TW202527998A

TW202527998A - 抗FGFR2b抗體-藥物綴合物及其應用

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Publication number: TW202527998A
Application number: TW113149478A
Authority: TW
Inventors: 付雅媛; 葛元潔; 唐任宏
Original assignee: 大陸商山東先聲生物製藥有限公司
Priority date: 2023-12-18
Filing date: 2024-12-18
Publication date: 2025-07-16
Also published as: WO2025130905A1

Abstract

本發明涉及一種靶向人FGFR2的抗體-藥物偶聯物(ADC)及其應用。具體而言，本發明公開了一種特異性結合人FGFR2b亞型的ADC，對KATOIII和SNU-16等內源表達FGFR2b的腫瘤細胞具有較強的殺傷活性，尤其在體內藥效模型中體現出較高的抑瘤率，填補了FGFR2b領域的治療空白。

Description

抗FGFR2b抗體-藥物綴合物及其應用

本公開要求於2023 年12 月18 日提交中國專利局、申請號為202311755620.1、發明名稱為“抗FGFR2b抗體-藥物綴合物及其應用”的中國專利申請的優先權，以及於2024年12月11日提交中國專利局、申請號為202411822694.7、發明名稱為“抗FGFR2b抗體-藥物綴合物及其應用”的中國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本公開中。發明領域

本發明涉及抗體領域，具體而言，涉及抗FGFR2b抗體-藥物綴合物及其應用。

發明背景成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)家族由22個已知FGF組成，基於活性和序列的相似度被分為7個亞家族。目前已知的與FGF結合的只有4種成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)1-4及它們的亞型。當FGFR與配體及肝素結合後，會誘導FGFR形成二聚體，細胞內的酪胺酸激酶結構域發生自磷酸化，激活細胞內多條訊息傳遞通路如增殖(STATs，RAS/p38/JNKs，和RAS/MAPK/ERK)、存活(STATs和PI3K/AKT)和細胞骨架調節(PLC/Ca ²⁺)等，促進細胞增殖、存活、分化，參與調節生物體內的生理過程，如胚胎發育，器官發育，傷口癒合和血管生成等。不同的亞型它們的配體不同，FGFR2b是FGF7亞家族的高親和受體。不同的亞型組織表達不同，FGFR2b主要在上皮組織中表達(如結直腸管腔表面上皮細胞，食管基底至下三分之一的上皮細胞，胃腔面上皮壁細胞，子宮表面有鱗狀上皮、血管平滑肌細胞等)，FGFR2c型主要在間質組織中表達。

當FGFR發生過表達和突變時，會引起FGFR訊號通路的異常，通過促進細胞增殖、存活、遷移和血管生成來促進腫瘤的發生和發展。FGFR2在多種實體瘤中有過表達和突變，其中在胃癌，非小細胞肺癌鱗癌，三陰乳腺癌，子宮內膜癌，卵巢癌，胰腺癌，肝內膽管癌，結直腸癌中有FGFR2b亞型的表達。胃癌是全球常見的高發惡性腫瘤，年發病患者高達一百多萬，死亡率僅次於肺癌和乳腺癌。而目前胃癌的治療手段十分有限，尤其是對於占比較高的HER2陰性患者，缺乏有效的治療方案。數據統計顯示，HER2陰性的晚期胃癌及胃食管結合部癌患者中有約30%的病人是FGFR2b陽性，通過免疫組化染色、測序等手段確定胃癌組織中特異性高表達FGFR2b亞型而非FGFR2c亞型，而在臨近組織和正常器官中(除皮膚外)未檢測到FGFR2b的表達，FGFR2b可以作為這部分胃癌病人的治療靶點。另外，在31%的非小細胞肺癌鱗癌，13%三陰乳腺癌，40%卵巢癌，4%胰腺癌，22%肝內膽管癌中均有FGFR2b高表達(2+/3+ IHC)。

抗體偶聯藥物(antibody-drug conjugates, ADC)是一種新型的腫瘤治療方法，由負責選擇性識別癌細胞表面抗原的抗體(antibody)，藥物有效載荷(payload)，以及接子(linker)組成，通過將靶向特異性抗原的抗體與細胞毒性藥物結合，兼具抗體藥物的腫瘤靶向性和傳統小分子化療的強大殺傷效應，可以精準地攻擊腫瘤細胞並減少對正常細胞的損害。

發明概要一方面，本公開提供一種抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其結構通式為Pc-(L-D) _n，其中， D為細胞毒性藥物； L為連接子單元； Pc為特異性結合FGFR2b的抗體或其抗原結合片段；和 n為1~16的實數。

在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段具有如下一種或多種性質： (1) 以不大於5×10 ^-8M的親和力結合FGFR2； (2) 與人、鼠或猴FGFR2結合；和 (3) 結合FGFR2b而不結合FGFR2c。

在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)或/和輕鏈可變區(VL)，所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，或/和所述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1-3或/和所述LCDR1-3選自以下組合： (1) 所述HCDR1-3包含如SEQ ID NO.9-11所示序列；或/和所述LCDR1-3包含如SEQ ID NO.12-14所示序列； (2) 所述HCDR1-3包含如SEQ ID NO.15-17所示序列；或/和所述LCDR1-3包含如SEQ ID NO.18-20所示序列； (3) 所述HCDR1-3包含如SEQ ID NO.21-23所示序列；或/和所述LCDR1-3包含如SEQ ID NO.24-26所示序列；或， (4) 所述HCDR1-3或/和所述LCDR1-3包含與第(1)-(3)組中任一組所述HCDR1-3和LCDR1-3中的任一CDR相比，具有至少80%同一性的序列，或至多發生3個插入、缺失或替換突變的序列；優選地，所述至少80%同一性為85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。

在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段的HCDRs和LCDRs是根據Kabat編號系統劃分的。

在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)或/和輕鏈可變區(VL)，所述重鏈可變區或/和輕鏈可變區選自以下： (1) 所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO.1所示序列，或/和所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.2所示序列； (2) 所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO.3所示序列，或/和所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.4所示序列； (3) 所述重鏈可變區包含如SEQ ID NO.5所示序列，或/和所述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO.6所示序列；或， (4) 所述重鏈可變區或/和所述輕鏈可變區包含與第(1)-(3)組中任一組所述重鏈可變區或/和輕鏈可變區相比，具有至少80%同一性的序列，或至多發生3個插入、缺失或替換突變的序列；優選地，所述至少80%同一性為85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。

在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段包括重鏈恆定區序列和/或輕鏈恆定區序列；可選的，所述重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區選自完整的恆定區序列或其片段，所述恆定區片段包括CH1、鉸鏈區、CH2、CH3或Fc；可選的，所述重鏈恆定區選自人或鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區，所述輕鏈恆定區選自人或鼠κ恆定區或λ恆定區；可選的，所述抗體或其抗原結合片段包括完整的重鏈和輕鏈，所述重鏈由所述VH和重鏈恆定區組成，所述重鏈恆定區具有如SEQ ID NO.7所示序列，所述輕鏈由所述VL和輕鏈恆定區組成，所述輕鏈恆定區具有如SEQ ID NO.8所示序列。

在一些實施方案中，所述的抗體或其抗原結合片段為：(1) 嵌合抗體或其片段；(2)人源化抗體或其片段；和/或，(3) 全人源抗體或其片段；優選的，所述抗體或其抗原結合片段選自單株抗體、多株抗體、天然抗體、工程化抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、全長抗體、抗體片段、裸抗體、綴合抗體、人源化抗體、全人源抗體、Fab、Fab’、F(ab’) ₂、Fd、Fv、scFv、雙抗體(diabody)或單域抗體。

在一些實施方式中，所述抗原結合片段選自F(ab) ₂、Fab’、Fab、Fv片段、scFv、奈米抗體或affibody中的一種或多種。

在一些實施方案中，所述細胞毒性藥物選自微管蛋白抑制劑、DNA損傷劑或拓撲異構酶抑制劑，所述微管蛋白抑制劑包括但不限於海兔毒素(dolastatin)類、澳瑞他汀(auristatin)類、美登素(maytansine)類、微管溶素(Tubulysins)類和隱黏菌素(cryptomycins)類藥物，所述DNA損傷劑包括但不限於PBD類藥物，所述拓撲異構酶抑制劑包括但不限於喜樹鹼類藥物。

在一些實施方案中，所述細胞毒性藥物選自拓撲異構酶I抑制劑或澳瑞他汀類藥物。

在一些實施方案中，所述細胞毒性藥物選自式(D-I)所示化合物， (D-I) 其中， R ¹、R ²與其連接的原子共同形成5-6員雜環，所述5-6員雜環含有1或2個氧原子作為環原子，所述5-6員雜環任選被一個或多個氘原子取代； R ⁴選自H或C ₁-C ₃烷基； R ⁵選自H、鹵素、CN、＝O、OH、NH ₂或C ₁-C ₃烷基； R ⁶選自H或C ₁-C ₃烷基； R ⁷選自H、C ₁-C ₃烷基或者C ₃-C ₆環烷基，所述C ₁-C ₃烷基或C ₃-C ₆環烷基任選被氘、鹵素、CN、＝O、OH、NH ₂或C ₁-C ₃烷基取代。

在一些實施方案中，所述R ¹、R ²與它們連接的原子共同形成或。

在一些實施方案中，R ⁴選自H。

在一些實施方案中，R ⁵選自H。

在一些實施方案中，R ⁶選自H。

在一些實施方案中，R ⁷選自環丙基。

在一些實施方案中，式(D-I)所示化合物選自或。

在一些實施方案中，所述細胞毒性藥物選自、或。

在一些實施方案中，所述連接子單元選自，其中，m1選自整數2~8，L ¹選自由1至8個胺基酸構成的肽殘基，所述肽殘基進一步任選被鹵素、CN、＝O、C ₁-C ₆烷基、OH、O(C ₁-C ₆烷基)、NH ₂、NH(C ₁-C ₆烷基)、N(C ₁-C ₆烷基) ₂、C ₃-C ₆環烷基和4-7員雜環基中的一個或多個取代基取代，L ²選自或，所述連接子單元的a端與抗體或其抗原結合片段共價連接，b端與細胞毒性藥物共價連接。

在一些實施方案中，所述L ¹選自Val-Cit或Gly-Gly-Phe-Gly所示的肽殘基。

在一些實施方案中，m1為5。

在一些實施方案中，所述連接子單元為或，其a端與所述抗體或其抗原結合片段共價連接，b端與細胞毒性藥物共價連接。

在一些實施方案中，所述n選自1~16的實數，例如n選自2~12的實數，例如n選自4~10的實數，例如n選自3~9的實數，例如n選自4~8的實數，例如n選自6~8的實數，例如n選自3~5的實數。

在一些實施方案中，n選自3~9的實數，例如n為3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。

在一些實施方案中，n選自6~8的實數，例如n為6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。

在一些實施方案中，n選自3~5的實數，例如n為3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。

在一些實施方案中，所述抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽選自以下化合物或其藥學上可接受的鹽：、或，其中Pc和n如前述任一定義。

另一方面，本公開提供一種或多種分離的核酸分子，所述核酸分子可以是任意長度的分離形式的核苷酸、脫氧核苷酸和/或核糖核苷酸，所述核酸分子編碼前述的抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方案中，本公開提供一種包含上文所述的核酸分子的表達載體。

