TW202521132A - Ｃｃｌ４拮抗劑於製備用於抑制血管老化的醫藥組成物的用途 - Google Patents

Abstract

本揭露係提供一種CCL4拮抗劑於製備抑制血管老化之醫藥組成物的用途，其中該CCL4拮抗劑係藉由包含降低CCL4含量、抑制CCL4與其受體結合活性或其結合以抑制該血管老化。

Description

CCL4拮抗劑於製備用於抑制血管老化的醫藥組成物的用途

本揭露係有關一種CCL4拮抗劑之用途，尤其係有關一種CCL4拮抗劑於製備抑制血管老化之醫藥組成物的用途。

隨著人類壽命的延長，預期壽命從1900年的33歲上升至目前的70歲，全球人口持續老化。當人經歷老化時，身體的各個器官都會出現變化，其中心血管系統所產生的變化對健康的影響最不可忽視。隨著年紀增長，心血管方面會出現的生理變化包括收縮壓和脈壓增加、心室增厚以及心臟舒張功能、最大心跳速率、最大心輸出量和最大氧氣消耗量的降低。此外，血管彈性變差，掌管心臟收縮節奏的竇房結和房室結因細胞數量減少而導致功能失調，從而引起凝血反應因子含量增加。

相對的，血管一旦出現老化，可能導致出現全身衰老的症狀，包含身體功能減退及心腦功能減退，甚至引發如心肌梗塞和腦中風等致命疾病。然而，目前臨床上並無針對抑制血管老化之有效策略。

巨噬細胞發炎蛋白-1β(Macrophage inflammatory protein-1β,MIP-1β，亦稱為C-C motif chemokine ligand 4,CCL4，如本文所用)為CC細胞因子家族之成員，最先分離自由脂多醣所活化的巨噬細胞培養液(Lodi P.J.等人，Science 263：1762-1767,1994)，分子量為7.8千道爾頓，其蛋白質結構係由92個胺基酸前驅物所組成。在心血管疾病患者中已觀察到MIP-1β有受到增量調節(Tatara,Y.等人，J Mol Cell Cardiol 47：104-111,2009；Mirabelli-Badenier,M.等人，Thromb Haemost 105：409-420,2011)。

MIP-1β/CCL4係藉由與細胞表面上的CC細胞因子受體(CCR，屬於G-蛋白-偶和型受體超家族)結合，而進一步執行其生化功能。在心肌梗塞動物模式中，誘導梗塞心臟產生細胞因子，會促使具有特殊性質的白血球族群再補充到缺血部位，而在梗塞小鼠之心肌中，MIP-1β及其受體CCR5會明顯受到誘導產生(Dobaczewski M等人，Am J Pathol 176：2177-2187,2010)。但是至目前為止，MIP-1β/CCL4是否與血管老化有關，仍未有相關研究。

因此，吾等嘗試在臨床檢體研究中，釐清CCL4是否為造成血管老化的關鍵因子，並驗證抑制CCL4是否可以抑制血管老化，以期開發出與此相關的新治療策略。

基於上述針對抑制血管老化於臨床上的不足之處，以及吾等的研究結果，本揭露係提供一種CCL4拮抗劑於製備抑制血管老化之醫藥組成物的用途，其中，該醫藥組成物包含有效量的CCL4拮抗劑及其藥學上可接受的載體。

另一方面，本揭露提供一種在有需要的個體中抑制血管老化的方法，包含對該個體投予有效量的醫藥組成物，其中，該醫藥組成物包含CCL4拮抗劑及其藥學上可接受的載體。

於本揭露的一實施態樣中，CCL4拮抗劑係選自由抗CCL4抗體或其片段、CCL4基因干擾核糖核酸、CCL4小分子拮抗劑、CCR1拮抗劑、CCR2拮抗劑及CCR5拮抗劑所組成群組之至少一者。

