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TW202527906A - 包含經結合之肺炎鏈球菌莢膜醣抗原之佐劑化致免疫性組成物及其用途 - Google Patents

包含經結合之肺炎鏈球菌莢膜醣抗原之佐劑化致免疫性組成物及其用途

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TW202527906A
TW202527906A TW113134398A TW113134398A TW202527906A TW 202527906 A TW202527906 A TW 202527906A TW 113134398 A TW113134398 A TW 113134398A TW 113134398 A TW113134398 A TW 113134398A TW 202527906 A TW202527906 A TW 202527906A
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TW
Taiwan
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serotype
polysaccharide
kda
carrier protein
molecular weight
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Application number
TW113134398A
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艾薩斯 康涅斯基
納文 蘇倫登
Original Assignee
美商輝瑞股份有限公司
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Publication date
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Abstract

本發明關於新穎佐劑化致免疫性組成物，其包含經結合之肺炎鏈球菌莢膜醣抗原(醣結合物)及含皂素之脂質體佐劑。本發明之致免疫性組成物通常包含醣結合物，其中該醣係衍生自肺炎鏈球菌的血清型。本發明亦關於使用該新穎致免疫性組成物的人類個體(特別為嬰兒和老年人)之疫苗接種以對抗肺炎鏈球菌感染。

Description

包含經結合之肺炎鏈球菌莢膜醣抗原之佐劑化致免疫性組成物及其用途
本發明關於新穎佐劑化致免疫性組成物，其包含經結合之肺炎鏈球菌莢膜醣抗原(醣結合物)及含皂素之脂質體佐劑。本發明之致免疫性組成物通常包含醣結合物，其中該醣係衍生自肺炎鏈球菌的血清型。本發明亦關於使用該新穎致免疫性組成物的人類個體(特別為嬰兒和老年人)之疫苗接種以對抗肺炎鏈球菌感染。
由肺炎鏈球菌引起之感染為全世界發病率及死亡率的主要原因。肺炎、發熱性菌血症(febrile bacteraemia)及腦膜炎為侵襲性肺炎鏈球菌感染症的最常見表現，而細菌在呼吸道內擴散可導致中耳感染、鼻竇炎或復發性支氣管炎。與侵襲性感染症相比，非侵襲性表現通常不太嚴重，但明顯更常見。
在歐洲及美國，肺炎鏈球菌肺炎為最常見的社區型細菌性肺炎，估計每年每10萬名成年人中有約100人受影響。發熱性菌血症及腦膜炎的對應數值分別為每10萬人中有15至19人及每10萬人中有1至2人。該等表現中之一或多者的風險在嬰兒及老年人以及任何年齡之免疫功能不全的人中更高得多。即使在經濟發達地區，侵襲性肺炎鏈球菌感染症亦帶來高死亡率；對患有肺炎鏈球菌肺炎的成人之死亡率平均為10%至20%，而其在高風險群中可能超過50%。肺炎迄今為全世界肺炎鏈球菌死亡的最常見原因。
肺炎鏈球菌感染症之致病因子(即肺炎鏈球菌(肺炎球菌))為由多醣莢膜包圍之革蘭氏陽性(Gram-positive)囊封之球菌。此莢膜之組成差異允許約91種莢膜類型之間的血清學區分，其中一些時常與肺炎鏈球菌感染症相關，其他則幾乎不相關。侵襲性肺炎鏈球菌感染包括肺炎、腦膜炎和發熱性菌血症；其中常見的非侵襲性表現包括中耳炎、鼻竇炎和支氣管炎。
肺炎鏈球菌結合型疫苗(PCV)為用於保護免受肺炎鏈球菌(肺炎球菌)引起的疾病之肺炎鏈球菌疫苗。當前全球市場上可取得五種PCV疫苗：Prevnar ®(在一些國家稱為Prevenar)(七價疫苗)、SYNFLORIX ®(十價疫苗)、Prevnar 13 ®(十三價疫苗)、Vaxneuvance TM(15價疫苗)及Prevnar 20 TM(20價疫苗)。
近期對基本抗生素具抗性的微生物擴散發展情況及免疫功能不全的人數增加，突顯對具有甚至更廣泛的保護作用之肺炎鏈球菌疫苗的需求。
特定言之，由於未見於Prevnar 13 ®的血清型及隨時間之血清型置換的可能性，因此對解決仍未滿足之涵蓋肺炎鏈球菌感染症的醫療要求有需求。超出Prevnar 13 ®的13種血清型的致病特異性血清型，係隨區域、族群而改變，且可能由於抗生素抗性的獲得、肺炎鏈球菌疫苗的引入及未知來源的長期趨勢而隨時間變化。對可用於人體及特別用於不滿2歲的兒童中誘發對抗額外的肺炎鏈球菌血清型的免疫反應之致免疫性組成物有需求。
本發明之新穎致免疫性組成物的目的為提供對抗未於Prevnar 20 TM中發現之額外的肺炎鏈球菌血清型之適當保護。在一個態樣中，本發明之致免疫性組成物的目的為提供對抗未於Vaxneuvance TM及/或Prevnar 20 TM中發現之額外的肺炎鏈球菌血清型之適當保護，同時維持對抗當前以該疫苗涵蓋之血清型的免疫反應。
1. 本發明之肺炎鏈球菌醣結合物 本發明部分關於經結合之肺炎鏈球菌莢膜醣抗原(亦稱為醣結合物)。出於本發明之目的，術語「醣結合物(glycoconjugate)」指示經由共價或非共價鍵與載體蛋白質結合之肺炎鏈球菌莢膜醣。在一實施態樣中，肺炎鏈球菌莢膜醣係經由非共價鍵與載體蛋白質結合(諸如根瘤菌抗生物素蛋白(rhizavidin)/生物素系統，參見例如WO2012155007、WO2020056202)。莢膜醣較佳地經由共價鍵結合。在一個實施態樣中，莢膜醣係與載體蛋白質直接結合。在第二實施態樣中，莢膜醣係通過間隔子/連接子與載體蛋白質結合。 1.1 本發明之肺炎鏈球菌莢膜醣
在此整篇說明書中，術語「醣」可指示多醣或寡醣且包括該兩者。在一實施態樣中，本發明之醣可為寡醣。寡醣具有少數的重複單元(通常為5至15個重複單元)且通常經合成或藉由多醣水解而衍生。然而，本發明及在本發明之致免疫性組成物中的所有醣較佳為多醣。由於抗原表面上存在的表位，使高分子量多醣能夠誘發特定的抗體免疫反應。較佳地考慮單離及純化之高分子量莢膜多醣用於本發明之結合物、組成物及方法中。因此，在本發明之較佳的實施態樣中，醣為多醣。
在本發明中所使用之醣較佳為肺炎鏈球菌莢膜醣(在本文亦稱為「肺炎鏈球菌莢膜醣( S. pneumoniaecapsular saccharide)」或「莢膜醣」)。莢膜係見於幾種醫學重要性的細菌。細菌莢膜主要由多醣所組成。莢膜醣係藉由熟習本技術領域的普通技能者已知的標準技術來製備。
在一實施態樣中，在本發明中所使用之肺炎鏈球菌莢膜醣為合成的碳水化合物。
然而，在較佳的實施態樣中，根據本發明之肺炎鏈球菌莢膜醣的來源可為肺炎鏈球菌細胞。可用作為莢膜醣來源之肺炎鏈球菌株可自建立的培養物收集中心(諸如例如自美國菌種保存中心(ATCC，Manassas, VA USA)或鏈球菌參考實驗室(疾病管制與預防中心，Atlanta, GA USA))或臨床樣本獲得。
肺炎鏈球菌莢膜醣可使用熟習本技術領域的普通技能者已知的單離程序自細菌直接獲得(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381、US2007/0184071、US2007/0184072、US2007/0231340和US2008/0102498及WO2008/118752中所揭示之方法)。肺炎鏈球菌莢膜醣亦可使用熟習本技術領域者已知的合成方案生產。
若肺炎鏈球菌莢膜醣係自細菌直接獲得，則細菌細胞可在培養基中(例如在基於大豆之培養基中)生長。在發酵之後，可將細菌細胞溶解以生產細胞溶解物。接著可將莢膜醣使用本技術中已知的純化技術自細胞溶解物單離，包括使用離心、深層過濾、沉澱、超濾、以活性碳處理、透濾及/或管柱層析術(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381及WO2008/118752)。接著經純化之莢膜醣可用於製備致免疫性結合物。
以純化所獲得的經單離之莢膜醣可以不同的參數特徵化，包括例如重量平均分子量(Mw)。多醣的分子量可藉由尺寸排阻層析術(SEC)與多角度雷射光散射檢測器(MALLS)組合來測量。
在本發明中所使用之莢膜醣為來自肺炎鏈球菌之莢膜醣。
在本發明中所使用之莢膜醣較佳為來自選自下列的肺炎鏈球菌血清型之莢膜醣：血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、6D、6E、6F、6G、6H、7A、7B、7C、7F、8、9A、9L、9V、9N、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、11D、11E、11F、12A、12B、12F、13、14、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、18B、18C、18F、19A、19B、19C、19F、20A、20B、21、22A、22F、23A、23B、23F、24A、24B、24F、25A、25F、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33E、33F、34、35A、35B、35C、35F、36、37、38、39、40、41A、41F、42、43、44、45、46、47A、47F和48。
在本發明中所使用之莢膜醣較佳為來自選自下列的肺炎鏈球菌血清型之莢膜醣：血清型1、2、3、4、5、6A、6B、6C、7C、7F、8、9V、9N、10A、10B、11A、12F、14、15A、15B、15C、16F、17F、18C、19A、19F、20A、20B、21、22A、22F、23A、23B、23F、24B、24F、27、29、31、33B、33F、34、35B、35F、38、72和73。
肺炎鏈球菌莢膜多醣包含重複的寡醣單元，該單元可含有至多8個糖殘基。
在一實施態樣中，本發明之莢膜醣可為一個寡醣單元，或比重複寡醣單元之天然長度醣鏈短。在一實施態樣中，本發明之莢膜醣為相關血清型之一個重複寡醣單元。
在一實施態樣中，本發明之莢膜醣可為寡醣。寡醣具有少數的重複單元(通常為5至15個重複單元)且通常經合成或藉由多醣水解而衍生。
在較佳的實施態樣中，本發明之莢膜醣為多醣。由於抗原表面上存在的表位，使高分子量莢膜多醣能夠誘發特定的抗體免疫反應。較佳地考慮單離及純化之高分子量莢膜多醣用於本發明之結合物、組成物及方法中。
在較佳的實施態樣中，在本發明中所使用的經單離之莢膜醣(在進一步處理之前已純化)具有介於50 kDa與5000 kDa之間的重量平均分子量。在較佳的實施態樣中，在本發明中所使用之莢膜醣具有介於200 kDa與4000 kDa之間的重量平均分子量。
考慮在上述範圍中之任一者內的任何整數作為本揭示之一實施態樣。 1.2 本發明之肺炎鏈球菌醣結合物的屬性
一般而言，醣與載體之結合增強醣的致免疫性，因為其使醣自T非依賴性抗原轉化成T依賴性抗原，因此容許啟動免疫記憶。結合對兒科疫苗特別有用。
可將上述經單離之莢膜醣活化(例如經化學活化)，使其能夠反應(例如與連接子或直接與載體蛋白質反應)且接著併入醣結合物中，如本文進一步所述。
在活化之前，可縮減經單離之多醣的尺寸，同時保留多醣結構的關鍵特徵。可能使用機械式或化學式尺寸分級。在一實施態樣中，經單離之多醣的尺寸係藉由化學水解來縮減。化學水解可能使用弱酸(例如乙酸、甲酸、丙酸)進行。在一實施態樣中，化學水解係使用甲酸進行。在一實施態樣中，化學水解係使用丙酸進行。在較佳的實施態樣中，化學水解係使用乙酸進行。化學水解亦可使用稀釋之強酸(諸如稀釋之氫氯酸、稀釋之硫酸、稀釋之磷酸、稀釋之硝酸或稀釋之過氯酸)進行。在一實施態樣中，化學水解係使用稀釋之氫氯酸進行。在一實施態樣中，化學水解係使用稀釋之硫酸進行。在一實施態樣中，化學水解係使用稀釋之磷酸進行。在一實施態樣中，化學水解係使用稀釋之硝酸進行。在一實施態樣中，化學水解係使用稀釋之過氯酸進行。
經單離之多醣的尺寸亦可藉由機械均質化來縮減。在一實施態樣中，經單離之多醣的尺寸係藉由高壓均質化來縮減。高壓均質化係藉由將製程流通過具有尺寸足夠小的流徑泵送來達成高剪切速率。剪切速率係藉由使用較大的施加之均質化壓力來增加，且暴露時間可藉由使進料流通過均質機再循環來增加。
醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在醣活化之前(亦即在最終的尺寸分級步驟之後但在醣與活化劑反應之前)的Mw。在本發明之上下文中，醣的Mw實質上未經活化步驟修飾，且併入結合物之醣的Mw係與活化之前所測量之醣的Mw相似。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣結合物包含肺炎鏈球菌莢膜醣，其中該醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣結合物包含肺炎鏈球菌莢膜醣，其中該醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與600 kDa之間。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣結合物包含肺炎鏈球菌莢膜醣，其中該醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與500 kDa之間。
在一些實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣結合物具有介於250 kDa與20,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
使本發明之肺炎鏈球菌醣結合物特徵化的另一方式係藉由與醣結合之載體蛋白質(例如CRM 197、SCP、DT或TT)中的離胺酸殘基數量，該醣可以經結合之離胺酸範圍(結合程度)特徵化。由於與多醣的共價鍵聯，使載體蛋白質之離胺酸修飾的證據可藉由使用熟習本技術領域者已知的常規方法之胺基酸分析來獲得。與用於產生結合物材料之載體蛋白質起始材料相比，結合可導致回收之離胺酸殘基的數量減少。在較佳的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
本發明之肺炎鏈球菌醣結合物亦可以醣對載體蛋白質之比(重量/重量)特徵化。在一些實施態樣中，在醣結合物中的肺炎鏈球菌莢膜醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.5與3.0之間。在其他的實施態樣中，醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.5與2.0之間。在其他的實施態樣中，醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.5與1.5之間。在其他的實施態樣中，醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.8與1.2之間。在其他的實施態樣中，醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.5與1.0之間。在其他的實施態樣中，醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於1.0與1.5之間。在其他的實施態樣中，醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於1.0與2.0之間。在進一步的實施態樣中，醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.8與1.2之間。
本發明之肺炎鏈球菌醣結合物及致免疫性組成物可含有未與載體蛋白質結合但仍存在於醣結合物組成物中之游離醣。游離醣可與醣結合物非共價締合(亦即與醣結合物非共價結合、吸附至醣結合物或包埋於醣結合物中或與醣結合物包埋)。在較佳的實施態樣中，與醣總量相比，本發明之各肺炎鏈球菌醣結合物包含少於約50%之游離肺炎鏈球菌醣。在較佳的實施態樣中，與醣總量相比，本發明之各肺炎鏈球菌醣結合物包含少於約25%之游離肺炎鏈球菌醣。
肺炎鏈球菌醣結合物亦可以其分子尺寸分布(K d)特徵化。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於測定結合物之相對分子尺寸分布。尺寸排阻層析術(SEC)係使用於重力饋料管柱中得出結合物之分子尺寸分布輪廓。自介質中的孔排阻之大分子比小分子更快析出。使用分液收集器(fraction collector)收集管柱析出液。分液係藉由醣檢定法經比色測試。為判定K d，管柱係經校準以確立分子係經完全排阻的分液(V 0)，(K d=0)，及表示最大滯留的分液(V i)，(K d=1)。達到特定之樣品屬性的分液(V e)與K d的關係式為K d=(V e-V 0)/(V i-V 0)。
在較佳的實施態樣中，至少30%的本發明之肺炎鏈球菌醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。在較佳的實施態樣中，至少40%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。在較佳的實施態樣中，在介於40%與80%之間的本發明之肺炎鏈球菌醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。 1.3 本發明之肺炎鏈球菌醣結合物的製備模式
本發明之肺炎鏈球菌醣結合物可以熟習本技術領域的普通技能者已知的任何偶合技術製備。
在一實施態樣中，肺炎鏈球菌莢膜醣係經由非共價鍵與載體蛋白質偶合(參見例如WO2012155007、WO2020056202)。
在一實施態樣中，肺炎鏈球菌莢膜醣係經由共價鍵結合。在一個實施態樣中，莢膜醣係與載體蛋白質直接結合。在第二實施態樣中，莢膜醣係通過間隔子/連接子與載體蛋白質結合。
在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係經由連接子(例如雙官能連接子)與載體蛋白質結合。連接子視需要為異雙官能或同雙官能，具有例如反應性胺基及反應性羧酸基、兩個反應性胺基或兩個反應性羧酸基。連接子具有例如介於4與20個、4與12個、5與10個之間的碳原子。
可能的連接子為己二酸二醯肼(ADH)。其他的連接子包括B-丙醯胺基(WO 00/10599)、硝苯基乙胺(Gever等人之(1979) Med. Microbiol. lmmunol. 165；171-288)、鹵烷基鹵化物(US4057685)、醣苷鍵聯(US4673574、US4808700)、己二胺和6-胺基己酸(US4459286)。
在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係與載體蛋白質直接結合(沒有連接子)。
一般而言，在蛋白質載體上的下列類型之化學基團可用於偶合/結合： 1)胺基(例如經由離胺酸)。在一個實施態樣中，此基團直接連結至醣上的羧基或以碳二亞胺化學連結至連接子上的羧基，例如以EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺)。在另一實施態樣中，此基團直接連結至醣上以CDAP或CNBr活化之羥基或連結至連接子上的此等基團；連結至醣或具有醛基之連接子；連結至醣或具有琥珀醯亞胺酯基團之連接子。 2)羧基(例如經由天冬胺酸或麩胺酸)。在一個實施態樣中，此基團直接連結至醣上的胺基或以碳二亞胺化學連結至連接子上的胺基，例如以EDAC。 3)巰基(例如經由半胱胺酸)。在一個實施態樣中，此基團連結至溴或氯乙醯化醣或以順丁烯二醯亞胺化學連結至連接子。在一個實施態樣中，此基團係經雙重氮聯苯胺活化/修飾。 4)羥基(例如經由酪胺酸)。在一個實施態樣中，此基團係經雙重氮聯苯胺活化/修飾。 5)咪唑基(例如經由組胺酸)。在一個實施態樣中，此基團係經雙重氮聯苯胺活化/修飾。 6)胍基(例如經由精胺酸)。 7)吲哚基(例如經由色胺酸)。
在肺炎鏈球菌醣上，通常下列基團可用於偶合：OH、COOH或NH2。醛基可在本技術中已知的不同處理之後產生，諸如：過碘酸鹽、酸水解、過氧化氫等。
在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係使用CDAP化學製備。在該實施態樣中，肺炎鏈球菌醣係經四氟硼酸1-氰基-4-二甲胺基吡啶鎓鹽(CDAP)活化以形成氰酸酯。接著經活化之醣可直接或經由間隔子(連接子)基團與載體蛋白質上的胺基偶合。例如，間隔子可能為給出硫醇化多醣之胱胺或半胱胺，該硫醇化多醣可經由在與經順丁烯二醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或經鹵乙醯化之載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺(iodoacetimide)、溴乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBA；SIB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SlAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基SIAB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)或3-[溴乙醯胺基]丙酸琥珀醯亞胺酯(SBAP))反應之後所獲得硫醚鍵聯與載體偶合。
在較佳的實施態樣中，經活化之醣的氰酸酯係與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合且經胺基衍生之醣係使用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上的羧基與載體蛋白質結合。此等結合物描述於例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中。
在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係使用碳二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S--NHS、EDC、TSTU製備。許多該等技術描述於國際專利申請案公開號WO 98/42721中。結合可涉及羰基連接子，其可藉由醣之游離羥基與CDI之反應來形成(參見Bethell等人之(1979) 1. Biol. Chern. 254：2572-2574；Hearn等人之(1981) J. Chromatogr. 218：509-518)，隨後與蛋白質反應以形成胺甲酸酯鍵聯。這可涉及將變旋異構物末端還原成一級羥基、視需要地保護/去保護一級羥基、將一級羥基與CDI反應以形成CDI胺甲酸酯中間物、及將CDI胺基甲酸酯中間物與蛋白質上的胺基偶合。 直接還原胺化作用
在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係藉由直接還原胺化來製備(參見例如US 4365170、US 4673574、WO2006/110381、WO2008/079653、WO2008/143709、WO2008/079732、WO2011/110531、WO2012/119972、WO2015110941、WO2015110940、WO2018/144439、WO2018/156491)。
根據本發明，還原胺化作用涉及兩個步驟：(1)氧化(活化)經純化之肺炎鏈球菌醣，(2)還原經活化之醣及載體蛋白質(例如CRM 197、TT或SCP)以形成醣結合物。
如上文所述及，在氧化之前，可執行肺炎鏈球菌醣之尺寸分級至標的分子量(MW)範圍。因此，在一實施態樣中，經單離之多醣係在氧化之前經尺寸分級。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣係藉由包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合： (a)將該肺炎鏈球菌醣與氧化劑反應； (b)將步驟(a)的經活化之醣與載體蛋白質複合(compounding)；且 (c)將複合的經活化之醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣係藉由包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合： (a)將該肺炎鏈球菌醣與氧化劑反應； (a’)將氧化反應以添加淬滅劑淬滅； (b)將步驟(a’)的經活化之醣與載體蛋白質複合；且 (c)將複合的經活化之醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
在氧化步驟(a)之後，認為醣經活化且被稱為「經活化之醣」。
在一實施態樣中，氧化劑為氧化末端羥基成為醛之任何氧化劑。在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸鹽。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸兩者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO 4 -)和原過碘酸鹽(IO 6 5-)兩者及過碘酸鹽的各種鹽(例如過碘酸鈉和過碘酸鉀)。
在一實施態樣中，氧化劑為在二價陽離子存在下的過碘酸鹽(參見WO2008/143709)。
在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸。在一實施態樣中，氧化劑為在二價陽離子存在下的過碘酸。在一實施態樣中，氧化劑為在Mg 2+存在下的過碘酸。在一實施態樣中，氧化劑為在Ca 2+存在下的過碘酸。在一實施態樣中，氧化劑為原過碘酸鹽。
在較佳的實施態樣中，氧化劑為過碘酸鈉。在一實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鹽。在一實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鈉。
當多醣與過碘酸鹽反應時，過碘酸鹽氧化鄰位羥基以形成羰基或醛基且造成C-C鍵斷裂。出於此原因，術語「將多醣與過碘酸鹽反應」包括以過碘酸鹽氧化鄰位羥基。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將多醣與0.01至2莫耳當量之過碘酸鹽反應。在一個實施態樣中，步驟a)包含將多醣與0.1至1.0莫耳當量之過碘酸鹽反應。在一個實施態樣中，步驟a)包含將多醣與0.1至0.5莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一實施態樣中，氧化劑為穩定的硝醯基化合物與氧化劑的混合物(參見WO2014097099)。
在一態樣中，該穩定的硝醯基化合物為攜帶TEMPO或PROXYL (2,2,5,5-四甲基-1-吡咯啶氧基)部分之分子。該分子較佳地具有在氧化劑的存在下選擇性地氧化一級醇以產生醛基而不影響二級羥基的能力。該分子更佳地具有在氧化劑的存在下選擇性地氧化一級醇以產生醛基而不過度氧化成羧基的能力。在一態樣中，該穩定的硝醯基化合物為TEMPO、2,2,6,6-四甲基-4-(甲基磺醯氧基)-1-哌啶氧化物(piperidinooxy)、4-膦醯氧基-TEMPO、4-側氧基-TEMPO、4-甲氧基-TEMPO、4-異硫氰基-TEMPO、4-(2-碘乙醯胺基)-TEMPO游離基、4-羥基-TEMPO、4-氰基-TEMPO、4-羧基-TEMPO、4-(2-溴乙醯胺基)-TEMPO或4-胺基-TEMPO、4-乙醯胺基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧化物。該穩定的硝醯基化合物較佳為TEMPO。在一態樣中，該穩定的硝醯基化合物係選自由下列所組成之群組：TEMPO、2,2,6,6-四甲基-4-(甲基磺醯氧基)-1-哌啶氧化物、4-膦醯氧基-TEMPO、4-側氧基-TEMPO、4-甲氧基-TEMPO、4-異硫氰基-TEMPO、4-(2-碘乙醯胺基)-TEMPO游離基、4-羥基-TEMPO、4-氰基-TEMPO、4-羧基-TEMPO、4-(2-溴乙醯胺基)-TEMPO、4-胺基-TEMPO、4-乙醯胺基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧化物。該穩定的硝醯基化合物較佳為TEMPO。在進一步的態樣中，該穩定的硝醯基化合物為3β-DOXYL-5α-膽甾烷、5-DOXYL-硬脂酸、16-DOXYL-硬脂酸、5-DOXYL-硬脂酸甲酯、3-(胺基甲基)-PROXYL、3-胺甲醯基-PROXYL、3-胺甲醯基-2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉1-氧化物、3-羧基-PROXYL或3-氰基-PROXYL。在進一步的態樣中，該穩定的硝醯基化合物係選自由下列所組成之群組：3β-DOXYL-5α-膽甾烷、5-DOXYL-硬脂酸、16-DOXYL-硬脂酸、5-DOXYL-硬脂酸甲酯、3-(胺基甲基)-PROXYL、3-胺甲醯基-PROXYL、3-胺甲醯基-2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉1-氧化物、3-羧基-PROXYL、3-氰基-PROXYL。
在一態樣中，氧化劑為攜帶N-鹵基部分之分子。該分子較佳地具有在硝醯基化合物的存在下選擇性地氧化一級醇的能力。在一態樣中，該氧化劑為N-氯琥珀醯亞胺、N-溴琥珀醯亞胺、N-碘琥珀醯亞胺、二氯異三聚氰酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三𠯤烷(triazinane)-2,4,6-三酮、二溴異三聚氰酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮、二碘異三聚氰酸或1,3,5-三碘-1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮。在一態樣中，該氧化劑係選自由下列所組成之群組：N-氯琥珀醯亞胺、N-溴琥珀醯亞胺、N-碘琥珀醯亞胺、二氯異三聚氰酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮、二溴異三聚氰酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮、二碘異三聚氰酸和1,3,5-三碘-1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮。該氧化劑較佳為N-氯琥珀醯亞胺。
在一態樣中，該穩定的硝醯基化合物為2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基游離基(TEMPO)及該氧化劑為N-氯琥珀醯亞胺(NCS)。
在一個實施態樣中，步驟a’)之淬滅劑係選自鄰位二醇、1,2-胺基醇、胺基酸、麩胱甘肽、亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽(dithionite)、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、次磷酸鹽或亞磷酸。
在一個實施態樣中，淬滅劑為式(I)之1,2-胺基醇： 其中R 1係選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。
在一個實施態樣中，淬滅劑係選自亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、次磷酸鹽或亞磷酸之鈉及鉀鹽。
在一個實施態樣中，淬滅劑為胺基酸。在此等實施態樣中，該胺基酸可選自絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、胱胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、羥基脯胺酸、色胺酸、酪胺酸和組胺酸。
在一個實施態樣中，淬滅劑為亞硫酸鹽，諸如硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽。
在一個實施態樣中，淬滅劑為包含兩個鄰位羥基之化合物(鄰位二醇)，亦即兩個羥基經共價連結至兩個相鄰的碳原子。
淬滅劑較佳為式(II)化合物： 其中R 1和R 2各自獨立地選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。
在較佳的實施態樣中，淬滅劑為甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,2-丁二醇或2,3-丁二醇或抗壞血酸。在甚至較佳的實施態樣中，淬滅劑為2,3-丁二醇。
在較佳的實施態樣中，經活化之肺炎鏈球菌醣的氧化程度(在本發明文件中亦稱為「活化程度」)係介於2與30之間。在一實施態樣中，經活化之肺炎鏈球菌醣的氧化程度(DO)係介於10與25之間。
在一個實施態樣中，經活化之醣及載體蛋白質係在步驟b)之前凍乾。
在一實施態樣中，在步驟b)的經活化之肺炎鏈球菌醣對載體蛋白質的初始輸入比(重量比)係介於4：1與0.1：1之間。在一實施態樣中，在步驟b)的經活化之肺炎鏈球菌醣對載體蛋白質的初始輸入比(重量比)係介於1.5：1與0.5：1之間。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在水性溶劑中進行。在另一實施態樣中，還原反應(c)係在非質子性溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)的存在下進行。在一實施態樣中，還原反應(c)係在二甲基甲醯胺(DMF)的存在下進行。在一實施態樣中，還原反應(c)係在二甲基亞碸(DMSO)的存在下進行。
在一個實施態樣中，還原反應(c)係在基本上由二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)所組成之溶液中進行。在一個實施態樣中，還原反應(c)係在基本上由二甲基甲醯胺(DMF)所組成之溶液中進行。在一個實施態樣中，還原反應(c)係在基本上由二甲基亞碸(DMSO)所組成之溶液中進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行。在一實施態樣中，還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下的硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMe iPrN-BH 3、苯甲胺-BH 3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。在一實施態樣中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。在較佳的實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉。在一實施態樣中，還原劑為在鎳存在下的氰基硼氫化鈉(參見WO2018144439)。
在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於0.2與20莫耳當量之間的還原劑。在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於0.5與10莫耳當量之間的還原劑。在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於1.0與5莫耳當量之間的還原劑。
在還原反應結束時，可能有未反應之醛基剩餘在結合物中，該等醛基可使用適合的封端劑封端。在一個實施態樣中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH 4)。在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至20莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至10莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至5莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。 CDI及/或CDT化學
在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係藉由CDI及/或CDT化學來製備，如WO2022249107中所揭示。
CDI及/或CDT化學涉及兩個步驟：(1)將肺炎鏈球菌醣與CDI及/或CDT在非質子性溶劑中反應以生產經活化之醣(活化)，(2)將經活化之醣與載體蛋白質(例如CRM 197、TT或SCP)反應以形成醣結合物。
在一實施態樣中，步驟(1)之活化劑為1,1’-羰基二咪唑(CDI)。在一實施態樣中，步驟(1)之活化劑為1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)。
如上文所述及，在以CDI及/或CDT活化之前，可執行肺炎鏈球菌醣之尺寸分級至標的分子量(MW)範圍。
因此，在一實施態樣中，肺炎鏈球菌醣係在以CDI活化之前經尺寸分級。在一實施態樣中，經單離之多醣係在以CDT活化之前經尺寸分級。在一實施態樣中，將肺炎鏈球菌醣尺寸分級至上文所定義之標的分子量(MW)範圍中之任一者。
因此，在一實施態樣中，肺炎鏈球菌醣係藉由包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合： (a)將該經單離之多醣與CDI及/或CDT在非質子性溶劑中反應； (b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質在非質子性溶劑中反應以形成醣結合物。
在步驟(a)之後，認為多醣經活化且被稱為「經活化之多醣」。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將肺炎鏈球菌醣與CDI反應。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將肺炎鏈球菌醣與一定量的CDI反應，該CDI之量係在相對於反應混合物中存在的肺炎球菌糖之量的0.5至10莫耳當量之間。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將肺炎鏈球菌醣與CDT反應。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將肺炎鏈球菌醣與一定量的CDT反應，該CDT之量係介於反應混合物中存在的肺炎球菌糖之量的0.5至10莫耳當量之間。
在一實施態樣中，活化反應a)係在二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、N-甲基-2-吡咯啶酮或六甲基磷醯胺(HMPA)的存在下進行。在一實施態樣中，活化反應a)係在二甲基亞碸(DMSO)的存在下進行。
在一個實施態樣中，活化反應a)係在基本上由二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)所組成之溶液中進行。在一個實施態樣中，活化反應a)係在基本上由二甲基亞碸(DMSO)所組成之溶液中進行。
在一實施態樣中，結合反應b)係在二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺、N-甲基-2-吡咯啶酮或六甲基磷醯胺(HMPA)的存在下進行。
在一實施態樣中，結合反應b)係在二甲基亞碸(DMSO)的存在下進行。
在一個實施態樣中，結合反應b)係在基本上由二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)所組成之溶液中進行。在一個實施態樣中，結合反應b)係在基本上由二甲基亞碸(DMSO)所組成之溶液中進行。
在一個實施態樣中，弱有機鹼可在活化反應a)之後，但在結合反應b)之前添加至反應混合物中。弱有機鹼可在載體蛋白質引入反應混合物中之前或之後添加。因此，在一個實施態樣中，弱有機鹼係在引入載體蛋白質之前添加至反應混合物中。在另一實施態樣中，弱有機鹼係在引入載體蛋白質之後添加至反應混合物中。弱有機鹼可選自烷烴胺、咪唑、三唑、吡啶、組胺酸和胍。烷烴胺包括烷基一級胺 諸如甲胺、乙胺、丙胺、異丙胺；烷基二級胺，諸如二甲胺、二乙胺、二丙胺、二異丙胺；烷基三級胺，諸如三甲胺、三乙胺、三異丙胺、二-N,N’-異丙基乙胺等。在一實施態樣中，弱有機鹼為烷烴胺。在一實施態樣中，弱有機鹼為咪唑。在一實施態樣中，弱有機鹼為三唑。在一實施態樣中，弱有機鹼為吡啶。在一實施態樣中，弱有機鹼為組胺酸。在一實施態樣中，弱有機鹼為胍。
在一個實施態樣中，在結合反應b)之後，將經活化之多醣的未結合之反應位點水解。在一個實施態樣中，未結合之反應位點係藉由添加至水溶液之結合溶液中來水解。在一個實施態樣中，未結合之反應位點係藉由添加至水性緩衝溶液之結合溶液中來水解。在一個實施態樣中，未結合之反應位點係藉由添加至水性緩衝溶液之結合溶液中且調整pH至介於約3.0至約10.0之間來水解。在一個實施態樣中，未結合之反應位點係藉由添加至水性緩衝溶液之結合溶液中且調整pH至介於約7.0至約10.0之間來水解。在一個實施態樣中，未結合之反應位點係藉由添加至水性緩衝溶液之結合溶液中且調整pH至介於約3.0至約7.0之間來水解。在一個實施態樣中，未結合之反應位點係藉由添加至水性緩衝溶液之結合溶液中且調整pH至約4.0來水解。在一個實施態樣中，未結合之反應位點係藉由添加至水性緩衝溶液之結合溶液中且調整pH至約9.0來水解。 eTEC化學
在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係藉由eTEC化學來製備，如WO2014027302中所揭示。
eTEC間隔子包括七個直鏈原子(亦即-C(O)NH(CH2)2SCH2C(O)-)且提供在醣與載體蛋白質之間穩定的硫醚及醯胺鍵。經eTEC連結之醣結合物的合成涉及醣的經活化之羥基與硫烷基胺試劑(例如胱胺或半胱胺酸胺或其鹽)的胺基之反應，形成與醣的胺甲酸酯鍵聯以提供硫醇化醣。一或多個游離巰基的產生係藉由與還原劑反應以提供經活化之硫醇化醣來完成。經活化之硫醇化醣的游離巰基與含胺之殘基上具有一或多個α-鹵乙醯胺基的經活化之載體蛋白質的反應產生用於形成結合物之硫醚鍵，其中載體蛋白質係通過醯胺鍵連接至eTEC間隔子。
因此，在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣結合物包含通過胺甲酸(2-((2-側氧乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔子與載體蛋白質共價結合之肺炎鏈球菌醣。
在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物包含通過胺甲酸(2-((2-側氧乙基)硫基)乙基)酯(eTEC)間隔子與載體蛋白質結合之肺炎鏈球菌醣，其中醣係通過胺甲酸酯鍵聯共價連結至eTEC間隔子，且其中載體蛋白質係通過醯胺鍵聯共價連結至eTEC間隔子。
本發明的經eTEC連結之醣結合物可以通式(III)表示： ，其中(醣)表示肺炎鏈球菌醣。
式(III)為本發明之醣結合物的示意圖示。不應理解為僅有一個鍵聯存在於醣與載體蛋白質之間。反而，個別的載體蛋白質分子可連結至一個以上的肺炎球菌醣分子及個別的醣分子可連結一個以上個別的載體蛋白質分子。另外，大多數的醣重複單元維持未經修飾，且在載體蛋白質與醣之間的共價鍵聯係針對少數的醣重複單元。 點擊化學
在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係以點擊化學製備(參見例如PCT/IB2023/050202)。
因此，在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合且具有通式(IV)之肺炎鏈球菌醣： ， 其中X係選自由下列所組成之群組：CH 2(CH 2) n’、(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、NHCO(CH 2) n’、NHCO(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、OCH 2(CH 2) n’和O(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2；其中n’係選自1至10及m係選自1至4， 其中X'係選自由下列所組成之群組：CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O、CH 2O(CH 2CH 2O) m’(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10及m’係選自0至4， 其中在方括號中的結構表示肺炎鏈球菌醣的重複單元，且其中n表示重複單元的數量。
在特別的態樣中，本發明指向包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合且具有通式(IV)之肺炎鏈球菌醣的肺炎鏈球菌醣結合物，其中X為CH 2(CH 2) n’，其中n’為2，且其中X'為CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’為1。
在特別的態樣中，本發明關於包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合且具有通式(V)之肺炎鏈球菌醣的肺炎鏈球菌醣結合物， 其中在方括號中的結構表示肺炎鏈球菌醣的重複單元，且其中n表示重複單元的數量。
在一態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合且具有通式(VI)之肺炎鏈球菌醣： ， 其中X係選自由下列所組成之群組：CH 2(CH 2) n’、(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、NHCO(CH 2) n’、NHCO(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、OCH 2(CH 2) n’和O(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2；其中n’係選自0至10及m係選自1至4， 其中X'係選自由下列所組成之群組：CH 2(CH 2) n”、CH 2O(CH 2) n’’CH 2、CH 2O(CH 2CH 2O) m’(CH 2) n’’CH 2，其中n’’係選自0至10及m’係選自0至4，及其中在方括號中的結構表示肺炎鏈球菌醣的重複單元，且其中n表示重複單元的數量。
在特別的態樣中，本發明指向包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合且具有通式(VI)之肺炎鏈球菌醣的肺炎鏈球菌醣結合物，其中X為CH 2(CH 2) n’，其中n’為0，且其中X'為CH 2(CH 2) n”，其中n’’為0。
在特別的態樣中，本發明關於包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合且具有通式(VII)之肺炎鏈球菌醣的肺炎鏈球菌醣結合物， 其中在方括號中的結構表示肺炎鏈球菌醣的重複單元，且其中n表示重複單元的數量。
式(IV)、(V)、(VII)和(VII)為本發明之醣結合物的示意圖示。不應理解為鍵聯係存在於醣的每個重複單元上(在方括號中的結構)。反而，大多數的醣重複單元維持未經修飾且在載體蛋白質與醣之間的共價鍵聯係針對少數的醣重複單元。另外，個別的載體蛋白質(CP)分子可連結至一個以上的醣分子及個別的醣分子可連結一個以上個別的載體蛋白質(CP)分子。在方括號中的結構表示肺炎鏈球菌醣的重複單元。
在與載體蛋白質結合之後，本發明之肺炎鏈球菌醣結合物可藉由熟習本技術領域者已知的各種技術純化(相對於醣-蛋白質結合物的量富集)。該等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沉澱/溶析、管柱層析術(DEAE或疏水性相互作用層析術)及深層過濾。因此，在一個實施態樣中，用於生產本發明之醣結合物之製程包含純化在生產之後的醣結合物的步驟。 1.4 本發明之肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、15B、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F醣結合物
在一態樣中，本發明關於包含肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F醣結合物之組成物。
肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F多醣的結構為本技術中已知(參見例如Geno K等人之(2015) Clin Microbiol Rev Vol 28：3, p 871-899)。
在一實施態樣中，在本發明中所使用之肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜醣為合成的碳水化合物。合成的肺炎鏈球菌1型莢膜醣之製備可例如如WO2015004041中所揭示來進行。合成的肺炎鏈球菌4型莢膜醣之製備可例如如WO2016091399中所揭示來進行。合成的肺炎鏈球菌5型莢膜醣之製備可例如如WO2016198170中所揭示來進行。合成的肺炎鏈球菌8型莢膜醣之製備可例如如WO2017220753中所揭示來進行。
然而，在較佳的實施態樣中，根據本發明之細菌多醣的來源可為肺炎鏈球菌細菌細胞。可用作為肺炎鏈球菌莢膜多醣來源之細菌株可自建立的培養物收集中心(諸如例如自鏈球菌參考實驗室(疾病管制與預防中心，Atlanta, GA USA))或臨床樣本獲得。
肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣可使用熟習本技術的普通技能者已知的單離程序自細菌直接獲得。該等亦可購得(諸如例如來自美國菌種保存中心(ATCC，Manassas, VA USA)(例如參考編號ATCC 13-X、ATCC 36-X、ATCC 41-X、ATCC 280-X、ATCC 107-X、ATCC 284-X、ATCC 505-X、ATCC 331-X、ATCC 511-X、ATCC 514-X、ATCC 517-X、ATCC 520-X、ATCC 81-X、ATCC 289-X、ATCC 304-X、ATCC 101-X、ATCC 527-X、ATCC 104-X、ATCC 535-X))。
若莢膜多醣係自細菌直接獲得，則細菌細胞可在培養基中(較佳地在基於大豆之培養基中)生長。在生產肺炎鏈球菌莢膜多醣之細菌細胞發酵之後，可將細菌細胞溶解以生產細胞溶解物。接著可將莢膜多醣使用本技術中已知的純化技術自細胞溶解物單離，包括使用離心、深層過濾、沉澱、超濾、以活性碳處理、透濾及/或管柱層析術(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381、WO2008/118752和WO2020170190)。接著可將經純化之莢膜多醣用於製備醣結合物。
經單離之莢膜醣可以不同的參數特徵化，包括例如重量平均分子量(Mw)。
莢膜醣的分子量可藉由尺寸排阻層析術(SEC)與多角度雷射光散射檢測器(MALLS)組合來測量。
在較佳的實施態樣中，經單離之莢膜多醣(亦即在進一步處理之前已純化)具有介於5 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之莢膜多醣具有介於10 kDa與3,000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之莢膜多醣具有介於50 kDa與1,000 kDa之間的重量平均分子量。
考慮在上述範圍中之任一者內的任何整數作為本揭示之一實施態樣。
為了產生具有有利的可過濾性特徵、致免疫性及/或產率之結合物，在與載體蛋白質結合之前，可執行莢膜多醣之尺寸分級至標的分子量範圍。最好縮減經純化之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣的尺寸，同時保留多醣結構的關鍵特徵。可能使用機械式或化學式尺寸分級(參見例如WO2006/110381、WO2015110941)。
在一實施態樣中，經純化之莢膜多醣的尺寸係藉由化學水解來縮減。化學水解可能使用弱酸(例如乙酸、甲酸、丙酸)進行。化學水解亦可使用稀釋之強酸(諸如稀釋之氫氯酸、稀釋之硫酸、稀釋之磷酸、稀釋之硝酸或稀釋之過氯酸)進行。
經純化之多醣的尺寸亦可藉由機械均質化來縮減。在一實施態樣中，經純化之多醣的尺寸係藉由高壓均質化來縮減。高壓均質化係藉由將製程流通過具有尺寸足夠小的流徑泵送來達成高剪切速率。剪切速率係藉由使用較大的施加之均質化壓力來增加，且暴露時間可藉由使進料流通過均質機再循環來增加。
在一實施態樣中，經單離之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣未經尺寸分級。
經單離之血清型1莢膜多醣可經去O-乙醯化(參見例如WO 2008/079653)。因此，在一實施態樣中，經單離之血清型1莢膜多醣係經部分去O-乙醯化。在一實施態樣中，去O-乙醯化係使用弱鹼進行。部分去O-乙醯化可使用碳酸氫鈉/碳酸鈉緩衝液執行。
在一實施態樣中，經單離之血清型1莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型1莢膜多醣在結合之前具有介於150 kDa與900 kDa之間的重量平均分子量。在較佳的實施態樣中，經單離之血清型1莢膜多醣在結合之前具有介於150 kDa與700 kDa之間的重量平均分子量。經單離之醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指多醣在活化之前(亦即在最終的尺寸分級步驟之後但在多醣與活化劑反應之前)的Mw。
在一實施態樣中，經單離之血清型4莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型4莢膜多醣在結合之前具有介於300 kDa與900 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型5莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1,000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型5莢膜多醣在結合之前具有介於200 kDa與600 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型6A莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型6A莢膜多醣在結合之前具有介於300 kDa與900 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型6B莢膜多醣在結合之前具有之間的重量平均分子量介於100 kDa與1000 kDa。在一實施態樣中，經單離之血清型6B莢膜多醣在結合之前具有之間的重量平均分子量介於200 kDa與900 kDa。