在一些實施方案中，本公開提供了一種包含上文所述的核酸分子，或上文所述的表達載體的分離的宿主細胞；優選地，所述宿主細胞是真核細胞或原核細胞；更優選地，所述宿主細胞來源於哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、大腸桿菌和/或枯草桿菌；更優選地，所述宿主細胞選自Expi293或CHO細胞。

另一方面，本公開提供一種藥物組合物，其包含本公開前述通式為Pc-(L-D) _n的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的輔料。

在一些實施方案中，所述藥物組合物中還包含其它治療劑，例如其它抗體，典型的包含PD-1/PD-L1抑制劑；或例如化療藥物。

另一方面，本公開提供治療哺乳動物腫瘤的方法，包括對需要該治療的哺乳動物，優選人類，給予治療有效量的前述通式為Pc-(L-D)n的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或上文所述的藥物組合物。

在一些實施方案中，所述方法還包含使用額外的治療劑，例如其它抗體，典型的包含PD-1/PD-L1抑制劑；或例如化療藥物。

在一些實施方案中，所述腫瘤是表達FGFR2b的腫瘤。

在一些實施方案中，所述腫瘤選自由下列組成的組：胃癌、非小細胞肺癌鱗癌、三陰乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、胰腺癌、肝內膽管癌、結直腸癌。

另一方面，本公開提供前述通式為Pc-(L-D) _n的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或上文所述的藥物組合物在製備治療腫瘤的藥物中的用途。

在一些實施方案中，所述腫瘤是表達FGFR2b的腫瘤。

另一方面，本公開提供前述通式為Pc-(L-D) _n的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或上文所述的藥物組合物在治療腫瘤中的用途。

在一些實施方案中，所述腫瘤是表達FGFR2b的腫瘤。

另一方面，本公開提供治療腫瘤的前述通式為Pc-(L-D) _n的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或其藥物組合物。有益效果：

本公開的抗體-藥物偶聯物具有如下優勢： 1. 可特異性識別FGFR2b靶點，相較於FGFR2c，對FGFR2b具有更高的選擇性； 2. 相較於現有的單抗療法具有更好的抑瘤效果，在治療腫瘤等疾病中具有廣闊的臨床應用前景。 3. 截至發明完成之日，尚無FGFR2b靶點的ADC藥物進入臨床階段，發明人通過研究獲得一種FGFR2b的ADC，擁有同等或更低劑量下優於Bemarituzumab的藥效，並且經過驗證發現，在Bemarituzumab耐藥的胃癌病人腫瘤小鼠移植模型中，本公開的FGFR2b-ADC能夠顯著的抑制腫瘤的生長。

較佳實施例之詳細說明下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

本發明實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。 術語定義和說明

除非另有說明，本公開中所用的術語具有下列含義，本公開中記載的基團和術語定義，包括其作為實例的定義、示例性的定義、優選的定義、表格中記載的定義、實施例中具體化合物的定義等，可以彼此之間任意組合和結合。一個特定的術語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照本領域普通的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。

此外，除非本文另有說明，本文單數形式的術語應包括複數形式，複數形式的術語應包括單數形式。更具體地，如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，除非另外明確指出，否則單數形式“一種”和“這種”包括複數指示物。

本文術語“包括”、“包含”和“具有”之間可互換使用，旨在表示方案的包含性，意味著所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同時應當理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……組成”方案。

術語“和/或”在本文使用時，包括“和”、“或”和“由所屬術語鏈接的要素的全部或任何其他組合”的含義。

本文術語FGFR(Fibroblast Growth Factor Receptors)，即成纖維細胞生長因子受體，一般包括FGFR1-FGFR4(也稱CD331-334)四種類型。FGFR是酪胺酸酶受體家族的一支，為I型跨膜蛋白，細胞外區域，其包含由2個或3個免疫球蛋白樣結構域(IgI至IgIII)組成的配體結合位點；單次穿過跨膜區域；和細胞內區域，其包含酪胺酸激酶結構域。FGFR通常以二聚體形式發揮作用。其中，胞外結構域包含三個Ig樣區域D1(IgI)、D2(IgII)、D3(IgIII)，其中D1和Acidic box組成自抑制區；D2和D3負責與配體結合(D2與細胞表面硫酸乙醯肝素結合，D3由於可變剪接有IIIb和IIIc兩種形式，FGFR4中目前只發現IIIc一種亞型)。根據Ig樣結構域的個數，FGFR可分為兩種形式，一種是α型，含有IgI, IgII, IgIII三個區域；另一種是β型，只含IgII和IgIII。示例性的，本公開中FGFR2b包含“FGFR2(α)b”和“FGFR2(β)b”。

將人FGF分類成22種FGF (FGF1至FGF14和FGF16至FGF23)。除了FGF19、FGF21、FGF23是內分泌外，其餘皆為旁分泌產生，其中FGF7隻能與IIIb型的FGFR2結合。FGFR與FGF結合介導了RAS-RAF-MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT以及PLCγ等訊號通路的激活傳遞，FGFR基因變異通常在肺癌、肝癌、肝內膽管癌、乳腺癌、胃癌、子宮癌及膀胱癌等實體瘤中廣泛存在，並且不同癌種的FGFR突變類型及頻率也存在差異。

FGFR具有下述活性：(1)結合FGF；(2)該結合會使FGFR二聚化；(3)該二聚化會在FGFR的特定酪胺酸殘基處將FGFR磷酸化；(4)該磷酸化會促進銜接蛋白諸如FGFR受質2α(FRS2α)的募集；和(5)這會將FGF刺激產生的訊息傳遞至表達FGFR的細胞或組織或活化訊息傳遞。

術語“FGFR2b”和“FGFR2IIIb”可以互換使用，指成纖維細胞生長因子受體2IIIb剪接形式。一種示例性的人FGFR2IIIb在GenBank登錄號NP_075259 .4(日期：2013年7月7日)中顯示。FGFR2 IIIb蛋白通常結合選自FGF1、FGF3、FGF7 (KGF)、FGF10、FGF22和FGF23的一種或兩種或更多種FGF。FGFR2 IIIb蛋白可以結合其它FGF，並且可以不結合在上面組中包括的FGF的突變形式。

術語“FGFR2c”和“FGFR2IIIc”可以互換使用，指成纖維細胞生長因子受體2IIIc剪接形式。一種示例性的人FGFR2IIIc在GenBank登錄號NP_000132 .3(日期：2013年7月7日)中顯示。FGFR2 IIIc蛋白通常結合選自FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF9、FGF17、FGF18、FGF21和FGF23的一種或兩種或更多種FGF。FGFR2 IIIc蛋白可以結合其它FGF，並且可以不結合在上面組中包括的FGF的突變形式。

在一些實施方案中，本公開所述的抗體以高親和力結合FGFR2b而以低親和力結合FGFR2c或不結合FGFR2c。通常情況下，本公開的抗體或其抗原結合片段以高於FGFR2c 10倍、100倍、1000倍或10000倍的親和力或結合活性結合FGFR2b。

術語“抗體-藥物偶聯物” (antibody drug conjugate，ADC)，指抗體或其抗原結合片段通過穩定的連接子單元與具有生物活性的藥物相連。所述的連接可以是共價鍵或非共價相互作用例如通過靜電力。為了形成免疫綴合物，可以使用本領域中已知的各種接頭。

術語“DAR”或“藥物抗體比率”是指每個抗體分子連接的小分子細胞毒性藥物的平均數目。在本公開的抗體-藥物偶聯物中，DAR由變量“n”定義，n既可以是整數，也可以是小數。

本文術語“抗原結合分子”按最廣義使用，是指特異性結合抗原的分子。示例性地，抗原結合分子包括但不限於抗體或抗體模擬物。“抗體模擬物”是指能夠與抗原特異性結合，但與抗體結構無關的有機化合物或結合域，示例性地，抗體模擬物包括但不限於affibody、affitin、affilin、經設計的錨蛋白重複蛋白(DARPin)、核酸適體或Kunitz型結構域肽。

本文術語“抗體”按最廣義使用，是指包含來自免疫球蛋白重鏈可變區的足夠序列和/或來自免疫球蛋白輕鏈可變區的足夠序列，從而能夠特異性結合至抗原的多肽或多肽組合。本文“抗體”涵蓋各種形式和各種結構，只要它們展現出期望的抗原結合活性。本文“抗體”包括具有移植的互補決定區(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白質支架或人工支架。此類支架包括抗體衍生的支架(其包含引入以例如穩定化抗體三維結構的突變)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。此類支架還可以包括非抗體衍生的支架，例如本領域已知可用於移植CDR的支架蛋白，包括但不限於肌腱蛋白、纖連蛋白、肽適體等。

本文術語“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結合片段(即“抗原結合部分”)或單鏈。“抗體”是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(在此縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(在此縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH和VL區可進一步再分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，CDR散布在被稱為構架區(FR)的更加保守的區域中。每個VH和VL，均由三個CDR和四個FR組成，它們從胺基端向羧基端以如下順序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有可與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，該宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)和經典補體系統的第一成分(C1q)。由於免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將本文“免疫球蛋白”分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分為IgA1和IgA2。輕鏈通過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

本文“抗體”還包括不包含輕鏈的抗體，例如，由單峰駝(Camelus dromedarius)、雙峰駝(Camelus bactrianus)、大羊駝(Lama glama)、原駝(Lama guanicoe)和羊駝(Vicugna pacos)等駱駝科動物產生的重鏈抗體(heavy-chain antibodies, HCAbs)以及在鯊等軟骨魚綱中發現的免疫球蛋白新抗原受體(Ig new antigen receptor, IgNAR)。

本文術語“抗體”可以來源於任何動物，包括但不限於人和非人動物，所述非人動物選自靈長類動物、哺乳動物、齧齒動物和脊椎動物，例如駱駝科動物、大羊駝、原鴕、羊駝、羊、兔、小鼠、大鼠或軟骨魚綱(例如鯊)。

本文“抗體”包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體的片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人源抗體。

術語“抗體”是指從基本上同質的抗體群體獲得的抗體，即，除了可能的變異體(例如含有天然存在的突變或在製劑的生產過程中產生，此類變體通常以少量存在)之外，包含所述群體的各個抗體是相同的和/或結合相同的表位。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑中的每種單株抗體針對抗原上的單一決定簇。本文修飾語“單株”不應解釋為需要通過任何特定方法產生所述抗體或抗原結合分子。舉例來說，單株抗體可通過多種技術製得，包括(但不限於)雜交瘤技術、重組DNA方法、噬菌體庫展示技術和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉殖基因動物的方法和其它本領域已知的方法。

術語“抗體”是指通過多細胞生物體的免疫系統製造和配對的抗體。本文術語“工程化抗體”的抗體是指通過基因工程、抗體工程等技術獲得的非天然抗體，示例性地，“工程化抗體”包括人源化抗體、小分子抗體(例如scFv等)、雙特異性抗體等等。

術語“單特異性”是指表示具有一個或多個結合位點，其中每個結合位點結合相同抗原的相同表位。

術語“多特異性抗體”是指具有至少兩個抗原結合位點，所述至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。因此，諸如“雙特異性”、“三特異性”、“四特異性”等術語是指抗體/抗原結合分子可以結合的不同表位的數目。