於本揭露的一實施態樣中，血管老化伴隨CCL4含量升高。

於本揭露的一實施態樣中，CCL4拮抗劑係藉由包含降低CCL4含量、抑制CCL4與其受體結合活性或其結合以抑制血管老化。

於本揭露的一實施態樣中，抑制血管老化包括抵抗血管內皮細胞衰老及/或提升血管生成能力。

於本揭露的一實施態樣中，抵抗血管內皮細胞衰老係包括選自由降低ROS、逆轉老化因子及降低發炎因子所組成群組之至少一者；提升血管生成能力包括血管新生因子上調。

於本揭露的一個實施態樣中，逆轉老化因子係包括選自由SIRT1上調、p53下調及p16下調所組成群組之至少一者。

於本揭露的一實施態樣中，發炎因子係包括選自由TNF-α、IL-1β及IL-6所組成群組之至少一者。

於本揭露的一實施態樣中，血管生成能力係包括選自由管形成、細胞遷移能力及血管萌芽所組成群組之至少一者。

於本揭露的一實施態樣中，血管新生因子係包括選自由p-eNOS、p-AKT、VEGF及SDF-1α所組成群組之至少一者。

於本揭露的一實施態樣中，該CCL4拮抗劑係以0.01mg/kg至100mg/kg的量投予。

於本揭露的一實施態樣中，該醫藥組成物係以每週1至25次的頻率投予。於本揭露的一實施態樣中，該醫藥組成物持續投予1至4週。

於本揭露中，經由CCL4拮抗劑之抑制作用，有效調節體內老化因子、發炎因子及血管新生因子，從而抵抗血管內皮細胞衰老及/或提升血管生成能力，以達到抑制血管老化之功效。

藉由閱讀於後詳細的敘述，一併參考此處所述的圖式，會更理解本揭露的實施方式。

圖1A至圖1F係顯示抑制CCL4可藉由調節老化因子和發炎因子以逆轉細胞衰老。圖1A顯示年輕受試者(<30歲；n=7)與老年受試者(>55歲；n=8)的血漿CCL4濃度之比較；圖1B顯示抑制CCL4對於年輕(P4)和老化(P9)細胞之與衰老相關的半乳糖苷酶活性之影響(n=3)；圖1C顯示抑制CCL4對於P4和P9細胞中ROS的產生之影響(n=3)；圖1D至圖1F分別顯示抑制CCL4對於P4和P9細胞中CCL4、老化因子和發炎因子的表現之影響(n=3)。「N」代表從「n」個不同個體培養的細胞，並對從每個個體培養的細胞進行三個獨立的實驗。P4：繼代4；P9：繼代9；siCCL4：CCL4siRNA；si-控制組：20至25nt之非標靶siRNA。*P<0.05；**P<0.01。

圖2A至圖2D係顯示抑制CCL4對於血管生成能力之影響。圖2A顯示CCL4的抑制不影響細胞增殖(n=3)；圖2B和圖2C分別顯示CCL4 的抑制對於細胞的管形成和遷移能力之影響(n=3)；圖2D顯示抑制CCL4對於P4和P9細胞中血管新生因子的表現之影響(n=3)。

圖3A至圖3E係顯示以siRNA抑制CCL4對於改善老年小鼠的血管生成能力之影響。圖3A顯示抑制CCL4影響年輕和老年小鼠之主動脈環內皮細胞萌芽的代表性圖像；圖3B顯示抑制CCL4對於年輕和老年小鼠血管萌芽面積之影響(n=3)；圖3C至圖3E分別顯示抑制CCL4對於年輕和老年小鼠中血管新生因子、老化因子和發炎因子的表現之影響(n=3)。WT6M：6個月大的野生型小鼠；CCL4KO6M：6個月大的CCL4基因敲除小鼠；WT18M：18個月大的野生型小鼠；CCL4KO18M：18個月大的CCL4基因敲除小鼠。

圖4A至圖4D係說明以siRNA抑制CCL4可增強老年小鼠的新生血管生成。圖4A顯示抑制CCL4影響年輕和老年小鼠之基質膠塞的代表性圖像，以及該膠塞血紅素含量(n=6)；圖4B係顯示年輕和老年小鼠於抑制CCL4前後之基質膠塞切片的H&E染色的代表性圖像；圖4C和圖4D分別顯示年輕和老年小鼠於抑制CCL4前後之基質膠塞切片以CD31和Ki67抗體進行免疫染色的代表性圖像。

圖5A至圖5E係顯示以中和抗體抑制CCL4對於改善老年小鼠的血管生成能力之影響。圖5A顯示抑制CCL4影響年輕和老年小鼠之主動脈環內皮細胞萌芽的代表性圖像；圖5B顯示抑制CCL4對於年輕和老年小鼠血管萌芽面積之影響(n=6)；圖5C至圖5E分別顯示抑制CCL4對於年輕和老年小鼠中血管新生因子、老化因子和發炎因子的表現之影響(n=3)。WT6M： 6個月大的野生型小鼠；WT18M：18個月大的野生型小鼠；mAb：單株中和抗體。

圖6A至圖6D係說明以中和抗體抑制CCL4可增強老年小鼠的新生血管生成。圖6A顯示抑制CCL4影響年輕和老年小鼠之基質膠塞的代表性圖像，以及該膠塞的血紅素含量(n=6)；圖6B係顯示年輕和老年小鼠於抑制CCL4前後之基質膠塞切片的H&E染色的代表性圖像；圖6C和圖6D分別顯示年輕和老年小鼠於抑制CCL4前後之基質膠塞切片以CD31和Ki67抗體進行免疫染色的代表性圖像。

