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TW202515915A - 抗ｐｉｌｒａ抗體、其用途以及相關方法及試劑 - Google Patents

抗ｐｉｌｒａ抗體、其用途以及相關方法及試劑 Download PDF

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TW202515915A
TW202515915A TW113123113A TW113123113A TW202515915A TW 202515915 A TW202515915 A TW 202515915A TW 113123113 A TW113123113 A TW 113123113A TW 113123113 A TW113123113 A TW 113123113A TW 202515915 A TW202515915 A TW 202515915A
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pilra
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TW113123113A
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金度真
希沃特 吉爾瑪 米斯克
凱瑟琳 Ｍ 夢露
辛西亞 維羅尼卡 帕斯圖科娃
漢娜 莎貝爾斯特朗
理查德 二世 西奧利斯
譚雅 Ｎ 維拉科迪
丹 夏
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美商戴納立製藥公司
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Abstract

本文提供具有高度期望的選擇性之抗PILRA抗體：其具有相當的與食蟹猴及人類PILRA蛋白之結合，但與人類PILRB蛋白之結合弱得多，並且結合至PILRA G78及R78變異體。本文所述之抗體之結合及選擇性概況允許其用於動物研究( 例如，猴)而不需要依賴於替代分子且亦在用任一PILRA變異體治療個體時。在本文中首次進一步描述與PILRA相關之生物發現及減少細胞中之PILRA傳訊之效應。

Description

抗PILRA抗體、其用途以及相關方法及試劑
配對免疫球蛋白樣2型受體α (PILRA)係一種跨膜受體，其在多種免疫細胞諸如小神經膠質細胞上表現且據信在抑制性細胞傳訊路徑中發揮作用。PILRA之錯義變異體(G78R)與阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)風險降低相關。G78R變異體改變了唾液酸接合所必需的殘基之相互作用，從而導致若干PILRA配位體之結合減少。
仍然需要調節PILRA活性之治療劑。
本文描述了選擇性結合至食蟹猴PILRA (cynoPILRA)及hPILRA，但與人類PILRB (hPILRB)之結合可能相對較低的抗體。吾人已鑑別允許所需選擇性之抗原決定基。此選擇性概況為高度有利的，但鑒於cynoPILRA與hPILRB之間的較高同源性，亦非常具有挑戰性。在食蟹猴蛋白與人類蛋白之間具有相當的結合允許在猴中進行研究而無需依賴於替代分子。相反，與PILRB之結合並非所需的，因為PILRB雖然具有與PILRA高度類似之細胞外域，但具有不同細胞內域，從而預期具有不同或甚至相反的活性。此外，本文所述之抗體亦包含可結合至CD98重鏈(CD98hc)蛋白之經修飾Fc多肽。
此外，本文所述的具有此選擇性概況之某些抗體亦結合至兩種PILRA變異體形式(G78及R78)且在此處具有活性，因此鑒於各變異體之頻率在世界之不同地區非常不同，確保其可用於各種群體中。
除了開發高度可用抗體以外，吾人亦作出與PILRA生物學相關之重大發現，包括發現PILRA傳訊之某些下游效應物，且首次表徵減少小神經膠質細胞中PILRA受體之傳訊的效應。此等見解首次允許將PILRA配位體阻斷與細胞中之生物效應關聯，從而提供用於藥物發現以及用於量測已知PILRA結合物對於細胞及動物之生物影響的新穎方法。
在一態樣中，本揭示案提供一種經單離抗體，其包含以下各者： (a) 特異性結合至配對免疫球蛋白樣2型受體α (PILRA)之可變區； (b) 第一Fc多肽；及 (c) 第二Fc多肽， 其中該第一Fc多肽經修飾以特異性結合至CD98重鏈(CD98hc)蛋白。
在一些實施例中，抗體特異性結合至PILRA之G78變異體及PILRA之R78變異體。在一些實施例中，針對PILRA之G78變異體之結合親和力及針對PILRA之R78變異體之結合親和力彼此在50倍內( 例如，40倍、30倍、20倍、10倍、5倍、或2倍內)。
在一些實施例中，PILRA為食蟹猴配對免疫球蛋白樣2型受體α (cynoPILRA)。在一些實施例中，針對cynoPILRA之結合親和力比針對人類配對免疫球蛋白樣2型受體β (hPILRB)之結合親和力強至少2倍( 例如，至少4倍、6倍、8倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或100倍)。
在一些實施例中，PILRA為人類配對免疫球蛋白樣2型受體α (hPILRA)。
在一些實施例中，抗體之可變區包含： (1) CDR-H1序列，其與GYTFTEYYMY (SEQ ID NO:10)之序列包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)序列一致性，或相對於SEQ ID NO:10之序列具有多至兩個胺基酸取代； (2) CDR-H2序列，其與RIDPEDGGTD (SEQ ID NO:11)之序列包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)序列一致性，或相對於SEQ ID NO:11之序列具有多至兩個胺基酸取代； (3) CDR-H3序列，其與TIRGTVFAF (SEQ ID NO:12)之序列包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)序列一致性，或相對於SEQ ID NO:12之序列具有多至兩個胺基酸取代； (4) CDR-L1序列，其與RASEDIFNGLA (SEQ ID NO:13)之序列包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)序列一致性，或相對於SEQ ID NO:13之序列具有多至兩個胺基酸取代； (5) CDR-L2序列，其與NAKTLHT (SEQ ID NO:14)之序列包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)序列一致性，或相對於SEQ ID NO:14之序列具有多至兩個胺基酸取代；及 (6) CDR-L3序列，其與QQYYDYPLT (SEQ ID NO:15)之序列包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)序列一致性，或相對於SEQ ID NO:15之序列具有多至兩個胺基酸取代。
在一些實施例中，胺基酸取代為保守取代。
在一些實施例中，抗體之可變區包含：包含SEQ ID NO:10之序列或相對於SEQ ID NO:10之序列之一或多個保守取代的CDR-H1；包含SEQ ID NO:11之序列或相對於SEQ ID NO:11之序列之一或多個保守取代的CDR-H2；包含SEQ ID NO:12之序列或相對於SEQ ID NO:12之序列之一或多個保守取代的CDR-H3；包含SEQ ID NO:13之序列或相對於SEQ ID NO:13之序列之一或多個保守取代的CDR-L1；包含SEQ ID NO:14之序列或相對於SEQ ID NO:14之序列之一或多個保守取代的CDR-L2；及包含SEQ ID NO:15之序列或相對於SEQ ID NO:15之序列之一或多個保守取代的CDR-L3。
在一些實施例中，抗體之可變區包含：包含SEQ ID NO:10之序列之CDR-H1；包含SEQ ID NO:11之序列之CDR-H2；包含SEQ ID NO:12之序列之CDR-H3；包含SEQ ID NO:13之序列之CDR-L1；包含SEQ ID NO:14之序列之CDR-L2；及包含SEQ ID NO:15之序列之CDR-L3。
在一些實施例中，抗體之可變區包含與SEQ ID NO:16具有至少85% ( 例如，至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)序列一致性之重鏈可變區(V H)序列。在某些實施例中，V H序列包含SEQ ID NO:16之序列。
在一些實施例中，抗體之可變區包含與SEQ ID NO:17具有至少85% ( 例如，至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)序列一致性之輕鏈可變區(V L)序列。在某些實施例中，V L序列包含SEQ ID NO:17之序列。
在一些實施例中，抗體之可變區包含：包含SEQ ID NO:16之V H序列及包含SEQ ID NO:17之V L序列。
在一些實施例中，抗體之可變區包含與SEQ ID NO:21具有至少85% ( 例如，至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)序列一致性之重鏈可變區(V H)序列。在某些實施例中，V H序列包含SEQ ID NO:21之序列。
在一些實施例中，抗體之可變區包含與SEQ ID NO:22具有至少85% ( 例如，至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)序列一致性之輕鏈可變區(V L)序列。在某些實施例中，V L序列包含SEQ ID NO:22之序列。
在一些實施例中，可變區包含：包含SEQ ID NO:21之V H序列及包含SEQ ID NO:22之V L序列。
在一些實施例中，CD98hc蛋白為人類CD98hc蛋白。在一些實施例中，CD98hc蛋白與LAT1 (SLC7A5)、LAT2 (SLC7A8)、y+LAT1 (SLC7A7)、y+LAT2 (SLC7A6)、Asc-1 (SLC7A10)、或xCT (SLC7A11)形成複合物。在某些實施例中，CD98hc蛋白與LAT1 (SLC7A5)形成複合物。
在本文所述之抗體之一些實施例中，第一Fc多肽包含與SEQ ID NO:64之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列。在某些實施例中，第一Fc多肽包含：根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala。
在本文所述之抗體之一些實施例中，與具有野生型Fc二聚體之抗體相比，該抗體具有經改良之腦部吸收。在一些實施例中，與具有野生型Fc二聚體之抗體相比，該抗體具有至少兩倍(例如，至少兩、三、四、五、六、或七倍)經改良之腦部吸收。在具體實施例中，與具有野生型Fc二聚體之抗體相比，該抗體具有兩倍與七倍之間(例如，兩倍與六倍之間、兩倍與五倍之間、兩倍與四倍之間、兩倍與三倍之間、三倍與七倍之間、四倍與七倍之間、五倍與七倍之間、或六倍與七倍之間；兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、或七倍)經改良之腦部吸收。
在一些實施例中，根據EU編號，第一Fc多肽具有T366W取代且第二Fc多肽具有T366S、L368A、及Y407V取代。在一些實施例中，根據EU編號，第一Fc多肽具有T366S、L368A、及Y407V取代且第二Fc多肽具有T366W取代。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含減少效應子功能之修飾。在某些實施例中，根據EU編號，減少效應子功能之修飾包含位置234處之Ala及位置235處之Ala之取代。在某些實施例中，減少效應子功能之修飾包含位置329處Gly之取代。
在本文所述之抗體之一些實施例中，抗體包含： (i) 第一重鏈，其包含：(1)具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的V H序列，及(2)包含用於CD98hc結合之修飾、杵突變、及減少或消除效應子功能之修飾的第一Fc多肽； (ii) 第二重鏈，其包含：(1)具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3之V H序列，及(2)包含臼突變及減少或消除效應子功能之修飾的第二Fc多肽；及 (iii) 第一輕鏈及第二輕鏈，其各自包含具有相應SEQ ID NO:13-15之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3之V L序列。
在本文所述之抗體之一些實施例中，抗體包含： (i) 該第一重鏈包含：(1)具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的V H序列，及(2)第一Fc多肽，其包含根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、位置442處之Ala、位置366處之Trp、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列； (ii) 該第二重鏈包含：(1)具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的V H序列，及(2)第二Fc多肽，其包含根據EU編號之T366S、L368A、Y407V、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列；及 (iii) 該第一輕鏈及該第二輕鏈各自包含具有相應SEQ ID NO:13-15之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3之V L序列。在一些實施例中，第一重鏈及第二重鏈中之各者中之V H序列與SEQ ID NO:16包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性。在一些實施例中，第一輕鏈及第二輕鏈中之各者中之V L序列與SEQ ID NO:17包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性。在一些實施例中，第一重鏈及第二重鏈中之各者中之V H序列與SEQ ID NO:16包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性且第一輕鏈及第二輕鏈中之各者中之V L序列與SEQ ID NO:17包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性。
在本文所述之抗體之一些實施例中，抗體包含： (i) 該第一重鏈包含：(1)具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3且與SEQ ID NO:16具有至少90% ( 例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的V H序列，及(2)第一Fc多肽，其包含根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、位置442處之Ala、位置366處之Trp、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列； (ii) 該第二重鏈包含：(1)具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3且與SEQ ID NO:16具有至少90% ( 例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的V H序列，及(2)第二Fc多肽，其包含根據EU編號之T366S、L368A、Y407V、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列；及 (iii) 該第一輕鏈及該第二輕鏈各自包含具有相應SEQ ID NO:13-15之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3且與SEQ ID NO:17具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性之V L序列。
在本文所述之抗體之一些實施例中，抗體包含： (i) 該第一重鏈包含與SEQ ID NO:18之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列； (ii) 該第二重鏈包含與SEQ ID NO:19之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列；及 (iii) 該第一輕鏈及該第二輕鏈各自包含與SEQ ID NO:20之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性之序列。
在本文所述之抗體之一些實施例中，抗體包含： (i) 該第一重鏈包含：具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的V H序列，及第一Fc多肽，其包含根據EU編號來編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、位置442處之Ala、位置366處之Trp、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列； (ii) 該第二重鏈包含具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的V H序列，及第二Fc多肽，其包含根據EU編號來編號之T366S、L368A、Y407V、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列；及 (iii) 該第一輕鏈及該第二輕鏈各自包含具有SEQ ID NO:13-15之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3之V L序列。在一些實施例中，第一重鏈及第二重鏈中之各者中之V H序列與SEQ ID NO:21包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性。在一些實施例中，第一輕鏈及第二輕鏈中之各者中之V L序列與SEQ ID NO:22包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性。在一些實施例中，第一重鏈及第二重鏈中之各者中之V H序列與SEQ ID NO:21包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性且第一輕鏈及第二輕鏈中之各者中之V L序列與SEQ ID NO:22包含至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性。
在本文所述之抗體之一些實施例中，抗體包含： (i) 該第一重鏈包含：具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3且與SEQ ID NO:21具有至少90% ( 例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的V H序列，及第一Fc多肽，其包含根據EU編號來編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、位置442處之Ala、位置366處之Trp、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列； (ii) 該第二重鏈包含：具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3且與SEQ ID NO:21具有至少90% ( 例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的V H序列，及第二Fc多肽，其包含根據EU編號來編號之T366S、L368A、Y407V、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列；及 (iii) 該第一輕鏈及該第二輕鏈各自包含具有相應SEQ ID NO:13-15之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3且與SEQ ID NO:22具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性之V L序列。
在一些實施例中，抗體包含： (i) 該第一重鏈包含與SEQ ID NO:23之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列； (ii) 該第二重鏈包含與SEQ ID NO:24之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性的序列；及 (iii) 該第一輕鏈及該第二輕鏈各自包含與SEQ ID NO:25之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%、或100%)一致性之序列。
在本文所述之抗體之一些實施例中，抗體拮抗hPILRA活性。在某些實施例中，抗體阻斷唾液酸化蛋白與hPILRA之結合。唾液酸化蛋白之實例包括但不限於唾液酸化NPDC1、PANP、HSV-1 gB、COLEC12、C4a、C4b、DAG1、及Clec4g。
在一些實施例中，抗體增強EGFR或STAT3之磷酸化，或降低STAT1之磷酸化。在某些實施例中，抗體增強細胞遷移。在某些實施例中，抗體增強小神經膠質細胞遷移。在某些實施例中，抗體增強抗炎基因或蛋白質表現。在具體實施例中，抗體增強IL1RN基因表現。在某些實施例中，抗體減少促炎性細胞介素蛋白質表現或分泌。在具體實施例中，抗體減少TNF、IL 6及/或IP 10表現。在一些實施例中，抗體增加細胞呼吸。在一些實施例中，抗體增加粒線體呼吸。在某些實施例中，抗體增加ATP產生。在某些實施例中，抗體增加脂肪酸代謝。在某些實施例中，抗體不活化周圍免疫細胞。在一些實施例中，抗體不活化嗜中性球及單核球。在一些實施例中，抗體增加小神經膠質細胞中之脂質儲存或脂質水準。
在另一態樣中，本揭示案提供一種醫藥組成物，其包含本文所述之經單離抗體及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本揭示案提供一或多種多核苷酸，其包含編碼本文所述之經單離抗體中任一者之重鏈及/或輕鏈的一或多個核酸序列。
在另一態樣中，本揭示案提供一或多種載體，其包含一或多種本文所述多核苷酸。
在另一態樣中，本揭示案提供一種宿主細胞，其包含一或多種本文所述之多核苷酸或一或多種本文所述之載體。
在另一態樣中，本揭示案提供產生經單離抗體之方法，其包含在表現本文所述之經單離抗體的條件下培養本文所述之宿主細胞。
在另一態樣中，本揭示案提供治療個體之神經退化性疾病的方法，其包含向個體投與本文所述之經單離抗體或本文所述之醫藥組成物。在某些實施例中，神經退化性疾病選自由以下組成之群：阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、原發性年齡相關tau蛋白病、進行性核上神經麻痺症(PSP)、額顳葉型失智症、額顳葉型失智症伴與染色體17相關之帕金森症、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮側索硬化症、肌萎縮側索硬化症/關島型帕金森氏症-失智症綜合症(amyotrophic lateral sclerosis/parkinsonism-dementia complex of Guam，ALS-PDC)、皮質基底核退化症、慢性創傷性腦病、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、拳擊員失智症、擴散性神經原纖維纏結伴鈣化、唐氏症候群(Down’s syndrome)、家族性英國型失智症、家族性丹麥型失智症、格施謝三氏症(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、球狀神經膠質tau蛋白病、瓜達洛普帕金森氏病伴失智症(Guadeloupean parkinsonism with dementia)、瓜達洛普(Guadelopean) PSP、哈-斯二氏病(Hallevorden-Spatz disease)、遺傳性彌漫性腦白質病伴失智症(HDLS)、杭丁頓氏病(Huntington’s disease)、包涵體肌炎、多系統萎縮症、肌強直性營養不良、Nasu-Hakola病、神經原纖維纏結佔優性失智症、C型尼-皮二氏病(Niemann-Pick disease type C)、蒼白球-腦橋-黑質變性、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、皮克氏病(Pick’s disease)、腦炎後帕金森氏症、朊病毒蛋白大腦澱粉樣血管病、進行性皮層下神經膠瘤病、亞急性硬化性全腦炎、及僅纏結性失智症。
在另一態樣中，本揭示案提供一種用於確定抗體是否在PILRA蛋白處具有活性的方法，該方法包含： (a) 使表現該PILRA蛋白之細胞與該抗體接觸； (b) 在步驟(a)之前、同時、或之後，使具有較低PILRA表現或無PILRA表現之與步驟(a)相同類型之細胞與該抗體接觸；及 (c) 在兩種細胞中，量測以下中之一者：磷酸化STAT3 (pSTAT3)水準及磷酸化STAT1 (pSTAT1)水準， 其中在該等細胞之間此等量測結果中之一者之水準的變化指示該抗體在步驟(a)之該PILRA蛋白處具有活性，及 其中該抗體特異性結合至CD98重鏈(CD98hc)蛋白。
在該方法之一些實施例中，步驟(c)量測pSTAT3水準。在某些實施例中，步驟(a)之細胞天然地表現PILRA蛋白。
在某些實施例中，具有較低PILRA表現之細胞使PILRA蛋白得以敲除。在具體實施例中，細胞為HEK細胞。在具體實施例中，細胞為iMicroglia。在具體實施例中，細胞為PILRA LoF iMicroglia。
在某些實施例中，步驟(a)之細胞經工程化或經修飾以表現或過度表現PILRA蛋白。在一些實施例中，具有較低PILRA表現之細胞天然地表現PILRA蛋白或不經工程化或不經修飾來表現PILRA蛋白。
在該方法之一些實施例中，抗體來自抗體文庫。在一些實施例中，已知抗體結合PILRA蛋白。在一些實施例中，未知抗體是否結合PILRA蛋白。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2023年6月21日提交之美國臨時申請案第63/509,422號之優先權，其揭示內容出於所有目的全部以引用方式併入本文。 I. 簡介
PILRA為在各種免疫細胞諸如小神經膠質細胞、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞、及嗜中性球之細胞表面上表現的抑制性跨膜受體。不受特定理論約束，咸信在配位體結合後，PILRA藉由募集細胞質磷酸酶，諸如PTPN6/SHP-1及PTPN11/SHP-2，經由其透過使傳訊分子去磷酸化來阻斷信號轉導的SH2域而充當抑制性受體。PILRA之錯義變異體(G78R)改變PILRA之唾液酸結合袋，從而導致PILRA與若干其配位體之結合減少，該等配位體中之一者為唾液酸化單純性疱疹病毒1型醣蛋白B (HSV-1gB)。已提示HSV-1感染存在於一些阿茲海默氏病患者中。提出PILRA之G78R變異體藉由拮抗或減少PILRA傳訊，由此改變小神經膠質細胞反應，從而保護個體免於阿茲海默氏病。