術語“價”表示抗體/抗原結合分子中規定數目的結合位點的存在。因此，術語“單價”、“二價”、“四價”和“六價”分別表示抗體/抗原結合分子中一個結合位點、兩個結合位點、四個結合位點和六個結合位點的存在。

本文“全長抗體”、“完好抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，是指具有基本上與天然抗體結構相似的結構。

本文“抗原結合片段”和“抗體片段”在本文中可互換使用，其不具備完整抗體的全部結構，僅包含完整抗體的局部或局部的變體，所述局部或局部的變體具備結合抗原的能力。示例性地，本文“抗原結合片段”或“抗體片段”包括但不限於Fab、F(ab’) ₂、Fab’、Fab’-SH、Fd、Fv、scFv、雙抗體(diabody)和單域抗體。

本文術語“單域抗體”(single domain antibody, sdAb) 是指選殖重鏈抗體的可變區，構建僅由一個重鏈可變區組成的單域抗體，它是具有完整功能的最小的抗原結合片段。通常先獲得天然缺失輕鏈和重鏈恆定區1(CH1)的重鏈抗體後，再選殖抗體重鏈的可變區，構建僅由一個重鏈可變區組成的單域抗體。

完整抗體的木瓜蛋白酶消化生成兩個同一的抗原結合片段，稱作“Fab”片段，每個含有重和輕鏈可變域，還有輕鏈的恆定域和重鏈的第一恆定域(CH1)。如此，本文術語“Fab片段”指包含輕鏈的VL域和恆定域(CL)的輕鏈片段，和重鏈的VH域和第一恆定域(CH1)的抗體片段。Fab’片段因在重鏈CH1域的羧基末端增加少數殘基而與Fab片段不同，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH是其中恆定域的半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基團的Fab’片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點(兩個Fab片段)和Fc區的一部分的F(ab’) ₂片段。

“Fv片段”是由 IgG 和 IgM 產生的最小片段，包含完整抗原結合位點，Fv 片段具有與 Fab 相同的結合特性和相似的三維結合特性，Fv片段的 VH 和 VL 鏈通過非共價相互作用結合在一起。

術語“scFv”(single-chain variable fragment)是指包含VL和VH結構域的單個多肽鏈，其中所述VL和VH通過接頭(linker)相連。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有胺基酸序列(GGGGS) ₄(SEQ ID NO. 37)的接頭，但也可使用其變體。在一些情況下，scFv的VH與VL之間還可以存在二硫鍵，形成二硫鍵連接的Fv(dsFv)。

術語“雙抗體(diabody)”，其VH和VL結構域在單個多肽鏈上表達，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結構域之間配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合部位。

術語“嵌合抗體(Chimeric antibody)”是指，這樣的抗體，其輕鏈或/和重鏈的一部分源自一個抗體(其可以源自某一特定物種或屬於某一特定抗體類或亞類)，且輕鏈或/和重鏈的另一部分源自另一個抗體(其可以源自相同或不同的物種或屬於相同或不同的抗體類或亞類)，但無論如何，其仍保留對目標抗原的結合活性。例如，術語“嵌合抗體”可包括這樣的抗體(例如人鼠嵌合抗體)，其中抗體的重鏈和輕鏈可變區來自第一抗體(例如鼠源抗體)，而抗體的重鏈和輕鏈恆定區來自第二抗體(例如人抗體)。

術語“人源化抗體”是指，經基因工程改造的非人源抗體，其胺基酸序列經修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分CDR區來自於非人源抗體(供體抗體)，全部或部分的非CDR區(例如，可變區FR和/或恆定區)來自於人源免疫球蛋白(受體抗體)。人源化抗體通常保留或部分保留了供體抗體的預期性質，包括但不限於，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力、增強免疫應答的能力等。

術語“全人源抗體”是指具有其中FR和CDR二者都源自人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。此外，如果抗體包含恆定區，則恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本文全人源抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)。然而，本文“全人源抗體”不包括其中來源於另一個哺乳動物物種(例如小鼠)的種系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗體。

本文術語“裸抗體”是指不與另一種作用劑或分子(例如標記或藥物)、肽或多肽連接、融合或綴合的抗體。在具體的實施方案中，由哺乳動物宿主細胞表達的裸抗體可被宿主細胞的醣基化機器(例如醣基化酶)醣基化。在某些實施方案，當通過不具有其自身醣基化機器(例如醣基化酶)的宿主細胞表達時，裸抗體不被醣基化。在某些實施方案中，裸抗體是完整抗體，而在其它實施方案中，裸抗體是完整抗體的抗原結合片段，例如Fab 抗體。

術語“可變區”是指抗體重鏈或輕鏈中牽涉使抗體結合抗原的區域，“重鏈可變區”與“VH”、“HCVR”可互換使用，“輕鏈可變區”與“VL”、“LCVR”可互換使用。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別是VH和VL)一般具有相似的結構,每個域包含四個保守的框架區(FR)和三個高變區(HVR)。單個VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。本文術語“互補決定區”與“CDR”可互換使用，通常指重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)的高變區(HVR)，該部位因在空間結構上可與抗原表位形成精密的互補，故又稱為互補決定區，其中，重鏈可變區CDR可縮寫為HCDR，輕鏈可變區CDR可縮寫為LCDR。本術語“構架區”或“FR區”可互換，是指抗體重鏈可變區或輕鏈可變區中除CDR以外的那些胺基酸殘基。通常典型的抗體可變區由4個FR區和3個CDR區按以下順序組成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

本文“CDR”可由本領域公知的方式加以標注和定義，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統或IMGT編號系統，使用的工具網站包括但不限於AbRSA網站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis網站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和IMGT網站(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。本文CDR包括不同定義方式的胺基酸殘基的重疊(overlap)和子集。

本文術語“重鏈恆定區”是指抗體重鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出效應子功能，諸如與Fc受體的相互作用，其相對於抗體的可變結構域具有更保守的胺基酸序列。“重鏈恆定區”選自CH1結構域，鉸鏈區，CH2結構域，CH3結構域，或其變體或片段。“重鏈恆定區”包括“全長重鏈恆定區”和“重鏈恆定區片段”，前者具有基本上與天然抗體恆定區基本相似的結構，而後者僅包括“全長重鏈恆定區的一部分”。示例性地，典型的“全長抗體重鏈恆定區”由CH1結構域-鉸鏈區-CH2結構域-CH3結構域組成；當抗體為IgE時，其還包括CH4結構域；當抗體為重鏈抗體時，則其不包括CH1結構域。示例性地，典型的“重鏈恆定區片段”選自Fc或CH3結構域。

本文術語“輕鏈恆定區”是指抗體輕鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，所述輕鏈恆定區選自恆定κ結構域或恆定λ結構域。

本文術語“Fc”是指完整抗體經木瓜蛋白酶水解而成的抗體羧基端部分，典型地，其包含抗體的CH3和CH2結構域。Fc區包括例如天然序列Fc區、重組Fc區和變體Fc區。盡管免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可以略微變化，但是人IgG重鏈的Fc區通常被定義為從Cys226位置的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。Fc區的C末端離胺酸(根據Kabat編號系統的殘基447)可以例如在抗體的產生或純化過程中，或通過對編碼抗體重鏈的核酸重組工程化而除去，因此，Fc區可包括或不包括Lys447。

本文術語“保守胺基酸”通常是指屬於同一類或具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性、親水性、主鏈構象和剛性)的胺基酸。示例性地，下述每組內的胺基酸屬於彼此的保守胺基酸殘基，組內胺基酸殘基的替換屬於保守胺基酸的替換： 1)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)； 2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)； 3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)； 4)精胺酸(R)、離胺酸(K)、組胺酸(H)； 5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；和 6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。

本文術語“同一性”可通過以下方式計算獲得：為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的“同一性”百分數，將所述序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸占據時，則所述分子在這個位置處是相同的。

本文術語“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物質。每個核苷酸由鹼基，特別是嘌呤或嘧啶鹼基(即胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脫氧核糖或核糖)和磷酸基團組成。通常，核酸分子由鹼基的序列描述，由此所述鹼基代表核酸分子的一級結構(線性結構)。鹼基的序列通常表示為5′至3′。在本文中，術語核酸分子涵蓋脫氧核糖核酸(DNA)，包括例如互補DNA(cDNA)和基因組DNA、核糖核酸(RNA)，特別是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含兩種或更多種這些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是線性的或環狀的。此外，術語核酸分子包括有義鏈和反義鏈二者，以及單鏈和雙鏈形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架鍵合或化學修飾的殘基的修飾的核苷酸鹼基。核酸分子還涵蓋DNA和RNA分子，其適合作為載體用於在體外和/或體內，例如在宿主或患者中，直接表達本發明的抗體。此類DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)載體可以是未修飾的或修飾的。例如，可以對mRNA進行化學修飾以增強RNA載體的穩定性和/或被編碼分子的表達，從而可以將mRNA注入到受試者內以在體內產生抗體(參見例如EP 2 101 823 B1，其通過援引加入併入本文)。

如本文所用，術語“載體”包括核酸載體，例如DNA載體(如質體)，RNA載體，病毒或其他適合的複製子(例如病毒載體)。已經開發了多種載體用於將編碼外源蛋白質的多核苷酸遞送到原核或真核細胞中。本發明的表達載體含有多核苷酸序列以及例如用於表達蛋白質和/或將這些多核苷酸序列整合到哺乳動物細胞基因組中的附加序列元件。可以用於表達本發明的抗體和抗體片段的某些載體包括含有指導基因轉錄的調控序列(如啓動子和增強子區域)的質體。用於表達抗體和抗體片段的其他有用的載體含有多核苷酸序列，其增強這些基因的翻譯速率或改善由基因轉錄產生的mRNA的穩定性或核輸出。這些序列元件包括例如5’和3’非翻譯區、內部核糖體進入位點(IRES)和聚腺苷酸化訊號位點，以便指導表達載體上攜帶的基因的有效轉錄。本發明的表達載體還可以含有以下多核苷酸，該多核苷酸編碼用於選擇含有這種載體的細胞的標記。適合的標記的實例包括編碼抗生素(如胺苄青黴素、氯黴素、卡那黴素或諾爾絲菌素)抗性的基因。

本文術語“宿主細胞”是指細胞中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”，其包括原代的經轉化的細胞和來源於其的後代，而不考慮傳代的次數。後代在核酸內容物上可能與親本細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括具有與在初始轉化的細胞中篩選或選擇的相同功能或生物學活性的突變體後代。

考慮到為最佳比對這兩個序列而需要引入的空位的數目和每個空位的長度，兩個序列之間的同一性百分數隨所述序列共有的相同位置變化而變化。

本文中“n為1-16的實數”指n為大於或等於1且小於或等於16的任意實數。

本文中“ ”表示連接位點。

本文中消旋體或者對映體純的化合物的圖示法來自Maehr，J.Chem.Ed.1985，62:114-120(其通過援引加入併入本文)。除非另有說明，用楔形鍵和虛楔鍵( 和 )表示一個立體中心的絕對構型，用黑實鍵和虛鍵( 和 )表示一個立體中心的相對構型(如脂環化合物的順反構型)。

