TW202502815A - 具有改良之親和力及功效之人類ｆｇｆ２３結合抗體 - Google Patents
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Abstract
本揭示案提供相較於布羅索尤單抗(burosumab)對人類FGF23具有增加之親和力的改良之人類FGF23結合抗體，相較於布羅索尤單抗，該等抗體能夠降低給藥頻率，改良療法便利性且達成更高功效，而不會損害安全性。
Description
本揭示案係關於與布羅索尤單抗(burosumab)相比具有改良之親和力及改良之功效的人類FGF23結合抗體。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2024年2月1日提出申請之美國臨時申請案第63/548,711號、2023年7月18日提出申請之美國臨時申請案第63/514,180號及2023年3月10日提出申請之美國臨時申請案第63/489,458號之權益及優先權，各案之全部揭示內容特此以引用之方式整體併入本文中用於所有目的。
序列表 XML 之引用
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布羅索尤單抗(亦即，布羅索尤單抗-twza，以CRYSVITA®銷售)係一種纖維母細胞生長因子23(FGF23)阻斷抗體，適用於治療成人及6個月及以上兒科患者的X性聯低磷血症(XLH)且適用於在腫瘤無法定位或移除時治療成人及2歲及以上兒童的腫瘤誘發之骨軟化症(TIO)中之FGF23相關低磷血症。布羅索尤單抗係一種重組人類IgG1κ單株抗體。布羅索尤單抗由4條多肽鏈(2條一致重鏈，各447個胺基酸；及2條一致輕鏈，各213個胺基酸)組成且其分子量為147 kDa。布羅索尤單抗特異性結合至FGF23且阻斷其與Klotho-FGF受體複合物之相互作用。
FGF23係參與磷酸鹽及維生素D代謝的天然存在之細胞介素。循環FGF23之水準過量可導致尿磷酸鹽排泄增加、維生素D合成減少及隨之引起之低磷血症，從而導致骨礦化缺陷及對包括肌肉在內之其他組織之影響。布羅索尤單抗結合至FGF23且抑制FGF23與纖維母細胞生長因子受體1(FGFR1)及專性輔助受體Klotho結合之能力。此抑制作用將恢復腎小管對磷酸鹽之再吸收且增加維生素D之產生，由此增強鈣及磷酸鹽之腸吸收。此等組合作用改善血清磷水準及骨礦化。
布羅索尤單抗係藉由每2週(Q2W)皮下注射向兒科患者投與，代表著顯著治療負擔。另外，成人及兒科患者均必須經受高劑量體積之布羅索尤單抗注射，其中分三次單獨的1 ml注射投與最多達3 ml量(參見例如布羅索尤單抗-twza處方資訊，見於www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/daf/index.cfm)。因此，需要與布羅索尤單抗相比具有改良之親和力及功效之人類FGF23結合抗體。
本揭示案提供相較於布羅索尤單抗對人類FGF23具有增加之親和力的改良之人類FGF23結合抗體，相較於布羅索尤單抗，該等抗體能夠降低給藥頻率，改良療法便利性且達成更高功效，而不會損害安全性。
本揭示案提供藉由改變布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)及/或輕鏈序列(SEQ ID NO：2)中之一或多個胺基酸工程改造成相較於布羅索尤單抗具有改良之親和力的FGF23結合抗體。在一些實施例中，FGF23結合抗體係藉由改變布羅索尤單抗之重鏈可變區序列(VH，SEQ ID NO：3)及/或輕鏈可變區序列(VL，SEQ ID NO：4)中之一或多個胺基酸而工程改造成相較於布羅索尤單抗具有改良之親和力。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3但相對於SEQ ID NO：3包含一或多個胺基酸變化之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其中該一或多個胺基酸變化係選自T30E、T30F、T30Q、T30S、T30Y、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、N31Y、H32E、H32F、H32Q、H32S、H32T、I50D、I50E、I50F、I50S、I50T、I50Y、N52E、N52F、N52Q、N52Y、I54E、I54F、I54L、I54Q、I54S、I54T、I54V、I54Y、S55E、S55F、S55Q、S55T、S55Y、S59D、S59E、S59F、S59I、S59L、S59Q、S59T、S59V、S59Y、D99E、D99Q、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100L、I100Q、I100V、I100Y、V101F、V101I、V101L、V101T、V101Y、D102E、D102F、D102I、D102L、D102Q、D102Y、A103D、A103E、A103F、A103Q、A103S、A103T及A103Y。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：4但相對於SEQ ID NO：4包含一或多個胺基酸變化的輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中該一或多個胺基酸變化係選自A25L、A25V、I29F、I29L、I29V、S30D、S30E、S30F、S30I、S30L、S30Q、S30T、S30V、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31I、S31L、S31Q、S31T、S31V、S31Y、A32F、A32I、A32L、A32T、A32V、A32Y、V34F、V34I、V34L、V34Y、D50E、D50F、D50I、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、A51F、A51I、A51L、A51S、A51T、A51V、S52D、S52E、S52F、S52Q、S52T、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53I、S53L、S53Q、S53R、S53T、S53V、S53Y、Q90F、Q90Y、F91K、F91R、F91Y、N92D、N92E、N92F、N92Q、N92S、N92T、N92Y、D93E、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94D、Y94E、Y94F、Y94Q、Y94S及Y94T。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之VH胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之VL胺基酸序列，其中該VH胺基酸序列包含一或多個選自以下之胺基酸變化：T30E、T30F、T30Q、T30S、T30Y、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、N31Y、H32E、H32F、H32Q、H32S、H32T、I50D、I50E、I50F、I50S、I50T、I50Y、N52E、N52F、N52Q、N52Y、I54E、I54F、I54L、I54Q、I54S、I54T、I54V、I54Y、S55E、S55F、S55Q、S55T、S55Y、S59D、S59E、S59F、S59I、S59L、S59Q、S59T、S59V、S59Y、D99E、D99Q、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100L、I100Q、I100V、I100Y、V101F、V101I、V101L、V101T、V101Y、D102E、D102F、D102I、D102L、D102Q、D102Y、A103D、A103E、A103F、A103Q、A103S、A103T及A103Y，及/或其中該VL胺基酸序列包含一或多個選自以下之胺基酸變化：A25L、A25V、I29F、I29L、I29V、S30D、S30E、S30F、S30I、S30L、S30Q、S30T、S30V、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31I、S31L、S31Q、S31T、S31V、S31Y、A32F、A32I、A32L、A32T、A32V、A32Y、V34F、V34I、V34L、V34Y、D50E、D50F、D50I、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、A51F、A51I、A51L、A51S、A51T、A51V、S52D、S52E、S52F、S52Q、S52T、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53I、S53L、S53Q、S53R、S53T、S53V、S53Y、Q90F、Q90Y、F91K、F91R、F91Y、N92D、N92E、N92F、N92Q、N92S、N92T、N92Y、D93E、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94D、Y94E、Y94F、Y94Q、Y94S及Y94T。