在一實施態樣中，經單離之血清型7F莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型7F莢膜多醣在結合之前具有介於200 kDa與900 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型8莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型8莢膜多醣在結合之前具有介於200 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型9V莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型9V莢膜多醣在結合之前具有介於200 kDa與900 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型10A莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型10A莢膜多醣在結合之前具有介於200 kDa與900 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型11A莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型11A莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型12F莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型12F莢膜多醣在結合之前具有介於150 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型14莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型14莢膜多醣在結合之前具有介於200 kDa與900 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型15B莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型15B莢膜多醣在結合之前具有介於150 kDa與300 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型18C莢膜多醣在結合之前具有介於20 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型18C莢膜多醣在結合之前具有介於20 kDa與500 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型19A莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型19A莢膜多醣在結合之前具有介於250 kDa與700 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型19F莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型19F莢膜多醣在結合之前具有介於250 kDa與800 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型22F莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型22F莢膜多醣在結合之前具有介於400 kDa與700 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型23F莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型23F莢膜多醣在結合之前具有介於200 kDa與800 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型33F莢膜多醣在結合之前具有介於300 kDa與2000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型33F莢膜多醣在結合之前具有介於500 kDa與2000 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，本發明之血清型1醣結合物包含血清型1莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與750 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於250 kDa與600 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型4醣結合物包含血清型4莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與1,000 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於400 kDa與900 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型5醣結合物包含血清型5莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於150 kDa與800 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與500 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型6A醣結合物包含血清型6A莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與1,000 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於300 kDa與800 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型6B醣結合物包含血清型6B莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與1,000 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於300 kDa與800 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型7F醣結合物包含血清型7F莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與1,000 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於300 kDa與800 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型8醣結合物包含血清型8莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與800 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於300 kDa與600 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與400 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型9V醣結合物包含血清型9V莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與900 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於300 kDa與600 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與400 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型10A醣結合物包含血清型10A莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與800 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於300 kDa與600 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與400 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型11A醣結合物包含血清型11A莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於75 kDa與600 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與400 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型12F醣結合物包含血清型12F莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於150 kDa與600 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於150 kDa與400 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於250 kDa與350 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型14醣結合物包含血清型14莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與800 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與600 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型15B醣結合物包含血清型15B莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與600 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於150 kDa與300 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型18C醣結合物包含血清型18C莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於20 kDa與800 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於20 kDa與400 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於20 kDa與200 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型19A醣結合物包含血清型19A莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與700 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於250 kDa與500 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型19F醣結合物包含血清型19F莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與900 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於250 kDa與600 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型22F醣結合物包含血清型22F莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與900 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於400 kDa與700 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型23F醣結合物包含血清型23F莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與900 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與600 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型33F醣結合物包含血清型33F莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與2,500 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與2,000 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於600 kDa與2,000 kDa之間。其中在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指在多醣活化之後(亦即在最終的尺寸分級步驟之後及在多醣與活化劑反應之後)的Mw。
在一些實施態樣中，本發明之血清型1醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型1醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型1醣結合物具有介於2,000 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型4醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型4醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型4醣結合物具有介於2,000 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型5醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型5醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型5醣結合物具有介於2,000 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型6A醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型6A醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型6A醣結合物具有介於2,000 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型6B醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型6B醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型6B醣結合物具有介於2,000 kDa與5,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型7F醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型7F醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型7F醣結合物具有介於2,000 kDa與5,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型8醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型8醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型8醣結合物具有介於2,500 kDa與8,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型9V醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型9V醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型9V醣結合物具有介於2,000 kDa與5,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型10A醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型10A醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型10A醣結合物具有介於2,000 kDa與5,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型11A醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型11A醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型11A醣結合物具有介於700 kDa與4,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型12F醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型12F醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型12F醣結合物具有介於1,500 kDa與4,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型14醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型14醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型14醣結合物具有介於2,000 kDa與5,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型15B醣結合物具有介於1,000 kDa與25,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型15B醣結合物具有介於2,000 kDa與20,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型15B醣結合物具有介於5,000 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型18C醣結合物具有介於150 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型18C醣結合物具有介於250 kDa與7,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型18C醣結合物具有介於300 kDa與4,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型19A醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型19A醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型19A醣結合物具有介於2,000 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型19F醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型19F醣結合物具有介於750 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型19F醣結合物具有介於1,000 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型22F醣結合物具有介於500 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型22F醣結合物具有介於1,000 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型22F醣結合物具有介於2,500 kDa與5,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型23F醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型23F醣結合物具有介於750 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型23F醣結合物具有介於1,000 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一些實施態樣中，本發明之血清型33F醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型33F醣結合物具有介於750 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在較佳的實施態樣中，血清型33F醣結合物具有介於2,000 kDa與6,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
本發明之醣結合物亦可以醣對載體蛋白質之比(重量/重量)特徵化。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型1多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.6與2.0之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型4多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.9與2.1之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)甚至更佳地介於1.0與1.9之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型5多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於1.3與2.5之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型6A多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.7與1.6之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型6B多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.4與0.8之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型7F多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.7與1.5之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型8多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.6與1.6之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型9V多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於1.2與2.3之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型10A多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.7與1.6之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型11A多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.9與1.5之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型12F多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.7與1.5之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型14多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於1.4與2.6之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型15B多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.6與1.6之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型18C多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.7與1.5之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型19A多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.4與0.9之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型19F多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.5與1.0之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型22F多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.8與1.2之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型23F多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.4與1.0之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型33F多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於1.0與2.2之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為TT。載體蛋白質較佳為CRM 197。
使本發明之醣結合物特徵化的另一方式係藉由與醣結合之載體蛋白質(例如CRM197、DT或TT)中的離胺酸殘基數量，該醣可以經結合之離胺酸範圍(結合程度)特徵化。由於與多醣的共價鍵聯，使載體蛋白質之離胺酸修飾的證據可藉由使用熟習本技術領域者已知的常規方法之胺基酸分析來獲得。與用於產生結合物材料之載體蛋白質起始材料相比，結合導致回收之離胺酸殘基的數量減少。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型1醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型4醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型5醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型6A醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型6B醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型7F醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型8醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型9V醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型10A醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型11A醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型12F醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型14醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型15B醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型18C醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型19A醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型19F醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型22F醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型23F醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型33F醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
本發明之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F醣結合物及包含該醣結合物之致免疫性組成物可含有未與載體蛋白質共價結合但仍存在於醣結合物組成物中之游離醣。游離醣可與醣結合物非共價締合(亦即與醣結合物非共價結合、吸附至醣結合物或包埋於醣結合物中或與醣結合物包埋)。
在一實施態樣中，與血清型1多醣總量相比，本發明之血清型1醣結合物包含少於約40%之游離血清型1多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型1多醣總量相比，血清型1醣結合物包含少於約20%之游離血清型1多醣。
在一實施態樣中，與血清型1多醣總量相比，本發明之血清型1醣結合物包含少於約40%之游離血清型1多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型1多醣總量相比，血清型1醣結合物包含少於約20%之游離血清型1多醣。
在一實施態樣中，與血清型4多醣總量相比，本發明之血清型4醣結合物包含少於約40%之游離血清型4多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型4多醣總量相比，血清型4醣結合物包含少於約30%之游離血清型4多醣。
在一實施態樣中，與血清型5多醣總量相比，本發明之血清型5醣結合物包含少於約45%之游離血清型5多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型5多醣總量相比，血清型5醣結合物包含少於約40%之游離血清型5多醣。
在一實施態樣中，與血清型6A多醣總量相比，本發明之血清型6A醣結合物包含少於約40%之游離血清型6A多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型6A多醣總量相比，血清型6A醣結合物包含少於約30%之游離血清型6A多醣。
在一實施態樣中，與血清型6B多醣總量相比，本發明之血清型6B醣結合物包含少於約30%之游離血清型6B多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型6B多醣總量相比，血清型6B醣結合物包含少於約20%之游離血清型6B多醣。
在一實施態樣中，與血清型7F多醣總量相比，本發明之血清型7F醣結合物包含少於約30%之游離血清型7F多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型7F多醣總量相比，血清型7F醣結合物包含少於約20%之游離血清型7F多醣。
在一實施態樣中，與血清型8多醣總量相比，本發明之血清型8醣結合物包含少於約30%之游離血清型8多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型8多醣總量相比，血清型8醣結合物包含少於約20%之游離血清型8多醣。
在一實施態樣中，與血清型9V多醣總量相比，本發明之血清型9V醣結合物包含少於約40%之游離血清型9V多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型9V多醣總量相比，血清型9V醣結合物包含少於約35%之游離血清型9V多醣。
在一實施態樣中，與血清型10A多醣總量相比，本發明之血清型10A醣結合物包含少於約40%之游離血清型10A多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型10A多醣總量相比，血清型10A醣結合物包含少於約20%之游離血清型10A多醣。
在一實施態樣中，與血清型11A多醣總量相比，本發明之血清型11A醣結合物包含少於約40%之游離血清型11A多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型11A多醣總量相比，血清型11A醣結合物包含少於約30%之游離血清型11A多醣。
在一實施態樣中，與血清型12F多醣總量相比，本發明之血清型12F醣結合物包含少於約40%之游離血清型12F多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型12F多醣總量相比，血清型12F醣結合物包含少於約30%之游離血清型12F多醣。
在一實施態樣中，與血清型14多醣總量相比，本發明之血清型14醣結合物包含少於約40%之游離血清型14多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型14多醣總量相比，血清型14醣結合物包含少於約35%之游離血清型14多醣。
在一實施態樣中，與血清型15B多醣總量相比，本發明之血清型15B醣結合物包含少於約40%之游離血清型15B多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型15B多醣總量相比，血清型15B醣結合物包含少於約35%之游離血清型15B多醣。
在一實施態樣中，與血清型18C多醣總量相比，本發明之血清型18C醣結合物包含少於約30%之游離血清型18C多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型多醣總量相比，血清型18C醣結合物包含少於約20%之游離血清型18C多醣。
在一實施態樣中，與血清型19A多醣總量相比，本發明之血清型19A醣結合物包含少於約40%之游離血清型19A多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型19A多醣總量相比，血清型19A醣結合物包含少於約30%之游離血清型19A多醣。
在一實施態樣中，與血清型19F多醣總量相比，本發明之血清型19F醣結合物包含少於約30%之游離血清型19F多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型19F多醣總量相比，血清型19F醣結合物包含少於約20%之游離血清型19F多醣。
在一實施態樣中，與血清型22F多醣總量相比，本發明之血清型22F醣結合物包含少於約40%之游離血清型22F多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型22F多醣總量相比，血清型22F醣結合物包含少於約20%之游離血清型22F多醣。
在一實施態樣中，與血清型23F多醣總量相比，本發明之血清型23F醣結合物包含少於約30%之游離血清型23F多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型23F多醣總量相比，血清型23F醣結合物包含少於約20%之游離血清型23F多醣。
在一實施態樣中，與血清型33F多醣總量相比，本發明之血清型33F醣結合物包含少於約30%之游離血清型33F多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型33F多醣總量相比，血清型33F醣結合物包含少於約20%之游離血清型33F多醣。
本發明之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F醣結合物亦可以其分子尺寸分布(Kd)特徵化。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於測定結合物之相對分子尺寸分布。尺寸排阻層析術(SEC)係使用於重力饋料管柱中得出結合物之分子尺寸分布輪廓。自介質中的孔排阻之大分子比小分子更快溶析。使用溶析份收集器收集管柱溶析液。溶析份係藉由醣檢定法經比色測試。校準用於測定Kd之管柱以確立完全排阻之分子的溶析份(V0)，(Kd=0)及表示最大滯留的溶析份(Vi)，(Kd=1)。達到特定之樣品屬性的溶析份(Ve)係藉由運算式Kd=(Ve-V0)/ (Vi-V0)與Kd關聯。
在一實施態樣中，至少40%之血清型1醣結合物在在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少50%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於50%與80%之間的血清型1醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少30%之血清型4醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少40%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於40%與80%之間的血清型4醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少40%之血清型5醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少55%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於55%與80%之間的血清型5醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少50%之血清型6A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少60%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於60%與90%之間的血清型6A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少30%之血清型6B醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少35%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於35%與80%之間的血清型6B醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少50%之血清型7F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少65%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於65%與90%之間的血清型7F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少60%之血清型8醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少70%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於70%與90%之間的血清型8醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少30%之血清型9V醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少40%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於40%與80%之間的血清型9V醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少40%之血清型10A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少55%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於55%與85%之間的血清型10A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少50%之血清型11A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少60%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於60%與85%之間的血清型11A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少40%之血清型12F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少50%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於50%與80%之間的血清型12F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少40%之血清型14醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少50%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於50%與80%之間的血清型14醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少30%之血清型15B醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少40%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於40%與80%之間的血清型15B醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少30%之血清型18C醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少40%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於40%與80%之間的血清型18C醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少40%之血清型19A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少50%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於50%與80%之間的血清型19A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少40%之血清型19F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少50%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於50%與80%之間的血清型19F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少30%之血清型22F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少40%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於40%與80%之間的血清型22F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少30%之血清型23F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少35%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於35%與80%之間的血清型23F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，至少50%之血清型33F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少60%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於60%與95%之間的血清型33F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F醣係經四氟硼酸1-氰基-4-二甲胺基吡啶鎓鹽(CDAP)活化以形成氰酸酯。接著經活化之多醣可直接或經由間隔子(連接子)基團與載體蛋白質上的胺基偶合。例如，間隔子可能為給出硫醇化多醣之胱胺或半胱胺，該硫醇化多醣可能經由在與經順丁烯二醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或經鹵乙醯化之載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、溴乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBA；SIB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SlAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基SIAB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)或3-[溴乙醯胺基]丙酸琥珀醯亞胺酯(SBAP))反應之後所獲得的硫醚鍵聯與載體偶合。氰酸酯較佳地與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且經胺基衍生之醣係使用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上的羧基與載體蛋白質(例如CRM 197)結合。此等結合物描述於例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中。
用於結合之其他適合的技術係使用碳二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S--NHS、EDC、TSTU。許多該等技術描述於國際專利申請案公開號WO 98/42721中。結合可涉及羰基連接子，其可藉由醣的游離羥基與1,1’-羰基二咪唑(CDI)之反應來形成(參見Bethell等人之(1979) J. Biol. Chern. 254：2572-2574；Hearn等人之(1981) J. Chromatogr. 218：509-518)，隨後與蛋白質反應以形成胺甲酸酯鍵聯。這可涉及將變旋異構物末端還原成一級羥基、視需要地保護/去保護一級羥基、將一級羥基與CDI反應以形成CDI胺甲酸酯中間物、及將CDI胺基甲酸酯中間物與蛋白質上的胺基偶合。
在一實施態樣中，本發明之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F醣結合物係使用還原胺化化學製備。根據本發明，還原胺化涉及兩個步驟：(1)氧化(活化)經純化之醣，(2)還原經活化之醣及載體蛋白質以形成醣結合物(參見例如WO2006/110381、WO2008/079653、WO2008/143709、WO2008/079732、WO2011/110531、WO2012/119972、WO2015110941、WO2015110940、WO2018/144439、WO2018/156491)。
在一實施態樣中，本發明之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F醣結合物係使用還原胺化化學製備。
在另一實施態樣中，本發明之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F和23F醣結合物係使用還原胺化化學製備。
如上文所述及，在氧化之前，可執行經單離之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣之尺寸分級至標的分子量(MW)範圍。因此，在一實施態樣中，經單離之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣係在氧化之前經尺寸分級。
因此，在一實施態樣中，經單離之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F莢膜多醣係在氧化之前經尺寸分級。
在一實施態樣中，經單離之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣係藉由包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合： (a)將該經單離之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣與氧化劑反應以生產經活化之多醣；(b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質複合；且(c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
在氧化步驟(a)之後，認為醣經活化且被稱為「經活化之多醣」。
在一實施態樣中，氧化劑為氧化末端羥基成為醛之任何氧化劑。在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸鹽。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸兩者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO 4-)和原過碘酸鹽(IO 6 5-)兩者及過碘酸鹽的各種鹽(例如過碘酸鈉和過碘酸鉀)。
在一實施態樣中，將經單離之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F莢膜多醣與過碘酸鹽反應。
在一實施態樣中，將經單離之血清型血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、14、15B、18C、19A、19F、22F和23F莢膜多醣與過碘酸鹽反應。
在較佳的實施態樣中，氧化劑為過碘酸鈉。在一實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鹽。在最佳的實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鈉。
當多醣與過碘酸鹽反應時，過碘酸鹽氧化鄰位羥基以形成羰基或醛基且造成C-C鍵斷裂。出於此原因，術語「將多醣與過碘酸鹽反應」包括以過碘酸鹽氧化鄰位羥基。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F多醣與過碘酸鹽反應。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F多醣與0.05至2莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F多醣與0.05至0.2莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F多醣與0.2至0.5莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F多醣與0.5至1.5莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F多醣與1.5至2.0莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一些實施態樣中，將步驟(a)之反應淬滅。因此，在步驟(a)之後，可執行步驟(a’)(參見WO2015110940)。因此，在一實施態樣中，經單離之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣係藉由包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合： (a)將該經單離之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣與氧化劑反應以生產經活化之多醣；(a’)將氧化反應以添加淬滅劑淬滅，得到經活化之多醣；(b)將步驟(a’)的經活化之醣與載體蛋白質複合；且(c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
在一實施態樣中，氧化劑為2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)游離基及N-氯琥珀醯亞胺(NCS)作為助氧化劑。此氧化劑特別適合於氧化血清型12F莢膜多醣。在此實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之醣結合物係使用2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)游離基氧化醣的一級醇成為醛及使用N-氯琥珀醯亞胺(NCS)作為助氧化劑(在下文的「TEMPO/NCS氧化」)來製備，諸如實施例7及WO 2014/097099中所述。因此，在一個態樣中，本發明之來自肺炎鏈球菌血清型12F之醣結合物係藉由包含下列步驟之方法獲得：a)將經單離之血清型12F莢膜多醣與2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)及N-氯琥珀醯亞胺(NCS)反應以生產經活化之多醣；(b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質複合；且(c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物(在下文的「TEMPO/NCS-還原胺化」)。在一個態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之醣結合物係以該方法獲得。
在一實施態樣中，將經單離之血清型血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F莢膜多醣與過碘酸鹽反應且將經單離之血清型12F莢膜多醣與TEMPO/NCS反應。
在一實施態樣中，將經單離之血清型血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、14、15B、18C、19A、19F、22F和23F莢膜多醣與過碘酸鹽反應且將經單離之血清型12F莢膜多醣與TEMPO/NCS反應。
在較佳的實施態樣中，經活化之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F多醣的氧化程度(在本發明文件中亦稱為「活化程度」)係介於2與30之間。
在一實施態樣中，當載體蛋白質為TT時，經活化之血清型1多醣的氧化程度係介於1與15之間(參見例如WO2019/152921的表2)。
在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型1多醣的氧化程度係介於4與10之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型4多醣的氧化程度係介於1與15之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型4多醣的氧化程度係介於1與5之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型5多醣的氧化程度係介於1與15之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型5多醣的氧化程度係介於2與6之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，當載體蛋白質為TT時，經活化之血清型5多醣的氧化程度係介於1與15之間。參見WO2019/152921的表2。
