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TW202521160A - 靶向傳遞至細胞之藥劑及方法 - Google Patents

靶向傳遞至細胞之藥劑及方法 Download PDF

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TW202521160A
TW202521160A TW113128916A TW113128916A TW202521160A TW 202521160 A TW202521160 A TW 202521160A TW 113128916 A TW113128916 A TW 113128916A TW 113128916 A TW113128916 A TW 113128916A TW 202521160 A TW202521160 A TW 202521160A
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烏古爾 薩欣
正欣 董
詹姆斯 麥克唐納
法盧克 沃希多
詹 柏根
漢斯－烏爾里奇 舒默迪特
喬瑟林 維斯戴烏伯－勞許
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德商拜恩迪克公司
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Abstract

本發明是有關將負載靶向傳遞至細胞之藥劑及方法。負載包括各種分子，諸如治療劑或診斷劑，特別是毒素、免疫調節劑或放射性診斷劑。在一些實施例中，本發明涉及向個體提供包含負載與至少兩個標籤的化合物(標籤接合物)，以及結合至該標籤接合物之該等標籤且結合至目標抗原的化合物(對接化合物)，該目標抗原為例如目標細胞上的細胞表面抗原。

Description

靶向傳遞至細胞之藥劑及方法
本發明是有關將負載靶向傳遞至細胞之藥劑及方法。負載包括各種分子，諸如治療劑或診斷劑，特別是毒素、免疫調節劑或放射性診斷劑。在一些實施例中，本發明涉及向個體提供包含負載與至少兩個標籤的化合物(標籤接合物(tag conjugate))，以及結合至該標籤接合物之該等標籤且結合至目標抗原(例如目標細胞上的細胞表面抗原)的化合物(對接化合物(docking compound))。在一些實施例中，對接化合物包含肽或多肽。在一些實施例中，對接化合物包含結合至目標細胞的結合部分(主要靶向部分)以及結合至該標籤接合物的該等標籤的又一結合部分。標籤接合物的該等標籤可能結合至其在對接化合物上的結合部分，而對接化合物的主要靶向部分可能結合至目標細胞上的目標抗原(諸如癌細胞上的抗原)，從而將負載精確地傳遞至目標細胞。在一些實施例中，透過投予編碼對接化合物的核酸(例如RNA)向個體提供對接化合物。在一些實施例中，透過投予對接化合物向個體提供對接化合物。在一些實施例中，透過投予向個體提供預形成的複合物，其中對接化合物結合至標籤接合物。
在醫學治療和診斷的許多領域中，需要將藥劑(諸如治療劑(藥物)或診斷劑(例如顯影劑))選擇性地傳遞至個體(例如患者)體內的特定細胞。
主動靶向細胞可能透過將所需負載直接或間接結合至靶向部分來達成，靶向部分結合至感興趣的目標細胞上的細胞表面抗原。靶向部分通常是對細胞表面目標(例如膜蛋白)具有親和力的構造，並且包括抗體或抗體片段。
本發明是有關一種方法，其中使用結合至目標細胞(例如透過結合至細胞表面抗原)的對接化合物。對接化合物進一步包含結合至包含負載並配備有至少兩個標籤的化合物的部分，該等標籤被對接化合物上的部分所靶向。在一些實施例中，結合至包含負載的標籤接合物的對接化合物以編碼對接化合物的核酸形式投予，以供在個體中表現對接化合物。對接化合物可能例如透過結合至細胞表面抗原而結合至目標細胞，從而靶向負載。對接化合物上和標籤接合物上的交互作用部分對的常見實例是抗體/標籤系統。本文所述的概念允許使用單一類型的標籤接合物來靶向多種目標細胞範圍，即透過使用單一類型的標籤接合物與靶向不同主要目標的不同對接化合物。本文所述的概念的進一步優點在於，因為使用單一對接化合物的主要靶向可以與包含不同負載的不同標籤接合物組合進行。
本發明是有關將負載靶向傳遞至細胞之藥劑及方法。在一些實施例中，負載包含診斷化合物(例如放射性同位素)或治療化合物(例如毒素或免疫調節劑)。使用本文所述之包含負載的標籤接合物以及經由標籤接合物的標籤而結合至標籤接合物之對接化合物來達到靶向傳遞負載，該等對接化合物包含靶向分子以供靶向目標細胞上之抗原。
在一個態樣中，本發明是有關一種套組，其包含： (i)    包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物，或編碼該化合物的核酸；及 (ii)   包含負載部分和至少兩個標籤的化合物，該針對標籤之結合部分結合至該至少兩個標籤， 其中標籤是肽標籤。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含有包含聚合物的部分。在一些實施例中，負載部分和肽標籤透過包含聚合物的部分所偶聯。在一些實施例中，聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
在一個態樣中，本發明是有關一種套組，其包含： (i)    包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物，或編碼該化合物的核酸；及 (ii)  包含負載部分和至少兩個標籤的化合物，該針對標籤之結合部分結合至該至少兩個標籤， 其中(ii)的化合物進一步包含有包含聚合物的部分，其中該聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
在一些實施例中，負載部分和標籤透過包含聚合物的部分所偶聯，其中該聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
在一些實施例中，標籤是肽標籤。
在一些實施例中，聚合物選自由聚(乙二醇) (poly(ethylene glycol)，PEG)、聚肌胺酸(polysarcosine，pSar) (聚(N-甲基甘胺酸))、聚㗁唑啉(polyoxazoline，POX)、聚㗁嗪(polyoxazine，POZ)和聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(poly-2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)acetic acid，pAEEA)，其衍生物和組合所組成之群組。
在一些實施例中，聚合物包含至少一個聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，負載部分和標籤透過包含至少一個聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物的部分偶聯。
在一些實施例中，核酸是RNA。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含該等標籤中的兩個。
在一些實施例中，(ii)的化合物中的標籤總數是二。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含一或多個負載部分。
在一些實施例中，(ii)的化合物中的負載部分總數是一。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含兩個或更多個負載部分。
在一些實施例中，(ii)的化合物中的負載部分的總數是二。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含呈非分支(線性)構形的負載部分及標籤。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含呈非分支(線性)構形的至少兩個標籤及至少一個負載部分。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含呈非分支(線性)構形的至少兩個標籤及至少兩個負載部分。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含呈非分支(線性)構形的兩個標籤及一個或兩個負載部分
在一些實施例中，(ii)的化合物包含連接呈非分支(線性)構形的標籤及負載部分的一或多個連接部分。
在一些實施例中，連接部分是分支或非分支連接部分。
在一些實施例中，至少一個連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含藉由連接部分連接的兩個標籤。
在一些實施例中，連接該等標籤的連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，負載部分連接至該等標籤中的至少一者。
在一些實施例中，負載部分藉由連接部分連接至標籤。
在一些實施例中，連接負載部分和標籤的連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，連接負載部分和標籤的連接部分包含酶促切割位點(enzymatic cleavage site)。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含下式： P-L A-T-L B-T 或 P-L A-T-L B-T-L C-P 其中 P包含負載部分； T包含標籤； L A包含連接部分； L B包含連接部分；且 L C包含連接部分。
在一些實施例中，L A、L B和L C中的一或多者包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L B包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L A及/或L C包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L A及/或L C不包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L A及/或L C包含酶促切割位點。
在一些實施例中，L A、L B和L C中的一或多者包含式[AEEA] u-[L D-[AEEA] v] w， 其中 AEEA是2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸或其衍生物； L D包含連接部分； u為2或更大的整數； 各v為2或更大的整數；且 w為1至4的整數； 其中 不同的基團[L D-[AEEA] v]可能相同或不同。
在一些實施例中，L B包含式[AEEA] u-[L D-[AEEA] v] w， 其中 AEEA為2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸或其衍生物； L D包含連接部分； u為2或更大的整數； 各v為2或更大的整數；且 w為1至4的整數； 其中 不同的基團[L D-[AEEA] v]可能相同或不同。
在一些實施例中，u和v各自為2至10的整數。
在一些實施例中，u和v各自為2至8的整數。
在一些實施例中，u和v各自為2、4或6的整數。
在一些實施例中，L D包含胺基酸。
在一些實施例中，L D包含胺基酸的D-異構物。
在一些實施例中，L D包含半胱胺酸或離胺酸。
在一些實施例中，L D連接至側鏈。
在一些實施例中，側鏈包含功能性部分。
在一些實施例中，功能性部分包含增溶(solubilizing)官能基。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含呈分支(非線性)構形的負載部分和標籤。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含呈分支(非線性)構形的至少兩個標籤和至少一個負載部分。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含呈分支(非線性)構形的至少兩個標籤和至少兩個負載部分。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含呈分支(非線性)構形的兩個標籤和一或兩個負載部分。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含連接呈分支(非線性)構形的標籤和負載部分的一或多個連接部分。
在一些實施例中，至少一個連接部分是分支連接部分。
在一些實施例中，至少一個連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含藉由連接部分連接的兩個標籤。
在一些實施例中，連接標籤的連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，負載部分連接至連接標籤的連接部分。
在一些實施例中，負載部分連接至藉由連接部分連接標籤的連接部分。
在一些實施例中，連接負載部分的連接部分和連接標籤的連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含連接兩個標籤的主鏈和從主鏈分支並將一或多個負載部分連接至主鏈的一或多個側鏈。
在一些實施例中，一或多個負載部分透過包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物的部分連接至主鏈。
在一些實施例中，側鏈透過主鏈中的分支部分連接至主鏈。
在一些實施例中，主鏈包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，主鏈包含兩個或更多個聚2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，主鏈的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物透過包含分支部分的部分所連接。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含下式： [[P] m-L 1] n-B 1-[L 2-T] o其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； T包含標籤； L 1包含連接部分； L 2包含連接部分； m為1至4的整數； n為1至4的整數；且 o為2至4的整數；其中 不同的基團[L 2-T]可能相同或不同，不同的基團P可能相同或不同，且不同的基團[[P] m-L 1]可能相同或不同。
在一些實施例中，負載部分選自由放射性同位素、毒素和免疫調節劑所組成之群組。
在一些實施例中，B 1的化合價數(valency)對應於或大於n和o的總和。
在一些實施例中，B 1包含胺基酸或雙胺基酸(bis-amino acid)。
在一些實施例中，B 1包含胺基酸的D-異構物。
在一些實施例中，B 1包含半胱胺酸或離胺酸。
在一些實施例中，L 1包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L 1包含酶促切割位點。
在一些實施例中，L 2包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目為2、4或6。
在一些實施例中，L 2包含選自由以下所組成之群組的一或多者：限制構形的部分、供白蛋白結合的部分、增加循環時間的部分、減少腎滯留或攝取的部分，以及酶促切割位點。
在一些實施例中，L 2包含(i)包含半胱胺酸的部分和(ii)聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物和T藉由該包含半胱胺酸的部分所連接。
在一些實施例中，[[P] m-L 1]包含式[[P-L 1'] m-B 2-L 1'']， 其中 B 2包含分支部分； L 1'包含連接部分； L 1''包含連接部分；且 m為1至4的整數；其中 不同的基團[[P-L 1'] m-B 2-L 1'']可能相同或不同，且其中在基團[[P-L 1'] m-B 2-L 1'']中，不同的基團[P-L 1']可能相同或不同。
在一些實施例中，B 2的化合價數對應於或大於m加上1的值。
在一些實施例中，B 2包含胺基酸。
在一些實施例中，B 2包含胺基酸的D-異構物。
在一些實施例中，B 2包含半胱胺酸或離胺酸。
在一些實施例中，L 1'包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物、聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物、半胱胺酸，或其組合。
在一些實施例中，L 1 ''包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L 1''包含經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的部分。
在一些實施例中，經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的部分是胺基酸。
在一些實施例中，經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的胺基酸是離胺酸。
在一些實施例中，L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間。
在一些實施例中，L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間。
在一些實施例中，L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目為2、4或6。
在一些實施例中，L 1'及/或L 1''經增溶官能基取代。
在一些實施例中，L 1'及/或L 1''包含經增溶官能基取代的胺基酸。
在一些實施例中，經增溶官能基取代的胺基酸是離胺酸或半胱胺酸。
在一些實施例中，m為1至3的整數，n為1至3的整數，而o為2或3。
在一些實施例中，o為2。
在一些實施例中，n為1或2。
在一些實施例中，m為1或2。
在一些實施例中，o為2，n為1且m為1。
在一些實施例中，負載部分包含放射性同位素，例如包含放射性同位素的螯合化合物。在一些實施例中，(ii)的化合物中的螯合化合物與標籤共價連接並螯合放射性同位素，諸如放射性核種與放射性標記。在一些實施例中，(ii)的化合物包含1、2、3、4、5或6個放射性同位素分子，例如包含放射性同位素的螯合化合物，其中放射性同位素及/或螯合化合物分子較佳地共價附接至(ii)的化合物。在一些實施例中，(ii)的化合物包含1個放射性同位素分子，例如含有放射性同位素的螯合化合物。
在一些實施例中，o為2，n為2且m為2。
在一些實施例中，負載部分包含毒素或免疫調節劑。在一些實施例中，(ii)的化合物包含1、2、3、4、5或6個毒素或免疫調節劑分子，該等毒素或免疫調節劑分子較佳地共價附接至(ii)的化合物。在一些實施例中，(ii)的化合物包含4個毒素或免疫調節劑分子。
在一些實施例中，(i)的化合物包含針對標籤之單一結合部分或至少兩個(例如兩個)針對標籤之結合部分。
在一些實施例中，負載部分包含放射性同位素(例如包含放射性同位素的螯合化合物)，而(i)的化合物包含針對標籤之單一結合部分。
在一些實施例中，負載部分包含毒素或免疫調節劑，而(i)的化合物包含至少兩個(例如兩個)針對標籤之結合部分。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含下式： P-L 1-B 1-[L 2-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； T包含標籤； L 1包含連接部分；且 L 2包含連接部分；其中 不同的基團[L 2-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含下式： P-[AEEA] p-B 1-[[AEEA] q-R-[AEEA] r-C-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； R為視情況選用的並包含限制構形的部分； C為視情況選用的並包含連接部分； T包含標籤； p為0至6的整數； q為1至4的整數；且 r為1至4的整數；其中 不同的基團[[AEEA] q-R-[AEEA] r-C-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含下式： [[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’] 2-B 1-[L 2-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； B 2包含分支部分； T包含標籤； L 1'包含連接部分； L 1 ’’包含連接部分；且 L 2包含連接部分；其中 不同的基團[[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’]可能相同或不同，其中在基團[[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同，而不同的基團[L 2-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含下式： [[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s] 2-B 1-[[AEEA] t-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； B 2包含分支部分； T包含標籤； L 1'包含連接部分； s為2至8的整數；且 t為2至8的整數；其中 不同的基團[[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s]可能相同或不同，其中在基團[[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同，而不同的基團[[AEEA] t-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，[AEEA]是2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸或其衍生物。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含下式： P-[AEEA]-B 1-[[AEEA] 2-C-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； C為視情況選用的並包含連接部分；且 T包含ALFA標籤；其中 不同的基團[[AEEA] 2-C-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，P包含放射性同位素、包含放射性同位素的螯合化合物，或放射性同位素的螯合化合物。在一些實施例中，B 1包含胺基酸。在一些實施例中，C包含胺基酸。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含下式： P-[AEEA]-B 1-[[AEEA] 2-C-T] 2其中 P包含放射性同位素、包含放射性同位素的螯合化合物，或放射性同位素的螯合化合物； B 1包含胺基酸，較佳地離胺酸； C包含半胱胺酸部分；且 T包含ALFA標籤；其中 不同的基團[[AEEA] 2-C-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，T包含式-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-的ALFA標籤。在一些實施例中，T包含式-Pro-Ser-Arg-Leu-環(Glu-Glu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-的ALFA標籤。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含在本文中顯示為EX-007或EX-008的化合物的結構。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含至少兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含標籤，且其中該至少兩條鏈共價連接。在一些實施例中，(ii)的化合物包含兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含標籤，並且其中該兩條鏈共價連接。在一些實施例中，該等鏈中的至少一者包含至少一個負載部分。在一些實施例中，該等鏈中的各者包含至少一個負載部分。在一些實施例中，(ii)的化合物包含兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含標籤和負載部分，且其中該兩條鏈共價連接。在一些實施例中，(ii)的化合物包含兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含標籤和兩個負載部分，並且其中該兩條鏈共價連接。
在一些實施例中，標籤包含ALFA標籤。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含ALFA標籤和兩個負載部分，且其中該兩條鏈共價連接。
在一些實施例中，共價連接包含三唑。在一些實施例中，共價連接包含1,2,3-三唑。在一些實施例中，共價連接是透過待連接鏈中所含的疊氮化物和炔烴之間的分子間環加成(「點擊」)反應形成。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含ALFA標籤和兩個負載部分，且其中該兩條鏈透過包含1,2,3-三唑的部分共價連接。
在一些實施例中，各鏈包含下式的部分： *-[[AEEA] 2-C-T] 其中 C為視情況選用的並包含連接部分； T包含標籤；且 *是與該等鏈的另一者形成共價連接的部分的附接點。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含兩條鏈，其中各鏈包含下式的部分： *-[[AEEA] 2-C-T] 其中 C為視情況選用並包含連接部分； T包含標籤；且 *是與另一條鏈形成共價連接的部分的附接點。
在一些實施例中，與該等鏈的另一者(another of the chains)形成共價連接的部分或與另一條鏈(the other chain)形成共價連接的部分包含一或多個負載部分。在一些實施例中，與該等鏈的另一者形成共價連接的部分或與另一條鏈形成共價連接的部分包含兩個負載部分。
在一些實施例中，與該等鏈的另一者形成共價連接的部分或與另一條鏈形成共價連接的部分包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間，諸如2、4或6，特別是2。
在一些實施例中，與該等鏈的另一者形成共價連接的部分或與另一條鏈形成共價連接的部分包含從附接點*延伸而出並含有兩個胺基酸的主鏈，其中這兩個胺基酸是透過包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物的部分所連接，且其中該兩個胺基酸各自透過其側鏈連接至負載部分。在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間，諸如2、4或6，特別是2。在一些實施例中，胺基酸包含半胱胺酸。
在一些實施例中，負載部分包含毒素或免疫調節劑。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含兩條鏈，其中各鏈包含下式的部分： Cys-[AEEA] u-Cys-A-[AEEA] 2-C-T 其中 A為視情況選用的並包含將部分Cys-[AEEA] u-Cys附接至部分[AEEA] 2-C-T的部分； C為視情況選用的並包含連接部分； T包含標籤； Cys為透過其側鏈連接到負載部分的半胱胺酸；且 u為1或2。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含兩條鏈，其中各鏈包含下式的部分： Cys-[AEEA] u-Cys-A-[AEEA] 2-C-T 其中 A為視情況選用的並包含將部分Cys-[AEEA] u-Cys附接至部分[AEEA] 2-C-T的部分； C為視情況選用的並包含連接部分； T包含ALFA標籤； Cys為透過其側鏈連接到負載部分的半胱胺酸；且 u為1或2。
在一些實施中，負載部分包含毒素或免疫調節劑。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含兩條鏈，其中各鏈包含下式的部分： Cys-[AEEA] u-Cys-A-[AEEA] 2-C-T 其中 A為視情況選用的並包含將部分Cys-[AEEA] u-Cys附接至部分[AEEA] 2-C-T的部分； C為視情況選用並包含連接部分； T包含ALFA標籤； Cys為透過其側鏈連接到毒素或免疫調節劑的半胱胺酸；且 u為1或2。
在一些實施例中，C包含胺基酸。
在一些實施例中，A包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間，諸如2、4或6，特別是2。在一些實施例中，A與另一條鏈形成共價連接。在一些實施例中，共價連接包含三唑。在一些實施例中，共價連接包含1,2,3-三唑。在一些實施例中，共價連接是透過待連接鏈中所包含的疊氮化物和炔烴之間的分子間環加成(「點擊」)反應形成。
在一些實施例中，T包含式-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-的ALFA標籤。在一些實施例中，T包含式-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-的ALFA標籤。
在一些實施例中，(ii)的化合物包含本文所示的化合物的結構，特別是實例中所示的化合物的結構。在一些實施例中，(ii)的化合物包含在本文中顯示為EX-001至EX-058的化合物的結構。在一些實施例中，(ii)的化合物包含在本文中顯示為EX-014、EX-053或EX-054的化合物的結構。應理解，含有提及毒素的佔位的那些結構也可能含有免疫調節劑而不是毒素，而含有提及免疫調節劑的佔位的那些結構也可能含有毒素而不是免疫調節劑。也應理解，含有螯合劑(諸如DOTA)的那些結構還可能含有任何其他螯合劑來代替這些結構中所示的特定螯合劑，並且視情況可能進一步含有放射性同位素，諸如放射性核種與放射性標記，特別是與螯合劑複合的Ga 68或Cu 64。
在本文所述套組的所有態樣和實施例的一些實施例中，標籤為ALFA標籤。
在本文所述套組的所有態樣和實施例的一些實施例中，標籤為環狀ALFA標籤。
在一個態樣中，本發明是有關上述(ii)的化合物。
在一個態樣中，本發明是有關包含負載部分和至少兩個肽標籤的化合物。
在一些實施例中，化合物包含有包含聚合物的部分。
在一些實施例中，負載部分和肽標籤是透過包含聚合物的部分所偶聯。在一些實施例中，聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
在一個態樣中，本發明是有關包含負載部分和至少兩個標籤的化合物，其中該化合物進一步包含有包含聚合物的部分，其中該聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
在一些實施例中，負載部分和標籤是透過包含聚合物的部分所偶聯，其中該聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
在一些實施例中，標籤是肽標籤。
在一些實施例中，聚合物選自由聚(乙二醇) (PEG)、聚肌胺酸(pSar) (聚(N-甲基甘胺酸))、聚㗁唑啉(POX)、聚㗁嗪(POZ)和聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)，其衍生物及組合所組成之群組。
在一些實施例中，聚合物包含至少一個聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，負載部分和標籤是透過包含至少一個聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物的部分偶聯。
在一些實施例中，負載部分和標籤是透過包含至少一個聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分的部分偶聯。
在一些實施例中，化合物包含該等標籤中的兩個。
在一些實施例中，化合物中的標籤總數是二。
在一些實施例中，化合物包含一或多個負載部分。
在一些實施例中，化合物中的負載部分總數為一。
在一些實施例中，化合物包含兩個或更多個負載部分。
在一些實施例中，化合物中的負載部分的總數為二。
在一些實施例中，化合物包含呈非分支(線性)構形的負載部分和標籤。
在一些實施例中，化合物包含呈非分支(線性)構形的至少兩個標籤和至少一個負載部分。
在一些實施例中，化合物包含呈非分支(線性)構形的至少兩個標籤和至少兩個負載部分。
在一些實施例中，化合物包含呈非分支(線性)構形的兩個標籤和一或兩個負載部分。
在一些實施例中，化合物包含連接呈非分支(線性)構形之標籤和負載部分的一或多個連接部分。
在一些實施例中，連接部分是分支或非分支連接部分。
在一些實施例中，至少一個連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，化合物包含藉由連接部分連接的兩個標籤。
在一些實施例中，連接標籤的連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，負載部分連接至該等標籤中的至少一者。
在一些實施例中，負載部分是藉由連接部分連接至標籤。
在一些實施例中，連接負載部分和標籤的連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，連接負載部分和標籤的連接部分包含酶促切割位點。
在一些實施例中，該化合物包含下式： P-L A-T-L B-T 或 P-L A-T-L B-T-L C-P 其中 P包含負載部分； T包含標籤； L A包含連接部分； L B包含連接部分；且 L C包含連接部分。
在一些實施例中，L A、L B和L C中的一或多者包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L B包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L A及/或L C包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L A及/或L C不包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L A及/或L C包含酶促切割位點。
在一些實施例中，L A、L B和L C中的一或多者包含式[AEEA] u-[L D-[AEEA] v] w， 其中 AEEA為2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸或其衍生物； L D包含連接部分； u為2或更大的整數； 各v為2或更大的整數；且 w為1至4的整數； 其中 不同的基團[L D-[AEEA] v]可能相同或不同。
在一些實施例中，L B包含式[AEEA] u-[L D-[AEEA] v] w， 其中 AEEA為2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸或其衍生物； L D包含連接部分； u為2或更大的整數； 各v為2或更大的整數；且 w為1至4的整數； 其中 不同的基團[L D-[AEEA] v]可能相同或不同。
在一些實施例中，u和v各自為2至10的整數。
在一些實施例中，u和v各自為2至8的整數。
在一些實施例中，u和v各自為2、4或6的整數。
在一些實施例中，L D包含胺基酸。
在一些實施例中，L D包含胺基酸的D-異構物。
在一些實施例中，L D包含半胱胺酸或離胺酸。
在一些實施例中，L D連接至側鏈。
在一些實施例中，側鏈包含功能性部分。
在一些實施例中，功能性部分包含增溶官能基。
在一些實施例中，化合物包含呈分支(非線性)構形的負載部分和標籤。
在一些實施例中，化合物包含呈分支(非線性)構形的至少兩個標籤和至少一個負載部分。
在一些實施例中，化合物包含呈分支(非線性)構形的至少兩個標籤和至少兩個負載部分。
在一些實施例中，化合物包呈含分支(非線性)構形的兩個標籤和一或兩個負載部分。
在一些實施例中，化合物包含連接呈分支(非線性)構形之標籤和負載部分的一或多個連接部分。
在一些實施例中，至少一個連接部分是分支連接部分。
在一些實施例中，至少一個連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，化合物包含藉由連接部分連接的兩個標籤。
在一些實施例中，連接標籤的連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，負載部分連接至連接標籤的連接部分。
在一些實施例中，負載部分連接至藉由連接部分連接標籤的連接部分。
在一些實施例中，連接負載部分的連接部分和連接標籤的連接部分包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，化合物包含連接兩個標籤的主鏈和從主鏈分支而來並將一或多個負載部分連接至主鏈的一或多個側鏈。
在一些實施例中，一或多個負載部分透過包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物的部分連接至主鏈。
在一些實施例中，側鏈透過主鏈中的分支部分連接至主鏈。
在一些實施例中，主鏈包含連續或不連續的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，主鏈包含兩個或更多個聚2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，主鏈的聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物透過包含分支部分的部分所連接。
在一些實施例中，該化合物包含下式： [[P] m-L 1] n-B 1-[L 2-T] o其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； T包含標籤； L 1包含連接部分； L 2包含連接部分； m為1至4的整數； n為1至4的整數；且 o為2至4的整數；其中 不同的基團[L 2-T]可能相同或不同，不同的基團P可能相同或不同，而不同的基團[[P] m-L 1]可能相同或不同。
在一些實施例中，負載部分選自由放射性同位素、毒素和免疫調節劑所組成之群組。
在一些實施例中，B 1的化合價數對應於或大於n和o的總和。
在一些實施例中，B 1包含胺基酸或雙胺基酸。
在一些實施例中，B 1包含胺基酸的D-異構物。
在一些實施例中，B 1包含半胱胺酸或離胺酸。
在一些實施例中，L 1包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L 1包含酶促切割位點。
在一些實施例中，L 2包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目為2、4或6。
在一些實施例中，L 2包含選自由以下所組成之群組的一或多者：限制構形的部分、供白蛋白結合的部分、增加循環時間的部分、減少腎滯留或攝取的部分，以及酶促切割位點。
在一些實施例中，L 2包含(i)包含半胱胺酸的部分和(ii)聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物和T是藉由包含半胱胺酸的部分所連接。
在一些實施例中，[[P] m-L 1]包含式[[P-L 1’] m-B 2-L 1’’] 其中 B 2包含分支部分； L 1'包含連接部分； L 1’’包含連接部分；且 m為1至4的整數；其中 不同的基團[[P-L 1’] m-B 2-L 1’’]可能相同或不同，並且其中在基團[[P-L 1’] m-B 2-L 1’’]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同。
在一些實施例中，B 2的化合價數對應於或大於m加上1的值。
在一些實施例中，B 2包含胺基酸。
在一些實施例中，B 2包含胺基酸的D-異構物。
在一些實施例中，B 2包含半胱胺酸或離胺酸。
在一些實施例中，L 1'包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物、聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物、半胱胺酸，或其組合。
在一些實施例中，L 1 ''包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L 1''包含經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的部分。
在一些實施例中，經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的部分是胺基酸。
在一些實施例中，經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的胺基酸是離胺酸。
在一些實施例中，L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間。
在一些實施例中，L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間。
在一些實施例中，L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目為2、4或6。
在一些實施例中，L 1'及/或L 1''經增溶官能基取代。
在一些實施例中，L 1'及/或L 1''包含經增溶官能基取代的胺基酸。
在一些實施例中，經增溶官能基取代的胺基酸是離胺酸或半胱胺酸。
在一些實施例中，m為1至3的整數，n為1至3的整數，而o為2或3。
在一些實施例中，o為2。
在一些實施例中，n為1或2。
在一些實施例中，m為1或2。
在一些實施例中，o為2，n為1且m為1。
在一些實施例中，負載部分包含放射性同位素，例如包含放射性同位素的螯合化合物。在一些實施例中，化合物中的螯合化合物與標籤共價連接並螯合放射性同位素，諸如放射性核種與放射性標記。在一些實施例中，化合物包含1、2、3、4、5或6個放射性同位素分子，例如包含放射性同位素的螯合化合物，其中放射性同位素及/或螯合化合物分子較佳地共價附接至化合物。在一些實施例中，化合物包含1個放射性同位素分子，例如含有放射性同位素的螯合化合物。
在一些實施例中，o為2，n為2且m為2。
在一些實施例中，負載部分包含毒素或免疫調節劑。在一些實施例中，化合物包含1、2、3、4、5或6個毒素或免疫調節劑分子，該等毒素或免疫調節劑分子較佳地共價附接至化合物。在一些實施例中，化合物包含4個毒素或免疫調節劑分子。
在一些實施例中，化合物包含下式： P-L 1-B 1-[L 2-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； T包含標籤； L 1包含連接部分；且 L 2包含連接部分；其中 不同的基團[L 2-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，化合物包含下式： P-[AEEA] p-B 1-[[AEEA] q-R-[AEEA] r-C-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； R為視情況選用的並包含限制構形的部分； C為視情況選用的並包含連接部分； T包含標籤； p為0至6的整數； q為1至4的整數；且 r為1至4的整數；其中 不同的基團[[AEEA] q-R-[AEEA] r-C-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，化合物包含下式： [[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’] 2-B 1-[L 2-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； B 2包含分支部分； T包含標籤； L 1'包含連接部分； L 1 ’’包含連接部分；且 L 2包含連接部分；其中 不同的基團[[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’]可能相同或不同，其中在基團[[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同，且不同的基團[L 2-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，化合物包含下式： [[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s] 2-B 1-[[AEEA] t-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； B 2包含分支部分； T包含標籤； L 1'包含連接部分； s為2至8的整數；且 t為2至8的整數；其中 不同的基團[[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s]可能相同或不同，其中在基團[[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同，且不同的基團[[AEEA] t-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，[AEEA]是2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸或其衍生物。
在一些實施例中，化合物包含下式： P-[AEEA]-B 1-[[AEEA] 2-C-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； C為視情況選用的並包含連接部分；且 T包含ALFA標籤；其中 不同的基團[[AEEA] 2-C-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，P包含放射性同位素、包含放射性同位素的螯合化合物，或放射性同位素的螯合化合物。在一些實施例中，B 1包含胺基酸。在一些實施例中，C包含胺基酸。
在一些實施例中，化合物包含下式： P-[AEEA]-B 1-[[AEEA] 2-C-T] 2其中 P包含放射性同位素、包含放射性同位素的螯合化合物，或放射性同位素的螯合化合物； B 1包含胺基酸，較佳地離胺酸； C包含半胱胺酸部分；且 T包含ALFA標籤；其中 不同的基團[[AEEA] 2-C-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，T包含式-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-的ALFA標籤。在一些實施例中，T包含式-Pro-Ser-Arg-Leu-環(Glu-Glu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-的ALFA標籤。
在一些實施例中，化合物包含在本文中顯示為EX-007或EX-008的化合物的結構。
在一些實施例中，化合物包含至少兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含標籤，且其中該至少兩條鏈共價連接。在一些實施例中，化合物包含兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含標籤，並且其中該兩條鏈共價連接。在一些實施例中，該等鏈中的至少一者包含至少一個負載部分。在一些實施例中，該等鏈中的各者包含至少一個負載部分。在一些實施例中，化合物包含兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含標籤和負載部分，且其中該兩條鏈共價連接。在一些實施例中，化合物包含兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含標籤和兩個負載部分，並且其中該兩條鏈共價連接。
在一些實施例中，標籤包含ALFA標籤。
在一些實施例中，化合物包含兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含ALFA標籤和兩個負載部分，且其中該兩條鏈共價連接。
在一些實施例中，共價連接包含三唑。在一些實施例中，共價連接包含1,2,3-三唑。在一些實施例中，共價連接是透過待連接鏈中所含的疊氮化物和炔烴之間的分子間環加成(「點擊」)反應形成。
在一些實施例中，化合物包含兩條鏈，其中該等鏈中的各者包含ALFA標籤和兩個負載部分，且其中該兩條鏈透過包含1,2,3-三唑的部分共價連接。
在一些實施例中，各鏈包含下式的部分： *-[[AEEA] 2-C-T] 其中 C為視情況選用的並包含連接部分； T包含標籤；且 *是與該等鏈的另一者形成共價連接的部分的附接點。
在一些實施例中，化合物包含兩條鏈，其中各鏈包含下式的部分： *-[[AEEA] 2-C-T] 其中 C為視情況選用的並包含連接部分； T包含標籤；且 *是與另一條鏈形成共價連接的部分的附接點。
在一些實施例中，與該等鏈的另一者形成共價連接的部分或與另一條鏈形成共價連接的部分包含一或多個負載部分。在一些實施例中，與該等鏈的另一者形成共價連接的部分或與另一條鏈形成共價連接的部分包含兩個負載部分。
在一些實施例中，與該等鏈的另一者形成共價連接的部分或與另一條鏈形成共價連接的部分包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物或的重複單元數目在2和10之間，諸如2、4或6，特別是2。
在一些實施例中，與該等鏈的另一者形成共價連接的部分或與另一條鏈形成共價連接的部分包含從附接點*延伸而出並包含兩個胺基酸的主鏈，其中這兩個胺基酸是透過包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物連接，且其中兩個胺基酸各自透過其側鏈連接至負載部分。在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間，諸如2、4或6，特別是2。在一些實施例中，胺基酸包含半胱胺酸。
在一些實施例中，負載部分包含毒素或免疫調節劑。
在一些實施例中，化合物包含兩條鏈，其中各鏈包含下式的部分： Cys-[AEEA] u-Cys-A-[AEEA] 2-C-T 其中 A為視情況選用的並包含將部分Cys-[AEEA] u-Cys附接至部分[AEEA] 2-C-T的部分； C為視情況選用的並包含連接部分； T包含標籤； Cys為透過其側鏈連接至負載部分的半胱胺酸；且 u為1或2。
在一些實施例中，化合物包含兩條鏈，其中各鏈包含下式的部分： Cys-[AEEA] u-Cys-A-[AEEA] 2-C-T 其中 A為視情況選用的並包含將部分Cys-[AEEA] u-Cys附接至部分[AEEA] 2-C-T的部分； C為視情況選用的並包含連接部分； T包含ALFA標籤； Cys為透過其側鏈連接至負載部分的半胱胺酸；且 u為1或2。
在一些實施中，負載部分包含毒素或免疫調節劑。
在一些實施例中，化合物包含兩條鏈，其中各鏈包含下式的部分： Cys-[AEEA] u-Cys-A-[AEEA] 2-C-T 其中 A為視情況選用的並包含將部分Cys-[AEEA] u-Cys附接至部分[AEEA] 2-C-T的部分； C為視情況選用的並包含連接部分； T包含ALFA標籤； Cys為透過其側鏈連接至毒素或免疫調節劑的半胱胺酸；且 u為1或2。
在一些實施例中，C包含胺基酸。
在一些實施例中，A包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間，諸如2、4或6，特別是2。在一些實施例中，A與另一條鏈形成共價連接。在一些實施例中，共價連接包含三唑。在一些實施例中，共價連接包含1,2,3-三唑。在一些實施例中，共價連接是透過待連接鏈中所包含的疊氮化物和炔烴之間的分子間環加成(「點擊」)反應形成。
在一些實施例中，T包含式-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-的ALFA標籤。在一些實施例中，T包含式-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-的ALFA標籤。
在一些實施例中，化合物包含本文所示的化合物的結構，特別是實例中所示的化合物的結構。在一些實施例中，化合物包含在本文中顯示為EX-001至EX-058的化合物的結構。在一些實施例中，化合物包含在本文中顯示為EX-014、EX-053或EX-054的化合物的結構。應理解，包含提及毒素的佔位的那些結構也可能含有免疫調節劑而不是毒素，並且包含提及免疫調節劑的佔位的那些結構也可能含有毒素而不是免疫調節劑。也應理解，含有螯合劑(諸如DOTA)的那些結構還可能含有任何其他螯合劑來代替這些結構中所示的特定螯合劑，並且視情況進一步可能含有放射性同位素，諸如放射性核種和放射性標記，特別是與螯合劑複合的Ga 68或Cu 64。
在本文所述化合物的所有態樣和實施例的一些實施例中，標籤為ALFA標籤。
在本文所述化合物的所有態樣和實施例的一些實施例中，標籤為環狀ALFA標籤。