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之輕鏈可變區(VL)，但在VH及VL序列中包含至少兩個胺基酸變化，其中該至少兩個胺基酸變化係選自VL：S31E/VL：D50F、VH：N31F/VH：S59F、VL：D50F/VL：S53E、VL：S31F/VL：S52E、VL：D50F/VH：V101I、VH：S59D/VH：V101I、VL：S31F/VL：S53E、VL：N92E/VL：D93F、VL：S31E/VL：S53E、VL：S31F/VL：D50F、VH：N31E/VH：S59E、VH：S57E/VH：S59D、VH：N31E/VH：I54F、VH：S59T/VH：V101L、VH：I54Y/VH：V101F、VH：N52F/VH：V101I、VL：N92D/VL：D93F、VH：N52F/VH：V101L、VL：S31F/VL：D50E、VL：Y94D/VH：S59D、VL：Y94D/VH：S59E、VL：N92F/VH：S59E、VL：N92Y/VH：S59E、VL：Y94E/VH：S59E、VL：S52D/VH：S59E及VL：S52E/VH：S59E。
本文亦提供相對於布羅索尤單抗具有一或多個獨特互補決定區(CDR)之FGF23結合抗體。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：22-32之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(HCDR1)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：33-65之胺基酸序列的重鏈互補決定區2(HCDR2)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：66-93之胺基酸序列的重鏈互補決定區3(HCDR3)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：94-126之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(LCDR1)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：127-158之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2(LCDR2)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：159-185之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3(LCDR3)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中：該HCDR1包含選自SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：22-32之胺基酸序列；該HCDR2包含選自SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：33-65之胺基酸序列；該HCDR3包含選自SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：66-93之胺基酸序列；該LCDR1包含選自SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：94-126之胺基酸序列；該LCDR2包含選自SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：127-158之胺基酸序列；且該LCDR3包含選自SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：159-185之胺基酸序列。
本文亦提供相對於布羅索尤單抗具有一或多個獨特可變區結構域之FGF23結合抗體。
舉例而言，該經分離抗體或其片段可包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，或其中該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH，該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列，或該抗體或其片段可包含VL，該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH，該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列，或該抗體或其片段可包含VL，該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH及VL，其中該VH可包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且該VL可包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH及VL，其中該VH可包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列，且該VL可包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH及VL，其中該VH可包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列，且該VL可包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH及VL，其中該VH可包含選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列，或該VL可包含選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH及VL，其中該VH可包含選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列，且該VL可包含選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列。
在一些態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之VH胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之VL胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：3相比，該VH胺基酸序列包含一或多個選自I54F、I54Y、S59D、S59E、V101I及A103S之胺基酸變化。