在一實施態樣中，經活化之血清型6A多醣的氧化程度係介於1與15之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型6A多醣的氧化程度係介於5與15之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型6B多醣的氧化程度係介於1與15之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型6B多醣的氧化程度係介於7與13之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型7F多醣的氧化程度係介於1與15之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型7F多醣的氧化程度係介於2與8之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型8多醣的氧化程度係介於1與20之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型8多醣的氧化程度係介於1與17之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型9V多醣的氧化程度係介於1與15之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型9V多醣的氧化程度係介於4與9之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型10A多醣的氧化程度係介於1與15之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型10A多醣的氧化程度係介於1與12之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型11A多醣的氧化程度係介於1與20之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型11A多醣的氧化程度係介於1與15之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型12F多醣的氧化程度係介於1與15之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型12F多醣的氧化程度係介於1與9之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型14多醣的氧化程度係介於1與20之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型14多醣的氧化程度係介於6與13之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型15B多醣的氧化程度係介於1與20之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型15B多醣的氧化程度係介於1與17之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型15B多醣的氧化程度係介於1與15之間當載體蛋白質為TT。參見WO2019/152925的表2。
在一實施態樣中，經活化之血清型18C多醣的氧化程度係介於1與20之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型18C多醣的氧化程度係介於6與14之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型19A多醣的氧化程度係介於1與20之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型19A多醣的氧化程度係介於7與13之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型19F多醣的氧化程度係介於1與20之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型19F多醣的氧化程度係介於6與12 之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型22F多醣係介於1與20。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型22F多醣的氧化程度係介於1與16之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，當載體蛋白質為TT時，經活化之血清型22F多醣的氧化程度係介於1與20之間。參見WO2019/152925的表2。
在一實施態樣中，經活化之血清型23F多醣的氧化程度係介於1與20之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型23F多醣的氧化程度係介於6與14之間。參見WO2019/152921的表1。
在一實施態樣中，經活化之血清型33F多醣的氧化程度係介於1與20之間。在較佳的實施態樣中，當載體蛋白質為CRM 197時，經活化之血清型33F多醣的氧化程度係介於1與15之間。參見WO2019/152921的表1。
可將經活化之多醣及載體蛋白質獨立地凍乾(分開凍乾)或一起凍乾(共同凍乾)(冷凍乾燥)。在一個實施態樣中，將經活化之多醣及載體蛋白質共同凍乾。在另一實施態樣中，將經活化之多醣及載體蛋白質獨立地凍乾。
在一個實施態樣中，凍乾係在非還原糖的存在下發生，可能的非還原糖包括蔗糖、繭蜜糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇(lactitol)和異麥芽酮糖(palatinit)。
在一實施態樣中，在步驟b)的經活化之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於4：1與0.1：1之間。在一實施態樣中，經活化之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於1.5：1與0.5：1之間。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在非質子性溶劑中進行。在一個實施態樣中，還原反應(c)係在基本上由二甲基亞碸(DMSO)所組成之溶液中進行。在一實施態樣中，還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在水性溶劑中進行。
在一實施態樣中，用於血清型6A、6B、7F、8、10A、15B、19A、19F、22F和23F之還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行及用於血清型1、4、5、9V、11A、12F、14和18C之還原反應(c)係在水性溶劑中進行。
在一實施態樣中，用於血清型6A、6B、7F、8、10A、15B、19A、19F、22F和23F之還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行及用於血清型1、4、5、9V、11A、12F、14、18C和33F之還原反應(c)係在水性溶劑中進行。
在一實施態樣中，用於血清型6A、6B、7F、18C、19A、19F和23F之還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行及用於血清型1、4、5、9V、14、22F和33F之還原反應(c)係在水性溶劑中進行。
在一實施態樣中，用於血清型6A、6B、7F、11A、12F、19A、19F和23F之還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行及用於血清型1、4、5、8、9V、10A、14、15B、18C、22F和33F之還原反應(c)係在水性溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下的硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苯甲胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。在一實施態樣中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。在較佳的實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉。在一實施態樣中，還原劑為在鎳存在下的氰基硼氫化鈉(參見WO2018144439)。
在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於0.2與10莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中較佳地使用介於0.5與5莫耳當量之間的還原劑。
在還原反應結束時，可能有未反應之醛基剩餘在結合物中，該等醛基可使用適合的封端劑封端。在一個實施態樣中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH4)。
在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至20莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至3莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。
在與載體蛋白質結合之後，血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F醣結合物可藉由熟習本技術領域者已知的各種技術純化(相對於醣-蛋白質結合物的量富集)。該等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沉澱/溶析、管柱層析術(DEAE或疏水性相互作用層析術)及深層過濾。因此，在一個實施態樣中，用於生產本發明之血清型1醣結合物之製程包含純化在生產之後的醣結合物的步驟。
在特定的實施態樣中，本發明之血清型33F醣結合物係使用還原胺化作用製備。
在其他的實施態樣中，本發明之血清型33F醣結合物係使用eTEC結合來製備(在下文的「經血清型33F eTEC結合之醣結合物」)，諸如WO 2014/027302或WO2015110941中所述(參見實施例1、2和3)。該33F醣結合物包含通過一或多個eTEC間隔子與載體蛋白質共價結合之醣，其中醣係通過胺甲酸酯鍵聯與eTEC間隔子共價結合，且其中載體蛋白質係通過醯胺鍵聯與eTEC間隔子共價結合。本發明之經eTEC連結之醣結合物可以通式(III)表示： 其中構成eTEC間隔子的原子包含在中間框中。
eTEC間隔子包括七個直鏈原子(亦即-C(O)NH(CH 2) 2SCH 2C(O)-)且提供在醣與載體蛋白質之間穩定的硫醚及醯胺鍵。經eTEC連結之醣結合物的合成涉及醣的經活化之羥基與硫烷基胺試劑(例如胱胺或半胱胺酸胺或其鹽)的胺基之反應，形成與醣的胺甲酸酯鍵聯以提供硫醇化醣。一或多個游離巰基的產生係藉由與還原劑反應以提供經活化之硫醇化醣來完成。經活化之硫醇化醣的游離巰基與含胺之殘基上具有一或多個α-鹵乙醯胺基的經活化之載體蛋白質的反應產生用於形成結合物之硫醚鍵，其中載體蛋白質係通過醯胺鍵連接至eTEC間隔子。
在本發明之經血清型33F eTEC連結之醣結合物中，醣可為多醣或寡醣。載體蛋白質可選自如本文所述或熟習本技術領域者已知的任何適合的載體。醣較佳為多醣。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為CRM 197。在一些此等實施態樣中，經eTEC連結之醣結合物包含肺炎鏈球菌血清型33F莢膜多醣。
在特佳的實施態樣中，經eTEC連結之醣結合物包含Pn-33F莢膜多醣，其係通過eTEC間隔子與CRM 197共價結合(經血清型33F eTEC連結之醣結合物)。
在一實施態樣中，本發明之血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F和23F醣結合物係使用還原胺化化學來製備及本發明之血清型33F醣結合物係使用eTEC結合來製備。 1.5 本發明之肺炎鏈球菌血清型15A醣結合物
在一態樣中，本發明關於肺炎鏈球菌血清型15A醣結合物。
肺炎鏈球菌血清型15A多醣之結構為本技術中已知的(參見例如Geno K等人之(2015) Clin Microbiol Rev Vol 28：3, p 871-899)。
在一實施態樣中，在本發明中所使用之莢膜肺炎鏈球菌血清型15A醣為合成的碳水化合物。
然而，在較佳的實施態樣中，根據本發明之細菌多醣的來源可為肺炎鏈球菌血清型15A細菌細胞。可用作為肺炎鏈球菌血清型15A多醣來源之細菌株可自建立的培養物收集中心(諸如例如自鏈球菌參考實驗室(疾病管制與預防中心，Atlanta, GA USA))或臨床樣本獲得。
血清型15A醣可使用熟習本技術的普通技能者已知的單離程序自細菌直接獲得。該等亦可購得(諸如例如來自美國菌種保存中心(ATCC，Manassas, VA USA)(例如參考編號ATCC (537-X))。
若血清型15A醣係自細菌直接獲得，則細菌細胞可在培養基中(較佳地在基於大豆之培養基中)生長。在生產肺炎鏈球菌血清型15A莢膜多醣之細菌細胞發酵之後，可將細菌細胞溶解以生產細胞溶解物。接著可將血清型15A多醣使用本技術中已知的純化技術自細胞溶解物單離，包括使用離心、深層過濾、沉澱、超濾、以活性碳處理、透濾及/或管柱層析術(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381、WO2008/118752和WO2020170190)。接著可將經純化之血清型15A莢膜多醣用於製備醣結合物。
藉由純化來自肺炎鏈球菌細胞溶解物之血清型15A多醣及視需要地尺寸分級經純化之多醣所獲得的經單離之血清型15A莢膜醣可以不同的參數特徵化，包括例如重量平均分子量(Mw)。
多醣的分子量可藉由尺寸排阻層析術(SEC)與多角度雷射光散射檢測器(MALLS)組合來測量。
在較佳的實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣(亦即在進一步處理之前已純化)具有介於100 kDa與2500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣具有介於250 kDa與1500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣具有介於500 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。
考慮在上述範圍中之任一者內的任何整數作為本揭示之一實施態樣。
為了產生具有有利的可過濾性特徵、致免疫性及/或產率之血清型15A結合物，可在與載體蛋白質結合之前執行多醣之尺寸分級至標的分子量範圍。最好縮減經純化之血清型15A多醣的尺寸，同時保留多醣結構的關鍵特徵。可能使用機械式或化學式尺寸分級。
在一實施態樣中，經純化之血清型15A多醣的尺寸係藉由化學水解來縮減。化學水解可能使用弱酸(例如乙酸、甲酸、丙酸)進行。化學水解亦可使用稀釋之強酸(諸如稀釋之氫氯酸、稀釋之硫酸、稀釋之磷酸、稀釋之硝酸或稀釋之過氯酸)進行。
然而，經純化之血清型15A多醣的尺寸較佳地可藉由機械均質化來縮減。在一實施態樣中，經純化之血清型15A多醣的尺寸係藉由高壓均質化來縮減。高壓均質化係藉由將製程流通過具有尺寸足夠小的流徑泵送來達成高剪切速率。剪切速率係藉由使用較大的施加之均質化壓力來增加，且暴露時間可藉由使進料流通過均質機再循環來增加。
在一實施態樣中，將經單離之血清型15A莢膜多醣經尺寸分級至介於50 kDa與500 kDa之間的重量平均分子量。在較佳的實施態樣中，將經單離之血清型15A莢膜多醣經尺寸分級至介於75 kDa與250 kDa之間的重量平均分子量。將經單離之血清型15A莢膜多醣較佳地尺寸分級至少於175 kDa之重量平均分子量。在甚至較佳的實施態樣中，將經單離之血清型15A莢膜多醣經尺寸分級至介於75 kDa與175 kDa之間的重量平均分子量。在最佳的實施態樣中，將經單離之血清型15A莢膜多醣經尺寸分級至介於100 kDa與175 kDa之間的重量平均分子量。經單離之血清型15A多醣較佳地藉由機械均質化來尺寸分級，較佳地藉由高壓均質化。
在一實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣未經尺寸分級。
在一實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣在結合之前具有介於50 kDa與500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣在結合之前具有介於75 kDa與250 kDa之間的重量平均分子量。在較佳的實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣在結合之前具有介於75 kDa與175 kDa之間的重量平均分子量。在甚至較佳的實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣在結合之前具有介於90 kDa與150 kDa之間的重量平均分子量。在最佳的實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與175 kDa之間的重量平均分子量。
醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指多醣在活化之前(亦即在最終的尺寸分級步驟之後但在多醣與活化劑反應之前)的Mw。在本發明之上下文中，15A多醣的Mw未因活化步驟而實質地修飾且併入結合物中之15A多醣的Mw與在活化之前所測量之多醣的Mw類似。
在一實施態樣中，本發明之血清型15A醣結合物包含血清型15A莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與500 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於75 kDa與250 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於75 kDa與175 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於90 kDa與150 kDa之間。
在一些實施態樣中，本發明之血清型15A醣結合物具有介於500 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型15A醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。血清型15A醣結合物較佳地具有介於1,000 kDa與6,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
本發明之血清型15A醣結合物亦可以醣對載體蛋白質之比(重量/重量)特徵化。在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型15A多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.5與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.5與1.5之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)甚至更佳地介於0.7與1.1之間。
使本發明之血清型15A醣結合物特徵化的另一方式係藉由與醣結合之載體蛋白質(例如CRM197、DT或TT)中的離胺酸殘基數量，該醣可以經結合之離胺酸範圍(結合程度)特徵化。由於與多醣的共價鍵聯，使載體蛋白質之離胺酸修飾的證據可藉由使用熟習本技術領域者已知的常規方法之胺基酸分析來獲得。與用於產生結合物材料之載體蛋白質起始材料相比，結合導致回收之離胺酸殘基的數量減少。在較佳的實施態樣中，本發明之血清型15A醣結合物的結合程度係介於2與20之間。本發明之血清型15A醣結合物的結合程度較佳地介於5與10之間。
本發明之血清型15A醣結合物及致免疫性組成物可含有未與載體蛋白質共價結合但仍存在於醣結合物組成物中之游離醣。游離醣可與醣結合物非共價締合(亦即與醣結合物非共價結合、吸附至醣結合物或包埋於醣結合物中或與醣結合物包埋)。
在一實施態樣中，與血清型15A多醣總量相比，血清型15A醣結合物包含少於約40%之游離血清型15A多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型15A多醣總量相比，血清型15A醣結合物包含少於約25%之游離血清型15A多醣。
血清型15A醣結合物亦可以其分子尺寸分布(Kd)特徵化。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於測定結合物之相對分子尺寸分布。尺寸排阻層析術(SEC)係使用於重力饋料管柱中得出結合物之分子尺寸分布輪廓。自介質中的孔排阻之大分子比小分子更快溶析。使用溶析份收集器收集管柱溶析液。溶析份係藉由醣檢定法經比色測試。校準用於測定Kd之管柱以確立完全排阻之分子的溶析份(V0)，(Kd=0)及表示最大滯留的溶析份(Vi)，(Kd=1)。達到特定之樣品屬性的溶析份(Ve)係藉由運算式Kd=(Ve-V0)/(Vi-V0)與Kd關聯。
在一實施態樣中，至少40%之血清型15A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少50%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於50%與90%之間的血清型15A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，血清型15A醣係經四氟硼酸1-氰基-4-二甲胺基吡啶鎓鹽(CDAP)活化以形成氰酸酯。接著經活化之醣可直接或經由間隔子(連接子)基團與載體蛋白質(較佳為CRM 197)上的胺基偶合。例如，間隔子可能為給出硫醇化多醣之胱胺或半胱胺，該多醣可能經由在與經順丁烯二醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或經鹵乙醯化之載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、溴乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBA；SIB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SlAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基SIAB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)或3-[溴乙醯胺基]丙酸琥珀醯亞胺酯(SBAP))反應之後所獲得的硫醚鍵聯與載體偶合。氰酸酯較佳地與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且經胺基衍生之醣係使用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上的羧基與載體蛋白質(例如CRM 197)結合。此等結合物描述於例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中。
用於結合之其他適合的技術係使用碳二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S--NHS、EDC、TSTU。許多該等技術描述於國際專利申請案公開號WO 98/42721中。結合可涉及羰基連接子，其可藉由醣的游離羥基與1,1’-羰基二咪唑(CDI)之反應來形成(參見Bethell等人之(1979) J. Biol. Chern. 254：2572-2574；Hearn等人之(1981) J. Chromatogr. 218：509-518)，隨後與蛋白質反應以形成胺甲酸酯鍵聯。這可涉及將變旋異構物末端還原成一級羥基、視需要地保護/去保護一級羥基、將一級羥基與CDI反應以形成CDI胺甲酸酯中間物、及將CDI胺基甲酸酯中間物與蛋白質上的胺基偶合。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型15A醣結合物係使用還原胺化化學來製備。根據本發明，還原胺化涉及兩個步驟：(1)氧化(活化)經純化之醣，(2)還原經活化之醣及載體蛋白質以形成醣結合物(參見例如WO2006/110381、WO2008/079653、WO2008/143709、WO2008/079732、WO2011/110531、WO2012/119972、WO2015110941、WO2015110940、WO2018/144439、WO2018/156491)。
在一實施態樣中，本發明之血清型15A醣結合物係藉由將經單離之血清型15A莢膜多醣以包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合來製備： (a)將該經單離之血清型15A莢膜多醣與氧化劑反應；(b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質複合；且(c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
如上文所述及，在氧化之前，可執行經單離之血清型15A莢膜多醣之尺寸分級至標的分子量(MW)範圍。因此，在一實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣係在氧化之前經尺寸分級。
在一實施態樣中，經單離之血清型15A莢膜多醣在氧化之前未經尺寸分級。
在一實施態樣中，氧化步驟(a)係在介於4.0與6.0之間的pH下進行。氧化步驟(a)較佳地在介於4.5與5.5之間的pH下進行。
在一實施態樣中，氧化步驟(a)係在約5.0之pH下進行。
在氧化步驟(a)之後，認為醣經活化且被稱為「經活化之多醣」。
在一實施態樣中，本發明之經活化之血清型15A多醣具有介於50 kDa與500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於75 kDa與250 kDa之間。在較佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於75 kDa與175 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於90 kDa與150 kDa之間。
在一實施態樣中，氧化劑為氧化末端羥基成為醛之任何氧化劑。在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸鹽。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸兩者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO 4-)和原過碘酸鹽(IO 6 5-)兩者及過碘酸鹽的各種鹽(例如過碘酸鈉和過碘酸鉀)。
在較佳的實施態樣中，氧化劑為過碘酸鈉。在一實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鹽。在最佳的實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鈉。
當多醣與過碘酸鹽反應時，過碘酸鹽氧化鄰位羥基以形成羰基或醛基且造成C-C鍵斷裂。出於此原因，術語「將多醣與過碘酸鹽反應」包括以過碘酸鹽氧化鄰位羥基。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將多醣與0.1至2莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)較佳地包含將多醣與0.5至1.5莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)最佳地包含將多醣與0.8至1.2莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一實施態樣中，經活化之血清型15A多醣的氧化程度(在本發明文件中亦稱為「活化程度」)係介於2與20之間。在較佳的實施態樣中，經活化之血清型15A多醣的氧化程度係介於2與8之間。在最佳的實施態樣中，經活化之血清型15A多醣的氧化程度為5±2.5。
在一個實施態樣中，經活化之血清型15A多醣及載體蛋白質係在步驟b)之前凍乾。凍乾較佳地發生在步驟a)之後。在一個實施態樣中，經活化之多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾。
在一個實施態樣中，經活化之血清型15A多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾，且經活化之多醣及載體蛋白質係在相同的溶液中回溶。
在一實施態樣中，將經活化之血清型15A多醣及載體蛋白質獨立地凍乾(分開凍乾)。在一實施態樣中，將經活化之血清型15A多醣及載體蛋白質一起凍乾(共同凍乾)。
在一個實施態樣中，凍乾係在非還原糖的存在下發生，可能的非還原糖包括蔗糖、繭蜜糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。在一實施態樣中，糖係選自由蔗糖、繭蜜糖和甘露醇所組成之群組。在一實施態樣中，糖為蔗糖、繭蜜糖或甘露醇。在一實施態樣中，糖為蔗糖。
在一實施態樣中，在步驟b)中的經活化之血清型15A莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於3：1與0.5：1之間。在一實施態樣中，經活化之血清型15A莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於1.5：1與0.5：1之間。經活化之血清型15A莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)較佳地介於1.1：1與0.9：1之間。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在水性溶劑中進行。還原反應(c)較佳地在非質子性溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)的存在下進行。還原反應(c)較佳地在二甲基亞碸(DMSO)的存在下進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行。
還原反應(c)最佳地在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下的硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苯甲胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。在一實施態樣中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。在一實施態樣中，還原劑為在鎳存在下的氰基硼氫化鈉(參見WO2018144439)。在較佳的實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉。
在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於0.2與5莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中較佳地使用介於0.5與2莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中最佳地使用介於0.9與1.1莫耳當量之間的還原劑。
在還原反應結束時，可能有未反應之醛基剩餘在結合物中，該等醛基可使用適合的封端劑封端。在一個實施態樣中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH 4)。
在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至20莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至3莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。
在與載體蛋白質結合之後，血清型15A醣結合物可藉由熟習本技術領域者已知的各種技術純化(相對於醣-蛋白質結合物的量富集)。該等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沉澱/溶析、管柱層析術(DEAE或疏水性相互作用層析術)及深層過濾。因此，在一個實施態樣中，用於生產本發明之血清型15A醣結合物之製程包含純化在生產之後的醣結合物的步驟。 1.6 本發明之肺炎鏈球菌血清型23A醣結合物
在一態樣中，本發明關於肺炎鏈球菌血清型23A醣結合物。
肺炎鏈球菌血清型23A多醣之結構為本技術中已知的(參見例如Ravenscroft N等人之(2017) Carbohydrate Res. Vol. 450, p 19-29及WO2019050814)。血清型23A莢膜多醣之結構為：→4)-β-D-Glc p-(1→3)-[[α-L-Rha p-(1→2)]-[Gro-(2→P→3)]-β-D-Gal p-(1→4)]-β-L-Rha p-(1→。
在一實施態樣中，在本發明中所使用之莢膜肺炎鏈球菌血清型23A醣本發明為合成的碳水化合物。
然而，在較佳的實施態樣中，根據本發明之細菌多醣的來源可為肺炎鏈球菌血清型23A細菌細胞。可用作為肺炎鏈球菌血清型23A多醣來源之細菌株可自建立的培養物收集中心(諸如例如自鏈球菌參考實驗室(疾病管制與預防中心，Atlanta, GA USA))或臨床樣本獲得。
血清型23A醣可使用熟習本技術的普通技能者已知的單離程序自細菌直接獲得。該等亦可購得(諸如例如來自美國菌種保存中心(ATCC，Manassas, VA USA)(例如參考編號ATCC 545-X、編號ATCC 546-X、編號ATCC 547-X))。
若血清型23A醣係自細菌直接獲得，則細菌細胞可在培養基中(較佳地在基於大豆之培養基中)生長。在生產肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣之細菌細胞發酵之後，可將細菌細胞溶解以生產細胞溶解物。接著可將血清型23A多醣使用本技術中已知的純化技術自細胞溶解物單離，包括使用離心、深層過濾、沉澱、超濾、以活性碳處理、透濾及/或管柱層析術(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381、WO2008/118752和WO2020170190)。接著可將經純化之血清型23A莢膜多醣用於製備醣結合物。
藉由純化來自肺炎鏈球菌細胞溶解物之血清型23A多醣及視需要地尺寸分級經純化之多醣所獲得的經單離之血清型23A莢膜醣可以不同的參數特徵化，包括例如重量平均分子量(Mw)。
多醣的分子量可藉由尺寸排阻層析術(SEC)與多角度雷射光散射檢測器(MALLS)組合來測量。
在較佳的實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣(亦即在進一步處理之前已純化)具有介於100 kDa與2500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣具有介於250 kDa與1500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣具有介於500 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。
考慮在上述範圍中之任一者內的任何整數作為本揭示之一實施態樣。
為了產生具有有利的可過濾性特徵、致免疫性及/或產率之血清型23A結合物，可在與載體蛋白質結合之前執行多醣之尺寸分級至標的分子量範圍。最好縮減經純化之血清型23A多醣的尺寸，同時保留多醣結構的關鍵特徵。可能使用機械式或化學式尺寸分級。
經純化之血清型23A多醣的尺寸最佳地藉由機械均質化來縮減。
頃發現不適合使用酸水解來縮減血清型23A多醣的尺寸，如WO2019050814或WO2019050818中所建議。
頃發現酸水解可影響血清型23A多醣結構完整性。頃發現即使相對溫和的水解(例如在80℃下以100 mM乙酸處理2小時)亦導致25%之支鏈鼠李糖(α-L-Rha p-(1→2))損失(參見圖1)。
機械式尺寸分級能不釋放此殘基，自免疫學觀點來看，這很重要。此外，此殘基為過碘酸鹽氧化的主要活化位點。因此，若使用多醣之過碘酸鹽氧化反應(例如在還原胺化化學中的活化步驟)，則對保留此殘基很重要。
因此，在較佳的實施態樣中，經純化之血清型23A多醣的尺寸係藉由機械均質化來縮減。
在一實施態樣中，經純化之血清型23A多醣的尺寸係藉由高壓均質化來縮減。高壓均質化係藉由將製程流通過具有尺寸足夠小的流徑泵送來達成高剪切速率。剪切速率係藉由使用較大的施加之均質化壓力來增加，且暴露時間可藉由使進料流通過均質機再循環來增加。
在最佳的實施態樣中，製備本發明之血清型23A醣結合物之製程不包含血清型23A多醣以酸水解之尺寸分級的步驟。
在一實施態樣中，將經單離之血清型23A莢膜多醣經尺寸分級至介於50 kDa與500 kDa之間的重量平均分子量。在較佳的實施態樣中，將經單離之血清型23A莢膜多醣經尺寸分級至介於75 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。在甚至較佳的實施態樣中，將經單離之血清型23A莢膜多醣經尺寸分級至介於100 kDa與350 kDa之間的重量平均分子量。在最佳的實施態樣中，將經單離之血清型23A莢膜多醣經尺寸分級至介於125 kDa與225 kDa之間的重量平均分子量。經單離之血清型23A多醣較佳地藉由機械均質化來尺寸分級，最佳地藉由高壓均質化。
在一實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣未經尺寸分級。
在一實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣在結合之前具有介於50 kDa與500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣在結合之前具有介於75 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。在甚至較佳的實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與350 kDa之間的重量平均分子量。在最佳的實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣在結合之前具有介於125 kDa與225 kDa之間的重量平均分子量。
醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指多醣在活化之前(亦即在最終的尺寸分級步驟之後但在多醣與活化劑反應之前)的Mw。在本發明之上下文中，23A多醣的Mw未因活化步驟而實質地修飾且併入結合物中之23A多醣的Mw與在活化之前所測量之多醣的Mw類似。
在一實施態樣中，本發明之血清型23A醣結合物包含血清型23A莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與400 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與300 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於120 kDa與240 kDa之間。
在一些實施態樣中，本發明之血清型23A醣結合物具有介於500 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型23A醣結合物具有介於1,000 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。血清型23A醣結合物較佳地具有介於2,000 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
本發明之血清型23A醣結合物亦可以醣對載體蛋白質之比(重量/重量)特徵化。在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型23A多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.5與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.7與1.5之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)甚至更佳地介於0.8與1.4之間。
使本發明之血清型23A醣結合物特徵化的另一方式係藉由與醣結合之載體蛋白質(例如CRM197、DT或TT)中的離胺酸殘基數量，該醣可以經結合之離胺酸範圍(結合程度)特徵化。由於與多醣的共價鍵聯，使載體蛋白質之離胺酸修飾的證據可藉由使用熟習本技術領域者已知的常規方法之胺基酸分析來獲得。與用於產生結合物材料之載體蛋白質起始材料相比，結合導致回收之離胺酸殘基的數量減少。在較佳的實施態樣中，本發明之血清型23A醣結合物的結合程度係介於2與20之間。本發明之血清型23A醣結合物的結合程度較佳地介於5與15之間。
本發明之血清型23A醣結合物及致免疫性組成物可含有未與載體蛋白質共價結合但仍存在於醣結合物組成物中之游離醣。游離醣可與醣結合物非共價締合(亦即與醣結合物非共價結合、吸附至醣結合物或包埋於醣結合物中或與醣結合物包埋)。
在一實施態樣中，與血清型23A多醣總量相比，血清型23A醣結合物包含少於約40%之游離血清型23A多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型23A多醣總量相比，血清型23A醣結合物包含少於約25%之游離血清型23A多醣。
血清型23A醣結合物亦可以其分子尺寸分布(Kd)特徵化。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於測定結合物之相對分子尺寸分布。尺寸排阻層析術(SEC)係使用於重力饋料管柱中得出結合物之分子尺寸分布輪廓。自介質中的孔排阻之大分子比小分子更快溶析。使用溶析份收集器收集管柱溶析液。溶析份係藉由醣檢定法經比色測試。校準用於測定Kd之管柱以確立完全排阻之分子的溶析份(V0)，(Kd=0)及表示最大滯留的溶析份(Vi)，(Kd=1)。達到特定之樣品屬性的溶析份(Ve)係藉由運算式Kd=(Ve-V0)/(Vi-V0)與Kd關聯。
在一實施態樣中，至少40%之血清型23A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少50%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於50%與90%之間的血清型23A醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
血清型23A醣結合物亦可以剩餘在23A多醣中的支鏈鼠李糖殘基量特徵化。如上文所述及，頃發現血清型23A多醣可釋放支鏈鼠李糖殘基(參見圖1)。
因此，在一實施態樣中，當與其中支鏈鼠李糖含量被認為是約100%之天然肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣相比時，本發明之肺炎鏈球菌血清型23A醣結合物包含其中該肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣具有大於75%之支鏈鼠李糖含量的肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣。在一實施態樣中，當與其中支鏈鼠李糖含量被認為是約100%之天然肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣相比時，本發明之肺炎鏈球菌血清型23A醣結合物包含其中該肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣具有大於90%之支鏈鼠李糖含量的肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣。當與其中支鏈鼠李糖含量被認為是約100%之天然肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣相比時，本發明之肺炎鏈球菌血清型23A醣結合物較佳地包含其中該肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣具有大於95%之支鏈鼠李糖含量的肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣。
在最佳的實施態樣中，當與其中支鏈鼠李糖含量被認為是約100%之天然肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣相比時，本發明之肺炎鏈球菌血清型23A醣結合物包含其中該肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣具有約100%之支鏈鼠李糖含量的肺炎鏈球菌血清型23A莢膜多醣。
在一實施態樣中，血清型23A醣係經四氟硼酸1-氰基-4-二甲胺基吡啶鎓鹽(CDAP)活化以形成氰酸酯。接著經活化之醣可直接或經由間隔子(連接子)基團與載體蛋白質(較佳為CRM 197)上的胺基偶合。例如，間隔子可能為給出硫醇化多醣之胱胺或半胱胺，該多醣可能經由在與經順丁烯二醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或經鹵乙醯化之載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、溴乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBA；SIB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SlAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基SIAB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)或3-[溴乙醯胺基]丙酸琥珀醯亞胺酯(SBAP))反應之後所獲得的硫醚鍵聯與載體偶合。氰酸酯較佳地與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且經胺基衍生之醣係使用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上的羧基與載體蛋白質(例如CRM 197)結合。此等結合物描述於例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中。
用於結合之其他適合的技術係使用碳二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S--NHS、EDC、TSTU。許多該等技術描述於國際專利申請案公開號WO 98/42721中。結合可涉及羰基連接子，其可藉由醣的游離羥基與1,1’-羰基二咪唑(CDI)之反應來形成(參見Bethell等人之(1979) J. Biol. Chern. 254：2572-2574；Hearn等人之(1981) J. Chromatogr. 218：509-518)，隨後與蛋白質反應以形成胺甲酸酯鍵聯。這可涉及將變旋異構物末端還原成一級羥基、視需要地保護/去保護一級羥基、將一級羥基與CDI反應以形成CDI胺甲酸酯中間物、及將CDI胺基甲酸酯中間物與蛋白質上的胺基偶合。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型23A醣結合物係使用還原胺化化學來製備。根據本發明，還原胺化涉及兩個步驟：(1)氧化(活化)經純化之醣，(2)還原經活化之醣及載體蛋白質以形成醣結合物(參見例如WO2006/110381、WO2008/079653、WO2008/143709、WO2008/079732、WO2011/110531、WO2012/119972、WO2015110941、WO2015110940、WO2018/144439、WO2018/156491)。
在一實施態樣中，本發明之血清型23A醣結合物係藉由將經單離之血清型23A莢膜多醣以包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合來製備： (a)將該經單離之血清型23A莢膜多醣與氧化劑反應；(b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質複合；且(c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
如上文所述及，在氧化之前，可執行經單離之血清型23A莢膜多醣之尺寸分級至標的分子量(MW)範圍。因此，在一實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣係在氧化之前經尺寸分級。
在較佳的實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣的尺寸可藉由機械均質化來縮減。在一實施態樣中，經單離之血清型23A多醣的尺寸係藉由高壓均質化來縮減。在最佳的實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣不以酸水解進行尺寸分級。
在一實施態樣中，經單離之血清型23A莢膜多醣在氧化之前未經尺寸分級。
在一實施態樣中，氧化步驟(a)係在介於4.5與6.5之間的pH下進行。氧化步驟(a)較佳地在介於5.0與6.0之間的pH下進行。
在一實施態樣中，氧化步驟(a)係在約5.0之pH下進行。
在氧化步驟(a)之後，認為醣經活化且被稱為「經活化之多醣」。
在一實施態樣中，本發明之經活化之血清型23A多醣具有介於50 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與250 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於120 kDa與200 kDa之間。
在一實施態樣中，本發明之經活化之血清型23A多醣保留至少80%之支鏈鼠李糖。在一實施態樣中，本發明之經活化之血清型23A多醣保留至少85%之支鏈鼠李糖。在一實施態樣中，本發明之經活化之血清型23A多醣保留至少90%之支鏈鼠李糖。在較佳的實施態樣中，本發明之經活化之血清型23A多醣保留至少95%之支鏈鼠李糖。
在較佳的實施態樣中，本發明之經活化之血清型23A多醣保留至少96%之支鏈鼠李糖。
在一實施態樣中，氧化劑為氧化末端羥基成為醛之任何氧化劑。在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸鹽。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸兩者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO 4-)和原過碘酸鹽(IO 6 5-)兩者及過碘酸鹽的各種鹽(例如過碘酸鈉和過碘酸鉀)。
在較佳的實施態樣中，氧化劑為過碘酸鈉。在一實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鹽。在最佳的實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鈉。
當多醣與過碘酸鹽反應時，過碘酸鹽氧化鄰位羥基以形成羰基或醛基且造成C-C鍵斷裂。出於此原因，術語「將多醣與過碘酸鹽反應」包括以過碘酸鹽氧化鄰位羥基。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將多醣與0.1至2莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)較佳地包含將多醣與0.2至1.5莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)最佳地包含將多醣與0.3至0.5莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一實施態樣中，經活化之血清型23A多醣的氧化程度(在本發明文件中亦稱為「活化程度」)係介於2與20之間。在較佳的實施態樣中，經活化之血清型23A多醣的氧化程度係介於2與8之間。在最佳的實施態樣中，經活化之血清型23A多醣的氧化程度為5±2.5。
在一個實施態樣中，經活化之血清型23A多醣及載體蛋白質係在步驟b)之前凍乾。凍乾較佳地發生在步驟a)之後。在一個實施態樣中，經活化之多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾。
在一個實施態樣中，經活化之血清型23A多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾，且經活化之多醣及載體蛋白質係在相同的溶液中回溶。
在一實施態樣中，將經活化之血清型23A多醣及載體蛋白質獨立地凍乾(分開凍乾)。在一實施態樣中，將經活化之血清型23A多醣及載體蛋白質一起凍乾(共同凍乾)。
在一個實施態樣中，凍乾係在非還原糖的存在下發生，可能的非還原糖包括蔗糖、繭蜜糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。在一實施態樣中，糖係選自由蔗糖、繭蜜糖和甘露醇所組成之群組。在一實施態樣中，糖為蔗糖、繭蜜糖和甘露醇。在一實施態樣中，糖為蔗糖。
在一實施態樣中，在步驟b)中的經活化之血清型23A莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於2：1與0.5：1之間。在一實施態樣中，經活化之血清型23A莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於1.2：1與0.6：1之間。經活化之血清型23A莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)較佳地介於0.9：1與0.7：1之間。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在水性溶劑中進行。還原反應(c)較佳地在非質子性溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)的存在下進行。還原反應(c)較佳地在二甲基亞碸(DMSO)的存在下進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行。
還原反應(c)最佳地在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下的硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苯甲胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。在一實施態樣中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。在一實施態樣中，還原劑為在鎳存在下的氰基硼氫化鈉(參見WO2018144439)。在較佳的實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉。
在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於0.2與5莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中較佳地使用介於0.2與1.5莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中最佳地使用介於0.5與1.0莫耳當量之間的還原劑。
在還原反應結束時，可能有未反應之醛基剩餘在結合物中，該等醛基可使用適合的封端劑封端。在一個實施態樣中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH 4)。
在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至20莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至3莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。
在與載體蛋白質結合之後，血清型23A醣結合物可藉由熟習本技術領域者已知的各種技術純化(相對於醣-蛋白質結合物的量富集)。該等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沉澱/溶析、管柱層析術(DEAE或疏水性相互作用層析術)及深層過濾。因此，在一個實施態樣中，用於生產本發明之血清型23A醣結合物之製程包含純化在生產之後的醣結合物的步驟。 1.7 本發明之肺炎鏈球菌血清型23B醣結合物
在一態樣中，本發明關於肺炎鏈球菌血清型23B醣結合物。
肺炎鏈球菌血清型23B多醣之結構為本技術中已知的(參見例如Ravenscroft N等人之(2017) Carbohydrate Res. Vol. 450, p 19-29及WO2019050814)。血清型23A莢膜多醣之結構為：→4)-β-D-Glc p-(1→4)-[Gro-(2→P→3)]- β-D-Gal p-(1→4)- β-L-Rha p-(1→。
在一實施態樣中，在本發明中所使用之莢膜肺炎鏈球菌血清型23B醣為合成的碳水化合物。