在一個態樣中，本發明是有關治療具有特徵在於表現目標抗原之細胞的疾病、病症或病況之個體的方法，包含： (i) 向個體提供包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物； (ii) 允許包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物與表現目標抗原的細胞締合；以及 (iii) 向個體投予上述化合物，例如上述(ii)的化合物，其包含針對標籤之結合部分所結合的標籤。
在一些實施例中，藉由向個體投予編碼包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的多肽的RNA，向個體提供包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物；並允許個體體內的細胞表現該多肽。
在一些實施例中，表現多肽的細胞經RNA轉染。
在一些實施例中，RNA以顆粒化調配物(particulate formulation)投予，諸如調配為脂質奈米顆粒。
在一些實施例中，表現多肽的細胞分泌該多肽。
在一些實施例中，表現多肽的細胞表現該多肽，使得其被釋放到血流中。
在一些實施例中，目標抗原是細胞表面抗原。
在一些實施例中，包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物是包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的融合多肽。
在一些實施例中，結合至目標抗原的結合部分包含抗體或抗體衍生物。
在一些實施例中，針對標籤之結合部分包含抗體或抗體衍生物。
在一些實施例中，抗體衍生物是抗體片段。
在一些實施例中，疾病、病症或病況是癌症。
在一些實施例中，表現目標抗原的細胞是病變細胞。
在一些實施例中，表現目標抗原的細胞是癌細胞。
在一些實施例中，目標抗原是腫瘤抗原。
在一些實施例中，負載部分包含放射性同位素，例如包含放射性同位素的螯合化合物。
在一些實施例中，負載部分包含毒素或免疫調節劑。
在一些實施例中，包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物包含針對標籤之單一結合部分或至少兩個(例如兩個)針對標籤之結合部分。
在一些實施例中，負載部分包含放射性同位素，例如包含放射性同位素的螯合化合物，且包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物包含針對標籤之單一結合部分。
在一些實施例中，負載部分包含毒素或免疫調節劑，且包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物包含至少兩個(例如兩個) 針對標籤之結合部分。
在一些實施例中，標籤為ALFA標籤。
在一些實施例中，標籤為環狀ALFA標籤。
儘管下面進一步詳細說明了本發明，但是應當理解，本發明不限於本文所述的特定方法、方案，和試劑，因為這些可以會有所改變。還應理解，本文所使用的術語僅作為說明特定實施例為目的，並不希望限制本發明的範疇，本發明的範疇將僅由隨附申請專利範圍所囿限。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語與技術領域中具有通常技術者一般理解的含義相同。
在下文中，將更為詳細說明本發明的元件。這些元件與特定實施例一起列出，然而應當理解，它們可以按任何方式並按任何數量組合以創造出更多實施例。不同描述的實例和較佳實施例不應被解釋為將本發明僅侷限於明確描述的實施例。此說明應當被理解為支持並含括將明確描述的實施例與任何數量的揭示及/或較佳元件相結合的實施例。此外，除非上下文另有說明，否則所有描述的元件的任何排列與組合都應被認為是本說明書所揭示的。
除非另有說明，否則本發明的實施將採用常規化學、生物化學、藥學、細胞生物學、免疫學和重組DNA技術，這些技術在該領域的文獻中進行了解釋。
除非上下文有需要，否則在本說明書通篇與其後的申請專利範圍中，單詞「包含(comprise)」以及諸如「包含(comprises)」和「包含(comprising)」的變體將被理解為暗示包括所陳述的特徵、元件、成員、整數或步驟，或成組的特徵、元件、成員、整數或步驟，但不排除任何其他特徵、元件、成員、整數或步驟或成組的特徵、元件、成員、整數或步驟。術語「基本上由…組成」將申請專利範圍或揭示內容的範圍限制於指定的特徵、元件、成員、整數或步驟以及那些不實質上影響申請專利範圍或揭示內容的基本和新穎特徵者。術語「由…組成」將申請專利範圍或揭示內容的範疇限制於指定的特徵、元件、成員、整數或步驟。術語「包含」涵蓋術語「基本上由…組成」，其復而涵蓋術語「由…組成」。因此，在本申請案中每次出現時，術語「包含」可能用術語「基本上由…組成」或「由…組成」替換。同樣，在本申請案中每次出現時，術語「基本上由…組成」可以用術語「由…組成」替換。
除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則在說明本發明的上下文中(尤其是在申請專利範圍的上下文中)所用的術語「一(a和an)」和「該(the)」以及類似的參考用語將被解釋為涵蓋單數和複數。
除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本文所述的所有方法都可以按任何適當順序進行。
在此提供的任何和所有實例或例示性語言(例如「諸如」)的使用僅旨在更為充分說明本發明而並非對所請求保護的發明範疇構成限制。說明書中的任何語言都不應被解釋為表示對實施本發明至關重要的任何未請求保護的元件。
如本文所用的術語「視情況」或「視情況地」表示隨後描述的事件、情況或條件可能發生或可能不發生，並且該描述包括該等事件、情況或條件發生的情況和不發生的情況。
在本文中使用時，「及/或」應被視為兩個指定特徵或組分中的每一者連同或不連同另一者的具體揭示。例如，「X及/或Y」應被視為(i) X、(ii) Y和(iii) X和Y中每一者的具體揭示，就像各自在本文中單獨列出一樣。
在本發明的上下文中，術語「約」表示具有通常技藝者將理解仍然確保所討論的特徵的技術效用的準確度區間。此術語通常表示與所示數值偏差±10%、±5%、±4%、±3%、±2%、±1%、±0.9%、±0.8%、±0.7%、±0.6%、±0.5%、±0.4%、±0.3%、±0.2%、±0.1%、±0.05%，例如±0.01%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±10%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±5%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±4%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±3%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±2%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±1%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.9%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.8%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.7%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.6%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.5%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.4%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.3%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.2%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.1%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.05%。在一些實施例中，「約」表示與所示數值偏差±0.01%。如具有通常技術者將理解的，對於給定技術效用的數值的這樣具體偏差將取決於技術效用的性質。例如，自然或生物技術效用通常可能比人造或工程技術效用有更大的偏差。
本文對數值範圍的引用僅旨在用作單獨提及落入該範圍內的每個各別數值的速記方法。除非本文另有說明，否則每個單獨數值都被併入說明書中，就好像它在本文中被單獨引用一樣。
在本說明書的全文通篇中引用了若干份文件。在此引用的每份文件(包括所有專利、專利申請案、科學出版物、製造商的說明書、說明書等)，無論是上文還是下文，均以全文引用的方式併入本文。本文中的任何內容均不應被解釋為承認本發明無權先於這些先前發明的此等揭示內容。
在下文中，將提供應用於本發明所有態樣的定義與實施例。除非另有說明，否則以下定義的術語具有所定義的含義。任何未定義的術語都有其技藝所公認的含義。
如本文所用，諸如「減少」或「抑制」的術語表示導致整體降低的能力，例如在程度上降低約5%或更多、約10%或更多、約15%或更多、約20%或更多、約25%或更多、約30%或更多、約40%或更多、約50%或更多，或約75%或更多。術語「抑制」或類似片語包括完全或基本上完全抑制，即減少至零或基本上減少至零。
如本文所用，諸如「增強」的術語表示導致整體增加的能力，例如在程度上增強例如至少約5%或更多、約10%或更多、約15%或更多、約20%或更多、約25%或更多、約30%或更多、約40%或更多、約50%或更多、約75%或更多，或約100%或更多。
如本文所用，「生理pH」是指pH為約7.4。在一些實施例中，生理pH為7.3至7.5。在一些實施例中，生理pH為7.35至7.45。在一些實施例中，生理pH為7.3、7.35、7.4、7.45或7.5。
如本發明所用，「% w/v」是指重量體積百分率，其是測量以克(g)為單位的溶質數量的濃度單位，表示為以毫升(mL)為單位的溶液總體積的百分率。
如本發明所用，「以重量計的%」是指重量百分率，其是測量以克(g)為單位的物質數量的濃度單位，表示為以克(g)為單位的總組成物的總重量的百分率。
如本發明所用，「mol %」定義為一種組分的莫耳數相對於所有組分的總莫耳數的比值乘以100。
如本發明所用，「總脂質的mol %」定義為一種脂質組分的莫耳數與所有脂質的總莫耳數的比值乘以100。在此上下文中，在一些實施例中，術語「總脂質」包括脂質和脂質樣物質。
術語「離子強度」是指特定溶液中不同種類離子物質的數量與其對應電荷之間的數學關係。因此，離子強度I在數學上由下式表示： 其中c是特定離子物質的莫耳濃度，而z是其電荷的絕對值。總和Σ是溶液中所有不同種類離子(i)的總和。
根據本發明，在一些實施例中，術語「離子強度」是有關一價離子的存在。關於二價離子(特別是二價陽離子)的存在，由於螯合劑的存在，它們的濃度或有效濃度(存在游離離子)在一些實施例中低到足以防止RNA降解。在一些實施例中，二價離子的濃度或有效濃度低於水解核苷酸(諸如RNA核苷酸)之間的磷酸二酯鍵的催化量。在一些實施例中，游離二價離子的濃度為20 μM或更少。在一些實施例中，沒有或基本上沒有游離二價離子。
「滲透壓」是指特定溶質的濃度，表示為每千克溶劑的溶質滲透克分子(osmole)數。
術語「凍乾(lyophilizing或lyophilization)」是指藉由將物質冷凍，然後降低周圍壓力(例如低於15 Pa，諸如低於10 Pa、低於5 Pa，或1 Pa或更少)使物質中的冷凍介質直接從固相昇華到氣相而對物質進行冷凍-乾燥。因此，該等術語「凍乾」及「冷凍乾燥」在本文中互換使用。
術語「噴霧乾燥」是指藉由在容器(噴霧乾燥器)內混合(加熱)氣體與霧化(噴霧)的流體來對物質進行噴霧-乾燥，其中來自形成液滴的溶劑蒸發，產生乾燥粉末。
術語「回溶」是有關將諸如水的溶劑添加到乾燥的產品中以使其恢復為液體狀態，諸如其原始液體狀態。
在本發明的上下文中，術語「重組」表示「透過遺傳工程做出」。在一個實施例中，在本發明的上下文中「重組物體」不是天然存在的。
如本文所用，術語「天然存在的」是指物體可以在自然界中被發現到。例如，存在於生物體(包括病毒)中且可以從自然界的來源中分離且未經人在實驗室中有目的修飾的肽或核酸是天然存在的。術語「在自然界中被發現到」表示「存在於自然界中」，並包括已知物體以及尚未被發現及/或尚未從自然界中被分離出來，但將來可能從天然來源中被發現及/或被分離出來的物體。
如本文所用，術語「室溫」和「環境溫度」在本文中可互換使用，並且是指至少約15℃，例如約15℃至約35℃、約15℃至約30℃、約15℃至約25℃，或約17℃至約22℃的溫度。這樣的溫度將包括15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃，21℃和22℃。
術語「EDTA」是指乙二胺四乙酸二鈉鹽。所有濃度均相對於EDTA二鈉鹽提供。
術語「冷凍保護劑(cryoprotectant)」是有關被添加到調配物中以便在冷凍階段期間保護活性成分的物質。
術語「凍乾保護劑(lyoprotectant)」是有關被添加到調配物中以便在乾燥階段期間保護活性成分的物質。
根據本發明，術語「肽」是指包含約兩個或更多個、約3個或更多個、約4個或更多個、約6個或更多個、約8個或更多個、約10個或更多個、約13個或更多個、約16個或更多個、約20個或更多個，且至多約50個、約100個或約150個經由肽鍵彼此連接的連續胺基酸的物質。術語「多肽」是指大型肽，特別是具有至少約151個胺基酸的肽。「肽」與「多肽」均為蛋白質分子。因此該等術語「肽」、「蛋白質」和「多肽」在本文中通常用作同義詞。
本文所揭示的肽與多肽可能包含線性或環化肽序列。
在一些實施例中，本文所揭示的肽包含至少一個環狀部分，即含有鍵環序列的多肽鏈，在本文中稱為「環狀肽」。環序列可以透過肽的胺基端和羧基端之間的連接；胺基端和側鏈之間的連接；羧基端和側鏈之間的連接；或兩個半胱胺酸胺基酸的兩個包括硫基的側鏈之間透過形成雙硫鍵的連接，或更複雜的排列而出現。
在一些實施例中，本文所揭示的肽和多肽由天然存在的胺基酸、非天然存在的胺基酸、胺基酸衍生物及非胺基酸組分或其混合物組成。在一些實施例中，本文所揭示的肽和多肽包含胺基酸模擬物和胺基酸類似物。在一些實施例中，本文所揭示的肽和多肽包含對酶促切割具有抗性的非天然存在的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所揭示的肽或多肽的一或多個位置經非天然存在的胺基酸取代。在一些實施例中，取代的胺基酸與原有殘基在化學上相關(例如脂族、帶電、鹼性、酸性、芳族、親水性)或為原有殘基的同電子排列體。
在最廣泛的意義上，如本文所用，術語「胺基酸」是指例如透過形成一或多個肽鍵可以、正在或已被併入肽中的化合物及/或物質。在一些實施例中，胺基酸具有通用結構H 2N-C(H)(R)-COOH。在一些實施例中，胺基酸是天然存在的胺基酸。在一些實施例中，胺基酸是非天然胺基酸。在一些實施例中，胺基酸是D-胺基酸。在一些實施例中，胺基酸是L-胺基酸。「標準胺基酸」或「蛋白質胺基酸」是指天然存在的肽和多肽中常見的二十種標準L-胺基酸中的任一者。「非標準胺基酸」是指標準胺基酸之外的任何胺基酸，無論其是合成製備的還是從天然來源獲得的。在一些實施例中，肽或多肽中的胺基酸(包括羧基端及/或胺基端胺基酸)與上述通用結構相比時可以含有結構修飾。例如，在一些實施例中，與通用結構相比時，胺基酸可能透過甲基化、醯胺化、乙醯化、聚乙二醇化、醣基化、磷酸化及/或取代(例如胺基、羧酸基、一或多個質子及/或羥基的取代)而被修飾。在一些實施例中，與含有其他方面相同的未經修飾胺基酸的肽或多肽相比，此類修飾可能會例如改變含有經修飾胺基酸的肽或多肽的循環半衰期。在一些實施例中，與含有其他方面相同的未經修飾胺基酸的肽或多肽相比，此類修飾不會顯著改變含有經修飾胺基酸的肽或多肽的相關活性。如從上下文中將會是清楚的，在一些實施例中，術語「胺基酸」可能用於指游離胺基酸。在一些實施例中，它可能用於指肽或多肽的胺基酸殘基。
下表列出了20種天然胺基酸及其縮寫：
名稱 縮寫
丙胺酸 Ala A
精胺酸 Arg R
天冬醯胺酸 Asn N
天冬胺酸 Asp D
半胱胺酸 Cys C
麩胺酸 Glu E
麩醯胺酸 Gln Q
甘胺酸 Gly G
組胺酸 His H
異白胺酸 Ile I
白胺酸 Leu L
離胺酸 Lys K
甲硫胺酸 Met M
苯丙胺酸 Phe F
脯胺酸 Pro P
絲胺酸 Ser S
蘇胺酸 Thr T
色胺酸 Trp W
酪胺酸 Tyr Y
纈胺酸 Val V
通常，胺基酸是L-胺基酸，而D-胺基酸由前綴「D」表示。前綴「同型(homo)」或「h」表示一種α-胺基酸，其在其他方面與常見胺基酸之一者相似，但在碳鏈中含有多一個亞甲基。
如本文所用，「Orn」表示鳥胺酸或2,5-二胺基戊酸，「Dab」表示2,4-二胺基丁酸，「Dap」表示2,3-二胺基丙酸，「hLys」表示2,7-二胺基庚酸，「hCys」表示2-胺基-4-巰基丁酸，而「Pen」表示青黴胺或2-胺基-3-甲基-3-氫硫基丁酸。
也可能包括非肽鍵聯與其他化學修飾。例如，肽或多肽的部分或全部可能合成為擬肽物，例如類肽(參見例如Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-71及Horwell (1995) Trends Biotechnol.l3:132-4)。肽或多肽可能包括一或多個(例如全部)非可水解鍵。許多非可水解肽鍵以及含有此類鍵的肽的合成程序是本領域已知的。例示性非可水解鍵包括-[CH 2NH]-還原醯胺肽鍵、-[COCH 2]-酮亞甲基肽鍵、-[CH(CN)NH]-(氰基亞甲基)胺基肽鍵、-[CH 2CH(OH)]-羥基亞乙基肽鍵、-[CH 2O]-氧基亞甲基肽鍵，以及-[CH 2S]-硫代亞甲基肽鍵(參見例如美國專利第6,172,043號)。
如本文所用，術語「醯胺」表示式「-NHC(O)-」的基團。
術語「硫代醯胺」表示式「-NHC(S)-」的基團。
如本文所用，術語「雙硫鍵(disulfide bond)」、「雙硫橋」或「雙硫鍵(disulfide)」包括兩個硫原子之間形成的共價鍵。胺基酸半胱胺酸包含可與第二個硫醇基團形成雙硫鍵或橋的硫醇基團。
術語「醚」是指在兩個碳原子之間具有氧的基團或化合物。
術語「硫醚」是指在兩個碳原子之間具有硫的基團或化合物。
術語「酯」是指由羧酸和醇透過前者中的-C(＝O)OH基團的羥基和後者的羥基結合同時在名義上失去水而衍生的化合物。因此，該術語是指基團-C(O)O-。
術語「硫酯」是指基團-C(O)S-或-C(S)O-。
術語「三唑」是指在其結構中併入任何具有兩個碳原子和三個氮原子的五員環的雜環結構的化學化合物(例如1,2,3-三唑)。
術語「部分(portion)」是指部分(fraction)。關於特定結構(諸如胺基酸序列或蛋白質)，術語其「部分」可能指該結構的連續或不連續部分。
術語「部分」和「片段」在本文中可互換使用並且是指連續元件。例如，諸如胺基酸序列或蛋白質的結構的一部分是指該結構的連續元件。當在組成物的上下文中使用時，術語「部分」表示組成物的一部分。例如，組成物的一部分可能是該組成物的0.1%至99.9% (例如0.1%、0.5%、1%、5%、10%、50%、90%或99%)的任何部分。
提及胺基酸序列(肽或蛋白質)時，「片段」是有關於胺基酸序列的一部分，即代表在N-端及/或C-端處被縮短的胺基酸序列的序列。在C-端處被縮短的片段(N-端片段)可例如藉由轉譯缺少開放讀框3'端的截短型開放讀框來獲得。在N端處被縮短的片段(C端片段)可例如藉由轉譯缺少開放讀框5'端的截短型開放讀框來獲得，只要該截短型開放讀框包含用於啟動轉譯的起始密碼子即可。胺基酸序列的片段包含例如胺基酸序列的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%胺基酸殘基。胺基酸序列的片段包含胺基酸序列的例如至少6個，特別是至少8個、至少10個、至少12個、至少15個、至少20個、至少30個、至少50個或至少100個連續胺基酸。胺基酸序列的片段包含胺基酸序列的例如至多8個，特別是至多10個、至多12個、至多15個、至多20個、至多30個或至多55個連續胺基酸。
如本文所用且提到胺基酸序列(肽或多太)時，「變體」表示因為至少一個胺基酸(例如不同的胺基酸，或相同胺基酸的修飾)而不同於親本胺基酸序列的胺基酸序列。親本胺基酸序列可能是天然存在的或野生型(WT)胺基酸序列，或者可能是野生型胺基酸序列的經修飾形式。較佳地，變體胺基酸序列與親本胺基序列相比具有至少一處胺基酸差異，與親本相比具有例如1至約20處胺基酸修飾，諸如1至約10個或1至約5處胺基酸差異。
如本文中所用且提到胺基酸序列(肽或多太)時，「野生型」或「WT」或「天然」是指在自然界中發現的胺基酸序列，包括對偶基因變異。野生型胺基酸序列、肽或多肽具有未經有意修飾的胺基酸序列。
出於本發明之目的，胺基酸序列(肽或多肽)的「變體」可能包含胺基酸插入變體、胺基酸添加變體、胺基酸缺失變體及/或胺基酸取代變體。術語「變體」包括所有突變體、剪接變體、經轉譯後修飾的變體、構形、同型、對偶基因變體、物種變體和物種同源物，特別是那些天然存在的。術語「變體」尤其包括胺基酸序列的片段。
胺基酸插入變體包含在特定胺基酸序列中插入單個或兩個或更多個胺基酸。在胺基酸序列變體具有插入的情況下，將一或多個胺基酸殘基插入到胺基酸序列中的特定位點，儘管隨機插入並且適當篩選所得產物也是可行的。胺基酸添加變體包含一或多個胺基酸(諸如1、2、3、5、10、20、30、50或更多個胺基酸)的胺基及/或羧基端融合物。胺基酸缺失變體的特徵在於從序列中去除一或多個胺基酸，諸如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多個胺基酸。缺失可能在蛋白質的任何位置。在蛋白質N-端及/或C-端處包含缺失的胺基酸缺失變體也稱為N-端及/或C-端截短變體。胺基酸取代變體的特徵在於序列中的至少一個殘基被移除且另一個殘基被插入其位置。偏好修飾位於胺基酸序列中在同源蛋白質或多肽之間不保守的位置及/或用具有相似性質的其他胺基酸替換胺基酸。在一些實施例中，肽和多肽變體中的胺基酸變化是保守胺基酸變化，即類似帶電或不帶電胺基酸的取代。保守的胺基酸變化涉及取代在其側鏈中相關的胺基酸家族中的一者的取代。天然胺基酸通常分為四個家族：酸性(天冬胺酸、麩胺酸)、鹼性(離胺酸、精胺酸、組胺酸)、非極性(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)和不帶電極性(甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)胺基酸。苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸有時被一起歸類為芳族胺基酸。在一個實施例中，保守胺基酸取代包括下群內的取代： 甘胺酸、丙胺酸； 纈胺酸、異白胺酸、白胺酸； 天冬胺酸、麩胺酸； 天冬醯胺酸、麩醯胺酸； 絲胺酸、蘇胺酸； 離胺酸、精胺酸；以及 苯丙胺酸、酪胺酸。
在一些實施例中，給定胺基酸序列和該給定胺基酸序列之變體的胺基酸序列之間的相似性(諸如同一性)程度將為至少約60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。較佳針對參考胺基酸序列全長至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%的胺基酸區域提供相似性或同一性程度。例如，如果參考胺基酸序列由200個胺基酸組成，則較佳針對例如至少約20、至少約40、至少約60、至少約80、至少約100、至少約120、至少約140、至少約160、至少約180或約200個胺基酸，在一些實施例中為連續胺基酸提供相似性或同一性程度。在一些實施例中，相似性或同一性程度是針對參考胺基酸序列的全長提供。用於確定序列相似性(諸如序列同一性)的比對可以使用本領域已知的工具進行，諸如使用最佳序列比對，例如使用Align、使用標準設定，較佳為EMBOSS:: nee，Matrix:Blosum62，空位開放(Gap Open)10.0，空位延伸(Gap Extend)0.5。
「序列相似性」表示相同或代表保守胺基酸取代的胺基酸百分率。兩個胺基酸序列之間的「序列同一性」表示序列之間相同的胺基酸百分率。兩個核酸序列之間的「序列同一性」表示序列之間相同的核苷酸百分率。
術語「同一%」、「同一性%」或類似術語欲指於待比較序列之間進行最佳比對時，相同的核苷酸或胺基酸的百分率。該百分率純粹是統計的，且兩個序列之間的差異在待比較序列的整個長度上可能但不一定隨機分布。兩個序列的比較通常透過在最佳比對後相對於區段或「比較窗口」比較序列來進行，以鑑定出對應序列的局部區域。用於比較的最佳比對可能手動進行或借助演算法，例如Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482的局部同源演算法、借助Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443的局部同源演算法、借助Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444的相似性檢索演算法，或借助使用該等演算法的電腦程式(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)來進行。在一些實施例中，使用BLASTN或BLASTP演算法確定兩個序列的同一性百分率，如美國國家生物技術資訊中心(NCBI)網站(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq)上可用的。在一些實施例中，NCBI網站上用於BLASTN演算法的演算法參數包括：(i)預期閾值設為10；(ii)字組大小設為28；(iii)查詢範圍內的最大匹配設為0；(iv)匹配/不匹配分數設為1、-2；(v)空位成本設為線性；以及(vi)使用低複雜度區域濾波器。在一些實施例中，NCBI網站上用於BLASTP演算法的演算法參數包括：(i)預期閾值設為10；(ii)字組大小設為3；(iii)查詢範圍內的最大匹配設為0；(iv)矩陣設為BLOSUM62；(v)空位成本設為存在：11延伸：1；以及(vi)條件成分評分矩陣調整。
透過確定待比較序列處對應的相同位置數，將這個數除以要比較的位置數(例如參考序列中的位置數)，並將這個結果乘以100來獲得同一性百分率。
在一些實施例中，針對參考序列全長的至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%的一個區域提供相似性或同一性程度。例如，若參考核酸序列由200個核苷酸組成，則較佳地針對至少約100、至少約120、至少約140、至少約160、至少約180或約200個核苷酸，在一些實施例中為連續核苷酸提供同一性程度。在一些實施例中，相似性或同一性程度是針對參考序列的全長提供的。
根據本發明，同源胺基酸序列展現出至少40%，特別是至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%，和例如至少95%、至少98%或至少99%的胺基酸殘基同一性。
具有通常知識者可以輕鬆製備本文所述的胺基酸序列變體，例如透過重組DNA操作。用於製備具有取代、添加、插入或缺失的肽或多肽的DNA序列的操作詳細描述於例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, M.R. Green and J. Sambrook et al. (1989),eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2012中。此外，本文所述的肽、多肽和胺基酸變體可能藉助已知的肽合成技術(諸如例如透過固相合成和類似方法)容易地製備。
在一些實施例中，胺基酸序列(肽或多肽)的片段或變體是「功能片段」或「功能變體」。術語胺基酸序列的「功能片段」或「功能變體」是有關展現出一或多種與其衍生而來的胺基酸序列的功能性質相同或相似之功能性質的任何片段或變體，即它在功能上等同。有關於結合劑(諸如抗體)的序列，一種特定功能是由片段或變體衍生而來的胺基酸序列所展現出的一或多種結合活性。如本文所用，術語「功能片段」或「功能變體」特別指與親本分子或序列的胺基酸序列相比包含改變了一或多個胺基酸的胺基酸序列，但仍然能夠實現親本分子或序列的一或多種功能(例如結合至目標分子)的變體分子或序列。在一些實施例中，修飾在親本分子或序列的胺基酸序列中並不會明顯影響或改變分子或序列的特徵。在不同的實施例中，功能片段或功能變體的功能可能降低但仍明顯存在，例如功能片段或功能變體的功能可以是親本分子或序列的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%，或至少90%。然而，在其他實施例中，與親本分子或序列相比，功能片段或功能變體的功能可能受到增強。
「衍生自」指定胺基酸序列(肽或多肽)的胺基酸序列(肽或多肽)是指第二個胺基酸序列的來源。在一些實施例中，衍生自特定胺基酸序列的胺基酸序列具有與該特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的胺基酸序列。衍生自特定胺基酸序列的胺基酸序列可能是那個特定序列或其片段的變體。例如，技術領域中具有通常技術者將理解適用於本文的序列可以被改變，使得它們的序列不同於它們所衍生而來的天然存在的或天然序列，但同時保有天然序列的期望活性。
在一些實施例中，「經分離的」表示脫離(例如純化)自然狀態或人工組成物(諸如製程的組成物)。例如，天然存在於活動物體內的核酸、肽或多肽不是「經分離的」，但與其自然狀態的共存材料部分或完全分離的同一核酸、肽或多肽是「經分離的」。經分離的核酸、肽或多肽可以按基本上純化的形式存在，或可以存在於非天然環境中，諸如例如宿主細胞。
術語「結合(bind或binding)」是有關與目標的非共價交互作用。在一些實施例中，術語「結合(bind或binding)」是有關特異性結合。如本文所用，術語「特異性結合」或「特異性地結合」是指辨識特定目標分子但基本上不辨識或結合樣品或個體中的其他分子的分子，諸如抗體。舉例而言，特異性地結合至一個物種的某一抗原的抗體也可能結合至一或多個其他物種的該抗原。但是，這種跨物種反應性本身並不會改變抗體的特異性分類。在另一個實例中，特異性地結合至某一抗原的抗體也可能結合至抗原的不同對偶基因形式。然而，這種交叉反應性本身並不會改變抗體的特異性分類。
在一些情況下，術語「特異性結合」或「特異性地結合」可用於指抗體、蛋白質或肽與第二種化學物質的交互作用，表示該交互作用仰賴於存在化學物質上的特定結構(例如抗原決定位或表位)；例如，抗體辨識並結合至特定的蛋白質結構，而不是一般的蛋白質。如果抗體對表位「A」具有特異性，則在含有經標記「A」和抗體的反應中，含有表位A (或游離、未經標記的A)的分子的存在將減少與抗體結合的經標記A的數量。
如本文所用，當使用生物層干涉術(BLI)測定或例如在BIAcore 3000儀器中使用表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)技術測定時，術語「結合」或「能夠結合」通常是具有對應於K D為約10 -7M或更小，諸如約10 -8M或更小，諸如約10 ‑9M或更小、約10 ‑10M或更小，或約10 ‑11M或更小的親和力的結合。在一些實施例中，結合部分或藥劑以對應於比其結合至非特異性目標(例如BSA、酪蛋白)的親和力低至少十倍，諸如低至少100倍，例如低至少1,000倍，諸如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍的K D的親和力結合至預定目標。
如本文所用，術語「k d」 (sec ‑1)是指特定交互作用(例如抗體-抗原交互作用)的解離速率常數。該值也稱為k off值。
如本文所用，術語「K D」 (M)是指特定交互作用(例如抗體-抗原交互作用)的解離平衡常數。
一般而言，術語「結合(bind或binding)」和「目標(target)或「靶向(targeting)」在本文中可互換使用。
術語「遺傳修飾」或僅僅「修飾」包括用核酸轉染細胞。術語「轉染」是有關將核酸(例如DNA及/或RNA)引入細胞中。出於本發明之目的，術語「轉染」還包括將核酸引入細胞中或由此細胞攝取核酸，其中細胞可能存在於個體(例如患者)體內，或該細胞可能在活體外(例如在患者體外)。因此，根據本發明，用於轉染本文所述之核酸的細胞可以存在於活體外或活體內，例如細胞可以形成患者的器官、組織及/或身體的一部分。根據本發明，轉染可以是瞬時的或穩定的。就轉染的一些應用來說，被轉染的遺傳物質僅瞬時表現就足夠了。RNA可以被轉染到細胞中以瞬時表現其編碼的蛋白質。因為轉染過程中被引入的核酸通常不會併入到細胞核基因體中，因此外來核酸將會透過有絲分裂稀釋或被降解。允許核酸進行游離基因體擴增的細胞大大降低了稀釋率。如果希望被轉染的核酸實際上保留在細胞及其子細胞的基因體中，就必須進行穩定轉染。例如，這種穩定轉染可以藉由使用基於病毒的系統或基於轉位子的系統進行轉染來達到。一般而言，經編碼對接化合物的核酸轉染的細胞以編碼對接化合物的核酸瞬時轉染。RNA可以被轉染到細胞中以瞬時表現其編碼的蛋白質。
如本文所用，術語「連接(linked)」、「融合(fused)」或「融合(fusion)」可互換使用。這些術語是指兩個或多個元件或組分或結構域結合在一起。
如本文所用，術語「融合蛋白」是指包含兩個或更多次單位的多肽或蛋白質。較佳地，融合蛋白是兩個或更多次單元之間的轉譯融合物。轉譯融合可能透過將閱讀框中一個次單位的編碼核苷酸序列與再一個次單位的編碼核苷酸序列進行遺傳工程改造來生成。次單位可能因為連接子而散佈。
如本文所用，「內源」是指來自生物體、細胞、組織或系統或在生物體、細胞、組織或系統內部產生的任何材料。
如本文所用，術語「外源」是指從生物體、細胞、組織或系統外部引入或產生的任何材料。
術語「自體」用於描述衍生自同一名個體的任何事物。例如，「自體移植」是指衍生自同一名個體的組織或器官的移植。此類程序是有利的，因為它們克服了免疫屏障，否則會導致排斥。
術語「同種異體」用於描述衍生自同一個物種的不同個體的任何事物。當一或多個基因座處的基因不同時，則該兩名或多名個體稱為彼此同種異體。
術語「同基因(syngeneic)」用於描述衍生自具有相同基因型的個體或組織的任何事物，即同卵雙胞胎或相同近親系(inbred strain)的動物或其組織。
術語「異源(heterologous)」用於描述由多個不同元件組成的事物。例如，將一名個體的骨髓轉移到另一名個體中就構成異源移植。異源基因是衍生自於該名個體以外來源的基因。
根據本發明的不同實施例，編碼肽或多肽的核酸被細胞攝取或被引入(即轉染或轉導)細胞中，該細胞可能存在於活體外或個體體內，導致該肽或多肽的表現。細胞可能例如在細胞內(例如在細胞質中及/或在細胞核中)表現所編碼的肽或多肽、可能分泌所編碼的肽或多肽，及/或可以在表面上表現它。在一些實施例中，如果所編碼的肽或多肽是對接化合物，則細胞分泌所編碼的肽或多肽。
根據本發明，諸如「表現…的核酸」和「編碼…的核酸」的術語或類似術語在本文中可互換使用，並且就特定肽或多肽而言，表示該核酸如果存在於適當的環境中(例如在細胞內)便可以被表現以產生該肽或多肽。
如本文所用，術語「表現」包括特定核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。
在本發明的上下文中，術語「轉錄」是有關一種過程，其中DNA序列中的遺傳密碼被轉錄成RNA (尤其是mRNA)。隨後，RNA可以被轉譯成肽或多肽。
就RNA而言，術語「表現」或「轉譯」是有關一種在細胞核醣體中的過程，透過該過程mRNA的股引導胺基酸序列組裝而做出肽或多肽。
本文所述的醫學製劑(特別是套組)可能包含指導材料或說明書。如本文所用，「指導材料」或「說明書」包括可用於傳達本發明的組成物和方法的有用性的出版物、記錄、圖表或任何其他表現媒介。例如，本發明套組的指導材料可能例如貼在含有本發明組成物/調配物的容器上或與含有組成物/調配物的容器一起運輸。或者，指導材料可能與容器各別運輸，目的是指導材料和組成物由接收者共用。
術語「平均直徑」是指透過動態光散射(dynamic light scattering，DLS)以及使用所謂的累積演算法進行數據分析所測量的顆粒的平均流體動力學直徑，其結果提供了具有長度維度的所謂Z 平均值，以及無因次的多分散性指數(PI) (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321)。在此，顆粒的「平均直徑」、「直徑」或「大小」與Z 平均值的這個值以同義來使用。
在一些實施例中，「多分散性指數」是透過如「平均直徑」定義中提到所謂的累積分析基於動態光散射測量結果來計算的。在一些先決條件下，它可以用作為奈米顆粒整體的尺寸分布的度量。 對接化合物
根據本發明，藉由提供帶有結合至目標細胞上的目標(例如目標細胞上的抗原)的部分以及結合至攜帶負載之化合物(標籤接合物)的部分的對接化合物，將負載特異性地傳遞至目標細胞。目標細胞上的目標在本文中也稱為「主要目標」。
「對接化合物」用於在主要目標(例如目標細胞或目標細胞上的抗原)與對接化合物之間形成連接，諸如非共價連接。對接化合物可能與包含要被傳遞至目標細胞的負載的化合物(標籤接合物)形成連接，諸如非共價或共價連接。標籤接合物包含用於透過共價附接至負載之對接化合物結合的標籤。
在一些實施例中，對接化合物包含「主要靶向部分」，例如靶向目標細胞上的細胞表面抗原的部分，它能夠結合至感興趣的主要目標，例如目標細胞上的細胞表面抗原。如本文所用，「主要靶向部分」是有關結合至主要目標的對接化合物的部分。這樣的靶向部分通常是對細胞表面目標具有親和力的部分。這些部分可以是結合至主要目標的任何肽或蛋白質(例如抗體或抗體片段)。本文所用的適當主要靶向部分的具體實施例包括細胞表面抗原結合部分，諸如抗體、抗體片段和DARPin。主要靶向部分的其他實例是結合至受體的肽或蛋白質。
主要靶向部分較佳地以高特異性及/或高親和力結合，且與主要目標的鍵在體內較佳地是穩定的。
為了允許主要目標的特異性靶向，對接化合物的主要靶向部分可以包含化合物，包括但不限於抗體、抗體片段(例如F(ab')2、Fab、scFV、VHH結構域)，和其他蛋白質或肽。
根據一些實施例，主要目標是細胞表面抗原，諸如癌症抗原，且合適的主要靶向部分包括但不限於靶向細胞表面抗原的肽和多肽，例如抗體、抗體片段和DARPin。
根據一些實施例，主要目標是受體，而合適的主要靶向部分包括但不限於這樣一個受體的配體或其仍結合至受體的部分，例如在受體結合蛋白配體的情況下的受體結合肽。
根據一些實施例，挑選主要目標和主要靶向部分以對某些細胞(例如病變細胞，諸如涉入疾病或為疾病特徵的細胞)產生特異性或提升的靶向，疾病為諸如癌症、發炎、感染、心血管疾病(例如血栓、動脈粥狀硬化病變)、缺氧部位(例如中風)、腫瘤、心血管疾病、腦疾病、細胞凋亡和血管生成。這可以透過挑選帶有細胞特異性表現的主要目標來達到。例如，癌症抗原(例如本文所述的那些)可能在癌細胞中表現，而它們在正常非癌性細胞中不表現或以較低量表現。
對接化合物進一步包含充當標籤接合物的相應標籤的結合部分的基團。結合至標籤接合物的對接化合物的部分和主要靶向部分彼此連接，較佳地透過共價鍵聯。
根據一些實施例，對接化合物包含雙特異性分子，諸如雙特異性多肽(例如雙特異性抗體)。在一些實施例中，對接化合物包含結合至主要目標的結合結構域以及結合至標籤接合物的結合結構域。在一些實施例中，對接化合物包含結合至主要目標的抗體或抗體片段以及結合至標籤接合物的抗體或抗體片段。在一些實施例中，至少一個結合結構域包含抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，各個結合結構域包含抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，至少一個結合結構域包含單域抗體，諸如VHH。在一些實施例中，各個結合結構域包含單域抗體，諸如VHH。在一些實施例中，一個結合結構域包含抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，而另一個結合結構域包含單域抗體(諸如VHH)。在一些實施例中，結合至主要目標的結合結構域包含抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，結合至主要目標的結合結構域包含單域抗體(諸如VHH)。在一些實施例中，結合至標籤接合物的結合結構域包含抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，結合至標籤接合物的結合結構域包含單域抗體，諸如VHH。在一些實施例中，結合至主要目標的結合結構域包含抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，而結合至標籤接合物的結合結構域包含單域抗體(諸如VHH)。
在一些實施例中，對接化合物包含一個結合至主要目標的結合結構域以及一個結合至標籤接合物的結合結構域。在一些實施例中，對接化合物包含一個結合至主要目標的結合結構域以及兩個結合至標籤接合物的結合結構域。在一些實施例中，對接化合物包含結合至主要目標的兩個結合結構域以及結合至標籤接合物的兩個結合結構域。
在一些實施例中，對接化合物包含抗體，其中抗體的Fab片段被結合至主要目標並以N端連接至重鏈的剩餘部分的VHH替換。在一些實施例中，重鏈以C端連接至結合到標籤接合物上的標籤的VHH。
在一些實施例中，對接化合物包含結合至主要目標的全長抗體。在一些實施例中，全長抗體的重鏈以C端連接至結合到標籤接合物上的標籤的VHH。
在一些實施例中，對接化合物包含融合蛋白，其包含結合至主要目標的結合結構域以及結合至標籤接合物的結合結構域。
在一些實施例中，對接化合物包含單肽鏈。在一些實施例中，單肽鏈包含結合至主要目標的部分(例如抗體、抗體片段或DARPin)以及結合至標籤接合物的部分(例如抗體或抗體片段)。在一些實施例中，對接化合物包含可例如藉由一或多個雙硫鍵共價連接的兩條肽鏈，其中各肽鏈包含結合至主要目標的部分(例如抗體、抗體片段或DARPin)，以及結合至標籤接合物的部分(例如抗體或抗體片段)。在一些實施例中，抗體片段是VHH，scFv或其混合物。在不同的實施例中，對接化合物或對接化合物的肽鏈包含以下結構之一(從N端到C端)： VHH (α標籤接合物)-視情況選用的連接子-VHH (α主要目標) VHH (α主要目標)-視情況選用的連接子-VHH (α標籤接合物) VHH (α標籤接合物)-視情況選用的連接子-scFv (α主要目標) scFv (α主要目標)-視情況選用的連接子-VHH (α標籤接合物) VHH (α主要目標)-視情況選用的連接子-scFv (α標籤接合物) scFv (α標籤接合物)-視情況選用的連接子-VHH (α主要目標) scFv (α標籤接合物)-視情況選用的連接子-scFv (α主要目標) scFv (α主要目標)-視情況選用的連接子-scFv (α標籤接合物)。
在一個態樣中，本發明提供一種如本文所述的對接化合物。在一些實施例中，對接化合物包含雙特異性分子，諸如雙特異性多肽(例如雙特異性抗體)，其中一種特異性(單價、二價或甚至更多化合價數)結合至表位標籤(例如ALFA標籤)，而另一種特異性(單價、二價或甚至更多化合價數)結合至主要目標(例如目標細胞上的細胞表面抗原)。在一些實施例中，結合至表位標籤的特異性是抗體或抗體片段，諸如NbALFA-奈米抗體(NbALFA)。在一些實施例中，結合至主要目標的特異性是抗體、抗體片段或DARPin。在一些實施例中，靶向主要目標的對接化合物的部分選自由抗主要目標DARPin、抗主要目標VHH和抗主要目標scFv所組成之群組，及/或結合至標籤接合物之對接化合物的部分為NbALFA-奈米抗體(NbALFA)。在一些實施例中，對接化合物具有選自由NbALFA x 抗主要目標DARPin、NbALFA x 抗主要目標VHH和NbALFA x 抗主要目標scFv所組成之群組的結構。在一些實施例中，主要目標是癌症抗原。在一些實施例中，對接化合物包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至表位標籤(例如ALFA標籤)的奈米抗體和抗癌症抗原VHH。在一些實施例中，對接化合物包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至表位標籤(例如ALFA標籤)和抗癌症抗原scFv的奈米抗體。在一些實施例中，對接化合物包含雙特異性分子，該雙特異性分子包含結合至表位標籤(例如ALFA標籤)和抗癌症抗原DARPin的奈米抗體。
在一些實施例中，可透過向個體投予編碼對接化合物的核酸並允許個體的細胞表現對接化合物來提供對接化合物。將編碼對接化合物的核酸傳遞至目標細胞以進行表現可能透過使用包含該核酸的顆粒來實現。顆粒可能包含靶向分子，其結合至目標(例如目標細胞上的抗原)以進行表現。在一些實施例中，對接化合物會從表現核酸的細胞被分泌。在一些實施例中，對接化合物包含訊號肽(例如N端訊號肽)，其允許從表現該核酸的細胞分泌對接化合物。在一些實施例中，表現核酸的細胞是與本文中要被傳遞負載的細胞相同的細胞。在一些實施例中，表現該核酸的細胞與本文中要被傳遞負載的細胞不同。在一些實施例中，表現核酸的細胞是肝臟細胞。在一些實施例中，表現核酸的細胞將對接化合物分泌到血流中。在一些較佳實施例中，編碼對接化合物的核酸是RNA。RNA編碼的對接化合物在本文中也稱為「RiboDocker」。 標籤接合物
本文所述的標籤接合物包含要被傳遞的負載以及供對接化合物結合的標籤。因此，標籤接合物的標籤是標籤接合物的一部分，其形成對接化合物的結合伴侶。一般而言，標籤接合物的標籤以使它們可用於結合至對接化合物的方式共價附接至負載部分。
本文所述的標籤接合物包含至少兩個標籤。在一些實施例中，本文所述的標籤接合物包含2、3、4、5、6、7、8個或甚至更多個標籤，這些標籤可能相同或不同。在一些實施例中，本文所述的標籤接合物的標籤是相同的。在一些實施例中，本文所述的標籤接合物包含部分或完全不同的標籤，但對接化合物的一或多個針對標籤之結合部分結合至不同的標籤。在一些實施例中，本文所述的標籤接合物的標籤中的各者都包含ALFA標籤。在一些實施例中，本文所述的標籤接合物包含兩個標籤，較佳地兩個ALFA標籤。在一些實施例中，本文所述的標籤接合物包含兩個相同的標籤，較佳地兩個相同的ALFA標籤。
在一些實施例中，標籤接合物的標籤包含肽或蛋白質(例如肽標籤)。
在一些實施例中，標籤接合物的標籤包含肽或蛋白質(例如肽標籤)，並且例如透過連接子化學連接至負載部分。
標籤接合物進一步包含在本文中被稱為「負載部分」或「負載」的部分，其能夠吸引、提供或帶來期望的診斷、顯影及/或治療效用。標籤和負載部分可能共價或非共價連接。
在一些實施例中，標籤接合物包含聚合物。在一些實施例中，標籤接合物的負載部分和標籤接合物的標籤是透過包含聚合物的連接子所連接。
在一些實施例中，聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。在一些實施例中，聚合物是親水性聚合物。在一些實施例中，標籤接合物的聚合物部分有助於賦予標籤接合物隱形性質。在一些實施例中，本文所述的標籤接合物的血漿半衰期大於2小時，例如在3至10小時之間。這個特徵有利地允許標籤接合物在目標細胞處積聚並在合理的時間內在其中釋放其內容物(負載)。因此，本文所述的靶向傳遞的有效性增加。
術語「隱形」在本文中被用來描述本文所述的顆粒不被它們所投予的宿主免疫系統偵測到然後被隔離及/或降解，或幾乎不被偵測到然後被隔離及/或降解，及/或被偵測到然後慢慢被隔離及/或降解的能力。
巨噬細胞是免疫系統最為重要的組分之一，且在血液循環消除外來顆粒(包括脂質體和其他膠態顆粒)方面發揮主要作用。在分子層面上，清除顆粒分兩個步驟進行：透過將血清蛋白(或「調理素」)沉積在顆粒表面處進行調理作用，然後巨噬細胞辨識並捕獲經過調理的顆粒。
用親水性與撓性聚合物(例如聚(乙二醇)類的聚合物)的鏈對顆粒表面進行改質，透過防止調理素觸及顆粒表面而賦予它們位阻(steric)保護作用。
在一些實施例中，本文使用的聚合物選自由聚(乙二醇) (PEG)、聚肌胺酸(pSar) (聚(N-甲基甘胺酸)、聚㗁唑啉(POX)、聚㗁嗪(POZ)以及聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA) (包括其衍生物)所組成之群組。
在一些實施例中，聚合物被設計成透過形成保護性親水層在空間上穩定標籤接合物。在一些實施例中，當在活體內投予此類標籤接合物時，聚合物可以減少標籤接合物與血清蛋白的締合及/或因而被網狀內皮系統攝取。
在一些實施例中，PEG是乙二醇或環氧乙烷的視情況經取代的直鏈或分支聚合物。在一些實施例中，PEG是未經取代的。在一些實施例中，PEG被例如一或多個烷基、烷氧基、醯基、羥基或芳基取代。在一些實施例中，PEG具有約130至約50,000、在另一個實施例中約150至約30,000、在另一個實施例中約150至約20,000、在另一個實施例中約150至約15,000、在另一個實施例中約150至約10,000、在另一個實施例中約150至約6000、在另一個實施例中約150至約5000、在另一個實施例中約150至約4000、在另一個實施例中約150至約3000，在另一個實施例中約300至約3000、在另一個實施例中約1000至約3000，並且在又一個實施例中約1500至約2500的分子量。
在一些實施例中，PEG部分具有1000或更大的分子量。在一些實施例中，PEG部分包含10個或更多個單元的式(O-CH 2-CH 2) n。在一些實施例中，PEG包含20至200個環氧乙烷單元，諸如約45個環氧乙烷單元。
在一些實施例中，PEG包含「PEG2k」，也稱為「PEG 2000」，其具有約2000道耳頓的平均分子量。
在一些實施例中，使用PEG 2000、PEG 3000和PEG 5000作為聚合物。
在一些實施例中，pSar包含2至200個之間的肌胺酸單元，諸如5至100個之間的肌胺酸單元、10至50個之間的肌胺酸單元、15至40個之間的肌胺酸單元，例如約23個肌肉胺酸單元。
在一些實施例中，pSar包含以下通式的結構： 其中s是肌胺酸單元的數量。
在一些實施例中，POX及/或POZ聚合物包含2和200個之間、2和190個之間、2和180個之間、2和170個之間、2和160個之間、2和150個之間、2和140個之間、2和130個之間、2和120個之間、2和110個之間、2和100個之間、2和90個之間、2和80個之間、2和70個之間、5和200個之間、5和190個之間、5和180個之間、5和170個之間、5和160個之間、5和150個之間、5和140個之間、5和130個之間、5和120個之間、5和110個之間、5和100個之間、5和90個之間、5和80個之間、5和70個之間、10和200個之間、10和190個之間、10和180個之間、10和170個之間、10和160個之間、10和150個之間、10和140個之間、10和130個之間、10和120個之間、10和110個之間、10和100個之間、10和90個之間、10和80個之間，或10和70個之間的POX及/或POZ重複單元。
在一些實施例中，POX及/或POZ聚合物包含以下通式： ， 其中a是1和2之間的整數；R 11為烷基，特別是C 1-3烷基，諸如甲基、乙基、異丙基或正丙基，並且針對每個重複單元獨立地選擇；而m是指POX及/或POZ重複單元的數目。
在一些實施例中，POX及/或POZ聚合物是POX的聚合物並包含以下通式的重複單元： 。
在一些實施例中，POX及/或POZ聚合物是POZ的聚合物並包含以下通式的重複單元： 。
在該等式的上述實施例的任一者中，m (即聚合物中重複單元的數目)較佳為2和190之間，諸如2和180之間、2和170之間、2和160之間、2和150之間、2和140之間、2和130之間、2和120之間、2和110之間、2和100之間、2和90之間、2和80之間、2和70之間、5和200之間、5和190之間、5和180之間、5和170之間、5和160之間、5和150之間、5和140之間、5和130之間、5和120之間、5和110之間、5和100之間、5和90之間、5和80之間、5和70之間、10和200之間、10和190之間、10和180之間、10和170之間、10和160之間、10和150之間、10和140之間、10和130之間、10和120之間、10和110之間、10和100之間、10和90之間、10和80之間，或10和70之間。在某些實施例中，m為2至180，諸如4至160、6至140、8至120或10至100，例如20至80、30至70，或40至50。
在一些實施例中，POX及/或POZ聚合物是包含以下通式的重複單元的共聚物： ， 其中，共聚物中左側所示的重複單元數目為1至199；共聚物中右式重複單元的數目為1至199；而共聚物中左式重複單元數目與右式重複單元數目的總和為2至200。
在一些實施例中，共聚物中左式的重複單元數目為1至179，諸如1至159、1至139、1至119或1至99；共聚物中右式重複單元數目為1至179，諸如1至159、1至139、1至119或1至99；而共聚物中左式重複單元數目與右式重複單元數目的總和為2至180，諸如4至160、6至140、8至120或10至100，例如20至80、30至70，或40至50。
在上述實施例的一些中，R 11在每次出現時(即在每個重複單元中)可能是相同的烷基(例如R 11在每個重複單元中可能是甲基)。在一些替代實施例中，至少一個重複單元中的R 11不同於另一個重複單元中的R 11(例如，對於至少一個重複單元來說，R 11是一個特定的烷基(諸如乙基)，而對於至少一個不同的重複單元來說，R 11是一個特定的不同烷基(諸如甲基))。例如，每個R 11可能選自兩個不同的烷基(諸如甲基和乙基)且並非所有R 11都是相同的烷基。
在上述實施例的任一者中，R 11較佳為甲基或乙基，更佳為甲基。因此，在一些實施例中，各R 11為甲基或各R 11為乙基。在一些替代實施例中，對於每個重複單元來說，R 11獨立地選自甲基和乙基，其中在至少一個重複單元中R 11是甲基，而在至少一個重複單元中R 11是乙基。