如以下實例部分中詳述，產生特異性結合至人類PILRA (hPILRA)之抗體。證明此等抗體調節由PILRA調控之一或多種小神經膠質細胞功能。本文揭示之抗體具有高度期望的特性。此等抗體包括選擇性結合至食蟹猴(「食蟹猴」) PILRA (cynoPILRA)及hPILRA，但與人類PILRB (hPILRB)之結合可能相對較低的抗體。此為高度有利的，但鑒於cynoPILRA與hPILRB之間的較高同源性，亦非常具有挑戰性。在食蟹猴與人類PILRA之間具有相當的結合允許在猴中進行研究而無需使用替代分子。與PILRB之結合並非所需的，因為鑒於其相應細胞內域中之差異，認為PILRB具有與PILRA相比不同或相反的活性。本文所述之某些抗體可以結合至cynoPILRA之結合親和力為相對於針對hPILRA之結合親和力在100倍內( 例如，在90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍、5倍、或2倍內)。抗體針對hPILRA之結合親和力亦可比其針對hPILRB之結合親和力強至少10倍( 例如，至少15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或100倍)。
抗體進一步包含經修飾Fc多肽，其含有允許Fc多肽結合至CD98hc蛋白(來自 例如人類之CD98hc蛋白)之突變。在一些態樣中，本文揭示之抗體能夠透過經修飾Fc多肽來結合至CD98重鏈(CD98hc)蛋白( 例如，在腦內皮細胞(BEC)表面上表現)且由此與缺少CD98hc結合Fc突變之抗體相比，可更有效地穿過血腦障壁(BBB)。
CD98在腦內皮細胞上高度地表現且因此為受體介導胞吞轉送(RMT)之有希望靶。CD98為在CD98hc (4F2重鏈)與CD98輕鏈之間形成的異二聚體。迄今為止，已鑑別六種CD98輕鏈， 亦即，LAT1 (SLC7A5，4F2輕鏈)、LAT2 (SLC7A8)、y +LAT1 (SLC7A7)、y +LAT2 (SLC7A6)、Asc-1 (SLC7A10)、或xCT (SLC7A11)。在複合物中，CD98重鏈將輕鏈運輸至細胞表面，其中其充當優先運輸支鏈(纈胺酸、白胺酸、異白胺酸)及芳族(色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸)胺基酸之較大中性胺基酸運輸者。利用CD98受體介導之胞吞轉送路徑，含有本文所述之CD98hc結合位點之經修飾Fc多肽可用於運輸治療劑穿過BBB。此方法可基本上改良治療劑之腦部吸收且因此高度適用於治療其中腦部遞送有利之病症及疾病。另外，此方法可用於提供腦部吸收及向腦部特定細胞外或神經腫瘤學靶之遞送。例如，本文提供之CD98hc結合多肽可用於靶向此類細胞外靶或神經腫瘤學靶，同時若如此需要，則保持野生型效應子功能。另外，在其中神經元吸收並不期望的情況下( 例如，靶為抗原或斑塊諸如β澱粉樣蛋白、Tau蛋白或α-突觸核蛋白)，本文提供之此類CD98hc結合多肽可用於靶向此類細胞外靶。本文提供之CD98hc結合多肽具有獨特動力學、生物分佈、及安全性質，其可為基於蛋白之治療劑提供最佳化及適合預期目的之BBB運輸平台。
在某些實施例中，本文揭示之抗體進一步包含減少或消除效應子功能的Fc多肽中之突變及 例如藉由增加抗體Fc與Fc新生兒受體(FcRn)之結合來增加 活體內半衰期之突變。
吾人亦發現抗體與PILRA序列之某些胺基酸殘基之結合可傳達期望的性質。此等殘基包括PILRA序列( 例如，SEQ ID NO:1)之殘基63、64、78、106、143、116-118、及182-186。在特定實例中，吾人展示結合至包括(i) hPILRA之G78、K106、及E143或(ii) T63及A64之抗原決定基的抗體亦可結合cynoPILRA，但具有減少的與hPILRB之結合。 II. 定義
如本文所用，除非上下文另外明確說明，否則單數形式「一個/種(a/an)」、及「該/該等(the)」包括複數指示物。因此，例如，提及「一種抗體」視情況包括兩種或更多種此類分子之組合，及其類似者。
如本文所用，術語「約」及「大約」當用於修飾以數值或範圍指定之量時指示該數值以及熟悉此項技藝者已知的與該值的合理偏差例如± 20%、± 10%、或± 5%係在所述值之預期含義內。
如本文所用，術語「PILRA」係指由基因 PILRA編碼的配對免疫球蛋白樣2型受體α蛋白。如本文所用，「PILRA」或「PILRA蛋白」係指任何脊椎動物之天然( 亦即，野生型) PILRA蛋白，該任何脊椎動物諸如但不限於人類、非人類靈長類動物( 例如，食蟹猴)、齧齒動物( 例如，小鼠、大鼠)、及其他哺乳動物。在一些實施例中，PILRA蛋白為具有SEQ ID NO:1之序列的人類PILRA (hPILRA)蛋白： MGRPLLLPLLPLLLPPAFLQPSGSTGSGPSYLYGVTQPKHLSASMGGSVEIPFSFYYPWELATAPDVRISWRRGHFHGQSFYSTRPPSIHKDYVNRLFLNWTEGQKSGFLRISNLQKQDQSVYFCRVELDTRSSGRQQWQSIEGTKLSITQAVTTTTQRPSSMTTTWRLSSTTTTTGLRVTQGKRRSDSWHISLETAVGVAVAVTVLGIMILGLICLLRWRRRKGQQRTKATTPAREPFQNTEEPYENIRNEGQNTDPKLNPKDDGIVYASLALSSSTSPRAPPSHRPLKSPQNETLYSVLKA。
在一些實施例中，PILRA蛋白為具有SEQ ID NO:2之序列的食蟹猴PILRA (cynoPILRA)蛋白： MGRPLLLPLLLPLLPLLLPPAFLQPGGSAGSGPSGPYGVTQRKHLSAPMGGSVEIPFSFYHPWELAAAPNMKISWRRGNFHGEFFYRTRPAFIHEDYSNRLLLNWTEGQDRGLLRIWNLRKEDQSVYFCRVELDTRRSGRQRWQSIEGTKLTITQAVTTTTQRPSSMTTTRRPSSATTTAGLRVTQGKRHSDSWHLSLKTAVGVTVAVAVLGIMILGLICLLRWRRRKGQQRTKATTPAKEPFQNTEEPYENIRNEGQNTDPKPNPKDDGIVYASLALSSSTSPRVPPSHHPLKSPQNETLYSVLKV。
如本文所用，術語「PILRB」係指由基因 PILRB編碼的配對免疫球蛋白樣2型受體β蛋白。如本文所用，「PILRB」或「PILRB蛋白」係指任何脊椎動物之天然( 亦即，野生型) PILRB蛋白，該任何脊椎動物諸如但不限於人類、非人類靈長類動物( 例如，食蟹猴)、齧齒動物( 例如，小鼠、大鼠)、及其他哺乳動物。在一些實施例中，PILRB蛋白為具有SEQ ID NO:3之序列的人類PILRB (hPILRB)蛋白： MGRPLLLPLLLLLQPPAFLQPGGSTGSGPSYLYGVTQPKHLSASMGGSVEIPFSFYYPWELAIVPNVRISWRRGHFHGQSFYSTRPPSIHKDYVNRLFLNWTEGQESGFLRISNLRKEDQSVYFCRVELDTRRSGRQQLQSIKGTKLTITQAVTTTTTWRPSSTTTIAGLRVTESKGHSESWHLSLDTAIRVALAVAVLKTVILGLLCLLLLWWRRRKGSRAPSSDF。
如本文所用，術語「CD98hc」或「CD98重鏈」係指4F2細胞表面抗原重鏈且由 SLC3A2基因編碼。CD98hc亦稱為4F2重鏈。人類CD98hc序列在SEQ ID NO:5及UNIPROT登錄號P08195中闡明。來自其他物種之CD98hc序列亦為已知的( 例如，小鼠UNIPROT登錄號P10852及食蟹猴UNIPROT登錄號G8F3Z0)。
如本文所用，術語「抗PILRA抗體」係指特異性結合至PILRA蛋白( 例如，人類PILRA)之抗體。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含特異性結合至CD98hc蛋白( 例如，hCD98hc)之經修飾Fc多肽。
如本文所用，術語「抗體」係指具有經由其可變區特異性結合至抗原之免疫球蛋白折疊之蛋白質。該術語包括完整多株抗體、完整單株抗體(包括全長抗體)以及單鏈抗體、多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人源化抗體、及人類抗體。如本文所用，術語「抗體」亦包括經由其可變區保留結合特異性之抗體片段，包括但不限於Fab、F(ab’) 2、Fv、scFv、及二價scFv。抗體可含有經分類為κ或λ之輕鏈。抗體可含有經分類為γ、μ、α、δ或ε之重鏈，其又分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。
如本文所用，術語「全長抗體」通常係指具有藉由二硫鍵相互連接之四個多肽鏈(兩個重鏈及兩個輕鏈)的免疫球蛋白分子。各重鏈自N端至C端由重鏈可變區(V H)、CH1恆定域、鉸鏈區、CH2恆定域、及CH3恆定域組成。各輕鏈自N端至C端由輕鏈可變區(V L)及CL恆定域組成。Fab域或片段由V H、CH1、V L、及CL域形成。全長抗體亦可描述為具有兩個Fab域及Fc域，其中Fc域包含兩個Fc多肽且各Fc多肽可包括CH2域、CH3域，且可含有抗體之鉸鏈區之至少一部分。
如本文所用，術語「抗PILRA抗原結合部分」係指特異性結合至PILRA蛋白( 例如，hPILRA及/或cynoPILRA)之抗原結合區段或實體。術語「抗原結合部分」及「抗原結合片段」在本文中可互換使用且係指抗體之保留經由其可變區特異性結合至抗原( 例如，PILRA蛋白)之能力的一或多種片段。抗原結合片段之實例包括但不限於Fab片段(由V L、V H、CL及CH1域組成之單價片段)、F(ab’) 2片段(在鉸鏈區處包含由二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段)、單鏈Fv (scFv)、經二硫鍵連接之Fv (dsFv)、互補決定區(CDR)、V L(輕鏈可變區)、及V H(重鏈可變區)。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中來源於生殖系可變(V)基因、多樣性(D)基因、或連接(J)基因(而非來源於恆定(Cμ及Cδ)基因區段)且賦予抗體結合至抗原之特異性的域。通常，抗體可變區包含四個保守性「構架」區，其穿插有三個高變「互補決定區」。
術語「互補決定區」或「CDR」係指各鏈中之三個高變區，其中斷由輕鏈及重鏈可變區建立之四個構架區。CDR主要負責抗體與抗原之抗原決定基的結合。各鏈之CDR通常稱為CDR1、CDR2、及CDR3，其自N端開始依次編號，且通常亦由特定CDR所位於的鏈鑑別。因此，V HCDR3或CDR-H3位於存在該CDR之抗體之重鏈的可變區，而V LCDR1或CDR-L1為來自存在該CDR之抗體之輕鏈之可變區的CDR1。
不同輕鏈或重鏈之「構架區」或「FR」在物種內為相對保守的。抗體之構架區為組成型輕鏈及重鏈之經組合構架區，其用於在三維空間內定位且比對CDR。構架序列可獲自包括生殖系抗體基因序列之公共DNA資料庫或已公佈參考文獻。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於人類及小鼠序列之「VBASE2」生殖系可變基因序列資料庫中。
CDR及構架區之胺基酸序列可使用此項技術中之各種熟知定義來確定， 例如Kabat、Chothia、國際ImMunoGeneTics資料庫(IMGT)、AbM、及已觀測抗原接觸(observed antigen contacts) (「Contact」)。在一些實施例中，CDR根據Contact定義來確定。 參見MacCallum 等人, J. Mol.Biol., 262:732-745 (1996)。在一些實施例中，CDR藉由Kabat、Chothia、及/或Contact CDR定義之組合來確定。
術語「抗原決定基」係指抗體之CDR所特異性結合之抗原的區域或區且可包括若干個胺基酸或若干個胺基酸之部分，例如5或6個或更多個，例如20或更多個胺基酸或彼等胺基酸之部分。舉例而言，在靶為蛋白質時，抗原決定基可包含連續胺基酸( 例如，線性抗原決定基)或來自蛋白質的藉由蛋白質折疊而彼此接近的不同部分的胺基酸( 例如，不連續或構象抗原決定基)。在一些實施例中，抗原決定基在一個胺基酸處( 例如，在絲胺酸或蘇胺酸殘基處)經磷酸化。
如本文所用，如參考抗PILRA抗體使用之片語「識別抗原決定基」意指抗體CDR與抗原( 亦即，PILRA蛋白)在該抗原決定基或該抗原之含有該抗原決定基的部分處相互作用或特異性結合。
「單株抗體」係指由細胞之單一純系或單一細胞株產生且由一級胺基酸序列相同之抗體分子組成或基本上由該等抗體分子組成之抗體。
「多株抗體」係指自異質抗體群體獲得之抗體，其中該群體中之不同抗體結合到抗原之不同抗原決定基。
「嵌合抗體」係指如下抗體分子，其中恆定區或其部分經改變、置換或交換，使得抗原結合位點( 亦即，可變區、CDR、或其部分)連接至具有不同或經改變類別、效應子功能及/或種類之恆定區，或者其中可變區或其部分經具有不同或經改變抗原特異性之可變區( 例如CDR及來自不同種類之構架區)改變、置換或交換。在一些實施例中，嵌合抗體為包含來自一個來源或種類( 例如，小鼠)之可變區及來源於第二來源或種類( 例如，人類)之恆定區的單株抗體。用於產生嵌合抗體之方法係此項技術中描述的。
「人源化抗體」為來源於非人類來源( 例如鼠類)之嵌合免疫球蛋白，其在CDR外部含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列。一般而言，人源化抗體將包含至少一個( 例如兩個)抗原結合可變區，其中CDR區基本上對應於非人類免疫球蛋白之彼等者且構架區基本上對應於人類免疫球蛋白序列之彼等者。人源化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白序列。抗體人源化之方法為此項技術中已知的。
「人類抗體」或「完全人類抗體」為具有人類重鏈及輕鏈序列之抗體，該等序列通常來源於人類生殖系基因。在一些實施例中，抗體由人類細胞、由利用人類抗體庫之非人類動物( 例如，經遺傳工程化以表現人類抗體序列之基因轉殖小鼠)、或由噬菌體展示平台產生。
術語「特異性結合」係指與分子(例如，抗體或其抗原結合部分)結合到另一個抗原決定基或非靶化合物(例如，結構不同的抗原)相比，其以更大親和力、更大親合力、及/或更大與樣品中抗原決定基或靶之持續時間結合到該抗原決定基或靶。在一些實施例中，特異性結合到抗原決定基或靶之抗體(或其抗原結合部分)為以比其他抗原決定基或非靶化合物大至少1.5倍， 例如至少1.5倍、2.5倍、5倍、10倍、100倍、1,000倍、10,000倍、或更大親和力結合到抗原決定基或靶之抗體(或其抗原結合部分)。如本文所用，術語「特異性結合」、「特異性結合至」、或對於特定抗原決定基或靶「具有特異性」可藉由例如分子針對其所結合之抗原決定基或靶具有 例如10 -4M或更小， 例如10 -5M、10 -6M、10 -7M、10 -8M、10 -9M、10 -10M、10 -11M、或10 -12M之平衡解離常數K D來展現。熟習此項技術者認識到特異性結合至來自一個物種之靶( 例如，PILRA蛋白( 例如，hPILRA及/或cynoPILRA))之抗體亦可特異性結合至彼靶之異種同源物。
術語「結合親和力」在本文中用於係指兩個分子之間， 例如抗體(或其抗原結合部分)與抗原之間的非共價相互作用之強度。因此，舉例而言，除非上下文另外指明或由上下文清晰，否則該術語可係指抗體(或其抗原結合部分)與抗原之間的1:1相互作用。結合親和力可藉由量測平衡解離常數(K D)來定量，該平衡解離常數係指解離速率常數(k d，時間 -1)除以締合速率常數(k a，時間 -1M -1)。K D可藉由例如使用表面電漿子共振(SPR)方法，例如Biacore™系統；動力排阻檢定，諸如KinExA®；及生物層干涉術(例如，使用ForteBio® Octet平台)量測複合物形成及解離動力學來確定。如本文所用，「結合親和力」不僅包括正式結合親和力，諸如反映抗體(或其抗原結合部分)與抗原之間的1:1相互作用之彼等者，而且亦包括表觀親和力，其K D值經計算且可反映親合結合。
如本文所用，術語「交叉反應」係指抗體結合到除了產生該抗體之抗原以外的抗原之能力。在一些實施例中，交叉反應性係指抗體結合到除了產生該抗體之抗原以外的來自另一物種的抗原之能力。作為非限制性實例，如本文所述且針對人類PILRA肽產生之抗PILRA抗體可以表現出與來自不同物種( 例如，食蟹猴或小鼠)之PILRA肽或蛋白之交叉反應性。
術語「調節」係指更改或改變蛋白質或細胞之一或多種性質。細胞之性質可由於改變細胞之蛋白質( 例如，PILRA蛋白)之一或多種性質， 亦即，藉由結合至細胞之蛋白質來改變。可調節之細胞之性質包括但不限於細胞生長、遷移、存活、傳訊、吞噬作用、及生物標誌物分泌。例如，結合至細胞之PILRA蛋白的分子可由於PILRA結合而引起細胞之一或多個下游傳訊反應或活性，因而，該分子被認為調節細胞之傳訊反應或活性。在一些實施例中，術語「調節」可係指相對於在無PILRA結合的情況下細胞之傳訊反應或活性，由於PILRA結合而導致的細胞之傳訊反應或活性增加或降低。由於PILRA結合而導致的細胞之傳訊反應或活性變化之實例包括但不限於磷酸化STAT3 (pSTAT3)水準、磷酸化STAT1 (pSTAT1)水準、磷酸化EGFR (pEGFR)水準、鈣黏蛋白表現、整聯蛋白表現、及細胞( 例如，小神經膠質細胞)遷移之變化。
如本文所用，術語「CH3域」及「CH2域」係指免疫球蛋白恆定區域多肽。在IgG抗體之情形下，CH3域多肽係指如根據EU編號方案來編號的約位置341至約位置447之胺基酸之區段，且CH2域多肽係指如根據EU編號方案來編號的約位置231至約位置340之胺基酸之區段。CH2及CH3域多肽亦可藉由IMGT (ImMunoGeneTics)編號方案來編號，其中根據IMGT Scientific圖表編號(IMGT網站)，CH2域編號為1-110且CH3域編號為1-107。CH2及CH3域為免疫球蛋白之Fc區域之部分。在IgG抗體之情形下，Fc區域係指如根據EU編號方案來編號的約位置231至約位置447之胺基酸之區段。如本文所用，術語「Fc區域」亦可包括抗體之鉸鏈區之至少一部分。示範性部分鉸鏈區序列為DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:59)。
在鑑別多肽序列中之給定胺基酸殘基之情形下使用時，術語「對應於」、「參考…來確定」或「參考…來編號」係指當將給定胺基酸序列與參考序列進行最大比對及比較時，指定參考序列之殘基之位置。因此，例如，當多肽中之胺基酸殘基在與SEQ ID NO:1最佳比對時，與SEQ ID NO:1中之胺基酸對準，則該殘基「對應於」SEQ ID NO:1中之胺基酸。與參考序列比對之多肽不一定與參考序列相同長度。
如本文所用，術語「Fc多肽」係指藉由Ig折疊來表徵為結構域的天然存在之免疫球蛋白重鏈多肽之C端區域。Fc多肽含有包括至少CH2域及/或CH3域的恆定區序列且可含有鉸鏈區之至少一部分，但不含有可變區。
「經修飾Fc多肽」係指如與野生型免疫球蛋白重鏈Fc多肽序列相比，具有至少一個突變， 例如，取代、缺失或插入，但保留天然Fc多肽之總體Ig折疊或結構的Fc多肽。
如參考核酸或蛋白( 例如，抗體)所用之術語「經單離」表示該核酸或蛋白質基本上不含在自然狀態下與其締合之其他細胞組分。純度及均質性通常使用分析化學技術諸如電泳( 例如，聚丙烯醯胺凝膠電泳)或層析( 例如，高效液相層析)來確定。在一些實施例中，經單離核酸或蛋白質( 例如，抗體)為至少85%純的、至少90%純的、至少95%純的、或至少99%純的。
術語「胺基酸」係指天然存在及合成之胺基酸，且係指以類似於天然存在之胺基酸之方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸係由遺傳密碼編碼之彼等胺基酸，以及後來經修飾之彼等胺基酸， 例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。天然存在之α-胺基酸包括但不限於丙胺酸(Ala)、半胱胺酸(Cys)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、苯丙胺酸(Phe)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ile)、精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、天冬醯胺(Asn)、脯胺酸(Pro)、麩醯胺(Gln)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、及其組合。天然存在之α-胺基酸的立體異構物包括但不限於D-丙胺酸(D-Ala)、D-半胱胺酸(D-Cys)、D-天冬胺酸(D-Asp)、D-麩胺酸(D-Glu)、D-苯丙胺酸(D-Phe)、D-組胺酸(D-His)、D-異白胺酸(D-Ile)、D-精胺酸(D-Arg)、D-離胺酸(D-Lys)、D-白胺酸(D-Leu)、D-甲硫胺酸(D-Met)、D-天冬醯胺(D-Asn)、D-脯胺酸(D-Pro)、D-麩醯胺(D-Gln)、D-絲胺酸(D-Ser)、D-蘇胺酸(D-Thr)、D-纈胺酸(D-Val)、D-色胺酸(D-Trp)、D-酪胺酸(D-Tyr)、及其組合。「胺基酸類似物」係指具有與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構( 亦即，α碳結合至氫、羧基、胺基及R基團)的化合物， 例如，高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此等類似物具有經修飾R基團( 例如，正白胺酸)或經修飾肽骨架，但保持與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構。「胺基酸模擬物」係指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構，但以與天然存在之胺基酸類似之方式起作用的化合物。胺基酸在本文中可以其通常已知之三字母符號或以IUPAC-IUB生物化學命名委員會所推薦之單字母符號來提及。
術語「多肽」及「肽」在本文中可互換用於指示單鏈中之胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。胺基酸聚合物可包含完整L-胺基酸、完整D-胺基酸、或L胺基酸及D胺基酸之混合物。
如本文所用，術語「蛋白質」係指多肽或單鏈多肽之二聚物( 亦即，兩個)或多聚物( 亦即，三個或更多個)。蛋白質之單鏈多肽可藉由共價鍵( 例如二硫鍵)或非共價相互作用連接。
術語「多核苷酸」及「核酸」可互換地係指具有任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基、及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中之任何受質。多核苷酸可包含經修飾核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。本文涵蓋之多核苷酸之實例包括單鏈及雙鏈DNA、單鏈及雙鏈RNA，及具有單鏈及雙鏈DNA及RNA之混合物之雜合分子。
術語「保守取代」及「保守突變」係指導致一胺基酸被可經分類為具有類似特徵之另一胺基酸取代的改變。以此方式定義之保守性胺基酸組之類別的實例可包括：「帶電荷/極性組」，包括Glu (麩胺酸或E)、Asp (天冬胺酸或D)、Asn (天冬醯胺或N)、Gln (麩醯胺或Q)、Lys (離胺酸或K)、Arg (精胺酸或R)、及His (組胺酸或H)；「芳族組」，包括Phe (苯丙胺酸或F)、Tyr (酪胺酸或Y)、Trp (色胺酸或W)、及(組胺酸或H)；及「脂族組」，包括Gly (甘胺酸或G)、Ala (丙胺酸或A)、Val (纈胺酸或V)、Leu (白胺酸或L)、Ile (異白胺酸或I)、Met (甲硫胺酸或M)、Ser (絲胺酸或S)、Thr (蘇胺酸或T)、及Cys (半胱胺酸或C)。在各組內，亦可鑑別亞組。舉例而言，帶電荷或極性胺基酸之組可細分成包括以下之子組：「帶正電荷子組」，包含Lys、Arg及His；「帶負電荷子組」，包含Glu及Asp；及「極性子組」，包含Asn及Gln。在另一個實例中，芳族或環狀組可細分成包括以下之子組：「氮環子組」，包含Pro、His及Trp；及「苯基子組」，包含Phe及Tyr。在另一實例中，脂族組可細分成子組， 例如「脂族非極性子組」，包含Val、Leu、Gly、及Ala；及「脂族弱極性子組」，包含Met、Ser、Thr、及Cys。保守突變之類別之實例包括以上子組內的胺基酸之胺基酸取代，諸如但不限於：Lys取代Arg或反之亦然，以使得可保持正電荷；Glu取代Asp或反之亦然，以使得可保持負電荷；Ser取代Thr或反之亦然，以使得可保持游離-OH；及Gln取代Asn或反之亦然，以使得可保持游離-NH 2。在一些實施例中，疏水性胺基酸取代天然存在之疏水性胺基酸， 例如在活性位點中，以保護疏水性。
在兩種或更多種多肽序列之情形下，術語「一致」或「一致性」百分比係指兩個或更多個序列或子序列當使用序列比較算法或藉由手動比對及目視檢查所量測來比較及比對比較窗口或指定區域之最大一致性時，為相同的或在指定區域內具有指定百分比之相同胺基酸殘基， 例如至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更大百分比。
關於多肽之序列比較，通常一個胺基酸序列充當與候選序列進行比較之參考序列。比對可使用熟悉此項技藝者可用之各種方法進行， 例如可視比對或使用可公開獲得之軟體使用已知算法實現最大比對。此類程式包括BLAST程式、ALIGN、ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Calif.)或Megalign (DNASTAR)。用於比對以實現最大比對之參數可藉由熟悉此項技藝者確定。關於出於此應用目的而進行之多肽序列的序列比較，使用用於以默認參數比對兩種蛋白序列之BLASTP算法標準蛋白BLAST。
如本文所互換使用，術語「個體(subject)」、「個體(individual)」、及「患者」係指哺乳動物，包括但不限於人類、非人靈長類動物、齧齒動物( 例如，大鼠、小鼠、及豚鼠)、兔、牛、豬、馬、及其他哺乳動物種類。在一個實施例中，個體(subject)、個體(individual)、或患者為人類。
術語「治療(treating/treatment)」及類似術語在本文中通常用於意指獲得所要藥理學及/或生理學作用。「治療(treating/treatment)」可係指成功治療或減輕神經退化性疾病( 例如，阿茲海默氏病或本文所述之另一種神經退化性疾病)之任何標記，包括任何客觀或主觀參數，諸如緩解、緩和、患者存活改善、存活時間或存活率增加、症狀減輕或者使得疾病更為患者所耐受、變性或衰弱速率減慢、或改善患者之身體或心理健康。症狀之治療或減輕可以基於客觀或主觀參數。治療作用可與未接受治療之一個體或一組個體相比較，或者與治療前或治療期間之不同時間點的同一患者相比較。
術語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指在生物學上或藥理學上相容以用於人類或動物之非活性藥物成分，諸如但不限於緩衝劑、載劑、或防腐劑。
如本文所用，藥劑( 例如，如本文所述之抗體)之「治療量」或「治療有效量」為藥劑的治療、減輕、去除或減少個體之疾病症狀之嚴重性的量。藥劑(例如，如本文所述之抗體)之「治療量」可改善患者存活、增加存活時間或存活率、減少症狀、使得損傷、疾病、或病狀( 例如，神經退化性疾病)更耐受、減慢變性或衰弱速率、或改善患者身體或心理健康。
術語「投與」係指將藥劑、化合物、或組成物遞送到所要生物作用位點之方法。該等方法包括但不限於局部遞送、非經腸遞送、靜脈內遞送、經皮遞送、肌肉內遞送、鞘內遞送、結腸遞送、直腸遞送、或腹膜內遞送。在一個實施例中，如本文所述之抗體係靜脈內投與。
術語「對照」或「對照值」係指參考值或基線值。適當對照可由熟習此項技術者確定。在一些情況下，對照值可相對於相同個體或實驗內之基線來確定。在其他情況下，對照值可相對於對照個體( 例如，健康對照或疾病對照)或對照個體之群體( 例如，健康對照或疾病對照， 例如，10、20、50、100、200、500、1000個或更多個對照個體之群體)之平均值來確定。 III. 抗PILRA抗體
在一態樣中，提供特異性結合至配對免疫球蛋白樣2型受體α(PILRA)蛋白( 例如，hPILRA及/或cynoPILRA蛋白)且包含特異性結合至CD98重鏈(CD98hc)蛋白之經修飾Fc多肽的抗體。在一些實施例中，抗體特異性結合至hPILRA蛋白。在一些實施例中，抗PILRA抗體對於PILRA之選擇性超過其他PILR受體( 例如，配對免疫球蛋白樣2型受體β (PILRB))。