然而，在較佳的實施態樣中，根據本發明之細菌多醣的來源可為肺炎鏈球菌血清型23B細菌細胞。可用作為肺炎鏈球菌血清型23B多醣來源之細菌株可自建立的培養物收集中心(諸如例如自鏈球菌參考實驗室(疾病管制與預防中心，Atlanta, GA USA))或臨床樣本獲得。
血清型23B醣可使用熟習本技術的普通技能者已知的單離程序自細菌直接獲得。該等亦可購得(諸如例如來自美國菌種保存中心(ATCC，Manassas, VA USA)(例如參考編號ATCC 548-X、編號ATCC 549-X、編號ATCC 550-X))。
若血清型23B醣係自細菌直接獲得，則細菌細胞可在培養基中(較佳地在基於大豆之培養基中)生長。在生產肺炎鏈球菌血清型23B莢膜多醣之細菌細胞發酵之後，可將細菌細胞溶解以生產細胞溶解物。接著可將血清型23B多醣使用本技術中已知的純化技術自細胞溶解物單離，包括使用離心、深層過濾、沉澱、超濾、以活性碳處理、透濾及/或管柱層析術(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381、WO2008/118752和WO2020170190)。接著可將經純化之血清型23B莢膜多醣用於製備醣結合物。
藉由純化來自肺炎鏈球菌細胞溶解物之血清型23B多醣及視需要地尺寸分級經純化之多醣所獲得的經單離之血清型23B莢膜醣可以不同的參數特徵化，包括例如重量平均分子量(Mw)。
多醣的分子量可藉由尺寸排阻層析術(SEC)與多角度雷射光散射檢測器(MALLS)組合來測量。
在較佳的實施態樣中，經單離之血清型23B莢膜多醣(亦即在進一步處理之前已純化)具有介於100 kDa與2500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型23B莢膜多醣具有介於250 kDa與2000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型23B莢膜多醣具有介於300 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。
考慮在上述範圍中之任一者內的任何整數作為本揭示之一實施態樣。
為了產生具有有利的可過濾性特徵、致免疫性及/或產率之血清型23B結合物，可在與載體蛋白質結合之前執行多醣之尺寸分級至標的分子量範圍。最好縮減經純化之血清型23B多醣的尺寸，同時保留多醣結構的關鍵特徵。可能使用機械式或化學式尺寸分級。
在一實施態樣中，經純化之血清型23B多醣的尺寸係藉由化學水解來縮減。化學水解可能使用弱酸(例如乙酸、甲酸、丙酸)進行。化學水解亦可使用稀釋之強酸(諸如稀釋之氫氯酸、稀釋之硫酸、稀釋之磷酸、稀釋之硝酸或稀釋之過氯酸)進行。
然而，經純化之血清型23B多醣的尺寸較佳地可藉由機械均質化來縮減。在一實施態樣中，經純化之血清型23B多醣的尺寸係藉由高壓均質化來縮減。高壓均質化係藉由將製程流通過具有尺寸足夠小的流徑泵送來達成高剪切速率。剪切速率係藉由使用較大的施加之均質化壓力來增加，且暴露時間可藉由使進料流通過均質機再循環來增加。
在一實施態樣中，將經單離之血清型23B莢膜多醣經尺寸分級至介於50 kDa與750 kDa之間的重量平均分子量。在較佳的實施態樣中，將經單離之血清型23B莢膜多醣經尺寸分級至介於75 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。在甚至較佳的實施態樣中，將經單離之血清型23B莢膜多醣經尺寸分級至介於100 kDa與250 kDa之間的重量平均分子量。經單離之血清型23B多醣較佳地藉由機械均質化來尺寸分級，最佳地藉由高壓均質化。
在一實施態樣中，經單離之血清型23B莢膜多醣未經尺寸分級。
在一實施態樣中，經單離之血清型23B莢膜多醣在結合之前具有介於50 kDa與750 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型23B莢膜多醣在結合之前具有介於75 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。在甚至較佳的實施態樣中，經單離之血清型23B莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與250 kDa之間的重量平均分子量。
醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指多醣在活化之前(亦即在最終的尺寸分級步驟之後但在多醣與活化劑反應之前)的Mw。在本發明之上下文中，23B多醣的Mw未因活化步驟而實質地修飾且併入結合物中之23B多醣的Mw與在活化之前所測量之多醣的Mw類似。
在一實施態樣中，本發明之血清型23B醣結合物包含血清型23B莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於40 kDa與600 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與300 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與200 kDa之間。
在一些實施態樣中，本發明之血清型23B醣結合物具有介於250 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型23B醣結合物具有介於500 kDa與4,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。血清型23B醣結合物較佳地具有介於700 kDa與2,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
本發明之血清型23B醣結合物亦可以醣對載體蛋白質之比(重量/重量)特徵化。在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型23B多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.5與1.5之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)甚至更佳地介於0.6與1.3之間。
使本發明之血清型23B醣結合物特徵化的另一方式係藉由與醣結合之載體蛋白質(例如CRM197、DT或TT)中的離胺酸殘基數量，該醣可以經結合之離胺酸範圍(結合程度)特徵化。由於與多醣的共價鍵聯，使載體蛋白質之離胺酸修飾的證據可藉由使用熟習本技術領域者已知的常規方法之胺基酸分析來獲得。與用於產生結合物材料之載體蛋白質起始材料相比，結合導致回收之離胺酸殘基的數量減少。在較佳的實施態樣中，本發明之血清型23B醣結合物的結合程度係介於2與15之間。本發明之血清型23B醣結合物的結合程度較佳地介於5與12之間。
本發明之血清型23B醣結合物及致免疫性組成物可含有未與載體蛋白質共價結合但仍存在於醣結合物組成物中之游離醣。游離醣可與醣結合物非共價締合(亦即與醣結合物非共價結合、吸附至醣結合物或包埋於醣結合物中或與醣結合物包埋)。
在一實施態樣中，與血清型23B多醣總量相比，血清型23B醣結合物包含少於約40%之游離血清型23B多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型23B多醣總量相比，血清型23B醣結合物包含少於約25%之游離血清型23B多醣。
血清型23B醣結合物亦可以其分子尺寸分布(Kd)特徵化。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於測定結合物之相對分子尺寸分布。尺寸排阻層析術(SEC)係使用於重力饋料管柱中得出結合物之分子尺寸分布輪廓。自介質中的孔排阻之大分子比小分子更快溶析。使用溶析份收集器收集管柱溶析液。溶析份係藉由醣檢定法經比色測試。校準用於測定Kd之管柱以確立完全排阻之分子的溶析份(V0)，(Kd=0)及表示最大滯留的溶析份(Vi)，(Kd=1)。達到特定之樣品屬性的溶析份(Ve)係藉由運算式Kd=(Ve-V0)/(Vi-V0)與Kd關聯。
在一實施態樣中，至少30%之血清型23B醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少35%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於40%與60%之間的血清型23B醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，血清型23B醣係經四氟硼酸1-氰基-4-二甲胺基吡啶鎓鹽(CDAP)活化以形成氰酸酯。接著經活化之醣可直接或經由間隔子(連接子)基團與載體蛋白質(較佳為CRM 197)上的胺基偶合。例如，間隔子可能為給出硫醇化多醣之胱胺或半胱胺，該多醣可能經由在與經順丁烯二醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或經鹵乙醯化之載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、溴乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBA；SIB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SlAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基SIAB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)或3-[溴乙醯胺基]丙酸琥珀醯亞胺酯(SBAP))反應之後所獲得的硫醚鍵聯與載體偶合。氰酸酯較佳地與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且經胺基衍生之醣係使用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上的羧基與載體蛋白質(例如CRM 197)結合。此等結合物描述於例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中。
用於結合之其他適合的技術係使用碳二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S--NHS、EDC、TSTU。許多該等技術描述於國際專利申請案公開號WO 98/42721中。結合可涉及羰基連接子，其可藉由醣的游離羥基與1,1’-羰基二咪唑(CDI)之反應來形成(參見Bethell等人之(1979) J. Biol. Chern. 254：2572-2574；Hearn等人之(1981) J. Chromatogr. 218：509-518)，隨後與蛋白質反應以形成胺甲酸酯鍵聯。這可涉及將變旋異構物末端還原成一級羥基、視需要地保護/去保護一級羥基、將一級羥基與CDI反應以形成CDI胺甲酸酯中間物、及將CDI胺基甲酸酯中間物與蛋白質上的胺基偶合。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型23B醣結合物係使用還原胺化化學來製備。根據本發明，還原胺化涉及兩個步驟：(1)氧化(活化)經純化之醣，(2)還原經活化之醣及載體蛋白質以形成醣結合物(參見例如WO2006/110381、WO2008/079653、WO2008/143709、WO2008/079732、WO2011/110531、WO2012/119972、WO2015110941、WO2015110940、WO2018/144439、WO2018/156491)。
在一實施態樣中，本發明之血清型23B醣結合物係藉由將經單離之血清型23B莢膜多醣以包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合來製備： (a)將該經單離之血清型23B莢膜多醣與氧化劑反應；(b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質複合；且(c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
如上文所述及，在氧化之前，可執行經單離之血清型23B莢膜多醣之尺寸分級至標的分子量(MW)範圍。因此，在一實施態樣中，經單離之血清型23B莢膜多醣係在氧化之前經尺寸分級。
在較佳的實施態樣中，經單離之血清型23B莢膜多醣的尺寸可藉由機械均質化來縮減。在一實施態樣中，經單離之血清型23B多醣的尺寸係藉由高壓均質化來縮減。
在一實施態樣中，經單離之血清型23B莢膜多醣在氧化之前未經尺寸分級。
在一實施態樣中，氧化步驟(a)係在介於4.0與6.5之間的pH下進行。氧化步驟(a)較佳地在介於4.5與5.5之間的pH下進行。
在一實施態樣中，氧化步驟(a)係在約5.0之pH下進行。
在氧化步驟(a)之後，認為醣經活化且被稱為「經活化之多醣」。
在一實施態樣中，本發明之經活化之血清型23B多醣具有介於40 kDa與600 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與300 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與200 kDa之間。
在一實施態樣中，氧化劑為氧化末端羥基成為醛之任何氧化劑。在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸鹽。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸兩者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO 4-)和原過碘酸鹽(IO 6 5-)兩者及過碘酸鹽的各種鹽(例如過碘酸鈉和過碘酸鉀)。
在較佳的實施態樣中，氧化劑為過碘酸鈉。在一實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鹽。在最佳的實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鈉。
當多醣與過碘酸鹽反應時，過碘酸鹽氧化鄰位羥基以形成羰基或醛基且造成C-C鍵斷裂。出於此原因，術語「將多醣與過碘酸鹽反應」包括以過碘酸鹽氧化鄰位羥基。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將多醣與0.05至1莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)較佳地包含將多醣與0.1至0.3莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)最佳地包含將多醣與約0.2莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一實施態樣中，經活化之血清型23B多醣的氧化程度(在本發明文件中亦稱為「活化程度」)係介於2與20之間。在較佳的實施態樣中，經活化之血清型23B多醣的氧化程度係介於4與15之間。在最佳的實施態樣中，經活化之血清型23B多醣的氧化程度為9±3。
在一個實施態樣中，經活化之血清型23B多醣及載體蛋白質係在步驟b)之前凍乾。凍乾較佳地發生在步驟a)之後。在一個實施態樣中，經活化之多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾。
在一個實施態樣中，經活化之血清型23B多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾，且經活化之多醣及載體蛋白質係在相同的溶液中回溶。
在一實施態樣中，將經活化之血清型23B多醣及載體蛋白質獨立地凍乾(分開凍乾)。在一實施態樣中，將經活化之血清型23B多醣及載體蛋白質一起凍乾(共同凍乾)。
在一個實施態樣中，凍乾係在非還原糖的存在下發生，可能的非還原糖包括蔗糖、繭蜜糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。在一實施態樣中，糖係選自由蔗糖、繭蜜糖和甘露醇所組成之群組。在一實施態樣中，糖為蔗糖、繭蜜糖或甘露醇。在一實施態樣中，糖為蔗糖。
在一實施態樣中，在步驟b)中的經活化之血清型23B莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於2：1與0.5：1之間。在一實施態樣中，經活化之血清型23B莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於1.2：1與0.6：1之間。經活化之血清型23B莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)較佳地介於0.9：1與0.7：1之間。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在水性溶劑中進行。還原反應(c)較佳地在非質子性溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)的存在下進行。還原反應(c)較佳地在二甲基亞碸(DMSO)的存在下進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行。
還原反應(c)最佳地在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下的硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苯甲胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。在一實施態樣中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。在一實施態樣中，還原劑為在鎳存在下的氰基硼氫化鈉(參見WO2018144439)。在較佳的實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉。
在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於0.2與5莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中較佳地使用介於0.5與1.5莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中最佳地使用介於0.9與1.1莫耳當量之間的還原劑。
在還原反應結束時，可能有未反應之醛基剩餘在結合物中，該等醛基可使用適合的封端劑封端。在一個實施態樣中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH 4)。
在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至20莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至3莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。
在與載體蛋白質結合之後，血清型23B醣結合物可藉由熟習本技術領域者已知的各種技術純化(相對於醣-蛋白質結合物的量富集)。該等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沉澱/溶析、管柱層析術(DEAE或疏水性相互作用層析術)及深層過濾。因此，在一個實施態樣中，用於生產本發明之血清型23B醣結合物之製程包含純化在生產之後的醣結合物的步驟。 1.8 本發明之肺炎鏈球菌血清型24F醣結合物
在一態樣中，本發明關於肺炎鏈球菌血清型24F醣結合物。
肺炎鏈球菌血清型24F多醣之結構為本技術中已知的(參見例如WO2019050815)。
在一實施態樣中，在本發明中所使用之莢膜肺炎鏈球菌血清型24F醣為合成的碳水化合物。
然而，在較佳的實施態樣中，根據本發明之細菌多醣的來源可為肺炎鏈球菌血清型24F細菌細胞。可用作為肺炎鏈球菌血清型24F多醣來源之細菌株可自建立的培養物收集中心(諸如例如自鏈球菌參考實驗室(疾病管制與預防中心，Atlanta, GA USA))或臨床樣本獲得。
血清型24F醣可使用熟習本技術的普通技能者已知的單離程序自細菌直接獲得。該等亦可購得(諸如例如來自美國菌種保存中心(ATCC，Manassas, VA USA)(例如參考編號ATCC 551-X、編號ATCC 552-X、編號ATCC 553-X))。
若血清型24F醣係自細菌直接獲得，則細菌細胞可在培養基中(較佳地在基於大豆之培養基中)生長。在生產肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣之細菌細胞發酵之後，可將細菌細胞溶解以生產細胞溶解物。接著可將血清型24F多醣使用本技術中已知的純化技術自細胞溶解物單離，包括使用離心、深層過濾、沉澱、超濾、以活性碳處理、透濾及/或管柱層析術(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381、WO2008/118752和WO2020170190)。接著可將經純化之血清型24F莢膜多醣用於製備醣結合物。
藉由純化來自肺炎鏈球菌細胞溶解物之血清型24F多醣及視需要地尺寸分級經純化之多醣所獲得的經單離之血清型24F莢膜醣可以不同的參數特徵化，包括例如重量平均分子量(Mw)。
多醣的分子量可藉由尺寸排阻層析術(SEC)與多角度雷射光散射檢測器(MALLS)組合來測量。
在較佳的實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣(亦即在進一步處理之前已純化)具有介於100 kDa與2500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣具有介於250 kDa與2000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣具有介於500 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。
考慮在上述範圍中之任一者內的任何整數作為本揭示之一實施態樣。
為了產生具有有利的可過濾性特徵、致免疫性及/或產率之血清型24F結合物，可在與載體蛋白質結合之前執行多醣之尺寸分級至標的分子量範圍。最好縮減經純化之血清型24F多醣的尺寸，同時保留多醣結構的關鍵特徵。可能使用機械式或化學式尺寸分級。
經純化之血清型24F多醣的尺寸最佳地可藉由機械均質化來縮減。
頃發現不適合使用酸水解來縮減血清型24F多醣的尺寸，如WO2019050815或WO2019050818中所建議。
頃發現酸水解可影響血清型24F多醣結構完整性。頃發現即使相對溫和的水解(例如在80℃下以100 mM乙酸處理約2小時)亦導致25%之支鏈核糖殘基損失(參見圖2)。
機械式尺寸分級能不釋放此殘基，自免疫學觀點來看，其可能很重要。
因此，在較佳的實施態樣中，經純化之血清型24F多醣的尺寸可藉由機械均質化來縮減。
在一實施態樣中，經純化之血清型24F多醣的尺寸係藉由高壓均質化來縮減。高壓均質化係藉由將製程流通過具有尺寸足夠小的流徑泵送來達成高剪切速率。剪切速率係藉由使用較大的施加之均質化壓力來增加，且暴露時間可藉由使進料流通過均質機再循環來增加。
在最佳的實施態樣中，製備本發明之血清型24F醣結合物之製程不包含血清型24F多醣以酸水解之尺寸分級的步驟。
在一實施態樣中，將經單離之血清型24F莢膜多醣經尺寸分級至介於50 kDa與500 kDa之間的重量平均分子量。在較佳的實施態樣中，將經單離之血清型24F莢膜多醣經尺寸分級至介於75 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。在甚至較佳的實施態樣中，將經單離之血清型24F莢膜多醣經尺寸分級至介於125 kDa與275 kDa之間的重量平均分子量。在最佳的實施態樣中，將經單離之血清型24F莢膜多醣經尺寸分級至介於125 kDa與225 kDa之間的重量平均分子量。經單離之血清型24F多醣較佳地藉由機械均質化來尺寸分級，最佳地藉由高壓均質化。
在一實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣未經尺寸分級。
在一實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣在結合之前具有介於50 kDa與500 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣在結合之前具有介於75 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量。在甚至較佳的實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣在結合之前具有介於125 kDa與275kDa之間的重量平均分子量。在最佳的實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣在結合之前具有介於125 kDa與225 kDa之間的重量平均分子量。
醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指多醣在活化之前(亦即在最終的尺寸分級步驟之後但在多醣與活化劑反應之前)的Mw。在本發明之上下文中，24F多醣的Mw未因活化步驟而實質地修飾且併入結合物中之24F多醣的Mw與在活化之前所測量之多醣的Mw類似。
在一實施態樣中，本發明之血清型24F醣結合物包含血清型24F莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與400 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於120 kDa與250 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於120 kDa與200 kDa之間。
在一些實施態樣中，本發明之血清型24F醣結合物具有介於500 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型24F醣結合物具有介於1,500 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。血清型24F醣結合物較佳地具有介於3,000 kDa與6,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
本發明之血清型24F醣結合物亦可以醣對載體蛋白質之比(重量/重量)特徵化。在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型24F多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.5與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.7與1.5之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)甚至更佳地介於0.8與1.4之間。
使本發明之血清型24F醣結合物特徵化的另一方式係藉由與醣結合之載體蛋白質(例如CRM197、DT或TT)中的離胺酸殘基數量，該醣可以經結合之離胺酸範圍(結合程度)特徵化。由於與多醣的共價鍵聯，使載體蛋白質之離胺酸修飾的證據可藉由使用熟習本技術領域者已知的常規方法之胺基酸分析來獲得。與用於產生結合物材料之載體蛋白質起始材料相比，結合導致回收之離胺酸殘基的數量減少。在較佳的實施態樣中，本發明之血清型24F醣結合物的結合程度係介於2與15之間。本發明之血清型24F醣結合物的結合程度較佳地介於5與12之間。
本發明之血清型24F醣結合物及致免疫性組成物可含有未與載體蛋白質共價結合但仍存在於醣結合物組成物中之游離醣。游離醣可與醣結合物非共價締合(亦即與醣結合物非共價結合、吸附至醣結合物或包埋於醣結合物中或與醣結合物包埋)。
在一實施態樣中，與血清型24F多醣總量相比，血清型24F醣結合物包含少於約40%之游離血清型24F多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型24F多醣總量相比，血清型24F醣結合物包含少於約25%之游離血清型24F多醣。
血清型24F醣結合物亦可以其分子尺寸分布(Kd)特徵化。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於測定結合物之相對分子尺寸分布。尺寸排阻層析術(SEC)係使用於重力饋料管柱中得出結合物之分子尺寸分布輪廓。自介質中的孔排阻之大分子比小分子更快溶析。使用溶析份收集器收集管柱溶析液。溶析份係藉由醣檢定法經比色測試。校準用於測定Kd之管柱以確立完全排阻之分子的溶析份(V0)，(Kd=0)及表示最大滯留的溶析份(Vi)，(Kd=1)。達到特定之樣品屬性的溶析份(Ve)係藉由運算式Kd=(Ve-V0)/(Vi-V0)與Kd關聯。
在一實施態樣中，至少40%之血清型24F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少50%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於50%與90%之間的血清型24F醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
血清型24F醣結合物亦可以剩餘在24F多醣中的支鏈核糖殘基量特徵化。如上文所述及，頃發現血清型24F多醣可釋放支鏈核糖殘基(參見圖7)。
因此，在一實施態樣中，當與其中核糖含量被認為是約100%之天然肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣相比時，本發明之肺炎鏈球菌血清型24F醣結合物包含其中該肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣具有大於75%之核糖含量的肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣。在一實施態樣中，當與其中核糖含量被認為是約100%之天然肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣相比時，本發明之肺炎鏈球菌血清型24F醣結合物包含其中該肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣具有大於90%之核糖含量的肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣。當與其中核糖含量被認為是約100%之天然肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣相比時，本發明之肺炎鏈球菌血清型24F醣結合物較佳地包含其中該肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣具有大於95%之核糖含量的肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣。
在最佳的實施態樣中，當與其中核糖含量被認為是約100%之天然肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣相比時，本發明之肺炎鏈球菌血清型24F醣結合物包含其中該肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣具有約100%之核糖含量的肺炎鏈球菌血清型24F莢膜多醣。
在一實施態樣中，血清型24F醣係經四氟硼酸1-氰基-4-二甲胺基吡啶鎓鹽(CDAP)活化以形成氰酸酯。接著經活化之醣可直接或經由間隔子(連接子)基團與載體蛋白質(較佳為CRM 197)上的胺基偶合。例如，間隔子可能為給出硫醇化多醣之胱胺或半胱胺，該多醣可能經由在與經順丁烯二醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或經鹵乙醯化之載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、溴乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBA；SIB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SlAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基SIAB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)或3-[溴乙醯胺基]丙酸琥珀醯亞胺酯(SBAP))反應之後所獲得的硫醚鍵聯與載體偶合。氰酸酯較佳地與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且經胺基衍生之醣係使用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上的羧基與載體蛋白質(例如CRM 197)結合。此等結合物描述於例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中。
用於結合之其他適合的技術係使用碳二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S--NHS、EDC、TSTU。許多該等技術描述於國際專利申請案公開號WO 98/42721中。結合可涉及羰基連接子，其可藉由醣的游離羥基與1,1’-羰基二咪唑(CDI)之反應來形成(參見Bethell等人之(1979) J. Biol. Chern. 254：2572-2574；Hearn等人之(1981) J. Chromatogr. 218：509-518)，隨後與蛋白質反應以形成胺甲酸酯鍵聯。這可涉及將變旋異構物末端還原成一級羥基、視需要地保護/去保護一級羥基、將一級羥基與CDI反應以形成CDI胺甲酸酯中間物、及將CDI胺基甲酸酯中間物與蛋白質上的胺基偶合。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型24F醣結合物係使用還原胺化化學來製備。根據本發明，還原胺化涉及兩個步驟：(1)氧化(活化)經純化之醣，(2)還原經活化之醣及載體蛋白質以形成醣結合物。
在一實施態樣中，本發明之血清型24F醣結合物係藉由將經單離之血清型24F莢膜多醣以包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合來製備：(a)將該經單離之血清型24F莢膜多醣與氧化劑反應；(b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質複合；且(c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
如上文所述及，在氧化之前，可執行經單離之血清型24F莢膜多醣之尺寸分級至標的分子量(MW)範圍。因此，在一實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣係在氧化之前經尺寸分級。
在較佳的實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣的尺寸可藉由機械均質化來縮減。在一實施態樣中，經單離之血清型24F多醣的尺寸係藉由高壓均質化來縮減。在最佳的實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣不以酸水解進行尺寸分級。
在一實施態樣中，經單離之血清型24F莢膜多醣在氧化之前未經尺寸分級。
在一實施態樣中，氧化步驟(a)係在介於4.5與6.5之間的pH下進行。氧化步驟(a)較佳地在介於5.0與6.0之間的pH下進行。
在一實施態樣中，氧化步驟(a)係在約5.0之pH下進行。
在氧化步驟(a)之後，認為醣經活化且被稱為「經活化之多醣」。
在一實施態樣中，本發明之經活化之血清型24F多醣具有介於50 kDa與400 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於120 kDa與250 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於120 kDa與200 kDa之間。
在一實施態樣中，本發明之經活化之血清型24F多醣保留至少75%之支鏈核糖。在一實施態樣中，本發明之經活化之血清型24F多醣保留至少90%之支鏈核糖。在較佳的實施態樣中，本發明之經活化之血清型24F多醣保留至少95%之支鏈核糖。
在最佳的實施態樣中，本發明之經活化之血清型24F多醣保留約100%之支鏈核糖。
在一實施態樣中，氧化劑為氧化末端羥基成為醛之任何氧化劑。在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸鹽。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸兩者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO 4-)和原過碘酸鹽(IO 6 5-)兩者及過碘酸鹽的各種鹽(例如過碘酸鈉和過碘酸鉀)。
在較佳的實施態樣中，氧化劑為過碘酸鈉。在一實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鹽。在最佳的實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鈉。
當多醣與過碘酸鹽反應時，過碘酸鹽氧化鄰位羥基以形成羰基或醛基且造成C-C鍵斷裂。出於此原因，術語「將多醣與過碘酸鹽反應」包括以過碘酸鹽氧化鄰位羥基。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將多醣與0.1至2莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)較佳地包含將多醣與0.5至1.5莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)最佳地包含將多醣與0.9至1.1莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一實施態樣中，經活化之血清型24F多醣的氧化程度(在本發明文件中亦稱為「活化程度」)係介於2與20之間。在較佳的實施態樣中，經活化之血清型24F多醣的氧化程度係介於4與15之間。在最佳的實施態樣中，經活化之血清型24F多醣的氧化程度為9±3。
在一個實施態樣中，經活化之血清型24F多醣及載體蛋白質係在步驟b)之前凍乾。凍乾較佳地發生在步驟a)之後。在一個實施態樣中，經活化之多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾。
在一個實施態樣中，經活化之血清型24F多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾，且經活化之多醣及載體蛋白質係在相同的溶液中回溶。
在一實施態樣中，經活化之血清型24F多醣及載體蛋白質獨立地凍乾(分開凍乾)。在一實施態樣中，經活化之血清型24F將多醣及載體蛋白質一起凍乾(共同凍乾)。
在一個實施態樣中，凍乾係在非還原糖的存在下發生，可能的非還原糖包括蔗糖、繭蜜糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。在一實施態樣中，糖係選自由蔗糖、繭蜜糖和甘露醇所組成之群組。在一實施態樣中，糖為蔗糖、繭蜜糖或甘露醇。在一實施態樣中，糖為蔗糖。
在一實施態樣中，在步驟b)中的經活化之血清型24F莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於2：1與0.5：1之間。在一實施態樣中，經活化之血清型24F莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於1.2：1與0.6：1之間。經活化之血清型24F莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)較佳地介於0.9：1與0.7：1之間。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在水性溶劑中進行。還原反應(c)較佳地在非質子性溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)的存在下進行。還原反應(c)較佳地在二甲基亞碸(DMSO)的存在下進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行。
還原反應(c)最佳地在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下的硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苯甲胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。在一實施態樣中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。在一實施態樣中，還原劑為在鎳存在下的氰基硼氫化鈉(參見WO2018144439)。在較佳的實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉。
在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於0.2與5莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中較佳地使用介於0.5與2.5莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中最佳地使用介於1.5與2.5莫耳當量之間的還原劑。
在一個實施態樣中，在步驟c)中使用約2莫耳當量之還原劑。
在還原反應結束時，可能有未反應之醛基剩餘在結合物中，該等醛基可使用適合的封端劑封端。在一個實施態樣中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH 4)。
在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至20莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至3莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。
在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與約2莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。
在與載體蛋白質結合之後，血清型24F醣結合物可藉由熟習本技術領域者已知的各種技術純化(相對於醣-蛋白質結合物的量富集)。該等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沉澱/溶析、管柱層析術(DEAE或疏水性相互作用層析術)及深層過濾。因此，在一個實施態樣中，用於生產本發明之血清型24F醣結合物之製程包含純化在生產之後的醣結合物的步驟。 1.9 本發明之肺炎鏈球菌血清型35B醣結合物
在一態樣中，本發明關於肺炎鏈球菌血清型35B醣結合物。
肺炎鏈球菌血清型35B多醣之結構為本技術中已知的(參見例如Geno K等人之(2015) Clin Microbiol Rev Vol 28：3, p 871-899)。
在一實施態樣中，在本發明中所使用之莢膜肺炎鏈球菌血清型35B醣為合成的碳水化合物。
然而，在較佳的實施態樣中，根據本發明之細菌多醣的來源可為肺炎鏈球菌血清型35B細菌細胞。可用作為肺炎鏈球菌血清型35B多醣來源之細菌株可自建立的培養物收集中心(諸如例如自鏈球菌參考實驗室(疾病管制與預防中心，Atlanta, GA USA))或臨床樣本獲得。
血清型35B醣可使用熟習本技術的普通技能者已知的單離程序自細菌直接獲得。該等亦可購得(諸如例如來自美國菌種保存中心(ATCC，Manassas, VA USA)(例如參考編號ATCC 539-X、編號ATCC 540-X、編號ATCC 541-X))。
若血清型35B醣係自細菌直接獲得，則細菌細胞可在培養基中(較佳地在基於大豆之培養基中)生長。在生產肺炎鏈球菌血清型35B莢膜多醣之細菌細胞發酵之後，可將細菌細胞溶解以生產細胞溶解物。接著可將血清型35B多醣使用本技術中已知的純化技術自細胞溶解物單離，包括使用離心、深層過濾、沉澱、超濾、以活性碳處理、透濾及/或管柱層析術(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381、WO2008/118752和WO2020170190)。接著可將經純化之血清型35B莢膜多醣用於製備醣結合物。
藉由純化來自肺炎鏈球菌細胞溶解物之血清型35B多醣及視需要地尺寸分級經純化之多醣所獲得的經單離之血清型35B莢膜醣可以不同的參數特徵化，包括例如重量平均分子量(Mw)。
多醣的分子量可藉由尺寸排阻層析術(SEC)與多角度雷射光散射檢測器(MALLS)組合來測量。
在較佳的實施態樣中，經單離之血清型35B莢膜多醣(亦即在進一步處理之前已純化)具有介於100 kDa與5000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型35B莢膜多醣具有介於300 kDa與2000 kDa之間的重量平均分子量。在較佳的實施態樣中，經單離之血清型35B莢膜多醣具有介於500 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。
考慮在上述範圍中之任一者內的任何整數作為本揭示之一實施態樣。
可將經純化之血清型35B多醣的尺寸縮減，同時保留多醣結構的關鍵特徵。可能使用機械式或化學式尺寸分級。
然而，頃發現肺炎鏈球菌血清型35B多醣在以過碘酸鹽活化期間斷裂，該過碘酸鹽為常用的還原胺化製程中所使用之經典氧化劑。過碘酸鹽氧化似乎發生在血清型35B多醣的主鏈上且使甘露醇或核糖醇斷裂，導致尺寸縮減。以過碘酸鹽活化導致多醣Mw減少。因此，在其中使用過碘酸鹽活化的例子中，血清型35B莢膜多醣未經尺寸分級。
因此，在一實施態樣中，經單離之血清型35B莢膜多醣未經尺寸分級。
在一實施態樣中，經單離之血清型35B莢膜多醣在結合之前具有介於100 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之血清型35B莢膜多醣在結合之前具有介於300 kDa與2000 kDa之間的重量平均分子量。在甚至較佳的實施態樣中，經單離之血清型35B莢膜多醣在結合之前具有介於500 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。
在結合之前的醣之重量平均分子量(Mw)係指多醣在活化之前(亦即在多醣與活化劑反應之前)的Mw。
在一實施態樣中，本發明之血清型35B醣結合物包含血清型35B莢膜多醣，其中該多醣的重量平均分子量(Mw)係介於15 kDa與100 kDa之間。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於25 kDa與50 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於約30 kDa與約40 kDa之間。
在一些實施態樣中，本發明之血清型35B醣結合物具有介於250 kDa與7,500 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型35B醣結合物具有介於500 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。血清型35B醣結合物較佳地具有介於1,000 kDa與4,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
本發明之血清型35B醣結合物亦可以醣對載體蛋白質之比(重量/重量)特徵化。在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型35B多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.4與3.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)較佳地介於0.4與2.0之間。醣對載體蛋白質之比(w/w)甚至更佳地介於0.5與1.5之間。
使本發明之血清型35B醣結合物特徵化的另一方式係藉由與醣結合之載體蛋白質(例如CRM197、DT或TT)中的離胺酸殘基數量，該醣可以經結合之離胺酸範圍(結合程度)特徵化。由於與多醣的共價鍵聯，使載體蛋白質之離胺酸修飾的證據可藉由使用熟習本技術領域者已知的常規方法之胺基酸分析來獲得。與用於產生結合物材料之載體蛋白質起始材料相比，結合導致回收之離胺酸殘基的數量減少。在較佳的實施態樣中，本發明之血清型35B醣結合物的結合程度係介於2與15之間。本發明之血清型35B醣結合物的結合程度較佳地介於5與10之間。
本發明之血清型35B醣結合物及致免疫性組成物可含有未與載體蛋白質共價結合但仍存在於醣結合物組成物中之游離醣。游離醣可與醣結合物非共價締合(亦即與醣結合物非共價結合、吸附至醣結合物或包埋於醣結合物中或與醣結合物包埋)。
在一實施態樣中，與血清型35B多醣總量相比，血清型35B醣結合物包含少於約40%之游離血清型35B多醣。在一實施態樣中，與血清型35B多醣總量相比，血清型35B醣結合物包含少於約20%之游離血清型35B多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型35B多醣總量相比，血清型35B醣結合物包含少於約10%之游離血清型35B多醣。
血清型35B醣結合物亦可以其分子尺寸分布(Kd)特徵化。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於測定結合物之相對分子尺寸分布。尺寸排阻層析術(SEC)係使用於重力饋料管柱中得出結合物之分子尺寸分布輪廓。自介質中的孔排阻之大分子比小分子更快溶析。使用溶析份收集器收集管柱溶析液。溶析份係藉由醣檢定法經比色測試。校準用於測定Kd之管柱以確立完全排阻之分子的溶析份(V0)，(Kd=0)及表示最大滯留的溶析份(Vi)，(Kd=1)。達到特定之樣品屬性的溶析份(Ve)係藉由運算式Kd=(Ve-V0)/(Vi-V0)與Kd關聯。
在一實施態樣中，至少40%之血清型35B醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，至少60%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。在較佳的實施態樣中，介於50%與80%之間的血清型35B醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之Kd。
在一實施態樣中，血清型35B醣係經四氟硼酸1-氰基-4-二甲胺基吡啶鎓鹽(CDAP)活化以形成氰酸酯。接著經活化之醣可直接或經由間隔子(連接子)基團與載體蛋白質(較佳為CRM 197)上的胺基偶合。例如，間隔子可能為給出硫醇化多醣之胱胺或半胱胺，該多醣可能經由在與經順丁烯二醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或經鹵乙醯化之載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、溴乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBA；SIB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SlAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(磺基SIAB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)或3-[溴乙醯胺基]丙酸琥珀醯亞胺酯(SBAP))反應之後所獲得的硫醚鍵聯與載體偶合。氰酸酯較佳地與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且經胺基衍生之醣係使用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上的羧基與載體蛋白質(例如CRM 197)結合。此等結合物描述於例如WO 93/15760、WO 95/08348和WO 96/129094中。
用於結合之其他適合的技術係使用碳二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S--NHS、EDC、TSTU。許多該等技術描述於國際專利申請案公開號WO 98/42721中。結合可涉及羰基連接子，其可藉由醣的游離羥基與1,1’-羰基二咪唑(CDI)之反應來形成(參見Bethell等人之(1979) J. Biol. Chern. 254：2572-2574；Hearn等人之(1981) J. Chromatogr. 218：509-518)，隨後與蛋白質反應以形成胺甲酸酯鍵聯。這可涉及將變旋異構物末端還原成一級羥基、視需要地保護/去保護一級羥基、將一級羥基與CDI反應以形成CDI胺甲酸酯中間物、及將CDI胺基甲酸酯中間物與蛋白質上的胺基偶合。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型35B醣結合物係使用還原胺化化學來製備。根據本發明，還原胺化涉及兩個步驟：(1)氧化(活化)經純化之醣，(2)還原經活化之醣及載體蛋白質以形成醣結合物。
在一實施態樣中，本發明之血清型35B醣結合物係藉由將經單離之血清型35B莢膜多醣以包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合來製備：(a)將該經單離之血清型35B莢膜多醣與氧化劑反應；(b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質複合；且(c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
經單離之血清型35B莢膜多醣較佳地在氧化之前未經尺寸分級。
在較佳的實施態樣中，步驟(a)係以添加淬滅劑淬滅以終止氧化。
因此，在較佳的實施態樣中，本發明之血清型35B醣結合物係藉由將經單離之血清型35B莢膜多醣以包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合來製備：(a)將該經單離之血清型35B莢膜多醣與氧化劑反應；(a’)將氧化反應以添加淬滅劑淬滅，得到經活化之血清型35B莢膜多醣；(b)將步驟(a’)的經活化之醣與載體蛋白質複合；且(c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
在一實施態樣中，氧化步驟(a)係在介於5.0與7.0之間的pH下進行。氧化步驟(a)較佳地在介於5.5與6.5之間的pH下進行。
在一實施態樣中，氧化步驟(a)係在約6.0之pH下進行。
在氧化步驟(a)至(a’)之後，認為醣經活化且被稱為「經活化之多醣」。
在一實施態樣中，氧化劑為氧化末端羥基成為醛之任何氧化劑。在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸鹽。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸兩者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO 4-)和原過碘酸鹽(IO 6 5-)兩者及過碘酸鹽的各種鹽(例如過碘酸鈉和過碘酸鉀)。
在較佳的實施態樣中，氧化劑為過碘酸鈉。在一實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鹽。在最佳的實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鈉。
當多醣與過碘酸鹽反應時，過碘酸鹽氧化鄰位羥基以形成羰基或醛基且造成C-C鍵斷裂。出於此原因，術語「將多醣與過碘酸鹽反應」包括以過碘酸鹽氧化鄰位羥基。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將多醣與0.05至0.2莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)較佳地包含將多醣與0.09至0.11莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)最佳地包含將多醣與約0.1莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一個實施態樣中，淬滅劑係選自鄰位二醇、1,2-胺基醇、胺基酸、麩胱甘肽、亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、次磷酸鹽或亞磷酸。
在一個實施態樣中，淬滅劑為式(I)之1,2-胺基醇： 其中R 1係選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。
