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TW202516003A - 用於治療神經退化性疾病之反義寡核苷酸 - Google Patents

用於治療神經退化性疾病之反義寡核苷酸 Download PDF

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TW202516003A
TW202516003A TW113122147A TW113122147A TW202516003A TW 202516003 A TW202516003 A TW 202516003A TW 113122147 A TW113122147 A TW 113122147A TW 113122147 A TW113122147 A TW 113122147A TW 202516003 A TW202516003 A TW 202516003A
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TW113122147A
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巴特 克藍
葛拉達斯 喬漢尼斯 普拉騰伯格
克里斯多夫 庫伊勒 多爾
馬汀 霍克斯
蘿拉 卡洛
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荷蘭商Ｐｒｏｑｒ治療上市公司Ｉｉ
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Abstract

本揭露係關於導引寡核苷酸，其至少部分與包含目標核苷酸之目標 RELN核酸序列之一部分互補，其中該目標 RELN核酸序列編碼絡絲蛋白(reelin)蛋白質，其中該導引寡核苷酸之組態使得其能夠在細胞內，於生理條件下，與該目標 RELN核酸序列之部分形成雙股複合物，且該雙股複合物能夠募集核酸編輯實體，以對該目標核苷酸進行編輯，從而產生包含經編輯目標核苷酸之經編輯 RELN核酸序列；以及其組合物、載體，及其相關之使用方法。

Description

用於治療神經退化性疾病之反義寡核苷酸
本揭露係關於醫學領域，且尤其關於諸如阿茲海默氏症之神經退化性疾病的領域。本揭露描述導引寡核苷酸，其介導 RELN基因及/或其編碼之轉錄本中的核苷酸特異性編輯，以引起經編碼絡絲蛋白(reelin)蛋白質發生變化，從而影響絡絲蛋白之活性。
為諸如阿茲海默氏症(AD)之神經退化性疾病找到有效的治療方法係一項緊迫且尚未滿足的醫療需求。AD係一種進行性神經病症，其特徵在於包括失智、認知減退、記憶喪失及日常功能減弱的症狀。AD通常開始得緩慢，且隨著年齡增長而逐漸惡化。迄今為止，儘管已為尋找AD之治療方法進行了大量研究工作，但大多未能成功找到有效的治療方法。
在分子層面上，由澱粉樣蛋白之前驅蛋白(Amyloid Precursor Protein，APP)聚集形成的澱粉樣蛋白斑塊，以及患者腦中沉積的由高度磷酸化Tau蛋白構成的所謂神經原纖維纏結，均為AD病理學之標誌。Tau蛋白為細胞骨架之重要組分。其正常功能為結合微管蛋白，穩定細胞內運動蛋白用於組織細胞運輸的微管結構。過度磷酸化Tau無法非常好地執行此功能，而Tau失調與發育過程中的神經元遷移紊亂及神經元變性有關，導致諸如帕金森氏症候群(Parkinsonism)及額顳葉型失智之神經退化性疾病，以及導致為表現突變Tau變異體而生成的動物模型出現神經退化。最近的一項研究(Lopera F等人, Nat Med .2023, 29:1243-1252)在一名人類個體中發現了由 RELN基因編碼之絡絲蛋白蛋白質中存在胺基酸突變，該突變能夠抵抗體染色體顯性阿茲海默氏症(ADAD)之症狀發作。在小鼠模型中證實了此絡絲蛋白變異體在保護免受AD方面的有效性。
在機制上，此絡絲蛋白突變之保護作用可藉由一個已在2002年假設的模型來合理解釋(Ohkubo N等人, FASEB J .2002, 17(2):295-297)。根據此模型(該模型後來由其他人優化)，絡絲蛋白透過脂蛋白元E受體(APOEr)/disabled-1 (Dab1)/糖原合酶激酶-3β (GSK3β)級聯反應參與Tau之磷酸化。藉由絡絲蛋白蛋白質與ApoE受體及其他與src家族激酶作為細胞內效應蛋白協同作用的鈣黏蛋白相關神經元受體(CNR)結合時，Dab1被磷酸化，從而激活Dab1以抑制兩種已知在神經原纖維纏結中鑑別出的位置上磷酸化Tau的下游激酶：GSK3β及CDK5。此一系列事件之結果為阻斷Tau之過度磷酸化，預期可改善Tau功能或甚至使Tau功能正常化，此支持如下假設：所描述之絡絲蛋白變異體之新增功能型態樣導致了所觀察到的針對ADAD之預防作用。
此處假設可使用本文所描述之方法鑑別絡絲蛋白中之其他新增功能型突變，且提出重新產生此等新增功能型變異體，以期在患有或容易發展出AD及其他形式之失智，諸如額顳葉型失智；及/或神經精神病症，包括思覺失調症、抑鬱症、自閉症、(顳葉)癲癇；及/或其他神經退化性病症，包括帕金森氏症候群、帕金森氏症(Parkinson's disease)、脊髓小腦失調及其類似病症的患者中產生臨床上有益的結果。
本揭露旨在提供可用於治療諸如AD之神經退化性疾病的導引寡核苷酸，其中該導引寡核苷酸藉由利用核酸編輯機制來靶向且修正 RELN基因或經編碼 RELN轉錄分子，較佳前驅mRNA及/或mRNA中的一或多個目標核苷酸，從而進行核酸編輯以產生經編輯 RELN核酸序列。
本揭露係關於一種導引寡核苷酸，其至少部分與包含目標核苷酸之人類 RELN核酸分子之一部分互補，其中 RELN核酸分子編碼絡絲蛋白蛋白質，其中導引寡核苷酸之組態使得其能夠在細胞，較佳腦細胞，更佳神經元內的生理條件下與 RELN核酸之部分形成雙股複合物，且該雙股複合物能夠募集細胞中天然存在的核酸編輯酶，以對該目標核苷酸進行編輯，從而產生包含經編輯目標核苷酸之經編輯 RELN核酸。較佳地，對目標核苷酸之編輯導致經編碼絡絲蛋白蛋白質之活性提高。更佳地，經編碼絡絲蛋白蛋白質具備新增功能型表型，該新增功能型表型選自以下中之一或多者：i)觸發信號傳導的能力增強，較佳為APOEr/Dab1/GSK3β路徑；ii)增加Dab1磷酸化的能力增強；iii)減少與神經原纖維纏結相關之Tau磷酸化的能力增強；iv)促進管狀結構形成及/或穩定性及/或神經元密度的能力增強；v)對蛋白水解降解的抗性增強；及/或vi) 絡絲蛋白蛋白質與醣胺聚糖，較佳肝素，及/或NRP1的結合增強。在另一較佳實施例中，對目標核苷酸之編輯在經編碼絡絲蛋白蛋白質中之胺基酸位置3446至3460中之一或多處引入胺基酸變異體，較佳地，其中對目標核苷酸之編輯在經編碼絡絲蛋白蛋白質中之胺基酸位置3447處引入組胺酸變為精胺酸之變化(H3447R)。應注意，胺基酸位置3447係關於 RELN同功型203 (Ensemble轉錄本ENST00000428762.6；RELN 203)，其為比同功型201之轉錄本長6個核苷酸的轉錄本。在同功型201中，組胺酸之密碼子編碼胺基酸3445。為了一致性，在整個本揭露中使用H3447R，但本文所揭露之導引寡核苷酸可在兩種同功型中引起目標腺苷之去胺，且在203中提供胺基酸變化H3447R，在201中提供胺基酸變化H3445R。應注意，在隨附實例中使用的人類iPSC前腦神經元中，同功型201為最豐富的 RELN同功型，而同功型203為此等細胞中第二豐富的同功型。較佳地，目標核苷酸為腺苷，且核酸編輯酶為作用於RNA之腺苷去胺酶(Adenosine Deaminase Acting on RNA，ADAR)。較佳地， RELN核酸分子為mRNA或前驅mRNA。
在一較佳實施例中，導引寡核苷酸包含SEQ ID NO: 102 (5'-UG UA GAA A CI UCU GAG CCC AUG UUGUCG UGA AA-3')或SEQ ID NO: 103 (5'-UG UA GAA A ZI UCU GAG CCC AUG UUGUCGUGAAA-3')中連續23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33個核苷酸的片段，且至少包含帶下劃線之核苷酸部分(分別表示為SEQ ID NO: 104 (5'-UA GAA A CI UCU GAG CCC AUG UUG-3')及SEQ ID NO: 105 (5'-UA GAA A ZI UCU GAG CCC AUG UUG-3'))，其中Z為胞苷類似物，其為包含6-胺基-5-硝基-3-基-2(1H)-吡啶酮核鹼基之核苷酸，較佳去氧核苷酸，且I為肌苷，較佳為去氧肌苷。在另一較佳實施例中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含結構(自5'至3')： N 8N 7N 6N 5N 4N 3N 2N 1ᶿZdId^M 2M 3M 4M 5M 6M 7M 8M 9M 10M 11M 12M 13M 14M 15M 16M 17M 18M 19M 20M 21M 22M 23M 24其中：Zd為核苷酸位置0處之孤兒核苷酸，其為攜帶Benner鹼基之去氧核苷酸；N 1為Ae或Ad；N 2為Af；N 3及N 5各自獨立地為Am或Af；N 4為Gf；N 6為Uf；N 7不存在(則N 8亦不存在)，為Gm或Gf；N 8不存在或為Um；Id為去氧肌苷；M 2為Um；M 3為Cf；M 4、M 14及M 15各自獨立地為m5Ue或Um；M 5及M 7為Gf；M 6為Am或Af；M 8及M 10各自獨立地為Cm或Cf；M 9為Cf；M 11為Am；M 12為Um；M 13為Gm；M 16為Ge或Gm；M 17不存在(當M 18至M 24亦不存在時)，為m5Ue或Um；M 18不存在(當M 19至M 24亦不存在時)，為Cm或m5Ce；M 19不存在(當M 20至M 24亦不存在時)，為Gm或Ge；M 20不存在(當M 21至M 24亦不存在時)，為Um或m5Ue；M 21不存在(當M 22至M 24亦不存在時)，為Gm或Ge；M 22不存在(當M 23及M 24亦不存在時)，為Am或Ae；M 23不存在(當M 24亦不存在時)，或為Ae；M 24不存在，或為Ae；ᶿ位於鍵聯位置0處，且為PO鍵聯或甲磺醯基胺基磷酸酯(PNms)鍵聯；^位於鍵聯位置-2處，且為MP或PNms鍵聯；所有其他鍵聯為PO、PS、PNdmi或PNms鍵聯；及其中Gm、Am、Um及Cm分別為2'- O-甲基(2'-OMe)修飾之鳥苷、腺苷、尿苷及胞苷；m5Ce為2'- O-甲氧基乙基(亦稱作2'-甲氧基乙氧基、2'- O-MOE，或簡稱2'-MOE)修飾之5-甲基胞苷；Ge為2'-MOE修飾之鳥苷；Ae為2'-MOE修飾之腺苷；m5Ue為2'-MOE修飾之5-甲基尿苷(有時亦稱為「Te」」；2'-MOE修飾之胸苷)；Af、Uf、Gf及Cf分別為2'-氟(2'-F)修飾之腺苷、尿苷、鳥苷及胞嘧啶。
本揭露亦關於一種載體，較佳為病毒載體，更佳為腺相關病毒(AAV)載體，其包含編碼本文所揭露之導引寡核苷酸之核酸分子。本揭露亦關於本文所揭露之導引寡核苷酸，其用於治療、改善神經退化性疾病，較佳AD，更佳ADAD，或減緩其進展。
本揭露係關於一種治療、改善有需要之人類個體之神經退化性疾病、較佳AD、更佳ADAD，或減緩其進展的方法，該方法包含向該個體投與本文所揭露之導引寡核苷酸，藉此編輯目標 RELN核酸序列以編碼絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質能夠延緩神經退化性疾病之一或多種症狀發作。
據認為，本文首次揭露可驅動編輯目標 RELN核酸序列的導引寡核苷酸。該等導引寡核苷酸可用作治療劑以治療、改善諸如AD之神經退化性疾病，或減緩其進展。舉例而言，已鑑別出，在絡絲蛋白蛋白質中僅改變單個胺基酸可足以啟動或增強減緩AD進展的保護性路徑。藉由靶向 RELNDNA序列或(前驅) mRNA轉錄分子，此技術在基因層面上發揮作用。因此，本揭露開啟了使用特異性基因編輯技術治療神經退化性疾病的一個全新領域。基因編輯技術不受特別限制。適合之技術包括已知的利用導引寡核苷酸之基因療法技術，其包括DNA編輯技術，諸如基於Cas9之技術，以及RNA編輯技術，諸如ADAR介導之編輯技術。DNA編輯技術及RNA編輯技術各具有優缺點。舉例而言，DNA編輯基因療法可在DNA分子中產生永久性變化，且因此針對特定病症可僅需要單次治療。在某些情況下，可能不需要或不希望對DNA進行不可逆的改變。RNA編輯之優點則在於短暫性：僅編輯RNA且隨時間推移產生經修正蛋白質，但當導引寡核苷酸已被代謝過程分解且產生新mRNA時，「舊」版本之蛋白質再次產生。視疾病及嚴重程度而定，可以選擇適當之方式來改變編碼絡絲蛋白蛋白質之核酸。 實施例
根據第一態樣，本揭露提供一種導引寡核苷酸，其至少部分與包含目標核苷酸之人類 RELN核酸分子之一部分互補，其中 RELN核酸分子編碼絡絲蛋白蛋白質，其中導引寡核苷酸之組態使得其能夠在細胞內，於生理條件下，與 RELN核酸之部分形成雙股複合物，且雙股複合物能夠募集細胞中天然(=內源性)存在的核酸編輯酶，以對目標核苷酸進行編輯，從而產生包含經編輯目標核苷酸之經編輯 RELN核酸。
在一些實施例中，對目標核苷酸之編輯導致經編碼絡絲蛋白蛋白質之活性提高，較佳選自以下中之一或多者： - 觸發信號傳導的能力增強，較佳為APOEr/Dab1/GSK3β路徑； - 增加Dab1磷酸化的能力增強； - 減少與神經原纖維纏結相關之Tau磷酸化的能力增強； - 促進管狀結構形成及/或穩定性及/或神經元密度的能力增強； - 對蛋白水解降解的抗性增強；及/或 - 絡絲蛋白蛋白質與醣胺聚糖，較佳肝素，及/或NRP1的結合增強。
在一些實施例中，對目標核苷酸之編輯在經編碼絡絲蛋白蛋白質中之胺基酸位置3446至3460中之一或多處引入胺基酸變異體，較佳地，其中對目標核苷酸之編輯在經編碼絡絲蛋白蛋白質中之胺基酸位置3447處引入組胺酸變為精胺酸之變化(H3447R)。
在一些實施例中，細胞為腦細胞，較佳為神經元。
在一些實施例中，目標核苷酸為腺苷，且核酸編輯酶為ADAR酶。
在一些實施例中， RELN核酸分子為mRNA或前驅mRNA。
在一些實施例中，孤兒核苷酸為導引寡核苷酸中與目標核苷酸相對之核苷酸，其中核苷酸編號方式為：孤兒核苷酸編號為0，且核苷酸進一步向5'端正(+)遞增且向3'端負(-)遞增，且其中至少一個核鹼基、糖或核苷間鍵聯已經化學修飾。在一些實施例中，孤兒核苷酸為去氧胞苷、胞苷類似物、去氧尿苷，或尿苷類似物。胞苷類似物較佳為包含6-胺基-5-硝基-3-基-2(1H)-吡啶酮核鹼基(本文中及別處亦稱為「Benner鹼基」，或Z)之去氧核苷酸。尿苷類似物較佳為包含異尿嘧啶核鹼基之去氧核苷酸。在一些實施例中，導引寡核苷酸之長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸。
在一些實施例中，導引寡核苷酸包含SEQ ID NO: 102 (5'-UG UA GAA A CI UCU GAG CCC AUG UUGUCG UGA AA-3')或SEQ ID NO: 103 (5'-UG UA GAA A ZI UCU GAG CCC AUG UUGUCGUGAAA-3')中連續23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33個核苷酸的片段，至少包含帶下劃線之核苷酸部分(分別為SEQ ID NO: 104 (5'-UA GAA A CI UCU GAG CCC AUG UUG-3')及SEQ ID NO: 105 (5'-UA GAA A ZI UCU GAG CCC AUG UUG-3'))，其中Z為核苷酸，較佳為去氧核苷酸，其包含Benner鹼基，且I為肌苷，較佳為去氧肌苷。
在一些實施例中，導引寡核苷酸包含一或多個核苷間鍵聯修飾，其各自獨立地選自硫代磷酸酯(PS)、膦醯基乙酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯(MP)、磺醯基胺基磷酸酯、(1,3-二甲基亞咪唑啶-2-基)胺基磷酸酯(PNdmi)，或具有根據式(I)之結構之鍵聯修飾。 其中：X=O或S；且R=芳基、經取代芳基、雜環、經取代雜環、芳族雜環、經取代芳族雜環、C 1-C 6烷氧基、經取代C 1-C 6烷氧基、C 1-C 20烷基、經取代C 1-C 20烷基、C 1-C 6烯基、C 1-C 6經取代烯基、C 1-C 6炔基、經取代C 1-C 6炔基，或偶聯基團(conjugate group)。在一較佳實施例中，X=O且R=甲基。在彼實施例中，該鍵聯修飾通常稱為甲磺醯基胺基磷酸酯(PNms)。
在一些實施例中，導引寡核苷酸之核苷間鍵聯編號方式為：鍵聯編號0為孤兒核苷酸中之鍵聯5'，且寡核苷酸中之鍵聯位置向5'端正(+)遞增且向3'端負(-)遞增，且其中鍵聯位置-2為MP或PNms鍵聯。
在一些實施例中，導引寡核苷酸包含一或多個核苷酸，該一或多個核苷酸在核糖之2'、3'及/或5'位置處包含單取代或二取代基，其各自獨立地選自由以下組成之群：-OH；-F；經取代或未經取代、直鏈或分支鏈低碳(C 1-C 10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基，其可能間雜有一或多個雜原子；-O-、S-或N-烷基；-O-、S-或N-烯基；-O-、S-或N-炔基；-O-、S-或N-烯丙基；-O-烷基-O-烷基；-甲氧基；-胺基丙氧基；-甲氧基乙氧基；-二甲胺基氧基乙氧基；及-二甲胺基乙氧基乙氧基。