在一些實施例中，聚合物包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)或聚-2-(2-(2-甲基胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pMAEEA)，或其衍生物。
在一些實施例中，聚合物包含以下通式： 其中 X 2和X 1一起為視情況經取代的醯胺、視情況經取代的硫代醯胺酯或硫酯； Y為-CH 2-、-(CH 2) 2-或-(CH 2) 3-； z為2至24；且 n為重複單元的數目，例如1至100。
在一些實施例中， (i)當X 1為-C(O)-時，則X 2為-NR 1-； (ii)當X 1為-NR 1-時，則X 2為-C(O)-； (iii)當X 1為-C(S)-時，則X 2為-NR 1-； (iv)當X 1為-NR 1-時，則X 2為-C(S)-； (v)當X 1為-C(O)-時，則X 2為-O-； (vi)當X 1為-O-時，則X 2為-C(O)-； (vii)當X 1為-C(S)-時，則X 2為-O-； (viii)當X 1為-O-時，則X 2為-C(S)-； (ix)當X 1是-C(O)-時，則X 2是-S-；或 (x)當X 1為-S-時，則X 2為-C(O)-； 其中R 1為氫或C 1-8烷基；較佳地 (i)當X 1為-C(O)-時，則X 2為-NR 1-； (ii)當X 1為-NR 1-時，則X 2為-C(O)-； (iii)當X 1為-C(S)-時，則X 2為-NR 1-； (iv)當X 1為-NR 1-時，則X 2為-C(S)-； (v)當X 1為-C(O)-時，則X 2為-O-；或 (vi)當X 1為-O-時，則X 2為-C(O)-； 其中R 1為氫或C 1-8烷基。
在一些實施例中，X 1為-C(O)-且X 2為-NR 1-，其中R 1為氫或C 1-8烷基。在一些實施例中，X 1為-C(O)-且X 2為-NR 1-，其中R 1為氫或甲基。在一些實施例中，X 1為-C(O)-且X 2為-NR 1-，其中R 1為氫。
在一些實施例中，Y為-CH 2-或-(CH 2) 2-。在一些實施例中，Y為-CH 2-。
在一些實施例中，聚合物包含以下通式： 其中 R 1為氫或C 1-8烷基； z為2至24；且 n為重複單元的數目，例如1至100。
在上式的一些實施例中，z為2至10。在一些實施例中，z為2至7。在一些實施例中，z為2至5。在一些實施例中，z為2或3。在一些實施例中，z為2。
在一些實施例中，聚合物包含以下通式： 其中 R 1為氫或C 1-8烷基；且 n為重複單元的數目，例如1至100。
在上式的一些實施例中，R 1為氫或甲基。在一些實施例中，R 1為氫。
在一些實施例中，聚合物包含以下通式： 其中 n為重複單元的數目，例如1至100。
在上式的一些實施例中，n為2至50。在一些實施例中，n為4至25。在一些實施例中，n為6至20。在一些實施例中，n為8至16。在一些實施例中，n為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19或20。在一些實施例中，n為2、4、6、8，10或12。在一些實施例中，n為2、4或6。
在一些實施例中，標籤接合物包含呈非分支排列的標籤和負載部分。
在一些實施例中，標籤接合物包含下式： P-L A-T-L B-T 或 P-L A-T-L B-T-L C-P 其中 P包含負載部分； T包含標籤； L A包含連接部分； L B包含連接部分；且 L C包含連接部分。
在一些實施例中，L A、L B和L C中的一或多者包含本文所述的聚合物。在一些實施例中，L A、L B和L C中的一或多者包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L B包含本文所述的聚合物。在一些實施例中，L B包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間，例如2和10之間，諸如2、4或6。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)或聚-2-(2-(2-甲基胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pMAEEA)，或其衍生物。在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物包含以下通式： 其中n在2和30之間，例如2和10之間，諸如2、4或6。
在一些實施例中，標籤接合物包含分支部分，標籤和負載部分透過連接部分連接至該分支部分。
術語「分支部分」指一種化學部分，例如胺基酸或聚合物(諸如肽)，其提供用於連接至標籤的官能基(例如經由包含如本文所述的聚合物的連接部分)，並且提供用於連接至負載部分(等)的官能基(例如經由可包含如本文所述的聚合物的連接部分)。因此，本文所述的標籤接合物可能包含數個藉由分支部分連接的臂。在一些實施例中，本文所述的標籤接合物包含以標籤為尾端的兩個臂，以及以負載部分為尾端的一或多個臂。
在一些實施例中，術語「分支部分」是指以負載部分為尾端的臂中的一個化學部分，其提供用於(例如經由連接部分)將超過一個負載部分及/或更多官能基連接至該臂的官能基。
在一些實施例中，將標籤連接至分支部分的連接部分中的至少一者包含如上所述的聚合物。在一些實施例中，將標籤連接至分支部分的連接部分中的各者包含如上所述的聚合物。在一些實施例中，將負載部分連接至分支部分的連接部分中的至少一者包含如上所述的聚合物。在一些實施例中，將負載部分連接至分支部分的連接部分中的各者包含如上所述的聚合物。
在一些實施例中，標籤接合物包含下式： [[P] m-L 1] n-B 1-[L 2-T] o其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； T包含標籤； L 1包含連接部分； L 2包含連接部分； m為1至4的整數； n為1至4的整數；且 o為2至4的整數；其中 不同的基團[L 2-T]可能相同或不同，不同的基團P可能相同或不同，且不同的基團[[P] m-L 1]可能相同或不同。
在一些實施例中，負載部分選自由放射性同位素、毒素和免疫調節劑所組成之群組。
在一些實施例中，B 1的化合價數對應於或大於n和o的總和。
在一些實施例中，B 1包含胺基酸或雙胺基酸。在一些實施例中，二價胺基酸接合物可使用胺基酸衍生的疊氮化物和炔烴作為結構單元(building block)經由分子間環加成(「點擊」)反應來獲得。
在一些實施例中，B 1包含胺基酸的D-異構物。
在一些實施例中，B 1包含半胱胺酸或離胺酸。
一些實施例中，L 1包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L 2包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間，例如2和10之間，諸如2、4或6。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)或聚-2-(2-(2-甲基胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pMAEEA)，或其衍生物。在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物包含以下通式： 其中n在2和30之間，例如2和10之間，諸如2、4或6。
在一些實施例中，L 2包含(i)包含半胱胺酸的部分，以及(ii)聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物與T藉由包含半胱胺酸的部分所連接。
在一些實施例中，[[P] m-L 1]包含式[[P-L 1’] m-B 2-L 1’’]， 其中 B 2包含分支部分； L 1’包含連接部分； L 1’’包含連接部分；且 m為1至4的整數；其中 不同的基團[[P-L 1’] m-B 2-L 1’’]可能相同或不同，且其中在基團[[P-L 1’] m-B 2-L 1’’]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同。
在一些實施例中，B 2的化合價數對應於或大於m加上1的值。
在一些實施例中，B 2包含胺基酸。
在一些實施例中，B 2包含胺基酸的D-異構物。
在一些實施例中，B 2包含半胱胺酸或離胺酸。
在一些實施例中，L 1'包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物、聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物、半胱胺酸，或其組合。
在一些實施例中，L 1 ''包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
在一些實施例中，L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間，例如在2和10之間，諸如2、4或6。
在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)或聚-2-(2-(2-甲基胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pMAEEA)，或其衍生物。在一些實施例中，聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物包含以下通式： 其中n在2和30之間，例如2和10之間，諸如2、4或6。
在式[[P] m-L 1] n-B 1-[L 2-T] o或[[P-L 1’] m-B 2-L 1’’] n-B 1-[L 2-T] o的一些實施例中，m為1至3的整數，n為1至3的整數，而o為2或3。
在一些實施例中，o為2。
在一些實施例中，n為1或2。
在一些實施例中，m為1或2。
在一些實施例中，o為2，n為1且m為1。在一些實施例中，負載部分可能包含放射性同位素，例如包含放射性同位素的螯合化合物，及/或對接化合物可能包含針對標籤之單一結合部分。
在一些實施例中，標籤接合物包含下式： P-L 1-B 1-[L 2-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； T包含標籤； L 1包含連接部分；且 L 2包含連接部分；其中 不同的基團[L 2-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，標籤接合物包含下式： P-[AEEA] p-B 1-[[AEEA] q-R-[AEEA] r-C-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； R為視情況選用並包含限制構形的部分； C為視情況選用的並包含連接部分； T包含標籤； p為0至6的整數； q為1至4的整數；且 r為1至4的整數； 其中 不同的基團[[AEEA] q-R-[AEEA] r-C-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，o為2，n為2且m為2。在這些實施例中，負載部分可能包含毒素或免疫調節劑，及/或對接化合物可能包含至少兩個針對標籤之結合部分，例如兩個針對標籤之結合部分。
在一些實施例中，標籤接合物包含下式： [[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’] 2-B 1-[L 2-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； B 2包含分支部分； T包含標籤； L 1'包含連接部分； L 1 ’’包含連接部分；且 L 2包含連接部分；其中 不同的基團[[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’]可能相同或不同，其中在基團[[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同，且不同的基團[L 2-T]可能相同或不同。
在一些實施例中，標籤接合物包含下式： [[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s] 2-B 1-[[AEEA] t-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； B 2包含分支部分； T包含標籤； L 1'包含連接部分； s為2至8的整數；且 t為2至8的整數；其中 不同的基團[[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s]可能相同或不同，其中在基團[[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同，而不同的基團[[AEEA] t-T]可能相同或不同。
在上述所有標籤接合物的一些實施例中，標籤為ALFA標籤，例如環狀ALFA標籤。
本發明在一個態樣中供如上所述的標籤接合物。 標籤接合物上和對接化合物上的交互作用部分
在一些實施例中，彼此交互作用的標籤接合物上的部分(即標籤)和對接化合物上的部分彼此非共價結合。
在一些實施例中，標籤接合物上和對接化合物上彼此交互作用的部分在生理條件下彼此結合。
在一些實施例中，標籤接合物上和對接化合物上彼此交互作用的部分是抗原/抗體系統。
在一些實施例中，結合至對接化合物的標籤接合物的部分包含肽或蛋白質(例如肽標籤)，而結合至標籤接合物的對接化合物的部分包含結合至肽或蛋白質的結合劑(例如抗體或抗體片段)。
在一些實施例中，標籤接合物上和對接化合物上彼此交互作用的部分包含表位標籤/結合劑系統。
如本文所用，「表位標籤」是指抗體或具有抗體樣功能的蛋白質分子可以結合至其的一段胺基酸。
在一些實施例中，表位標籤包含ALFA標籤。在一些實施例中，表位標籤/結合劑系統包含ALFA標籤和ALFA特異性單域抗體(sdAb) (NbALFA奈米抗體)。
使用ALFA標籤/ALFA特異性sdAb系統在本發明上下文中特別有利。可以為對應的應用挑選對sdAb具有合適親和力的ALFA標籤。
舉例來說，在受益於對接化合物和標籤接合物之間緊密結合的應用中(例如在使用毒素-負載的應用中)，可以挑選高親和力標籤，諸如高親和力ALFA標籤。在這樣的實施例中，也可能偏好使用具有至少兩個針對標籤之結合部分的對接化合物，其中標籤較佳地是高親和力標籤。一個化合物中的兩個標籤結合至另一個化合物中的兩個針對標籤之結合部分的效果可能會產生更為緊密的結合。對接化合物和標籤接合物之間的這種「二對二」結合在游離標籤接合物的循環應降至最低的應用中特別有利，例如以便避免游離標籤接合物的脫靶效應或增加標籤接合物在循環中的半衰期。具有適當親和力的表位標籤/結合劑系統在描述於下面的實例中。
在僅在目標側利用本文所述標籤接合物的結合性效應的其他應用中(例如在使用放射診斷劑，相對親和力較低之標籤(中/低親和力標籤，諸如中/低親和力ALFA標籤)的應用中)，例如可能偏好增加目標位點處(例如腫瘤細胞處)的結合性效應。在這樣的實施例中，也可能偏好使用具有針對標籤之單一結合部分的對接化合物，其中標籤較佳為中/低親和力標籤。在這樣的實施例中，具有高密度目標抗原的目標位點(例如目標細胞)將使得對接化合物(例如帶有一個針對標籤之結合部分)彼此緊密接近結合。由於這種接近性，因為兩個對接化合物的兩個針對標籤之結合部分在目標位點處或在目標上的接近性所產生的結合性效應，包含兩個標籤的標籤接合物將較佳地結合至目標位點處的對接化合物。在對接化合物接近度較低之側(例如在循環中或在目標非特異性對接化合物沉積的側面處)與單一對接化合物結合的可能性較小。可以在本發明上下文中使用利用結合性效應的表位標籤/結合劑系統揭示於下面的實例中。
這種結合性效應的一個主要優點是，可以將包含兩個標籤的游離標籤-接合物的脫靶結合降至最低，同時標籤-接合物的目標特異性積聚發生在具有高密度結合對接化合物(包含一個針對標籤之結合部分)的目標細胞上。這對於放射診斷應用特別有利，在放射診斷應用中脫靶結合會干擾影像讀數(readount)。然而，這種效應也可能有利於減少標籤接合物與其他負載類別(諸如毒素、治療性放射性核種或免疫調節劑)的脫靶效應。
在一些實施例中，WT ALFA (Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH 2)對NbALFA的親和力被用作為一個參考點。在一些實施例中，高親和力標籤(例如高親和力Alfa標籤)的特徵在於具有與特定結合伴侶(例如NbAlfa)解離的值，諸如按照k dis測量，其相對於對應野生型標籤(例如Alfa標籤)的對應值為5或更少，例如4或更少、3或更少、2或更少，或者1或更少。換句話說，在一些實施例中，k dis(高親和力標籤)/k dis(野生型標籤)比值為5或更少，例如4或更少、3或更少、2或更少，或者1或更少。在一些實施例中，中/低親和力標籤(例如中/低親和力Alfa標籤)的特徵在於具有與特定結合伴侶(例如NbAlfa)解離的值，諸如按照k dis測量，其相對於對應野生型標籤(例如Alfa標籤)的對應值為大於5，例如大於6、大於7或大於8。換句話說，在一些實施例中，k dis(中/低親和力標籤)/k dis(野生型標籤)比值大於5，例如大於6、大於7，或者大於8。在一些實施例中，藉由生物層干涉術(BLI)測定親和力。
在一些實施例中，也可以透過使用WT ALFA作為參考品來挑選具有適當結合性質(諸如適當k dis)的標籤/結合劑系統，其不同於ALFA標籤/ALFA特異性sdAb系統。
高親和力標籤的實例為 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2、 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-(環8)Lys-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2、 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-(環13)Glu-NH2、 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2、 -     Ac-Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-(環6)Glu-Glu-Leu-Arg-(環10)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2。
中/低親和力標籤的實例為 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Asp-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2、 -     Ac-Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-(環6)Lys-Glu-Leu-Arg-(環10)Glu-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2、 -     Ac-Pro-Ser-Arg-Leu-(環5)Glu-Glu-Glu-Leu-(環9)Lys-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2。
基於所提供的高和中/低親和力標籤的實例以及所提供的確定表位標籤/結合劑系統對於相應應用的適用性的方法，具有通常知識者可以挑選出適當的系統。
在一些實施例中，ALFA標籤包含胺基酸序列 -AA0-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13-AA14-， 其中AA0、AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7、AA8、AA9、AA10、AA11、AA12，AA13以及AA14的胺基酸為： AA0為Pro或缺失； AA1為Ser、Gly、Thr或Pro； AA2為Arg、Gly、Ala、Glu或Pro； AA3為Leu、Ile或Val； AA4為Glu或Gln； AA5為Glu或Gln； AA6為Glu或Gln； AA7為Leu、Ile或Val； AA8為Arg、Ala、Gln或Glu； AA9為Arg、Ala、Gln或Glu； AA10為Arg； AA11為Leu； AA12為Thr、Ser、Asp、Glu、Pro、Ala或缺失； AA13為Glu、Lys、Pro、Ser、Ala、Asp或缺失；且 AA14為Pro或缺失。
在一些實施例中，ALFA標籤包含選自由SRLEEELRRRLTE、PSRLEEELRRRLTE、SRLEEELRRRLTEP，以及PSRLEEELRRRLTEP所組成之群組的序列。
在一些實施例中，ALFA標籤包含以下環化胺基酸序列 -AA0-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-AA10-AA11-AA12-AA13-AA14-， 其中AA0、AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7、AA8、AA9、AA10、AA11、AA12，AA13以及AA14的胺基酸中的任兩者(X1、X2)的側鏈共價連接；且 其中並非X1與X2的AA0、AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6、AA7、AA8、AA9、AA10、AA11、AA12，AA13以及AA14的胺基酸： AA0為Pro或缺失； AA1為Ser、Gly、Thr或Pro； AA2為Arg、Gly、Ala、Glu或Pro； AA3為Leu、Ile或Val； AA4為Glu或Gln； AA5為Glu或Gln； AA6為Glu或Gln； AA7為Leu、Ile或Val； AA8為Arg、Ala、Gln或Glu； AA9為Arg、Ala、Gln或Glu； AA10為Arg； AA11為Leu； AA12為Thr、Ser、Asp、Glu、Pro、Ala或缺失； AA13為Glu、Lys、Pro、Ser、Ala、Asp或缺失；且 AA14為Pro或缺失。
在一些實施例中，X1和X2被2個或3個胺基酸隔開。
在一些實施例中，AA5為X1且AA9為X2，AA5為X1且AA8為X2，AA9為X1且AA13為X2，AA6為X1且AA9為X2，AA9為X1且AA12為X2，AA10為X1且AA13為X2、AA6為X1且AA10為X2，或AA4為X1且AA8為X2。
在一些實施例中，ALFA標籤包含選自由以下所組成之群組的環化胺基酸序列 a.    -AA0-AA1-AA2-AA3-AA4-環(X1-AA6-AA7-AA8-X2)-Arg-Leu-AA12-AA13-AA14-、 b.   -AA0-AA1-AA2-AA3-AA4-環(X1-AA6-AA7-X2)-AA9-Arg-Leu-AA12-AA13-AA14-、 c.    -AA0-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-環(X1-Arg-Leu-AA12-X2)-AA14-、 d.   -AA0-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-環(X1-AA7-AA8-X2)-Arg-Leu-AA12-AA13-AA14-、 e.    -AA0-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-環(X1-Arg-Leu-X2)-AA13-AA14-、 f.    -AA0-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-AA9-環(X1-Leu-AA12-X2)-AA14-、 g.    -AA0-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-環(X1-AA7-AA8-AA9-X2)-Leu-AA12-AA13-AA14-，以及 h.   -AA0-AA1-AA2-AA3-環(X1-AA5-AA6-AA7-X2)-AA9-Arg-Leu-AA12-AA13-AA14-， 其中X 1與X 2胺基酸殘基的側鏈共價連接； AA0為Pro或缺失； AA1為Ser、Gly、Thr或Pro； AA2為Arg、Gly、Ala、Glu或Pro； AA3為Leu、Ile或Val； AA4為Glu或Gln； AA5為Glu或Gln； AA6為Glu或Gln； AA7為Leu、Ile或Val； AA8為Arg、Ala、Gln或Glu； AA9為Arg、Ala、Gln或Glu； AA12為Thr、Ser、Asp、Glu、Pro、Ala或缺失； AA13為Glu、Lys、Pro、Ser、Ala、Asp或缺失；且 AA14為Pro或缺失。
在一些實施例中，本文所揭示的肽中的X 1和X 2經由醯胺、雙硫鍵、硫醚、醚、酯、硫酯、硫代醯胺、伸烷基、伸烯基、伸炔基及/或1,2,3-三唑共價連接。
在一些實施例中，本文所述的環化胺基酸序列是藉由X 1和X 2中之一者的側鏈的胺基經由醯胺鍵連接至X 1和X 2中之另一者的側鏈的羧基而生成。具有側接胺基的胺基酸(例如離胺酸或離胺酸衍生物)的側鏈的胺基，以及酸性胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸或其衍生物)的側鏈的羧基可經由醯胺鍵用於生成環化胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所述的環化胺基酸序列是藉由將X 1和X 2中之一者的側鏈的巰基經由雙硫鍵連接至X 1和X 2中之另一者的側鏈的巰基而生成。含巰基胺基酸包括半胱胺酸和其他含巰基胺基酸。
在一些實施例中，X 1和X 2獨立地選自由Glu、DGlu、Asp、DAsp、Lys、DLys、hLys、DhLys、Orn、DOrn、Dab、DDab、Dap、DDap、Cys、DCys、hCys、DhCys、Pen，以及DPen所組成之群組，條件是當X 1為Glu、DGlu、Asp，或 DAsp時，X 2為Lys、DLys、hLys、DhLys、Orn、DOrn、Dab、DDab、Dap，或Ddap；當X1為Lys、DLys、hLys、DhLys、Orn、DOrn、Dab、DDab、Dap，或Ddap時，X2為Glu、DGlu、Asp，或DAsp；當X1為Cys、DCys、hCys、DhCys、Pen，或DPen時，X2為Cys、DCys、hCys、DhCys、Pen，或DPen。
在一些實施例中，X 1為Glu且X 2為Lys。在一些實施例中，-環(Glu--------Lys)-、-c(Glu--------Lys)-、-環(E-------- K)-、-c(E---------K)-、-E---------K-環或-環E----環K-包含以下結構： 。
在一些實施例中，X 1為Lys且X 2為Glu。在一些實施例中，-環(Lys------Glu)-、-c(Lys------Glu)-、-環(K------E)-、-c(K-------E)-、-K-----E-環或環K------環E-包含以下結構： 。
在一些實施例中，X 1為Cys且X 2為Cys。在一些實施例中，-環(Cys------Cys)-、c(Cys------Cys)-、-環(C-----C)-、-c(C--------C)-、-C----C環或-環C-----環C-包含以下結構： 。
經上文確認之上位化的具體環化胺基酸序列包括例如， -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Thr-Glu)-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Arg-Cys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Thr-Asp)-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DGlu-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Arg-Glu)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-環(Glu-Glu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-DCys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-Thr-Cys)-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Arg-Cys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-Cys)-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Cys-Leu-Arg-Arg-Cys)-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-Thr-Cys)-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Arg-Cys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Cys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-Cys)-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Cys-Leu-Arg-Arg-Cys)-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DGlu-Glu-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-Arg-Glu)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Arg-DGlu)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-Arg-DGlu)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DGlu-Glu-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-Arg-Glu)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Arg-DGlu)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-Arg-DGlu)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-Arg-Asp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DAsp-Glu-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DAsp-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Arg-DAsp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-Arg-DAsp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-Arg-Asp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DAsp-Glu-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DAsp-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Arg-DAsp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-Arg-DAsp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DGlu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-DLys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DGlu-Glu-Leu-DLys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Glu)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-DGlu)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-DGlu)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-DLys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Asp)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-DAsp)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DAsp-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DAsp-Glu-Leu-DLys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-DAsp)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-Asp)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-DLys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DGlu-Glu-Leu-DLys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu- -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Glu)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-DGlu)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-DGlu)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-DLys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Asp)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-DAsp)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DAsp-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DAsp-Glu-Leu-DLys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-DAsp)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DLys-Glu-Leu-Asp)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Asp-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Lys-Leu-Arg-Asp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(DAsp-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Lys-Leu-Arg-DAsp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Asp-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(DLys-Leu-Arg-Asp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(DLys-Leu-Arg-DAsp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(DAsp-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Asp-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Lys-Leu-Arg-Asp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(DAsp-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Lys-Leu-Arg-DAsp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Asp-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(DLys-Leu-Arg-Asp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(DLys-Leu-Arg-DAsp)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(DAsp-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Cys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-Cys)-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-Cys)-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Cys-Leu-Arg-Cys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Cys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-Cys)-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-Cys)-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Cys-Leu-Arg-Cys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DCys-Glu-Leu-DCys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(DCys-Glu-Leu-Cys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 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-Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DhCys-Glu-Leu-DhCys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-DhCys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DCys-Glu-Leu-DhCys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DhCys-Glu-Leu-Cys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DhCys-Glu-Leu-DCys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-DCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DCys-Leu-Thr-Cys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DCys-Leu-Thr-DCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(hCys-Leu-Thr-Cys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(hCys-Leu-Thr-DCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(hCys-Leu-Thr-hCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-hCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DCys-Leu-Thr-hCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-hCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DhCys-Leu-Thr-Cys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DhCys-Leu-Thr-DCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DhCys-Leu-Thr-hCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-DhCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DCys-Leu-Thr-DhCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-DhCys)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Pen-Leu-Thr-Pen)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Pen-Leu-Thr-DPen)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DPen-Leu-Thr-Pen)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DPen-Leu-Thr-DPen)-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(DCys-Arg-Leu-Cys)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(DCys-Arg-Leu-DCys)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-DCys)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(hCys-Arg-Leu-Cys)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(hCys-Arg-Leu-DCys)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-hCys)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(hCys-Arg-Leu-hCys)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(hCys-Arg-Leu-DhCys)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(DhCys-Arg-Leu-hCys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-DCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DCys-Leu-Thr-Cys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DCys-Leu-Thr-DCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(hCys-Leu-Thr-Cys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(hCys-Leu-Thr-DCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(hCys-Leu-Thr-hCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-hCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DCys-Leu-Thr-hCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-hCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DhCys-Leu-Thr-Cys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DhCys-Leu-Thr-DCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DhCys-Leu-Thr-hCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-DhCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DCys-Leu-Thr-DhCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-DhCys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Pen-Leu-Thr-Pen)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Pen-Leu-Thr-DPen)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DPen-Leu-Thr-Pen)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(DPen-Leu-Thr-DPen)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(DCys-Arg-Leu-Cys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(DCys-Arg-Leu-DCys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-DCys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(hCys-Arg-Leu-Cys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(hCys-Arg-Leu-DCys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-hCys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(hCys-Arg-Leu-hCys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(hCys-Arg-Leu-DhCys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(DhCys-Arg-Leu-hCys)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Asp)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Asp-Arg-Leu-Lys)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Glu)-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Glu-Arg-Leu-Lys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Asp)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Asp-Arg-Leu-Lys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Glu)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Glu-Arg-Leu-Lys)-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-Thr-Cys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Arg-Cys)-Arg-Leu-Thr-Glu-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-Cys)-Pro-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Cys-Leu-Arg-Arg-Cys)-Leu-Thr-Glu-Pro-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Arg-Glu)-Arg-Leu-Thr-Glu-，以及 -Ser-Arg-Leu-環(Glu-Glu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-。
在一些實施例中，環肽透過環肽中最左側胺基酸的α-胺部分附接至3-巰基丙醯基部分。在一些實施例中，環肽中最右側的胺基酸包含醯胺。
在一些實施例中，環化胺基酸序列是選自由以下所組成之群組中的一者： -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Thr-Glu)-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Arg-Cys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Thr-Asp)-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu- -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(DGlu-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu- -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-DLys)-Arg-Leu-Thr-Glu- -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Arg-Glu)-Arg-Leu-Thr-Glu- -Pro-Ser-Arg-Leu-環(Glu-Glu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-DCys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-Thr-Cys)-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Arg-Cys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-Cys)-、 -Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Cys-Leu-Arg-Arg-Cys)-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Cys-Arg-Leu-Thr-Cys)-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Arg-Cys)-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Cys-Glu-Leu-Cys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-環(Cys-Leu-Thr-Cys)-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-環(Cys-Leu-Arg-Arg-Cys)-Leu-Thr-Glu-、 -Ser-Arg-Leu-Glu-環(Lys-Glu-Leu-Arg-Glu)-Arg-Leu-Thr-Glu-，以及 -Ser-Arg-Leu-環(Glu-Glu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-。