在一些實施例中，抗PILRA抗體為包含如本文所揭示之一或多個互補決定區(CDR)、重鏈可變區、及/或輕鏈可變區序列之抗體。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含如本文揭示之一或多個CDR、重鏈可變區、及/或輕鏈可變區序列且進一步包含如本文揭示之一或多種功能特性， 例如，拮抗PILRA活性( 例如，阻斷配位體與hPILRA之結合，改變下游蛋白之磷酸化( 例如，增加STAT3之磷酸化)，增加抗炎基因或蛋白質表現，及/或減少細胞介素蛋白質表現)的抗體。在一些實施例中，本文所述之抗PILRA抗體亦包含特異性結合至CD98hc蛋白( 例如，hCD98hc)之經修飾Fc多肽。
在一些實施例中，抗PILRA抗體為完全人類抗體。在一些實施例中，抗PILRA抗體為嵌合抗體。在一些實施例中，抗PILRA抗體為人源化及/或親和力成熟抗體。在一些實施例中，抗PILRA抗體為完全人類抗體。 抗PILRA抗體序列
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含選自由以下組成之群的一或多個CDR： (a) 重鏈CDR1 (CDR-H1)序列，其與GYTFTEYYMY (SEQ ID NO:10)之胺基酸序列具有至少90%序列一致性( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代； (b) 重鏈CDR2 (CDR-H2)序列，其與RIDPEDGGTD (SEQ ID NO:11)之胺基酸序列具有至少80%序列一致性( 例如，至少82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:11之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代； (c) 重鏈CDR3 (CDR-H3)序列，其與TIRGTVFAF (SEQ ID NO:12)之胺基酸序列具有至少80%序列一致性( 例如，至少82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:12之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代； (d) 輕鏈CDR1 (CDR-L1)序列，其與RASEDIFNGLA (SEQ ID NO:13)之胺基酸序列具有至少90%序列一致性( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:13之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代； (e) 輕鏈CDR2 (CDR-L2)序列，其與NAKTLHT (SEQ ID NO:14)之胺基酸序列具有至少80%序列一致性( 例如，至少82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:14之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代；及 (f) 輕鏈CDR3 (CDR-L3)序列，其與QQYYDYPLT (SEQ ID NO:15)之胺基酸序列具有至少80%序列一致性( 例如，至少82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:15之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含選自由以下組成之群的一或多個CDR： (a) 包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的CDR-H1序列； (b) 包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的CDR-H2序列； (c) 包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的CDR-H3序列； (d) 包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的CDR-L1序列； (e) 包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的CDR-L2序列；及 (f) 包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的CDR-L3序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含選自由以下組成之群的一或多個CDR： (a) CDR-H1序列，其與GYTFIGFYIH (SEQ ID NO:26)之胺基酸序列具有至少90%序列一致性( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:26之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代； (b) CDR-H2序列，其與WINPESGDTT (SEQ ID NO:27)之胺基酸序列具有至少80%序列一致性( 例如，至少82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:27之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代； (c) CDR-H3序列，其與GNWNFPDTFDF (SEQ ID NO:28)之胺基酸序列具有至少80%序列一致性( 例如，至少82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:28之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代； (d) CDR-L1序列，其與RSSQSISIYLN (SEQ ID NO:29)之胺基酸序列具有至少90%序列一致性( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:29之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代； (e) CDR-L2序列，其與VASSLQS (SEQ ID NO:30)之胺基酸序列具有至少80%序列一致性( 例如，至少82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:30之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代；及 (f) CDR-L3序列，其與QQSYSAPFT (SEQ ID NO:31)之胺基酸序列具有至少80%序列一致性( 例如，至少82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)，或相對於SEQ ID NO:31之胺基酸序列具有多至兩個胺基酸取代。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含選自由以下組成之群的一或多個CDR： (a) 包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列的CDR-H1序列； (b) 包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的CDR-H2序列； (c) 包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的CDR-H3序列； (d) 包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列的CDR-L1序列； (e) 包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列的CDR-L2序列；及 (f) 包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列的CDR-L3序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含(a)-(f)中之兩者、三者、四者、五者、或全部六者。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含(a)之CDR-H1、(b)之CDR-H2、及(c)之CDR-H3。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含(d)之CDR-L1、(e)之CDR-L2、及(f)之CDR-L3。在一些實施例中，具有多至兩個胺基酸取代之CDR相對於參考序列具有一個胺基酸取代( 例如，一個保守取代)。在一些實施例中，具有多至兩個胺基酸取代之CDR相對於參考序列具有兩個胺基酸取代( 例如，兩個保守取代)。在一些實施例中，多至兩個胺基酸取代係保守取代。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含重鏈可變區(V H)，其包含與SEQ ID NO:16之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的V H序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含輕鏈可變區(V L)，其包含與SEQ ID NO:17之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含有包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的V L序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含：包含與SEQ ID NO:16之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含與SEQ ID NO:17之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含：包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含：分別包含SEQ ID NO:10-12之胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，及與SEQ ID NO:16具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V H序列，及分別包含SEQ ID NO:13-15之胺基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，及與SEQ ID NO:17具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V L序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 與SEQ ID NO:18具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性的第一重鏈； (ii) 與SEQ ID NO:19具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性的第二重鏈；及 (iii) 與SEQ ID NO:20具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性的第一輕鏈及第二輕鏈。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含重鏈可變區(V H)，其包含與SEQ ID NO:21之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的V H序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含輕鏈可變區(V L)，其包含與SEQ ID NO:22之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含有包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的V L序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含：包含與SEQ ID NO:21之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含與SEQ ID NO:22之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含：包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含：分別包含SEQ ID NO:10-12之胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，及與SEQ ID NO:21具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V H序列，及分別包含SEQ ID NO:13-15之胺基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，及與SEQ ID NO:22具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V L序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 與SEQ ID NO:23具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性的第一重鏈； (ii) 與SEQ ID NO:24具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之第二重鏈；及 (iii) 與SEQ ID NO:25具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性的第一輕鏈及第二輕鏈。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含重鏈可變區(V H)，其包含與SEQ ID NO:32之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含有包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的V H序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含輕鏈可變區(V L)，其包含與SEQ ID NO:33之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含有包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列的V L序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含：包含與SEQ ID NO:32之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區(V H)，及包含與SEQ ID NO:33之序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區(V L)。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含：包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的重鏈可變區(V H)，及包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列的輕鏈可變區(V L)。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含：分別包含SEQ ID NO:26-28之胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，及與SEQ ID NO:32具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V H序列，及分別包含SEQ ID NO:29-31之胺基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，及與SEQ ID NO:33具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V L序列。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 與SEQ ID NO:34具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性的第一重鏈； (ii) 與SEQ ID NO:35具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之第二重鏈；及 (iii) 與SEQ ID NO:36具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性的第一輕鏈及第二輕鏈。
在一些實施例中，重鏈序列或其一部分及/或輕鏈序列或其一部分來源於本文所述之抗PILRA抗體。 抗PILRA抗體之結合特性
在一些實施例中，如本文所述的特異性結合至PILRA蛋白( 例如，hPILRA蛋白)之抗體結合至在細胞( 例如，內源性表現PILRA之細胞株，諸如免疫細胞，或經工程化以表現PILRA之細胞株， 例如如以下實例部分所描述的)上表現之PILRA。在一些實施例中，如本文所述的特異性結合至PILRA蛋白之抗體結合至純化或重組PILRA蛋白或其一部分，或結合至包含PILRA或其一部分之嵌合蛋白。
在一些實施例中，特異性結合至人類PILRA蛋白之抗體表現出與另一種類之一或多種其他PILRA蛋白之交叉反應性。在一些實施例中，特異性結合至人類PILRA蛋白之抗體表現出與食蟹猴(「食蟹猴」) PILRA蛋白(cynoPILRA)之交叉反應性。
用於分析結合親和力、結合動力學、及交叉反應性之方法為此項技術中已知的。該等方法包括但不限於固相結合檢定( 例如，ELISA檢定)、免疫沉澱法、表面電漿子共振( 例如，Biacore ™(GE Healthcare, Piscataway, NJ))、動力排阻檢定( 例如，KinExA ®)、流動式細胞測量術、螢光活化細胞分選(FACS)、生物層干涉術( 例如，Octet ™(FortéBio, Inc., Menlo Park, CA))、及西方墨點分析。在一些實施例中，使用ELISA確定結合親和力及/或交叉反應性。用於進行ELISA檢定之方法為此項技術中已知的，且亦描述於以下實例部分中。在一些實施例中，使用表面電漿子共振(SPR)確定結合親和力、結合動力學、及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用動力排阻檢定確定結合親和力、結合動力學、及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用生物層干涉術檢定確定結合親和力、結合動力學、及/或交叉反應性。
在一些實施例中，本文所述之抗PILRA抗體特異性結合至食蟹猴配對免疫球蛋白樣2型受體α (cynoPILRA)，其中針對cynoPILRA之結合親和力比針對人類配對免疫球蛋白樣2型受體β (hPILRB)之結合親和力強至少2倍( 例如，至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或100倍)。
如本文所述，在一些實施例中，本文所述之抗PILRA抗體表現出與hPILRA及cynoPILRA之交叉反應性。在一些實施例中，本文所述之抗PILRA抗體結合至hPILRA及cynoPILRA。
在某些實施例中，抗PILRA抗體針對cynoPILRA之結合親和力相對於針對hPILRA之結合親和力在100倍內( 例如，在100倍、90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、或1.5倍內)。在具體實施例中，抗PILRA抗體以0.1 nM與500 nM之間( 例如，0.1 nM與400 nM之間、0.1 nM與300 nM之間、0.1 nM與200 nM之間、或0.1 nM與100 nM之間)的結合親和力結合至hPILRA。在具體實施例中，抗PILRA抗體以0.1 nM與100 nM之間( 例如，0.1 nM與90 nM之間、0.1 nM與80 nM之間、0.1 nM與70 nM之間、0.1 nM與60 nM之間、0.1 nM與50 nM之間、0.1 nM與40 nM之間、0.1 nM與30 nM之間、0.1 nM與20 nM之間、0.1 nM與10 nM之間、0.1 nM與5 nM之間、0.1 nM與1 nM之間、1 nM與100 nM之間、5 nM與100 nM之間、10 nM與100 nM之間、20 nM與100 nM之間、30 nM與100 nM之間、40 nM與100 nM之間、50 nM與100 nM之間、60 nM與100 nM之間、70 nM與100 nM之間、80 nM與100 nM之間、或90 nM與100 nM之間)的結合親和力結合至hPILRA。
在一些實施例中，本文所述之抗PILRA抗體結合至hPILRA及/或cynoPILRA之選擇性超過hPILRB。在具體實施例中，抗體針對hPILRA之結合親和力比針對hPILRB之結合親和力強至少10倍( 例如，至少10倍、20倍、40倍、60倍、80倍、100倍、120倍、140倍、160倍、180倍、200倍、220倍、240倍、260倍、280倍、或300倍)。 由抗PILRA抗體識別之抗原決定基
在一些實施例中，抗PILRA抗體識別與由如本文所述之抗體純系識別之抗原決定基相同或基本上相同的人類PILRA之抗原決定基。如本文所用，如參考由如本文所述之抗體純系所識別之抗原決定基使用，術語「基本上相同」意指抗PILRA抗體識別之抗原決定基與由如本文所述之抗體純系所識別之抗原決定基相同、或在該抗原決定基內、或與該抗原決定基幾乎相同( 例如，與該抗原決定基具有至少90%序列一致性( 例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性)或相對於該抗原決定基具有一個、兩個、或三個胺基酸取代， 例如保守取代)，或與該抗原決定基具有大量重複( 例如，與其具有至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%重複)。
在一些實施例中，抗PILRA抗體識別的人類PILRA之抗原決定基與本文所述之抗體( 例如，包含分別具有SEQ ID NO:10-12之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2、及CDR-H3，及分別具有SEQ ID NO:13-15之胺基酸序列之CDR-L1、CDR-L2、及CDR-L3的抗體)及其變異體所識別之抗原決定基相同或基本上相同。
在一些實施例中，抗PILRA抗體識別在PILRA之細胞外域(ECD)， 例如包含SEQ ID NO:1之胺基酸20至143之ECD內的人類PILRA之抗原決定基。在一些實施例中，抗PILRA抗體在PILRA之莖區域內之抗原決定基處結合至人類PILRA。在一些實施例中，抗PILRA抗體為抑制PILRA傳訊之拮抗劑。
在一些實施例中，抗PILRA抗體在以下位置中之一或多者處結合至一或多個胺基酸：63、64、78、106、143、116-118、及182-186，其中位置參考SEQ ID NO:1來確定。在具體實施例中，本文所述之抗PILRA抗體在以下位置中之一或多者處結合至一或多個胺基酸：SEQ ID NO:1：63、64、78、106、143、116-118、及182-186。圖5展示cynoPILRA、hPILRA、及hPILRB之ECD及莖區域序列之比對。在某些實施例中，抗PILRA抗體在hPILRA之以下位置中之一或多者處結合至一或多個胺基酸：78、106、及143。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之G78、K106、及/或E143。在一些實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之G78。在一些實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:4之R78。在一些實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之K106。在一些實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之E143。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之G78、K106、及E143。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:4之R78、K106、及E143。
在某些實施例中，抗PILRA抗體在hPILRA之以下位置中之一或多者處結合至一或多個胺基酸：63及64。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之T63及/或A64。在一些實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之T63。在一些實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之A64。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之T63及A64。
在某些實施例中，抗PILRA抗體在hPILRA之以下位置中之一或多者處結合至一或多個胺基酸：106及116-118。在一些實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之Q116、K117、及/或Q118 ( 例如，Q116、K117、及Q118)。
在一些實施例中，抗PILRA抗體識別hPILRA之莖2區域內之抗原決定基， 例如，SEQ ID NO:1之位置182-186之QGKRR (SEQ ID NO:7)。在一些實施例中，抗PILRA抗體識別包含SEQ ID NO:1之殘基182-186內之1、2、3、或4個胺基酸的抗原決定基。在一些實施例中，抗PILRA抗體識別包含SEQ ID NO:1之殘基182-186內之2、3、或4個胺基酸的抗原決定基。在一些實施例中，抗PILRA抗體識別包含SEQ ID NO:1之殘基182-186內之所有五個胺基酸的抗原決定基。在一些實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之Q182、G183、K184、R185、及/或R186 ( 例如，Q182、G183、K184、R185、及R186)。
在一些實施例中，抗PILRA抗體識別hPILRA之莖1區域內之抗原決定基， 例如，SEQ ID NO:1之位置156-163之TTQRPSSM (SEQ ID NO:6)。在一些實施例中，抗PILRA抗體識別包含SEQ ID NO:1之殘基156-163內之1、2、3、4、5、6、或7個胺基酸的抗原決定基。在一些實施例中，抗PILRA抗體識別包含SEQ ID NO:1之殘基156-163內之2、3、4、5、6、或7個胺基酸的抗原決定基。在一些實施例中，抗PILRA抗體識別包含SEQ ID NO:1之殘基156-163內之所有八個胺基酸的抗原決定基。在一些實施例中，抗PILRA抗體結合至SEQ ID NO:1之T156、T157、Q158、R159、P160、S161、S162、及/或M163 ( 例如，T156、T157、Q158、R159、P160、S161、S162、及M163)。 交叉反應性