術語“立體異構體”是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產生的異構體，包括順反異構體、對映異構體和非對映異構體。

本公開的化合物可以具有不對稱原子如碳原子、硫原子、氮原子、磷原子或不對稱雙鍵，因此本公開的化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。特定的幾何或立體異構體形式可以是順式和反式異構體、E型和Z型幾何異構體、(-)-和(+)-對映體、(R)-和(S)-對映體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體，以及其外消旋混合物或其它混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，以上所有這些異構體以及它們的混合物都屬於本公開化合物的定義範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子、不對稱硫原子、不對稱氮原子或不對稱磷原子，所有取代基中涉及到的這些異構體以及它們的混合物，也均包括在本公開化合物的定義範圍之內。本公開的含有不對稱原子的化合物可以以光學活性純的形式或外消旋形式被分離出來，光學活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或通過使用手性原料或手性試劑合成。

術語“被取代”是指特定原子上的任意一個或多個氫原子被取代基取代，只要特定原子的價態是正常的並且取代後的化合物是穩定的。當取代基為氧代(即=O)時，意味著兩個氫原子被取代，氧代不會發生在芳香基上。

術語“任選”或“任選地”是指隨後描述的事件或情況可以發生或不發生，該描述包括發生所述事件或情況和不發生所述事件或情況。例如，乙基“任選”被鹵素取代，是指乙基可以是未被取代的(CH ₂CH ₃)、單取代的(CH ₂CH ₂F、CH ₂CH ₂Cl等)、多取代的(CHFCH ₂F、CH ₂CHF ₂、CHFCH ₂Cl、CH ₂CHCl ₂等)或完全被取代的(CF ₂CF ₃、CF ₂CCl ₃、CCl ₂CCl ₃等)。本領域技術人員可理解，對於包含一個或多個取代基的任何基團，不會引入任何在空間上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。

本文中的C _m-C _n，是指具有m-n範圍中的整數個碳原子。

術語“烷基”是指通式為C _nH _2n+1的烴基，該烷基可以是直鏈或支鏈的。術語“C ₁-C ₆烷基”應理解為表示具有1、2、3、4、5或6個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴基。所述烷基包括但不限於甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、二級丁基、三級丁基、異戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1，1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，1-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基或1，2-二甲基丁基等；術語“C ₁-C ₃烷基”指含有1至3個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基。

本文所述“C ₁-C ₆烷基”可以進一步包含“C ₁-C ₃烷基”。

術語“環烷基”指完全飽和的且以單環、並環、橋環或螺環等形式存在的碳環。術語“C ₃-C ₆環烷基”應理解為表示飽和的單環、並環、螺環或橋環，其具有3～6個碳原子，具體實例包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。

術語“雜環基”是指完全飽和的或部分飽和的單環、並環、螺環或橋環基團，其環原子中含有1-5個雜原子或雜原子團(即含有雜原子的原子團)，所述“雜原子或雜原子團”包括但不限於氮原子(N)、氧原子(O)、硫原子(S)、磷原子(P)、硼原子(B)、-S(=O) ₂-、-S(=O)-、-P(=O) ₂-、-P(=O)-、-NH-、-S(=O)(=NH)-、-C(=O)NH-或-NHC(=O)NH-等。術語“4-7員雜環基” 指環原子數目為4、5、6或7的雜環基，且其環原子中含有1-3個獨立選自上文所述的雜原子或雜原子團。術語“5-6員雜環基” 指環原子數目為5或6雜環基，且其環原子中含有1-3個獨立選自上文所述的雜原子或雜原子團。其中，4員雜環基的實例包括但不限於氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基；5員雜環基的實例包括但不限於四氫呋喃基、二氧雜環戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基、4 ,5-二氫㗁唑或2 ,5-二氫-1H-吡咯基；6員雜環基的實例包括但不限於四氫吡喃基、哌啶基、嗎啉基、二噻烷基、硫代嗎啉基、哌𠯤基、三噻烷基、四氫吡啶基或4H-[1,3,4]噻二𠯤基；7員雜環基的實例包括但不限於二氮雜環庚烷基。“4-7員雜環基”可以包含“4-7員雜環烷基”、“5-6員雜環基”、“5-6員雜環烷基”等範圍。

術語“鹵”或“鹵素”是指氟、氯、溴和碘。

術語“治療”是指外科手術或藥物處理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是預防、減緩(減少)治療對象中不希望的生理變化或病變，如癌症、自身免疫性疾病和病毒感染的進展。有益的或所希望的臨床結果包括但不限於症狀的減輕、疾病程度減弱、疾病狀態穩定(即，未惡化)、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和、以及緩解(無論是部分緩解或完全緩解)，無論是可檢測的或不可檢測的。需要治療的對象包括已患有病症或疾病的對象以及易於患上病症或疾病的對象或打算預防病症或疾病的對象。當提到減緩、減輕、減弱、緩和、緩解等術語時，其含義也包括消除、消失、不發生等情況。

術語“有效量”指單獨給予或與另一治療劑組合給予細胞、組織或對象時能有效防止或緩解疾病病症或該疾病進展的治療劑用量。“有效量”還指足以緩解症狀，例如治療、治癒、防止或緩解相關醫學病症，或治療、治癒、防止或緩解這些病症的速度增加的化合物用量。當將活性成分單獨給予個體時，治療有效劑量單指該成分。當應用某一組合時，治療有效劑量指產生治療作用的活性成分的組合用量，而無論是組合、連續或同時給予。

術語“受試者”是指接受對如本公開所述的特定疾病或病症的治療的生物體。對象和患者的實例包括接受疾病或病症治療的哺乳動物，如人、靈長類動物(例如，猴)或非靈長類哺乳動物。

構成“治療有效量”的本公開化合物的量取決於該化合物、疾病狀態及其嚴重性、給藥方式以及待被治療的哺乳動物的年齡而改變，但可例行性地由本領域技術人員根據其自身的知識及本公開內容而確定。

術語“藥學上可接受的”，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。

術語“藥學上可接受的鹽”是指藥學上可接受的酸或鹼的鹽，包括化合物與無機酸或有機酸形成的鹽，以及化合物與無機鹼或有機鹼形成的鹽。

術語“藥物組合物”是指一種或多種本公開的化合物或其鹽與藥學上可接受的輔料組成的混合物。藥物組合物的目的是有利於對有機體給予本公開的化合物。

術語“藥學上可接受的輔料”是指對有機體無明顯刺激作用，而且不會損害該活性化合物的生物活性及性能的那些輔料。合適的輔料是本領域技術人員熟知的，例如碳水化合物、蠟、水溶性和/ 或水可膨脹的聚合物、親水性或疏水性材料、明膠、油、溶劑、水等。

詞語“包括(comprise)”或“包含(comprise)”及其英文變體例如comprises或comprising可理解為開放的、非排他性的意義，即“包括但不限於”。

本公開還包括與本文中記載的那些相同的，但一個或多個原子被原子量或質量數不同於自然中通常發現的原子量或質量數的原子置換的同位素標記的本公開化合物。可結合到本公開化合物的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，諸如分別為 ²H、 ³H、 ¹¹C、 ¹³C、 ¹⁴C、 ¹³N、 ¹⁵N、 ¹⁵O、 ¹⁷O、 ¹⁸O、 ³¹P、 ³²P、 ³⁵S、 ¹⁸F、 ¹²³I、 ¹²⁵I和 ³⁶Cl等。

某些同位素標記的本公開化合物(例如用 ³H及 ¹⁴C標記)可用於化合物和/或受質組織分布分析中。氚化(即 ³H)和碳-14(即 ¹⁴C)同位素對於由於它們易於製備和可檢測性是尤其優選的。正電子發射同位素，諸如 ¹⁵O、 ¹³N、 ¹¹C和 ¹⁸F可用於正電子發射斷層掃描(PET)研究以測定受質占有率。通常可以通過與公開於下文的方案和/或實施例中的那些類似的下列程序，通過同位素標記試劑取代未經同位素標記的試劑來製備同位素標記的本公開化合物。

本公開的藥物組合物可適用於腸胃外給藥，如合適的單位劑型的無菌溶液劑、混懸劑或凍乾產品。例如，本公開的藥物組合物可以是用於肌內或皮下給藥的無菌注射水溶液形式。本公開的藥物組合物在使用時可接受其它溶媒或溶劑，如水、林格氏液或等滲氯化鈉溶液。

本公開所述的藥物組合物，還可以包含治療性抗體或化療藥物，示例性的如PD-1/PD-L1抑制劑。所述的藥物組合物可以在一個藥品包裝盒內作為組合包裝，或者本公開所述的抗FGFR2b抗體的藥物綴合物與其它治療劑分開獨立包裝於不同的藥盒中。

本公開的化合物可以通過本領域技術人員所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其它化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本領域技術上人員所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本公開的實施例。

本公開具體實施方式的化學反應是在合適的溶劑中完成的，所述的溶劑須適合於本公開的化學變化及其所需的試劑和物料。為了獲得本公開的化合物，有時需要本領域技術人員在已有實施方式的基礎上對合成步驟或者反應流程進行修改或選擇。

本領域合成路線規劃中的一個重要考量因素是為反應性官能團(如本公開中的胺基、羧基)選擇合適的保護基，例如，可參考Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (4th Ed). Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.本公開引用的所有參考文獻整體上併入本公開。

本文術語“癌症”指向或描述哺乳動物中典型地以不受調節的細胞生長為特徵的生理狀況。此定義中包括良性和惡性癌症。本文術語“腫瘤”或“瘤”是指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖,無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。

非限制性的示例癌症包括胃癌、非小細胞肺癌鱗癌、三陰乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、胰腺癌、肝內膽管癌、結直腸癌和食道癌。在一些實施方案中，癌症包含FGFR2基因擴增。在一些實施方案中，FGFR2擴增包括＞3的FGFR2:CEN10(染色體10著絲粒)比。在一些實施方案中，包含FGFR2基因的癌症過表達FGFR2IIIb。在一些實施方案中，包含FGFR2過表達的癌症過表達FGFR2IIIb的程度高於FGFR2IIIc。在一些實施方案中，包含FGFR2擴增的癌症表達FGFR2IIIb的歸一化水平超過FGFR2IIIc表達的歸一化水平的2倍、3倍、5倍或10倍。在一些實施方案中，所述表達水平對GUSB歸一化。在一些實施方案中，癌症過表達FGFR2IIIb但不包含FGFR2基因擴增。在一些實施方案中，胃癌包含FGFR2基因擴增。在一些實施方案中，包含FGFR2基因擴增的胃癌過表達FGFR2IIIb。在一些實施方案中，包含FGFR2基因擴增的胃癌過表達FGFR2IIIb的程度大於FGFR2IIIc。在一些實施方案中，包含FGFR2基因擴增的胃癌表達FGFR2IIIb的歸一化水平是FGFR2IIIc表達的歸一化水平的超過2倍、3倍、5倍或10倍。在一些實施方案中，所述表達水平對GUSB歸一化。在一些實施方案中，胃癌過表達FGFR2IIIb但不包含FGFR2基因擴增。在一些實施方案中，過表達是mRNA過表達。在一些實施方案中，過表達是蛋白質過表達。