在一些實施例中，環化胺基酸序列為-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-。在一些其他實施例中，環化胺基酸序列為-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu-。在又一些其他實施例中，環化胺基酸序列為-Ser-Arg-Leu-Glu-環(Glu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-。在又一些其他實施例中，環化胺基酸序列為-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Thr-Glu)-。
環肽可能具有形成環結構的不同環狀橋接部分。較佳地，環結構中納入化學穩定的橋接部分，諸如例如醯胺基、內酯基、醚基、硫醚基、二硫基、伸烷基，烯基或1,2,3-三唑。以下是說明肽中橋接部分可變性的實例： 。
在一些實施例中，ALFA標籤結合部分包含抗體或抗體片段，例如駱駝科動物VHH結構域。在一些實施例中，ALFA標籤結合部分包含單域抗體(sdAb) (NbALFA奈米抗體)。
在一些實施例中，ALFA標籤結合部分包含單域抗體，例如包含CDR1序列VTX 1SALNAMAMG (其中X 1為I或V)、CDR2序列AVSX 2RGNAM (其中X 2為E、H、N，D或S)，以及CDR3序列LEDRVDSFHDY的駱駝科動物VHH結構域。
在一些實施例中，ALFA標籤結合部分包含單域抗體，例如包含CDR1序列GVTX 1SALNAMAMG (其中X 1為I或V)、CDR2序列AVSX 2RGNAM (其中X 2為E、H、N，D或S)，以及CDR3序列LEDRVDSFHDY的駱駝科動物VHH結構域。
在一些實施例中，ALFA標籤結合部分包含單域抗體，例如包含CDR1序列VTISALNAMAM、CDR2序列AVSERGNAM，以及CDR3序列LEDRVDSFHDY的駱駝科動物VHH結構域。
在一些實施例中，ALFA標籤結合部分包含單域抗體，例如包含CDR1序列GVTISALNAMAMG、CDR2序列AVSERGNAM，以及CDR3序列LEDRVDSFHDY的駱駝科動物VHH結構域。
在一些實施例中，ALFA標籤結合部分包含單域抗體，例如包含以下的駱駝科動物VHH結構域：胺基酸序列EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS、與該胺基酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%同一性的胺基酸序列，或該胺基酸序列或與該胺基酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%同一性的胺基酸序列的片段。在一些實施例中，胺基酸序列包含如上所述的CDR1、CDR2以及CDR3序列。
在一些實施例中，表位標籤/結合劑系統包含有包含序列PDRVRAVSHWSS (Spot-標籤)的表位標籤，且結合劑包含有特異性地結合至Spot-標籤的單域抗體(sdAb或奈米抗體) (Spot奈米抗體(14.7kD))。
在一些實施例中，在標籤接合物上的部分和彼此交互作用的對接化合物上的部分結合後，形成共價連接。在這些實施例中，本文所用的系統可能包括形成共價鍵的Tag/Catcher系統，例如形成異肽鍵的SpyTag/SpyCatcher。
SpyTag/SpyCatcher系統是一種用於重組蛋白不可逆結合的技術。肽SpyTag自發地與蛋白質SpyCatcher反應，在兩者之間形成分子間異肽鍵。使用Tag/Catcher對，可以在兩個重組蛋白之間達到生物結合。
在一些實施例中，標籤接合物上與對接化合物上的交互作用部分包含地高辛(Digoxigenin)與結合至地高辛的抗體、抗體片段或衍生物，例如scFv或任何蛋白質。
在一些實施例中，標籤接合物上與對接化合物上的交互作用部分包含咖啡因與結合至咖啡因的抗體、抗體片段或衍生物，例如奈米抗體。
在一些實施例中，標籤接合物上與對接化合物上的交互作用部分包含GFP與結合至GFP的抗體、抗體片段或衍生物，例如奈米抗體。
在一些實施例中，標籤接合物上與對接化合物上的交互作用部分包含生物素與結合至生物素的抗體、抗體片段或衍生物。
在一個態樣中，本發明提供一種複合物，其中標籤接合物結合至對接化合物。因此，標籤接合物和對接化合物包含彼此交互作用的部分。
因此，本發明在一個態樣中提供一種複合物，其包含： (i)   包含結合至目標抗原的結合部分以及針對標籤之結合部分的化合物(對接化合物)，以及 (ii)  包含負載部分和至少兩個針對標籤之結合部分結合的標籤的化合物(標籤接合物)。
本文說明複合的標籤接合物和對接化合物的不同實施例。
在一些實施例中，標籤接合物包含至少兩個ALFA標籤。在一些實施例中，至少兩個ALFA標籤可能相同或不同。在一些實施例中，標籤接合物包含至少兩個相同的ALFA標籤。在這些實施例中，結合至標籤接合物的對接化合物的部分可能是NbALFA奈米抗體(NbALFA)。在一些實施例中，對接化合物包含至少兩個結合至標籤接合物的標籤的部分，例如至少兩個NbALFA奈米抗體(NbALFA)。在一些實施例中，對接化合物可能具有選自由NbALFA x 抗主要目標DARPin、NbALFA x 抗主要目標VHH和NbALFA x 抗主要目標scFv所組成之群組的結構。在一些實施例中，對接化合物包含全長抗主要目標抗體，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈，其中NbALFA連接至重鏈中的各者的C端。 負載
在一些實施例中，負載包含治療性部分或診斷性部分。
負載可以是例如可偵測的標記。如本文所用，「可偵測標記」是有關例如存在於細胞、組織或生物體中時允許其偵測的化合物。在本發明的上下文中設想可偵測標記的一種類型是對比提供劑(contrast providing agent)。在本發明的上下文中設想不同類型的可偵測標記並且描述於下文中。
因此，根據本發明的一些實施例，本發明的藥劑和方法用於顯影，尤其是醫學顯影。為了識別主要目標，可以使用包含一或多個可偵測標記的顯影探針作為負載。顯影探針的可偵測標記的具體實例是傳統顯影系統中使用的對比提供部分，諸如MRI可顯影結構、自旋標記、光學標記、超音波反應結構、X射線反應部分、放射性核種、(生物)發光和FRET型染料。在本發明上下文中所設性的例示性可偵測標記包括但不限於螢光分子(例如自發螢光分子、在與試劑接觸時發出螢光的分子等)、放射性標記；生物素，例如透過抗生物素蛋白與生物素的結合來偵測；螢光標籤、包含順磁性金屬的MRI顯影結構、顯影試劑以及類似物。用於顯影的放射性核種可以是例如選自由以下所組成之群組的同位素： 3H、 11C、 13N、 15O、 18F、 19F、 51Cr、 52Fe、 52Mn、 55Co、 60Cu、 61Cu、 62Zn、 62Cu、 63Zn、 64Cu、 66Ga、 67Ga、 68Ga、 70As、 71As、 72As、 74As、 75Se、 75Br、 76Br、 77Br、 80Br、 82Br、 82Rb、 86Y、 88Y、 89Sr、 89Zr、 97Ru、 99Tc、 110In、 111In、 113In、 114In、 117Sn、 120I、 122Xe、 123I、 124I、 125I、 166Ho、 167Tm、 169Yb、 193Pt、 195Pt、 201Tl，以及 203Pb。其他元素和同位素(諸如用於治療的元素和同位素)也可能在某些應用中用於顯影。
MRI可顯影部分可能是順磁性離子或超順磁性顆粒。順磁性離子可以是選自由以下所組成之群組的元素：Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl。
X射線反應部分包括但不限於碘、鋇和硫酸鋇。
再者，本發明上下文中所設想的可偵測標記還包括可以透過抗體結合(例如透過可偵測標記抗體的結合)被偵測到的肽或多肽。在一些實施例中，可偵測標記是小尺寸有機PET和SPECT標記，例如 18F、 11C或 123I。
本文所描述的許多放射性標記較佳地作為螯合物提供。螯合基團是本領域具有通常知識者周知的。在某些實施例中，螯合基團衍生自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、環己基1,2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-O,O'-雙(2-胺基乙基)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、N,N-雙(羥基芐基)-乙二胺-N,N′-二乙酸(HBED)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N'',N'''-四乙酸(DOTA)、羥基乙基二胺三乙酸(HEDTA)、1,4,8,11-四氮雜環十四烷-N,N',N'',N'''-四乙酸(TETA)、經取代的DTPA、經取代的EDTA以及類似物。在一些實施例中，螯合基團選自由DOTA、DOTAM、NOTA、NOTP、PCTA、DATA、TRAP、DFO、THP、HBED及DEDPA所組成之群組。
螯合劑1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N,N',N'''-四乙酸(DOTA)因其能夠螯合許多在診斷上和治療上重要的金屬(諸如放射性核種和放射性標記)而受到特別關注。
包含可偵測放射性標記的負載可以被稱為放射診斷性負載。
本文使用的尤佳負載包含用於 68Ga複合的DOTA螯合劑。
在一些實施例中，負載包括DOTA- 68Ga。
負載還可以是治療劑，諸如醫藥活性劑。醫藥活性劑的實例是具有通常知識者已知的並且提供於本文中。治療劑也可以視情況包含可偵測標記。在一些實施例中，如本文所述的可偵測標記(例如放射性標記)用於治療目的。
因此，根據一些實施例，本文所述的藥劑和方法用於靶向治療。這是透過使用包含一或多種醫藥活性劑(例如藥物或用於放射治療的放射性同位素)的負載來達到的。
術語「醫藥活性劑」是有關當投予給個體時在治療上有效的任何藥劑(諸如化合物或細胞)。術語「醫藥活性劑」進一步是有關在包含投予該藥劑的治療干預中改變(較佳地治癒、減輕或部分阻止)給定疾病及其併發症的臨床表現的任何藥劑。
在一些實施例中，醫藥活性劑包含醫藥活性RNA或醫藥活性肽或蛋白質。
「醫藥活性RNA」是編碼醫藥活性肽或蛋白質或其本身具有醫藥活性的RNA，例如其具有一或多種醫藥活性，諸如醫藥活性蛋白質所述者。例如，RNA可能是RNA干擾(RNAi)的一或多條鏈。此類藥劑包括靶向目標轉錄本(例如個體的內源疾病相關轉錄本的轉錄本)的短干擾RNA (siRNA)、或短髮夾RNA (shRNA)，或siRNA或微RNA樣RNA的前驅物。
當以治療有效量投予給個體時，「醫藥活性肽或蛋白質」對個體的病況或疾病狀態有正向或有利的作用。較佳地，醫藥活性肽或蛋白質具有治癒或姑息性質並且可能被投予以改善、舒緩、緩解、逆轉、延遲疾病或病症的一或多種症狀發作或減輕疾病或病症的一或多種症狀的嚴重程度。醫藥活性肽或蛋白質可能具有預防性質並且可以用於延遲疾病發作或減輕此類疾病或病理狀況的嚴重程度。術語「醫藥活性肽或蛋白質」包括完整蛋白質或多肽，並且還可以指其醫藥活性片段。它還可以包括肽或蛋白質的醫藥活性類似物。術語「醫藥活性肽或蛋白質」包括作為抗原的肽和蛋白質，即向個體投予肽或蛋白質在個體中引發免疫反應，該免疫反應可能是治療性的或部分或完全保護性的。
醫藥活性蛋白的實例包括但不限於細胞激素和免疫系統蛋白，諸如免疫活性化合物(例如介白素、群落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子、紅血球生成素、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素、整合素、位址素(addressin)、選滯蛋白(seletin)、歸巢(homing)受體、T細胞受體、免疫球蛋白、可溶性主要組織相容性複合體抗原、免疫活性抗原(諸如細菌、寄生蟲或病毒抗原、過敏原、自體抗原、抗體)、激素(胰島素、甲狀腺激素、兒茶酚胺、促性腺素、生長激素、催乳素、催產素、多巴胺、牛生長激素、瘦素以及類似物)、生長激素(例如人類生長激素)、生長因子(例如表皮生長因子、神經生長因子、類胰島素生長因子以及類似物)、生長因子受體、酶(組織血漿蛋白原活化因子、鏈球菌激酶、膽固醇生物合成或降解酶、類固醇生成酶、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、去氫酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、細胞色素、腺苷酸或鳥苷酸環化酶、神經醯胺酶以及類似物)、受體(類固醇激素受體、肽受體)、結合蛋白(生長激素或生長因子結合蛋白以及類似物)、轉錄和轉譯因子、腫瘤生長抑制蛋白(如抑制血管生成的蛋白質)、結構蛋白(諸如膠原蛋白、絲纖維蛋白、纖維蛋白原、彈性蛋白、微管蛋白、肌動蛋白和肌球蛋白)、血液蛋白(凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、胰島素、因子IX、因子X、組織血漿蛋白原活化因子、蛋白C、馮維勒布蘭德因子(von Wilebrand factor)、抗凝血酶III、葡萄糖腦苷酶、紅血球生成素顆粒球群落刺激因子(GCSF)或經修飾的因子VIII，抗凝血劑以及類似物。
在一些實施例中，醫藥活性蛋白是涉入調節淋巴恆定的細胞激素，較佳地為涉入並較佳誘導或增強T細胞發育、引發、擴增、分化及/或存活的細胞激素。在一些實施例中，細胞激素是介白素。在一些實施例中，根據本發明的醫藥活性蛋白是選自由IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21所組成之群組的介白素。
在一些實施例中，負載包含可用於放射治療及/或化學治療的化合物。在一些實施例中，負載包含化療化合物。
化學治療是一類使用一或多種抗癌藥物(化療劑)的癌症治療方法，通常是作為標準化化學治療方案的一部分。術語化學治療意味著非特異性使用細胞內毒物來抑制有絲分裂。此意義排除阻斷細胞外訊號(訊號轉導)的更多選擇性藥劑。開發具有特定分子目標或遺傳目標的療法(其抑制經典內分泌激素(主要是乳癌的雌激素和攝護腺癌的雄激素)的生長促進訊號)現在被稱為激素療法。相比之下，生長訊號(像是與受體酪胺酸激酶相關者)的抑制作用被稱為靶向治療。
傳統化療劑是透過干擾細胞分裂(有絲分裂)而具有細胞毒性，但癌細胞對這些藥劑的易感性差異很大。在很大程度上，化療可以被認為是一種損害或壓迫細胞的方法，如果細胞凋亡開始，可能導致細胞死亡。
化療劑包括烷化劑、抗代謝物、抗微管劑、拓樸異構酶抑制劑和細胞毒性抗生素。
烷化劑能夠烷基化許多分子，包括蛋白質、RNA和DNA。烷化劑的亞型有氮芥類(nitrogen mustards)、亞硝基脲類(nitrosoureas)、四嗪類(tetrazines)、吖丙烷類(aziridines)、順鉑類(cisplatins)及其衍生物，與非典型烷化劑。氮芥包括甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、美法崙(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、異環磷醯胺(ifosfamide)和白消安(busulfan)。亞硝基脲包括N-亞硝基-N-甲基脲(MNU)、卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)和司莫司汀(semustine，MeCCNU)、福莫司汀(fotemustine)和鏈脲佐菌素(streptozotocin)。四嗪包括達卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)和替莫唑胺(temozolomide)。吖丙烷(Aziridine)類包括塞替派(thiotepa)、絲裂黴素(mytomycin)和二嗪醌(diaziquone，AZQ)。順鉑及其衍生物包括順鉑、卡鉑(carboplatin)和奧沙利鉑(oxaliplatin)。它們透過與生物學重要分子中的胺基、羧基、巰基和磷酸根形成共價鍵來損害細胞功能。非典型烷化劑包括丙卡巴肼和六甲基三聚氰胺。在一個尤佳的實施例中，烷化劑是環磷醯胺。
抗代謝物是一群阻礙DNA和RNA合成的分子。其中許多與DNA和RNA的結構單元具有相似的結構。抗代謝物類似核鹼基或核苷，但其化學基團有所改變。這些藥物透過阻斷DNA合成所需的酶或併入DNA或RNA來發揮作用。抗代謝藥物的亞型是抗葉酸劑類(anti-folates)、氟嘧啶類(fluoropyrimidines)、去氧核苷類似物和硫嘌呤類。抗葉酸劑包括甲胺蝶呤(methotrexate)和培美曲塞(pemetrexed)。氟嘧啶類包括氟尿嘧啶(fluorouracil)和卡培他濱(capecitabine)。去氧核苷類似物包括阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、地西他濱(decitabine)、阿札胞苷(azacitidine)、氟達拉濱(fludarabine)、奈拉濱(nelarabine)、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)和噴司他丁(pentostatin)。硫嘌呤類包括硫鳥嘌呤(thioguanine)和巰基嘌呤(mercaptopurine)。
抗微管劑透過阻止微管功能來阻斷細胞分裂。長春花生物鹼類可防止微管形成，而紫杉烷類則防止微管解體。長春花生物鹼類包括長春瑞濱(vinorelbine)、長春地辛(vindesine)和長春氟寧(vinflunine)。紫杉烷類包括多西紫杉醇(docetaxel) (Taxotere)和紫杉醇(paclitaxel) (Taxol)。
拓樸異構酶抑制劑是影響兩種酶活性的藥物：拓樸異構酶I和拓樸異構酶II，且包括但不限於伊立替康(irinotecan)、拓樸替康(topotecan)、喜樹鹼(camptothecin)、依托泊苷(etoposide)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、替尼泊苷(teniposide)、新生黴素(novobiocin)、美巴隆(merbarone)和阿克拉比星(aclarubicin)。
細胞毒性抗生素是一群具有不同作用機制的藥物。它們在化療適應症中的共同主題是它們會中斷細胞分裂。最為重要的亞群是蒽環類(anthracyclines) (例如阿黴素(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、吡柔比星(pirarubicin)和阿克拉比星(aclarubicin))和博來黴素(bleomycin)；其他著名的實例包括絲裂黴素C (mitomycin C)、米托蒽醌和放線菌素(actinomycin)。
在一些實施例中，本文可用的負載包含放射性診斷劑，例如包含放射診斷性同位素的螯合劑。
在一些實施例中，本文可用的負載包含免疫調節劑，例如干擾素基因刺激因子(STING)促效劑或TLR (例如TLR7/8促效劑)。在一些實施例中，負載包含STING促效劑。
STING在免疫和非免疫來源的多種組織類型中廣泛表現，並且在免疫和非免疫細胞中是第1型干擾素反應所必需的。STING已被證明可以直接結合至多種不同的環二核苷酸。STING促效劑的顯著臨床前抗腫瘤活性導致了多種藥理學類別藥劑的開發，並處於轉化為臨床的不同階段。
在一些實施例中，本文可用的負載包含毒素。在一些實施例中，負載包含細胞毒性劑或細胞抑制劑。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害且特別是殺死細胞的任何藥劑。
可用的細胞毒劑類別包括例如抗微管蛋白劑、DNA小溝結合劑(例如烯二炔和來昔菌素(lexitropsin))、DNA複製抑制劑、烷化劑(例如鉑複合物，諸如順鉑、單(鉑)、雙(鉑))和三核鉑複合物和卡鉑)、蒽環、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物類、化療增敏劑、多卡黴素(duocarmycin)、依托泊苷、氟化嘧啶、離子載體(ionophore)、亞硝基脲、鉑醇(platinol)、預形成化合物、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素、放射增敏劑、類固醇、紫杉烷類(例如紫杉醇和多西紫杉醇)、拓樸異構酶抑制劑、長春花生物鹼或類似物。
單獨的細胞毒劑包括例如雄激素、安曲黴素(anthramycin，AMC)、天冬醯胺酸酶(asparaginase)、5-氮雜胞苷(5-azacytidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、博來黴素、白消安、丁硫胺酸亞磺醯亞胺(buthionine sulfoximine)、喜樹鹼、卡鉑、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、順鉑、秋水仙鹼、環磷醯胺、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytidine arabinoside)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、達卡巴嗪、放線菌素D (原放線菌素)、柔紅黴素、地卡巴嗪、多西紫杉醇、多柔比星、雌激素、5-氟去氧尿苷、5-氟尿嘧啶、短桿菌肽D (gramicidin D)、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、甲基二(氯乙基)胺、美法崙、6-巰基嘌呤、甲胺蝶呤、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡黴素(plicamycin)、丙卡巴肼、鏈脲佐菌素、替尼泊苷、6-硫鳥嘌呤、硫TEPA、拓樸替康、長春花鹼、長春花新鹼、長春瑞濱、VP-16以及VM-26。
抗微管蛋白劑的實例包括但不限於多拉司他汀(dolastatin) (例如奧瑞他汀(auristatin) E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)、類美登素(maytansinoid)、紫杉烷(例如紫杉醇、多西紫杉醇)、T67 (Tularik)、長春花生物鹼(如長春新鹼、長春花鹼、長春地辛和長春瑞濱)、漿果赤黴素衍生物(baccatin derivative)、紫杉烷類似物(例如埃坡黴素(epothilone) A和B)、諾考達唑(nocodazole)、秋水仙鹼和秋水仙胺(colcimid)、雌莫司汀(estramustine)、念球藻素(cryptophysin)、西馬多丁(cemadotin)、考布他汀(combretastatin)、圓皮海绵内酯(discodermolide)和軟珊瑚素(eleutherobin)。
在特定實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑是奧瑞他汀E (本領域也稱為多拉司他汀-10)或其衍生物。通常，奧瑞他汀E衍生物是例如奧瑞他汀E和酮酸之間形成的酯。例如，奧瑞他汀E可以分別與對乙醯基苯甲酸或苯甲醯戊酸反應產生AEB和AEVB。其他典型的奧瑞他汀衍生物包括AFP、MMAF和MMAE。
在某些實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑是類美登素，另一群抗微管蛋白劑。例如，在特定實施例中，類美登素是美登素、DM-1或DM-4。
類美登素是有效的微管靶向化合物，其在有絲分裂時抑制細胞的增生。類美登素是美登素的衍生物，美登素為一種附接到氯化苯環的19員環柄巨環內酯(ansa macrolide)結構。美登素具有下式： 。
類美登素是本領域熟知的並且可以透過已知技術合成或從天然來源分離而來。尤佳的類美登素是美登素的含硫醇衍生物，諸如DM1和DM4。美登素的這類含硫醇衍生物包括其中與羰基結合的甲基被含有游離巰基的基團(諸如基團-R-SH)替換的化合物，其中R表示伸烷基或其它含碳原子基團。
DM1，也稱為美登素(mertansine)，是一種具有下式的類美登素： 。
特別地，術語「美登素」或「DM1」是指化合物 N 2'-去乙醯基- N 2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素。
「DM4」指化合物 N 2'-去乙醯基- N 2'-(4-甲基-4-巰基-1-側氧基戊基)-美登素。
在一些實施例中，負載包含選自由多拉司他汀或多拉司他汀肽類似物與衍生物奧瑞他汀所組成之群組的化合物。奧瑞他汀是多拉司他汀10的合成類似物，多拉司他汀10是衍生自海洋軟體動物龍骨海鹿( Dolabelaauricularia)的天然產物。與類美登素一樣，奧瑞他汀也是微管破壞劑。
例示性的奧瑞他汀實施例包括單甲基奧瑞他汀藥物部分，諸如MMAE和MMAF。
MMAE，也稱為單甲基奧瑞他汀E，具有下式： 。
具體地，術語「MMAE」是指化合物(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺。MMAE實際上是去甲基奧瑞他汀E，即N端胺基只有一個甲基取代基，而不是像奧瑞他汀E本身那樣有兩個甲基取代基。
MMAF，又稱單甲基奧瑞他汀F，是指化合物(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺基)丁醯胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺基)-3-苯基丙酸。
在一些實施例中，負載部分包含下式的伊沙替康(exatecan)部分： 其中 表示鍵，藉其伊沙替康部分視情況經由連接部分可附接至不同分子(諸如標籤接合物)，該連接部分可能包含切割位點，諸如 一個酶促切割位點。本文說明此類切割位點的實例。
在一些實施例中，負載部分包含德魯替康(deruxtecan)部分。在一些實施例中，負載部分包含德魯替康。
德魯替康具有下式： 。
在一些實施例中，德魯替康部分包含下式： 其中表示 代表鍵，藉其德魯替康部分視情況經由連接部分可附接至不同分子(諸如標籤接合物)。
在一些實施例中，連接部分包含由下列偶聯對之一者的反應所產生的官能基：馬來醯亞胺/硫醇；疊氮化物/炔烴；硫醇/溴乙醯胺；羧酸酯/胺。視情況，連接部分還可能包含伸烷基部分。
在一些實施例中，德魯替康部分包含下式： 其中R 1選自由*-伸烷基-R 2所組成之群組，其中*表示與德魯替康部分的其餘部分的附接點；伸烷基視情況經1、2或3個R 11取代，其中各R 11獨立地選自由OH、鹵素、C 1-6烷基和=O所組成之群組；R 2是由偶聯對之一者的反應所產生的二價官能基。
在一些實施例中，伸烷基部分是C 1-12伸烷基部分，諸如C 2-6伸烷基部分，其中伸烷基部分視情況經1、2或3個R 11取代，其中各R 11獨立地選擇選自由OH、鹵素、C 1-6烷基和=O所組成之群組。
在一些實施例中，R 2包含以下二價基團之一者： -NHC(O)-    -C(O)NH-   -SCH 2C(O)- 其中各 或-表示鍵。
在一些實施例中，要被傳送至目標細胞的負載由目標細胞攝取。在一些實施例中，負載在目標細胞處從標籤接合物釋放，例如透過細胞外切割。在一些實施例中，標籤接合物是可切割的。在一些實施例中，標籤接合物在細胞內環境中是可切割的。在一些實施例中，標籤接合物在細胞外環境中是可切割的。在一些實施例中，切割導致負載部分從標籤接合物釋放。在一些實施例中，標籤接合物包含用於將負載部分從標籤接合物切割的酶促切割位點，例如組織蛋白酶B連接子、MMP連接子、豆莢蛋白(legumain)連接子、葡萄糖苷酶連接子或酯鍵。 標籤接合物及對接化合物的實施例
在一些實施例中，標籤接合物的標籤為ALFA標籤。
在一些實施例中，標籤接合物包含兩個ALFA標籤。在一些實施例中，ALFA標籤是相同的。在這些實施例中，對接化合物上的標籤接合物結合部分包含ALFA特異性單域抗體(sdAb) (NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，對接化合物包含一個針對標籤之結合部分，例如一個NbALFA-奈米抗體。在一些實施例中，標籤接合物包含兩個(較佳地相同的)標籤(例如ALFA標籤)，而對接化合物包含一個針對標籤之結合部分(例如NbALFA-奈米抗體)。在這些實施例中，兩個不同對接化合物的針對標籤之結合部分(例如NbALFA-奈米抗體)可能結合至標籤接合物的標籤之一(例如ALFA標籤)。在一些實施例中，對接化合物可能是單價結合至標籤(例如ALFA標籤)，並且視情況單價結合至目標抗原。在這些實施例中，負載較佳地包含螯合劑，該螯合劑包含放射診斷性同位素(例如DOTA- 68Ga)。在這些實施例中，負載較佳地包含放射性診斷劑。
在一些實施例中，對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。在一些實施例中，標籤接合物包含兩個(較佳地相同的)標籤(例如ALFA標籤)，而對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。在這些實施例中，對接化合物的各個針對標籤之結合部分(例如各個NbALFA-奈米抗體)可能結合至標籤接合物的標籤之一(例如ALFA標籤)。在一些實施例中，對接化合物可能是二價結合至標籤(例如ALFA標籤)，並視情況二價結合至目標抗原。在這些實施例中，負載較佳地包含毒素或免疫調節劑。
在其中對接化合物二價結合至ALFA並二價結合至目標抗原的實施例中，對接化合物包含結合至主要目標的全長抗體，其中全長抗體重鏈的各者C端連接至NbALFA-奈米抗體。因此，對接化合物可能包含結構IgG x NbALFA。或者，對接化合物包含抗體(例如IgG或IgA抗體)的Fc結構域，其中各N端連接至結合至主要目標的結合部分(例如單域抗體，諸如VHH)，而各C端連接至NbALFA-奈米抗體。因此，對接化合物可能包含結構VHH-Fc x NbALFA。
在一些實施例中，本文使用的ALFA標籤包含選自由以下所組成之群組的環化胺基酸序列：Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Thr-Glu)、Ser-Arg-Leu-Glu-環(Asp-Glu-Leu-Arg-Lys)-Arg-Leu-Thr-Glu，以及Pro-Ser-Arg-Leu-環(Glu-Glu-Glu-Leu-Lys)-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu。本文使用的尤佳ALFA標籤包含環化胺基酸序列Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-環(Lys-Arg-Leu-Thr-Glu)。
在一些實施例中，標籤接合物包含至少一個pAEEA結構。
在一些實施例中，負載包含毒素而標籤包含高親和力標籤(諸如高親和力ALFA標籤)。在一些實施例中，負載包含毒素，標籤包含高親和力標籤(諸如高親和力ALFA標籤)，而對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA奈米抗體)。在一些實施例中，負載包含毒素，標籤包含選自由以下所組成之群組的ALFA標籤： -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2、 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-(環8)Lys-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2、 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-(環13)Glu-NH2、 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2，以及 -     Ac-Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-(環6)Glu-Glu-Leu-Arg-(環10)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2， 而對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。在這些實施例的一些中，標籤接合物包含兩個標籤。在這些實施例的一些中，「Ac」及/或「NH2」部分可能不存在。
在這些實施例中，可能將標籤接合物和對接化合物的預形成複合物投予給個體。
在一些實施例中，負載包含免疫調節劑而標籤包含高親和力標籤(諸如高親和力ALFA標籤)。在一些實施例中，負載包含免疫調節劑，標籤包含高親和力標籤(諸如高親和力ALFA標籤)，而對接化合物包含兩個標籤的結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。在一些實施例中，負載包含免疫調節劑，標籤包含選自由以下所組成之群組的ALFA標籤： -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2、 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-(環8)Lys-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2、 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-(環13)Glu-NH2、 -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2，以及 -     Ac-Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-(環6)Glu-Glu-Leu-Arg-(環10)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2， 而對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。在這些實施例的一些中，標籤接合物包含兩個標籤。在這些實施例的一些中，「Ac」及/或「NH2」部分可能不存在。
在這些實施例中，可能將標籤接合物和對接化合物的預形成複合物投予給個體。
在一些實施例中，負載包含放射性診斷劑且標籤包含中/低親和力標籤(諸如中/低親和力ALFA標籤)。在一些實施例中，負載包含放射性診斷劑，標籤包含中/低親和力標籤(諸如中/低親和力ALFA標籤)，而對接化合物包含針對標籤之單一結合部分(例如單一NbALFA-奈米抗體)。在一些實施例中，負載包含放射性診斷劑，標籤包含選自由以下所組成之群組的ALFA標籤： -     Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Asp-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2、 -     Ac-Pro-Ser-Arg-Leu-Glu-(環6)Lys-Glu-Leu-Arg-(環10)Glu-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2，以及 -     Ac-Pro-Ser-Arg-Leu-(環5)Glu-Glu-Glu-Leu-(環9)Lys-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2， 而對接化合物包含針對標籤之單一結合部分(例如單一NbALFA-奈米抗體)。在這些實施例的一些中，標籤接合物包含兩個標籤。在這些實施例的一些中，「Ac」及/或「NH2」部分可能不存在。
在這些實施例中，標籤接合物和對接化合物的複合物可能在個體體內形成。例如，在投予編碼對接化合物的RNA之後，在個體體內產生對接化合物以供結合至目標抗原和標籤接合物。
在一些實施例中，標籤接合物包含負載以及兩個標籤，該負載包含毒素(例如包含依沙替康部分的毒素)，各標籤包含ALFA標籤Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu、Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-(環13)Glu，或Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu，而對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，標籤接合物包含負載以及兩個標籤，該負載包含毒素(例如包含依沙替康部分的毒素)，各標籤包含ALFA標籤Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu，而對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，標籤接合物包含負載以及兩個標籤，該負載包含毒素(例如包含依沙替康部分的毒素)，各標籤包含ALFA標籤Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu，而對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，標籤接合物包含負載以及兩個標籤，該負載包含免疫調節劑(例如STING促效劑)，各標籤包含ALFA標籤Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu、Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-(環13)Glu，或Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu，而對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，標籤接合物包含負載以及兩個標籤，該負載包含免疫調節劑(例如STING促效劑)，各標籤包含ALFA標籤Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu，而對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，標籤接合物包含負載以及兩個標籤，該負載包含免疫調節劑(例如STING促效劑)，各標籤包含ALFA標籤Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu，而對接化合物包含兩個針對標籤之結合部分(例如兩個NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，標籤接合物包含負載以及兩個標籤，該負載包含有包含放射診斷性同位素(例如DOTA- 68Ga)的螯合劑，各標籤包含ALFA標籤Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Asp-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu，或Pro-Ser-Arg-Leu-(環5)Glu-Glu-Glu-Leu-(環9)Lys-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu，而對接化合物包含針對標籤之單一結合部分(例如單一NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，標籤接合物包含負載以及兩個標籤，該負載包含有包含放射診斷性同位素(例如DOTA- 68Ga)的螯合劑，各標籤包含ALFA標籤Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Asp-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu，而對接化合物包含針對標籤之單一結合部分(例如單一NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，標籤接合物包含負載以及兩個標籤，該負載包含有包含放射診斷性同位素(例如DOTA- 68Ga)的螯合劑，各標籤包含ALFA標籤Pro-Ser-Arg-Leu-(環5)Glu-Glu-Glu-Leu-(環9)Lys-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu，而對接化合物包含針對標籤之單一結合部分(例如單一NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，標籤接合物是包含放射診斷性同位素(例如DOTA- 68Ga)的EX-007，而對接化合物包含針對標籤之單一結合部分(例如單一NbALFA-奈米抗體)。
在一些實施例中，標籤接合物是包含放射診斷性同位素(例如DOTA- 68Ga)的EX-008，而對接化合物包含針對標籤之單一結合部分(例如單一NbALFA-奈米抗體)。 用於靶向傳遞的細胞
根據本發明，透過靶向目標細胞上的目標(例如目標細胞上的抗原，在本文中也稱為「主要目標」)，將負載特異性地傳遞至目標細胞。
在一些實施例中，主要目標是結構，諸如存在於目標細胞表面上的蛋白質，諸如包括細胞表面受體的細胞表面抗原。
諸如「在細胞表面上表現」、「與細胞表面締合」或「細胞表面分子」的術語表示諸如受體或抗原的分子與細胞的質膜締合並且位於細胞的質膜處，其中該分子的至少一部分朝向該細胞的細胞外空間並且可從該細胞的外部接近，例如透過結合分子(諸如位於細胞外部的抗體)。在這上下文中，一部分較佳地為至少4個、較佳地至少8個、較佳地至少12個、更佳地至少20個胺基酸。締合可能是直接的或間接的。例如，締合可能是透過一或多個跨膜結構域、一或多個脂質錨定物，或透過與任何其他蛋白質、脂質、醣類或可在細胞質膜的外小葉上發現的其他結構的交互作用。例如，與細胞表面締合的分子可能是具有細胞外部分的跨膜蛋白，或者可能是透過與另一種作為跨膜蛋白的蛋白質交互作用而與細胞表面締合的蛋白質。
「細胞表面」或「細胞的表面」按照其在本領域中的正常含意使用，並且因此包括易於被蛋白質和其他分子結合的細胞外部。如果抗原位於細胞的表面處並且易於被例如添加至細胞的抗原特異性抗體結合，則該抗原在該細胞表面上表現。在一個實施例中，在細胞表面上表現的抗原是具有被結合分子(諸如抗體)辨識的細胞外部分的整合膜蛋白。
在本發明的上下文中，術語「細胞外部分」或「胞外結構域」是指分子(例如蛋白質)的一部分，其面向細胞的細胞外空間且較佳地可(例如被結合分子，諸如位於細胞外部的抗體)從該細胞的外部接近。
在一些實施例中，主要目標可能存在於病變細胞上。在這些實施例中，本文所述的藥劑和方法可能傳遞為毒素或放射性診斷劑的負載。
主要目標可能在疾病(例如感染或癌症)期間被上調。在罹病組織中，標記可能與健康組織不同，並為治療(尤其是標靶治療)提供獨特的可能性。
在一些實施例中，主要目標是疾病相關抗原，諸如腫瘤抗原、病毒抗原或細菌抗原。這允許病變細胞受到本文所述的方法和藥劑所靶向，例如用於傳遞醫藥活性劑。
術語「疾病相關抗原」以其最廣泛的含義使用，意指與疾病相關的任何抗原。疾病相關抗原可能與微生物感染相關(通常為微生物抗原)，或與癌症(通常為腫瘤)相關。
在一些實施例中，主要目標是腫瘤抗原。在本發明的上下文中，術語「腫瘤抗原」或「腫瘤相關抗原」是有關在正常條件下在有限數量的組織及/或器官中或在特定發育階段中特異性地表現的蛋白質，例如腫瘤抗原可能在正常條件下特異性地表現於胃組織中(較佳地胃黏膜中)、生殖器官中(例如睪丸中)、滋養層組織中(例如胎盤中)，或種系細胞中，並且在一或多種腫瘤或癌組織中表現或異常表現。在這上下文中，「有限數量」較佳地表示不超過3個，更佳地不超過2個。在本發明上下文中的腫瘤抗原包括例如分化抗原，較佳地細胞類型特異性分化抗原(即在某一個分化階段於某種細胞類型中在正常條件下特異性地表現的蛋白質)、癌症/睪丸抗原(即在睪丸中並且有時在胎盤中在正常條件下特異性地表現的蛋白質)，以及種系特異性抗原。在本發明的上下文中，腫瘤抗原較佳地與癌細胞的細胞表面締合，並且較佳地在正常組織中不表現或僅少量表現。較佳地，腫瘤抗原或腫瘤抗原的異常表現鑑定癌細胞。在本發明的上下文中，由個體(例如患有癌症疾病的患者)中的癌細胞所表現的腫瘤抗原較佳地是該名個體中的自身蛋白。在較佳實施例中，本發明上下文中的腫瘤抗原在正常條件下特異性地在非必需的組織或器官(非必需的組織或器官即當被免疫系統損害時不會導致個體死亡的組織或器官)中表現，或在免疫系統無法或難以接近的身體器官或結構中表現。較佳地，在正常組織中表現的腫瘤抗原和在癌組織中表現的腫瘤抗原之間，腫瘤抗原的胺基酸序列是相同的。
腫瘤抗原的實例包括 p53、ART-4、BAGE、β-鏈蛋白/m、Bcr-abL、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、密連蛋白家族的細胞表面蛋白(諸如密連蛋白-6、密連蛋白-18.2和密連蛋白-12)、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT (或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A (較佳地MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C)、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、p190次要BCR-abL、Pm1/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、存活蛋白(SURVIVIN)、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE以及WT。尤佳的腫瘤抗原包括密連蛋白-18.2 (CLDN18.2)和密連蛋白-6 (CLDN6)。
在一些實施例中，主要目標是一種結構，諸如存在於目標細胞表面上的蛋白質，諸如細胞表面抗原或細胞表面受體，與其他細胞類型相比，其存在或其量是某些細胞類型的特徵。這允許以存在或數量增加為特徵的某些細胞類型被本文所述的方法和藥劑所靶向。
在一些實施例中，用於靶向傳遞的細胞是免疫效應細胞而主要目標是免疫效應細胞所特有的細胞表面抗原。
在一些實施例中，主要目標(例如CD3，諸如CD3e)、CD4或CD8可能存在於免疫細胞(諸如免疫效應細胞)上。在這些實施例中，本文所述的藥劑和方法可能傳遞作為免疫調節劑的負載。
在一些實施例中，主要目標可能存在於病變細胞(例如腫瘤細胞)上，而本文所述的藥劑和方法可能將負載(例如免疫調節劑)傳遞至靠近病變細胞的免疫細胞。例如，如果對接化合物包含Fc序列(例如免疫球蛋白重鏈的Fc序列)，則本文所述靶向病變細胞的包含標籤接合物和對接化合物的複合物可透過Fc媒介的內化作用被位於所靶向病變細胞附近的免疫細胞攝取。 免疫效應細胞
與本文所述的方法和藥劑結合使用的免疫細胞特別包括免疫效應細胞，諸如具有溶解潛力的細胞，特別是類淋巴細胞，並且較佳是T細胞，特別是細胞毒性淋巴球，較佳地選自細胞毒性T細胞、自然殺手(NK)細胞和淋巴因子活化的殺手(LAK)細胞。活化之後，這些細胞毒性淋巴球中的各者會觸發目標細胞的破壞。例如，細胞毒性T細胞會透過以下一種或兩種方式觸發目標細胞的破壞。首先，T細胞活化後會釋放細胞毒素(諸如穿孔素、顆粒酶和顆粒溶素)。穿孔素和顆粒溶素在目標細胞中產生孔，顆粒酶進入細胞並觸發細胞質中的凋亡蛋白酶級聯，從而誘導細胞凋亡(計畫性細胞死亡)。其次，經由T細胞和目標細胞之間的Fas-Fas配體交互作用可以誘導細胞凋亡。儘管可以使用異源細胞或同種異體細胞，但結合本發明使用的細胞將較佳地為自體細胞。
在本發明的上下文中，術語「效應功能」包括由免疫系統的組分媒介的任何功能，其導致例如殺死病變細胞(諸如腫瘤細胞)，或抑制腫瘤生長及/或抑制腫瘤發展，包括抑制腫瘤擴散和轉移。較佳地，本發明上下文中的效應功能是T細胞媒介的效應功能。這些功能在輔助T細胞(CD4 +T細胞)的情況下包含釋放細胞激素及/或活化CD8 +淋巴球(CTL)及/或B細胞，而在CTL的情況下包含消除細胞(即特徵在於表現抗原的細胞)，例如經由細胞凋亡或穿孔素媒介的細胞溶解、細胞激素(諸如IFN-g和TNF-α)的產生，以及表現抗原的目標細胞的特異性細胞溶解性殺傷。
在本發明的上下文中，術語「免疫效應細胞」或「免疫反應性細胞」是有關在免疫反應期間發揮效應功能的細胞。在一些實施例中，「免疫效應細胞」能夠結合抗原(諸如在細胞上MHC的背景下被呈現的抗原或在細胞表面上被表現的抗原)並媒介免疫反應。舉例來說，免疫效應細胞包含T細胞(細胞毒性T細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤性T細胞)、B細胞、自然殺手細胞、嗜中性球、巨噬細胞和樹突狀細胞。較佳地，在本發明的上下文中，「免疫效應細胞」是T細胞，較佳地CD4 +及/或CD8 +T細胞，最佳地CD8 +T細胞。術語「免疫效應細胞」也包括在適當刺激下可以成熟變為免疫細胞(諸如T細胞，特別是T輔助細胞，或細胞溶解性T細胞)的細胞。免疫效應細胞包含CD34 +造血幹細胞、未成熟和成熟的T細胞，以及未成熟和成熟的B細胞。當暴露於抗原時，T細胞前驅細胞分化為細胞溶解性T細胞，這類似於免疫系統的殖株選擇。
「類淋巴細胞」是能夠產生免疫反應(諸如細胞性免疫反應)的細胞，或此類細胞的前驅細胞，並且包括淋巴球，較佳地T淋巴球、淋巴母細胞和漿細胞。類淋巴細胞可能是如本文所述的免疫效應細胞。較佳的類淋巴細胞是可被修飾成在細胞表面表現抗原受體的T細胞。在一些實施例中，類淋巴細胞缺乏T細胞受體的內源性表現。
術語「T細胞」和「T淋巴球」在本文中可互換使用，並且包括T輔助細胞(CD4 +T細胞)和細胞毒性T細胞(CTL，CD8 +T細胞)，其包含細胞溶解性T細胞。
T細胞屬於一群被稱為淋巴球的白血球，在細胞媒介的免疫性中發揮核心作用。它們與其他淋巴球類型(諸如B細胞和自然殺手細胞)的區別在於其細胞表面上存在一種稱為T細胞受體(TCR)的特殊受體。胸腺是負責T細胞成熟的主要器官。已經發現了幾種不同的T細胞亞群，每種亞群都有不同的功能。
T輔助細胞在免疫過程中協助其他白血球，包括B細胞成熟變為漿細胞以及活化細胞毒性T細胞和巨噬細胞等功能。這些細胞也稱為CD4 +T細胞，因為它們在其表面上表現CD4醣蛋白。當輔助T細胞被抗原呈現細胞(APC)表面所表現的MHC第II類分子呈現肽抗原時，它們就會被活化。一旦被活化，它們會迅速分裂並分泌被稱為細胞激素的小型蛋白質，細胞激素會調節或協助主動免疫反應。
細胞毒性T細胞會破壞被病毒感染的細胞和腫瘤細胞，也與移植排斥有關。這些細胞也被稱為CD8 +T細胞，因為它們在其表面上表現CD8醣蛋白。這些細胞透過結合至與MHC第I類締合的抗原來辨識其目標，而MHC第I類存在於人體幾乎每個細胞的表面。
「調節性T細胞」或「Treg」是調節免疫系統、維持對自身抗原的耐受性並預防自體免疫疾病的一個T細胞亞群。Treg具有免疫抑制作用，通常抑制或下調效應T細胞的誘導和增生。Treg表現生物標記CD4、FoxP3和CD25。
如本文所用，術語「初始T細胞」是指成熟T細胞，其與經活化T細胞或記憶T細胞不同，在周邊內尚未遭遇過其同源抗原。初始T細胞的特徵通常是表面表現L-選擇素(CD62L)、缺乏活化標記CD25、CD44或CD69，以及缺乏記憶CD45RO同型。
如本文所用，術語「記憶T細胞」是指先前已遭遇過並回應其同源抗原的T細胞亞群(subgroup)或亞群(subpopulation)。第二次遇到抗原時，記憶T細胞可以繁殖，產生比免疫系統第一次對抗原做出反應時更快且更強的免疫反應。記憶T細胞可能是CD4 +或CD8 +並且通常表現CD45RO。
如本文所用，術語「T細胞」也包括在適當刺激下可以成熟變為T細胞的細胞。
大多數T細胞都有T細胞受體(TCR)，它以多種蛋白質的複合體形式存在。實際的T細胞受體由兩條各別的肽鏈組成，它們由獨立的T細胞受體α和β (TCRα和TCRβ)基因產生，分別被稱為α-TCR鏈和β-TCR鏈。γδT細胞(γδ T細胞)代表一小部分T細胞，在其表面上具有獨特的T細胞受體(TCR)。然而，在γδ T細胞中，TCR由一條γ鏈和一條δ鏈組成。這群T細胞比αβ T細胞少見的多(佔T細胞總數的2%)。
所有T細胞均源自骨髓中的造血幹細胞。衍生自造血幹細胞的造血前驅細胞在胸腺中生長，並透過細胞分裂擴增，生成大量未成熟的胸腺細胞。最早的胸腺細胞既不表現CD4也不表現CD8，因此被歸類為雙陰性(CD4 -CD8 -)細胞。隨著發育的進展，它們成為雙陽性胸腺細胞(CD4 +CD8 +)，並最終成熟為單陽性(CD4 +CD8 -或CD4 -CD8 +)胸腺細胞，然後從胸腺被釋放到周邊組織。
如本文所用，術語「NK細胞」或「自然殺手細胞」是指由CD56或CD16的表現且不存在T細胞受體所定義的一個周邊血液淋巴球亞群。如本文所提供的，NK細胞也可以從幹細胞或前驅細胞分化而來。 靶向傳遞負載
本文所述的藥劑和方法可用於多種應用，其中需要將負載(例如治療性化合物或診斷性化合物)傳遞至目標細胞。本文所述的藥劑可能藉由活體外或活體內方案投予。
