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TW202510886A - 作為用於預測癌症治療反應性之生物標記之存活素 - Google Patents

作為用於預測癌症治療反應性之生物標記之存活素 Download PDF

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TW202510886A
TW202510886A TW113119810A TW113119810A TW202510886A TW 202510886 A TW202510886 A TW 202510886A TW 113119810 A TW113119810 A TW 113119810A TW 113119810 A TW113119810 A TW 113119810A TW 202510886 A TW202510886 A TW 202510886A
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TW113119810A
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米榭拉 加羅法洛
約翰尼斯 柏波
法比歐 薩瓦雷斯
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德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司
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Abstract

本發明係關於一種判定癌症患者對於用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之化合物治療、或對於用抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物治療之反應性的方法，該方法包含：量測在用該化合物治療之前自該患者獲得之第一樣本中存活素水平；量測在用該化合物治療期間或之後自該患者獲得之第二樣本中存活素水平；比較該第二樣本中存活素水平與該第一樣本中存活素水平，其中當該第二樣本中存活素水平相較於該第一樣本中存活素水平降低時，判定該患者對用該化合物之治療有反應。本發明進一步關於一種存活素之用途，其用於判定化合物抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之能力、或化合物抑制MDM2與p53之間相互作用之能力、或包含抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之化合物或抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物的醫藥調配物治療癌症之能力的方法中。

Description

作為用於預測癌症治療反應性之生物標記之存活素
本發明係關於靶向癌症療法領域、用於評定特定化合物之活性的生物標記及使用生物標記來監測用該等化合物之治療。特定言之，本發明係關於一種判定癌症患者對用抑制KRAS (K-Ras)蛋白或KRAS (K-Ras)蛋白之突變體之化合物治療或用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療之反應性的方法，該方法包含：量測在用該化合物治療之前自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平；量測在用該化合物治療期間或之後自該患者獲得之第二樣本中的存活素水平；比較該第二樣本中之存活素水平與該第一樣本中之存活素水平，其中當該第二樣本中之存活素水平相較於該第一樣本中之存活素水平降低時，判定該患者對用該化合物之該治療有反應。本發明進一步係關於一種存活素之用途，其用於判定化合物抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體的能力、或包含抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物的醫藥調配物治療癌症之能力的方法中。本發明進一步係關於一種存活素之用途，其用於判定化合物抑制MDM2與p53之間的相互作用的能力、或包含抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物的醫藥調配物治療癌症之能力的方法中。
癌症係世界上主要的死亡原因，且其治療及成效已藉由靶向療法顯著變革。 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(術語「KRAS」及「K-Ras」在本申請案中同義地使用)在信號轉導中起主要作用，且為突變最頻繁之致癌基因。已在所有癌細胞之約30%中識別到其功能獲得型突變。KRAS突變與腫瘤起始及發展密切相關，且與一系列高度致命的癌症相關聯，包括胰管腺癌(PDAC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及結腸直腸癌(CRC) (Huang等人，2021)。
KRAS係人類癌症(包括胰管腺癌(PDAC))中突變最多之致癌基因，其中95%之患者具有RAS之突變形式。KRAS突變誘導此致癌基因之組成性活化及下游傳訊，包括促進腫瘤發生、侵入性、癌轉移及療法耐藥性之ERK、PI3K (Dhirendra等人，2017)。
KRAS基因係大鼠肉瘤病毒致癌基因家族(RAS)之成員，該大鼠肉瘤病毒致癌基因家族在人類中包括兩種其他同功異型物：Harvey鼠類肉瘤病毒致癌基因(HRAS)及神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(NRAS)。
RAS基因在進化上係保守的，具有類似結構，且由分佈於全長大致為30 kb之DNA上的四個外顯子構成。KRAS基因編碼兩種高度相關之蛋白質同功異型物，KRAS-4B及KRAS-4A，歸因於第四外顯子之不同剪切，其分別由188及189個胺基酸組成(Huang等人，2021)。
RAS係一種結合鳥嘌呤核苷酸之膜結合調節蛋白(G蛋白)，屬於鳥苷三磷酸酶(GTP酶)家族。RAS充當鳥苷二磷酸(GDP)/鳥苷三磷酸(GTP)二元開關，其控制自經活化膜受體至胞內分子之重要信號轉導。
包括KRAS、NRAS及HRAS及其任何突變體之Ras家族蛋白質為以GTP結合狀態或GDP結合狀態存在於細胞中之小GTP酶(McCormick等人，2016；Nimnual等人，2002)。Ras家族蛋白質具有較弱的固有GTP酶活性及較慢的核苷酸交換速率(Hunter等人，2015)。GTP酶活化蛋白(GAP) (諸如NF1)之結合增加了Ras家族蛋白質之GTP酶活性。鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)，諸如SOS1 (非七激酶子1 (Son of Sevenless 1))之結合促進自Ras家族蛋白質釋放GDP，使得能夠進行GTP結合(Chardin等人，1993)。當處於GTP結合狀態時，Ras家族蛋白質具有活性且接合包括C-RAF及磷酸肌醇3-激酶(PI3K)之效應蛋白，以促進RAF/促分裂原或胞外信號調節激酶(MEK/ERK)通路、PI3K/AKT/哺乳動物雷帕黴素目標(mammalian target of rapamycin；mTOR)通路及RalGDS (Ral鳥嘌呤核苷酸解離刺激因子)通路(McCormick等人，2016；Rodriguez-Viciana等人，2005)。此等通路影響各種細胞過程，諸如增殖、存活、代謝、運動、血管生成、免疫及生長(Young等人，2009；Rodriguez-Viciana等人，2005)。
KRAS蛋白充當精細調節之分子開關，其藉由在經活化構形與去活化構形之間循環來控制多個傳訊級聯。KRAS蛋白可由生長因子、趨化因子、Ca 2+或受體酪胺酸激酶(RTK)活化。經活化KRAS蛋白可活化多個傳訊通路，包括作為KRAS傳訊之典型下游目標的RAF/MEK/ERK通路。經活化KRAS-GTP可將快速加速纖維肉瘤(RAF) (絲胺酸/蘇胺酸特異性蛋白激酶)自細胞質募集至血漿膜，誘導RAF之構形變化且藉由同源或異源二聚促進RAF活化。RAF之C端催化域結合至促分裂原活化蛋白激酶(MEK1/2)且藉由磷酸化將其活化。MEK1/2使胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化及活化，且經活化ERK使核糖體S6激酶(RSK)、血清反應因子(SRF)、E26轉譯特異性轉錄因子(ETS)及ETS樣-1蛋白磷酸化以調節對應目標基因之轉錄及轉譯，因此參與細胞增殖、分化、遷移及其他生命活動之調節。
亦發現KRAS與磷酸肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B (AKT)-哺乳動物雷帕黴素目標(mTOR)通路有關，該通路被認為在細胞生命活動(諸如細胞增殖、分化、細胞凋亡及葡萄糖傳送)中起重要作用且對腫瘤耐藥性之產生具有極大影響。經活化KRAS可藉由結合至其p110次單元來活化PI3K。經活化PI3K催化之磷脂醯肌醇4,5-雙磷酸(PIP2)轉化成磷脂醯肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)。PIP3促進磷酸肌醇依賴性激酶1 (PDK1)使Thr308處之AKT磷酸化。mTOR複合物2進一步使AKT之絲胺酸磷酸化位點(Ser473)磷酸化，從而引起完全AKT活化。經活化AKT進入細胞核，活化或抑制許多下游通路，且調節細胞增殖、細胞凋亡及代謝過程。一方面，AKT可直接活化mTOR目標蛋白，該等mTOR目標蛋白在細胞增殖、存活、代謝、蛋白質合成及轉錄中起重要作用。另一方面，AKT使Bcl-XL/Bcl-2相關死亡啟動子(BAD)磷酸化及活化，從而促進BAD與伴隨蛋白14-3-3而非Bcl-2/Bcl-XL結合，因此抑制細胞凋亡。
此外，RAL鳥嘌呤核苷酸解離刺激因子(RalGDS)為KRAS之下游傳訊蛋白，該傳訊蛋白充當GTP/GDP交換因子以促進RAS樣蛋白(RAL)之GDP/GTP轉化。RAL蛋白之下游效應因子包括與細胞遷移相關聯之Rac/細胞分裂週期42 (Cdc42)、與病毒免疫相關聯之TANK結合激酶1 (TBK1)及與胞吞作用相關聯之磷脂酶D (PLD)。KRAS亦調節TIAM1及RAC1特異性鳥嘌呤核苷酸交換因子，以活化影響細胞形狀、遷移、黏附、肌動蛋白細胞骨架形成、胞吞作用及膜運輸(trafficking)之RAC1傳訊通路。另外，KRAS亦可藉由活化PLCε來調節磷脂醯肌醇信號通路。簡而言之，KRAS介導之信號網路係複雜的，且與各種生命活動相關(Huang等人，2021)。
KRAS經由MAP激酶(MAPK)傳訊藉由上調PD-L1表現、下調腫瘤細胞之MHC1表現以及增強各種細胞介素及趨化介素之分泌以募集免疫抑制免疫細胞來介導腫瘤宏觀環境中之免疫逃逸。
Ras家族蛋白質中之癌症相關突變抑制其固有GTP酶活性及GAP誘導之GTP酶活性，從而使得GTP結合/活性突變Ras家族蛋白質之群體增加(McCormick等人，2015；Hunter等人，2015)。此繼而使得突變Ras家族蛋白質下游之效應通路(例如，RAF/MEK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、RalGDS通路)持續活化。在包括肺癌、結腸直腸癌及胰臟癌之各種人類癌症中發現KRAS突變(例如，胺基酸G12、G13、Q61、A146) (Cox等人，2014)。亦在各種人類癌症類型中發現HRAS (例如，胺基酸G12、G13、Q61)及NRAS (例如，胺基酸G12、G13、Q61、A146)中之突變，然而，與KRAS突變相比，頻率通常較低(Cox等人，2014)。亦已將Ras家族蛋白質/Ras基因中之改變(例如，突變、過度表現、基因擴增)描述為針對諸如EGFR抗體西妥昔單抗(cetuximab)及帕尼單抗(panitumumab) (Leto等人，2014)以及EGFR酪胺酸激酶抑制劑奧希替尼(osimertinib)/AZD9291 (Ortiz-Cuaran等人，2016；Eberlein等人，2015)之癌症藥物的耐藥性機制。
Ras家族蛋白質之殘基12處的甘胺酸至半胱胺酸突變(G12C突變，例如KRAS G12C、NRAS G12C及HRAS G12C)係由密碼子12處之G.C至T.A鹼基顛換產生，突變常見於RAS基因中，在癌症類型中佔所有KRAS突變之14%、所有NRAS突變之2%及所有HRAS突變之2%。G12C突變在KRAS突變非小細胞肺癌中尤其豐富，大致一半攜載此突變，此與由菸草煙霧形成之DNA加成物相關聯。G12C突變並非僅與肺癌相關聯且在其他RAS突變癌症類型中被發現，包括例如所有KRAS突變結腸直腸癌之3-5%。
預期能夠共價結合至此等蛋白質之此類G12C突變Ras家族蛋白質之抑制劑(例如，KRAS G12C、NRAS G12C及HRAS G12C之共價結合劑)會抑制Ras家族蛋白質下游之細胞中之傳訊(例如，ERK磷酸化)。在與對突變Ras家族蛋白質(例如，KRAS突變癌細胞株)之依賴性相關聯的癌細胞中，預期此類結合劑/抑制劑會遞送抗癌功效(例如，抑制增殖、存活、癌轉移等)。
針對KRAS G12C突變蛋白之若干選擇性藥物已進入臨床研發階段；索托拉西布(sotorasib)最近已被批准用於治療KRAS G12C驅動肺癌(對應專利申請案WO 2018/217651、WO 2017/201161、WO 2019/099524、WO 2020/102730)。
已在諸如胃癌、胃食管結合部癌及食道癌之腫瘤適應症之子集中觀測到野生型(WT) KRAS原致癌基因之顯著擴增，其中，該擴增充當變化驅動因素且使攜帶此基因型之腫瘤模型在活體外及活體內對KRAS上癮(Wong等人，2018)。相比之下，未擴增之KRAS WT細胞株獨立於KRAS，除非其攜帶間接引起KRAS活化之基因的次級改變(Meyers等人，2017)。基於此等觀測，具有KRAS WT靶向活性之試劑提供用於治療KRAS依賴性癌症之另一方法。
蛋白水解靶向嵌合體(PROTAC)結合至蛋白質，藉由誘導該等蛋白質泛素化而使該等蛋白質降解。PROTAC為三重或異雙官能分子，由結合至待降解之蛋白質之部分、結合至E3泛蛋白連接酶且可人工募集E3泛蛋白連接酶之第二部分及連接該兩個部分之連接子組成。每當形成由目標蛋白、PROTAC及連接酶組成之三聚複合物時，連接酶與目標之緊密靠近皆會引起目標蛋白泛素化。泛素化充當蛋白質之轉譯後修飾，尤其使得該等蛋白質募集至蛋白酶體，從而引起蛋白水解降解。目標蛋白上之多泛蛋白鏈接著被蛋白酶體識別，且目標蛋白被降解。
相比於經典小分子藥物，PROTAC驅動降解在亞化學計量性質下起作用，因此需要較低全身性暴露來達成功效。歸因於所形成之三元複合物之蛋白質-蛋白質相互作用介面的互補性差異，已展示PROTAC相較於目標配位體自身展示了對蛋白質降解更高的選擇性程度。另外，PROTAC有望擴增可成藥(druggable)蛋白體，此係因為降解不限於在功能上引起疾病之蛋白質域。在具有挑戰性之多域蛋白質(傳統上被視為不可成藥目標)的情況下，大部分可連接域可經靶向以降解，而不依賴於其功能性或對小分子阻斷之易感性。
本質上不可逆的是，預期藉由募集E3泛蛋白連接酶誘導之KRAS降解會誘導與不可逆抑制相當的細胞效應。此外，由於突變KRAS仍預期在GTP結合活性狀態與GDP結合非活性狀態之間進行GEF/GAP誘導循環，因此參與GDP結合狀態之PROTAC不僅誘導wt-擴增KRAS之降解而且誘導突變KRAS之降解可能會導致整個細胞KRAS池之較大部分逐漸降解。因此，致癌KRAS之降解可抑制腫瘤中之下游傳訊，從而遞送如針對KRAS抑制所描述之抗癌功效。在不可逆目標降解後，下游傳訊活性之恢復不僅取決於藥物自經治療個體之消除(例如，藉由清除)，而且進一步受核糖體從頭再合成目標蛋白之限制。不可逆抑制迄今受限於KRAS G12C蛋白，該KRAS G12C蛋白僅構成KRAS突變腫瘤之整個補體的一部分。相比之下，經誘導之KRAS降解具有能夠不可逆地抑制大部分剩餘的KRAS突變/改變(包括擴增)驅動腫瘤生長之KRAS傳訊的潛力，其限制條件為其可由異雙官能降解劑分子結合。已使用野生型(例如，擴增或過度表現)或突變KRAS (例如，G12C、G12D、G12V、G13D)之降解劑來遞送抗癌功效。
儘管在此項技術中實行許多方法以用KRAS靶向化合物來治療患者，但仍存在許多態樣待研究，諸如提供量測癌症患者對用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物治療之反應性的手段。
ERBB跨膜受體酪胺酸激酶(RTK)家族由四個成員組成：EGFR (ERBBI)、HER2 (Neu，ERBB2)、HER3 (ERBB3)及HER4 (ERBB4)。未識別到有配位體之HER2為其他ERBB成員之較佳二聚伴侶(partner)。一旦形成活性配位體-受體複合物，EGFR、HER2、HER3或HER4之胞內酪胺酸激酶域便藉由自磷酸化或轉磷酸化而活化，且隨後引發信號轉導級聯，最顯著的是接合促分裂原活化蛋白(MAP)激酶及/或磷酸肌醇3-激酶(PI3K)通路。
在廣泛多種人類惡性腫瘤中觀測到異常HER2傳訊。描述蛋白質之胞外、(近)膜及胞內區之致癌突變。總體而言，此等突變使HER2呈現組成性活性，從而推動癌症起始、腫瘤維持及生長。類似地，HER2過度表現會增加HER2傳訊，且成為包括乳癌、胃癌或肺癌之各種適應症的腫瘤轉化及腫瘤維持之基礎。
因此，對HER2致癌傳訊之干擾引起對腫瘤生長之抑制。靶向療法包括HER2定向抗體(包括曲妥珠單抗(trastuzumab)及帕妥珠單抗(pertuzumab))、HER2定向抗體-藥物共軛物(曲妥珠單抗-DM1 (T-DM1，曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(adotrastuzumab emtansine)))及抑制HER2激酶域之小分子。
總而言之，由HER2致癌突變或HER2野生型過度表現(例如歸因於基因擴增)驅動之腫瘤可受益於HER2特異性酪胺酸激酶抑制劑(TKI)。總體而言，HER2改變會影響多至6-7%之所有人類癌症(WO2021213800)。
p53之去活化係腫瘤逃避身體之控制機制且促進腫瘤生長及增殖之中心機制。在許多癌症類型中，TP53基因經常突變或缺失，從而使p53蛋白之腫瘤抑制活性去活化。然而，p53腫瘤抑制活性之丟失亦可經由MDM2之擴增而發生。由於MDM2為p53之負調節因子，此促進p53降解且抑制p53腫瘤抑制活性(Zhao等人，2014)。
總體而言，大致5-7%之腫瘤展示MDM2擴增。然而，此類擴增在某些腫瘤類型中比在其他類型中更常見，在某些類型之晚期軟組織肉瘤(STS)中，發生率高達90%。
因此，阻斷MDM2-p53相互作用以再激活野生型p53功能係一種有前景的癌症治療策略。已研發出經設計以靶向MDM2-p53相互作用之初始化合物。彼種類之化合物可具有雙重作用機制：直接靶向腫瘤細胞及施加免疫細胞調節作用；該等化合物直接結合至MDM2且阻斷該MDM2與p53相互作用，從而引起處於野生型TP53狀態之腫瘤細胞中之p53穩定、TP53目標基因誘導、細胞週期停滯及細胞凋亡。p53之活化亦藉由增加腫瘤中之CD8+ T細胞浸潤來促進抗腫瘤免疫反應，且誘導抗腫瘤免疫記憶。
小鼠雙微體2 (MDM2)蛋白(或其人類同源物，亦稱為HDM2)用於以自動調節方式下調p53活性，且在正常細胞條件(不存在應力)下，MDM2蛋白用以將p53活性維持在低水平。MDM2直接抑制p53之反式活化功能，自細胞核輸出p53且促進蛋白酶體介導之p53降解。
腫瘤抑制蛋白p53為序列特異性轉錄因子且在若干細胞過程之調節中起主要作用，該等細胞過程包括細胞週期及生長停滯、細胞凋亡、DNA修復、衰老、血管生成及先天性免疫。
由MDM2之過度表現或p53突變或損失引起的MDM2/p53平衡之失調引起正常細胞之惡性轉化。目前，已知p53在幾乎所有類型之人類癌症中起關鍵作用，且p53基因之突變或損失可在世界上超過50%之所有人類癌症中被識別到。
在含有野生型p53之腫瘤中，MDM2為p53活性之主要細胞抑制劑，且在許多人類腫瘤中發現MDM2之過度表現。由於MDM2經由直接蛋白質-蛋白質相互作用來抑制p53，因此最近已實行使用小分子阻斷此相互作用。
與本發明相關之化合物的特徵在於對MDM2與p53之間的相互作用之強大抑制作用及繼而針對腫瘤細胞(例如，骨肉瘤、ALL等)之高活體外功效，此係經由抑制MDM2與p53之間的相互作用來介導且為在活體內模型及未來患者中有對應功效之前提條件(WO 2017/060431)。
根據第一態樣，本發明係關於一種判定癌症患者對用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物治療之反應性的方法，該方法包含： -量測在用該化合物治療之前自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， -量測在用該化合物治療期間或之後自該患者獲得之第二樣本中的存活素水平， -比較該第二樣本中之存活素水平與該第一樣本中之存活素水平， 其中當該第二樣本中之存活素水平相較於該第一樣本中之存活素水平降低時，判定該患者對用該化合物之該治療有反應。
此外，本發明係關於一種判定癌症患者對用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療之反應性的方法，該方法包含： -量測在用該化合物治療之前自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， -量測在用該化合物治療期間或之後自該患者獲得之第二樣本中的存活素水平， -比較該第二樣本中之存活素水平與該第一樣本中之存活素水平， 其中當該第二樣本中之存活素水平相較於該第一樣本中之存活素水平降低時，判定該患者對用該化合物之該治療有反應。
根據第二態樣，本發明係關於一種抑制KRAS蛋白或K-Ras蛋白之突變體之化合物，其用於治療癌症患者， i)其中KRAS抑制劑係選自由以下組成之群：KRAS(G12C)抑制劑或降解劑、KRAS(G12D)抑制劑或降解劑、GDP-KRAS抑制劑或降解劑及HER2抑制劑或降解劑；且 ii)其中已根據上文所描述之方法判定該患者對用該化合物之該治療有反應。
此外，本發明係關於一種抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物，其用於治療癌症患者，其中已根據上文所描述之方法判定該患者對用之該化合物之該治療有反應。
根據第三態樣，本發明係關於一種用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物治療患者之癌症的方法，其中已根據上文所描述之方法中之任一者判定該患者對用該化合物之該治療有反應。
此外，本發明係關於一種用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療患者之癌症的方法，其中已根據上文所描述之方法中之任一者判定該患者對用該化合物之該治療有反應。
根據第四態樣，本發明係關於一種存活素之用途，其用於判定化合物抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體的能力、或包含抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物的醫藥調配物治療癌症之能力的方法中。
此外，本發明係關於一種存活素之用途，其用於判定化合物抑制MDM2與p53之間的相互作用的能力、或包含抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物的醫藥調配物治療癌症之能力的方法中。
根據第五態樣，本發明係關於一種部件套組(kit of parts)，其包含用於判定由患有癌症之患者提供之樣本中之存活素水平的構件及如何執行如上文所描述之該等方法中之任一者的說明書。
本發明人已出乎意料地發現細胞凋亡抑制因子(IAP)蛋白存活素可充當用於選擇可藉由KRAS抑制劑更有利地治療之癌症患者的生物標記，且可藉由定量測定由患者提供之血液、血漿或血清樣本而容易地評定及監測此生物標記。
藉由使用此類分子生物標記，可避免對KRAS抑制劑無反應之癌症患者的非有效治療，且因此可更快速地為該等患者更換更有效的藥物種類，從而增加治療有效性且延長存活時間。將存活素水平判定為樣本中易於提供之生物標記進一步減少了臨床人員之總體治療成本及勞動時間。另外，以此方式可避免頻繁採集腫瘤樣本以監測治療成效及評定癌症進展。
此等目標符合根據本發明之獨立申請專利範圍的主題、方法及手段。附屬申請專利範圍與較佳實施例相關。
本發明之目標之額外細節、特徵、特性及優點揭示於附屬申請專利範圍以及以例示性方式展示本發明之較佳實施例的各別圖式及實例之以下描述中。然而，此等實例及圖式決不應理解為限制本發明之範疇。
在詳細描述本發明之前，應理解，本發明不限於所描述之特定化合物或方法，因為此類化合物或方法可變化。亦應理解，本文中所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的且不意欲為限制性的。必須指出，除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括單數及/或複數個指示物。此外，應理解，在給定由數值定界之參數範圍的情況下，認為該等範圍包括此等限制值。亦應理解，由數值定界之值範圍應理解為包括該等定界值。
應進一步理解，本文中所揭示之實施例不意欲理解為彼此不相關之個別實施例。用一個實施例論述之特徵意謂亦結合本文中所展示之其他實施例揭示。若在一種情況下，特定特徵不用一個實施例而用另一實施例揭示，則熟習此項技術者應理解，不必意謂該特徵不意欲用該另一實施例揭示。熟習此項技術者應理解，本申請案之要旨為揭示該特徵亦適用於另一實施例，但僅出於清楚起見且將說明書保持在可管理範圍中，此尚未進行。
此外，本文中所提及之先前技術文獻之內容以引用之方式併入。此尤其係指揭示標準或常規方法之先前技術文獻。在彼情況下，以引用之方式併入主要目的係使得能夠充分揭示且避免冗長重複。
根據第一態樣，本發明係關於一種判定癌症患者對用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物治療之反應性的方法，該方法包含： -量測在用該化合物治療之前自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， -量測在用該化合物治療期間或之後自該患者獲得之第二樣本中的存活素水平， -比較該第二樣本中之存活素水平與該第一樣本中之存活素水平， 其中當該第二樣本中之存活素水平相較於該第一樣本中之存活素水平降低時，判定該患者對用該化合物之該治療有反應。
可在治療週期期間獲得多於一個樣本以及多於第一樣本及第二樣本以繼續監測患者之反應性或在治療結束之後監測潛在復發。
判定癌症患者之反應性的該方法較佳在活體外(離體)執行。
本發明亦係關於一種判定癌症患者對用抑制HER2蛋白或HER2蛋白之突變體之化合物治療之反應性的方法，該方法包含： -量測在用該化合物治療之前自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， -量測在用該化合物治療期間或之後自該患者獲得之第二樣本中的存活素水平， -比較該第二樣本中之存活素水平與該第一樣本中之存活素水平， 其中當該第二樣本中之存活素水平相較於該第一樣本中之存活素水平降低時，判定該患者對用該化合物之該治療有反應，較佳地，其中HER2抑制劑為HER2-cpd#1。
如上文所描述，可在治療週期期間獲得多於一個樣本以及多於第一樣本及第二樣本以繼續監測患者之反應性或在治療結束之後監測潛在復發。此外，判定癌症患者之反應性的該方法較佳在活體外(離體)執行。
本發明進一步係關於一種判定癌症患者對用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物(在本文中亦稱為MDM2抑制劑或MDM2i)治療之反應性的方法，該方法包含： -量測在用該化合物治療之前自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， -量測在用該化合物治療期間或之後自該患者獲得之第二樣本中的存活素水平， -比較該第二樣本中之存活素水平與該第一樣本中之存活素水平， 其中當該第二樣本中之存活素水平相較於該第一樣本中之存活素水平降低時，判定該患者對用該化合物之該治療有反應，較佳地，其中抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物為MDM2i-cpd#1。
如上文所描述，可在治療週期期間獲得多於一個樣本以及多於第一樣本及第二樣本以繼續監測患者之反應性或在治療結束之後監測潛在復發。此外，判定癌症患者之反應性的該方法較佳在活體外(離體)執行。
如本文中所使用，術語「抑制(inhibit)」或「抑制(inhibiting)」係指藉由該化合物分別完全或部分地減少或預防該KRAS蛋白或該KRAS蛋白之突變體、或該HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體的活性及/或功能。術語「抑制(inhibit)」或「抑制(inhibiting)」亦指該化合物分別結合至KRAS蛋白或該KRAS蛋白之突變體、或HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體，其中該結合可為直接或間接的、競爭性的或異位的。術語「抑制(inhibit)」或「抑制(inhibiting)」亦指分別降解該KRAS蛋白或該KRAS蛋白之突變體、或該HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體，及分別標記該KRAS蛋白或該KRAS蛋白之突變體、或該HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體的降解；及分別完全或部分地以各種方式中和該KRAS蛋白或該KRAS蛋白之突變體、或該HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體的活性及/或功能。當在抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物的上下文中使用時，相同考慮適用於術語「抑制(inhibit)」或「抑制(inhibiting)」，如下文進一步描述。
如本文中所使用，術語存活素之「水平」或「量測」存活素之「水平」係指存活素之RNA、mRNA或蛋白質中之任一者之水平或量或量測。該等術語進一步係指量測樣本中之存活素的水平或量，其中存活素之RNA、mRNA或蛋白質可在細胞內、在細胞膜中或在細胞膜上、在細胞外部、在流體培養基中、在胞泌體內及/或可在血液、血漿或血清樣本中。
如本文中所使用，術語「降低」係指第二(或第n+1)樣本中之生物標記存活素水平相較於第一(或第n)樣本中之水平降低至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多，或100%。
如本文中所使用，術語「存活素」係指具有根據UniProtKB/TrEMBL條目O15392之胺基酸序列的蛋白質，以及該蛋白質之任何變體、同功異型物、剪接變體、活性突變體或次級資料庫條目。
由 BIRC5( 含桿狀病毒 IAP 重複 5 (Baculoviral IAP Repeat-Containing 5)，亦稱為 API4)基因編碼之存活素為 蛋白質之「細胞凋亡抑制因子」 (IAP) 家族的最小成員，且為細胞凋亡之抑制因子及細胞週期之調節因子。此等功能性屬性使得存活素為展現不同功能(包括調節細胞死亡及細胞增殖)之獨特蛋白。
存活素為具有多官能域之具有142個胺基酸的小蛋白質。其三分之二N端包含球狀桿狀病毒細胞凋亡抑制因子重複(BIR)域(aa 20-90)，該域之完整性取決於由C57、C60、C84及H77創建之鋅指；三分之一C端為延長的α螺旋(98-142)。IAP家族成員通常含有多個桿狀病毒IAP重複(BIR)域，但 BIRC5基因編碼之存活素蛋白質僅含有單個BIR域。基因表現在胎兒發育期間及大部分腫瘤中較高，但在成人組織中較低。除經活化T淋巴球、紅血球母細胞及自我更新幹細胞之外，成人細胞中不存在存活素(Wheatley及Altieri，2019)。
已展示存活素(BIRC5)參與細胞凋亡抑制及細胞增殖(LaCasse等人，1998)。存活素在許多癌症類型中上調，在正常組織中表現較低(Kawasaki等人，1998)。若干出版物已展示存活素與不良預後(Takai等人，2002)及對化學療法之耐藥性(Zafaroni等人，2002)相關。
細胞凋亡為計畫性細胞死亡之主要形式，且依賴於稱作凋亡蛋白酶之半胱胺酸蛋白酶而以控制方式分解細胞。存活素保護細胞免於細胞凋亡及自噬性死亡；存活素在細胞質內之定位對其抗細胞凋亡活性至關重要。已發現存活素表現會降低凋亡蛋白酶活性，然而，存活素在生理濃度下不結合至凋亡蛋白酶，而是與XIAP及B型肝炎病毒X相互作用蛋白(HBXIP，亦稱為LAMTOR5)協作以與XIAP相關因子1 (XAF1)形成複合物，以影響XIAP與凋亡蛋白酶之相互作用或增強其他IAP家族成員之作用。
除其胞內定位之外，亦在自癌細胞構成性分泌之胞泌體的表面上發現存活素。已發現存活素自腫瘤細胞之此釋放支持相鄰腫瘤細胞逃避細胞凋亡(Khan等人，2011)。
由於其抗細胞凋亡效應，存活素已被視為癌症療法之目標(Altieri，2003；Li等人，2019；Wheatley及Altieri，2019)。突變KRAS及存活素兩者均展示促成瘤形成(Tecleab及Sebti，2013)。已展示KRAS抑制劑與β鏈蛋白抑制劑之組合應用在癌細胞之生長停滯、細胞死亡及存活素下調方面起協同作用；然而，此效果僅在組合應用之情況下被觀測到，而在用任一抑制劑單獨處理之情況下未達到效果(Mologni等人，2012)。
本發明人已出乎意料地發現細胞凋亡抑制因子(IAP)蛋白存活素可用於判定癌症患者對用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體或抑制HER2蛋白或HER2蛋白之突變體之化合物治療的反應性之方法中，且因此充當用於選擇可藉由KRAS或HER2抑制劑更有利地治療之癌症患者，較佳患有KRAS依賴性癌症之患者的生物標記。類似地，本案發明人發現，存活素亦可用於判定癌症患者對用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療之反應性的方法中，如下文進一步描述。本案發明人進一步發現可藉由定量測定血液、血漿或血清樣本而容易地評定及監測此生物標記。
此發現亦為出人意料的，因為已報導K-RAS依賴性人類癌細胞在很大程度上增加了富含存活素之胞泌體的產生，因此加強對自身及其他癌細胞以及非癌纖維母細胞之保護，從而免於細胞凋亡細胞死亡(Chang等人，2021)。此外，Chang等人(2021)觀測到，存活素之上調係腫瘤細胞使其對用抗腫瘤藥物治療具有耐藥性的手段。出乎意料地，儘管存活素具有該抗細胞凋亡及保護效應，但本發明人發現用K-RAS抑制劑進行治療性干預是有效的，本發明人亦展示，可自自經治療小鼠獲得之樣本非侵入性地監測該治療性功效。因此，此等小鼠實驗提供證據表明存活素水平之評定同樣適用於判定癌症患者對用KRAS抑制劑或降解劑治療或用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療的反應性。
在本發明之一或多個較佳實施例中，該第一樣本及/或該第二樣本為血液、血漿或血清樣本。較佳地，所有樣本均為血液、血漿或血清樣本。
在本發明之一或多個較佳實施例中，量測樣本中之存活素水平之步驟包含自該樣本分離胞泌體及量測該等胞泌體中所包含之存活素水平。用於分離胞泌體及量測該等胞泌體中所包含之存活素水平的手段及方法為此項技術中已知的，且已描述於本文之實驗部分中。
在本發明之一或多個較佳實施例中，存活素水平係使用選自由以下組成之群存活素特異性分析來量測：西方墨點法(Western Blot)、ELISA、RIA、MSD® S-PLEX技術及FACS。較佳地，存活素水平係使用ELISA或MSD® S-PLEX技術來量測。
在本發明之一或多個較佳實施例中，癌症為KRAS依賴性癌症，較佳為選自由以下組成之群的KRAS依賴性癌症：胰管腺癌(PDAC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及結腸直腸癌(CRC)。
在本發明之一或多個較佳實施例中，待用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物(其係選自由KRAS(G12C)抑制劑或降解劑、KRAS(G12D)抑制劑或降解劑及GDP-KRAS抑制劑或降解劑組成之群)治療的癌症係選自：腦腫瘤，諸如例如聽覺神經鞘瘤、星形細胞瘤(諸如毛狀星形細胞瘤、原纖維性星形細胞瘤、原生質星形細胞瘤、大圓形細胞性星形細胞瘤、退行性星形細胞瘤)及神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、腦淋巴瘤、腦轉移瘤、垂體腫瘤(諸如促乳素瘤、HGH (人類生長激素)產生腫瘤及ACTH產生腫瘤(促腎上腺皮質激素))、顱咽管瘤、神經管母細胞瘤、腦膜瘤及寡樹突神經膠質瘤；神經腫瘤(贅瘤)，諸如例如營養神經系統之腫瘤(諸如神經母細胞瘤交感神經瘤、神經節細胞瘤、副神經節瘤(嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma/chromaffinoma))及頸動脈球(glomus-caroticum)腫瘤)、周邊神經系統上之腫瘤(諸如截肢性神經瘤、神經纖維瘤、神經鞘瘤(neurilemmoma/Schwannoma)及惡性神經鞘瘤)，以及中樞神經系統之腫瘤(諸如腦腫瘤及骨髓腫瘤)；腸癌，諸如例如直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、大腸癌、小腸腫瘤及十二指腸腫瘤；眼瞼腫瘤，諸如基底癌或基底細胞癌；胰臟癌(pancreatic cancer)或胰臟癌(carcinoma of the pancrea)；膀胱癌(bladder cancer)或膀胱癌(carcinoma of the bladder)及其他尿道上皮癌；肺癌(支氣管癌)，諸如例如小細胞支氣管癌(燕麥細胞癌)及非小細胞支氣管癌(NSCLC)，諸如板上皮癌、腺癌及大細胞支氣管癌；乳癌，諸如例如乳腺癌(諸如浸潤性乳腺管癌、膠質性癌、小葉侵襲性癌、管狀癌、腺囊癌及乳頭狀癌)、激素受體陽性乳癌(雌激素受體陽性乳癌、孕酮受體陽性乳癌)、Her2陽性乳癌、三陰性乳癌；非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma；NHL)，諸如例如伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、低惡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及黏液蕈狀肉芽腫(mucosis fungoides)；子宮癌或子宮內膜癌或子宮體癌；CUP症候群(原發灶不明癌)；卵巢癌(ovarian cancer)或卵巢癌(ovarian carcinoma)，諸如黏液性、子宮內膜或漿液性癌症；膽囊癌；膽管癌，諸如例如克拉斯金腫瘤(Klatskin tumor)；睪丸癌，諸如例如精原細胞瘤及非精原細胞瘤；淋巴瘤(淋巴肉瘤)，諸如例如惡性淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，諸如慢性淋巴性白血病、白血病網狀內皮增殖病、免疫細胞瘤、漿細胞瘤、多發性骨髓瘤(MM)、免疫母細胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、T區蕈狀肉芽腫(T-zone mycosis fungoides)、大細胞退行性淋巴胚細胞瘤及淋巴胚細胞瘤；喉頭癌，諸如例如聲帶腫瘤、聲門上、聲門及聲門下喉頭腫瘤；骨癌，諸如例如骨軟骨瘤、軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨瘤、骨樣骨瘤、骨母細胞瘤、嗜酸性球性肉芽腫(eosinophilic granuloma)、巨細胞腫瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、網狀細胞肉瘤、軟組織肉瘤、脂肪肉瘤、漿細胞瘤、纖維性結構不良、幼年型骨囊腫及動脈瘤性骨囊腫；頭頸部腫瘤，諸如例如嘴唇、舌、口底、口腔、齒齦、齶、唾液腺、咽喉、鼻腔、鼻竇、喉頭及中耳之腫瘤；肝癌，諸如例如肝細胞癌(liver cell carcinoma)或肝細胞癌(hepatocellular carcinoma；HCC)；白血病，諸如例如急性白血病，諸如急性淋巴性/淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)；慢性白血病，諸如慢性淋巴性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)；骨髓發育不良症候群(MDS)；胃癌(stomach cancer)或胃癌(gastric carcinoma)，諸如例如乳頭狀腺癌、管狀腺癌及黏液性腺癌、戒環細胞癌、腺鱗癌、小細胞癌及未分化性瘤；黑色素瘤，諸如例如表面擴散黑色素瘤、結節性黑色素瘤、小痣性惡性(lentigo-maligna)黑色素瘤及肢端小痣性(acral-lentiginous)黑色素瘤；腎癌，諸如例如腎細胞癌或腎上腺樣瘤或格拉維茨氏腫瘤(Grawitz's tumour)；食道癌(oesophageal cancer)或食道癌(carcinoma of the oesophagus)；陰莖癌；前列腺癌(例如去勢抗性前列腺癌)；咽喉癌或咽癌，諸如例如鼻咽癌、口咽癌及下咽癌；視網膜母細胞瘤、陰道癌(vaginal cancer)或陰道癌(vaginal carcinoma)、間皮瘤；板上皮癌、腺癌、原位癌、惡性黑色素瘤及肉瘤；甲狀腺癌，諸如例如乳頭狀、濾泡性及甲狀腺髓質癌，以及退行性癌；皮膚之眼瞼鱗狀細胞癌、表皮樣癌及板上皮癌；胸腺瘤、尿道癌症、子宮頸癌、腺樣囊性癌症(AdCC)、腎上腺皮質癌及外陰癌。