在某些實施例中，抗PILRA抗體識別在hPILRA與cynoPILRA之間保守的一或多個抗原決定基。在一些實施例中，抗PILRA抗體在hPILRA及/或cynoPILRA中之以下位置中之一或多者處結合至一或多個胺基酸：64、78、139、143、156-163、及182-185，其中位置參考SEQ ID NO:1來確定。在一些實施例中，抗PILRA抗體在hPILRA及cynoPILRA中之以下位置中之一或多者處結合至一或多個胺基酸：64、78、139、143、156-163、及182-185，其中位置參考SEQ ID NO:1來確定。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至具有SEQ ID NO:1之序列的hPILRA之A64、G78、W139、E143、T156、T157、Q158、R159、P160、S161、S162、M163、Q182、G183、K184、及/或R185及具有SEQ ID NO:2之序列的cynoPILRA之A68、G82、W143、E147、T160、T161、Q162、R163、P164、S165、S166、M167、Q186、G187、K188、及/或R189。
在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至具有SEQ ID NO:1之序列的hPILRA之A64及具有SEQ ID NO:2之序列的cynoPILRA之A68。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至具有SEQ ID NO:1之序列的hPILRA之G78及具有SEQ ID NO:2之序列的cynoPILRA之G82。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至具有SEQ ID NO:4之序列的hPILRA之R78及具有SEQ ID NO:2之序列的cynoPILRA之G82。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至具有SEQ ID NO:1之序列的hPILRA之W139及具有SEQ ID NO:2之序列的cynoPILRA之W143。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至具有SEQ ID NO:1之序列的hPILRA之E143及具有SEQ ID NO:2之序列的cynoPILRA之E147。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至hPILRA ( 例如，SEQ ID NO:1之位置156-163)及cynoPILRA ( 例如，SEQ ID NO:2之位置160至167)之TTQRPSSM (SEQ ID NO:6)內相同的一或多個胺基酸。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至hPILRA ( 例如，SEQ ID NO:1之位置182-185)及cynoPILRA ( 例如，SEQ ID NO:2之位置186至189)之QGKR (SEQ ID NO:8)內相同的一或多個胺基酸。
在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至具有SEQ ID NO:1之序列的hPILRA之G78、K106、E143及具有SEQ ID NO:2之序列的cynoPILRA之G82、D110、E147。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至具有SEQ ID NO:4之序列的hPILRA之R78、K106、E143及具有SEQ ID NO:2之序列的cynoPILRA之G82、D110、E147。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至具有SEQ ID NO:1之序列的hPILRA之T63及A64及具有SEQ ID NO:2之序列的cynoPILRA之A67及A68。在具體實施例中，抗PILRA抗體結合至hPILRA之QGKRR (SEQ ID NO:7) ( 例如，SEQ ID NO:1之位置182-186)內之一或多個位置及cynoPILRA之QGKRH (SEQ ID NO:9) ( 例如，SEQ ID NO:2之位置186至190)之相同相應位置。 抗PILRA抗體之功能特性
在一些實施例中，抗PILRA抗體( 例如，具有如揭示之一或多個CDR、重鏈可變區、及/或輕鏈可變區序列之抗體)在如本文揭示之一或多個活性方面起作用。例如，在一些實施例中，抗PILRA抗體拮抗或減少PILRA活性， 亦即，藉由配位體來誘導之PILRA活性。
在某些實施例中，抗PILRA抗體阻斷配位體與hPILRA之結合。在具體實施例中，抗PILRA抗體阻斷唾液酸化蛋白與hPILRA之結合， 例如，唾液酸化形式之任何以下蛋白質：神經增殖分化及控制蛋白1 (NPDC1)、PILRA相關神經蛋白(PANP；PIANP)、單純性疱疹病毒1型醣蛋白B (HSV-1gB)、膠原凝素-12 (COLEC12)、補體組分4A (C4a)、補體組分4B (C4b)、肌營養不良蛋白聚糖1 (肌營養不良蛋白相關醣蛋白1；DAG1)、及c型凝集素域家族成員G (Clec4g)。
此外，在一些實施例中，抗PILRA抗體改變一或多種下游蛋白質之磷酸化， 例如，增加EGFR或STAT3之磷酸化或降低STAT1之磷酸化。在一些實施例中，若與對照值相比，用抗PILRA抗體處理之樣品中之下游蛋白質磷酸化水準增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更大，則抗PILRA抗體誘導或增加一或多種下游蛋白質( 例如，EGFR或STAT3)之磷酸化。在一些實施例中，若與對照值相比，用抗PILRA抗體處理之樣品中之下游蛋白質磷酸化水準增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、或更大，則抗PILRA抗體誘導一或多種下游蛋白質( 例如，EGFR或STAT3)之磷酸化。在一些實施例中，若與對照值相比，用抗PILRA抗體處理之樣品中之下游蛋白質磷酸化水準降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更大，則抗PILRA抗體降低一或多種下游蛋白質( 例如，STAT1)之磷酸化。在一些實施例中，若與對照值相比，用抗PILRA抗體處理之樣品中之下游蛋白質磷酸化水準降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、或更大，則抗PILRA抗體降低一或多種下游蛋白質( 例如，STAT1)之磷酸化。
在一些實施例中，對照值為未處理樣品( 例如，包含未用抗PILRA抗體處理之PILRA表現細胞的樣品，或來自未用抗PILRA抗體處理之個體之樣品)，或用PILRA配位體處理但未用抗PILRA抗體處理之樣品，或用合適非PILRA結合抗體處理之樣品中之下游蛋白質磷酸化水準。
為了偵測及/或量化樣品中之磷酸化，在一些實施例中，使用免疫檢定。在一些實施例中，免疫檢定為酶免疫檢定(EIA)、酶多因子免疫檢定(EMIA)、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、微粒酶免疫檢定(MEIA)、免疫組織化學(IHC)、免疫細胞化學、毛細管電泳免疫檢定(CEIA)、放射性免疫檢定(RIA)、免疫螢光、化學發光免疫檢定(CL)、或電化學發光免疫檢定(ECL)。在一些實施例中，使用利用放大發光接近均勻檢定(amplified luminescent proximity homogenous assay)(AlphaLISA®, PerkinElmer Inc.)之免疫檢定來偵測及/或量化磷酸化。
在一些實施例中，磷酸化使用包含一或多種細胞， 例如，一或多種PILRA表現細胞( 例如，內源性表現PILRA之細胞株，諸如人類IPSC衍生性小神經膠質細胞，或經工程化以表現PILRA之細胞株， 例如如以下實例部分所描述的)之樣品來量測。在一些實施例中，樣品包含流體， 例如血液、血漿、血清、尿液、或腦脊髓液。在一些實施例中，樣品包含組織( 例如，肺、腦、腎、脾、神經組織、或骨骼肌)或來自此組織之細胞。在一些實施例中，樣品包含內源性流體、組織、或細胞( 例如，來自人類或非人類個體)。
此外，在一些實施例中，抗PILRA抗體增加抗炎基因或蛋白質表現。例如，抗PILRA抗體增強IL1RN基因表現。在一些實施例中，若與對照值相比，用抗PILRA抗體處理之樣品中之抗炎基因或蛋白質表現水準增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更大，則抗PILRA抗體增強抗炎基因或蛋白質表現。在其他實施例中，抗PILRA抗體減少促炎性細胞介素蛋白質表現或分泌。例如，抗PILRA抗體減少TNF、IL-6、及/或IP-10表現。在一些實施例中，若與對照值相比，用抗PILRA抗體處理之樣品中之細胞介素蛋白質表現水準減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更大，則抗PILRA抗體減少細胞介素蛋白質表現。
此外，在一些實施例中，抗PILRA抗體增強細胞遷移及/或細胞功能( 例如，對於小神經膠質細胞，包括IPSC衍生性小神經膠質細胞及疾病相關小神經膠質細胞而言)。疾病相關小神經膠質細胞及偵測疾病相關小神經膠質細胞之方法描述於Keren-Shaul 等人, Cell, 2017, 169:1276-1290中。在一些實施例中，抗PILRA抗體增強一或多種細胞類型( 例如，小神經膠質細胞、單核球、或嗜中性球)之細胞遷移。在一些實施例中，抗PILRA抗體增強一或多種細胞類型( 例如，小神經膠質細胞、單核球、或嗜中性球)之細胞功能( 例如，ATP產生、脂肪酸代謝、及/或細胞呼吸)。在一些實施例中，抗PILRA抗體增強小神經膠質細胞之細胞遷移及/或細胞功能。在一些實施例中，抗PILRA抗體增強疾病相關小神經膠質細胞之細胞遷移及/或細胞功能。
在一些實施例中，若與對照值相比，用抗PILRA抗體處理之樣品中之活性水準增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更大，則抗PILRA抗體增強細胞遷移及/或細胞功能。在一些實施例中，若與對照值相比，用抗PILRA抗體處理之樣品中之活性水準增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、或更大，則抗PILRA抗體增強細胞遷移及/或細胞功能。在一些實施例中，對照值為未處理樣品( 例如，未用抗PILRA抗體處理之樣品)、用PILRA配位體處理但未用抗PILRA抗體處理之樣品、或用合適非PILRA結合抗體來處理之樣品中之活性( 例如，遷移或功能)水準。
在一些實施例中，細胞遷移使用趨化性檢定來量測。趨化性檢定為此項技術中已知的。在一些實施例中，對包含內源性表現PILRA之細胞，諸如人類IPSC衍生性小神經膠質細胞的樣品進行細胞遷移檢定( 例如，趨化性檢定)。在一些實施例中，對包含已經工程化以表現PILRA之細胞的樣品進行細胞遷移檢定( 例如，趨化性檢定)。在一些實施例中，對包含PILRA已缺失或無功能活性之細胞的樣品進行細胞遷移檢定。在一些實施例中，使用如以下實例部分所述之趨化性檢定來量測細胞遷移。
在一些實施例中，使用對於細胞而言適當之功能檢定量測細胞功能。在一些實施例中，抗PILRA抗體增加脂肪酸代謝( 例如，脂肪酸氧化)。在一些實施例中，抗PILRA抗體增強細胞ATP產生。在一些實施例中，抗PILRA抗體增強細胞呼吸( 例如，粒線體或非粒線體呼吸)。細胞ATP產生及/或呼吸之變化可使用 例如如以下實例部分所述之一或多種檢定來評估。 IV. FC 多肽及其修飾
在一些實施例中，本文所述之抗PILRA抗體包含特異性結合至CD98hc蛋白之經修飾Fc多肽。在一些實施例中，抗PILRA抗體包含第一Fc多肽及第二Fc多肽，其中第一Fc多肽及第二Fc多肽中之一者經修飾以結合至CD98hc蛋白。在一些實施例中，抗PILRA抗體中之一個或兩個Fc多肽可進一步含有胺基酸修飾，其促進Fc多肽二聚體中之兩個Fc多肽之異二聚化、調節效應子功能、延長血清半衰期、影響醣化、及/或減少人類中之免疫原性。在一些實施例中，存在於抗PILRA抗體中之兩個Fc多肽獨立地與相應野生型Fc多肽( 例如，人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4 Fc多肽)( 例如，SEQ ID NO:55)具有至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%胺基酸序列一致性。經修飾Fc多肽( 例如，CD98hc結合Fc多肽)之實例及描述可見於 例如國際專利公開案第PCT/US2022/053220號中，該公開案以全文引用方式併入本文。
在一些實施例中，本文所述之抗PILRA抗體中Fc多肽二聚體之僅一個Fc多肽具有導致Fc多肽結合至CD98hc之胺基酸修飾。在一些實施例中，本文所述之抗PILRA抗體中Fc多肽二聚體之兩個Fc多肽可具有導致Fc多肽結合至CD98hc之胺基酸修飾。 用於BBB受體結合之Fc多肽修飾
本文提供能夠被運輸穿過BBB的包含Fc多肽二聚體之抗PILRA抗體。此抗體包含結合至BBB受體， 例如CD98hc之經修飾Fc多肽。BBB受體在BBB內皮，以及其他細胞及組織類型上表現。在一些實施例中，BBB受體為CD98hc蛋白。
在各種Fc修飾，包括在結合至BBB受體， 例如CD98hc蛋白之經修飾Fc多肽中引入之彼等修飾中指定之胺基酸殘基在本文中使用EU索引編號來編號。任何Fc多肽， 例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4 Fc多肽，可在如本文所述之一或多個位置中具有修飾， 例如，胺基酸取代。在一些實施例中，針對BBB ( 例如，CD98hc)受體結合活性來修飾之域為人類Ig CH3域，諸如IgG1 CH3域。CH3域可為任何IgG亞型， 亦即，來自IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。在IgG1抗體之情形下，CH3域係指如根據EU編號方案來編號的約位置341至約位置447之胺基酸區段。
在一些實施例中，存在於本文所述之抗PILRA抗體中之BBB ( 例如，CD98hc)受體結合Fc多肽包含由378、380、382、383、384、385、386、387、389、391、421、422、424、426、428、434、436、438、440、441、及442組成之一組胺基酸位置中之至少十一、十二個、十三個、十四個、或十五個取代。在一些實施例中，取代選自位置378處之Ser、Val、Asp、Glu、或Tyr，位置380處之Leu、Ile、Met、Ala、Gln、Val、或Lys，位置382處之Asn、Ser、Leu、Met、Pro、Tyr、Lys、Ala、或Thr，位置383處之Thr、Phe、Asn、Pro、Asp、Leu、His、或Gln，位置384處之Lys、Arg、His、Ile、Leu、Phe、Tyr、Val、或Gln，位置385處之Phe或Tyr，位置386處之Val、Leu、Ala、Ile、Phe、Tyr、Ser、Thr、His、Arg、或Glu，位置387處之Leu或Ile，位置389處之Asp、Gln、Ala、Thr、His、或Val，位置391處之Thr、Val、或Ala，位置421處之Glu、Gln、或Ala，位置422處之Leu、Met、Ile、Thr、或Pro，位置424處之Ala，位置426處之Asn，位置428處之Leu、Thr、Pro、Tyr、Phe、Ile、Ala、Lys、His、或Trp，位置434處之Ser，位置436處之Leu、Val、His、Phe、Pro、Arg或Trp，位置438處之Phe或Trp，位置440處之Leu、Pro、Glu、Asn、Val、Ala、Ile、或Asp，位置441處之Pro，及位置442處之Ala、Val、Met、Gln、Phe、Pro、Leu、Tyr、Lys、Arg、His、或Met。
在一些實施例中，存在於本文所述之抗PILRA抗體中之BBB ( 例如，CD98hc)受體結合Fc多肽包含根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala。
在一些實施例中，BBB ( 例如，CD98hc)受體結合Fc多肽與SEQ ID NO:64之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性且在一些實施例中具有根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala。在具體實施例中，BBB ( 例如，CD98hc)受體結合Fc多肽具有SEQ ID NO:64之序列。在本文所述之抗PILRA抗體之一些實施例中，Fc多肽二聚體中兩個Fc多肽中之一者可為具有SEQ ID NO:64之序列的BBB ( 例如，CD98hc)受體結合Fc多肽，而Fc多肽二聚體中之另一Fc多肽可具有野生型Fc多肽之序列( 例如，SEQ ID NO:55)。在本文所述之抗PILRA抗體之其他實施例中，Fc多肽二聚體中之兩個Fc多肽可為具有SEQ ID NO:64之序列的BBB ( 例如，CD98hc)受體結合Fc多肽。 用於異二聚化之Fc多肽修飾
在一些實施例中，存在於抗PILRA抗體中之Fc多肽包括杵突變及臼突變以促進異二聚體形成及阻止同二聚體形成。通常，修飾引入第一多肽之界面處之突起(「杵」)及第二多肽之界面中之相應腔穴(「臼」)，以使得突起可位於腔穴中以便促進異二聚體形成並由此阻止同二聚體形成。突起藉由用較大側鏈( 例如，酪胺酸或色胺酸)置換來自第一多肽之界面的小胺基酸側鏈來構建。尺寸與突起相同或類似之補償腔穴藉由用較小胺基酸側鏈( 例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈來在第二多肽之界面中產生。在一些實施例中，此類額外突變位於對多肽與BBB受體 例如CD98hc之結合不具有負效應的Fc多肽中之位置處。
在用於二聚化之杵及臼方法之一個示例性實施例中，存在於抗PILRA抗體中之Fc多肽中之一者的位置366 (根據EU編號方案來編號)包含代替天然蘇胺酸之色胺酸。二聚體中之另一Fc多肽具有位置407 (根據EU編號方案來編號)處代替天然酪胺酸之纈胺酸。另一Fc多肽可進一步包含以下取代，其中位置366 (根據EU編號方案來編號)處之天然蘇胺酸經絲胺酸取代且位置368 (根據EU編號方案來編號)處之天然白胺酸經丙胺酸取代。因此，本文所述之抗PILRA抗體之Fc多肽中之一者具有T366W杵突變且另一Fc多肽具有Y407V突變，通常伴隨著T366S及L368A臼突變。
在一些實施例中，存在於本文所述之抗PILRA抗體中之一個或兩個Fc多肽亦可經工程化以含有用於異二聚化之其他修飾， 例如，CH3-CH3界面內之接觸殘基之靜電工程化，該等接觸殘基為天然地帶電荷或疏水性補片修飾。
例如，在一些實施例中，本文所述之抗PILRA抗體可含有Fc多肽二聚體，其具有的一個Fc多肽具有T366W杵突變且與SEQ ID NO:60之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性並且另一Fc多肽具有T366S、L368A、及Y407V臼突變且與SEQ ID NO:61之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性。在某些實施例中，Fc多肽二聚體中之一個或兩個Fc多肽可為CD98hc結合Fc多肽。在具體實施例中，本文所述之抗PILRA抗體可含有Fc多肽二聚體，其具有(i)與SEQ ID NO:61之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的第一Fc多肽，其中該序列包括根據EU編號之位置366處之Ser、位置368處之Ala、及位置407處之Val；及(ii)與SEQ ID NO:65之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的第二Fc多肽，其中根據EU編號，該序列包括位置366處之Trp且在一些實施例中具有位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala。
在具體實施例中，本文所述之抗PILRA抗體可含有(i)與SEQ ID NO:60之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的第一Fc多肽，其中該序列包括根據EU編號之位置366處之Trp，及(ii)與SEQ ID NO:67之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的第二Fc多肽，其中根據EU編號，該序列包括位置366處之Ser、位置368處之Ala、及位置407處之Val且在一些實施例中具有位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala。 用於調節效應子功能之Fc多肽修飾
在一些實施例中，存在於本文所述之抗PILRA抗體中之一個或兩個Fc多肽可包含減少效應子功能， 亦即減少在結合至介導效應子功能之效應細胞上表現之Fc受體後，誘導某些生物功能之能力的修飾。抗體效應子功能之實例包括但不限於C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)、細胞表面受體( 例如，B細胞受體)之下調、及B細胞活化。效應子功能可隨著抗體類別而變化。例如，天然人類IgG1及IgG3抗體可在結合至存在於免疫系統細胞上之合適Fc受體後引起ADCC及CDC活性；且天然人類IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4可在結合至存在於免疫細胞上之合適Fc受體後引起ADCP功能。
在一些實施例中，Fc多肽二聚體中之一個或兩個Fc多肽可包含減少或消除效應子功能之修飾。減少效應子功能之示例性Fc多肽突變包括但不限於CH2域中之取代， 例如根據EU編號方案之位置234及235及/或位置329處之取代。例如，在一些實施例中，一個或兩個Fc多肽包含位置234及235處之Ala殘基(在本文中亦稱為「LALA」)。在一些實施例中，一個或兩個Fc多肽包含位置329處之Gly殘基(在本文中亦稱為「P329G」或「PG」)或位置329處之Ser殘基(在本文中亦稱為「P329S」或「PS」)。在一些實施例中，一個或兩個Fc多肽包含位置234及235處之Ala殘基，及位置329處之Gly殘基(在本文中亦稱為「LALA PG」)。在一些實施例中，一個或兩個Fc多肽包含位置234及235處之Ala殘基，及位置329處之Ser殘基(在本文中亦稱為「LALA PS」)。
調節效應子功能之額外Fc多肽突變包括但不限於以下：位置329可具有突變，其中脯胺酸經甘胺酸或精胺酸或足夠大到破壞在Fc之脯胺酸329與FcγRIII之色胺酸殘基Trp 87及Trp 110之間形成的Fc/Fcγ受體界面的胺基酸殘基取代。額外示例性取代包括根據EU編號方案之S228P、E233P、L235E、N297A、N297D、及P331S。亦可存在多種取代， 例如，根據EU編號方案的人類IgG1 Fc區域之L234A及L235A；人類IgG1 Fc區域之L234A、L235A、及P329G；人類IgG1 Fc區域之L234A、L235A、及P329S；人類IgG4 Fc區域之S228P及L235E；人類IgG1 Fc區域之L234A及G237A；人類IgG1 Fc區域之L234A、L235A、及G237A；人類IgG2 Fc區域之V234A及G237A；人類IgG4 Fc區域之L235A、G237A、及E318A；及人類IgG4 Fc區域之S228P及L236E。在一些實施例中，一個或兩個Fc多肽可具有調節ADCC之一或多個胺基酸取代， 例如，根據EU編號方案之位置298、333、及/或334處之取代。 用於延長血清半衰期之Fc多肽修飾
在一些實施例中，增強血清半衰期之修飾可引入本文所述之任何Fc多肽中。例如，在一些實施例中，Fc多肽二聚體中之一個或兩個Fc多肽可包含如根據EU編號方案來編號之M428L及N434S取代(亦稱為LS取代)。或者，Fc多肽二聚體中之一個或兩個Fc多肽可具有N434S或N434A取代。或者，Fc多肽二聚體中之一個或兩個Fc多肽可具有M428L取代。在其他實施例中，Fc多肽二聚體中之一個或兩個Fc多肽可包含M252Y、S254T、及T256E取代。
在一些實施例中，Fc多肽中之一者或兩者可使其C端離胺酸移除( 例如，根據EU編號，Fc多肽之位置447處之Lys殘基)。C端離胺酸殘基在許多物種之免疫球蛋白中高度保守且可在蛋白質產生期間，藉由細胞機制來完全或部分移除。在一些實施例中，移除Fc多肽中之C端離胺酸可改善蛋白質之穩定性。
在一些實施例中，鉸鏈區( 例如，SEQ ID NO:58)或其一部分( 例如，SEQ ID NO:59)可連接至本文所述之Fc多肽或經修飾Fc多肽。鉸鏈區可來自任何免疫球蛋白亞類或同型。示例性免疫球蛋白鉸鏈為IgG鉸鏈區，諸如IgG1鉸鏈區， 例如，人類IgG1鉸鏈胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:58)或其一部分( 例如，DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:59))。在一些實施例中，鉸鏈區在Fc多肽之N端區域處。 V. 示例性抗PILRA抗體
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 分別包含SEQ ID NO:10-12之胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，及/或與SEQ ID NO:16或21具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V H序列，及分別包含SEQ ID NO:13-15之胺基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，及/或與SEQ ID NO:17或22具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V L序列；及 (ii) 第一Fc多肽；及 (iii) 第二Fc多肽，其中第一Fc多肽及第二Fc多肽中之一者經修飾以特異性結合至CD98hc蛋白。在一些實施例中，第一Fc多肽經修飾以特異性結合至CD98hc蛋白。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 分別包含SEQ ID NO:10-12之胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，及分別包含SEQ ID NO:13-15之胺基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3；及 (ii) 第一Fc多肽；及 (iii) 第二Fc多肽，其中第一Fc多肽及第二Fc多肽中之一者經修飾以特異性結合至CD98hc蛋白。在一些實施例中，第一Fc多肽經修飾以特異性結合至CD98hc蛋白。