在一個實施態樣中，淬滅劑係選自亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、次磷酸鹽或亞磷酸之鈉及鉀鹽。
在一個實施態樣中，淬滅劑為胺基酸。在此等實施態樣中，該胺基酸可選自絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、胱胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、羥基脯胺酸、色胺酸、酪胺酸和組胺酸。
在一個實施態樣中，淬滅劑為亞硫酸鹽，諸如硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽。
在一個實施態樣中，淬滅劑為包含兩個鄰位羥基(鄰位二醇)，亦即包含與兩個相鄰的碳原子共價連結之兩個羥基的化合物。
淬滅劑較佳為式(II)化合物： 其中R 1和R 2各自獨立地選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。
在較佳的實施態樣中，淬滅劑為甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,2-丁二醇或2,3-丁二醇或抗壞血酸。在最佳的實施態樣中，淬滅劑為2,3-丁二醇。
在較佳的實施態樣中，經單離之血清型35B多醣係藉由包含下列步驟之製程活化： (a)將經單離之血清型35B多醣與過碘酸鹽反應； (b)將氧化反應以添加2,3-丁二醇淬滅，得到經活化之血清型35B多醣。
在多醣的氧化步驟之後，認為多醣經活化且在下文被稱為「經活化之多醣」。
在一實施態樣中，本發明之經活化之血清型35B多醣具有介於15 kDa與100 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在一實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於25 kDa與50 kDa之間。在最佳的實施態樣中，重量平均分子量(Mw)係介於30 kDa與40 kDa之間。
在一實施態樣中，經活化之血清型35B多醣的氧化程度(在本發明文件中亦稱為「活化程度」)係介於2與20之間。在較佳的實施態樣中，經活化之血清型35B多醣的氧化程度係介於4與15之間。在最佳的實施態樣中，經活化之血清型35B多醣的氧化程度為9±3。
在一個實施態樣中，經活化之血清型35B多醣及載體蛋白質係在步驟b)之前凍乾。凍乾較佳地發生在步驟a)之後。在一個實施態樣中，經活化之多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾。
在一個實施態樣中，經活化之血清型35B多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾，且經活化之多醣及載體蛋白質係在相同的溶液中回溶。
在一實施態樣中，經活化之血清型35B多醣及載體蛋白質獨立地凍乾(分開凍乾)。在一實施態樣中，經活化之血清型35B將多醣及載體蛋白質一起凍乾(共同凍乾)。
在一個實施態樣中，凍乾係在非還原糖的存在下發生，可能的非還原糖包括蔗糖、繭蜜糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。在一實施態樣中，糖係選自由蔗糖、繭蜜糖和甘露醇所組成之群組。在一實施態樣中，糖為蔗糖、繭蜜糖或甘露醇。在一實施態樣中，糖為蔗糖。
在一實施態樣中，在步驟b)中的經活化之血清型35B莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於2：1與0.5：1之間。在一實施態樣中，經活化之血清型35B莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於1.2：1與0.6：1之間。經活化之血清型35B莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)較佳地介於0.9：1與0.7：1之間。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在水性溶劑中進行。還原反應(c)較佳地在非質子性溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)的存在下進行。還原反應(c)較佳地在二甲基亞碸(DMSO)的存在下進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中進行。
還原反應(c)最佳地在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下的硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苯甲胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。在一實施態樣中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。在一實施態樣中，還原劑為在鎳存在下的氰基硼氫化鈉(參見WO2018144439)。在較佳的實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉。
在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於0.2與5莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中較佳地使用介於0.5與1.5莫耳當量之間的還原劑。在步驟c)中最佳地使用介於0.9與1.1莫耳當量之間的還原劑。
在還原反應結束時，可能有未反應之醛基剩餘在結合物中，該等醛基可使用適合的封端劑封端。在一個實施態樣中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH 4)。
在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至20莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至3莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。
在與載體蛋白質結合之後，血清型35B醣結合物可藉由熟習本技術領域者已知的各種技術純化(相對於醣-蛋白質結合物的量富集)。該等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沉澱/溶析、管柱層析術(DEAE或疏水性相互作用層析術)及深層過濾。因此，在一個實施態樣中，用於生產本發明之血清型35B醣結合物之製程包含純化在生產之後的醣結合物的步驟。 1.10 本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物
在一態樣中，本發明關於包含肺炎鏈球菌血清型3醣結合物之組成物。
肺炎鏈球菌血清型3多醣之結構為本技術中已知的。血清型3之多醣重複單元係由具有一個葡萄哌喃糖(Glc p)及一個葡萄糖醛酸(Glc pA)之直鏈雙醣單元所組成(參見例如Geno K等人之(2015) Clin Microbiol Rev Vol 28：3, p 871-899)。
在一實施態樣中，在本發明中所使用之莢膜肺炎鏈球菌血清型3醣為合成的碳水化合物。可例如進行合成的肺炎鏈球菌型3莢膜醣之製備，如WO2017178664或WO2015040140中所揭示。
然而，在較佳的實施態樣中，根據本發明之細菌多醣的來源可為肺炎鏈球菌血清型3細菌細胞。可用作為肺炎鏈球菌血清型3多醣來源之細菌株可自建立的培養物收集中心(諸如例如自鏈球菌參考實驗室(疾病管制與預防中心，Atlanta, GA USA))或臨床樣本獲得。
血清型3多醣可使用熟習本技術領域的普通技能者已知的單離程序自細菌直接獲得(參見例如在US2006/0228380、US2006/0228381、US2007/0184071、US2007/0184072、US2007/0231340和US2008/0102498及WO2008/118752中所揭示之方法)。血清型3多醣亦可使用熟習本技術領域者已知的合成方案生產。該等亦可購得(諸如例如來自美國菌種保存中心(ATCC，Manassas, VA USA)(例如參考編號ATCC 172-X或ATCC 33-X))。
若血清型3多醣係以細菌直接獲得，則細菌細胞可在培養基中(較佳地在基於大豆之培養基中)生長。在生產肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣之細菌細胞發酵之後，可將細菌細胞溶解以生產細胞溶解物。接著可將血清型3多醣使用本技術中已知的純化技術自細胞溶解物單離，包括使用離心、深層過濾、沉澱、超濾、以活性碳處理、透濾及/或管柱層析術(參見例如US2006/0228380、US2006/0228381和WO2008/118752)。經純化之血清型3莢膜多醣接著可用於製備致免疫性結合物。
藉由純化來自肺炎鏈球菌細胞溶解物之血清型3多醣及視需要地尺寸分級經純化之多醣所獲得的經單離之血清型3莢膜多醣可以不同的參數特徵化，包括例如重量平均分子量(Mw)。
多醣的分子量可藉由尺寸排阻層析術(SEC)與多角度雷射光散射檢測器(MALLS)組合來測量。
在一實施態樣中，經單離之血清型3莢膜多醣(亦即在進一步處理之前已純化)具有介於5 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，經單離之莢膜多醣具有介於100 kDa與4,000 kDa之間的重量平均分子量。在較佳的實施態樣中，經單離之莢膜多醣具有介於1,000 kDa與3,500 kDa之間的重量平均分子量。
為了產生具有有利的可過濾性特徵、致免疫性及/或產率之血清型3結合物，較佳地在與載體蛋白質結合之前執行多醣之尺寸分級至標的分子量範圍。最好縮減經純化之血清型3多醣的尺寸，同時保留多醣結構的關鍵特徵。可能使用機械式或化學式尺寸分級。
在一實施態樣中，經純化之血清型3多醣的尺寸係藉由化學水解來縮減。化學水解可能使用弱酸(例如乙酸、甲酸、丙酸)進行。在一實施態樣中，化學水解係使用甲酸進行。在一實施態樣中，化學水解係使用丙酸進行。在較佳的實施態樣中，化學水解係使用乙酸進行。化學水解亦可使用稀釋之強酸(諸如稀釋之氫氯酸、稀釋之硫酸、稀釋之磷酸、稀釋之硝酸或稀釋之過氯酸)進行。在一實施態樣中，化學水解係使用稀釋之氫氯酸進行。在一實施態樣中，化學水解係使用稀釋之硫酸進行。在一實施態樣中，化學水解係使用稀釋之磷酸進行。在一實施態樣中，化學水解係使用稀釋之硝酸進行。在一實施態樣中，化學水解係使用稀釋之過氯酸進行。
經純化之血清型3多醣的尺寸亦可藉由機械均質化來縮減。在一實施態樣中，經純化之血清型3多醣的尺寸係藉由高壓均質化來縮減。高壓均質化係藉由將製程流通過具有尺寸足夠小的流徑泵送來達成高剪切速率。剪切速率係藉由使用較大的施加之均質化壓力來增加，且暴露時間可藉由使進料流通過均質機再循環來增加。高壓均質化製程可適合縮減經純化之血清型3多醣的尺寸，同時保留多醣之結構特徵。
在一實施態樣中，將經單離之血清型3莢膜多醣經尺寸分級至介於5 kDa與1000 kDa之間的重量平均分子量。在一實施態樣中，將經單離之血清型3莢膜多醣經尺寸分級至介於50 kDa與300 kDa之間的重量平均分子量。在較佳的實施態樣中，將經單離之血清型3莢膜多醣經尺寸分級至介於100 kDa與300 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型3莢膜多醣經尺寸分級至介於約200 kDa與約300 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型3莢膜多醣經尺寸分級至介於約100 kDa與約200 kDa之間的重量平均分子量。
在一實施態樣中，經單離之血清型3莢膜多醣未經尺寸分級。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。重量平均分子量(Mw)較佳地介於100 kDa與300 kDa之間。
血清型3醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係指血清型3多醣在活化之前(亦即在最終的尺寸分級步驟之後但在多醣與活化劑反應之前)的Mw。在本發明之上下文中，血清型3多醣的Mw未因活化步驟而實質地修飾且併入結合物中之血清型3多醣的Mw與在活化之前所測量之多醣的Mw類似。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與200 kDa之間。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前的重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與300 kDa之間。
在一些實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物具有介於250 kDa與20,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在其他的實施態樣中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。在又其他的實施態樣中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。血清型3醣結合物較佳地具有介於500 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
在一實施態樣中，血清型3醣結合物具有介於600 kDa與3,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。
多醣的分子量可藉由尺寸排阻層析術(SEC)與多角度雷射光散射檢測器(MALLS)組合來測量。
使本發明之血清型3醣結合物特徵化的另一方式係藉由與醣結合之載體蛋白質(例如CRM 197或SCP)中的離胺酸殘基數量，該醣可以經結合之離胺酸範圍(結合程度)特徵化。由於與多醣的共價鍵聯，使載體蛋白質之離胺酸修飾的證據可藉由使用熟習本技術領域者已知的常規方法之胺基酸分析來獲得。與用於產生結合物材料之載體蛋白質起始材料相比，結合導致回收之離胺酸殘基的數量減少。在較佳的實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物的結合程度係介於2與15之間。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物的結合程度係介於4與7之間。在一些此等實施態樣中，載體蛋白質為CRM 197。在其他的此等實施態樣中，載體蛋白質為SCP。
本發明之血清型3醣結合物亦可以醣對載體蛋白質之比(重量/重量)特徵化。在一些實施態樣中，在醣結合物中的血清型3多醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.5與3.0之間。在其他的實施態樣中，醣對載體蛋白質之比(w/w)係介於0.5與1.5之間。在較佳的實施態樣中，在結合物中的血清型3莢膜多醣對載體蛋白質之比係介於0.9與1.1之間。
本發明之血清型3醣結合物亦可以介於載體蛋白質與醣之間的共價鍵聯數量作為醣的重複單元之函數特徵化。在一個實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物係以多醣的每4個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。在另一實施態樣中，介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯係以多醣的每10個醣重複單元出現至少一次。在另一實施態樣中，介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯係以多醣的每15個醣重複單元出現至少一次。在進一步的實施態樣中，介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯係以多醣的每25個醣重複單元出現至少一次。在進一步的實施態樣中，介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯係以多醣的每50個醣重複單元出現至少一次。在又進一步的實施態樣中，介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯係以多醣的每100個醣重複單元出現至少一次。
在其他的實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物係以多醣的每5至10個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。
在其他的實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物係以多醣的每10至20個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。
在一些實施態樣中，載體蛋白質為CRM 197且介於CRM 197與多醣之間的共價鍵聯係以多醣的每4、10、15或25個醣重複單位出現至少一次。在常見的實施態樣中，載體蛋白質為SCP且介於SCP與多醣之間的共價鍵聯係以多醣的每4、10、15或25個醣重複單位出現至少一次。
本發明之血清型3醣結合物及致免疫性組成物可含有未與載體蛋白質共價結合但仍存在於醣結合物組成物中之游離醣。游離醣可與醣結合物非共價締合(亦即與醣結合物非共價結合、吸附至醣結合物或包埋於醣結合物中或與醣結合物包埋)。
在較佳的實施態樣中，與血清型3多醣總量相比，血清型3醣結合物包含少於約50%之游離血清型3多醣。在較佳的實施態樣中，與血清型3多醣總量相比，血清型3醣結合物包含少於約40%之游離血清型3多醣。在又較佳的實施態樣中，與血清型3多醣總量相比，血清型3醣結合物包含少於約25%之游離血清型3多醣。在甚至較佳的實施態樣中，與血清型3多醣總量相比，血清型3醣結合物包含少於約20%之游離血清型3多醣。在又較佳的實施態樣中，與血清型3多醣總量相比，血清型3醣結合物包含少於約15%之游離血清型3多醣。
血清型3醣結合物亦可以其分子尺寸分布(K d)特徵化。尺寸排阻層析介質(CL-4B)可用於測定結合物之相對分子尺寸分布。尺寸排阻層析術(SEC)係使用於重力饋料管柱中得出結合物之分子尺寸分布輪廓。自介質中的孔排阻之大分子比小分子更快溶析。使用溶析份收集器收集管柱溶析液。溶析份係藉由醣檢定法經比色測試。校準用於測定K d之管柱以確立完全排阻之分子的溶析份(V 0)，(K d=0)及表示最大滯留的溶析份(V i)，(K d=1)。達到特定之樣品屬性的溶析份(V e)係藉由運算式K d=(V e-V 0)/(V i-V 0)與K d關聯。
在較佳的實施態樣中，至少30%之血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。在較佳的實施態樣中，至少40%之醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。在較佳的實施態樣中，至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。在較佳的實施態樣中，至少60%之血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。在較佳的實施態樣中，介於50%與80%之間的血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。在較佳的實施態樣中，介於65%與80%之間的血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物係使用還原胺化化學來製備(參見WO2006110381、WO2008143709、PCT/IB2022/054920)。
根據本發明，還原胺化涉及兩個步驟：(1)氧化(活化)經純化之醣，(2)還原經活化之醣及載體蛋白質(例如CRM 197、TT或SCP)以形成醣結合物。
如上文所述及，在氧化之前，可執行多醣之尺寸分級至標的分子量(MW)範圍。
因此，在一實施態樣中，經單離之多醣係在氧化之前經尺寸分級。
在一實施態樣中，將經單離之多醣經尺寸分級至上文所定義之標的分子量(MW)範圍中之任一者。
在一實施態樣中，經單離之血清型3莢膜多醣係藉由包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合： (a)將經單離之多醣與氧化劑反應； (b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質複合；且 (c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。
在氧化步驟(a)之後，認為多醣經活化且被稱為「經活化之多醣」。
在一實施態樣中，氧化劑為氧化末端羥基成為醛之任何氧化劑。在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸鹽。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸兩者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO 4 -)和原過碘酸鹽(IO 6 5-)兩者及過碘酸鹽的各種鹽(例如過碘酸鈉和過碘酸鉀)。
在一實施態樣中，氧化劑為在二價陽離子存在下的過碘酸鹽(參見WO2008/143709)。
在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸。在一實施態樣中，氧化劑為在二價陽離子存在下的過碘酸。在一實施態樣中，氧化劑為在Mg 2+存在下的過碘酸。在一實施態樣中，氧化劑為在Ca 2+存在下的過碘酸。在一實施態樣中，氧化劑為原過碘酸鹽。
在一實施態樣中，氧化劑為過碘酸鈉。在一實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鹽。在一實施態樣中，用於氧化之過碘酸鹽為偏過碘酸鈉。
當多醣與過碘酸鹽反應時，過碘酸鹽氧化鄰位羥基以形成羰基或醛基且造成C-C鍵斷裂。出於此原因，術語「將多醣與過碘酸鹽反應」包括以過碘酸鹽氧化鄰位羥基。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將多醣與0.01至2莫耳當量之過碘酸鹽反應。步驟a)較佳地包含將多醣與0.1至2莫耳當量之過碘酸鹽反應。
在一個實施態樣中，步驟a)包含將多醣與0.01至2莫耳當量之過碘酸反應。步驟a)較佳地包含將多醣與0.2至2莫耳當量之過碘酸反應。
在較佳的實施態樣中，經活化之血清型3多醣的氧化程度(在本發明文件中亦稱為「活化程度」)係介於2與30之間。在較佳的實施態樣中，經活化之血清型3多醣的氧化程度係介於2至20之間。
在一實施態樣中，經活化之血清型3多醣的氧化程度係介於2至8之間。
在一實施態樣中，經活化之血清型3多醣的氧化程度係介於11至19之間。
在一個實施態樣中，經活化之多醣及載體蛋白質係在步驟b)之前凍乾。凍乾較佳地發生在步驟a)之後。在一個實施態樣中，經活化之多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾。
在一個實施態樣中，經活化之多醣係在步驟a)之後凍乾且亦將載體蛋白質凍乾，且經活化之多醣及載體蛋白質係在相同的溶液中回溶，這起到使經活化之多醣及載體蛋白質一起化合的作用。
在一實施態樣中，將經活化之多醣及載體蛋白質獨立地凍乾(分開凍乾)。在一實施態樣中，將經活化之多醣及載體蛋白質一起凍乾(共同凍乾)。
在一個實施態樣中，凍乾係在非還原糖的存在下發生，可能的非還原糖包括蔗糖、繭蜜糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。在一實施態樣中，糖係選自由蔗糖、繭蜜糖和甘露醇所組成之群組。在一實施態樣中，糖為蔗糖、繭蜜糖或甘露醇。在一實施態樣中，糖為繭蜜糖。在一實施態樣中，糖為蔗糖。
在一實施態樣中，在步驟b)中的經活化之血清型3莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於4：1與0.1：1之間。在一實施態樣中，經活化之血清型3莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於2：1與0.4：1之間。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在水性溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原反應(c)係在非質子性溶劑中進行。在一實施態樣中，還原反應(c)係在DMSO (二甲基亞碸)溶劑中進行。
在一實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下的硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMe iPrN-BH 3、苯甲胺-BH 3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。在一實施態樣中，還原劑為三乙醯氧基硼氫化鈉。在較佳的實施態樣中，還原劑為氰基硼氫化鈉。在一實施態樣中，還原劑為在鎳存在下的氰基硼氫化鈉(參見WO2018144439)。
在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於0.2與20莫耳當量之間的還原劑。在一個實施態樣中，在步驟c)中使用介於0.5與3莫耳當量之間的還原劑。
在還原反應結束時，可能有未反應之醛基剩餘在結合物中，該等醛基可使用適合的封端劑封端。在一個實施態樣中，此封端劑為硼氫化鈉(NaBH 4)。
在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至20莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。在一實施態樣中，封端係藉由將步驟c)的產物與1至3莫耳當量之硼氫化鈉混合來達成。
在一實施態樣中，本發明之醣結合物係使用CDI及/或CDT化學來製備(參見PCT/IB2022/054920)。
CDI及/或CDT化學涉及兩個步驟：1)將經單離之醣與CDI及/或CDT在非質子性溶劑中反應以生產經活化之醣(活化)，(2)將經活化之醣與載體蛋白質(例如CRM 197或SCP)反應以形成醣結合物。
在一實施態樣中，步驟(1)的活化劑為1,1’-羰基二咪唑(CDI)。在一實施態樣中，步驟(1)的活化劑為1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)。
在一實施態樣中，經單離之血清型3莢膜多醣係藉由包含下列步驟之製程與載體蛋白質結合： (a)將該經單離之多醣與CDI及/或CDT在非質子性溶劑中反應； (b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質在非質子性溶劑中反應以形成醣結合物。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物係使用點擊化學來製備(參見例如PCT/IB2022/054914)。
根據本發明，點擊化學包含三個步驟：(a)將經單離之血清型3莢膜多醣與碳酸衍生物及疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應以生產經活化之疊氮基多醣(多醣之活化)，(b)將載體蛋白質與攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑反應，其中NHS部分係與胺基反應以形成醯胺鍵聯，由此獲得經炔烴官能化之載體蛋白質(載體蛋白質之活化)，(c)將步驟(a)的經活化之疊氮基多醣與步驟(b)的經活化之炔烴-載體蛋白質藉由經Cu +1調介之疊氮化物-炔烴環加成反應來反應以形成醣結合物。
在步驟(a)之後，認為多醣經活化且在本文被稱為「經活化之多醣」或「經活化之疊氮基多醣」。
在步驟(b)之後，認為載體經活化且被稱為「經活化之載體」。
如上文所述及，在活化(a)之前，可執行多醣之尺寸分級至標的分子量(MW)範圍。
因此，在一實施態樣中，經單離之多醣係在以碳酸衍生物及疊氮基連接子活化之前經尺寸分級。
在一實施態樣中，將經單離之多醣尺寸分級至上文所定義之標的分子量(MW)範圍中之任一者。
在一實施態樣中，該碳酸衍生物為1,1’-羰基二咪唑(CDI)或1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)。該碳酸衍生物較佳為1,1’-羰基二咪唑(CDI)。
在一實施態樣中，該疊氮基連接子為式(I)化合物， 其中X係選自由下列所組成之群組：CH 2(CH 2) n、(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、NHCO(CH 2) n、NHCO(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、OCH 2(CH 2) n和O(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2；其中n係選自1至10及m係選自1至4。
在一實施態樣中，該疊氮基連接子為式(II)化合物， 。
在一實施態樣中，該疊氮基連接子為3-疊氮基丙胺。
在一實施態樣中，該攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑為攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及末端炔烴之劑。
在一實施態樣中，該攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑為攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及環炔烴之劑。
在一實施態樣中，該攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑為式(III)化合物， 其中X係選自由下列所組成之群組：CH 2O(CH 2) nCH 2C=O和CH 2O(CH 2CH 2O) m(CH 2) nCH 2C=O，其中n係選自0至10及m係選自0至4。
在一實施態樣中，該攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑為式(IV)化合物， 。
在一實施態樣中，步驟a)包含將多醣與碳酸衍生物反應，隨後將經碳酸衍生物活化之多醣與疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應以生產經活化之疊氮基多醣。
在一實施態樣中，在步驟a)，將經單離之多醣與碳酸衍生物在非質子性溶劑中反應。
在較佳的實施態樣中，將經單離之多醣與碳酸衍生物在基本上由二甲基亞碸(DMSO)所組成之溶液中反應。
在較佳的實施態樣中，將經單離之多醣與CDI在二甲基亞碸(DMSO)中反應。在一實施態樣中，將經單離之多醣與CDI在無水DMSO中反應。
一旦多醣已與碳酸衍生物反應且在碳酸衍生物以水最終淬滅之後，將經碳酸衍生物活化之多醣與疊氮基連接子反應。
在一個實施態樣中，步驟a)另包含將經碳酸衍生物活化之多醣與一定量的疊氮基連接子反應，該一定量係在相對於經活化之多醣的多醣重複單元之量(RU之莫耳當量)的0.01至10莫耳當量之間。
在一實施態樣中，結合反應c)係在水性緩衝液中進行。在一實施態樣中，結合反應c)係在水性緩衝液中以作為觸媒的銅(I)存在下進行。在一實施態樣中，結合反應c)係在水性緩衝液中以氧化劑及作為觸媒的銅(I)存在下進行。在較佳的實施態樣中，結合反應c)係在水性緩衝液中以作為觸媒的銅(I)及作為氧化劑的抗壞血酸鹽存在下進行。在一實施態樣中，可進一步添加THPTA (參(3-羥丙基三唑基甲基)胺)及胺基胍以防止蛋白質之副反應。因此，在較佳的實施態樣中，結合反應c)係在水性緩衝液中以作為觸媒的銅(I)及作為氧化劑的抗壞血酸鹽存在下進行，其中反應混合物另包含THPTA (參(3-羥丙基三唑基甲基)胺)及胺基胍。
在點擊結合反應之後，可能有未反應之疊氮基剩餘在結合物中，可將該疊氮基使用適合的疊氮基封端劑封端。因此，在一實施態樣中，在步驟c)之後，將結合物中的未反應之疊氮基使用適合的疊氮基封端劑封端。在一個實施態樣中，此疊氮基封端劑為攜帶炔烴基之劑。在一個實施態樣中，此疊氮基封端劑為攜帶末端炔烴之劑。在一個實施態樣中，此疊氮基封端劑為攜帶環炔烴之劑。
在一實施態樣中，該疊氮基封端劑為式(V)化合物， 其中X為(CH 2) n，其中n係選自1至15。
在一個實施態樣中，此疊氮基封端劑為炔丙醇。
因此，在一實施態樣中，在步驟(c)之後，製程另包含將剩餘在結合物中的未反應之疊氮基以疊氮基封端劑封端的步驟。
在點擊結合反應之後，未反應之炔烴基可能仍存在於結合物中，可將該炔烴基使用適合的炔烴基封端劑封端。在一個實施態樣中，此炔烴基封端劑為攜帶疊氮基之劑。
在一實施態樣中，該炔烴基封端劑為式(VI)化合物， 其中X為(CH 2) n，其中n係選自1至15。
在一個實施態樣中，此炔烴基封端劑為3-疊氮基-1-丙醇。
因此，在一實施態樣中，在步驟(c)之後，製程另包含將剩餘在結合物中的未反應之炔烴基以炔烴基封端劑封端的步驟。
在與載體蛋白質結合之後，醣結合物可藉由熟習本技術領域者已知的各種技術純化(相對於醣-蛋白質結合物的量富集)。該等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沉澱/溶析、管柱層析術(DEAE或疏水性相互作用層析術)及深層過濾。因此，在一個實施態樣中，用於生產本發明之醣結合物之製程包含純化在生產之後的醣結合物的步驟。
在一態樣中，本發明之血清型3醣結合物係根據如上文及申請案PCT/IB2022/054914中所揭示之點擊化學來生產，併入該申請案的全文以供參考。因此，在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)： ， 其中X係選自由下列所組成之群組：CH 2(CH 2) n’、(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、NHCO(CH 2) n’、NHCO(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、OCH 2(CH 2) n’和O(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2；其中n’係選自1至10及m係選自1至4， 且其中X'係選自由下列所組成之群組：CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O、CH 2O(CH 2CH 2O) m’(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10及m’係選自0至4。
式(VII)為本發明之血清型3醣結合物的示意圖示。不應理解為鍵聯係存在於糖的每一重複單元上。反而，大多數的肺炎鏈球菌血清型3醣重複單元維持未經修飾，且在載體蛋白質與醣之間的共價鍵聯係針對少數的醣重複單元。另外，個別的載體蛋白質(CP)分子可連結至一個以上的肺炎鏈球菌血清型3醣分子及個別的肺炎鏈球菌血清型3醣分子可連結一個以上個別的載體蛋白質(CP)分子。
在較佳的實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為CH 2(CH 2) n’，其中n’為2，且其中X'為CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’為1。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為CH 2(CH 2) n’，其中n’係選自1至10，且其中X'為CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10。在一實施態樣中，n’係選自1至5及n’’係選自0至10。在一實施態樣中，n’係選自1至5及n’’係選自0至5。在一實施態樣中，n’係選自1至3及n’’係選自0至3。在一實施態樣中，n’係選自1至2及n’’係選自0至2。在特別的實施態樣中，n’為1及n’’為0。在另一實施態樣中，n’為2及n’’為0。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為CH 2(CH 2) n’，其中n’係選自1至10，且其中X'為CH 2O(CH 2CH 2O) m’(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10及m’係選自0至4。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10。在一實施態樣中，m係選自1至3及n’’係選自0至10。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH 2O(CH 2CH 2O) m’(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10及m’係選自0至4。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為NHCO(CH 2) n’，其中n’係選自1至10，且其中X'為CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為NHCO(CH 2) n’，其中n’係選自1至10，且其中X'為CH 2O(CH 2CH 2O) m’(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10及m’係選自0至4。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為NHCO(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10。在一實施態樣中，m係選自1至3及n’’係選自0至10。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為NHCO(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH 2O(CH 2CH 2O) m’(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10及m’係選自0至4。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為OCH 2(CH 2) n’，其中n’係選自1至10，且其中X'為CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為OCH 2(CH 2) n’，其中n’係選自1至10，且其中X'為CH 2O(CH 2CH 2O) m’(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10及m’係選自0至4。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為O(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10。
在一實施態樣中，本發明之血清型3醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為O(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2，其中m係選自1至4，且其中X'為CH 2O(CH 2CH 2O) m’(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10及m’係選自0至4。
在與載體蛋白質結合之後，血清型3醣結合物可藉由熟習本技術領域者已知的各種技術純化(相對於醣-蛋白質結合物的量富集)。該等技術包括透析、濃縮/透濾操作、切向流過濾沉澱/溶析、管柱層析術(DEAE或疏水性相互作用層析術)及深層過濾。因此，在一個實施態樣中，用於生產本發明之醣結合物之製程包含純化在生產之後的醣結合物的步驟。 1.11 載體蛋白質
醣結合物之組分為與肺炎鏈球菌醣結合之載體蛋白質。術語「蛋白質載體」或「載體蛋白質」或「載體」可在本文互換使用。載體蛋白質應可順從於標準的結合程序。
在較佳的實施態樣中，肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質係選自由下列所組成之群組：DT (白喉類毒素)、TT (破傷風類毒素)或TT之片段C、CRM 197(白喉毒素之無毒性但抗原上相同的變異體)、其他DT突變體(諸如CRM 176、CRM 228、CRM 45(Uchida等人之(1973) J. Biol. Chem. 218：3838-3844)、CRM 9、CRM 102、CRM 103或CRM 107；及由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins, Ed：Frankel, Maecel Dekker Inc. (1992)中所述之其他突變；Glu-148至Asp、Gln或Ser及/或Ala 158至Gly之缺失或突變及在美國專利案號4,709,017和4,950,740中所揭示之其他突變；至少一或多個殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534之突變及美國專利案號5,917,017和6,455,673中所揭示之其他突變；或美國專利案號5,843,711中所揭示之片段)、肺炎鏈球菌溶血素(ply)(Kuo等人之(1995) Infect lmmun 63：2706-2713)，包括以一些方式去毒化(detoxified)之ply，例如dPLY-GMBS (WO 2004/081515、WO 2006/032499)或dPLY-formol、PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE (PhtA、PhtB、PhtD或PhtE之序列揭示於WO 00/37105和WO 00/39299中)及Pht蛋白質之融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物、Pht A-E (WO 01/98334、WO 03/054007、WO 2009/000826)、OMPC (腦膜炎球菌外膜蛋白質，其通常自腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)血清群B提取)(EP0372501)、PorB (來自腦膜炎雙球菌)、PD (流感嗜血桿菌蛋白質D；參見例如EP0594610 B)或其免疫學功能等效物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、熱休克蛋白質(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白質(WO 98/58668、EP0471177)、細胞介素、淋巴介質、生長因子或激素(WO 91/01146)、包含來自各種病原體衍生之抗原的多種人類CD4+ T細胞表位之人工蛋白質(Falugi等人之(2001) Eur J Immunol 31：3816-3824)，諸如N19蛋白質(Baraldoi等人之(2004) Infect lmmun 72：4884-4887)、肺炎鏈球菌表面蛋白質PspA (WO 02/091998)、鐵吸收蛋白質(WO 01/72337)、難養芽胞梭菌( Clostridium difficile)之毒素A或B (WO 00/61761)、運鐵蛋白結合蛋白質、肺炎鏈球菌黏著蛋白質(PsaA)、重組綠膿桿菌外毒素A (特別為其無毒性突變體(諸如攜帶在麩胺酸553上取代之外毒素A (Douglas等人之(1987) J. Bacteriol. 169(11)：4967-4971))。其他蛋白質，諸如卵白蛋白、鎖孔貝血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin) (KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素的經純化之蛋白質衍生物(PPD)亦可用作載體蛋白質。其他適合的載體蛋白質包括失活之細菌毒素，諸如霍亂類毒素(例如如WO 2004/083251中所述)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST和來自綠膿桿菌之外毒素A。另一適合的載體蛋白質為來自鏈球菌之C5a肽酶(SCP)。另一適合的載體蛋白質為根瘤菌抗生物素蛋白[aa 45-179J-GGGGSSS-SP1500-AAA-SP0785] (CP1) (WO2020056202)。
在較佳的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質係選自由下列所組成之群組：TT、DT、DT突變體(諸如CRM 197)和來自鏈球菌之C5a肽酶(SCP)。
在一實施態樣中，肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為DT (白喉類毒素)。在另一實施態樣中，肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為TT (破傷風類毒素)。
在另一實施態樣中，肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為PD (流感嗜血桿菌蛋白質D；參見例如EP0594610 B)。
在較佳的實施態樣中，肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為CRM 197或來自鏈球菌之C5a肽酶(SCP)。
在另一實施態樣中，肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為根瘤菌抗生物素蛋白[aa 45-179J-GGGGSSS-SP1500- AAA-SP0785] (CP1)。
在較佳的實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係與CRM 197蛋白質結合。CRM 197蛋白質為無毒形式的白喉毒素，但在免疫學上無法與白喉毒素區分。CRM 197係由非產毒性噬菌體β197 tox-感染之白喉棒狀桿菌( Corynebacterium diphtheriae)產生，該非產毒性噬菌體係由產毒性棒狀桿菌噬菌體(corynephage) β之亞硝基胍突變誘發產生(Uchida等人之(1971) Nature New Biology 233：8-11)。CRM 197蛋白質具有與白喉毒素相同的分子量，但因結構基因中的單一鹼基改變(鳥嘌呤改變成腺嘌呤)而與白喉毒素不同。此單一鹼基改變引起成熟蛋白質中的胺基酸取代(麩胺酸取代甘胺酸)且消除白喉毒素的毒性質。CRM 197蛋白質為醣之安全且有效的T細胞依賴性載體。關於CRM 197及其生產的更多細節可見於例如美國專利案號第5,614,382中。
在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係與CRM 197蛋白質結合。在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係與CRM 197蛋白質或CRM 197之A鏈結合(參見CN103495161)。在一實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物係與經由基因重組的大腸桿菌表現所獲得之CRM 197之A鏈結合(參見CN103495161)。
在其他較佳的實施態樣中，本發明之部分或全部肺炎鏈球菌醣結合物的載體蛋白質為SCP (鏈球菌C5a肽酶)。參見WO2022249106，特別為95至111頁，將其併入以供參考。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為來自GBS之SCP (SCPB)。SCPB的實例提供於WO97/26008之SEQ. ID. NO：3。亦參見WO00/34487之SEQ ID NO：3。
在另一較佳的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為來自GAS之SCP (SCPA)。
SCPA的實例可見於WO97/26008之SEQ.ID.No.1及SEQ.ID.No.2。亦參見WO00/34487之SEQ ID NO：1、2和23。
在較佳的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCP。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之片段。在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPA之片段。本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質較佳為SCPB之片段。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列(presequence)、原序列及細胞壁錨結構域。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維接合素III型(Fn)結構域中之二者，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段。在一實施態樣中，該SCP之非酵素活性片段包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPA之非酵素活性片段。在一實施態樣中，該SCPA之非酵素活性片段包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域。
在較佳的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPB之非酵素活性片段。該SCPB之非酵素活性片段較佳地包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域。
在一實施態樣中，SCP之酵素活性係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸而失活。在一實施態樣中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。數字指示根據WO00/34487之SEQ ID NO：1編號之肽酶中的胺基酸殘基位置。
因此，在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCP，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來完成。至少一個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該置換為D130A。在另一實施態樣中，該置換為H193A。在另一實施態樣中，該置換為N295A。在又另一實施態樣中，該置換為S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCPA，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來完成。至少一個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該置換為D130A。在另一實施態樣中，該置換為H193A。在另一實施態樣中，該置換為N295A。在又另一實施態樣中，該置換為S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCPB，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來完成。至少一個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該置換為D130A。在另一實施態樣中，該置換為H193A。在另一實施態樣中，該置換為N295A。在又另一實施態樣中，該置換為S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來完成。至少一個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該置換為D130A。在另一實施態樣中，該置換為H193A。在另一實施態樣中，該置換為N295A。在又另一實施態樣中，該置換為S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來完成。至少一個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該置換為D130A。在另一實施態樣中，該置換為H193A。在另一實施態樣中，該置換為N295A。在又另一實施態樣中，該置換為S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPA之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來完成。至少一個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該置換為D130A。在另一實施態樣中，該置換為H193A。在另一實施態樣中，該置換為N295A。在又另一實施態樣中，該置換為S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPB之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少一個胺基酸來完成。至少一個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少一個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該置換為D130A。在另一實施態樣中，該置換為H193A。在另一實施態樣中，該置換為N295A。在又另一實施態樣中，該置換為S512A。
在一實施態樣中，SCP之酵素活性係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸而失活。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
因此，在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCP，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來完成。至少兩個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。該至少兩個胺基酸置換較佳為D130A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCPA，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來完成。至少兩個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。該至少兩個胺基酸置換較佳為D130A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCPB，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來完成。至少兩個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。該至少兩個胺基酸置換較佳為D130A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來完成。至少兩個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。該至少兩個胺基酸置換較佳為D130A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來完成。至少兩個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。該至少兩個胺基酸置換較佳為D130A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPA之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來完成。至少兩個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。該至少兩個胺基酸置換較佳為D130A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPB之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少兩個胺基酸來完成。至少兩個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少兩個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及H193A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為D130A及N295A。該至少兩個胺基酸置換較佳為D130A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少兩個胺基酸置換為N295A及S512A。