在另一較佳實施例中，待用抑制或降解HER2之化合物治療之癌症係選自由以下之頭頸部之癌症/腫瘤/癌組成之群：例如鼻腔、鼻竇、鼻咽、口腔(包括唇、齒齦、牙槽脊、磨牙後三角、口底、舌、硬齶、頰黏膜)、口咽(包括舌根、扁桃體、扁桃體弓(tonsillar pilar)、軟齶、扁桃體窩、咽壁)、中耳、喉頭(包括上聲門、聲門、下聲門、聲帶)、下咽、唾液腺(包括小唾液腺)之腫瘤/癌/癌症；肺之癌症/腫瘤/癌：例如非小細胞肺癌(NSCLC) (鱗狀細胞癌、梭狀細胞癌、腺癌、大細胞癌、透明細胞癌、支氣管肺泡)、小細胞肺癌(SCLC) (燕麥細胞癌、中間型細胞癌、組合燕麥細胞癌)；縱隔之贅瘤：例如神經性腫瘤(包括神經纖維瘤、神經鞘瘤、惡性神經鞘瘤、神經肉瘤、神經節母細胞瘤、神經節細胞瘤、神經母細胞瘤、嗜鉻細胞瘤、副神經節瘤)、生殖細胞腫瘤(包括精原細胞瘤、畸胎瘤、非精原細胞瘤)、胸腺腫瘤(包括胸腺瘤、胸腺脂肪瘤、胸腺癌、胸腺類癌)、間葉性腫瘤(包括纖維瘤、纖維肉瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、黏液瘤、間皮瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、黃色肉芽腫、間葉瘤、血管瘤、血管內皮瘤、血管外皮瘤、淋巴管瘤、淋巴周邊細胞瘤、淋巴管肌瘤)；胃腸(GI)道之癌症/腫瘤/癌：例如食道、胃(胃癌)、胰臟、肝及膽道(包括肝細胞癌(HCC)，例如兒童HCC、纖維板層HCC、複合性HCC、梭狀細胞HCC、透明細胞HCC、巨細胞HCC、癌肉瘤HCC、硬化性HCC；肝母細胞瘤；膽管癌；膽管細胞癌；肝囊腺癌；血管肉瘤、血管內皮瘤、平滑肌肉瘤、惡性神經鞘瘤、纖維肉瘤、克拉斯金腫瘤)、膽囊、肝外膽管、小腸(包括十二指腸、空腸、回腸)、大腸(包括盲腸、結腸、直腸、肛門；結腸直腸癌、胃腸道基質瘤(GIST))、泌尿生殖系統(包括腎臟，例如腎盂、腎細胞癌(RCC)、腎母細胞瘤(威耳姆士腫瘤(Wilms tumor))、腎上腺樣瘤、格拉維茨腫瘤；輸尿管；膀胱，例如臍尿管癌、尿道上皮癌；尿道，例如遠端、球膜、前列腺；前列腺(雄激素依賴性、雄激素非依賴性、去勢抗性、激素非依賴性、激素難治性)、陰莖)之腫瘤/癌/癌症；睪丸之癌症/腫瘤/癌：例如精原細胞瘤、非精原細胞瘤；婦科癌症/腫瘤/癌：例如卵巢、輸卵管、腹膜、子宮頸、外陰、陰道、子宮體(包括子宮內膜、底部)之腫瘤/癌/癌症；乳房之癌症/腫瘤/癌：例如乳腺癌(浸潤性乳腺管癌、膠質性癌、小葉侵襲性癌、管狀癌、腺囊癌、乳頭狀癌、髓質癌、黏液性癌)、激素受體陽性乳癌(雌激素受體陽性乳癌、孕酮受體陽性乳癌)、Her2陽性乳癌、三陰性乳癌、佩吉特氏乳房病(Paget s disease of the breast)；內分泌系統之癌症/腫瘤/癌：例如內分泌腺、甲狀腺(甲狀腺癌/腫瘤；乳頭狀、濾泡性、退行性、髓質)、副甲狀腺(副甲狀腺癌/腫瘤)、腎上腺皮層(腎上腺皮層癌/腫瘤)、腦下腺(包括促乳素瘤、顱咽管瘤)、胸腺、腎上腺、松果體腺、頸動脈體、胰島細胞瘤、副神經節、胰臟內分泌腫瘤(PET；無氟功能性PET、胰多肽瘤(PPoma)、胃泌素瘤、胰島素瘤、血管活性腸肽瘤(VIPoma)、升糖素瘤、體抑素瘤、生長激素釋放因子瘤(GRFoma)、促腎上腺皮質激素瘤(ACTHoma))、類癌腫瘤之腫瘤/癌/癌症；軟組織之肉瘤：例如纖維肉瘤、纖維組織細胞瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposis sarcoma)、血管球腫瘤、血管外皮瘤、滑膜肉瘤、腱鞘巨細胞瘤、胸膜及腹膜孤立性纖維腫瘤、瀰漫性間皮瘤、惡性周邊神經外鞘瘤(MPNST)、顆粒細胞腫瘤、透明細胞肉瘤、黑素細胞神經鞘瘤、神經叢肉瘤(plexosarcoma)、神經母細胞瘤、神經節母細胞瘤、神經上皮瘤、骨外尤文氏肉瘤(extraskeletal Ewing´s sarcoma)、副神經節瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、間葉瘤、軟組織肺泡狀肉瘤、上皮樣肉瘤、腎外橫紋肌樣瘤、促結締組織增生性小細胞腫瘤；骨骼之肉瘤：例如骨髓瘤、網狀細胞肉瘤、軟骨肉瘤(包括中心細胞軟骨肉瘤、周邊細胞軟骨肉瘤、透明細胞軟骨肉瘤、間葉性軟骨肉瘤)、骨肉瘤(包括骨旁骨肉瘤、骨膜骨肉瘤、高惡性表面骨肉瘤、小細胞骨肉瘤、輻射誘導之骨肉瘤、佩吉特氏肉瘤)、尤文氏腫瘤、惡性巨細胞腫瘤、釉質瘤、(纖維)組織細胞瘤、纖維肉瘤、脊索瘤、小圓形細胞肉瘤、血管內皮瘤、血管外皮瘤、骨軟骨瘤、骨樣骨瘤、骨母細胞瘤、嗜酸性肉芽腫、軟骨母細胞瘤；間皮瘤：例如胸膜間皮瘤、腹膜間皮瘤；皮膚之癌症：例如基底細胞癌、鱗狀細胞癌、默克爾氏細胞癌(Merkel′s cell carcinoma)、黑色素瘤(包括皮膚黑色素瘤、淺面擴散黑色素瘤、小痣性惡性黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、結節性黑色素瘤、眼內黑色素瘤)、光化性角化症、眼瞼癌；中樞神經系統及大腦之贅瘤：例如星形細胞瘤(大腦星形細胞瘤、小腦星形細胞瘤、瀰漫性星形細胞瘤、原纖維性星形細胞瘤、退行性星形細胞瘤、毛狀星形細胞瘤、原生質星形細胞瘤、大圓形細胞性星形細胞瘤)、神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、寡樹突神經膠質瘤、寡突星形細胞瘤、室管膜瘤、室管膜母細胞瘤、脈絡叢腫瘤、神經管母細胞瘤、脊膜瘤、神經鞘瘤、血管母細胞瘤、血管瘤、血管外皮細胞瘤、神經瘤、神經節細胞瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤(例如聽覺神經瘤)、脊髓腫瘤；淋巴瘤及白血病：例如B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL) (包括小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、彌散性大細胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏淋巴瘤(BL))、T細胞非霍奇金氏淋巴瘤(包括退行性大細胞淋巴瘤(ALCL)、成年T細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、周邊T細胞淋巴瘤(PTCL))、淋巴母細胞T細胞淋巴瘤(T-LBL)、成年T細胞淋巴瘤、淋巴母細胞B細胞淋巴瘤(B-LBL)、免疫細胞瘤、慢性B細胞淋巴球性白血病(BchlorineL)、慢性T細胞淋巴球性白血病(TchlorineL)、B細胞小淋巴球性淋巴瘤(B-SLL)、皮膚T細胞淋巴瘤(CTLC)、原發性中樞神經系統淋巴瘤(PCNSL)、免疫母細胞瘤、霍奇金氏病(HD) (包括結節性淋巴球優勢HD (NLPHD)、結節性硬化HD (NSHD)、混合細胞性HD (MCHD)、富含淋巴球之典型HD、淋巴球耗竭性HD (LDHD))、大顆粒淋巴球白血病(LGL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性/骨髓白血病(AML)、急性淋巴性/淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性前髓細胞性白血病(APL)、慢性淋巴球性/淋巴性白血病(CLL)、前淋巴球性白血病(PLL)、毛細胞白血病、慢性骨髓性/骨髓白血病(CML)、骨髓瘤、漿細胞瘤、多發性骨髓瘤(MM)、漿細胞瘤、骨髓發育不良症候群(MDS)、慢性骨髓單核細胞性白血病(CMML)；原發部位未知之癌症(CUP)。
在另一較佳實施例中，用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療的癌症係選自：腦腫瘤，諸如例如聽覺神經鞘瘤、星形細胞瘤(諸如毛狀星形細胞瘤、原纖維性星形細胞瘤、原生質星形細胞瘤、大圓形細胞性星形細胞瘤、退行性星形細胞瘤)及神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、腦淋巴瘤、腦轉移瘤、垂體腫瘤(諸如促乳素瘤、HGH (人類生長激素)產生腫瘤及ACTH產生腫瘤(促腎上腺皮質激素))、顱咽管瘤、神經管母細胞瘤、腦膜瘤及寡樹突神經膠質瘤；神經腫瘤(贅瘤)，諸如例如營養神經系統之腫瘤(諸如神經母細胞瘤交感神經瘤、神經節細胞瘤、副神經節瘤(嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma/chromaffinoma))及頸動脈球腫瘤)、周邊神經系統上之腫瘤(諸如截肢性神經瘤、神經纖維瘤、神經鞘瘤(neurilemmoma/Schwannoma)及惡性神經鞘瘤)，以及中樞神經系統之腫瘤(諸如腦腫瘤及骨髓腫瘤)；腸癌，諸如例如直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、大腸癌、小腸腫瘤及十二指腸腫瘤；眼瞼腫瘤，諸如基底癌或基底細胞癌；胰臟癌(pancreatic cancer)或胰臟癌(carcinoma of the pancrea)；膀胱癌(bladder cancer)或膀胱癌(carcinoma of the bladder)及其他尿道上皮癌；肺癌(支氣管癌)，諸如例如小細胞支氣管癌(燕麥細胞癌)及非小細胞支氣管癌(NSCLC)，諸如板上皮癌、腺癌及大細胞支氣管癌；乳癌，諸如例如乳腺癌(諸如浸潤性乳腺管癌、膠質性癌、小葉侵襲性癌、管狀癌、腺囊癌及乳頭狀癌)、激素受體陽性乳癌(雌激素受體陽性乳癌、孕酮受體陽性乳癌)、Her2陽性乳癌、三陰性乳癌；非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，諸如例如伯基特氏淋巴瘤、低惡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及黏液蕈狀肉芽腫；子宮癌或子宮內膜癌或子宮體癌； CUP症候群(原發灶不明癌)；卵巢癌(ovarian cancer)或卵巢癌(ovarian carcinoma)，諸如黏液性、子宮內膜或漿液性癌症；膽囊癌；膽管癌，諸如例如克拉斯金腫瘤；睪丸癌，諸如例如精原細胞瘤及非精原細胞瘤；淋巴瘤(淋巴肉瘤)，諸如例如惡性淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，諸如慢性淋巴性白血病、白血病網狀內皮增殖病、免疫細胞瘤、漿細胞瘤、多發性骨髓瘤(MM)、免疫母細胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、T區蕈狀肉芽腫、大細胞退行性淋巴胚細胞瘤及淋巴胚細胞瘤；喉頭癌，諸如例如聲帶腫瘤、聲門上、聲門及聲門下喉頭腫瘤；骨癌，諸如例如骨軟骨瘤、軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨瘤、骨樣骨瘤、骨母細胞瘤、嗜酸性球性肉芽腫、巨細胞腫瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、網狀細胞肉瘤、軟組織肉瘤、脂肪肉瘤、漿細胞瘤、纖維性結構不良、幼年型骨囊腫及動脈瘤性骨囊腫；頭頸部腫瘤，諸如例如嘴唇、舌、口底、口腔、齒齦、齶、唾液腺、咽喉、鼻腔、鼻竇、喉頭及中耳之腫瘤；肝癌，諸如例如肝細胞癌(liver cell carcinoma)或肝細胞癌(hepatocellular carcinoma；HCC)；白血病，諸如例如急性白血病，諸如急性淋巴性/淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)；慢性白血病，諸如慢性淋巴性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)；骨髓發育不良症候群(MDS)；胃癌(stomach cancer)或胃癌(gastric carcinoma)，諸如例如乳頭狀腺癌、管狀腺癌及黏液性腺癌、戒環細胞癌、腺鱗癌、小細胞癌及未分化性瘤；黑色素瘤，諸如例如表面擴散黑色素瘤、結節性黑色素瘤、小痣性惡性黑色素瘤及肢端小痣性黑色素瘤；腎癌，諸如例如腎細胞癌或腎上腺樣瘤或格拉維茨氏腫瘤；食道癌(oesophageal cancer)或食道癌(carcinoma of the oesophagus)；陰莖癌；前列腺癌(例如去勢抗性前列腺癌)；咽喉癌或咽癌，諸如例如鼻咽癌、口咽癌及下咽癌；視網膜母細胞瘤、陰道癌(vaginal cancer)或陰道癌(vaginal carcinoma)、間皮瘤；板上皮癌、腺癌、原位癌、惡性黑色素瘤及肉瘤；甲狀腺癌，諸如例如乳頭狀、濾泡性及甲狀腺髓質癌，以及退行性癌；皮膚之眼瞼鱗狀細胞癌、表皮樣癌及板上皮癌；胸腺瘤、尿道癌症、子宮頸癌、腺樣囊性癌症(AdCC)、腎上腺皮質癌及外陰癌。更佳地，癌症具有功能性p53及/或p53野生型狀態。功能性p53意謂p53能夠結合至目標基因之DNA及激活目標基因之轉錄。
在本發明之一或多個較佳實施例中，抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物係選自由以下組成之群：KRAS(G12C)抑制劑或降解劑、KRAS(G12D)抑制劑或降解劑、GDP-KRAS抑制劑或降解劑及HER2抑制劑或降解劑。
在本發明之一或多個較佳實施例中，抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物可為抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物，其中抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物在信號轉導通路中充當位於HER2蛋白或HER2蛋白之突變體下游的KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體的間接抑制劑。
熟習此項技術者應理解，視化合物類型而定，KRAS依賴性癌症將變化。
在本發明之一或多個較佳實施例中，KRAS(G12C)抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：索托拉西布(AMG510)、阿達格拉西布(adagrasib) (MRTX849)、G12C-cpd#1、G12C-cpd#2、G12C-cpd#3、G12C-cpd#4、G12C-cpd#5、G12C-cpd#6、G12C-cpd#7、G12C-cpd#8、G12C-cpd#9、G12C-cpd#10及G12C-cpd#11。
在本發明之一或多個較佳實施例中，KRAS(G12D)抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：MRTX1133、G12D-cpd#2、G12D-cpd#3、G12D-cpd#4、G12D-cpd#5、G12D-cpd#6、G12D-cpd#7、G12D-cpd#8及G12D-cpd#9。
在本發明之一或多個較佳實施例中，GDP-KRAS抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：GDP-cpd#1、GDP-cpd#2、GDP-cpd#3、GDP-cpd#4、GDP-cpd#5、GDP-cpd#6、GDP-cpd#7、GDP-cpd#8、GDP-cpd#9、GDP-cpd#10、GDP-cpd#11、GDP-cpd#12、GDP-cpd#13、GDP-cpd#14。
在本發明之一或多個較佳實施例中，HER2抑制劑或降解劑為根據式(F)之化合物(參見下文)，更佳地，HER2抑制劑或降解劑為化合物HER2-cpd#1。
在本發明之一或多個較佳實施例中，抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物為MDM2i-cpd#1。
較佳地，化合物為選自表1中所展示之化合物的化合物。 表 1
化合物類型 化合物編號 / 實例 結構
G12C
G12C-cpd#1 Ic-4 (式A之化合物) 關於合成參見WO2021245051 (Ic-4)， 關於結果參見圖4至圖6
G12C-cpd#2 Id-2 (式A之化合物) 關於合成參見 WO2021245051 (Id-2)， 關於結果參見圖4至圖6
G12C-cpd#3 Ia-1 (式B之化合物) 關於合成參見 實例3以及WO2023099612 (Ia-1) 關於結果參見圖4至圖6
G12C-cpd#4 Ia-4 (式B之化合物) 關於合成參見 實例3以及WO2023099612 (Ia-4) 關於結果參見圖4至圖6
G12C-cpd#5 Ib-3 (式B之化合物) 關於合成參見 實例3以及WO2023099612 (Ib-3) 關於結果參見圖4至圖6
G12C-cpd#6 Ib-5 (式B之化合物) 關於合成參見 實例3以及WO2023099612 (Ib-5) 關於結果參見圖4至圖6
G12C-cpd#7 Ib-6 (式B之化合物) 關於合成參見 實例3以及WO2023099612 (Ib-6) 關於結果參見圖4至圖6
G12C-cpd#8 Ib-1 (式A之化合物) 關於合成參見 WO2021245051 (Ib-1) 關於結果參見圖4至圖6
G12C-cpd#9 Ib-4 (式A之化合物) 關於合成參見 WO2021245051 (Ib-4) 關於結果參見圖4至圖6
G12C-cpd#10 Id-1 (式A之化合物) 關於合成參見 WO2021245051 (Id-1) 關於結果參見圖4至圖6
G12C-cpd#11 Ia-2 (式A之化合物) 關於合成參見 實例3以及WO2023099612 (Ia-2) 關於結果參見圖4至圖6
G12D及 KRAS Protac
G12D-cpd#1  MRTX1133 參見Wang等人 ， 2022
G12D-cpd#2 I-049 (式C之化合物) 關於合成參見 實例4以及WO2023099624 (I-049) 關於結果參見圖7至圖9
G12D-cpd#3 I-45 (式C之化合物) 關於合成參見 實例4以及WO2023099624 (I-45) 關於結果參見圖7至圖9
G12D-cpd#4 II-149 (式C之化合物) 關於合成參見 實例4以及WO2023099624 (II-149) 關於結果參見圖7至圖9
GDP- Protac-cpd#5 I-27 (式D之化合物) 關於合成參見 實例5以及WO2023099620 (I-27) 關於結果參見圖7至圖9
G12D-cpd#6 II-9 (式E之化合物) 關於合成參見 實例6以及WO2023099608 (II-9) 關於結果參見圖7至圖9
G12D-cpd#7 II-184 (式C之化合物) 關於合成參見 實例4以及WO2023099624 (II-184) 關於結果參見圖7至圖9
G12D-cpd#8 II-187 (式C之化合物) 關於合成參見 實例4以及WO2023099624 (II-187) 關於結果參見圖7至圖9
G12D-cpd#9 II-165 (式C之化合物) 關於合成參見 實例4以及WO2023099624 (II-165) 關於結果參見圖7至圖9
GDP-K-Ras
GDP-cpd#1 I-34 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (I-34) 關於結果參見圖13
GDP-cpd#2 I-58 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (I-58) 關於結果參見圖13
GDP-cpd#3 II-20 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-20) 關於結果參見圖13
GDP-cpd#4 II-21 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-21) 關於結果參見圖13
GDP-cpd#5 II-86 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-86)
GDP-cpd#6 II-110 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-110)
GDP-cpd#7 II-111 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-111)
GDP-cpd#8 II-182 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-182) 關於結果參見圖13
GDP-cpd#9 II-189 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-189) 關於結果參見圖13
GDP-cpd#10 II-191 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-191) 關於結果參見圖13
GDP-cpd#11 II-192 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-192) 關於結果參見圖13
GDP-cpd#12 II-194 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-194) 關於結果參見圖13
GDP-cpd#13 II-201 (式C之化合物) 關於合成參見實例4以及WO2023099624 (II-201) 關於結果參見圖13
GDP-cpd#14 II-94 (式C之化合物) 關於合成參見WO2023099624 (II-94) 關於結果參見圖13
Her-2
Her2-cpd#1 I-01 (式F之化合物) 關於合成參見 WO2021213800 (I-01) 關於結果參見圖10
MDM2i
MDM2i-cpd#1 Ia-34 關於合成參見 WO2017060431 (Ia-34) 關於結果參見圖17
有時判斷抗癌藥物對可預測患者之臨床益處(諸如腫瘤消退)之「生物標記」或替代標記的影響。當監測患者對抗癌藥物之反應時，「生物標記」可為明確表明所投與化合物及所選劑量及治療方案能夠且達到之水平足以有效抑制經靶向癌症之基礎。在分子靶向療法之評估中，已證實難以應用傳統臨床終點；已發現用於細胞毒性化合物之標準臨床試驗終點不足以用來評估分子靶向之抗癌劑。對於其發展，重要的是可對化合物調節其分子目標之活性的功效及目標調節與臨床反應之間的關係進行終點評定。因此，間接指示治療對疾病狀態之影響的生物標記之可用性為用於開發微侵入性或非侵入性技術以評定抑制劑之療效(且因此對藥物進行臨床評估且歸根到底，監測經批准藥物之療法功效)的關鍵先決條件之一。
「生物標記」可定義為可量測特徵或特性，其為正常生理過程、致病過程之指標或對暴露或治療性干預之反應的指標。分子、組織學、放射線或生理生物標記藉由該可量測特徵之性質而表示不同類型之生物標記(Aboy等人，2019)。FDA及NIH將生物標記進一步歸類為預後、預測、反應性、監測、安全性、診斷及易感性/風險生物標記(BEST Resource)。根據該歸類，藥效學/反應生物標記為用於展示生物反應已出現在已暴露於醫療產品或環境試劑之個體中的生物標記(BEST Resource)。
藥效學/反應生物標記為其水平回應於暴露於醫療產品或環境試劑而改變的生物標記。藥效學/反應生物標記(諸如循環小分子或蛋白質)或生理量測之改變提供早期證據表明治療可能對感興趣之臨床終點有影響或可用於評定與安全性問題相關之藥理學終點。其亦可為患者管理提供有用資訊，例如是否繼續治療或調整劑量，或為醫療產品開發提供有用資訊，例如藥物是否具有被認為與臨床效果相關之藥效學效果。由於其評定之連續性質，藥效學/反應生物標記亦可屬於監測生物標記之種類。藥效學/反應生物標記在早期藥物研發試驗之環境中極為重要，且可用於量測對干預之反應水平且指導臨床劑量反應研究。藥效學/反應生物標記在臨床實踐中之主要效用係指導藥物之給藥或持續使用，或其他干預。此類生物標記可用於量測反應水平以使得可改變個別藥物劑量，或用於識別是否需要添加、減少或替換療法。在此等情況下，藥效學/反應生物標記可提供目標接合之證據。另外，此等生物標記可用於藥理學劑量範圍研究中以判定在評估臨床結果之試驗中應考慮哪些劑量(BEST Resource)。
如本申請案之實驗實例中所展示，本案發明人已發現，存活素係用於評定KRAS依賴性癌細胞及癌症類型中之KRAS抑制劑或降解劑之抑制活性的合適且可靠之生物標記，較佳為藥效學/反應生物標記。對HER2及/或KRAS依賴性癌細胞及癌症類型中之HER2抑制劑或降解劑同樣適用；本發明人已發現，存活素係用於評定HER2抑制劑之抑制活性的合適且可靠之生物標記。類似地，如實例9.5及圖17中所展示，用MDM2i-cpd#1成功治療後，存活素亦下調，且因此，存活素可方便地用作患者血液樣本中之循環生物標記以監測腫瘤治療期間之治療效果，藉此減少與侵入性腫瘤活組織切片檢查(biopsy)或繁瑣成像方法相關聯之患者的負擔。
在本發明之一或多個較佳實施例中，抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物可為抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物，其中抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物在信號轉導通路中充當位於HER2蛋白或HER2蛋白之突變體下游的KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體的間接抑制劑。因此，如本文中所使用之術語「抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物」涵蓋抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物。
本發明進一步係關於一種用於選擇患有癌症之患者以用KRAS抑制劑或降解劑治療的方法，該方法包含至少以下步驟： -測定在向患者投與KRAS抑制劑或降解劑之前來自該患者之樣本中的存活素水平，及 -判定來自該患者之至少一個第二樣本中之存活素水平降低。
類似地，本發明進一步係關於一種用於選擇患有癌症之患者以用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療的方法，該方法包含至少以下步驟： -測定在向患者投與該化合物之前來自該患者之樣本中的存活素水平，及 -判定來自該患者之至少一個第二樣本中之存活素水平降低。
本發明進一步係關於如上文所描述之用於選擇患者之方法，其中分別判定在向患者投與KRAS抑制劑或降解劑之後、或在投與抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物之後自患者獲得之若干樣本中，較佳所有樣本中之存活素水平降低。
本發明進一步係關於如上文所描述之用於選擇患者之方法，其進一步包含選擇該患者以分別用KRAS抑制劑或降解劑、或用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物繼續治療的步驟。
本發明進一步係關於一種用於選擇癌症患者以用充當KRAS抑制劑或降解劑之化合物治療的方法，該方法係藉由活體外測定來自該癌症患者之至少第一樣本及至少第二樣本中之存活素水平來進行，其中該至少第一樣本係在用充當KRAS抑制劑或降解劑之化合物治療該癌症患者之前收集的，且該至少第二樣本係在用充當KRAS抑制劑或降解劑之化合物治療該癌症患者之後收集的，其中已將在用充當KRAS抑制劑或降解劑之化合物治療該癌症患者之後自該癌症患者收集之第二或一或多個其他樣本中的存活素水平判定為分別相較於第一樣本或相較於一或多個其他樣本中之倒數第二樣本降低。
本發明進一步係關於一種選擇癌症患者以用抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物治療的方法，該方法係藉由離體測定來自該癌症患者之至少第一樣本及至少第二樣本中的存活素水平來進行，其中該至少第一樣本係在用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療該癌症患者之前收集的，且該至少第二樣本係在用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療該癌症患者之後收集的，其中已將在用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療該癌症患者之後自該癌症患者收集之第二或一或多個其他樣本中的存活素水平判定為分別相較於第一樣本或相較於一或多個其他樣本中之倒數第二樣本降低。
本發明進一步係關於一種用於預測癌症患者對KRAS抑制劑或降解劑之反應性的方法，該方法包含至少以下步驟： -提供來自患者之第一樣本， -隨後測定來自患者之該第一樣本中之存活素水平 -向患者投與KRAS抑制劑或降解劑，及 -當已將在投與該KRAS抑制劑或降解劑之後由該患者提供之第二或一或多個其他樣本中之存活素水平判定為分別相較於第一樣本或相較於一或多個其他樣本中之倒數第二樣本降低時，將該患者識別為對用該KRAS抑制劑或降解劑治療有反應。
本發明進一步係關於一種用於預測癌症患者對抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物之反應性的方法，該方法包含至少以下步驟： -提供來自患者之第一樣本， -隨後測定來自患者之該第一樣本中之存活素水平 -向患者投與抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物，及 -當已將在投與抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物之後由該患者提供之第二或一或多個其他樣本中之存活素水平判定為分別相較於第一樣本或相較於一或多個其他樣本中之倒數第二樣本降低時，將該患者識別為對用抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物之該治療有反應。
本發明進一步係關於一種判定抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物在治療癌症是否有效，及/或監測癌症患者對該治療之反應的方法，該方法包含至少以下步驟： -提供來自患者之第一樣本， -量測來自患者之該第一樣本中之存活素水平， -向患者投與抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物， -提供來自患者之第二樣本， -量測該第二樣本中之存活素水平， -比較在第一樣本及第二樣本中量測到之存活素水平，及 -視情況重複第四至第六步驟， 其中第二樣本中之存活素水平降低指示有效反應。
本發明進一步係關於一種判定抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物在治療癌症是否有效，及/或監測癌症患者對該治療之反應的方法，該方法包含至少以下步驟： -提供來自患者之第一樣本， -量測來自患者之該第一樣本中之存活素水平， -向患者投與抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物， -提供來自患者之第二樣本， -量測該第二樣本中之存活素水平， -比較在第一樣本及第二樣本中量測到之存活素水平，及 -視情況重複第四至第六步驟， 其中第二樣本中之存活素水平降低指示有效反應。
在如上文所描述之方法中之任一者的較佳實施例中，該(該等)樣本為血液、血漿或血清樣本。
在如上文所描述之方法中之任一者的較佳實施例中，抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物係選自由以下組成之群：KRAS(G12C)抑制劑或降解劑、KRAS(G12D)抑制劑或降解劑、GDP-KRAS抑制劑或降解劑及HER2抑制劑或降解劑。
在如上文所描述之方法中之任一者的其他較佳實施例中，KRAS(G12C)抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：索托拉西布(AMG510)、阿達格拉西布(MRTX849)、G12C-cpd#1、G12C-cpd#2、G12C-cpd#3、G12C-cpd#4、G12C-cpd#5、G12C-cpd#6、G12C-cpd#7、G12C-cpd#8、G12C-cpd#9、G12C-cpd#10及G12C-cpd#11。
在如上文所描述之方法中之任一者的其他較佳實施例中，KRAS(G12D)抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：MRTX1133、G12D-cpd#2、G12D-cpd#3、G12D-cpd#4、G12D-cpd#5、G12D-cpd#6、G12D-cpd#7、G12D-cpd#8及G12D-cpd#9。
在如上文所描述之方法中之任一者的其他較佳實施例中，GDP-KRAS抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：GDP-cpd#1、GDP-cpd#2、GDP-cpd#3、GDP-cpd#4、GDP-cpd#5、GDP-cpd#6、GDP-cpd#7、GDP-cpd#8、GDP-cpd#9、GDP-cpd#10、GDP-cpd#11、GDP-cpd#12、GDP-cpd#13及GDP-cpd#14。
在如上文所描述之方法中之任一者的其他較佳實施例中，HER2抑制劑或降解劑為根據式(F)之化合物(參見下文)，更佳地，HER2抑制劑或降解劑為化合物HER2-cpd#1。
在本發明之一或多個較佳實施例中，抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物可為抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物，其中抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物在信號轉導通路中充當位於HER2蛋白或HER2蛋白之突變體下游的KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體的間接抑制劑。
在如上文所描述之方法中之任一者的較佳實施例中，抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物為化合物MDM2i-cpd#1。
在如上文所描述之方法中之任一者的其他較佳實施例中，該存活素包含於胞泌體中。
在如上文所描述之方法中之任一者的其他較佳實施例中，該癌症為KRAS依賴性癌症，較佳為選自由以下組成之群的KRAS依賴性癌症：胰管腺癌(PDAC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及結腸直腸癌(CRC)。
在上文所描述之方法中之任一者的另一較佳實施例中，待用抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物治療的癌症係選自在上文定義為用此MDM2抑制劑治療之較佳癌症類型的癌症中之任一者。
在如上文所描述之方法中之任一者的其他較佳實施例中，測定存活素水平包含較佳選自由以下組成之群的存活素特異性分析：西方墨點法、ELISA、RIA、MSD® S-PLEX技術及FACS，更佳地，其中該分析為ELISA或MSD® S-PLEX技術。
根據第二態樣，本發明係關於一種抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物，其用於治療癌症患者， i)其中KRAS抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：KRAS(G12C)抑制劑或降解劑、KRAS(G12D)抑制劑或降解劑、GDP-KRAS抑制劑或降解劑及HER2抑制劑或降解劑；且 ii)其中已根據上文所描述之方法中之任一者判定該患者對用該化合物之該治療有反應。
根據本發明之此第二態樣，本發明亦係關於一種抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物，其用於治療癌症患者， i)其中抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物為MDM2i-cpd#1；且 ii)其中已根據本發明之判定癌症患者對用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療之反應性的方法判定該患者對用該化合物之該治療有反應。
在本發明之一或多個較佳實施例中，抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物可為抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物，其中抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物在信號轉導通路中充當位於HER2蛋白或HER2蛋白之突變體下游的KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體的間接抑制劑。
本發明進一步係關於一種KRAS抑制劑或降解劑，其用於治療展現分子生物標記存活素之患者的KRAS依賴性癌症的方法中。本發明進一步係關於一種抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物，其用於治療展現分子生物標記存活素之患者的癌症之方法中。
本發明進一步係關於一種KRAS抑制劑或降解劑，其用於治療患者之KRAS依賴性癌症的方法中，其中已判定該患者展現分子生物標記存活素。本發明進一步係關於一種抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物，其用於治療患者之癌症的方法中，其中已判定該患者展現分子生物標記存活素。
本發明進一步係關於一種KRAS抑制劑或降解劑，其用於治療患者之K-ras依賴性癌症的方法中，該方法包含判定該患者展現分子生物標記存活素。本發明進一步係關於一種抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物，其用於治療患者之癌症的方法中，該方法包含判定該患者展現分子生物標記存活素。
本發明進一步係關於一種KRAS抑制劑或降解劑，其用於治療患者之KRAS依賴性癌症的方法中，該方法包含： -量測自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， -將在治療期間自該患者獲得之至少第二樣本中的存活素水平與第一樣本中之存活素水平進行比較，及 -判定第二樣本中之存活素水平相較於第一樣本中之存活素水平降低，或在第二樣本之後在治療期間自該患者獲得之任何另一樣本中之存活素水平相較於在治療期間自該患者獲得之倒數第二樣本中的存活素水平降低。
本發明進一步係關於一種抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物，其用於治療患者之癌症的方法中，該方法包含： -量測自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， 將在治療期間自該患者獲得之至少第二樣本中的存活素水平與第一樣本中之存活素水平進行比較，及 -判定第二樣本中之存活素水平相較於第一樣本中之存活素水平降低，或在第二樣本之後在治療期間自該患者獲得之任何另一樣本中之存活素水平相較於在治療期間自該患者獲得之倒數第二樣本中的存活素水平降低。
本發明進一步係關於如上文所描述使用之該KRAS抑制劑或降解劑，其中該化合物選自由以下組成之群：KRAS(G12C)抑制劑或降解劑、KRAS(G12D)抑制劑或降解劑、GDP-KRAS抑制劑或降解劑及HER2抑制劑及降解劑。本發明進一步係關於如上文所描述使用之該KRAS抑制劑或降解劑，其中該化合物為MDM2i-cpd#1。
本發明進一步係關於如上文所描述使用之該KRAS抑制劑或降解劑或抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物，其中存活素包含於胞泌體中。
本發明進一步係關於如上文所描述使用之該KRAS抑制劑或降解劑或抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物，其中該(該等)樣本為血液、血漿或血清樣本。
本發明進一步係關於如上文所描述使用之該K-Ras抑制劑或降解劑，其中KRAS依賴性癌症係選自由以下組成之群：胰管腺癌(PDAC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及結腸直腸癌(CRC)。本發明進一步係關於如上文所描述使用之抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物，其中該癌症係選自在上文定義為用此MDM2抑制劑治療之較佳癌症類型的癌症中之任一者。
本發明進一步係關於如上文所描述使用之該K-Ras抑制劑或降解劑或該抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物，其中測定存活素水平包含較佳選自由以下組成之群的存活素特異性分析：西方墨點法、ELISA、RIA、MSD® S-PLEX技術及FACS。
就其最廣義而言，「生物標記」可定義為可量測特徵或特性，其為正常生理過程、致病過程之指標或對暴露或(治療性)干預之反應的指標。分子、組織學、放射線或生理生物標記表示不同類型之生物標記且已在醫學中使用：血壓或葡萄糖水平分別為生理及分子生物標記之簡單實例。
正使用各種方法進一步對生物標記進行分類。舉例而言，FDA及NIH將其歸類為預後、預測、反應性、監測、安全性、診斷及易感性/風險生物標記(BEST Resource 2018)。