在一些態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之VH胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之VL胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：4相比，該VL胺基酸序列包含一或多個選自S52D、S52E、N92F、N92Y、Y94D及Y94E之胺基酸變化。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-001之重鏈可變區(VH)及根據VL-027之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX126之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-001之重鏈可變區(VH)及根據VL-066之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX144之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-001之重鏈可變區(VH)及根據VL-067之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX145之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-028之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX156之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-029之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX157之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-061之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX175之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-055之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX182之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-050之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX201之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-054之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX202之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-027之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX203之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-030之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX204之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-066之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX205之抗體)。
亦提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-067之輕鏈可變區(VL)(亦即，根據抗體結構ID編號UGX206之抗體)。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：1之重鏈(HC)胺基酸序列及根據SEQ ID NO：2之輕鏈(LC)胺基酸序列，其中該抗體或其片段相對於SEQ ID NO：1包含一或多個HC胺基酸變化及/或相對於SEQ ID NO：2包含一或多個LC胺基酸變化，其中該一或多個HC胺基酸變化係選自T28Y、T30F、T30K、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、H32K、H32Y、Y33D、Y33L、Y33R、N52E、N52F、N52Q、N52R、N52Y、I54A、I54D、I54F、I54G、I54H、I54K、I54L、I54M、I54N、I54P、I54R、I54V、I54W、I54Y、S55E、S55F、S55I、S55Q、S55R、S55Y、S57E、S57F、S57R、S57Y、T58F、T58R、S59A、S59D、S59E、S59F、S59G、S59H、S59I、S59K、S59L、S59M、S59N、S59P、S59Q、S59R、S59T、S59V、S59W、S59Y、N60E、N60R、N60Y、A61F、A61R、A61Y、Q62L、Q62R、Q62Y、Q65E、Q65R、Q65Y、D99F、D99R、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100Y、V101A、V101D、V101E、V101F、V101G、V101H、V101I、V101K、V101L、V101M、V101N、V101P、V101Q、V101R、V101S、V101W、D102E、D102F、D102K、D102R、D102Y、A103D、A103F、A103G、A103H、A103I、A103K、A103L、A103M、A103N、A103P、A103R、A103S、A103T、A103V及A103W，且該一或多個LC胺基酸變化係選自Q27F、Q27R、G28D、G28Q、G28R、G28Y、I29F、I29L、S30D、S30E、S30F、S30L、S30Q、S30R、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31Q、S31Y、A32F、A32V、V34F、V34I、D50E、D50F、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、D50Y、A51V、S52A、S52D、S52E、S52F、S52G、S52H、S52I、S52K、S52L、S52M、S52N、S52P、S52Q、S52R、S52V、S52W、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53R、S53Y、L54E、L54Y、E55R、E55Y、S67E、S67R、S67Y、T69R、T69Y、F91E、F91R、F91Y、N92A、N92D、N92E、N92F、N92G、N92H、N92I、N92K、N92L、N92M、N92P、N92Q、N92R、N92S、N92T、N92V、N92W、N92Y、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94A、Y94D、Y94E、Y94F、Y94G、Y94H、Y94I、Y94K、Y94L、Y94M、Y94N、Y94P、Y94Q、Y94R、Y94S、Y94V及Y94W。
在另一態樣中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中該抗體或其片段相對於SEQ ID NO：3包含一或多個VH胺基酸變化及/或相對於SEQ ID NO：4包含一或多個VL胺基酸變化，其中該一或多個VH胺基酸變化係選自T28Y、T30F、T30K、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、H32K、H32Y、Y33D、Y33L、Y33R、N52E、N52F、N52Q、N52R、N52Y、I54A、I54D、I54F、I54G、I54H、I54K、I54L、I54M、I54N、I54P、I54R、I54V、I54W、I54Y、S55E、S55F、S55I、S55Q、S55R、S55Y、S57E、S57F、S57R、S57Y、T58F、T58R、S59A、S59D、S59E、S59F、S59G、S59H、S59I、S59K、S59L、S59M、S59N、S59P、S59Q、S59R、S59T、S59V、S59W、S59Y、N60E、N60R、N60Y、A61F、A61R、A61Y、Q62L、Q62R、Q62Y、Q65E、Q65R、Q65Y、D99F、D99R、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100Y、V101A、V101D、V101E、V101F、V101G、V101H、V101I、V101K、V101L、V101M、V101N、V101P、V101Q、V101R、V101S、V101W、D102E、D102F、D102K、D102R、D102Y、A103D、A103F、A103G、A103H、A103I、A103K、A103L、A103M、A103N、A103P、A103R、A103S、A103T、A103V及A103W，且該一或多個VL胺基酸變化係選自Q27F、Q27R、G28D、G28Q、G28R