本文術語“EC50”是指半最大有效濃度，其包括在指定暴露時間之後誘導基線與最大值之間的半途響應的抗體濃度。EC50本質上代表其中觀察到其最大作用的50％的抗體濃度，可通過本領域已知方法測量。 實施例 實施例1 ：抗人FGFR2b 抗體和對照抗體的製備1.1 抗人FGFR2b單株抗體的製備

本公司內部自研獲得3個抗人FGFR2b單株抗體Ab-1、Ab-2和Ab-3，將編碼所述抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的核酸序列分別重組至帶有訊息肽及人源抗體IgG1重鏈恆定區(CH)和輕鏈恆定區(CL)序列的表達載體pTT5上，得到表達VH-CH和VL-CL的重組質體。表 1示出抗體的VH和VL序列、訊息肽序列和人源抗體IgG1的CH和CL序列，表 2示出CDR序列的Kabat分析結果。表1 抗FGFR2b 單株抗體可變區、訊息肽、恆定區序列

序列名稱	SEQ ID NO.	胺基酸序列
Ab-1 VH	1	EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYWMHWVRQAPGQRLEWMGAIYPGNSDTNYNQKFKGRVTITADASASTAYMELSSLRSEDTAVYYCIRPFAYWGQGTLVTVSS
Ab-1 VL	2	DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKASQSVGNNVAWYLQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSSPYTFGQGTKLEIK
Ab-2 VH	3	EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGYAFSSYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPENADTNYQGKFEGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANPYYGSAMDYWGQGTTVTVSS
Ab-2 VL	4	DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLYSSSQKNFLAWYLQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSNPITFGQGTKLEIK
Ab-3 VH	5	EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFPSYNMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPDNADSSYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGFDSWGQGTTVTVSS
Ab-3 VL	6	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVNNNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYITPYTFGGGTKVEIK
人IgG1 CH	7	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1 CL	8	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

表2 抗FGFR2b 單株抗體CDR 序列的Kabat 分析結果

序列名稱	CDR1	SEQ ID NO.	CDR2	SEQ ID NO.	CDR3	SEQ ID NO.
Ab-1 VH	SYWMH	9	AIYPGNSDTNYNQKFKG	10	PFAY	11
Ab-1 VL	KASQSVGNNVA	12	YASNRYT	13	QQYYSSPYT	14
Ab-2 VH	SYWMN	15	QIYPENADTNYQGKFEG	16	PYYGSAMDY	17
Ab-2 VL	KSSQSLLYSSSQKNFLA	18	WASTRES	19	QQYYSNPIT	20
Ab-3 VH	SYNMH	21	TIYPDNADSSYNQKFKG	22	GGFDS	23
Ab-3 VL	KASQDVNNNVA	24	SASYRYT	25	QQHYITPYT	26

將表達質體和轉染試劑PEI(購自Polysciences，貨號：24765-1)加入OPTI-MEM(購自Gibco，貨號：11058021)中混勻後靜置15分鐘，加入Expi293F細胞(購自Thermofisher，貨號：A14527)中，放入5% CO ₂，120 rpm，37℃ 搖床培養。轉染第二天，加入OPM-293 ProFeed(購自上海奧浦邁，貨號：F081918-001)和6g/L葡萄糖(購自Sigma-Aldrich，貨號: G8270-5KG)。轉染第六天，收集細胞培養上清。

用Protein A柱(購自Cytiva，貨號17549802)純化細胞培養上清液中的抗體。Protein A柱先用3-5倍柱體積的平衡緩衝液(PBS磷酸緩衝液，pH7.4)(購自生工，貨號B548117-0500)平衡，然後將澄清的培養上清液上樣到Protein A柱，控制流速在10 mL/分鐘。上樣完畢後用平衡緩衝液清洗Protein A柱，平衡緩衝液的體積為Protein A柱柱床體積的3-5倍。用洗脫液(50 mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脫結合在Protein A柱上的蛋白。收集洗脫的蛋白，加入Tris緩衝液(購自國藥，貨號30188336)至pH中性。樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(購自Cytiva，貨號28990946)進一步純化，去除聚集體，收集單體的峰，然後用0.22 μm的濾器(購自Millipore，貨號SLGVR13SL)進行無菌過濾，使用Nanodrop(購自Thermofisher)測定濃度，使用HPLC-SEC測定抗體純度，使用內毒素檢測試劑盒(購自安度斯)檢測抗體內毒素含量，檢測合格後分裝備用，於-80℃保存。 1.2 對照抗體的製備

安進抗FGFR2b的陽性對照抗體Bemarituzumab(FPA144)的抗體序列即專利US8603987B2中的HuGAL-FR21序列，根據該專利獲得序列如表 3所示，命名為FPA144-hIgG1。再生元抗FGFR2b的陽性對照抗體mAb1和mAb2的抗體序列來自專利WO2022087243A1，根據該專利獲得序列如表 3所示。同型對照抗體是與FGFR2不結合的、針對異硫氰酸螢光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)的抗體，序列如表 3所示，命名為Isotype。參考1.1中抗體的表達和純化方法，獲得對照抗體。表3 對照抗體的重輕鏈序列

序列名稱	SEQ ID NO.	胺基酸序列
FPA144-hIgG1重鏈	27	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYIFTTYNVHWVRQAPGQGLEWIGSIYPDNGDTSYNQNFKGRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDFAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FPA144-hIgG1輕鏈	28	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQGVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHSTTPYTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
mAb1重鏈	29	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREESSASGVDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
mAb1輕鏈	30	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSTRYLAWYQQKRGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQEYGSSSITFGQGTRLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
mAb2重鏈	31	QVQLVESGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQTPVKGLEWVTLIWYDGSNKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCAREGNWNYGHAFDIWGQGTMVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
mAb2輕鏈	32	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQNIGNWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYNCQQYNSYSPTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Isotype重鏈	33	EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Isotype輕鏈	34	DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

注：抗體可變區 + 恆定區(斜體部分)

利用表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)分析測定抗體與人FGFR2(β)b蛋白的親和力。使用Protein A晶片(購自Cytiva，貨號：29-127-558)捕獲抗體。樣品和運行緩衝液是 HBS-EP+ (10mM HEPES, 150mM NaC1, 3mM EDTA, 0.05% surfactant P20)(購自Cytiva，貨號：BR-1006-69)。流經池設置為25℃。樣品塊設置為16℃。兩者都用運行緩衝液預處理。在每一個循環中，首先用Protein A晶片捕獲待測抗體，然後注入單一濃度的人FGFR2(β)b-His抗原蛋白，記錄抗體和抗原蛋白的結合和解離過程，最後用 Glycine pH 1.5(Cytiva；BR-1003-54)完成晶片再生。通過注射溶液中不同濃度的人FGFR2(β)b-His蛋白持續 240秒來測量結合，其中流速為30 µL/分鐘，從200 nM起始，以1:1稀釋，總共5個濃度。監測解離相長達 600 秒，並通過從樣品溶液切換到運行緩衝液觸發。通過用 10mM 甘胺酸溶液(pH 1.5)以30 µL/分鐘的流速洗滌30秒，再生表面。通過減去參比通道獲得的響應值來校正本體折射率(Bulk refractive index)差異。也減去空白注射(=雙重參照)。為了計算表觀 KD 和其他動力學參數，使用 Langmuir 1:1模型。抗體與人FGFR2(β)b-His蛋白的結合速率(ka)、解離速率(kd)及結合親和力(KD)，結果如表 4所示，所有三株候選人源化抗體對靶抗原人FGFR2(β)b均具有很好的親和力。表4 抗體與人FGFR2b 蛋白的親和力

抗體名稱	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)	Measured Rmax (RU)
Ab-1	7.28E+04	1.30E-03	1.78E-08	111.9
Ab-2	2.12E+05	4.91E-04	2.31E-09	101.0
Ab-3	1.91E+05	2.24E-04	1.17E-09	104.7
FPA144-hIgG1	1.27E+05	2.78E-04	2.18E-09	106.5
mAb1	8.35E+04	8.24E-04	9.87E-09	97.1
mAb2	5.83E+04	9.50E-04	1.63E-08	89.7

實施例2 ：抗體- 藥物偶聯物的製備2.1 藥物-連接子化合物的製備/來源

藥物-連接子1的結構如下所示，其製備參考專利文獻WO2023217227A1(實施例39)。

藥物-連接子2的結構如下所示，其購自MedChemExpress(MCE)，貨號為HY-15575。 2.2 抗體和藥物-連接子的偶聯

將10倍摩爾當量的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)加入2-10mg/ml的抗體溶液(1× PBS，pH 7.4)中，將混合溶液於恆溫金屬搖床37℃混勻孵育2小時，再加入15倍摩爾當量的上述藥物-連接子1化合物，反應液在25℃混勻反應4小時。反應結束後，用10 mM NaAC-HAc pH 5.5緩衝液超濾換液3次，除去殘留未反應的游離小分子，得到抗體藥物偶聯物。

將2.0-2.5倍摩爾當量的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽加入2-10mg/ml的抗體溶液(1× PBS，pH 7.4)中，將混合溶液於恆溫金屬搖床37℃混勻孵育3小時，再加入15倍摩爾當量的上述藥物-連接子2化合物，反應液在25℃混勻反應16小時。反應結束後，用1×PBS緩衝液超濾換液3次，除去殘留未反應的游離小分子，得到抗體藥物偶聯物。 2.3 ADC的純度和DAR值檢測

SEC純度分析：應用SEC-HPLC法分析待測蛋白樣品，表徵重組蛋白的分子大小均一性，測定重組蛋白的純度。本法所用的HPLC為Agilent 1260，色譜柱為TSKgel G3000SWXL(購自Tosoh Bioscience)，流動相為200 mM磷酸緩衝液，pH 7.0/異丙醇(Merck，1.01040.4008)(v/v 9:1)，檢測溫度為25°C，流速為0.5 mL/min，檢測波長為280 nm，目標蛋白上樣量為50 μg，分析時間為40 min。

DAR值測定：應用超高效液相色譜-質譜(UHPLC-MS)聯用法測量ADC分子的DAR值。首先將待測ADC分子經過PNGase F(NEB #P0705L)處理，脫掉N糖修飾，再用二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT，Sigma #646563)處理，37°C孵育1 h，還原成輕重鏈，然後用Thermo Vanquish UHPLC-Q Exactive Plus 質譜系統進行分析，取2 µg蛋白注射到Waters ACQUITY Protein BEH分子排阻色譜柱，流動相為含0.1%甲酸、0.05%TFA、25%乙腈的水溶液，流速為0.2 mL/min，分析時間30 min，質譜儀為Thermo Q Exactive Plus，質譜主要參數分別為噴霧電壓3.8 kV，毛細管加熱溫度300 ℃，鞘氣流速35 arb，母離子掃描範圍800-3000等，最後應用質譜數據分析軟體Biopharma Finder 4.1，通過Respect算法去捲積處理，分別計算出輕重鏈質譜峰的分子量信息和各組分的質譜響應訊號，以此計算出待測ADC樣品的DAR值，如表 5所示。表5 抗體藥物偶聯物的製備、DAR 值及純度