在本發明之含義內，生物標記用作生物狀態之指標。其為客觀地量測且評估為正常生物過程、致病過程或對治療性干預之藥理學反應之指標的特性。此符合1998年由NIH研究組給出之定義。
更特定言之，生物標記指示與疾病之風險或進展或疾病對給定治療之易感性相關的變化。一旦所提議生物標記被驗證，其便可用於診斷疾病風險、個體中疾病之存在，或為個體中之疾病定製治療(藥物治療或投與方案之選擇)。在評估潛在藥物療法時，生物標記可用作自然終點(諸如存活率或不可逆發病率)之替代物。若治療改變了與經改進健康直接相關之生物標記，則生物標記充當用於評估臨床益處之替代終點。
如本文中所使用之術語「樣本」係指組織樣本或體液樣本，諸如血液樣本。較佳地，該樣本為血液、血漿或血清樣本。
組織樣本係身體之器官或組織之部分，其典型地包括若干細胞類型，視情況具有使細胞保持在一起之細胞骨架結構。組織樣本可藉由活組織切片檢查，例如包括藉由切割、切片或打孔來獲得。此涉及提取樣本細胞或組織以供檢查。然而，術語「提供樣本」、「來自患者之樣本」或「自患者獲得之樣本」並不包括提取組織或血液之主動步驟，而實際上係指提供已提取之樣本，亦即，提供來自患者之離體樣本。如本文中所使用之術語「自患者獲得之樣本」係指離體(亦即，收集之後)的樣本，且與「提供來自患者之樣本」或「提供來自患者之離體樣本」同義。
此外，組織樣本可為腫瘤樣本或各別對照樣本，較佳來自同一組織。血液樣本可為血清或血漿樣本且較佳為血漿樣本。然而，血液樣本亦可包括細胞部分，例如用於全血球計數及血球檢查，諸如周邊血抹片。除血液以外的其他體液樣本包括但不限於黏液、精液、唾液、痰、支氣管灌洗物、母乳、膽汁及尿液。樣本可進一步為骨髓活組織切片檢查或抽出物或腦脊髓液。
樣本可使用此項技術中已知之任何方法進行分析，包括例如但不限於：藉由細胞化學，諸如與在不同種類細胞中或不同種類細胞上發現之某些物質反應的化學染色(染料)、流式細胞分析技術及免疫組織化學(IHC)，諸如藉由使用抗體染色、螢光原位雜交(FISH)、聚合酶連鎖反應(PCR)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、MSD® S-PLEX技術或西方墨點法。較佳地，分析係藉由ELISA或MSD® S-PLEX技術來進行。
在上文所描述之方法中之任一者中，第二(或第n+1)樣本中之生物標記存活素水平相較於第一樣本(或第n)中之水平降低至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多，或100%。
存活素特異性分析可基於抗體，特定言之單株抗體，尤其係當該存活素特異性分析為包含西方墨點法、點漬墨法(Dot Blot)、ELISA (酶聯免疫吸附測定)、RIA (放射免疫測定)、RIST (放射免疫吸附測定)、MSD® S-PLEX技術或FACS (螢光活化細胞分選器)之分析時。西方墨點法、點漬墨法、ELISA、RIA、RIST、MSD® S-PLEX技術及FACS之一般原理為熟習此項技術者所已知的(Coligan，2011)。
已描述針對存活素之抗體及單株抗體(Fenstermaker等人，2018；Watanuki-Miyauchi等人，2005；Arora等人，2012)。
存活素特異性分析為先前技術中已知的(Naumunik等人，2009；Derin等人，2008)。
如本文中所使用，術語「抗體」係指由一或多個多肽鏈組成之蛋白質，該一或多個多肽鏈由原生或重組免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因之片段或自其衍生之cDNA編碼。該等免疫球蛋白基因包括輕鏈κ、λ及重鏈α、δ、ε、γ及μ恆定區基因，以及許多不同可變區基因中之任一者。
基本免疫球蛋白(抗體)結構單元通常為四聚體，其由兩對相同的多肽鏈—輕鏈(L，分子量約為25 kDa)及重鏈(H，分子量約為50-70 kDa)構成。各重鏈由重鏈可變區(縮寫為VH或V H)及重鏈恆定區(縮寫為CH或C H)構成。重鏈恆定區由三個域構成，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈含有輕鏈可變區(縮寫為VL或V L)及輕鏈恆定區(縮寫為CL或C L)。VH及VL區可進一步再分成高變區，其亦稱作互補決定區(CDR)，穿插有稱作構架區(FR)之更保守區。各VH及VL區由自胺基端至羧基端按以下次序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區形成與抗原相互作用之結合域。
CDR對於抗體或其抗原結合部分之結合最為重要。FR可被其他序列替換，其限制條件為保留抗原結合所需之三維結構。構築體之結構變化最通常導致失去與抗原之充分結合。
(單株)抗體、其抗原結合片段或衍生物及抗原結合抗體樣蛋白之術語「抗原結合」係指保留以其原生形式特異性結合至抗原的能力之抗體之一或多個部分或片段。抗體之抗原結合部分的實例包括：Fab片段—由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab') 2片段—包含在鉸鏈區處由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體之單臂的VL及VH域組成之Fv片段；及由VH域及分離之互補決定區(CDR)組成之dAb片段。
如本文中所使用，術語「單株抗體(mAb)」應指具有同質抗體群體(亦即由整個免疫球蛋白組成之同質群體)之抗體組合物或其片段或衍生物。此抗體可選自由以下組成之群：IgG、IgD、IgE、IgA及/或IgM，或其片段或衍生物。尤佳地，該抗體為IgG。
如本文中所使用，術語抗體「片段」應指保留目標結合能力之此抗體之片段，例如CDR (互補決定區)、高變區、可變域(Fv)、IgG重鏈(由VH、CH1、鉸鏈、CH2及CH3區組成)、IgG輕鏈(由VL及CL區組成)及/或Fab及/或F(ab) 2。
如本文中所使用，術語抗體「衍生物」應指結構上不同於共同抗體概念但亦與其具有一些結構關係的蛋白質構築體，例如scFv、Fab及/或F(ab) 2，以及雙特異性、三特異性或更高特異性抗體構築體。
如本文中所使用之術語「KRAS依賴性癌症」係指癌症、癌細胞或癌症組織，其中該癌症、癌細胞或癌症組織包含：(i) K-ras致癌基因中之一或多個突變，其單獨或與一或多個共突變一起可影響KRAS蛋白之功能及腫瘤之出現及發展，及/或其中該癌症、癌細胞或癌症組織形成係由 K-ras致癌基因中之該一或多個突變引起；或(ii)野生型(WT) K-Ras原致癌基因之擴增。K-ras突變被視為人類癌症中最常見的致癌基因驅動因子。K-ras突變之概況在不同癌症類型當中可明顯不同。K-ras突變由單鹼基誤義突變主導，其中98%在密碼子12 (G12)、密碼子13 (G13)或密碼子61 (Q61)處被發現。已展示由突變引起之KRAS蛋白中之改變阻礙了KRAS與GAP之相互作用及結合至KRAS之GTP的水解，從而使KRAS處於組成性活性狀態(Huang等人，2021)。
如本文中所使用，術語「KRAS突變體」係指分別在K-ras基因中及在KRAS蛋白之任何胺基酸位置處包含任何種類之突變的K-ras基因或KRAS蛋白。特定言之，K-Ras突變體為在K-ras基因中之密碼子12 (G12)、密碼子13 (G13)或密碼子61 (Q61)處包含突變之KRAS蛋白。此外，特定言之，K-Ras突變體為KRAS(G12C)蛋白。
已在如上文所描述之諸如胃癌、胃食管結合部癌及食道癌之腫瘤適應症之子集中觀測到野生型(WT) KRAS原致癌基因之顯著擴增。
如本文中所使用，術語「KRAS抑制劑」或「K-Ras抑制劑」係指能夠抑制K-Ras活性之任何化合物、試劑、小分子、肽、多肽或蛋白質，包括KRAS蛋白之降解劑。根據本發明之KRAS抑制劑較佳為抑制KRAS野生型(較佳擴增的)之化合物。抑制在殘基12處突變之KRAS，諸如KRAS G12C、KRAS G12D、KRAS G12V、KRAS G12A及KRAS G12R，較佳抑制KRAS G12C及/或KRAS G12D，以及抑制在殘基13處突變之KRAS (諸如KRAS G13D，或在殘基61處突變之KRAS，諸如KRAS Q61H)的化合物。
該抑制可為直接地或間接地，競爭性地或異位地。
間接抑制劑包括但不限於藉由干擾KRAS傳訊通路上游之傳訊分子，諸如例如EGFR家族(包括EGFR (亦稱為ERBB1或HER1)、ERBB2/HER2、ERBB3/HER3及ERBB4/HER4)之受體酪胺酸激酶來抑制K-Ras活性之化合物。較佳地，間接KRAS抑制劑為HER2抑制劑。
在本發明之一或多個較佳實施例中，抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物可為抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物，其中抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物在信號轉導通路中充當位於HER2蛋白或HER2蛋白之突變體下游的KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體的間接抑制劑。
ERBB跨膜受體酪胺酸激酶(RTK)家族由在發展期間實現基本功能的四個成員組成：EGFR (ERBB1)、HER2 (Neu，ERBB2)、HER3 (ERBB3)及HER4 (ERBB4) (Citri等人，2006；Wang, Z，2017)。在EGFR、HER3或HER4之胞外域結合至其各別配位體及ERBB家族成員之後續同源二聚或異源二聚後，開始ERBB傳訊。未識別到有配位體之HER2為其他ERBB成員之較佳二聚伴侶。一旦形成活性配位體-受體複合物，EGFR、HER2、HER3或HER4之胞內酪胺酸激酶域便藉由自磷酸化或轉磷酸化而活化，且隨後引發信號轉導級聯，最顯著的是接合促分裂原活化蛋白(MAP)激酶及/或磷酸肌醇3-激酶(PI3K)通路(Citri等人，2006；Wang, Z，2017)，其中，涉及K-Ras，如上文所描述。
在癌症中，ERBB傳訊經由突變過度活化，該等突變藉由促進二聚或將平衡朝向激酶之活性構形異構物轉移及/或經由擴增及後續的RTK之過度表現來使RTK呈現組成性活性。兩種致癌機制均增加ERBB傳訊之淨輸出且藉此促進細胞存活、細胞生長及增殖。
在廣泛多種人類惡性腫瘤中觀測到異常HER2傳訊。描述蛋白質之胞外、(近)膜及胞內區之致癌突變。總體而言，此等突變使HER2呈現組成性活性，從而推動癌症起始、腫瘤維持及生長。類似地，HER2過度表現會增加HER2傳訊，且成為包括乳癌、胃癌或肺癌之各種適應症的腫瘤轉化及腫瘤維持之基礎。
因此，對HER2致癌傳訊之干擾引起對腫瘤生長之抑制。靶向療法包括HER2定向抗體(例如，曲妥珠單抗及帕妥珠單抗)、HER2定向抗體-藥物共軛物(曲妥珠單抗-DM1 (T-DM1，曲妥珠單抗-美坦新偶聯物))及抑制HER2激酶域之小分子(阿法替尼(afatinib)、來那替尼(neratinib)、拉帕替尼(lapatinib))。
由HER2致癌突變或HER2野生型過度表現(例如歸因於基因擴增)驅動之腫瘤可受益於HER2特異性酪胺酸激酶抑制劑(TKI)。總體而言，HER2改變會影響至多6-7%之所有人類癌症，且EGFR野生型保留TKI (酪胺酸激酶抑制劑)可作為有效治療選項出現。
HER2外顯子20突變構成引起增強之激酶活性的HER2功能獲得型突變之子集。此增強之HER2激酶活性饋入至經由促進突變細胞之生長、增殖及存活來刺激腫瘤轉化的下游傳訊級聯中。已研發出HER2外顯子20之選擇性抑制劑，且與先前技術化合物相比，除對EGFR野生型具有高選擇性之外，該等選擇性抑制劑亦展示改良之野生型EGFR保留功效概況。此外，一些此類化合物已展示改良之藥物動力學及藥理學概況，諸如良好代謝穩定性(WO2021/213800)。
KRAS抑制劑包括但不限於此項技術中已知之化合物，諸如例如索托拉西布(AMG510)及阿達格拉西布(MRTX849)，以及本文中詳述之化合物。
KRAS抑制劑較佳包括環狀2-胺基-3-氰基噻吩及 式 (A)之衍生物： 其中R 1a、R 1b、R 2a、R 2b、Z、R 3至R 5、A、p、U、V、W、L及E具有以下含義： [A0] R 1a 及 R 1b 均獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； R 2a 及 R 2b 均獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； 及/或視情況， R 1a 或 R 1b 中之一者及 R 2a 或 R 2b 中之一者與其所連接之碳原子一起形成環丙烷環； [B0] Z為-(CR 6aR 6b) n-； 各 R 6a 及 R 6b 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； n係選自由0、1及2組成之群； [C0] R 3 係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6鹵烷氧基、氰基-C 1-6烷基、鹵素、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-CN、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； [D0]環 A為選自由以下組成之群的環：吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、㗁唑、異㗁唑、噻唑、異噻唑及三唑； [E0]若存在，則各 R 4 獨立地選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6鹵烷氧基、氰基-C 1-6烷基、鹵素、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-CN、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； p係選自由0、1、2及3組成之群； [F0] U係選自由氮(=N-)及經 R A 取代之碳(=C(R A)-)組成之群； V係選自由氮(=N-)及經 R B 取代之碳(=C(R B)-)組成之群； W係選自由氮(=N-)及經 R C 取代之碳(=C(R C)-)組成之群； R A 、 R B 及 R C 各自獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6鹵烷基、視情況經C 3-5環烷基取代之C 2-6炔基、C 1-6烷氧基、C 1-6鹵烷氧基、鹵素、-CN、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-C(=O)NH 2、-C(=O)NH(C 1-4烷基)、-C(=O)N(C 1-4烷基) 2、-S-C 1-6烷基、-S(=O) 2-C 1-6烷基、C 3-5環烷基、3至5員雜環基及視情況經選自由以下組成之群的取代基取代的C 1-6烷基：C 1-6烷氧基、-CN、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-C(=O)NH 2、-C(=O)NH(C 1-4烷基)及-C(=O)N(C 1-4烷基) 2； [G0] R 5 係選自由 R a1 及 R b1 組成之群； R a1係選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-10環烷基、C 4-10環烯基、3-11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-10環烷基、C 4-10環烯基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況經一或多個相同或不同的 R b1 及/或 R c1 取代； 各 R b1 獨立地選自由以下組成之群：-OR c1、-NR c1R c1、鹵素、-CN、-C(=O)R c1、-C(=O)OR c1、-C(=O)NR c1R c1、-S(=O) 2R c1、-S(=O) 2NR c1R c1、-NHC(=O)R c1、-N(C 1-4烷基)C(=O)R c1、-NHS(=O) 2R c1、-N(C 1-4烷基)S(=O) 2R c1、-NHC(=O)OR c1、-N(C 1-4烷基)C(=O)OR c1及二價取代基=O； 各 R c1 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-10環烷基、C 4-10環烯基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-10環烷基、C 4-10環烯基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況經一或多個相同或不同的 R d1 及/或 R e1 取代； 各 R d1 獨立地選自由以下各者組成之群：-OR e1、-NR e1R e1、鹵素、-CN、-C(=O)R e1、-C(=O)OR e1、-C(=O)NR e1R e1、-S(=O) 2R e1、-S(=O) 2NR e1R e1、-NHC(=O)R e1、-N(C 1-4烷基)C(=O)R e1、-NHS(=O) 2R c1、-N(C 1-4烷基)S(=O) 2R c1、-NHC(=O)OR e1、-N(C 1-4烷基)C(=O)OR e1及二價取代基=O； 各 R e1 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-10環烷基、C 4-10環烯基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-10環烷基、C 4-10環烯基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代：C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、視情況經一或多個相同或不同的C 1-4烷基取代之3至11員雜環基、C 6-10芳基、5至10員雜芳基、-OH、C 1-6烷氧基、C 1-4烷氧基-C 1-4烷基、羥基-C 1-4烷基、鹵素、-CN、-NH 2、-C(=O)C 1-4烷基、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2及二價取代基=O； [H0] L為 -L 1-L 2-L 3- ，其中 L 1 連接至 E； L 1 係選自由以下組成之群：一鍵、-NH-、-N(C 1-4烷基)-、-O-、-C(=O)-、-NH-C(=O)-、-N(C 1-4烷基)-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-C(=O)-N(C 1-4烷基)-、-C(=O)-、C 1-6伸烷基、C 3-7伸環烷基、伸苯基、4至12員伸雜環基及5至10員伸雜芳基； L 2 係選自由以下組成之群：C 1-6伸烷基、C 3-7伸環烷基、伸苯基、4至12員伸雜環基及5至10員伸雜芳基； L 3 係選自由以下組成之群：一鍵、-NH-、-N(C 1-4烷基)-、-O-、-C(=O)-、-NH-C(=O)-、-N(C 1-4烷基)-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-C(=O)-N(C 1-4烷基)-、-C(=O)-、C 1-6伸烷基、C 3-7伸環烷基、伸苯基、4至12員伸雜環基及5至10員伸雜芳基； 其中 L 1 、 L 2 及 L 3 中之各C 1-6伸烷基、C 3-7伸環烷基、伸苯基、4至12員伸雜環基及5至10員伸雜芳基視情況且獨立地經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代：C 2-6炔基、C 1-6鹵烷基、C 3-7環烷基、苯基、5至6員雜芳基、鹵素、-OH、-CN、C 1-6烷氧基、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-C(=O)OH、-C(=O)-OC 1-6烷基、-C(=O)NH 2、-C(=O)NH(C 1-4烷基)、-C(=O)N(C 1-4烷基) 2、二價取代基=O及視情況經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代之C 1-6烷基：鹵素、-OH、-CN、C 1-4烷氧基、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-C(=O)OH、-C(=O)-OC 1-6烷基、-C(=O)NH 2、-C(=O)NH(C 1-4烷基)及-C(=O)N(C 1-4烷基) 2； [I0] E為 表示雙鍵或參鍵； Q 1 係選自由以下組成之群：一鍵、-CH 2-、-CH(OH)-、-C(=O)-、-C(=O)N(R G1)-、-C(=O)O-、-S(=O) 2-、-S(=O) 2N(R G1)-及-C(=NR H1)-； 各 R G1 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、羥基-C 1-6烷基、H 2N-C 1-6烷基、氰基-C 1-6烷基、(C 1-4烷基)HN-C 1-6烷基、(C 1-4烷基) 2N-C 1-6烷基、C 1-6烷氧基-C 1-6烷基、C 3-7環烷基及3至11員雜環基； 各 R H1 獨立地選自由以下組成之群：氫、-OH、C 1-6烷氧基、-CN及C 1-6烷基； 若 表示雙鍵，則 R D 係選自由以下組成之群：氫、C 3-7環烷基、苯基、鹵素、-CN、C 1-6烷氧基、-C(=O)O-C 1-6烷基、-NHC(=O)-C 1-6烷基及視情況經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代之C 1-6烷基：苯基、3至11員雜環基、C 1-6烷氧基、鹵素、-OH、-NH 2、-NH(C 1-6烷基)、-N(C 1-6烷基) 2、-C(=O)OH、-C(=O)O-C 1-6烷基、-C(=O)NH(C 1-6烷基)、-NHC(=O)-C 1-6烷基、-OC(=O)-C 1-6烷基及苯基-C 1-6烷氧基； R E 及 R F 各自獨立地選自由 R a2 及 R b2 組成之群； R a2 係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況經一或多個相同或不同的 R b2 及/或 R c2 取代； 各 R b2 獨立地選自由以下組成之群：-OR c2、-NR c2R c2、鹵素、-CN、-C(=O)R c2、-C(=O)OR c2、-C(=O)NR c2R c2、-S(=O) 2R c2、-S(=O) 2NR c2R c2、-NHC(=O)R c2、-N(C 1-4烷基)C(=O)R c2、-NHC(=O)OR c2、-N(C 1-4烷基)C(=O)OR c2及二價取代基=O； 各 R c2 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-10環烷基、C 4-10環烯基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-10環烷基、C 4-10環烯基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代：C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、鹵素、-OH、-C(=O)OH、-C(=O)O-C 1-6烷基、-C(=O)C 1-6烷基、-C(=O)NH 2、-C(=O)NH(C 1-6烷基)、-C(=O)N(C 1-6烷基) 2及二價取代基=O； 或 R D 及 R E 與其所連接之碳原子一起形成4至7員不飽和脂環或4至7員不飽和雜環，其中此4至7員不飽和脂環或4至7員不飽和雜環視情況，除 R F 之外，經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代：C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、-OH、C 1-6烷氧基、C 1-4烷氧基-C 1-4烷基、-NH 2、-CN、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、鹵素、-C(=O)O-C 1-6烷基及二價取代基=O； 或 若 Q 1 為-C(=O)N(R G1)-，則-C(=O)N(R G1)-之 R G1 及 R F 一起形成選自由以下組成之群的連接子：-C(=O)-、-CH 2-、-CH 2-C(=O)-、-C(=O)-CH 2-及-C 2H 4-； 若 表示參鍵，則 R D 及 R E 均不存在； R F 為 R a2 ； R a2 係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況經一或多個相同或不同的 R b2 及/或 R c2 取代； 各 R b2 獨立地選自由以下組成之群：-OR c2、-NR c2R c2、鹵素、-CN、-C(=O)R c2、-C(=O)OR c2、-C(=O)NR c2R c2、-S(=O) 2R c2、-S(=O) 2NR c2R c2、-NHC(=O)R c2、-N(C 1-4烷基)C(=O)R c2、-NHC(=O)OR c2、-N(C 1-4烷基)C(=O)OR c2及二價取代基=O； 各 R c2 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基； 或 E為 Q 2 係選自由以下組成之群：一鍵、-CH 2-、-CH(OH)-、-C(=O)-、-C(=O)N(R G2)-、-C(=O)O-、-S(=O) 2-、-S(=O) 2N(R G2)-及-C(=NR H2)-； 各 R G2 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、羥基-C 1-6烷基、H 2N-C 1-6烷基、氰基-C 1-6烷基、(C 1-4烷基)HN-C 1-6烷基、(C 1-4烷基) 2N-C 1-6烷基、C 1-6烷氧基-C 1-6烷基、C 3-7環烷基及3至11員雜環基； 各 R H2 獨立地選自由以下組成之群：氫、-OH、C 1-6烷氧基、-CN及C 1-6烷基； R I 係選自由氫及鹵素組成之群； R J 為氫；或 R I 及 R J 與其所連接之碳原子一起形成環丙烷或環氧乙烷環； R K 係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、-CN及鹵素； R L 係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、-CN、鹵素及-C(=O)-C 1-6烷基； 或 E為 Q 3 係選自由以下組成之群：-C(=O)-、-C(=O)N(R G3)-、-C(=O)O-、-S(=O) 2-、-S(=O) 2N(R G3)-及-C(=NR H3)-； 各 R G3 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、羥基-C 1-6烷基、H 2N-C 1-6烷基、氰基-C 1-6烷基、(C 1-4烷基)HN-C 1-6烷基、(C 1-4烷基) 2N-C 1-6烷基、C 1-6烷氧基-C 1-6烷基、C 3-7環烷基及3至11員雜環基； 各 R H3 獨立地選自由以下組成之群：氫、-OH、C 1-6烷氧基、-CN及C 1-6烷基； R M 係選自由以下組成之群：鹵素、-CN及-O-C(=O)-C 1-6烷基； 或 E為 Q 4 係選自由以下組成之群：一鍵、-C(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-C(=O)N(C 1-4烷基)-、-S(=O) 2-及-S(=O) 2NH-； 環 B係選自由以下組成之群：苯基、吡啶基、嘧啶基、嗒𠯤基、吡𠯤基及5員雜芳基； q係選自由1、2、3及4組成之群； 各 R N 獨立地選自由以下組成之群：C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、乙烯基、乙炔基、鹵素、-CN、硝基及C 1-4烷氧基； 或其鹽。
KRAS抑制劑較佳亦包括 式 (B)之化合物： 其中 R 1a 及 R 1b 均獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； R 2a 及 R 2b 均獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； 及/或視情況， R 1a 或 R 1b 中之一者及 R 2a 或 R 2b 中之一者與其所連接之碳原子一起形成環丙烷環； Z為-(CR 6aR 6b) n-； 各 R 6a 及 R 6b 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； 或 R 6a 及 R 6b 與其所連接之碳原子一起形成環丙烷環； n係選自由0、1及2組成之群； -L-為一鍵或選自-O-、-S-及-N(R 13)-，其中 R 13 為氫或C 1-6烷基； R 3 經 E取代，且 當-L-選自-O-、-S-及-N(R 13)-時，則R 3係選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、5至10員雜芳基及3至11員雜環基，其中C 1-6烷基、5至10員雜芳基、C 1-6烷氧基及3至11員雜環基均視情況且獨立地經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代：鹵素、C 1-6烷基、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至11員雜環基； 當 -L-為一鍵時，則 R 3 係選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況且獨立地經一或多個相同或不同的 R 7 及/或 R 8 取代； 各 R 7 獨立地選自由以下組成之群：鹵素、-CN、-OH、C 1-6烷氧基、-NR 8R 8、-C(=O)R 8、-C(=O)OR 8、-C(=O)NR 8R 8、-NHC(=O)OR 8及二價取代基=O； 各 R 8 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、苯基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、苯基及5至10員雜芳基均視情況經一或多個相同或不同的 R 9 及/或 R 10 取代； 各 R 9 獨立地為-OR 10； 各 R 10 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、3至11員雜環基及5至10員雜芳基； W為氮(-N=)或-CH=； V為氮(-N=)或-CH=； U為氮(-N=)或-C( R 11 )=； R 11 係選自氫、鹵素及C 1-4烷氧基； 環 A為選自由以下組成之群的環：吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、異㗁唑、異噻唑及三唑； 若存在，則各 R 4 獨立地選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6鹵烷氧基、氰基-C 1-6烷基、鹵素、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-CN、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； p係選自由0、1、2及3組成之群； R 5 為視情況經一或多個相同或不同的C 1-6烷基、C 1-6烷氧基或5至6員雜環基取代之3至11員雜環基，其中C 1-6烷基視情況經環丙基取代； 或 R 5 為經3至11員雜環基取代之-O-C 1-6烷基，其中3至11員雜環基視情況經一或多個相同或不同的 R 12 取代； 各 R 12 係選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、鹵素及3至11員雜環基； E為 表示雙鍵或參鍵； Q 1 係選自由以下組成之群：一鍵、-CH 2-、-CH(OH)-、-C(=O)-、-C(=O)N(R G1)-、-C(=O)O-、-S(=O) 2-、-S(=O) 2N(R G1)-及-C(=NR H1)-； 各 R G1 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、羥基-C 1-6烷基、H 2N-C 1-6烷基、氰基-C 1-6烷基、(C 1-4烷基)HN-C 1-6烷基、(C 1-4烷基) 2N-C 1-6烷基、C 1-6烷氧基-C 1-6烷基、C 3-7環烷基及3至11員雜環基； 各 R H1 獨立地選自由以下組成之群：氫、-OH、C 1-6烷氧基、-CN及C 1-6烷基； 若 表示雙鍵，則 R D係選自由以下組成之群：氫、C 3-7環烷基、苯基、鹵素、-CN、C 1-6烷氧基、-C(=O)O-C 1-6烷基、-NHC(=O)-C 1-6烷基及視情況經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代之C 1-6烷基：苯基、3至11員雜環基、C 1-6烷氧基、鹵素、-OH、-NH 2、-NH(C 1-6烷基)、-N(C 1-6烷基) 2、-C(=O)OH、-C(=O)O-C 1-6烷基、-C(=O)NH(C 1-6烷基)、-NHC(=O)-C 1-6烷基、-OC(=O)-C 1-6烷基及苯基-C 1-6烷氧基； R E 及 R F 各自獨立地選自由 R a2 及 R b2 組成之群； R a2 係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況經一或多個相同或不同的 R b2 及/或 R c2 取代； 各 R b2 獨立地選自由以下組成之群：-OR c2、-NR c2R c2、鹵素、-CN、-C(=O)R c2、-C(=O)OR c2、-C(=O)NR c2R c2、-S(=O) 2R c2、-S(=O) 2NR c2R c2、-NHC(=O)R c2、-N(C 1-4烷基)C(=O)R c2、-NHC(=O)OR c2、-N(C 1-4烷基)C(=O)OR c2及二價取代基=O； 各 R c2 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-10環烷基、C 4-10環烯基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-10環烷基、C 4-10環烯基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代：C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、鹵素、-OH、-C(=O)OH、-C(=O)O-C 1-6烷基、-C(=O)C 1-6烷基、-C(=O)NH 2、-C(=O)NH(C 1-6烷基)、-C(=O)N(C 1-6烷基) 2及二價取代基=O； 或 R D 及 R E 與其所連接之碳原子一起形成4至7員不飽和脂環或4至7員不飽和雜環，其中此4至7員不飽和脂環或4至7員不飽和雜環視情況，除 R F 之外，經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代：C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、-OH、C 1-6烷氧基、C 1-4烷氧基-C 1-4烷基、-NH 2、-CN、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、鹵素、-C(=O)O-C 1-6烷基及二價取代基=O； 或 若 Q 1 為-C(=O)N(R G1)-，則-C(=O)N(R G1)-之 R G1 及 R F 一起形成選自由以下組成之群的連接子：-C(=O)-、-CH 2-、-CH 2-C(=O)-、-C(=O)-CH 2-及-C 2H 4-； 若 表示參鍵，則 R D 及 R E 均不存在； R F 為 R a2 ； R a2 係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況經一或多個相同或不同的 R b2 及/或 R c2 取代； 各 R b2 獨立地選自由以下組成之群：-OR c2、-NR c2R c2、鹵素、-CN、-C(=O)R c2、-C(=O)OR c2、-C(=O)NR c2R c2、-S(=O) 2R c2、-S(=O) 2NR c2R c2、-NHC(=O)R c2、-N(C 1-4烷基)C(=O)R c2、-NHC(=O)OR c2、-N(C 1-4烷基)C(=O)OR c2及二價取代基=O； 各 R c2 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基； 或 E為 Q 2 係選自由以下組成之群：一鍵、-CH 2-、-CH(OH)-、-C(=O)-、-C(=O)N(R G2)-、-C(=O)O-、-S(=O) 2-、-S(=O) 2N(R G2)-及-C(=NR H2)-； 各 R G2 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、羥基-C 1-6烷基、H 2N-C 1-6烷基、氰基-C 1-6烷基、(C 1-4烷基)HN-C 1-6烷基、(C 1-4烷基) 2N-C 1-6烷基、C 1-6烷氧基-C 1-6烷基、C 3-7環烷基及3至11員雜環基； 各 R H2 獨立地選自由以下組成之群：氫、-OH、C 1-6烷氧基、-CN及C 1-6烷基； R I 係選自由氫及鹵素組成之群； R J 為氫；或 R I 及 R J 與其所連接之碳原子一起形成環丙烷或環氧乙烷環； R K 係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、-CN及鹵素； R L係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、-CN、鹵素及-C(=O)-C 1-6烷基； 或 E為 Q 3 係選自由以下組成之群：-C(=O)-、-C(=O)N(R G3)-、-C(=O)O-、-S(=O) 2-、-S(=O) 2N(R G3)-及-C(=NR H3)-； 各 R G3 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、羥基-C 1-6烷基、H 2N-C 1-6烷基、氰基-C 1-6烷基、(C 1-4烷基)HN-C 1-6烷基、(C 1-4烷基) 2N-C 1-6烷基、C 1-6烷氧基-C 1-6烷基、C 3-7環烷基及3至11員雜環基； 各 R H3 獨立地選自由以下組成之群：氫、-OH、C 1-6烷氧基、-CN及C 1-6烷基； R M 係選自由以下組成之群：鹵素、-CN及-O-C(=O)-C 1-6烷基； 或 E為 Q 4 係選自由以下組成之群：一鍵、-C(=O)-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-C(=O)N(C 1-4烷基)-、-S(=O) 2-及-S(=O) 2NH-； 環 B係選自由以下組成之群：苯基、吡啶基、嘧啶基、嗒𠯤基、吡𠯤基及5員雜芳基； q係選自由1、2、3及4組成之群； 各 R N 獨立地選自由以下組成之群：C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、乙烯基、乙炔基、鹵素、-CN、硝基及C 1-4烷氧基； 或其鹽。
KRAS抑制劑較佳亦包括 式 (C)之化合物： 其中 R 1a 及 R 1b 均獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基，及3至5員雜環基； R 2a 及 R 2b 均獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基，及3至5員雜環基； 及/或視情況， R 1a 或 R 1b 中之一者及 R 2a 或 R 2b 中之一者與其所連接之碳原子一起形成環丙烷環； Z為-(CR 6aR 6b) n-； 各 R 6a 及 R 6b 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基，及3至5員雜環基； 或 R 6a 及 R 6b 與其所連接之碳原子一起形成環丙烷環； n係選自由0、1及2組成之群； R 3係選自由以下組成之群：鹵素、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、-N 3、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基，及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況且獨立地經一或多個相同或不同的 R 7 及/或 R 8 取代； 各 R 7 獨立地選自由以下組成之群：鹵素、-CN、-OR 8、-NR 8R 8、-C(=O)R 8、-C(=O)OR 8、-C(=O)NR 8R 8、-NHC(=O)OR 8及二價取代基=O； 各 R 8 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基，及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基、C 6-10芳基及5至10員雜芳基均視情況經一或多個相同或不同的 R 9 及/或 R 10 取代； 各 R 9 獨立地選自由以下組成之群：-OR 10、-NR 10R 10及-C(O)NR 10R 10； 各 R 10 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 3-10環烷基、3至11員雜環基，及5至10員雜芳基，其中C 1-6烷基視情況經選自由以下組成之群的取代基取代：C 1-6烷氧基、C 3-10環烷基，及視情況經C 1-6烷基取代之3至11員雜環基； W為氮(-N=)或-CH=； V為氮(-N=)或-CH=； U為氮(-N=)或-C( R 11 )=； R 11 係選自氫、鹵素及C 1-4烷氧基； 環 A為選自由以下組成之群的環：吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、㗁唑、異㗁唑、噻唑、異噻唑及三唑； 若存在，則各 R 4 獨立地選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6鹵烷氧基、氰基-C 1-6烷基、鹵素、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-CN、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； p係選自由0、1、2及3組成之群； R 5 為視情況經一或多個相同或不同的C 1-6烷基、C 1-6烷氧基或5至6員雜環基取代之3至11員雜環基，其中C 1-6烷基視情況經環丙基取代； 或 R 5 為經3至11員雜環基取代之-O-C 1-6烷基，其中3至11員雜環基視情況經一或多個相同或不同的 R 12 取代， 各 R 12 係選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、鹵素及3至11員雜環基； 或其鹽。