在一些實施例中，目標 RELN核酸序列之部分包含選自SEQ ID NO: 1及2之核苷酸序列中連續9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33個核苷酸的片段： 5'-… CAACATGGGCTC AGAC ATTTC TACAACAGAAGA …-3' (SEQ ID NO: 1)；及 5'-… CAACAUGGGCUC AGAC AUUUC UACAACAGAAGA …-3' (SEQ ID NO: 2) 且至少包含帶下劃線之核苷酸部分，其中粗體A為目標核苷酸且其中核酸編輯實體為ADAR，較佳為人類ADAR1及/或人類ADAR2，甚至更佳地，其中ADAR酶天然表現於細胞中(=內源性的)。
在一些實施例中，對目標核苷酸之編輯導致絡絲蛋白蛋白質之表現量提高、活性提高及/或穩定性提高。
在一些實施例中，核酸編輯實體為核酸編輯酶，較佳為去胺酶，更佳為腺苷去胺酶，諸如人類ADAR1 (hADAR1)及人類ADAR2 (hADAR2)，或胞苷去胺酶。
在一些實施例中，核酸編輯實體天然表現於細胞中(亦即細胞內源性)。
在一些實施例中，目標 RELN核酸序列天然表現於細胞內。
在一些實施例中，目標 RELN核酸序列為DNA。
在一些實施例中，核酸編輯實體選自包含以下之清單：Cas9酶；鹼基編輯酶；dCas9-去胺酶；dCas9-腺苷去胺酶；dCas9-胞苷去胺酶；先導編輯酶(prime editing enzyme)；或Cas9切口酶。
在一些實施例中，導引寡核苷酸之5'及/或3'末端上之最末端兩個核苷酸之間的鍵聯為PNdmi鍵聯或PNms鍵聯，較佳地，其中兩個最末端鍵聯均為PNms鍵聯。
在一些實施例中，孤兒核苷酸(-1)之3'之第一個核苷酸為去氧肌苷。
在一些實施例中，導引寡核苷酸包含選自以下之核苷酸序列中連續9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33個核苷酸的片段： 5'-…TCTTCTGTTGTA GAAA CGTCT GAGCCCATGTTG…-3' (SEQ ID NO: 3)， 5'-…TCTTCTGTTGTA GAAA CITCT GAGCCCATGTTG…-3' (SEQ ID NO: 4)， 5'-…UCUUCUGUUGUA GAAA CGUCU GAGCCCAUGUUG…-3' (SEQ ID NO: 5)，及 5'-…UCUUCUGUUGUA GAAA CIUCU GAGCCCAUGUUG…-3' (SEQ ID NO: 6) 且包含至少帶下劃線之核苷酸部分。
在一些實施例中，導引寡核苷酸至少包含SEQ ID NO: 6之帶下劃線部分，其中孤兒核苷酸(帶下劃線部分中，中間的粗體C)為攜帶胞苷類似物，較佳Benner鹼基之去氧核苷酸(Zd，而非C；參見國際專利申請公開案第WO2022/252376號)，且其中核苷酸位置-1為去氧肌苷(Id)。
在一些實施例中，導引寡核苷酸至少包含SEQ ID NO: 6之帶下劃線部分，其中孤兒核苷酸(帶下劃線部分中，中間的粗體C)為去氧尿苷，且其中核苷酸位置-1為去氧肌苷(Id)。
在一些實施例中，導引寡核苷酸至少包含SEQ ID NO: 6之帶下劃線部分，其中孤兒核苷酸(帶下劃線部分中，中間的粗體C)為攜帶尿苷類似物，較佳異尿嘧啶之去氧核苷酸，且其中核苷酸位置-1為去氧肌苷(Id)。
在一些實施例中，導引寡核苷酸至少包含SEQ ID NO: 6之帶下劃線部分，其中孤兒核苷酸(帶下劃線部分中，中間的粗體C)為攜帶Benner鹼基之去氧核苷酸(Zd，而非C)，其中核苷酸位置-1為Id，且其中核苷酸位置+1為去氧腺苷(Ad)或其中核糖之2'位置經2'-O-甲氧基乙基(亦稱作2'-甲氧基乙氧基、2'-O-MOE或簡稱2'-MOE)取代的腺苷(Ae)，較佳地，其中鍵聯位置-2為MP或PNms鍵聯，更佳為PNms鍵聯。
在一些實施例中，導引寡核苷酸至少包含SEQ ID NO: 6之帶下劃線部分，其中孤兒核苷酸(帶下劃線部分中，中間的粗體C)為攜帶Benner鹼基之去氧核苷酸(Zd，而非C)，其中核苷酸位置-1為Id，其中緊鄰孤兒核苷酸之5'部分之長度為6、7、或8個核苷酸，且其中緊鄰孤兒核苷酸之3'部分之長度至少為16個核苷酸，更佳為16、17、18、19、20、、21、22、23或24個核苷酸。
在一些實施例中，導引寡核苷酸包含結構(自5'至3')： N 8N 7N 6N 5N 4N 3N 2N 1ᶿZdId^M 2M 3M 4M 5M 6M 7M 8M 9M 10M 11M 12M 13M 14M 15M 16M 17M 18M 19M 20M 21M 22M 23M 24其中： - Zd為核苷酸位置0處之孤兒核苷酸，其為攜帶Benner鹼基之去氧核苷酸； - N 1為Ae或Ad； - N 2為Af； - N 3及N 5各自獨立地為Am或Af； - N 4為Gf； - N 6為Uf； - N 7不存在(若如此，則N8亦不存在)，為Gm或Gf； - N8不存在或為Um； - Id為去氧肌苷； - M 2為Um； - M 3為Cf； - M 4、M 14及M 15各自獨立地為m5Ue或Um； - M 5及M 7為Gf； - M 6為Am或Af； - M 8及M 10各自獨立地為Cm或Cf； - M 9為Cf； - M 11為Am； - M 12為Um； - M 13為Gm； - M 16為Ge或Gm； - M 17不存在(若如此，則M 18至M 24亦不存在)，為m5Ue或Um； - M 18不存在(若如此，則M 19至M 24亦不存在)，為Cm或m5Ce； - M 19不存在(若如此，則M 20至M 24亦不存在)，為Gm或Ge； - M 20不存在(若如此，則M 21至M 24亦不存在)，為Um或m5Ue； - M 21不存在(若如此，則M 22至M 24亦不存在)，為Gm或Ge； - M 22不存在(若如此，則M 23及M 24亦不存在)，為Am或Ae； - M 23不存在(若如此，則M 24亦不存在)，或為Ae； - M 24不存在，或為Ae； - ᶿ位於鍵聯位置0處，且為PO鍵聯或PNms鍵聯； - ^位於鍵聯位置-2處，且為MP或PNms鍵聯； - 所有其他鍵聯為PO、PS、PNdmi或PNms鍵聯；及 其中Gm、Am、Um及Cm分別為2'- O-甲基(2'-OMe)修飾之鳥苷、腺苷、尿苷及胞苷；m5Ce為2'-MOE修飾之5-甲基胞苷；Ge為2'-MOE修飾之鳥苷；Ae為2'-MOE修飾之腺苷；m5Ue為2'-MOE修飾之5-甲基尿苷(有時亦稱為「Te」」；2'-MOE修飾之胸苷)；Af、Uf、Gf及Cf分別為2'-F修飾之腺苷、尿苷、鳥苷及胞嘧啶。
在一些實施例中，導引寡核苷酸包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 41、44、50、58、59、60、61、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93及94中之任一者之序列。較佳地，導引寡核苷酸包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 65、66、90、64、88、89、69、67、82、83、84、58、61、59、60、41、44、50、68、70、71、72、73、78、79、80、81、85、86及87中之任一者之序列。
在一些實施例中，導引寡核苷酸與三萜醣苷，較佳AG1856結合，較佳偶聯。
根據第二態樣，本揭露提供一種載體，較佳為病毒載體，更佳為腺相關病毒(AAV)載體，其包含編碼根據本揭露之第一態樣之導引寡核苷酸的核酸分子。
根據第三態樣，本揭露提供一種醫藥組合物，其包含根據本揭露之第一態樣之導引寡核苷酸或根據本揭露之第二態樣之載體，及醫藥學上可接受之載劑。
根據第四態樣，本揭露提供一種根據本揭露之第一態樣之導引寡核苷酸，或根據本揭露之第二態樣之載體，或根據本揭露之第三態樣之醫藥組合物，其用於治療、改善神經退化性疾病，較佳AD，更佳ADAD，或減緩其進展。
根據第五態樣，本揭露提供一種根據本揭露之第一態樣之導引寡核苷酸，或根據本揭露之第二態樣之載體，或根據本揭露之第三態樣之醫藥組合物的用途，其用於製造用於治療、改善神經退化性疾病，較佳AD，更佳ADAD，或減緩其進展的藥物。
根據第六態樣，本揭露提供一種治療、改善有需要之人類個體之神經退化性疾病、較佳AD、更佳ADAD，或減緩其進展的方法，該方法包含向該個體投與根據本揭露之第一態樣之導引寡核苷酸，或根據本揭露之第二態樣之載體，或根據本揭露之第三態樣之醫藥組合物，藉此編輯目標 RELN核酸序列以編碼絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質能夠延緩神經退化性疾病，較佳AD，更佳ADAD之一或多種症狀發作。
根據第七態樣，本揭露提供一種活體外、離體或活體對細胞中之目標 RELN核酸序列中之目標腺苷進行去胺的方法，該方法包含以下步驟：(i)向細胞提供根據本揭露之第一態樣之導引寡核苷酸，或根據本揭露之第二態樣之載體，或根據本揭露之第三態樣之醫藥組合物；(ii)允許細胞攝取導引寡核苷酸或載體或組合物；(iii)允許導引寡核苷酸與目標 RELN核酸序列黏接；及(iv)允許核酸編輯實體編輯目標。
在一些實施例中，該方法包含步驟(v)：使用功能性讀出以鑑定經編輯目標核苷酸之存在。
在一些實施例中，該方法包含在投與導引寡核苷酸之前、之後或同時投與三萜醣苷的步驟。在一些實施例中，三萜醣苷為AG1856。在一較佳態樣中，三萜醣苷，諸如AG1856與導引寡核苷酸以(非)共價方式鍵結，以便在導引寡核苷酸進入需要發生目標核苷酸去胺的目標細胞後，改善內體逃逸能力。
根據第八態樣，本揭露提供一種在細胞、較佳腦細胞中編輯人類 RELN核酸序列的方法，其中該人類 RELN核酸序列為前驅mRNA或mRNA，該方法包含使目標 RELN核酸序列與能夠觸發ADAR介導之腺苷成為肌苷之去胺作用的導引寡核苷酸接觸，藉此編輯目標 RELN核酸序列以編碼絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質能夠延緩神經退化性疾病，較佳AD，更佳ADAD之一或多種症狀發作。
根據第九態樣，本揭露提供一種導引寡核苷酸，其用於藉由提供導引寡核苷酸且允許導引寡核苷酸與人類 RELN前驅mRNA或mRNA分子雜交，藉此吸引ADAR酶以對目標腺苷進行去胺，從而編輯人類 RELN前驅mRNA或mRNA分子中之目標腺苷，其中目標區域為SEQ ID NO: 106，且其中目標腺苷為編碼 RELN編碼之人類絡絲蛋白蛋白質中之位置3447處之組胺酸的密碼子的第二個核苷酸。在第九態樣之一些實施例中，核酸分子選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 65、66、90、64、88、89、69、67、82、83、84、58、61、59、60、41、44、50、68、70、71、72、73、78、79、80、81、85、86及87。在第九態樣之一些實施例中，核酸分子包含至少一個非天然存在之化學修飾，及/或在核糖、鍵聯或鹼基部分中包含一或多個額外非天然存在之化學修飾，其限制條件為孤兒核苷酸，即核酸中與目標區域中之目標腺苷直接相對的核苷酸，不為包含2'-OMe核糖取代基之胞苷。 定義
本文所提及之導引寡核苷酸有時稱作反義寡核苷酸(AON)。儘管編輯事件係由核酸編輯實體執行的，而寡核苷酸之作用僅觸發編輯發生，但其有時亦稱作「編輯寡核苷酸」或「EON」。除非上下文另外規定，否則每當提及導引寡核苷酸、寡核苷酸、寡聚、ON、ASO、寡核苷酸組合物、反股寡核苷酸、AON、(RNA)編輯寡核苷酸、EON及RNA (反義)寡核苷酸時，均意謂寡核糖核苷酸及去氧寡核糖核苷酸兩者。潛在地，寡核苷酸可能完全缺乏RNA及DNA核苷酸(如其在自然界中所呈現)且可完全由經修飾核苷酸組成。每當提及「寡核糖核苷酸」時，可包含鹼基A、G、C、U或I。每當提及「去氧寡核糖核苷酸」時，可包含鹼基A、G、C、T或I。然而，本文所揭露之導引寡核苷酸可包含核糖核苷酸與去氧核糖核苷酸之混合物。當使用去氧核糖核苷酸時，因此在糖之2'位置處不具有修飾時，核苷酸通常縮寫為dA (或Ad)、dC (或Cd)、dG (或Gd)或T，其中「d」表示核苷之去氧性質，而為正常RNA或在2'位置處經修飾之核糖核苷通常縮寫為不帶「d」，且通常縮寫為具有其各別修飾且如本文中所解釋。
術語「核苷」係指連接至(去氧)核糖基糖之核鹼基，其不含磷酸酯基團。「核苷酸」由核苷及一或多個磷酸酯基團構成。因此，術語「核苷酸」係指各別核鹼基-(去氧)核糖基-磷酸連接子，以及核糖部分或磷酸基團之任何化學修飾。因此，該術語將包括：包括鎖定的核糖基部分(包含2'-4'橋，其包含亞甲基或任何其他基團)之核苷酸、非鎖定核酸(UNA)、蘇糖核酸(TNA)、包括連接子之核苷酸，該連接子包含磷酸二酯(PO)、膦醯基乙酸酯、磷酸三酯、PS、(二)硫代磷酸酯、MP (或MeP)、甲基硫代膦酸酯、胺基磷酸酯鍵聯、PNdmi，及根據本文中所描述之式(I)結構之鍵聯。除非上下文明確要求不同，否則術語核鹼基、核苷及核苷酸有時可互換使用，例如當核苷連接至相鄰核苷且此等核苷之間的鍵聯經修飾時。如本文中所陳述，核苷酸為核苷加一或多個磷酸酯基團。術語「核糖核苷」及「去氧核糖核苷」，或「核糖」及「去氧核糖」係如此項技術中所使用。
術語腺苷及腺嘌呤、鳥苷及鳥嘌呤、胞苷及胞嘧啶、尿嘧啶及尿苷、胸腺嘧啶及胸苷/尿苷、肌苷及次黃嘌呤有時可互換使用，以一方面指對應之核鹼基，且另一方面指核苷或核苷酸。核鹼基胸腺嘧啶(T)亦稱為5-甲基尿嘧啶(m 5U)且為尿嘧啶(U)衍生物；胸腺嘧啶及5-甲基尿嘧啶在整個文件文本中可互換。同樣，核苷酸胸苷亦稱為5-甲基尿苷且為尿苷衍生物；胸苷及5-甲基尿苷在整個文件文本中可互換。
每當提及寡核苷酸中之核苷酸，包括諸如胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-甲醯基胞嘧啶、5-乙醯基胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶，及β-D-葡萄糖苷基-5-羥甲基胞嘧啶。每當提及腺嘌呤時，包括N6-甲基腺嘌呤、8-側氧基-腺嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及7-甲基腺嘌呤。每當提及尿嘧啶時，包括二氫尿嘧啶、異尿嘧啶、N3-醣基化尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N1-甲基假尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶及5-羥甲基尿嘧啶。每當提及鳥嘌呤時，包括1-甲基鳥嘌呤、7-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、N2,N2,7-三甲基鳥苷及N2,7-二甲基鳥苷。每當提及核苷或核苷酸時，包括呋喃核糖衍生物，諸如2'-去氧、2'-羥基，及2'- O-取代之變異體，諸如2'-OMe，以及其他修飾，包括2'-4'橋接之變異體。每當提及寡核苷酸時，一或多個鍵聯可為天然存在之磷酸二酯鍵聯，而兩個單核苷酸之間的剩餘鍵聯可為經修飾鍵聯。此類經修飾鍵聯之實例為膦醯基乙酸酯、磷酸三酯、PS、(二)硫代磷酸酯、MP、胺基磷酸酯鍵聯、磷醯基胍、硫代磷醯基胍、磺醯基胺基磷酸酯、PNdmi及根據式(I)之鍵聯結構，進一步詳細描述於下文。
術語「包含(comprising)」涵蓋「包括(including)」以及「由……組成」，例如「包含X」之組合物可排他性地由X組成或可包括其他某物，例如X+Y。與數值 x相關之術語「約」可視情況選用且意謂例如 x±10%。
字語「實質上」不排除「完全」，例如「實質上不含Y」之組合物可完全不含Y。在相關情況下，字語「實質上」可自本揭露或申請專利範圍之定義中省略。
術語「有助於」或「介導」可與「能夠促進」互換使用。在有利於ADAR編輯(或可介導ADAR編輯)之導引寡核苷酸的情形下，此意謂導引寡核苷酸在進入細胞後，與目標RNA序列相互作用，藉此形成由ADAR酶識別之雙股結構，接著該ADAR酶可將目標腺苷去胺為肌苷。因此，導引寡核苷酸自身不具有酶促功能(ADAR酶具有)，但其可在結合至目標RNA分子之後觸發、誘導、引起、組織、介導、提供、給出、產生、促進及/或導致RNA編輯。
術語「錯配」在本文中用於指雙股RNA複合物中的相對核苷酸根據Watson-Crick鹼基配對規則不能形成完美鹼基對。在歷史意義上，錯配之核苷酸為G-A、C-A、U-C、A-A、G-G、C-C、U-U對。在一些實施例中，導引寡核苷酸包含少於四個與目標序列的錯配，例如0、1或2個錯配。「搖擺」鹼基對為G-U、I-U、I-A及I-C鹼基對。當U與目標A相對置放時，不存在錯配，且導引寡核苷酸可100%互補。當C與目標A相對置放時，導引寡核苷酸與目標序列之間存在至少1個錯配。儘管將G:G配對視為錯配，但其未必意謂相互作用不穩定，此意謂基於本揭露，術語「錯配」可能有些過時，其中Hoogsteen鹼基配對可視為基於核苷酸來源之錯配，但仍相對穩定。例如，雙螺旋RNA中經分離之G:G配對可能非常穩定，但仍定義為錯配。對ADAR酶之天然目標之分析已表明，此等通常包括在兩個股之間的錯配，該兩個股形成由ADAR1或2編輯之RNA螺旋。已表明此等錯配增強編輯反應之特異性(Stefl等人, 2006. Structure14(2):345-355；Tian等人, 2011. Nucleic Acids Res39(13):5669-5681)。導引寡核苷酸與目標RNA之間的配對/錯配核苷酸之最佳模式的表徵對於開發基於ADAR之高效AON療法亦至關重要。