以下係藉由特定的具體實施例用於說明本揭露之實施方式。熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本揭露之優點及功效。本揭露亦可藉由其它不同之實施方式加以實現或應用。本說明書中的各項細節亦可基於不同的觀點和應用，在不悖離本揭露所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。

應注意的是，如本文所使用，單數形式術語「一個」、「一種」及「該」除非明確地限於一個指示物，係包括複數個指示物。除非上下文另外明確指出，否則術語「或」與術語「和/或」可互換使用。

如本文所使用，術語「包括」或「包含」係指對本揭露內容係必不可少的組成、方法和其相應的組分，但對於未指定的元素之涵蓋是開放的，無論是否為必不可少的組成。

術語「個體」和「受試者」在本揭露中可互換使用，術語「個體」指人類或動物。個體的例子包括但不限於：人類、猴子、小鼠、大鼠、土撥鼠、雪貂、兔、倉鼠、牛、馬、豬、鹿、狗、貓、狐狸、狼、雞、鴯鶓、鴕鳥及魚。在本揭露之某些實施態樣中，個體係哺乳動物，如靈長類，諸如人類。

本揭露係涉及一種CCL4拮抗劑於製備抑制血管老化之醫藥組成物的用途。於本揭露的一實施態樣中，所述醫藥組成物包含有效量的CCL4拮抗劑及其藥學上可接受的載體。

於本揭露的一實施態樣中，CCL4拮抗劑能夠防止CCL4與其受體結合。在另一實施態樣中，CCL4拮抗劑係用於抑制因CCL4與其受體結合而產生的細胞內信號傳導之試劑。舉例來說，CCL4拮抗劑可以針對CCL4和CCL4的受體中的至少一種，從而阻斷有關CCL4的信號傳導。如本文所使用，CCL4的受體包括但不限於CCR1、CCR2和CCR5。

如本文所用，「CCR1」或「CCR1受體」、「CCR2」或「CCR2受體」及「CCR5」或「CCR5受體」可互換使用，並具有其在本領域中的通常意義。CCR1、CCR2及CCR5受體可源自任意來源，但一般源自哺乳動物(如人類或非人靈長類)的CCR1、CCR2及CCR5受體。在本揭露之一些實施態樣中，CCR1、CCR2及CCR5受體係人類受體。

於本揭露的一實施態樣中，所述「CCL4拮抗劑」包括在給予受試者後，導致受試者之與CCL4相關的生物學活性的抑制或下調的任何實體，包括不同於因CCL4與其受體的結合而引起的任何下游生物學效應。CCL4拮抗劑包括任何可抑制CCL4活性或阻斷CCL4受體活化、或任何CCL4受體 活化的下游生物學效應的試劑。舉例來說，所述試劑可為有機小分子或針對CCL4的抗體，例如CCL4中和抗體，其可阻斷CCL4與其受體間的相互作用，或可阻斷CCL4的活性。該CCL4拮抗劑亦可係針對CCL4受體的小分子或抗體，從而使該受體不能接近其配體CCL4。

在本揭露的一實施態樣中，所述CCL4拮抗劑係選自由抗CCL4抗體或其片段、CCL4基因干擾核糖核酸、CCL4小分子拮抗劑、CCR1拮抗劑、CCR2拮抗劑及CCR5拮抗劑所組成群組之至少一者。

以動物(如小鼠)進行投藥試驗，再依照藥物動力學換算成人類或其他動物之有效投藥劑量為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知之技術方案。在本揭露的一實施態樣中，用於投予個體之CCL4拮抗劑之每公斤體重的有效量的下限係選自0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg及25mg/kg，且上限係選自1000mg/kg、900mg/kg、800mg/kg、700mg/kg、600mg/kg、500mg/kg、400mg/kg、300mg/kg、200mg/kg、100mg/kg、90mg/kg、80mg/kg、70mg/kg、60mg/kg、50mg/kg、40mg/kg及30mg/kg。在一些實施態樣中，較佳地，該CCL4拮抗劑係以0.01mg/kg至100mg/kg的量投予；更佳地，該CCL4拮抗劑係以2mg/kg至10mg/kg的量投予；再更佳地，該CCL4拮抗劑係以2.5mg/kg至5mg/kg的量投予。

依據醫藥組成物的組成份或劑量濃度，以及投藥對象的不同而調整投藥頻率為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知之技術方案。在本揭露之一實施態樣中，含有CCL4拮抗劑的醫藥組成物係以1天內投予1至4次的頻率使用。在另一實施態樣中，含有CCL4拮抗劑的醫藥組成物係以1 週內投予1至25次的頻率使用。例如含有CCL4拮抗劑的醫藥組成物係1天內投予2次或1週內投予5次。在本揭露之一實施態樣中，含有CCL4拮抗劑的醫藥組成物係以每週1至5次的頻率投予，或者以每週2至7次的頻率投予。