KRAS抑制劑較佳亦包括 式 (D)之化合物： 其中 R 1a 及 R 1b 均獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環烷基； R 2a 及 R 2b 均獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環烷基； 及/或視情況， R 1a 或 R 1b 中之一者及 R 2a 或 R 2b 中之一者與其所連接之碳原子一起形成環丙烷環； Z為-(C R 3aR 3b ) n -； 各 R 3a 及 R 3b 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環烷基； 或 R 3a 及 R 3b 與其所連接之碳原子一起形成環丙烷環； n係選自由0、1及2組成之群； R 4 係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6鹵烷氧基、氰基-C 1-6烷基、鹵素、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-CN、C 3-5環烷基及3至5員雜環烷基； 環 A為5員伸雜芳基； 若存在，則各 R 5 獨立地選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6鹵烷氧基、氰基-C 1-6烷基、鹵素、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-CN、C 3-5環烷基及3至5員雜環烷基； m係選自由0、1、2及3組成之群； W為氮(-N=)或-CH=； V為氮(-N=)或-CH=； U為氮(-N=)或-C( R 11 )=； R 11 係選自氫、鹵素及C 1-4烷氧基； 環 B為視情況經一或多個相同或不同的C 1-6烷基、C 1-6烷氧基或5至6員雜環烷基取代之3至11員伸雜環烷基，其中C 1-6烷基視情況經環丙基取代； L係選自由以下組成之群：一鍵、C 1-8伸烷基、C 2-8伸烯基、C 2-8伸炔基及C 1-8伸烷氧基； X為-(CH 2)-或-O-； Y為5員伸雜芳基或-C(O)(N R 12 )-，其中該5員伸雜芳基包含至少一個氮原子，且其中該-C(O)(N R 12 )-經由C原子連接至 X； R 9 為C 1-4烷基； R 10 係選自由以下組成之群：氫、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C(O) R 12 及-C(O)O R 12 ，其中該C 1-6烷基視情況經-OH或-OP(O)(OH) 2取代； 各 R 12 獨立地為氫或C 1-4烷基； q係選自由0、1及2組成之群； 若存在，則各 R 6 在每次出現時獨立地為鹵素或C 1-3烷基； R 7 係選自由鹵素、C 1-3烷基、-CN及5員雜芳基組成之群，其中該5員雜芳基包含至少一個氮原子且視情況經 R 8 取代； R 8 為C 1-3烷基或C 1-3羥烷基； 或其鹽。
KRAS抑制劑較佳亦包括 式 (E)之化合物： 其中 R 1a 及 R 1b 均獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； R 2a 及 R 2b 均獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； 及/或視情況， R 1a 或 R 1b 中之一者及 R 2a 或 R 2b 中之一者與其所連接之碳原子一起形成環丙烷環； Z為-(CR 6aR 6b) n-； 各 R 6a 及 R 6b 獨立地選自由以下組成之群：氫、C 1-4烷基、C 1-4鹵烷基、C 1-4烷氧基、C 1-4鹵烷氧基、鹵素、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； 或 R 6a 及 R 6b 與其所連接之碳原子一起形成環丙烷環； n係選自由0、1及2組成之群； L係選自-O-、-S-及-N( R 7 )-，其中 R 7 為氫或C 1-6烷基； R 3 係選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、5至10員雜芳基及3至11員雜環基，其中C 1-6烷基、5至10員雜芳基、C 1-6烷氧基及3至11員雜環基均視情況且獨立地經選自由以下組成之群的一或多個相同或不同的取代基取代：鹵素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-C(O)O-C 1-6烷基、C 3-5環烷基或視情況經-N(C 1-4烷基) 2取代之3至11員雜環基； W為氮(-N=)或-CH=； V為氮(-N=)或-CH=； U為氮(-N=)或-C( R 11 )=； R 11 係選自氫、鹵素及C 1-4烷氧基； 環 A為選自由以下組成之群的環：吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、㗁唑、異㗁唑、噻唑、異噻唑及三唑； 若存在，則各 R 4 獨立地選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6鹵烷基、C 1-6烷氧基、C 1-6鹵烷氧基、氰基-C 1-6烷基、鹵素、-OH、-NH 2、-NH(C 1-4烷基)、-N(C 1-4烷基) 2、-CN、C 3-5環烷基及3至5員雜環基； p係選自由0、1、2及3組成之群； R 5 為視情況經一或多個相同或不同的C 1-6烷基、C 1-6烷氧基或5至6員雜環基取代之3至11員雜環基，其中C 1-6烷基視情況經環丙基取代； 或 R 5 為經3至11員雜環基取代之-O-C 1-6烷基，其中3至11員雜環基視情況經一或多個相同或不同的 R 12 取代， 各 R 12 係選自由以下組成之群：C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、鹵素及3至11員雜環基； 或其鹽。
HER2抑制劑較佳包括[1,3]二𠯤並[5,4- d]嘧啶及 式 (F)之衍生物： 其中 R 1 係選自由以下組成之群：氫、-CH 3、-CCH、-OCH 3及鹵素； R 2 為氫或鹵素； R 3 係選自由式(i.1)、(i.2)、(i.3)及(i.4)組成之群； 表 2 R 4 係選自由 R 4.a 及 R 4.b 組成之群    或 其中 Q 表示含有1個N原子之4至6員雜環基，其中環之一個碳原子視情況經甲基取代； Z 表示含有1個N原子之4至6員雜環基，其中環之一個碳原子視情況經甲基取代； R 5 為-H或-CH 3； 且 R 1 及 R 2 中之至少一者不為氫。
用於預測臨床結果之統計方法為此項技術中已知的且可容易地適用於根據本發明之方法。
如本文中所使用，術語「監測治療」或「監測」係指監測反應程度、監測反應持續時間、監測反應率、監測穩定率、監測穩定持續時間、監測疾病進展時間、監測無進展存活率或監測總存活期率。
根據第三態樣，本發明係關於一種用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物治療患者之癌症的方法，其中已根據上文所描述之方法中之任一者判定該患者對用該化合物之該治療有反應。類似地，本發明係關於一種用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物治療患者之癌症的方法，其中已根據上文所描述之方法中之任一者判定該患者對用該化合物之該治療有反應。
本發明進一步係關於一種用KRAS抑制劑或降解劑治療患者之KRAS依賴性癌症的方法，其包含： -判定該患者展現分子生物標記存活素，及 -向患者投與醫藥學上有效量之KRAS抑制劑或降解劑。
本發明進一步係關於一種用抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物治療患者之癌症的方法，其包含： -判定該患者展現分子生物標記存活素，及 -向患者投與醫藥學上有效量之抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物。
本發明進一步係關於一種用KRAS抑制劑或降解劑治療患者之KRAS依賴性癌症的方法，其包含： -量測自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， -將在治療期間自該患者獲得之至少第二樣本中的存活素水平與第一樣本中之存活素水平進行比較，及 -判定在治療期間自該患者獲得之第二樣本中之存活素水平相較於第一樣本中之存活素水平降低，或在第二樣本之後在治療期間自該患者獲得之任何另一樣本中之存活素水平相較於在治療期間自該患者獲得之倒數第二樣本中的存活素水平降低，及 -繼續向患者投與醫藥學上有效量之KRAS抑制劑或降解劑。
本發明進一步係關於一種用抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物治療患者之癌症的方法，其包含： -量測自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， -將在治療期間自該患者獲得之至少第二樣本中的存活素水平與第一樣本中之存活素水平進行比較，及 -判定在治療期間自該患者獲得之第二樣本中之存活素水平相較於第一樣本中之存活素水平降低，或在第二樣本之後在治療期間自該患者獲得之任何另一樣本中之存活素水平相較於在治療期間自該患者獲得之倒數第二樣本中的存活素水平降低，及 -繼續向患者投與醫藥學上有效量之抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物。
該癌症患者可為如上文所描述的已根據用於判定癌症患者對KRAS抑制劑之反應性、或癌症患者對抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物之反應性的方法中之任一者選擇的患者。
如本文中所使用，術語「單一療法」係指用本發明之化合物治療而不使用諸如放射療法或化學療法之額外抗癌療法。
如本文中所使用，如本文中所定義之術語「組合療法」可藉助於同時、依序或單獨投與該治療之個別組分來達成。如本文所定義之組合治療可作為唯一療法應用，或除本發明之組合治療之外，亦可涉及手術或放射療法或額外化學治療劑或靶向劑。在投與如本文中所描述之組合治療之前、期間或之後，手術可包含部分或完全腫瘤切除步驟。
患者之KRAS依賴性癌症之該治療可為利用該KRAS抑制劑及額外抗癌治療劑(例如免疫檢查點抑制劑)之組合療法。此外，對抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物有反應的癌症治療亦可為利用抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物及額外抗癌治療劑(例如免疫檢查點抑制劑)的組合療法。
「免疫檢查點」為T淋巴球之細胞膜上調節該等細胞之免疫反應度的受體。存在在T細胞之細胞膜上表現且與各別配位體(可溶或細胞結合配位體)相互作用之消炎性(抑制)及促炎性(活化)免疫檢查點。腫瘤細胞通常經由抑制抗腫瘤免疫反應之各別配位體來活化消炎性免疫檢查點通路，因此逃避免疫監視且促進腫瘤生長。「免疫檢查點抑制劑(ICI)」為試劑，特定言之單株抗體，其結合至消炎性免疫檢查點或其配位體，且可藉由再活化免疫系統且因此重新建立其對抗腫瘤之能力來中斷此腫瘤抑制策略。已展示ICI對各種腫瘤類型臨床上有效(Dyck及Mills，2017)。
換句話說，免疫檢查點抑制劑包含諸如PD-1之免疫抑制性受體的拮抗劑，在此情況下，該等拮抗劑抑制PD-1/PD-L1通路中之PD-1或PD-L1。PD-1或PD-L1抑制劑之實例包括但不限於阻斷人類PD-1之(人類或人源化)抗體，諸如帕博利珠單抗(pembrolizumab)或匹地利珠單抗(pidilizumab)，或阻斷PD-L1之抗體，諸如阿維魯單抗(avelumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)及阿替利珠單抗(atezolizumab)，以及全人類抗體，諸如阻斷PD-1之納武單抗(nivolumab)。
術語「治療有效量」用於指緩解或改善所治療之病症的症狀中之一或多者的活性劑之量。在另一態樣中，治療有效量係指已展示在例如延緩疾病進展方面有效之活性劑的目標血清濃度。功效可取決於待治療之病況以習知方式量測。
如本文中所使用之術語「治療」及「療法」及其類似者意謂包括疾病或病症之治療以及預防或抑制措施，從而產生任何臨床上需要或有益的作用，包括但不限於一或多種症狀之緩解或減輕，疾病或病症之進展的消退、延緩或停止。因此，舉例而言，術語治療包括在疾病或病症之症狀發作之前或之後投與試劑，藉此預防或移除疾病或病症之一或多種病徵。作為另一實例，該術語包括在疾病之臨床表現之後投與試劑以對抗疾病之症狀。
此外，在發作之後及已出現臨床症狀之後投與試劑(其中，無論治療是否使疾病得到改善，投與皆會影響疾病或病症之臨床參數，諸如組織損傷程度或癌轉移之量或程度)包含如本文中所使用之「治療」或「療法」。此外，與在不存在使用各別試劑之情況下的症狀相比，只要治療劑單獨或與另一治療劑組合緩解或改善了所治療之病症的至少一種症狀，則無論是否緩解病症之所有症狀，結果皆應被視為有效地治療了潛在病症。
根據第四態樣，本發明進一步係關於一種存活素之用途，其用於判定化合物抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體的能力、或包含抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物的醫藥調配物治療癌症之能力的方法中。
本發明進一步係關於如上文所描述之用途，其中存活素水平係在治療之前自患者獲得之樣本中及用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物治療之後自患者獲得之至少一個樣本中測定，且其中，在用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物治療之後存活素水平降低指示化合物能夠治療該癌症。
此外，根據本發明之此態樣，本發明亦係關於一種存活素之用途，其用於判定化合物抑制MDM2與p53之間的相互作用之能力、或包含抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物的醫藥調配物治療癌症的能力的方法中。較佳地，根據該用途，存活素水平係在治療之前自患者獲得之樣本中及用抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物治療之後自患者獲得之至少一個樣本中測定，且其中，在用抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物治療之後存活素水平降低指示化合物能夠治療該癌症。
本發明進一步係關於一種分子生物標記之用途，其用於選擇患有KRAS依賴性癌症之患者以用KRAS抑制劑或降解劑或包含該KRAS抑制劑或降解劑之醫藥調配物治療，其中該分子生物標記為存活素。本發明進一步係關於一種分子生物標記之用途，其用於選擇患有癌症之患者以用抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物、或包含抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物的醫藥調配物治療，其中該分子生物標記為存活素。
本發明進一步係關於一種分子生物標記之用途，其用於判定或證實KRAS抑制劑或降解劑或包含該KRAS抑制劑或降解劑之醫藥調配物抑制KRAS依賴性癌症之能力的方法中，其中該分子生物標記為存活素。本發明進一步係關於一種分子生物標記之用途，其用於判定或證實抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物、或包含抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物的醫藥調配物抑制癌症之能力的方法中，其中該分子生物標記為存活素。
本發明進一步係關於如上文所描述之分子生物標記之該用途，其中分子生物標記存活素水平係在治療之前由患者提供之樣本中及用該KRAS抑制劑或降解劑處理之後由患者提供之至少一個樣本中測定，且其中，將存活素水平識別為在用該KRAS抑制劑或降解劑治療之後降低。本發明進一步係關於如上文所描述之分子生物標記之該用途，其中分子生物標記存活素水平係在治療之前由患者提供之樣本中及用抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物治療之後由患者提供之至少一個樣本中測定，且其中，將存活素水平識別為在用抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物治療之後降低。
本發明進一步係關於如上文所描述之分子生物標記之該用途，其中該用途為活體外用途。
在如上文所描述之用途中之任一者的較佳實施例中，該(該等)樣本為血液、血漿或血清樣本。
在如上文所描述之用途中之任一者的其他較佳實施例中，抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之化合物係選自由以下組成之群：KRAS(G12C)抑制劑或降解劑、KRAS(G12D)抑制劑或降解劑、GDP-KRAS抑制劑或降解劑及HER2抑制劑及降解劑。在如上文所描述之用途中之任一者的又其他較佳實施例中，抑制MDM2與p53之間的相互作用之化合物為MDM2i-cpd#1。
熟習此項技術者應理解，視化合物類型而定，KRAS依賴性癌症將變化。
在如上文所描述之用途中之任一者的其他較佳實施例中，KRAS(G12C)抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：索托拉西布(AMG510)、阿達格拉西布(MRTX849)、G12C-cpd#1、G12C-cpd#2、G12C-cpd#3、G12C-cpd#4、G12C-cpd#5、G12C-cpd#6、G12C-cpd#7、G12C-cpd#8、G12C-cpd#9、G12C-cpd#10及G12C-cpd#11。
在如上文所描述之用途中之任一者的其他較佳實施例中，KRAS(G12D)抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：MRTX1133、G12D-cpd#2、G12D-cpd#3、G12D-cpd#4、G12D-cpd#5、G12D-cpd#6、G12D-cpd#7、G12D-cpd#8及G12D-cpd#9。
在如上文所描述之用途中之任一者的其他較佳實施例中，GDP-KRAS抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：GDP-cpd#1、GDP-cpd#2、GDP-cpd#3、GDP-cpd#4、GDP-cpd#5、GDP-cpd#6、GDP-cpd#7、GDP-cpd#8、GDP-cpd#9、GDP-cpd#10、GDP-cpd#11、GDP-cpd#12及GDP-cpd#13。
在如上文所描述之用途中之任一者的其他較佳實施例中，HER2抑制劑或降解劑為根據式(F)之化合物(參見上文)，更佳地，HER2抑制劑或降解劑為化合物HER2-cpd#1。
在本發明之一或多個較佳實施例中，抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體之該化合物可為抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物，其中抑制或降解HER2蛋白或該HER2蛋白之突變體之化合物在信號轉導通路中充當位於HER2蛋白或HER2蛋白之突變體下游的KRAS蛋白或KRAS蛋白之突變體的間接抑制劑。
在如上文所描述之用途中之任一者的其他較佳實施例中，該存活素包含於胞泌體中。
在如上文所描述之用途中之任一者的其他較佳實施例中，該KRAS依賴性癌症係選自由以下組成之群：胰管腺癌(PDAC)、非小細胞肺癌(NSCLC)及結腸直腸癌(CRC)。在上文所描述之用途中之任一者的又其他較佳實施例中，待用抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物治療的癌症係選自在上文定義為用此MDM2抑制劑治療之較佳癌症類型的癌症中之任一者。
在如上文所描述之用途中之任一者的其他較佳實施例中，測定存活素水平包含選自由以下組成之群的存活素特異性分析：西方墨點法、ELISA、RIA、MSD® S-PLEX技術及FACS。
在如上文所描述之用途中之任一者的其他較佳實施例中，該治療為該KRAS抑制劑或降解劑或抑制MDM2與p53之間的相互作用之該化合物與額外抗癌治療劑及/或醫療標準的組合療法。
根據第五態樣，本發明係關於一種部件套組，其包含用於測定自患有癌症，諸如例如KRAS依賴性癌症之患者提供之樣本中的存活素水平的構件及如何執行如上文所描述之該等方法中之任一者的說明書。
本發明進一步係關於一種部件套組，其包含用於測定由患有癌症，諸如KRAS依賴性癌症之患者提供之樣本中的存活素水平的構件，以用於執行上文所描述之方法中之任一者。
實例儘管已在圖式及前述描述中詳細地繪示及描述了本發明，但此繪示及描述應被視為說明性或例示性的，而非限定性的；本發明不限於所揭示實施例。所揭示實施例之其他變體可由熟習此項技術者在實踐所主張之本發明時根據對圖式、揭示內容及所附申請專利範圍之研究來理解及實現。在申請專利範圍中，字組「包含」不排除其他元素或步驟，且不定冠詞「一(a)」或「一(an)」不排除複數個。在相互不同之附屬申請專利範圍中敍述某些措施的純粹實情並不指示不能有利地使用此等措施之組合。申請專利範圍中之任何參考符號均不應被視為限制範疇。
本文中所揭示之全部胺基酸序列均自N端至C端展示；本文中所揭示之全部核酸序列均自5'端至3'端展示。
材料及方法 實例 1 ： 化合物KRAS抑制化合物及HER2抑制化合物分別展示於上表1中。
化合物之合成 實例 2 ： 根據式 (A) 之化合物之合成根據式(A)之化合物之合成已描述於WO2021/245051中。
實例 3 ： 根據式 (B) 之化合物之合成 縮寫之清單( 表 3)
Ac 乙醯基
ACN 乙腈
aq. 水，水溶液
ATP 腺苷三磷酸
Bn 苯甲基
Boc 三級丁氧基羰基
Bu 丁基
c 濃度
Cbz 羧基苯甲基
CDI 1,1´-羰基二咪唑
d 天
TLC 薄層層析
Davephos 2-二甲胺基-2'-二環己基胺基膦基聯苯
DBU 1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一-7-烯
DCE 二氯乙烷
DCM 二氯甲烷
DEA 二乙胺
DIPEA N-乙基- N,N-二異丙胺(Hünig鹼)
DMA 二甲基乙醯胺
DMAP 4- N,N-二甲胺基吡啶
DME 1,2-二甲氧乙烷
DMF N,N-二甲基甲醯胺
DMSO 二甲亞碸
DPPA 二苯基磷醯基疊氮化物
dppf 1.1´-雙(二苯基膦基)二茂鐵
EDTA 乙二胺四乙酸
EGTA 乙二醇四乙酸
eq. 當量
ESI 電灑離子化法
Et 乙基
Et 2O 二乙醚
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
h 小時
HATU 六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)- N,N,N',N'-四甲基-
HPLC 高效液相層析
i 異
conc. 濃縮
LC 液相層析
LiHMDS 雙(三甲基矽基)醯胺鋰
sln. 溶液
Me 甲基
MeOH 甲醇
min 分鐘
MPLC 中壓液相層析
MS 質譜法
MTBE 甲基三級丁基醚
NMM N-甲基𠰌啉
NMP N-甲基吡咯啶酮
NP 正相
n.a. 不可用
PBS 磷酸鹽緩衝鹽水
Ph 苯基
Pr 丙基
PTSA 對甲苯磺酸
Py 吡啶
rac 外消旋
red. 還原
Rf (R f) 滯留因子
RP 逆相
RRLC 快速解析液相層析
rt 環境溫度
SFC 超臨界流體層析
S N 親核取代
TBAF 氟化四丁基銨
TBDMS 三級丁基二甲基矽基
TBME 三級丁基甲醚
TBTU 四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基-
tBu 三級丁基
TEA 三乙胺
temp. 溫度
tert 三級
Tf 三氟甲磺酸酯
TFA 三氟乙酸
THF 四氫呋喃
TMS 三甲基矽基
t Ret. 滯留時間(HPLC)
TRIS 參(羥甲基)-胺基甲烷
TsOH 對甲苯磺酸
UPLC 超高效液相層析
UV 紫外線
wt 重量
實例本發明之特徵及優點將根據以下詳述實例變得顯而易見，該等實例藉助於實例說明本發明之原理而不限制其範疇。
根據本發明之化合物之製備除非另外陳述，否則使用化學實驗室中常用之方法在商業上可獲得設備中進行所有反應。對空氣及/或水分敏感之起始物質在保護性氣體下儲存，且與此對應之反應及操縱在保護性氣體(氮氣或氬氣)下進行。
若化合物由結構式且由其術語兩者表示，則在存在衝突之情況下，以結構式為準。
微波反應在由Biotage之引發器/反應器中或在由CEM製造之Explorer中或在由Anton Paar製造之Synthos 3000或Monowave 3000中，在密封容器(較佳2、5或20 mL)中較佳在攪拌下進行。
層析薄層層析在由Merck製造之玻璃(具有螢光指示劑F-254)上之現成矽膠60 TLC板上進行。
根據本發明之實例化合物之 製備型高壓層析 (RP HPLC)在具有由Waters製造之管柱(名稱：SunFire™ Prep C18, OBD™ 10 µm, 50 × 150 mm或SunFire™ Prep C18 OBD™ 5 µm, 30 × 50 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 10 µm, 50 × 150 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 5 µm, 30 × 150 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 5 µm, 30 × 50 mm)及由YMC製造之管柱(名稱：Actus-Triart Prep C18, 5 µm, 30 × 50 mm)的Agilent或Gilson系統上進行。
使用不同梯度的H 2O/乙腈溶離化合物，而對於Agilent系統，向水中添加5%酸性改質劑(20 mL HCOOH至1 L H 2O/乙腈(1/1)) (酸性條件)。對於Gilson系統，向水中添加0.1% HCOOH。
對於Agilent系統在鹼性條件下之層析，亦使用H 2O/乙腈梯度，而藉由添加5%鹼性改質劑(50 g NH 4HCO 3+ 50 mL NH 3(25%於H 2O中)用H 2O補足至1 L)使水呈鹼性。對於Gilson系統，如下使水呈鹼性：用H 2O將5 mL NH 4HCO 3溶液(158 g於1L H 2O中)及2 mL NH 3(28%於H 2O中)補充至1 L。
中間物及根據本發明之實例化合物的 超臨界流體層析 (SFC)在具有以下管柱之JASCO SFC系統上進行：Chiralcel OJ (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak AD (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak AS (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak IC (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak IA (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralcel OJ (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralcel OD (250 × 20 mm, 5 µm)、Phenomenex Lux C2 (250 × 20 mm, 5 µm)。
中間物及最終化合物之 分析型 HPLC ( 反應控制 )係使用由Waters製造之管柱(名稱：XBridge TMC18, 2.5 µm, 2.1 × 20 mm或XBridge TMC18, 2.5 µm, 2.1 × 30 mm或Aquity UPLC BEH C18, 1.7 µM, 2.1 × 50mm)及由YMC製造之管柱(名稱：Triart C18, 3.0 µm, 2.0 × 30 mm)以及由Phenomenex製造之管柱(名稱：Luna C18, 5.0 µm, 2.0 × 30 mm)進行。分析設備在各情況下亦配備有質量偵測器。
HPLC 質譜法 /UV 光譜法使用HPLC-MS設備(具有質量偵測器之高效液相層析)產生表徵根據本發明之實例化合物的滯留時間/MS-ESI +。在注射峰值處溶離之化合物給出滯留時間t Ret.= 0.00。
SFC 方法 ( 製備型 )在Waters Thar SFC 80系統中執行製備型SFC 管柱：              Chiralpak AD-H (21 × 250 mm)，5µm 流量：              25 g/min 移動相：           75 % CO 2+ 25 % MeOH (0.5 %異丙胺) ABPR：           120 bar 溫度：              35℃ UV:                 220 nm 堆疊時間：       8 min
HPLC 方法 ( 分析型 ) 方法 A 在與Agilent 6140質譜儀耦接之Agilent 1200系列LC系統上分析樣本。純度係經由在230-400 nm範圍內之170 nm頻寬下的UV偵測來測定。LC參數如下： 管柱            Waters Xbridge C18管柱，3.5 µm粒度，2.1 × 30 mm； 流量            1 mL/min； 管柱溫度      60℃； 注射            5 µL注射； 溶劑            A：20 mM NH 4HCO 3/NH 3pH 9 B：MS級乙腈； 梯度            0.0 - 1.5 min            10 % - 95 % B 1.5 - 2.0 min            95 % B 2.0 - 2.1min             95 % - 10 % B 方法 B HPLC          Agilent 1100/1200系列 MS             Agilent LC/MSD SL 管柱            Waters X-Bridge BEH C18，2.5 µm，2.1 × 30 mm XP 溶劑            A：20 mM NH 4HCO 3/28 mM NH 3/H 2O；B：乙腈(HPLC級) 偵測            MS：正及負模式 質量範圍      100 - 750 m/z 流量            1.40 mL/min 管柱溫度      45℃ 梯度：         0.00 - 1.00 min: 15 % B à 95 % B 1.00 - 1.30 min: 95 % B 方法 F HPLC          Agilent 1100/1200系統 MS              1200系列LC/MSD (API-ES +/- 3000/3500 V，Quadrupol，G6140A) MSD信號設定  掃描正/負150 - 750 管柱                YMC；零件編號TA12S03-0302WT；Triart C18，3 µm，12 nm；30 × 2.0 mm管柱 溶離劑 A：H 2O + 0.11 %甲酸 B：MeCN + 0.1 %甲酸(HPLC級) 偵測信號         UV 254 nm，230 nm，214 nm (頻寬10，參考關閉) 光譜                範圍：190-400 nm；狹縫：4 nm 峰寬                ＞ 0.0031 min (0.063 s反應時間，80Hz) 注射                0.5 µL標準注射 流量                1.4 mL/min 管柱溫度         45℃ 梯度                 0.0 - 1.0 min       15 % à 95 % B 1.0 - 1.1 min            95 % B 停止時間：1.23 min
根據本發明之化合物及中間物藉由下文描述之合成方法製備，其中通式之取代基具有上文給出之含義。此等方法意欲作為本發明之說明，而不限制其主題及此等實例所主張之化合物的範疇。在未描述起始化合物之製備之情況下，其為商業上可獲得的或其合成描述於先前技術中或其可類似於已知先前技術化合物或本文中所描述之方法而製備，亦即合成此等化合物在有機化學工作者之技能內。文獻中所描述之物質可根據公開之合成方法製備。若描繪以下化學結構而無立體中心(例如，經不對稱取代之碳原子)之確切組態，則兩種組態應視為包括且揭示於此表示中。呈外消旋形式之立體中心的表示應始終視為包括且揭示兩種鏡像異構物(若不存在其他經定義立體中心)或所有其他潛在非鏡像異構物及鏡像異構物(若存在額外經定義或未經定義之立體中心)。
合成 A-2a 之實驗程序 在0℃下向5-氯戊腈(22.9 g，194.8 mmol，1.0當量)於無水EtOH (136 mL)中之懸浮液中逐滴添加乙醯氯(111.3 mL，1.558 mol，8.0當量)。使反應混合物達到rt且攪拌12 h。將混合物在減壓下濃縮且用Et 2O洗滌，且粗產物 A-2a不經進一步純化即在下一步驟中直接用作HCl鹽。
合成 A- 3a 之實驗程序 將粗產物 A-2a(HCl鹽) (28 g，139.9 mmol，1.0當量)及乙二醇(7.382 g，118.94 mmol，0.9當量)溶解於DCM (300 mL)中且在rt下攪拌6 d。將所得懸浮液在減壓下濃縮，用Et 2O (200 mL)稀釋且過濾。將濾液在減壓下濃縮，溶於DCM (200 mL)中且用2N KOH溶液(150 mL)處理。將混合物在rt下攪拌過夜，保持各相完整。將各相分離，用DCM萃取水相兩次，且合併之有機相經MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗原酸酯 A-3a不經進一步純化即用於下一步驟。
合成 A-4a 之實驗程序 將粗產物 A-3a(22.3 g，106.9 mmol，1.0當量)、1-環己烯氧基三甲基矽烷(16.42 mL，82.3 mmol，0.8當量)及氯化鋅(10.195 g，74.8 mmol，0.7當量)溶解於DCM (120 mL)中且在rt下攪拌5 h。藉由添加飽和碳酸氫鈉溶液來處理反應混合物。將有機相分離，經MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物藉由NP層析(梯度溶離：0%至50% EtOAc/環己烷)純化，得到所需化合物 A-4a。
合成 A- 5a 之實驗程序 將 A-4a(14.9 g，57.14 mmol，1.0當量)及碘化鈉(25.954 g，171.4 mmol，3.0當量)溶解於丙酮(120 mL)中且在回流下攪拌16 h。將反應混合物在減壓下濃縮，用DCM稀釋且用飽和硫代硫酸鈉溶液洗滌。將有機相分離，經MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物 A-5a不經進一步純化即用於下一步驟。
合成 A-6b 之實驗程序 將 A-5a(30 g，85.0 mmol，1.0當量)溶解於THF中。在0℃下用三級丁醇鉀(28.67 g，256.0 mmol，3.0當量)處理混合物且在rt下攪拌過夜。反應混合物藉由添加水(2 mL)淬滅，藉由添加Et 2O及飽和碳酸氫鈉溶液稀釋。將有機相分離，經MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物藉由NP層析(梯度溶離：0%至50% EtOAc/環己烷)純化，得到(外消旋)化合物 A- 6a(反應順序 A-1aà A-6a係基於Marko等人, THL 2003, 44, 3333-3336及Maulide等人, Eur. J. Org. Chem. 2004, 19:3962-3967)。
可接著在經由SFC (例如使用CHIRACEL OX-3管柱及使用乙腈作為共溶劑)進行對掌性分離之後獲得所需鏡像異構物 A-6b。
合成 E-4c 之實驗程序 ( 方法 C) 向 E-1c(10.20 g，57.22 mmol)於DCM (60.0 mL)中之經攪拌溶液中添加哌𠯤-1-甲酸三級丁酯(11.22 g，57.22 mmol，1.0當量)。接著添加DIPEA (20.71 g，160.21 mmol，2.8當量)，且將反應混合物在60℃下攪拌1 h。在完全轉化之後，將混合物溶解於EtOAc中且用水(3×)洗滌。將有機相乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物經由管柱層析(DCM/MeOH)純化，得到 E-4c。
以下(額外)中間物 E-4(表4)可以類似方式根據方法A至E使用不同胺 PG-L-H及中間物 E-1來獲得。必要時，粗產物 E-4可藉由層析純化。 表 4
編號 方法 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
E-4c C 0.72 324 F
E-4s C 1.49 352 A
合成 E-8d 之實驗程序 向 E-1a(600 mg，3.21 mmol，93%純度，1.0當量)於無水DMSO (6 mL)中之溶液中添加氟化銫(1.218 g，8.02 mmol，2.5當量)，且將所得混合物在rt下攪拌1 h，直至觀測到起始材料完全轉化。將所得懸浮液過濾，且經過濾固體用無水DMSO (2 mL)洗滌。將濾液(8 mL)添加至( S)‐1‐(( S)‐1‐甲基吡咯啶-2-基)乙-1-醇(453 mg，3.51 mmol，1.1當量)中，且添加DIPEA (1.085 mL，6.38 mmol，2當量)。將混合物在rt下攪拌1 h。在觀測到起始材料完全轉化之後，將哌𠯤-1-羧酸三級丁酯(674 mg，3.51 mmol，97%純度，1.1當量)於無水DMSO (3 mL)及DIPEA (1.085 mL，6.38 mmol，2當量)中之溶液添加至混合物中。將混合物在rt下攪拌30 min。在觀測到完全轉化之後，將反應物用乙腈及水稀釋，過濾且藉由鹼性逆相層析(梯度溶離：30%至98%乙腈/水)純化，得到所需產物 E-8d。
以下中間物 E-8(表5)可以類似方式而無需分別分離對應中間物 E-5及 E-7來獲得。必要時，粗產物 E-8藉由層析純化。 表 5
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
E-8d 1.55 417 A
E-8e 1.67 445 A
合成 E-8p 之實驗程序 ( 方法 J) 向 E-4r(200 mg，0.59 mmol，1.0當量)及( S)‐1‐(( S)-1-甲基吡咯啶-2-基)乙-1-醇(91.8 mg，0.71 mmol，1.2當量)於乙腈(1.5 mL)中之混合物中添加三甲胺(149.8 mg，1.48 mmol，2.5當量)。將混合物在40℃下攪拌2 h。將混合物在80℃下攪拌16 h。在減壓下移除溶劑，且粗產物藉由正相層析(梯度溶離：0%至90% MeOH/DCM+氨)純化，得到所需產物 E-8p。
標記為「 J」之中間物 E-8(表6)可以類似方式獲得。必要時，粗產物 E-8藉由層析純化。 表 6
編號 方法 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
E-8p J 0.46 431 F
E-8an J 0.50 455 F
合成 E-8ch 之實驗程序 ( 方法 M) 在rt下將 E-6h(100.0 mg，0.31 mmol，1.0當量)及( S)-1,3-二甲基哌𠯤(42.5 mg，0.37 mmol，1.2當量)溶解於DMSO (1 mL)中，且添加DIPEA (115.0 µL，0.62 mmol，2.0當量)，且將混合物攪拌1 h。將混合物用乙腈及水稀釋，且藉由酸性逆相層析純化，得到 E-8ch。