、G28Y、I29F、I29L、S30D、S30E、S30F、S30L、S30Q、S30R、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31Q、S31Y、A32F、A32V、V34F、V34I、D50E、D50F、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、D50Y、A51V、S52A、S52D、S52E、S52F、S52G、S52H、S52I、S52K、S52L、S52M、S52N、S52P、S52Q、S52R、S52V、S52W、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53R、S53Y、L54E、L54Y、E55R、E55Y、S67E、S67R、S67Y、T69R、T69Y、F91E、F91R、F91Y、N92A、N92D、N92E、N92F、N92G、N92H、N92I、N92K、N92L、N92M、N92P、N92Q、N92R、N92S、N92T、N92V、N92W、N92Y、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94A、Y94D、Y94E、Y94F、Y94G、Y94H、Y94I、Y94K、Y94L、Y94M、Y94N、Y94P、Y94Q、Y94R、Y94S、Y94V及Y94W。
本文亦提供相較於布羅索尤單抗對人類FGF23具有增加之親和力的FGF23結合抗體或其片段。
舉例而言，經分離抗體或其片段對人類FGF23之結合親和力可相較於布羅索尤單抗增加約2倍至約10倍。
在一些實施例中，經分離抗體或其片段對人類FGF23之結合親和力(K
D)在約1×10
-12M至約7×10
-12M之間。
在一些實施例中，本文所提供之經分離抗體或片段係用於減少有需要之個體之血清FGF23之方法中。
在一些實施例中，本文所提供之經分離抗體或片段係用於增加有需要之個體之腎磷酸鹽再吸收最大臨限值(TmP)的方法中。
在一些實施例中，本文所提供之經分離抗體或片段係用於增加有需要之個體之血清無機磷(Pi)的方法中。
在一些實施例中，本文所提供之經分離抗體或片段係用於增加有需要之個體之血清1,25二羥基維生素D(1,25[OH]2D)濃度的方法中。
在一些實施例中，本文所提供之經分離抗體或片段係用於治療有需要之個體之低磷血疾患(hypophosphatemic condition)之方法中。
在一些實施例中，該個體經診斷患有X性聯低磷血症(XLH)或腫瘤誘發之骨軟化症(TIO)。
本文亦提供減少有需要之個體之血清FGF23之方法，該等方法包括向該個體投與本文所描述之經分離抗體或其片段。
在另一態樣中，本揭示案提供增加有需要之個體之腎磷酸鹽再吸收最大臨限值(TmP)之方法，該等方法包括向該個體投與本文所描述之經分離抗體或其片段。
亦提供增加有需要之個體之血清無機磷(Pi)之方法，該等方法包括向該個體投與本文所描述之經分離抗體或其片段。
亦提供增加有需要之個體之血清1,25二羥基維生素D(1,25[OH]2D)濃度之方法，該等方法包括向該個體投與本文所描述之經分離抗體或其片段。
亦提供治療有需要之個體之低磷血疾患之方法，該等方法包括向該個體投與本文所描述之經分離抗體或其片段。
在一些實施例中，欲根據本文所描述之方法治療之個體經診斷患有X性聯低磷血症(XLH)或腫瘤誘發之骨軟化症(TIO)。
本揭示案之此等及其他態樣及特徵將於本申請案之以下章節中描述。
本揭示案提供相較於布羅索尤單抗，對人類FGF23具有增加之親和力的人類FGF23結合抗體。與布羅索尤單抗相比，本揭示案之抗體可允許降低給藥頻率、增加便利性及患者順應性以及改良效力，同時維持可接受之毒性及安全概況。為了改良布羅索尤單抗對人類FGF23之親和力，抗體變異體係合理設計成與布羅索尤單抗相比，對人類FGF23具有增加之結合親和力。
I. 定義
在本說明書通篇，提供某些量之數值範圍。應理解，此等範圍包含端點及其中之所有子範圍，包括所揭示範圍內及其間之每一整數。因此，範圍「自50至80」包括其中的所有可能範圍(例如51-79、52-78、53-77、54-76、55-75、60-70等)以及自50至80之每一個別整數(例如50、51、52、53、54等)。在範圍係以分數、百分比、小數及類似形式提供之情況下，此等範圍同樣包括其中所有可能的子範圍以及在所揭示範圍內及其間的每一個別分數、百分比、小數等。舉例而言，範圍「自0.1至1.0」包括其中的所有可能範圍(例如0.2至0.9等)及自0.1至1.0之每一個別1/10小數(例如0.1、0.2、0.3、0.4等)。此外，給定範圍內之所有值均可為由此所涵蓋之範圍的端點(例如，範圍50-80包括具有諸如55-80、50-75等端點之範圍)。
術語「一(a/an)」係指該實體之一或多者；例如，「一種雄激素受體調節劑」係指一或多種雄激素受體調節劑或至少一種雄激素受體調節劑。因此，術語「一個(種)」、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。另外，以不定冠詞「a/an(一個(種))」提及之「抑制劑」不排除存在多於一種抑制劑之可能性，除非上下文明確要求存在一種且僅存在一種抑制劑。
術語「親和力」(或「結合親和力」)係指分子或分子復合物與結合搭配物之結合強度，該結合搭配物為諸如配位體或抗原決定基或抗原。親和力可根據解離常數(K
D)來表示，解離常數描述處於平衡的分子或複合物及其結合搭配物解離之速率。K
D可表示為配位體之締合速率常數(k
on)與解離速率常數(k
off)之比率，或K
D=k
off/k
on。關於抗體/抗原結合親和力，平衡時抗體/抗原複合物形成之速率等於該複合物解離成未結合之抗體及抗原的速率，且抗體之親和力可表示為1/K
D，因此，較小的K
D值反映抗體對其靶抗原的親和力較大。用於測定結合親和力之方法係已知的且包括例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)方法及基於表面電漿子共振(SPR)之方法。
如本文所用，術語「抗體結構編號系統」或「ASN#」係指用於對來自抗體及抗體樣結構之完整序列進行結構比對及分類之編號方案。ASN#系統之描述提供於www.just-evotecbiologics.com/white-papers-application-notes/coreab-sequence-classification/(2023年7月5日最後一次訪問；以引用之方式整體併入本文)。ASN#系統基於且實質上等同於Honneger編號方案，亦即，「AHo」編號方案(例如參見Honegger, Annemarie及Andreas PluÈckthun. 「Yet another numbering Scheme for immunoglobulin variable domain：an automatic modelling and analysis tool.」Journal of molecular biology 309.3(2001)：657-670；以引用之方式整體併入本文中)，其「基於覆蓋所觀察之長度變化的免疫球蛋白可變區之3D結構之結構比對，以均質化格式對免疫球蛋白超家族之可變結構域進行編號…(numbers the variable domains of the immunoglobulin superfamily in a homogenized format … based on structural alignments of the 3D structures of the immunoglobulin variable regions covering the observed length variation)」(Dondelinger, Mathieu等人,「Understanding the significance and implications of antibody numbering and antigen-binding surface/residue definition.」Frontiers in immunology 9(2018)：2278)。
如本說明書及申請專利範圍所用，動詞「包含(comprise)」及其語法變化形式係以其非限制性含義使用，意思指包括該詞之後的項目，但不排除未具體提及之項目。
術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指減輕、緩解、延遲、減少、改善或管理個體之疾患之至少一種症狀中的一或多者。治療亦可意謂以下中之一或多者：停滯、延遲疾患之發作(亦即，在該疾患有臨床表現之前的時期)或降低疾患發展或惡化之風險。