如本文中所使用，術語「互補」係指導引寡核苷酸在生理條件下與第二核酸股雜交的事實。實例為(i)當作為第一核酸股之導引寡核苷酸(=導引寡核苷酸)與第二互補核酸股(活體外)形成異雙螺旋RNA編輯寡核苷酸複合物時，或(ii)當其與目標RNA分子形成雙股複合物時。該術語未必意謂核酸股中之各核苷酸與其逆序列中之相對核苷酸完美配對。換言之，雖然導引寡核苷酸可與目標序列互補，但導引寡核苷酸與目標序列之間可能存在錯配、搖擺及/或凸起，而在生理條件下，導引寡核苷酸仍與目標序列雜交，使得細胞RNA編輯酶可將目標腺苷去胺為肌苷。因此，術語「實質上互補」亦意謂，儘管存在錯配、搖擺及/或凸起，但導引寡核苷酸與目標序列之間有足夠的匹配核苷酸，使得在生理條件下導引寡核苷酸與目標RNA分子雜交。如本文中所示，若在生理條件下導引寡核苷酸能夠與其目標雜交，則導引寡核苷酸可為與目標序列互補的，但亦可包含一或多個與目標序列之錯配、搖擺及/或凸起。
術語「孤兒核苷酸」係關於導引寡核苷酸中與目標腺苷直接相對的核苷酸，該目標腺苷為由去胺酶去胺之腺苷。孤兒核苷酸可為天然胞苷或去氧胞苷，或者尿苷或去氧尿苷。其亦可為下文進一步詳細描述之經化學修飾之核苷酸，或天然(去氧)胞苷之已知或經化學修飾之類似物，諸如攜帶Benner鹼基(6-胺基-5-硝基-3-基-2(1H)-吡啶酮)的核苷酸，或天然(去氧)尿苷之已知或經化學修飾之類似物，諸如異尿苷，如下文進一步詳細概述。
「核苷酸類似物」係指核酸核苷酸之類似物。核苷酸類似物為腺苷、鳥苷、胞苷、胸苷、尿苷、去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胞苷、去氧胸苷或去氧尿苷之類似物。
與核酸序列有關之術語「下游」意謂在3'方向上進一步沿著序列向前；術語「上游」之意義則相反。因此，在編碼多肽之任何序列中，起始密碼子在有義股中之終止密碼子的上游，但在反義股中之終止密碼子的下游。此同樣適用於本文所揭露之導引寡核苷酸。反義導引寡核苷酸中位於孤兒核苷酸上游之核苷酸朝向5'末端置放，而孤兒核苷酸下游之核苷酸朝向3'末端置放。
本文所揭露之導引寡核苷酸中的核苷酸「編號方式」為：孤兒核苷酸編號為0，且孤兒核苷酸之5'之核苷酸為編號+1。計數進一步朝5'端正(+)遞增且朝3'端負(-)遞增，其中孤兒核苷酸之3'之第一個核苷酸為編號-1。導引寡核苷酸中核苷間鍵聯之編號方式為：編號為0之鍵聯為孤兒核苷酸之5'之鍵聯，且寡核苷酸中鍵聯位置朝5'端正(+)遞增且朝3'端負(-)遞增。
提及「雜交」通常係指特異性雜交且排除非特異性雜交。特異性雜交可使用此項技術中熟知之技術，在所選擇之實驗條件下發生，以確保探針與目標之間的最穩定的相互作用發生在探針與目標具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%序列一致性時。
術語「剪接突變」係關於編碼前驅mRNA之基因發生突變，其中剪接機制功能異常，亦即自外顯子中剪接內含子受到干擾，且由於異常的剪接，後續轉譯偏離框架，導致所編碼之蛋白質過早終止。通常此類縮短之蛋白質快速降解且不具有任何功能活性。
每當提及與本文所揭露之導引寡核苷酸相關的「裸露」形式時，其意謂導引寡核苷酸係在實驗室或製造設施中製造的，通常透過該實驗室或製造設施對該導引寡核苷酸進行化學修飾，以防止該導引寡核苷酸在投與後進入哺乳動物身體或組織或細胞後快速降解。因此，導引寡核苷酸之裸露形式不同於由病毒基因體編碼(及遞送)或在質體載體內編碼(及遞送)的導引寡核苷酸形式。當投與該等病毒載體或質體載體時，經編碼導引寡核苷酸係由病毒載體基因體或質體在該病毒載體或質體載體被遞送到的細胞中表現。因此，導引寡核苷酸未經化學修飾，僅包含天然存在之核苷酸，較佳為天然存在之RNA核苷酸。
值得注意的是，當導引寡核苷酸包含本文詳述之化學修飾時，其仍可透過遞送媒劑之方式遞送。適合之遞送媒劑為奈米粒子遞送媒劑，諸如聚合奈米粒子、樹枝狀聚合物、無機奈米粒子及奈米晶體、有機奈米晶體，及脂質體。較佳奈米粒子為脂質奈米粒子(LNP)，其為奈米尺寸之脂質囊泡，攜帶有本揭露之導引寡核苷酸且幫助遞送至目標細胞。若應用LNP或任何其他類似類型之載劑，則導引寡核苷酸仍視為裸露的，因為其並非自編碼聚核苷酸轉錄(諸如在質體或載體之情況下，其中導引寡核苷酸並不視為「裸露」的)。因此，即使經化學修飾之導引寡核苷酸係由載劑，較佳由LNP囊封，其仍視為裸露的，因為其已按原樣在實驗室設定中製造且隨後使用熟習此項技術者已知之方法囊封於載劑中。本揭露亦關於一種遞送媒劑，較佳為LNP，其包含本文所揭露之「裸露」的且經化學修飾之導引寡核苷酸。熟習此項技術者應理解，當使用遞送部分或連接至導引寡核苷酸時(諸如使用GalNAc部分以靶向肝臟中之肝細胞，及/或如本文所論述與皂苷連接/偶聯時)，導引寡核苷酸仍視為裸露的，即使當皂苷-導引物囊封於諸如LNP之遞送媒劑中時亦如此。換言之，有許多種可行的非限制性投與方法：i)按原樣使用裸露的導引寡核苷酸；ii)將裸露的導引寡核苷酸囊封於遞送媒劑，較佳於LNP中；iii)將裸露的導引寡核苷酸與(但不結合)諸如AG1856之皂苷一起或分開投與；iv)將裸露的導引寡核苷酸與諸如AG1856之皂苷進行偶聯；v)將裸露的導引寡核苷酸與諸如AG1856之皂苷進行偶聯，且其中皂苷導引物-偶聯物囊封於遞送媒劑，較佳於LNP中；或vi)透過編碼載體，諸如質體或病毒載體，自其中轉錄出導引寡核苷酸。根據疾病目標及需要靶向的細胞，選擇一種投與方法，儘管較佳的是以裸露形式投與導引寡核苷酸，無論其是否與遞送部分(或內體釋放劑)偶聯，或者無論其是否囊封於諸如LNP之遞送媒劑中。
本文所揭露之導引寡核苷酸且當以裸露形式遞送時，其長度較佳為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸。然而，當本文所揭露之導引寡核苷酸透過病毒載體之表現來遞送時，則導引寡核苷酸亦可更長，諸如長度為70、80、90、100、150或200或更多個核苷酸。
術語「HEON」係指異雙螺旋雙股複合物分子，其中本文所揭露之導引寡核苷酸與部分或完全互補、部分或完全重疊之有義寡核苷酸雜交。由於本文所揭露之導引寡核苷酸通常具有與有義股中之化學修飾不同的特定化學修飾，因此該兩條股形成了此類 異雙螺旋RNA編輯寡核苷酸複合物。有義股可以幾乎完全進行化學修飾，該等修飾可能與本文所揭露之導引寡核苷酸中進行的修飾相似或不同，例如，藉由提供具有攜帶2'-OMe取代基、2'-F取代基或2'-MOE取代基之核糖(ribose sugar) 部分的核苷酸。應理解，HEON中存在的有義股與細胞中之目標RNA分子為不同的實體。HEON中之有義股之長度較佳為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸。HEON通常活體外產生，且用作遞送工具，以保護導引寡核苷酸在投與至細胞時免受降解。換言之，HEON較佳在導引寡核苷酸被投與至細胞之前形成。 RELN 核酸序列
本揭露係關於導引寡核苷酸，其介導對目標 RELN核酸序列中存在的一或多個目標核苷酸的編輯。 RELN基因編碼絡絲蛋白蛋白質。較佳地，導引寡核苷酸介導對人類 RELN核酸序列中存在的一或多個目標核苷酸的編輯。尤其較佳的是，人類 RELN核酸序列存在於人類細胞中，其中編輯在該細胞內發生。
在一些實施例中，目標核苷酸為可藉由編輯為絡絲蛋白蛋白質提供以下一或多個功能的任何核苷酸：新增功能型表型；上調由絡絲蛋白啟動之信號傳導路徑的能力增強；增加Dab1磷酸化、減少Tau磷酸化及/或增加神經元密度的能力增強；及/或絡絲蛋白蛋白質與醣胺聚糖，較佳為肝素，及/或NRP1的結合增強。
在一些實施例中，目標核苷酸為藉由經編輯目標核苷酸對絡絲蛋白蛋白質之「α-GAG結合位點」、「β-GAG結合位點」及/或神經纖毛蛋白1 (neuropilin 1，NRP1)結合位點中之任一胺基酸產生結構影響的任何核苷酸。α-GAG結合位點覆蓋人類絡絲蛋白蛋白質之六個C末端胺基酸(3455-3460)。β-GAG結合位點覆蓋人類絡絲蛋白蛋白質之胺基酸3446-3451。只要胺基酸之突變在此等位點中之一者內產生效果，則經編輯目標核苷酸可以位於此等位點之外的胺基酸之密碼子內。較佳地，目標核苷酸位於編碼此等位點中之一者內的胺基酸之密碼子內。尤其較佳的是，目標核苷酸位於編碼人類絡絲蛋白蛋白質之胺基酸3446-3460中之一者的密碼子內，較佳地，位於人類絡絲蛋白蛋白質之胺基酸3446-3451或3455-3460內。
在一尤其較佳實施例中，目標核苷酸位於人類絡絲蛋白蛋白質之胺基酸3447之密碼子內。特定言之，目標RELN核酸序列編碼在人類絡絲蛋白蛋白質之位置3447處編碼的胺基酸不為精胺酸，而較佳在人類絡絲蛋白蛋白質之位置3447處編碼組胺酸。在此等實施例中，較佳的是，經編輯 RELN核酸序列在人類絡絲蛋白蛋白質之位置3447處編碼精胺酸，從而產生一種改變的蛋白質變異體，本文稱之為H3447R。
在一個尤其較佳實施例中，目標核苷酸是腺苷，而核酸編輯實體為腺苷去胺酶。在更佳實施例中，包含目標核苷酸之目標 RELN核酸序列為包含目標腺苷之 RELNRNA轉錄分子(前驅mRNA及/或mRNA)，而核酸編輯實體為ADAR酶，更佳為人類ADAR1及/或人類ADAR2。在此等實施例內，較佳的是， RELNRNA轉錄分子具有在人類絡絲蛋白蛋白質之位置3447處編碼組胺酸的密碼子CAU，其中CAU密碼子內的腺苷為目標腺苷。在此實施例中，ADAR介導之編輯產生CIU，轉譯機制將其解讀為CGU，從而編碼精胺酸。因此，在一些實施例中，較佳的是，細胞為人類的細胞，其DNA編碼之絡絲蛋白在人類絡絲蛋白蛋白質之位置3447處的胺基酸不為精胺酸，而較佳為組胺酸。
在一些實施例中，經編輯 RELN核酸序列編碼一種絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質具有增強之能力以保護免受AD及/或AD之一或多種症狀。在一些實施例中，經編輯 RELN核酸序列編碼一種絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質具有上調或啟動保護免受AD及/或AD之一或多種症狀的路徑的能力。在一些實施例中，經編輯 RELN核酸序列編碼一種絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質具有增強的結合醣胺聚糖(GAG)之能力，尤其在絡絲蛋白之C末端區。尤其較佳的是，經編輯 RELN核酸序列編碼一種絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質具有增強的結合肝素之能力。在一些實施例中，經編輯 RELN核酸序列編碼一種絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質具有增強的結合神經纖毛蛋白1之能力。在一些實施例中，經編輯 RELN核酸序列編碼一種絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質具有增強的降低Tau病理學之能力。在一些實施例中，經編輯 RELN核酸序列編碼一種絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質具有增強的降低Tau磷酸化之能力。在一些實施例中，經編輯 RELN核酸序列編碼一種絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質具有增強的增加Dab1磷酸化之能力。在一些實施例中，經編輯 RELN核酸序列編碼一種絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質具有增加神經元密度之能力。
在一些實施例中，經編輯 RELN核酸序列編碼具有新增功能型表型之絡絲蛋白蛋白質。新增功能型之實例除了實例中所描述的變異體之外，亦為具有如下特性之變異體：1)觸發信號傳導的能力增強，較佳為APOEr/Dab1/GSK3β路徑；2)增加Dab1磷酸化的能力增強；3)減少神經原纖維纏結中發現的Tau磷酸化的能力增強；4)促進微管結構形成及/或微管結構之穩定性及/或神經元密度的能力增強；5)對蛋白水解降解的抗性增強；及/或與醣胺聚糖，較佳肝素的結合增強；及/或6)與NRP1的結合增強。
一較佳實施例為藉助於降低蛋白酶之滅活作用使絡絲蛋白蛋白質具有新增功能型。舉例而言，ADAMTS-3被鑑定為在大腦(例如大腦皮層及海馬體)中裂解絡絲蛋白且使其失活的蛋白酶。在小鼠中阻斷ADAMTS-3之表現已被證明可以減少Tau磷酸化，且增加樹突分支及伸長(Ogino H等人, J Neurosci .2017, 37(12):3181-3191)。因此，改變絡絲蛋白中之ADAMTS-3裂解位點，諸如N-t位點中之Pro-Ala序列(Koie M等人, J Biol Chem .2014, 289:12922-12930)，可上調絡絲蛋白且成為一種可行的策略，以形成具有新增功能型表型之絡絲蛋白。本揭露係關於多種導引寡核苷酸，其旨在使目標RELN核酸序列中之目標腺苷去胺。然而，不排除在單次治療中靶向兩個或更多個腺苷進行去胺。在不希望受理論束縛的情況下，藉由組合本文所揭露之導引寡核苷酸來靶向多個目標核苷酸，諸如目標腺苷，且由此靶向單個絡絲蛋白蛋白質內之多種胺基酸，實現協同或累加效應，從而提高治療效果。 神經退化性疾病
目標核苷酸為一種如下之核苷酸，藉由對其進行編輯會產生經編輯 RELN核酸序列，該經編輯 RELN核酸序列編碼與未經編輯之絡絲蛋白蛋白質相比具有有益治療功效的經編輯絡絲蛋白蛋白質。特定言之，有益治療功效可包括治療、緩解或減輕神經退化性疾病，諸如AD，或該疾病之一或多種症狀，包括輕度認知障礙、認知減退及/或失智。
在一些實施例中，導引寡核苷酸用於已診斷出患有AD之個體。在其他實施例中，導引寡核苷酸預防性地用於已鑑別為具有罹患AD之風險的個體。在一些實施例中，導引寡核苷酸預防性地用於認知健康的個體。在一些實施例中，導引寡核苷酸用於具有PSEN1-E280A突變(其中PSEN1為編碼早老素1之基因)之個體，該突變為與AD中輕度認知障礙之發展相關的突變。在一些實施例中，導引寡核苷酸用於具有兩個APOE3 Christchurch (APOECh) (R136S)基因變異體複本的個體中。在一些實施例中，導引寡核苷酸用於患有ADAD之個體。
在一些實施例中，細胞為腦細胞，較佳為神經元。在一些實施例中，細胞位於內顳葉，較佳內皮層，更佳內嗅皮層中。在一些實施例中，編輯發生在細胞之內質網中或周圍。 DNA 編輯
在一些實施例中，本揭露係關於「DNA編輯」。與本文之揭露內容相容的DNA編輯技術包括基於CRISPR Cas9核酸酶之DNA編輯技術。此等技術在此項技術中眾所周知。此等技術包括使用CRISPR-Cas9向DNA引入雙股斷裂，此可使用具有必要序列之導引RNA寡核苷酸來程式化，以將CRISPR-Cas9酶導引至特定位點。該等斷裂可用於在DNA之指定位點刪除、修飾及/或插入DNA序列。另一種來源於CRISPR-Cas9之系統使用鹼基編輯器(BE)系統，該系統使用催化死亡Cas9 (dCas9)，該dCas9已與功能性酶，諸如DNA去胺酶融合。dCas9不向DNA引入雙股斷裂，而是定位DNA去胺酶以導致目標DNA核苷酸去胺，其同樣係由導引寡核苷酸導引至特定位點。DNA去胺酶可為胞苷去胺酶(以誘導C至T之取代)或腺嘌呤去胺酶(以誘導A至G之取代)。與胞苷去胺酶融合之dCas9亦稱為胞苷鹼基編輯器(Cytidine Base Editor，CBE)，而與腺嘌呤去胺酶融合之dCas9亦稱為腺嘌呤鹼基編輯器(Adenine Base Editor，ABE)。進一步發展稱為先導編輯(Prime Editing)。先導編輯使用與逆轉錄酶融合之Cas9切口酶。先導編輯再次使用導引寡核苷酸將酶導引至DNA之特定位點。先導編輯亦使用包含先導編輯導引RNA (pegRNA)之寡核苷酸，該pegRNA包含引子結合位點序列及含有所需編輯之序列。此可為與導引寡核苷酸相同的分子之一部分。首先，由導引寡核苷酸導引之Cas9切口酶在DNA一條股之指定部分產生切割。隨後，逆轉錄酶使用pegRNA作為模板進行逆轉錄，將經編輯序列提供到DNA中。 RNA 編輯
在一些實施例中，本揭露係關於「RNA編輯」。RNA編輯係一種自然過程，透過該過程，真核細胞改變其RNA分子之序列，此通常係以位點特異性及精確方式進行的，從而將基因體編碼之RNA之組庫擴大了若干數量級。RNA編輯酶已經描述用於整個動物及植物界中的真核物種，且此等過程在自最簡單的生命形式(諸如秀麗隱桿線蟲( Caenorhabditis elegans))到人類的後生動物中，對於控制細胞內穩態起著重要作用。RNA編輯之實例為將腺苷轉換為肌苷(A至I)及將胞苷轉換為尿苷，其分別透過稱為作用於RNA之腺苷去胺酶(ADAR)及APOBEC/AID (作用於RNA之胞苷去胺酶)的酶來發生。