在本揭露之一實施態樣中，含有CCL4拮抗劑的醫藥組成物係持續投予1至4週以抑制血管老化。在本揭露之另一實施態樣中，含有CCL4拮抗劑的醫藥組成物係持續投予1至8週以抑制血管老化。

在本揭露的一態樣中，造成衰老的主要因子係血管內皮細胞老化，導致血管擴張物質與血管收縮物質之間的平衡失常。此外，於老化時，因細胞無法不斷分裂與再生，導致抗氧化酶之系統不平衡與失能，而使細胞內活性氧物種(Reactive oxygen species,ROS)增高。ROS的增加會導致內皮細胞分泌過量的CCL4，並降低血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)與基質細胞衍生因子-1(Stromal derived factor-1,SDF-1)在內皮細胞中之分泌，進而造成內皮細胞功能障礙。

在本揭露的一實施態樣中，所述血管老化伴隨CCL4含量升高。

在本揭露的一實施態樣中，所述CCL4拮抗劑係藉由包含降低CCL4含量、抑制CCL4與其受體結合活性或其結合以抑制血管老化。

在本揭露的一實施態樣中，所述抑制血管老化包括抵抗血管內皮細胞衰老及/或提升血管生成能力。

如本文所使用，術語「血管內皮細胞」係由一層扁平細胞所組成，其形成血管內壁，是血管管腔內血液及其他血管壁組織的介面。內皮細胞乃沿著整個循環系統分布，從心臟一直到最小的微血管都是。內皮細胞功 能正常對於維持全身的血管張力、抑制血小板凝集、調節免疫反應以及抑制血管平滑肌增生均非常重要。內皮細胞功能異常亦為各項心血管相關疾病發生的早期指標。

在本揭露的一實施態樣中，所述抵抗血管內皮細胞衰老係包括選自由降低ROS、逆轉老化因子及降低發炎因子所組成群組之至少一者；所述提升血管生成能力包括血管新生因子上調。

如本文所使用，術語「ROS(Reactive oxygen species，活性氧物種)」，是生物有氧代謝過程中的一種副產品，包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等。這些粒子相當微小，由於存在未配對的自由電子，而十分活躍。過高的活性氧水平會對細胞和基因結構造成損壞。ROS是正常氧代謝後，由氧形成的天然副產物，並且在細胞信號傳導(cell signaling)，和保持機體恆常性(homeostasis)起很大作用。然而，在時間以及外界環境影響下，ROS的量會急劇增多。引起這種改變的原因有可能是由於明顯的細胞結構的損壞。

如本文所使用，術語「老化因子」係指出現在哺乳類動物細胞上的老化指標，該指標含量與老化細胞可能為正相關或負相關。也就是說，在一些態樣中，老化因子的含量隨著細胞老化而上調；在另一些態樣中，老化因子的含量隨著細胞老化而下調。反之，當逆轉老化現象時，上述態樣的老化因子的含量將呈現反向調整。

在本揭露的一實施態樣中，所述逆轉老化因子係包括選自由SIRT1(Sirtuin 1，又稱為NAD-依賴性去乙醯化酶Sirtuin-1)上調、p53下調及p16下調所組成群組之至少一者。

如本文所使用，術語「發炎因子」係指參與發炎反應的各種細胞因子，諸如促炎細胞因子(pro-inflammatory cytokines)。一般發炎反應可提供機體自我防禦及修復，但慢性發炎或發炎失衡會引發各種疾病，產生促炎細胞因子以活化免疫細胞，釋放大量損傷相關分子模式(damageassociated molecular pattern，DAMP)，經血液循環影響患者全身，引發發炎反應。

在本揭露的一實施態樣中，所述發炎因子係包括選自由TNF-α(腫瘤壞死因子-α)、IL-1β(白細胞介素-1β)及IL-6(白細胞介素-6)所組成群組之至少一者。

在本揭露的一實施態樣中，所述血管生成能力係包括選自由管形成、細胞遷移能力及血管萌芽所組成群組之至少一者。

如本文所使用，術語「管形成」表示血管的生長或形成。血管生成包括從先前存在的血管中生長出新血管，以及指自發性血管形成的脈管形成和透過自現有血管分裂而形成新血管。血管生成包括「新血管形成」、「血管再形成」、「新血管生成」和「血管再生」。

如本文所使用，術語「細胞遷移」係指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質的濃度梯度後而產生的移動。移動過程中，細胞不斷重複著向前方伸出突觸/偽足，然後牽拉後方胞體的循環過程。細胞骨架和其結合蛋白，還有細胞間質係此過程的物質基礎，另外還有多種物質會對之進行精密調節。在血管新生時，一群血管內皮細胞會從聚集處向外移動及分化。換句話說，細胞遷移是血管新生過程中不可或缺的一環。

