其係如請求項1至24所使用，其中該CMV VLP包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12之胺基酸序列、較佳由其組成。
  26. 如請求項1至25之組成物，其係如請求項1至25所使用，其中該NGF抗原係選自由以下組成之群：犬科動物NGF（cNGF）、貓科動物NGF（fNGF）、馬科動物NGF（eNGF）、牛科動物NGF（bNGF）及豬科動物NGF（pNGF），其中較佳地該抗原為犬科動物NGF（cNGF）或貓科動物NGF（fNGF），且其中更佳地，該抗原為犬科動物NGF（cNGF）。
  27. 如請求項1至26之組成物，其係如請求項1至26所使用，其中該NGF抗原包含以下或較佳由以下組成：選自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:55中之任一者的胺基酸序列，或與SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:55中之任一者具有至少90%，較佳至少95%序列一致性的胺基酸序列。
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