ADAR為一種多域蛋白，其包含催化域及二至三個雙股RNA識別域，取決於所討論之酶。各識別域識別特定的雙股RNA (dsRNA)序列及/或構形。儘管催化域之主要功能為藉由核鹼基之去胺作用，在目標RNA中預定的鄰近位置將A轉換為I，但催化域在識別及結合dsRNA螺旋之部分中亦發揮作用。細胞之轉譯機制將肌苷讀取為鳥苷，此意味著，若經編輯腺苷位於mRNA或前驅mRNA之編碼區，則其可以重新編碼蛋白質序列。有趣的是，A至I之轉換亦可能發生在目標mRNA之5'非編碼序列中，在原始起始位點之上游產生新的轉譯起始位點，從而產生N末端延長的蛋白質，或者發生在3'非轉譯區(UTR)或轉錄本之其他非編碼部分，此可能影響RNA之加工及/或穩定性。此外，A至I之轉換亦可能發生在前驅mRNA內含子或外顯子中的剪接元件中，從而改變剪接模式。因此，外顯子可能被包括或跳過。催化腺苷去胺之酶屬於ADAR之酶家族，包括人類去胺酶hADAR1及hADAR2，以及hADAR3。然而，對於hADAR3，尚未證實其去胺酶活性。
已描述了使用導引寡核苷酸(或反義寡核苷酸；AON或EON)且應用腺苷去胺酶來編輯目標RNA (例如Woolf等人, Proc Natl Acad Sci USA . 1995 ,92:8298-8302；Montiel-Gonzalez等人, Proc Natl Acad Sci USA .2013, 110(45):18285-18290；Vogel等人, Angewandte Chemie2014, 國際版53:267-271)。Montiel-Gonzalez等人(2013)所描述之方法的一個缺點為，需要一種融合蛋白，該融合蛋白由噬菌體λ N蛋白之boxB識別域與截短的天然ADAR蛋白之腺苷去胺酶域融合而組成。其要求目標細胞被融合蛋白轉導(此為主要障礙)，或目標細胞被編碼經工程改造之腺苷去胺酶融合蛋白的核酸構築體轉染以進行表現。由Vogel等人(2014)所描述之系統具有類似缺點，因為尚不清楚如何應用系統，而無需首先以基因方式修飾ADAR且隨後轉染或轉型含有目標RNA之細胞，以向細胞提供此經基因工程改造之蛋白質。US 9,650,627描述一種類似系統。Woolf等人(1995)的與目標RNA序列100%互補之寡核苷酸嚴重缺乏特異性：編輯與導引寡核苷酸互補之目標RNA股中的幾乎所有腺苷。
已知ADAR可作用於任何dsRNA。透過有時稱為「混雜編輯(promiscuous editing)」之方法，酶將編輯dsRNA中之多個A。因此，需要方法及手段來規避該混雜編輯，且僅靶向目標RNA分子中之特定腺苷，以變得在治療上適用。Vogel等人(2014)表明，此類脫靶編輯可藉由在導引寡核苷酸中在與不應被編輯之腺苷相對之位置處使用2'-OMe修飾之核苷來抑制，且使用與目標RNA上特異性靶向之腺苷直接相對的未經修飾之核苷。然而，在不使用與導引寡核苷酸具有共價鍵之重組ADAR酶的情況下，則尚未證明能夠在目標核苷酸處發生特異性編輯效果。若干公開案現已證明，內源性ADAR之募集(因此在不需要外源性及/或重組來源之情況下)係可實行的，同時維持其中可靶向目標RNA分子內之單一腺苷且使其去胺基為肌苷之特異性。國際專利申請公開案第WO2016/097212號揭露用於靶向編輯RNA之AON，其中該AON之特徵為與目標RNA序列互補之序列(本文中稱為「靶向部分」)且存在較佳與目標RNA不互補之莖環(stem-loop)/髮夾結構(本文中稱為「募集部分」)。該等寡核苷酸稱為「自我成環AON (self-looping AON)」。募集部分用於將細胞中存在之天然ADAR酶(亦即內源性存在)募集至藉由目標序列與靶向部分雜交所形成之dsRNA中。由於募集部分，不需要結合實體或存在經修飾之重組ADAR酶。國際專利申請公開案第WO2016/097212號將募集部分描述為莖環結構，其仿效天然受質(例如GluB受體)或ADAR酶之已知由dsRNA結合域或Z-DNA結合域所識別之Z-DNA結構。莖環結構可為由兩個獨立核酸股形成之分子間莖環結構或在單一核酸股內形成之分子內莖環結構。描述的募集部分之莖環結構為在AON自身內形成之分子內莖環結構，且認為其吸引(內源性) ADAR。此後，在國際專利申請公開案第WO2017/050306號、第WO2020/001793號、第WO2017/010556號、第US11,390,865號、第WO2020/246560號及第WO2022/078995號中描述了用於RNA編輯的類似的包含莖環結構之系統。
國際專利申請公開案第WO2017/220751號及第WO2018/041973號描述一種新一代AON，其不包含此類莖環結構，但(幾乎完全)與目標區域互補，且似乎仍能夠吸引內源性ADAR酶。在一個實施例中，寡核苷酸與目標序列之間存在一或多個錯配核苷酸、搖擺或凸起。與目標腺苷相對之核苷位點處可能僅存在一個錯配，但在其他實施例中，AON被描述為當與目標序列區域連接時具有多個凸起及/或搖擺。當仔細選擇AON之序列，使其能夠吸引/募集ADAR時，似乎可以用缺乏莖環結構之AON及內源性ADAR酶來實現活體外、離體及活體內RNA編輯。「孤兒核苷」被定義為導引寡核苷酸(或AON)中直接相對目標RNA分子中之目標腺苷置放的核苷，其為一個具有未經修飾之胞嘧啶核鹼基且不攜帶2'-OMe修飾的核苷酸。孤兒核苷可為去氧核糖核苷(DNA)，其中導引寡核苷酸之其餘部分仍可能在糖實體處攜帶2'- O-烷基修飾(諸如2'-OMe)，或直接包圍孤兒核苷之核苷酸含有進一步改良RNA編輯效率及/或增加對核酸酶之抗性的化學修飾(諸如與RNA相比的DNA)。使用能夠「保護」AON在遞送至細胞時免於降解的有義寡核苷酸(SON)甚至可以進一步改善該等效果(描述於國際專利申請公開案第WO2018/134301號及第US11,274,300號中)。
對目標RNA中之特定腺苷進行ADAR介導之編輯時，在寡核苷酸中使用化學修飾及特定結構，其已為本領域許多揭露案之主題，諸如國際專利申請公開案第WO2019/111957號、第WO2019/158475號、第WO2020/165077號、第WO2020/201406號、第WO2020/211780號、第WO2021/008447號、第WO2021/020550號、第WO2021/060527號、第WO2021/117729號、第WO2021/136408號、第WO2021/182474號、第WO2021/216853號、第WO2021/242778號、第WO2021/242870號、第WO2021/242889號、第WO2022/007803號、第WO2022/018207號、第WO2022/026928號及第WO2022/124345號。特定糖部分之使用已揭示於例如國際專利申請公開案第WO2020/154342號、第WO2020/154343號、第WO2020/154344號、第WO2022/103839及第WO2022/103852號中，而立體限定的連接子部分(通常用於例如可用於外顯子跳躍、間隔子、siRNA的寡核苷酸，或尤其用於與各種目標序列相關的RNA編輯寡核苷酸)之使用已描述於國際專利申請公開案第WO2011/005761號、第WO2014/010250號、第WO2014/012081號、第WO2015/107425號、第WO2017/015575 (HTT)號、第WO2017/062862號、第WO2017/160741號、第WO2017/192664號、第WO2017/192679 (DMD)號、第WO2017/198775號、第WO2017/210647號、第WO2018/067973號、第WO2018/098264號、第WO2018/223056 (PNPLA3)號、第WO2018/223073 (APOC3)號、第WO2018/223081 (PNPLA3)號、第WO2018/237194號、第WO2019/032607 (C9orf72)號、第WO2019/055951號、第WO2019/075357 (SMA/ALS)號、第WO2019/200185 (DM1)號、第WO2019/217784 (DM1)號、第WO2019/219581號、第WO2020/118246 (DM1)號、第WO2020/160336 (HTT)號、第WO2020/191252號、第WO2020/196662號、第WO2020/219981 (USH2A)號、第WO2020/219983 (RHO)號、第WO2020/227691 (C9orf72)號、第WO2021/071788 (C9orf72)號、第WO2021/071858號、第WO2021/178237 (MAPT)號、第WO2021/234459號、第WO2021/237223號、第WO2022/099159號、第WO2021/030778號、第WO2022/174053及第WO2023/278589號中。
除此等揭露案以外，大量公開案係關於特定RNA目標分子或該等RNA目標分子內之特定腺苷之靶向，以便修復引起過早終止密碼子之突變或其他導致疾病之突變。關於在指定目標RNA分子內靶向腺苷之此類揭露案之實例為國際專利申請公開案第WO2020/157008及第WO2021/136404 (USH2A)；第WO2021/113270 (APP)；第WO2021/113390 (CMT1A)；第WO2021/209010 (IDUA，賀勒侯症群(Hurler syndrome))；第WO2021/231673及第WO2021/242903 (LRRK2)；第WO2021/231675 (ASS1)；第WO2021/231679 (GJB2)；第WO2019/071274及第WO2021/231680 (MECP2)；第WO2021/231685及第WO2021/231692 (OTOF，體染色體隱性非症候群型聽覺損失)；第WO2021/231691 (XLRS)；第WO2021/231698 (精胺基丁二酸裂解酶缺乏)；第WO2021/130313及第WO2021/231830 (ABCA4)；及第WO2021/243023 (SERPINA1)。
尤其較佳的是，ADAR1及/或ADAR2內源性存在於細胞中。此類導引寡核苷酸在與目標RNA分子結合之後，可介導目標RNA分子中存在之目標腺苷的RNA編輯，因為去胺酶被募集至雙股寡核苷酸/目標RNA分子複合物中，隨後將目標腺苷去胺為肌苷。
不斷需要改善導引寡核苷酸之藥物動力學特性，同時不負面影響目標RNA中目標腺苷編輯效率，及/或不負面影響導引寡核苷酸自身穩定性，因為該導引寡核苷酸在天然細胞中存在之核酸酶作用下不斷容易降解。許多化學修飾可用於產生寡核苷酸(且許多已在此項技術中應用)。然而，許多此等特性並非始終與達成高效RNA編輯之需要相容。在搜尋較佳藥物動力學特性時，早期發現，一些但非所有核苷酸之核糖進行2'-MOE修飾後，出人意料地與高效ADAR參與及編輯相容(國際專利申請公開案第WO2019/158475號)。以類似方式，早期發現，在一些但非所有核苷間鍵聯處使用PS鍵聯後，出人意料地與高效ADAR參與及編輯相容(國際專利申請公開案第WO2019/219581號)。此外，早期發現，在一些但非所有導引寡核苷酸位置上進行膦醯基乙酸酯鍵聯修飾及/或UNA核糖修飾後，出人意料地與具有核苷酸去胺活性之酶的高效參與及隨後的去胺相容(國際專利申請公開案第WO2020/165077號)。儘管已知膦醯基乙酸酯及UNA修飾之如此特性，但不知其與具有核苷酸去胺活性之酶之參與及與去胺反應之相容性。
在一些實施例中，本揭露提供導引寡核苷酸，其可對(介導、引起或觸發)目標轉錄分子，諸如前驅mRNA及/或mRNA中之目標腺苷進行RNA編輯。目標轉錄分子可能由突變基因編碼，其中該突變為疾病病因，且其中編輯可以逆轉突變以產生野生型蛋白或具有野生型功能之蛋白(例如，當突變胺基酸被改變為不引起疾病或提供經改善表型的胺基酸時)。如本文更詳細地揭露，目標轉錄分子亦可能由野生型基因編碼，諸如在本揭露之一較佳態樣中，其中目標 RELN核酸分子為本揭露中所示之野生型人類 RELN基因之轉錄本。特定言之，RNA編輯編碼一種經修飾絡絲蛋白蛋白質，其改善經治療個體之疾病病狀。特定言之，目標 RELN核酸序列為天然存在於個體中的序列。換言之，目標 RELN核酸序列為用根據本揭露之導引寡核苷酸治療之前的序列。
使用RNA編輯技術進行各種治療時，所靶向之轉錄分子之非限制性實例為SERPINA1 (用於治療α1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏；參見例如國際專利申請公開案第WO2016/097212號、第WO2017/220751號、第WO2018/041973及第WO2021/243023)、 IDUA(用於治療賀勒侯症群；參見例如國際專利申請公開案第WO2017/220751號、第WO2018/041973,及第WO2021/209010)、 LRRK2(用於治療帕金森氏症；參見例如國際專利申請公開案第WO2016/097212號、第WO2017/220751號、第WO2018/041973號、第WO2021/231673及第WO2021/242903)、 ABCA4(用於治療斯特格病(Stargardt disease)；參見例如國際專利申請公開案第WO2021/130313及第WO2021/231830)、 USH2A(用於治療尤塞氏症候群(Usher syndrome)；參見例如國際專利申請公開案第WO2020/157008號、第WO2020/219981及第WO2021/136404)、 APP(參見例如國際專利申請公開案第WO2021/113270)、 CMT1A(參見例如國際專利申請公開案第WO2021/113390)、ASS1 (參見例如國際專利申請公開案第WO2021/231675)、 GJB2(參見例如國際專利申請公開案第WO2021/231679)、 MECP2(用於治療雷特症候群(Rett syndrome)；參見例如國際專利申請公開案第WO2019/071274及第WO2021/231680)、 OTOF(用於治療體體染色體隱性非症候群型聽覺損失；參見例如國際專利申請公開案第WO2021/231685及第WO2021/231692)、 XLRS(參見例如國際專利申請公開案第WO2021/231691)、 PCSK9(用於治療高膽固醇血症；參見例如國際專利申請公開案第WO2023/152371)，及 HFE(用於治療血色素沉著症/鐵過載；參見例如國際專利申請公開案第WO2024/110565)。 化學修飾
各種化學性質及修飾在寡核苷酸之領域中為已知的，其可根據本揭露容易地使用。視需要及/或除非另外指出，否則本文中所列之化學修飾可與意欲用於DNA編輯或RNA編輯之導引寡核苷酸一起使用。本文中所列之所有可用於本文所揭露之導引寡核苷酸的化學修飾，在導引寡核苷酸與互補股形成HEON複合物時，諸如國際專利申請公開案第WO2024/084048中所描述及上文所揭露，亦可用於與導引寡核苷酸互補的有義股，不同之處在於相對的有義股不具有孤兒核苷酸。因此，與孤兒核苷酸相關之修飾僅與本文所揭露之導引寡核苷酸有關，但所有其他修飾既與本文所揭露之導引寡核苷酸有關，亦與任何可能與導引寡核苷酸一起用於醫藥產品的(保護)有義寡核苷酸有關。此包括使用疏水性部分(諸如生育酚及膽固醇)，其可以結合至導引寡核苷酸或其相對股上，或結合至二者。
熟習此項技術者已知，寡核苷酸，諸如本文中所概述之導引寡核苷酸通常由重複單體組成。此類單體最常為核苷酸或經化學修飾之核苷酸。RNA中最常見的天然存在之核苷酸為單磷酸腺苷(A)、單磷酸胞苷(C)、單磷酸鳥苷(G)及單磷酸尿苷(U)。此等由戊醣糖、核糖、經由磷酸酯連接的5'-連接之磷酸酯基團，及1'-連接之鹼基組成。糖連接鹼基與磷酸酯，因此通常稱為核苷酸之「骨架」。因此，戊醣糖中之修飾通常稱為「骨架修飾」。原始戊糖可完全經另一個以類似方式連接鹼基與磷酸酯的部分所置換。因此，應理解，儘管戊醣糖通常為骨架，但骨架未必為戊醣糖。可應用於本文所揭露之導引寡核苷酸之單體中的骨架修飾之實例揭露於國際專利申請公開案第WO2020/154342、第WO2020/154343及第WO2020/154344中。
本文所揭露之導引寡核苷酸中之核苷可為天然核苷(去氧核糖核苷或核糖核苷)或非天然核苷。應指出，在RNA編輯中，雙股RNA通常為具有去胺活性之酶(諸如ADAR)的受質，核糖核苷被視為「天然的」，而去氧核糖核苷則可以出於討論之目的被視為非天然的或經修飾的，僅僅係因為在RNA-RNA雙股(天然)受質組態中不存在DNA。熟習此項技術者應理解，當核苷酸具有天然核糖部分時，其在鹼基及/或鍵聯中仍可經非天然修飾。
在此項技術中，應認識到，基於寡核苷酸之療法中常見的限制因素包括寡核苷酸被細胞攝取的能力(當直接遞送，或「裸露」的，即未使用諸如病毒載體或質體等遞送媒劑時)、生物分佈及對核酸酶介導之降解的抗性。熟習此項技術者已知，且此項技術中已詳細描述，各種化學修飾可有助於克服該等限制。此類現常用化學修飾之實例為對糖之2'-OMe、2'-F及2'-MOE修飾，及在核苷之間使用PS鍵聯，如本文中所描述。 核糖修飾