標記為「 M」之中間物 E-8(表7)可以類似方式獲得。必要時，粗產物 E-8藉由層析純化。 表 7
編號 方法 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
E-8ch M 1.55 417 A
E-8cj L 1.66 432 A
本文中未明確揭示之額外腈建構嵌段 E-8揭示於WO 2021/245051及WO 2021/245055 (包括合成)中，該等各案關於此類建構嵌段 E-8、其合成及其合成用途之揭示內容以引用之方式併入本文中。彼等建構嵌段亦可用於合成本文中未特定揭示之根據本發明之額外式( I)之化合物。
流程 3a ：
合成 E-12a 之實驗程序 向 E-8aq(1.776 g，4.26 mmol，1當量)於MeOH (35 mL)中之溶液中添加氫氧化鈉於水中之溶液(16 mL，4 M，63.96 mmol，15.0當量)且將所得混合物在65℃下攪拌1.5 h。在減壓下減小反應體積以移除大部分MeOH，且用HCl水溶液(8 M)謹慎地中和剩餘水溶液。將混合物用乙腈稀釋且藉由酸性逆相層析(梯度溶離：10%至85%乙腈/水)純化，得到所需產物 E-12a。
合成 E-12e 之實驗程序 向 E-8c(2.2 g，4.97 mmol，1當量)於MeOH中之溶液中添加氫氧化鈉於水中之溶液(6.2 mL，4 M，40 mmol，5.0當量)且將所得混合物在65℃下攪拌4 h。將反應混合物在減壓下濃縮，懸浮於MeOH中，過濾且藉由酸性逆相層析(梯度溶離：10%至85%乙腈/水)純化。合併含有產物之溶離份(fraction)，在減壓下濃縮且凍乾，得到所需產物 E-12e。
以下中間物 E-12/E-12*(表8)可按類似方式，以不同中間物 E-8/E-8*為起始物質而獲得。必要時，粗產物 E-8/E-8*藉由層析純化。 表 8
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
E-12d 1.02 464 A
E-12i 0.99 464 A
流程 4a ：
合成 B-1a 之實驗程序 將CDI (18.781 g，112.352 mmol，2.0當量)溶解於無水THF中且加熱至50℃。在第二燒瓶中，將含 E-12d(13.021 g，28.088 mmol，0.5當量)及活化分子篩(molsieve)之無水THF在rt下攪拌10 min，隨後添加至CDI溶液中。將反應混合物在50℃下攪拌15 min。在第三燒瓶中，將 A-6b(15 g，56.176 mmol，1.0當量)溶解於含1 M LiHMDS溶液之THF (117.969 mL，117.969 mmol，2.1當量)中且在rt下攪拌10 min，隨後添加至活性酯中。將反應混合物在50℃下攪拌過夜。在冷卻至rt之後，將反應混合物在減壓下濃縮，用DCM稀釋且用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。用EtOAx (3×100 mL)萃取水相。合併之有機相經MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物藉由NP層析(在鹼性條件下使用MeOH/DCM 0-10%梯度)純化。將含有產物之溶離份合併且冷凍乾燥，得到 B-1a。
以下中間物 B-1/B-1*(表9)可按類似方式以不同中間物 E- 12/E-12*起始而獲得。必要時，粗產物 B-1/B-1*藉由層析純化。 表 9
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
B-1a 1.01, 1.06, 1.19 (互變異構體) 670 A
B-1c 1.02, 1.10 (互變異構體) 670 B
流程 5a ：
合成 B-6a 及 B-7a 之實驗程序 向 B-1a(12.7 g，19 mmol，1.0當量)於EtOH/水中之溶液中添加羥胺鹽酸鹽(50%含量於水中，3.131 g，47 mmol，2.5當量)且將反應混合物加熱至50℃後，持續2 h。將反應混合物在減壓下濃縮，溶解於MeOH (40 mL)中且用濃HCl (40 mL)處理。將反應混合物在60℃下攪拌1 h，在減壓下濃縮，溶解於EtOAc中且藉由謹慎地添加飽和碳酸鈉溶液來中和。用EtOAc萃取水相(三次)，合併之有機相經MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物藉由RP層析(在鹼性條件下使用ACN/水30-80%梯度)純化。含有產物之溶離份經合併且冷凍乾燥，得到 B-6a以及另一異㗁唑異構體 B-7a。
以下中間物 B-6/B-6*、 B-7/B-7*(表10)可按類似方式，以不同中間物 B-1/B-1*為起始物質而獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 10
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
B-6a 1.45 523 A
B-6c 1.60 523 A
B-7a 1.35 523 A
B-7c 1.34 523 A
流程 6a ：
合成 C-3a 之實驗程序 在氮氣下在rt下向 B-6a(1.2 g，2.3 mmol，1.0當量)於EtOH (10 mL)中之溶液中添加丙二腈(95%純度，798.2 mg，11mmol，5.0當量)、β-丙胺酸(95%純度，646 mg，6.9 mmol，3.0當量)及活化分子篩(來自Roth，200 mg)。將反應混合物加熱至80℃，持續3 h。在藉由HPLC-MS監測到完全縮合反應後，添加硫(220.9 mg，6.9 mmol，3.0當量)且將反應混合物在80℃下攪拌15 min。將反應混合物冷卻至rt，用水及EtOAc溶解且過濾。將層分離。向水相中添加4N NaOH溶液(10 mL)且用EtOAc萃取3次。合併之有機相經MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。在鹼性條件下藉由使用一定梯度之矽膠層析來純化粗產物。將含有產物之溶離份合併且冷凍乾燥，得到 C-3a。
以下中間物 C-3/C-3*及 C-4/C-4*(表11)可按類似方式，以不同中間物 B-6/B-6*及 B-7/B-7*為起始物質而獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 11
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
C-3a 1.51 603 A
C-3c 1.46 603 A
C-4a 1.41 603 A
C-4c 1.41 603 A
C-4d 1.51 575 A
C-4e 1.41 603 A
根據本發明之化合物 (I) 之合成 ： 流程 7 ：
合成化合物 Ia-1 之實驗程序 向2-氟丙烯酸(136 mg，1.51 mmol，2.6當量)及HATU (552 mg，1.452 mmol，2.5當量)於DMF (0.6 mL)中之溶液中添加TEA (353 mg，3.484 mmol，6.0當量)且將反應混合物在rt下攪拌2 min。向反應混合物中添加 C-3a(350 mg，581 mmol，1.0當量)溶解於DMF (3 mL)中之溶液，且將混合物在rt下攪拌15 min。反應完成後，將混合物用乙腈及水稀釋，過濾且藉由鹼性逆相層析(梯度溶離：30%至98%乙腈/水)純化，得到所需化合物 Ia-1。
合成化合物 Ia-2 之實驗程序 向碳酸鈉(154 mg，1.45 mmol，2.5當量)於丙酮/水(8:1)及 C-3a(350 mg，581 µmol，1.0當量)中之溶液中添加新鮮製備之丙烯醯氯於丙酮(81.3 mg，871 µmol，1.5當量)中之溶液。反應完成後，將混合物用乙腈及水稀釋，過濾且藉由鹼性逆相層析(梯度溶離：30%至98%乙腈/水)純化，得到所需化合物 Ia-2。 表 12
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
Ia-1 1.60 675 A
Ia-2 1.52 657 A
Ia-4 1.47 657 A
Ib-3 1.47 657 A
Ib-5 1.55 675 A
Ib-6 1.55 675 A
實例 4 ： 根據式 (C) 之化合物之合成 縮寫之清單(表13)
Ac 乙醯基
ACN 乙腈
aq. 水，水溶液
ATP 腺苷三磷酸
Bn 苯甲基
Boc 三級丁氧基羰基
Bu 丁基
c 濃度
CDI 1,1´-羰基二咪唑
d 天
TLC 薄層層析
DCM 二氯甲烷
DIPEA N-乙基- N,N-二異丙胺(Hünig鹼)
DMAP 4- N,N-二甲胺基吡啶
DME 1,2-二甲氧乙烷
DMF N,N-二甲基甲醯胺
DMSO 二甲亞碸
dppf 1.1´-雙(二苯基膦基)二茂鐵
equiv. 當量
ESI 電灑離子化法
Et 乙基
Et 2O 二乙醚
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
h 小時
HATU 六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)- N,N,N',N'-四甲基-
HPLC 高效液相層析
i 異
conc. 濃縮
LC 液相層析
LiHMDS 雙(三甲基矽基)醯胺鋰
m-CPBA 間氯過氧苯甲酸
Me 甲基
MeOH 甲醇
min 分鐘
MS 質譜法
NP 正相
n.a. 不可用
PBS 磷酸鹽緩衝鹽水
Ph 苯基
Pr 丙基
Py 吡啶
rac 外消旋
red. 還原
Rf (R f) 滯留因子
RP 逆相
rt 環境溫度
s 秒
SFC 超臨界流體層析
S N 親核取代
tBu 三級丁基
TEA 三乙胺
temp. 溫度
tert 三級
Tf 三氟甲磺酸酯
TFA 三氟乙酸
THF 四氫呋喃
TLC 薄層層析
t Ret. 滯留時間(HPLC)
Ts 甲苯磺酸鹽
UPLC 超高效液相層析
UV 紫外線
Wt 重量
實例本發明之特徵及優點將根據以下詳述實例變得顯而易見，該等實例藉助於實例說明本發明之原理而不限制其範疇。
根據本發明之化合物之製備除非另外陳述，否則使用化學實驗室中常用之方法在商業上可獲得設備中進行所有反應。對空氣及/或水分敏感之起始物質在保護性氣體下儲存，且與此對應之反應及操縱在保護性氣體(氮氣或氬氣)下進行。
若化合物由結構式且由其術語兩者表示，則在存在衝突之情況下，以結構式為準。
微波反應在由Biotage之引發器/反應器中或在由CEM製造之Explorer中或在由Anton Paar製造之Synthos 3000或Monowave 3000中，在密封容器(較佳2、5或20 mL)中較佳在攪拌下進行。
層析
薄層層析在由Merck製造之玻璃(具有螢光指示劑F-254)上之現成矽膠60 TLC板上進行。
根據本發明之實例化合物之 製備型高壓層析 (RP HPLC)在具有由Waters製造之管柱(名稱：SunFire™ Prep C18, OBD™ 10 µm, 50 × 150 mm或SunFire™ Prep C18 OBD™ 5 µm, 30 × 50 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 10 µm, 50 × 150 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 5 µm, 30 × 150 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 5 µm, 30 × 50 mm)及由YMC製造之管柱(名稱：Actus-Triart Prep C18, 5 µm, 30 × 50 mm)的Agilent或Gilson系統上進行。
使用不同梯度的H 2O/ACN溶離化合物，而對於Agilent系統，向水中添加5%酸性改質劑(20 mL HCOOH至1 L H 2O/ACN (1/1)) (酸性條件)。對於Gilson系統，向水中添加0.1% HCOOH。
對於Agilent系統在鹼性條件下之層析，亦使用H 2O/ACN梯度，而藉由添加5%鹼性改質劑(50 g NH 4HCO 3+ 50 mL NH 3(25%於H 2O中)用H 2O補足至1 L)使水呈鹼性。對於Gilson系統，如下使水呈鹼性：5 mL NH 4HCO 3溶液(158 g於1 L H 2O中)及2 mL NH 3(28%於H 2O中)用H 2O補充至1 L。
中間物及根據本發明之實例化合物的 超臨界流體層析 (SFC)在具有以下管柱之JASCO SFC系統上進行：Chiralcel OJ (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak AD (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak AS (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak IC (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak IA (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralcel OJ (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralcel OD (250 × 20 mm, 5 µm)、Phenomenex Lux C2 (250 × 20 mm, 5 µm)。
中間物及最終化合物之 分析型 HPLC ( 反應控制 )係使用由Waters製造之管柱(名稱：XBridge TMC18, 2.5 µm, 2.1 × 20 mm或XBridge TMC18, 2.5 µm, 2.1 × 30 mm或Aquity UPLC BEH C18, 1.7 µM, 2.1 × 50mm)及由YMC製造之管柱(名稱：Triart C18, 3.0 µm, 2.0 × 30 mm)以及由Phenomenex製造之管柱(名稱：Luna C18, 5.0 µm, 2.0 × 30 mm)進行。分析設備在各情況下亦配備有質量偵測器。
HPLC 質譜法 /UV 光譜法使用HPLC-MS設備(具有質量偵測器之高效液相層析)產生表徵根據本發明之實例化合物的滯留時間/MS-ESI +。在注射峰值處溶離之化合物給出滯留時間t Ret.= 0.00。 方法 A HPLC                    Agilent 1100系統 MS                       1200系列LC/MSD (API-ES+/-3000V，Quadrupol，G6140) MSD信號設定         掃描正/負120 - 900m/z 偵測信號                315 nm (頻寬170nm，參考關閉) 光譜範圍                230 - 400 nm 峰寬                      ＜0.01 min 管柱                      Waters，Xbridge C18，2.5 µm，2.1×20 mm管柱 管柱溫度                60℃ 溶劑                      A：20mM NH 4HCO 3水溶液/ NH3 pH 9 B：ACN HPLC級 流量                      1.00 mL/min 梯度                      0.00 - 1.50 min         10 %至95 % B 1.50 - 2.00 min         95 % B 2.00 - 2.10 min         95 %至10 % B 方法 B HPLC                    Agilent 1260系統 MS                       1200系列LC/MSD (MM-ES+APCI +/- 3000 V，Quadrupol，G6130) 偵測                           UV：254 nm (頻寬8，參考關閉) UV：230 nm (頻寬8，參考關閉) UV光譜範圍：190 - 400 nm；步長：4 nm MS：正及負模式 質量範圍                100 - 800 m/z 管柱                      Waters；零件號186003389；XBridge BEH C18，2.5 µm，30 × 2.1 mm 管柱溫度                45℃ 溶劑                      A：5 mM NH 4HCO 3/19 mM NH 3/H 2O；B：ACN (HPLC級) 流量                      1.40 mL/min 梯度                      0.00 - 1.00 min：5 % B至100 % B 1.00 - 1.37 min：100 % B 1.37 - 1.40 min：100 % B至5 % B 方法 C HPLC                    Agilent 1260系列 MS                       Agilent LC/MSD Quadrupole 偵測                      MS：正及負模式 質量範圍                100 - 750 m/z 管柱                      Waters X-Bridge BEH C18，2.5 µm，2.1 × 30 mm XP 管柱溫度                45℃ 溶劑                      A：20 mM NH 4HCO 3/30 mM NH 3/H 2O；B：ACN (HPLC級) 流量                      1.40 mL/min 梯度                      0.00 - 1.00 min：15% B至95% B 1.00 - 1.30 min：95 % B 方法 E HPLC                    Agilent 1100/1200系統 MS                        1200 Series LC/MSD (MM-ES + APCI +/- 3000 V，Quadrupol，G6130B) MSD信號設定     掃描正/負150 - 750 偵測信號              UV 254 nm，230 nm，214 nm (頻寬8，參考關閉) 光譜                     範圍：190 - 400 nm；狹縫：4 nm 峰寬                     ＞ 0.0031 min (0.063 s反應時間，80Hz) 管柱                     Waters，零件號186003389，XBridge BEH C18，2.5 µm，2.1 × 30 mm)管柱 管柱溫度                45℃ 溶劑                      A：5 mM NH 4HCO 3/18 mM NH 3/H 2O (pH = 9.2) B：ACN (HPLC級) 流量                      1.4 mL/min 梯度                      0.0 - 1.0 min            15 %至95 % B 1.0 - 1.1 min            95 % B 停止時間：1.3 min 方法 SFC-1 製備                      Waters UPC 2-MS 軟體                      Empower3 MS                        QDa 管柱                      CHIRALCEL OX-3(4.6*150MM) 3µm A-溶劑                  CO2 B-溶劑                   ACN 總流量                   3g/min 共溶劑之百分比      15 ABPR                    1500psi 管柱溫度                30℃ PDA範圍                200nm至400nm 解析度                   1.2nm MS參數                  - QDa MS掃描範圍    100Da至1000Da 錐孔電壓 正掃描                   20V 負掃描                   15V 負掃描                   15V
根據本發明之化合物及中間物藉由下文描述之合成方法製備，其中通式之取代基具有上文給出之含義。此等方法意欲作為本發明之說明，而不限制其主題及此等實例所主張之化合物的範疇。在未描述起始化合物之製備之情況下，其為商業上可獲得的或其合成描述於先前技術中或其可類似於已知先前技術化合物或本文中所描述之方法而製備，亦即合成此等化合物在有機化學工作者之技能內。文獻中所描述之物質可根據公開之合成方法製備。若描繪以下化學結構而無立體中心(例如，經不對稱取代之碳原子)之確切組態，則兩種組態應視為包括且揭示於此表示中。呈外消旋形式之立體中心的表示應始終視為包括且揭示兩種鏡像異構物(若不存在其他經定義立體中心)或所有其他潛在非鏡像異構物及鏡像異構物(若存在額外經定義或未經定義之立體中心)。
螺酮中間物 A 之 合成 合成 A-2a 之實驗程序
在0℃下向5-氯戊腈(22.9 g，195 mmol，1.00當量)於EtOH (136 mL)中之懸浮液中逐滴添加乙醯氯(111 mL，1.56 mol，8.00當量)。將反應混合物升溫至rt且攪拌12 h。將混合物在減壓下濃縮且用Et 2O洗滌，且粗產物 A-2a不經進一步純化即在下一步驟中直接用作HCl鹽(HPLC方法：A；t ret= 1.03 min；[M+H] += 164)。
合成 A-3a 之實驗程序 將粗 A-2a(HCl鹽) (28.0 g，140 mmol，1.00當量)及乙二醇(7.38 g，119 mmol，0.90當量)溶解於DCM (300 mL)中且在rt下攪拌6 d。將所得懸浮液在減壓下濃縮，用Et 2O (200 mL)稀釋且過濾。將濾液在減壓下濃縮，溶於DCM (200 mL)中且用KOH溶液(2 M於水中，150 mL)處理。將混合物在rt下攪拌過夜，保持各相完整。將各相分離，用DCM (2×)萃取水相，且合併之有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗原酸酯 A-3a不經進一步純化即用於下一步驟(HPLC方法：A；t ret= 1.37 min；[M+H] += 163)。
合成 A-4a 之實驗程序 將粗 A-3a(22.3 g，107 mmol，1.00當量)、1-環己烯氧基三甲基矽烷(16.4 mL，82.3 mmol，0.80當量)及氯化鋅(10.2 g，74.8 mmol，0.70當量)溶解於DCM (120 mL)中且在rt下攪拌5 h。藉由添加飽和碳酸氫鈉溶液來處理反應混合物。將有機相分離，經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物藉由NP層析純化，得到所需化合物 A-4a(HPLC方法：A；t ret= 1.25 min；[M+H] += 283)。
合成 A- 5a 之實驗程序 將 A-4a(14.9 g，57.1 mmol，1.00當量)及碘化鈉(25.9 g，171 mmol，3.00當量)溶解於丙酮(120 mL)中且在回流下攪拌16 h。將反應混合物在減壓下濃縮，用DCM稀釋且用飽和硫代硫酸鈉溶液洗滌。將有機相分離，經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物 A-5a不經進一步純化即用於下一步驟。
合成 A-6b 之實驗程序 將 A-5a(30.0 g，85.0 mmol，1.00當量)溶解於THF中。在0℃下用三級丁醇鉀(28.7 g，256 mmol，3.0當量)處理混合物且在rt下攪拌過夜。反應混合物藉由添加水(2 mL)淬滅，藉由添加Et 2O及飽和碳酸氫鈉溶液稀釋。將有機相分離，經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物藉由NP層析純化，得到(外消旋)化合物 A-6a(HPLC方法：A；t ret= 1.17 min；[M+H] += 225)。
反應順序 A-1a A-6a係基於Marko等人, THL 2003, 44, 3333-3336及Maulide等人, Eur. J. Org. Chem. 2004, 19:3962-3967。
可接著在經由SFC之對掌性分離(使用Lux Cellulose-4管柱(250×30mm，5µm)，30℃管柱溫度，90% CO 2，10% ACN作為共溶劑)之後獲得鏡像異構物 A-6b，其中鏡像異構物 A-6b(HPLC方法：A；t ret= 1.17 min；[M+H] += 225/SFC方法：SFC-1；t ret= 2.99 min)作為第2峰在另一鏡像異構物之後溶離。
合成 A-6b 之替代程序
步驟 1 在氮氣下向乾燥及清潔反應器中裝入甲苯(234 L) (注意：此反應總計2.5V甲苯)。添加水(1.56 kg，85.5 mol，保持H 2O:Pd = 160:1)，隨後在氮氣下用1,1,3,3-四甲基胍(175.5 kg，1527.6 mol，2.0當量)沖洗進料管線，且接著用甲苯(13 L)沖洗。在氮氣下添加 A-7a(130.0 kg，763.8 mol)，隨後用甲苯(13 L)沖洗。在氮氣下添加乙酸烯丙酯(98.8 kg，992.9 mol，1.3當量)且用甲苯(13 L)沖洗。在攪動下，使混合物在0.5 h內冷卻至10℃。藉由用氮氣使溶液鼓泡約30 min來使批料脫氣。添加含(S,S)-DACH-Ph Trost配位體(0.429 kg，0.619 mol，0.081 mol%)之脫氣甲苯(13 L) (注意：保持Pd:配位體=1:1.15)，接著用脫氣甲苯(13 L)沖洗。添加含烯丙基氯化鈀(II)二聚體(97.5 g，267 mol，0.035 mol%)之脫氣甲苯(13 L)，接著用脫氣甲苯(13 L)沖洗。批料在10-15℃下保持至少8 h。在藉由HPLC完成反應之後，在低於25℃下添加N-乙醯基-L-半胱胺酸(3.9 kg，22.9 mol，0.03當量)於水(260 L)中之溶液。將所得溶液升溫至20-25℃且保持在20-25℃下至少1 h。在相切割以捨棄底部水層之後，添加10 wt% NH 4Cl水溶液(260 L)。在將混合物攪動10 min之後，排出底部水層。進一步用水(130 L)洗滌有機相。有機層經由極短矽藻土墊過濾且用甲苯(65 L)沖洗反應器及矽藻土床。將濾液裝入清潔反應器中，且接著在真空下在40-50℃下餾出甲苯。粗產物直接用於下一步驟，或該產物藉助於最少量之甲苯(65 L)排出至容器中且在20-23℃下儲存。150 kg A-8a通常以淡黃色油狀物形式獲得，產率為96%，對映體比率≥ 90:10。
1H NMR (500 MHz, CDCl 3): δ 5.75 (ddt, J = 14.8, 9.4, 7.5 Hz, 1H), 5.06-5.00 (m, 2H), 4.19 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.61 (dd, J = 13.9, 7.1 Hz, 1H), 2.51-2.43 (m, 3H), 2.33 (dd, J = 13.9, 7.9 Hz, 1H), 2.03-1.98 (m, 1H), 1.78-1.60 (m, 3H), 1.50-1.42 (m, 1H), 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C NMR (125 MHz, CDCl 3): δ 207.7, 171.6, 133.5, 118.4, 61.3, 61.0, 41.3, 39.4, 35.9, 27.7, 22.6, 14.3. ESI-MS: m/z 211 [M+H] +。
步驟 2 向含有來自步驟1之 A-8a(150 kg，713.4 mol)之反應器(少於1V甲苯，若使用)中添加乙二醇(600 L)，得到黃色雙相混合物。在將混合物冷卻至10-15℃之後，以將內部溫度維持在20-30℃之間的速率添加TMSCl (193.5 kg，1783.5 mol，2.5當量)，歷時不少於15 min (獲得橙色雙相混合物)。需要充分攪動以達成混合。在將批料在20-25℃下保持2 h之後，停止攪動，且在20-25℃下保持至少15 min。將批料冷卻至0-5℃。以將內部溫度維持在低於20℃之速率添加含NaOH (96 kg，1854.8 mol，2.6當量)之水(600 L) (獲得淡黃色混濁雙相混合物)。添加甲苯(300 L)，且接著攪動批料10 min。在相切割以排出底部水層(注意：可在相界(interphase)處形成一些沉澱物)之後，用水(300 L)洗滌有機層兩次。有機相經由短矽藻土墊過濾以移除不可溶固體/相界。將有機溶液裝入清潔及乾燥反應器中且接著在40-50℃下餾出溶劑，得到最小可攪拌體積。粗產物 A-9a(189 kg，95.2 wt%，100%產率)藉助於最少量之甲苯排出至容器中。
1H NMR (500 MHz, CDCl 3): δ 5.65 (ddt, J = 14.7, 8.1, 6.6 Hz, 1H), 5.07-4.98 (m, 2H), 4.20-4.10 (m, 2H), 3.97-3.88 (m, 4H), 2.81 (dd, J = 13.9, 6.6 Hz, 1H), 2.35 (dd, J = 13.9, 8.1 Hz, 1H), 2.04-1.98 (m, 1H), 1.75-1.35 (m, 7H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C NMR (125 MHz, CDCl 3): δ 173.7, 134.3, 117.6, 110.9, 65.0, 64.7, 60.5, 54.6, 36.2, 32.3, 30.3, 23.3, 20.9, 14.4. ESI-MS: m/z 255 [M+H] +。
步驟 3 在氮氣下向乾燥及清潔反應器中添加9-BBN (688.5 kg，401 mol，1.2當量)。將溶液冷卻至0-5℃以獲得漿料。在0-5℃下添加來自步驟2之 A-9a(85.0 kg，334.2 mol)且用THF (40 L)沖洗。使混合物在1 h內升溫至20-23℃且在20-23℃下保持不少於1 h。此後將混合物冷卻至-45至-40℃，一次性添加氯乙酸甲酯(69.6 kg，1.3當量)，隨後逐滴添加LiHMDS (909.5 kg，1102.9 mol)，同時使溫度保持低於-35℃。接著使批料在1 h內升溫至20-23℃且接著在20-23℃下保持至少18 h。藉由在真空下在加熱(35℃)下蒸餾來移除約12-13 V溶劑。添加EtOH (255 kg)，隨後添加NaOH (13.4 kg)於H 2O (212.5 L)中之溶液。將混合物在回流下(在66-70℃下)加熱至少14 h。
此後，在回流下藉由蒸餾移除約5-6 V溶劑，將批料冷卻至20-25℃且接著經由短矽藻土墊過濾以移除不可溶物質且用庚烷(160 L)沖洗。在真空下在40-50℃下蒸餾約5-6 V溶劑(或大部分殘餘THF及乙醇)。將批料冷卻至20-25℃。此後，添加水(255 L)，用庚烷(2364.8 kg)萃取粗產物兩次。合併之庚烷層用水(85 L)洗滌一次。在藉由在真空下在40-50℃下蒸餾移除溶劑之後，以52.6%分析產率獲得呈黃色油狀物之粗產物(52.7 kg，87.5 wt%)。粗產物 A-6b直接用於下一步驟。
1H NMR (500 MHz, CDCl 3): δ 4.01-3.82 (m, 4H), 2.50-2.44 (m, 1H), 2.382.34 (m, 1H), 2.28-2.22 (m, 1H), 2.11-2.05 (m, 1H), 2.01-1.95 (m, 1H), 1.92-1.86 (m, 1H), 1.81-1.58 (m, 6H), 1.54-1.43 (m, 3H), 1.27-1.18 (m, 1H). ESI-MS: m/z 225 [M+H] +。
醇、吡唑及甲苯磺酸鹽中間物 B 之合成 合成 B-2a 之實驗程序
將 B-1a(4.92 g，19.1 mmol，1.00當量)、N,N'-羰基二咪唑(5.14 g，28.6 mmol，1.50當量)及分子篩(3A，500 mg)溶解於DCM (29.5 mL)中且在rt下攪拌40 min。在完全活化之後，添加N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(2.79 g，28.6 mmol，1.50當量)且將反應物在rt下再次攪拌2 h。在完全轉化之後，添加水(100 mL)及DCM (150 mL)且將各相分離，用DCM (2×)萃取水相。用鹽水洗滌合併之有機相且在減壓下濃縮。殘餘物藉由NP層析純化，得到產物 B-2a。
以下中間物 B-2(表14)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 1 4
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
B-2a 0.43 189 ([M+H-Boc] +) C
B-2b 0.47 177 ([M+H-Boc] +) C
B-2d 0.44 189 ([M+H-Boc] +) C
合成 B-3a 之實驗程序 在氬氣氛圍下將 B- 2a(4.88 g，16.9 mmol，1.00當量)溶解於THF (15 mL)中且冷卻至-10℃。添加溴(甲基)鎂(3.4 M於MeTHF中，6.46 mL，22.0 mmol，1.3當量)且在-10℃下攪拌1 h。在完全轉化之後，將反應混合物冷卻至-20℃且藉由添加鹽水淬滅。用DCM (3×)萃取所得混合物。將合併之有機相在減壓下濃縮以獲得 B-3a。
以下中間物 B-3(表15)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 15
編號 結果 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
B-3a 0.97 144 ([M+H-Boc] +) A
B-3b 0.50 132 ([M+H-Boc] +) C
B-3d 0.48 144 ([M+H-Boc] +) C
合成 B-4a 之實驗程序 在氬氣氛圍下將( R)-甲基㗁唑硼啶(0.99 g，3.3 mmol，0.20當量)溶解於THF (2 mL)中且冷卻至-5℃。添加硼烷-甲硫醚複合物(1.0 M，22 mL 22.0 mmol，1.3當量)。將混合物在rt下攪拌30 min。將混合物冷卻至-5℃且逐滴緩慢添加 B-3a(4.1 g，17 mmol，1當量)。將反應物在rt下攪拌1 h。在起始物質完全轉化之後，將反應物冷卻至-10℃且藉由添加MeOH淬滅。將混合物在減壓下濃縮。將殘餘物溶解於水(150 mL)及甲酸(0.5 mL)中且用DCM (3×)萃取。將合併之有機相在減壓下濃縮且藉由NP層析純化，得到產物 B-4a。
以下中間物 B-4(表16)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 16
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
B-4a 0.44 190 ([M+H-tBu] +) C
B-4b 0.46 178 ([M+H- tBu] +) C
B-4d 0.44 190 ([M+H- tBu] +) C
合成 B-5a 之實驗程序 在氬氣氛圍下將 B-4a(306 mg，12.5 mmol，1.00當量)溶解於THF (30.6 mL)中。緩慢添加鋁氫化鋰(1 M於THF中，24.9 mL，25.0 mmol，2.00當量)。將反應物在60℃下攪拌1 h。在完全轉化之後，將反應物冷卻至rt，添加羅謝爾(Rochelle)鹽溶液及KOH且攪拌1 h。用DCM (3×)萃取現有懸浮液，將合併之有機相在減壓下濃縮，得到 B-5a。
以下中間物 B-5(表17)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 17
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
B-5a 0.92 160 A
B-5b 0.92 148 A
B-5d 0.07 160 C
醇、吡唑及甲苯磺酸鹽中間物 B 之合成 合成 B-11a 之實驗程序
將1H-吡唑-3-甲酸(500 mg，4.46 mmol，1.00當量)溶解於ACN (4.5 mL)中。添加吡咯啶(745 µL，8.92 mmol，2.00當量)、DIPEA (1.50 mL，8.92 mmol，2.00當量)及1-丙烷膦酸酐(2.00 mL，6.69 mmol，1.50當量)且將反應混合物在rt下攪拌1 h，直至完全轉化。將反應混合物用飽和NaHCO 3稀釋且用DCM萃取，且將有機相乾燥，過濾，且在真空下移除溶劑。粗產物經由NP層析純化以獲得 B-11a(HPLC方法：C，t ret= 0.14 min；[M+H] += 166)。
合成 B-15a 之實驗程序 將3-乙炔基氧雜環丁烷-3-醇(120 mg，1.16 mmol，1.00當量)及(三甲基矽基)重氮甲烷(2 M溶液於己烷中，2.00 mL，4.00 mmol，3.46當量)合併且在密閉小瓶中在50℃下攪拌3 h，直至完全轉化。將反應混合物冷卻至rt，用MeOH稀釋，且在真空中移除溶劑，以獲得粗 B-15a(HPLC方法：C，t ret= 0.08 min；[M+H] += 141)。粗產物不經純化即用於下一步驟。
酯及酸 E 之合成 合成中間物 E-9a 之實驗程序 ：
將4,6-二氯嘧啶-2-甲酸 E-8a(900 mg，4.66 mmol，1.00當量)溶解於DMSO (2 mL)中且逐滴添加DIPEA (1.5 mL，8.8 mmol，2.0當量)及(S)-3-甲基-1,4-二氮雜環庚烷-1-甲酸三級丁酯(1.04 g，4.896 mmol，95%純度，1.05當量)。接著將反應混合物在40℃下攪拌18 h。將混合物用ACN稀釋且藉由RP層析純化，得到所需產物 E-9a(HPLC方法：A，t ret= 0.82 min；[M+H] += 371)。
合成中間物 E-11a 之實驗程序 ： 將 E-10a(3.00 g，14.5 mmol，1.00當量)溶解於DCM (30 mL)中且添加DIPEA (5.34 mL，29 mmol，2.0當量)及 B-5b(3.20 g，21.8 mmol，1.5當量)。接著將反應混合物在rt下攪拌18 h。在完全轉化之後，濃縮混合物，添加水且用EtOAc萃取混合物，且用鹽水洗滌有機相，乾燥，過濾且濃縮。粗產物藉由NP層析純化，產生 E-11a。
以下中間物 E-11(表18)可以類似方式獲得。必要時，粗產物 E-11藉由層析純化。 表 18
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
E-11a 1.13 318 A
E-11c 0.67 207 A
合成 E-11e 之實驗程序： 將 B-5a(100 mg，0.48 mmol，1.00當量)溶解於THF (500 µL)中，添加LiHMDS (591 µL，0.59 mmol，1.10當量)且攪拌5 min。同時將4,6-二氯嘧啶-2-甲酸甲酯(170 mg，0.81 mmol，1.5當量)溶解於THF (500 µL)中。將 B-5a之溶液逐滴添加至4,6-二氯嘧啶-2-甲酸甲酯溶液中，歷時5 min。將反應物攪拌25 min。在觀測到起始物質完全轉化之後，將反應物過濾且藉由RP層析純化，得到 E-11e(HPLC方法：A，t ret= 1.08 min；[M+H] += 330)。
二酮 F 之合成 當報導多個HPLC滯留時間時，其意謂存在不同互變異構體。
合成 F-4a 之實驗程序 將 A-6b(1.4 g，5.31 mmol，1.1當量)及溴化鎂二乙基醚合物(2.5 g，9.66 mmol，2.0當量)溶解於DCM (10.0 mL)中。逐滴添加溶解於DCM (10 mL)中之 F-3a(1.0 g，4.83 mmol，1.0當量)。添加DIPEA (2.1 mL，12.08 mmol，2.5當量)且將反應混合物在rt下攪拌7 h。反應物用1 M HCl淬滅，用DCM及水稀釋。將有機相分離、蒸發，且所得殘餘物藉由RP層析純化，得到 F-4a(HPLC方法：C，t ret= 0.633 min；[M+H] += 399)。
合成 F-5a 之實驗程序 在氮氣氛圍下將4,6-二氯嘧啶-2-甲酸甲酯(2.00 g，9.67 mmol，1.00當量)溶解於無水ACN (5 mL)中。添加溴化鎂二乙基醚合物(2.99 g，11.6 mmol，1.20當量)、 A-6b(2.38 g，10.6 mmol，1.10當量)於ACN (5 mL)中之溶液及DIPEA (2.67 mL，14.5 mmol，1.50當量)，且將反應混合物在50℃下攪拌20 h。在完全轉化之後，反應混合物謹慎地用HCl (1 M)淬滅，用水稀釋，用DCM萃取，且將有機相乾燥、過濾且濃縮以獲得粗 F-5a。粗化合物藉由正相層析(HPLC方法：H，t ret= 2.50min；[M+H] = 399/401)純化。