術語「個體」可指人類、非人類靈長類動物、哺乳動物、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、犬、貓及諸如此類。個體可疑似患有諸如XLH或TIO之低磷血疾患或有患低磷血疾患之風險，或者可診斷為患有低磷血疾患，諸如XLH或TIO。
本揭示案包括可有助於理解當前揭示之主題的資訊。並不承認本文所提供之任何資訊係先前技術或與當前主張之發明相關，或者明確或隱含提及之任何出版物皆係先前技術。
II. 綜述
布羅索尤單抗療法有效地改善低磷血症之臨床症狀。許多臨床試驗已將布羅索尤單抗確立為患有X性聯低磷血症(XLH)之成人及兒童的安全且有效之療法(Schindeler等人, 「Clinical evidence for the benefits of burosumab therapy for X-linked hypophosphatemia(XLH)and other conditions in adults and children.」Frontiers in Endocrinology 11(2020)：338。)。其他研究亦已證實，布羅索尤單抗為腫瘤誘發之骨軟化症(TIO)的安全且有效的治療(Jan de Beur等人,「Burosumab for the treatment of tumor‐induced osteomalacia.」Journal of Bone and Mineral Research 36.4(2021)：627-635。)。
然而，在64週後，用布羅索尤單抗治療僅使血清磷水準恢復至3.3 mg/dL，此接近在健康群體中所見正常水準之3.2 mg/dL下限(參見例如新加坡衛生科學局關於Crysvita新藥申請的效益-風險評估的總結報告(Summary Report of Benefit-Risk Assessment from the Health Sciences Authority of Singapore in connection with a New Drug Application for Crysvita)第12部分之圖1及圖2，可見於www.hsa.gov.sg/docs/default-source/hprg-tpb/summary-reports/crysvita_summary-report_2021.pdf)。此外，用布羅索尤單抗治療需要在兒科患者中每2週(Q2W)進行皮下注射，且成人及兒科患者均必須經歷高劑量體積之布羅索尤單抗注射，其中分三次單獨的1 ml注射投與最多達3 ml藥物，代表著患者的顯著治療負擔。
因此，本說明書提供與布羅索尤單抗相比對人類FGF23具有改良之結合親和力的人類FGF23結合抗體。經考慮，改良布羅索尤單抗之結合親和力將增加該抗體之效力，減少血清中生物可利用之FGF23之量，且能夠減少給藥量及/或給藥頻率，由此減輕需要人類FGF23結合抗體療法之患者的治療負擔，同時不會顯著負面影響該療法之安全概況。
據信，布羅索尤單抗以高親和力結合至完整人類FGF23。然而，利用不同源材料量測布羅索尤單抗親和力之不同分析得到不同值。舉例而言，歐洲藥品管理局(European Medicines Agency)關於Crysvita之評估報告報導：「在Biacore競爭性結合研究中，[布羅索尤單抗]顯示以相似結合親和力(K
D為約10-11M)與人類、食蟹獼猴及兔FGF23結合。」(參見評估報告：Crysvita, 2017年12月14日(EMA/148319/2018)，可見於www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/crysvita-epar-public-assessment-report_en.pdf)。本案發明人之研究使用表面電漿子共振(SPR)方法，使用來自HEK293S細胞上清液之重組人類FGF23(R179Q)以及用CHO細胞製造之布羅索尤單抗來測定布羅索尤單抗親和力，且發現估計之結合親和力(K
D)為約1×10
-11至3×10
-11(資料未顯示)。Yamazaki等人報導了FN1之親和力為4.7×10
-11，FN1係作者描述為以與布羅索尤單抗相同之方式結合人類FGF23之小鼠單株抗FGF23抗體(Yamazaki, Yuji等人，「Anti‐FGF23 neutralizing antibodies show the physiological role and structural features of FGF23.」Journal of Bone and Mineral Research 23.9(2008)：1509-1518。)。另一團隊利用ELISA，使用在大腸桿菌中表現之重組人類FGF23以及在HEK293細胞中表現之布羅索尤單抗來測定布羅索尤單抗親和力，且發現估計之結合親和力為約0.5×10
-9或0.77×10
-9(Kanhasut等人,「Prediction of the structural interface between fibroblast growth factor23 and burosumab using alanine scanning and molecular docking.」, 2022年5月16日,預印本(第1版)，可見於Research Square [doi.org/ 10.21203/rs.3.rs-1630525/v1])。由評價布羅索尤單抗親和力之研究得到的完全不同之結果強調了需要對此單株抗體與人類FGF23之結合動力學進行全面研究。
Kanhasut等人進一步研究了改良布羅索尤單抗與FGF23之結合親和力的方法。使用丙胺酸掃描資料及分子對接來建立同源建模之布羅索尤單抗與FGF23之晶體結構之間的相互作用的模型，作者鑑別出布羅索尤單抗輕鏈可變結構域(VL)上預測會增強與抗原決定基之相互作用的四個胺基酸變化：A32S、S52D、S67Y及T69D(Kabat編號方案)。基於原始丙胺酸掃描資料，作者亦詢問重鏈可變結構域(VH)上之第五個變化V97A(Kabat編號方案)。此研究提供的資料證實，具有兩個胺基酸變化VH：V97A(亦即，根據線性編號方案之V101A)及VL：A32S(亦即，根據Kabat及線性編號方案兩者之A32S)之布羅索尤單抗變異型抗體的FGF23結合親和力K
D=0.21×10
-9增強約3倍。
然而，Kanhasut等人的研究存在若干缺陷，使其結論之有效性及生物學意義受到質疑。舉例而言，Kanhasut等人使用在大腸桿菌細胞中表現之FGF23，這意味著抗原蛋白並非以與在基於哺乳動物細胞之系統中發現之形式類似的形式進行糖基化。此外，對於K
D測定，Kanhasut等人使用滴定ELISA方法，該方法被認為具有高度可變性且並非用於親和力量測之最精確分析。Kanhasut等人之整個研究所報導的布羅索尤單抗K
D之不一致顯示出該分析之高度可變性，且使人對該研究之最終準確性及意義提出質疑。最後，針對本文所描述的布羅索尤單抗：FGF23複合物之結構評價表明，Kanhasut等人所鑑別之抗原決定基殘基與晶體結構中所鑑別之抗原決定基殘基不一致。事實上，本案發明人對VH：V97A及VL：A32S(亦即，根據線性編號方案，分別為重鏈V101A及輕鏈A32S)胺基酸取代進行了表面電漿子共振分析，且展示此等變化損害而非改良布羅索尤單抗之親和力(資料未顯示)。
此等及其他研究披露，需要對布羅索尤單抗結合動力學(包括布羅索尤單抗與人類FGF23之結合之K
D的測定)及精確抗原決定基定位以及用於改良布羅索尤單抗之結合親和力的新方法進行更權威性的研究。重要的是，在設計與布羅索尤單抗相比具有改良之結合親和力的抗體時，微調對人類FGF23之親和力以使得效力得到改良而不損害安全性非常關鍵。舉例而言，親和力增加過多可能會引起個體之血清FGF23濃度降低，從而導致不安全的血清磷水準及高磷血症之症狀。另一方面，與用布羅索尤單抗治療相比，親和力之極小改良可能無法提供臨床益處。因此，需要合理設計之抗人類FGF23抗體，該等抗體具有經微調以增加效力而不會導致不安全之血清磷水準或高磷血症之臨床症狀的結合親和力。
本揭示案提供相較於布羅索尤單抗，對人類FGF23具有增加之親和力的合理設計之人類FGF23結合抗體。本文所描述之人類FGF23結合抗體之合理設計可涉及例如布羅索尤單抗-人類FGF23相互作用之結晶學分析及/或涉及以下任一者之電腦模擬建模：使用分子動力學之構形取樣及一系列表示對接模板之目標構形狀態的選擇；重要抗體之同源模型的產生及能量最小化，選擇可能之構形狀態；引導重要抗體模型分子對接至FGFR23結構上(例如基於HDX資料選擇之抗原決定基)；基於對接結果進行之互補位及抗原決定基確定；抗原-抗體結合相互作用之評價及排序(例如第1殼層(shell)互補位：抗原決定基及第2殼層)；與最近公佈的描述布羅索尤單抗：FGF23結合之結果的比較(Kanhasut等人，Nature(2022)12：14754)；關於任何所需額外變化之評估(亦即，穩定性、可開發性)；及/或轉譯後修飾及相關補救之評估。根據此等研究，可將個別或多個胺基酸變化引入布羅索尤單抗主鏈序列中且分析其結合特性。可篩選變異型抗體設計以鑑別具有改良之結合特性的布羅索尤單抗變異體。