除與RNA編輯相容性方面存在某些限制的孤兒核苷酸之核糖部分之外，本文所揭露之導引寡核苷酸中所有核苷酸之核糖2'基團均可獨立地選自2'-H (亦即DNA)、2'-OH (亦即RNA)、2'-OMe、2'-MOE、2'-F或2'-4'鍵聯(例如鎖核酸(LNA))，或其他核糖基1'取代基、2'取代基、3'取代基、4'取代基或5'取代基。導引寡核苷酸中之孤兒核苷酸不包含對核糖、鹼基或鍵聯之其他化學修飾，當核鹼基為天然存在之胞嘧啶時，較佳不攜帶2'-OMe或2'-MOE取代基，但可以攜帶2'-F、2',2'-二氟(diF)或2'-阿糖-F (FANA)取代，或可為DNA。國際專利申請公開案第WO2024/013360號描述藉由2',2'-二取代之取代(諸如diF)對孤兒核苷酸之核糖部分之2'位置進行修飾，此同樣適用於本文所揭露之內容。2'-4'鍵聯可選自此項技術中已知之許多連接子，諸如亞甲基連接子、醯胺連接子或經約束之乙基連接子(cEt)。
本文所揭露之導引寡核苷酸可包含一或多個攜帶2'-MOE核糖修飾之核苷酸。此外，本文所揭露之導引寡核苷酸可包含一或多個未攜帶2'-MOE核糖修飾之核苷酸，或其中2'-MOE核糖修飾所處位置並不阻止具有腺苷去胺酶活性之酶對目標腺苷去胺。本文所揭露之導引寡核苷酸可在不包含2'-MOE核糖修飾之位置處包含2'-OMe核糖修飾。本文所揭露之導引寡核苷酸可在不包含2'-MOE或2'-OMe核糖修飾或其他2'核糖取代之位置處包含去氧核苷酸。本文所揭露之導引寡核苷酸可包含一或多個核苷酸，其包含2'取代，該2'取代包含2'-MOE、2'-OMe、2'-OH、2'-去氧、TNA、2'-氟(2'-F)、2',2'-二氟(diF)修飾、2'-氟-2'- C-甲基修飾，或2'-4'鍵聯(亦即橋接核酸，諸如LNA，或例如在國際專利申請公開案第WO2018/007475號中提及之實例)。可用於本文所揭露之導引寡核苷酸的其他核酸單體為例如出於改善親和力目的的阿拉伯糖核酸(arabinonucleic acids)及2'-去氧-2'-氟阿拉伯糖核酸(FANA)。2'-4'鍵聯可選自此項技術中已知之連接子，諸如亞甲基連接子或經約束之乙基連接子。可存在於本文所揭露之導引寡核苷酸中的廣泛多種2'修飾為此項技術中已知的，包括(但不限於)在國際專利申請公開案第WO2016/097212、第WO2017/220751、第WO2018/041973、第WO2018/134301、第WO2019/219581、第WO2019/158475及第WO2022/099159中詳細概述之修飾。在所有情況下，修飾應與RNA編輯相容，使得導引寡核苷酸發揮其作為可與目標RNA形成雙股複合物之寡核苷酸的作用，且藉由產生此雙股核酸複合物，募集去胺酶，該酶隨後可使目標腺苷去胺。若本文所揭露之導引寡核苷酸中的單體包含UNA核糖修飾，則該單體之2'位置可包含上文所論述之相同的修飾，諸如2'-MOE、2'-OMe、2'-OH、2'-去氧、2'-F、2',2'-diF、2'-氟-2'-C-甲基、阿拉伯糖核酸、FANA或2'-4'-鍵聯(亦即橋接核酸，諸如LNA)。在一態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含至少一個包含蘇糖核酸(TNA)核糖修飾之核苷酸。在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含至少一個具有糖部分之核苷酸，該糖部分包含2'-F修飾。對於攜帶2'-F修飾之核苷酸，較佳位置為導引寡核苷酸中之位置-3，其可與上文所論述之孤兒核苷酸中相同的2'修飾一起存在。 鹼基修飾
鹼基，有時稱為核鹼基，通常為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或其衍生物。核鹼基定義為可透過H-鍵、極化鍵(諸如透過CF部分)或芳族電子相互作用鍵結至另一核鹼基的部分。胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶為嘧啶鹼基，且通常透過其1-氮連接至骨架。腺嘌呤及鳥嘌呤為嘌呤鹼基，且通常經由其9-氮連接至骨架。如本文中所使用，術語「腺嘌呤」、「鳥嘌呤」、「胞嘧啶」、「胸腺嘧啶」、「尿嘧啶」及「次黃嘌呤」係指此類核鹼基。術語「腺苷」、「鳥苷」、「胞苷」、「胸苷」、「尿苷」及「肌苷」係指連接至(去氧)核糖基糖之核鹼基。本文所揭露之導引寡核苷酸中的核鹼基可為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或能夠透過H-鍵、極化鍵(諸如CF)或芳族電子相互作用與另一核鹼基相互作用之任何其他部分。本文所揭露之導引寡核苷酸中任何位置處的核鹼基可為以下之經修飾形式：腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或尿嘧啶，諸如次黃嘌呤(肌苷中之核鹼基)、假尿嘧啶、假胞嘧啶、異尿嘧啶、N3-醣基化尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、乳清酸、阿格嗎特啶(agmatidine)、賴西啶(lysidine)、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-取代之嘧啶(例如5-鹵基尿嘧啶、5-鹵基甲基尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-胺基甲基尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、5-甲醯基尿嘧啶、5-胺基甲基胞嘧啶、5-甲醯基胞嘧啶)、5-羥甲基胞嘧啶、7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤、8-氮雜-7-去氮雜鳥嘌呤、8-氮雜-7-去氮雜腺嘌呤、8-氮雜-7-去氮雜-2,6-二胺基嘌呤、8-側氧基-腺嘌呤、3-去氮雜嘌呤(諸如3-去氮雜-腺苷)、假異胞嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、N2-環戊基鳥嘌呤、N2-環戊基-2-胺基嘌呤、N2-丙基-2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、G形夾及其衍生物、Super A、Super T、Super G、胺基修飾之核鹼基或其衍生物；及簡併鹼基或通用鹼基，如2,6-二氟甲苯，或不存在，如無鹼基位點(例如1-去氧核糖、1,2-二去氧核糖、1-去氧-2- O-甲基核糖、氮雜核糖)。經修飾之鹼基包含合成及天然鹼基，諸如肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤及此項技術中已知或將已知的其他嘧啶及嘌呤鹼基之-氮雜、去氮雜、-羥基、-鹵基、-硫基、巰基、-烷基、-烯基、-炔基、硫基烷基衍生物。嘌呤核鹼基及/或嘧啶核鹼基可經修飾以改變其特性，例如藉由對雜環進行胺化或去胺。確切的化學性質及型式可能因寡核苷酸構築體而異，亦可能因應用而異，且可根據熟習此項技術者之意願及偏好來制定。
骨架修飾表明存在經修飾型式之核糖基部分(亦即戊醣部分)，其天然存在於RNA中，諸如雙環糖、四氫哌喃、己醣、𠰌啉基、2'-修飾之糖、4'-修飾之糖、5'-修飾之糖及4'-取代之糖。適合之修飾之實例包括(但不限於)2'- O-修飾之RNA單體，諸如2'- O-烷基或2'- O-(經取代)烷基，諸如2'-OMe、2'- O-(2-氰基乙基)、2'-MOE、2'- O-(2-硫基甲基)乙基、2'- O-丁醯基、2'- O-炔丙基、2'- O-烯丙基、2'- O-(2-胺基丙基)、2'- O-(2-(二甲胺基)丙基)、2'- O-(2-胺基)乙基、2'- O-(2-(二甲胺基)乙基)；2'-去氧(DNA)；2'- O-(鹵基烷基)甲基，諸如2'- O-(2-氯乙氧基)甲基(MCEM)、2'- O-(2,2-二氯乙氧基)甲基(DCEM)；2'- O-烷氧基羰基，諸如2'- O-[2-(甲氧基羰基)乙基] (MOCE)、2'- O-[2- N-甲基胺甲醯基)乙基] (MCE)、2'- O-[2-( N, N-二甲基胺甲醯基)乙基] (DCME)；2'-鹵基，例如2'-F、FANA；2'-O-[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (NMA)；雙環或橋接核酸(BNA)骨架修飾，諸如構形受限之核苷酸(CRN)單體、LNA單體、木糖( xylo)-LNA單體、α-LNA單體、α-l-LNA單體、β-d-LNA單體、2'-胺基-LNA單體、2'-(烷基胺基)-LNA單體、2'-(醯胺基)-LNA單體、2'- N-取代之2'-胺基-LNA單體、2'-硫基-LNA單體、(2'- O,4'- C)約束之乙基(cEt) BNA單體、(2'-O,4'- C)約束之甲氧基乙基(cMOE) BNA單體、2',4'-BNA NC(NH)單體、2',4'-BNA NC(NMe)單體、2',4'-BNA NC(NBn)單體、伸乙基橋接之核酸(ENA)單體、carba-LNA (cLNA)單體、3,4-二氫-2 H-哌喃核酸(DpNA)單體、2'-C-橋接之雙環核苷酸(CBBN)單體、側氧基-CBBN單體、雜環橋接之BNA單體(諸如三唑基或四唑基連接)、醯胺基橋接之BNA單體(諸如AmNA)、脲橋接之BNA單體、磺醯胺橋接之BNA單體、雙環碳環核苷酸單體、TriNA單體、α-l-TriNA單體、雙環DNA (bcDNA)單體、F-bcDNA單體、三環DNA (tcDNA)單體、F-tcDNA單體、α變旋異構雙環DNA (abcDNA)單體、氧雜環丁烷核苷酸單體、衍生自2'-胺基LNA之鎖PMO單體、胍橋接之核酸(GuNA)單體、螺環丙烯橋接之核酸(scpBNA)單體及其衍生物；環己烯基核酸(CeNA)單體、阿卓糖醇(altriol)核酸(ANA)單體、己糖醇核酸(HNA)單體、氟化HNA (F-HNA)單體、哌喃糖基-RNA (p-RNA)單體、3'-去氧哌喃糖基DNA (p-DNA)、UNA；以上單體中之任一者之反向型式。所有此等修飾為熟習此項技術者已知。 孤兒核苷酸
人類ADAR2之誘變研究揭示，當與野生型酶相比時，殘基488處自麩胺酸至麩醯胺酸(E488Q)之單一突變使去胺之速率常數增加60倍(Kuttan及Bass, Proc Natl Acad Sci USA .2012, 109(48):3295-3304)。在去胺反應期間，ADAR將經編輯鹼基脫離其RNA雙螺旋且進入酶活性位點中(Matthews等人, Nat Struct Mol Biol2016. 23(5):426-433)。當ADAR2在較佳環境(A:C錯配)中編輯腺苷時，與目標腺苷相對的核苷酸通常稱為「孤兒核苷酸」(或視具體情況而定，為「孤兒胞苷」)，如上文所指示。ADAR2 E488Q與雙股RNA (dsRNA)結合之晶體結構揭示，位置488處之麩醯胺酸(Gln；Q)側鏈可向孤兒胞苷之N3位置供給H-鍵，此引起ADAR2 E488Q之催化速率增加。在野生型酶中，其中位置488處存在麩胺酸(glutamate/glutamic acid；Glu；E))而非麩醯胺酸(Gln)，麩醯胺酸之醯胺基不存在且實際上為羧酸。對於野生型情形，為了獲得孤兒胞苷與E488Q突變異體之相同接觸，需要質子化才能發生此接觸。為了利用內源性表現之ADAR2來校正疾病相關突變，必需最大化細胞中存在之野生型ADAR2酶的編輯效率。國際專利申請公開案第WO2020/252376號揭露使用具有經修飾RNA鹼基之導引寡核苷酸，尤其在孤兒胞苷之位置，以模擬E488Q ADAR2突變異體觀察到的氫鍵模式。藉由用在N3處充當H-鍵供體之胞苷類似物來置換導引寡核苷酸中與目標腺苷相對的核苷酸，預想有可能使相同接觸穩定，咸信此可增加突變型酶之催化速率。兩種胞苷類似物備受關注：最初選擇的假異胞苷(亦稱為「piC」；Lu等人, J Org Chem .2009, 74(21):8021-8030；Burchenal等人, Cancer Res .1976, 36:1520-1523)及Benner鹼基Z (亦稱為「dZ」；Yang等人, Nucl Acid Res .2006, 34(21):6095-6101)，因為其在N3處提供氫鍵供給，同時對核鹼基之形狀具有極小擾動。Benner鹼基亦以其化學名稱6-胺基-5-硝基-3-基-2(1H)-吡啶酮來指代。除了對核糖2'基團之修飾以外，導引寡核苷酸中亦可能存在胞苷類似物。孤兒核苷酸中之核糖2'基團可獨立地選自2'-H (亦即DNA)、2'-OH (亦即RNA)、2'-OMe、2'-MOE、2'-F或2'-4'-連接(亦即橋接核酸，諸如LNA)，或其他2'取代。2'-4'鍵聯可選自此項技術中已知之連接子，諸如亞甲基連接子或經約束之乙基連接子。
本文所揭露之導引寡核苷酸中的孤兒核苷酸較佳為胞苷或其類似物(諸如攜帶Benner鹼基之核苷酸)或者尿苷或其類似物(諸如異尿苷)。不管孤兒核苷酸為胞苷或其類似物，抑或尿嘧啶或其類似物，其較佳包含去氧核糖(2'-H；=DNA)，但亦可能在糖之2'位置處包含diF修飾。在一實施例中，側接孤兒核苷酸的至少一個核苷酸不包含2'-OMe修飾，且在另一實施例中，側接孤兒核苷酸的兩個相鄰(直接相鄰)核苷酸不包含2'-OMe修飾。就RNA編輯而言，進行完全修飾，其中寡核苷酸之所有核苷酸(包括孤兒核苷酸)均持有2'-OMe修飾，且保留天然鹼基，此導致寡核苷酸失去功能(此項技術中已知)，大概因為其阻礙了目標位置上的ADAR活性。一般而言，目標RNA中之腺苷可藉由提供具有2'-OMe基團之相對核苷酸(至少在該核苷酸內沒有其他化學取代或修飾的情況下)來避免編輯，或藉由提供鳥嘌呤或腺嘌呤作為相對鹼基來避免編輯，因為此等兩種核鹼基亦能夠減少相對腺苷之編輯。 鍵聯修飾
核苷酸通常係透過使其5'-磷酸酯部分縮合成鄰近核苷酸單體之3'-羥基部分而連接至鄰近核苷。類似地，其3'-羥基部分通常連接至鄰近核苷酸單體之5'-磷酸酯。此形成PO鍵。PO與骨架形成交替共聚物。鹼基接枝至此共聚物，即接枝至骨架部分。由於此特徵，由寡核苷酸之所連接骨架形成之交替共聚物通常稱為寡核苷酸之「主鏈」。由於PO鍵將鄰近單體連接在一起，因此其通常稱為「主鏈鍵聯」。應理解，當磷酸酯基經修飾以使得其實際上為諸如PS之類似部分時，此類部分仍稱為單體之主鏈鍵聯。此稱為「主鏈鍵聯修飾」。一般而言，寡核苷酸之主鏈包含交替骨架及主鏈鍵聯。
如本文詳細概述，本文所揭露之裸露的導引寡核苷酸包含至少一個、較佳多個鍵聯修飾。一般而言，更佳的係，本文所揭露之導引寡核苷酸包含儘可能多的鍵聯修飾，若該導引寡核苷酸能夠介導編輯，則可能包含所有位置之鍵聯修飾。鍵聯修飾可為(但不限於) RNA中存在之PO之經修飾形式，諸如PS、對掌性純PS、( R)-PS、( S)-PS、MP、對掌性純MP、( R)-MP、( S)-MP、磷醯基胍(諸如PNdmi)、對掌性純磷醯基胍、( R)-磷醯基胍、( S)-磷醯基胍、二硫代磷酸酯(PS2)、膦醯基乙酸酯(PACE)、膦醯基乙醯胺(PACA)、硫代膦醯基乙酸酯、硫代膦醯基乙醯胺、甲基硫代磷酸酯、甲基硫代膦酸酯、PS前驅藥、烷基化PS、H-膦酸酯、乙基磷酸酯、乙基PS、硼代磷酸酯、硼代PS、甲基硼代磷酸酯、甲基硼代PS酯、甲基硼代膦酸酯、甲基硼代硫代磷酸酯、磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯，及其衍生物。另一修飾包括胺基亞磷酸酯、胺基磷酸酯、N3' P5'、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、二胺基硫代磷酸酯、胺基磺酸酯、二乙烯亞碸、醯胺、磺酸酯、矽氧烷、硫化物、碸、甲醯基、烯基、亞甲基肼基、磺醯胺、三唑、草醯基(oxalyl)、胺基甲酸酯、亞甲基亞胺基(MMI)，及硫代乙醯胺核酸(TANA)；及其衍生物。亦包括各種鹽、混合鹽、去質子化、質子化、互變異構及游離酸形式，以及3' 3'及2' 5'鍵聯。本文所揭露之導引寡核苷酸亦可包含一或多個根據式(I)結構之鍵聯修飾： 其中： X=O或S；及 R=芳基、經取代芳基、雜環、經取代雜環、芳族雜環、經取代芳族雜環、C 1-C 6烷氧基、經取代C 1-C 6烷氧基、C 1-C 20烷基、經取代C 1-C 20烷基、C 1-C 6烯基、C 1-C 6經取代烯基、C 1-C 6炔基、經取代C 1-C 6炔基，或偶聯基團。在一較佳實施例中，X=O且R=甲基，其中鍵聯修飾稱為MsPA或PNms。在其他較佳態樣中，R等於以下結構(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)中之一者：
本文亦揭露一種導引寡核苷酸，其能夠藉由在細胞內該導引寡核苷酸與目標RNA核酸分子之區域形成雙股複合物後，募集細胞內之去胺酶來介導腺苷去胺，其中該區域包含目標腺苷，其中該去胺酶可以將目標腺苷去胺成肌苷，且其中導引寡核苷酸在一個及/或兩個末端包含根據式(II)結構之部分： 其中：X=O或S； Y=O -或S -；及 R=芳基、經取代芳基、雜環、經取代雜環、芳族雜環、經取代芳族雜環、C 1-C 6烷氧基、經取代C 1-C 6烷氧基、C 1-C 20烷基、經取代C 1-C 20烷基、C 1-C 6烯基、C 1-C 6經取代烯基、C 1-C 6炔基、經取代C 1-C 6炔基，或偶聯基團。在一較佳實施例中，X=O且R=甲基。