在一些實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 與SEQ ID NO:16或21具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V H序列，及與SEQ ID NO:17或22具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V L序列；及 (ii) 第一Fc多肽；及 (iii) 第二Fc多肽，其中第一Fc多肽及第二Fc多肽中之一者經修飾以特異性結合至CD98hc蛋白。在一些實施例中，第一Fc多肽經修飾以特異性結合至CD98hc蛋白。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含用於CD98hc結合之修飾( 例如，根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala)，杵突變( 例如，T366W)，及減少或消除效應子功能之修飾( 例如，L234A、L235A、及P329G)。在某些實施例中，第一Fc多肽包含與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列。在具體實施例中，第一Fc多肽包含根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列。
在一些實施例中，第二Fc多肽包含臼突變( 例如，T366S、L368A、及Y407V)及減少或消除效應子功能之修飾( 例如，L234A、L235A、及P329G)。在某些實施例中，第二Fc多肽包含與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列。在具體實施例中，第二Fc多肽包含根據EU編號來編號之位置366處之Ser、位置368處之Ala、位置407處之Val、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列。
在具體實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 分別包含SEQ ID NO:10-12之胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，及/或與SEQ ID NO:16具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V H序列，及分別包含SEQ ID NO:13-15之胺基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，及/或與SEQ ID NO:17具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V L序列；及 (ii) 第一Fc多肽，其包含根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列；及 (iii) 第二Fc多肽，其包含根據EU編號之位置366處之Ser、位置368處之Ala、位置407處之Val、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列。
在具體實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 分別包含SEQ ID NO:10-12之胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，及分別包含SEQ ID NO:13-15之胺基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3；及 (ii) 第一Fc多肽，其包含根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列；及 (iii) 第二Fc多肽，其包含根據EU編號之位置366處之Ser、位置368處之Ala、位置407處之Val、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列。
在具體實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 與SEQ ID NO:16具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V H序列，及與SEQ ID NO:17具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V L序列；及 (ii) 第一Fc多肽，其包含根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列；及 (iii) 第二Fc多肽，其包含根據EU編號之位置366處之Ser、位置368處之Ala、位置407處之Val、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列。
在具體實施例中，抗PILRA抗體包含：具有與SEQ ID NO:18之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性之序列的第一重鏈，具有與SEQ ID NO:19之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性之序列的第二重鏈，及各自具有與SEQ ID NO:20之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性之序列的第一輕鏈及第二輕鏈。
在具體實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 分別包含SEQ ID NO:10-12之胺基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，及/或與SEQ ID NO:21具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V H序列，及分別包含SEQ ID NO:13-15之胺基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，及/或與SEQ ID NO:22具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V L序列；及 (ii) 第一Fc多肽，其包含根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列；及 (iii) 第二Fc多肽，其包含根據EU編號之位置366處之Ser、位置368處之Ala、位置407處之Val、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列。
在具體實施例中，抗PILRA抗體包含： (i) 與SEQ ID NO:21具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V H序列，及與SEQ ID NO:22具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之V L序列；及 (ii) 第一Fc多肽，其包含根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列；及 (iii) 第二Fc多肽，其包含根據EU編號之位置366處之Ser、位置368處之Ala、位置407處之Val、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性的序列。
在具體實施例中，抗PILRA抗體包含：具有與SEQ ID NO:23之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性之序列的第一重鏈，具有與SEQ ID NO:24之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性之序列的第二重鏈，及各自具有與SEQ ID NO:25之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性之序列的第一輕鏈及第二輕鏈。 VI. 細胞株及工程化方法
本文亦提供對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的、對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的、或對於編碼PILRA蛋白之G78變異體及R78變異體之基因為雜合的細胞及細胞株。本揭示案提供工程化人類誘導多能幹細胞(IPSC)或細胞株，其已經修飾( 亦即，經遺傳工程化)以表現編碼PILRA蛋白之R78變異體或G78變異體之基因( 亦即，對於該基因為純合)的兩個拷貝。在一些實施例中，IPSC在內源性基因體基因座處經修飾。
本揭示案亦提供工程化小神經膠質細胞或細胞株，其來源於已經修飾( 亦即，經遺傳工程化)以表現編碼PILRA蛋白之R78變異體或G78變異體之基因( 亦即，對於該基因為純合)的兩個拷貝的人類誘導多能幹細胞(IPSC)。工程化小神經膠質細胞或細胞株亦可來源於人類誘導多能幹細胞(IPSC)，其已經修飾( 亦即，經遺傳工程化)以表現編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因的一個拷貝及編碼G78變異體之基因的一個拷貝( 亦即，對於編碼R78及G78變異體之基因為雜合的)。在一些實施例中，IPSC在內源性基因體基因座處經修飾。在一些實施例中，工程化小神經膠質細胞或細胞株藉由定向分化來衍生。
本文亦提供充當匹配對之細胞株( 例如，IPSC株或由其衍生之小神經膠質細胞)的兩個細胞株，其中一個細胞株表現PILRA蛋白之G78變異體且另一細胞株表現PILRA蛋白之R78變異體。本揭示案提供匹配對之細胞株，其中：(a)該對之第一細胞株對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的；且(b)該對之第二細胞株對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的，其中該對之第一細胞株及第二細胞株來源於相同母體細胞株，且一個或兩個細胞株在內源性PILRA基因中經工程化。在匹配對之細胞株之具體實施例中，用於產生匹配對之細胞株之母體細胞株對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因可為純合的，此意味著僅需要自母體細胞株產生對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的該對中之細胞株。在匹配對之細胞株之其他實施例中，用於產生匹配對之細胞株之母體細胞株對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因可為純合的，此意味著僅需要自母體細胞株產生對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的該對中之細胞株。在其他實施例中，母體細胞株對於編碼PILRA蛋白之R78變異體及G78變異體之基因為雜合的( 亦即，一個等位基因編碼G78變異體且另一等位基因編碼R78變異體)。在此情況下，匹配對中之兩個細胞株需要自母體細胞株產生。
在匹配對之細胞株之一些實施例中，包括對於編碼PILRA蛋白之G78變異體及R78變異體之基因為雜合的第三細胞株。在一些實施例中，第三細胞株來源於對於編碼PILRA蛋白之R78變異體或G78變異體之基因為純合的母體細胞株。
本揭示案亦提供產生具有經修飾PILRA基因之骨髓細胞株或能夠分化為骨髓細胞株之幹細胞株( 例如，IPSC株或由其衍生之小神經膠質細胞)的方法，該方法包含：(a)確定現有骨髓細胞株或現有幹細胞株是否對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的、對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的、或對於編碼PILRA蛋白之R78及G78變異體之基因為雜合的；及(b)藉由修飾編碼PILRA蛋白之基因來使細胞株工程化以產生對於編碼PILRA蛋白之R78變異體或PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的工程化細胞株，其中工程化細胞株在工程化之前對於編碼選定變異體之基因不為純合的。換言之，根據現有細胞株，現有細胞株可需要或不需要經修飾以產生所需細胞株中之選定變異體。
本揭示案亦提供產生匹配對之細胞株( 例如，IPSC株或由其衍生之小神經膠質細胞)的方法，該方法包含：(a)確定現有骨髓細胞株或能夠分化為骨髓細胞株之現有幹細胞株是否對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的、對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的、或對於編碼PILRA蛋白之R78及G78變異體之基因為雜合的；及(b)藉由修飾編碼PILRA蛋白之基因來使(i)第一細胞株工程化以產生對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的工程化細胞株，及/或藉由修飾編碼PILRA蛋白之基因來使(ii)第二細胞株工程化以產生對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的工程化細胞株。在一些實施例中，工程化細胞株在工程化之前對於編碼選定變異體之基因不為純合的。
在具體實施例中，步驟(a)之現有細胞株對於PILRA蛋白之R78變異體為純合的，且步驟(b)之工程化包含修飾現有細胞株以產生對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的工程化細胞株。在具體實施例中，步驟(a)之現有細胞株對於PILRA蛋白之G78變異體為純合的，且步驟(b)之工程化包含修飾現有細胞株以產生對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的工程化細胞株。在其他實施例中，步驟(a)之現有細胞株對於編碼PILRA蛋白之R78及G78變異體之基因為雜合的，且步驟(b)之工程化包含修飾現有細胞株以產生對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的工程化細胞株，及對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的工程化細胞株。
在內源性基因體基因座( 例如，PILRA基因座位)處具有修飾之工程化細胞或細胞株可使用各種方法及技術，例如CRIPSR/Cas9系統、鋅指核酸酶(ZFN)、Tale效應域核酸酶(TALEN)、及轉座子介導系統來產生。此等方法通常包含向細胞投與編碼一或多個核酸酶之一或多個多核苷酸以使得核酸酶藉由裂解DNA以在DNA鏈中產生5’及3’切割末端，從而介導內源性基因之修飾。在由與自5’末端5’延伸之序列及自3’末端3’延伸之序列基本上同源之左同源性臂及右同源性臂所側接之供體序列存在下，將供體整合至藉由核酸酶經由同源介導修復(HDR)所靶向之內源性基因中。在一些實施例中，內源性基因體基因座處之修飾使用CRISPR/Cas9系統來進行。例如，將編碼對具有所需變異體之PILRA進行編碼之異源基因的核酸序列引入欲修飾之細胞之內源性PILRA基因體基因座中，導致編碼內源性PILRA之天然存在之序列藉由異源基因來置換。 CRISPR
在一些實施例中，編碼具有所需變異體之PILRA之異源基因的引入或敲入使用CRIPSR/Cas9系統來進行。CRISPR/Cas9系統包括Cas9蛋白及能夠將Cas9蛋白引導至欲置換之內源性PILRA基因中之目標模體且與其雜交的至少一個至兩個核糖核酸。此等核糖核酸通常被稱為「單一引導RNA」或「sgRNA」。然後，Cas9蛋白裂解目標模體，導致雙鏈斷裂或單鏈斷裂。在包含由兩個同源性臂側接之異源PILRA基因序列的供體DNA存在下，將供體DNA插入目標DNA中，從而置換內源性基因。
用於本揭示案中之Cas9蛋白可為天然存在之Cas9蛋白或其功能衍生物。天然序列多肽之「功能衍生物」為具有與天然序列多肽相同之定性生物學性質的化合物。「功能衍生物」包括但不限於天然序列之片段及天然序列多肽及其片段之衍生物，限制條件為其具有與相應天然序列多肽相同的生物活性。本文涵蓋之生物活性為Cas9之功能衍生物將DNA受質水解成片段的能力。Cas9多肽或其片段之合適功能衍生物包括但不限於Cas9蛋白或其片段之突變體、融合物、共價修飾。
在一些實施例中，Cas9蛋白來自 化膿性鏈球菌( Streptococcus pyogenes)。Cas9含有2個內切核酸酶域，包括裂解與sgRNA不互補的目標DNA之RuvC樣域，及裂解與sgRNA互補之目標DNA的HNH核酸酶域。Cas9之雙鏈內切核酸酶活性亦要求稱為原間隔物相關模體(PAM)之短保守序列(2-5個核苷酸)直接在目標序列中之目標模體3’之後。在一些實施例中，PAM模體為NGG模體。將供體DNA引入反應。在一個實例中，供體DNA包含左同源性臂與右同源性臂之間的所需變異體之異源PILRA基因。
sgRNA可根據所使用特定CRISPR/Cas9系統及目標多核苷酸之序列來選擇。在一些實施例中，一個至兩個核糖核酸經設計以與同由Cas9蛋白識別之脫氧核糖核酸模體直接相鄰的目標模體雜交。在一些實施例中，一個至兩個核糖核酸中之各者經設計以與同由Cas9蛋白識別之脫氧核糖核酸模體直接相鄰的目標模體雜交，其中目標模體側接欲置換之基因體序列。引導RNA可使用例如在http://crispr.mit.edu處易於得到之軟體來設計。
在一些實施例中，如本文揭示之供體DNA包含編碼hPILRA G78變異體之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，如本文揭示之供體DNA包含編碼hPILRA R78變異體之胺基酸序列的核苷酸序列。如本文揭示之供體DNA進一步包含左同源性臂及右同源性臂，其側接核苷酸序列且經設計為相對於Cas9蛋白之裂解位點，重疊5’外顯子序列及3’外顯子序列。同源性臂可延伸超過5’外顯子序列及3’外顯子序列，且同源性臂中之各者之長度可為至少20、30、40、50、100、或150個核苷酸。熟習此項技術者可容易確定實驗所需之同源性臂之最佳長度。
在一些實施例中，亦可選擇sgRNA以使與除了目標多核苷酸序列以外之核酸序列的雜交最小化。在一些實施例中，一個至兩個核糖核酸經設計以與目標模體雜交，在與細胞中之所有其他基因體核苷酸序列相比時，該模體含有至少兩個失配以使CRISPR/Cas9系統之脫靶效應最小化。熟習此項技藝者認識到，各種技術可用於選擇用於使脫靶效應最小化之合適目標模體( 例如，生物資訊學分析)。 鋅指核酸酶(ZFN)
在一些實施例中，編碼具有所需變異體之PILRA之異源基因的引入或敲入使用ZFN來進行。ZFN為包含FokI內切核酸酶之非特異性裂解域(N)及鋅指蛋白(ZFP)的融合蛋白。一對ZNF參與識別目標基因中之特定基因座：一個識別欲修飾位點上游之序列且另一個識別下游之序列。ZFN之核酸酶部分在特定基因座處切割。然後，供體DNA可插入特定基因座中。使用ZFN之方法為熟知的，例如，如美國專利案第9,045,763號以及Durai 等人, 「Zinc Finger Nucleases: Custom-Designed Molecular Scissors for Genome Engineering of Plant and Mammalian cells,」 Nucleic Acid Research, 33 (18):5978-5990 (2005)所揭示，該等文獻之揭示內容以全文引用方式併入。 轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)
在一些實施例中，編碼具有所需變異體之PILRA之異源基因的引入或敲入使用TALEN來進行。TALEN與ZFN之相似之處在於其在基因體位點周圍結合為一對且引導相同非特異性核酸酶FokI以在特定位點處裂解基因體，而非識別DNA三聯體，各域識別單一核苷酸。使用ZFN之方法亦為熟知的，例如，如美國專利案第9,005,973號以及Christian 等人, 「Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases,」 Genetics, 186(2): 757-761 (2010)所揭示，該等文獻之揭示內容以全文引用方式併入。
本揭示案亦提供自對於編碼PILRA蛋白之R78及G78變異體之基因為雜合的現有骨髓細胞株( 例如，IPSC株或由其衍生之小神經膠質細胞)或能夠分化為骨髓細胞株之現有幹細胞株來產生匹配對之細胞株的方法，該方法包含：(a)使現有細胞株工程化以產生對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的第一工程化細胞株；及(b)使步驟(a)產生之細胞株或現有細胞株工程化以產生對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的第二工程化細胞株。如本文所述，CRIPSR/Cas9系統可用於使用包含編碼hPILRA R78變異體或G78變異體之胺基酸序列之核苷酸序列的供體DNA來產生匹配對之細胞株。
在另一態樣中，本揭示案提供自對於編碼PILRA蛋白之R78及G78變異體之基因為雜合的現有骨髓細胞株或能夠分化為骨髓細胞之現有幹細胞株( 例如，IPSC株或由其衍生之小神經膠質細胞)來產生匹配對之細胞株的方法，該方法包含：(a)使現有細胞株工程化以產生對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的第一工程化細胞株；及(b)使步驟(a)產生之細胞株或現有細胞株工程化以產生對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的第二工程化細胞株。如本文所述，CRIPSR/Cas9系統可用於使用包含編碼hPILRA R78變異體或G78變異體之胺基酸序列之核苷酸序列的供體DNA來產生匹配對之細胞株。
本揭示案亦提供自對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的現有骨髓細胞株或能夠分化為骨髓細胞株之現有幹細胞株( 例如，IPSC株或由其衍生之小神經膠質細胞)來產生匹配對之細胞株的方法，該方法包含：使現有細胞株工程化以產生對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的工程化細胞株。如本文所述，CRIPSR/Cas9系統可用於使用包含編碼hPILRA G78變異體之胺基酸序列之核苷酸序列的供體DNA來產生匹配對之細胞株。
本揭示案亦提供自對於編碼PILRA蛋白之G78變異體之基因為純合的現有骨髓細胞株或能夠分化為骨髓細胞株之現有幹細胞株( 例如，IPSC株或由其衍生之小神經膠質細胞)來產生匹配對之細胞株的方法，該方法包含：使現有細胞株工程化以產生對於編碼PILRA蛋白之R78變異體之基因為純合的工程化細胞株。如本文所述，CRIPSR/Cas9系統可用於使用包含編碼hPILRA R78變異體之胺基酸序列之核苷酸序列的供體DNA來產生匹配對之細胞株。
在一些實施例中，本文所述之工程化細胞、細胞株、或細胞模型藉由定向分化來衍生。 VII. 篩選方法
本揭示案亦提供篩選及鑑別結合至PILRA蛋白及/或調節其表現或活性之抗體， 亦即，拮抗或減少PILRA活性之抗體( 亦即，阻斷配位體與hPILRA之結合之抗體)的方法。在一些實施例中，可量測與PILRA結合及/或活化相關之一或多個下游傳訊反應以鑑別PILRA結合抗體。例如，結合至細胞之PILRA蛋白的抗體可由於PILRA結合而引起細胞之一或多個下游傳訊反應或活性。在一些實施例中，相對於無PILRA結合的情況下細胞之傳訊反應或活性，結合至PILRA蛋白之抗體可由於PILRA結合而引起細胞之傳訊反應或活性增加或降低。由於PILRA結合而導致的細胞之傳訊反應或活性變化之實例包括但不限於磷酸化STAT3 (pSTAT3)水準、磷酸化STAT1 (pSTAT1)水準、磷酸化EGFR (pEGFR)水準、鈣黏蛋白表現、整聯蛋白表現、及細胞( 例如，小神經膠質細胞)遷移之變化。在具體實施例中，結合至PILRA並拮抗或減少PILRA活性之抗體可引起下游傳訊反應，諸如pSTAT3 ( 例如，pSTAT3 Y705、或pSTAT3 S727)水準之增加、pEGFR水準之增加、蛋白質( 例如，鈣黏蛋白、整聯蛋白)之表現水準及/或細胞分泌之增加、及/或細胞( 例如，小神經膠質細胞)遷移之增加。可由結合至PILRA並拮抗或減少PILRA活性之抗體所引起的其他下游傳訊反應之實例可為例如較高細胞呼吸、較高脂肪酸代謝( 例如，脂肪酸氧化)、較高ATP產生、增加抗炎基因或蛋白質表現、及/或減少細胞介素蛋白質表現。
本文提供篩選以確定抗體是否在PILRA蛋白處具有活性的方法，該方法包含：(a)使表現PILRA蛋白之細胞與抗體接觸；(b)在步驟(a)之前、同時、或之後，使具有較低PILRA表現的與步驟(a)相同類型之細胞與分子接觸；及(c)在兩種細胞中，量測以下中之一者：磷酸化STAT3 (pSTAT3)水準、磷酸化STAT1 (pSTAT1)水準、磷酸化EGFR (pEGFR)水準、鈣黏蛋白表現、整聯蛋白表現、及小神經膠質細胞遷移。在一些實施例中，在細胞之間，此等量測結果中之一者之水準的變化指示分子在步驟(a)之PILRA蛋白處具有活性。
在篩選方法之某些實施例中，步驟(a)之細胞天然地表現PILRA蛋白。在一些實施例中，具有較低PILRA表現之細胞具有PILRA蛋白敲除或沉默。在具體實施例中，細胞可為小神經膠質細胞。在某些實施例中，細胞為iMicroglia ( 例如，PILRA LoF iMicroglia)。
在篩選方法之某些實施例中，步驟(a)之細胞經工程化或經修飾以表現或過度表現PILRA蛋白。在一些實施例中，具有較低PILRA表現之細胞天然地表現PILRA蛋白或不經工程化或不經修飾來表現PILRA蛋白。
在一些實施例中，抗體文庫可使用本文所述之方法來篩選。在某些情況下，已知抗體結合PILRA蛋白。在其他情況下，未知抗體是否結合PILRA蛋白。
本文亦提供確定結合至PILRA蛋白之抗體是否調節PILRA表現細胞中之傳訊反應或活性的方法，該方法包含：(a)使細胞與分子接觸；及(b)量測以下中之一者：磷酸化STAT3 (pSTAT3)水準、磷酸化STAT1 (pSTAT1)水準、磷酸化EGFR (pEGFR)水準、鈣黏蛋白表現、整聯蛋白表現、及細胞( 例如，小神經膠質細胞)遷移。在一些實施例中，量測結果中之一者之水準的變化指示抗體調節PILRA表現細胞中之傳訊反應或活性。在某些實施例中，變化為相對於無抗體之細胞中之水準，當抗體接觸細胞時量測結果中之一者之水準的增加或降低，尤其為在申請案中別處描述之變化。在此等方法之具體實施例中，細胞在 活體外檢定中。在其他實施例中，細胞在哺乳動物中( 亦即，活體內方法)。
在一些實施例中，在方法 活體內使用時，且步驟(a)包含向哺乳動物投與抗體。
在一些實施例中，PILRA表現細胞可為小神經膠質細胞、骨髓細胞、單核球、或嗜中性球。 篩選檢定
鑑別結合至PILRA蛋白及/或調節其表現或活性的抗體的篩選檢定可藉由標準方法來執行。篩選方法可涉及高通量技術。另外，此等篩選技術可在培養細胞或生物體諸如小鼠、蠕蟲、蒼蠅、或酵母中執行。
可獲得用於執行此類篩選檢定之許多方法。根據一種方法，候選抗體以不同濃度添加至PILRA表現細胞之培養基。若將下游傳訊諸如磷酸-STAT3 (pSTAT3)誘導用作抗體是否結合PILRA蛋白及/或調節其表現或活性之量測，則pSTAT3水準可在表現PILRA蛋白之細胞中進行量測且與表現較低水準之PILRA之相應細胞( 例如，PILRA剔除)中的pSTAT3水準進行比較。在其他情況下，pSTAT3水準可在將抗體添加至細胞之前及之後量測。可比較pSTAT3之此等水準。
在另一個方法中，亦可量測蛋白質諸如整聯蛋白及鈣黏蛋白之細胞分泌物以確定抗體是否結合PILRA蛋白及/或調節其表現或活性，因為在實例中證明抗PILRA抗體增強此等蛋白質之iMicroglial分泌。標準實驗室技術可用於自細胞中單離此等蛋白質且此等蛋白質之偵測可使用 例如質譜、西方墨點法、及蛋白質組剖析器套組；人類可溶性受體陣列套組-非造血組(R&D ARY012)來進行。
在其他實施例中，結合至PILRA蛋白之候選抗體可使用基於層析之技術來鑑別。例如，重組PILRA可藉由標準技術自經工程化以表現PILRA之細胞中純化且可固定在管柱上。然後，使候選抗體之溶液穿過管柱，且對於PILRA具有特異性之抗體基於其結合至多肽且固定在管柱上之能力來進行鑑別。為了單離抗體，將管柱洗滌以移除非特異性結合分子，並且然後將所關注抗體自管柱中釋放且收集。若需要，藉由此方法(或任何其他合適方法)單離之抗體可經進一步純化( 例如，藉由高效液相層析)。 測試分子