因此，本揭示案提供相較於布羅索尤單抗，對人類FGF23之親和力增加的人類FGF23結合抗體，與布羅索尤單抗相比，該等抗體能夠降低給藥頻率、增加便利性及患者順應性，以及改良效力，同時維持可接受之毒性及安全概況。
為了改良布羅索尤單抗對人類FGF23之親和力，抗體變異體係設計成與布羅索尤單抗相比，對人類FGF23具有增加之結合親和力。
下文進一步闡述本揭示案之抗體之此等及其他態樣以及其用途。
III. 組成物
本揭示案之組成物包含一或多種結合至人類FGF23之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，人類FGF23結合抗體係工程改造成具有改良之親和力的布羅索尤單抗變異體(亦即，經工程改造之人類FGF23結合抗體)。
在一些實施例中，本文所提供的經工程改造之人類FGF23結合抗體可投與個體以用於降低個體之血清FGF23。
在一些實施例中，本文所提供的經工程改造之人類FGF23結合抗體可投與個體以用於增加個體之腎磷酸鹽再吸收最大臨限值(TmP)。
在一些實施例中，本文所提供的經工程改造之人類FGF23結合抗體可投與個體以用於增加個體之血清無機磷(Pi)。
在一些實施例中，本文所提供的經工程改造之人類FGF23結合抗體可投與個體以用於增加個體之血清1,25二羥基維生素D(1,25[OH]2D)濃度。
在一些實施例中，本文所提供的經工程改造之人類FGF23結合抗體可用於治療個體之低磷血疾患，包括XLH或骨軟化症，諸如腫瘤誘發之骨軟化症(TIO)。
在一些實施例中，與布羅索尤單抗相比，本文所提供的經工程改造之人類FGF23結合抗體對人類FGF23之親和力增加。
在一些實施例中，藉由將抗體之K
D降低至約1×10
-12與約7×10
-12之間，本文所提供之抗體對人類FGF23之結合親和力相對於布羅索尤單抗增加。
在一些實施例中，與布羅索尤單抗相比，本文所提供之抗體對人類FGF23之結合親和力增加約2倍至約10倍。舉例而言，本文所提供之抗體對人類FGF23之結合親和力相較於布羅索尤單抗可增加約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約5.5倍、約6倍、約6.5倍、約7倍、約7.5倍、約8倍、約8.5倍、約9倍、約9.5倍或約10倍。
在一些實施例中，相對於用布羅索尤單抗治療在個體體內所觀察到的游離FGF23減少，本文所提供之抗體與人類FGF23之結合親和力相對於布羅索尤單抗增加引起個體體內之游離FGF23減少。游離FGF23係指生物可利用之FGF23。與布羅索尤單抗相比，本文所提供之抗體與FGF23之結合可使個體體內游離FGF23之量減少至少約5%或至少約10%。
與布羅索尤單抗之胺基酸序列相比，本文所描述的經工程改造之人類FGF23結合抗體可具有一或多個胺基酸取代。舉例而言，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)可在重鏈序列中包含一或多個胺基酸取代。本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)可在輕鏈序列中包含一或多個胺基酸取代。本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)在重鏈序列中包含一或多個胺基酸取代且相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)在輕鏈序列中包含一或多個胺基酸取代。
本文所描述的經工程改造之人類FGF23結合抗體相較於布羅索尤單抗之胺基酸序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸取代。舉例而言，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)可在重鏈序列中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸取代。本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)可在輕鏈序列中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸取代。本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)在重鏈序列中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸取代及相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)在輕鏈序列中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸取代。
本文所描述的經工程改造之人類FGF23結合抗體相較於布羅索尤單抗之胺基酸序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸缺失。舉例而言，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)可在重鏈序列中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸缺失。本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)可在輕鏈序列中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸缺失。本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)在重鏈序列中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸缺失及相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)在輕鏈序列中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸缺失。
本文所描述的經工程改造之人類FGF23結合抗體相較於布羅索尤單抗之胺基酸序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸插入。舉例而言，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)可在重鏈序列中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸插入。本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)可在輕鏈序列中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸插入。本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)在重鏈序列中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸插入及相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)在輕鏈序列中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸插入。