偶聯物編號	偶聯反應受質	DAR	SEC純度(單體%)
抗體	藥物-連接子
ADC-1	FGFR2b-Ab-1	藥物-連接子1	7.6~8.0	大於90%
ADC-2	FGFR2b-Ab-2	藥物-連接子1
ADC-3	FGFR2b-Ab-3	藥物-連接子1
ADC-4	anti-FITC-hIgG1	藥物-連接子1
ADC-5	FGFR2b-Ab-1	藥物-連接子2	3.9~4.5	大於90%
ADC-6	FGFR2b-Ab-2	藥物-連接子2
ADC-7	FGFR2b-Ab-3	藥物-連接子2
ADC-8	anti-FITC-hIgG1	藥物-連接子2

實施例3 ：抗FGFR2b 抗體及FGFR2b-ADC 與腫瘤細胞的結合活性

將人FGFR2b高表達的KATOIII(購自南京科佰生物)、中高表達的SNU-16(購自南京科佰生物)、中低表達的OVCAR3(購自ATCC)、低表達的NUGC4(購自JCRB)腫瘤細胞系在T-175細胞培養瓶中擴大培養至90%匯合度。吸盡培養基，用PBS緩衝液洗滌1次，然後用Versene(購自Gibco，貨號：15040066)處理和收集細胞。進行細胞計數後，用PBS磷酸緩衝液(購自Hyclone，貨號：SH30256.01)洗滌細胞2次，並稀釋至2 × 10 ⁶個細胞每毫升，按每孔50 μL加入到 96孔FACS反應板中。在PBS磷酸緩衝液中加入1％(v/v)胎牛血清(購自Excell Bio，貨號：FSP500)作為流式細胞分析(FACS)緩衝液，1500 rpm 4℃離心洗滌2次。每孔加入100 μL稀釋後的抗體，4℃孵育1小時。用FACS緩衝液離心洗滌3次，每孔加入50 μL Alexa Fluor 647螢光標記的山羊抗人IgG(H+L)二抗(購自Jackson Immuno, 貨號：109-605-088)，4℃孵育1小時。用FACS緩衝液離心洗滌3次。用100 μL的FACS緩衝液懸浮細胞，用FACS(購自BD，型號：FACS CantoII)檢測。

檢測結果如表 6和圖1所示，ADC-1與腫瘤細胞系的結合活性較Ab-1減弱，ADC-2和ADC-3與腫瘤細胞的結合活性無顯著變化；ADC-5、ADC-6和ADC-7與腫瘤細胞的結合活性無顯著變化。表 6 抗 FGFR2b 抗體及 FGFR2b-ADC 與腫瘤細胞的結合活性

分子名稱	結合 MFI
KATOIII	SNU16	OVCAR3	NUGC-4
Emax	EC50 (nM)	Emax	EC50 (nM)	Emax	EC50 (nM)	Emax	EC50 (nM)
ADC-1	142130	11.30	12745	7.09	1801	3.43	742	11.97
ADC-5	121886	1.44	10551	0.96	1923	0.81	586	1.77
Ab-1	134184	0.86	16684	0.80	1969	0.34	688	1.03
ADC-2	137674	1.42	12646	1.75	1269	1.69	640	4.09
ADC-6	128214	1.81	11307	1.77	1174	1.66	546	4.31
Ab-2	134266	1.61	15604	2.34	1306	1.51	668	4.20
ADC-3	148653	1.23	13810	1.12	1409	1.22	711	2.24
ADC-7	125731	1.28	12016	0.98	1285	1.27	611	2.39
Ab-3	136721	1.00	16719	1.36	1398	0.94	744	2.60
FPA144-hIgG1	136991	0.87	15853	0.91	1373	0.80	737	1.64
ADC-4	141	不結合	93	不結合	108	不結合	86	不結合
ADC-8	457	不結合	756	不結合	147	不結合	104	不結合
Isotype	119	不結合	108	不結合	93	不結合	81	不結合

實施例4 ：抗FGFR2b 抗體的內吞效應

本實驗所用KATOIII細胞(購自南京科佰生物，貨號：CBP60483)培養基為RPMI 1640+10% FBS(分別購自Gibco，貨號：10491；Gibco，貨號：10091-148)。用流式緩衝液(購自Biolegend，貨號：420201)重懸KATOIII細胞，將細胞密度調整為2 × 10 ⁶個/mL。將每孔50 μL的細胞懸液加入到圓底96孔板(購自Corning，貨號：3799)中，使得每孔中細胞數為1×10 ⁵個。隨後加入50 μL梯度稀釋好的抗體(起始濃度100 nM，3倍稀釋)，4℃孵育1小時。1小時後，洗去未結合抗體，用流式緩衝液重懸細胞，對照組繼續放置於4℃，內吞組於37℃放置4小時。4小時後，PBS洗滌兩次後加入Alexa Fluor 647 螢光標記的山羊抗人IgG Fcγ二抗(購自Jackson Immuno，貨號：109-605-098)，4℃孵育1小時後，PBS洗滌兩次後，FACS檢測分析Alexa Fluor 647 螢光訊號(MFI)。採用GraphPad Prism 9.0軟體計算並製圖。定義添加同型陰性對照抗體的孔為陰性對照，內吞效率=(對照組MFI-內吞組MFI)/對照組MFI×100%。

結果如表 7所示，在本實驗中飽和濃度100 nM條件下陰性同型對照Isotype 在KATOIII細胞中沒有明顯內吞活性，3個抗FGFR2b抗體Ab-1、Ab-2、Ab-3在KATOIII細胞中均存在一定程度內吞活性(內吞率40%-43.5%)，且本發明的抗FGFR2b單株抗體內吞活性均優於對照抗體FPA144-hIgG1(內吞率為30.5%)。表7 抗FGFR2b 抗體在KATOIII 細胞中的內吞活性

抗體	內吞率 (%)
Ab-1	43.5
Ab-2	42.5
Ab-3	40
FPA144-hIgG1	30.5
Isotype	無內吞

實施例5 ：ADC 對腫瘤細胞的體外增殖抑制作用

本實驗所用KATOIII細胞(購自南京科佰生物，貨號：CBP60483)培養基為RPMI 1640+10% FBS，SNU16細胞(購自南京科佰生物，貨號：CBP60502)培養基為RPMI 1640+10% FBS，OVCAR3細胞(購自ATCC，貨號：HTB-161)培養基為1640+20%FBS +10 μg/mL insulin(購自Solarbio，貨號40112ES25)。

在本實驗中KATOIII為FGFR2b高表達細胞系，SNU16為FGFR2b中高表達細胞系，OVCAR3為FGFR2b中表達細胞系。將KATOIII、SNU16和OVCAR3細胞用Versene(購自Gibco，貨號：15040066)消化後，用各自對應培養基重懸，調整細胞密度。KATOIII、SNU16和OVCAR3細胞均按照5 × 10 ³個細胞/90 μL，接種於96孔板(購自Corning，貨號：3610)中，置於37℃ 5%CO ₂培養箱中培養過夜。第二天，按照實驗設計用完全培養基梯度稀釋抗體偶聯藥物，轉移10 μL稀釋後的ADC至對應孔板中。細胞板置於37℃ 5%CO ₂培養箱中培養5天。5天後，每孔中加入100 μL CellTiter-Glo檢測試劑(購自Promega，貨號：G9243，使用方法參照產品說明書)，在Envision 儀器(購自PerkinElmer，型號：Envision 2105)上讀取螢光值檢測細胞活力。

另設陽性對照組和陰性對照組作為殺傷0%和100%對照。陽性對照組為不加受試藥物，其他操作與實驗組一致結果，陰性對照組為不加細胞，僅加同體積的培養基，其他操作與實驗組一致。細胞殺傷率計算公式：細胞殺傷率=((陽性對照-樣品孔讀值)/(陽性對照-陰性孔讀值))×100％。採用GraphPad Prism 9.0軟體計算並製圖。

結果如表 8，圖2所示。荷載不同毒素的ADC藥物體外均對表達FGFR2b的腫瘤細胞具有良好的增殖抑制活性，且殺傷活性IC50與FGFR2b表達成正相關。表8 ADC 對腫瘤細胞增殖的抑制作用

ADC 名稱	KATOIII	SNU16	OVCAR3
IC50 (nM)	Emax (%)	IC50 (nM)	Emax (%)	IC50 (nM)	Emax (%)
ADC-5	0.028	72	0.057	96	4	94
ADC-6	0.021	72	0.066	97	10	98
ADC-7	0.021	70	0.054	96	7.2	100
ADC-8	＞22.22	31	＞66.67	35	29	92
ADC-1	未檢測	未檢測	2.2	84	15	56
ADC-2	未檢測	未檢測	0.27	80	2.6	61
ADC-3	未檢測	未檢測	0.13	79	2.1	61
ADC-4	未檢測	未檢測	無殺傷	無殺傷	94	65

實施例6 ：ADC 對 胃癌荷瘤小鼠的體內藥效

選擇FGFR2b陽性的人源胃癌細胞SNU-16-#232和KATO-III-#729進行小鼠 (CB17-SCID：雌性，6-8周，北京維通利華實驗動物技術有限公司)體內模型建立，並以此模型來評價候選分子在體內的抗腫瘤療效。 6.1 ADC抑制人源胃癌SNU-16-#232腫瘤生長

以人源胃癌細胞SNU-16-#232(自提原代細胞，購自南京科佰生物)接種時間為該實驗第0天，在實驗第0天，收集並接種擴增培養至所需數量且處於對數生長期(匯合度80%左右，接種前一天給細胞更換新鮮培養基)的人源胃癌細胞SNU-16-#232。首先將細胞懸液收集至50 mL離心管，300 g，7分鐘離心，吸取適量無血清RPMI1640培養基(購自Gibco，貨號：61870-036)重懸細胞，取500 μL細胞懸液於細胞計數儀(Beckman，SIC-TP-573)進行計數，最後根據細胞計數結果，使用無血清培養基調整細胞密度為200 × 10 ⁶個細胞/mL，置於冰上，通過傳遞窗傳遞至SPF動物房進行接種建模，接種前將上述細胞懸液與Matrigel基質膠(購自康寧生物，貨號：356237)等比例混合，於每隻小鼠右側腋窩皮下接種100 μL上述細胞混合液。

胃癌細胞SNU-16-#232接種之後，進行腫瘤生長監測，當整體瘤體積均值在100-150 mm ³左右，選擇瘤體積合適的小鼠進行隨機分組，每組6隻小鼠，每組根據方案進行相應藥物尾靜脈給藥並測量腫瘤體積以及小鼠體重變化，具體給藥方案如表 9所示，其中PBS為陰性對照組，ADC-4和ADC-8為同型對照，ADC-2、ADC-3、ADC-5、ADC-6和ADC-7為ADC候選分子，ADC候選分子選擇與同型對照相同的單位體重給藥質量。具有美登素類結構的分子製備抗體-藥物偶聯物時通常比具有喜樹鹼類結構的分子毒性更強，在臨床上用藥時美登素類ADC的劑量比喜樹鹼類ADC更低。因此在設計實驗時，具有藥物-連接子2結構(參見實施例2)的分子劑量較具有藥物-連接子1結構的ADC劑量更低。