如本文所使用，術語「血管萌芽」又稱芽生性血管新生(Sprouting angiogenesis)或出芽性血管新生，為最早發現的血管生成形式。 血管萌芽可分為三個已被深入研究的階段。首先，缺乏血管的組織會出現低氧狀態，進而釋放出血管內皮生長因子A(VEGF-A)等訊號分子。其後，分泌的VEGF-A等訊號分子會活化現有的血管內皮細胞上的受體，使血管內皮細胞活化。這些被活化的血管內皮細胞亦稱為尖端細胞(tip cells)，可釋放用於降解基底膜的蛋白酶，使內皮細胞自原有(母體)血管壁脫離。最後，自原有血管脫離的內皮細胞在周圍基質中增殖，並形成連接相鄰血管的實體芽(solid sprout)。位於尖端細胞後方的細胞則持續增殖，使新生的微血管芽持續成長，這些細胞又稱為柄細胞(stalk cells)。柄細胞增生較快，主要負責形成新生血管的分支網絡。決定血管內皮細胞成為尖端細胞或柄細胞的主要細胞所處微環境中VEGF、JAG-1等不同訊號分子之間的相對量。

如本文所使用，術語「血管新生因子」係指促進血管新生的生理性的相關因子。在本揭露的一實施態樣中，所述血管新生因子係包括選自由p-eNOS(p-內皮型一氧化氮合成酶)、p-AKT(p-蛋白激酶B)、VEGF(血管內皮生長因子)、SDF-1α(基質細胞衍生因子-1α)及其組合所組成之群組。

如本文所使用，術語「有效量」係指在治療的受試者上賦予期望的治療效果(例如，期望的抑制血管老化)所需的活性劑(例如，CCL4拮抗劑)的量。如本技術領域中具有通常知識者所知，有效劑量將根據給藥途徑、賦形劑使用、與其他治療方法共同使用的可能性及待治療的病症而變化。

在本揭露的一個實施態樣中，「藥學上可接受的載體」可以是稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、助流劑、表面活性劑或其組合。

在本揭露的一個實施態樣中，「醫藥組成物」可為無菌的可注射組成物，其可以係在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的溶液或懸浮液。可採用之可接受的媒介物和溶劑係包括1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液和等張的氯化鈉溶液。另外，常規上使用不揮發性油作為溶劑或懸浮介質(如合成的甘油單酯或甘油二酯)。脂肪酸係如油酸及其甘油酯衍生物，其可用於製備注射劑、作為天然藥學上可接受的油(例如橄欖油和蓖麻油)，例如其聚氧乙烯化形式。此些油溶液或懸浮液也可包含長鏈醇稀釋劑或分散劑、羧甲基纖維素或類似的分散劑。其他常用的表面活性劑(例如Tweens和Spans或其他類似的乳化劑或生物利用度增強劑)，其係用於藥學上可接受的固體、液體或其他劑型的製備，以用於配製目的。

醫藥組成物中的載體必須是「可接受的」，其係與組成物的活性劑相容(並能穩定活性劑)，且對待治療的受試者無害。可將一種或多種助溶劑使用作為藥物賦形劑，以輸送活性化合物。其他載體的實例還包括膠體氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素和月桂基硫酸鈉。

已透過許多實例說明本揭露，以下實施例僅是示例性的，無意以任何方式限制本揭露的適用範圍。

實施例

材料及方法

臨床樣本

血液樣本係採自自願受試者的外周靜脈，並排除患有糖尿病、重大全身性疾病和過去6個月內接受過重大手術的受試者。人口統計學和臨 床數據係於納入試驗時獲得者。所述之人體研究係經研究委員會機構的批准，且符合《赫爾辛基宣言》。

細胞培養

初代HAEC(ScienCell,Catalog #6100,Carlsbad,CA,USA)在纖連蛋白塗布的培養盤中培養，其中含有5%胎牛血清和1%內皮細胞生長補充劑的內皮細胞培養基，並於37℃，95%空氣和5%二氧化碳環境中培養。

siRNA轉染

使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，在培養基中以ccl4 siRNA(Santa Cruz Biotechnology,sc-43932,Dallas,TX,USA)轉染細胞。

細胞增殖分析

根據製造商的說明，使用Cell Counting Kit-8(CCK-8；Dojindo Molecular Technologies,Inc.,Rockville,MD,USA)評估細胞活力。簡而言之，添加試劑並將細胞於37℃下培育2小時，並測定450nm處的吸光度。