本文所描述的經工程改造之人類FGF23結合抗體相較於布羅索尤單抗之胺基酸序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸變化，其中該等變化包含相對於布羅索尤單抗之胺基酸序列的取代、缺失及/或插入之組合。舉例而言，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)可在重鏈序列中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸變化，其中該等變化包含相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)的取代、缺失及/或插入之組合。本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)可在輕鏈序列中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸變化，其中該等變化包含相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)的取代、缺失及/或插入之組合。本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含相對於布羅索尤單抗之重鏈序列(SEQ ID NO：1)在重鏈序列中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸變化以及相對於布羅索尤單抗之輕鏈序列(SEQ ID NO：2)在輕鏈序列中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或超過20個胺基酸變化，其中該等變化包含相對於布羅索尤單抗之重鏈及輕鏈序列(分別為SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2)的取代、缺失及/或插入之組合。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之人類FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗重鏈序列及/或布羅索尤單抗輕鏈序列之胺基酸序列包含一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入(統稱為「變化」)，其中該一或多個胺基酸變化影響一或多個布羅索尤單抗互補位殘基及/或一或多個與布羅索尤單抗互補位殘基相鄰之殘基。示例布羅索尤單抗互補位區域及互補位殘基提供於本文之表4中。與布羅索尤單抗互補位殘基相鄰之布羅索尤單抗殘基可包括在布羅索尤單抗互補位殘基之1個胺基酸殘基內、2個胺基酸殘基內、3個胺基酸殘基內、4個胺基酸殘基內、5個胺基酸殘基內、6個胺基酸殘基內、7個胺基酸殘基內、8個胺基酸殘基內、9個胺基酸殘基內或10個胺基酸殘基內之殘基。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之人類FGF23結合抗體包含表13中所提供之一或多個輕鏈可變區胺基酸變化。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之人類FGF23結合抗體包含表14中所提供之一或多個重鏈可變區胺基酸變化。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之人類FGF23結合抗體包含根據表15中所提供之胺基酸變化中的兩個胺基酸變化。
在一些實施例中，本文所提供的經工程改造之人類FGF23結合抗體係表16及表17中所描述之UGX101至UGX196中之一者。
某些經工程改造之FGF23結合抗體之胺基酸變化
本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可相對於SEQ ID NO：3在重鏈可變區(VH)中包含一或多個胺基酸變化，其中該一或多個胺基酸變化係選自T30E、T30F、T30Q、T30S、T30Y、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、N31Y、H32E、H32F、H32Q、H32S、H32T、I50D、I50E、I50F、I50S、I50T、I50Y、N52E、N52F、N52Q、N52Y、I54E、I54F、I54L、I54Q、I54S、I54T、I54V、I54Y、S55E、S55F、S55Q、S55T、S55Y、S59D、S59E、S59F、S59I、S59L、S59Q、S59T、S59V、S59Y、D99E、D99Q、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100L、I100Q、I100V、I100Y、V101F、V101I、V101L、V101T、V101Y、D102E、D102F、D102I、D102L、D102Q、D102Y、A103D、A103E、A103F、A103Q、A103S、A103T及A103Y。
本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可相對於SEQ ID NO：4在輕鏈可變區(VL)中包含一或多個胺基酸變化，其中該一或多個胺基酸變化係選自A25L、A25V、I29F、I29L、I29V、S30D、S30E、S30F、S30I、S30L、S30Q、S30T、S30V、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31I、S31L、S31Q、S31T、S31V、S31Y、A32F、A32I、A32L、A32T、A32V、A32Y、V34F、V34I、V34L、V34Y、D50E、D50F、D50I、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、A51F、A51I、A51L、A51S、A51T、A51V、S52D、S52E、S52F、S52Q、S52T、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53I、S53L、S53Q、S53R、S53T、S53V、S53Y、Q90F、Q90Y、F91K、F91R、F91Y、N92D、N92E、N92F、N92Q、N92S、N92T、N92Y、D93E、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94D、Y94E、Y94F、Y94Q、Y94S及Y94T。
本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可相對於SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4分別在重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)中包含一或多個胺基酸變化，其中該VH中之一或多個胺基酸變化係選自T30E、T30F、T30Q、T30S、T30Y、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、N31Y、H32E、H32F、H32Q、H32S、H32T、I50D、I50E、I50F、I50S、I50T、I50Y、N52E、N52F、N52Q、N52Y、I54E、I54F、I54L、I54Q、I54S、I54T、I54V、I54Y、S55E、S55F、S55Q、S55T、S55Y、S59D、S59E、S59F、S59I、S59L、S59Q、S59T、S59V、S59Y、D99E、D99Q、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100L、I100Q、I100V、I100Y、V101F、V101I、V101L、V101T、V101Y、D102E、D102F、D102I、D102L、D102Q、D102Y、A103D、A103E、A103F、A103Q、A103S、A103T及A103Y，且其中該VL中之一或多個胺基酸變化係選自A25L、A25V、I29F、I29L、I29V、S30D、S30E、S30F、S30I、S30L、S30Q、S30T、S30V、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31I、S31L、S31Q、S31T、S31V、S31Y、A32F、A32I、A32L、A32T、A32V、A32Y、V34F、V34I、V34L、V34Y、D50E、D50F、D50I、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、A51F、A51I、A51L、A51S、A51T、A51V、S52D、S52E、S52F、S52Q、S52T、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53I、S53L、S53Q、S53R、S53T、S53V、S53Y、Q90F、Q90Y、F91K、F91R、F91Y、N92D、N92E、N92F、N92Q、N92S、N92T、N92Y、D93E、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94D、Y94E、Y94F、Y94Q、Y94S及Y94T。