本文所揭露之導引寡核苷酸可包含對PO鍵聯中一個非橋接氧原子的取代。此修飾使鹼基配對略微不穩定，但顯著增加對核酸酶降解之抗性。較佳之核苷酸類似物或等效物包含PS、膦醯基乙酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、H-膦酸酯、甲基及其他烷基膦酸酯(包括3'-伸烷基膦酸酯、5'-伸烷基膦酸酯及對掌性膦酸酯)、亞膦酸酯、胺基磷酸酯(包括3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯)、硫代胺基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯或硼代磷酸酯。尤其較佳為經修飾以含有PS之核苷間鍵聯。尤其較佳為經修飾以含有PNms之核苷間鍵聯。尤其較佳為經修飾以含有PNdmi之核苷間鍵聯。核苷酸之間的常規核苷間鍵聯可藉由PO鍵之單或二硫化改變，以分別得到PS酯或二硫代磷酸酯。核苷間鍵聯亦可能有其他修飾，包括醯胺化及肽連接子。熟習此項技術者可根據目標核酸序列，確定導引寡核苷酸在本文所揭露之導引寡核苷酸之各鍵聯位置上包含何種鍵聯修飾，以產生最有效且最穩定的寡核苷酸化合物。
許多非天然存在之鍵聯修飾，諸如PS為對掌性。此意謂存在為熟習此項技術者已知的Rp及Sp組態。在一個實施例中，PS鍵聯之對掌性受到控制，此意謂各鍵聯呈Rp或呈Sp組態，以較佳者為準。在指定鍵聯位置選擇Rp或Sp組態可能取決於目標序列以及與目標腺苷結合及誘導編輯的效率。然而，若並非特別需要，則組合物可包含在某一指定鍵聯位置處具有Rp及Sp組態兩者之導引寡核苷酸作為活性化合物。此類導引寡核苷酸之混合物亦為可行的，其中某些位置較佳具有任一組態，而對於其他位置而言，此並不重要。在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含一或多個(對掌性純的或對掌性混合的) PS鍵聯。在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含一或多個(對掌性純的或對掌性混合的)胺基磷酸酯(PN)鍵聯。在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含一或多個(對掌性純的或對掌性混合的) PNms鍵聯。在一個態樣中，PN鍵聯連接導引寡核苷酸之各端上的兩個末端核苷酸。本文所揭露之導引寡核苷酸亦可在不受對掌性控制的所有位置包含鍵聯修飾。本文所揭露之導引寡核苷酸亦可包含一或多個天然存在之核苷間鍵聯。經修飾鍵聯之選擇及數目可視特定目標、序列、長度，及在所關注之特定細胞類型中所觀察到的導引寡核苷酸之穩定性而定，此可藉由熟習此項技術者已知之方法評估。在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸之5'及/或3'末端的二、三、四或五個核苷之間分別的至少一個、至少兩個、至少三個或至少四個核苷間鍵聯為經修飾之核苷間鍵聯。在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含至少一個根據式(III)結構的MP核苷間鍵聯：
如此項技術中所指出，導引寡核苷酸中MP鍵聯之較佳位置為鍵聯位置-2，由此使位置-1處之核苷與位置-2處之核苷連接。在一較佳實施例中，在本文所揭露之導引寡核苷酸中，此位置包含根據式(I)結構鍵聯修飾而非MP鍵聯。國際專利申請公開案第WO2020/201406號揭示在第一核酸股中之孤兒核苷酸周圍之某些位置使用MP鍵聯修飾。儘管MP鍵聯之存在與人類ADAR酶之RNA編輯係相容的，但在寡核苷酸之生產期間引入MP鍵聯係具有挑戰性的，因為偶合及去偶過程中需要額外的生產(純化)步驟。在一個態樣中，導引寡核苷酸不包含MP鍵聯。
在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含至少一個PNdmi鍵聯，較佳連接導引寡核苷酸5'及/或3'端之最末端的兩個核苷。較佳用於本文所揭露之導引寡核苷酸中的PNdmi鍵聯具有式(IV)之結構：
可用於本文所揭露之導引寡核苷酸中的其他核苷間鍵聯為揭露於國際專利申請公開案第WO2023/278589號中的彼等核苷間鍵聯。在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含至少一個膦醯基乙酸酯及/或至少一個膦醯基乙醯胺核苷間鍵聯。 偶聯化學物質
在一個態樣中，導引寡核苷酸共價或非共價、直接或透過連接子連接、結合於三萜醣苷、較佳AG1856。AG1856亦稱為「皂苷」(參見國際專利申請案第PCT/EP2024/051278號，未公開；以及國際專利申請公開案第WO2021/122998號)。一旦目標細胞攝取了導引寡核苷酸，皂苷能夠改善該導引寡核苷酸之內體釋放，且可能在治療期間提供更高效的編輯。皂苷，較佳AG1856可共同投與(或在投與導引寡核苷酸之前/之後投與)，但較佳為透過一或多個連接部分與導引寡核苷酸直接地或間接地偶聯。熟練人員基於此等教示內容能夠找到此類偶聯物之最佳型式，以實現靶向 RELN前驅mRNA及/或mRNA且將導引寡核苷酸導引至所選目標細胞的目的。
在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸，或在進入目標細胞之前與其黏接的有義股(在本文所揭露之HEON中)，與疏水性部分結合，諸如棕櫚基或其類似物、膽固醇或其類似物，或生育酚或其類似物。其較佳結合至5'末端。在疏水性部分結合至5'末端以及結合至3'末端之情況下，此類疏水性部分可相同或不同。結合至寡核苷酸之疏水性部分可直接結合，或藉由另一物質間接介導。當疏水性部分直接結合時，若該部分係經由共價鍵、離子鍵、氫鍵或其類似鍵結合，則足夠。當疏水性部分間接結合時，其可經由連接子(連接子)結合。連接子可為可裂解或不可裂解連接子。可裂解連接子係指可在生理條件下，例如在細胞或動物體(例如人體)中裂解之連接子。可裂解連接子係藉由內源性酶(諸如核酸酶)，或藉由對身體或細胞之部分具有特異性之生理環境(諸如pH或還原環境(諸如麩胱甘肽濃度))選擇性地裂解。可裂解連接子之實例包含(但不限於)醯胺、酯、PO之一個或兩個酯、磷酸酯、胺基甲酸酯及二硫鍵，以及天然DNA連接子。可裂解連接子亦包括自我分解型連接子。不可裂解連接子係指在生理條件下不裂解或與可裂解連接子相比裂解極緩慢的連接子，例如PS鍵、由PS鍵聯連接之經修飾或未經修飾之去氧核糖核苷、經由PS鍵聯連接之間隔子及由經修飾或未經修飾之核糖核苷組成之連接子。當連接子為諸如DNA之核酸，或寡核苷酸時，鏈長不受限制。然而，其通常可為2至20個鹼基長、3至10個鹼基長或4至6個鹼基長。連接配位體及寡核苷酸的間隔子之長度或組合物不受限制，且可包括例如乙二醇、三乙二醇(TEG)、HEG、烷基鏈、丙基、6-胺基己基或十二基。一或多種其他類型之分子可透過一或多種連接子結合至導引寡核苷酸，該等連接子包括肽、糖、維生素、聚合物、抗體(片段)、小分子及其類似物。 概述
除了本文所揭露之化合物中某些位置處的特定較佳化學修飾之外，本文所揭露之導引寡核苷酸亦可包含一或多個(額外)對核鹼基、骨架及/或主鏈鍵聯的修飾，該(等)修飾可能存在於或可能不存在於同一單體中，例如在3'及/或5'位置處。在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含至少一個根據式(I)結構之核苷間鍵聯，及/或該導引寡核苷酸進一步包含至少一個具有包含2'-OMe修飾之糖部分的核苷酸，及/或該導引寡核苷酸包含至少一個具有包含2'-MOE修飾之糖部分的核苷酸，及/或該導引寡核苷酸包含至少一個具有包含2'-F修飾之糖部分的核苷酸，及/或該導引寡核苷酸包含一個在糖部分中攜帶2'-H的孤兒核苷酸，因此稱為DNA核苷酸，儘管在其鹼基及/或與其相鄰核苷之鍵聯中可能存在額外修飾。在一個態樣中，孤兒核苷酸在糖部分中攜帶2'-F。在一個態樣中，孤兒核苷酸在糖部分中攜帶diF取代基。在一個態樣中，孤兒核苷酸在糖部分中攜帶2'-F及2'- C-甲基。在一個態樣中，孤兒核苷酸在糖部分中包含處於阿拉伯糖組態(FANA)中之2'-F。
在一個態樣中，導引寡核苷酸為一種反義寡核苷酸，其可與包含目標腺苷之目標 RELN核酸序列之一部分形成雙股核酸複合物，其中該雙股核酸複合物可募集腺苷去胺酶，以對目標RNA分子中之目標腺苷進行去胺，其中導引寡核苷酸中與目標腺苷相對的核苷酸為孤兒核苷酸，且其中該孤兒核苷酸具有式(V)之結構： 其中：X為O、NH、OCH 2、CH 2、Se或S；B為選自由以下組成之群的含氮鹼基：胞嘧啶、尿嘧啶、異尿嘧啶、N3-醣基化尿嘧啶、假異胞嘧啶、8-側氧基-腺嘌呤及6-胺基-5-硝基-3-基-2(1H)-吡啶酮；R 1及R 2皆獨立地選自H、OH、F或CH 3；R 3為導引寡核苷酸之一部分，位於孤兒核苷酸之5'，由6、7或8個核苷酸組成；及R 4為導引寡核苷酸之一部分，位於孤兒核苷酸之3'，由16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸組成。孤兒核苷酸之3'及/或5'之核苷酸可為DNA，更佳為3' (位置-1)處之核苷酸。
本文所揭露之導引寡核苷酸之其他化學修飾包括用氘或氚取代一個或超過一個的任何氫原子，其實例可見於例如國際專利申請公開案第WO2014/022566號或第WO2015/011694號中。同樣，在所有情況下，修飾應與編輯相容，使得導引寡核苷酸發揮其作為寡核苷酸之作用，即可在結合至其目標序列之後由於產生之雙股核酸實體而募集腺苷去胺酶。在本揭露之所有態樣中，具有腺苷去胺酶活性之酶較佳為ADAR1、ADAR2或ADAT。
本文所揭露之導引寡核苷酸較佳不包括5'末端O6-苯甲基鳥苷或5'末端胺基修飾，且較佳不共價連接至SNAP標籤域(一種經工程改造之O6-烷基鳥苷-DNA-烷基轉移酶)。本文所揭露之導引寡核苷酸較佳不包含boxB RNA髮夾序列。在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含與目標序列的0、1、2或3個搖擺鹼基對，及/或與目標RNA序列的0、1、2、3、4、5、6、7或8個錯配鹼基對。當孤兒核苷酸為尿苷時，不存在錯配，而當孤兒核苷酸為尿苷類似物或衍生物時，其定義可能有所不同。尿苷之一個替代方案為將異尿苷相對於目標腺苷置放，其可能不會如G與U配對般配對。較佳地，目標序列中之目標腺苷與導引寡核苷酸中之核苷形成錯配鹼基對，該核苷與目標腺苷直接相對。
如上文所概述，本文所揭露之導引寡核苷酸在預定點處使用特定核苷酸修飾，以確保穩定性以及適當的ADAR結合及活性。此等變化可能有所不同，可能包括導引寡核苷酸主鏈、核苷酸糖基部分以及核鹼基或PO鍵聯中的修飾，如本文詳細概述。其亦可在導引寡核苷酸之整個序列中可變地分佈。可能需要特定修飾以支持ADAR酶之RNA-結合域內以及去胺酶域中的不同胺基酸殘基之相互作用。舉例而言，核苷酸之間的PS鍵聯或2'-OMe或2'-MOE修飾在導引寡核苷酸之一些部分中可能容許，但在其他部分中應避免，以免破壞酶與磷酸酯及2'-OH基團的關鍵相互作用。當目標序列對於ADAR編輯並非最佳時，亦可能必需特定核苷酸修飾來提高對受質RNA之編輯活性。先前工作已確定某些序列情形更適合編輯。舉例而言，目標序列5'-UAG-3' (目標A位於中間)含有ADAR2之最佳最近鄰核苷酸，而5'-CAA-3'目標序列則並非優選的(Schneider等人, Nucleic Acids Res .2014, 42(10):e87)。ADAR2去胺酶域之結構分析提示，藉由仔細選擇與目標三核苷酸相對之核苷酸，有可能增強編輯效果。舉例而言，由於鳥苷鹼基與ADAR2之胺基酸側鏈發生空間衝突，因此與相對股上之3'-GCU-5'序列配對的5'-CAA-3'目標序列(在中間形成A-C錯配)並非優選的。在該情況下，與C相對之鳥苷較佳經肌苷(因此，在導引寡核苷酸內的-1位置處)置換，更佳經Id置換，如本揭露進一步概述。
與已針對siRNA或間隔體以及其與RNA酶降解的關係，以及該等間隔體在雙股複合物中之使用(參見例如EP 3954395 A1)所描述的情況相比，本文所揭露之導引寡核苷酸不包含使目標序列(或有義核酸股)成為RNA酶介導之降解的目標的DNA核苷酸片段。不希望目標轉錄分子透過導引寡核苷酸與轉錄分子之結合而降解。在一個實施例中，導引寡核苷酸在其序列內的任何位置均不包含四個或更多個連續的DNA核苷酸。在一實施例中，導引寡核苷酸由儘可能多的經(化學)修飾核苷酸構成，以增強對RNA酶介導之降解的抗性，同時儘可能高效地產生RNA編輯效果。此意謂導引寡核苷酸中之孤兒核苷酸及若干其他核苷酸可能為DNA，但亦意謂在導引寡核苷酸中不存在四個或更多個連續的DNA核苷酸。因此，本文所揭露之導引寡核苷酸不為間隔體。間隔體減少目標轉錄本之表現，但不會對目標轉錄本內之指定腺苷產生RNA編輯。在原理上，間隔體為一種單股核酸，由中心區(具有至少四個連續去氧核糖核苷酸之DNA間隔區)及直接位於其5'端(5'翼區)及3'端(3'翼區)之翼區組成。相比之下，本文所揭露之導引寡核苷酸可為任何產生RNA編輯效應的寡核苷酸，其中目標RNA分子中之目標腺苷被去胺為肌苷，因此該導引寡核苷酸儘可能抵抗RNA酶介導之降解，以產生此效應，且允許mRNA轉錄本被轉譯成蛋白質。
本文所揭露之導引寡核苷酸亦可在使用助劑的情況下投與，該等助劑將提高導引寡核苷酸進入目標細胞及/或一旦進入細胞後的內體逃逸的效率。可應用於此類應用之部分為例如一組稱為「皂苷」或「三萜醣苷」之化合物(通常從自然界中純化)。在本文所揭露之方法中可使用的皂苷較佳為AG1856，其揭露於國際專利申請公開案第WO2021/122998號中，且在國際專利申請案第PCT/EP2024/051278號(未公開)中進一步描述為與產生RNA編輯的寡核苷酸一起使用。 組 合物及方法
本文亦揭露一種醫藥組合物，其包含本文所揭露之導引寡核苷酸，且進一步包含醫藥學上可接受之載劑、溶劑、稀釋劑，及/或其他添加劑(諸如皂苷或三萜醣苷，如AG1856(如上文所論述)，該添加劑實際上亦可與導引寡核苷酸分開投與)，且可溶解於醫藥學上可接受之有機溶劑中，或類似溶劑中。投與導引寡核苷酸或醫藥組合物之劑型可取決於待治療之病症及需靶向之組織，且可根據此項技術中的常用程序進行選擇。醫藥組合物可藉由單劑量投與或藉由多劑量投與進行投與。其可每天投與或以適當時間間隔投與，該等時間間隔可使用本領域中之公共常識確定且可基於病症及活性成分之功效而調整。
儘管在一較佳實施例中，本文所揭露之導引寡核苷酸為一種單股寡核苷酸，其包含與目標核苷酸相對的孤兒核苷酸，其中孤兒核苷酸如本文所揭露進行化學修飾，且其中寡核苷酸之其餘部分亦如本文所揭露進行化學修飾以防止其被核酸酶降解；但在另一實施例中，揭露了任何類型之寡核苷酸或異雙螺旋寡核苷酸複合物，其可能或可能不與髮夾結構(內部或在末端)結合，可能與核酸編輯實體或其催化域結合，或其中寡核苷酸呈環狀型式。在一較佳態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸為一種「裸露」的寡核苷酸，其在序列內之一或多個核苷酸之核糖及/或鹼基中包含多種化學修飾，較佳包含至少一個根據本文所揭露之式(I)結構之鍵聯，該導引寡核苷酸可與目標核酸序列或其包括目標腺苷之部分雜交，且可募集目標細胞中之內源性(天然存在)核酸編輯實體以編輯目標核苷酸。在另一態樣中，本文所揭露的以「裸露」形式遞送之導引寡核苷酸不包含用於募集去胺酶的莖-環結構，此使得導引寡核苷酸更短，且改善細胞遞送及轉運。
此項技術中已知，RNA編輯實體(諸如人類ADAR酶)係根據若干因素以不同特異性編輯dsRNA結構。一個重要因素為構成dsRNA序列之兩個股的互補程度。兩個股完全互補通常引起人類ADAR之催化域以無差別方式使腺苷去胺，與其遇到的任何腺苷反應。可藉由引入化學修飾及/或確保dsRNA中之若干錯配來提高hADAR1及2之特異性，此可能有助於以尚未明確定義之方式來定位dsRNA結合域。另外，去胺反應自身可藉由提供寡核苷酸來增強，該寡核苷酸包含與所編輯之腺苷相對的錯配。遵循本申請案之說明，熟習此項技術者將能夠根據其需求設計寡核苷酸之互補部分。
一般技術者應理解，細胞內部之編輯實體(諸如編輯酶)被重新導向至其他目標位點之程度可藉由改變第一核酸股對於編輯實體之識別域的親和力來調節。精確修飾可透過一些試誤法及/或透過基於導引寡核苷酸與編輯酶識別域之間的結構相互作用的計算方法來確定。另外或替代地，細胞中駐存之編輯酶之募集及重新定向程度可藉由導引寡核苷酸之劑量及給藥方案來調節。此係由實驗者(活體外)或臨床醫師通常在I期及/或II期臨床試驗中確定。
本文揭露在真核生物，較佳後生動物，更佳哺乳動物，更佳神經元細胞，更佳人類神經元細胞，及最佳來自人類中樞神經系統之細胞中，對RNA序列中之目標腺苷進行位點特異性編輯。目標細胞可位於活體外、離體或活體內。本文所揭露之導引寡核苷酸之一個優點為其既可原位與活機體中之細胞一起使用，亦可與培養中之細胞一起使用。在一些實施例中，細胞經離體處理且隨後引入至活機體中(例如重新引入至其最初所來源之有機體中)。本文所揭露之導引寡核苷酸亦可用於編輯來自移植物或所謂類器官(例如腦組織類器官)中之細胞的目標RNA序列。類器官可視為三維的活體外來源之組織，但可使用特定條件驅動產生單個孤立的組織。在治療情形中，其為有用的，因為其可活體外來源於患者之細胞，隨後該等類器官作為自體材料重新引入患者體內，與正常移植物相比，其不大可能被排斥。