通常，可根據在此項技術中已知之方法，自天然產物或合成(或半合成)提取物之較大文庫或化學文庫中鑑別出潛在抗體。熟習藥物發現及開發領域技藝者理解，測試提取物或化合物之確切來源對於本揭示案之篩選程序並非關鍵的。因此，實際上許多化學提取物或分子可使用本文所述之方法來篩選。此類提取物或分子之實例包括但不限於基於植物、真菌、原核生物或動物之提取物、發酵液、及合成化合物、以及現有化合物之修飾。亦可獲得用於產生許多分子之隨機或定向合成( 例如，半合成或總合成)的許多方法。合成化合物文庫為可商購獲得的。或者，呈細菌、真菌、植物、及動物提取物形式之天然化合物文庫為可商購獲得的。另外，若需要，天然及合成產生文庫根據在此項技術中已知之方法， 例如，藉由標準提取及分餾方法來產生。此外，若需要，任何文庫或化合物容易使用標準化學、物理、或生物化學方法來修飾。
當發現粗提取物具有活性時，陽性前導提取物之進一步分餾為單離產生所觀察到之效應的化學成分所需要的。因此，提取、分餾、及純化過程之目標為表徵及鑑別具有所需活性之粗提取物內之化學實體。此類異質提取物之分餾及純化方法為此項技術中已知的。若需要，顯示有用之分子可根據此項技術中已知之方法來化學修飾。 VIII. 量測細胞或動物中PILRA結合抗體之活性
本文亦提供量測結合至PILRA蛋白( 例如，hPILRA G78或R78)之抗體之結合及/或活性的方法。在一些實施例中，抗體拮抗或減少PILRA活性( 亦即，阻斷配位體與hPILRA之結合的抗體)。可進行各種量測以確定PILRA結合抗體之結合及/或活性及其對於細胞或動物之效應。例如，在本文中證明磷酸化STAT3之誘導為PILRA依賴性的且在PILRA受到拮抗時發生的細胞下游傳訊反應。
在一些實施例中，為了量測PILRA結合抗體之結合及/或活性，在將細胞與PILRA結合分子一起培育之後，可使用例如蛋白質組剖析器人類磷酸-激酶陣列套組( 例如，ARY003C，R&D Systems)來量測磷酸化STAT3 ( 例如，pSTAT3 Y705及/或pSTAT3 S727)水準。在其他實施例中，為了量測磷酸化蛋白質水準，在將細胞與PILRA結合分子一起培育之後，可固定細胞且可使用標準免疫細胞化學方案來偵測磷酸化蛋白質。然後，可用共焦顯微鏡來對細胞攝影且可使用軟體來分析影像以計算每個細胞之平均螢光光斑面積及強度，從而確定磷酸化蛋白質水準。
依賴於PILRA結合( 亦即，拮抗)之其他細胞反應包括 例如磷酸化EGFR ( 例如，pEGFR Y1086)水準之增加，其亦可使用如上所述之磷酸-激酶陣列套組或免疫細胞化學來量測。
在一些實施例中，量測在抗體之PILRA結合後STAT3及/或EGFR之磷酸化水準可用於將分子之拮抗效應分級。例如，其結合產生最高水準之pSTAT3的PILRA結合抗體可被確定為在PILRA蛋白處具有最大拮抗活性。
為了確定PILRA結合抗體之結合及/或活性及其對於細胞或動物之效應而可進行的其他量測包括例如量測細胞遷移，其為PILRA依賴性的且在PILRA受到拮抗時發生的另一個細胞下游傳訊反應。例如，細胞遷移之量測及定量可使用細胞遷移檢定來進行，其中橡皮塞可用於產生無細胞偵測區域。然後，橡皮塞可在添加PILRA結合分子後移除，且可添加細胞染色劑諸如NucBlue或DAPI。可用顯微術對細胞攝影且可使用軟體分析影像以量化遷移至偵測區域之細胞的核標記。此外，因為拮抗PILRA之PILRA結合抗體亦增強活動蛋白之細胞分泌，所以在將PILRA結合分子添加至細胞之後，亦可對細胞上清液中之此類活動蛋白進行定量。例如，上清液中之可溶性分析物可用蛋白質體剖析器套組，諸如人類可溶性受體陣列套組-非造血組( 例如，R&D ARY012)來分析。可以此方式定量之活動蛋白之實例包括但不限於鈣黏蛋白及整聯蛋白。
量測PILRA結合抗體之結合及/或活性可在細胞或動物( 例如，小鼠、猴子)中進行。對於 活體內研究，可經由可用的任何投與模式( 例如，IV、IP、經口、經鼻、或經皮投與)，向動物， 例如表現PILRA蛋白( 例如，PILRA G78或R78)之動物投與PILRA結合抗體。可將合適細胞、組織、及/或流體樣品自動物中單離以量測及量化本文所述之PILRA依賴性下游傳訊反應中之一或多者，諸如pSTAT3水準、pEGFR水準、活動蛋白( 例如，鈣黏蛋白、整聯蛋白)之量。在一些實施例中，細胞或動物對於編碼PILRA G78之基因為純合的。在一些實施例中，細胞或動物對於編碼PILRA R78之基因為純合的。在一些實施例中，細胞或動物對於編碼PILRA G78及R78變異體之基因為雜合的。 IX. 抗體之製備
在一些實施例中，抗體藉由以用於誘導抗體反應之抗原或抗原混合物免疫一或多隻動物( 例如，小鼠、兔、或大鼠)來製備。在一些實施例中，投與抗原或抗原混合物以及佐劑( 例如，弗氏佐劑(Freund’s adjuvant))。在初始免疫後，可投與該抗原或該等抗原之一或多個後續補強注射以提高抗體產生。在免疫後， 例如自脾及/或淋巴組織收穫抗原特異性B細胞。為了生成單株抗體，將B細胞與骨髓細胞融合，隨後針對抗原特異性進行篩選。製備抗體之方法亦描述於以下實例部分中。
編碼所關注抗體之重鏈及輕鏈之基因可自細胞選殖， 例如，編碼單株抗體之基因可自融合瘤選殖並且用於產生重組單株抗體。編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因文庫亦可自融合瘤或漿細胞製備。或者，可以使用噬菌體或酵母展示技術來鑑別特異性結合到所選抗原之抗體及Fab片段。抗體亦可製成為雙特異性的， 亦即能夠識別兩種不同抗原。抗體亦可為雜結合物， 例如兩個共價連接抗體或免疫毒素。
抗體可使用任何數目的表現系統產生，該等表現系統包括原核及真核表現系統。在一些實施例中，表現系統為哺乳動物細胞表型，諸如融合瘤或CHO細胞表現系統。許多此類系統可廣泛獲自商業供應商。在抗體包含V H及V L區之實施例中，該V H及V L區可使用單一載體， 例如以雙順反子表現單元或在不同啟動子控制下來表現。在其他實施例中，V H及V L區可使用單獨載體表現。如本文所述之V H或V L區可視情況在N端包含甲硫胺酸。
在一些實施例中，抗體為嵌合抗體。用於製得嵌合抗體之方法為此項技術中已知的。舉例而言，可製成嵌合抗體，其中來自一種物種諸如小鼠之抗原結合區(重鏈可變區及輕鏈可變區)融合至另一物種諸如人類之效應子區(恆定域)。作為另一個實例，可製成「類別轉換」嵌合抗體，其中抗體之效應子區經不同免疫球蛋白類別或子類別之效應子區取代。
在一些實施例中，抗體為人源化抗體。一般而言，非人類抗體經人源化以降低其免疫原性。人源化抗體通常包含一或多個非人類(例如，源自小鼠可變區序列)可變區( 例如，CDR)或其部分及可能一些非人類構架區或其部分，且進一步包含一或多個源自人類抗體序列之恆定區。用於使非人類抗體人源化之方法為此項技術中已知的。基因轉殖小鼠或其他生物體諸如其他哺乳動物可用於表現人源化或人類抗體。使抗體人源化之其他方法包括例如可變域表面重整、CDR移植、移植特異性決定殘基(SDR)、引導選擇、及構架改組。
作為人源化之替代方案，可生成完全人類抗體。作為非限制性實例，可產生如下基因轉殖動物( 例如小鼠)，它們一旦免疫便能產生人類抗體之完整庫而不產生內源性免疫球蛋白。例如，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中抗體重鏈接合區(JH)基因的同型缺失使內源性抗體產生受到完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至該種生殖系突變小鼠中，由此將會導致在抗原激發時產生人類抗體。作為另一個實例，可藉由基於融合瘤之方法，諸如藉由使用用於生成產生人類單株抗體之細胞株的原代人類B細胞來產生人類抗體。
亦可使用噬菌體展示或酵母展示技術來產生人類抗體。在噬菌體展示中，可變重鏈及可變輕鏈基因庫在噬菌體展示載體中經擴增且表現。在一些實施例中，抗體文庫為自人類來源擴增之天然庫。在一些實施例中，抗體文庫為藉由選殖重鏈及輕鏈序列且重組以生成具有不同抗原特異性之較大抗體池來製成之合成文庫。噬菌體通常展示抗體片段( 例如，Fab片段或scFv片段)，然後針對其與所關注抗原之結合進行篩選。
在一些實施例中，生成抗體片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’) 2、scFv、V H、或V HH)。例如，可以生成如下抗體片段，其含有與SEQ ID NO:16之序列具有至少90% (例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之V H序列及/或與SEQ ID NO:17之序列具有至少90% (例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之V L序列。在另一實例中，可產生如下抗體片段，其含有與SEQ ID NO:21之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性之V H序列及/或與SEQ ID NO:22之序列具有至少90% ( 例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%)一致性或100%一致性之V L序列。已開發用於產生抗體片段之各種技術。傳統上，該等片段經由蛋白水解消化完整抗體來獲得。然而，此等片段現可直接使用重組宿主細胞產生。例如，抗體片段可自抗體噬菌體文庫單離。或者，可直接自 大腸桿菌細胞回收Fab'-SH片段且化學偶合以形成F(ab’) 2片段。根據另一種方法，F(ab') 2片段可直接自重組宿主細胞培養物中單離。用於產生抗體片段之其他技術將為熟悉此項技藝者顯而易知的。
在一些實施例中，抗體或抗體片段經結合至另一分子， 例如聚乙二醇(PEG化)或血清白蛋白，以提供經延長之 活體內半衰期。 X. 核酸、載體、及宿主細胞
在一些實施例中，使用重組方法製備如本文所揭示之抗PILRA抗體。因此，在一些態樣中，本揭示案提供包含編碼任一種如本文所述之抗PILRA抗體( 例如，本文所述之CDR、重鏈可變區、及輕鏈可變區中之任一或多個)之核酸序列的經單離核酸；包含此類核酸之載體；及引入該等核酸以用於複製編碼抗體之核酸且/或表現該等抗體之宿主細胞。
在一些實施例中，多核苷酸( 例如，經單離多核苷酸)包含編碼如本文所述之抗體的核苷酸序列。在一些實施例中，多核苷酸包含編碼表1中揭示之一或多個胺基酸序列( 例如，CDR、重鏈、或輕鏈序列)的核苷酸序列。在一些實施例中，多核苷酸包含編碼與表1中所揭示之序列( 例如CDR、重鏈、或輕鏈序列)具有至少85%序列一致性( 例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%序列一致性)之胺基酸序列的核苷酸序列。在一些實施例中，如本文所述之多核苷酸可操作連接至異源核酸， 例如異源啟動子。
含有編碼本揭示案之抗體之多核苷酸或其片段的適合載體包括選殖載體及表現載體。雖然所選之選殖載體可根據預期使用之宿主細胞而改變，有用選殖載體通常具有自我複製能力，可具有特定限制性內切核酸酶之單一靶標，且/或可攜帶可用於選擇含有該載體之純系的標記物的基因。實例包括質體及細菌病毒， 例如pUC18、pUC19、Bluescript ( 例如pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA、及穿梭載體諸如pSA3及pAT28。該等及許多其他選殖載體可獲自商業供應商，諸如BioRad、Strategene、及Invitrogen。
表現載體通常為含有本揭示案之核酸的可複製多核苷酸構築體。表現載體可在宿主細胞中複製，呈遊離體形式或作為染色體DNA之整體部分。適合表現載體包括但不限於質體、病毒載體、及任何其他載體，該等病毒載體包括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒。
適用於選殖或表現如本文所述之多核苷酸或載體之宿主細胞包括原核或真核細胞。在一些實施例中，宿主細胞為原核細胞。在一些實施例中，宿主細胞為真核細胞， 例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞。在一些實施例中，宿主細胞為人類細胞， 例如人類胚胎腎(HEK)細胞。
在另一態樣中，提供製成如本文所述之抗PILRA抗體的方法。在一些實施例中，該方法包括在適用於表現抗體之條件下培養如本文所述之宿主細胞( 例如，表現如本文所述之多核苷酸或載體之宿主細胞)。在一些實施例中，隨後自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。 XI. 使用抗PILRA抗體之治療方法
在另一態樣中，提供使用如本文所揭示之抗PILRA抗體( 例如，如以上部分III及V中所述之抗PILRA抗體)之治療方法。在一些實施例中，提供治療神經退化性疾病之方法。在一些實施例中，提供調節一或多種PILRA活性( 例如，患有神經退化性疾病之個體中)之方法。
在一些實施例中，提供治療神經退化性疾病之方法。在一些實施例中，神經退化性疾病選自由以下組成之群：阿茲海默氏病、原發性年齡相關tau蛋白病、進行性核上神經麻痺症(PSP)、額顳葉型失智症、額顳葉型失智症伴與染色體17相關之帕金森症、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮側索硬化症、肌萎縮側索硬化症/關島型帕金森氏症-失智症綜合症(ALS-PDC)、皮質基底核退化症、慢性創傷性腦病、庫賈氏病、拳擊員失智症、擴散性神經原纖維纏結伴鈣化、唐氏症候群、家族性英國型失智症、家族性丹麥型失智症、格施謝三氏症、球狀神經膠tau蛋白病、瓜達洛普帕金森氏病伴失智症、瓜達洛普PSP、哈-斯二氏病、遺傳性彌漫性腦白質病伴失智症(HDLS)、杭丁頓氏病、包涵體肌炎、多系統萎縮症、肌強直性營養不良、Nasu-Hakola病、神經原纖維纏結佔優性失智症、C型尼-皮二氏病、蒼白球-腦橋-黑質變性、帕金森氏病、皮克氏病、腦炎後帕金森氏症、朊病毒蛋白大腦澱粉樣血管病、進行性皮層下神經膠瘤病、亞急性硬化性全腦炎、及僅纏結性失智症。在一些實施例中，神經退化性疾病為阿茲海默氏病。在一些實施例中，神經退化性疾病為Nasu-Hakola病。在一些實施例中，神經退化性疾病為額顳葉型失智症。在一些實施例中，神經退化性疾病為帕金森氏病。在一些實施例中，該方法包含向該個體投與特異性結合至hPILRA蛋白之經單離抗體( 例如如本文所述之抗PILRA抗體)或包含如本文所述之抗PILRA抗體的醫藥組成物。
在一些實施例中，如本文所述之抗PILRA抗體(或其抗原結合部分或醫藥組成物)用於治療特徵在於PILRA活性的神經退化性疾病。在一些實施例中，特徵在於PILRA活性之神經退化性疾病為阿茲海默氏病。
在一些實施例中，提供調節個體中( 例如，患有神經退化性疾病之個體中)之一或多種PILRA活性之方法。在一些實施例中，該方法包含拮抗或減少PILRA活性， 例如阻斷配位體與hPILRA之結合，改變一或多個下游蛋白質之磷酸化( 例如，增加EGFR或STAT3之磷酸化；降低STAT1之磷酸化)，升高細胞呼吸、脂肪酸代謝( 例如，脂肪酸氧化)及ATP產生，增強細胞遷移，增加抗炎基因或蛋白質表現，及/或減少細胞介素蛋白質表現。因此，在另一態樣中，提供了拮抗 例如患有神經退化性疾病之個體之PILRA活性的方法。在一些實施例中，調節個體中之一或多種PILRA活性的方法包含向該個體投與特異性結合至人類hPILRA蛋白之經單離抗體或其抗原結合部分( 例如，如本文所述之抗PILRA抗體)或包含如本文所述之抗PILRA抗體的醫藥組成物。
在一些實施例中，欲治療個體為人類， 例如人類成人或人類兒童。
在一些實施例中，提供減少患有神經退化性疾病之個體中之斑塊積聚的方法。在一些實施例中，該方法包含向個體投與如本文所述之抗體或醫藥組成物。在一些實施例中，個體患有阿茲海默氏病。在一些實施例中，個體為神經退化性疾病之動物模型( 例如，5XFAD或APP/PS1小鼠模型)。在一些實施例中，斑塊積聚藉由澱粉樣蛋白斑塊攝影及/或Tau攝影， 例如使用正電子發射斷層攝影(PET)掃描來量測。在一些實施例中，投與抗PILRA抗體使斑塊積聚與基線值( 例如，在投與抗PILRA抗體前個體中之斑塊積聚水準)相比減少至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%。
在一些實施例中，向個體投與治療有效量或劑量之抗PILRA抗體。然而，該等劑量可根據若干種因素而變化，該等因素包括所選投與路徑、組成物之調配、患者反應、病狀之嚴重性、個體體重、及處方醫師之判斷。劑量可隨時間推移按個別患者所要求而增強或減小。在某些情況下，最初向患者給予低劑量，然後增加至患者可耐受之有效劑量。有效量之確定完全在熟習此項技術者之能力範圍內。
如本文所述之抗PILRA抗體之投與路徑可為經口、腹膜內、經皮、皮下、靜脈內、肌肉內、鞘內、吸入、局部、病灶內、直腸、支氣管內、經鼻、經黏膜、腸內、眼部或經耳遞送、或此項技術中已知之任何其他方法。在一些實施例中，抗體係經口、靜脈內或腹膜內投與。
在一些實施例中，向個體投與抗PILRA抗體(及視情況另一種治療劑)延長時間段， 例如達至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350日或更長時間。 XII. 醫藥組成物及套組
在另一個態樣中，提供包含特異性結合到hPILRA蛋白之抗體之醫藥組成物及套組。在一些實施例中，該等醫藥組成物及套組係用於治療神經退化性疾病。在一些實施例中，醫藥組成物及套組係用於調節( 例如，增強或抑制)一或多種PILRA活性， 例如EGFR、STAT3、及/或STAT1磷酸化。 醫藥組成物
在一些實施例中，提供包含抗PILRA抗體之醫藥組成物。在一些實施例中，抗PILRA抗體為如以上部分III所描述之抗體。
在一些實施例中，醫藥組成物包含如本文所述之抗PILRA抗體且進一步包含一或多種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容且不干擾或以其他方式抑制活性劑活性之任何溶劑、分散介質、或包衣劑。各種醫藥學上可接受之賦形劑為此項技術中熟知的。
在一些實施例中，載劑適用於靜脈內、肌肉內、經口、腹膜內、鞘內、經皮、局部、或皮下投與。醫藥學上可接受之載劑可含有一或多種生理學上可接受之化合物，其例如用於使組成物穩定或增強或減少活性劑之吸收。生理學上可接受之化合物可包括例如碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、或葡聚糖；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或麩胱甘肽；螯合劑；低分子量蛋白；減小活性劑之清除率或水解之組成物；或賦形劑；或其他穩定劑及/或緩衝劑。其他醫藥學上可接受之載劑及其調配物為此項技術中熟知的。
本文所述之醫藥組成物可以熟悉此項技藝者已知之方式， 例如藉助於習知混合、溶解、粒化、糖衣錠製備、乳化、囊封、覆埋或凍乾製程來製造。以下方法及賦形劑僅為示範性的且絕非限制性。
對於經口投與，抗PILRA抗體可藉由將其與此項技術中熟知之醫藥學上可接受之載劑組合來調配。此類載劑允許將該等化合物調配為錠劑、丸劑、糖衣錠、膠囊、乳液、親脂性及親水性懸浮液、液體、凝膠、糖漿、漿料、懸浮液及其類似者，用於所治療之患者經口攝取。經口使用之醫藥製劑可藉由將化合物與固體賦形劑混合、視情況研磨所得混合物、且需要時在加入合適助劑後加工顆粒混合物來獲得以獲得錠劑或糖衣丸核心。適合賦形劑包括例如填充劑，諸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纖維素製劑，諸如玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、及/或聚乙烯基吡咯啶酮(PVP)。需要時，可添加崩解劑，諸如交聯聚乙烯基吡咯啶酮、瓊脂、或海藻酸或其鹽如海藻酸鈉。
抗PILRA抗體可經調配用於藉由注射， 例如藉由團式注射或連續輸注進行非經腸投藥。對於注射，可藉由將該或該等化合物溶解、懸浮或乳化於水性或非水性溶劑(諸如植物油或其他類似油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸之酯或丙二醇)中；及必要時連同習知添加劑(諸如增溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑及防腐劑)一起而將其調配為製劑。在一些實施例中，化合物可於水溶液中， 例如於生理學上相容之緩衝液(諸如漢克斯氏溶液(Hankss)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理食鹽水緩衝液)中調配。用於注射之調配物可在添加防腐劑的情況下以單位劑形， 例如在安瓿或多劑量容器中呈現。組成物可採用諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。
通常，用於 活體內投與之醫藥組成物係無菌的。滅菌可根據此項技術中已知之方法完成，該等方法 例如熱滅菌、蒸汽滅菌、無菌過濾、或輻射。
本揭示案之醫藥組成物的劑量及所要藥物濃度可視預期之特定用途而變化。適當劑量或投藥路徑之確定完全在熟悉此項技藝者之技能範圍內。適合劑量亦描述於以上中。 套組
在一些實施例中，提供包含抗PILRA抗體之套組。在一些實施例中，抗PILRA抗體為如以上部分III及V中所述之抗體。
在一些實施例中，該套組進一步包含一或多種額外治療劑。舉例而言，在一些實施例中，該套組包含如本文所述之抗PILRA抗體且進一步包含用於治療神經退化性疾病 例如阿茲海默氏病之一或多種額外治療劑。在一些實施例中，治療劑為用於治療神經退化性疾病之認知或行為症狀之藥劑( 例如，抗抑鬱藥、多巴胺促效劑、或抗精神病藥)。在一些實施例中，治療劑為神經保護劑( 例如，卡比多巴/左旋多巴、抗膽鹼劑、多巴胺激導性劑、單胺氧化酶B (MAO-B)抑制劑、兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)抑制劑、谷胺酸激導性劑、組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、大麻素、半胱天冬酶抑制劑、抑黑素、抗炎劑、激素( 例如，雌激素或孕酮)、或維生素)。
在一些實施例中，套組包含如本文所述之抗PILRA抗體且進一步包含用於量測抗PILRA抗體誘導活性( 例如，用於量測EGFR、STAT3、及/或STAT1磷酸化)之一或多種試劑。
在一些實施例中，套組進一步包含含有用於實踐本文所述之方法之指南( 亦即，方案)的說明性材料( 例如，用於使用套組進行如以上所述之治療方法的說明書)。雖然說明性材料通常包含書寫或列印材料，但其不限於此類材料。本揭示案涵蓋能夠存儲此類說明書且向最終使用者傳達該等說明之任何介質。此類介質包括但不限於電子存儲介質( 例如，磁盤、磁帶、磁匣、晶片)、光學介質( 例如，CD-ROM)等。此類介質可包括提供此類說明性材料之網際網路網站地址。 實例
本揭示案將藉助於特定實例更詳細地加以描述。提供以下實例以僅達成說明性目的，且不欲以任何方式限制本揭示案。 實例1 - HEK293細胞中PILRA及PILRB結合之評估 HEK293 細胞中之PILRA結合
將表現hPILRA G78之HEK293細胞(亦稱為「HEK PILRA G78細胞」或「HEK PILRA G78細胞」)及表現hPILRB DAP12之HEK 293細胞(「HEK hPILRB DAP12細胞」)單獨地用NucBlue Live ReadyProbes試劑標記且在4℃下旋轉30分鐘。標記後，將母體HEK293細胞與HEK G78細胞混合，同時將表現hPILRA R78之HEK 293細胞(亦稱為「HEK PILRA R78細胞」或「HEK PILRA R78細胞」)單獨地與HEK hPILRB DAP12細胞混合。然後，在4℃下在旋轉下使用FACS稀釋劑(PBS、0.2% FBS、1mM EDTA)，將此等細胞與各種濃度之抗PILRA或同型對照抗體一起培育30分鐘。然後，將細胞用FACS稀釋劑洗滌兩次且在4℃下在260 rpm下與Alexa Fluor 647結合抗人類IgG一起培育30分鐘。最後，將細胞洗滌一次，且藉由FACS使用BD FACS Canto II來偵測抗體結合。中值螢光強度(MFI)來源於用FLOJO軟體進行之資料分析(圖1A-1C)。下表1列出實例中使用之各抗PILRA抗體。 表1
抗PILRA抗體與在HEK293細胞(圖1B及1C)上表現之人類PILRA G78 (常見變異體)及PILRA R78 (AD保護變異體)之結合表明某些抗體之細胞表面目標接合( 例如，Ab CL 1、Ab CL 2、及Ab CL 4)。缺少抗PILRA抗體( 例如，不具有CD98hc結合之抗體， 例如，Ab CL 1及Ab CL 3)與母體HEK293細胞之結合表明結合之特異性(圖1A)。最後，在高濃度下具有CD98hc結合之抗PILRA抗體與母體HEK293細胞之較低結合(圖1A)並非PILRA驅動的，而是由與CD98hc之結合驅動的( 例如，Ab CL 2及Ab CL 4，及CD98hc:同型對照)。 HEK293 細胞中之PILRB結合
在4℃下在旋轉下將HEK hPILRB DAP12細胞用NucBlue Live ReadyProbes試劑標記30分鐘。在4℃下在旋轉下使用FACS稀釋劑(PBS、0.2% FBS、及1 mM EDTA)，將HEK hPILRA R78及hPILRB DAP12細胞混合，洗滌，且與各種濃度之抗PILRA或同型對照抗體一起培育30分鐘。將細胞用FACS稀釋劑洗滌兩次，在4℃下在旋轉下與Alexa Fluor 647結合抗人類IgG一起培育30分鐘，且洗滌一次。藉由FACS偵測抗體與細胞之結合且中值螢光強度(MFI)來源於用FLOJO軟體進行之資料分析(圖1D)。陽性對照Ab CL (參見表1)為用作陽性對照之PILRB結合抗體。結果表明，PILRA抗體具有PILRA結合之相對良好特異性及與PILRB之較低脫靶結合。
在hPILRA與hPILRB之間存在較高水準之序列相似性。人類PILRB受體功能尚未完全理解。與PILRA相反，它被視為活化受體。因此，人類PILRB結合為潛在脫靶安全性風險。圖5中之序列比對突出人類PILRA上之有限抗原決定基，賦予人類PILRA特異性及食蟹猴PILRA交叉反應性。 CHO 細胞中之PILRA結合
在4℃下在旋轉下，將CHO-K1及cynoPILRA表現CHO細胞用NucBlue Live細胞染色劑染色30分鐘。在4℃下在旋轉下使用FACS稀釋劑(PBS，2% FBS，1 mM EDTA)，將細胞混合，洗滌，且與各種濃度之抗PILRA或同型對照抗體一起培育30分鐘。將細胞用FACS稀釋劑洗滌兩次且在4℃下在旋轉下，與Alexa Fluor 647結合抗人類IgG一起培育30分鐘。經由BD FACS Canto II來偵測抗體與細胞之結合且在經由FLOJO及PRISM軟體來分析結果之後，得到中值螢光強度(MFI) (圖2A及2B)。將細胞株重複運行兩次以考慮到內部變化性。結果指示某些抗體，包括具有CD98hc結合能力之彼等抗體( 例如，Ab CL 2及Ab CL 4)，能夠特異性結合在CHO細胞上表現之cynoPILRA。
總之，抗PILRA抗體與在CHO-K1細胞上表現之cynoPILRA之結合證明細胞表面目標接合及食蟹猴交叉反應性。CynoPILRA交叉反應性為實現食蟹猴中之抗體安全評估、TE/PK/PD研究的唯一結合性質。 實例2 – 抗PILRA抗體之表徵 結合性質
藉由SPR使用Biacore 8K儀器(表2)來量測抗PILRA抗體與hPILRA、hPILRB、及cynoPILRA細胞外域(ECD)之結合親和力。將抗體捕獲在固定有小鼠抗人類Fab之Biacore™ Series S CM5感測器晶片(來自GE Healthcare之人類Fab捕獲套組)上，隨後以30 μL/分鐘之流速，注射重組ECD試劑之連續3倍稀釋液。使用3分鐘締合隨後10分鐘解離來分析各樣品。各注射後，使用50 mM甘胺酸pH 2.0再生緩衝液來再生感測晶片。使用k on及k off之同時擬合之1:1 Languir模型進行動力學分析。 抗原決定基定位