在一實施態樣中，SCP之酵素活性係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸而失活。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
因此，在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCP，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來完成。至少三個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCPA，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來完成。至少三個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCPB，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來完成。至少三個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來完成。至少三個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來完成。至少三個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPA之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來完成。至少三個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPB之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少三個胺基酸來完成。至少三個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少三個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換係選自由D130A、H193A、N295A及S512A所組成之群組。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及N295A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、H193A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為D130A、N295A及S512A。在一實施態樣中，該至少三個胺基酸置換為H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，SCP之酵素活性係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸而失活。在一實施態樣中，該至少四個胺基酸置換為 D130A、H193A、N295A及S512A。
因此，在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCP，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來完成。至少四個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCPA，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來完成。至少四個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為非酵素活性SCPB，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來完成。至少四個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來完成。至少四個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來完成。至少四個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPA之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來完成。至少四個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCPB之非酵素活性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三種纖維結合蛋白III型(Fn)結構域，但不包含輸出訊號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該失活係藉由置換野生型序列之至少四個胺基酸來完成。至少四個胺基酸之該置換較佳地在蛋白酶結構域中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分1中。在一實施態樣中，至少四個胺基酸之該置換係在蛋白酶結構域之部分2中。在一實施態樣中，該至少四個胺基酸置換為D130A、H193A、N295A及S512A。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由SEQ ID NO：1所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由SEQ ID NO：2所組成。
SEQ ID NO：1：
SEQ ID NO：1為950個胺基酸長度。
SEQ ID NO：2：
SEQ ID NO：2為949個胺基酸長度。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：1具有至少90%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：1具有至少95%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：1具有至少99%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：1具有至少99.5%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：1具有至少99.8%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：1具有至少99.85%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：2具有至少90%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：2具有至少95%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：2具有至少99%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：2具有至少99.5%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：2具有至少99.8%之同一性的多肽所組成。
在特別的實施態樣中，本發明之肺炎鏈球菌醣醣結合物的載體蛋白質為SCP之非酵素活性片段，其係由與SEQ ID NO：2具有至少99.85%之同一性的多肽所組成。 2. 本發明之致免疫性組成物 2.1 本發明之醣結合物的組合
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物(諸如上文章節1中所揭示者)及含皂素之脂質體佐劑。
在較佳的態樣中，本發明關於多價肺炎鏈球菌致免疫性組成物，特別為高價組成物。
因此，在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含至少20種來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物(諸如上文章節1中所揭示者)及含皂素之脂質體佐劑。
不同的肺炎鏈球菌莢膜醣的數量較佳地可在20種不同的血清型(或「v」，價數)至45種不同的血清型(45v)之範圍內。
因此，在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含介於20與45種之間來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物(諸如上文章節1中所揭示者)及含皂素之脂質體佐劑。
若用於組成物中之2或更多種醣的蛋白質載體為相同的，則醣可與蛋白質載體的同一分子結合(載體分子具有2或更多種與其結合之不同的醣)[參見例如WO2020121159]。
然而，在較佳的實施態樣中，醣各自個別地與蛋白質載體的不同分子結合(蛋白質載體的各分子僅具有一種與其結合的醣類型)。在該實施態樣中，認為莢膜醣獨立地與載體蛋白質結合。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含20種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含21種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含22種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含23種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含24種本發明之肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含25種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含26種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含27種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含28種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含29種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含30種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含31種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含32種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含33種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含34種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含35種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含36種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含種37肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含38種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含39種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含40種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含41種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含42種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含43種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含44種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含45種肺炎鏈球菌醣結合物及含皂素之脂質體佐劑。
本發明之致免疫性組成物較佳地包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F之醣結合物(諸如上文章節1中所揭示者)且另包含含皂素之脂質體佐劑。
本發明之致免疫性組成物更佳地包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F之醣結合物(諸如上文章節1中所揭示者)且另包含含皂素之脂質體佐劑。
本發明之致免疫性組成物包含甚至更佳地來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物(諸如上文章節1中所揭示者)且另包含含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含21至25種來自肺炎鏈球菌的不同血清型之肺炎鏈球菌醣結合物，其中該血清型係選自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B，且另包含含皂素之脂質體佐劑。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F之醣結合物及另外包含1至5種來自肺炎鏈球菌血清型15A、23A、23B、24F及/或35B之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為21、22、23、24或25價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F之醣結合物及另外包含一種來自肺炎鏈球菌血清型15A、23A、23B、24F或35B之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為21價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F之醣結合物及另外包含2種選自肺炎鏈球菌血清型15A、23A、23B、24F和35B之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F之醣結合物及另外包含3種選自肺炎鏈球菌血清型15A、23A、23B、24F和35B之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F之醣結合物及另外包含4種選自肺炎鏈球菌血清型15A、23A、23B、24F和35B之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為24價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為21價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為21價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為21價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為21價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為21價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為22價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為23價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F和33F之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為24價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為24價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F、24F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為24價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為24價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為24價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為25價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為26價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少兩種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為27價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少三種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為28價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少四種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為29價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少五種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為30價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少六種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為31價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少七種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為32價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少八種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為33價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少九種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為34價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十一種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為36價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十二種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為37價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十三種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為38價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十四種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為39價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十五種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為40價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十六種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為41價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十七種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為42價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十八種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為43價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十九種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為44價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少二十種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為45價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為26價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少兩種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為27價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少三種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為28價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少四種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為29價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少五種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為30價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少六種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為31價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少七種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為32價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少八種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為33價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少九種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為34價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F之醣結合物和35B及另外包含至少十一種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在一實施態樣中，致免疫性組成物為36價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在較佳的實施態樣中，醣各自獨立地與蛋白質載體的不同分子結合(蛋白質載體的各分子僅具有一種與其結合的醣類型)。在該實施態樣中，認為莢膜醣獨立地與載體蛋白質結合。上述致免疫性組成物之所有醣結合物較佳地獨立地與載體蛋白質結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，本發明之醣結合物係與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型22F之醣結合物係與CRM 197結合。在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型33F之醣結合物係與CRM 197結合。在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型15B之醣結合物係與CRM197結合。在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之醣結合物係與CRM 197結合。在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型10A之醣結合物係與CRM197結合。在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型11A之醣結合物係與CRM 197結合。在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型8之醣結合物係與CRM 197結合。在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F之醣結合物係與CRM 197結合。在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型1、5和7F之醣結合物係與CRM 197結合。在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型6A和19A之醣結合物係與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，上述致免疫性組成物中任一者之醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少一種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，一種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少兩種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，兩種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少三種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，三種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少四種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，四種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少五種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，五種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少一種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，一種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少兩種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，兩種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少三種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，三種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少四種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，四種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少五種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在上述致免疫性組成物中之任一者的實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，五種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在較佳的實施態樣中，致免疫性組成物為25價肺炎鏈球菌結合物組成物。
在一實施態樣中，本發明關於致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物，其中醣結合物全部個別地與CRM 197結合，且另包含含皂素之脂質體佐劑。在較佳的實施態樣中，致免疫性組成物為25價肺炎鏈球菌結合物組成物。
本發明之組成物可包括少量游離載體。當給出之載體蛋白質係以游離及結合兩種形式存在於本發明之組成物中時，非結合形式總體上較佳地不超過組成物中的載體蛋白質總量之5%，且更佳地以少於2重量%存在。 2.2 本發明之致免疫性組成物的醣劑量
選擇各劑量中之醣結合物的量作為誘發免疫保護性反應的量，在典型的疫苗接種者中沒有明顯的不良副作用。
在致免疫性組成物中之特定的醣結合物的量可基於該結合物的總醣(經結合之醣及未經結合之醣)來計算。例如，在100 µg醣劑量中，具有20%之游離醣之醣結合物具有約80 µg經結合之醣及約20 µg未經結合之醣。醣結合物的量可取決於細菌及細菌血清型而改變。醣濃度可藉由羰基醣酸檢定法來測定。
本發明之致免疫性組成物含有含皂素之脂質體佐劑，已顯示其大幅增強免疫反應。因此，用於本發明之致免疫性組成物之各醣結合物的劑量通常低於目前用於人類之肺炎鏈球菌結合型疫苗的劑量。
一般而言，以給出之血清型的各劑量包含約0.1 µg至約5 µg之醣。在較佳的實施態樣中，以給出之血清型的各劑量包含約0.2 µg至約4 µg之醣。考慮在上述範圍中之任一者內的任何整數作為本揭示之一實施態樣。
在一實施態樣中，以各特定之醣結合物的各劑量包含約0.5 µg至約1.1 µg之醣。
在一實施態樣中，以各特定之醣結合物的各劑量包含約0.5 µg、0.55 µg、約1.0 µg、1.1 µg、約1.5 µg、約2.0 µg、約2.2 µg、約2.5 µg、約3.0 µg、約3.5 µg、約4.0 µg、約4.5 µg或約5.0 µg之醣。
在一實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約兩倍。
在一實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約兩倍。
在一實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約兩倍及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約三倍。
在一實施態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約兩倍及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約四倍。
因此，在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg至1.1 µg，除了來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量，其為約1.0 µg至2.2 µg。來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量較佳為其他醣結合物之劑量的約兩倍。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg及來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.0 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.55 µg及來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.1 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.0 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.1 µg及來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.2 µg。
在另一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg至1.1 µg，除了來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣劑量，其為約1.0 µg至2.2 µg。來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣劑量較佳為其他醣結合物之劑量的約兩倍。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣劑量為約1.0 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.55 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣劑量為約1.1 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣劑量為約2.0 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.1 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣量為約2.2 µg。
在另一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg至1.1 µg，除了來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量，其為約1.0 µg至2.2 µg及除了來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量，其為約1.5 µg至3.3 µg。來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量較佳為其他醣結合物之劑量的約兩倍及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量較佳為其他醣結合物之劑量的約三倍。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約1.5 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.55 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.1 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約1.65 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.0 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約3.0 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.1 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.2 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約3.3 µg。
在另一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg至1.1 µg，除了來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量，其為約1.0 µg至2.2 µg及除了來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量，其為約2.0 µg至4.4 µg。來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量較佳為其他醣結合物之劑量的約兩倍及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量較佳為其他醣結合物之劑量的約四倍。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約2.0 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.55 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.1 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約2.2 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.0 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約4.0 µg。
在一實施態樣中，致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.1 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.2 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約4.4 µg。 2.3 載體量
一般而言，各劑量包含10 µg至150 µg之載體蛋白質，特別為15 µg至100 µg之載體蛋白質，更特別為25 µg至100 µg之載體蛋白質，且甚至更特別為25 µg至75 µg之載體蛋白質。
在一實施態樣中，各劑量包含約25 µg、約30 µg、約35 µg、約40 µg、約45 µg、約50 µg、約60 µg或約70 µg之載體蛋白質。
各劑量較佳地包含約30 µg至約70 µg之載體蛋白質。
本發明之組成物可包括少量游離載體。當給出之載體蛋白質係以游離及結合兩種形式存在於本發明之組成物中時，非結合形式總體上較佳地不超過組成物中的載體蛋白質總量之5%，且更佳地以少於2重量%存在。 3. 本發明之含皂素之脂質體佐劑
本發明之致免疫性組成物包含含皂素之脂質體佐劑。
在較佳的態樣中，本發明之含皂素之脂質體佐劑為包含至少一種皂素之含單磷醯基脂質A (MPLA)之脂質體組成物。在一個態樣中，含皂素之脂質體佐劑包含含單磷醯基脂質A (MPLA)之脂質體組成物及至少一種皂素，其中脂質體組成物包含i)包含磷脂之脂質雙層及ii)膽固醇。
在一個態樣中，皂素可選自QS-7、QS-18、QS-21或其混合物。皂素較佳為QS-21。
在一個態樣中，磷脂係選自二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)和二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)。磷脂較佳為DMPC和DMPG。
在較佳的態樣中，含皂素之脂質體佐劑包含單磷醯基脂質A (MPLA)、QS-21、DMPC、DMPG及膽固醇。
在非常佳的態樣中，含皂素之脂質體佐劑包含在磷酸鹽緩衝液中的單磷醯基脂質A (MPLA)、QS-21、DMPC、DMPG及膽固醇。
MPLA較佳為單磷醯基3-去醯基脂質A (亦稱為3D-PHAD)。3D PHAD為衍生自明尼蘇達沙氏桿菌之MPLA的合成類似物。
在一個態樣中，本發明之致免疫性組成物包含約0.1至約1.0 mg/mL或更高的MPLA，包括約0.1 mg/mL、約0.2 mg/mL、約0.3 mg/mL、約0.4 mg/mL、約0.5 mg/mL、約0.6 mg/mL、約0.7 mg/mL、約0.8 mg/mL、約0.9 mg/mL或約1.0 mg/mL或更高的MPLA (較佳為單磷醯基3-去醯基脂質A)。
在一個態樣中，組成物包含約0.2至約0.6 mg/mL之MPLA (較佳為單磷醯基3-去醯基脂質A)。
在一個較佳的態樣中，組成物包含約0.3至約0.5 mg/mL之MPLA (較佳為單磷醯基3-去醯基脂質A)。
在一個特別的態樣中，組成物包含約0.4 mg/mL之MPLA (較佳為單磷醯基3-去醯基脂質A)。
在一個態樣中，本發明之致免疫性組成物包含約0.05至約1.0 mg/mL或更高的QS-21，包括約0.05 mg/mL、約0.1 mg/mL、約0.2 mg/mL、約0.3 mg/mL、約0.4 mg/mL、約0.5 mg/mL、約0.6 mg/mL、約0.7 mg/mL、約0.8 mg/mL、約0.9 mg/mL或約1.0 mg/mL或更高的QS-21。
在一個態樣中，組成物包含約0.1至約0.4 mg/mL之QS-21。
在一個特別的態樣中，組成物包含約0.2 mg/mL之QS-21。
在一個態樣中，本發明之致免疫性組成物包含約0.5至約20 mg/mL或更高的膽固醇，包括約1.0 mg/mL、約2.0 mg/mL、約3.0 mg/mL、約4.0 mg/mL、約5.0 mg/mL、約6.0 mg/mL、約7.0 mg/mL、約8.0 mg/mL、約9.0 mg/mL、約10.0 mg/mL、約11.0 mg/mL、約12.0 mg/mL、約13.0 mg/mL、約14.0 mg/mL、約15.0 mg/mL、約16.0 mg/mL、約17.0 mg/mL、約18.0 mg/mL、約19.0 mg/mL、約20.0 mg/mL或更高的膽固醇。
在一個態樣中，組成物包含約5至約15 mg/mL之膽固醇。
在一個特別的態樣中，組成物包含約11 mg/mL之膽固醇。
在一個態樣中，本發明之致免疫性組成物包含約0.5至約20 mg/mL或更高的DMPC，包括約0.5 mg/mL、約1.0 mg/mL、約2.0 mg/mL、約3.0 mg/mL、約4.0 mg/mL、約5.0 mg/mL、約6.0 mg/mL、約7.0 mg/mL、約8.0 mg/mL、約9.0 mg/mL、約10.0 mg/mL、約11.0 mg/mL、約12.0 mg/mL、約13.0 mg/mL、約14.0 mg/mL、約15.0 mg/mL、約16.0 mg/mL、約17.0 mg/mL、約18.0 mg/mL、約19.0 mg/mL、約20.0 mg/mL或更高的DMPC。
在一個態樣中，組成物包含約5至約15 mg/mL之DMPC。
在一個態樣中，組成物包含約14 mg/mL之DMPC。
在一個態樣中，本發明之致免疫性組成物包含約0.5至約3.0 mg/mL或更高的DMPG，包括約0.5 mg/mL、約0.6 mg/mL、約0.7 mg/mL、約0.8 mg/mL、約0.9 mg/mL、約1.0 mg/mL、約1.1 mg/mL、約1.2 mg/mL、約1.3 mg/mL、約1.4 mg/mL、約1.5 mg/mL、約1.6 mg/mL、約1.7 mg/mL、約1.8 mg/mL、約1.9 mg/mL、約2.0 mg/mL或更高，或至少約2.5 mg/mL、至少約3.0 mg/mL或更高的DMPG。
在一個態樣中，組成物包含約1.0至約2.0 mg/mL之DMPG。
在一個特別的態樣中，組成物包含約1.6 mg/ml之DMPG。
在較佳的態樣中，包含含皂素之脂質體佐劑之致免疫性組成物包含約0.4 mg/mL之單磷醯基3-去醯基脂質A (亦稱為3D-PHAD)、約0.2 mg/mL之QS-21、約14 mg/mL之DMPC、約1.6 mg/ml之DMPG及約11 mg/mL之膽固醇。
在另一的態樣中，包含含皂素之脂質體佐劑之致免疫性組成物包含約0.8 mg/mL之單磷醯基3-去醯基脂質A (亦稱為3D-PHAD)、約0.4 mg/mL之QS-21、約28 mg/mL之DMPC、約3.2 mg/ml之DMPG及約22 mg/mL之膽固醇。
在另一的態樣中，包含含皂素之脂質體佐劑之致免疫性組成物約0.2 mg/mL之單磷醯基3-去醯基脂質A (亦稱為3D-PHAD)、約0.1 mg/mL之QS-21、約7 mg/mL之DMPC、約0.8 mg/ml之DMPG及約5.5 mg/mL之膽固醇。
本發明之含皂素之脂質體佐劑可為均質的或非均質的。如本文所使用之術語「均質」應意指包含具有30至400 nm之尺寸範圍的脂質體之最終佐劑調配物，該尺寸範圍係如本技術中已知的方法所測定，該等方法包括但不限於動態光散射(DLS)、透射電子低溫顯微術(例如低溫TEM或低溫EM)、奈米粒子追蹤分析(Nanoparticle Tracking Analysis)(NTA，例如ViewSizer)。「均質」佐劑調配物亦可意指包含具有介於約0.05至0.5之間或介於約0.05至約0.3之間，較佳為約0.3之多分散性指數(PDI)的脂質體之最終佐劑調配物。如本文所使用之術語「非均質」應意指包含具有30 nm至超過10微米、約30 nm至4微米、約30 nm至1400 nm、較佳為約30 nm至1000 nm之不同尺寸範圍的脂質體之最終佐劑調配物，該尺寸範圍係如本技術中已知的方法所測定，該等方法包括但不限於動態光散射(DLS)、透射電子顯微術(例如低溫TEM或低溫EM)、奈米粒子追蹤分析(NTA，例如ViewSizer)。「非均質」佐劑調配物亦可意指包含具有＞0.5之多分散性指數(PDI)的脂質體之最終佐劑調配物。如本文所使用之術語「約」係指參考值之±5%。
在一實施態樣中，本發明之含皂素之脂質體佐劑為均質的。
在一實施態樣中，本發明之含皂素之脂質體佐劑為非均質的。
除非另有其他註明，否則在本申請案的實施例中所使用的含皂素之脂質體佐劑為非均質含皂素之脂質體佐劑。
在一個態樣中，本發明之含皂素之脂質體佐劑係根據PCT申請案號PCT/IB2023/052255中所述之製程及方法生產，將其全文併入本文以供參考。描述可擴展用於製造之多種製備非均質及均質脂質體佐劑調配物之製程。
在本發明中，含皂素之脂質體佐劑可藉由生產包含脂質體雙層之均質佐劑調配物之第一方法生產，該脂質體雙層包含(a)單磷醯基脂質A (MPLA)、(b)皂素及(c)脂質體組成物，該脂質體組成物包含(i)至少一種選自磷脂醯膽鹼(PC)及/或磷脂醯甘油(PG)之磷脂，其中磷脂係選自由下列所組成之群組：二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)及其組合，及(ii)膽固醇，其中在脂質體組成物中之膽固醇的莫耳百分比濃度為大於50% (mol/mol)，或膽固醇對磷脂之莫耳比為大於1，該方法包含下列步驟： (i)將磷脂、膽固醇及MPLA溶解在有機溶劑中以形成有機相； (ii)將步驟(i)之有機相在特定流率及有機相對水相之特定比率下注入水相中以形成脂質體； (iii)將步驟(ii)之脂質體攪拌以形成中間物脂質體； (iv)將步驟(iii)之中間物脂質體的有機相移除； (v)將步驟(iv)之中間物脂質體濃縮；且 (vi)將步驟(v)之中間物脂質體與皂素化合以形成具有約30至400 nm之尺寸範圍及0.05至0.5之多分散性指數的最終佐劑調配物， 由此生產均質佐劑調配物。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的一個態樣中，在步驟(i)中，將磷脂、膽固醇及MPLA藉由音波處理、加熱或其組合溶解在有機溶劑中，較佳地藉由加熱。在一個態樣中，有機溶劑為乙醇或異丙醇。在另一態樣中，將有機相加熱至介於45℃至65℃之間的溫度。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的另一態樣中，水相包含水及視需要的緩衝液。在較佳的態樣中，緩衝液包含在pH 6.2下含有150 mM NaCl之10 mM磷酸鹽。在較佳的態樣中，水相為在pH 6.2下含有150 mM NaCl之10 mM磷酸鹽。在另一態樣中，水相係在介於20℃至60℃之間的溫度下。在另一態樣中，步驟(ii)之流率為0.5 mL/min至400 mL/min或快速添加。在另一態樣中，步驟(ii)之流率為0.5 mL/min至400 mL/min。在另一態樣中，步驟(ii)之注入係藉由快速注入步驟(i)之有機相來進行。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的另一態樣中，步驟(iii)之中間物脂質體係在700 rpm至900 rpm之速率下攪拌。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的另一態樣中，步驟(ii)的有機相對水相之比係在1：4至1：16之範圍內。在較佳的態樣中，該比為1：8。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的另一態樣中，在步驟(iv)之中間物脂質體的尺寸係藉由使用高壓擠壓機或微流體均質機來縮減尺寸。在一個態樣中，在步驟(iv)之中間物脂質體的尺寸係藉由使用50 nm至120 nm之尺寸範圍的膜或介於17000 PSI與24000 PSI之間的均質化壓力或該兩者之組合來縮減尺寸。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的另一態樣中，有機溶劑係在步驟(iv)之尺寸縮減之前或步驟(iv)之尺寸縮減之後移除。在一個態樣中，移除步驟(iv)之中間物脂質體的有機相係藉由切向流過濾(TFF)。在另一態樣中，TFF為TFF透濾。在另一態樣中，TFF包含具有100至500 kDa之範圍的截留分子量(MWCO)之膜。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的另一態樣中，步驟(v)之濃縮係藉由超濾。在一個態樣中，超濾包含生物負荷減少過濾器及無菌過濾器。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的另一態樣中，步驟(vi)之化合係在300 rpm之混合速度下。在一個態樣中，步驟(vi)之化合時間係在1小時至24小時之範圍內。在另一態樣中，步驟(vi)之化合係發生在室溫或2至8℃下。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的另一態樣中，最終佐劑調配物具有約30 nm至400 nm之尺寸範圍。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的另一態樣中，最終佐劑調配物具有0.05至0.5之多分散性指數。
在生產均質佐劑組成物之第一方法的進一步態樣中，步驟(ii)之注入係藉由泵或注射器注入。在較佳的態樣中，步驟(ii)之注入係藉由泵。
在一個態樣中，本發明之含皂素之脂質體佐劑可藉由生產包含脂質體雙層之均質佐劑調配物之第二方法生產，該脂質體雙層包含(a)單磷醯基脂質A (MPLA)，(b)皂素及(c)脂質體組成物，該脂質體組成物包含(i)至少一種選自磷脂醯膽鹼(PC)及/或磷脂醯甘油(PG)之磷脂，其中磷脂係選自由下列所組成之群組：二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)及其組合，及(ii)膽固醇，其中在脂質體組成物中之膽固醇的莫耳百分比濃度為大於50% (mol/mol)，或膽固醇對磷脂之莫耳比為大於1，該方法包含下列步驟： (i)將磷脂、膽固醇及MPLA溶解在有機溶劑或有機溶劑的混合物中以形成有機相； (ii)將步驟(i)之有機相在特定流率及有機相對水相之特定比率下注入水相中以形成脂質體； (iii)將步驟(ii)之中間物脂質體濃縮； (iv)將步驟(iii)之中間物脂質體的有機相移除； (v)將步驟(iv)之中間物脂質體過濾；且 (vi)將步驟(v)之中間物脂質體與皂素化合以形成具有約30至400 nm之尺寸範圍及0.05至0.5之多分散性指數的最終佐劑調配物， 由此生產均質佐劑調配物。
在生產均質佐劑組成物之第二方法的另一態樣中，在步驟(i)中，將磷脂、膽固醇及MPLA藉由音波處理、加熱、攪拌或其組合溶解在有機溶劑中。在一個態樣中，有機溶劑為乙醇或異丙醇或其他有機溶劑。在一個態樣中，有機溶劑為乙醇或異丙醇。在另一態樣中，將有機相加熱至介於45℃至65℃之間的溫度，較佳地介於50℃至65℃之間或介於45℃至55℃之間。
在生產均質佐劑組成物之第二方法的另一態樣中，水相包含水及視需要的緩衝液。在一個態樣中，緩衝液包含在pH 6.2下含有150 mM NaCl之10 mM磷酸鹽。在較佳的態樣中，水相為在pH 6.2下含有150 mM NaCl之10 mM磷酸鹽。在另一態樣中，水相係在介於20℃至60℃之間的溫度下。在另一態樣中，步驟(ii)之流率為5 mL/min至15 mL/min。在另一態樣中，步驟(ii)之流率為12 mL/min。在另一態樣中，步驟(ii)之中間物脂質體係在100 rpm至1000 rpm之速率下攪拌。在另一態樣中，步驟(ii)的有機相對水相之比係在1：2至1：16之範圍內。在較佳的態樣中，該比為4：7。
在生產均質佐劑組成物之第二方法的另一態樣中，步驟(iii)之濃縮係藉由超濾。
在生產均質佐劑組成物之第二方法的另一態樣中，移除步驟(iv)之中間物脂質體的有機相係藉由切向流過濾(TFF)。在一個態樣中，TFF為TFF透濾。在另一態樣中，TFF包含具有100至500 kDa之範圍的截留分子量(MWCO)之膜。
在生產均質佐劑組成物之第二方法的另一態樣中，步驟(v)之過濾包含生物負荷減少過濾器及無菌過濾器。
在生產均質佐劑組成物之第二方法的另一態樣中，步驟(vi)之化合係在RT下以350 rpm之混合速率經1小時。
在生產均質佐劑組成物之第二方法的另一態樣中，最終佐劑調配物具有約50至200 nm之尺寸範圍。最終佐劑調配物較佳地具有約100 nm之尺寸。
在生產均質佐劑組成物之第二方法的另一態樣中，最終佐劑調配物具有0.05至0.5之多分散性指數。最終佐劑調配物較佳地具有＜0.2之PDI。
在生產均質佐劑組成物之第二方法的進一步態樣中，步驟(ii)之注入係藉由泵或注射器注入。在較佳的態樣中，步驟(ii)之注入係藉由泵。