不希望受理論束縛，例如透過人類ADAR2進行之RNA編輯被認為發生在細胞核中之初級轉錄本上，發生在轉錄或剪接期間，或發生在細胞質中，在細胞質中可編輯例如成熟mRNA、miRNA或ncRNA。一般而言，RNA編輯可用於產生具有不同特性之RNA序列。該等特性可為編碼特性(產生具有不同序列或長度之蛋白質，從而導致蛋白質特性或功能改變)，或結合特性(引起RNA自身或目標或結合搭配物之抑制或過度表現；藉由重新編碼miRNA或其目標RNA上的同源序列，可能改變整個表現路徑)。蛋白質功能或定位可根據需要，藉由功能域或識別模體進行改變，包括(但不限於)信號序列、靶向或定位信號、蛋白水解分裂或共轉譯或轉譯後修飾的識別位點、酶之催化位點、結合搭配物之結合位點、降解或活化信號等。本揭露涵蓋此等及其他形式之RNA及蛋白質「工程改造」，無論用於預防、延緩或治療疾病還是用於醫藥或生物技術中之任何其他目的，作為診斷、防治、治療、研究工具或其他。
待投與之導引寡核苷酸之量、劑量及給藥方案可因細胞類型、待治療之疾病、目標群體、投與模式(例如全身性投與對比局部投與)、疾病嚴重程度及可接受之副作用水平而異，但此等因素可在且應在活體外研究、臨床前及臨床試驗期間藉由試誤法來評估。當經修飾序列導致容易偵測之表型變化，或指定生物標記物(之含量或活性) (諸如血漿膽酸含量)發生變化時，試驗尤為直接。較高劑量之導引寡核苷酸可能在細胞內與ADAR酶競爭性結合，從而耗盡自由參與RNA編輯之酶之量，但常規劑量試驗將揭示給定導引寡核苷酸與給定目標的任何此類效應。
一個適合之試驗技術涉及將導引寡核苷酸遞送至細胞株或測試有機體，隨後在其後之不同時間點獲取切片檢查樣品。可在切片檢查樣品中評估目標RNA之序列且可容易地追蹤具有修飾之細胞的比例。如上文所提及，在治療前後，或使用或不使用本文所揭露之導引寡核苷酸治療個體的情況下，來自經治療個體之樣品中的血漿膽酸含量濃度為評估該個體體內某些蛋白質功能的適當生物標記物。在進行過一次此試驗後，則可保留相關知識，且未來可在不需要獲取切片檢查樣品之情況下進行遞送。因此，本文所揭露之方法可包括一個步驟，即鑑別細胞之目標RNA序列中是否存在所需變化，從而驗證目標RNA序列是否已經被修飾。此步驟通常將涉及對目標RNA或其cDNA複本(或其剪接產物之cDNA複本，在目標RNA為前驅mRNA之情況下)之相關部分進行定序，如上文所論述，且因此可容易地驗證序列變化。或者，如上文所指示，可在治療之前、期間及/或之後評估蛋白質功能變化或評估任何其他潛在標記物，該等量測較佳係活體外對獲自經治療個體之樣品進行。
在細胞中出現RNA編輯之後，經修飾RNA可隨時間推移變得稀釋，例如由於細胞分裂、經編輯RNA之半衰期有限等。因此，在實際治療方面，本文所揭露之方法可能涉及重複遞送導引寡核苷酸，直至已修飾足夠的目標RNA，從而為患者提供切實益處及/或隨著時間推移維持益處。
本文所揭露之導引寡核苷酸尤其適用於治療用途，且因此亦揭露一種醫藥組合物，其包含本文所揭露之導引寡核苷酸及醫藥學上可接受之載劑、溶劑或稀釋劑。在一些實施例中，醫藥學上可接受之載劑可簡單地為生理鹽水溶液。此對於經肺遞送尤其有用，可為等滲的或低滲的。本文所揭露之導引寡核苷酸適合以水溶液(例如生理鹽水)或以懸浮液之形式投與，視情況包含添加劑、賦形劑及其他與醫藥用途相容的成分，濃度範圍為1 ng/ml至1 g/ml，較佳10 ng/ml至500 mg/ml，更佳100 ng/ml至100 mg/ml。劑量之適宜範圍可在約1 μg/kg至約100 mg/kg之間，較佳約10 μg/kg至約10 mg/kg，更佳約100 μg/kg至約1 mg/kg。投與可藉由吸入(例如透過霧化)、鼻內、經口、藉由注射或輸注、靜脈內、皮下、皮內、肌內、氣管內、腹膜內、直腸內、鞘內、腦室內(例如大池內)、非經腸及其類似方式進行。投與可呈固體形式、呈粉末、丸劑、凝膠、溶液、緩慢釋放型調配物形式，或呈任何其他與人類醫藥用途相容的形式。
在一個實施例中，關於A至I轉換的去胺作用，鑑別編輯是否發生的步驟包含以下步驟：對目標核酸序列進行定序；評估非功能性或功能較低之蛋白質的存在或不存在；評估RNA中目標腺苷之去胺是否改變了前驅mRNA之剪接；或使用功能性讀出，因為去胺後的目標核酸應編碼具有較低功能或無功能的蛋白質，或者另一方面，編碼功能增強、恢復或新獲得的蛋白質。去胺轉變為肌苷的鑑定可能為使用適合之生物標記物進行功能性讀出。功能性評估通常將根據熟習此項技術者已知之方法進行。使用熟習此項技術者熟知之方法，在目標腺苷去胺後鑑定肌苷存在的適合方式為dPCR或定序。然而，熟悉神經退化性疾病領域之技術人員將較佳應用測試來監測與神經功能相關的某些生物標記物。
在一個實施例中，本文所揭露之方法包含向個體投與本文所揭露之導引寡核苷酸或能夠表現其之載體的步驟，使導引寡核苷酸與目標核酸序列在個體之細胞中形成雙股核酸複合物；允許核苷酸編輯實體，諸如內源存在之腺苷去胺酶，諸如ADAR 1或ADAR2參與；且允許該實體編輯目標核酸序列中之目標核苷酸，從而緩解、治療、改善疾病或減緩疾病進展。
細胞中存在之核苷酸編輯實體在本質上通常為蛋白質，諸如在後生動物(包括哺乳動物)中存在之ADAR酶。尤其較佳為人類ADAR，即hADAR1及hADAR2，包括其任何同功型。此項技術中已知之RNA編輯酶(可針對其適宜地設計本文所揭露之寡核苷酸構築體)包括作用於RNA之腺苷去胺酶(ADAR)，諸如人類或人類細胞中之hADAR1及hADAR2，及胞苷去胺酶。已知hADAR1以兩種同功型存在；一種為150 kDa干擾素可誘導型長同功型，另一種為110 kDa較短同功型，後者係透過替代性剪接自共同的前驅mRNA產生。因此，細胞中可用150 kDa同功型之含量可受干擾素，尤其干擾素-γ (IFN-γ)影響。hADAR1亦可由TNF-α誘導。此為開發組合療法提供了機會，其中IFN-γ或TNF-α及本文所揭露之導引寡核苷酸以組合產品形式，或以單獨產品形式同時或以任何次序相繼投與患者。某些疾病病狀可能已與患者之某些組織中IFN-γ或TNF-α含量的增加相一致，從而為針對病變組織進行更具特異性的編輯創造了更多機會。一般技術者應理解，細胞內部之編輯實體被重新導向至其他目標位點之程度可藉由改變第一核酸股對於編輯分子之識別域的親和力來調節。
在一些實施例中，本文所揭露之導引寡核苷酸可利用內源性細胞路徑及天然存在之ADAR酶來特異性地編輯目標RNA序列中之目標腺苷。本文所揭露之某些導引寡核苷酸能夠募集ADAR且與其複合，從而促進與該導引寡核苷酸結合之目標RNA序列中(單個)特定目標腺苷核苷酸的去胺。在一些實施例中，僅一個腺苷去胺。當本文所揭露之導引寡核苷酸與ADAR複合時，較佳導致單個目標腺苷去胺。
本文所揭露之導引寡核苷酸，尤其當其呈裸露形式時，通常比16個核苷酸長。在一個態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸比20個核苷酸長。本文所揭露之導引寡核苷酸較佳比100個核苷酸短，仍更佳比60個核苷酸短，仍更佳比50個核苷酸短。在一較佳態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含18至70個核苷酸，更佳包含18至60個核苷酸，且甚至更佳包含18至50個核苷酸。因此，在一尤其較佳態樣中，本文所揭露之導引寡核苷酸包含16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸。在一個尤其較佳實施例中，本文所揭露之導引寡核苷酸之長度為23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33個核苷酸。較佳地，當導引寡核苷酸靶向人類 RELN基因之前驅mRNA及/或mRNA時，其具有隨附實例中所示之非對稱設計。較佳地，自孤兒位置(即位置0)來看，5'部分之長度為6、7或8個核苷酸。較佳地，自孤兒位置(即位置0)來看，3'部分之長度為16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸。
在一實施例中，導引寡核苷酸不適用於不需要導引寡核苷酸之編輯系統。在一實施例中，導引寡核苷酸不適用於藉由同源重組在小鼠中產生 Reln-H3448R突變。在一實施例中，導引寡核苷酸不適用於藉由同源重組產生小鼠 Reln-H3448R突變及/或人類 RELN-H3447R突變。在一實施例中，導引寡核苷酸不適用於經由同源重組產生攜帶 Reln - COLBOS變異體的 Reln-H3448R-Tg基因嵌入小鼠模型。
在一個實施例中，核酸編輯酶不使用同源重組進行編輯。在一實施例中，核酸編輯酶不藉由同源重組產生小鼠 Reln-H3448R突變及/或人類 RELN-H3447R突變。在一實施例中，核酸編輯實體不藉由同源重組產生攜帶 Reln-COLBOS變異體的 Reln-H3448R-Tg基因嵌入小鼠模型。 實例 實例 1 . 使用不同導引寡核苷酸對 RELN 轉錄本進行 RNA 編輯。
設計了多種導引寡核苷酸，用於靶向CAU密碼子(在人類 RELN轉錄本中)中之腺苷，該密碼子在人類絡絲蛋白蛋白質的胺基酸位置3447處編碼組胺酸(H) (H3447)，且其中自腺苷成為肌苷(CIU)之去胺將提供一個密碼子，該密碼子將在此位置轉譯為精胺酸(R)。因此，胺基酸變化在本文中通常稱為H3447R。 圖 1A中提供目標密碼子之序列及其在人類 RELNDNA中的周圍序列。顯然，使用本揭露之導引寡核苷酸及內源性ADAR酶進行去胺的目標序列發生在自DNA轉錄之轉錄本上，因此實際目標序列包含尿苷(U)而非胸苷殘基(T)。因此， 圖 1A中之序列表示彼目標轉錄本，其中T經U置換。 圖 2、 圖 3及 圖 7中提供了導引寡核苷酸之序列、設計及化學修飾。在圖式簡單說明中討論了化學修飾。
首先，使用神經前驅細胞培養基且通常根據熟習此項技術者已知之方案，將人類iPSC (WT04)來源之神經前驅細胞分化為成熟的皮層神經元。為了對導引寡核苷酸進行初步篩選且確定RNA編輯效率，執行了以下操作。在第0天，將成熟神經元以每孔2.0×10 5個細胞之濃度接種於12孔盤中，且使其擴增至第11天。用如下三種不同方案進行導引寡核苷酸處理： 1)在第11天，遵照製造商說明書使用Lipofectamine ®RNAiMAX Reagent，用200 nM導引寡核苷酸(每種導引寡核苷酸進行N=2或3次生物學重複處理)轉染細胞。在採集之前將培養盤在37℃、5% CO 2條件下培育48小時。在第2天(轉染後48小時)，丟棄上清液，且如下文所描述處理細胞以分離RNA。 2)在第11天，藉由自主攝取(自主，即不使用轉染助劑)，用溶解於培養基中的5 µM導引寡核苷酸(每種導引寡核苷酸進行N=2次生物學重複處理)處理細胞，且在採集之前將培養盤在37℃、5% CO 2條件下培育7天。在導引寡核苷酸處理開始後的第2天及第4天，用不含導引寡核苷酸的50%新鮮培養基更新細胞。在處理開始後的第7天，丟棄上清液，且如下文所描述處理細胞以進行RNA分離。 3)在第11天，藉由自主攝取，用溶解於含有1 µM三萜醣苷AG1856 (皂苷)之培養基中的5 µM導引核苷酸(每種導引寡核苷酸進行N=1或2次生物學重複處理)處理細胞。隨後，在採集之前將培養盤在37℃、5% CO 2條件下培育7天。在導引寡核苷酸+皂苷處理開始後的第2天及第4天，用不含導引寡核苷酸或皂苷的50%新鮮培養基更新細胞。在處理開始後的第7天，丟棄上清液，且如下文所描述處理細胞以進行RNA分離。
收集細胞，且根據製造商說明書，使用ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System (Promega-Z612)進行RNA分離。使用Maxima Reverse Transcriptase (Thermo-EP0742)套組，用寡聚-dT引子、隨機六聚體引子及dNTP混合物(各10 mM)，對總RNA進行逆轉錄。隨後，使用Digital PCR系統(QIAGEN, QIAcuity dPCR系統)，在含有cDNA、適當引子對及探針及dPCR主混合物(QIAGEN - QIAcuity Mastermix (4×))的每份12 μl的反應混合物等分試樣中進行定量PCR。藉由QIAcuity系統對盤進行預處理。使用 表 1中給出的正向及反向引子與以下PCR程序一起使用：95℃持續2分鐘；95℃持續15秒及63℃持續30秒，40個循環。通道成像(HEX、FAM及CY5，探針序列參見 表 1)分別進行了500、500及400毫秒，且分別設置了6、6及8之增益值。 表 1 .人類RELN轉錄本中H3447R編輯的dPCR所用的引子及探針。「+」符號表示符號3'端有鎖核酸(LNA)。括號中給出了SEQ ID NO。
名稱 序列 5' -3' 條項
hRELN 201_e63-64 fw 1 ATGTGGAGGTCGTCCTCACTCGC (95) Fw引子1
hRELN_e65 rv 2 TGGGTATCGCCTAAGTGACC (96) Rv引子1
hRELN_e65_G_ FAM 4 /56-FAM/ATGGGCTCAG+A+C+G+TTTC+TACAACAG/3IABkFQ/ (97) Fam探針
hRELN_e65_A_ HEX 4 /5HEX/ATGGGCTCAG+A+C+A+TT+TC+TACAACAG/3IABkFQ/ (98) Hex探針
hRELN_e54_fw 1 CACTGTGAGACAAGCGGTTACAC (99) Fw引子2
hRELN_e55_rv 1 GATGGGACGATGGCAAGAGG (100) Rv引子2
hRELN_e54-55_Con_Cy5 1 /5Cy5/TCTTCGAGGTGC+AAA+GTT+CCTGCA/3IAbRQSp/ (101) Cy5探針
編輯百分比係藉由將各轉染之生物學重複之所有A及G計數合併，接著根據以下公式計算得出： 分數 = SUM(G) / (SUM(A+G) × 100
圖 4展示轉染實驗之結果。 圖 5展示在自主攝取(無皂苷)情況下能夠容易偵測到RNA編輯的實驗結果。 圖 6展示在自主攝取(用皂苷共處理)情況下能夠容易偵測到RNA編輯的實驗結果。轉染資料表明，尤其具有約8個核苷酸的相對較短的5'部分及約16至22個核苷酸的相對較長的3'部分的不對稱導引寡核苷酸，產生了最高的編輯效率，約為10%至12%(參見RM116835、RM116836及RM116837)。此等實驗表明，RM116835、RM116836、RM116837、RM116838 (具有典型的不對稱設計)以及RM116818及RM116827為本文所揭露內容之較佳實施例。亦表明，不對稱設計，即自孤兒位置計算的導引寡核苷酸之5'部分相對較短，而自孤兒位置計算的導引寡核苷酸之3'部分相對較長，為本文所揭露內容之較佳實施例。
不出所料，自主攝取後的RNA效率低於轉染情況下觀察到的效率。儘管總體編輯效率低於3%，但RM116827及一些不對稱導引寡核苷酸(RM116836、RM116837及RM116838)表現良好。當在內體釋放因子AG1856 (三萜醣苷或皂苷)之情形下使用自主攝取時，發現不對稱設計之導引寡核苷酸RM116835、RM116836、RM116837及RM116838，以及RM116821及RM116827表現尤其良好，達到約9.5%之編輯。 實例 2 . 使用另一組導引寡核苷酸對 RELN 轉錄本進行 RNA 編輯。
基於實例1中所獲得之結果，以RM116835及RM116838之設計為基礎，進一步設計了額外導引寡核苷酸進行測試。此等額外31種設計如 圖 7所描繪，其中RM118850至RM118867基於RM116835 (SEQ ID NO: 58)，RM118868至RM118880基於RM116838 (SEQ ID NO: 61)。與新合成的RM116835及RM116838寡核苷酸一起，此等31種新的導引寡核苷酸在如上文實驗設置3)中所描述之皂苷的情形下進行了自主攝取實驗，隨後按照實例1中所描述的RNA分離、cDNA產生及dPCR偵測設置進行操作。如上文所描述量測目標腺苷之RNA編輯。值得注意的是，存在不同的 RELN同功型，稱為201及203，其中同功型210缺少同功型203中存在的外顯子64。外顯子64僅6個核苷酸長，且其序列恰好與上述實驗設置中用於cDNA產生的正向引子「hRELN 201_e63-64 fw 1」 (表1)相匹配。為了區分導引寡核苷酸對同功型201及同功型203之影響(且主要為了區分兩種同功型之cDNA產生)，生成另一種正向引子「hRELN_e63-64-65_fw 2」，其序列為5'-ATG TGG AGG TCG TCC TAG TAA GC-3' (SEQ ID NO: 107)。使用此等兩種不同的正向引子進行兩種不同的cDNA產生，來分別評估其對同功型201及203的影響，隨後分別評估其之RNA編輯。
編輯百分比結果提供於 圖 8中，其中 圖 8A展示使用201同功型正向引子之編輯百分比， 圖 8B展示使用203同功型正向引子之編輯百分比。兩種同功型之間的編輯百分比模式似乎類似。與 圖 6中所示之資料相比，該兩種原始導引寡核苷酸在此新的實驗中表現略好，其中RM116835展示13.9% (201)及18.3% (203)之編輯百分比，RM116838展示11.3% (201)及13.2% (203)之編輯百分比。有趣地，其證明有可能設計出進一步改良之導引寡核苷酸，其展示出極大提高之編輯效率，最佳表現者為： RM118851 (SEQ ID NO: 65) - 22.3 % (201)及23.2 % (203) RM118852 (SEQ ID NO: 66) - 20.4 % (201)及24.2 % (203) RM118850 (SEQ ID NO: 64) - 18.4 % (201)及20.3 % (203) RM118874 (SEQ ID NO: 88) - 20.0 % (201)及21.1 % (203) RM118876 (SEQ ID NO: 90) - 19.1 % (201)及25.4 % (203) RM118875 (SEQ ID NO: 89) - 17.2 % (201)及17.1 % (203) RM118855 (SEQ ID NO: 69) - 16.4 % (201)及18.1 % (203) RM118853 (SEQ ID NO: 67) - 16.3 % (201)及17.2 % (203) RM118868 (SEQ ID NO: 82) - 16.2 % (201)及16.6 % (203) RM118869 (SEQ ID NO: 83) - 14.2 % (201)及17.4 % (203) RM118870 (SEQ ID NO: 84) - 16.0 % (201)及17.6 % (203)