β-半乳糖苷酶染色分析

使用β-半乳糖苷酶染色試劑盒(Merck,Darmstadt,Germany)檢測衰老表型。透過光學顯微鏡於隨機選擇的10個低倍視野中觀察衰老相關的β-半乳糖苷酶陽性細胞的數量。

ROS生成測定

使用Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)測量細胞產生的過氧化氫。簡而言之，辣根過氧化物酶催化Amplex Red與過氧化氫(H₂O₂)發生化學計量反應(由水 和試鹵靈組成)。然後，將細胞刮入磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)中。將細胞碎片離心後，加入50μL工作溶液於50μL上清液中。培育30分鐘後，以540nm激發波長和590nm發射波長於微量盤分析儀測量螢光。

遷移和管形成試驗

藉由室測定(chamber assay)評估遷移。將細胞(1x10⁴個細胞)重懸於含有5% FBS的培養基中。添加細胞至帶有聚碳酸酯膜的24孔Transwell盤的上室。將補充胎牛血清的培養基添加至下室，並將各室培育18小時。培育後以4%三聚甲醛固定膜，並以蘇木精溶液染色。於隨機高倍(×100)顯微鏡視野下對遷移的細胞數進行計數。

使用血管新生測定試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)進行體外管形成測定。將ECMatrix凝膠溶液與ECMatrix稀釋緩衝液混合，並置於96孔盤中。接著，將細胞(1×10⁴個細胞)置於含有10% FBS培養基的基質溶液並培育16小時。在倒立光學顯微鏡(×40)下檢查管形成。使用Image-Pro Plus(Media Cybernetics,Inc.Rockville,MD,USA)比較由細胞形成的完整管數量的平均值。

西方墨點法

使用裂解緩衝液萃取總細胞或組織裂解物，並於8至12%(v/v)SDS-PAGE膠中分離蛋白質。電泳後(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)，將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜(Millipore,Darmstadt,Germany)上。將該膜與下列抗體在4℃過夜培育：CCL4(Santa Cruz Biotechnology,sc-393441,Dallas,TX,USA)；p-AKT(BD Biosciences,550747；NJ,USA)；AKT(BD Biosciences,610868；NJ,USA)；VEGF(Santa Cruz Biotechnology, sc-152；Dallas,TX,USA)；SDF-1(Cell Signaling,3530S；Boston,MA,USA)；IL-1β(Santa Cruz Biotechnology,sc-7884；Dallas,TX,USA)；IL-6(Cell Signaling,12153S；Boston,MA,USA)；TNF-α(Cell Signaling,3707S；Boston,MA,USA)；SIRT1(Cell Signaling,8469S；Boston,MA,USA)；p53(Cell Signaling,2524S；Boston,MA,USA)；p16(Cell Signaling,80772S和29271S；Boston,MA,USA)；p-eNOS(Cell Signaling,9571S；Boston,MA,USA)；eNOS(Cell Signaling,32027S；Boston,MA,USA)以及肌動蛋白(actin)(Merck,MAB1501,Darmstadt,Germany)。上述蛋白依據肌動蛋白表現量標準化。

動物準備

六周大的雄性C57BL/6JNarl-Ccl4em1敲除(CCL4KO)小鼠係購自國家實驗動物中心(台灣台北)。CCL4KO小鼠係使用CRISPR/Cas9系統於C57BL/6JNarl遺傳背景下生成的。所有小鼠均使用特定引子(正向引子：5'-TCTCCCTCCTTTCTCTTCCGTG-3'(SEQ ID NO：1)；反向引子：5'-TCTACTCCCAATGATGGCTGACC-3'(SEQ ID NO：2))以PCR進行基因分型。C57BL/6JNarl小鼠作為野生型(WT)對照組。6個月大的小鼠定義為年輕組，18個月大的小鼠定義為老年組。依照國立陽明交通大學動物保護委員會管理條例的規定，動物在國立陽明交通大學(台灣台北)動物中心之特定的無病原體條件下飼養，所有小鼠均在12小時晝夜循環的微型隔離籠中飼養。該動物研究獲得國立陽明交通大學動物保護委員會批准。

中和抗體治療

分別對6個月及18個月大的C57BL/6JNarl野生型(WT)小鼠腹膜內注射CCL4單株中和抗體(R&D Systems,MAB451,Minneapolis,MN,USA)。注射劑量為100μg/次；注射頻率為3次/週，持續2週。

基質膠體血管新生試驗

於小鼠皮下注射含有30ng/mL VEGF(Peprotech,Rocky Hill,CT,USA)和50U肝素(Sigma-Aldrich,Darmstadt,Germany)的生長因子減少的基底膜基質(Corning® Matrigel,Glendale,AZ,USA)。14天後收集膠塞(plug)，並在500μL細胞裂解緩衝液中均質，並於4℃下以6000g離心60分鐘。使用比色測定(Sigma-Aldrich,MAK115,Darmstadt,Germany)於400nm波長下檢測血紅素。此外，獲取之膠塞用於組織學和免疫組織化學分析。