使用本文所述的方法和藥劑傳遞負載可以與多種目標細胞一起使用，使得負載被傳遞至目標細胞並且視情況被引入到目標細胞(或目標細胞附近的細胞)中。本發明可提供將負載活體外或活體內傳遞到目標細胞，這取決於目標細胞的位置。舉例而言，當目標細胞是經分離的細胞時，則負載可能在允許目標細胞存活的細胞培養條件下直接被傳遞給細胞。或者，當一或多個目標細胞是多細胞生物體的一部分時，本文所述的靶向化合物(標籤接合物/對接化合物)可能以使得靶向化合物能夠到達並視情況進入目標細胞(或目標細胞附近的細胞)的方式被提供給生物體或宿主。「活體內」表示將靶向化合物(或編碼其的核酸酸)投予至動物的活體。「離體」表示細胞在體外被修飾。這些細胞可能會返回活體。向多細胞生物體投予靶向化合物(或編碼其的核酸)的路徑取決於數種參數，包括靶向化合物的性質。特別感興趣的全身性路徑是血管路徑，透過這個路徑將靶向化合物(或編碼其的核酸)引入宿主的血管系統(例如動脈或靜脈)，其中靜脈內投予路徑在許多實施例是特別感興趣的。關於投予，靶向化合物(或編碼其的核酸)通常存在於醫藥製劑(例如包含醫藥上可接受的載劑、稀釋劑及/或佐劑)中，並且包括有效量的負載。在某些實施例中，靶向化合物(或編碼其的核酸)在水性傳遞媒劑(例如鹽水溶液)中投予。因此，在許多實施例中，採用水基傳遞媒劑(例如鹽水溶液)血管內地(例如動脈內或靜脈內)投予靶向化合物(或編碼其的核酸)。
在許多實施例中，以活體內方式將靶向化合物(或編碼其的核酸)投予給多細胞生物體，使得負載被引入多細胞生物體的目標細胞中。在核酸的情況下，通常在足以發生核酸表現的條件下投予。在一些實施例中，本文所述的藥劑和方法導致核酸的瞬時表現，而不是如上所述的持續表現。瞬時表現表示在投予核酸後，呈可偵測含量的核酸表現不會持續一段較長的時間。較長時間是指至少1週，通常至少2個月，更通常至少6個月。可偵測含量表示核酸的表現處於這樣的含量，使得人們可以在哺乳動物中(例如在哺乳動物的血清中)偵測到呈治療濃度之所編碼的蛋白質。
在一些實施例中，在不將核酸併入到宿主的目標細胞基因體中的情況下達到上述瞬時表現。 結合部分及結合劑
本發明說明了結合部分或結合劑，諸如抗體或抗體衍生物。此外，本發明說明了雙特異性或多特異性結合劑，諸如包含第一結合結構域和第二結合結構域的雙特異性抗體，其中第一結合結構域能夠結合至主要目標而第二結合結構域能夠結合至標籤接合物。
如本文所用，術語「結合劑」是指能夠結合至期望抗原的任何藥劑。在某些實施例中，結合劑是或包含抗體、抗體片段、或任何其他結合蛋白，或其任何組合。
如本文所用，術語「結合部分」是指能夠結合至期望抗原的任何部分、基團或結構域。在某些實施例中，結合部分是或包含抗體、抗體片段、或任何其他結合蛋白，或其任何組合。
如本文所用，術語「抗原」是能夠被結合部分或結合劑(諸如抗體)結合的分子。抗原還可能額外誘導體液性免疫反應及/或細胞性免疫反應，導致B淋巴球及/或T淋巴球產生。抗原可能具有一或多個表位(B細胞表位和T細胞表位)。
術語「表位」是指被結合劑辨識的分子或抗原的一個部分或片段。例如，表位可能被抗體或任何其他結合蛋白辨識。表位可能包括抗原的連續或不連續部分，並且長度可能是約5個和約100個胺基酸之間，諸如約5個和約50個胺基酸之間，更佳地約8個和約30個胺基酸之間，最佳地約8個和約25個胺基酸之間，例如表位的長度較佳地可能為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個胺基酸。在一些實施例中，表位的長度為約10個和約25個胺基酸之間。術語「表位」包括結構性表位。
術語「免疫球蛋白」是指一類結構上相關的醣蛋白，其由兩對多肽鏈(一對低分子量輕(L)鏈和一對重(H)鏈)組成，所有四條鏈藉由雙硫鍵相互連接。免疫球蛋白的結構已進行過充分表徵。例如參見Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))。簡言之，每條重鏈通常由重鏈可變區(本文縮寫為V H或VH)和重鏈恆定區(本文縮寫為C H或CH)組成。重鏈恆定區通常由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。鉸鏈區是重鏈CH1結構域和CH2結構域之間的區域且具有高度撓性。鉸鏈區的雙硫鍵是IgG分子中兩條重鏈之間交互作用的一部分。每條輕鏈通常由輕鏈可變區(本文縮寫為V L或VL)和輕鏈恆定區(本文縮寫為C L或CL)組成。輕鏈恆定區通常由一個結構域CL組成。VH區和VL區可能進一步細分為高度變異區(或在序列及/或結構限定環的形式上可能高度變異的高度變異區)，也稱為互補決定區(CDR)，散佈有較保守的區域，稱為框架區(FR)。每個VH和VL通常由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4 (亦參見Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901‑917 (1987))。
如本文所用，術語「抗體」(Ab)是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者的衍生物，其具有結合、較佳地特異性地結合至抗原的能力。在一些實施例中，結合發生在典型生理條件下，具有特殊意義時間的半衰期，諸如至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約一小時、至少約兩小時、至少約四小時、至少約8小時、至少約12小時、約24小時或更長、約48小時或更長、約3、4、5、6、7或更多天等，或任何其他相關功能上定義的時間(例如足以誘導、促進、增強及/或調節與抗體結合至抗原相關的生理反應的時間)。免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原交互作用的結合結構域。如本文所用，術語「抗原結合區」、「結合區」或「結合結構域」是指與抗原交互作用的區域或結構域且通常包含VH區和VL區兩者。當本文使用時，術語抗體不僅包括單特異性抗體，還包括多特異性抗體(其包含多個，諸如兩個或更多個，例如三個或更多個不同的抗原結合區)。抗體(Ab)的恆定區可能媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞(諸如效應細胞)和補體系統的組分，諸如C1q (經典補體活化路徑中的第一個組分)。如上所述，除非另有說明或與上下文明顯矛盾，否則如本文所用的術語抗體包括作為抗原結合片段的抗體片段(即保有特異性地結合至抗原的能力)，以及抗體衍生物(即衍生自抗體的結構)。已經證明，抗體的抗原結合功能可能由全長抗體的片段來執行。術語「抗體」中所涵括的抗原結合片段的實例包括(i) Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段，或如WO2007059782 (Genmab)中所述的單價抗體；(ii) F(ab') 2片段，包含在鉸鏈區處藉由雙硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)基本上由VH結構域和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)基本上由抗體單臂的VL結構域和VH結構域組成的Fv片段、(v) dAb片段(Ward et al ., Nature 341, 544‑546 (1989))，其基本上由VH結構域組成，也稱為結構域抗體(Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov;21(11):484-90)；(vi)駱駝科動物或奈米抗體分子(Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24)，以及(vii)經分離的互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由各別的基因編碼，但它們可能使用重組方法藉由合成連接子連接，使它們能夠製成單條蛋白鏈，其中VL區和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)，參見例如Bird et al ., Science 242, 423-426 (1988)與Huston et al ., PNAS USA 85, 5879‑5883 (1988))。此類單鏈抗體含括在術語抗體內，除非另有說明或上下文明確指出。儘管此類片段通常包括在抗體的含義內，但它們共同且各自獨立地是本發明的獨特特徵，展現出不同的生物學性質和效用。在本發明上下文中本文進一步討論這些和其他有用的抗體片段以及此類片段的雙特異性形式。也應理解，除非另有說明，否則術語抗體還包括多株抗體、單株抗體(mAb)、抗體樣多肽(諸如嵌合抗體和人源化抗體)，以及保有特異性地結合至抗原的能力的抗體片段(抗原結合片段)，其是透過任何已知技術提供，諸如酶促切割、肽合成和重組技術。
片語「單鏈Fv」或「scFv」是指其中傳統雙鏈抗體的重鏈和輕鏈(VH和VL)的可變結構域已連接形成一條鏈的抗體。視情況，在兩條鏈之間插入連接子(通常是肽)以允許正確折疊並創造出活性結合位點。
單域抗體，也稱為奈米抗體，是由單一單體可變抗體結構域所組成的抗體片段。在一些實施例中，單域抗體是重鏈抗體的可變結構域(V H)。這些被稱為VHH片段。與完整抗體一樣，單域抗體能夠選擇性地結合至特定抗原。第一個單域抗體是從駱駝科動物發現的重鏈抗體改造而來的。軟骨魚類還具有重鏈抗體(IgNAR，「免疫球蛋白新抗原受體」)，從中可以獲得被稱為VNAR片段的單域抗體。另一種方法是將來自人類或小鼠的常見免疫球蛋白G (IgG)的二聚體可變結構域拆分為單體。雖然目前大多數對單域抗體的研究都是基於重鏈可變結構域，但衍生自輕鏈的奈米抗體也已被證明可以特異性地結合至目標表位。
抗體可以有任何同型。如本文所用，術語「同型」是指由重鏈恆定區基因編碼的免疫球蛋白類別(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。當本文提及特定同型(例如IgG1)時，該術語不限於特定同型序列(例如特定IgG1序列)，而是用於指示該抗體在序列上比其他同型更接近該同型(例如IgG1)。因此，例如IgG1抗體可能是天然存在的IgG1抗體的序列變體，包括恆定區中的變異。
在各種實施例中，抗體是IgGl抗體，更具體地是IgGlκ或IgGlλ同型(即IgGl，κ、λ)、IgG2a抗體(例如IgG2a，κ、λ)、IgG2b抗體(例如IgG2b，κ、λ)、IgG3抗體(例如IgG3，κ、λ)或IgG4抗體(例如IgG4，κ、λ)。
如本文所用，術語「單株抗體」是指單一分子組成物的抗體分子的製劑。單株抗體組成物展現出對特定表位的單一結合特異性和親和力。因此，術語「人類單株抗體」是指展現出單一結合特異性的抗體，其具有衍生自人類種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。人類單株抗體可能透過融合瘤產生，該融合瘤包括從轉基因或轉染色體非人類動物(諸如轉基因小鼠)獲得的B細胞，其具有包含融合至永生化細胞之人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因體。
如本文所用，術語「嵌合抗體」是指其中可變區是衍生自非人物種(例如衍生自囓齒動物)且恆定區是衍生自不同物種(諸如人類)的抗體。開發用於治療應用的嵌合單株抗體是為了降低抗體免疫原性。如在嵌合抗體的上下文中使用時，術語「可變區」或「可變結構域」是指包含免疫球蛋白重鏈和輕鏈兩者的CDR與框架區的區域。嵌合抗體可能透過使用如Sambrook et al ., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15中描述的標準DNA技術來生成。嵌合抗體可能是經遺傳或酶促工程改造的重組抗體。生成嵌合抗體在本領域具有通常知識者的知識範圍內，且因而嵌合抗體的生成可透過本文所述以外的其他方法進行。
如本文所用，術語「人源化抗體」是指一種經遺傳改造的非人類抗體，其含有人類抗體恆定結構域以及非人類可變結構(經修飾成與人類可變結構域含有高序列同源性程度)。這可以例如透過將一起形成抗原結合位點的六個非人類抗體互補決定區(CDR)移植到同源人類受體框架區(FR)上來達到(參見WO92/22653和EP0629240)。為了完全重建親本抗體的結合親和力與特異性，可能需要將親本抗體(即非人類抗體)的框架殘基取代成人類框架區(回復突變)。結構同源性建模可能有助於辨識框架區中對於抗體結合性質至關重要的胺基酸殘基。因此，人源化抗體可能包含非人類CDR序列，主要是視情況包含非人類胺基酸序列的一或多個胺基酸回復突變的人類框架區，以及完全人類恆定區。視情況，可能施加額外胺基酸修飾(其不必然是回復突變)以獲得具有偏好特徵(諸如親和力與生化性質)的人源化抗體。
如本文所用，術語「人類抗體」是指包括具有衍生自人類種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。人類抗體可能包括不由人類種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定點突變或透過活體內體細胞突變引入的突變)。然而，如本文所用，術語「人類抗體」並非意欲包括其中衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠或大鼠)的種系的CDR序列已被移植到人類框架序列上的抗體。人類單株抗體可以透過多種技術產生，包括習知單株抗體方法，例如Kohler and Milstein , Nature256: 495 (1975)的標準體細胞雜交技術。雖然偏好體細胞雜交程序，但原則上也可以採用用於產生單株抗體的其他技術，例如B淋巴球的病毒或致癌轉形或使用人類抗體基因庫的噬菌體展示技術。用於製備分泌人類單株抗體的融合瘤的適當動物系統是鼠類系統。在小鼠中生成融合瘤是一個非常成熟的程序。用於分離經免疫的脾細胞以進行融合的免疫方案和技術是本領域已知的。融合伴侶(例如鼠類骨髓瘤細胞)和融合程序也是已知的。因此，可以例如使用攜帶部分人類免疫系統而不是小鼠或大鼠系統的轉基因或轉染色體小鼠或大鼠來生成人類單株抗體。因此，在一些實施例中，人類抗體是獲自攜帶人類種系免疫球蛋白序列而非動物免疫球蛋白序列的轉基因動物，諸如小鼠或大鼠。在這些實施例中，抗體源自於被引入動物的人類種系免疫球蛋白序列，但最終的抗體序列是該人類種系免疫球蛋白序列透過內源性動物抗體機制的體細胞超突變和親和力成熟進一步修飾，參見例如Mendez et al. 1997 Nat Genet. 15(2):146-56。
當本文使用時，除非上下文矛盾，否則術語「Fab臂」、「結合臂」或「臂」包括一對重鏈-輕鏈並且在本文中與「半分子」互換使用。
當在抗體的上下文中使用時，術語「全長」表示抗體不是片段，而是含有通常在自然界中發現特定同型的所有結構域，例如IgG1抗體的VH、CH1、CH2、CH3、鉸鏈、VL和CL結構域。
當本文使用時，除非上下文矛盾，否則術語「Fc區」是指由免疫球蛋白重鏈的兩個Fc序列組成的抗體區，其中該等Fc序列包含至少鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域。
除非與上下文矛盾，否則如本文所用的術語「特異性」意欲具有以下含義。如果兩個抗體結合至相同抗原和相同表位，則它們具有「相同特異性」。
天然存在的抗體通常是單特異性的，即它們結合至單一抗原。本文所述的結合劑(例如對接化合物)結合至例如主要目標與標籤接合物上的不同表位。這樣的結合劑為至少雙特異性或多特異性(諸如三特異性、四特異性等)。因此，結合劑可能包含兩個或更多可如本文所述的抗體或其片段。具體來說，本文所述的結合劑可能是由兩個不同抗體、抗體和不同抗體的片段，以及兩個不同抗體的片段(形成兩個結合結構域的兩個不同抗體的該等片段)組成的人工蛋白。
根據本發明，雙特異性結合劑(特別是雙特異性蛋白，諸如雙特異性抗體)是具有兩種不同結合特異性並因此可能結合至兩個表位的分子。具體來說，如本文所用，術語「雙特異性抗體」是指包含兩個抗原結合位點的抗體，第一個結合位點對第一個表位具有親和力，而第二個結合位點對不同於第一個表位的第二個表位具有結合親和力。
如本文所用，術語「雙特異性」是指具有結合至不同表位的兩個不同抗原結合區的藥劑。
「多特異性結合劑」是具有超過兩種不同結合特異性的分子。
雙特異性抗體的許多不同形式和用途是本領域已知的，並由Kontermann; Drug Discov Today, 2015 Jul;20(7):838-47與MAbs, 2012 Mar-Apr;4(2):182-97進行了綜述。
根據本發明的雙特異性結合劑不限於任何特定的雙特異性形式或生產它的方法。
可用於本文的雙特異性抗體分子的實例包括(i)具有包含不同抗原結合區的兩個臂的單一抗體；(ii)對兩個不同表位具有特異性的單鏈抗體，例如經由額外肽連接子串聯連接的兩個scFv；(iii)雙可變結構域抗體(DVD-Ig)，其中每條輕鏈和重鏈包含透過短肽鍵聯串聯的兩個可變結構域(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)；(iv)化學連結的雙特異性(Fab')2片段；(v) Tandab，它是兩個單鏈雙抗體的融合物，產生四價雙特異性抗體，對每個目標抗原具有兩個結合位點；(vi)撓性抗體，它是scFv與雙抗體的組合，產生多價分子；(vii)所謂的「對接和鎖定」分子，基於蛋白激酶A中的「二聚化和對接結構域」，當應用於Fab時可以產生由兩個連接至不同Fab片段的相同Fab片段組成的三價雙特異性結合蛋白；(viii)所謂的Scorpion分子，包含例如融合至人類Fab臂的兩個末端的兩個scFv；以及(ix)雙抗體。
術語「雙特異性抗體」包括雙抗體。雙抗體是二價雙特異性抗體，其中VH結構域和VL結構域在單條多肽鏈上表現，但使用的連接子短到不允許同一條鏈上的兩個結構域之間配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123)。雙特異性抗體也包括雙特異性單鏈抗體。術語「雙特異性單鏈抗體」表示包含兩個結合結構域的單一多肽鏈。具體地說，如本文所用，術語「雙特異性單鏈抗體」或「單鏈雙特異性抗體」或相關術語較佳地表示將至少兩個抗體可變區連接在缺乏完全免疫球蛋白中存在之恆定部分及/或Fc部分的單條多肽鏈中而產生的抗體結構。例如，雙特異性單鏈抗體可能是總共具有兩個抗體可變區(例如兩個VH區)的結構，每個可變區能夠特異性地結合至各自的表位，並且透過短多肽間隔子彼此連接，使得兩個抗體可變區及其插入的間隔子以單一連續多肽鏈存在。雙特異性單鏈抗體的另一個實例可能是具有三個抗體可變區的單一多肽鏈。在此，兩個抗體可變區(例如一個VH和一個VL)可能組成scFv，其中兩個抗體可變區經由合成多肽連接子彼此連接，連接子通常經過遺傳改造以具有最低限度的免疫原性同時對蛋白水解保有最大程度的抗性。這個scFv能夠特異性地結合至特定表位，並且連接至能夠結合與scFv結合的表位不同的表位的另一抗體可變區(例如VH區)。雙特異性單鏈抗體的又另一個實例可能是具有四個抗體可變區的單一多肽鏈。在此，前兩個抗體可變區(例如VH區和VL區)可能形成能夠結合至一個表位的一個scFv，而第二個VH區和VL區可能形成能夠結合至另一個表位的第二個scFv。在單一連續多肽鏈內，一種特異性的個別抗體可變區可能有利地被合成多肽連接子分隔開，而各別scFv可能有利地被如上所述的短多肽間隔子分隔開。根據一些實施例，雙特異性抗體的第一結合結構域包含一個抗體可變結構域，較佳地VHH結構域。根據一些實施例，雙特異性抗體的第一結合結構域包含兩個抗體可變結構域，較佳地scFv，即VH-VL或VL-VH。根據一些實施例，雙特異性抗體的第二結合結構域包含一個抗體可變結構域，較佳地VHH結構域。根據一些實施例，雙特異性抗體的第二結合結構域包含兩個抗體可變結構域，較佳地scFv，即VH-VL或VL-VH。因此，在其最小形式中，雙特異性抗體中抗體可變區的總數僅為二。例如，這樣的抗體可以包含兩個VH結構域或兩個VHH結構域。根據一些實施例，雙特異性抗體的第一結合結構域和第二結合結構域各自包含一個抗體可變結構域，較佳地VHH結構域。根據一些實施例，雙特異性抗體的第一結合結構域和第二結合結構域各自包含兩個抗體可變結構域，較佳地scFv，即VH-VL或VL-VH。在這個實施例中，結合劑較佳地包含(i)第一抗體的重鏈可變結構域(VH)、(ii)第一抗體的輕鏈可變結構域(VL)、(iii)第二抗體的重鏈可變結構域(VH)，以及((iv)第二抗體的輕鏈可變結構域(VL)。
在一些實施例中，雙特異性分子包含兩個Fab區，每個Fab區針對不同的表位。在一些實施例中，本發明的分子是抗原結合片段(Fab)2複合體。Fab2複合體由兩個Fab片段組成，一個Fab片段包含對一個表位具有特異性的Fv結構域(即VH和VL結構域)，而另一個Fab片段包含對另一個表位具有特異性的Fv結構域。Fab片段中的各者可能由兩條單鏈(VL-CL模組和VH-CH模組)組成。或者，個別Fab片段中的各者可以排列在單鏈中，較佳地VL-CL-CH-VH，且個別可變結構域和恆定結構域可能用肽連接子連接。
在一些實施例中，根據本發明的結合劑包括各種類型的二價和三價單鏈可變片段(scFv)、模擬兩種抗體的可變結構域的融合蛋白。二價(或二價)單鏈可變片段(di-scFv、bi-scFv)可以藉由連接兩個scFv進行工程改造。這可以透過產生具有兩個VH和兩個VL區的單一肽鏈來完成，從而產生串聯scFv。本發明也包括包含超過兩個scFv結合結構域的多特異性分子。
另一種可能性是使用連接肽創造scFv，該連接肽短到兩個可變區無法折疊在一起(大約五個胺基酸)，迫使scFv二聚化。這種類型被稱為雙抗體。較短的連接子(一個或兩個胺基酸)導致三聚體的形成，即所謂的三抗體(triabody或tribody)。四抗體也已產生。它們對其目標表現出比雙抗體更高的親和力。
雙特異性抗體片段的一個尤佳實例是雙抗體(Kipriyanov, Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772)，其是小型二價和雙特異性抗體片段。雙抗體包含在同一多肽鏈(VH-VL)上透過肽連接子連接的重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)，該肽連接子短到不允許同一條鏈上的兩個結構域之間配對。這迫使與另一條鏈的互補結構域配對，並促使具有兩個功能性抗原結合位點的二聚體分子的組裝。
在一些實施例中，根據本發明的雙特異性或多特異性分子包含免疫球蛋白的可變結構域(VH、VL)和恆定結構域(C)。在一些實施例中，雙特異性分子是微型抗體，較佳地包含兩條單一VH-VL-C鏈的微型抗體，該兩條VH-VL-C鏈經由恆定結構域(C)彼此連結。根據這個態樣，對應的可變重鏈區(VH)、對應的可變輕鏈區(VL)和恆定結構域(C)從N端到C端按照VH(表位1)-VL(表位1)-(C)和VH(表位2)-VL(表位2)-C的順序排列，其中C較佳地是CH3結構域，表位1指第一個表位而表位2指第二個表位。恆定結構域的配對導致微型抗體的形成。
根據另一個態樣，本發明的雙特異性結合劑呈雙特異性單鏈抗體結構的形式，其中該結構包含至少兩個結合結構域或由至少兩個結合結構域組成。在一些實施例中，每個結合結構域包含來自抗體重鏈的一個可變區(「VH區」)，其中第一結合結構域的VH區特異性地結合至表位1，而第二個結合結構域的VH區特異性地結合至表位2。兩個結合結構域視情況藉由短多肽間隔子彼此連接。每個結合結構域可能額外包含來自抗體輕鏈的一個可變區(「VL區」)，第一和第二結合結構域的各者內的VH區和VL區經由多肽連接子彼此連接，該多肽連接子長到允許第一結合結構域的VH區和VL區與第二結合結構域的VH區和VL區彼此配對。
在一些實施例中，本文所述的結合劑包含抗體(例如全長抗體)，其包含第一結合結構域。在一些實施例中，本文所述的結合劑包含抗體片段(諸如scFv或VHH)，其包含共價連接至包含第一結合結構域的抗體的第二結合結構域。在一些實施例中，結合劑包含抗體片段(諸如scFv或VHH)，其共價連接至抗體的輕鏈或重鏈的N端或C端。
在一些實施例中，本文所述的結合部分(例如包含結合至主要目標的對接化合物中的結合部分)包含DARPin。在一些實施例中，結合部分將負載引導至目標細胞(諸如癌細胞)。
術語「DARPin」是指經過設計的錨蛋白重複序列蛋白。DARPin基於天然存在的錨蛋白重複序列蛋白，但含有一或多個胺基酸突變，這些突變可以影響例如它們與目標分子的結合親和力、它們的細胞表面表現以及類似性質。DARPin較佳地包括2至3個側接N-和C-加帽重複序列的錨蛋白重複序列模組。每個錨蛋白重複序列模組包含約33個胺基酸殘基。
在釀酒酵母、黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲中，透過四種此類蛋白之間的序列比較而在1987年鑑定出錨蛋白重複序列蛋白。Breeden和Nasmyth報導swi6p、cddOp、notch和lin-12序列中約33個殘基的重複序列單元的多個拷貝(Breeden et al., Nature 329, 651-654 (1987))。隨後在錨蛋白中發現了這個重複序列單元的24個拷貝，從而將該重複序列單元命名為錨蛋白重複序列(Lux et al., Nature 344, 36-42 (1990))。之後，這個重複序列單元已在不同生物體和病毒的數百種蛋白質中被鑑定出來(Bork, Proteins 17(4), 363-74 (1993))。這些蛋白質位於細胞核、細胞質或細胞外空間。這與這些蛋白質的錨蛋白重複序列結構域與雙硫橋無關並因此與環境的氧化態無關是一致的。每個蛋白質的重複序列單元數量從兩個到超過二十個不等。錨蛋白重複序列單元的三級結構共享一個特徵折疊(Sedgwick and Smerdon, Trends Biochem Sci. 24(8), 311-6 (1999))，由β-髮夾和隨後的兩個反平行α-螺旋組成，並以將重複單元與下一個重複單元聯接的環結尾。由錨蛋白重複序列單元建構的結構域是透過將重複單元堆疊成延伸且彎曲的結構而形成的。含有錨蛋白重複序列結構域的蛋白質通常含有額外的結構域。雖然額外結構域具有各種功能，但錨蛋白重複序列結構域最常見的功能是結合其他蛋白質。在分析這些蛋白質的重複序列單元時，目標交互作用殘基主要發現於β-髮夾和第一個α-螺旋的暴露部分。因此，這些目標交互作用殘基在錨蛋白重複序列結構域上形成大的接觸表面。這個接觸表面暴露在由α-螺旋1、α-螺旋2和環的堆疊單元構成的框架上。
透過篩選DARPin組合庫並挑選出那些對目標具有期望結合性質的DARPin來鑑定結合至特定目標的DARPin。此類篩選方法描述於例如Muench et al., Molecular Therapy, 16(4), 686-693, 2011中。例如，核醣體展示或噬菌體展示方法可用來從多樣庫中挑選目標特異性DARPin。
術語「重複序列蛋白」是指包含一或多個重複序列結構域的(多)肽/蛋白質。在一個實施例中，重複序列蛋白包含至多四個重複序列結構域。在一個實施例中，重複序列蛋白包含至多三個重複序列結構域。在一個實施例中，重複序列蛋白包含至多兩個重複序列結構域。在最佳的實施例中，重複序列蛋白包含一個重複序列結構域。
重複序列蛋白的個別結構域可能直接或經由(多)肽連接子彼此連接。術語「(多)肽連接子」是指能夠連接兩個蛋白質結構域的胺基酸序列。此類連接子包括例如長度各異的甘胺酸-絲胺酸-連接子並且是相關領域具有通常知識者已知的。
術語「重複序列結構域」是指包含兩個或更多個連續重複序列單元(模組)的蛋白質結構域。在一個實施例中，該等重複序列單元是具有相同或相似折疊結構的結構單元，並且較佳地緊密堆疊以較佳地創造出具有共同疏水核的超螺旋結構。
術語「結構單元」是指(多)肽的局部有序部分，其由沿著(多)肽鏈彼此靠近的二級結構的兩個或更多個區段之間的三維交互作用形成。這樣的結構單元包含結構模體。
術語「結構模體」是指存在於至少一個結構單元中的二級結構元件的三維排列。結構模體是相關領域具有通常知識者所知的。該等結構單元單獨並不能夠獲得明確的三維排列；然而，它們在重複序列結構域中作為重複序列模組連續排列會導致相鄰單元的相互穩定，這可能導致超螺旋結構。
術語「重複模組」是指重複序列蛋白的重複序列胺基酸序列，其衍生自天然存在的蛋白質的重複序列單元。重複序列結構域中包含的各個重複序列模組衍生自天然存在的重複序列蛋白家族的一或多個重複序列單元，例如錨蛋白重複序列蛋白。
術語「成組重複序列模組」是指重複序列結構域中存在的重複序列模組的總數。存在於重複序列結構域中的此類「成組重複序列模組」包含兩個或更多個連續的重複序列模組，並且可能僅包含兩個或更多個拷貝中的一種類型的重複序列模組，或者兩種或更多種不同類型的模組，每種模組以一或多個拷貝存在。這種包含例如3個重複序列模組的成組重複序列模組可能從N端到C端連續地包含重複序列模組1、重複序列模組2和重複序列模組3。
不同的重複序列結構域可能具有每個重複序列結構域相同數量的重複序列模組，或者每個重複序列結構域的重複序列模組數量可能不同。
較佳地，一組中所含的重複序列模組是同源重複序列模組。在本發明的上下文中，術語「同源重複序列模組」是指重複序列模組，其中該等重複序列模組中超過70%的框架殘基是同源的。較佳地，該等重複序列模組中超過80%的框架殘基是同源的。最佳地，該等重複序列模組中超過90%的框架殘基是同源的。確定多肽之間同源性百分率的電腦程式(諸如Fasta、Blast或Gap)是相關領域具有通常知識者已知的。
術語「重複序列單元」是指包含一或多種天然存在的蛋白質的序列模體的胺基酸序列，其中該等「重複序列單元」存在於多個拷貝中，並且其展現出所有該等模體共有的明確折疊拓樸學，其決定了蛋白質的折疊。此類重複序列單元包含框架殘基和交互作用殘基。
此類重複序列單元的一個實例是錨蛋白重複序列單元。含有兩個或更多此類重複序列單元的天然存在的蛋白質被稱為「天然存在的重複序列蛋白」。當彼此比較時，重複序列蛋白的各個重複序列單元的胺基酸序列可能具有大量突變、取代、添加及/或缺失，同時基本上仍保有重複序列單元的通用模式或模體。
術語「重複序列模體」或「重複共有序列」是指從一或多個重複序列單元推導而來的胺基酸序列。此類重複序列模體包含框架殘基位置和目標交互作用殘基位置。該等框架殘基位置對應於該等重複序列單元的框架殘基位置。該等目標交互作用殘基位置對應於該等重複序列單元的目標交互作用殘基位置。此類重複序列模體包含固定位置和隨機位置。術語「固定位置」是指重複序列模體中的胺基酸位置，其中該位置被設定為特定胺基酸。通常，此類固定位置對應於框架殘基的位置。
術語「隨機位置」是指重複序列模體中的胺基酸位置，其中在該胺基酸位置處允許有兩個或更多個胺基酸。通常，此類隨機位置對應於目標交互作用殘基的位置。然而，框架殘基的一些位置也可能是隨機的。
術語「折疊拓樸學」是指該等重複序列單元的三級結構。折疊拓樸學將由形成α-螺旋或β-褶片的至少部分的胺基酸延伸段、或形成線性多肽或環的胺基酸延伸段，或α-螺旋、β-褶片及/或線性多肽/環的任何組合來決定。
術語「連續」是指其中該等模組串聯排列的排列方式。
在重複序列蛋白中，有至少2個、通常6個或更多個、10個或更多個、或20個或更多個重複序列單元，通常約2至6個重複序列單元。大多數情況下，重複序列蛋白是結構蛋白及/或黏附蛋白，存在於原核生物和真核生物中，包括脊椎動物和非脊椎動物。
在大多數情況下，該等重複序列單元將展現出高度序列同一性(對應位置處的相同胺基酸殘基)或序列相似性(胺基酸殘基不同，但具有相似的理化性質)，且一些胺基酸殘基還可能是關鍵殘基，其在天然存在的蛋白質中所發現的不同重複序列單元中高度保守。
然而，只要維持共同的折疊拓樸學，在天然存在的蛋白質中發現的不同重複序列單元之間的胺基酸插入及/或缺失及/或取代所致的高度序列變異性將是可能的。
術語「框架殘基」是有關重複序列單元的胺基酸殘基或重複序列模組的對應胺基酸殘基，其有助於折疊拓樸學，即其有助於該等重複序列單元(或模組)的折疊或其有助於與相鄰單元(或模組)的交互作用。這種貢獻可能是與重複序列單元(模組)中其他殘基交互作用，或對α-螺旋或β-褶片或形成線性多肽或環的胺基酸延伸段中發現的多肽主鏈構形的影響。
術語「目標交互作用殘基」是指重複序列單元的胺基酸殘基，或重複序列模組的對應胺基酸殘基，其有助於與目標物質交互作用。這種貢獻可能是與目標物質的直接交互作用，或對其他直接交互作用的殘基的影響，例如藉由穩定該重複序列單元(模組)的(多)肽構形以允許或增強該等直接交互作用的殘基與該目標的交互作用。
「目標」可能是單獨的分子，諸如核酸分子、(多)肽蛋白質、醣類或任何其他天然存在的分子，包括此類單獨分子的任何部分，或兩個或更多此類分子的複合物。具體來說，目標可能是免疫效應細胞(特別是CD8)上的分子。
在一個實施例中，重複序列模組直接連接。在本發明的上下文中，術語「直接連接」是指重複序列模組，其在重複序列蛋白中排列為直接重複序列，而沒有插入的胺基酸序列。
在另一個實施例中，重複序列模組藉由(多)肽連接子連接。因此，重複序列模組可能經由(多)肽連接子作為分隔個別模組的插入序列間接連接。「插入序列」可能是任何胺基酸序列，其允許連接個別模組而不干擾模組的折疊拓樸學或堆疊。較佳地，該等插入序列是少於10個、甚至更佳少於5個胺基酸殘基的短(多)肽連接子。
在一個實施例中，重複序列蛋白進一步包含N端及/或C端加帽模組，其具有與該等重複序列模組中的任一者不同的胺基酸序列。術語「加帽模組」是指與重複序列結構域的N端或C端重複序列模組融合的多肽，其中該加帽模組與該重複序列模組形成緊密的三級交互作用，從而在不與連續重複序列模組接觸的一側將該重複序列模組的疏水核心與溶劑予以屏蔽。
該N端及/或C端加帽模組可能是或可能衍生自加帽單元或在與重複單元相鄰的天然存在的重複序列蛋白中發現到的其他結構域。
術語「加帽單元」是指天然存在的折疊(多)肽，其中該(多)肽界定在N-或C-端與重複序列單元融合的特定結構單元，其中該(多)肽與該重複序列單元形成緊密的三級交互作用，從而提供在一側將該重複序列單元的疏水核心與溶劑予以屏蔽的帽。此類加帽單元可能與該等重複序列模體具有序列相似性。 核酸
術語「核酸」包括去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、其組合，及其經修飾形式。該術語包括基因體DNA、cDNA、mRNA、重組產生的和化學合成的分子。在一些實施例中，核酸是DNA。在一些實施例中，核酸是RNA。在一些實施例中，核酸是DNA與RNA的混合物。核酸可能以單股或雙股與線性或共價環狀閉合分子存在。核酸可以是經分離的。根據本發明，術語「經分離的核酸」表示核酸(i)在活體外擴增，例如經由DNA聚合酶鏈反應(PCR)或活體外轉錄RNA (使用例如RNA聚合酶)、(ii)藉由選殖重組產生、(iii)例如藉由切割和凝膠電泳分離來純化，或(iv)例如透過化學合成來合成的。
術語「核苷」(本文縮寫為「N」)是有關可被認為是不具有磷酸根的核苷酸的化合物。雖然核苷是連接至糖(例如核糖或去氧核糖)的核鹼基，但核苷酸由核苷和一或多個磷酸根組成。核苷的實例包括胞苷、尿苷、假尿苷、腺苷和鳥苷。
通常組成天然存在的核酸的五種標準核苷是尿苷、腺苷、胸苷、胞苷和鳥苷。五種核苷通常分別縮寫為其單字母代碼U、A、T、C和G。然而，胸苷更常寫作為「dT」 (「d」代表「去氧」)，因為它含有2'-去氧呋喃核糖部分，而不是尿苷中的呋喃核糖環。這是因為胸苷存在於去氧核糖核酸(DNA)而不存在於核糖核酸(RNA)中。反之，尿苷存在於RNA而非DNA中。其餘三種核苷可能存在於RNA和DNA兩者中。在RNA中它們將表示為A、C和G，而在DNA中它們將表示為dA、dC和dG。
在一些實施例中，經修飾的嘌呤(A或G)或嘧啶(C、T或U)鹼基部分經一或多個烷基修飾，例如一或多個C 1-4烷基，例如一或多個甲基。經修飾的嘌呤或嘧啶鹼基部分的特定實例包括N 7-烷基-鳥嘌呤、N 6-烷基-腺嘌呤、5-烷基-胞嘧啶、5-烷基-尿嘧啶和N(1)-烷基-尿嘧啶，諸如N 7-C 1-4烷基-鳥嘌呤、N 6-C 1-4烷基-腺嘌呤、5-C 1-4烷基-胞嘧啶、5-C 1-4烷基-尿嘧啶和N(1)-C 1-4烷基-尿嘧啶，較佳地為N 7-甲基-鳥嘌呤、N 6-甲基-腺嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、5-甲基-尿嘧啶和N(1)-甲基-尿嘧啶。 DNA
在本文中，術語「DNA」是有關包括去氧核糖核苷酸殘基的核酸分子。在較佳實施例中，DNA含有全部或大部分去氧核糖核苷酸殘基。如本文所用，「去氧核糖核苷酸」是指在β-D-呋喃核糖基的2'-位置處缺乏羥基的核苷酸。DNA包括但不限於雙股DNA、單股DNA、經分離的DNA(諸如經部分純化的DNA)、基本上純的DNA、合成的DNA、重組產生的DNA，以及因為添加、缺失、取代及/或改變一或多個核苷酸而與天然存在的DNA有所差異的DNA。這種改變可能是指將非核苷酸材料添加到內部DNA核苷酸或DNA末端。本文也考量到DNA中的核苷酸可能是非標準核苷酸，諸如化學合成的核苷酸或核糖核苷酸。就本發明來說，這些經過改變的DNA被認為是天然存在的DNA的類似物。基於分子中的核苷酸殘基總數，如果分子中的去氧核糖核苷酸殘基含量大於50% (諸如至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%)，則該分子含有「大部分去氧核糖核苷酸殘基」。分子中的核苷酸殘基總數是所有核苷酸殘基的總和(無論核苷酸殘基是否為標準(即天然存在的)核苷酸殘基或其類似物)。
DNA可能是重組DNA並且可能透過選殖核酸(特別是cDNA)來獲得。cDNA可能透過逆轉錄RNA來獲得。
核酸可能包含在載體中。如本文所用，術語「載體」包括具有通常知識者已知的任何載體，包括質體載體、黏質體載體、噬菌體載體(諸如拉目達噬菌體)、病毒載體(諸如逆轉錄病毒、腺病毒或桿狀病毒載體)，或人工染色體載體(諸如細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)或P1人工染色體(PAC))。該等載體包括表現載體以及選殖載體。表現載體包含質體以及病毒載體，且通常含有所需的編碼序列，以及在特定宿主生物體(例如細菌、酵母、植物、昆蟲或哺乳動物)，或在活體外表現系統中表現可操作地連接的編碼序列必需的適當DNA序列。選殖載體通常用於改造和擴增某個所需DNA片段，並且可能缺乏表現所需DNA片段必要的功能序列。 RNA
術語「RNA」是有關包括核糖核苷酸殘基的核酸分子。在較佳實施例中，RNA含有全部或大部分核糖核苷酸殘基。如本文所用，「核糖核苷酸」是指在β-D-呋喃核糖基的2'-位置處帶有羥基的核苷酸。RNA含括但不限於雙股RNA、單股RNA、經分離的RNA(諸如經部分純化的RNA)、基本上純的RNA、合成的RNA、重組產生的RNA，以及因為添加、缺失、取代及/或改變一或多個核苷酸而與天然存在的RNA有所差異的經修飾的RNA。這種改變可能是指將非核苷酸材料添加到內部RNA核苷酸或RNA末端。本文也考量到RNA中的核苷酸可能是非標準核苷酸，諸如化學合成的核苷酸或去氧核糖核苷酸。就本發明來說，這些經過改變/修飾的核苷酸可被認為是天然存在的核苷酸的類似物，且含有此等經改變/經修飾核苷酸的對應RNA (即經改變/經修飾的RNA)可被認為是天然存在的RNA的類似物。基於分子中的核苷酸殘基總數，如果分子中的核糖核苷酸殘基含量大於50% (諸如至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%)，則該分子含有「大部分核糖核苷酸殘基」。分子中的核苷酸殘基總數是所有核苷酸殘基的總和(無論核苷酸殘基是否為標準(即天然存在的)核苷酸殘基或其類似物)。
「RNA」包括mRNA、tRNA、核醣體RNA (rRNA)、小核RNA (snRNA)、自我擴增RNA (saRNA)、反式擴增RNA (taRNA)、單股RNA (ssRNA)、dsRNA、抑制性RNA (諸如反義ssRNA、小干擾RNA (siRNA)或微RNA (miRNA))、活化RNA (諸如小活化RNA)和免疫刺激性RNA(isRNA)。在一些實施例中，「RNA」是指mRNA。
如本文所用，術語「活體外轉錄」或「IVT」表示以無細胞的方式進行轉錄(即生成RNA)。也就是說，IVT不使用活的/培養的細胞，而是使用從細胞提取而來的轉錄機器(例如，細胞溶胞產物或其經分離的組分，包括RNA聚合酶(較佳地T7、T3或SP6聚合酶))。
根據本發明，術語「RNA」包括「mRNA」。根據本發明，術語「mRNA」表示「信使-RNA」並包括可以藉由使用DNA模板生成的「轉錄本」。一般而言，mRNA編碼肽或多肽。
mRNA是單股的，但可能包含自我互補序列，自我互補序列允許部分mRNA折疊並與其自身配對形成雙螺旋。
根據本發明，「dsRNA」表示雙股RNA且是具有兩條部分或完全互補股的RNA。
在一些實施例中，較佳地編碼肽或多肽的mRNA具有至少45個核苷酸(諸如至少60個、至少90個、至少100個、至少200個、至少300個、至少400個、至少500個、至少600個、至少700個、至少800個、至少900個、至少1,000個、至少1,500個、至少2,000個、至少2,500個、至少3,000個、至少3,500個、至少4,000個、至少4,500個、至少5,000個、至少6,000個、至少7,000個、至少8,000個、至少9,000個核苷酸)，較佳地至多15,000個(諸如至多14,000個、至多13,000個、至多12,000個核苷酸，至多11,000個核苷酸或至多10,000個核苷酸)的長度。
如本技術領域中已確立的，mRNA通常含有5'非轉譯區(5'-UTR)、肽/多肽編碼區，和3'非轉譯區(3'-UTR)。在一些實施例中，RNA是藉由活體外轉錄或化學合成產生。在一個實施例中，mRNA是使用DNA模板藉由活體外轉錄產生。活體外轉錄方法是具有通常知識者已知的；參見例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4 thEdition, M.R. Green and J. Sambrook eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2012。此外，各種活體外轉錄套組可供商用，例如Thermo Fisher Scientific (諸如TranscriptAid TMT7套組、MEGAscript ®T7套組、MAXIscript ®)、New England BioLabs Inc. (諸如HiScribe™ T7套組、HiScribe™ T7 ARCA mRNA套組)、Promega (諸如RiboMAX™、HeLaScribe ®、Riboprobe ®系統)、Jena Bioscience (諸如SP6或T7轉錄套組)和Epicenter (諸如AmpliScribe™)。為了提供經修飾的mRNA，可以在合成(較佳地活體外轉錄)期間併入經對應修飾的核苷酸(諸如經修飾的天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸及/或經修飾的非天然存在的核苷酸)，或在轉錄後可以在mRNA中進行修飾，及/或將修飾添加至mRNA。
在一些實施例中，RNA是活體外轉錄的RNA (IVT-RNA)並且可藉由活體外轉錄合適的DNA模板而獲得。控制轉錄的啟動子可以是任何RNA聚合酶的任何啟動子。RNA聚合酶的具體實例是T7、T3和SP6 RNA聚合酶。較佳地，活體外轉錄受T7或SP6啟動子控制。用於活體外轉錄的DNA模板可藉由選殖核酸(特別是cDNA)，並將其引入用於活體外轉錄的適當載體中來獲得。cDNA可以藉由逆轉錄RNA來獲得。
在本發明的一些實施例中，RNA是「複製子RNA」或簡稱為「複製子」，特別是「自我複製RNA」或「自我擴增RNA」。在某些實施例中，複製子或自我複製RNA是衍生自或包含衍生自ssRNA病毒的元件，ssRNA病毒特別是正股ssRNA病毒，諸如阿伐病毒。阿伐病毒是正股RNA病毒的典型代表。阿伐病毒在受感染細胞的細胞質中複製(有關阿伐病毒生命週期的綜述，參見José et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856)。許多阿伐病毒的基因體總長度通常在11,000至12,000個核苷酸之間，且基因體RNA通常具有5'帽和3'聚(A)尾。阿伐病毒的基因體編碼非結構蛋白(參與病毒RNA的轉錄、修飾和複製以及蛋白質修飾)和結構蛋白(形成病毒顆粒)。基因體中通常有兩個開放讀框(ORF)。四個非結構蛋白(nsP1-nsP4)通常由從基因體5'端附近開始的第一個ORF一起編碼，而阿伐病毒結構蛋白由第二個ORF一起編碼，該第二個ORF位於第一個ORF下游並延伸到靠近基因體的3'端。通常，第一個ORF大於第二個ORF，比例約為2：1。在被阿伐病毒感染的細胞中，只有編碼非結構蛋白的核酸序列是從基因體RNA轉譯而來，而編碼結構蛋白的遺傳訊息是從亞基因體轉錄本轉譯而來，亞基因體轉錄本則是一種類似於真核生物信使RNA的RNA分子(mRNA；Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124)。感染後，即在病毒生命週期的早期階段，(+)股基因體RNA直接充當信使RNA，用於轉譯編碼非結構多蛋白(nsP1234)的開放讀框。
阿伐病毒衍生的載體已被提議用於將外來遺傳訊息傳遞到目標細胞或目標生物體中。在簡單的方法中，編碼阿伐病毒結構蛋白的開放讀框被編碼感興趣蛋白質的開放讀框替換。基於阿伐病毒的反式複製(反式擴增)系統仰賴於兩個各別核酸分子上的阿伐病毒核苷酸序列元件：一個核酸分子編碼病毒複製酶，而另一個核酸分子能夠被該複製酶反式複製(因此命名反式複製系統)。反式複製需要在給定宿主細胞中同時存在這兩種核酸分子。能夠被複製酶反式複製的核酸分子必須包含某些阿伐病毒序列元件以允許被阿伐病毒複製酶辨識和RNA合成。
在本發明的一些實施例中，本文所述的RNA (特別是mRNA)含有一或多種修飾，例如以便增加其穩定性及/或增加轉譯效率及/或降低免疫原性及/或降低細胞毒性。例如，為了增加RNA (特別是mRNA)的表現，可能在編碼區(即編碼所表現的肽或多肽的序列)內對其進行修飾，較佳地並未改變所表現的肽或多肽的序列。此類修飾描述於例如WO 2007/036366和PCT/EP2019/056502中，並包括以下：5'-帽結構；天然存在的聚(A)尾的延伸或截短；5'-及/或3'-非轉譯區(UTR)的改變，諸如引入與該RNA的編碼區不相關的UTR；用合成核苷酸替換一或多個天然存在的核苷酸；以及密碼子優化(例如改變，較佳地增加RNA的GC含量)。
在一些實施例中，本文所述的RNA (特別是mRNA)包含5'-帽結構。在一些實施例中，RNA不具有未加帽的5'-三磷酸。在一些實施例中，RNA (特別是mRNA)可能包含習知的5'-帽及/或5'-帽類似物。術語「習知5'-帽」是指在RNA分子的5'-端上發現的帽結構，並且通常包含鳥苷5'-三磷酸(Gppp)，其經由其三磷酸部分連接至RNA的下一個核苷酸的5'-端位置(即鳥苷經由5'至5'三磷酸鍵聯連接至RNA的其餘部分)。鳥苷可以在位置N 7處被甲基化(產生帽結構m 7Gppp)。術語「5'-帽類似物」包括基於習知5'-帽但已在m 7鳥苷結構的2'-或3'-位置處進行修飾的5'-帽，以避免5'-帽類似物以相反方向整合(此類5'-帽類似物也稱為抗反向帽類似物(ARCA))。尤佳的5'-帽類似物是在磷酸酯橋中的橋接和非橋接氧處具有一或多個取代者，諸如在β-磷酸酯處經硫代磷酸酯修飾的5'-帽類似物(諸如m 2 7,2'OG(5')ppSp(5')G (稱為β-S-ARCA或β-S-ARCA))，如PCT/EP2019/056502中所述。提供具有如本文所述的5'-帽結構的RNA (特別是mRNA)可能在相應的5'-帽化合物存在下透過活體外轉錄DNA模板來達到，其中該5'-帽結構是共轉錄地被併入到所生成的RNA (特別是mRNA)股中，或者可以例如透過活體外轉錄來生成RNA (特別是mRNA)，且5'-帽結構可能使用加帽酶(例如牛痘病毒的加帽酶)在轉錄後被附接至RNA。
在一些實施例中，RNA (特別是mRNA)包含選自由以下所組成之群組的5'-帽結構：m 2 7,2'OG(5’)ppSp(5')G (尤其是其D1非鏡像異構物)、m 2 7,3'OG(5')ppp(5')G，以及m 2 7,3'-OGppp(m 1 2'-O)ApG。
在一些實施例中，RNA (特別是mRNA)包含cap0、cap1或cap2，較佳地cap1或cap2。根據本發明，術語「cap0」表示結構「m 7GpppN」，其中N是在位置2'處帶有OH部分的任何核苷。根據本發明，術語「cap1」表示結構「m 7GpppNm」，其中Nm是在位置2'處帶有OCH 3部分的任何核苷。根據本發明，術語「cap2」表示結構「m 7GpppNmNm」，其中各個Nm獨立地是在位置2'處帶有OCH 3部分的任何核苷。
5'-帽類似物β-S-ARCA (β-S-ARCA)具有以下結構： 。
「β-S-ARCA的D1非鏡像異構物」或「β-S-ARCA(D1)」是與β-S-ARCA的D2非鏡像異構物(β-S-ARCA(D2))相比，在HPLC管柱上首先被溶析出來的β-S-ARCA非鏡像異構物，因此展現出較短的滯留時間。HPLC較佳地是分析型HPLC。在一些實施例中，使用Supelcosil LC-18-T RP管柱(較佳地為5 μm，4.6×250 mm形式)進行分離，可施用1.3 ml/min的流速。在一些實施例中，在15分鐘內使用甲醇在乙酸銨中的梯度，例如0-25%甲醇在0.05M乙酸銨中的線性梯度，pH=5.9。UV偵測(VWD)可以在260 nm下進行，而螢光偵測(FLD)可以在280 nm下激發並在337 nm下偵測。
5'-帽類似物m 2 7,3'-OGppp(m 1 2'-O)ApG (又稱為m 2 7,3'OG(5')ppp(5')m 2'-OApG)具有以下結構，其為cap1的結構單元： 。
包含β-S-ARCA和mRNA的例示性cap0 mRNA具有以下結構： 。
包含m 2 7,3'OG(5')ppp(5')G和mRNA的例示性cap0 mRNA具有以下結構： 。
包含m 2 7,3'-OGppp(m 1 2'-O)ApG和mRNA的例示性cap1 mRNA具有以下結構： 。
如本文所用，術語「聚-A尾」或「聚-A序列」是指腺苷酸殘基的不間斷或間斷序列，其通常位於RNA (尤其是mRNA)分子的3'端處。聚-A尾或聚-A序列是彼等具有通常知識者熟知的，並且可能在本文所述RNA (尤其是mRNA)中的3'-UTR之後。不間斷的聚-A尾以連續的腺苷酸殘基為特徵。在自然界中，不間斷的聚-A尾是典型的。本文揭示的RNA (尤其是mRNA)可具有在轉錄後透過非模板依賴性RNA聚合酶附接到RNA游離3'端的聚-A尾，或具有由DNA編碼並由模板依賴性RNA聚合酶轉錄的聚-A尾。
已經證明，約120個A核苷酸的聚-A尾對經轉染真核細胞中的RNA含量，以及從存在於聚-A尾的上游(5')的開放讀框轉譯而來的蛋白質含量具有有益影響(Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017)。
聚-A尾可能是任何長度。在一些實施例中，聚-A尾包含至少20個、至少30個、至少40個、至少80個或至少100個和至多500個、至多400個、至多300個、至多200個或至多150個A核苷酸，且特別是約120個A核酸，基本上由其組成或由其組成。在此上下文中，按聚-A尾中的核苷酸數量計，「基本上由…組成」表示聚-A尾中的大部分核苷酸，通常至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%是A核苷酸，但允許其餘的核苷酸是A核苷酸以外的核苷酸，諸如U核苷酸(尿苷酸)，G核苷酸(鳥苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在此上下文中，「由…組成」表示聚-A尾中的所有核苷酸，即按聚-A尾中核苷酸數量100%是A核苷酸。術語「A核苷酸」或「A」是指腺苷酸。
在一些實施例中，基於在與編碼股互補的股中包含重複dT核苷酸(去氧胸苷酸)的DNA模板，聚-A尾在RNA轉錄期間(例如活體外轉錄RNA的製備期間)被附接。編碼聚-A尾的DNA序列(編碼股)稱為聚(A)盒。
在一些實施例中，存在於DNA編碼股中的聚(A)盒基本上由dA核苷酸組成，但被四種核苷酸(dA、dC、dG和dT)的隨機序列打斷。這種隨機序列的長度可能是5到50、10到30，或10到20個核苷酸。這個盒揭示於WO 2016/005324 A1中，在此以引用的方式併入。WO 2016/005324 A1中揭示的任何聚(A)盒都可能用於本發明。含括基本上由dA核苷酸組成，但被具有四種核苷酸(dA、dC、dG、dT)的分布相同且長度為例如5至50個核苷酸的隨機序列中斷的聚(A)盒顯示在DNA層次上大腸桿菌內不斷增殖質體DNA，在RNA層次上仍與幫助RNA穩定性和轉譯效率有關的有益性質相關。因此，在一些實施例中，本文所述的RNA (尤其是mRNA)分子中所包含的聚-A尾基本上由A核苷酸組成，但被四種核苷酸(A、C、G、U)的隨機序列中斷。這種隨機序列的長度可能是5至50、10至30，或10至20個核苷酸。
在一些實施例中，聚(A)尾包含30個腺嘌呤核苷酸，隨後是70個腺嘌呤核苷酸，其中30個腺嘌呤核苷酸和70個腺嘌呤核苷酸被10個核苷酸的連接子序列分隔開。
在一些實施例中，除了A核苷酸以外，並沒有核苷酸在聚-A尾3'-端處側接聚-A尾，即聚-A尾在其3'-端未被A以外的核苷酸掩蔽或跟著。
在一些實施例中，聚-A尾可能包含至少20、至少30、至少40、至少80、或至少100和至多500、至多400、至多300、至多200，或至多150個核苷酸。在一些實施例中，聚-A尾可能基本上由至少20、至少30、至少40、至少80、或至少100和至多500、至多400、至多300、至多200，或至多150個核苷酸組成。在一些實施例中，聚-A尾可能由至少20、至少30、至少40、至少80、或至少100和至多500、至多400、至多300、至多200，或最多150個核苷酸組成。在一些實施例中，聚-A尾包含至少100個核苷酸。在一些實施例中，聚-A尾包含約150個核苷酸。在一些實施例中，聚-A尾包含約120個核苷酸。