抑瘤率計算公式如下：抑瘤率(%) = [1-(Vt(治療組)-V0(治療組))/(Vt(同型對照組)-V0(同型對照組))]×100 %，其中V0是分組時平均腫瘤體積，Vt為治療後某一次測量時的平均腫瘤體積。

結果如表 10，圖3所示，給藥後第44天，各組均表現較好藥效，並且在給藥周期內小鼠體重無明顯異常變化，ADC-8較ADC-4表現出更強非特異性殺傷，因此具有藥物-連接子2結構的分子起效窗相對更小。表9 ADC 在人源胃癌SNU-16-#232 荷瘤小鼠體內藥效給藥方案

分組	藥物	給藥劑量 (mg/kg, mpk)	給藥方式及頻率
組1	ADC-2	5.0	尾靜脈給藥，單次給藥
組2	ADC-3	5.0
組3	ADC-2	10.0
組4	ADC-3	10.0
組5	ADC-4	10.0
組6	ADC-6	1.7
組7	ADC-7	1.7
組8	ADC-5	5.0
組9	ADC-6	5.0
組10	ADC-7	5.0
組11	ADC-8	5.0
組12	PBS	-

表10 ADC 在人源胃癌SNU-16-#232 荷瘤小鼠體內藥效結果

組別	藥物	給藥劑量 (mpk)	治療後第 44 天
體重變化率 (%)	瘤體積 (mm ³)	抑瘤率 (%)	顯著性	P 值	完全緩解數
組1	ADC-2	5	12.66	53.87	106.80	****	＜0.0001	0/6
組2	ADC-3	14.87	83.05	103.74	****	＜0.0001	0/6
組3	ADC-2	10	15.56	20.64	110.99	****	＜0.0001	1/6
組4	ADC-3	11.82	16.97	111.36	****	＜0.0001	2/6
組5	ADC-4	12.36	941.00	25.31 (vs.組12)	vs.組12***	0.0009	0/6
組6	ADC-6	1.7	10.59	131.72	93.92	****	＜0.0001	0/6
組7	ADC-7	14.85	122.55	96.31	****	＜0.0001	0/6
組8	ADC-5	5	13.33	71.85	112.25	****	＜0.0001	0/6
組9	ADC-6	13.21	99.30	104.23	****	＜0.0001	0/6
組10	ADC-7	11.40	90.51	106.10	****	＜0.0001	0/6
組11	ADC-8	15.11	440.45	70.38 (vs.組12)	vs.組12****	＜0.0001	0/6
組12	PBS	-	15.48	1222.73	N/A	N/A	N/A	0/6

6.2 ADC抑制人源胃癌KATOIII-#729腫瘤生長

以人源胃癌細胞KATOIII-#729(自提原代細胞，購自南京科佰生物)接種時間為該實驗第0天，在實驗第0天，收集並接種擴增培養至所需數量且處於對數生長期(匯合度80%左右，接種前一天給細胞更換新鮮培養基)的人源胃癌細胞KATOIII-#729。首先，去除細胞培養瓶中的培養基，使用磷酸鹽緩衝液(PBS, 購自Hyclone，貨號：SH30256.01)洗滌2次，隨後加入適量0.25 %胰酶消化液(購自Gibco，貨號：25200-072)，輕柔搖晃瓶底，確保胰酶消化液均勻覆蓋於細胞表面，並將其置於37℃環境，消化5分鐘，然後加入含10 % 胎牛血清(Fetal Bovine serum, FBS, 購自Gibco，貨號：10091-148/2418958P)的完全培養基終止消化反應，並將黏附在瓶底的細胞輕柔吹離培養瓶，消化好的細胞懸液收集至50 mL離心管，350 g，5分鐘離心，吸取適量無血清RPMI1640培養基重懸細胞，並經70 μm篩網過濾，取500 μL細胞懸液於細胞計數儀進行計數，最後根據細胞計數結果，使用無血清培養基調整細胞密度為100 × 10 ⁶個細胞/mL，置於冰上，通過傳遞窗傳遞至SPF動物房進行接種建模，接種前將上述細胞懸液與Matrigel基質膠等比例混合，於每隻小鼠右側腋窩皮下接種200 μL上述細胞混合液。

胃癌細胞KATOIII-#729接種之後，進行腫瘤生長監測，當整體瘤體積均值在200 mm ³左右，選擇瘤體積合適的小鼠進行隨機分組，每組6隻小鼠，每組根據方案進行相應藥物尾靜脈給藥並測量腫瘤體積以及小鼠體重變化，具體給藥方案如表 11所示，其中PBS為陰性對照組，ADC-4和ADC-8為不同的同型對照。

結果如表 12，圖4所示，各候選分子均表現較好藥效，分子間無顯著差異，ADC-8較ADC-4表現出更強非特異性殺傷，因此具有藥物-連接子2結構的分子起效窗相對更小。 表11 ADC 在人源胃癌KATOIII-#729 荷瘤小鼠體內藥效給藥方案

分組	藥物	給藥劑量 (mpk)	給藥方式及頻率
組1	PBS	-	尾靜脈給藥，單次給藥
組2	ADC-2	3
組3	ADC-3	3
組4	ADC-2	10
組5	ADC-3	10
組6	ADC-4	10
組7	ADC-5	1
組8	ADC-6	1
組9	ADC-7	1
組10	ADC-5	3
組11	ADC-6	3
組12	ADC-7	3
組13	ADC-8	3

表12 ADC 在人源胃癌KATOIII-#729 荷瘤小鼠體內藥效結果

組別	藥物	給藥劑量 (mpk)	治療後第 31 天
體重變化率 (%)	瘤體積 (mm ³)	抑瘤率 (%)	顯著性	P 值	完全緩解數
組1	PBS	-	7.29	421.97	N/A	N/A	N/A	0/6
組2	ADC-2	3	9.07	50.59	169.21	****	＜0.0001	0/6
組3	ADC-3	9.84	43.04	172.09	****	＜0.0001	1/6
組4	ADC-2	10	8.82	18.25	186.82	****	＜0.0001	2/6
組5	ADC-3	8.64	22.11	185.74	****	＜0.0001	2/6
組6	ADC-4	9.18	359.00	23.91 (vs. 組1)	vs.組1****	＜0.0001	0/6
組7	ADC-5	1	9.65	68.07	296.13	****	＜0.0001	0/6
組8	ADC-6	9.84	56.33	322.99	****	＜0.0001	0/6
組9	ADC-7	7.26	79.13	283.92	****	＜0.0001	0/6
組10	ADC-5	3	12.73	12.09	402.21	****	＜0.0001	4/6
組11	ADC-6	10.61	10.71	408.07	****	＜0.0001	4/6
組12	ADC-7	8.79	9.57	405.52	****	＜0.0001	4/6
組13	ADC-8	12.38	235.24	77.29 (vs.組1)	vs.組1****	＜0.0001	0/6

實施例7 ： FGFR2b-ADC 藥效驗證7.1 對照FGFR2b-ADC的製備

陽性對照FGFR2b ADC的製備方法參考專利WO2022087243A1和WO2022015656A1。

將mAb1和mAb2的IgG進行N297Q突變，以實現定點偶聯，突變後的mAb1和mAb2的抗體重鏈序列如表 13所示。參考實施例1的1.1部分中抗體的表達和純化方法，獲得抗體mAb1(N297Q)和mAb2(N297Q)。 表13 對照抗FGFR2b 抗體IgG N297Q 突變後序列

序列名稱	SEQ ID NO.	胺基酸序列
mAb1(N297Q)重鏈	35	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREESSASGVDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
mAb1輕鏈	30	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSTRYLAWYQQKRGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQEYGSSSITFGQGTRLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
mAb2(N297Q)重鏈	36	QVQLVESGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQTPVKGLEWVTLIWYDGSNKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCAREGNWNYGHAFDIWGQGTMVTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
mAb2輕鏈	32	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQNIGNWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYNCQQYNSYSPTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

注：抗體可變區 + 恆定區(斜體部分)

胺基-疊氮接頭AL1 (CAS:134179-38-7) 結構如下所示，其購自MCE，貨號為HY-W021401。

支鏈接頭BL7 (CAS: 2253947-15-6) 的結構如下所示，其製備參考專利文獻WO2018218004A1。

藥物-連接子3結構 (CAS No. : 2699066-62-9) 如下所示，其購自MCE，貨號為HY-157407。

使用PBS將轉麩胺醯胺酶(購自MCE，貨號：HY-P2962)溶解至10 mg/mL，使用PBS將純化後的抗體樣品稀釋濃度至2 mg/mL，將溶解後的酶與抗體以10 : 1的比例混合後，加入150倍摩爾當量的接頭AL1或BL7，混合後37℃靜置過夜。隨後使用Protein A柱去除過量的酶與連接子，樣品使用MS檢測，DAR4與DAR8分別增加了804 Da與1232 Da。

使用“點擊”化學法將藥物-連接子3偶聯至已連接抗體的接頭上。將連接了AL1或BL7的抗體(1× PBS，pH 7.4)與大於等於10摩爾當量的溶於DMSO的10 mg/mL藥物-連接子3混合，反應溶液中含有5%-15%(V/V)有機溶劑，室溫反應過夜。反應過後使用陽離子交換去除過量的游離小分子，隨後使用透析卡將樣品透析至保存緩衝液中。

參考實施例2.3中ADC的純度和DAR值檢測方法，得到ADC樣品的SEC純度和DAR值，如表 14所示。 表14 抗體藥物偶聯物的製備、DAR 值及純度

偶聯物編號	偶聯反應受質	DAR	SEC純度 (單體%)
抗體	接頭	藥物-連接子
ADC-9	mAb1(297Q)	BL7	藥物-連接子3	7.6~8.0	大於90%
ADC-10	mAb2(297Q)	BL7	藥物-連接子3
ADC-11	mAb1(297Q)	AL1	藥物-連接子3	3.9~4.5	大於90%
ADC-12	mAb2(297Q)	AL1	藥物-連接子3

7.2 抗FGFR2b 抗體及FGFR2b-ADC 與腫瘤細胞的結合活性

參考實施例3的方法檢測抗FGFR2b抗體及FGFR2b-ADC與腫瘤細胞的結合活性。結果如表 15，圖 5所示，本公開抗FGFR2b抗體及FGFR2b-ADC與腫瘤細胞的結合活性均強於對照抗FGFR2b抗體及FGFR2b-ADC。 表15 抗FGFR2b 抗體及FGFR2b-ADC 與腫瘤細胞的結合活性

分子名稱	結合 MFI
KATOIII	SNU16	NUGC4
Emax	EC50 (nM)	Emax	EC50 (nM)	Emax	EC50 (nM)
ADC-2	69192	1.10	17234	1.90	372	2.80
ADC-6	65342	1.41	16133	2.19	340	3.16
Ab-2	76228	1.24	19552	1.71	380	2.43
ADC-3	77210	1.12	19571	1.59	418	2.01
ADC-7	68278	1.03	18002	1.36	382	1.58
Ab-3	85830	1.39	21455	1.81	439	2.33
ADC-9	48424	1.47	10360	2.42	146	不結合
ADC-11	51107	1.68	10577	2.47	147	不結合
mAb1(N297Q)	52201	2.12	11171	3.26	161	不結合
ADC-10	45686	1.47	9266	2.52	141	不結合
ADC-12	48948	1.68	9484	2.79	138	不結合
mAb2(N297Q)	48702	2.08	9881	3.25	127	不結合
ADC-4	217	不結合	176	不結合	122	不結合
ADC-8	2767	不結合	1657	不結合	141	不結合
Isotype	233	不結合	120	不結合	118	不結合