主動脈環測定

將主動脈環切成0.5mm，並嵌入1mg/mL第1型大鼠尾膠原基質(Millipore,Darmstadt,Germany)，於37℃下培育1小時。主動脈環在含有2.5%胎牛血清(Gibco,Carlsbad,CA,USA)、50U/mL青黴素和0.5mg/mL鏈黴素(Sigma-Aldrich,Darmstadt,Germany)的EBM-2(Lonza,Basel,Switzerland)和30ng/mL VEGF(Peprotech,Rocky Hill,CT,USA)的24孔盤中培養7天。使用顯微鏡(x100)拍攝影像。

基質膠塞中的毛細血管密度和細胞增生

使用蘇木精/伊紅(H&E)染色以評估形態變化。將切片脫蠟並與抗鼠CD31大鼠單株抗體(Abcam,124432,Waltham,MA,USA)和抗鼠增生標記Ki67兔多株抗體(Novus,NB500-170,Minneapolis,MN,USA)培育。 使用親合素-生物素複合體技術和Vector Red顯色基質使抗體分佈可視化，接著以蘇木精複染。

統計分析

結果以平均值±標準差的形式呈現。統計分析通過未配對的Student t檢定或變異數分析進行，然後進行Scheffe多重比較事後檢定。SPSS軟體(version 14；SPSS)用於分析數據。p值<0.05被認為具有統計上顯著性。

實施例1：老年受試者血漿CCL4濃度增加

血漿採集自年輕(<30歲)和老年(>55歲)受試者。與年輕人相比，老年受試者的血漿CCL4含量升高(圖1A)，顯示CCL4可能與全身和血管衰老過程有關。

實施例2：CCL4的抑制可逆轉細胞衰老並減少老化HAEC的發炎

相較於人主動脈內皮細胞(HAEC)中的年輕細胞(繼代4；P4)，老化細胞(繼代9；P9)的細胞衰老顯著增加。經驗證，以siRNA抑制CCL4可減少HAEC的衰老(圖1B)；老化HAEC中ROS生成增強，而以siCCL4處理的組中，ROS生成減少(圖1C)；在老化的HAEC中CCL4的表現較高，而藉由投藥siCCL4降低其表現(圖1D)；抑制CCL4可逆轉老化標記，例如SIRT1表現量上調，p53和p16則下降(圖1E)。此外，CCL4的抑制可減少因年紀誘發的發炎蛋白，如TNF-α、IL-1β和IL-6(圖1F)。這些數據顯示，抑制CCL4可逆轉老化過程並減少老化HAEC的發炎。

實施例3：CCL4的抑制逆轉年紀誘發的細胞功能障礙並增加老化HAEC中的血管生成蛋白

老化的HAEC中細胞增生能力下降。經驗證，以siRNA抑制CCL4不會影響老化HAEC中的細胞增生(圖2A)；老化HAEC的管形成和遷移能力減弱，而以siCCL4抑制可顯著改善其能力(圖2B和2C)；包括p-eNOS、p-AKT、VEGF和SDF-1α等血管生成因子於老化的HAEC中減少，而在以CCL4抑制的組中上調(圖2D)。上述研究結果顯示，抑制CCL4可逆轉因老化受損的細胞功能並增加老化HAEC中的血管生成蛋白。

實施例4：藉由基因敲除抑制CCL4可改善老年小鼠的血管生成

與年輕小鼠(WT6M)相比，老年野生型小鼠(WT18M)的主動脈環之主動脈萌芽受損。而相較於老年野生型小鼠(WT18M)，老年CCL4敲除小鼠(CCL4KO18M)的主動脈環血管萌芽面積增加(圖3A和3B)。另外，在主動脈組織中血管生成、老化和發炎標記的表現之評估中，相較於老年野生型小鼠(WT18M)，老年CCL4敲除小鼠(CCL4KO18M)的主動脈具有較高的血管生成蛋白(p-AKT/VEGF)(圖3C)，並且逆轉老化蛋白(SIRT1上調/p53下調/p16下調)(圖3D)與下調發炎蛋白(IL-6/TNF-α)(圖3E)。