在另一態樣中，本發明之含皂素之脂質體佐劑可藉由生產包含脂質體雙層之非均質佐劑調配物之第一方法生產，該脂質體雙層包含(a)單磷醯基脂質A (MPLA)、(b)皂素及(c)脂質體組成物，該脂質體組成物包含(i)至少一種選自磷脂醯膽鹼(PC)及/或磷脂醯甘油(PG)之磷脂，其中磷脂係選自由下列所組成之群組：二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)及其組合，及(ii)膽固醇，其中在脂質體組成物中之膽固醇的莫耳百分比濃度為大於50% (mol/mol)，或膽固醇對磷脂之莫耳比為大於1，該方法包含下列步驟： (i)將磷脂、膽固醇及MPLA溶解在有機溶劑中以形成作為有機相之脂質溶液； (ii)將步驟(i)之有機相及水相一起在特定流率及有機溶劑相對水相之特定比率下同時注入水相中以形成脂質體； (iii)將步驟(ii)之中間物脂質體濃縮； (iv)將步驟(iii)之中間物脂質體的有機相移除； (v)將步驟(iv)之中間物脂質體以微流控均質機在~17500 psi下處理10次； (vi)將步驟(v)之中間物脂質體使用0.22 um膜過濾；且 (vii)將步驟(vi)之中間物脂質體與皂素化合， 由此生產非均質佐劑調配物。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，在步驟(i)中，將磷脂、膽固醇及MPLA藉由音波處理、加熱、攪拌或其組合溶解在有機溶劑中。在一個態樣中，有機溶劑為乙醇或異丙醇或其混合物。在另一態樣中，將脂質調配物有機相加熱至45至65℃之溫度。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，水相包含水及視需要的緩衝液。在一個態樣中，緩衝液包含在pH 6.2下含有150 mM NaCl之10 mM磷酸鹽。在較佳的態樣中，水相為在pH 6.2下含有150 mM NaCl之10 mM磷酸鹽。在另一態樣中，水相係在介於45℃至60℃之間的溫度下。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，在步驟(ii)中，有機相具有0.5至2 ml/min之流率及水相具有5至15 ml/min之流率。在第一方法的另一態樣中，在步驟(ii)中，有機相具有1.333 ml/min之流率及水相具有10.667 ml/min之流率。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，步驟(iii)之中間物脂質體係在100 rpm至900 rpm之速率下攪拌。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，步驟(ii)的有機相對水相之比係在1：4至1：8之範圍內。在較佳的態樣中，該比為1：8。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，步驟(iii)和步驟(iv)之中間物脂質體的有機相之移除係藉由切向流過濾(TFF)。在一個態樣中，TFF為TFF超濾及透濾。在另一態樣中，TFF包含具有100至500 kDa之範圍的截留分子量(MWCO)之膜。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，步驟(iii)之濃縮係藉由超濾。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，在步驟(iv)中之中間物脂質體的尺寸係藉由使用微流控均質機來處理。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，有機溶劑係在步驟(v)之微流控均質化之前移除。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，將緩衝液添加至步驟(vii)之化合中。在一個態樣中，步驟(vii)之化合係在RT下以350 rpm之混合速率經1小時至48小時或攪動1 hr。在另一態樣中，在步驟(vii)之化合之後，將中間物脂質體在RT下不攪拌貯存至多48小時。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，最終佐劑調配物具有約300 nm至1000 nm之尺寸。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的另一態樣中，最終佐劑調配物具有0.4至1.0之多分散性指數。
在生產非均質佐劑調配物之第一方法的進一步態樣中，步驟(ii)之注入係藉由Nanoassemblr或泵或注射器注入。
在另一態樣中，本發明之含皂素之脂質體佐劑可藉由生產包含脂質體雙層之非均質佐劑調配物之第二方法生產，該脂質體雙層包含(a)單磷醯基脂質A (MPLA)、(b)皂素及(c)脂質體組成物，該脂質體組成物包含(i)至少一種選自磷脂醯膽鹼(PC)及/或磷脂醯甘油(PG)之磷脂，其中磷脂係選自由下列所組成之群組：二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)及其組合，及(ii)膽固醇，其中在脂質體組成物中之膽固醇的莫耳百分比濃度為大於50% (mol/mol)，或膽固醇對磷脂之莫耳比為大於1，該方法包含下列步驟： (i)將磷脂、膽固醇及MPLA溶解在有機溶劑中以形成作為脂質調配物之有機相； (ii)將步驟(i)之有機相在特定流率及有機相對水相之特定比率下注入水相中以形成脂質體； (iii)將步驟(ii)之脂質體攪拌以形成中間物脂質體； (iv)將步驟(iii)之中間物脂質體濃縮； (v)將步驟(iv)之中間物脂質體的有機相移除；且 (vi)將步驟(vi)之中間物脂質體與皂素化合， 由此生產非均質佐劑調配物。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，在步驟(i)中，將磷脂、膽固醇及MPLA藉由音波處理、加熱、攪拌或其組合溶解在有機溶劑中。在一個態樣中，有機溶劑包含乙酸乙酯及異丙醇。在另一態樣中，將脂質調配物有機相加熱至50℃至65℃之溫度。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，水相包含水及視需要的緩衝液。在一個態樣中，緩衝液包含在pH 6.2下含有150 mM NaCl之10 mM磷酸鹽。在較佳的態樣中，水相為在pH 6.2下含有150 mM NaCl之10 mM磷酸鹽。在另一態樣中，水相係在20℃至25℃之溫度下。在進一步的態樣中，步驟(ii)之流率為10至30 mL/min。在進一步的態樣中，步驟(ii)之流率為20 mL/min。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，步驟(iii)之中間物脂質體係在100 rpm至900 rpm之速率下攪拌。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，步驟(ii)的有機相對水相之比係在1：4至1：8之範圍內。在較佳的態樣中，該比為1：8。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，有機溶劑係在步驟(vi)之化合之前移除。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，步驟(iv)和步驟(v)之中間物脂質體的有機相之移除係藉由切向流過濾(TFF)。在一個態樣中，TFF為TFF超濾及透濾。在另一態樣中，TFF包含具有100至500 kDa之範圍的截留分子量(MWCO)之膜。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，步驟(vi)之濃縮係藉由超濾。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，將緩衝液添加至步驟(vi)之化合中。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，步驟(vi)之化合係在RT下以300 rpm之混合速率經1小時。在一個態樣中，在步驟(vii)之化合之後，將中間物脂質體在RT下不攪拌貯存24小時。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，最終佐劑調配物具有300 nm至1000 nm之尺寸範圍。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，最終佐劑調配物具有0.4至1.0之多分散性指數。
在生產非均質佐劑調配物之第二方法的另一態樣中，步驟(ii)之注入係藉由移液管、泵或注射器注入。
在另一態樣中，本發明之含皂素之脂質體佐劑可藉由生產包含脂質體雙層之非均質佐劑調配物之第三方法生產，該脂質體雙層包含(a)單磷醯基脂質A (MPLA)、(b)皂素及(c)脂質體組成物，該脂質體組成物包含(i)至少一種選自磷脂醯膽鹼(PC)及/或磷脂醯甘油(PG)之磷脂，其中磷脂係選自由下列所組成之群組：二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)及其組合，及(ii)膽固醇，其中在脂質體組成物中之膽固醇的莫耳百分比濃度為大於50% (mol/mol)，或膽固醇對磷脂之莫耳比為大於1，該方法包含下列步驟： (i)製備包含磷脂、膽固醇及MPLA的經凍乾之有機相； (ii)將步驟(i)的經凍乾之有機相以水相再水合以形成中間物脂質體； (iii)將步驟(ii)之中間物脂質體使用微流控均質機縮減尺寸； (iv)將步驟(iii)之中間物脂質體與皂素化合， 由此生產非均質佐劑調配物。
在生產非均質佐劑調配物之第三方法的另一態樣中，在步驟(i)中，將磷脂、膽固醇及MPLA藉由音波處理、加熱、攪拌或其組合溶解在有機溶劑中。在一個態樣中，有機溶劑包含三級丁醇(TBA)或其混合物。在另一態樣中，將脂質有機相加熱至25℃至65℃之溫度。在另一態樣中，將有機相溶液凍乾。
在生產非均質佐劑調配物之第三方法的另一態樣中，水相包含水或緩衝液。在一個態樣中，緩衝液包含在pH 6.2下含有150 mM NaCl之10 mM磷酸鹽。在較佳的態樣中，水相為在pH 6.2下含有150 mM NaCl之10 mM磷酸鹽。在另一態樣中，水相係在20℃至70℃之溫度下。
在生產非均質佐劑調配物之第三方法的另一態樣中，將步驟(ii)之中間物脂質體在100至1000 rpm之速率下攪拌。
在生產非均質佐劑調配物之第三方法的另一態樣中，將步驟(iii)之中間物脂質體的尺寸以微流控均質機及在或約18640 PSI之壓力下縮減尺寸。
在生產非均質佐劑調配物之第三方法的另一態樣中，有機溶劑係在步驟(ii)之再水合之前移除。在一個態樣中，有機溶劑之移除係藉由凍乾。
在生產非均質佐劑調配物之第三方法的另一態樣中，將緩衝液添加至步驟(iv)之化合中。
在生產非均質佐劑調配物之第三方法的另一態樣中，步驟(iv)之化合係在RT下以300 rpm之混合速率或藉由攪動經1小時。
在生產非均質佐劑調配物之第三方法的另一態樣中，在步驟(iv)之化合之後，將中間物脂質體在RT下不攪拌貯存24小時。
在生產非均質佐劑調配物之第三方法的另一態樣中，最終佐劑調配物具有＞300 nm的尺寸。
在生產非均質佐劑調配物之第三方法的另一態樣中，最終佐劑調配物具有＞0.4之多分散性指數。
在生產均質或非均質佐劑調配物之方法的一個態樣中，皂素係選自由下列所組成之群組：QS-7、QS-18、QS-21或其混合物。在較佳的態樣中，皂素為QS-21。
在生產均質或非均質佐劑調配物之方法的一個態樣中，該至少一種磷脂為二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)和二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)之混合物。
在一個態樣中，佐劑調配物之脂質體組成物可包含超過50% (mol/mol)、約55%至約71% (mol/mol)或較佳為約55% (mol/mol)之莫耳百分比濃度之膽固醇。
在一個態樣中，本發明之含皂素之脂質體佐劑為包含至少一種皂素(例如QS-21)的含單磷醯基脂質A (MPLA)之脂質體組成物，如美國專利案號10,434,167中所述(例如ALFQ)，特此併入其全文以供參考。 4. 其他佐劑
本文所揭示之致免疫性組成物可另包含額外的佐劑。在一些實施態樣中，本文所揭示之致免疫性組成物可另包含至少一種額外的佐劑。
術語「佐劑」係指增強對抗原的免疫反應之化合物或混合物。抗原主要可充當為遞送系統，主要充當為免疫調節劑或具有該兩者的強力特徵。適合的佐劑包括適用於哺乳動物(包括人類)之佐劑。
在一實施態樣中，本文所揭示之致免疫性組成物另包含鋁鹽(alum)作為佐劑(例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)。
在較佳的實施態樣中，本文所揭示之致免疫性組成物另包含磷酸鋁或氫氧化鋁作為佐劑。在甚至較佳的實施態樣中，本文所揭示之致免疫性組成物包含磷酸鋁作為佐劑。
在本發明之一實施態樣中，如本文所揭示之致免疫性組成物另包含CpG寡核苷酸作為佐劑。如本文所使用之CpG寡核苷酸係指免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)，且據此該等術語可互換使用，除非另有其他指示。免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸含有一或多個免疫刺激性CpG基序，其為視需要地在特定較佳的鹼基背景內之未甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸。CpG免疫刺激性基序之甲基化狀態通常係指在二核苷酸中的胞嘧啶殘基。含有至少一個未甲基化CpG二核苷酸之免疫刺激性寡核苷酸為含有以磷酸酯鍵連結至3'鳥嘌呤之5'未甲基化胞嘧啶且通過與類鐸受體9 (TLR-9)結合來活化免疫系統之寡核苷酸。在另一實施態樣中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多個甲基化CpG二核苷酸，其係通過TLR9活化免疫系統，但不如CpG基序之未甲基化一樣強。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多個迴文序列，其進而可涵蓋CpG二核苷酸。CpG寡核苷酸已在多個頒予之專利、公開專利申請案及其他公開案中描述，包括美國專利案號6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；和6,339,068。
在本發明之一實施態樣中，如本文所揭示之致免疫性組成物包含在WO 2010/125480的第3頁第22行至第12頁第36行所描述之CpG寡核苷酸中之任一者。
已鑑定出不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸。該等被稱為A、B、C和P類別，且更詳細地描述於WO 2010/125480的第3頁第22行至第12頁第36行。本發明之方法涵蓋該等不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸之用途。 5. 其他抗原
本發明之致免疫性組成物包含經結合之肺炎鏈球菌醣抗原(醣結合物)。該等亦可另包括來自其他病原體，特別地來自細菌及/或病毒之抗原。較佳的其他抗原係選自：白喉類毒素(D)、破傷風類毒素(T)、百日咳抗原(P)(其通常為非細胞型(Pa))、B型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、A型肝炎病毒(HAV)抗原、經結合之b型流感嗜血桿菌莢膜醣(Hib)、失活之脊髓灰白質病毒疫苗(IPV)。
在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物包含D-T-Pa。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物包含D-T-Pa-Hib、D-T-Pa-IPV或D-T-Pa-HBsAg。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV或D-T-Pa-HBsAg-Hib。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib。
百日咳抗原：百日咳博德氏桿菌引起百日咳。在疫苗中的百日咳抗原為細胞型(全細胞，呈失活之百日咳博德氏桿菌細胞形式)或非細胞型。細胞型百日咳抗原之製備已有完備記載(例如其可藉由百日咳博德氏桿菌的I期培養物之熱失活來獲得)。然而，本發明較佳地使用非細胞型抗原。在使用非細胞型抗原的情況下，較佳的是使用下列抗原中之一者、兩者或(較佳地)三者：(1)去毒化百日咳毒素(百日咳類毒素或PT)；(2)絲狀血球凝集素(FHA)；(3)百日咳桿菌黏附素(pertactin)(亦稱為69千道爾頓外膜蛋白質)。FHA及百日咳桿菌黏附素可在根據本發明使用之前以甲醛處理。PT較佳地藉由以甲醛及/或戊二醛處理來去毒化。非細胞型百日咳抗原較佳地吸附至一或多種鋁鹽佐劑上。作為替代方案，其可以未吸附狀態添加。在添加百日咳桿菌黏附素的情況下，則其較佳地已吸附至氫氧化鋁佐劑上。PT及FHA可吸附至氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁上。以PT、FHA及百日咳桿菌黏附素全部皆吸附至氫氧化鋁上最佳。
失活之脊髓灰白質病毒疫苗：脊髓灰白質病毒引起脊髓灰白質炎。本發明之較佳的實施態樣使用IPV，而非使用經口脊髓灰白質病毒疫苗。在投予患者之前，脊髓灰白質病毒必須失活，且這可藉由以甲醛處理來達成。脊髓灰白質炎可由三種類型的脊髓灰白質病毒中之一者引起。三種類型相似且引起相同的症狀，但該等在抗原上不同且以一種類型的感染不阻止其他類型免於感染。因此，較佳的是使用本發明中的三種脊髓灰白質病毒抗原：1型脊髓灰白質病毒(例如Mahoney菌株)、2型脊髓灰白質病毒(例如MEF-1菌株)及3型脊髓灰白質病毒(例如Saukett菌株)。病毒較佳地個別生長、純化及失活，且接著合併以給出與本發明使用之主體三價混合物。
白喉類毒素：白喉棒狀桿菌引起白喉。白喉毒素可經處理(例如使用福馬林或甲醛)以移除毒性，同時保留在注射後誘發特異性抗毒素抗體的能力。將該等白喉類毒素用於白喉疫苗中。較佳的白喉類毒素為藉由甲醛處理所製備之白喉類毒素。白喉類毒素可藉由使白喉棒狀桿菌於生長培養基中生長、隨後以甲醛處理、超濾且沈澱來獲得。接著可將類毒素物料以包含無菌過濾及/或透析之製程處理。白喉類毒素較佳地吸附至氫氧化鋁佐劑上。
破傷風類毒素：破傷風桿菌引起破傷風。破傷風毒素可經處理以給出保護性類毒素。將類毒素用於破傷風疫苗中。較佳的破傷風類毒素為藉由甲醛處理所製備之破傷風類毒素。破傷風類毒素可藉由使破傷風桿菌於生長培養基中生長、隨後以甲醛處理、超濾且沈澱來獲得。接著可將物料以包含無菌過濾及/或透析之製程處理。
A型肝炎病毒抗原：A型肝炎病毒(HAV)為引起病毒性肝炎之已知的病毒中之一者。較佳的HAV組份係基於失活之病毒，且失活可藉由以福馬林處理來達成。
B型肝炎病毒(HBV)為引起病毒性肝炎之已知的病毒中之一者。殼體的主要組份為稱為HBV表面抗原或更常稱為HBsAg之蛋白質，其通常為具有~24 kDa之分子量的226個胺基酸多肽。所有現有的B型肝炎疫苗皆含有HBsAg，且當此抗原投予正常疫苗接種者時，其刺激免受HBV感染的抗HBsAg抗體之生產。用於疫苗製造之HBsAg已以兩種方式製成：自慢性B型肝炎載體的血漿純化呈微粒形式之抗原或以重組DNA方法(例如在酵母細胞中的重組表現)表現蛋白質。與天然HBsAg (亦即如在經血漿純化之產物中)不同，經酵母表現之HBsAg通常未經糖化，且此為與本發明使用之HBsAg的最佳形式。
經結合之b型流感嗜血桿菌抗原：b型流感嗜血桿菌(Hib)引起細菌性腦膜炎。Hib疫苗通常係基於莢膜糖抗原，其製法已有完備記載。Hib醣可與載體蛋白質結合，以便增強其致免疫性，尤其在兒童中。典型的載體蛋白質為破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM 197、流感嗜血桿菌蛋白質D及來自血清群B腦膜炎球菌之外膜蛋白複合物。結合物之醣部分可包含如自Hib細菌所製備之全長磷酸多核糖基核糖醇(polyribosylribitol)(PRP)及/或全長PRP之片段。Hib結合物可吸附或可不吸附至鋁鹽佐劑。
在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物另包括經結合之腦膜炎雙球菌血清群Y莢膜醣(MenY)及/或經結合之腦膜炎雙球菌血清群C莢膜醣(MenC)。
在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物另包括經結合之腦膜炎雙球菌血清群A莢膜醣(MenA)、經結合之腦膜炎雙球菌血清群W135莢膜醣(MenW135)、經結合之腦膜炎雙球菌血清群Y莢膜醣(MenY)及/或經結合之腦膜炎雙球菌血清群C莢膜醣(MenC)。
在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物另包括經結合之腦膜炎雙球菌血清群W135莢膜醣(MenW135)、經結合之腦膜炎雙球菌血清群Y莢膜醣(MenY)及/或經結合之腦膜炎雙球菌血清群C莢膜醣(MenC)。 6. 調配物
本發明之致免疫性組成物可調配成液體形式(亦即溶液或懸浮液)或凍乾形式。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係調配成液體形式。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係調配成凍乾形式。液體調配物可有利地自其包裝形式直接投予且因此非常適合於注射而無需在水性介質中回溶，如本發明之凍乾組成物所要求的其他情況。
本發明之致免疫性組成物的調配物可使用本技術認可之方法完成。例如，個別的多醣及/或結合物可以生理上可接受的媒劑調配以製備組成物。此等媒劑的實例包括但不限於水、緩衝食鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)和右旋糖溶液。
本揭示提供包含本文所揭示之醣結合物與醫藥上可接受的賦形劑、載劑或稀釋劑的組合中之任一者之致免疫性組成物。
在一實施態樣中，本揭示之致免疫性組成物係呈液體形式，較佳為水性液體形式。
本揭示之致免疫性組成物可包含緩衝液、鹽、二價陽離子、非離子清潔劑、低溫保護劑(諸如糖)和抗氧化劑(諸如自由基清除劑或螯合劑)或其任何多種組合中之一或多者。
在一實施態樣中，本揭示之致免疫性組成物包含緩衝液。在一實施態樣中，該緩衝液具有約3.5至約7.5之pKa。在一些實施態樣中，緩衝液為磷酸鹽、琥珀酸鹽、組胺酸或檸檬酸鹽。在一些實施態樣中，緩衝液為琥珀酸鹽。在一些實施態樣中，緩衝液為組胺酸。在特定的實施態樣中，緩衝液為1 mM至10 mM之最終濃度的琥珀酸鹽。在一個特別的實施態樣中，琥珀酸鹽緩衝液之最終濃度為約5 mM。
在一實施態樣中，本揭示之致免疫性組成物包含鹽。在一些實施態樣中，鹽係選自由氯化鎂、氯化鉀、氯化鈉及其組合所組成之群組。在一個特別的實施態樣中，鹽為氯化鈉。在一個特別的實施態樣中，本發明之致免疫性組成物包含150 mM之氯化鈉。
在一實施態樣中，本揭示之致免疫性組成物包含界面活性劑。在一實施態樣中，界面活性劑係選自由下列所組成之群組：聚山梨醇酯20 (TWEEN TM20)、聚山梨醇酯40 (TWEEN TM40)、聚山梨醇酯60 (TWEEN™60)、聚山梨醇酯65 (TWEEN™65)、聚山梨醇酯80 (TWEEN™80)、聚山梨醇酯85 (TWEEN™85)、TRITON™ N-101、TRITON™ X-100、辛苯聚醇(oxtoxynol) 40、壬苯醇醚(nonoxynol)-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧乙烯-660羥基硬脂酸酯(PEG-15、Solutol H 15)、聚氧乙烯-35-蓖麻油酸酯(CREMOPHOR® EL)、大豆卵磷脂和泊洛沙姆(poloxamer)。
在特定的實施態樣中，本揭示之致免疫性組成物具有5.5至7.5之pH，更佳為5.6至7.0之pH。
在一個實施態樣中，本揭示提供由本文所揭示之致免疫性組成物中之任一者填充之容器。在一個實施態樣中，容器係選自由下列所組成之群組：小瓶、注射器、燒瓶、發酵罐、生物反應器、袋、罐、安瓶、卡管及可棄式筆。在特定的實施態樣中，容器經矽化。
在一實施態樣中，本揭示之容器係由玻璃、金屬(例如鋼、不銹鋼、鋁等等)及/或聚合物(例如熱塑性體、彈性體、熱塑性彈性體)製成。在一實施態樣中，本揭示之容器係由玻璃製成。
在一個實施態樣中，本揭示提供由本文所揭示之致免疫性組成物中之任一者填充之注射器。在特定的實施態樣中，注射器經矽化及/或由玻璃製成。
用於注射的本發明之致免疫性組成物的典型劑量具有0.1 mL至2 mL之體積。在一實施態樣中，用於注射的本發明之致免疫性組成物具有0.2 mL至1 mL之體積，甚至更佳為約0.5 mL之體積。 7. 本發明之致免疫性組成物之用途
本文所揭示之醣結合物可用作為抗原。例如，該等可為疫苗的一部分。
因此，在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係用作為藥物。
在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係用作為疫苗。
因此，在一實施態樣中，本文所述之致免疫性組成物係於個體中用於產生免疫反應。在一個態樣中，個體為哺乳動物，諸如人類、非人類靈長類動物、貓、綿羊、豬、馬、牛科動物或狗。個體較佳為人類。
本文所述之致免疫性組成物可於治療性或預防性方法中用於預防、治療或改善個體的細菌感染、疾病或病況。特定言之，本文所述之致免疫性組成物可用於預防、治療或改善個體的肺炎鏈球菌感染、疾病或病況。本文所述之致免疫性組成物較佳地可藉由組成物中所含之血清型用於預防、治療或改善個體的肺炎鏈球菌感染、疾病或病況。
因此，在一個態樣中，本揭示提供預防、治療或改善個體的與組成物中存在之肺炎鏈球菌血清型相關的感染、疾病或病況之方法，其包含對個體投予免疫有效量的本揭示之致免疫性組成物。
在一態樣中，本揭示提供預防、治療或改善個體的與組成物中存在的肺炎鏈球菌血清型相關的感染、疾病或病況之方法，其包含對個體投予免疫有效量的本揭示之致免疫性組成物。
在一些此等實施態樣中，感染、疾病或病況係選自由下列所組成之群組：肺炎、鼻竇炎、中耳炎、急性中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、胸膜積膿(pleural empyema)、結膜炎、骨髓炎、敗血性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包膜炎、乳突炎、蜂窩組織炎、軟組織感染及腦膿瘍。
在一實施態樣中，本揭示提供誘發個體對組成物中存在的肺炎鏈球菌血清型的免疫反應之方法，其包含對個體投予免疫有效量的本揭示之致免疫性組成物。在一個態樣中，個體為哺乳動物，諸如人類、貓、綿羊、豬、馬、牛科動物或狗。個體較佳為人類。
在一實施態樣中，本揭示提供誘發個體對組成物中存在的肺炎鏈球菌血清型的免疫反應之方法，其包含對個體投予免疫有效量的本揭示之致免疫性組成物。在一個態樣中，個體為哺乳動物，諸如人類、貓、綿羊、豬、馬、牛科動物或狗。個體較佳為人類。
在一實施態樣中，本文所揭示之致免疫性組成物係用作為疫苗。在此等實施態樣中，本文所述之致免疫性組成物可用於預防個體由組成物中存在的肺炎鏈球菌血清型之感染。因此，在一個態樣中，本發明提供預防個體由組成物中存在的肺炎鏈球菌血清型感染之方法，其包含對個體投予免疫有效量的本揭示之致免疫性組成物。在一些此等實施態樣中，感染係選自由下列所組成之群組：肺炎、鼻竇炎、中耳炎、急性中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、胸膜積膿、結膜炎、骨髓炎、敗血性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包膜炎、乳突炎、蜂窩組織炎、軟組織感染及腦膿瘍。在一個態樣中，個體為哺乳動物，諸如人類、貓、綿羊、豬、馬、牛科動物或狗。個體較佳為人類。
在一個態樣中，本發明提供預防個體由組成物中存在的肺炎鏈球菌血清型感染之方法，其包含對個體投予免疫有效量的本揭示之致免疫性組成物。在一些此等實施態樣中，感染係選自由下列所組成之群組：肺炎、鼻竇炎、中耳炎、急性中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、胸膜積膿、結膜炎、骨髓炎、敗血性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包膜炎、乳突炎、蜂窩組織炎、軟組織感染及腦膿瘍。在一個態樣中，個體為哺乳動物，諸如人類、貓、綿羊、豬、馬、牛科動物或狗。個體較佳為人類。
本揭示之致免疫性組成物可用於保護或治療對組成物中存在的肺炎鏈球菌血清型感染敏感的人類，其係藉助於經由全身性或黏膜途徑投予致免疫性組成物。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係藉由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下途徑投予。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係藉由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下注射投予。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係藉由肌肉內或皮下注射投予。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係藉由肌肉內注射投予。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係藉由皮下注射投予。
本揭示之致免疫性組成物可用於保護或治療對組成物中存在的肺炎鏈球菌血清型感染敏感的人類，其係藉助於經由全身性或黏膜途徑投予致免疫性組成物。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係藉由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下途徑投予。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係藉由肌肉內、腹膜內、皮內或皮下注射投予。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係藉由肌肉內或皮下注射投予。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係藉由肌肉內注射投予。在一實施態樣中，本發明之致免疫性組成物係藉由皮下注射投予。 8. 欲以本發明之致免疫性組成物治療的個體
如本文所揭示，本文所述之致免疫性組成物可用於預防、治療或改善個體的細菌感染、疾病或病況之各種治療性或預防性方法。
在較佳的實施態樣中，該個體為人類。在最佳的實施態樣中，該個體為新生兒(亦即不滿三個月齡)、嬰兒(亦即3個月至一歲)或幼兒(亦即一歲至四歲)。在一實施態樣中，本文所揭示之致免疫性組成物係用作為疫苗。
在此實施態樣中，欲接種疫苗的個體可能不滿一歲。例如，欲接種疫苗的個體可為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11或約12個月齡。在一實施態樣中，欲接種疫苗的個體為約2、約4或約6個月齡。在另一實施態樣中，欲接種疫苗的個體為不滿2歲。例如，欲接種疫苗的個體可為約12至約15個月齡。在一些例子中，需要少至一次劑量的根據本發明之致免疫性組成物，但在一些情況下，可給予第二次、第三次或第四次劑量(參見下文章節8)。
在本發明之一實施態樣中，欲接種疫苗的個體為50歲或更年長的成人，更佳為55歲或更年長的成人。在一實施態樣中，欲接種疫苗的個體為65歲或更年長、70歲或更年長、75歲或更年長、或80歲或更年長的成人。
在一實施態樣中，欲接種疫苗的個體為免疫功能不全的個體，特別為人類。免疫功能不全的個體通常被定義為對傳染原攻擊發動正常的體液或細胞防禦的能力表現出減弱或降低的人。
在本發明之一實施態樣中，欲接種疫苗之免疫功能不全的個體患有損害免疫系統且導致抗體反應不足以防止或治療肺炎鏈球菌感染症的疾病或病況。
在一實施態樣中，該疾病為原發性免疫缺乏症。該原發性免疫缺乏症較佳地選自由下列所組成之群組：合併T細胞及B細胞免疫缺乏症、抗體缺乏症、明確定義的症候群、免疫失調疾病、吞噬細胞症、先天性免疫缺乏症、自體發炎性病症和補體缺乏症。在一實施態樣中，該原發性免疫缺乏症係選自WO 2010/125480之第24頁第11行至第25頁第19行中所揭示之病症。
在本發明之特別的實施態樣中，欲接種疫苗之免疫功能不全的個體患有選自由下列所組成之群組的疾病：HIV感染、後天免疫缺乏症候群(AIDS)、癌症、慢性心臟病或肺病、鬱血性心衰竭、糖尿病、慢性肝病、酒精中毒、肝硬化、脊髓液滲漏、心肌病、慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(COPD)、脾功能障礙(諸如鐮狀細胞疾病)、脾功能缺乏(無脾症)、血液惡性疾病、白血病、多發性骨髓瘤、霍奇金氏疾病(Hodgkin’s disease)、淋巴瘤、腎衰竭、腎病症候群及氣喘。
在本發明之一實施態樣中，欲接種疫苗之免疫功能不全的個體患有營養不良。
在本發明之特別的實施態樣中，欲接種疫苗之免疫功能不全的個體正服用降低身體對感染的抗性之藥物或治療。在一實施態樣中，該藥物係選自WO 2010/125480之第26頁第33行至第26頁第4行中所揭示之藥物。
在本發明之特別的實施態樣中，欲接種疫苗之免疫功能不全的個體為吸菸者。
在本發明之特別的實施態樣中，欲接種疫苗之免疫功能不全的個體具有低於5×10 9個細胞/公升、或低於4×10 9個細胞/公升、或低於3×10 9個細胞/公升、或低於2×10 9個細胞/公升、或低於1×10 9個細胞/公升、或低於0.5×10 9個細胞/公升、或低於0.3×10 9個細胞/公升、或低於0.1×10 9個細胞/公升之白血球計數(white blood cell count) (白血球計數(leukocyte count))。
白血球計數(white blood cell count) (白血球計數(leukocyte count))：在血液中的白血球(WBC)數目。WBC通常係作為CBC (全血球計數)的一部分測量。白血球為血液中的感染對抗細胞且不同於被稱為紅血球之紅(攜氧)血球。有不同類型的白血球，包括嗜中性球(多形核白血球；PMN)、桿狀核細胞(略微不成熟的嗜中性球)、T型淋巴球(T細胞)、B型淋巴球(B細胞)、單核球、嗜酸性球和嗜鹼性球。所有類型的白血球反映於白血球計數中。白血球計數的正常範圍通常在介於4,300與10,800個細胞/立方毫米血液之間。這亦可稱為白細胞計數且可以國際單位形式表述為4.3至10.8×10 9個細胞/公升。
在本發明之特別的實施態樣中，欲接種疫苗之免疫功能不全的個體患有嗜中性球減少症。在本發明之特別的實施態樣中，欲接種疫苗之免疫功能不全的個體具有低於2×10 9個細胞/公升、或低於1×10 9個細胞/公升、或低於0.5×10 9個細胞/公升、或低於0.1×10 9個細胞/公升、或低於0.05×10 9個細胞/公升之嗜中性球計數。
低白血球計數或「嗜中性球減少症」為以循環血液中異常低的嗜中性球含量為特徵的病況。嗜中性球為幫助預防及對抗感染的特定種類之白血球。癌症患者經歷嗜中性球減少症的最常見原因為作為化學療法的副作用。經化學療法誘發之嗜中性球減少症增加患者的感染風險且擾亂癌症治療。
在本發明之特別的實施態樣中，欲接種疫苗之免疫功能不全的個體具有低於500/mm 3之CD4+細胞計數、或低於300/mm 3之CD4+細胞計數、或低於200/mm 3之CD4+細胞計數、低於100/mm 3之CD4+細胞計數、低於75/mm 3之CD4+細胞計數、或低於50/mm 3之CD4+細胞計數。
CD4細胞試驗通常係以mm 3計的細胞數目報告。正常的CD4計數係介於500與1,600之間，且CD8計數係介於375與1,100之間。CD4計數在患有HIV的人群中大幅下降。
在本發明之一實施態樣中，本文所揭示之免疫功能不全的個體中之任一者為男人或女人。 9. 方案
在一些例子中，需要少至一次劑量的根據本發明之致免疫性組成物，但在一些情況下(諸如較大的免疫缺陷之病況)，可給予第二次、第三次或第四次劑量。在初次疫苗接種之後，個體可接受一或多次適當間隔之加強免疫。
在一實施態樣中，根據本發明之致免疫性組成物的疫苗接種時程為單次劑量。在特別的實施態樣中，該單次劑量時程係對至少2歲的健康人群。
在一實施態樣中，根據本發明之致免疫性組成物的疫苗接種時程為多劑量時程。在特別的實施態樣中，該多劑量時程係由約1個月至約2個月的間隔隔開的2次劑量系列所組成。在特別的實施態樣中，該多劑量時程係由約1個月的間隔隔開的2次劑量系列或由約2個月的間隔隔開的2次劑量系列所組成。
在另一實施態樣中，該多劑量時程係由約1個月至約2個月的間隔隔開的3次劑量系列所組成。在另一實施態樣中，該多劑量時程係由約1個月的間隔隔開的3次劑量系列或由約2個月的間隔隔開的3次劑量系列所組成。
在另一實施態樣中，該多劑量時程係由約1個月至約2個月的間隔隔開的3次劑量系列，隨後在第一次劑量之後約10個月至約13個月的第四次劑量所組成。在另一實施態樣中，該多劑量時程係由約1個月的間隔隔開的3次劑量系列，隨後在第一次劑量之後約10個月至約13個月的第四次劑量所組成，或由約2個月的間隔隔開的3次劑量系列，隨後在第一次劑量之後約10個月至約13個月的第四次劑量所組成。
在一實施態樣中，多劑量時程係由在一歲時至少一次劑量(例如1、2或3次劑量)，隨後至少一次學步期劑量所組成。
在一實施態樣中，多劑量時程係由在2個月齡開始以約1個月至約2個月的間隔隔開的2或3次劑量系列(例如在劑量之間相隔28至56天)及隨後在12至18個月齡的學步期劑量所組成。在一實施態樣中，該多劑量時程係由在2個月齡開始以約1個月至約2個月的間隔隔開的3次劑量系列(例如在劑量之間相隔28至56天)及隨後在12至15個月齡的學步期劑量所組成。在另一實施態樣中，該多劑量時程係由在2個月齡開始以約2個月的間隔隔開的2次劑量系列及隨後在12至18個月年齡的學步期劑量所組成。
在一實施態樣中，多劑量時程係由在2、4、6及12至15個月齡的4次疫苗劑量系列所組成。
在一實施態樣中，初次劑量係在第0天給予及一或多次加強劑量係在約2至約24週之範圍內的間隔給予，較佳為4至8週之給藥間隔。
在一實施態樣中，初次劑量係在第0天給予及加強劑量係在約3個月之後給予。 10 本發明之特別的實施態樣係於以下編號段落1至220中提出： 1. 一種包含來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物及含皂素之脂質體佐劑之致免疫性組成物。 2. 段落1之致免疫性組成物，其中含皂素之脂質體佐劑為包含至少一種皂素之含單磷醯基脂質A (MPLA)之脂質體組成物。 3. 段落1之致免疫性組成物，其中含皂素之脂質體佐劑包含含單磷醯基脂質A (MPLA)之脂質體組成物及至少一種皂素，其中脂質體組成物包含i)包含磷脂之脂質雙層及ii)膽固醇。 4. 段落3之致免疫性組成物，其中皂素係選自QS-7、QS-18、QS-21或其混合物。 5. 段落3至5中任一者之致免疫性組成物，其中皂素為QS-21。 6. 段落3至6中任一者之致免疫性組成物，其中磷脂係選自二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)和二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)。 7. 段落3至6中任一者之致免疫性組成物，其中磷脂為DMPC和DMPG。 8. 段落1之致免疫性組成物，其中含皂素之脂質體佐劑包含單磷醯基脂質A (MPLA)、QS-21、DMPC、DMPG及膽固醇。 9. 段落1之致免疫性組成物，其中含皂素之脂質體佐劑包含在磷酸鹽緩衝液中的單磷醯基脂質A (MPLA)、QS-21、DMPC、DMPG及膽固醇。 10. 段落2至9中任一者之致免疫性組成物，其中MPLA為單磷醯基3-去醯基脂質A。 11. 段落2至10中任一者之致免疫性組成物，其包含約0.1至約1.0 mg/mL或更高的MPLA。 12. 段落2至10中任一者之致免疫性組成物，其包含約0.2至約0.6 mg/mL之MPLA。 13. 段落2至10中任一者之致免疫性組成物，其包含約0.3至約0.5 mg/mL之MPLA。 14. 段落2至10中任一者之致免疫性組成物，其包含約0.4 mg/mL之MPLA。 15. 段落1至14中任一者之致免疫性組成物，其包含約0.05至約1.0 mg/mL或更高的QS-21。 16. 段落1至14中任一者之致免疫性組成物，其包含約0.1至約0.4 mg/mL之QS-21。 17. 段落1至14中任一者之致免疫性組成物，其包含約0.2 mg/mL之QS-21。 18. 段落1至17中任一者之致免疫性組成物，其包含約0.5至約20 mg/mL或更高的膽固醇。 19. 段落1至17中任一者之致免疫性組成物，其包含約5至約15 mg/mL之膽固醇。 20. 段落1至17中任一者之致免疫性組成物，其包含約11 mg/mL之膽固醇。 21. 段落1至20中任一者之致免疫性組成物，其包含約0.5至約20 mg/mL或更高的DMPC。 22. 段落1至20中任一者之致免疫性組成物，其包含約5至約15 mg/mL之DMPC。 23. 段落1至20中任一者之致免疫性組成物，其包含約14 mg/mL之DMPC。 24. 段落1至23中任一者之致免疫性組成物，其包含約0.5至約3.0 mg/mL或更高的DMPG。 25. 段落1至24中任一者之致免疫性組成物，其包含約1.0至約2.0 mg/mL之DMPG。 26. 段落1至24中任一者之致免疫性組成物，其包含約1.6 mg/mL之DMPG。 27. 段落1之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑包含約0.4 mg/mL之單磷醯基3-去醯基脂質A、約0.2 mg/mL之QS-21、約14 mg/mL之DMPC、約1.6 mg/ml之DMPG及約11 mg/mL之膽固醇。 28. 段落1之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑包含約0.8 mg/mL之單磷醯基3-去醯基脂質A、約0.4 mg/mL之QS-21、約28 mg/mL之DMPC、約3.2 mg/ml之DMPG及約22 mg/mL之膽固醇。 29. 段落1之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑包含約0.2 mg/mL之單磷醯基3-去醯基脂質A、約0.1 mg/mL之QS-21、約7 mg/mL之DMPC、約0.8 mg/ml之DMPG及約5.5 mg/mL之膽固醇。 30. 段落1至29中任一者之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑為均質的。 31. 段落1至29中任一者之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑為非均質的。 32. 段落1至31中任一者之致免疫性組成物，其包含至少20種來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物。 33. 段落1至31中任一者之致免疫性組成物，其包含介於20與45種之間來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物。 34. 段落1至31中任一者之致免疫性組成物，其包含25種來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物。 35. 段落1至31中任一者之致免疫性組成物，其包含35種來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物。 36. 段落1至31中任一者之致免疫性組成物，其包含45種來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物。 37. 段落1至36中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F之醣結合物。 38. 段落1至36中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F之醣結合物。 39. 段落1至36中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物。 40. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含21至25種來自肺炎鏈球菌的不同血清型之肺炎鏈球菌醣結合物，其中該血清型係選自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B。 41. 段落1至36中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物。 42. 段落41之致免疫性組成物，其中該致免疫性組成物為25價肺炎鏈球菌結合物組成物。 43. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物。 44. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少兩種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物。 45. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少三種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物。 46. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少四種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物。 47. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少五種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物。 48. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物。 49. 段落48之致免疫性組成物，其為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。 50. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少11種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物。 51. 段落50之致免疫性組成物，其為36價肺炎鏈球菌結合物組成物。 52. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少15種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物。 53. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少20種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物。 54. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少五種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物。 55. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少九種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物。 56. 段落55之致免疫性組成物，其為34價肺炎鏈球菌結合物組成物。 57. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物。 58. 段落57之致免疫性組成物，其為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。 59. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、35F和38之醣結合物，其中該致免疫性組成物為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。 60. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、34、35F和38之醣結合物，其中該致免疫性組成物為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。 61. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，其中該致免疫性組成物為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。 62. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少11種來自肺炎鏈球菌血清型7C、9N、16F、17F、20B、21、27、31、34、35F和38之醣結合物，其中該致免疫性組成物為36價肺炎鏈球菌結合物組成物。 63. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌之醣結合物係與CRM 197結合。 64. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與CRM 197結合。 65. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3醣之結合物係與SCP結合。 66. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中肺炎鏈球菌之醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 67. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 68. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少一種其他醣結合物係與TT結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 69. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少一種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 70. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，一種其他醣結合物與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 71. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少兩種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 72. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，兩種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 73. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少三種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 74. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，三種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 75. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少四種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 76. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，四種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 77. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，至少五種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 78. 段落1至62中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，五種其他醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 79. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係與SCP結合，及其他醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 80. 段落79之致免疫性組成物，其中該致免疫性組成物為25價肺炎鏈球菌結合物組成物。 81. 段落1至33中任一者之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物，其中醣結合物全部個別地與CRM 197結合。 82. 段落81之致免疫性組成物，其中該致免疫性組成物為25價肺炎鏈球菌結合物組成物。 83. 段落37至82中任一者之致免疫性組成物，其中該來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)： ， 其中X係選自由下列所組成之群組：CH 2(CH 2) n’、(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、NHCO(CH 2) n’、NHCO(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、OCH 2(CH 2) n’和O(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2；其中n’係選自1至10及m係選自1至4， 且其中X'係選自由下列所組成之群組：CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O、CH 2O(CH 2CH 2O) m’(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’係選自0至10及m’係選自0至4。 84. 段落37至82中任一者之致免疫性組成物，其中該來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物包含通過間隔子與載體蛋白質(CP)共價結合之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X為CH 2(CH 2) n’，其中n’為2，且其中X'為CH 2O(CH 2) n’’CH 2C=O，其中n’’為1。 85. 段落37至82中任一者之致免疫性組成物，其中該來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係根據包含下列步驟之方法生產： (a)將經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與碳酸衍生物及疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應以生產經活化之疊氮基多醣， (b)將載體蛋白質與攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑反應，其中NHS部分係與胺基反應以形成醯胺鍵聯，由此獲得經炔烴官能化之載體蛋白質， (c)將步驟(a)的經活化之疊氮基多醣與步驟(b)的經活化之炔烴-載體蛋白質藉由經Cu +1調介之疊氮化物-炔烴環加成反應來反應以形成醣結合物。 86. 段落85之致免疫性組成物，其中經單離之肺炎鏈球菌血清型3多醣係在活化步驟(a)之前經尺寸分級。 87. 段落85之致免疫性組成物，其中將經單離之肺炎鏈球菌血清型3多醣經尺寸分級至介於100 kDa與200 kDa之間的重量平均分子量。 88. 段落85至87中任一者之致免疫性組成物，其中該碳酸衍生物係選自由下列所組成之群組：1,1’-羰基二咪唑(CDI)、1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)、碳酸二琥珀醯亞胺酯(DSC)和氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺酯。 89. 段落85至87中任一者之致免疫性組成物，其中該碳酸衍生物為1,1’-羰基二咪唑(CDI)。 90. 段落85至87中任一者之致免疫性組成物，其中該碳酸衍生物為1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)。 91. 段落85至90中任一者之致免疫性組成物，其中該疊氮基連接子為式(I)化合物， 其中X係選自由下列所組成之群組：CH 2(CH 2) n、(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、NHCO(CH 2) n、NHCO(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2、OCH 2(CH 2) n和O(CH 2CH 2O) mCH 2CH 2；其中n係選自1至10及m係選自1至4。 92. 段落85至90中任一者之致免疫性組成物，其中該疊氮基連接子為式(II)化合物， 。 93. 段落85至92中任一者之致免疫性組成物，其中該攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑為攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及末端炔烴之劑。 94. 段落85至92中任一者之致免疫性組成物，其中該攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑為攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及環炔烴之劑。 95. 段落85至92中任一者之致免疫性組成物，其中該攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑為式(III)化合物， 其中X係選自由下列所組成之群組：CH 2O(CH 2) nCH 2C=O和CH 2O(CH 2CH 2O) m(CH 2) nCH 2C=O，其中n係選自0至10及m係選自0至4。 