7.3 FGFR2b-ADC對腫瘤細胞的體外增殖抑制作用

參考實施例5的方法檢測FGFR2b-ADC對腫瘤細胞的體外增殖抑制活性。結果如表 16，圖 6所示，本公開FGFR2b-ADC對腫瘤細胞的體外增殖抑制活性均強於對照FGFR2b-ADC。 表16 ADC 對腫瘤細胞增殖的抑制作用

ADC 名稱	SNU16
IC50 (nM)	Emax (%)
ADC-2	0.26	91.0
ADC-3	0.24	89.9
ADC-4	＞30	12.8
ADC-6	0.057	97.8
ADC-7	0.060	97.3
ADC-8	25.52	72.1
ADC-9	1.11	84.1
ADC-10	0.92	87.4
ADC-11	3.50	65.1
ADC-12	3.11	76.2

(無)

圖1. 抗體及ADC與腫瘤細胞的結合活性；圖2. ADC對腫瘤細胞的體外增殖抑制作用；圖3. ADC調控SNU-16-#232腫瘤生長及荷瘤小鼠體重變化曲線；圖4. ADC調控KATOIII-#729腫瘤生長及荷瘤小鼠體重變化曲線；圖5. 與對照抗體及ADC與腫瘤細胞的結合活性比較；圖6. 與對照ADC對腫瘤細胞的體外增殖抑制作用比較。

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(無)

Claims

一種抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其結構通式為Pc-(L-D) _n，其中， D為細胞毒性藥物； L為連接子單元； Pc為特異性結合FGFR2b的抗體或其抗原結合片段；和 n為1~16的實數；其中，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)或/和輕鏈可變區(VL)，所述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，或/和所述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1-3或/和所述LCDR1-3選自以下組合： (1) 所述HCDR1-3為SEQ ID NO.9-11所示序列；或/和所述LCDR1-3為SEQ ID NO.12-14所示序列； (2) 所述HCDR1-3為SEQ ID NO.15-17所示序列；或/和所述LCDR1-3為SEQ ID NO.18-20所示序列； (3) 所述HCDR1-3為SEQ ID NO.21-23所示序列；或/和所述LCDR1-3為SEQ ID NO.24-26所示序列；或， (4) 所述HCDR1-3或/和所述LCDR1-3為與第(1)-(3)組中任一組所述HCDR1-3和LCDR1-3中的任一CDR相比，具有至少80%同一性的序列，或至多發生3個插入、缺失或替換突變的序列；優選地，所述至少80%同一性為85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。
如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)或/和輕鏈可變區(VL)，所述重鏈可變區或/和輕鏈可變區選自以下： (1) 所述重鏈可變區為SEQ ID NO.1所示序列，或/和所述輕鏈可變區為SEQ ID NO.2所示序列； (2) 所述重鏈可變區為SEQ ID NO.3所示序列，或/和所述輕鏈可變區為SEQ ID NO.4所示序列； (3) 所述重鏈可變區為SEQ ID NO.5所示序列，或/和所述輕鏈可變區為SEQ ID NO.6所示序列；或， (4) 所述重鏈可變區或/和所述輕鏈可變區為與第(1)-(3)組中任一組所述重鏈可變區或/和輕鏈可變區相比，具有至少80%同一性的序列，或至多發生3個插入、缺失或替換突變的序列；優選地，所述至少80%同一性為85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的同一性。
如請求項2所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述抗體或其抗原結合片段包括重鏈恆定區序列和/或輕鏈恆定區序列；可選的，所述重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區選自完整的恆定區序列或其片段，所述恆定區片段包括CH1、鉸鏈區、CH2、CH3或Fc；可選的，所述重鏈恆定區選自人或鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區，所述輕鏈恆定區選自人或鼠κ恆定區或λ恆定區；可選的，所述抗體或其抗原結合片段包括完整的重鏈和輕鏈，所述重鏈由所述VH和重鏈恆定區組成，所述重鏈恆定區具有如SEQ ID NO.7所示序列，所述輕鏈由所述VL和輕鏈恆定區組成，所述輕鏈恆定區具有如SEQ ID NO.8所示序列。
如請求項1至3任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述抗體或其抗原結合片段為：(1) 嵌合抗體或其片段；(2)人源化抗體或其片段；和/或，(3) 全人源抗體或其片段；優選地，所述抗體或其抗原結合片段選自單株抗體、多株抗體、天然抗體、工程化抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體、全長抗體、抗體片段、裸抗體、綴合抗體、人源化抗體、全人源抗體、Fab、Fab’、F(ab’) ₂、Fd、Fv、scFv、雙抗體(diabody)或單域抗體。
如請求項4所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述抗原結合片段選自F(ab) ₂、Fab’、Fab、Fv片段、scFv、奈米抗體或affibody中的一種或多種。
如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述細胞毒性藥物選自微管蛋白抑制劑、DNA損傷劑或拓撲異構酶抑制劑；所述微管蛋白抑制劑包括但不限於海兔毒素(dolastatin)類、澳瑞他汀(auristatin)類、美登素(maytansine)類、微管溶素(Tubulysins)類和隱黏菌素(cryptomycins)類藥物，所述DNA損傷劑包括但不限於PBD類藥物，所述拓撲異構酶抑制劑包括但不限於喜樹鹼類藥物。
如請求項6所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述細胞毒性藥物選自拓撲異構酶I抑制劑或澳瑞他汀類藥物。
如請求項7所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述細胞毒性藥物選自式（D-I）所示化合物， (D-I) 其中， R ¹、R ²與其連接的原子共同形成5-6員雜環基，所述5-6員雜環基含有1或2個氧原子作為環原子，所述5-6員雜環基任選被一個或多個D原子取代； R ⁴選自H或C ₁-C ₃烷基； R ⁵選自H、鹵素、CN、＝O、OH、NH ₂或C ₁-C ₃烷基； R ⁶選自H或C ₁-C ₃烷基； R ⁷選自H、C ₁-C ₃烷基或者C ₃-C ₆環烷基，所述C ₁-C ₃烷基或C ₃-C ₆環烷基任選被D、鹵素、CN、＝O、OH、NH ₂或C ₁-C ₃烷基取代。
如請求項8所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述R ¹、R ²與它們連接的原子共同形成或。
如請求項8所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，R ⁴選自H。
如請求項8所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，R ⁵選自H。
如請求項8所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，R ⁶選自H。
如請求項8所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，R ⁷選自環丙基。
如請求項8至13任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，式(D-I)所示化合物選自或。
如請求項7至14任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述細胞毒性藥物選自、或。
如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，所述連接子單元選自，其中，m1選自整數2~8，L ¹選自由1至8個胺基酸構成的肽殘基，所述肽殘基進一步任選被鹵素、CN、＝O、C ₁-C ₆烷基、OH、O(C ₁-C ₆烷基)、NH ₂、NH(C ₁-C ₆烷基)、N(C ₁-C ₆烷基) ₂、C ₃-C ₆環烷基和4-7員雜環基中的一個或多個取代基取代，L ²選自或，所述連接子單元的a端與所述抗體或其抗原結合片段共價連接，b端與細胞毒性藥物共價連接。
如請求項16所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述L ¹選自Val-Cit或Gly-Gly-Phe-Gly所示的肽殘基。
如請求項16所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，m1為5。
如請求項16至18任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述連接子單元為或，其a端與所述抗體或其抗原結合片段共價連接，b端與細胞毒性藥物共價連接。
如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，n選自1~16的實數，例如n選自2~12的實數，例如n選自4~10的實數，例如n選自3~9的實數，例如n選自4~8的實數，例如n選自6~8的實數，例如n選自3~5的實數。
如請求項20所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，n選自3~9的實數，例如n為3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。
如請求項20所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，n選自6~8的實數，例如n為6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。
如請求項20所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，n選自3~5的實數，例如n為3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
如請求項1至23任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽選自以下化合物或其藥學上可接受的鹽：、或，其中，Pc包含請求項1至5任一項中所述的抗體或其抗原結合片段，和n包含請求項20至23任一項中所述的實數。
一種或多種分離的核酸分子，所述核酸分子可以是任意長度的分離形式的核苷酸、脫氧核苷酸和/或核糖核苷酸，所述核酸分子編碼請求項1至25任一項中所述的抗體或其抗原結合片段。
一種包含請求項25所述的核酸分子的表達載體。
一種分離的宿主細胞，其中，包含請求項25所述的核酸分子，或請求項26所述的表達載體；優選地，所述宿主細胞是真核細胞或原核細胞；更優選地，所述宿主細胞來源於哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、大腸桿菌和/或枯草桿菌；更優選地，所述宿主細胞選自Expi293或CHO細胞。
一種藥物組合物，其包含請求項1至24任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的輔料；優選地，所述藥物組合物中還包含其它治療劑，或化療藥物；優選地，所述其它治療劑包含PD-1/PD-L1抑制劑。
一種治療哺乳動物腫瘤的方法，其中，包括對需要該治療的哺乳動物，優選人類，給予治療有效量的請求項1至24任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或請求項28所述的藥物組合；優選地，所述方法還包含使用額外的治療劑，例如其它抗體，典型的包含PD-1/PD-L1抑制劑，或例如化療藥物；優選地，所述腫瘤是表達FGFR2b的腫瘤；更優選地，所述腫瘤選自由下列組成的組：胃癌、非小細胞肺癌鱗癌、三陰乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、胰腺癌、肝內膽管癌、結直腸癌。
一種如請求項1至24任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或請求項28所述的藥物組合物在製備治療腫瘤的藥物中的用途；優選地，所述藥物組合物中還包含其它治療劑，例如其它抗體，典型的包含PD-1/PD-L1抑制劑，或例如化療藥物；優選地，所述腫瘤是表達FGFR2b的腫瘤；更優選地，所述腫瘤選自由下列組成的組：胃癌、非小細胞肺癌鱗癌、三陰乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、胰腺癌、肝內膽管癌、結直腸癌。
一種如請求項1至24任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或請求項28所述的藥物組合物在治療腫瘤中的用途；優選地，所述藥物組合物中還包含其它治療劑，例如其它抗體，典型的包含PD-1/PD-L1抑制劑，或例如化療藥物；優選地，所述腫瘤是表達FGFR2b的腫瘤；更優選地，所述腫瘤選自由下列組成的組：胃癌、非小細胞肺癌鱗癌、三陰乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、胰腺癌、肝內膽管癌、結直腸癌。
一種治療腫瘤的請求項1至24任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或請求項28所述的藥物組合物；優選地，所述藥物組合物中還包含其它治療劑，例如其它抗體，典型的包含PD-1/PD-L1抑制劑，或例如化療藥物；優選地，所述腫瘤是表達FGFR2b的腫瘤；更優選地，所述腫瘤選自由下列組成的組：胃癌、非小細胞肺癌鱗癌、三陰乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、胰腺癌、肝內膽管癌、結直腸癌。