在一些實施例中，本發明所述的RNA (尤其是mRNA)包含5'-UTR及/或3'-UTR。術語「非轉譯區」或「UTR」是有關DNA分子中被轉錄但未被轉譯成胺基酸序列的一個區域，或是RNA分子(諸如mRNA分子)中的對應區域。非轉譯區(UTR)可位於開放讀框的5' (上游) (5'-UTR)及/或開放讀框的3' (下游) (3'-UTR)。5'-UTR (若存在的話)位於5'端處，在蛋白質編碼區的起始密碼子上游。5'-UTR位於5'-帽 (若存在的話)的下游，例如與5'-帽直接相鄰。3'-UTR (若存在的話)位於3'端處，在蛋白質編碼區的終止密碼子下游，但術語「3'-UTR」通常不包括聚-A序列。因此，3'-UTR位於聚-A序列(若存在的話)的上游，例如與聚-A序列直接相鄰。將3'-UTR併入到RNA (較佳地mRNA)分子的3'-非轉譯區可以使得轉譯效率提高。協同效應可能透過併入兩個或更多個這樣的3'-UTR (其較佳地以頭尾相接方向排列；參見例Holtkamp et al., Blood 108, 4009-4017 (2006))而達到。3'-UTR對於它們所引入其中的RNA (例如mRNA)可能是自體的或異體的。在某些實施例中，3'-UTR衍生自球蛋白基因或mRNA，例如α2-球蛋白、α1-球蛋白或β-球蛋白(例如β-球蛋白，例如人類β-球蛋白)的基因或mRNA。例如，可以透過用衍生自球蛋白基因(諸如α2-球蛋白、α1-球蛋白、β-球蛋白，如β-球蛋白，例如人類β-球蛋白)的3'-UTR的一或多個(例如兩個)拷貝替換現有的3'-UTR或插入一或多個(例如兩個)拷貝的3'-UTR來修飾RNA(例如mRNA)。
在一些實施例中，5'-UTR是或包含經修飾的人類α-球蛋白5'-UTR。在一些實施例中，3'-UTR包含胺基端分裂強化子(AES)信使RNA的胺基末端增強子的第一序列，以及粒線體編碼的12S核醣體RNA的第二序列。
本文所述的RNA (特別是mRNA)可能具有經修飾的核糖核苷酸，以增加其穩定性及/或降低免疫原性及/或降低細胞毒性。例如，在一些實施例中，本文所述的RNA (特別是mRNA)中的尿苷(部分或完全，較佳地完全)被經修飾的核苷替換。在一些實施例中，經修飾的核苷是經修飾的尿苷。
在一些實施例中，替換尿苷的經修飾尿苷是選自由假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-尿苷(m5U)及其組合所組成之群組。
在一些實施例中，(部分或完全，較佳地完全)替換RNA中的尿苷的經修飾核苷可能是以下中的任一或多者：3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮雜-尿苷、6-氮雜-尿苷、2-硫代-5-氮雜-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羥基-尿苷(ho5U)、5-胺基烯丙基-尿苷、5-鹵代-尿苷(例如5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羥基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羥基甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-胺基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基胺基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基胺基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基胺基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-胺甲醯基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基胺基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸基甲基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸基甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-脫氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脫氮-假尿苷、二氫尿苷(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿苷、5-甲基-二氫尿苷(m5D)、2-硫代-二氫尿苷、2-硫代-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷(inm5U)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Um)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基胺基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、去氧胸苷、2'-F-阿拉伯糖-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿拉伯糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基胺基)尿苷，或本技術領域中已知的任何其他經修飾的尿苷。
受到假尿苷(部分或完全，較佳地完全替換尿苷)修飾的RNA (較佳地mRNA)在本文被稱為「經ψ-修飾的」，而術語「經m1ψ-修飾的」表示RNA (較佳地mRNA)含有N(1)-甲基假尿苷(部分或完全，較佳地完全替換尿苷)。此外，術語「經m5U修飾的」表示RNA (較佳地mRNA)含有5-甲基尿苷(部分或完全，較佳地完全替換尿苷)。與未修飾形式相比，此類經ψ-或m1ψ-或m5U-修飾的RNA通常展現出低免疫原性，因此在要避免或最小程度地誘導免疫反應的應用中是偏好的。在一些實施例中，RNA (較佳地mRNA)含有完全替換尿苷的N(1)-甲基假尿苷。
本發明中所述的RNA (特別是mRNA)的密碼子可能進一步被優化，例如增加RNA的GC含量及/或將感興趣之肽或多肽要被表現的細胞(或個體)中罕見的密碼子替換成該細胞(或個體)中常用的同義密碼子。在一些實施例中，由本發明中所述的RNA (特別是mRNA)編碼的胺基酸序列由密碼子經優化，及/或與野生型編碼序列相比其G/C含量增加的編碼序列編碼。這也包括其中編碼序列的一或多個序列區域是密碼子經優化，及/或與野生型編碼序列的對應序列區相比G/C含量增加的實施例。在一些實施例中，密碼子優化及/或G/C含量增加較佳地並不會改變編碼的胺基酸序列的序列。
術語「密碼子經優化的」是指改變核酸分子編碼區中的密碼子以反映宿主生物體的典型密碼子使用，較佳地並不會改變由核酸分子編碼的胺基酸序列。在本發明的上下文中，編碼區較佳地是密碼子經優化的，以便使用本文所述的RNA (特別是mRNA)在待治療的個體中進行優化表現。密碼子優化是基於發現到轉譯效率也受到細胞中tRNA出現的頻率不同所決定。因此，RNA (特別是mRNA)的序列可能受到修飾，使得頻繁出現的tRNA可用的密碼子被插入取代「罕見密碼子」。
在一些實施例中，與野生型RNA對應編碼序列的鳥苷/胞嘧啶(G/C)含量相比，本文所述的RNA (特別是mRNA)編碼區的G/C含量增加，其中與野生型RNA編碼的胺基酸序列相比，該RNA編碼的胺基酸序列較佳地並未受到修飾。RNA序列的這個修飾是基於要被轉譯的任何RNA區域的序列對於該RNA的效率轉譯很重要。G (鳥苷)/C (胞嘧啶)含量增加的序列比A (腺苷)/U (尿嘧啶)含量增加的序列更為穩定。關於幾個密碼子編碼同一個胺基酸(所謂的遺傳密碼簡併)，可以決定對穩定性最有利的密碼子(所謂的替代密碼子使用)。根據RNA編碼的胺基酸，與其野生型序列相比，RNA序列有多種修飾的可能性。特別地，含有A及/或U核苷酸的密碼子可以透過用其他密碼子取代這些密碼子而進行修飾，該等其他密碼子編碼相同的胺基酸但不含A及/或U或含有較低量的A及/或U核苷酸。
在不同實施例中，與野生型RNA編碼區的G/C含量相比，本文所述的RNA (特別是mRNA)的編碼區的G/C含量增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少55%，或甚至更多。
上述修飾(即併入5'-帽結構、併入聚-A序列、暴露聚-A序列、改變5'-及/或3'-UTR (諸如併入一或多個3'-UTR)、以合成核苷酸替換一或多個天然存在的核苷酸(例如以5-甲基胞苷替換胞苷及/或假尿苷(ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5U)替換尿苷)，以及密碼子優化)的組合對RNA (較佳地mRNA)的穩定性和轉譯效率提高有協同效應。因此，在一些實施例中，本發明中所述的RNA (特別是mRNA)含有至少兩種、至少三種、至少四種或全部五種上述修飾的組合，即(i)併入5'-帽結構、(ii)併入聚-A序列，暴露聚-A序列；(iii)改變5'-及/或3'-UTR (諸如併入一或多個3'-UTR)；(iv)以合成核苷酸替換一或多個天然存在的核苷酸(例如5-甲基胞苷替換胞苷及/或假尿苷(ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1ψ)或5-甲基尿苷(m5U)替換尿苷)，以及(v)密碼子優化。 顆粒
核酸(諸如RNA)可能與一或多種傳遞媒劑一起投予，該等傳遞媒劑保護核酸免於降解、最大限度地傳遞到中靶細胞並將暴露於脫靶細胞降至最低。此類傳遞媒劑可能複合或封裝核酸並包括一系列材料(包括聚合物、脂質及其混合物)。在一些實施例中，此類傳遞媒劑可能與核酸形成顆粒。
在本發明的上下文中，術語「顆粒」是有關由分子或分子複合物(特別是顆粒形成化合物)形成的結構化實體。在一些實施例中，顆粒是含有核酸的顆粒，諸如包含DNA、RNA或其混合物的顆粒。在一些實施例中，顆粒含有由一或多種類型的兩親性物質(例如兩親性脂質)製成的包膜(例如一或多層(layer或lamella))。在此上下文中，用語「兩親性物質」表示該物質具有親水性和親脂性。包膜也可能包含不必然是兩親性的額外物質(例如額外脂質)。因此，顆粒可能是單層或多層結構，其中構成一或多層的物質包含一或多種類型的兩親性物質(特別是選自由兩親性脂質所組成之群組)，視情況與不必然是兩親性的額外物質(例如額外脂質)組合。在一些實施例中，術語「顆粒」是有關微米或奈米尺寸的結構，諸如微米或奈米尺寸的緻密結構。根據本發明，術語「顆粒」包括奈米顆粒。
術語「奈米顆粒」是有關包含至少一種顆粒形成劑(例如至少一種陽離子或陽離子可電離脂質)的奈米尺寸顆粒，其中顆粒的所有三種外部維度均為奈米尺度，即至少約1 nm並低於約1000 nm。較佳地，顆粒的大小是其直徑。
在一些實施例中，本文所述的顆粒具有在約10至約2000 nm範圍內的大小(諸如直徑)，諸如在約20至約1500 nm (諸如約30至約1200 nm，約40至約1100 nm、約50至約1000 nm、約60至約900 nm、約70至約800 nm、約80至約700 nm、約90至約600 nm或約50至約500 nm)範圍內，或約100至約500 nm (諸如在10至1000 nm、15至500 nm、20至450 nm、25至400 nm、30至350 nm、40至300 nm、50至250 nm、60至200 nm、70至150 nm或80至150 nm)範圍內。在一些實施例中，本文所述的顆粒具有在約40 nm至約200 nm (諸如約50 nm至約180 nm、約60 nm至約160 nm、約80 nm至約150 nm或約80 nm至約120 nm)範圍內的大小。
本文所述的顆粒可能展現出小於約0.5、小於約0.4、小於約0.3、小於約0.2、小於約0.1或小於約0.05的多分散性指數(PDI)。舉例來說，顆粒可能展現出約0.01至約0.4或約0.1至約0.3範圍內的多分散性指數。
「核酸顆粒」可用於將核酸傳遞至感興趣的目標位點(例如細胞、組織、器官與類似者)。核酸顆粒可能由至少一種陽離子或陽離子可電離化合物形成，諸如與核酸複合的聚合物或脂質。在不希望受任何理論囿限的情況下，咸信陽離子或陽離子可電離化合物與核酸結合在一起形成聚集體，而這種聚集現象產生在膠態上穩定的顆粒。
在一些實施例中，核酸可能與顆粒非共價締合。在一些實施例中，核酸可能黏附至顆粒的外表面(表面核酸)及/或可能包含在顆粒中(封裝的核酸)。
N/P比提供脂質中氮基團與核酸中磷酸根數量的比值。它與電荷比相關，因為氮原子(取決於pH)通常帶正電，而磷酸根帶負電。當存在電荷平衡時，N/P比取決於pH。脂質調配物通常以大於四到至多十二的N/P比形成，因為帶正電的奈米顆粒被認為有利於轉染。在這種情況下，核酸被認為是完全結合到奈米顆粒。
術語「顆粒形成組分」或「顆粒形成劑」是有關例如藉由與核酸締合而形成顆粒的任何組分。本文可用的核酸傳遞媒劑(諸如顆粒形成劑)包括聚合物、聚合物衍生物、脂質及其混合物。此類組分包括可以是核酸顆粒一部分的任何組分，例如陽離子或陽離子可電離脂質。
如本文所用，「聚合物」具有其普通意義，即包含透過共價鍵連接的一或多個重複單元(單體)的分子結構。重複單元可以全部相同，或者在一些情況下聚合物內部存在超過一種類型的重複單元。在一些情況下，聚合物是生物衍生的，即生物聚合物(諸如蛋白質)。在一些情況下，聚合物中還可以存在額外部分，例如靶向部分。
如果聚合物內存在超過一種類型的重複單元，則該聚合物稱為「共聚物」。應理解，本文所採用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重複單元可以按任何方式排列。例如，重複單元可以按無規順序、按交替順序，或以「嵌段」共聚物排列，「嵌段」共聚物即包含一或多個各自包含第一重複單元(例如第一嵌段)的第一區域以及一或多個各自包含第二重複單元(例如第二嵌段)的一或多個區域。嵌段共聚物可以具有兩種(二嵌段共聚物)、三種(三嵌段共聚物)，或更多數量的不同嵌段。
在某些實施例中，聚合物是生物相容的。生物相容性聚合物是一種在適當濃度下通常不會導致顯著細胞死亡的聚合物。在某些實施例中，生物相容性聚合物是可生物降解的，即聚合物能夠在生理環境內(諸如在體內)以化學及/或生物方式降解。
在某些實施例中，聚合物可能是魚精蛋白或聚亞烷基亞胺。
術語「魚精蛋白」是指任何各種分子量相對較低的強鹼性蛋白，其富含精胺酸並且被發現尤其代替各種動物(如魚)精子細胞中的體細胞組蛋白與DNA締合。具體地，術語「魚精蛋白」是指在魚精子中發現的蛋白質，其為強鹼性、可溶於水、不因熱凝集、並且在水解時主要產生精胺酸。它們以經純化形式用於長效胰島素調配物中並用於中和肝素的抗凝血作用。
根據本發明，如本文所用的術語「魚精蛋白」表示包含從天然或生物來源獲得或衍生而來的任何魚精蛋白胺基酸序列，包括其片段和該胺基酸序列或其片段的多聚體形式，以及人工且專門為特定目的設計且不能從天然或生物來源中分離的(合成)多肽。
在一些實施例中，聚亞烷基亞胺包括聚乙烯亞胺及/或聚丙烯亞胺，較佳地聚乙烯亞胺。偏好的聚亞烷基亞胺是聚乙烯亞胺(PEI)。PEI的平均分子量較佳為0.75·10 2至10 7Da，較佳地1000至10 5Da，更佳地10000至40000 Da，更佳地15000至30000 Da，甚至更佳地20000至25000 Da。
根據本發明偏好的是線性聚亞烷基亞胺，例如線性聚乙烯亞胺(PEI)。
考慮到用於本文的陽離子聚合物(包括聚陽離子聚合物)包括能夠靜電結合核酸的任何陽離子聚合物。在一些實施例中，考慮到用於本文的陽離子聚合物包括核酸可與之締合的任何陽離子聚合物，例如藉由與核酸形成複合物或形成核酸封閉或封裝其中的囊泡。
本文所述的顆粒還可能包含陽離子聚合物以外的聚合物，即非陽離子聚合物及/或陰離子聚合物。陰離子聚合物與中性聚合物在本文中統稱為非陽離子聚合物。
在本發明的一些實施例中，本文所述的核酸(諸如RNA)可能存在於脂質複合物顆粒中。
脂質複合物(LPX)是大體上藉由將預形成的陽離子脂質脂質體與陰離子核酸混合而形成的靜電複合物。形成的脂質複合物具有獨特的分子內部排列，這是由於從脂質體結構轉變為緊湊的核酸脂質複合物所致。
通常，脂質複合物顆粒可透過將核酸添加至膠態脂質體分散液中來獲得。在一些實施例中，使用乙醇注射技術如下形成膠態脂質體分散液：在攪拌同時將包含脂質(諸如陽離子或陽離子可電離脂質)和額外脂質的乙醇溶液注射到水溶液中。
在一些實施例中，脂質體是自我封閉的單層或多層囊泡顆粒，其中層包含脂質雙層且封裝的內腔包含水相。使用脂質體形成奈米顆粒的先決條件是混合物中的脂質視需要能夠在所施加的水性環境中形成層狀(雙層)相。
在某些實施例中，核酸脂質複合物顆粒包括陽離子脂質和額外脂質兩者。在例示性實施例中，陽離子脂質是DOTMA而額外脂質是DOPE。
在一些實施例中，本文所述的核酸呈脂質奈米顆粒(LNP)的形式存在。
一般而言，脂質奈米顆粒可透過將水相中的核酸(例如RNA)與包含有機溶劑(諸如乙醇)的相中的脂質直接混合而獲得。在這種情況下，脂質或脂質混合物可用於顆粒形成，其在水中不會形成層狀(雙層)相。
LNP通常包含四種組分：陽離子可電離脂質、中性脂質(諸如磷脂)、類固醇(諸如膽固醇)和聚合物結合型脂質(諸如PEG-脂質)。
在一些實施例中，LNP包含40至60莫耳%、40至55莫耳%、45至55莫耳%，或45至50莫耳%的陽離子可電離脂質。
在一些實施例中，中性脂質以5至15莫耳%、7至13莫耳%，或9至11莫耳%範圍的濃度存在。
在一些實施例中，類固醇以30至50莫耳%、30至45莫耳%、35至45莫耳%，或35至43莫耳%範圍的濃度存在。
在一些實施例中，LNP包含1至10莫耳%、1至5莫耳%，或1至2.5莫耳%的聚合物結合型脂質。
在一些實施例中，LNP包含45至55莫耳%的陽離子可電離脂質；5至15莫耳%的中性脂質；30至45莫耳%的類固醇；1至5莫耳%的聚合物結合型脂質；以及核酸，封裝在脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒締合。
在一些實施例中，莫耳百分率是基於脂質奈米顆粒中存在的脂質的總莫耳來決定。在一些實施例中，莫耳百分率是基於脂質奈米顆粒中存在的陽離子可電離脂質、中性脂質、類固醇和聚合物結合型脂質的總莫耳來決定。
在一些實施例中，中性脂質選自由DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE及SM所組成之群組。在一些實施例中，中性脂質選自由DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE及SM所組成之群組。在一些實施例中，中性脂質是DSPC。
在一些實施例中，類固醇是膽固醇。
在一些實施例中，聚合物結合型脂質是聚乙二醇化脂質。
在一些實施例中，LNP的陽離子可電離脂質組分具有以下結構中之一者：
編號 結構
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
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醫藥組成物
本文所述的藥劑(例如標籤接合物、對接化合物、包含標籤接合物與對接化合物的複合物，以及編碼對接化合物的核酸)可能呈醫藥組成物投予，且可能呈任何適當醫藥組成物的形式投予。因此，本文描述包含本文所述藥劑(例如標籤接合物、對接化合物、包含標籤接合物與對接化合物的複合物，以及編碼對接化合物的核酸)的醫藥組成物。
在一些實施例中，本文所述的藥劑可能呈醫藥組成物投予，該醫藥組成物可能包含醫藥上可接受的載劑並且可能視情況包含一或多種穩定劑等。在一些實施例中，醫藥組成物用於治療性或防治性治療，例如用於治療或預防疾病。
術語「醫藥組成物」是有關一種包含治療有效藥劑的調配物，較佳連同醫藥上可接受的載劑、稀釋劑及/或賦形劑。藉由將醫藥組成物投予給個體，該醫藥組成物可用於治療、預防或降低疾病或病症的嚴重程度。醫藥組成物在本技術領域中也稱為醫藥調配物。
根據本發明的醫藥組成物通常以「醫藥有效量」並呈「醫藥上可接受的製劑」施用。
術語「醫藥上可接受的」是指材料的無毒性，該材料不與醫藥組成物的活性成分的作用交互作用。
術語「醫藥有效量」或「治療有效量」是指單獨或與更多劑量及/或藥劑一起達到期望反應或期望效應之量。在治療特定疾病的情況下，期望反應較佳地是有關抑制疾病的進程。這包含減緩疾病的進程，特別是中斷或逆轉疾病的進程。治療疾病時所期望的反應也可能是延遲該疾病或該病況的發作或預防該疾病或該病況的發作。本文所述組成物的有效量將取決於待治療的病況、疾病的嚴重程度、患者的個別參數(包括年齡、生理狀況、身材和體重)、治療持續時間、伴隨療法(若有的話)的類型、特定投藥路徑和類似因素。因此，本文所述組成物的投藥劑量可取決於各種此類參數。在患者對初始劑量反應不足的情況下，可以使用更高的劑量(或藉由不同的、更為局部的投藥路徑達到有效更高的劑量)。
本發明的醫藥組成物可能含有鹽、緩衝劑、防腐劑和視情況選用的其他治療劑。在一個實施例中，本發明的醫藥組成物包含一或多種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑及/或賦形劑。
用於本發明醫藥組成物中的合適防腐劑包括但不限於氯化苯二甲烴銨(benzalkonium chloride)、氯丁醇、對羥基苯甲酸酯和硫柳汞。
如本文所用，術語「賦形劑」是指可能存在於本發明醫藥組成物中，但並非活性成分的物質。賦形劑的實例包括但不限於載體、黏合劑、稀釋劑、潤滑劑、增稠劑、表面活性劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、緩衝劑、調味劑或著色劑。
術語「稀釋劑」是有關於一種稀釋劑及/或稀化劑。此外，術語「稀釋劑」包括流體、液體或固體懸浮劑及/或混合介質中的任何一或多者。適當稀釋劑的實例包括乙醇、甘油和水。
術語「載劑」是指可能是天然的、合成的、有機的、無機的組分，其中結合了活性組分以促進、提高或能夠投予醫藥組成物。如本文所用的載劑可能是一或多種適合投予給個體的相容性固體或液體填充劑、稀釋劑或封裝物質。合適的載體包括但不限於無菌水、Ringer、Ringer乳酸、無菌氯化鈉溶液、等滲鹽水、聚亞烷基二醇、氫化萘，尤其是生物相容性乳酸交酯聚合物、乳酸交酯/乙醇酸交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一個實施例中，本發明的醫藥組成物包括等滲鹽水。
供治療使用的醫藥上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑是醫藥技術領域中眾所周知的，並且描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)中。
醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑可以根據預期的投藥路徑和標準醫藥實務進行挑選。
在一個實施例中，本文所述的醫藥組成物可以靜脈內、動脈內、皮下，皮內或肌肉內投予。在某些實施例中，醫藥組成物經配製供局部投藥或全身性投藥。全身性投藥可能包括經腸投藥(涉及透過胃腸道吸收)，或非經腸投藥。如本文所用，「非經腸投藥」是指以透過胃腸道以外的任何方式投藥，諸如透過靜脈內注射。在一些實施例中，醫藥組成物經配製供全身性投藥。例如用於靜脈內投藥。 治療
本文所述的藥劑、組成物和方法可以用於治療患有疾病的個體，疾病為例如特徵在於存在表現某一種抗原的病變細胞的疾病。本文所述的藥劑、組成物和方法可以用於各種疾病的治療性或防治性治療。尤佳的疾病是癌症疾病。在一些實施例中，本文所述的藥劑、組成物和方法可用於涉及某一抗原的疾病的防治性及/或治療性治療。
例如，如果抗原衍生自病毒，則該等藥劑、組成物和方法可用於治療該病毒引起的病毒性疾病。如果抗原是腫瘤抗原，則該等藥劑、組成物和方法可用於治療其中癌細胞表現該腫瘤抗原的癌症疾病。
術語「疾病」是指影響個體身體的異常病況。疾病通常被解釋為一種與特定症狀和徵象有關的醫學病況。疾病可能原本是由外部來源的因素引起的(諸如傳染病)，也可能是由內部功能障礙引起的(諸如自體免疫疾病)。在人類中，「疾病」通常更廣泛地用於指導致罹病個體的疼痛、功能障礙、痛苦、社會問題或死亡的任何病況，或對與該個體接觸的人造成類似問題的任何病況。在這個更廣泛的意義上，它有時包括傷害、殘疾、病症、症候群、感染、孤立症狀、異常行為以及結構和功能的非典型變化，而在其他情況下和出於其他目的，這些可能被視為可區分的類別。疾病通常不只會影響個體的身體，還會影響個體的情緒，因為罹患疾病以及與許多疾病共存會改變一個人對生命的看法和一個人的個性。
在本發明上下文中，術語「治療(treatment、treating)」或「治療性干預」是有關出於對抗病況(諸如疾病或病症)為目的而管理和照護個體。該術語意欲納入針對個體所罹患之給定病況的廣泛治療，諸如投予治療有效化合物以減輕症狀或併發症、延遲疾病、病症或病況的進程、減輕或緩解症狀和併發症，及/或治癒或消除疾病、病症或病況以及預防病況，其中預防要理解成為了對抗疾病、病況或病症而對個體進行管理和照護，並且包括投予活性化合物以預防症狀或併發症的發作。
術語「治療性治療」是有關改善健康狀況及/或延長(增加)個體壽命的任何治療。該治療可能消除個體的疾病、阻止或減緩個體的疾病發展、抑制或減緩個體的疾病發展、降低個體症狀的頻率或嚴重程度，及/或降低在目前或以前已患有疾病的個體中復發。
術語「防治性治療」或「預防性治療」是有關希望防止個體發生疾病的任何治療。術語「防治性治療」或「預防性治療」在本文中可交替使用。
術語「個體(individual)」和「個體(subject)」在本文中可交替使用。它們是指可能患有或易患有疾病或病症(例如癌症)，但可能有或可能沒有疾病或病症的人類或另一種哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物)。在許多實施例中，個體是人類。除非另有說明，否則術語「個體(individual和subject)」不表示特定年齡，因此含括成人、老人、兒童和新生兒。在本發明的實施例中，「個體(individual或subject)」是「患者」。
術語「患者」表示進行治療的個體(individual或subject)，特別是罹病的個體(individual或subject)。
在本發明的一些實施例中，目的是將可偵測標記傳遞至表現某一抗原的病變細胞(諸如表現腫瘤抗原的癌細胞)，以及診斷疾病(諸如癌症疾病，涉及表現諸如腫瘤抗原之抗原的細胞)。
在本發明的一些實施例中，目的是將醫藥活性劑傳遞至表現某一抗原的病變細胞(諸如表現腫瘤抗原的癌細胞)，以及治療疾病(諸如癌症疾病，涉及表現諸如腫瘤抗原之抗原的細胞)。
在本發明的一些實施例中，目的是將產生殺死或損害細胞的輻射(例如電離輻射，例如放射性核種和放射性標記)的化合物傳遞至表現某一抗原的病變細胞(諸如表現腫瘤抗原的癌細胞)，以及治療疾病(諸如癌症疾病，涉及表現諸如腫瘤抗原之抗原的細胞)。
在本發明的一些實施例中，目的是將負載(例如免疫調節劑)傳遞至免疫細胞以調節(例如誘導或增強)免疫細胞的發育、引發、擴增、分化及/或存活。在一些實施例中，免疫細胞可能靶向表現某一抗原的病變細胞(諸如表現腫瘤抗原的癌細胞)，以供治療疾病(諸如癌症疾病，涉及表現諸如腫瘤抗原之抗原的細胞)。在一些實施例中，免疫細胞對病變細胞發揮一或多種免疫效應功能，例如透過細胞性免疫反應殺死病變細胞。
術語「涉及某一抗原的疾病」或「涉及表現某一抗原之細胞的疾病」或類似術語是指涉及某一抗原的任何疾病，例如特徵為存在某一抗原的疾病。涉及某一抗原的疾病可以是傳染病，或癌症疾病或簡單說癌症。如上所述，抗原可能是疾病相關抗原(諸如腫瘤相關抗原)、病毒抗原，或細菌抗原。在一些實施例中，涉及某一抗原的疾病是涉及(較佳地在細胞表面上)表現某一抗原之細胞的疾病。
術語「傳染病」是指可以從個體傳播到個體或從生物體傳播到生物體並且是由微生物病原體引起的任何疾病(例如普通感冒)。傳染病是本領域已知的並且包括例如病毒性疾病、細菌性疾病或寄生蟲性疾病，這些疾病分別由病毒、細菌和寄生蟲引起。在這方面，傳染病可以是例如肝炎、性傳染病(例如披衣菌或淋病)、結核病、HIV/後天免疫缺乏症候群(AIDS)、白喉、B型肝炎、C型肝炎、霍亂、嚴重急性呼吸道疾病症候群(SARS)、禽流感，和流感。
術語「癌症疾病」或「癌症」是指或描述個體的生理狀況，其通常以細胞生長不受控制為特徵。癌症的實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病。更具體地，此類癌症的實例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、結腸癌、乳癌、攝護腺癌、子宮癌、性器官和生殖器官癌瘤、霍奇金病、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、膀胱癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、神經外胚層癌、脊軸腫瘤、神經膠質瘤、腦膜瘤和垂體腺瘤。根據本發明，術語「癌症」還包括癌症轉移。
如本文所用，術語「實體腫瘤」或「實體癌」是指癌性團塊(cancerous mass)的表現，如本領域(例如哈里森內科醫學原理，第14版)中所熟知的。較佳地，該術語指除血液以外的身體組織的癌症或癌瘤，較佳血液、骨髓和淋巴系統以外的身體組織的癌症或癌瘤。例如，實體腫瘤包括但不限於攝護腺癌、肺癌、結腸直腸組織癌、膀胱癌、口咽/喉組織癌、腎癌、乳癌、子宮內膜癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃癌、胰臟癌、腦癌和中樞神經系統癌。
本文所述的方法和藥劑特別可用於治療癌症，例如實體癌，其特徵在於病變細胞表現對接化合物引導至其的抗原。
在此引用的文件和研究並非是要承認上述任何一項是相關的先前技藝。關於這些文件內容的所有聲明均是基於申請人可獲得的資訊，並不構成對這些文件內容正確性的任何承認。
提供以下說明以使具有通常知識者能夠製造和使用各種實施例。對特定設備、技術和應用的說明僅作為實例提供。在此描述對實例的各種修改對本領域具有通常知識者來說將是顯而易見的，並且在不偏離各種實施例的精神和範疇的情況下，此處定義的一般性原則可適用於其他實例和應用。因此，各種實施例不希望受限於本文描述和示出的實例，而是符合與申請專利範圍一致的範疇。 縮寫
本申請案中可能出現的一些縮寫定義如下：
縮寫 含義
Ac 乙醯基
AcOH 乙酸
Aq. 水性
Atm. 大氣
Boc 三級-丁氧基羰基
BSA 牛血清白蛋白
conc. 濃
DCM 二氯甲烷
DIAD 偶氮二甲酸二異丙酯
DIBAL-D 二異丁基氘化鋁
DIPEA N, N-二異丙基乙胺
DMF N, N-二甲基甲醯胺
DMA N,N-二甲基乙醯胺
DMAP 4-二甲基胺基吡啶
DME 1,2-二甲氧基乙烷
DMF N,N-二甲基甲醯胺
dppf 1,1-雙(二苯基膦)二茂鐵
DMSO 二甲亞碸
DTT 二硫蘇糖醇
EC 50 半最大有效濃度
EDC.HCl 1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽
EDTA 乙二胺四乙酸
ELISA 酶聯免疫吸附分析
ELSD 蒸發光散射偵測器
eq. 當量
EtOAc, AcOEt 乙酸乙酯
FA 甲酸
FCC 急驟管柱層析術(Flash column chromatography)
h 小時
HATU 1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1 H-1,2,3-三唑並[4,5-b]吡錠3-氧化六氟磷酸鹽
HOBt 1-羥基苯並三唑
HOAt 1-羥基-7-氮雜苯並三唑
IC 50 半最大抑制濃度
LC, HPLC 高效液相層析術
LC MS, LCMS, LC-MS or LC/MS 偶聯至質譜術的高效液相層析術
Min. 分
NMP 1-甲基-2-吡咯啶
No. 編號
μW 微波
PBS 磷酸鹽緩衝鹽水
Prep HPLC 製備型HPLC
Py 吡啶
RM 反應混合物
RT 室溫
Rt 滯留時間
RV 反應容器
s 秒
sat. 飽和
SM 起始材料
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氫呋喃
TLC 薄層層析術
TRIS 參(羥基甲基)胺基甲烷
Trt 三苯甲基(三苯基甲基)
Tween 20 聚氧乙烯(20)單月桂酸去水山梨醇酯
UPLC 超高效液相層析術
UPLC-MS 偶聯至質譜術的超高效液相層析術
WT 野生型
實例 實例 1 - 雙 ALFA 接合物的實例與合成
以下說明例示性雙ALFA接合物(標籤接合物)和製備這些接合物的方法。
實例 ( 通用結構 ) 結構
EX-001 (1A)
EX-002 (1A)
EX-003 (1A)
EX-004 (2A)
EX-005 (3A)
EX-006 (2A)
EX-007 (2A)
EX-008 (2A)
EX-009 (1B)
EX-010 (1B)
EX-011 (1B)
EX-012 (1B)
EX-013 (1B)
EX-014 (3B)
EX-015 (4B)
EX-016 (3B)
EX-017 (3B)
EX-018 (1B)
EX-019 (3B)
EX-020 (4B)
EX-021 (4B)
EX-022 (3B)
EX-023 (2B)
EX-024 (1A)
EX-025 (1A)
EX-026 (1A)
EX-027 (2A)
EX-028 (3A)
EX-029 (2A)
EX-030 (2A)
EX-031 (2A)
EX-032 (1B)
EX-033 (2B)
EX-034 (3B)
EX-035 (4B)
EX-036
EX-037
EX-038
EX-039 (T5A)
EX-040 (T3A)
EX-041 (T3A)
EX-042 (T3A)
EX-043 (T3A)  
EX-044 (T3A)
EX-045 (T3A)
EX-046 (T3A)
EX-047 (T3A)
EX-048 (T3A)
EX-049 (T3A)
EX-050 (T3A)
EX-051 (T3A)
EX-052 (T3A)
EX-053 (T3A)
EX-054 (T3A)
EX-055 (T3A)
EX-056 (T3A)
EX-057 (T3A)
EX-058 (T5A)
實例 MS 數據 UPLC 純度 (%)
EX-001 分子量 4535.12 實驗值 4535.2 93
EX-002 分子量 5115.8 實驗值 5116.0 99
EX-003 分子量 5696.8 實驗值 5697.0 99
EX-004 分子量 4865.52 實驗值 4865.6 98
EX-005 分子量 5929.77 實驗值 5930.75 96
EX-006 分子量 5591.31 實驗值 5592.06 96
EX-007 分子量 4837.47 實驗值 4837.6 94
EX-008 分子量 5059.8 實驗值 5060.15 98
EX-009 分子量 5911.61 實驗值 5912.15 98
EX-010
EX-011 分子量 6936.72 實驗值 6936.32 98
EX-012
EX-013
EX-014
EX-015 分子量 10666.72 實驗值 10666.5 94
EX-016
EX-017
EX-018
EX-019
EX-020
EX-021
EX-022
EX-023
EX-024 分子量 4545.2 實驗值 4545.6 99
EX-025 分子量 5125.85 實驗值 5126.5 100
EX-026 分子量 5706.48 實驗值 5707.05 96
EX-027 分子量 4875.6 實驗值 4876 99
EX-028 分子量 5939.87 實驗值 5940.9 98
EX-029 分子量 5601.41 實驗值 5602.85 99
EX-030 分子量 4847.57 實驗值 4848 98
EX-031 分子量 5069.86 實驗值 5070.45 77
EX-032
EX-033
EX-034
EX-035
EX-036 分子量 4774.37 實驗值 4774.72 95%
EX-037 分子量 5804.44 實驗值 5806.25 91%
EX-038 分子量 6026.73 實驗值 6028.65 92%
材料與方法
所有無水溶劑均由商業供應商(例如Sigma-Aldrich ®)提供，裝在適當的容器(例如Sure/Seal TM瓶)中，並且無需進一步純化即可使用。
除非另有指明，否則所有起始材料均從商業供應商獲得且無需進一步純化即可使用。除非另有指明，否則所有溫度均以℃表示，且所有反應均在RT下進行。除非另有指明，否則化合物是藉由急驟管柱層析術(FCC)、製備型HPLC或製備型手性HPLC純化。除非另有指明，否則矽膠(平均粒度為50 mm)是用於急驟管柱層析術純化的固定相。
分析方法：
UHPLC-MS儀器與方法
儀器：Waters H-Class UPLC，配備有QSM、樣品組織器、管柱加熱器、PDA UV偵測器和QDa質譜儀。
儀器：Thermo Vanquish UHPLC，配備有管柱加熱器、UV偵測器和LTQ (線性離子阱)質譜儀
管柱： Waters BEH C 18 Column ， 100 x 2.1 mm ， 1.7 µm ， 130 Å 孔徑
40℃管柱溫度。UV吸收波長：214 nm。MS範圍：200-1250 Da。流動相A：0.100% TFA於水中。流動相B：0.085% TFA於乙腈中。流速：0.5 mL/min。梯度：
時間(min) % B
0.0 10
8.0 80
8.1 90
9.0 90
9.1 10
11.0 10
管柱： ACQUITY UPLC Protein BEH C4 Column ， 300 Å ， 1.7 µm ， 2.1 mm X 100 mm
Lcms_long_C4方法：40℃管柱溫度。UV吸收波長：214 nm。MS範圍：200-1250 Da。流動相A：0.1% TFA於水中。流動相B：0.085% TFA於乙腈中。流速：0.5 mL/min。梯度：
時間(min) % B
0.0 10
8.0 80
8.1 90
9.0 90
9.1 10
11.0 10
HPLC儀器與方法
儀器：Waters 2767 Autopure，配備有SQD2質譜儀和UV偵測器。質譜儀範圍：200-3000 Da。UV偵測器波長：214 nm。
管柱： Waters XBridge Protein BEH C4 OBD Prep Column ， 100 x 19 mm ，粒度 5 µm ，孔徑 300 Å。
方法：15 mL/min流速。流動相A：0.05% TFA於水中。流動相B：0.05% TFA於乙腈中。以5% B加載樣品，使用線性梯度進行溶析。
管柱： Phenomenex Luna 18 Column ， 250 x 30 mm ，粒度 10 µm ，孔徑 100 Å。
方法：30 mL/min流速。流動相A：0.05% TFA於水中。流動相B：0.05% TFA於乙腈中。以5% B加載樣品，使用線性梯度進行溶析： 通用示意圖 A ：合成環狀 ALFA 中間體
步驟 1 ：合成環狀 ALFA 肽中間體， Int-A-001 ：
環狀ALFA肽中間體是使用Fmoc固相肽合成化學進行合成。將懸浮在10 mL的1：1二氯甲烷/二甲基甲醯胺(DCM：DMF)中的Rink醯胺AM樹脂加載到自動肽合成儀上，用於預溶脹和樹脂轉移。使用4 mL於DMF中的20%哌啶(在90℃下藉由微波加熱3 min)對N端α Fmoc保護基進行去保護以啟動肽合成。瀝乾後，用5mL DMF將樹脂洗滌三次，每次洗滌五秒。然後透過添加2.5 mL下一個於DMF中的0.3 M胺基酸(7.5當量)、1 mL於DMF中的1 M DIC(10當量)溶液和0.5 mL於DMF中的1 M Oxyma (5當量)連同0.1M二異丙基乙胺(DIEA)溶液至反應容器(RV)中進行偶聯反應。將偶聯反應加熱至90℃歷時2 min。瀝乾反應溶液，並重複偶聯反應。第二次偶聯後，將樹脂瀝乾並用4 mL DMF洗滌四次。然後將4 mL於DMF中的20%哌啶加入RV，以脫除Fmoc基團的保護，並偶聯下一個胺基酸。對每個胺基酸依序重複Fmoc去除和偶聯的循環。Fmoc-Glu(O-2-PhiPr)-OH和Fmoc-Lys(Mmt)-OH胺基酸被併入肽中間體序列中以允許選擇性環化。
步驟 2 ：對 Lys(Mmt) 和 Glu(O-2-PhiPr) 選擇性去保護， Int-A-002
在燒結注射器中向含有Int-A-001的樹脂添加5 mL部分去保護混合物(2% TFA、2% TIS於DCM中)。將反應攪拌5 min，然後經由過濾從樹脂移除去保護混合物。加入另外5 mL部分去保護混合物，攪拌5 min，然後移除。重複這個過程六次，直到流出液的黃色/橙色消失(Mmt和2-PhiPr移除總共30 min)。用DCM和DMF徹底沖洗樹脂以得到Int-A-002。
步驟 3 ：經由側鏈醯胺鍵形成進行內醯胺環化， Int-A-003
環化在與步驟2的部分去保護相同的燒結注射器中進行。5當量的PyAOP與5當量的HOAt以DMF中的溶液被添加至注射器。讓樹脂膨脹，然後添加10當量DIEA。將反應攪拌歷時2至3小時。經由過濾從樹脂中移除反應混合物，並用DCM和DMF徹底沖洗剩餘的樹脂，得到Int-A-003。
步驟 4 ：溴乙醯胺偶聯， Int-A-004
在燒結注射器中向含有Int-A-003的樹脂加入7 mL於DMF中的20%哌啶。將反應攪拌10 min，然後用DCM和DMF徹底沖洗。接著將於7 mL DMF中的DIC (3當量)、Oxyma (3當量)和溴乙酸(3當量)加入樹脂。30 min後，用DCM和DMF徹底洗滌樹脂，得到Int-A-004。
步驟 5 ：切割和整體去保護， Int-A-005
在燒結注射器中向含有Int-A-004的樹脂加入10 mL切割混合物(87.5% TFA、5%大茴香硫醚、2.5%水、2.5% TIS、2.5% EDT)。將反應在室溫下攪拌歷時2 h，然後在40℃下攪拌歷時1 h。接著，藉由將反應溶液添加至~25mL冷乙醚中，然後離心，將所得肽中間體從溶液中沉澱出來。移除上清液，並將所得沉澱物重新溶解於50：50的MeCN：水中。藉由RP HPLC純化所得的粗製肽中間體，得到Int-A-005。 通用示意圖 B ：合成具有通用結構 1A 的雙 ALFA-DOTA 接合物
步驟 1 ：合成 DOTA-AEEA-dCys-AEEA-AEEA- 環狀 ALFA 中間體， Int-B-001 ：
使用與合成Int-A-005類似的方案，藉由使用Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-參乙酸三級丁酯-10-乙酸(DOTA-參(三級丁酯))來合成含有DOTA的環狀ALFA肽中間體。關於這個中間體，DOTA-參(三級丁酯)取代溴乙酸偶聯至N端。
步驟 2 ：合成溴乙醯胺 -AEEA-AEEA- 環狀 ALFA 中間體 Int-B-002 ：
使用與合成Int-A-005類似的方案，藉由使用Fmoc-AEEA-OH來合成含有溴乙醯胺的環狀ALFA中間體。
步驟 3 ：硫醇結合， EX-001 ：
向含有DOTA的中間體Int-B-001 (1當量)和含有環狀ALFA的中間體Int-B-002 (2.1當量)在1：1：1水：DMF：MeCN的溶液加入10當量DIEA。將反應混合物在室溫下攪拌10 min。之後藉由RP HPLC純化反應，並將級分凍乾而得到白色粉末狀的EX-001。
EX-002 ：以與EX-001類似的方式合成標題化合物。
EX-003 ：以與EX-001類似的方式合成標題化合物。
EX-024 ：以與EX-001類似的方式，透過使用Fmoc-Lys(生物素)-OH並以乙酸酐將N端加帽合成標題化合物。
EX-025 ：以與EX-001類似的方式，透過使用Fmoc-Lys(生物素)-OH並以乙酸酐將N端加帽合成標題化合物。
EX-026 ：以與EX-001類似的方式，透過使用Fmoc-Lys(生物素)-OH並以乙酸酐將N端加帽合成標題化合物。 通用示意圖 C ：合成含 DOTA 中間體
步驟 1 ，合成 dCys(Trt)-AEEA-AEEA-Lys(ivDde)-AEEA-AEEA-dCys(Trt) 中間體， Int-C-001 ：
含有半胱胺酸的中間體是使用Fmoc固相肽合成化學進行合成。將懸浮在10 mL的1：1二氯甲烷/二甲基甲醯胺(DCM：DMF)中的Rink醯胺AM樹脂加載到自動肽合成儀上，用於預溶脹和樹脂轉移。使用4 mL於DMF中的20%哌啶(在50℃下藉由微波加熱3 min)對N端α Fmoc保護基進行去保護以啟動肽合成。瀝乾後，用5 mL DMF將樹脂洗滌三次，每次洗滌五秒。然後透過添加2.5 mL下一個於DMF中的0.3 M胺基酸(7.5當量)、1 mL於DMF中的1 M DIC (10當量)和0.5 mL於DMF中的1 M Oxyma (5當量)連同0.1 M二異丙基乙胺(DIEA)溶液至反應容器(RV)中進行偶聯反應。將偶聯反應加熱至60℃歷時10 min。瀝乾反應溶液，並重複偶聯反應。第二次偶聯後，將樹脂瀝乾並用4 mL DMF洗滌四次。接著將4 mL於DMF中的20%哌啶加入RV，以脫除Fmoc基團的保護，並偶聯下一個胺基酸。對每個胺基酸依序重複Fmoc移除和偶聯的循環。
步驟 2 ， N 端乙醯化， Int-C-002 ：
固相肽合成完成後，將含有半胱胺酸的樹脂Int-C-001轉移至20 mL燒結注射器中。向樹脂加入7 mL加帽溶液(81.25% DMF、12.5% 2 M DIEA於NMP中、6.25%乙酸酐)，並將反應攪拌15 min。移除加帽溶液，又再加入7 mL加帽溶液，並將反應再攪拌15 min。然後用DCM和DMF徹底洗滌樹脂以獲得Int-C-002。
步驟 3 ，選擇性去保護， Int-C-003 ：
向含有Int-C-002的樹脂加入5 mL於DMF中的4%無水肼。將反應攪拌5 min，然後經由過濾移除肼溶液。重複過程又再兩次。然後，用DCM和DMF徹底洗滌樹脂，得到Int-C-003。
步驟 4 ，偶聯 AEEA 和 DOTA ， Int-C-004 ：
將含有Int-C-004的樹脂轉移到自動合成儀中以供偶聯AEEA和DOTA。AEEA和DOTA的偶聯以與合成Int-C-001的步驟1類似的方式，透過使用Fmoc-AEEA-OH和1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7-參-乙酸三級丁酯-10-乙酸(DOTA-參(三級丁酯))進行。
步驟 5 ，切割和整體去保護， Int-C-005 ：
向含有Int-C-004的樹脂加入10 mL切割混合物(87.5% TFA、5%大茴香硫醚、2.5%水、2.5% TIS、2.5% EDT)。將反應在室溫下攪拌2 h，然後在40℃下攪拌1小時。藉由將反應溶液加入至~25 mL冷乙醚，接著離心，將所得粗製物質從溶液中沉澱出來。移除上清液，並將所得沉澱物重新溶解在50：50 MeCN：水中。藉由RP HPLC純化粗製物質並將級分凍乾以得到Int-C-005。 通用示意圖 D ：合成具有通用結構 2A 和 3A 的雙 ALFA-DOTA 接合物
合成 EX-008 ：
向含有DOTA的中間體Int-C-005 (1當量)和含有環狀ALFA的中間體Int-A-005 (2.1當量)於1：1：1水：DMF：MeCN中的溶液加入10當量DIEA。將反應混合物在室溫下攪拌10 min。然後藉由RP HPLC純化反應，並將級分凍乾以得到白色粉末狀的EX-008。
EX-004 ：
以與EX-008類似的方式合成標題化合物。
EX-005 ：
以與EX-008類似的方式，透過在合成中使用Fmoc-AEPA-OH合成標題化合物。
EX-006 ：
以與EX-008類似的方式合成標題化合物。
EX-007 ：
以與EX-008類似的方式合成標題化合物。
EX-027 ：
以與EX-008類似的方式，透過使用Fmoc-Lys(生物素)-OH並以乙酸酐將N端加帽合成標題化合物。
EX-028 ：
以與EX-008類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH、Fmoc-Lys(生物素)-OH並以乙酸酐將N端加帽合成標題化合物。
EX-029 ：
以與EX-008類似的方式，透過使用Fmoc-Lys(生物素)-OH並以乙酸酐將N端加帽合成標題化合物。
EX-030 ：
以與EX-008類似的方式，透過使用Fmoc-Lys(生物素)-OH並以乙酸酐將N端加帽合成標題化合物。
EX-031 ：
以與EX-008類似的方式，透過使用Fmoc-Lys(生物素)-OH並以乙酸酐將N端加帽合成標題化合物。
EX-037 ：
以與EX-008類似的方式合成標題化合物。
EX-038 ：
以與EX-008類似的方式合成標題化合物。 通用示意圖 E ：合成具有通用結構 1B 、 2B 、 3B 的雙 ALFA- 毒素接合物
步驟 1 ，合成含疊 氮化物的環狀 ALFA 肽中間體， Int-E-001 ：
使用與合成Int-A-005類似的方案，透過使用Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-疊氮基離胺酸-OH、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH合成含疊氮化物的環狀ALFA肽中間體。針對這個中間體，N端以乙酸酐加帽。
步驟 2 ，合成含炔烴的環狀 ALFA 肽中間體 Int-E-002 ：
使用與合成Int-A-005類似的方案，透過使用Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-炔丙基-Gly-OH、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH合成含炔烴的環狀ALFA肽中間體。針對這個中間體，N端以乙酸酐加帽。
步驟 3 ，銅點擊反應， Int-E-003 ：
將含疊氮化物的肽中間體Int-E-001 (6 mg，2.1 µmol，1.0當量)和含炔烴的肽中間體Int-E-002 (6.1 mg，2.3 µmol，1.1當量)溶解於200 µL的1：1水：MeCN中。將所得溶液用氮氣鼓泡2 min。在另一個小瓶中，將THPTA (10.2 g，23.5 µmol)和抗壞血酸鈉(22.8 mg，115 µmol)溶解於200 µL水中，並用氮氣鼓泡2 min。向所得澄清溶液加入五水硫酸銅的水溶液(6 mg，24 µmol)。在氮氣下將所得銅(I)混合物加入兩種肽中間體的溶液中。1-2小時後，以含有0.05% TFA的50：50水：MeCN淬滅反應並使用RP HPLC純化以得到Int-E-003。
步驟 4 ，硫醇結合反應， EX-012 ：
使用標準半胱胺酸結合方案，將毒素負載-連接子結合至含有半胱胺酸的肽中間體。如果需要的話，可以用TCEP處理含半胱胺酸的肽中間體。向含有半胱胺酸的肽中間體Int-E-003 (1當量)於含有EDTA (pH 7.6，20 mM EDTA)的PBS緩衝液中的溶液添加毒素負載-連接子(替代毒素負載-連接子1，4.8當量)於DMF中的溶液。將反應在氮氣下於室溫或40℃下攪拌1-2小時。完成後，以含有0.05% TFA的50：50水：MeCN淬滅反應並使用RP HPLC純化以得到EX-012。
EX-009 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用市售德魯替康(CAS 1599440-13-7)合成標題化合物。
EX-010 ：
以與EX-012類似的方式合成標題化合物。
EX-011 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用市售的德魯替康(CAS 1599440-13-7)合成標題化合物。
EX-013 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-014 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-016 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-017 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH合成標題化合物。
EX-018 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-019 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-022 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-023 ：
以與EX-012類似的方式合成標題化合物。
EX-032 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-033 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-034 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-036 ：
以與EX-012類似的方式合成標題化合物。 通用示意圖 F ：合成具有通用結構 4B 的雙 ALFA- 毒素接合物
步驟 1 ，合成 pAEEA 骨架模組， Int-F-001 ：
Int-F-001是以0.2 mmol規模使用標準Fmoc固相合成方案在Sieber醯胺樹脂上合成。偶聯以60℃偶聯加上50℃ Fmoc去保護的10 min雙重偶聯進行。溴乙酸偶聯在未添加Oxyma、無最終去保護的情況下進行。將樹脂轉移到燒結注射器中，並用切割混合物(1% TFA/DCM)處理三次，每次30 min。合併切割濾液，在旋轉蒸發儀上移除揮發物，並在RP HPLC或SEC上純化殘餘物，得到白色固體狀的Int-F-001。
步驟 2 ，合成雙 ALFA 肽中間體， Int-F-002 ：
將Int-F-001 (0.5當量)和含半胱胺酸的ALFA (1.1當量)溶解於反應瓶的1：1 MeCN：水中(至約10 mg/mL)。雙ALFA形成是透過添加DIEA (8當量)引發的。完成後，將反應混合物冷凍並凍乾，得到灰白色凍乾餅狀的Int-F-002。該材料無需進一步純化即可用於後續步驟。
步驟 3 ，半胱胺酸的三苯甲基去保護和硫醇結合， EX-015 ：
向Int-F-002添加去保護混合物(5 mg/mL於TFA中)。5 min後，完全移除三苯甲基。在真空或氮氣流下移除TFA。將所得殘餘物溶解於MeCN/PBS (1：3)中並添加NaOH (0.1 N)以將溶液的pH調整至7.4。將德魯替康(CAS 1599440-13-7)以DMF中的溶液(20 mg/mL)添加。完成後，藉由RP HPLC純化反應混合物並凍乾，以得到黃色固體狀的EX-015。