96. 段落85至92中任一者之致免疫性組成物，其中該攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑為式(IV)化合物： 。 97. 段落85至96中任一者之致免疫性組成物，其中步驟a)包含將經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與碳酸衍生物反應，隨後將經碳酸衍生物活化之多醣與疊氮基連接子在非質子性溶劑中反應以生產經活化之疊氮基多醣。 98. 段落85至97中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟a)，將經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與該碳酸衍生物在非質子性溶劑中反應。 99. 段落85至98中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟a)，將經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與碳酸衍生物在基本上由二甲基亞碸(DMSO)所組成之溶液中反應。 100. 段落85至99中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟a)，將經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與CDI在包含0.1%至1% (v/v)之水的非質子性溶劑中反應。 101. 段落85至99中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟a)，將經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與CDI在包含0.1%至1% (v/v)之水的DMSO中反應。 102. 段落85至101中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟a)，在碳酸衍生物活化之後添加水。 103. 任何段落102之致免疫性組成物，其中添加水，使混合物中的總水含量達到介於約1%至約10% (v/v)之間。 104. 段落85至103中任一者之致免疫性組成物，其中步驟a)另包含將經碳酸衍生物活化之多醣與一定量的疊氮基連接子反應，該一定量係在相對於經活化之多醣的多醣重複單元之量的0.01至10莫耳當量之間。 105. 段落85至104中任一者之致免疫性組成物，其中經活化之多醣在步驟a)之後的活化程度係介於0.5至50%之間。 106. 段落85至105中任一者之致免疫性組成物，其中步驟b)包含將載體蛋白質與一定量的攜帶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔烴基之劑反應，該一定量為相對於載體上之離胺酸的0.1至10莫耳當量。 107. 段落85至106中任一者之致免疫性組成物，其中經活化之載體在步驟b)之後的活化程度係介於1與50之間。 108. 段落85至107中任一者之致免疫性組成物，其中結合反應c)係在水性緩衝液中以作為觸媒的銅(I)存在下進行。 109. 段落85至107中任一者之致免疫性組成物，其中結合反應c)係在水性緩衝液中以氧化劑及作為觸媒的銅(I)存在下進行。 110. 段落85至107中任一者之致免疫性組成物，其中結合反應c)係在水性緩衝液中以作為觸媒的銅(I)及作為氧化劑的抗壞血酸鹽存在下進行，其中反應混合物另包含THPTA (參(3-羥丙基三唑基甲基)胺)及胺基胍。 111. 段落85至110中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟c)的經活化之疊氮基多醣對經活化之炔烴載體的初始輸入比(重量比)係介於0.1與3之間。 112. 段落85至111中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟c)之後，該方法另包含將剩餘在結合物中的未反應之疊氮基以疊氮基封端劑封端的步驟。 113. 段落112之致免疫性組成物，其中該疊氮基封端劑為式(V)化合物， 其中X為(CH 2) n，其中n係選自1至15。 114. 段落112之致免疫性組成物，其中該疊氮基封端劑為炔丙醇。 115. 段落112至114中任一者之致免疫性組成物，其中未反應之疊氮基的封端係以一定量的封端劑執行，該一定量係在相對於經活化之多醣的多醣重複單元之量的0.05至20莫耳當量之間。 116. 段落85至115中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟c)之後，該方法另包含將剩餘在結合物中的未反應之炔烴基以炔烴基封端劑封端的步驟。 117. 段落116之致免疫性組成物，其中該炔烴基封端劑為攜帶疊氮基之劑。 118. 段落117之致免疫性組成物，其中該炔烴基封端劑為式(VI)化合物， 其中X為(CH 2) n，其中n係選自1至15。 119. 段落117之致免疫性組成物，其中該炔烴基封端劑為3-疊氮基1-丙醇。 120. 段落116至119中任一者之致免疫性組成物，其中未反應之炔烴基的封端係以一定量的封端劑執行，該一定量係在相對於經活化之多醣的多醣重複單元之量的0.05至20莫耳當量之間。 121. 段落37至82中任一者之致免疫性組成物，其中該來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係使用還原胺化化學來製備。 122. 段落37至82中任一者之致免疫性組成物，其中該來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係根據包含下列步驟之方法生產： (a)將經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與氧化劑； (b)將步驟(a)的經活化之多醣與載體蛋白質複合；且 (c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。 123. 段落122之致免疫性組成物，其中經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣係在活化步驟(a)之前經尺寸分級。 124. 段落122之致免疫性組成物，其中經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣係在活化步驟(a)之前經尺寸分級至介於100 kDa與200 kDa之間的重量平均分子量。 125. 段落37至82中任一者之致免疫性組成物，其中該來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物係根據包含下列步驟之方法生產： (a)將經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與氧化劑； (a’)將氧化反應以添加淬滅劑淬滅； (b)將步驟(a)或(a’)的經活化之多醣與載體蛋白質複合；且 (c)將複合的經活化之多醣及載體蛋白質與還原劑反應以形成醣結合物。 126. 段落125之致免疫性組成物，其中經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣係在活化步驟(a)之前經尺寸分級。 127. 段落125之致免疫性組成物，其中經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣係在活化步驟(a)之前經尺寸分級至介於100 kDa與200 kDa之間的重量平均分子量。 128. 段落122至127中任一者之致免疫性組成物，其中該氧化劑為過碘酸鹽。 129. 段落122至127中任一者之致免疫性組成物，其中該氧化劑為過碘酸。 130. 段落122至129中任一者之致免疫性組成物，其中步驟a)包含將經單離之肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與0.01至2莫耳當量之過碘酸鹽反應。 131. 段落122至130中任一者之致免疫性組成物，其中經活化之血清型3多醣的氧化程度係介於2與8之間。 132. 段落122至130中任一者之致免疫性組成物，其中經活化之血清型3多醣的氧化程度係介於11至19之間。 133. 段落122至130中任一者之致免疫性組成物，其中經活化之血清型3多醣的氧化程度為約15。 134. 段落122至133中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟b)的經活化之血清型3莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於4：1與0.1：1之間。 135. 段落122至133中任一者之致免疫性組成物，其中經活化之血清型3莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量/重量)係介於1.5：1與0.5：1之間。 136. 段落122至135中任一者之致免疫性組成物，其中還原反應(c)係在水性溶劑中進行。 137. 段落122至135中任一者之致免疫性組成物，其中還原反應(c)係在非質子性溶劑中進行。 138. 段落122至135中任一者之致免疫性組成物，其中還原反應(c)係在基本上由二甲基亞碸(DMSO)所組成之群組的溶液中進行。 139. 段落122至138中任一者之致免疫性組成物，其中還原劑為氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下的硼氫化鈉或硼氫化鋅、胺硼烷，諸如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMe iPrN-BH 3、苯甲胺-BH 3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB)。 140. 段落122至138中任一者之致免疫性組成物，其中還原劑為氰基硼氫化鈉。 141. 段落122至139中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟c)中使用介於0.2與20莫耳當量之間的還原劑。 142. 段落122至139中任一者之致免疫性組成物，其中在步驟c)中使用介於0.5與3莫耳當量之間的還原劑。 143. 段落122至142中任一者之致免疫性組成物，其中將步驟c)之產物與1至20莫耳當量之硼氫化鈉反應15 min至15 hr。 144. 段落37至143中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣的重量平均分子量(Mw)係介於50 kDa與1,000 kDa之間。 145. 段落37至143中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣的重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與300 kDa之間。 146. 段落37至143中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣的重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與200 kDa之間。 147. 段落37至143中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣的重量平均分子量(Mw)係介於200 kDa與300 kDa之間。 148. 段落37至143中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣的重量平均分子量(Mw)係介於100 kDa與300 kDa之間。 149. 段落37至148中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物具有介於250 kDa與20,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。 150. 段落37至148中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。 151. 段落37至148中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物具有介於500 kDa與10,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。 152. 段落37至148中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物具有介於500 kDa與5,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。 153. 段落37至148中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物具有介於600 kDa與3,000 kDa之間的重量平均分子量(Mw)。 154. 段落37至153中任一者之致免疫性組成物，其中血清型3醣結合物的結合程度係介於2與15之間。 155. 段落37至153中任一者之致免疫性組成物，其中血清型3醣結合物的結合程度係介於4與7之間。 156. 段落37至155中任一者之致免疫性組成物，其中在血清型3醣結合物中的血清型3多醣對載體蛋白質之比係介於0.5與3.0 (w/w)之間。 157. 段落37至155中任一者之致免疫性組成物，其中在血清型3醣結合物中的血清型3多醣對載體蛋白質之比係介於0.5與1.5 (w/w)之間。 158. 段落37至155中任一者之致免疫性組成物，其中在血清型3醣結合物中的血清型3多醣對載體蛋白質之比係介於0.9與1.1 (w/w)之間。 159. 段落37至158中任一者之致免疫性組成物，其中該血清型3醣結合物係以多醣的每4個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。 160. 段落37至158中任一者之致免疫性組成物，其中該血清型3醣結合物係以多醣的每10個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。 161. 段落37至158中任一者之致免疫性組成物，其中該血清型3醣結合物係以多醣的每15個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。 162. 段落37至158中任一者之致免疫性組成物，其中該血清型3醣結合物係以多醣的每25個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。 163. 段落37至158中任一者之致免疫性組成物，其中該血清型3醣結合物係以多醣的每50個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。 164. 段落37至158中任一者之致免疫性組成物，其中該血清型3醣結合物係以多醣的每100個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。 165. 段落37至158中任一者之致免疫性組成物，其中該血清型3醣結合物係以多醣的每5至10個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。 166. 段落37至158中任一者之致免疫性組成物，其中該血清型3醣結合物係以多醣的每10至20個醣重複單元包含至少一個介於載體蛋白質與多醣之間的共價鍵聯。 167. 段落37至166中任一者之致免疫性組成物，與血清型3多醣總量相比，其包含少於約50%之游離血清型3多醣。 168. 段落37至166中任一者之致免疫性組成物，與血清型3多醣總量相比，其包含少於約40%之游離血清型3多醣。 169. 段落37至166中任一者之致免疫性組成物，與血清型3多醣總量相比，其包含少於約25%之游離血清型3多醣。 170. 段落37至166中任一者之致免疫性組成物，與血清型3多醣總量相比，其包含少於約20%之游離血清型3多醣。 171. 段落37至166中任一者之致免疫性組成物，與血清型3多醣總量相比，其包含少於約15%之游離血清型3多醣。 172. 段落37至171中任一者之致免疫性組成物，其中至少30%之血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。 173. 段落37至171中任一者之致免疫性組成物，其中至少40%之血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。 174. 段落37至171中任一者之致免疫性組成物，其中至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。 175. 段落37至171中任一者之致免疫性組成物，其中至少60%之血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。 176. 段落37至171中任一者之致免疫性組成物，其中介於50%與80%之間的血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。 177. 段落37至171中任一者之致免疫性組成物，其中介於65%與80%之間的血清型3醣結合物在CL-4B管柱中具有小於或等於0.3之K d。 178. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中以給出之血清型的各劑量包含約0.1 µg至約5 µg之醣。 179. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中以給出之血清型的各劑量包含約0.2 µg至約4 µg之醣。 180. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中各特定之醣結合物的各劑量包含約0.5 µg至約1.1 µg之醣。 181. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中各特定之醣結合物的各劑量包含約0.5 µg、0.55 µg、約1.0 µg、1.1 µg、約1.5 µg、約2.0 µg、約2.2 µg、約2.5 µg、約3.0 µg、約3.5 µg、約4.0 µg、約4.5 µg或約5.0 µg之醣。 182. 段落1至181中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約兩倍。 183. 段落1至181中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約兩倍。 184. 段落1至181中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約兩倍及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約三倍。 185. 段落1至181中任一者之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約兩倍及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣量為其他醣結合物之劑量的約四倍。 186. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg至1.1 µg，除了來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量，其為約1.0 µg至2.2 µg。 187. 段落186之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為其他醣結合物之劑量的約兩倍。 188. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg及來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.0 µg。 189. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.55 µg及來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.1 µg。 190. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.0 µg。 191. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.1 µg及來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.2 µg。 192. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg至1.1 µg，除了來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣劑量，其為約1.0 µg至2.2 µg。 193. 段落192之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣劑量為其他醣結合物之劑量的約兩倍。 194. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣劑量為約1.0 µg。 195. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.55 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣劑量為約1.1 µg。 196. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣劑量為約2.0 µg。 197. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.1 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3和6B之醣結合物的醣量為約2.2 µg。 198. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg至1.1 µg，除了來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量，其為約1.0 µg至2.2 µg及除了來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量，其為約1.5 µg至3.3 µg。 199. 段落198之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為其他醣結合物之劑量的約兩倍及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為其他醣結合物之劑量的約三倍。 200. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約1.5 µg。 201. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.55 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.1 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約1.65 µg。 202. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.0 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約3.0 µg。 203. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.1 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.2 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約3.3 µg。 204. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg至1.1 µg，除了來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量，其為約1.0 µg至2.2 µg及除了來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量，其為約2.0 µg至4.4 µg。 205. 段落204之致免疫性組成物，其中來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為其他醣結合物之劑量的約兩倍及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為其他醣結合物之劑量的約四倍。 206. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.5 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約2.0 µg。 207. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約0.55 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約1.1 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約2.2 µg。 208. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.0 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.0 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約4.0 µg。 209. 段落1至177中任一者之致免疫性組成物，其中致免疫性組成物之各特定的醣結合物之醣的各劑量為約1.1 µg，來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物的醣劑量為約2.2 µg及來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物的醣劑量為約4.4 µg。 210. 段落1至209中任一者之致免疫性組成物，其中各劑量包含10 µg至150 µg之載體蛋白質。 211. 段落1至209中任一者之致免疫性組成物，其中各劑量包含15 µg至100 µg之載體蛋白質。 212. 段落1至209中任一者之致免疫性組成物，其中各劑量包含25 µg至100 µg之載體蛋白質。 213. 段落1至209中任一者之致免疫性組成物，其中各劑量包含25 µg至75 µg之載體蛋白質。 214. 段落1至209中任一者之致免疫性組成物，其中各劑量包含約25 µg、約30 µg、約35 µg、約40 µg、約45 µg、約50 µg、約60 µg或約70 µg之載體蛋白質。 215. 段落1至209中任一者之致免疫性組成物，其中各劑量包含約30 µg至約70 µg之載體蛋白質。 216. 段落1至215中任一者之致免疫性組成物，其中用於注射之劑量具有0.1 mL至2 mL之體積。 217. 段落1至215中任一者之致免疫性組成物，其中用於注射之劑量具有0.2 mL至1 mL之體積。 218. 段落1至215中任一者之致免疫性組成物，其中用於注射之劑量具有0.5 mL之體積。 219. 段落1至218中任一者之致免疫性組成物，其係用作為藥物。 220. 段落1至218中任一者之致免疫性組成物，其係用作為疫苗。
如本文所使用之術語「約」意指在值之統計學上有意義的範圍內，諸如所陳述之濃度範圍、時段、分子量、溫度或pH。此等範圍可在給出之值或範圍的數量級內，通常在20%之內，更通常在10%之內，且甚至更通常在5之%內或在1%之內。此等範圍有時可在用於測量及/或測定給出之值或範圍之標準方法的典型實驗誤差之內。以術語「約」所涵蓋的容許偏差係取決於根據研究的特定系統而定，且可由熟習本技術領域的普通技能者容易地察覺。每當在本申請案內敍述範圍時，亦考慮在該範圍內的每一整數作為本揭示之實施態樣。
本發明者意欲在本文使術語「包含(comprising、comprise及comprises)」在各情況下分別視需要地以術語「基本上由……所組成(consisting essentially of、consist essentially of、consists essentially of)」及「由……所組成(consisting of、consist of、consists of)」取代。
本說明書中所提及之所有公開案及專利申請案指示熟習本發明所屬技術領域者的水平。將此專利說明書內所引用之所有參考文獻或專利申請案併入本文以供參考。
本發明係於所附實施例中例證。下文實施例係使用熟習本技術領域者熟知及常規的標準技術進行，除非另有其他詳細描述。實施例為例證而非限制本發明。 [實施例] 實施例1：含QS-21之脂質體佐劑誘發明顯較高的血清型特異性OPA效價
此研究的目的係評價含QS-21之脂質體佐劑與低劑量的20價肺炎鏈球菌結合型疫苗(PCV20)組合時在幼恆河獼猴中是否具有任何抗原劑量節制(dose sparing)效應。 幼恆河獼猴研究
將總共28隻年齡及性別匹配的幼恆河獼猴(3至6個月齡)隨機分為4組(表1)。將幼猴在鎮靜下於雙肢肌肉內接種0.25 ml/肢之劑量的疫苗。
包括在PCV20疫苗中的血清型為1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F (全部與CRM 197結合)。
對照組接受全人類臨床劑量(2.2 µg/劑量(4.4 µg/劑量之6B))之PCV20，其亦含有125 µg/劑量之AlPO 4。
劑量節制組接受四分之一劑量的與全劑量之AlPO 4(125 µg/劑量)及含QS-21之脂質體佐劑(100 µg之3D-PHAD及50 µg之QS-21)混合之PCV20 (0.55 µg (1.1 µg之6B))或四分之一劑量的僅與含QS-21之脂質體佐劑(100 µg之3D-PHAD及50 µg之QS-21)獨立混合重構之PCV20 (0.55 µg (1.1 µg之6B))結合物。
包括含有AlPO 4(125 µg/劑量)之默克(Merck) 15價PCV疫苗(Vaxneuvance®)作為額外的對照組(表1)。
在初次疫苗接種(D0)之前1週(wk=-1)採集預採血(Pre-bleed)以評定基線血清型3特異性血清效價。不包括含QS-21之脂質體佐劑的組別係在初次疫苗接種之後第8週和第16週投予兩次重複的疫苗接種。採集有關血清的全血：在第1劑量(PD1)之後4週和8週；在PD2之後1、4和8週；及在PD3之後1、4、16和36週。自全血採集血清且將其分成500 µl等份試樣及儲存在-80℃下。將收到的冷凍血清解凍、加條碼、熱失活且轉移至各自的檢定組以測定血清型特異性IgG及OPA效價。 調理吞噬作用(opsonophagocytosis)檢定法
當以抗體及/或補體調理時，肺炎鏈球菌(Pn)變得容易被多型核細胞及巨噬細胞攝取且破壞。此過程稱為調理吞噬作用。
微菌落調理吞噬檢定法(mcOPA)係如先前所述方式執行(參見例如WO2022/249106)。
關於Pn3 mcOPA，將由目標細菌細胞及經熱失活之試驗血清所組成的反應混合物在環境震盪器中在25℃下培育30分鐘。接著將經分化之HL-60組織培養細胞(效應細胞)及幼兔補體添加至反應混合物中，且在環境震盪器中在37℃下培育45分鐘。功能性抗肺炎鏈球菌抗體效價係藉由測量含有試驗血清之mcOPA反應中的細菌存活率來測定。接著平板培養檢定混合物且經隔夜生長。
在第2天，測定未經吞噬之活細菌的數量。mcOPA抗體效價為血清稀釋度之倒數，當與不含血清的細菌效應細胞補體對照孔相比時，導致細菌菌落數量減少50%。 用於血清IgG定量的直接Luminex免疫檢定法
使用兩種肺炎鏈球菌之直接Luminex免疫檢定法(dLIA)定量下列的肺炎鏈球菌多醣在血清中的IgG抗體濃度：1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F (Pavliakova、Danka等人之 Msphere3.4 (2018)：10-1128)。使用由Luminex讀數器以中位數螢光強度(MFI)表示的訊號計算相對於參考標準物確立的IgG濃度之抗原特異性IgG濃度。
結果 四分之一劑量的具有含QS-21之脂質體佐劑(QS-21 adj)之PCV20比全劑量的具有AlPO 4之PCV20誘發更顯著改進的血清型3 OPA及IgG效價。
當PCV20與含QS-21之脂質體佐劑組合時，評估其四分之一劑量以測定此佐劑/劑量水平對在幼恆河獼猴中接受全劑量的含AlPO 4之PCV20的動物是否能產生等效的功能性抗體反應。由於無法自幼恆河獼猴採集大量血液，因此僅測量血清型3 (ST3) OPA效價。有趣的是以四分之一劑量的具有含QS-21之脂質體佐劑與或不與AlPO 4之PCV20疫苗接種的幼恆河獼猴產生ST3特異性OPA效價，其顯著超過自接受全劑量的PCV20疫苗接種的幼恆河獼猴所測量的OPA效價(在第1劑量之後第4週；圖1)。在含QS-21之脂質體佐劑化之組別中的ST3特異性OPA幾何平均效價比接受全劑量之PCV20的組別高4至6倍(圖1)。AlPO 4的存在或不存在不顯著地影響含QS-21之脂質體佐劑自四分之一劑量的PCV20疫苗接種之幼恆河獼猴誘發OPA效價(圖1)，其表明AlPO 4在產生抗原之劑量節制反應中可能是可有可無的。以全劑量之PCV15疫苗接種之幼恆河獼猴產生比以四分之一劑量的PCV20-含QS-21之脂質體佐劑疫苗接種之幼恆河獼猴低1.5至2倍效價(圖1)。
當測量來自幼恆河獼猴之血清型3特異性IgG反應時，出現與OPA反應類似的樣式(圖2)。如以ST3-OPA效價所觀察，與投予全劑量的具有AlPO 4佐劑之PCV20的動物相比，接受AlPO 4存在或不存在的四分之一劑量的具有含QS-21之脂質體佐劑之PCV20的動物誘發出增加＞5倍的ST3特異性IgG效價(圖2)。 與全劑量的具有AlPO 4之PCV20相比，四分之一劑量的具有含QS-21之脂質體佐劑之PCV20對PCV20中所包括的所有血清型皆產生更高的IgG效價
比對PCV20中所包括的所有血清型之IgG效價係使用在第1劑量之後第4週所獲得的血清測量(使用血清型特異性multiplex Luminex IgG檢定法)。如以血清型3特異性IgG效價所觀察，包括在四分之一劑量的經含QS-21之脂質體佐劑(±AlPO 4)佐劑化之PCV20中的所有其他血清型皆產生比全劑量的具有AlPO 4佐劑之PCV20更高的IgG效價(表2)。取決於血清型而定，四分之一劑量的經含QS-21之脂質體佐劑佐劑化之PCV20誘發比全劑量的具有AlPO 4佐劑之PCV20高2至33倍的效價(參見表2)。以AlPO 4存在或不存在的LiNA-2B組別測量出較高的抗體效價(表2)。
研究結果表明在AlPO 4存在或不存在的含QS-21之脂質體佐劑在幼恆河獼猴中對PCV20具有劑量節制效應。在第1劑量之後第4週的時間點，與投予人類臨床全劑量之PCV20 (2.2 µg/劑量(6B-4.4 µg))相比，接受四分之一劑量的經含QS-21之脂質體佐劑佐劑化之PCV20 (0.55 µg/劑量(6B-1.1 µg))的幼恆河獼猴誘發出增加數倍的血清型特異性IgG及OPA (僅測試血清型3)效價。
儘管已出於清晰理解的目的而以例證及實例方式非常詳細地描述前述發明，但可在所附申請專利範圍之範疇內實踐特定的改變及修飾。
[圖1]：含QS-21之脂質體佐劑對四分之一劑量的PCV20 OPA效價的效果。ST3特異性調理吞噬效價係在第1劑量之後4週自幼恆河獼猴採集之血清測量。每個點代表個體動物且數據係以OPA之幾何平均效價表示，具有95%之信賴區間。LLOQ-定量下限。QS-21 adj-含QS-21之脂質體佐劑。
[圖2]：含QS-21之脂質體佐劑對四分之一劑量的PCV20 IgG效價的效果。ST3特異性IgG效價係在第1劑量之後4週自幼恆河獼猴採集之血清測量。每個點代表個體動物且數據係以IgG之µg/ml表示，具有95%之信賴區間。LLOQ-定量下限。QS-21 adj-含QS-21之脂質體佐劑。
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Claims (22)

  1. 一種包含來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物及含皂素之脂質體佐劑之致免疫性組成物，該脂質體佐劑包含含單磷醯基脂質A (MPLA)之脂質體組成物及至少一種皂素，其中該脂質體組成物包含i)包含磷脂之脂質雙層及ii)膽固醇。
  2. 如請求項1之致免疫性組成物，其中該皂素為QS-21。
  3. 如請求項1至2中任一項之致免疫性組成物，其中該磷脂為DMPC及DMPG。
  4. 如請求項1之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑包含在磷酸鹽緩衝液中的單磷醯基脂質A (MPLA)、QS-21、DMPC、DMPG及膽固醇。
  5. 如請求項1至4中任一項之致免疫性組成物，其中MPLA為單磷醯基3-去醯基脂質A。
  6. 如請求項1至5中任一項之致免疫性組成物，其包含約0.1至約1.0 mg/mL或更高的MPLA。
  7. 如請求項1至6中任一項之致免疫性組成物，其包含約0.05至約1.0 mg/mL或更高的QS-21。
  8. 如請求項1至7中任一項之致免疫性組成物，其包含約0.5至約20 mg/mL或更高的膽固醇。
  9. 如請求項1至8中任一項之致免疫性組成物，其包含約0.5至約20 mg/mL或更高的DMPC。
  10. 如請求項1至9中任一項之致免疫性組成物，其包含約0.5至約3.0 mg/mL或更高的DMPG。
  11. 如請求項1之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑包含約0.4 mg/mL之單磷醯基3-去醯基脂質A、約0.2 mg/mL之QS-21、約14 mg/mL之DMPC、約1.6 mg/ml之DMPG及約11 mg/mL之膽固醇。
  12. 如請求項1之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑包含約0.8 mg/mL之單磷醯基3-去醯基脂質A、約0.4 mg/mL之QS-21、約28 mg/mL之DMPC、約3.2 mg/ml之DMPG及約22 mg/mL之膽固醇。
  13. 如請求項1之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑包含約0.2 mg/mL之單磷醯基3-去醯基脂質A、約0.1 mg/mL之QS-21、約7 mg/mL之DMPC、約0.8 mg/ml之DMPG及約5.5 mg/mL之膽固醇。
  14. 如請求項1至13中任一項之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑為均質的。
  15. 如請求項1至13中任一項之致免疫性組成物，其中該含皂素之脂質體佐劑為非均質的。
  16. 如請求項1至15中任一項之致免疫性組成物，其包含至少20種來自肺炎鏈球菌的不同血清型之醣結合物。
  17. 如請求項1至16中任一項之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F之醣結合物。
  18. 如請求項1至16中任一項之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物。
  19. 如請求項1至18中任一項之致免疫性組成物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F和35B之醣結合物及另外包含至少十種來自肺炎鏈球菌血清型2、6C、7C、7F、9N、10B、15C、16F、17F、20A、20B、21、22A、24B、27、29、31、33B、34、35F、38、72和73之醣結合物。
  20. 如請求項19之致免疫性組成物，其為35價肺炎鏈球菌結合物組成物。
  21. 如請求項1至20中任一項之致免疫性組成物，其係用作為藥物。
  22. 如請求項1至20中任一項之致免疫性組成物，其係用作為疫苗。
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Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
EP0027888B1 (en) 1979-09-21 1986-04-16 Hitachi, Ltd. Semiconductor switch
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4459286A (en) 1983-01-31 1984-07-10 Merck & Co., Inc. Coupled H. influenzae type B vaccine
US4808700A (en) 1984-07-09 1989-02-28 Praxis Biologics, Inc. Immunogenic conjugates of non-toxic E. coli LT-B enterotoxin subunit and capsular polymers
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
CA2006700A1 (en) 1989-01-17 1990-07-17 Antonello Pessi Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
EP0482068A1 (en) 1989-07-14 1992-04-29 American Cyanamid Company Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
DE69113564T2 (de) 1990-08-13 1996-05-30 American Cyanamid Co Faser-Hemagglutinin von Bordetella pertussis als Träger für konjugierten Impfstoff.
ATE245446T1 (de) 1992-02-11 2003-08-15 Jackson H M Found Military Med Dualer träger für immunogene konstrukte
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
CA2135052A1 (en) 1992-05-06 1993-11-11 R. John Collier Diphtheria toxin receptor-binding region
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
PT616034E (pt) 1993-03-05 2005-02-28 Wyeth Corp Plasmideo para a producao de proteina crm e toxina da difteria
JP3828145B2 (ja) 1993-09-22 2006-10-04 ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン 免疫原性構成物の製造のための新規シアン化試薬を使った可溶性炭水化物の活性化方法
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
JP3468773B2 (ja) 1994-07-15 2003-11-17 ザ ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 免疫調節オリゴヌクレオチド
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6355255B1 (en) 1998-12-07 2002-03-12 Regents Of The University Of Minnesota Streptococcal C5a peptidase vaccine
US5846547A (en) 1996-01-22 1998-12-08 Regents Of The University Of Minnesota Streptococcal C5a peptidase vaccine
JP2001513776A (ja) 1997-02-28 2001-09-04 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＬＰＳ関連障害の処置における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸の使用
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
DE69838294T2 (de) 1997-05-20 2009-08-13 Ottawa Health Research Institute, Ottawa Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
WO1999051259A2 (en) 1998-04-03 1999-10-14 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
WO2000010599A2 (en) 1998-08-19 2000-03-02 North American Vaccine, Inc. IMMUNOGENIC β-PROPIONAMIDO-LINKED POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATE USEFUL AS A VACCINE PRODUCED USING AN N-ACRYLOYLATED POLYSACCHARIDE
JP4689044B2 (ja) 1998-12-21 2011-05-25 メディミューン，インコーポレーテッド ワクチン用の肺炎連鎖球菌タンパク質と免疫原断片
CA2356836C (en) 1998-12-23 2011-09-13 Shire Biochem Inc. Novel streptococcus antigens
EP1165796A2 (en) 1999-04-09 2002-01-02 Techlab, Inc. Recombinant clostridium toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
AU2001270381B2 (en) 2000-06-20 2007-05-24 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
US20030035806A1 (en) 2001-05-11 2003-02-20 D'ambra Anello J. Novel meningitis conjugate vaccine
EP1456231A2 (en) 2001-12-20 2004-09-15 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
KR101052996B1 (ko) 2003-03-13 2011-07-29 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 박테리아 세포용해소에 대한 정제 공정
CA2519511A1 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
GB0421083D0 (en) 2004-09-22 2004-10-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
HUE050049T2 (hu) 2005-04-08 2020-11-30 Wyeth Llc Szennyezõanyagok elválasztása streptococcus pneumoniae poliszacharidtól PH manipulációjával
CN104815327A (zh) 2005-04-08 2015-08-05 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
TWI457133B (zh) * 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
WO2008045852A2 (en) 2006-10-10 2008-04-17 Wyeth Purification of streptococcus pneumoniae type 3 polysaccharides
UA99278C2 (ru) 2007-03-23 2012-08-10 УАЙЕТ ЭлЭлСи Способ получения существенно очищенных капсульных полисахаридов из лизата клеток streptococcus pneumoniae
AU2008267208B2 (en) 2007-06-26 2012-01-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
RU2536248C2 (ru) 2009-04-30 2014-12-20 Коули Фармасьютикал Груп, Инк. Пневмококковая вакцина и ее применения
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
EP2706991B1 (en) 2011-05-11 2021-03-24 Children's Medical Center Corporation Multiple antigen presenting immunogenic composition, and methods and uses thereof
PT2885007T (pt) 2012-08-16 2018-12-10 Pfizer Processos e composições de glicoconjugação
HUE060718T2 (hu) 2012-12-20 2023-04-28 Pfizer Glikokonjugációs eljárás
CN105492454B (zh) 2013-07-07 2019-09-27 马普科技促进协会 合成针对1型肺炎链球菌的疫苗
EP2851092A1 (en) 2013-09-18 2015-03-25 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Protein and peptide-free synthetic vaccines against streptococcus pneumoniae type 3
CN103495161B (zh) 2013-10-08 2019-06-18 江苏康泰生物医学技术有限公司 一种多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物及其制备方法
BR112016015835B1 (pt) 2014-01-21 2023-12-26 Pfizer Inc Processo de preparação de conjugados compreendendo polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae
EP3607966A1 (en) 2014-01-21 2020-02-12 Pfizer Inc Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP3122380B1 (en) 2014-03-25 2025-03-19 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Army Non-toxic adjuvant formulation comprising a monophosphoryl lipid a (mpla)-containing liposome composition and a saponin
WO2016091399A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vaccines against streptococcus pneumoniae serotype 4
EP3303357B1 (en) 2015-06-08 2021-05-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vaccines against streptococcus pneumoniae serotype 5
CN109311924B (zh) 2016-04-14 2020-04-17 马克斯·普朗克科学促进学会 针对肺炎链球菌3型的疫苗的改善的制备
WO2017220753A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR20190108583A (ko) 2017-01-31 2019-09-24 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 다당류-단백질 접합체 제조 방법
EP3589314A4 (en) 2017-02-24 2021-04-21 Merck Sharp & Dohme Corp. INCREASED IMMUNOGENICITY OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATES
JP2020533299A (ja) 2017-09-07 2020-11-19 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． キャリアタンパク質へのコンジュゲーションのための肺炎球菌多糖の製剤方法
PL3678654T3 (pl) 2017-09-07 2024-12-16 Merck Sharp & Dohme Llc Polisacharydy pneumokokowe i ich zastosowanie w immunogennych koniugatach polisacharyd-białko nośnikowe
WO2019050814A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTI-PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES AND THEIR USE IN IMMUNOGENIC CONJUGATES POLYSACCHARIDE-PROTEIN CARRIER
AU2019215216B2 (en) 2018-02-05 2025-04-17 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
SG11202006387QA (en) 2018-02-05 2020-07-29 Sanofi Pasteur Inc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
IL281204B2 (en) 2018-09-12 2025-07-01 Affinivax Inc Multivalent pneumococcal vaccines
WO2020121159A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
EP4346893A2 (en) 2021-05-28 2024-04-10 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PE20240090A1 (es) 2021-05-28 2024-01-16 Pfizer Composiciones inmunogenas que comprenden antigenos de sacarido capsular conjugados y sus usos
CN120513083A (zh) * 2022-12-01 2025-08-19 辉瑞大药厂 肺炎链球菌缀合物疫苗制剂

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