藉由SPR使用Biacore 8K儀器來鑑別抗PILRA抗體之PILRA結合抗原決定基。將抗PILRA抗體捕獲在固定有小鼠抗人類Fab之Biacore™ Series S CM5感測器晶片(來自GE Healthcare之人類Fab捕獲套組)上，隨後注射1 μM濃度之單一點PILRA至PILRB突變體變異體。 人類PILRA之配位體阻斷
拮抗PILRA之一種可能作用機制為阻斷包括NPDC1、PANP、及HSV gB之已知唾液酸化配位體之結合。與結合更遠端抗原決定基之抗PILRA抗體相比，結合與配位體結合位點G78鄰近之抗原決定基的抗PILRA抗體可能更有效地阻斷(較小)配位體。吾人鑑別阻斷配位體結合之抗PILRA抗體。
藉由SPR使用Biacore 8K儀器來評估抗PILRA抗體之配位體阻斷特性。將抗PILRA抗體捕獲在固定有小鼠抗人類Fab之Biacore™ Series S CM5感測器晶片(來自GE Healthcare之人類Fab捕獲套組)上，隨後注射300 nM重組hPILRA ECD。藉由隨後注射作為PILRA之已知唾液酸化配位體的以下重組PILRA配位體來監測hPILRA-配位體相互作用：hNPDC1 (35-181)、hPANP (76-178)，及HSV gB (23-279)。阻斷配位體與hPILRA之結合表明抗體能夠拮抗hPILRA。
下表2展示抗PILRA抗體與hPILRA G78、hPILRA R78、hPILRB、cynoPILRA、及人類CD98hc之結合親和力。該表亦展示各抗體之結合抗原決定基，以及在表現hPILRA G78、hPILRA R78、hPILRB、或cynoPILRA之HEK293或CHO細胞中量測的EC50結合值。該表亦展示抗體是否阻斷各種所測試配位體。 表2 實例3 – 抗PILRA抗體誘導之傳訊路徑 人類iMicroglia及PILRA LoF iMicroglia中磷酸激酶蛋白活性之評估 – STAT3 Y705
理解PILRA下游傳訊對於鑑別拮抗抗體為至關緊要的。將野生型人類iMicroglia及PILRA功能喪失(LoF) iMicroglia在DIV 72下塗鋪在含有血清之培養基中。24小時後，更換培養基以移除血清並72小時後，使細胞裂解。使用蛋白質組剖析器人類磷酸-激酶陣列套組(ARY003C，R&D Systems)按照手冊說明書來量測磷酸激酶水準pSTAT3 Y705 (圖3A)。結果表明，PILRA功能喪失增強iMicroglia中之STAT3傳訊。 表現hPILRA G78或R78之HEK293細胞中抗PILRA抗體下游傳訊之評估 – STAT3 Y705
在低血清條件(1%胎牛血清)下，將HEK293細胞、人類PILRA G78表現HEK293細胞、或人類PILRA R78表現HEK293細胞用抗PILRA抗體(＜200 nM)劑量滴定30分鐘。將細胞用4%冰冷多聚甲醛固定且使用標準免疫細胞化學方案( 亦即，自動染色機器人)，針對磷酸-STAT3 (Y705)(在本文中亦稱為「pSTAT3 (Y705)」或「pSTAT3 Y705」)進行染色(圖3B)。遵循類似方案，亦將hPILRA R78表現HEK293細胞用抗PILRA抗體進行劑量滴定且針對pSTAT3 Y705進行染色(圖3C)。用共焦顯微鏡對細胞攝影且在Harmony軟體中分析影像以計算每個細胞之平均螢光光斑面積。資料表示為相對於同型對照背景之平均值+/-SD倍數表現，n=2個實驗。結果表明PILRA抗體，包括具有CD98hc結合能力之彼等抗體，在PILRA G78表現細胞(圖3B)及PILRA R78表現細胞(圖3C)中誘導磷酸-STAT3 (Y705)傳訊。圖3D進一步展示在母體HEK293細胞中，相同PILRA抗體未誘導pSTAT3 Y705。
表3列出展示hPILRA G78表現或R78表現HEK293細胞中各抗體之pSTAT3 Y705 (規範)及pSTAT3 S727 (非規範)之誘導的nM效力的EC50值。磷酸化STAT3 (S727)(在本文中亦稱為「pSTAT3 (S727)」或「pSTAT3 S727」)之誘導的評估以與上文對於pSTAT3 Y705所述類似的方式來執行。在hPILRA G78表現及hPILRA R78表現HEK293細胞中，而非在母體HEK293細胞中，磷酸化STAT3 Y705及STAT3 S727之誘導證明特定PILRA依賴性下游傳訊。此外，對於同型對照抗體之傳訊誘導之缺乏證明PILRA選擇性及特異性。 表3
抗體CL STAT3 Y705 (EC50) STAT3 S727 (EC50)
huPILRA G78 HEK huPILRA R78 HEK huPILRA G78 HEK huPILRA R78 HEK
Ab CL 1 13 nM 1.9 nM 7.0 nM 3.1 nM
Ab CL 2 18 nM 3.0 nM 6.6 nM 6.4 nM
Ab CL 3 17 nM 2.6 nM 18 nM 5.7 nM
Ab CL 4 16 nM 3.1 nM 7.3 nM 3.3 nM
Ref. Ab CL 1.5 nM 1.3 nM 9.6 nM 1.2 nM
無CD98hc結合之同型對照 N/A N/A N/A N/A
在一些實施例中，hPILRA R78或G78表現HEK293細胞中pSTAT3 (Y705)及/或pSTAT3 (S727)之劑量反應性誘導可用於基於效力及最大效應來將拮抗性抗體分級。
總之，如結果展示，給予抗PILRA抗體之野生型及PILRA LoF iMicroglia中STAT3之磷酸化狀態的基礎變化提示此等途徑在PILRA下游，此為先前未認識到的與PILRA生物學相關之顯著發現。在一些實施例中，拮抗性抗PILRA抗體以與PILRA LoF類似的方式調節此pSTAT3傳訊效應。 實例4 – PILRA對於IMICROGLIA中之抗炎表型的效應
理解 活體外人類iMicroglia中之PILRA依賴性功能可有助於預測 活體內功能。調節發炎狀態可在神經退化性疾病中為有益的。對PILRA功能喪失(LoF) iMicroglia功能進行表型複製之抗PILRA抗體被分類為功能拮抗劑。為了評估PILRA依賴性轉錄變化，將野生型iMicroglia及PILRA LoF iMicroglia塗鋪在含有血清之培養基中。24小時後，更換培養基以移除血清 72小時後，添加脂多醣/內毒素(LPS，10 ng/ml)或媒劑以刺激細胞介素反應。LPS處理後24小時收集細胞並自獲自相同分化批次之野生型iMicroglia或PILRA LoF iMicroglia的5個獨立收穫物(DIV 59、63、70、73、77)中單離RNA。對於每個收穫物之各條件，將兩個技術重複彙集。
為了評估LPS誘導之PILRA依賴性促炎性細胞介素分泌，在DIV53下，將野生型iMicroglia及PILRA LoF iMicroglia塗鋪在含有血清之培養基中。24小時後，更換培養基以移除血清且向野生型細胞給予抗體(100 nM)。72小時後，添加LPS (10 ng/ml)以刺激細胞介素反應。LPS處理後24小時收集上清液並在商業炎性組套組(人類促炎性(4重) MSD及人類IP-10 MSD，Meso Scale Discovery)上運行。資料表示為平均值+/- SEM，n=3個技術重複。
對於LPS誘導之轉錄變化，相對於野生型iMicroglia，PILRA LoF抑制PILRA LoF iMicroglia中LPS誘導之TNF及CXCL10基因表現(圖4A及4B)。對於LPS誘導之細胞介素分泌的變化，相對於野生型iMicroglia，PILRA LoF抑制PILRA LoF iMicroglia中LPS誘導之TNFα及IP-10分泌(圖4C及4D)。
另外，抗PILRA抗體，包括具有CD98hc結合能力之彼等抗體( 例如，Ab CL 2)，能夠減弱野生型iMicroglia中LPS誘導之IP-10及TNFα細胞介素分泌，模仿在PILRA LoF iMicroglia中觀察到之表型(圖4E及4F)。此外，對於同型對照抗體之表型之缺乏證明特異性。
此實例展示抗PILRA抗體刺激野生型iMicroglia中之IL1RA細胞介素分泌，模仿在PILRA LoF iMicroglia中觀察到之表型。此外，抗PILRA抗體減弱具有內源性水準之hPILRA之野生型iMicroglia及iPSC衍生性iMicroglia中LPS誘導之細胞介素分泌。總之，抗PILRA抗體，包括具有CD98hc結合能力之彼等( 例如，Ab CL 2)，促成抗炎表型。 實例5 – 抗PILRA抗體之藥物動力學概況
為了評估 活體內抗PILRA抗體之藥物動力學概況，產生含有包括PILRA基因之人類基因體序列的BAC基因轉殖(BACtg)小鼠。藉由將BAC純系CTD-2110B7顯微注射至來自C57BL/6J (JAX庫存編號000664)品系之胚胎中來產生此等小鼠。此BAC純系含有整個人類PILRA (R78版本)及PILRB編碼區及其調控元件，並確認此模型中人類PILRA之表現。
經由靜脈內注射(IV)，向人類PILRA BACtg小鼠給予50 mg/kg抗體Ab CL 1或Ab CL 2一次。在指示時間點獲得血漿及腦部樣品。使用基於MSD (Meso Scale Discovery)之平台夾心電化學發光免疫檢定來量化小鼠血漿及腦部裂解物中抗體Ab CL 1及Ab CL 2之總濃度。如圖6A展示，由於外圍中與CD98hc之差異結合，在Ab CL 1與Ab CL 2之間觀察到全身暴露之差異。如圖6B展示，PK概況展現相對於不結合至CD98hc之Ab CL 1，結合至CD98hc之Ab CL 2接近腦部之能力。與Ab CL 1相比，Ab CL 2表現出腦部中超過七倍更高暴露。
此實例表明相對於缺少CD98hc結合能力之抗PILRA抗體Ab CL 1，具有CD98hc結合能力之抗PILRA抗體Ab CL 2表現出全身及腦部暴露之差異。在腦部，Ab CL 2之更高藥物暴露藉由CD98hc目標接合及橫跨BBB之遞送來實現或促進。 實例6 – 抗PILRA抗體之定位
向表現人類PILRA之人類PILRA BACtg小鼠(如上實例5所述)靜脈內投與單一劑量之媒劑或50 mg/kg Ab CL 2 (具有CD98hc結合能力之抗PILRA抗體)且在第7天分解以收穫組織。PBS灌注後，將腦部切開且固定在4% PFA中，然後在蔗糖溶液中平衡，然後以40 μm之厚度切片以進行Iba1、NeuN、及抗huIgG染色。使用Leica SP8 Lightning共焦顯微鏡獲得腦部影像，且將Iba1陽性及NeuN陽性細胞表面上之huIgG信號定量。資料表示為平均值+/- SEM，n=4-5，混合性別。
在人類PILRA BACtg腦部中，Iba1陽性小神經膠質細胞表面及NeuN陽性神經元表面上之huIgG信號之量測結果展示抗PILRA抗體(huIgG)定位在小神經膠質細胞上(圖7A)，而非在神經元上(圖7B)，指示 活體內CD98hc目標接合。媒劑組中之HuIgG信號指示背景。 實例7 – 在活體外小神經膠質細胞中之脂質微滴形成
將野生型、PILRA LoF及PILRA LoF+OE iMicroglia細胞以15k/孔之密度塗鋪在預塗佈96孔板上含有血清之培養基中。24小時後，更換培養基以移除血清92小時後，使用來自Thermo Fisher Scientific之BODIPYTM 493/503中性脂質檢定使用製造商說明書來評定脂質微滴積聚。資料表示為平均值+/- SEM，n=3-6個技術重複。
如圖8展示，與野生型小神經膠質細胞相比，PILRA LoF (PILRA KO)小神經膠質細胞表現出脂質微滴積聚增加(n=6個實驗)。此外，KO細胞中PILRA之互補(PILRA KO + OE)將脂質微滴減少至野生型水準(n=3個實驗)。 實例8 – 抗PILRA抗體對於活體內小神經膠質細胞之脂質代謝之效應
向表現人類PILRA之人類PILRA BACtg小鼠(如上實例5所述)靜脈內投與單一劑量之媒劑或50 mg/kg Ab CL 2 (具有CD98hc結合能力之抗PILRA抗體)且在第7天分解以收穫組織。使用成人腦解離套組(Miltenyi Biotec)，將腦部組織解離至單一細胞懸浮液中，隨後染色及FACS分選。將約30,000個CD11+小神經膠質細胞直接分選至含有替代內部標準(脂質及代謝物)之400 μl甲醇中以進行LCMS分析。資料表示為平均值+/- SEM，n=6，混合性別。
在50 mg/kg之單一劑量後第7天，抗PILRA抗體(Ab CL 2)顯著增加小神經膠質細胞中之磷脂合成相關MG及DG脂質，指示 活體內抗PILRA抗體之脂質儲存增加(圖9A及9B)。另外， 活體內小神經膠質細胞中，與抗炎相關之縮醛磷脂(PE(P-18:0/18:1))、焦麩胺酸、及苯丙胺酸藉由Ab CL 2上調(圖9C-9E)。由於Ab CL 2投與所導致的脂質及代謝物升高與小神經膠質細胞中用PILRA LoF所觀察到的脂質液滴積聚增加一致(實例7，圖8)，證明期望的藥效動力學反應由抗PILRA抗體 活體內誘導。 非正式序列表
SEQ ID NO 序列 描述
1 MGRPLLLPLLPLLLPPAFLQPSGSTGSGPSYLYGVTQPKHLSASMGGSVEIPFSFYYPWELATAPDVRISWRRGHFHGQSFYSTRPPSIHKDYVNRLFLNWTEGQKSGFLRISNLQKQDQSVYFCRVELDTRSSGRQQWQSIEGTKLSITQAVTTTTQRPSSMTTTWRLSSTTTTTGLRVTQGKRRSDSWHISLETAVGVAVAVTVLGIMILGLICLLRWRRRKGQQRTKATTPAREPFQNTEEPYENIRNEGQNTDPKLNPKDDGIVYASLALSSSTSPRAPPSHRPLKSPQNETLYSVLKA 人類PILRA (hPILRA)蛋白
2 MGRPLLLPLLLPLLPLLLPPAFLQPGGSAGSGPSGPYGVTQRKHLSAPMGGSVEIPFSFYHPWELAAAPNMKISWRRGNFHGEFFYRTRPAFIHEDYSNRLLLNWTEGQDRGLLRIWNLRKEDQSVYFCRVELDTRRSGRQRWQSIEGTKLTITQAVTTTTQRPSSMTTTRRPSSATTTAGLRVTQGKRHSDSWHLSLKTAVGVTVAVAVLGIMILGLICLLRWRRRKGQQRTKATTPAKEPFQNTEEPYENIRNEGQNTDPKPNPKDDGIVYASLALSSSTSPRVPPSHHPLKSPQNETLYSVLKV 食蟹猴PILRA (cynoPILRA)蛋白
3 MGRPLLLPLLLLLQPPAFLQPGGSTGSGPSYLYGVTQPKHLSASMGGSVEIPFSFYYPWELAIVPNVRISWRRGHFHGQSFYSTRPPSIHKDYVNRLFLNWTEGQESGFLRISNLRKEDQSVYFCRVELDTRRSGRQQLQSIKGTKLTITQAVTTTTTWRPSSTTTIAGLRVTESKGHSESWHLSLDTAIRVALAVAVLKTVILGLLCLLLLWWRRRKGSRAPSSDF 人類PILRB (hPILRB)蛋白
4 MGRPLLLPLLPLLLPPAFLQPSGSTGSGPSYLYGVTQPKHLSASMGGSVEIPFSFYYPWELATAPDVRISWRRGHFHRQSFYSTRPPSIHKDYVNRLFLNWTEGQKSGFLRISNLQKQDQSVYFCRVELDTRSSGRQQWQSIEGTKLSITQAVTTTTQRPSSMTTTWRLSSTTTTTGLRVTQGKRRSDSWHISLETAVGVAVAVTVLGIMILGLICLLRWRRRKGQQRTKATTPAREPFQNTEEPYENIRNEGQNTDPKLNPKDDGIVYASLALSSSTSPRAPPSHRPLKSPQNETLYSVLKA 人類PILRA蛋白(R78)
5 MELQPPEASIAVVSIPRQLPGSHSEAGVQGLSAGDDSELGSHCVAQTGLELLASGDPLPSASQNAEMIETGSDCVTQAGLQLLASSDPPALASKNAEVTGTMSQDTEVDMKEVELNELEPEKQPMNAASGAAMSLAGAEKNGLVKIKVAEDEAEAAAAAKFTGLSKEELLKVAGSPGWVRTRWALLLLFWLGWLGMLAGAVVIIVRAPRCRELPAQKWWHTGALYRIGDLQAFQGHGAGNLAGLKGRLDYLSSLKVKGLVLGPIHKNQKDDVAQTDLLQIDPNFGSKEDFDSLLQSAKKKSIRVILDLTPNYRGENSWFSTQVDTVATKVKDALEFWLQAGVDGFQVRDIENLKDASSFLAEWQNITKGFSEDRLLIAGTNSSDLQQILSLLESNKDLLLTSSYLSDSGSTGEHTKSLVTQYLNATGNRWCSWSLSQARLLTSFLPAQLLRLYQLMLFTLPGTPVFSYGDEIGLDAAALPGQPMEAPVMLWDESSFPDIPGAVSANMTVKGQSEDPGSLLSLFRRLSDQRSKERSLLHGDFHAFSAGPGLFSYIRHWDQNERFLVVLNFGDVGLSAGLQASDLPASASLPAKADLLLSTQPGREEGSPLELERLKLEPHEGLLLRFPYAA 人類CD98hc
6 TTQRPSSM hPILRA之莖1區域
7 QGKRR hPILRA之莖2區域
8 QGKR hPILRA之莖2區域
9 QGKRH cynoPILRA之莖2區域
10 GYTFTEYYMY CDR-H1 Ab CL 1-4
11 RIDPEDGGTD CDR-H2 Ab CL 1-4
12 TIRGTVFAF CDR-H3 Ab CL 1-4
13 RASEDIFNGLA CDR-L1 Ab CL 1-4
14 NAKTLHT CDR-L2 Ab CL 1-4
15 QQYYDYPLT CDR-L3 Ab CL 1-4
16 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYYMYWVRQAPGQGLELIGRIDPEDGGTDYIEKFKNRVTLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCATTIRGTVFAFWGQGTLVTVSS V HAb CL 1及2
17 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIFNGLAWYQQKPGKSPKLLIYNAKTLHTGVPSRFSGSGSGSDYTLTISSLQPEDFATYFCQQYYDYPLTFGQGTKVEIK V LAb CL 1及2
18 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYYMYWVRQAPGQGLELIGRIDPEDGGTDYIEKFKNRVTLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCATTIRGTVFAFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWNSRFVLENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGEIFACNVYHEALHNHYTFKNLALSPGK 重鏈1 Ab CL 2
19 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYYMYWVRQAPGQGLELIGRIDPEDGGTDYIEKFKNRVTLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCATTIRGTVFAFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 重鏈2 Ab CL 2
20 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIFNGLAWYQQKPGKSPKLLIYNAKTLHTGVPSRFSGSGSGSDYTLTISSLQPEDFATYFCQQYYDYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 輕鏈1及輕鏈2 Ab CL 1及2
21 EVQLQQSGPELQRPGASVKLSCKASGYTFTEYYMYWVKQRPKQGLELIGRIDPEDGGTDYIEKFKNKATLTADTSSNTAYMQLSSLTSEDTATYFCATTIRGTVFAFWGQGTLVTVSS V HAb CL 3及4
22 DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRASEDIFNGLAWYQQKPGKSPHLLIYNAKTLHTGVPSRFSGSGSGSQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYDYPLTFGSGTKLEIK V LAb CL 3及4
23 EVQLQQSGPELQRPGASVKLSCKASGYTFTEYYMYWVKQRPKQGLELIGRIDPEDGGTDYIEKFKNKATLTADTSSNTAYMQLSSLTSEDTATYFCATTIRGTVFAFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWNSRFVLENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGEIFACNVYHEALHNHYTFKNLALSPGK 重鏈1 Ab CL 4
24 EVQLQQSGPELQRPGASVKLSCKASGYTFTEYYMYWVKQRPKQGLELIGRIDPEDGGTDYIEKFKNKATLTADTSSNTAYMQLSSLTSEDTATYFCATTIRGTVFAFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 重鏈2 Ab CL 4
25 DIQMTQSPASLSASLGETVTIECRASEDIFNGLAWYQQKPGKSPHLLIYNAKTLHTGVPSRFSGSGSGSQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYDYPLTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 輕鏈1及輕鏈2 Ab CL 3及4
26 GYTFIGFYIH CDR-H1 Ab CL 5
27 WINPESGDTT CDR-H2 Ab CL 5
28 GNWNFPDTFDF CDR-H3 Ab CL 5
29 RSSQSISIYLN CDR-L1 Ab CL 5
30 VASSLQS CDR-L2 Ab CL 5
31 QQSYSAPFT CDR-L3 Ab CL 5
32 QVQLVQSGAEVKKPGASVRVSCKASGYTFIGFYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPESGDTTYAQKFQGRVTMTTDTSINTAYMDLNRLRSDDSAVYFCARGNWNFPDTFDFWGQGTMVIVSS V HAb CL 5
33 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSISIYLNWHQQIPGKAPKLLIYVASSLQSGIPSRFSGRGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPFTFGPGTKVDIK V LAb CL 5
34 QVQLVQSGAEVKKPGASVRVSCKASGYTFIGFYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPESGDTTYAQKFQGRVTMTTDTSINTAYMDLNRLRSDDSAVYFCARGNWNFPDTFDFWGQGTMVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESYGTEWVNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 重鏈1 Ab CL 5
35 QVQLVQSGAEVKKPGASVRVSCKASGYTFIGFYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPESGDTTYAQKFQGRVTMTTDTSINTAYMDLNRLRSDDSAVYFCARGNWNFPDTFDFWGQGTMVIVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 重鏈2 Ab CL 5
36 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSISIYLNWHQQIPGKAPKLLIYVASSLQSGIPSRFSGRGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 輕鏈1及輕鏈2 Ab CL 5
37 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYYMYWVRQAPGQGLELIGRIDPEDGGTDYIEKFKNRVTLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCATTIRGTVFAFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 重鏈1及重鏈2 Ab CL 1
38 EVQLQQSGPELQRPGASVKLSCKASGYTFTEYYMYWVKQRPKQGLELIGRIDPEDGGTDYIEKFKNKATLTADTSSNTAYMQLSSLTSEDTATYFCATTIRGTVFAFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 重鏈1及重鏈2 Ab CL 3
39 GYSITSDYAWN 無CD98hc結合之CDR-H1同型對照
40 YMSYSGSTRYNPSLRSRVTISVDTSKN 無CD98hc結合之CDR-H2同型對照
41 GWPLAY 無CD98hc結合之CDR-H3同型對照
42 SASSSVSYMY 無CD98hc結合之CDR-L1同型對照
43 DTSNLAS 無CD98hc結合之CDR-L2同型對照
44 QQWSSYPPIT 無CD98hc結合之CDR-L3同型對照
45 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYMSYSGSTRYNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGWPLAYWGQGTLVTVSS 無CD98hc結合之V H同型對照
46 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQWSSYPPITFGQGTKVEIK 無CD98hc結合之V L同型對照
47 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYMSYSGSTRYNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGWPLAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 無CD98hc結合之重鏈1及重鏈2同型對照
48 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYMSYSGSTRYNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGWPLAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWNSRFVLENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGEIFACNVYHEALHNHYTFKNLALSPGK 重鏈1 CD98hc:同型對照
49 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYAWNWIRQPPGKGLEWIGYMSYSGSTRYNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGWPLAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 重鏈2 CD98hc:同型對照