EX-020 ：
以與EX-015類似的方式合成標題化合物。
EX-021 ：
以與EX-015類似的方式合成標題化合物。
EX-035 ：
以與EX-015類似的方式，透過使用免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。 通用示意圖 G ：合成具有通用結構 T5A 同二聚體的雙 ALFA- 毒素接合物
步驟 1 ，合成環狀 ALFA 肽中間體， Int-G-001 ：
使用與合成Int-A-005類似的方案，透過使用固相肽合成來合成環狀ALFA肽中間體。從樹脂上選擇性切割肽並使離胺酸側鏈選擇性去保護，得到Int-G-001。
步驟 2 ，交聯環狀 ALFA 肽中間體， Int-G-002 ：
使用活化的交聯劑將環狀ALFA肽中間體偶聯在一起，該交聯劑為諸如但不限於3,6-二氧雜辛二酸的雙-N-羥基琥珀醯亞胺酯。使用與合成Int-A-005的步驟5類似的方案，在酸性條件下對所得材料進行整體去保護。
步驟 3 ，硫醇結合反應， EX-039 ：
使用標準半胱胺酸結合方案將毒素負載-連接子結合至含有半胱胺酸的肽中間體。以與合成EX-012的步驟4所述類似的方式合成標題化合物。
EX-040 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-041 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-042 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH、Fmoc-半胱胺酸和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-043 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-044 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-045 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH、Fmoc-半胱胺酸和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-046 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-047 ：
以與EX-039類似的方式，透過使用免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-048 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-049 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-050 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH、Fmoc-半胱胺酸和免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-051 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-052 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-053 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH、Fmoc-半胱胺酸和免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-054 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-AEPA-OH和免疫調節劑負載-連接子合成標題化合物。
EX-055 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-N-甲基-AEEA-OH、Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-056 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-N-甲基-AEEA-OH、Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-057 ：
以與EX-012類似的方式，透過使用Fmoc-N-甲基-AEEA-OH、Fmoc-AEPA-OH和替代毒素負載-連接子2合成標題化合物。
EX-058 ：
以與EX-039類似的方式，透過經由N端偶聯合成標題化合物。 實例 2 - 雙 ALFA 接合物的活體外穩定性及溶解度表徵血漿穩定性分析
藉由將5 µL於DMSO中的1 mM化合物儲備溶液摻入495 µL人類或小鼠Li-肝素血漿(Innovative Research，Cat.No. IPLALIH5OML (人類)和IGMSBC (Balb C小鼠))中來進行血漿穩定性測量。將最終混合物渦旋並在37℃下培育。在0、1、3、6和24小時藉由加入100 µL乙腈/甲酸= 99/1 (v/v)中止後，直接淬滅酶反應。離心後，回收的上清液藉由液相層析術串聯質譜術(LC-MS/MS)進行分析。所使用的LC-MS (液相層析術質譜術)系統是呈陽離子模式的Shimadzu 8060 NX三重四極桿。在Waters Cortex T3 50 mm x 3管柱x 1.7µm上達到層析分離。以5% B開始流速為0.7 mL/min的梯度程式，然後在1.4 min內線性梯度至95% B。在以95% B線性等度維持0.2 min後，在0.1 min內回復到5% B的起始條件。最後，在下一次注射前維持5% B歷時0.6 min。總分析時間為2.3 min。代表性分子的血漿穩定性結果顯示於圖1中。 溶解度分析
藉由將5 µL於二甲亞碸中的1 mM溶液摻入495 µL介質(磷酸鹽或組胺酸緩衝液)中進行溶解度測量。磷酸鹽緩衝液含有50 mM Na 2HPO 4x 2H 2O和50 mM KH 2PO 4(pH 7.4)，而組胺酸緩衝液由20 mM組胺酸、120 mM氯化鈉、50 mM蔗糖和0.02%聚山梨醇酯20 (pH 6.0)組成。每種介質中的樣品最終濃度為100 µM。將混合物在23℃、以1400 rpm連續震盪進行培育。24h後，離心樣品，並透過LC-MS (ThermoFisher Scientific Vanquish Liquid Chromatography偶聯ThermoFisher Scientific LTQ XL)以正離子模式分析上清液。所使用的層析管柱是Acquity UPLC Protein BEH C4，300Å，1.7μm，2.1mm x 100mm。以0% B開始流速為0.5 mL/min的梯度程式，然後在2 min內線性梯度至95% B。在以95% B線性等度維持0.5 min後，在0.1 min內回復到0% B的起始條件。最後，在下一次注射前維持5% B持續0.9 min。總分析時間為3.5 min。分析過程中LC自動進樣器維持在23℃。 實例 3 - 親和力、結合性與結合評估以及複合物形成測試
單價ProteinDocker 一種包含單一NbALFA部分的經重組生產和經純化的蛋白質
二價ProteinDocker 一種經重組生產和經純化的蛋白質，展項出IgG1樣結構，其中一個NbALFA部分融合至位於Fc之C端處的CH3結構域中之各者。此融合產生包含兩個NbALFA的融合蛋白。
方法 測量包含雙 ALFA 和 NbALFA 的蛋白質的親和力與結合性驅動之交互作用
關於親和力和結合性測量，使用Sartorius的Octet HTX裝置。儀器使用生物層干涉術(BLI)偵測分子：分子交互作用。
關於親和力測量，將市售的SAX2.0生物感測器浸泡在從儀器製造商購入的動力學緩衝液(KB)中至少10 min。在KB中經過120 sec基線後，以30.99 nM的濃度加載化合物的生物素化衍生物歷時240 sec。隨後，在100 µg/mL生物細胞素溶液中進行淬滅步驟，然後在KB中進行120 sec基線。使用七種不同濃度的單價ProteinDocker在900 sec內測量締合，從10 nM開始以1：1連續稀釋低至0.15625 nM。作為參考品，測量沒有含NbALFA的蛋白質的KB。在KB中於1500 sec內獲得解離。從所有其他生物感測器的訊號扣除參考孔的訊號，並將這些經過處理之數據的訊號與第二基線的平均值比對。關於步驟間校正，將數據與解離步驟比對，並對所有曲線套用Savitzky-Golay濾波。使用1：1朗繆(Langmuir)結合模型全域擬合締合與解離。
關於結合性測量，採用Octet HTX的16通道模式以便同時雙重參考。市售SSA生物感測器在KB中淬滅歷時10 min，然後是120 sec基線測量。隨後，16個生物感測器中的八個加載2.5 µg/mL生物素化NbALFA歷時60 sec，而其餘8個生物感測器在KB中進一步培育。所有生物感測器均在100 µg/mL生物細胞素溶液中淬滅歷時120 sec。按照生物感測器管柱使用七種不同濃度的雙ALFA衍生物在900 sec內測量締合，從2.5 nM開始以1：1連續稀釋低至39.0625 pM。作為參考品，KB是用兩個生物感測器管柱的第八個生物感測器進行測量的。在1500 sec內於KB中獲得解離。從成對加載NbALFA的生物感測器扣除參考生物感測器的訊號，接著將各別管柱中所有生物感測器的訊號扣除參考孔的訊號。這個雙重參考步驟之後，將訊號與第二基線的平均值對齊。關於步驟間校正，將數據與解離步驟對齊，並套用Savitzky-Golay濾波。使用1：1朗繆結合模型全域擬合締合和解離。 雙 ALFA 和二價 ProteinDocker 在溶液中的結合
為了研究複合物的形成，將二價ProteinDocker在PBS中與不同濃度的雙ALFA接合物混合。用0 µM、0.5 µM、5 µM或50 µM的雙ALFA接合物將最終濃度調整至5 µM蛋白質。混合後，將樣品在室溫下培育至少20 min，以使NbALFA部分結合至雙ALFA接合物上的ALFA標籤。 奈米差示掃描螢光術和動態光散射
使用NanoTemper的Prometheus PANTA研究熱穩定性。將10 µL預培育的雙ALFA-ProteinDocker複合物或單獨ProteinDocker加載至毛細管中。將毛細管上樣至儀器中後，對所有樣品進行1℃/min的升溫從25℃至95℃。在這個過程期間，於350 nm和330 nm下測量蛋白質的固有螢光。將比率相對於溫度作圖並計算一階導數(first derivative)。最小值和最大值對應於多結構域蛋白質變性過程中所觀察到的不同TM值。比較一個蛋白質與不同濃度雙ALFA接合物的TM值。
在加熱升溫期間，對所有樣品進行了DLS測量，從而能夠以溫度依賴性方式評估濁度出現。這些值與溫度誘導的蛋白質沉澱相關。
所有測量至少以二重複進行。 評估大型複合物形成的尺寸排阻層析術
採用Agilent Infinity II HPLC與Biozen 1.8 µm dSEC-2、200 Å LC管柱(300 x 4.6 mm)進行複合物形成分析。將流速調整至0.25 mL/min，產生約255巴壓力。使用0.2 M磷酸鉀、250 mM KCl、pH 6.2、5%乙腈作為可溶相。每次運行需要20 min，不包括每次分析之間的2-3 min清洗步驟。施加10 µL預培育的雙ALFA：ProteinDocker複合物或單獨ProteinDocker，並透過在280 nm下的吸光度進行偵測。 雙 ALFA 存在的情況下與二價 ProteinDocker 的 Fc 受體結合
採用Octet HTX系統評估與CD64的結合。將Fab2G生物感測器浸泡10 min後，於KB中測量60 sec基線，然後以25 nM的濃度對二價ProteinDocker或預培育的雙ALFA：ProteinDocker複合物進行300 sec加載步驟。達到反應閾值0.7 nm後，停止加載，並在120 秒的時間內使用100 µg/mL生物細胞素溶液進行淬滅，然後在KB中進行120 sec基線步驟。使用七種不同濃度的CD64在600 sec內測量締合，從5 nM開始以1：1連續稀釋低至78.125 pM。作為參考品，分別測量沒有CD64但有固定ProteinDocker或ProteinDocker複合物的KB。於KB中在600 sec內獲得解離。從所有其他生物感測器的訊號扣除參考孔的訊號，並將這些經過處理之數據的訊號與第二基線的平均值比對。關於步驟間校正，將數據與解離步驟比對，並對所有曲線套用Savitzky-Golay濾波。使用1：1朗繆結合模型全域擬合締合和解離。
為了測定與FcRn的結合，將SAX2.0生物感測器在KB中浸泡10 min，接著KB中進行60 sec秒基線。在300 sec內完成生物素化人類FcRn的加載或直至達到反應閾值1.5 nm。隨後在100 µg/mL生物細胞素溶液中淬滅後，在100 mM磷酸鈉、150 mM NaCl、0.05% Tween-20、pH6.0 緩衝液(KB-pH6)中測量基線歷時120 sec。二價ProteinDocker (有或沒有提前與雙ALFA預複合)在KB-pH6中以1：1連續稀釋從1600 nM低至25 nM。在60 sec內測量締合，然後在KB-pH6中在60 S內測量解離。從所有其他生物感測器的訊號扣除參考孔的訊號，並將這些經過處理之數據的訊號與第二基線的平均值比對。關於步驟間校正，將數據與解離步驟比對，並對所有曲線套用Savitzky-Golay濾波。使用1：1朗繆結合模型全域擬合締合和解離。由於FcRn交互作用顯示與抗體Fc部分的異質結合行為，因此僅擬合解離的前5或10 sec。 結果與討論 評估雙 ALFA 和單價 ProteinDocker 的親和力和結合性交互作用
首先，研究了雙ALFA接合物的分叉點和連接子長度對結合至單價ProteinDocker的影響。因此，測試了5對不同的雙ALFA接合物，全部包含相同的環狀ALFA部分(Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2)。
每對包含一個雙ALFA骨架的DOTA或生物素結合衍生物。雖然親和力測量會因為抗體的大小而有強烈反應，但結合性反應較低卻顯著。就所有測試的化合物來說，測定的親和力KD在4.986E-10和6.895E-10 M之間，在締合速率或解離速率方面沒有顯著差異。在結合性測量中，無法計算任何測試物的解離速率，因為解離速率超出了儀器限制(表2)。 表 2 ：雙ALFA對的概述及其與單價NbALFA的親和力和結合性動力學結合數據。
對 雙 ALFA 結合至 測量設定 KD [M] ka [1/Ms] Kdis [1/s]
1 EX-001 DOTA 結合性 ＜1.0E-12 7.068E04 ＜1.0E-07
EX-024 生物素 親和力 6.510E-10 4.538E05 2.954E-04
2 EX-002 DOTA 結合性 ＜1.0E-12 1.746E05 ＜1.0E-07
EX025 生物素 親和力 6.679E-10 4.227E05 2.823E-04
3 EX-003 DOTA 結合性 ＜1.0E-12 4.743E05 ＜1.0E-07
EX-026 生物素 親和力 6.895E-10 3.984E05 2.747E-04
4 EX-005 DOTA 結合性 ＜1.0E-12 M 1.004E05 ＜1.0E-07
EX-028 生物素 親和力 6.731E-10 3.061E05 2.060E-04
5 EX-006 DOTA 結合性 ＜1.0E-12 6.888E04 ＜1.0E-07
EX-029 生物素 親和力 4.986E-10 4.976E05 2.481E-04
直接比較每對的解離曲線，以便評估肽結構對結合性效應的影響(圖2)。不同對之間沒有重大差異，顯示連接子長度和通用結構對親和力與結合性之間的動態範圍沒有影響。
在親和力與結合性測量中，解離曲線之間的差異是結合性效應的顯像(visualization)。所有測試化合物之間的這種差異是相似的，與連接子或分叉點無關。
在下一個步驟中，測試了ALFA肽的親和力的影響。因此，以不同的環狀ALFA部分合成包含固定分叉點和固定連接子長度的雙ALFA接合物，該環狀ALFA部分對NbALFA展現出不同的結合親和力。我們使用Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-(環13)Glu-NH2作為高仿射ALFA、Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-(環5)Asp-Glu-Leu-Arg-(環9)Lys-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2作為中仿射ALFA，以及Ac-Pro-Ser-Arg-Leu-(環5)Glu-Glu-Glu-Leu-(環9)Lys-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH2作為低仿射ALFA。再次生成DOTA衍生物與生物素衍生物，並測試三對雙ALFA接合物的親和力與結合性(表3)。生物素偶聯的WT線性ALFA (Ac-Ser-Arg-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Arg-Arg-Arg-Leu-Thr-Glu-NH 2)，已知與NbALFA具有最高的親和力，用作為親和力測量的參考品。 表 3 ：雙ALFA對的概述及其與單價NbALFA的親和力與結合性動力學結合數據。
對 雙 ALFA 結合至 測量步驟 KD [M] ka [1/Ms] Kdis [1/s]
高親和力 EX-004 DOTA 結合性 ＜1.0E-12 1.044E06 ＜1.0E-7
EX-027 生物素 親和力 9.783E-10 2.012E05 1.969E-04
中親和力 EX-007 DOTA 結合性 ＜1.0E-12 ＜1.0E-12 ＜1.0E-7
EX-030 生物素 親和力 1.630E-09 2.714E05 4.426E-04
低親和力 EX-008 DOTA 結合性 ＜1.0E-12 6.983E04 ＜1.0E-7
EX-031 生物素 親和力 2.202E-09 5.064E05 1.115E-03
線性ALFA - 生物素 親和力 8.055E-11 6.768E05 5.451E-05
關於親和力測量，觀察到解離速率的顯著差異。線性ALFA顯示最高的解離速率，而高、中和低環狀ALFA接合物的測定親和力一如預期較低。然而，在結合性測量中，就所有高、中和低親和力環狀ALFA接合物來說，無法測定解離速率，因為解離率超過了儀器限制，且解離速率超過了WT ALFA的解離速率。解離曲線的比較說明親和力與結合性測量之間的動態範圍(圖3)。這種所謂的結合性效應可以在需要於目標位點進行高度特異性結合的應用中被利用。由於結合性效應，確保了具有相對低親和力的接合物在目標位點處與高密度的相應交互作用結合部分的高度特異性和緊密結合，而接合物將不會有效地結合至其他位點處或循環中的單獨交互作用結合部分。因此，針對此類應用，偏好標籤接合物上和對接化合物上的交互作用部分連同親和力在範圍低至中仿射之環狀ALFA，因為這些與更大結合性效應相關，這透過圖3圖式中親和力與結合性曲線之間的面積來說明。
雖然較低仿射的雙ALFA接合物顯示出解離速率增加且親和力較低，但結合性測量中的解離速率則保持不變。因此，較低仿射的肽導致較強的相對結合性效應，因此更偏好用作為放射性診斷劑的預期用途。線性ALFA在親和力測量中展現出的解離速率類似於其環狀對應物在結合性測量中所測定的解離速率，如圖3中所示。高仿射雙ALFA接合物在親和力測量中的解離速率也與線性ALFA的解離速率不相上下，因此強調與中或低親和力雙ALFA化合物相比，線性ALFA的親和力不太適合雙ALFA接合物對目標結合的單價ProteinDocker的選擇性結合性效應。
根據觀察到的親和力，值得注意的是，親和力與結合性之間的解離速率應盡可能不同，以允許對目標結合的ProteinDocker產生選擇性結合性效應。然而，計算出的解離速率被測定為1.0E-07 1/s，這超出了結合性測量中的儀器限制。因此，作為近似值，我們還將不同環狀ALFA接合物在親和力測量中的解離速率與線性ALFA測定的親和力進行比較，後者可用作參考點。發現與WT ALFA相比，高親和力環狀ALFA的解離速率變化倍數為3.61，中仿射環狀ALFA為8.11，而低仿射環狀ALFA為20.45。綜上所述，吾人得出結論，親和力與結合性之間解離速率變化倍數應至少為＞5倍，較佳地＞8倍，更佳地＞20倍，以促進對目標結合的單價ProteinDocker的選擇性結合性效應。 評估雙 ALFA 和二價 ProteinDocker 結合性交互作用
為了研究結合至二價ProteinDocker之雙ALFA上分叉點以及毒素的數量與結構的影響，進行了結合性測量。在二價蛋白質中，雙ALFA始終以結合性結合，因此無法進行親和力測量。雖然結合速率和解離速率差異很小，但所有測試化合物的總體KD值基本上相同，強調出雙ALFA：NbALFA結合與分叉的性質和毒素結合肽的結構，以及每個雙ALFA的毒素數量無關(表4)。 表 4 ：結合性驅動的雙ALFA毒素接合物及其與二價ProteinDocker結合的動力學參數。
毒素 - 接合物 KD [M] ka [1/Ms] Kdis [1/s]
EX-015 6.649E-11 4.142E05 2.754E-05
EX-036 ＜1.0E-12 7.955E05 ＜1.0E-07
雙 ALFA 與二價 ProteinDocker 的溶劑中結合
雖然生物層干涉術(BLI)結合分析需要固定雙ALFA或ProteinDocker，但使用NanoDSF的熱位移分析可以對溶液中的結合進行定性分析。因此，將固定量的ProteinDocker與無雙ALFA或莫耳濃度低10倍、等莫耳或高10倍的雙ALFA一起預培育。隨後，進行NanoDSF測量，以評估ProteinDocker在肽存在下的穩定性。儘管單獨ProteinDocker在54.20℃時顯示第一個TM值，但使用至少等莫耳濃度的雙ALFA時，TM值會升至67.99℃以上(表5)。 表 5 ：與不同濃度雙ALFA接合物EX-036組合之二價ProteinDocker的TM值。
雙 ALFA ： ProteinDocker 比率 TM 值 [℃]
TM1 TM2 TM3
0.1：1 54.26 67.85 82.87
1：1 68.08 75.25 82.74
10：1 67.99 75.27
0：1 54.20 67.94 83.15
在肽存在的情況下，穩定性增加可以透過ALFA：NbALFA交互作用對VHH的穩定作用來解釋。由於在等莫耳濃度下無法再偵測到一開始的TM值，因此確認了ProteinDocker和雙ALFA接合物的定量結合(圖4)。在肽濃度低10倍時，未結合的NbALFA會變性，就像在沒有雙ALFA的ProteinDocker中一樣，因為結合不是定量的。
由於ProteinDocker是一種多結構域蛋白質，因此不同結構域在不同溫度下變性時會觀察到多個TM值。在沒有肽的情況下，ProteinDocker樣品中的第一個TM值反映了NbALFA VHH的穩定性。這個螢光訊號比率的一階導數最小值也出現在雙ALFA：ProteinDocker比率為0.1：1的情況下，但在更高雙ALFA含量的樣品中完全不存在。在這些之中，與ALFA標籤複合的NbALFA變性和另一個最大值重疊，因此無法觀察到。 雙 ALFA 對二價 ProteinDocker 與 Fc 受體結合的影響
二價ProteinDocker包含IgG1樣結構，其中兩個NbALFA融合至Fc的c端。Fc部分透過與Fcγ受體(其中包括FcγRI/CD64)交互作用來媒介效應功能，並透過與新生兒Fc受體(FcRn)交互作用來延長抗體的半衰期。就作用的預期模式來說，效應功能以及長半衰期至關重要。為了研究二價ProteinDocker與雙ALFA的結合是否會對與Fc受體的交互作用產生負面影響，在pH 7.4和pH 6.0下將ProteinDocker與10倍莫耳過量的雙ALFA複合。作為陽性對照，將未經複合的ProteinDocker進行了平行測試。使用NanoDSF，透過熱位移在中性和酸化pH條件下驗證了複合成功(表6)。 表 6 ：與10倍過量EX-036組合的二價ProteinDocker在pH 7.4和pH 6.0下的TM值
雙 ALFA ： ProteinDocker 比率 測試物 pH 值 TM1 [℃] 濁度出現 [℃]
10：1 ProteinDocker + EX-036 7.4 68.03 70.10
ProteinDocker + EX-036 6.0 68.21 69.19
/ 單獨ProteinDocker 7.4 54.39 66.47
單獨ProteinDocker 6.0 55.76 66.36
隨著TM1在存在10倍莫耳過量的雙ALFA的情況下明顯升高，這對於反映ProteinDocker開始沉澱之溫度的濁度出現也是如此，因此證實了ProteinDocker：雙ALFA複合物的定量形成。
BLI測量證實FcRn和CD64結合親和力都不會受到複合雙ALFA的負面影響(表7)。因此，ProteinDocker：雙ALFA複合物預期具有完整的效應功能且半衰期不變。由於FcRn與IgG抗體Fc部分的結合具有pH依賴性，因此結合研究需要在pH 6.0下進行。 表 7 ：在雙ALFA存在或不存在的情況下，ProteinDocker與CD64和FcRn的動力學結合參數。
報導子 肽 KD [M] ka [1/Ms] Kdis [1/s]
FcRn 單獨ProteinDocker 5.279E-08 5.279E05 2.009E-02
ProteinDocker + EX-036 3.667E-08 5.627E05 2.064E-02
CD64 單獨ProteinDocker 6.935E-11 3.208E06 2.225E-04
ProteinDocker + EX-036 6.163E-11 3.107E06 1.915E-4
複合物形成評估
針對二價ProteinDocker和雙ALFA接合物，設想了一種1：1交互作用。然而，如果一個ProteinDocker以2：1的方式結合至兩個獨立的雙ALFA接合物，則兩個ALFA標籤在這個複合物中保持游離狀態，並且可以被其他ProteinDocker接合。結果，可能形成大型的巨分子簇，這可能對抗體的PK和免疫原性產生負面影響。為了量化這些大型複合物存在的風險，將二價ProteinDocker在莫耳濃度低10倍、等莫耳或高10倍下與雙ALFA接合物EX-036一起培育並進行SEC分析。作為對照，未經複合的ProteinDocker也進行了測試(圖5)。
在較高濃度ProteinDocker的情況下，預期較高分子量複合物的形成會升高。在高濃度樣品中，不同的ProteinDocker分子非常接近。雙ALFA接合物的一個ALFA部分被二價ProteinDocker上的一個NbALFA結合後，第二個ALFA標籤可以被附近的第二個ProteinDocker接合。在低濃度樣品中，這第二個ProteinDocker分子較不靠近，有利於雙ALFA接合物的第二個ALFA標籤被第一個ProteinDocker上的第二個NbALFA部分結合。
由於在這些實驗中使用高濃度樣品，因此有利於複合物形成。是以，在此觀察到的較高分子複合物超出了活體內預期會觀察到的情況，在活體中蛋白質效價較低。
在10倍低與未經複合的ProteinDocker之間，沒有觀察到滯留時間的差異。在肽等莫耳濃度或高10倍時，觀察到主峰略微位移，顯示已形成預期的1：1複合物。在等莫耳濃度下，觀察到較高分子量物質少量形成(~3%)，在肽10倍分子過量時，這種現象顯著減少(＜1%)。
在雙ALFA接合物過量時高分子物質的總量低於1%，且這個分析是在明顯比活體內預期高的濃度下進行，因此認為患者體內形成大型複合物的風險為低。 實例 4 - 雙 ALFA- 接合物的放射性標記
Ex-007和Ex-008在實例4的上下文中分別稱為肽29和肽31。 Ga-68 標記
肽29和肽31以經衰減校正的莫耳活性進行標記，以便在投藥之時達到期望的活性(7-10MBq/nmol)。標記前透過HPLC測定肽的基線純度；圖6為肽29，而圖9為肽31。根據下文所述的方案進行標記： Ÿ 使用分級方法在0.1 M HCl中溶析生成器。 Ÿ 將7-15 MBq/nmol轉移至離心管中，並測量活性。 Ÿ 以1：2的比率添加1 M NH4OAc標記緩衝液。最大反應體積1.5 mL。 Ÿ pH測量介於3.5-4.0之間 Ÿ 將無水EtOH添加至反應混合物中至最終乙醇濃度為5.0% Ÿ 將肽29或肽逐份添加到反應混合物以達到期望的比活性。 。使用經衰減校正的比活性以便在投藥之時達到期望的活性(7-10MBq/nmol))。 Ÿ 將反應混合物在95℃下以600 RPM攪拌30 min。 。15 min後藉由放射性-TLC和放射性-HPLC監測併入程度。 。兩種肽反應15 min後，獲得併入程度≧92% Ÿ結束反應後，將反應混合物冷卻至室溫並從粗製品中取出樣品用於藉由放射性-HPLC和放射性-iTLC測定併入程度。 Ÿ根據表8中所述的純化標準，可以依照併入程度來純化產物。 Ÿ用4 mM DTPA (佔總反應體積的比率為1：10)淬滅反應。 Ÿ最終產物在水性配製緩衝液中配製成活性濃度為100 MBq/mL (10 MBq在100 µL注射體積中)與化合物濃度為10 nmol/mL(1 nmol/100 µL)。 Ÿ藉由放射性-HPLC分析最終產物(EOS)的放射化學純度(RCP)；圖7為肽29，而圖10為肽31，以及放射性-TLC，圖8為肽29，而圖11為肽31。 Ÿ EOS後1小時和4小時藉由放射性-HPLC評估各個化合物的緩衝液穩定性(RCP)；圖12為肽29，而圖13為肽31。
分析結果的討論。Ÿ 兩種化合物的最佳反應時間均顯示為15 min。 Ÿ 獲得＞92%的併入程度。 Ÿ 最終產物中獲得的RCP ＞ 92%。 Ÿ 在監測的7小時內未觀察到不穩定跡象
EOS後7小時，兩種化合物獲得的RCP ＞ 94% In-111 標記
肽29和肽31以經衰減校正的莫耳活性進行標記，以便在投藥之時達到期望的活性(28-30 MBq/nmol)。圖6為肽29，而圖9為肽31。根據下文所述的方案進行標記： Ÿ 將In-111 (0.02 M HCl)轉移至離心管中，並測量活性。 Ÿ 添加標記緩衝液2.5 M NaOAc ((化合物體積+In-111體積)/9=緩衝液體積)。 Ÿ pH測量介於5.0-5.5之間 Ÿ 將肽29或肽逐份添加到反應混合物中以達到期望的比活性。 Ÿ 將反應混合物在95℃下以600 RPM攪拌30 min。 。15 min後藉由放射性-TLC和放射性-HPLC監測併入程度。 。15 min反應後，獲得併入程度≧98%。 Ÿ 結束反應後，將反應混合物冷卻至室溫並從粗製品中取出樣品用於藉由放射性-HPLC和放射性-iTLC測定併入程度。 Ÿ 根據表8中所述的純化標準，可以依照併入程度來純化產物。 Ÿ 用4 mM DTPA (佔總反應體積的比率為1:10)淬滅反應。 Ÿ 最終產物在水性配製緩衝液中配製成活性濃度為300 MBq/mL (30 MBq在100 µL注射體積中)與化合物濃度為10 nmol/mL(1 nmol/100 µL)。 Ÿ 藉由放射性-HPLC分析最終產物(EOS)的放射化學純度(RCP)；圖14為肽29，而圖16為肽31，以及放射性-TLC；圖15為肽29，而圖17為肽31。 Ÿ EOS後1、4和24小時將藉由放射性-HPLC評估各個化合物的緩衝液穩定性(RCP)。圖18為肽29，而圖19為肽31。
結果討論：Ÿ 兩種化合物的最佳反應時間均顯示為15 min。 Ÿ 獲得＞98%的併入程度。 Ÿ 最終產物中獲得的放射化學純度(RCP) ＞97%。 Ÿ 在監測的24小時內，游離In-111的百分率增加。 Ÿ EOS後24小時，兩種化合物獲得的RCP ＞90%。 表 8 ：純化標準實例
QC參數 純化策略
併入(放射性-HPLC) ≦50.0%將進行新標記
50.1-92.0%化合物將藉由固相萃取(SPE)純化
92.1%無樣品操作
實例 5 – 放射診斷性化合物的活體內實驗
單價ProteinDocker 一種包含單一NbALFA部分的經重組生產和經純化的蛋白質
單價RiboDocker 一種編碼包含單一NbALFA部分的雙特異性抗體的mRNA
兩種經放射性標記之 DOTA- 肽的 PK 和生物分布概況
這個研究之目的是評估兩種經放射性標記之DOTA-肽(EX-007和EX-008)的藥物動力學(PK)與生物分布概況。這兩個DOTA-肽以兩種不同的放射性同位素(例如鎵68 (Ga-68)或銦-11 (In-111))進行放射性標記，並被靜脈內注射到幼稚無胸腺裸鼠中。在活體內使用PET/CT和SPECT/CT，並在離體使用伽瑪計數來評估PK和生物分布。例如在注射後15、30、60和180分鐘分析經Ga-68標記的DOTA-肽，並且例如在注射後1、24和72小時測定經In-111標記的DOTA-肽。
肽在活體內的生物半衰期通常較短(約幾分鐘)。吾人在不同器官中並未看到累積。 用 RIBODOCKER ( 呈蛋白質或 RNA) 和經放射性標記的 DOTA- 肽進行預靶向
從血液清除緩慢且經直接放射性標記之抗體延遲攝取到腫瘤中會導致骨髓持續的輻射暴露和高背景訊號。為了克服這些限制，已經開發出預靶向技術。在預靶向時，首先靜脈內投予未經放射性標記的雙特異性單株抗體(ProteinDocker或RiboDocker)。ProteinDocker或RiboDocker定位在腫瘤中並從血流移除後，投予經放射性標記的肽(EX-007或EX-008)，肽被ProteinDocker或RiboDocker快速捕獲於腫瘤中，而其餘部分則非常迅速從血液被移除並經由腎臟排除。預靶向會減少了輻射敏感性正常組織(諸如骨髓)以及其他組織的輻射暴露，從而產生良好的腫瘤-噪音比。吾人透過使用二價經放射性標記的肽(EX-007和EX-008)來獲得甚至更好的對比度，它們可以交聯目標細胞表面上的ProteinDocker或RiboDocker，並以增加的親和力(或結合性)結合，同時結合在血流中維持快速可逆，避免追蹤過量的ProteinDocker或RiboDocker。
也使用經螢光團標記的肽(EX-037和EX-038)進行如上所述的類似預靶向實驗。在此，吾人也預期透過使用二價結合至ProteinDocker或RiboDocker的經螢光團結合之肽來獲得更好的腫瘤-非腫瘤訊號。 實例 6 - 使用雙 -ALFA- 毒素接合物的細胞死亡分析
實驗說明
ES-2和其中二價ProteinDocker靶向抗原(CLDN6/密連蛋白-6；抗原+)過度表現的變體(ES-2-抗原+)的同源對被用來評估本發明的效力和特異性。在處理前一天，將細胞以10-20%的滿度接種在平底孔盤的McCoy氏5A培養基(補充有10%熱不活化FCS)中(5x10 3個細胞在96孔形式中)。二價ProteinDocker和雙ALFA在室溫下以等莫耳比率複合歷時30 min，然後製備所有分析化合物的連續稀釋液。將經稀釋的化合物與三種IncuCyte ®染料混合並添加至細胞，以根據製造商的說明測量細胞死亡(IncuCyte ®Cytotox NIR Dye)和細胞凋亡誘導(IncuCyte ®Caspase-3/7 Green Dye和IncuCyte ®Annexin V Orange Dye)。以8個濃度分析測試物以確定劑量依賴性細胞死亡誘導。經由IncuCyte ®SX5 Live-cell分析系統對細胞進行監測歷時96小時。每1-3小時擷取影像。校正了光譜重疊(spectral overlap)，並根據細胞株和染料調整區隔閾值，然後藉由IncuCyte ®Live-cell分析系統對螢光訊號進行自動定量。動力學分析避免為每個細胞株建立最佳讀數時間點，並避免基於不適當的讀數時間而得出誤導性結論。多重冗餘的細胞死亡讀數(細胞匯合、DNA結合染料、細胞凋亡酶3/7活性報導子和膜聯蛋白V染色)證實了細胞死亡誘導、誘導的細胞死亡類型(壞死與細胞凋亡)的正確解釋，以及細胞毒性效應與細胞抑制效應的明確區分或與瞬時細胞死亡無關的單一過程活化(凋亡蛋白酶活化、磷酸絲胺酸暴露)，其已知會誤導細胞死亡分析的解釋(Kepp et al, Nature Reviews Drug Discovery 2011)。使用Graphpad Prims 9進行數據分析、顯像和EC50值計算。結果顯示於圖20中。
在進一步的實驗中，於共培養環境中分析旁觀者殺滅活性。因此，使用增生染料或IncuCyte ®CytoLight染料將抗原陽性細胞和抗原陰性細胞標記為不同的螢光顏色，以便將IncuCyte ®Cytotox訊號歸因於特定細胞。這允許對本發明的直接抗體媒介的攝取與隨後的負載釋放，以及抗原陰性周圍細胞中的細胞死亡誘導進行詳細的動力學分析。
此外，上述實驗將使用RiboDocker mRNA作為起始材料進行。mRNA將被轉染至HEK293細胞中，隨後生產並分泌二價ProteinDocker。被轉染後24小時收取上清液。將上清液的稀釋液與新鮮培養基混合，並在將其施用於目標細胞之前或之後與雙ALFA一起培育。 實例 7 - 雙 -ALFA- 毒素接合物的活體內實驗
二價ProteinDocker  包含兩個NbALFA部分的經重組生產和經純化蛋白質
二價RiboDocker 編碼包含兩個NbALFA部分的雙特異性抗體的mRNA
雙-alfa接合物 仰賴活體外研究的結果
活體內研究原理證明
為了選出在活體內最有效的雙-alfa接合物及其同源Docker，吾人將在功效模型中測試一組與ProteinDocker複合的接合物。首先，將確立此類Docker接合物複合物的可耐受劑量。幼稚小鼠將以不同劑量接受Docker接合物複合物注射，以確立耐受劑量。然後將選出耐受劑量用於實際的活體內功效研究。將使用人類目標抗原陽性腫瘤細胞株建立免疫功能低下的小鼠，然後用預形成的複合物進行幾個治療週期。複合物可以按照抗原特異性方式歸巢到腫瘤，在內吞作用時將其負載釋放到目標細胞中，並透過其細胞毒性功能殺死腫瘤細胞。此外，Fc媒介的效應(像是抗體依賴性細胞吞噬作用)可能有助於整體功效。將監測整體健康狀況、腫瘤生長動力學和存活率。 預靶向研究
與預形成複合物的功效研究類似，兩種原料藥可以各別注射。目的是使複合物在活體內循環中形成，以抗原特異性方式歸巢至腫瘤微環境，並發揮Docker和負載的效應功能。在最後一個步驟中，可以透過mRNA奈米顆粒的傳遞和活體內轉譯來提供Docker。 實例 8 - 涉及雙 -ALFA- 免疫調節劑接合物的實驗 簡短說明：
RiboDocker免疫調節劑由兩個組分組成：1) RiboDocker mRNA，編碼Fc勝任全長IgG (呈蛋白質形式，也稱為ProteinDocker)，在一個位點二價結合至腫瘤抗原，而在另一個位點具有兩個NanobodyALFA；2)由兩個結合NanobodyALFA的ALFA肽組成的接合物，免疫調節負載經由連接子附接至該等ALFA肽，該連接子視情況是可切割的；參見圖21。數量不等的負載附接至接合物而創造出不同DAR (目標為2-4)。免疫調節負載是促效性化合物，像是STING促效劑，其在進入細胞後誘導免疫活化。
以下部分說明用於挑選接合物和RiboDocker接合物對的活體外方法。 非目標活性的分析： THP-1 和 PBMC 分析
THP-1和PBMC分析旨在說明免疫調節劑接合物於沒有腫瘤抗原的情況下的背景活性，這些接合物是游離的或與ProteinDocker複合的。THP-1 Dual Cells (購自Invivogen (Cat. Thpd-nfis))是一種報導細胞，可用來輕鬆監測PRR活化下游的路徑活化。PBMC也用於代表更真實的生物學場景。由於這些是初代人類細胞，因此至少要比較兩名捐贈者。THP-1細胞以1x10 5細胞/孔的密度接種於96孔盤中，而PBMC以5x10 5個細胞/孔的密度接種於96孔盤中。以連續稀釋添加測試物，然後培養THP-1細胞歷時24 h。1 h刺激後洗滌PBMC，並又再培養23 h。針對兩種細胞株，24 h後分析結束，此時離心細胞並取得上清液。在THP-1細胞上清液中，根據製造商的說明測量SEAP (分泌型鹼性磷酸酶) (其表明NFkB活化)以及lucia螢光素酶(其表明IRF活化)。根據製造商的說明，使用Mesoscale Multiplex Assay Kit分析PBMC上清液在免疫活化後所誘導的分泌型細胞激素。基於數據計算EC50值，並將其與游離負載所誘導的免疫活化進行比較。 目標媒介的活性的分析：抗原 + 細胞的刺激
取決於所分析的負載，使用不同的抗原+細胞來分析抗原媒介的活性。如果可能的話，採用內源性表現目標抗原的腫瘤細胞。因此，將0.1-5x10 5個細胞/孔接種在96孔盤中，並添加接合物的連續稀釋液，接合物是游離的或與抗原結合ProteinDocker預複合的。刺激進行歷時24小時，之後離心細胞並取得上清液，以便根據製造商的說明使用Mesoscale Multiplex Assay Kit分析分泌型細胞激素。或者，可以藉由穩定表現抗原以及路途活化報導元件的細胞株來分析抗原媒介的活性。例如，將抗原陽性HEK報導細胞以0.1-5x10 5個細胞/孔接種在96孔盤中並靜置過夜以進行附著。次日，加入接合物的連續稀釋液，接合物是游離的或與抗原結合ProteinDocker預複合的。24 h後，分析細胞上清液的SEAP和lucia螢光素酶報導活性(參見THP-1分析)。計算並比較預複合和游離接合物之間的EC50值，以描述抗原媒介的活性。 Fc 媒介的活性的分析：共培養分析
ProteinDocker是具有勝任Fc功能的全長IgG。因此，不僅預期在抗原+細胞中的活性，還預期在FcR+免疫細胞中Fc媒介的內化和活性。為了分析這種效應，設定了客製化的免疫分析(參見圖22)。抗原+細胞本身不會對負載反應，其與THP-1細胞或PBMC反應細胞共培養，這些細胞具有FcgR能力並且容易對負載反應。由於Fc媒介的攝取會透過抗原依賴性FcgR聚集而增強，因此反應的有效刺激端視非反應細胞(例如腫瘤細胞)上存在的抗原以及反應細胞中的路徑活化而定。將抗原+細胞以0.1-5x10 5個細胞/孔接種於96孔盤中並靜置過夜以進行附著。次日，加入免疫細胞：1x10 5個細胞的THP-1細胞或5x10 5個細胞的PBMC。此外，添加測試物並留在細胞上歷時24 h。將與結合至抗原+細胞株的ProteinDocker預複合的接合物和帶有非結合劑的預複合物進行比較，以說明抗原結合在Fc媒介活性中的重要性。此外，將活性與游離負載進行比較，以分析Fc媒介的攝取和訊號傳導是否會增加活性勝過游離負載(僅被動進入細胞)。藉由THP-1報導讀數(參見THP-1分析)以說明路徑活化，或根據製造商的說明使用Mesoscale Multiplex Assay Kit藉由分析PBMC上清液中的分泌型細胞激素來分析活性。計算EC50值並在各組之間進行比較，以便了解與對照組相比的Fc媒介的活性。 實例 9 - ALFA STING 接合物的實例
參考品 結構
SD18317 (PIC8)
SD17248
PIC12
PIC13
PIC14
參考品 MW (g/mol) UPLC 方法； RT (min) LC-MS (M+H) +
SD18317 (PIC8) 3477.86 lcms_long_C4; 3.7 1160.68 (M+3H) 3+
SD17248 3214.62 lcms_long_C4; 4.1 1072.49 (M+3H) 3+
PIC12 3338.68 lcms_long_C4; 3.9 1113.79 (M+3H) 3+
PIC13 3314.74 lcms_long; 3.5 1105.91 (M+3H) 3+
PIC14 5110.68 lcms_short; 2.8 1279.46 (M+4H) 4+
參考品 結構
SD17247
SD17553
SD17453
SD17516
SD17537
SD18319
SD18320
SD18321 (PIC7)
SD18322
參考品 MW (g/mol) UPLC 方法； RT (min) LC-MS (M+H) +
SD17247 7731.70 lcms_long_C4; (4.4) 1105.59 (M+7H) 7+
SD17553 11547.79 lcms_long_C4; 1155.96 (M+10H) 10+
SD17453 6540.37 lcms_long_C4; 4.6 1091.21 (M+6H) 6+
SD17516 6770.56 lcms_long_C4; 4.6 1129.55 (M+6H) 6+
SD17537 7351.20 lcms_long_C4; 4.5 1226.29 (M+6H) 6+
SD18319 7901.88 lcms_long_C4; 3.7 1129.9 (M+7H) 7+
SD18320 8228.13 lcms_long_C4; 3.9 1029.44 (M+8H) 8+
SD18321 (PIC7) 8040.01 lcms_long_C4; 3.8 1149.67 (M+7H) 7+
SD18322 5561.23 lcms_long_C4_60C: 3.9 1113.00 (M+5H) 5+
材料與方法UPLC-MS儀器與方法
儀器：Waters H-Class UPLC，配備有QSM、樣品組織器、管柱加熱器、PDA UV偵測器和QDa質譜儀。
管柱： Waters BEH C18 Column ， 100 x 2.1 mm ， 1.7 µm ， 130 Å 孔徑
Lcms_long方法：40℃管柱溫度。UV吸收波長：214 nm。MS範圍：200-1250 Da。流動相A：0.1% TFA於水中。流動相B：0.085% TFA於乙腈中。流速：0.5 mL/min。梯度：
時間(min) % B
0.0 10
8.0 80
8.1 90
9.0 90
9.1 10
11.0 10
管柱： Waters BEH C 18Column ， 50 x 2.1 mm ， 1.7 µm ， 130 Å 孔徑
Lcms_short方法：40℃管柱溫度。UV吸收波長：214 nm。MS範圍：200-1250 Da。流動相A：0.1% TFA於水中。流動相B：0.085% TFA於乙腈中。流速：0.5 mL/min。梯度：
時間(min) % B
0.0 0
5 80
5.1 90
6.0 90
6.1 0
7.0 0
Lcms_long_C4_60C方法：與Lcms_long_C4方法相同，但管柱溫度為60℃。 SEC儀器與方法
製備型尺寸排阻層析術是在JAI Preparative Recycling HPLC (LaboACE LC-7080)系統上進行，該系統配備有串聯的2.5HR Plus和2HR Plus管柱(20×600 mm)，使用10% MeOH/CHCl3作為溶析液。 合成單 ALFA 中間體
合成 SD17248-A
步驟 1 ：合成環狀 ALFA 肽中間體， SD17248-A3
環狀ALFA肽中間體是使用Fmoc固相肽合成化學進行合成。將懸浮在10 mL的1：1二氯甲烷/二甲基甲醯胺(DCM：DMF)中的Rink醯胺AM樹脂加載到自動肽合成儀上，用於預溶脹和樹脂轉移。使用4 mL於DMF中的20%哌啶(在50℃下藉由微波加熱3 min)對N端α Fmoc保護基進行去保護以啟動肽合成。瀝乾後，用5 mL DMF將樹脂洗滌三次，每次洗滌五秒。然後透過添加2.5 mL下一個於DMF中的0.3 M胺基酸(7.5當量)、1 mL於DMF中的1 M DIC(10當量)溶液和0.5 mL於DMF中的1 M Oxyma (5當量)連同0.1M DIEA溶液至RV進行偶聯反應。將偶聯反應加熱至60℃歷時10 min。瀝乾反應溶液，並重複偶聯反應。第二次偶聯後，將樹脂瀝乾並用4 mL DMF洗滌四次。然後將4 mL於DMF中的20%哌啶加入RV，以脫除Fmoc基團的保護，並偶聯下一個胺基酸。對每個胺基酸依序重複Fmoc去除和偶聯的循環。Fmoc-Glu(O-2-PhiPr)-OH和Fmoc-Lys(Mmt)-OH胺基酸被併入肽中間體序列中以允許選擇性環化。固相肽合成完成後，將含肽樹脂轉移至20 mL燒結注射器中。向樹脂加入7 mL加帽溶液(81.25% DMF、12.5%於NMP中的2 M DIEA、6.25%乙酸酐)，並將反應攪拌15 min。移除加帽溶液，又再加入7 mL加帽溶液，並將反應再攪拌15 min。然後用DCM和DMF徹底洗滌樹脂。
步驟 2 ：對 Lys(Mmt) 和 Glu(O-2-PhiPr) 選擇性去保護， SD17248-A2
在燒結注射器中向含有 SD17248-A3的樹脂添加5 mL部分去保護混合物(2% TFA、2%TIS於DCM中)。將反應攪拌5 min，然後經由過濾從樹脂移除去保護混合物。加入另外5 mL部分去保護混合物，攪拌5 min，然後移除。重複這個過程六次，直到流出液的黃色/橙色消失(Mmt和2-PhiPr移除總共30 min)。用DCM和DMF徹底沖洗樹脂以得到 SD17248-A2。
步驟 3 ：經由側鏈醯胺鍵形成進行內醯胺環化， SD17248-A1
環化是在與步驟2的部分去保護相同的燒結注射器中進行。5當量的PyAOP與5當量的HOAt以DMF中的溶液被添加至注射器。讓樹脂膨脹，然後加入10當量的DIEA。將反應攪拌2-3小時。經由過濾從樹脂中移除反應混合物，並用DCM和DMF徹底沖洗剩餘的樹脂，得到 SD17248-A1。
步驟 4 ：切割和整體去保護， SD17248-A
在燒結注射器中向含有 SD17248-A1的樹脂加入10 mL切割混合物(87.5% TFA、5%大茴香硫醚、2.5%水、2.5% TIS、2.5% EDT)。將反應在室溫下攪拌歷時2 h，然後在40℃下攪拌歷時1 h。接著，藉由將反應溶液添加至~25mL冷乙醚中，然後離心，將所得肽中間體從溶液中沉澱出來。移除上清液，並將所得沉澱物重新溶解於50：50 MeCN：水中。藉由RP HPLC純化所得的粗製肽中間體，得到 SD17248-A。從0.3 mmol規模合成中分離出159.2 mg (產率25%，純度＞95%)。
[M+2H] 2+= 1038.99
合成 SD18317-A/PIC8-A
遵循與合成 SD17248A類似的方案製備標題化合物。
[M+2H]2 += 1184.23
合成 PIC12-A
遵循與合成 SD17248A類似的方案，使用Fmoc-L-半胱胺酸製備標題化合物。
[M+2H] 2+= 1114.18
合成 PIC13-A
遵循與合成 SD17248A類似的方案，使用Fmoc-AEPA-OH製備標題化合物。
[M+2H] 2+= 1102.18
合成 PIC14-A
遵循與合成 SD17248A類似的方案製備標題化合物。
[M+3H] 3+= 963.54 合成雙 ALFA 中間體
合成 SD17453-B
步驟 1 ：合成環狀 ALFA 肽中間體， SD17453-B3 ：
環狀ALFA肽中間體是使用Fmoc固相肽合成化學進行合成。將懸浮在10 mL的1：1二氯甲烷/二甲基甲醯胺(DCM：DMF)中的Rink醯胺AM樹脂加載到自動肽合成儀上，用於預溶脹和樹脂轉移。使用4 mL於DMF中的20%哌啶(在50℃下藉由微波加熱3 min)對N端α Fmoc保護基進行去保護以啟動肽合成。瀝乾後，用5 mL DMF將樹脂洗滌三次，每次洗滌五秒。然後透過添加2.5 mL下一個於DMF中的0.3 M胺基酸(7.5當量)、1 mL於DMF中的1 M DIC(10當量)溶液和於DMF中的0.5 mL 1 M Oxyma (5當量)連同0.1M DIEA溶液至RV進行偶聯反應。將偶聯反應加熱至60℃歷時10 min。瀝乾反應溶液，並重複偶聯反應。第二次偶聯後，將樹脂瀝乾並用4 mL DMF洗滌四次。然後將4 mL於DMF中的20%哌啶加入RV，以脫除Fmoc基團的保護，並偶聯下一個胺基酸。對每個胺基酸依序重複這個Fmoc去除和偶聯的循環。對偶聯至樹脂的第一個殘基使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH以使得2個ALFA肽同時長成。Fmoc-Glu(O-2-PhiPr)-OH和Fmoc-Lys(Mmt)-OH胺基酸被併入肽中間體序列中以允許選擇性環化。固相肽合成完成後，將含肽樹脂轉移至20 mL燒結注射器中。向樹脂加入7 mL加帽溶液(81.25% DMF、12.5%於NMP中的2 M DIEA、6.25%乙酸酐)，並將反應攪拌15 min。移除加帽溶液，又再加入7 mL加帽溶液，並將反應再攪拌15 min。然後用DCM和DMF徹底洗滌樹脂。
步驟 2 ：對 Lys(Mmt) 和 Glu(O-2-PhiPr) 選擇性去保護， SD17453-B2
向含有 SD17453-B3的樹脂添加5 mL部分去保護混合物(2% TFA、2% TIS於DCM中)。將反應攪拌5min，然後經由過濾從樹脂移除去保護混合物。加入另外5 mL部分去保護混合物，攪拌5 min，然後移除。重複這個過程六次，直到流出液的黃色/橙色消失(Mmt和2-PhiPr移除總共30 min)。用DCM和DMF徹底沖洗樹脂以得到 SD17453-B2。
步驟 3 ：經由側鏈醯胺鍵形成進行內醯胺環化， SD17453-B1
環化在與步驟2的部分去保護相同的燒結注射器中進行。10當量的PyAOP與10當量HOAt以DMF中的溶液被添加至注射器。讓樹脂膨脹，然後加入20當量的DIEA。將反應攪拌2-3小時。經由過濾從樹脂中移除反應混合物，並用DCM和DMF徹底沖洗剩餘的樹脂，得到 SD17453-B1。
步驟 4 ：切割和整體去保護， SD17453-B
在燒結注射器中向含有 SD17453-B1的樹脂加入10 mL切割混合物(87.5% TFA、5%大茴香硫醚、2.5%水、2.5% TIS、2.5% EDT)。將反應在室溫下攪拌2 h，然後在40℃下攪拌1 h。接著，藉由將反應溶液添加至~25mL冷乙醚中，然後離心，將所得肽中間體從溶液中沉澱出來。移除上清液，並將所得沉澱物重新溶解於50：50的MeCN：水中。藉由RP HPLC純化所得的粗製肽中間體，得到SD17453-B。從0.3 mmol規模合成中分離出42 mg (產率5%，純度＞95%)。
[M+4H] 4+= 1066.52