合成 F-8a 之實驗程序 將 F-4a(1.27 g，2.77 mmol，1.0當量)溶解於二㗁烷(10 mL)中且添加碳酸銫水溶液(2 M，3.46 mL，6.93 mmol，2.5當量)且在80℃下攪拌15 min。接著向反應混合物中添加吡啶-4-硼酸(357 mg，2.91 mmol，1.1當量)及Pd(dppf)Cl 2CH 2Cl 2(238 mg，0.28 mmol，0.1當量)且在90℃下攪拌30 min，直至觀測到起始物質完全轉化。將反應混合物過濾且用水稀釋且用DCM萃取三次。蒸發有機相，且將殘餘物溶解於DMF中且藉由RP層析純化，得到所需產物 F-8a(HPLC方法：C，t ret= 0.80 / 86 min；[M+H] = 440)。
合成 F-9a 之實驗程序 將 F-5a(10.0 g，19.4 mmol，1.00當量)溶解於DMSO (10 mL)中，添加(1S)-1-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]乙醇(2.76 g，21.4 mmol，1.10當量)及DIPEA (6.78 mL，38.8 mmol，2.0當量)且將溶液在rt下攪拌過夜。用DCM及水稀釋反應混合物。將有機相分離、蒸發，且所得殘餘物藉由RP層析純化，得到 F- 9a(HPLC方法：A，t ret= 1.58/1.66 min；[M+H] = 492)。
合成 F-11a 之實驗程序 在氬氣氛圍下將 E-9a(1.05 g，2.83 mmol，1.00當量)及1-(1H-咪唑-羰基)-1H-咪唑(918 mg，5.66 mmol，2.00當量)溶解於THF (5 mL)中且在rt下攪拌1 h。在酸完全活化之後，將 A-6b(1.34 mg，5.98 mmol，2.00當量)及LiHMDS (1.0 M於THF中，5.95 mL，5.95 mmol，2.10當量)之溶液添加至反應混合物且用THF (5 mL)洗滌。將所得混合物在60℃下攪拌過夜。在完全轉化之後，將反應混合物用飽和NaHCO 3水溶液稀釋且用DCM萃取三次。將有機相合併，乾燥，過濾且在減壓下濃縮。將粗產物溶解於ACN及水中，過濾且藉由鹼性RP層析純化，得到所需產物 F-11a(HPLC方法：C，t ret= 0.888/0.936/0.978 min；[M+H] = 557)。
合成 F-12a 之實驗程序 將 E-11e(1.80 g，0.01 mol，1當量)溶解於THF (18 mL)中，添加活化分子篩3Å (200 mg/1 ml溶劑)且在50℃下在氬氣氛圍下攪拌20 min。接著添加溴化鎂乙基醚合物(2.11 g，0.01 mol，1.5當量)且進一步在50℃下攪拌30 min。同時，使用含亦在50℃下使用活化分子篩3Å預乾燥20 min之 A-6b(1.47 g，0.01 mmol，1.5當量)之THF (8 ml)製備第二溶液。接著添加LiHMDS (1 M於THF中，13.7 mL，0.01 mol，2.5當量)且攪拌15 min。此後，將第二溶液添加至第一溶液中且在50℃下攪拌1 h。在完全轉化之後，反應混合物謹慎地用水淬滅，在減壓下移除THF。藉由使用1N HCl將殘餘物pH調整至7-8且用5% MeOH/DCM (2×)萃取，將合併之有機層用鹽水溶液洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮以獲得粗 F-12a。粗化合物藉由NP層析純化。
以下中間物 F-12(表19)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 19
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
F-12a 5.69 6.00 6.13 522 I
F-12b 1.61 1.78 510 H
F-12c 1.62 1.75 510 H
異㗁唑中間物 G 之 合成 合成 G-9a 及 G-10a 之實驗程序
將 F-11a(1.10 g，1.91 mmol，1.0當量)溶解於1,4-二㗁烷(3 mL)中且添加羥胺(50%於水中，140 µL，2.29 mmol，1.2當量)。將反應混合物在rt下攪拌過夜。在完全轉化之後，將反應混合物用飽和NaHCO 3水溶液稀釋且用DCM萃取三次。將有機相合併，乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到粗產物。
將 G-9a及 G-10a之粗混合物(1.0 g，1.68 mmol，1.0當量)溶解於1,4-二㗁烷(6 mL)中且添加HCl (4 M於水中，2.11 mL，8.44 mmol，5.0當量)。將反應混合物在rt下攪拌3 h。在完全轉化之後，將反應物用飽和NaHCO 3水溶液稀釋且用DCM萃取三次。將有機相合併，乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到粗產物。將粗產物溶解於ACN及水中，過濾且藉由鹼性RP層析純化，得到所需產物 G-11a及 G-12a。
以下中間物 G-11及 G-12(表20)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 20
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G-11a 0.67 430 C
G-11b 1.57 445 A
G-11c 1.52 463 A
G-12b 1.62 445 A
G-11e 3.01 475 K
合成 G-35a 之實驗程序 將 G-12b(140 mg，0.31 mmol，1.0當量)溶解於二㗁烷(2mL)中。添加[1-(氧雜環丁烷-3-基)-1H-吡唑-3-基]硼酸( B-9c) (66.3 mg，0.38 mmol，1.19當量)、XPHOS PD G3 (29.9 mg，0.03 mmol，0.1當量)及碳酸銫(400 µl，0.80 mmol，2.54當量)。將反應物在80℃下在氬氣氛圍下攪拌10 min。在觀測到完全轉化之後，用DCM/水萃取反應物。將合併之有機相在減壓下濃縮，溶解於ACN/水中且藉由RP層析純化，得到所需產物 G-35a。
合成 A-10a 之實驗程序 在氮氣下向乾燥及清潔反應器中裝入9-BBN (387 mL，193.5 mmol，1.2當量，0.5 M於THF中)。將溶液冷卻至0-5℃以獲得漿料。在0-5℃添加 A-9a(41.0 g，161.2 mmol)且用THF (20.5 mL)沖洗。使混合物在1 h內升溫至20-23℃且在20-23℃保持不少於1 h。在將混合物冷卻至-45至-40℃後，一次性添加氯乙酸甲酯，隨後逐滴添加LiHMDS (355 mL，532.0 mmol，3.3當量)，同時使溫度保持低於-35℃。接著使批料在1 h內升溫至20-23℃且接著在20-23℃保持至少18 h。將批料冷卻至5-10℃，在低於20℃添加AcOH (30.4 mL，3.3當量)，隨後在低於20℃添加水(41 mL)。在低於20℃添加AcOH (30.4 mL，3.3當量)以達到pH約6-7。在低於35℃在真空下移除約15-16 V之THF。添加MTBE (246 mL)及水(205 mL)。在相切割以丟棄底部水層之後，將混合物冷卻至0-5℃，在低於20℃添加過碳酸鈉(37.2 g，322.4 mmol，2.0當量)於水(320 mL)中之溶液。在20-23℃下1 h後，添加20 wt%亞硫酸鈉溶液(31 mL)。在20-23℃下15 min之後，將底部水層分離且丟棄。用5 wt%氯化銨溶液(123 mL)及水(328 mL)洗有機層。在過濾之前，用5%活性碳處理有機層30 min。在真空下在低於35℃移除約4-5 V溶劑之後，獲得呈橙-棕色油狀之粗產物 A-10a(80%產率，HPLC方法：C，t ret= 0.84 min；[M+H] += 283)。
合成 G-70a 之實驗程序 向反應器中裝入 A-10a(45.5 g，161.2 mmol)、乙醇(91.0 mL)、NaOAc (39.7 g，483.6 mmol，3.0當量)、水(45.5 mL)及NH 2OH·HCl (33.6 g，483.6 mmol，3.0當量)。將混合物在73-78℃加熱不少於16 h。在批料冷卻至20-23℃之後，添加水(227.6 mL)0.5 h。接著添加MTBE (136.5 mL)0.5 h，隨後添加庚烷(113.8 mL)1 h。在20-23℃下0.5 h之後，藉由過濾收集固體。用MTBE (45 mL)及水(91.0 mL)連續洗固體。在真空下乾燥固體，得到40%產率之呈灰白色固體之產物 G-70a(18.27 g，93.2 wt%)。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 11.48 (br s, 1H), 4.04 (q, J = 6.0 Hz, 1H), 3.89-3.80 (m, 2H), 3.60 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 2.10-1.95 (m, 2H), 1.92-1.76 (m, 4H), 1.69-1.39 (m, 8H). ESI-MS: m/z 266 [M+H] +。
合成 G-71a 之實驗程序 向清潔反應器中裝入 G-70a(100.0 g，376.9 mmol，1.0當量)及K 3PO 4(240.0 g，1130.8 mmol，3.0當量)於水(499.0 g，500.0 mL)及甲苯(432.5 g，500.0 mL)中。攪動雙相混合物以充分混合。在將混合物冷卻至0~5℃之後，在低於5℃用注射泵添加Tf 2O (186.0 g，110.9 mL，659.6 mmol，1.750當量)2 h。在相切割之後，有機層經由矽藻土床用Na 2SO 4過濾。在用甲苯(50 mL)沖洗之後，粗產物 G-71a(149.8 g，100%產率)直接用於下一步驟。
1H NMR (500 MHz, CDCl 3): δ 3.95-3.91 (m, 3H), 3.77-3.74 (m, 1H), 2.51-2.44 (m, 2H), 2.16-1.80 (m, 4H), 1.77-1.48 (m, 8H). ESI-MS: m/z 398 [M+H] +。
合成 G-72a 之實驗程序 向乾燥及清潔高壓釜反應器中裝入 G-71a(750 g，1.89 mol，1當量)、Pd(OAc) 2(8.48 g，37.7 mmol，0.02當量)、rac-BINAP (23.5 g，37.7 mmol，0.02當量)、2-MeTHF (3 L)、EtOH (870 g，18.9 mol，10當量)及DIPEA (293 g，2.26 mol，1.2當量)。反應器用氮氣(100 psi)吹掃兩次且接著用CO (100 psi)吹掃兩次。將反應器加壓至200 psi CO且在55-60℃下加熱不少於12 h。將混合物轉移至反應器中且用反應器中之2-MeTHF (0.75 L)沖洗高壓釜反應器。用水(3.75 L)洗滌混合物。在經由短矽藻土墊過濾之後，藉由真空蒸餾移除溶劑，得到粗產物 G-72a(531.9 g，87.7%產率)，其不經純化即用於下一步驟。
1H NMR (400 MHz, CDCl 3): δ 4.38 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.95-3.85 (m, 3H), 3.76-3.73 (m, 1H), 2.85 (dt, J = 17.5, 5.5 Hz, 1H), 2.64 (ddd, J = 17.5, 9.6, 6.0 Hz, 1H), 2.22-2.14 (m, 1H), 2.04-1.88 (m, 3H), 1.78-1.45 (m, 8H), 1.37 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI-MS: m/z 322 [M+H] +。
合成 G-73a 之實驗程序 向乾燥及清潔反應器裝入 G -72a(482.0 g，1.5 mol，1當量)及EtOH (3 V)，且真空蒸餾約3 V以自先前羰基化步驟移除殘餘2-MeTHF。添加EtOH (1.45 L)及NH 4OH (1.93 L)。將混合物在20-25℃下保持不少於15 h。添加水(1.69 L)，歷時30 min。在20-25℃下30 min之後，收集固體且用1:2 EtOH/水(0.96 L)及水(0.48 L)洗滌。固體在1:1 MTBE/己烷(0.96 L)中漿化1 h。藉由過濾收集固體且在真空下在40-45℃下乾燥過夜，得到呈茶色固體狀之產物 G-73a(332.4 g，75.8%產率，基於卡爾費雪滴定(Karl Fischer titration)之含水量≤ 0.5%)。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 8.05 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 3.94-3.72 (m, 4H), 2.78 (dt, J = 17.1, 5.0 Hz, 1H), 2.54-2.48 (m, 1H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.93-1.78 (m, 3H), 1.70-1.42 (m, 8H). ESI-MS: m/z 293 [M+H] +。
合成 G-74a 之實驗程序 向乾燥及清潔反應器中裝入 G-73a(383 g，86.7重量%，1.137 mol，1當量)、MeCN (1.15 L)及吡啶(216 g，0.19 L，2.4當量)。在將混合物冷卻至0-5℃之後，在低於5℃下添加三氟乙酸酐(287 g，1.36 mol，1.2當量)。在0-5℃下5 min之後，在低於15℃下添加水(1.54 L)。將產物用MTBE (1.92 L)萃取且用5%碳酸氫鈉溶液(1.15 L)洗滌。有機層經由矽膠墊(380 g)過濾且用MTBE (0.58 L)沖洗。在藉由真空蒸餾移除溶劑之後，獲得呈紅棕色油狀物之產物 G-74a(421.8 g，97.8%產率)。
1H NMR (500 MHz, CDCl 3): δ 3.98-3.85 (m, 3H), 3.80-3.75 (m, 1H), 2.72 (dt, J = 17.0, 5.2 Hz, 1H), 2.60 (ddd, J = 17.0, 9.5, 5.8 Hz, 1H), 2.20-2.12 (m, 1H), 2.07-1.94 (m, 3H), 1.82-1.48 (m, 8H). ESI-MS: m/z 275 [M+H] +。
合成 G-76a 之實驗程序 向乾燥燒瓶中裝入含粗 G-74a(265 g，72.3重量%，698.4 mmol)之MeOH (1590 mL)及催化劑NaOMe (8.0 mL，25%於MeOH中，34.9 mmol)。將混合物在rt下攪拌1 h以達成＞ 99%轉化。在添加固體NH 4Cl (52.0 g，977.8 mmol，1.4當量)之後，將所得混合物在rt下攪拌以達成＞ 95%轉化(否則，添加更多NH 4Cl)。在rt下添加丙二酸二甲酯(168 g，1047.7 mmol，1.5當量)之後，添加NaOMe (377 g，25%於MeOH中，2.5當量)。將所得混合物加熱至回流4 h以達成＞ 95%轉化。在將混合物冷卻至23℃之後，添加水(795 mL)，隨後在低於20℃下緩慢添加6N HCl (349 mL)以達到pH約3。向漿料中添加MTBE (530 mL)。在rt下1 h之後，藉由過濾收集固體，用3V水(796 mL)及MTBE (530 mL)洗滌，得到具有71%粗產率之呈灰白色固體狀之產物 G-76a(178 g)。粗產物直接用於下一步驟。
1H NMR (500 MHz, CDCl 3): δ 5.82 (s, 1H), 3.96-3.74 (m, 4H), 2.74-2.70 (m, 1H), 2.62-2.59 (m, 1H), 2.22-2.10 (m, 1H), 2.12-1.90 (m, 3H), 1.80-1.48 (m, 8H). ESI-MS: m/z 360 [M+H] +。
合成 G-77a 之實驗程序 向乾燥燒瓶中裝入 G-76a(80.0 g，253.7 mmol)、DMAP (4.0 g)、氯化四甲基銨(4.0 g)及POCl 3(400 mL)。在80℃下加熱混合物1.5 h以達成＞ 99%轉化。在真空下移除POCl 3，得到黏稠的淡黃色漿料。添加MTBE (160 mL)。接著將混合物冷卻至5℃。緩慢添加水(800 mL)。將所得白色漿液在23℃下攪拌1 h。藉由過濾收集固體且接著用水(480 mL)及MTBE (160 mL)連續洗滌。在真空下在60℃下乾燥過夜之後，84.3 g產物 G-77a分離為＞ 99純度%及約93%產率之白色固體。
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6): δ 8.05(s, 1H),2.96-2.91 (m, 1H), 2.76-2.69 (m, 2H), 2.53-2.48 (m, 2H), 2.37-2.34 (m, 1H), 1.97-1.96 (m, 2H), 1.88-1.82 (m, 4H), 1.70-1.61 (m,1H), 1.52-1.41(m, 1H). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 209.8, 164.3,161.4, 157.3, 155.7, 120.8, 120.2, 50.3, 38.1, 37.5, 31.0, 26.6, 20.7,19.9, 18.0. ESI-MS: m/z 353 [M+H] +。
合成 G-78a 之實驗程序 向乾燥及清潔反應器中裝入LiHMDS (1 M於THF中) (406.4 kg，456.1 mol，1.1當量)。將溶液冷卻至0-5℃，在低於5℃下添加粗 A-6b(93.0 kg，414.6 mol)且用THF (46.5 kg)沖洗以幫助轉移。在0-5℃下30 min之後，在低於5℃下添加草酸二乙酯(72.5 kg，497.5 mol，1.2當量)。在混合物在1 h內升溫至20-25℃之後，將混合物在20-25℃下保持不少於3 h。在批料冷卻至10-15℃之後，在低於25℃下將冷卻HCl溶液[藉由在0-5℃下將乙醯氯(73.6 kg，932.9 mol，2.25當量)添加至EtOH (293.9 kg)中來製備]添加至批料中以達到黃色漿料之最終pH約6-7。一次性添加固體NH 2OH·HCl (28.8 kg，414.4 mol，1.05當量)，且將所得混合物加熱至回流66-70℃持續6-10 h。此後，藉由在回流66-70℃下蒸餾來移除5 V溶劑。使用EtOH (73.5 kg)移除殘餘THF。添加水(372.0 kg)及EtOH (293.9 kg)。在70-75℃下3-6 h之後，將混合物冷卻至30-35℃。接種0.5-1%之 G-78a晶體。在30-35℃下2-4 h之後，在不少於1 h內添加庚烷(63.2 kg)。在20-25℃下60 min之後，添加水(279.0 kg)，歷時4-6 h。在20-25℃下1 h之後，收集固體且用1:2 EtOH/水(51.2 kg EtOH及130.2 kg水)且接著用庚烷(63.2 kg)洗滌兩次。在氮氣流下在真空下乾燥固體，得到具有65%產率之產物 G-78a(93.0 kg)。
1H NMR (500 MHz, CDCl 3): δ 4.42 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.73 (dt, J = 16.8, 5.1 Hz, 1H), 2.64 (dt, J = 14.3, 6.0 Hz, 1H), 2.60-2.51 (m, 2H), 2.43-2.30 (m, 2H), 2.09-1.96 (m, 3H), 1.91-1.81 (m, 3H), 1.76-1.67 (m, 1H), 1.65-1.58 (m, 1H), 1.40 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI-MS: m/z 278 [M+H] +。
合成 G-79a 之實驗程序 向乾燥及清潔反應器中裝入 G-78a(72.0 kg，259.6 mol)、EtOH (56.9 kg)及NH 4OH (aq) (280.8 kg)。將混合物在20-25℃下保持不少於16 h。在添加水(144.0 kg)，歷時30 min之後，將漿液在20-25℃下保持30 min。藉由過濾收集固體，用1:3 EtOH/水(28.5 kg EtOH及108 kg水)且接著用庚烷(97.9 kg)洗滌。在23℃下在真空下歷時1 h之後，將固體在50-55℃下乾燥過夜，得到產物 G-79a(61.4 kg，87.2%產率，鏡像異構比率≥ 95:5 (254 nm)，基於卡爾費雪滴定之含水量≤ 0.5%)。
向乾燥及清潔反應器中裝入粗 G-79a(60.0 kg，1.0當量)、1,4-二㗁烷(240.0 kg)及活性碳(3.0 kg，5 wt%)。將混合物在55-65℃下攪拌2-4 h。在高溫(55至65℃)下過濾之後，用1,4-二㗁烷(33.0 kg)洗滌濾餅。將濾液轉移至清潔反應器中。將溫度調整至45-55℃且在45-55℃下攪拌1-2 h。添加水(240.0 kg)，歷時2 h。將溫度調整至45-55℃且在45-55℃下攪拌1-2 h。將混合物冷卻至35-45℃且在35-45℃下攪拌2-4 h。添加水(87.0 kg)，歷時4 h。將混合物冷卻至15-25℃且在15-25℃攪拌12-14 h。藉由離心收集固體，用水(120.0 kg)洗滌且在真空下在50-55℃下乾燥過夜，得到呈淡黃色至灰白色固體狀之產物 G-79a(44.8 kg，71%產率)。非所要異構體應少於0.5%。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 7.99 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 2.80-2.69 (m, 1H), 2.60-2.53 (m, 1H), 2.50-2.42 (m, 1H), 2.40-2.28 (m, 2H), 2.26-2.18 (m, 1H), 2.05-1.70 (m, 7H), 1.48-1.39 (m, 1H). ESI-MS: m/z 249 [M+H] +。
合成 G-80a 之實驗程序 向乾燥及清潔反應器中裝入 G-79a(40.0 kg，161.1 mol)、MeCN (96.0 kg)及吡啶(30.8 kg，386.6 mol，2.4當量)。在將混合物冷卻至0-5℃之後，在低於5℃下緩慢添加TFAA (40.8 kg，193.3 mol，1.2當量)。在0-5℃下5 min之後，在0-5℃下添加水(120.0 kg)，歷時30 min，且用0.5%之 G-80a晶體接種。在0-5℃下15 min之後，添加水(120.0 kg)，歷時30 min。在0-5℃下30 min持續30 min之後，藉由過濾收集固體，用1:3 MeCN/水(15.6乙腈及60.0 kg水)且接著用水(80.0 kg)洗滌。固體在真空下乾燥，得到呈茶色固體狀之粗產物(33.0 kg，93.6%產率)。
向乾燥及清潔反應器中裝入粗 G-80a(32.5 kg，1.0當量)及MTBE (48.1 kg)，將漿料在20-25℃下攪動30 min。添加庚烷(132.6 kg)，歷時1 h。在20-25℃下30 min之後，收集固體，在真空中乾燥，得到呈白色固體狀之產物 G-80a(26.6 kg，82.0%產率)，其具有＞ 99:1鏡像異構比率(254 nm)及＞ 98%純度(220 nm)。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 2.83-2.73 (m, 1H), 2.60-2.40 (m, 3H), 2.34-2.20 (m, 2H), 2.06-1.75 (m, 7H), 1.53-1.43 (m, 1H). ESI-MS: m/z 231 [M+H] +。
合成 G-82a 之實驗程序 向 G-80a(25.0 g，108.6 mmol，1.0當量)於MeOH (150 mL)中之經攪拌溶液中添加NaOMe (30%於MeOH中，4.89 g，27.1 mmol，0.25當量)且將所得混合物在rt下攪拌2 h。接著添加NH 4Cl (6.39 g，119.4 mmol，1.1當量)且將混合物在rt下攪拌16 h。在完全轉化為所需脒之後，混合物經由矽藻土床過濾且濃縮。將殘餘物溶解於DMF (125 mL)中，在0℃下添加1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(32.3 g，212.3 mmol，2.1當量)及丙二酸二乙酯(13.4 g，101.1 mmol，1.0當量)且將所得混合物在90℃下攪拌16 h。在完全轉化之後，添加冰冷水，用1 N HCl酸化混合物且藉由過濾收集沉澱物。將沉澱物在減壓下乾燥，產生粗 G-82a(HPLC方法：H，t ret= 1.51 min；[M+H] = 316)，其不經純化即用於下一步驟。
合成 G-83a 之實驗程序 在0℃下合併 G- 82a(10.0 g，30.1 mmol，1.0當量)及POCl 3(48.0 g，310.0 mmol，10.3當量)且攪拌5 min。添加DIPEA (8.2 g，63.2 mmol，2.1當量)且將所得混合物在80℃下攪拌3 h。在完全轉化之後，在0℃下將冰冷水(1 L)緩慢添加至混合物中，且隨後使混合物達到rt且攪拌1 h。藉由過濾收集沉澱物，用水及己烷洗滌且在真空下乾燥，得到 G-83a(HPLC方法：H，t ret= 2.22 min；[M+H] = 352/354)。粗產物不經純化即用於下一步驟。
合成 G-84a 之實驗程序 將 B-5d(694 mg，4.09 mmol，1.2當量)溶解於無水THF (13mL)中且冷卻至0℃。在0℃下逐滴添加LiHMDS (1.0 M於THF中，5.11 mL，5.11 mmol，1.5當量)且將混合物額外攪拌15 min。將 G-77a(1.20 g，3.41 mmol，1.0當量)溶解於無水THF (13mL)中且在0℃下逐滴添加。將混合物在65℃下攪拌1.5 h。在完全轉化之後，將混合物用飽和NaHCO 3水溶液稀釋且用DCM萃取三次。將有機相合併，過濾且在減壓下濃縮以獲得 G-84a。粗產物不經純化即用於下一步驟。
以下中間物 G-84(表21)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 21
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G- 84a 0.89 475 C
G- 84b 1.52 475 A
G-84c 1.52 475 A
G-84d 2.10 466 G
合成 G-15a 之實驗程序 將 F-8a(356 mg，0.804 mmol，1.0當量)溶解於二㗁烷(2 mL)中且添加羥胺溶液(50%於水中，98.6 µL，1.61 mmol，2.0當量)。在40℃下攪拌所得溶液直至觀測到完全轉化。蒸發溶劑，所得殘餘物藉由RP層析純化，得到 G-13a( G-14a作為副產物被觀測到且藉由層析分離)。將 G-13a(136.0 mg，0.29 mmol，1.0當量)溶解於DCM (2 mL)中，且添加DIPEA (114.38 µL，0.65 mmol，2.2當量)及甲磺醯氯(34.2 µL，0.45 mmol，1.5當量)。在rt下攪拌所得溶液直至觀測到完全轉化。將反應混合物在減壓下濃縮且用DCM (3×)及水萃取。蒸發有機溶劑，所得殘餘物藉由RP層析純化，得到 G-15a。
以下中間物 G-15(表22)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 22
編號 結構 tret [min] [M+H]+ HPLC 方法
G-15a 1.64 439 A
G-15b 1.89 572 A
合成 G-29a 之實驗程序 將(1S)-1-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]乙-1-醇(122 µL mg，0.865 mmol，3.0當量)及三級丁醇鉀(97.0 mg，0.865 mmol，3.0當量)溶解於THF (2 mL)中且在50℃下攪拌30 min。添加 G-15b(165 mg，0.28 mmol，1當量)且將溶液在85℃下攪拌3 h。蒸發溶劑，且所得殘餘物藉由RP層析純化，得到 G-29a(HPLC方法：C， t ret= 1.12 min；[M+H] = 665)。
合成 G-30a 之實驗程序 將 G-29a(183 mg，275 µmol，1.0當量)及HCl (8 M，172 µL，1.38 mmol，5.0當量)溶解於MeOH (2.0mL)中且在60℃下攪拌直至完全轉化。將反應混合物在減壓下濃縮且用EtOAc/NaHCO 3萃取。將合併之有機相在減壓下濃縮，得到 G-30a(HPLC方法：A，t ret= 1.41 min；[M+H] = 521)。
合成 G-34a 之實驗程序 將 G-12b(100 mg，0.22 mmol，1.0當量)、(S)-5-甲基-4,7-二氮雜螺[2.5]辛烷2HCl (141 mg，0.67 mmol，3.0當量)及DIPEA (230 µL，0.67 mmol，6.0當量)溶解於DMSO (1 mL)中。將反應物在90℃下攪拌18 h。反應完成之後，在減壓下移除溶劑，且藉由鹼性RP層析純化殘餘物，得到所需產物 G-34a。
以下中間物 G-34(表23)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。
非鏡像異構混合物 G-34c可經由對掌性HPLC (Chiralpack IE，250X20 mm，5 µ；溶劑：乙醇/庚烷，60:40% + 0.1%二乙胺)分離，以獲得 G-34c1(作為峰1首先溶離)及 G-34c2(作為峰2隨後溶離)。 表 23
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G-34a 1.51 535 A
G-34h 1.01 569 B
G-34k 1.02 551 B
G-34i 1.24 639 B
合成 G-45a 之實驗程序 將 G-11a(217 mg，0.505 mmol，1.0當量)溶解於DMSO (2 mL)中且添加DIPEA (172 µL，1.01 mmol，2.0當量)及N-甲基哌𠯤(75.8 mg，0.757 mmol，1.5當量)。在90℃下攪拌反應混合物直至觀測到完全轉化。將混合物用飽和NaHCO 3水溶液稀釋且用DCM萃取三次。將有機相合併，過濾且在減壓下濃縮。將所得殘餘物溶解於ACN中且藉由鹼性RP層析純化，得到所需產物 G-45a。
以下中間物 G-45(表24)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。
非鏡像異構混合物 G-45l經由對掌性HPLC (管柱：Chiralpack IE，250×20 mm，5 µ；溶劑：乙醇/庚烷1:1 + 0.1%二乙胺)分離，以獲得 G-45I1(作為峰1首先溶離)及 G-45I2(作為峰2隨後溶離)。 表 24
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G-45a 1.38 494 A
G-45y 1.21 639 B
G-45z 1.04 553 B
合成 G-46a 之實驗程序 將4-(1H-吡唑-3-基)吡啶(73.4 mg，0.51 mmol，1.50當量)溶解於DMF (1 mL)中，添加NaH (51.7 mg，1.35 mmol，4.0當量)且在rt下攪拌20 min。添加 G-11b(150 mg，0.34 mmol，1.0當量)且將反應物在40℃下攪拌1 h。在完全轉化之後，用EtOAc/水萃取反應物。將有機相在減壓下濃縮且藉由RP層析純化，得到所需產物 G-46a。
以下中間物 G-46(表25)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 25
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G-46a 1.60 554 A
G-46b 1.59 555 A
G-46d 1.74 555 A
合成 G-48a 之實驗程序 將 G-11d(150 mg，0.32 mmol，1.0當量)溶解於二㗁烷(1.5 mL)中。添加1-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊-2-基)-1h-吡唑(82.7 mg，0.39 mmol，1.2當量)、XPHOS PD G3 (26.0 mg，0.03 mmol，0.09當量)及碳酸銫(0.4 ml，0.80 mmol，2.46當量)。將反應物在80℃下攪拌2 h。在觀測到完全轉化之後，用DCM/水萃取反應物。將合併之有機相在減壓下濃縮，溶解於ACN/水中且藉由RP層析純化，得到所需產物 G-48a。
以下中間物 G-48(表26)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 26
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G-48a 0.75 509 C
G-48g 1.54 494 A
G-48s 1.50 492 A
合成 G-51a 之實驗程序 將 G-11b(150 mg，0.34 mmol，1.0當量)溶解於二㗁烷(18 mL)中，添加2-㗁唑啶酮(59.9 mg，0.67 mmol，2.0當量)、Pd(dppf)Cl 2(24.7 mg，0.03 mmol，0.1當量)及NaOtBu (2.0M於THF中，185 µL，0.37 mmol，1.1當量)。將反應物在60℃下攪拌3 d。在觀測到完全轉化之後，將反應物過濾且在減壓下濃縮。用DCM/水萃取殘餘物。將合併之有機相在減壓下濃縮且藉由RP層析純化，得到 G-51a(HPLC方法：C，t ret= 0.78 min；[M+H] = 496)。
合成 G-63a 之實驗程序 在氬氣下將 G-45a(124 mg，0.251 mmol，1.0當量)溶解於DCM (1 mL)中且冷卻至0℃。添加甲醛(22.5 µL，0.301 mmol，1.2當量)，隨後添加三乙醯氧基硼氫化鈉(224 mg，1.01 mmol，4.0當量)。將溶液在0℃下攪拌30 min。在起始物質完全耗盡之後，反應物藉由添加水淬滅。用DCM萃取水相。將合併之有機相乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由RP層析純化，得到所需產物 G-63a。
以下中間物 G-63(表27)可以類似方式獲得。類似地獲得氘化中間物G-63，但三乙醯氧基硼氫化鈉由三乙醯氧基硼氘化鈉更換。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 27
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G-63a 0.70 508 C
合成 G-86a 之實驗程序 將 G-12b(2.00 g，4.23 mmol，1當量)、1H-吡唑-5-甲酸乙酯(936 mg，6.34 mmol，1.5當量)及碳酸銫(4.59 g，8.46 mmol，2當量)溶解於THF (20 mL)中。將反應物在70℃下攪拌2 h。在完全轉化之後，添加DCM，且用水洗滌溶液。將有機相在減壓下濃縮且藉由RP層析純化，以獲得 G-86a。
以下中間物 G-86(表28)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 28
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G- 86a 0.96 549 C
G- 86b 0.92 579 C
G- 86c 0.88 579 C
G- 86d 0.69 550 C
合成 G-88a 之實驗程序 將 G-11b(4.00 g，8.99 mmol，1當量)、2-(1H-吡唑-3-基)乙酸鹽酸鹽(1.73 g，10.34 mmol，1.15當量)及碳酸銫(8.79 g，26.97 mmol，3當量)溶解於DMSO (20 mL)中。將反應物在90℃下攪拌1.5 h。在完全轉化為所需中間物之後，將反應混合物冷卻至RT，添加異丙胺(1.55 mL，17.98 mmol，2.0當量)、1-甲基咪唑(1.43 mL，17.98 mmol，2.0當量)及氯-N,N,N',N'-四甲基甲脒鎓六氟磷酸鹽(5.15 g，17.98 mmol，2.0當量)且將混合物在RT下攪拌15 min。在完全轉化之後，添加DCM，且用水及鹽水洗滌溶液。將有機相在減壓下濃縮且藉由RP層析純化，以獲得 G-88a。
以下中間物 G-88(表29)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 29
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G- 88a 0.78 576 C
胺基氰基噻吩 I 及 II 之合成 合成 I-2 之實驗程序
將 G-30a(80.0 mg，154 µmol，1.00當量)、丙二腈(64.2 mg，953 µmol，6.20當量)、硫(23.1 mg，791 µmol，4.70當量)、ß-丙胺酸(60.9 mg，684 µmol，4.50當量)及硫酸鎂(23.5 mg，195 µmol，1.30當量)懸浮於EtOH (2.0 mL)中且在80℃下攪拌18 h。將反應混合物用EtOAc稀釋，過濾且用飽和NaHCO 3水溶液洗滌。將有機相分離且用EtOAc (2×)萃取剩餘水相。將合併之有機相用硫酸鎂乾燥，蒸發，且所得殘餘物藉由RP層析純化，得到 I-2。
以下最終化合物 I(表30)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 30
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
I-2 1.41 601 A
I-34 1.51 613 A
合成 I-37 之實驗程序 將 G-34h(91.0 mg，0.160 mmol，1.00當量)、乙酸銨(26.3 mg，0.320 mmol，2.00當量)及硫(10.3 mg，0.320 mmol，2.00當量)懸浮於EtOH (1.0 mL)中且在60℃下攪拌15 min。添加丙二腈(22.3 mg，0.320 mmol，2.00當量)。將反應物在80℃下攪拌5 h。在完全轉化之後，將混合物用DMSO稀釋，過濾且藉由RP層析純化，得到 I-37。
以下最終化合物 I(表31)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 31
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
I-37 1.44 649 A
I-38 1.23 719 B
I-39 1.57 633 A
I-46 0.92 659 C
I-47 0.94 629 C
I-49 1.45 631 A
I-50 1.53 645 A
合成 I-45 之實驗程序 將 I-38(225 mg，0.31 mmol，1.0當量)溶解於DCM/TFA (1:1，2.0 mL)中且將反應物在rt下攪拌3 h。在完全轉化之後，將反應混合物在真空下濃縮且藉由RP層析純化，得到 I-45(HPLC方法：A，t ret= 1.47 min；[M+H] = 619)。
合成 I-51 之實驗程序 向 I-46(2.73 g，4.14 mmol，1.0當量)於乙醇(47 mL)中之懸浮液中添加溶解於水(53 mL)中之氫氧化鉀(1.91 g，29.0 mmol，7.0當量)且將混合物在rt下攪拌2 h。在完全轉化之後，將混合物酸化至pH 6，在減壓下移除乙醇，且所得沉澱物藉由重複離心及用水洗滌來收集且在減壓下乾燥，得到所需產物 I-51。粗產物不經進一步純化即使用。
以下最終化合物 I(表32)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 32
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
I-51 0.56 631 C
I-52 1.08 601 A
合成 I-53 之實驗程序 向 I-51(90.1 mg，0.14 mmol，1.0當量)於DMSO (0.7 mL)中之溶液中添加(R)-四氫呋喃-3-胺鹽酸鹽(21.9 mg，0.17 mmol，1.2當量)、1-甲基咪唑(45.6 µL，0.57 mmol，4.0當量)及氯-N,N,N',N'-四甲基甲脒鎓六氟磷酸鹽(57.3 mg，0.20 mmol，1.4當量)且將混合物在rt下攪拌1 h。在完全轉化之後，用ACN稀釋混合物且經由RP層析分離產物，得到所需產物 I-53。
以下最終化合物 I(表33)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 33
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
I-53 1.46 700 A
I-58 1.51 658 A
合成 II-1 之實驗程序 將 G-11c(1.20 g，2.59 mmol，1.00當量)、乙酸銨(319 mg，4.15 mmol，1.60當量)、硫(133 mg，4.15 mmol，1.60當量)溶解於EtOH (12 mL)中且在60℃下攪拌15 min。緩慢逐滴添加(8mL/h)在EtOH中呈溶液形式之丙二腈(3.77 mL，4.28 mmol，1.65當量)。將反應物在80℃下攪拌5 h。在完全轉化之後，將反應物濃縮且藉由NP層析純化。將產物溶離份濃縮且用DCM及飽和NaHCO 3萃取。將有機相在減壓下濃縮以獲得 II-1。