50 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQWSSYPPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 無CD98hc結合之輕鏈1及輕鏈2同型對照，CD98hc:同型對照
51 QVTLKESGPGMLQPSQTLSLACSFSGFSLNSFGVAVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKSYNPALKSRLTISKDTSKNQVFLKLANVDTADTATYYCTRIADYGNHFDYWGQGTALTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 重鏈1及重鏈2 Ref. Ab CL
52 DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNSHVWLSWYQQKPGNIPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISGLQPEDIATYYCQQGQTYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 輕鏈1及輕鏈2 Ref. Ab CL
53 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSNHWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHYGTTDYNPSLQSRVTISVDKSKNQFSLKLTSVTAADTAVYFCARGLRDYYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 重鏈1及重鏈2 Ab CL
54 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 輕鏈1及輕鏈2 Ab CL
55 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 野生型人類Fc序列
56 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH2域序列
57 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CH3域序列
58 EPKSCDKTHTCPPCP 人類IgG1鉸鏈
59 DKTHTCPPCP 人類IgG1部分鉸鏈
60 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有杵之Fc序列
61 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有臼之Fc序列
62 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有杵LALA PG之Fc序列
63 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有臼LALA PG之Fc序列
64 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVLWNSRFVLENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGEIFACNVYHEALHNHYTFKNLALSPGK LLB2-10-8
65 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWNSRFVLENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGEIFACNVYHEALHNHYTFKNLALSPGK LLB2-10-8杵
66 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWNSRFVLENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGEIFACNVYHEALHNHYTFKNLALSPGK LLB2-10-8杵、LALA、及PG
67 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVLWNSRFVLENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGEIFACNVYHEALHNHYTFKNLALSPGK LLB2-10-8臼
68 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWNSRFVLENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGEIFACNVYHEALHNHYTFKNLALSPGK LLB2-10-8臼、LALA、及PG
圖1A-1C展示抗PILRA抗體與母體HEK293細胞(圖1A)或過度表現hPILRA之HEK293細胞(圖1B及1C)之結合曲線的圖表。抗PILRA抗體以劑量依賴性方式結合至在HEK293 G78 PILRA OE細胞上表現之hPILRA及HEK293 R78 PILRA OE細胞。資料表示為經由FACS檢定技術獲得之中值螢光強度螢光。 圖1D為抗PILRA抗體與表現hPILRB-DAP12之HEK293細胞的結合曲線的圖表。抗PILRA抗體不結合至表現hPILRB-DAP12之HEK293細胞。 圖2A及2B為抗PILRA抗體與母體CHO K1細胞(圖2A)或表現cynoPILRA之CHO細胞(圖2B)之結合曲線的圖表。抗PILRA抗體結合至表現cynoPILRA之CHO細胞。不結合至母體CHO-K1細胞。 圖3A為繪示在野生型人類iMicroglia及PILRA功能喪失(LoF) iMicroglia中之STAT3 Y705表現的條形圖。在無血清介質中，與野生型人類iMicroglia相比，PILRA LoF iMicroglia具有增加水準之磷酸化STAT3 Y705。圖表將超過背景之光斑強度表現展示為平均值+/-SEM。N=2個技術重複。P＞0.01，雙向ANOVA。 圖3B及3C為在表現hPILRA之HEK293細胞中，用於磷酸化STAT3 (Y705)表現之抗PILRA抗體之劑量曲線的圖表。在表現hPILRA G78 (圖3B)或R78 (圖3C)之HEK293細胞中觀察到pSTAT3 Y705之劑量依賴性誘導。對於表現hPILRA G78或R78之HEK293細胞進行抗PILRA抗體劑量滴定且在30分鐘後量測pSTAT3 Y705誘導。EC50值展示各抗體之pSTAT3 Y705之誘導的nM效力。資料表示為相對於同型對照之平均值+/-SD倍數表現，n=2個實驗。 圖3D為HEK293細胞中用於磷酸化STAT3 (Y705)表現之抗PILRA抗體之劑量曲線的圖表。抗PILRA抗體不誘導母體HEK293細胞中之pSTAT3 Y705。 圖4A及4B為展示野生型及PILRA LoF iMicroglia細胞中LPS誘導之基因表現變化的條形圖。相對於野生型iMicroglia，在PILRA LoF iMicroglia中，PILRA LoF抑制TNF (圖4A)及CXCL10 (圖4B)之LPS誘導基因表現變化。資料表示為平均值+/- SEM，n=3個技術重複。 圖4C及4D為展示野生型及PILRA LoF iMicroglia細胞中LPS誘導之細胞介素表現變化的條形圖。相對於野生型iMicroglia，在PILRA LoF iMicroglia中，PILRA LoF抑制TNFα (圖4C)及IP-10 (圖4D)中LPS誘導之細胞介素表現變化。資料表示為平均值+/- SEM，n=3個技術重複。 圖4E及4F為展示在抗PILRA抗體存在下野生型iMicroglia細胞中LPS誘導之基因表現變化的條形圖。抗PILRA抗體減弱野生型iMicroglia中LPS誘導之IP-10 (圖4E)及TNFα (圖4F)細胞介素分泌，模仿PILRA LoF iMicroglia中觀察到之表型。資料表示為平均值+/- SEM，n=3個技術重複。 圖5展示cynoPILRA、hPILRA、及hPILRB之ECD及莖區域序列之序列比對(位置參考SEQ ID NO:1之序列來確定)。 圖6A及6B展示與不結合至CD98hc之Ab CL 1相比，結合至CD98hc之Ab CL 2之全身及腦部藥物動力學概況。 圖7A及7B展示抗PILRA抗體(huIgG)於小神經膠質細胞上，而非在神經元上之定位，如藉由Iba1陽性小神經膠質細胞表面及NeuN陽性神經元表面上之huIgG信號來量測。媒劑組中之HuIgG信號指示背景。 圖8展示與野生型小神經膠質細胞相比，PILRA LoF小神經膠質細胞表現出脂質微滴積聚增加(n=6個實驗)。KO細胞中PILRA之互補(PILRA KO + OE)將脂質微滴減少至野生型水準(n=3個實驗)。 圖9A及9B展示在 活體內小神經膠質細胞中，抗PILRA抗體Ab CL 2顯著增加磷脂合成相關MG及DG脂質。 圖9C-9E展示在 活體內小神經膠質細胞中，與抗炎相關之縮醛磷脂(PE(P-18:0/18:1))、焦麩胺酸、及苯丙胺酸由Ab CL 2上調。
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Claims (74)

  1. 一種經單離抗體，其包含： (a) 特異性結合至配對免疫球蛋白樣2型受體α (PILRA)之可變區； (b) 第一Fc多肽；及 (c) 第二Fc多肽， 其中該第一Fc多肽經修飾以特異性結合至CD98重鏈(CD98hc)蛋白。
  2. 如請求項1之經單離抗體，其中該抗體特異性結合至該PILRA之G78變異體及該PILRA之R78變異體。
  3. 如請求項2之經單離抗體，其中針對該PILRA之G78變異體之結合親和力及針對該PILRA之R78變異體之結合親和力在彼此50倍內。
  4. 如請求項1至3中任一項之經單離抗體，其中該PILRA為食蟹猴配對免疫球蛋白樣2型受體α (cynoPILRA)。
  5. 如請求項4之經單離抗體，其中針對該cynoPILRA之結合親和力比針對人類配對免疫球蛋白樣2型受體β (hPILRB)之結合親和力強至少2倍。
  6. 如請求項1至3中任一項之經單離抗體，其中該PILRA為人類配對免疫球蛋白樣2型受體α (hPILRA)。
  7. 如請求項1至6中任一項之經單離抗體，其中該可變區包含： (1) CDR-H1序列，其與GYTFTEYYMY (SEQ ID NO:10)之序列包含至少90%序列一致性，或相對於SEQ ID NO:10之序列具有多至兩個胺基酸取代； (2) CDR-H2序列，其與RIDPEDGGTD (SEQ ID NO:11)之序列包含至少90%序列一致性，或相對於SEQ ID NO:11之序列具有多至兩個胺基酸取代； (3) CDR-H3序列，其與TIRGTVFAF (SEQ ID NO:12)之序列包含至少90%序列一致性，或相對於SEQ ID NO:12之序列具有多至兩個胺基酸取代； (4) CDR-L1序列，其與RASEDIFNGLA (SEQ ID NO:13)之序列包含至少90%序列一致性，或相對於SEQ ID NO:13之序列具有多至兩個胺基酸取代； (5) CDR-L2序列，其與NAKTLHT (SEQ ID NO:14)之序列包含至少90%序列一致性，或相對於SEQ ID NO:14之序列具有多至兩個胺基酸取代；及 (6) CDR-L3序列，其與QQYYDYPLT (SEQ ID NO:15)之序列包含至少90%序列一致性，或相對於SEQ ID NO:15之序列具有多至兩個胺基酸取代。
  8. 如請求項7之經單離抗體，其中該等胺基酸取代為保守取代。
  9. 如請求項1至8中任一項之經單離抗體，其中該可變區包含：包含SEQ ID NO:10之序列或相對於SEQ ID NO:10之序列之一或多個保守取代的CDR-H1；包含SEQ ID NO:11之序列或相對於SEQ ID NO:11之序列之一或多個保守取代的CDR-H2；包含SEQ ID NO:12之序列或相對於SEQ ID NO:12之序列之一或多個保守取代的CDR-H3；包含SEQ ID NO:13之序列或相對於SEQ ID NO:13之序列之一或多個保守取代的CDR-L1；包含SEQ ID NO:14之序列或相對於SEQ ID NO:14之序列之一或多個保守取代的CDR-L2；及包含SEQ ID NO:15之序列或相對於SEQ ID NO:15之序列之一或多個保守取代的CDR-L3。
  10. 如請求項1至9中任一項之經單離抗體，其中該可變區包含：包含SEQ ID NO:10之序列之CDR-H1；包含SEQ ID NO:11之序列之CDR-H2；包含SEQ ID NO:12之序列之CDR-H3；包含SEQ ID NO:13之序列之CDR-L1；包含SEQ ID NO:14之序列之CDR-L2；及包含SEQ ID NO:15之序列之CDR-L3。
  11. 如請求項1至10中任一項之經單離抗體，其中該可變區包含與SEQ ID NO:16具有至少85%序列一致性的重鏈可變區(V H)序列。
  12. 如請求項1至11中任一項之經單離抗體，其中該V H序列包含SEQ ID NO:16之序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之經單離抗體，其中該可變區包含與SEQ ID NO:17具有至少85%序列一致性的輕鏈可變區(V L)序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之經單離抗體，其中該V L序列包含SEQ ID NO:17之序列。
  15. 如請求項1至14中任一項之經單離抗體，其中該可變區包含：包含SEQ ID NO:16之V H序列及包含SEQ ID NO:17之V L序列。
  16. 如請求項1至10中任一項之經單離抗體，其中該可變區包含與SEQ ID NO:21具有至少85%序列一致性的重鏈可變區(V H)序列。
  17. 如請求項1至11中任一項之經單離抗體，其中該V H序列包含SEQ ID NO:21之序列。
  18. 如請求項1至12中任一項之經單離抗體，其中該可變區包含與SEQ ID NO:22具有至少85%序列一致性的輕鏈可變區(V L)序列。
  19. 如請求項1至13中任一項之經單離抗體，其中該V L序列包含SEQ ID NO:22之序列。
  20. 如請求項1至14中任一項之經單離抗體，其中該可變區包含：包含SEQ ID NO:21之V H序列及包含SEQ ID NO:22之V L序列。
  21. 如請求項1至15中任一項之經單離抗體，其中該CD98hc蛋白為人類CD98hc蛋白。
  22. 如請求項1至21中任一項之經單離抗體，其中該CD98hc蛋白與LAT1 (SLC7A5)、LAT2 (SLC7A8)、y+LAT1 (SLC7A7)、y+LAT2 (SLC7A6)、Asc-1 (SLC7A10)、或xCT (SLC7A11)形成複合物。
  23. 如請求項22之經單離抗體，其中該CD98hc蛋白與LAT1 (SLC7A5)形成複合物。
  24. 如請求項1至23中任一項之經單離抗體，其中該第一Fc多肽包含與SEQ ID NO:64之序列具有至少90%一致性的序列。
  25. 如請求項1至24中任一項之經單離抗體，其中該第一Fc多肽包含：根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、及位置442處之Ala。
  26. 如請求項1至25中任一項之經單離抗體，其中與具有野生型Fc二聚體之抗體相比，該抗體具有經改良之腦部吸收。
  27. 如請求項26之經單離抗體，其中與具有野生型Fc二聚體之抗體相比，該抗體具有至少兩倍經改良之腦部吸收。
  28. 如請求項29之經單離抗體，其中與具有野生型Fc二聚體之抗體相比，該抗體具有兩倍與七倍之間經改良之腦部吸收。
  29. 如請求項1至28中任一項之經單離抗體，其中根據EU編號，該第一Fc多肽具有T366W取代且該第二Fc多肽具有T366S、L368A、及Y407V取代。
  30. 如請求項1至26中任一項之經單離抗體，其中根據EU編號，該第一Fc多肽具有T366S、L368A、及Y407V取代且該第二Fc多肽具有T366W取代。
  31. 如請求項1至30中任一項之經單離抗體，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含減少效應子功能之修飾。
  32. 如請求項31之經單離抗體，其中該減少效應子功能之修飾包含根據EU編號之位置234處之Ala及位置235處之Ala之取代。
  33. 如請求項31或32之經單離抗體，其中該減少效應子功能之修飾包含位置329處之Gly之取代。
  34. 如請求項1至33中任一項之經單離抗體，其包含： (i) 第一重鏈，其包含：(1)具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的V H序列，及(2)包含用於CD98hc結合之修飾、杵突變、及減少或消除效應子功能之修飾的第一Fc多肽； (ii) 第二重鏈，其包含：(1)具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3之V H序列，及(2)包含臼突變及減少或消除效應子功能之修飾的第二Fc多肽；及 (iii) 第一輕鏈及第二輕鏈，其各自包含具有相應SEQ ID NO:13-15之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3之V L序列。
  35. 如請求項34之經單離抗體，其中： (i) 該第一重鏈包含：(1)具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3且與SEQ ID NO:16具有至少90%一致性的該V H序列，及(2)該第一Fc多肽，其包含根據EU編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、位置442處之Ala、位置366處之Trp、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90%一致性的序列； (ii) 該第二重鏈包含：(1)具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3且與SEQ ID NO:16具有至少90%一致性的該V H序列，及(2)該第二Fc多肽，其包含根據EU編號之T366S、L368A、Y407V、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90%一致性的序列；及 (iii) 該第一輕鏈及該第二輕鏈各自包含具有相應SEQ ID NO:13-15之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3且與SEQ ID NO:17具有至少90%一致性之V L序列。
  36. 如請求項35之經單離抗體，其中： (i) 該第一重鏈包含與SEQ ID NO:18之序列具有至少90%一致性的序列； (ii) 該第二重鏈包含與SEQ ID NO:19之序列具有至少90%一致性的序列；及 (iii) 該第一輕鏈及該第二輕鏈各自包含與SEQ ID NO:20之序列具有至少90%一致性之序列。
  37. 如請求項34之經單離抗體，其中： (i) 該第一重鏈包含：具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3且與SEQ ID NO:21具有至少90%一致性的V H序列，及該第一Fc多肽，其包含根據EU編號來編號之位置380處之Leu、位置382處之Asn、位置384處之Arg、位置385處之Phe、位置386處之Val、位置387處之Leu、位置421處之Glu、位置422處之Ile、位置424處之Ala、位置426處之Asn、位置428處之Tyr、位置438處之Phe、位置440處之Asn、位置442處之Ala、位置366處之Trp、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:66之序列具有至少90%一致性的序列； (ii) 該第二重鏈包含：具有相應SEQ ID NO:10-12之CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3且與SEQ ID NO:21具有至少90%一致性的V H序列，及該第二Fc多肽，其包含根據EU編號來編號之T366S、L368A、Y407V、位置234處之Ala、位置235處之Ala、及位置329處之Gly，及與SEQ ID NO:63之序列具有至少90%一致性之序列；及 (iii) 該第一輕鏈及該第二輕鏈各自包含具有相應SEQ ID NO:13-15之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3且與SEQ ID NO:22具有至少90%一致性之V L序列。
  38. 如請求項35之經單離抗體，其中： (i) 該第一重鏈包含與SEQ ID NO:23之序列具有至少90%一致性的序列； (ii) 該第二重鏈包含與SEQ ID NO:24之序列具有至少90%一致性的序列；及 (iii) 該第一輕鏈及該第二輕鏈各自包含與SEQ ID NO:25之序列具有至少90%一致性之序列。
  39. 如請求項1至38中任一項之經單離抗體，其中該抗體拮抗hPILRA活性。
  40. 如請求項1至39中任一項之經單離抗體，其中該抗體阻斷唾液酸化蛋白與hPILRA之結合。
  41. 如請求項40之經單離抗體，其中該唾液酸化蛋白為唾液酸化NPDC1、PANP、HSV-1 gB、COLEC12、C4a、C4b、DAG1、或Clec4g。
  42. 如請求項1至41中任一項之經單離抗體，其中該抗體增強EGFR或STAT3之磷酸化，或降低STAT1之磷酸化。
  43. 如請求項1至42中任一項之經單離抗體，其中該抗體增強細胞遷移。
  44. 如請求項43之經單離抗體，其中該抗體增強小神經膠質細胞遷移。
  45. 如請求項1至44中任一項之經單離抗體，其中該抗體增強抗炎基因或蛋白質表現。
  46. 如請求項45之經單離抗體，其中該抗體增強IL1RN基因表現。
  47. 如請求項1至46中任一項之經單離抗體，其中該抗體減少促炎性細胞介素蛋白質表現或分泌。
  48. 如請求項47之經單離抗體，其中該抗體減少TNF、IL-6、及/或IP-10表現。
  49. 如請求項1至48中任一項之經單離抗體，其中該抗體增加細胞呼吸。
  50. 如請求項49之經單離抗體，其中該抗體增加粒線體呼吸。
  51. 如請求項1至50中任一項之經單離抗體，其中該抗體增加ATP產生。
  52. 如請求項1至51中任一項之經單離抗體，其中該抗體增加脂肪酸代謝。
  53. 如請求項1至52中任一項之經單離抗體，其中該抗體不活化周圍免疫細胞。
  54. 如請求項53之經單離抗體，其中該抗體不活化嗜中性球及單核球。
  55. 如請求項1至54中任一項之經單離抗體，其中該抗體增加小神經膠質細胞中之脂質儲存或脂質水準。
  56. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至55中任一項之經單離抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  57. 一或多種多核苷酸，其包含編碼如請求項1至55中任一項之經單離抗體之重鏈及/或輕鏈的一或多個核酸序列。
  58. 一或多種載體，其包含如請求項57之一或多種多核苷酸。
  59. 一種宿主細胞，其包含如請求項57之一或多種多核苷酸或如請求項58之一或多種載體。
  60. 一種產生經單離抗體之方法，其包含在表現如請求項1至55中任一項之經單離抗體的條件下，培養如請求項59之宿主細胞。
  61. 一種治療個體之神經退化性疾病的方法，其包含向該個體投與如請求項1至55中任一項之經單離抗體或如請求項56之醫藥組成物。
  62. 如請求項61之方法，其中該神經退化性疾病選自由以下組成之群：阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、原發性年齡相關tau蛋白病、進行性核上神經麻痺症(PSP)、額顳葉型失智症、額顳葉型失智症伴與染色體17相關之帕金森症、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮側索硬化症、肌萎縮側索硬化症/關島型帕金森氏症-失智症綜合症(amyotrophic lateral sclerosis/parkinsonism-dementia complex of Guam，ALS-PDC)、皮質基底核退化症、慢性創傷性腦病、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、拳擊員失智症、擴散性神經原纖維纏結伴鈣化、唐氏症候群(Down’s syndrome)、家族性英國型失智症、家族性丹麥型失智症、格施謝三氏症(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、球狀神經膠質tau蛋白病、瓜達洛普帕金森氏病伴失智症(Guadeloupean parkinsonism with dementia)、瓜達洛普(Guadelopean) PSP、哈-斯二氏病(Hallevorden-Spatz disease)、遺傳性彌漫性腦白質病伴失智症(HDLS)、杭丁頓氏病(Huntington’s disease)、包涵體肌炎、多系統萎縮症、肌強直性營養不良、Nasu-Hakola病、神經原纖維纏結佔優性失智症、C型尼-皮二氏病(Niemann-Pick disease type C)、蒼白球-腦橋-黑質變性、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、皮克氏病(Pick’s disease)、腦炎後帕金森氏症、朊病毒蛋白大腦澱粉樣血管病、進行性皮層下神經膠瘤病、亞急性硬化性全腦炎、及僅纏結性失智症。
  63. 一種確定抗體是否在PILRA蛋白處具有活性的方法，該方法包含： (a) 使表現該PILRA蛋白之細胞與該抗體接觸； (b) 在步驟(a)之前、同時、或之後，使具有較低PILRA表現或無PILRA表現之與步驟(a)相同類型之細胞與該抗體接觸；及 (c) 在兩種細胞中，量測以下中之一者：磷酸化STAT3 (pSTAT3)水準及磷酸化STAT1 (pSTAT1)水準， 其中在該等細胞之間此等量測結果中之一者之水準的變化指示該抗體在步驟(a)之該PILRA蛋白處具有活性，及 其中該抗體特異性結合至CD98重鏈(CD98hc)蛋白。
  64. 如請求項63之方法，其中步驟(c)量測pSTAT3水準。
  65. 如請求項63或64之方法，其中步驟(a)之該細胞天然地表現該PILRA蛋白。
  66. 如請求項63至65之方法，其中該具有較低PILRA表現之細胞使該PILRA蛋白得以敲除。
  67. 如請求項66之方法，其中該細胞為HEK細胞。
  68. 如請求項67之方法，其中該細胞為iMicroglia。
  69. 如請求項68之方法，其中該細胞為PILRA LoF iMicroglia。
  70. 如請求項63之方法，其中步驟(a)之該細胞經工程化或經修飾以表現或過度表現該PILRA蛋白。
  71. 如請求項70之方法，其中該具有較低PILRA表現之細胞天然地表現該PILRA蛋白或不經工程化或不經修飾來表現該PILRA蛋白。
  72. 如請求項63至71中任一項之方法，其中該抗體來自抗體文庫。
  73. 如請求項63至72中任一項之方法，其中已知該抗體結合該PILRA蛋白。
  74. 如請求項63至72中任一項之方法，其中未知該抗體是否結合該PILRA蛋白。
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