合成 SD17537-B
遵循與合成 SD17453-B類似的方案製備標題化合物。
[M+4H] 4+= 1211.63
合成 SD18319-B
遵循與合成 SD17453-B類似的方案，使用Fmoc-AEPA-OH製備標題化合物。
[M+5H] 5+= 1225.49
合成 SD18320-B
遵循與合成 SD17453-B類似的方案製備標題化合物。
[M+5H] 5+= 1201.66
合成 SD18321-B/PIC7-B
遵循與合成 Int-E-003類似的方案製備標題化合物。
[M+5H] 5+= 1164.25
合成 SD18322-B
遵循與合成 SD17453-B類似的方案製備標題化合物。
[M+4H] 4+= 1113.28
合成 STING 藥物 - 連接子
合成 BrAc-AEEA2-16871 藥物 - 連接子
以 SD16871開始在3個步驟內製備 BrAc-AEEA2-16871。將SD16871 (45 mg，0.0576 mmol，1當量)溶解於DMF (2.5 mL)中。向此溶液添加Boc-AEEA2-OH (CAS 1069067-08-8) (28.2 mg，0.0691 mmol，1.2當量)、HATU (65.6 mg，0.173 mmol，3當量)和DIEA (30 uL，0.173 mmol，0.3當量)。40 min後，透過UPLC-MS分析判斷反應完成。真空移除DMF，將產物重新溶解於CHCl 3中的10% MeOH並藉由SEC純化。
將純 Boc-AEEA2-16871(22.27 mg，0.019 mmol)溶解於DCM (2.4 mL)中。向此溶液添加600 uL TFA。如藉由UPLC-MS判斷，5 min後Boc移除完成。真空移除DCM，將產物懸浮於5 mL水中並凍乾。
將純 H2N-AEEA2-16871(20.4 mg，0.019 mmol)溶解於1.5 mL DMF中。向此溶液添加溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(9 mg，0.038 mmol，2當量)和DIEA (10 uL，0.057 mmol，3當量)。如藉由UPLC-MS判斷，5 min後反應完成。真空移除DMF，將產物重新溶解於CHCl 3中的10% MeOH並藉由SEC純化。分離出16.25 mg (在3個步驟內為24%)。
[M+2H] 2+= 598.31
合成 BrAc-AEEA2-16803
遵循與合成 BrAc-AEEA2-16871類似的方案製備標題化合物。
[M+2H] 2+= 611.29
合成 ClAc-GGFG-AM-16803
遵循與合成 BrAc-AEEA2-16871類似的方案，使用Fmoc-GGFG-AM-OH (CAS 2264011-98-3)和氯乙酸製備標題化合物。用TFA代替Boc去保護，藉由將溶液加入DMF中的20%哌啶來移除Fmoc。反應時間10 min後，Fmoc移除完成。使溶液在MTBE中破碎並離心。倒出上清液，將沉澱物重新懸浮在MeOH中，並再次於MTBE中破碎以分離H2N-GGFG-AM-16803。在合成 BrAc-AEEA2-16871期間以與溴乙酸偶聯類似的方式進行氯乙酸偶聯。
[M+2H] 2+= 646.22 經由硫醇結合反應合成 ALFA-STING 接合物
合成 SD18317/PIC8
將 SD18317-A/PIC8-A(22 mg，0.0093 mmol)和 BrAc-AEEA2-16871(12.2 mg，0.0102 mmol，1.2 當量)溶於DMF (250u L)中。向此溶液添加DIEA (9 uL，0.0558 mmol，6當量)。在室溫下攪拌反應混合物。如藉由UPLC-MS監測判斷，10 min後反應完成。藉由RP-HPLC進行純化，分離出5.5 mg的 PIC8(產率17%，純度＞95%)。
[M+3H] 3+= 1160.68
合成 SD17248
遵循與合成 PIC8類似的方案，使用 BrAc-AEEA2-16803製備標題化合物。
[M+3H] 3+= 1072.49
合成 PIC12
遵循與合成 PIC8類似的方案製備標題化合物。
[M+3H] 3+= 1160.68
合成 PIC13
遵循與合成 PIC8類似的方案製備標題化合物。在結合完成後，藉由向反應混合物添加哌啶達到20% v/v來移除Fmoc。然後藉由HPLC純化所得混合物。
[M+3H] 3+= 1105.91
合成 PIC14
遵循與合成 PIC8類似的方案，使用2.2當量的 BrAc-AEEA-16871藥物-連接子製備標題化合物。
[M+4H] 4+= 1279.46
合成 SD17247
遵循與合成 EX-015類似的方案，使用2.2當量的 BrAc-AEEA-16803藥物-連接子製備標題化合物。
[M+7H] 7+= 1105.59
合成 SD17553
遵循與合成 EX-015類似的方案，使用4.4當量的 ClAc-GGFG-AM-16803藥物-連接子製備標題化合物。
[M+10H] 10+= 1155.96
合成 SD17453
遵循與合成 PIC8類似的方案，使用2.2當量的 BrAc-AEEA-16803藥物-連接子製備標題化合物。
[M+6H] 6+= 1091.21
合成 SD17516
遵循與合成 PIC8類似的方案，使用2.2當量的 ClAc-GGFG-AM-16803藥物-連接子製備標題化合物。
[M+6H] 6+= 1129.55
合成 SD17537
遵循與合成 PIC8類似的方案，使用2.2當量的 ClAc-GGFG-AM-16803藥物-連接子製備標題化合物。
[M+6H] 6+= 1226.29
合成 SD18319
遵循與合成 PIC8類似的方案，使用2.2當量的 BrAc-AEEA2-16871藥物-連接子製備標題化合物。
[M+7H] 7+= 1129.9
合成 SD18320
遵循與合成 PIC8類似的方案，使用2.2當量的 BrAc-AEEA2-16871藥物-連接子製備標題化合物。
[M+8H] 8+= 1029.44
合成 SD18321/PIC7
遵循與合成 PIC8類似的方案，使用2.2當量的 BrAc-AEEA2-16871藥物-連接子製備標題化合物。結合完成後，藉由向反應混合物添加哌啶達到20% v/v來移除Fmoc。然後藉由HPLC純化所得混合物。
[M+7H] 7+= 1149.67
合成 SD18322
遵循與合成 PIC8類似的方案製備標題化合物。
[M+5H] 5+= 1113.00 實例 10 - 親和力、結合性和結合評估以及複合物形成測試 材料與方法 測量包含雙 ALFA 和 NbALFA 的蛋白質的親和力驅動的交互作用
關於結合性測量，採用Octet HTX的16通道模式以便同時雙重參考。市售SSA生物感測器在KB中淬滅10 min，然後是120 sec基線測量。隨後，16個生物感測器中的八個加載2.5 µg/mL生物素化NbALFA歷時60 sec，而其餘8個生物感測器在KB中進一步培育。所有生物感測器均在100 µg/mL生物細胞素溶液中淬滅120 sec。按照生物感測器-管柱使用七種不同濃度的雙ALFA衍生物在900 sec內測量締合，從2.5 nM開始以1：1連續稀釋低至39.0625 pM。作為參考品，KB是用兩個生物感測器管柱的第八個生物感測器進行測量的。在1500 sec內於KB中獲得解離。從成對加載NbALF的生物感測器扣除參考生物感測器的訊號，接著將各別管柱中所有生物感測器扣除參考孔訊號。這個雙重參考步驟之後，將訊號與第二基線的平均值比對。關於步驟間校正，將數據與解離步驟比對，並套用Savitzky-Golay濾波。使用1：1朗繆結合模型全域擬合締合和解離。 雙 ALFA 和二價 ProteinDocker 在溶液中的結合
為了研究複合物的形成，將二價ProteinDocker在PBS中與不同濃度的雙ALFA接合物混合。用30 µM雙ALFA接合物將最終濃度調整至3 µM蛋白質。混合後，將樣品在室溫下培育至少20 min，以使NbALFA部分結合至雙ALFA接合物上的ALFA標籤。 用於複合物偵測的動態光散射
使用NanoTemper的Prometheus PANTA進行動態光散射測量。將10 µL預培育的雙ALFA-ProteinDocker複合物或單獨ProteinDocker加載至毛細管中。根據測試物(蛋白質)的半徑繪製強度分布，從而可以評估樣品中是否存在較大的聚集複合物。
所有測量至少以二重複進行。 結果 評估結合性驅動之雙 ALFA STING 促效劑與 NbALFA 交互作用
首先，我們努力研究雙ALFA接合物的兩個ALFA標籤是否可以同時與兩個NbALFA VHH結合，以及STING促效劑的存在是否會干擾這種交互作用。在使用NbALFA作為配體以及雙ALFA作為分析物的生物層干涉測量中，揭示了高仿射交互作用，解離速率超過儀器限制(圖23)。這種極慢的解離速率清楚表明結合性驅動的交互作用，證明兩個ALFA標籤可以同時被兩個NbALFA VHH所接合，而STING促效劑不會干擾這種交互作用。 複合物形成評估
針對二價ProteinDocker和雙ALFA接合物，設想了一種1：1交互作用。然而，如果一個ProteinDocker以2：1的方式結合至兩個獨立的雙ALFA接合物，則兩個ALFA標籤在這個複合物中保持游離狀態，並且可以被其他ProteinDocker接合。結果，可能形成大型的巨分子簇，這可能對抗體的PK和免疫原性產生負面影響。
為了研究複合物形成，在DLS中研究包含兩個NbALFA VHH部分的ProteinDocker。由此產生的強度分布產生低累積半徑，顯示蛋白質溶液中不存在聚集體。接下來，將ProteinDocker與10倍過量的雙ALFA STING促效劑一起培育，並重複DLS測量(圖24)。在高半徑值處觀察到少量的峰，但是，DLS過度代表了較大的分子，因為它們散射光更強。由於單體峰是最突出的峰，因此較大型複合物必須以非常低的豐度存在。
綜上所述，吾人證明雙ALFA STING促效劑經由兩個ALFA標籤以高結合性被NbALFA有效結合，並且在遇到展現兩個NbALFA部分的ProteinDocker時不會產生不樂見的高分子複合物。 實例 11 - 使用單價 RiboDocker 和經放射性標記的二價 ALFA ( 雙 ALFA) 肽的預靶向方法 Ga68-DOTA- 雙 ALFA 在有或沒有 RiboDocker 時的生物分布 ( 圖 25)
攜帶OV-90異種移植物的無胸腺裸鼠被投予30 µg針對腫瘤抗原並包含抗ALFA VHH的RiboDocker。隨後，大約幾個小時後(先前的研究中已證明足以從循環中消除RiboDocker的時間框架)，以0.1 nmol (10 MBq)的劑量靜脈內投予經Ga68放射性標記的DOTA-雙ALFA (包含兩個環化ALFA肽，各自以低親和力結合至抗ALFA VHH)。投予Ga68-DOTA-雙ALFA後3.5小時，將小鼠安樂死，並經由心臟穿刺收集血液樣品。接著，收取腫瘤和相關內臟器官，秤重並在具有針對Ga-68優化的能量範圍的伽瑪計數器中進行計數。計算每克組織的注射劑量百分率(%ID/g)。
投予RiboDocker後，在腫瘤組織內發現了雙ALFA肽顯著累積(10.3% ID/g)，而在腎臟以外的正常組織中留存的含量可以忽略不計。經放射性標記的雙ALFA由於其低分子量(~5 kDa)而經由腎臟排泄。該肽似乎被重新吸收，導致這個區域產生明顯的訊號。
值得注意的是，未用RiboDocker預把向的腫瘤在腫瘤中展現出Ga-68-DOTA-雙ALFA的低攝取(0.3% ID/g)，指出雙ALFA在腫瘤中的特異性累積是衍生自RiboDocker的預定位。
總而言之，這個研究的結果表明，用只有一個針對低親和力ALFA肽之結合位點的RiboDocker以及二價經Ga68標記的雙ALFA肽進行預靶向有可能成為一種高度敏感的腫瘤診斷方式。
因為RiboDocker單價結合至這個研究中所採用的二價ALFA肽，因此採用了AES (親和力增強系統效應(Affinity Enhancement System Effect))。這導致RiboDocker和ALFA肽之間在循環中的親和力較低，而在腫瘤中觀察到強烈的結合性效應。 RiboDocker 和雙 ALFA 治療方法用於治療的潛力 ( 圖 26)
本研究之目的是確定(除了Ga-68之外的)替代同位素是否可以與RiboDocker雙ALFA預靶向方法組合使用。此外，目的是確定在雙ALFA注射後3.5小時時間點監測腫瘤訊號的可能性。從治療的角度來看，在腫瘤中停留時間越長將是有益的。
如前所述，先用30 µg RiboDocker處理攜帶OV-90的裸鼠。隨後，在從血流中清除大部分RiboDocker後，投予0.1 nmol經放射性標記的DOTA-雙ALFA。如同前述實驗中所做的那樣，採用Cu-64代替使用Ga-68來標記雙ALFA肽。有鑑於Cu64的半衰期比Ga68的半衰期更長(分別為12.5小時和68 min)，這個同位素更適合分析注射後稍晚測量時間的數據。
這些數據提供了豐富的見解。透過改變同位素來獲得類似的結果是可行的。此外，肽注射後持續至多24小時可偵測到腫瘤訊號(8.8%ID/g)，這表示治療方法有效。結合的雙ALFA在腫瘤部位停留的時間越長，有效治療的可能性就越大。按照這種方式，吾人可以將Cu64同位素與治療同位素互換，或將同位素與毒素或免疫調節劑互換。 實例 12 - 使用經轉染以表現抗原的抗原 + 腫瘤細胞株和 THP-1 雙報導細胞的共培養物的預複合物的活體外活性，指明 IRF 和 NFB 誘導 THP-1 共培養分析方案
THP-1 Dual Cells TM購自Invivogen (Cat. Thpd-nfis)，並於有或沒有抗原存在下用於在分子層次上確定測試物的生物活性以及確定STING訊號傳導的下游活化(IRF和NFкB路徑活化)。簡言之，在實驗開始前一天接種培養的抗原+腫瘤細胞(96孔形式，於細胞類型建議的培養基+10%熱不活化FBS中)。接種後24小時，以每孔1 x 10 5個細胞添加THP-1細胞(不含FBS的細胞類型建議的培養基)。隨後添加測試物的連續稀釋液。這些測試物由結合結構域(ProteinDocker)和免疫接合物組成。這兩個組分在室溫下預複合歷時30 min，隨後稀釋並被添加到抗原+細胞。使用總共8個濃度在THP-1細胞中確定NFкB和IRF路徑的劑量依賴性活化。在抗原存在的情形下，預複合物經由FcgR接合被攝取到THP-1細胞中，導致STING媒介的免疫活化。刺激後24小時，透過離心細胞並收取上清液以供分析分泌型鹼性磷酸酶(藉由QUANTI-Blue TM偵測溶液測量，Cat. Rep-qbs Invivogen)和lucia螢光素酶(藉由QUANTI-Luc TM試劑測量，Cat. Rep-qlc1 Invivogen)來偵測免疫活化。讀數是根據製造商的說明進行的。圖形說明是使用GraphPad Prism 9創建的。 雙 ALFA 活體外共培養
圖27與28描述由ProteinDocker和不同的免疫接合物組成的預複合物的活性數據，將其添加到共接種的抗原+腫瘤細胞和THP-1雙報導細胞歷時24小時。比較的是與結合性ProteinDocker和非結合性對照複合的接合物。分析了THP-1雙報導細胞中STING媒介的訊號。ProteinDocker和免疫接合物的複合物被認為結合至腫瘤細胞上的抗原，此外還結合至骨髓細胞上的FcγR，導致旁觀者抗原免疫細胞的攝取與活化。分析的活性訊號指出僅有第二種攝取方式，因為未讀出腫瘤細胞刺激。與非結合劑相比，所有免疫接合物與結合性ProteinDocker結合時展現出更高的活性，如與兩種不同抗原+ 腫瘤細胞株共培養所見。與具有更加疏水的SD16803負載的接合物相比，具有SD16871負載的接合物的預複合物在更高濃度下表現出活性起始。這種活性差異是預期中的，因為僅負載之間的活性就相差20倍(圖29)，這在預複合物活性分析中也可見到。
觀察到與抗原表現無關的殘餘活性，因為非結合劑預複合物在高濃度下會誘導訊號。在不同程度上觀察到結合劑和非結合劑之間的轉變，但與非結合劑相比，所有測試的接合物在抗原存在下均展現出活性升高。與基於SD16803的化合物相比，含有SD16871負載的接合物的非結合劑背景有所降低。一般來說，偏好具有強烈抗原特異性活性但在抗原陰性環境中背景活性低的預複合物。抗原陰性環境中的高活性可能表示脫靶活性。因此，儘管在抗原特異性環境中的活性稍低，但基於非結合劑的低活性，將偏好基於SD16871的接合物。 實例 13 - 預複合物功效在同種同基因移植物 (syngraft) 中的活體內測試 預複合物功效在同種同基因移植物中的活體內測試方案
在鼠類B16F10黑色素瘤模型中測試ProteinDocker和免疫接合物之預複合物的抗腫瘤功效，這個模型經穩定轉染以過度表現模型抗原。C57Bl/6JRjx小鼠皮下注射3 x 10 5個B16F10細胞。在腫瘤接種後第13天和第19天靜脈內注射兩種具有抗原結合性ProteinDocker和非結合劑的預複合物。測試物配製於含有10% 5x HEPES、10%甘油和0.1% DMSO的PBS中。使用卡尺測量([mm]^3=(寬度×寬度×長度)/2)監測腫瘤尺寸，直到小鼠達到排除標準。 免疫接合物再同種同基因移植物中的抗腫瘤效用
為了說明兩種免疫接合物與ProteinDocker結合的抗腫瘤效用，使用沒有特定切割位點的SD17453和含有GGFG切割模體的SD17516進行活體內實驗。在兩次靜脈內注射後，兩種預複合物觀察到腫瘤生長顯著減少(圖30)。抗原特異性ProteinDocker觀察到的效用比非結合劑更強，然而非結合劑也展現出比未經處理組更好的腫瘤控制。這項觀察結果可能是由於EPR效應(增強的滲透性和滯留)，一定尺寸(≧40 kDa)的巨分子在腫瘤內被動累積。然而，與這種被動累積效用相比，使用抗原引導的ProteinDocker提高了功效。這個更勝於非結合性對照的優勢就SD17453來說略大於SD17516。
無
圖 1 ：(a) EX-004和(b) EX-007的血漿穩定性結果。所有測試的化合物在人類血漿中都更為穩定。 圖 2 ：雙ALFA接合物在親和力與結合性測量中的締合與解離曲線。時間繪製在X軸上，而親和力測量的反應繪製在左側Y軸上，結合性設定中的反應繪製在右側Y軸上。親和力曲線被描繪為虛線，而結合性結合曲線則顯示為實線。這些對對應於表2。 圖 3 ：雙ALFA接合物在親和力與結合性測量中的締合與解離曲線。時間繪製在X軸上，而親和力測量的反應繪製在左側Y軸上，結合性設定中的反應繪製在右側Y軸上。親和力曲線被描繪為虛線，而結合性結合曲線則顯示為實線。這些對對應於表3。關於高親和力對，納入線性NbALFA的親和力測量作為參考，反應繪製在第二個左側Y軸上。 圖 4 ：在不同濃度的雙ALFA接合物EX-036存在下，二價ProteinDocker的變性曲線。將350 nm和330 nm處的螢光訊號比值的一階導數相對於溫度作圖。最小值和最大值反映TM值。雖然頂行中的圖在~54℃處顯示出明顯的最小值，這反映了NbALFA的TM值，但在將至少等莫耳濃度的雙ALFA施用於ProteinDocker的下面兩個圖中，沒有觀察到這樣的最小值。 圖 5 ：在不同濃度的雙ALFA接合物EX-036的情況下，二價ProteinDocker的尺寸排阻分析。上圖表示雙ALFA接合物分子過量10倍，而中圖顯示與ProteinDocker等莫耳濃度的雙ALFA。在下圖中，相較於ProteinDocker，以10倍低分子濃度添加雙ALFA。總是以虛線疊加未複合的Protein Docker作為比較。 圖 6 ：依據HPLC，肽29冷未標記化學純度。 圖 7 ：Ga-68-DOTA-肽29的放射性HPLC層析圖。 圖 8 ：放射性TLC肽29經Ga-68標記。 圖 9 ：依據HPLC，肽31冷未標記化學純度。 圖 10 ：Ga-68-DOTA-肽31的放射性-HPLC層析圖。 圖 11 ：經Ga-68標記的肽31的放射性TLC。 圖 12 ：經Ga-68標記的肽29在7hr內的穩定性。 圖 13 ：經Ga-68標記的肽31在7 hr內的穩定性。 圖 14 ：In-111-DOTA-肽29的放射性-HPLC層析圖。 圖 15 ：經In-111標記的肽29的放射性TLC。 圖 16 ：In-111-DOTA-肽31的放射性-HPLC層析圖。 圖 17 ：經In-111標記的肽31的放射性TLC。 圖 18 ：經In-111標記的肽29在24 hr內的穩定性。 圖 19 ：經In-111標記的肽31在24 hr內的穩定性。 圖 20顯示抗原陰性ES-2和抗原陽性ES-2-抗原+細胞在處理後73小時，cytotox讀數的劑量反應曲線。僅二價Proteindocker和ProteinDocker + EX-036作為ProteinDocker媒介效應的對照。使用抗原陰性細胞或具有不相關目標的ProteinDocker來評估ProteinDocker + 雙ALFA複合物的特異性。EC50值經過計算並顯示在圖表中。 圖 21 ：RiboDocker免疫調節劑的組分。 圖 22 ：用於分析Fc媒介的活性的共培養分析。 圖 23 ： 雙 ALFA-STING 促效劑對 NbALFA 的生物層干涉結合性測量。顯示了SD17453 (A)或SD17516 (B)與NbALFA的結合性驅動交互作用的感測圖。將雙ALFA-STING促效劑的1：1連續稀釋液(從2.5 nM開始低至39.0625 pM)施加至固定的NbALFA歷時900秒。Y軸上描繪了基於NbALFA-ALFA結合的波長變化。900秒(垂直線)後，開始解離並測量剩餘的1500秒。所擷取的數據點描繪為連續線，而基於全局1：1朗謬(Langmuir)結合模型的全局擬合描繪為虛線。從這個擬合得出的動力學交互作用參數描繪於C中。 圖 24 ：使用動態光散射評估複合物形成。包含兩個NbALFA VHH部分的ProteinDocker在沒有雙ALFA STING促效劑肽(無肽)或與10倍過量的SD17516或SD17453的情況下培育。在較高半徑處觀察到的強度表明形成了較大的分子複合物。 圖 25 ： Ga68-DOTA- 雙 ALFA 在有和沒有 RiboDocker 時的生物分布。 圖 26 ： Cu64-DOTA- 雙 ALFA 在有 RiboDocker 時的生物分布。 圖 27 ：使用抗原+腫瘤細胞株(其經轉染以表現抗原)和THP-1雙報導細胞的共培養物的預複合物的活體外活性，指出IRF和NFB誘導，如THP-1-共培養分析方案中所述。 圖 28 ：使用內源性表現抗原的第二抗原+腫瘤細胞株和THP-1雙報導細胞的共培養物的預複合物的活體外活性，指出IRF和NFB誘導，如THP-1共培養物分析方案中所述。 圖 29 ：THP-1雙報導細胞中兩種STING靶向小分子負載的活體外活性。 圖 30 ：與具有非結合性ProteinDocker的複合物相比，由腫瘤抗原靶向ProteinDocker和SD17453 (A)或SD17516 (B)組成的預複合物的抗腫瘤功效。A+B)腫瘤生長描述為平均值+SEM。C)單一腫瘤的生長。
無
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Claims (155)

  1. 一種套組，其包含： (i) 包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物，或編碼該化合物的核酸；及 (ii) 包含負載部分和至少兩個標籤的化合物，針對標籤之該結合部分結合至該至少兩個標籤， 其中該標籤是肽標籤。
  2. 如請求項1之套組，其中(ii)的化合物包含有包含聚合物的部分。
  3. 如請求項1或2之套組，其中該負載部分和該肽標籤透過包含聚合物的部分所偶聯。
  4. 如請求項2或3之套組，其中該聚合物不是蛋白質胺基酸(proteinogenic amino acid)或其D-異構物的聚合物。
  5. 一種套組，其包含： (i) 包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之該結合部分的化合物，或編碼該化合物的核酸；及 (ii) 包含負載部分和至少兩個標籤的化合物，針對標籤之該結合部分結合至該至少兩個標籤， 其中(ii)的化合物進一步包含有包含聚合物的部分，其中該聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
  6. 如請求項5之套組，其中該負載部分和該標籤透過包含聚合物的部分所偶聯，其中該聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
  7. 如請求項5或6之套組，其中該標籤是肽標籤。
  8. 如請求項2至7中任一項之套組，其中該聚合物選自由聚(乙二醇) (PEG)、聚肌胺酸(polysarcosine，pSar) (聚(N-甲基甘胺酸))、聚㗁唑啉(polyoxazoline，POX)、聚㗁嗪(polyoxazine，POZ)和聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)，其衍生物和組合所組成之群組。
  9. 如請求項2至8中任一項之套組，其中該聚合物包含至少一個聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  10. 如請求項1至9中任一項之套組，其中該負載部分和該標籤透過包含至少一個聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物的部分偶聯。
  11. 如請求項1至10中任一項之套組，其中該核酸是RNA。
  12. 如請求項1至11中任一項之套組，其中(ii)的化合物包含該等標籤中的兩個。
  13. 如請求項1至12中任一項之套組，其中(ii)的化合物包含呈非分支(線性)構形的負載部分及標籤。
  14. 如請求項1至13中任一項之套組，其中(ii)的化合物包含下式： P-L A-T-L B-T 或 P-L A-T-L B-T-L C-P 其中 P包含負載部分； T包含標籤； L A包含連接部分； L B包含連接部分；且 L C包含連接部分。
  15. 如請求項14之套組，其中L A、L B和L C中的一或多者包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  16. 如請求項14或15之套組，其中L B包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  17. 如請求項14至16中任一項之套組，其中L A及/或L C包含酶促切割位點。
  18. 如請求項14至17中任一項之套組，其中L A、L B和L C中的一或多者包含式[AEEA] u-[L D-[AEEA] v] w， 其中 AEEA是2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸或其衍生物； L D包含連接部分； u為2或更大的整數； 各v為2或更大的整數；且 w為1至4的整數； 其中 不同的基團[L D-[AEEA] v]可能相同或不同。
  19. 如請求項14至18中任一項之套組，其中L B包含式[AEEA] u-[L D-[AEEA] v] w， 其中 AEEA為2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸或其衍生物； L D包含連接部分； u為2或更大的整數； 各v為2或更大的整數；且 w為1至4的整數； 其中 不同的基團[L D-[AEEA] v]可能相同或不同。
  20. 如請求項18或19之套組，其中u和v各自為2至10的整數。
  21. 如請求項1至12中任一項之套組，其中(ii)的化合物包含呈分支(非線性)構形的負載部分和標籤。
  22. 如請求項1至12及21中任一項之套組，其中(ii)的化合物包含下式： [[P] m-L 1] n-B 1-[L 2-T] o其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； T包含標籤； L 1包含連接部分； L 2包含連接部分； m為1至4的整數； n為1至4的整數；且 o為2至4的整數；其中 不同的基團[L 2-T]可能相同或不同，不同的基團P可能相同或不同，且不同的基團[[P] m-L 1]可能相同或不同。
  23. 如請求項1至22中任一項之套組，其中該負載部分選自由放射性同位素、毒素和免疫調節劑所組成之群組。
  24. 如請求項22或23之套組，其中B 1的化合價數(valency)對應於或大於n和o的總和。
  25. 如請求項22至24中任一項之套組，其中B 1包含胺基酸或雙胺基酸(bis-amino acid)。
  26. 如請求項22至25中任一項之套組，其中B 1包含胺基酸的D-異構物。
  27. 如請求項22至26中任一項之套組，其中B 1包含半胱胺酸或離胺酸。
  28. 如請求項22至27中任一項之套組，其中L 1包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  29. 如請求項22至28中任一項之套組，其中L 1包含酶促切割位點。
  30. 如請求項22至29中任一項之套組，其中L 2包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  31. 如請求項8至30中任一項之套組，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間。
  32. 如請求項8至31中任一項之套組，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間。
  33. 如請求項8至32中任一項之套組，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目為2、4或6。
  34. 如請求項22至33中任一項之套組，其中L 2包含選自由以下所組成之群組的一或多者：限制構形的部分、供白蛋白結合的部分、增加循環時間的部分、減少腎滯留或攝取的部分，以及酶促切割位點。
  35. 如請求項22至34中任一項之套組，其中L 2包含(i)包含半胱胺酸的部分和(ii)聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物和T藉由該包含半胱胺酸的部分所連接。
  36. 如請求項22至35中任一項之套組，其中[[P] m-L 1]包含式[[P-L 1'] m-B 2-L 1'']， 其中 B 2包含分支部分； L 1'包含連接部分； L 1''包含連接部分；且 m為1至4的整數；其中 不同的基團[[P-L 1'] m-B 2-L 1'']可能相同或不同，且其中在基團[[P-L 1'] m-B 2-L 1'']中，不同的基團[P-L 1']可能相同或不同。
  37. 如請求項36之套組，其中B 2的化合價數對應於或大於m加上1的值。
  38. 如請求項36或37之套組，其中B 2包含胺基酸。
  39. 如請求項36至38中任一項之套組，其中B 2包含胺基酸的D-異構物。
  40. 如請求項36至39中任一項之套組，其中B 2包含半胱胺酸或離胺酸。
  41. 如請求項36至40中任一項之套組，其中L 1'包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物、聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物、半胱胺酸，或其組合。
  42. 如請求項36至41中任一項之套組，其中L 1 ''包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  43. 如請求項36至42中任一項之套組，其中L 1''包含經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的部分。
  44. 如請求項43之套組，其中經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的部分是胺基酸。
  45. 如請求項44之套組，其中經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的胺基酸是離胺酸。
  46. 如請求項42至45中任一項之套組，其中L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間。
  47. 如請求項42至46中任一項之套組，其中L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間。
  48. 如請求項42至47中任一項之套組，其中L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目為2、4或6。
  49. 如請求項36至48中任一項之套組，其中L 1'及/或L 1''經增溶(solubilizing)官能基取代。
  50. 如請求項36至49中任一項之套組，其中L 1'及/或L 1''包含經增溶官能基取代的胺基酸。
  51. 如請求項50之套組，其中經增溶官能基取代的胺基酸是離胺酸或半胱胺酸。
  52. 如請求項22至51中任一項之套組，其中m為1至3的整數，n為1至3的整數，而o為2或3。
  53. 如請求項22至52中任一項之套組，其中o為2。
  54. 如請求項22至53中任一項之套組，其中n為1或2。
  55. 如請求項22至54中任一項之套組，其中m為1或2。
  56. 如請求項22至55中任一項之套組，其中o為2，n為1且m為1。
  57. 如請求項1至56中任一項之套組，其中該負載部分包含放射性同位素，例如包含放射性同位素的螯合化合物。
  58. 如請求項57之套組，其中(i)的化合物包含針對該標籤之單一結合部分。
  59. 如請求項22至55中任一項之套組，其中o為2，n為2且m為2。
  60. 如請求項1至56及59中任一項之套組，其中該負載部分包含毒素或免疫調節劑。
  61. 如請求項60之套組，其中(i)的化合物包含至少兩個針對該標籤之該結合部分。
  62. 如請求項60或61之套組，其中(i)的化合物包含兩個針對該標籤之該結合部分。
  63. 如請求項1至12及21至62中任一項之套組，其中(ii)的化合物包含下式： P-L 1-B 1-[L 2-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； T包含標籤； L 1包含連接部分；且 L 2包含連接部分；其中 不同的基團[L 2-T]可能相同或不同。
  64. 如請求項1至12及21至63中任一項之套組，其中(ii)的化合物包含下式： P-[AEEA] p-B 1-[[AEEA] q-R-[AEEA] r-C-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； R為視情況選用的並包含限制構形的部分； C為視情況選用的並包含連接部分； T包含標籤； p為0至6的整數； q為1至4的整數；且 r為1至4的整數；其中 不同的基團[[AEEA] q-R-[AEEA] r-C-T]可能相同或不同。
  65. 如請求項1至12及21至64中任一項之套組，其中(ii)的化合物包含下式： [[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’] 2-B 1-[L 2-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； B 2包含分支部分； T包含標籤； L 1'包含連接部分； L 1 ’’包含連接部分；且 L 2包含連接部分；其中 不同的基團[[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’]可能相同或不同，其中在基團[[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同，而不同的基團[L 2-T]可能相同或不同。
  66. 如請求項1至12及21至65中任一項之套組，其中(ii)的化合物包含下式： [[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s] 2-B 1-[[AEEA] t-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； B 2包含分支部分； T包含標籤； L 1'包含連接部分； s為2至8的整數；且 t為2至8的整數；其中 不同的基團[[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s]可能相同或不同，其中在基團[[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同，而不同的基團[[AEEA] t-T]可能相同或不同。
  67. 如請求項1至66中任一項之套組，其中該標籤為ALFA標籤。
  68. 如請求項1至67中任一項之套組，其中該標籤為環狀ALFA標籤。
  69. 一種化合物，其包含負載部分及至少兩個肽標籤。
  70. 如請求項69之化合物，其包含有包含聚合物的部分。
  71. 如請求項69或70之化合物，其中該負載部分和該肽標籤是透過包含聚合物的部分所偶聯。
  72. 如請求項70或71之化合物，其中該聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
  73. 一種化合物，其包含負載部分及至少兩個標籤，其中該化合物進一步包含有包含聚合物的部分，其中該聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
  74. 如請求項73之化合物，其中該負載部分和該標籤是透過包含聚合物的部分所偶聯，其中該聚合物不是蛋白質胺基酸或其D-異構物的聚合物。
  75. 如請求項73或74之化合物，其中該標籤是肽標籤。
  76. 如請求項70至75中任一項之化合物，其中該聚合物選自由聚(乙二醇) (PEG)、聚肌胺酸(pSar) (聚(N-甲基甘胺酸))、聚㗁唑啉(POX)、聚㗁嗪(POZ)和聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)，其衍生物及組合所組成之群組。
  77. 如請求項70至76中任一項之化合物，其中該聚合物包含至少一個聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  78. 如請求項69至77中任一項之化合物，其中該負載部分和該標籤是透過包含至少一個聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物的部分所偶聯。
  79. 如請求項69至78中任一項之化合物，其中該負載部分和該標籤是透過包含至少一個聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分的部分所偶聯。
  80. 如請求項69至79中任一項之化合物，其包含兩個該標籤aa。
  81. 如請求項69至80中任一項之化合物，其包含呈非分支(線性)構形的負載部分和標籤。
  82. 如請求項69至81中任一項之化合物，其包含下式： P-L A-T-L B-T 或 P-L A-T-L B-T-L C-P 其中 P包含負載部分； T包含標籤； L A包含連接部分； L B包含連接部分；且 L C包含連接部分。
  83. 如請求項82之化合物，其中L A、L B和L C中的一或多者包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  84. 如請求項82或83之化合物，其中L B包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  85. 如請求項82至84中任一項之化合物，其中L A及/或L C包含酶促切割位點。
  86. 如請求項82至85中任一項之化合物，其中L A、L B和L C中的一或多者包含式[AEEA] u-[L D-[AEEA] v] w， 其中 AEEA為2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸或其衍生物； L D包含連接部分； u為2或更大的整數； 各v為2或更大的整數；且 w為1至4的整數； 其中 不同的基團[L D-[AEEA] v]可能相同或不同。
  87. 如請求項82至86中任一項之化合物，其中L B包含式[AEEA] u-[L D-[AEEA] v] w， 其中 AEEA為2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸或其衍生物； L D包含連接部分； u為2或更大的整數； 各v為2或更大的整數；且 w為1至4的整數； 其中 不同的基團[L D-[AEEA] v]可能相同或不同。
  88. 如請求項86或87之化合物，其中u和v各自為2至10的整數。
  89. 如請求項69至80中任一項之化合物，其包含呈分支(非線性)構形的負載部分和標籤。
  90. 如請求項69至80及89中任一項之化合物，其包含下式： [[P] m-L 1] n-B 1-[L 2-T] o其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； T包含標籤； L 1包含連接部分； L 2包含連接部分； m為1至4的整數； n為1至4的整數；且 o為2至4的整數；其中 不同的基團[L 2-T]可能相同或不同，不同的基團P可能相同或不同，而不同的基團[[P] m-L 1]可能相同或不同。
  91. 如請求項69至90中任一項之化合物，其中該負載部分選自由放射性同位素、毒素和免疫調節劑所組成之群組。
  92. 如請求項90或91之化合物，其中B 1的化合價數對應於或大於n和o的總和。
  93. 如請求項90至92中任一項之化合物，其中B 1包含胺基酸或雙胺基酸。
  94. 如請求項90至93中任一項之化合物，其中B 1包含胺基酸的D-異構物。
  95. 如請求項90至94中任一項之化合物，其中B 1包含半胱胺酸或離胺酸。
  96. 如請求項90至95中任一項之化合物，其中L 1包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物，或聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  97. 如請求項90至96中任一項之化合物，其中L 1包含酶促切割位點。
  98. 如請求項90至97中任一項之化合物，其中L 2包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  99. 如請求項76至98中任一項之化合物，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間。
  100. 如請求項76至99中任一項之化合物，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間。
  101. 如請求項76至100中任一項之化合物，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目為2、4或6。
  102. 如請求項90至101中任一項之化合物，其中L 2包含選自由以下所組成之群組的一或多者：限制構形的部分、供白蛋白結合的部分、增加循環時間的部分、減少腎滯留或攝取的部分，以及酶促切割位點。
  103. 如請求項90至102中任一項之化合物，其中L 2包含(i)包含半胱胺酸的部分和(ii)聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物，其中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物和T是藉由包含半胱胺酸的部分所連接。
  104. 如請求項90至103中任一項之化合物，其中[[P] m-L 1]包含式[[P-L 1’] m-B 2-L 1’’]， 其中 B 2包含分支部分； L 1'包含連接部分； L 1’’包含連接部分；且 m為1至4的整數；其中 不同的基團[[P-L 1’] m-B 2-L 1’’]可能相同或不同，並且其中在基團[[P-L 1’] m-B 2-L 1’’]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同。
  105. 如請求項104之化合物，其中B 2的化合價數對應於或大於m加上1的值。
  106. 如請求項104或105之化合物，其中B 2包含胺基酸。
  107. 如請求項104至106中任一項之化合物，其中B 2包含胺基酸的D-異構物。
  108. 如請求項104至107中任一項之化合物，其中B 2包含半胱胺酸或離胺酸。
  109. 如請求項104至108中任一項之化合物，其中L 1'包含2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)部分或其衍生物、聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物、半胱胺酸，或其組合。
  110. 如請求項104至109中任一項之化合物，其中L 1 ''包含聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物。
  111. 如請求項104至110中任一項之化合物，其中L 1''包含經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的部分。
  112. 如請求項111之化合物，其中經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的部分是胺基酸。
  113. 如請求項112之化合物，其中經聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物所取代的胺基酸是離胺酸。
  114. 如請求項110至113中任一項之化合物，其中L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和30之間。
  115. 如請求項110至114中任一項之化合物，其中L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目在2和10之間。
  116. 如請求項110至115中任一項之化合物，其中L 1''中聚-2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(pAEEA)部分或其衍生物之2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙酸(AEEA)或其衍生物的重複單元數目為2、4或6。
  117. 如請求項104至116中任一項之化合物，其中L 1'及/或L 1''經增溶官能基取代。
  118. 如請求項104至117中任一項之化合物，其中L 1'及/或L 1''包含經增溶官能基取代的胺基酸。
  119. 如請求項118之化合物，其中經增溶官能基取代的胺基酸是離胺酸或半胱胺酸。
  120. 如請求項90至119中任一項之化合物，其中m為1至3的整數，n為1至3的整數，而o為2或3。
  121. 如請求項90至120中任一項之化合物，其中o為2。
  122. 如請求項90至121中任一項之化合物，其中n為1或2。
  123. 如請求項90至122中任一項之化合物，其中m為1或2。
  124. 如請求項90至123中任一項之化合物，其中o為2，n為1且m為1。
  125. 如請求項69至124中任一項之化合物，其中該負載部分包含放射性同位素，例如包含放射性同位素的螯合化合物。
  126. 如請求項90至123中任一項之化合物，其中o為2，n為2且m為2。
  127. 如請求項69至124及126中任一項之化合物，其中該負載部分包含毒素或免疫調節劑。
  128. 如請求項69至80及89至127中任一項之化合物，其包含下式： P-L 1-B 1-[L 2-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； T包含標籤； L 1包含連接部分；且 L 2包含連接部分；其中 不同的基團[L 2-T]可能相同或不同。
  129. 如請求項69至80及89至128中任一項之化合物，其包含下式： P-[AEEA] p-B 1-[[AEEA] q-R-[AEEA] r-C-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； R為視情況選用的並包含限制構形的部分； C為視情況選用的並包含連接部分； T包含標籤； p為0至6的整數； q為1至4的整數；且 r為1至4的整數；其中 不同的基團[[AEEA] q-R-[AEEA] r-C-T]可能相同或不同。
  130. 如請求項69至80及89至129中任一項之化合物，其包含下式： [[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’] 2-B 1-[L 2-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； B 2包含分支部分； T包含標籤； L 1'包含連接部分； L 1 ’’包含連接部分；且 L 2包含連接部分；其中 不同的基團[[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’]可能相同或不同，其中在基團[[P-L 1’] 2-B 2-L 1’’]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同，且不同的基團[L 2-T]可能相同或不同。
  131. 如請求項69至80及89至130中任一項之化合物，其包含下式： [[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s] 2-B 1-[[AEEA] t-T] 2其中 P包含負載部分； B 1包含分支部分； B 2包含分支部分； T包含標籤； L 1'包含連接部分； s為2至8的整數；且 t為2至8的整數；其中 不同的基團[[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s]可能相同或不同，其中在基團[[P-L 1’] 2-B 2-[AEEA] s]中，不同的基團[P-L 1’]可能相同或不同，且不同的基團[[AEEA] t-T]可能相同或不同。
  132. 如請求項69至131中任一項之化合物，其中該標籤為ALFA標籤。
  133. 如請求項69至132中任一項之化合物，其中該標籤為環狀ALFA標籤。
  134. 一種治療具有特徵在於表現目標抗原之細胞的疾病、病症或病況之個體的方法，包含： (i) 向個體提供包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物； (ii) 允許包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物與表現目標抗原的細胞締合；以及 (iii) 向個體投予如請求項69至133中任一項之化合物，其包含針對標籤之該結合部分所結合的標籤。
  135. 如請求項134之方法，其中藉由向該個體投予編碼包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的多肽的RNA，向該個體提供包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物；並允許該個體體內的細胞表現該多肽。
  136. 如請求項135之方法，其中表現該多肽的細胞經RNA轉染。
  137. 如請求項135或136之方法，其中RNA以顆粒化調配物(particulate formulation)投予，諸如調配為脂質奈米顆粒。
  138. 如請求項135至137中任一項之方法，其中表現該多肽的細胞分泌該多肽。
  139. 如請求項135至138中任一項之方法，其中表現該多肽的細胞表現該多肽，使得其被釋放到血流中。
  140. 如請求項134至139中任一項之方法，其中該目標抗原是細胞表面抗原。
  141. 如請求項134至140中任一項之方法，其中包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的化合物是包含結合至目標抗原的結合部分和針對標籤之結合部分的融合多肽。
  142. 如請求項134至141中任一項之方法，其中結合至該目標抗原的結合部分包含抗體或抗體衍生物。
  143. 如請求項134至142中任一項之方法，其中結合至標籤的該結合部分包含抗體或抗體衍生物。
  144. 如請求項142或143之方法，其中該抗體衍生物是抗體片段。
  145. 如請求項134至144中任一項之方法，其中該疾病、病症或病況是癌症。
  146. 如請求項134至145中任一項之方法，其中表現目標抗原的細胞是病變細胞。
  147. 如請求項134至146中任一項之方法，其中表現目標抗原的細胞是癌細胞。
  148. 如請求項134至147中任一項之方法，其中該目標抗原是腫瘤抗原。
  149. 如請求項134至148中任一項之方法，其中該負載部分包含放射性同位素，例如包含放射性同位素的螯合化合物。
  150. 如請求項149之方法，其中(i)的化合物包含針對該標籤之單一結合部分。
  151. 如請求項134至148中任一項之方法，其中該負載部分包含毒素或免疫調節劑。
  152. 如請求項151之方法，其中(i)的化合物包含至少兩個針對該標籤之結合部分。
  153. 如請求項151或152之方法，其中(i)的化合物包含兩個針對該標籤之結合部分。
  154. 如請求項134至153中任一項之方法，其中該標籤為ALFA標籤。
  155. 如請求項134至154中任一項之方法，其中該標籤為環狀ALFA標籤。
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