此外，藉由體內基質膠塞測定驗證CCL4敲除對新生血管形成之影響。相較於年輕小鼠(WT6M)的膠塞，老年野生型小鼠(WT18M)的膠塞中觀察到較低的血管形成和血紅素含量。而相較於老年野生型小鼠(WT18M)，老年CCL4敲除小鼠(CCL4KO18M)的膠塞的血管形成和血紅素含量增加(圖4A)。於蘇木精和伊紅(H&E)與CD31染色分析的切片中亦觀察 到老年CCL4敲除小鼠(CCL4KO18M)的膠塞中血管數量的增加(圖4B和4C)。另外，在老年CCL4敲除小鼠(CCL4KO18M)的膠塞中，檢測到Ki67(細胞增生標記)的表現高於老年野生型小鼠(WT18M)(圖4D)。

實施例5：藉由中和抗體抑制CCL4可改善老年小鼠的血管生成

相較於老年野生型小鼠(WT18M)，以中和抗體抑制CCL4的老年野生型小鼠(WT18M+CCL4 mAb)的主動脈環血管萌芽面積增加(圖5A和5B)。另外，在主動脈組織中血管生成、老化和發炎標記的表現之評估中，相較於老年野生型小鼠(WT18M)，以中和抗體抑制CCL4的老年野生型小鼠(WT18M+CCL4 mAb)的主動脈具有較高的血管生成蛋白(p-AKT/VEGF)(圖5C)，並且逆轉老化蛋白(SIRT1上調/p53下調/p16下調)(圖5D)與下調發炎蛋白(IL-6/TNF-α)(圖5E)。

此外，藉由體內基質膠塞測定驗證以中和抗體抑制CCL4對新生血管形成之影響。相較於年輕小鼠(WT6M)的膠塞，老年野生型小鼠(WT18M)的膠塞中觀察到較低的血管形成和血紅素含量。而相較於老年野生型小鼠(WT18M)，以中和抗體抑制CCL4的老年野生型小鼠(WT18M+CCL4mAb)的膠塞的血管形成和血紅素含量增加(圖6A)。於蘇木精和伊紅(H&E)與CD31染色分析的切片中，亦觀察到以中和抗體抑制CCL4的老年野生型小鼠(WT18M+CCL4 mAb)的膠塞中血管數量的增加(圖6B和6C)。另外，在以中和抗體抑制CCL4的老年野生型小鼠(WT18M+CCL4 mAb)的膠塞中，檢測到Ki67(細胞增生標記)的表現高於老年野生型小鼠(WT18M)(圖6D)。

從以上實施例可證，經由CCL4之抑制，可透過調節體內老化因子、發炎因子及血管新生因子，從而抑制血管老化，包括抵抗血管內皮細胞衰老及/或提升血管生成能力。

雖然已詳細說明本揭露之實施例，但對熟習此項技術者而言，在不實質上脫離本揭露的教示和特徵的情況下，對所示的實施例進行各種修改和改變仍被認為落在本揭露之精神及範疇內。因此，此修改和改變包含在本揭露闡述的精神和範圍內。

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Claims (12)

1. 一種CCL4拮抗劑於製備抑制血管老化之醫藥組成物的用途，其中，該醫藥組成物包含有效量的CCL4拮抗劑及其藥學上可接受的載體。
2. 如請求項1所述之用途，其中，該CCL4拮抗劑係選自由抗CCL4抗體或其片段、CCL4基因干擾核糖核酸、CCL4小分子拮抗劑、CCR1拮抗劑、CCR2拮抗劑及CCR5拮抗劑所組成群組之至少一者。
3. 如請求項1所述之用途，其中，該血管老化伴隨CCL4含量升高。
4. 如請求項1所述之用途，其中，該CCL4拮抗劑係藉由包含降低CCL4含量、抑制CCL4與其受體結合活性或其結合以抑制該血管老化。
5. 如請求項4所述之用途，其中，該抑制血管老化包括抵抗血管內皮細胞衰老及/或提升血管生成能力。
6. 如請求項5所述之用途，其中，該抵抗血管內皮細胞衰老係包括選自由降低ROS、逆轉老化因子及降低發炎因子所組成群組之至少一者，且該提升血管生成能力包括血管新生因子上調。
7. 如請求項6所述之用途，其中，該逆轉老化因子係包括選自由SIRT1上調、p53下調及p16下調所組成群組之至少一者。
8. 如請求項6所述之用途，其中，該發炎因子係包括選自由TNF-α、IL-1β及IL-6所組成群組之至少一者。
9. 如請求項6所述之用途，其中，該血管生成能力係包括選自由管形成、細胞遷移能力及血管萌芽所組成群組之至少一者。
10. 如請求項6所述之用途，其中，該血管新生因子係包括選自由p-eNOS、p-AKT、VEGF及SDF-1α所組成群組之至少一者。
11. 如請求項1所述之用途，其中，該CCL4拮抗劑係以0.01mg/kg至100mg/kg的量投予。
12. 如請求項1所述之用途，其中，該醫藥組成物係以每週1至25次的頻率投予。

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