以下最終化合物 II(表34)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 34
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
II-1 1.59 543 A
II-3 0.83 525 E
II-179 1.11 556 B
II-180 1.54 556 A
II-182 1.50 656 A
合成 II-17 之實驗程序 將 II-1(0.10 g，0.18 mmol，1.0當量)懸浮於DMSO (0.50 ml)中。添加DIPEA (0.11 mL，0.57 mmol，3.1當量)及(R)-5-甲基-4,7-二氮雜螺[2.5]辛烷二鹽酸鹽(42 mg，0.20 mmol，1.1當量)且將反應混合物在80℃下攪拌2 h。在完全轉化之後，反應混合物藉由RP層析純化。
以下最終化合物 II(表35)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 35
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
II-17 1.50 633 A
II-184 1.43 631 A
II-187 1.41 631 A
合成 II-19 之實驗程序 將 II-3(80 mg，0.15 mmol，1.0當量)及 B-11a(50.3 mg，0.31 mmol，2.0當量)溶解於THF (1.0 mL)中，添加碳酸銫(123 mg，0.38 mmol，2.5當量)且將混合物在65℃下攪拌3 h。在完全轉化之後，添加飽和NaHCO 3溶液且用DCM萃取產物。將有機相乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物藉由RP層析純化，得到所需最終產物 II-19。
以下最終化合物 II(表36)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 36
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
II-19 1.58 654 A
II-20 1.46 614 A
II-21 1.39 600 A
II-23 1.66 629 A
II-189 1.42 629 A
合成 II-24 之實驗程序 向 II-23(100 mg，0.159 mmol，1.0當量)於1-丙醇(1 mL)中之溶液中添加氫氧化鈉(4 M於水中，99.4 µL，0.40 mmol，2.5當量)且將混合物在rt下攪拌30 min。在完全轉化之後，添加飽和NaHCO 3，用DCM洗滌混合物，接著將水相用HCl酸化且用DCM萃取。將有機相乾燥、過濾且濃縮，且粗產物經由RP層析純化，得到所需產物 II-24。
以下最終化合物 II(表37)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 37
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
II-24 1.11 601 A
合成 II-25 之實驗程序 向 II-24(40 mg，0.067 mmol，1.0當量)於DMF (0.4 mL)中之溶液中添加氧雜環丁-3-胺鹽酸鹽(15 mg，0.133 mmol，2.0當量)、DIPEA (22.3 µL，0.166 mmol，2.5當量)及1-丙烷膦酸酐(29.7 µL，1.00 mmol，1.5當量)且將混合物在rt下攪拌3 h。在完全轉化之後，添加飽和NaHCO 3且用DCM萃取混合物。將有機相乾燥、過濾且濃縮，且粗產物經由RP層析純化，得到所需產物 II-25。
以下最終化合物 II(表38)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 38
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
II-25 1.44 656 A
II-26 1.49 670 A
II-191 1.57 705 A
II-192 1.48 670 A
II-194 1.46 670 A
合成 II-30 之實驗程序 在氬氣氛圍下向 G-63a(94.0 mg，0.18 mmol，1.0當量)及分子篩(3 Å)於無水EtOH (2 mL)中之溶液中添加丙二腈(64.4 mg，0.97 mmol，5.0當量)、硫(23.8 mg，0.74 mmol，4.0當量)及ß-丙胺酸(69.5 mg，0.78 mmol，4.0當量)。將反應混合物在80℃下攪拌過夜。在完全轉化之後，將混合物冷卻至rt，過濾且用DCM及飽和NaHCO 3水溶液萃取。將有機相合併且在減壓下濃縮。將殘餘物溶解於ACN及水中且藉由鹼性RP層析純化，得到所需產物 II-30。
以下最終化合物 II(表39)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。在 II-87之情況下，在反應期間使用 G-48r作為起始物質觀測到Boc去保護。 表 39
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
II-30 1.39 588 A
II-86 1.55 572 A
II-110 1.35 635 A
II-111 1.56 574 A
II-130 1.63 635 A
合成 II-143 之實驗程序 將 G-51a(90 mg，0.18 mmol，1.0當量)、乙酸銨(22.4 mg，0.29 mmol，1.6當量)及硫(9.32 mg，0.29 mmol，1.6當量)溶解於EtOH (1.20 mL)中且在60℃下攪拌15 min。逐滴緩慢添加在EtOH中呈溶液形式之丙二腈(0.26 mL，0.3 mmol，1.65當量)。將反應物在80℃下攪拌5 h。在完全轉化之後，添加DCM且用水萃取3次。將合併之有機相在減壓下濃縮，溶解於DMF/ACN/水中且藉由RP層析純化，得到 II-143。
以下最終化合物 II(表40)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 40
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
II-143 1.45 576 A
II-146 1.60 717 A
II-147 1.21 719 B
II-149 1.56 633 A
II-152 1.52 645 A
II-201 1.38 630 A
合成 II-160 之實驗程序 向 II-146(210 mg，0.29 mmol，1.0當量)於二㗁烷(3 mL)中之溶液中添加HCl (4 M於二㗁烷中，0.29 mL，1.17 mmol，4.0當量)且將反應混合物在rt下攪拌18 h。將反應混合物加熱至50℃且攪拌6 h。移除溶劑，且藉由RP層析純化殘餘物以獲得 II-160。
以下最終化合物 II(表41)可以類似方式獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 41
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
II-160 1.30 617 A
II-165 1.44 619 A
實例 5 ： 根據式 (D) 之化合物之合成 縮寫之清單( 表 42)
Ac 乙醯基
ACN 乙腈
aq. 水，水溶液
ATP 腺苷三磷酸
Bn 苯甲基
Boc 三級丁氧基羰基
Bu 丁基
C 濃度
c 濃度
Cbz 羧基苯甲基
CDI 1,1´-羰基二咪唑
cHexane 環己烷
D 天
d 天
TLC 薄層層析
Davephos 2-二甲胺基-2'-二環己基胺基膦基聯苯
DBU 1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一-7-烯
DCE 二氯乙烷
DCM 二氯甲烷
de 非鏡像異構過量
DEA 二乙胺
DIPEA N-乙基- N,N-二異丙胺(Hünig鹼)
DMA 二甲基乙醯胺
DMAP 4- N,N-二甲胺基吡啶
DME 1,2-二甲氧乙烷
DMF N,N-二甲基甲醯胺
DMSO 二甲亞碸
DPPA 二苯基磷醯基疊氮化物
dppf 1.1´-雙(二苯基膦基)二茂鐵
EDCI 1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺
EDTA 乙二胺四乙酸
EGTA 乙二醇四乙酸
eq. 當量
eq 當量
ESI 電灑離子化法
Et 乙基
Et 2O 二乙醚
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
h 小時
HATU 六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)- N,N,N',N'-四甲基-
HOBT 1-羥基苯并三唑水合物
HPLC 高效液相層析
i 異
conc. 濃縮
LC 液相層析
LiHMDS 雙(三甲基矽基)醯胺鋰
sln. 溶液
Me 甲基
MeOH 甲醇
min 分鐘
MPLC 質譜法
MS 甲基三級丁基醚
MTBE N-甲基𠰌啉
NMM N-甲基吡咯啶酮
NMP 質譜法
NP 正相
n.a. 不可用
PBS 磷酸鹽緩衝鹽水
Ph 苯基
Pr 丙基
PTSA 對甲苯磺酸
Py 吡啶
rac 外消旋
red. 還原
Rf (R f) 滯留因子
RP 逆相
RRLC 快速解析液相層析
RT 環境溫度
rt 環境溫度
SFC 超臨界流體層析
S N 親核取代
TBAF 氟化四丁基銨
TBDMS 三級丁基二甲基矽基
TBME 三級丁基甲醚
TBTU 四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基-
tBu 三級丁基
TEA 三乙胺
temp. 溫度
tert 三級
Tf 三氟甲磺酸酯
TFA 三氟乙酸
THF 四氫呋喃
TMS 三甲基矽基
t Ret. 滯留時間(HPLC)
TRIS 參(羥甲基)-胺基甲烷
TsOH 對甲苯磺酸
UPLC 超高效液相層析
UV 紫外線
wt 重量
化學實例除非另外陳述，否則使用化學實驗室中常用之方法在商業上可獲得設備中進行所有反應。對空氣及/或水分敏感之起始物質在保護性氣體下儲存，且與此對應之反應及操縱在保護性氣體(氮氣或氬氣)下進行。
若化合物由結構式且由其術語兩者表示，則在存在衝突之情況下，以結構式為準。
層析薄層層析在由Merck製造之玻璃(具有螢光指示劑F-254)上之現成矽膠60 TLC板上進行。
根據本發明之實例化合物之 製備型高壓層析 (RP HPLC)在具有由Waters製造之管柱(名稱：SunFire™ Prep C18, OBD™ 10 µm, 50 × 150 mm或SunFire™ Prep C18 OBD™ 5 µm, 30 × 50 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 10 µm, 50 × 150 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 5 µm, 30 × 150 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 5 µm, 30 × 50 mm)及由YMC製造之管柱(名稱：Actus-Triart Prep C18, 5 µm, 30 × 50 mm)以及Chiralpak IE (5 µm, 250 × 20 mm)的Agilent或Gilson系統上進行。
使用不同梯度的H 2O/乙腈溶離化合物，而對於Agilent系統，向水中添加5%酸性改質劑(20 mL HCOOH至1 L H 2O/ACN (1/1)) (酸性條件)。對於Gilson系統，向水中添加0.1% HCOOH。
對於Agilent系統在鹼性條件下之層析，亦使用H 2O/乙腈梯度，而藉由添加5%鹼性改質劑(50 g NH 4HCO 3+ 50 mL NH 3(25%於H 2O中)用H 2O補足至1 L)使水呈鹼性。對於Gilson系統，如下使水呈鹼性：用H 2O將5 mL NH 4HCO 3溶液(158 g於1 L H 2O中)及2 mL NH 3(28%於H 2O中)補充至1 L。在等濃度條件(60% EtOH/40% EtOH + 0.1% DEA)下亦使用Gilson系統。
中間物及根據本發明之實例化合物的 超臨界流體層析 (SFC)在具有以下管柱之Agilent 1260 SFC系統、JASCO SFC系統或Sepiatec SFC系統或Waters Thar SFC系統或Waters UPC 2-MS SFC系統上進行：Chiralcel OJ (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak AD-H (21 × 250 mm, 5 µm)、Chiralpak AD (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak AS (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak IC (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak IA (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralcel OJ (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralcel OD (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralcel OX-3 (150 × 4.6 mm, 3 µm)、Phenomenex Lux C2 (250 × 20 mm, 5 µm)。
分析型 SFC/UV 光譜法方法 SFC 方法 ： SFC-1SFC：         Agilent 1260 (二元泵) SFC 管柱：         Chiralpak AD-H (250 × 4,6 mm)，5 µm 流量：         2 ml/min 移動相：      A：CO 2+ B：MeOH ABPR：      120 Bar 溫度：         37.5℃ UV：          220 nm 梯度           80% A + 20% B (等濃度) 停止時間      10 min
中間物及最終化合物之 分析型 HPLC ( 反應控制 )係使用由Waters製造之管柱(名稱：XBridge TMC18, 2.5 µm, 2.1 × 20 mm或XBridge TMC18, 2.5 µm, 2.1 × 30 mm或Aquity UPLC BEH C18, 1.7 µM, 2.1 × 50mm)及由YMC製造之管柱(名稱：Triart C18, 3.0 µm, 2.0 × 30 mm)以及由Phenomenex製造之管柱(名稱：Luna C18, 5.0 µm, 2.0 × 30 mm)進行。分析設備在各情況下亦配備有質量偵測器。
HPLC 質譜法 /UV 光譜法使用HPLC-MS設備(具有質量偵測器之高效液相層析)產生表徵根據本發明之實例化合物的滯留時間/MS-ESI +。在注射峰值處溶離之化合物給出滯留時間t Ret.= 0.00。 方法 A HPLC               Agilent 1100系統 MS                  1200系列LC/MSD(API-ES+/-3000V，Quadrupol，G6140) MSD信號設定    掃描正/負120 - 1500 m/z 偵測信號           315 nm (頻寬170 nm，參考關閉) 光譜範圍           230 - 400 nm 峰寬                 ＜0.01 min 管柱                 Waters，Xbridge C18，2.5 µm，2.1×20 mm管柱 管柱溫度           60℃ 溶劑                 A：20mM NH 4HCO 3水溶液/ NH3 pH 9 B：ACN HPLC級 流量                 1.00 mL/min 梯度                 0.00 - 1.50 min         10 %至95 % B 1.50 - 2.00 min         95 % B 2.00 - 2.10 min         95 %至10 % B 方法 E UPLC-MS        Waters Acquity-UPLC-SQ Detector-2 MSD信號設定   掃描正及負100 – 1500， 源電壓：毛細血管電壓(kV)- 3.50，錐孔(V)：50 源溫度：去溶劑化溫度(℃)：350 源氣體流量：去溶劑化(L/Hr)：750，錐孔(L/Hr)：50 偵測信號          二極體陣列 光譜                範圍：200 - 400 nm；解析度：1.2nm 取樣速率          10點/秒 管柱                AQUITY UPLC BEH C18 1.7µm，2.1×50mm 管柱溫度          35℃ 溶劑                A：0.07%甲酸/ACN B：0.07%甲酸/水 流量                0.6 mL/min 梯度                0.0 - 0.30 min           97% B 0.30 - 2.20 min          97 %至2 % B 2.20 - 3.30 min          2 % B 3.30 - 4.50 min          2 %至97 % B 4.50 - 4.51 min          97 % B 方法 HHPLC               Agilent 1100/1200系統 MS                  1200系列LC/MSD (MM-ES + APCI +/- 3000 V，Quadrupol，G6130B) MSD信號設定    掃描正700 - 1350 管柱                 Waters，零件號186003389，XBridge BEH C18，2.5 µm，2.1 × 30 mm)管柱 溶離劑              A：5 mM NH 4HCO 3/18 mM NH 3(pH = 9.2) B：乙腈(HPLC級) 偵測信號           UV 254 nm，230 nm，214 nm (頻寬8，參考關閉) 光譜                 範圍：190-400 nm；狹縫：4 nm 峰寬                 ＞ 0.0031 min (0.063 s反應時間，80Hz) 注射                 0.5 µL標準注射 流量                 1.4 mL/min 管柱溫度           45℃ 梯度                 0.0 - 1.0 min            15 %至95 % B 1.0 - 1.1 min     95 % B 停止時間：       1.3 min
HPLC/UV 光譜法 方法 IHPLC               Agilent 1100/1200系統 管柱                 Chiralpak；零件號85394；IE，5 µm；150 × 2.1 mm 溶離劑              A：正庚烷 B：EtOH + 0.1 % DEA 偵測信號           UV 315 nm (頻寬170，參考關閉) 光譜                 範圍：190-400 nm；狹縫：4 nm 峰寬                 ＞ 0.0031 min (0.063 s 反應時間，80Hz) 注射                 0.5 µL標準注射 流量                 1.2 mL/min 管柱溫度           45℃ 等濃度                   70 % B 停止時間：            5 min
可使用熟習此項技術者已知且在有機合成文獻中描述之合成方法來獲得根據本發明之化合物及其中間物。較佳地，以類似於下文更充分解釋之製備方法之方式來獲得該等化合物，其中通式之取代基具有上文給出之含義。此等方法意欲作為本發明之說明，而不限制其主題及此等實例所主張之化合物的範疇。在一些情況下，進行反應步驟之次序可變化。亦可使用熟習此項技術者已知但在本文未詳細描述的反應方法之變型。
在未描述起始化合物之製備之情況下，其為商業上可獲得的或其合成描述於先前技術中或其可類似於已知先前技術化合物或本文中所描述之方法而製備，亦即合成此等化合物在有機化學工作者之技能內。文獻中所描述之物質可根據公開之合成方法製備。可使用習知保護基團來保護起始物質或中間物中之任何官能基。此等保護基團可使用熟習此項技術者熟悉之方法在反應順序內之適合階段裂解。若描繪以下化學結構而無立體中心(例如，經不對稱取代之碳原子)之確切組態，則兩種組態應視為包括且揭示於此表示中。呈外消旋形式之立體中心的表示應始終視為包括且揭示兩種鏡像異構物(若不存在其他經定義立體中心)或所有其他潛在非鏡像異構物及鏡像異構物(若存在額外經定義或未經定義之立體中心)。
流程 1 ： 流程 2 ：
合成 K-1a 之實驗程序 在rt下向1-甲基-2-氧代環己烷-1-羧酸乙酯(108.00 g，586.2 mmol)於甲苯(1.03 L)中之溶液中添加丙二腈(58.04 g，879.3 mmol，1.5當量)，隨後添加乙酸銨(9.04 g，117.2 mmol，0.2當量)及乙酸(13.41 mL，234.5 mmol，0.4當量)。將混合物在110℃下攪拌16 h。在完全轉化之後，將混合物用EtOAc稀釋且用水及鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮，得到粗產物 K-1a。此粗物質不經進一步純化即用於下一步驟(亦參見Naumann等人, Pharmazie 51 (1996), 4)。 表 43
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
K-1a n.a. n.a. -
合成 K-2a 之實驗程序 向 K-1a(250.0 g，1.1 mol)於DCM (3.0 L)中之溶液中添加硫(68.9 g，2.2 mol，2.0當量)及L-脯胺酸(24.8 g，0. 22 mol，0.2當量)且將所得混合物在80℃下攪拌12 h。在完全轉化之後，使混合物分配於EtOAc與水之間，且收集有機層。進一步用EtOAc萃取水層，且將合併之有機層用水及鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮，得到粗產物。粗產物經由管柱層析純化，得到 K-2a。 表 44
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
K-2a 1.08 265 A
合成 K-3a 之實驗程序 將 K-2a(78.0 mg，0.3 mmol，1.0當量)溶解於EtOH (1.5 mL)中且添加氫氧化鉀(4 M於水中，0.37 mL，1.5 mmol，5.0當量)。將混合物在78℃下攪拌16 h。在完全轉化之後，將水及EtOAc添加至混合物中，使用KHSO 4溶液(10%於水中)將水相之pH設定為pH 4，且使用EtOAc萃取產物。將合併之有機層乾燥，過濾且濃縮。粗產物經由酸性逆相層析(梯度溶離：20%至90%乙腈/水)純化，得到 K-3a。
鏡像異構物可藉由製備型SFC層析分離。舉例而言， K-3a轉化成 K-3b及其鏡像異構物。(分析型SFC方法SFC-1：針對 K-3b，t ret= 4.9 min，針對其他鏡像異構物，7.9 min)。 表 45
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
K-3a 0.22 237 A
K-3b 0.25 237 A
合成 K-9a 之實驗程序 在rt下向(S)-3-甲基1,4-二氮𠰢-1-甲酸三級丁酯(846.0 mg，214.30 mmol，1.0當量)及2-氯嘧啶-4-甲腈(528.9 mg，139.54 mmol，1.0當量)於DMSO (4 ml，4.5 V)中之溶液中添加TEA (1.1 ml，101.19 mmol，2.0當量)。將反應混合物在80℃下攪拌1 h。在完全轉化之後，將反應混合物冷卻至rt且添加水及EtOAc。將各相分離。將有機層用水洗滌，經硫酸鈉乾燥，接著過濾且在減壓下濃縮，得到粗產物，該粗產物藉由層析純化以獲得 K-9a。 表 46
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
K-9a 1.38 262 [M+H-異丁烯] + A
合成 K-10a 之實驗程序 在rt下向 K-9a(33.85 g，106.65 mmol，1.0當量)於EtOH (270 ml)中之溶液中添加50%羥胺溶液(13.05 ml，213.30 mmol，2.0當量)。將反應混合物在60℃下攪拌1 h。在完全轉化之後，反應混合物在減壓下濃縮，得到 K-10a，其不經純化即用於下一步驟。 表 47
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
K-10a 1,12 351 A
合成 K-11a 之實驗程序 在rt下向 K-3b(2.53 g，10.70 mmol，1.0當量)於DMSO (10 ml)中之經攪拌溶液中添加TEA (2.17 g，21.40 mmol，2.0 當量)及六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基(HATU，4.27 g，11.24 mmol，1.10當量)。將混合物在rt下攪拌15 min。在rt下添加 K-10a(3.75 g，10.70 mmol，1.0當量)且攪拌過夜。在完全轉化之後，用水及EtOAc稀釋反應混合物。將各相分離。將有機層用水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到粗產物。
必要時，粗產物 K-11藉由層析純化。 表 48
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
K-11a 1.43 513 [M+H-異丁烯] + A
合成 K-12a 之實驗程序 在rt下向 K-11a(2.00 g，3.51 mmol，1.0當量)於THF (40 mL)中之經攪拌溶液中添加DBU (1.98 mL，14.04 mmol，4.0當量)。將反應混合物在70℃下攪拌過夜。在完全轉化之後，反應混合物在減壓下濃縮，得到粗產物。粗產物藉由管柱層析純化，得到 K-12a。
必要時，粗產物 K-12藉由層析純化。 表 49
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
K-12a 1.51 551 A
K-12b 1.54 537 A
合成 K-13a 之實驗程序 在rt下向 K-12a(20.00 g，34.52 mmol，1.0當量)於MeOH (350 mL)中之經攪拌溶液中添加濃HCl (32.88 mL，345.21 mmol，10.0當量)。將反應混合物在50℃下攪拌2 h。在完全轉化之後，將反應混合物在減壓下濃縮且用水稀釋。用DCM萃取水相。合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到 K-13a，其不經進一步純化即用於下一步驟。
必要時，粗產物 K-13藉由層析純化。 表 50
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
K-13a 1.21 451 A
合成 E-1a 之實驗程序 在0℃下向2-(3-羥基-1,2-㗁唑-5-基)-3-甲基丁酸甲酯(15.00 g，0.08 mol，1.0當量)於DMF (75.0 mL)中之經攪拌溶液中添加碳酸鉀(31.17 g，0.23 mol，3.0當量)。逐滴添加1,3-二溴丙烷(15.20 g，0.08 mol，1.0當量)且將反應混合物在0℃下攪拌9小時。在完全轉化之後，反應混合物用水淬滅且用EtOAc萃取。將有機層用冰水洗滌，經硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮，得到粗產物。所得粗化合物藉由層析純化，得到 E-1a。
以下中間物 E-1(表43)可以類似方式獲得。必要時，粗產物 E-1藉由層析純化。 表 51
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
E-1a 1.96 320 A
E-1c 2.48 334/336 E
合成 E-2a 之實驗程序 向 K-13a(4.50 g，9.99 mmol，1.0當量)及 E-1a(3.72 g，11.03 mmol，1.1當量)於乙腈(45.0 mL)中之經攪拌溶液中添加碳酸鉀(2.76 g，19.98 mmol，2.0當量)且將混合物在60℃下在氬氣下攪拌22 h。在完全轉化之後，將反應混合物冷卻至rt，過濾，且用乙腈洗滌固體。將合併之溶液在減壓下濃縮且藉由層析純化，得到 E-2a。
以下中間 物 E-2(表52)可按類似方式，以不同中間物 K-13及 E-1或替代溴化物為起始物質而獲得。必要時，粗產物 E-2藉由層析純化。 表 52
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
E-2a 1.63 690 A
E-2c 1.72 704 A
合成 E-3a 之實驗程序 向 E-2a(4.26 g，6.18 mmol，1.0當量)甲醇(21.0 mL)中之經攪拌溶液中添加氫氧化鈉溶液(2 M於水中，6.18 mL，12.35 mmol，2.0當量)且將反應混合物在45℃下攪拌1 h。在完全轉化之後，反應混合物在減壓下濃縮。粗產物藉由層析純化，得到 E-3a。
以下中間物 E-3(表53)可按類似方式，以不同中間物 E-2為起始物質而獲得。必要時，粗產物 E-3藉由層析純化。 表 53
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
E-3a 1.14 676 A
E-3c 1.16 690 A
合成 I-1 之實驗程序 向 E-3a(219 mg，0.32 mmol，1.0當量)、(2S,4R)-4-羥基-N-{[4-(4-甲基-1,3-噻唑-5-基)苯基]甲基}吡咯烷-2-甲醯胺(113 mg，0.36 mmol，1.1當量)及HATU (184 mg，0.48 mmol，1.3當量)於DMF (1.0 mL)中之經攪拌溶液中添加DIPEA (0.16 mL，0.97 mmol，3.0當量)且將反應混合物在rt下攪拌30 min。在完全轉化之後，反應混合物用水淬滅，用乙腈稀釋且藉由層析純化。
以下化合物 I(表54)可按類似方式，以不同中間物 E-3及 A-4為起始物質而獲得。 表 54
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
I-1 0.78 975 H
I-2 1.41 961 A
I-3 1.47 989 A
經由化合物 I 之對掌性管柱層析進行對掌性分離 ：若獲得呈非鏡像異構物之混合物形式的化合物 I，則其可藉由對掌性層析分離成單一立體異構體，例如，如針對分離成 I-26及 I-27之 I-3所展示(表55)。 表 55
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
I-26 1.47 989 A
2.36 - I
I-27 1.47 989 A
3.22 - I
實例 6 ： 根據式 (E) 之化合物之合成 縮寫之清單( 表 56)
Ac 乙醯基
ACN 乙腈
aq. 水溶液
ATP 腺苷三磷酸
Bn 苯甲基
Boc 三級丁氧基羰基
Bu 丁基
c 濃度
CDI 1,1´-羰基二咪唑
d 天
TLC 薄層層析
Davephos 2-二甲胺基-2'-二環己基胺基膦基聯苯
DBU 1,8-二氮雜雙環(5.4.0)十一-7-烯
DCE 二氯乙烷
DCM 二氯甲烷
DEA 二乙胺
DIPEA N-乙基- N,N-二異丙胺(Hünig鹼)
DMA 二甲基乙醯胺
DMAP 4- N,N-二甲胺基吡啶
DME 1,2-二甲氧乙烷
DMF N,N-二甲基甲醯胺
DMSO 二甲亞碸
DPPA 二苯基磷醯基疊氮化物
dppf 1.1´-雙(二苯基膦基)二茂鐵
EDTA 乙二胺四乙酸
EGTA 乙二醇四乙酸
equiv. 當量
ESI 電灑離子化法
Et 乙基
Et 2O 二乙醚
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
h 小時
HATU 六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)- N,N,N',N'-四甲基-
HPLC 高效液相層析
i 異
conc. 濃縮
LC 液相層析
LiHMDS 雙(三甲基矽基)醯胺鋰
sln. 溶液
Me 甲基
MeOH 甲醇
min 分鐘
MPLC 中壓液相層析
MS 質譜法
MTBE 甲基三級丁基醚
NMM N-甲基𠰌啉
NMP N-甲基吡咯啶酮
NP 正相
n.a. 不可用
PBS 磷酸鹽緩衝鹽水
Ph 苯基
Pr 丙基
PTSA 對甲苯磺酸
Py 吡啶
rac 外消旋
red. 還原
Rf (R f) 滯留因子
RP 逆相
RRLC 快速解析液相層析
rt 環境溫度
SFC 超臨界流體層析
S N 親核取代
TBAF 氟化四丁基銨
TBDMS 三級丁基二甲基矽基
TBME 三級丁基甲醚
TBTU 四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基-
tBu 三級丁基
TEA 三乙胺
temp. 溫度
tert 三級
Tf 三氟甲磺酸酯
TFA 三氟乙酸
THF 四氫呋喃
t Ret. 滯留時間(HPLC)
TRIS 參(羥甲基)-胺基甲烷
TsOH 對甲苯磺酸
UPLC 超高效液相層析
UV 紫外線
wt 重量
根據本發明之化合物之製備除非另外陳述，否則使用化學實驗室中常用之方法在商業上可獲得設備中進行所有反應。對空氣及/或水分敏感之起始物質在保護性氣體下儲存，且與此對應之反應及操縱在保護性氣體(氮氣或氬氣)下進行。
若化合物由結構式且由其術語兩者表示，則在存在衝突之情況下，以結構式為準。
微波反應在由Biotage之引發器/反應器中或在由CEM製造之Explorer中或在由Anton Paar製造之Synthos 3000或Monowave 3000中，在密封容器(較佳2、5或20 mL)中較佳在攪拌下進行。
層析
薄層層析在由Merck製造之玻璃(具有螢光指示劑F-254)上之現成矽膠60 TLC板上進行。
根據本發明之實例化合物之 製備型高壓層析 (RP HPLC)在具有由Waters製造之管柱(名稱：SunFire™ Prep C18, OBD™ 10 µm, 50 × 150 mm或SunFire™ Prep C18 OBD™ 5 µm, 30 × 50 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 10 µm, 50 × 150 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 5 µm, 30 × 150 mm或XBridge™ Prep C18, OBD™ 5 µm, 30 × 50 mm)及由YMC製造之管柱(名稱：Actus-Triart Prep C18, 5 µm, 30 × 50 mm)的Agilent或Gilson系統上進行。
使用不同梯度的H 2O/乙腈溶離化合物，而對於Agilent系統，向水中添加5%酸性改質劑(20 mL HCOOH至1 L H 2O/乙腈(1/1)) (酸性條件)。對於Gilson系統，向水中添加0.1% HCOOH。
對於Agilent系統在鹼性條件下之層析，亦使用H 2O/乙腈梯度，而藉由添加5%鹼性改質劑(50 g NH 4HCO 3+ 50 mL NH 3(25%於H 2O中)用H 2O補足至1 L)使水呈鹼性。對於Gilson系統，如下使水呈鹼性：用H 2O將5 mL NH 4HCO 3溶液(158 g於1 L H 2O中)及2 mL NH 3(28%於H 2O中)補充至1 L。
中間物及根據本發明之實例化合物的 超臨界流體層析 (SFC)在具有以下管柱之JASCO SFC系統上進行：Chiralcel OJ (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak AD (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak AS (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak IC (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralpak IA (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralcel OJ (250 × 20 mm, 5 µm)、Chiralcel OD (250 × 20 mm, 5 µm)、Phenomenex Lux C2 (250 × 20 mm, 5 µm)。
中間物及最終化合物之 分析型 HPLC ( 反應控制 )係使用由Waters製造之管柱(名稱：XBridge TMC18, 2.5 µm, 2.1 × 20 mm或XBridge TMC18, 2.5 µm, 2.1 × 30 mm或Aquity UPLC BEH C18, 1.7 µm, 2.1 × 50mm)及由YMC製造之管柱(名稱：Triart C18, 3.0 µm, 2.0 × 30 mm)以及由Phenomenex製造之管柱(名稱：Luna C18, 5.0 µm, 2.0 × 30 mm)進行。分析設備在各情況下亦配備有質量偵測器。
HPLC 質譜法 /UV 光譜法使用HPLC-MS設備(具有質量偵測器之高效液相層析)產生表徵根據本發明之實例化合物的滯留時間/MS-ESI +。在注射峰值處溶離之化合物給出滯留時間t Ret.= 0.00。 方法 A HPLC               Agilent 1100系統 MS                  1200系列LC/MSD(API-ES+/-3000V，Quadrupol，G6140) MSD信號設定    掃描正/負120 - 900m/z 偵測信號           315 nm (頻寬170 nm，參考關閉) 光譜範圍           230 - 400 nm 峰寬            ＜0.01 min 管柱            Waters，Xbridge C18，2.5 µm，2.1×20 mm管柱 管柱溫度      60℃ 溶劑            A：20mM NH 4HCO 3/ NH 3/H 2O pH 9 B：ACN HPLC級 流量            1.00 mL/min 梯度            0.00 - 1.50 min         10 %至95 % B 1.50 - 2.00 min         95 % B 2.00 - 2.10 min         95 %至10 % B 方法 C HPLC          Agilent 1260系列 MS             Agilent LC/MSD Quadrupole 偵測            MS：正及負模式 質量範圍      100 - 750 m/z 管柱            Waters X-Bridge BEH C18，2.5 µm，2.1 × 30 mm XP 管柱溫度      45℃ 溶劑            A：20 mM NH 4HCO 3/30 mM NH 3/H 2O；B：ACN (HPLC級) 流量            1.40 mL/min 梯度            0.00 - 1.00 min：15% B至95% B 1.00 - 1.30 min：95 % B 方法 H UPLC-MS        Waters Acquity-Binary Solvent Manager-UPLC-SQ Detector-2 MSD信號設定   掃描正及負100 – 1500， 源電壓：毛細血管電壓(kV)- 3.50，錐孔(V)：50 源溫度：去溶劑化溫度(℃)：350 源氣體流量：去溶劑化(L/Hr)：750，錐孔(L/Hr)：50 偵測信號          二極體陣列 光譜                範圍：200-400 nm；解析度：1.2 nm 取樣速率          10點/秒 管柱                AQUITY UPLC BEH C18 1.7µm，2.1×50mm 管柱溫度          35℃ 溶劑                A：0.07%甲酸/ACN B：0.07%甲酸/水 流量                0.6 mL/min 梯度                0.0 - 0.40 min           97% B 0.40 - 2.50 min          97 %至2 % B 2.50 - 3.40 min          2 % B 3.40 - 3.50 min          2 %至97 % B 3.50 - 4.0 min           97 % B