在另一實驗中，對此等導引寡核苷酸及基於此等表現最佳者之設計而設計的新導引寡核苷酸進行了活體內實驗測試。為此，較佳將三萜醣苷(較佳為在上述自主/皂苷實驗中使用的皂苷AG1856)與導引寡核苷酸偶聯，以便在導引寡核苷酸進入需要編輯 RELN轉錄分子的目標細胞後，提供極高效的內體逃逸。AG1856與導引寡核苷酸之偶聯通常按照國際專利申請案PCT/EP2024/051278 (未公佈)中所描述進行。在另一種實驗設置中，使用LNP活體內遞送導引寡核苷酸。
除此之外，亦在相關哺乳動物(初代)細胞培養物中，使用西方墨點法及免疫螢光染色法確定磷酸化Dab1蛋白之含量及/或速率。
僅舉例而言，現將參考附圖來描述本揭露之一或多個實施例，在該等圖式中： 圖 1A展示5'至3'方向的一部分野生型人類 RELN核酸序列(NCBI參考序列：NM_005045.4)之核苷酸序列，其展示編碼人類絡絲蛋白中位置3447處之組胺酸(H3447)的密碼子CAT (帶下劃線)中的目標腺苷(粗體)及SEQ ID NO； 圖 1B展示 圖 1A中核酸序列的3'至5'方向的互補序列，其以粗體展示孤兒核苷酸(與目標腺苷相對之核苷酸)之位置，亦展示SEQ ID NO； 圖 1C展示圖 1A中核酸序列的5'至3'方向的反義序列，其以粗體展示孤兒核苷酸(與目標腺苷相對之核苷酸)之位置。應理解，當目標RELN核酸為前驅mRNA或mRNA分子時，胸苷殘基(T)應讀作尿苷殘基(U)。 圖 1D展示 圖 1A之5'至3'轉錄序列，且表示RNA編輯之同一目標序列部分(SEQ ID NO: 106)，且以粗體顯示腺苷(帶下劃線之密碼子的中間)。亦應理解，導引寡核苷酸中之孤兒核苷酸(如本揭露所揭露)並非如 圖 1B及 圖 1C所提出的為胸苷(T)，而是較佳為胞苷(C)、胞苷類似物、尿苷(U)或尿苷類似物。 圖 2展示本文所揭露之例示性導引寡核苷酸之序列。導引寡核苷酸中之化學修飾如下：Gm、Am、Um及Cm分別為2'-OMe修飾之鳥苷、腺苷、尿苷及胞苷；m5Ce為2'-MOE修飾之5-甲基胞苷；Ge為2'-MOE修飾之鳥苷；Ae為2'-MOE修飾之腺苷；m5Ue為2'-MOE修飾之5-甲基尿苷(有時亦稱為「Te」」；2'-MOE修飾之胸苷)；Af、Uf、Gf及Cf分別為2'-F修飾之腺苷、尿苷、鳥苷及胞嘧啶；Zd為胞苷類似物，亦稱作攜帶6-胺基-5-硝基-3-基-2(1H)-吡啶酮核鹼基(Benner鹼基，如本文進一步所概述)之核苷，在2'核糖(ribose)位置處有去氧部分(=DNA)；Id為去氧肌苷；*係指PS鍵聯；!係指PNdmi鍵聯；^係指MP鍵聯；及ᶿ係指PO鍵聯。 圖 3展示一組額外導引寡核苷酸之序列，以及其各別RM名稱及SEQ ID NO。化學修飾如 圖 2中所提供。 圖 4展示在人類iPSC (WT04)來源之神經前驅細胞中，在如圖下所示之導引寡核苷酸RM116817至RM116840 轉染後，在轉染後第2天獲得的 RELN目標(前驅) mRNA中， 圖 1D中所示之目標腺苷之編輯百分比。亦進行了陰性(未處理)對照(模擬)。 圖 5展示在人類iPSC (WT04)來源之神經前驅細胞中，在如圖下所示之導引寡核苷酸 自主攝取( gymnotic uptake)後，在開始用各別導引寡核苷酸自主處理後第7天獲得的 RELN目標(前驅) mRNA中， 圖 1D中所示之目標腺苷之編輯百分比。亦進行了陰性(未處理；NT)對照。 圖 6展示在人類iPSC (WT04)來源之神經前驅細胞中，在如圖下所示之導引寡核苷酸 自主攝取且用三萜醣苷AG1856 ( 皂苷)共處理後，在開始自主/皂苷處理後第7天獲得的 RELN目標(前驅) mRNA中， 圖 1D中所示之目標腺苷之編輯百分比。亦進行了陰性(未處理；NT)對照。 圖 7展示另一組導引寡核苷酸之序列，以及其各別RM編號及SEQ ID NO。RM118550至RM118867係基於寡核苷酸RM116835 (SEQ ID NO: 58，此亦稱作G3447-19)之序列及修飾而設計，而RM118868至RM118880係基於寡核苷酸RM116838 (SEQ ID NO: 61，此亦稱作G3447-22)之序列及修飾而設計。化學修飾提供於 圖 2中，其中#係指PNms鍵聯。 圖 8展示在人類iPSC (WT04)來源之神經前驅細胞中，在 圖 7之導引寡核苷酸 自主攝取且用三萜醣苷AG1856 ( 皂苷)共處理後，在開始自主/皂苷處理後第7天獲得的 RELN目標(前驅) mRNA中， 圖 1D中所示之目標腺苷之編輯百分比。亦進行了僅sap (皂苷)之陰性對照。 圖 8A展示了使用對同功型201之轉錄序列具有特異性之正向引子的結果，而 圖 8B展示使用對同功型203之轉錄本具有特異性之正向引子的結果。
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Claims (29)

  1. 一種導引寡核苷酸，其至少部分與包含目標核苷酸之人類 RELN核酸分子之一部分互補，其中該 RELN核酸分子編碼絡絲蛋白(reelin)蛋白質，其中該導引寡核苷酸之組態使得其能夠在細胞內，在生理條件下，與該 RELN核酸之部分形成雙股複合物，且該雙股複合物能夠募集該細胞中天然存在的核酸編輯酶，以對該目標核苷酸進行編輯，從而產生包含經編輯目標核苷酸之經編輯 RELN核酸。
  2. 如請求項1之導引寡核苷酸，其中對該目標核苷酸之編輯導致經編碼絡絲蛋白蛋白質之活性提高。
  3. 如請求項2之導引寡核苷酸，其中該經編碼絡絲蛋白蛋白質具備新增功能型表型，該新增功能型表型選自以下中之一或多者： (i)    觸發信號傳導的能力增強，較佳為APOEr/Dab1/GSK3β路徑； (ii)   增加Dab1磷酸化的能力增強； (iii)  減少與神經原纖維纏結相關之Tau磷酸化的能力增強； (iv)   促進管狀結構形成及/或穩定性及/或神經元密度的能力增強； (v)    對蛋白水解降解的抗性增強；及/或 (vi)   該絡絲蛋白蛋白質與醣胺聚糖，較佳肝素，及/或NRP1的結合增強。
  4. 如請求項1至3中任一項之導引寡核苷酸，其中對該目標核苷酸之編輯在該經編碼絡絲蛋白蛋白質中之胺基酸位置3446至3460中之一或多處引入胺基酸變異體，較佳地，其中對該目標核苷酸之編輯在該經編碼絡絲蛋白蛋白質中之胺基酸位置3447處引入組胺酸變為精胺酸之變化(H3447R)。
  5. 如請求項1至4中任一項之導引寡核苷酸，其中該細胞為腦細胞，較佳為神經元。
  6. 如請求項1至5中任一項之導引寡核苷酸，其中該目標核苷酸為腺苷，且該核酸編輯酶為作用於RNA (ADAR)酶之腺苷去胺酶。
  7. 如請求項1至6中任一項之導引寡核苷酸，其中該 RELN核酸分子為mRNA或前驅mRNA。
  8. 如請求項1至7中任一項之導引寡核苷酸，其中孤兒核苷酸為該導引寡核苷酸中與該目標核苷酸相對之核苷酸，其中核苷酸編號方式為：該孤兒核苷酸編號為0，且核苷酸進一步向5'端正(+)遞增且向3'端負(-)遞增，且其中至少一個核鹼基、糖或核苷間鍵聯已經化學修飾。
  9. 如請求項8之導引寡核苷酸，其中該孤兒核苷酸為去氧胞苷、胞苷類似物、去氧尿苷，或尿苷類似物。
  10. 如請求項1至9中任一項之導引寡核苷酸，其中該導引寡核苷酸之長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個核苷酸。
  11. 如請求項1至10中任一項之導引寡核苷酸，其中該導引寡核苷酸包含SEQ ID NO: 102 (5'-UG UA GAA A CI UCU GAG CCC AUG UUGUCG UGA AA-3')或SEQ ID NO: 103 (5'-UG UA GAA A ZI UCU GAG CCC AUG UUGUCGUGAAA-3')中連續23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33個核苷酸的片段，至少包含帶下劃線之核苷酸部分(分別為SEQ ID NO: 104 (5'-UA GAA A CI UCU GAG CCC AUG UUG-3')及SEQ ID NO: 105 (5'-UA GAA A ZI UCU GAG CCC AUG UUG-3'))，其中Z為包含6-胺基-5-硝基-3-基-2(1H)-吡啶酮核鹼基之核苷酸，且I為肌苷。
  12. 如請求項1至11中任一項之導引寡核苷酸，其中該導引寡核苷酸包含一或多個核苷間鍵聯修飾，其各自獨立地選自硫代磷酸酯(PS)、膦醯基乙酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯(MP)、磺醯基胺基磷酸酯、(1,3-二甲基亞咪唑啶-2-基)胺基磷酸酯(PNdmi)，或具有根據式(I)之結構之鍵聯修飾 其中：X=O或S；及 R=芳基、經取代芳基、雜環、經取代雜環、芳族雜環、經取代芳族雜環、C 1-C 6烷氧基、經取代C 1-C 6烷氧基、C 1-C 20烷基、經取代C 1-C 20烷基、C 1-C 6烯基、C 1-C 6經取代烯基、C 1-C 6炔基、經取代C 1-C 6炔基，或偶聯基團； 較佳地，其中X=O且R=甲基，且該鍵聯修飾為甲磺醯基胺基磷酸酯(PNms)。
  13. 如請求項1至12中任一項之導引寡核苷酸，其中該導引寡核苷酸之核苷間鍵聯編號方式為：該鍵聯編號0為該孤兒核苷酸中之鍵聯5'，且該寡核苷酸中之鍵聯位置向5'端正(+)遞增且向3'端負(-)遞增，且其中鍵聯位置-2為MP或PNms鍵聯。
  14. 如請求項1至13中任一項之導引寡核苷酸，其中該導引寡核苷酸包含一或多個核苷酸，該一或多個核苷酸在核糖之2'、3'及/或5'位置處包含單取代或二取代，其各自獨立地選自由以下組成之群：-OH；-F；經取代或未經取代、直鏈或分支鏈低碳(C 1-C 10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基，其可能間雜有一或多個雜原子；-O-、S-或N-烷基；-O-、S-或N-烯基；-O-、S-或N-炔基；-O-、S-或N-烯丙基；-O-烷基-O-烷基；-甲氧基；-胺基丙氧基；-甲氧基乙氧基；-二甲胺基氧基乙氧基；及-二甲胺基乙氧基乙氧基。
  15. 如請求項1至14中任一項之導引寡核苷酸，其包含結構(自5'至3')： N 8N 7N 6N 5N 4N 3N 2N 1ᶿZdId^M 2M 3M 4M 5M 6M 7M 8M 9M 10M 11M 12M 13M 14M 15M 16M 17M 18M 19M 20M 21M 22M 23M 24其中： Zd為核苷酸位置0處之孤兒核苷酸，其為攜帶Benner鹼基之去氧核苷酸； N 1為Ae或Ad； N 2為Af； N 3及N 5各自獨立地為Am或Af； N 4為Gf； N 6為Uf； N 7不存在(當N 8及N 9亦不存在時)，為Gm或Gf； N 8不存在(當N 9亦不存在時)，或為Um； Id為去氧肌苷； M 2為Um； M 3為Cf； M 4、M 14及M 15各自獨立地為m5Ue或Um； M 5及M 7為Gf； M 6為Am或Af； M 8及M 10各自獨立地為Cm或Cf； M 9為Cf； M 11為Am； M 12為Um； M 13為Gm； M 16為Ge或Gm； M 17不存在(當M 18至M 24亦不存在時)，為m5Ue或Um； M 18不存在(當M 19至M 24亦不存在時)，為Cm或m5Ce； M 19不存在(當M 20至M 24亦不存在時)，為Gm或Ge； M 20不存在(當M 21至M 24亦不存在時)，為Um或m5Ue； M 21不存在(當M 22至M 24亦不存在時)，為Gm或Ge； M 22不存在(當M 23及M 24亦不存在時)，為Am或Ae； M 23不存在(當M 24亦不存在時)，或為Ae； M 24不存在，或為Ae； ᶿ位於鍵聯位置0處，且為PO鍵聯或PNms鍵聯； ^位於鍵聯位置-2處，且為MP或PNms鍵聯； 所有其他鍵聯為PO、PS、PNdmi或PNms鍵聯；及 其中Gm、Am、Um及Cm分別為2'- O-甲基(2'-OMe)修飾之鳥苷、腺苷、尿苷及胞苷；m5Ce為2'-MOE修飾之5-甲基胞苷；Ge為2'-MOE修飾之鳥苷；Ae為2'-MOE修飾之腺苷；m5Ue為2'-MOE修飾之5-甲基尿苷(有時亦稱為「Te」」；2'-MOE修飾之胸苷)；Af、Uf、Gf及Cf分別為2'-F修飾之腺苷、尿苷、鳥苷及胞嘧啶。
  16. 如請求項1至15中任一項之導引寡核苷酸，其中該導引寡核苷酸包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 65、66、90、64、88、89、69、67、82、83、84、58、61、59、60、41、44、50、68、70、71、72、73、78、79、80、81、85、86及87中之任一者之序列。
  17. 如請求項1至16中任一項之導引寡核苷酸，其中該導引寡核苷酸與三萜醣苷，較佳AG1856結合，較佳偶聯。
  18. 一種載體，較佳為病毒載體，更佳為腺相關病毒(AAV)載體，其包含編碼如請求項1至7中任一項之導引寡核苷酸之核酸分子。
  19. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至17中任一項之導引寡核苷酸或如請求項18之載體，及醫藥學上可接受之載劑。
  20. 如請求項1至17中任一項之導引寡核苷酸，其用於治療、改善神經退化性疾病，較佳阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease)，更佳體染色體顯性阿茲海默氏症，或減緩其進展。
  21. 一種如請求項1至17中任一項之導引寡核苷酸之用途，其用於製造用以治療、改善神經退化性疾病，較佳阿茲海默氏症，更佳體染色體顯性阿茲海默氏症，或減緩其進展的藥物。
  22. 一種治療、改善有需要之人類個體之神經退化性疾病、較佳阿茲海默氏症、更佳體染色體顯性阿茲海默氏症，或減緩其進展的方法，該方法包含向該個體投與如請求項1至17中任一項之導引寡核苷酸或如請求項18之載體，藉此編輯目標 RELN核酸序列以編碼絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質有能力延緩該神經退化性疾病之一或多種症狀發作。
  23. 一種活體外、離體或活體內對腦細胞，較佳神經元中之目標 RELN核酸序列中之目標腺苷進行去胺的方法，該方法包含以下步驟： (i)    向該細胞提供如請求項1至17中任一項之導引寡核苷酸或如請求項18之載體； (ii)   使該細胞攝取該導引寡核苷酸或載體； (iii)  使該導引寡核苷酸與該目標 RELN核酸序列黏接；及 (iv)   使核酸編輯實體編輯該目標。
  24. 如請求項23之方法，其進一步包含在投與該導引寡核苷酸之前、之後或同時投與三萜醣苷，較佳AG1856的步驟。
  25. 一種在細胞中，較佳在腦細胞中編輯人類 RELN核酸序列的方法，其中該人類 RELN核酸序列為前驅mRNA或mRNA，該方法包含使該目標 RELN核酸序列與能夠觸發ADAR介導之腺苷成為肌苷之去胺作用的導引寡核苷酸接觸，藉此編輯該目標 RELN核酸序列以編碼絡絲蛋白蛋白質，該絡絲蛋白蛋白質有能力延緩神經退化性疾病，較佳阿茲海默氏症，更佳體染色體顯性阿茲海默氏症之一或多種症狀發作。
  26. 如請求項25之方法，其中導引核苷酸係根據請求項1至17中任一項。
  27. 一種編輯人類 RELN前驅mRNA或mRNA分子中之目標腺苷的核酸分子，其中目標區域為SEQ ID NO: 106，且其中該目標腺苷為編碼 RELN編碼之人類絡絲蛋白蛋白質中位置3447處之組胺酸的密碼子的第二核苷酸。
  28. 如請求項27之核酸分子，其中該核酸分子係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 41、44、50、58、59、60、61、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93及94。
  29. 如請求項27或28之核酸分子，其進一步包含至少一個非天然存在之化學修飾，及/或在核糖、鍵聯或鹼基部分中包含一或多個額外非天然存在之化學修飾，其限制條件為該孤兒核苷酸，即該核酸中與該目標區域中之目標腺苷直接相對的核苷酸，不為包含2'-OMe核糖取代之胞苷。
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