GCMS 方法 U GC                        Agilent Technologies-具有7693自動取樣器及5977A MSD之7890B GC系統 注射溫度                230℃ 管柱流量                2.0 mL/min 溶劑延遲                1.5 min 分流比率                10:01 管柱烘箱溫度程序   100℃/1 min，20℃/min/310°/5min 總運行時間            16 min 介面溫度                150℃ 離子源溫度            230℃ 氣體                      He 管柱及管柱尺寸      ZB-5MS (30m × 0.32mm；1µm) MSD掃描範圍         50-900 方法 V GC                        Agilent Technologies-具有7693自動取樣器及5977A MSD之7890B GC系統 注射溫度                230℃ 管柱流量                2.0 mL/min 溶劑延遲                1.5 min 分流比率                10:01 管柱烘箱溫度程序   40℃/2 min，15℃ /min/200°/1 min，25℃/min/310°/0 min， 總運行時間             18 min 介面溫度                150℃ 離子源溫度             230℃ Gas                       He 管柱及管柱尺寸       ZB-5MS (30m × 0.32mm；1µm) MSD掃描範圍         50-900 方法 W GC                        Agilent Technologies-具有7693自動取樣器及5977A MSD之7890B GC系統 注射溫度                230℃ 管柱流量                2.0 mL/min 溶劑延遲                1.5 min 分流比率                10:01 管柱烘箱溫度程序   60℃/3 min，20℃/min/310°/2min 總運行時間             18 min 介面溫度                150℃ 離子源溫度             230℃ 氣體                      He 管柱及管柱尺寸       ZB-5MS (30m × 0.32mm；1µm) 方法 SFC-1 製造                      Waters UPC 2-MS 軟體                      Empower3 MS                        QDa 管柱                      CHIRALCEL OX-3(4.6*150MM) 3µm A-溶劑                   CO2 B-溶劑                   ACN 總流量                   3g/min 共溶劑之百分比       15 ABPR                    1500psi 管柱溫度                30℃ PDA範圍                200nm至400nm 解析度                   1.2nm MS參數                  - QDa MS掃描範圍    100Da至1000Da 錐孔電壓 正掃描                   20V 負掃描                   15V
根據本發明之化合物及中間物藉由下文描述之合成方法製備，其中通式之取代基具有上文給出之含義。此等方法意欲作為本發明之說明，而不限制其主題及此等實例所主張之化合物的範疇。在未描述起始化合物之製備之情況下，其為商業上可獲得的或其合成描述於先前技術中或其可類似於已知先前技術化合物或本文中所描述之方法而製備，亦即合成此等化合物在有機化學工作者之技能內。文獻中所描述之物質可根據公開之合成方法製備。若描繪以下化學結構而無立體中心(例如，經不對稱取代之碳原子)之確切組態，則兩種組態應視為包括且揭示於此表示中。呈外消旋形式之立體中心的表示應始終視為包括且揭示兩種鏡像異構物(若不存在其他一或多個經定義立體中心)或所有其他潛在非鏡像異構物及鏡像異構物(若存在額外經定義或未經定義之立體中心)。
螺酮中間物 A 之 合成 合成 A-2a 之實驗程序
在0℃下向5-氯戊腈(22.9 g，195 mmol，1.00當量)於EtOH (136 mL)中之懸浮液中逐滴添加乙醯氯(111 mL，1.56 mol，8.00當量)。將反應混合物升溫至rt且攪拌12 h。將混合物在減壓下濃縮且用Et 2O洗滌，且粗產物 A-2a不經進一步純化即在下一步驟中直接用作HCl鹽(HPLC方法：A；t ret= 1.03 min；[M+H] += 164)。
合成 A-3a 之實驗程序 將粗 A-2a(HCl鹽) (28.0 g，140 mmol，1.00當量)及乙二醇(7.38 g，119 mmol，0.90當量)溶解於DCM (300 mL)中且在rt下攪拌6 d。將所得懸浮液在減壓下濃縮，用Et 2O (200 mL)稀釋且過濾。將濾液在減壓下濃縮，溶於DCM (200 mL)中且用KOH溶液(2 M於水中，150 mL)處理。將混合物在rt下攪拌過夜，保持各相完整。將各相分離，用DCM (2×)萃取水相，且合併之有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗原酸酯 A-3a不經進一步純化即用於下一步驟(HPLC方法：A；t ret= 1.37 min；[M+H] += 163)。
合成 A-4a 之實驗程序 將粗 A-3a(22.3 g，107 mmol，1.00當量)、1-環己烯氧基三甲基矽烷(16.4 mL，82.3 mmol，0.80當量)及氯化鋅(10.2 g，74.8 mmol，0.70當量)溶解於DCM (120 mL)中且在rt下攪拌5 h。藉由添加飽和碳酸氫鈉溶液來處理反應混合物。將有機相分離，經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物藉由NP層析純化，得到所需化合物 A-4a(HPLC方法：A；t ret= 1.25 min；[M+Na] += 283)。
合成 A-8a 之實驗程序 將 A-4a(14.9 g，57.1 mmol，1.0當量)及碘化鈉(26.0 g，171 mmol，3.0當量)溶解於丙酮(120 mL)中且在回流下攪拌16 h。將反應混合物在減壓下濃縮，用DCM稀釋且用飽和硫代硫酸鈉溶液洗滌。將有機相分離，經MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物 A-5a不經進一步純化即用於下一步驟。
將 A-5a(30 g，85.0 mmol，1.0當量)溶解於THF中。在0℃下用三級丁醇鉀(28.7 g，256 mmol，3.0當量)處理混合物且在rt下攪拌過夜。反應混合物藉由添加水(2 mL)淬滅，藉由添加Et 2O及飽和碳酸氫鈉溶液稀釋。將有機相分離，經MgSO 4乾燥，過濾且在減壓下濃縮。粗產物藉由NP層析純化，得到(外消旋)化合物 A -6a(反應順序 A-1a至 A-6a係基於Marko等人, THL 2003, 44, 3333-3336及Maulide等人, Eur. J. Org. Chem. 2004, 19:3962-3967)。
可接著經由使用以下條件之SFC在對掌性分離之後獲得鏡像異構物 A-6b：管柱：Lux；Cellulose-4 (250mm×30mm×5µm)，90% CO2，10% ACN，流量：90g/min，溫度：30℃，鏡像異構物 A-6b(SFC方法：SFC-1，t ret=2.99min)，作為峰2在鏡像異構物溶離之後獲得。
二酮 F 之合成 當報導多個HPLC滯留時間時，其意謂存在不同互變異構體。
合成 F-1a 之實驗程序 在氮氣氛圍下將4,6-二氯嘧啶-2-甲酸甲酯 E-4a(2.00 g，9.67 mmol，1.00當量)溶解於無水ACN (5 mL)中。添加溴化鎂二乙基醚合物(2.99 g，11.6 mmol，1.20當量)、 A-6b(2.38 g，10.6 mmol，1.10當量)於ACN (5 mL)中之溶液及DIPEA (2.67 mL，14.5 mmol，1.50當量)，且將反應混合物在50℃下攪拌20 h。在完全轉化之後，反應混合物謹慎地用1 M HCl淬滅，用水稀釋，用DCM萃取，將有機相乾燥、過濾且濃縮以獲得粗 F-1a。粗化合物藉由NP層析純化。(HPLC方法：H，t ret= 2.50 min；[M+H] = 399/401)。
合成 F-2a 之實驗程序 將 F-1a(10.0 g，19.4 mmol，1.00當量)溶解於DMSO (10 mL)中，添加(1S)-1-[(2S)-1-甲基吡咯啶-2-基]乙醇(2.76 g，21.4 mmol，1.10當量)及DIPEA (6.78 mL，38.8 mmol，2.0當量)且將溶液在rt下攪拌過夜。用DCM及水稀釋反應混合物。將分離有機相，蒸發，且所得殘餘物藉由RP層析純化，得到 F-2a。(HPLC方法：A，t ret= 1.58/1.66 min；[M+H] = 492)。
異㗁唑中間物 G 之合成 合成中間物 G3 及 G4 之實驗程序
將 F-3a(1.10 g，1.91 mmol，1.0當量)溶解於1,4-二㗁烷(3 mL)中且添加50%羥胺水溶液(140 µL，2.29 mmol，1.2當量)。將反應混合物在rt下攪拌過夜。在起始物質完全轉化之後，將反應物用飽和NaHCO 3水溶液稀釋且用DCM萃取三次。將有機相合併，過濾且在減壓下濃縮，得到粗產物。將 G-1a及 G-2a之粗混合物(1.00 g，1.68 mmol，1.0當量)溶解於1,4-二㗁烷(6 mL)中且添加4 M HCl水溶液(2.11 mL，8.44 mmol，5.0當量)。將反應混合物在rt下攪拌3 h。在觀測到起始物質完全轉化之後，將反應物用飽和NaHCO 3水溶液稀釋且用DCM萃取三次。將有機相合併，乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到粗產物。將粗產物溶解於ACN及水中，過濾，且藉由鹼性RP層析純化，得到所需產物 G-3a以及對應異㗁唑區位異構體 G - 4a。
以下中間物 G-3及 G-4(表57)可按類似方式自合適之中間物 F獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 57
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G-3a 0.67 430 C
G-3b 1.57 445 A
合成 G-9 及 G-10 之實驗程序 ( 方法 IV) 將 G-4b(150 mg，0.3 mmol，1.0當量)、2-羥基噻唑(39.4 mg，0.39 mmol，1.30當量)、t-BuONa (2 M於THF中，210 µL，0.42 mmol，1.4當量)溶解於THF (1.5 mL)中且在80℃下攪拌18 h。在完全轉化之後，反應混合物用DCM/H 2O萃取3次。將合併之有機相在減壓下濃縮且藉由RP層析純化，得到所需產物 G-10a。
以下中間物 G-9及 G-10(表58)可按類似方式自 G-3b及 G-4b獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 58
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G-10a 0.92 504 C
G-9i 1.04 610 C
合成 G-9 之實驗程序 將 G-9h(297 mg，476 µmol，1.0當量)溶解於DCM (0.91 mL)及三氟乙酸(0.99 mL，4.76 mmol，10.0當量)中。將反應物在rt下攪拌4 h。在完全轉化之後，在減壓下移除溶解產物。將殘餘物溶解於DCM中且用飽和Na 2CO 3水溶液萃取。將合併之有機相乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由RP層析純化，得到 G-9s。
以下中間物 G-9(表59)可按類似方式自 G-9h及 G-9i獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 59
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
G-9s 1.53 524 A
G-9t 0.58 0.73 510 C
胺基氰基噻吩 H 、 I 及 II 之合成 G-9 轉化為 II 之實驗程序
在氬氣氛圍下向 G-9a(75.0 mg，0.149 mmol，1.0當量)及分子篩(3 Å)於無水甲醇(4 mL)中之溶液中添加丙二腈(20.7 mg，0.297 mmol，2.0當量)、硫(7.15 mg，0.223 mmol，1.5當量)及ß-丙胺酸(16.7 mg，0.178 mmol，1.2當量)。將反應混合物在80℃下攪拌過夜。在完全轉化之後，將混合物冷卻至rt，過濾且用DCM及飽和NaHCO 3水溶液萃取。將有機相合併且在減壓下濃縮。將殘餘物溶解於乙腈及水中且藉由鹼性RP層析純化，得到所需產物 II-1。
以下化合物 II(表60)可按類似方式自對應酮 G-9獲得。必要時，粗產物藉由層析純化。 表 60
編號 結構 t ret [min] [M+H] + HPLC 方法
II-1 1.46 585 A
II-9 1.49 590 A
實例 7 ： 根據式 (F) 之化合物之合成根據式(F)之化合物之合成已描述於WO2021/213800中。
實例 8 ： 評定活體外及活體內之存活素水平 - 材料及方法 細胞效價發光 (Cell Titer Glow ； CTG) 分析使用384孔盤(VIEWPLATE-384 TC，Perkin Elmer，目錄號60007480)在兩種不同細胞株(表1)中執行細胞效價發光細胞生存力分析(Promega)。使用11種不同KRASG12C及9種KRASG12D抑制劑。兩種細胞株均根據ATCC標準協定生長，如表61中所展示。 表61.細胞培養條件
細胞株名稱 生長類型 培養基及培養條件
NCI-H358 黏附型 RPMI-1640 ATCC調配物(Gibco #A10491) + 5% FCS
SW1990 黏附型 Leiboviz´s L-15 (Gibco #11415-049) + 10% FCS + 0% CO 2
NCI-H358及SW1990細胞株以500個細胞/孔之密度接種於384孔盤中，總培養基為40 µL，一式三份。次日，將細胞用KRASG12D及KRASG12C抑制劑處理120小時，其中起始濃度為3 µM，隨後1:3稀釋。在第5天，將CTG試劑添加至各孔中，且用Enspire分光光度計在490 nm處量測到發光。
藉由使用內部BI統計程式MegaLab來量測IC50值。基於該等結果，排除具有高IC50之化合物(對於G12C抑制劑，IC50超過100 nM，且對於G12D抑制劑，IC50超過300 nM)。隨後用人類存活素ELISA套組(Abcam，ab183361)測試其餘化合物。
人類存活素 ELISA 分析細胞在T175燒瓶中生長至90%之融合度(confluency)。用100 nM之G12C抑制劑處理H358細胞，且用300 nM之G12D抑制劑處理SW1990細胞。向培養基(Gibco，A2720801)中添加胞泌體耗盡FBS。處理後72小時，收集細胞培養上清液，且根據人類存活素ELISA套組協定來收集細胞。
胞泌體提取用exoEasy Maxi套組(QIAGEN，76064)自細胞培養基分離胞泌體，如製造商說明書中所描述。簡言之，細胞培養上清液首先用0.8 µm過濾器(Sartorius Minisart NML，目錄號16592)過濾。接著，將1體積之經過濾細胞培養上清液與1體積之緩衝液XBP混合。接著將混合物添加至exoEasy旋轉管柱上且離心。隨後洗滌管柱，且將胞泌體溶離於400 µL之緩衝液XE中。
自腫瘤提取 RNA用刮刀將來自活體內研究之冷凍腫瘤切割成約5×5 mm之大小。接著將腫瘤移動至含有1個鋼珠之2 ml Eppendorf試管中。添加1 mL Trizol (Quiazol #79306 200ml Qiagen)且用tissueLyser II (Qiagen)將各樣本同質化。對試管進行離心，將上清液轉移至新試管中，向各樣本添加gDNA Eliminator Solution及溴-3-氯丙烷。將樣本再次離心，且隨後藉由管柱系統RNeasy MiniKit ((250) #74106 Qiagen)按照製造商說明書進行RNA分離。簡言之，在離心之後，使水相與70%乙醇以1:1之比率混合且添加至供應管柱。如所表明，對管柱進行離心且洗滌若干次。將RNA溶離於40 µl無H 2O核酸酶中。用QIAxpert Slide-40 (25) #990700 - RNeasy方法來量測RNA含量，且在Tape Station (Agilent)上建立RIN值。接著將分離之RNA進一步加工以進行定序。
自胞泌體提取 RNA藉由exoRNeasy Serum/Plasma Maxi套組(目錄號77064)按照製造商說明書自血漿分離胞泌體RNA。收集多至4 ml血漿/組小鼠，過濾且以1:1比率與XBP緩衝液結合。接著將混合物添加至供應管柱上，離心且洗滌。隨後將QIAzol添加至膜上，對試管進行離心，且將所收集之溶解產物轉移至新試管中。將氯仿添加至混合物中，對試管進行離心且將上部水相轉移至新的收集試管中。接著向試管中添加2體積100%乙醇且吸取至RNeasy MinElute旋轉管柱上。離心之後洗滌管柱，且將RNA溶離於14 μl無H 2O核酸酶中。與腫瘤類似，用QIAxpert Slide及TapeStation來量測RNA且隨後定序。
用於分析血漿樣本之 MSD® 96 孔 S-PLEX 存活素分析來自小鼠活體內功效及生物標記研究之血漿樣本或人類血漿樣本在10000 rcf下離心5分鐘，且接著根據製造商說明書以2倍稀釋度在偵測人類存活素之MSD® 96孔S-PLEX分析中進行測試。簡言之，藉由洗滌盤且在RT下在振盪之情況下與含有特異性存活素捕捉抗體之塗覆溶液一起培育1小時來(1.)組合該分析。在洗滌步驟之後，添加阻斷溶液，隨後添加校準劑及樣本溶液。該分析在RT下在振盪之情況下培育16-18小時。次日，洗滌盤且在RT下在振盪器上與含有特異性存活素捕捉抗體之(2.) TURBO-BOOST溶液一起培育1小時。在另一洗滌步驟之後，在RT下在振盪之情況下添加(3.) S-PLEX增強溶液30分鐘。接著再次洗滌盤且在27℃下在振盪下與(4.) S-PLEX偵測溶液一起培育1小時。最後，在洗滌步驟及添加MSD GOLD Read Buffer B之後在MSD儀器上(5.)讀取板。(6.)資料分析用MSD Discovery軟體執行且在GraphPad Prism中視覺化。
用於分析活體外實驗之 MSD® 96 孔 S-PLEX 存活素分析SNU1196細胞在T175燒瓶中生長至90%之融合度。用11種不同GDPi抑制劑(500 nM)來處理SNU1196細胞。向培養基(Gibco，A2720801)中添加胞泌體耗盡FBS。處理後72 h，收集細胞培養上清液，且根據Abcam人類存活素ELISA套組協定用套組中所提供之細胞溶解緩衝液來收集細胞。根據exoEasy Maxi套組(QIAGEN，76064)自上清液分離胞泌體，且藉由Quick Start™ Bradford蛋白質分析(Bio-Rad，500-0202)來測定分離之胞泌體及細胞溶解產物之蛋白質濃度。接著使用如上文所描述之MSD® 96孔S-PLEX分析來分析存活素水平。
人類血漿樣本分析來自各種適應症之人類血漿樣本以評定中值基線存活素水平與個體間生物變異之差異。額外獲得來自健康志願者之血漿樣本。CRC患者(n=21)血漿樣本購自商業供應商(BioIVT)，或來自根據生物標記研究提案(2023-brp-0004)進行之先前臨床研究的生物庫(biobanking)樣本。PDAC血漿樣本(n=4)購自商業供應商(BioIVT)。NSCLC血清樣本(n=31)為來自已完成臨床研究(1280.16)之剩餘樣本。
實例 9 ： 評定活體外及活體內之存活素水平 - 結果 實例 9.1 ： 存活素作為生物標記分析致瘤及健康細胞中之存活素表現，且如 圖 1A中所展示，在由來自胰臟腺癌上皮 細胞株HPAC之細胞釋放之胞泌體中偵測到存活素，但在來自健康志願者之胞泌體中未偵測到。使用MSDS-Plex ELISA分析額外量測健康對照組(n=30)及癌症患者(CRC (n=21)、PDAC (n=4)及NSCLC (n= 31))中之血漿存活素水平。結果表明，與健康志願者相比，癌症群體展現約2.5倍高之存活素水平(中值)基線(圖1B)。因此，相對於健康對照組，癌症患者中之存活素上調。另外，Nintedanib試驗之安慰劑組(來自1199.52之生物庫樣本)中之CRC患者展示穩定或增加的存活素水平，藉此指示存活素與進展性疾病之間的可能相關性(圖1C)。
此等發現符合先前公開之資料(Chang等人，2021)，該資料展示存活素在腫瘤中之表現，且更重要的是，高存活素水平與療法耐藥性相關聯。
為了進一步分析在用各種抗KRAS藥物治療後存活素之表現模式，採用活體內NSCLC CDX模型(使用非小細胞肺癌HCC461細胞株之細胞株衍生異種移植模型)。發現存活素以劑量依賴性方式顯著下調( 圖 2)。因此，活體內生物標記研究表明在每日用KRASG12D抑制劑化合物G12D-cpd#2 (參見 表 1)處理3天之後，劑量依賴性存活素下調。
藉由ELISA進一步測試GP2D及HPAC (G12D突變體)細胞中之 BIRC5編碼存活素水平，該等細胞用增加劑量之KRASG12D抑制劑處理2小時(頂部圖區)及24小時(底部圖區) ( 圖 3)。在IC50劑量(對於GP2D，為8 nM，且對於HPAC，為46 nM)下，存活素表現在24小時時降低而在2小時時未降低，此表明存活素可能為KRAS反應之晚期生物標記。
本案發明人已進一步展示，在用100 nM (圖4至圖6)或300 nM (圖7至圖9)之11種不同KRASG12C (圖4至圖6)或9種不同KRASG12D抑制劑(圖7至圖9)處理後，NCI-H358細胞(圖4至圖6)及SW1990細胞(圖7至圖9)之細胞溶解產物(圖4、圖7)、培養基(圖5、圖8)及胞泌體(圖6、圖9)中的存活素分別下調( 圖 4 至圖 9)。
亦發現在用HER2抑制劑處理PC9 YMVA-5細胞株之人類腺癌細胞後，存活素下調( 圖 10)。使用兩種不同GDP-KRAS抑制劑化合物Cpd#a及Cpd#b來獲得類似資料( 圖 11)。其他實驗表明，用各種GDP-KRAS抑制劑處理之SNU1196細胞(KRAS-WT amp)中之存活素調節：用11種不同GDP-KRAS抑制劑(500 nM)處理含有KRAS-WT擴增之SNU1196細胞72 h。S-Plex存活素分析用於量測細胞溶解產物及胞泌體中之存活素水平。如圖13 A及B中所展示，在細胞溶解產物及胞泌體中所測試之所有化合物中均觀測到強存活素下調，藉此證實藉由此等化合物對KRAS下游通路之抑制。
最後，本案發明人量測活體內之存活素水平( 圖 12)。向小鼠皮下注射SW1990細胞。當腫瘤達到200 mm 3時，用KRASG12D抑制劑G12D-cpd#2或媒劑處理小鼠3天。處理後3天收集來自各動物之腫瘤及血液。自腫瘤及血漿(胞泌體)兩者分離RNA且藉由RNA定序進行排序。在腫瘤及胞泌體兩者中觀測到存活素之劑量依賴性調節。
實例 9.2 ： 顯示血漿中之存活素的劑量依賴性調節的活體內小鼠研究Mesoscale Diagnostic (MSD) S-Plex分析用於以fg/ml濃度水平偵測小鼠及人類血漿中之存活素。值得關注地，使用此高靈敏度MSD S-Plex分析，顯示了血漿中之存活素的劑量依賴性調節( 圖 14)，此首次指示存活素為KRAS抑制之藥效學(PD)標誌。
在一個實例中，向小鼠皮下注射H358 KRAS G12C突變細胞。當腫瘤達到大致200 mm 3時，小鼠每天用媒劑或索托拉西布(3、10、30及100 mg/kg)處理一次，持續三天。自各小鼠收集血液，分離血漿且使用S-Plex存活素分析來分析存活素。如圖14 A及B中所展示，血漿中之存活素水平(圖14B)展示了與腫瘤中(14A)相同之劑量依賴性調節，此指示存活素為對KRAS抑制劑之反應的PD標誌，且存活素血漿水平可用於劑量遞增階段中之劑量發現且用於監測治療功效。
在用例示性GDP-KRAS抑制劑處理之後，MKN1腫瘤(圖14C)及小鼠血漿(圖14D)可展示類似相關性。再次向小鼠皮下注射MKN1 (GI，KRASWTamp)細胞。當腫瘤達到大致200 mm 3時，小鼠每天用媒劑或GDP-KRAS抑制劑處理一次，持續三天。自各小鼠收集血液，分離血漿且使用S-Plex存活素分析來分析存活素。
實例 9.3 ： 在 KRAS-WTamp 、 G12V 及 G12D 細胞株衍生異種移植 (CDX) 模型中之功效研究結束時 ， 小鼠血漿中之存活素下調及血漿存活素與腫瘤體積 (TV) 之相關性分別將SNU1196 (CRC，KRAS-WT amp；圖15 A及B)、CAPAN 2 (KRAS-G12V；圖15 C至E)及PK59 (KRAS-G12D)細胞皮下注射於免疫功能不全小鼠中。當腫瘤達到大致200 mm 3時，用例示性GDP抑制劑(與9.2中相同之抑制劑)或在表1中展示為G12D-cpd#2之G12D抑制劑處理小鼠。在功效研究結束時(第21天)，自各個別小鼠收集血液/血漿，且使用S-Plex分析來分析存活素水平。
如圖15 (A)及(B)中所展示，在於KRAS-WT擴增CDX模型中利用例示性GDP-KRAS抑制劑之功效研究結束時(第21天；圖15A)，小鼠血漿中之存活素下調，且存活素水平在活體內與腫瘤體積直接相關(圖15B)，此表明在功效研究結束時，血漿存活素水平與腫瘤體積之間呈強正相關性。圖15 (C)及(D)展示，在於KRAS-G12V活體內模型中利用示例性GDP-KRAS抑制劑之功效研究結束時(第21天)，小鼠血漿中之存活素以劑量依賴性方式下調，且展示在未攜帶腫瘤之未經處理之小鼠中未偵測到存活素。圖15 (E)展示亦在此模型中，存活素水平在活體內與腫瘤體積直接相關，此表明在功效研究結束時，血漿存活素水平與腫瘤體積之間呈強正相關性。圖15 (F)展示在於KRAS-G12D活體內模型中利用KRAS-G12D抑制劑之功效研究結束時(第21天)，小鼠血漿中之存活素下調。圖15 (G)額外展示兩種不同劑量(與F中相同之實驗)隨著時間推移之中值腫瘤體積且與對照組進行比較。圖15 (H)展示亦在此模型中，存活素水平在活體內與腫瘤體積直接相關，此表明在功效研究結束時，血漿存活素水平與腫瘤體積之間呈強正相關性。
如由此等圖式證明，存活素水平在活體內與腫瘤體積直接相關，此表明在功效研究結束時，血漿存活素水平與腫瘤體積之間呈強正相關性。因此，存活素可充當KRAS抑制之替代終點生物標記，且可方便地用作患者血液樣本中之循環生物標記以監測腫瘤治療期間之治療效果，藉此減少與侵入性腫瘤活組織切片檢查或繁瑣成像方法相關聯之患者的負擔。
實例 9.4 ： 在用 HER2 抑制劑 (HER2-cpd#1) 處理之 CDX 模型中之功效研究結束時 ， 腫瘤及血漿中之存活素水平下調及血漿存活素水平與腫瘤體積 (TV) 之間的相關性在第一組實驗中，且如圖16中所展示，在NSCLC Her2突變CDX (PC9 YMVA5)中用HER2抑制劑HER2-cpd#1處理之後，分析腫瘤(16A)以及血漿(16B)中之存活素水平下調。
在第二組實驗中，將NC-N87、SKGT-2或NCI-2170細胞皮下注射於免疫功能不全小鼠中。當腫瘤達到大致200 mm 3時，用媒劑或HER2-cpd#1處理小鼠。在功效研究結束時(第21天)，自各個別小鼠收集血液/血漿，且使用S-Plex分析來分析存活素水平。如圖16C-E中所展示，活體內存活素水平與腫瘤體積直接相關，且表明存活素水平與腫瘤體積(TV)之間呈強正相關性。因此，存活素亦可充當Her2抑制之替代終點生物標記，且可方便地用作患者血液樣本中之循環生物標記以監測腫瘤治療期間之治療效果，藉此減少與侵入性腫瘤活組織切片檢查或繁瑣成像方法相關聯之患者的負擔。
實例 9.5 ： TP53 WT CDX 及 PDX 模型中 MDM2 抑制劑 MDM2i-cpd#1 在 活體內對存活素水平 (RNA) 之 下調亦分析用MDM2i-cpd#1處理之兩種PDX模型中的存活素RNA水平。圖17A展示CRC PDX模型(Co10748,TP53 WT)中之存活素RNA下調，且圖17B展示惡性周邊神經鞘腫瘤之PDX模型(TP53WT)中的下調。
簡言之，對於CRC PDX (Co10748,TP53 WT)，用單次劑量5 mg/kg體重之MDM2i-cpd#1處理小鼠，且在24小時之後收集腫瘤且進行分析。對於惡性周邊神經鞘腫瘤之PDX模型(TP53WT)，用單次劑量1.5 mg/kg體重之MDM2i-cpd#1處理小鼠，且在24小時之後再次收集腫瘤且進行分析。結果表明，對於用MDM2抑制劑處理，存活素亦可充當MDM2抑制之替代終點生物標記，且可方便地用作患者血液樣本中之循環生物標記以監測腫瘤治療期間之治療效果，藉此減少與侵入性腫瘤活組織切片檢查或繁瑣成像方法相關聯之患者的負擔。
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圖 1.未經治療患者中之存活素水平；(A)在由HPAC細胞釋放之胞泌體中偵測到存活素，但在來自健康志願者之胞泌體中未偵測到；(B)健康對照組與癌症患者(結腸直腸癌，CRC；胰管腺癌，PDAC；及非小細胞肺癌，NSCLC)中之血漿存活素的比較；(C) CRC患者(安慰劑組)在不同時間點之存活素血漿水平。
圖 2.存活素/BIRC5為對KRAS抑制敏感之生物標記。活體內生物標記研究(HCC461)展示在每日用KRASG12D抑制劑處理3天之後，劑量依賴性存活素下調。
圖 3.用KRASG12D抑制劑處理2小時(頂部)及24小時(底部)之(A) GP2D細胞及(B) HPAC細胞中之ELISA分析，其展示用KRASG12D抑制劑處理24小時後，GP2D (左)及HPAC (右)細胞中之存活素下調。
圖 4.在用不同KRASG12C抑制劑處理之NCI-H358細胞中，存活素下調。ELISA分析展示用100 nM化合物G12C-cpd#1至G12C-cpd#11處理72小時之後，NCI-H358細胞中之存活素水平。
圖 5.在用不同KRASG12C抑制劑處理之NCI-H358細胞之培養基中，存活素下調。ELISA分析展示用100 nM化合物G12C-cpd#1至G12C-cpd#11處理72小時之後，H358之培養基中的存活素水平。
圖 6.在用不同KRASG12C抑制劑處理之NCI-H358細胞之胞泌體中，存活素下調。ELISA分析展示用100 nM化合物G12C-cpd#1至G12C-cpd#11處理72小時之後，H358細胞之胞泌體中的存活素水平。
圖 7.在用不同KRASG12D抑制劑及KRAS protac處理之SW1990細胞中，存活素下調。ELISA分析展示用300 nM化合物G12D-cpd#1至G12D-cpd#9處理72小時之後，SW1990細胞之細胞溶解產物中的存活素水平。
圖 8.在用不同KRASG12D抑制劑及KRAS Protac處理之SW1990細胞之培養基中，存活素下調。ELISA分析展示用300 nM化合物G12D-cpd#1至G12D-cpd#9處理72小時之後，SW1990細胞之上清液中的存活素水平。
圖 9.在用不同KRASG12D抑制劑及KRAS Protac處理之SW1990細胞之胞泌體中，存活素下調。ELISA分析展示用300 nM化合物G12D-cpd#1至G12D-cpd#9處理72小時之後，SW1990細胞之胞泌體中的存活素水平。
圖 10.ELISA分析展示用50 nM HER2-cpd#1處理之後，PC9細胞中之存活素水平。
圖 11.在活體內用兩種不同的GDP-KRAS抑制劑(Cpd#a、Cpd#b)處理後，存活素之劑量依賴性調節。
圖 12.在用KRASG12D抑制劑處理之後，SW1990 CDX模型中之腫瘤及血漿中之存活素的劑量依賴性調節。
圖 13.在用11種GDP-KRAS抑制劑(化合物編號參見表1)或DMSO處理72小時之SNU1196細胞(KRASWT amp)中之存活素調節。(A)細胞溶解產物；(B)胞泌體。
圖 14.H358腫瘤(A)及各別小鼠血漿(B)中之存活素的劑量依賴性調節，以及MKN1腫瘤(C)及各別小鼠血漿(D)中之存活素的調節。
圖 15.在CDX模型中之各種功效研究終止時存活素之下調及血漿存活素水平與腫瘤體積(TV)之間的相關性。(A, B) =用例示性GDP-KRAS抑制劑處理之KRAS-WTamp, CDX模型；(C - E) =用例示性GDP-KRAS抑制劑處理之KRAS-G12V CDX模型；且(F - H) =用在表1中展示為G12D-cpd#2之KRAS-G12D抑制劑處理的KRAS-G12D CDX模型，濃度展示於該圖式中。
圖 16.在用HER2抑制劑HER2-cpd#1處理之後的HER2突變PC9_YMVA-5 NSCLC CDX模型中之腫瘤(A)及血漿(B)中的存活素水平之下調；以及在用HER2抑制劑HER2-cpd#1之CDX模型((C) = NCI-N87、(D) = SK-GT-2、(E) = NCI-H2170)之功效研究終止時，血漿存活素水平與腫瘤體積之間的相關性。
圖 17.TP53 WT PDX模型中MDM2抑制劑MDM2i-cpd#1在活體內對存活素水平(RNA)之下調。(A)= CRC PDX模型(Co10748)；(B)=惡性周邊神經鞘腫瘤PDX。

Claims (20)

  1. 一種判定癌症患者對於用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之化合物治療之反應性的方法，該方法包含： 量測在用該化合物治療之前自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， 量測在用該化合物治療期間或之後自該患者獲得之第二樣本中的存活素水平， 比較該第二樣本中之存活素水平與該第一樣本中之存活素水平， 其中當該第二樣本中之存活素水平相較於該第一樣本中之存活素水平降低時，判定該患者對用該化合物之治療有反應。
  2. 一種判定癌症患者對於用抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物治療之反應性的方法，該方法包含： 量測在用該化合物治療之前自該患者獲得之第一樣本中的存活素水平， 量測在用該化合物治療期間或之後自該患者獲得之第二樣本中的存活素水平， 比較該第二樣本中之存活素水平與該第一樣本中之存活素水平， 其中當該第二樣本中之存活素水平相較於該第一樣本中之存活素水平降低時，判定該患者對用該化合物之治療有反應。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該第一樣本及/或該第二樣本為血液、血漿，或血清樣本。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中量測樣本中之存活素水平之步驟包含自該樣本分離胞泌體(exosomes)及量測該等胞泌體中所包含之存活素水平。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中存活素水平係使用選自由以下組成之群的存活素特異性分析量測：西方墨點法(Western Blot)、ELISA、RIA、FACS及MSD ®S-PLEX技術。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該癌症為KRAS依賴性癌症，較佳為選自由以下組成之群的KRAS依賴性癌症：胰管腺癌(PDAC)、非小細胞肺癌(NSCLC)，及結腸直腸癌(CRC)。
  7. 如請求項1及3至6中任一項之方法，其中抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之化合物係選自由以下組成之群：KRAS(G12C)抑制劑或降解劑、KRAS(G12D)抑制劑或降解劑、GDP-KRAS抑制劑或降解劑，及HER2抑制劑或降解劑。
  8. 如請求項1及3至7中任一項之方法，其中該KRAS(G12C)抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：索托拉西布(sotorasib) (AMG510)、阿達格拉西布(adagrasip) (MRTX849)、G12C-cpd#1、G12C-cpd#2、G12C-cpd#3、G12C-cpd#4、G12C-cpd#5、G12C-cpd#6、G12C-cpd#7、G12C-cpd#8、G12C-cpd#9、G12C-cpd#10，及G12C-cpd#11。
  9. 如請求項1及3至7中任一項之方法，其中該KRAS(G12D)抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：MRTX1133、G12D-cpd#2、G12D-cpd#3、G12D-cpd#4、G12D-cpd#5、G12D-cpd#6、G12D-cpd#7、G12D-cpd#8，及G12D-cpd#9。
  10. 如請求項1及3至7中任一項之方法，其中該GDP-KRAS抑制劑或降解劑係選自由以下組成之群：GDP-cpd#1、GDP-cpd#2、GDP-cpd#3、GDP-cpd#4、GDP-cpd#5、GDP-cpd#6、GDP-cpd#7、GDP-cpd#8、GDP-cpd#9、GDP-cpd#10、GDP-cpd#11、GDP-cpd#12、GDP-cpd#13及GDP-cpd#14。
  11. 如請求項1及3至7中任一項之方法，其中該HER2抑制劑為根據式F之化合物，較佳地其中該化合物為HER2-cpd#1。
  12. 如請求項2至6中任一項之方法，其中抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物為MDM2i-cpd#1。
  13. 一種抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之化合物，其用於治療癌症患者， i) 其中KRAS抑制劑係選自由以下組成之群：KRAS(G12C)抑制劑或降解劑、KRAS(G12D)抑制劑或降解劑、GDP-KRAS抑制劑或降解劑，及HER2抑制劑或降解劑；且 ii)     其中已如請求項1至11中任一項之方法判定該患者對於用該化合物之治療有反應。
  14. 一種抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物，其用於治療癌症患者， i) 其中抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物為MDM2i-cpd#1；且 ii)     其中已如請求項12之方法判定該患者對於用該化合物之治療有反應。
  15. 一種判定抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之化合物或抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物在治療癌症是否有效，及/或監測癌症患者對於該治療之反應的方法，該方法包含至少以下步驟： 提供來自該患者之第一樣本， 量測來自該患者之第一樣本中之存活素水平， 向該患者投與抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之化合物，接著 提供來自該患者之第二樣本， 量測該第二樣本中之存活素水平， 比較在該第一樣本及該第二樣本中所量測之存活素水平，及 視情況重複第四至第六步驟， 其中該第二樣本中之存活素水平降低指示有效反應。
  16. 一種存活素之用途，其用於判定化合物抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體的能力、或包含抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之化合物的醫藥調配物治療癌症之能力的方法中。
  17. 如請求項16之用途，其中存活素水平係在治療之前自該患者獲得之樣本中及在用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之化合物治療之後自該患者獲得之至少一個樣本中測定，且其中在用抑制KRAS蛋白或KRAS蛋白突變體之化合物治療之後存活素水平降低指示該化合物能夠治療該癌症。
  18. 一種存活素之用途，其用於判定化合物抑制MDM2與p53之間相互作用之能力、或包含抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物的醫藥調配物治療癌症之能力的方法中。
  19. 如請求項18之用途，其中存活素水平係在治療之前自該患者獲得之樣本中及在用抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物治療之後自該患者獲得之至少一個樣本中測定，且其中在用抑制MDM2與p53之間相互作用之化合物治療之後存活素水平降低指示該化合物能夠治療該癌症。
  20. 一種部件套組(kit of parts)，其包含用於測定患有癌症，較佳患有KRAS依賴性癌症之患者提供之樣本中存活素水平的構件及如何執行如請求項1至12及15中任一項之方法的說明書。
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