本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可相對於SEQ ID NO：3在重鏈可變區(VH)中、相對於SEQ ID NO：4在輕鏈可變區(VL)中或相對於SEQ ID NO：3在VH中及相對於SEQ ID NO：4在VL中包含至少兩個胺基酸變化，其中該至少兩個胺基酸變化係選自VL：S31E/VL：D50F、VH：N31F/VH：S59F、VL：D50F/VL：S53E、VL：S31F/VL：S52E、VL：D50F/VH：V101I、VH：S59D/VH：V101I、VL：S31F/VL：S53E、VL：N92E/VL：D93F、VL：S31E/VL：S53E、VL：S31F/VL：D50F、VH：N31E/VH：S59E、VH：S57E/VH：S59D、VH：N31E/VH：I54F、VH：S59T/ VH：V101L、VH：I54Y/VH：V101F、VH：N52F/VH：V101I、VL：N92D/VL：D93F、VH：N52F/VH：V101L、VL：S31F/VL：D50E、VL：Y94D/VH：S59D、VL：Y94D/VH：S59E、VL：N92F/VH：S59E、VL：N92Y/VH：S59E、VL：Y94E/VH：S59E、VL：S52D/VH：S59E及VL：S52E/VH：S59E。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之VH胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之VL胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：3相比，該VH胺基酸序列包含一或多個選自I54F、I54Y、S59D、S59E、V101I及A103S之胺基酸變化。
一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之VH胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之VL胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：4相比，該VL胺基酸序列包含一或多個選自S52D、S52E、N92F、N92Y、Y94D及Y94E之胺基酸變化。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-001之重鏈可變區(VH)及根據VL-027之輕鏈可變區(VL)(UGX126)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-001之重鏈可變區(VH )及根據VL-066之輕鏈可變區(VL)(UGX144)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-001之重鏈可變區(VH)及根據VL-067之輕鏈可變區(VL)(UGX145)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-028之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(UGX156)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-029之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(UGX157)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-061之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(UGX175)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-055之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(UGX182)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-050之輕鏈可變區(VL)(UGX201)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-054之輕鏈可變區(VL)(UGX202)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-027之輕鏈可變區(VL)(UGX203)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-030之輕鏈可變區(VL)(UGX204)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-066之輕鏈可變區(VL)(UGX205)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-067之輕鏈可變區(VL)(UGX206)。
在一些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：1之重鏈(HC)胺基酸序列及根據SEQ ID NO：2之輕鏈(LC)胺基酸序列，其中該抗體或其片段相對於SEQ ID NO：1包含一或多個HC胺基酸變化及/或相對於SEQ ID NO：2包含一或多個LC胺基酸變化，其中該一或多個HC胺基酸變化係選自T28Y、T30F、T30K、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、H32K、H32Y、Y33D、Y33L、Y33R、N52E、N52F、N52Q、N52R、N52Y、I54A、I54D、I54F、I54G、I54H、I54K、I54L、I54M、I54N、I54P、I54R、I54V、I54W、I54Y、S55E、S55F、S55I、S55Q、S55R、S55Y、S57E、S57F、S57R、S57Y、T58F、T58R、S59A、S59D、S59E、S59F、S59G、S59H、S59I、S59K、S59L、S59M、S59N、S59P、S59Q、S59R、S59T、S59V、S59W、S59Y、N60E、N60R、N60Y、A61F、A61R、A61Y、Q62L、Q62R、Q62Y、Q65E、Q65R、Q65Y、D99F、D99R、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100Y、V101A、V101D、V101E、V101F、V101G、V101H、V101I、V101K、V101L、V101M、V101N、V101P、V101Q、V101R、V101S、V101W、D102E、D102F、D102K、D102R、D102Y、A103D、A103F、A103G、A103H、A103I、A103K、A103L、A103M、A103N、A103P、A103R、A103S、A103T、A103V及A103W，且該一或多個LC胺基酸變化係選自Q27F、Q27R、G28D、G28Q、G28R、G28Y、I29F、I29L、S30D、S30E、S30F、S30L、S30Q、S30R、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31Q、S31Y、A32F、A32V、V34F、V34I、D50E、D50F、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、D50Y、A51V、S52A、S52D、S52E、S52F、S52G、S52H、S52I、S52K、S52L、S52M、S52N、S52P、S52Q、S52R、S52V、S52W、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53R、S53Y、L54E、L54Y、E55R、E55Y、S67E、S67R、S67Y、T69R、T69Y、F91E、F91R、F91Y、N92A、N92D、N92E、N92F、N92G、N92H、N92I、N92K、N92L、N92M、N92P、N92Q、N92R、N92S、N92T、N92V、N92W、N92Y、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94A、Y94D、Y94E、Y94F、Y94G、Y94H、Y94I、Y94K、Y94L、Y94M、Y94N、Y94P、Y94Q、Y94R、Y94S、Y94V及Y94W。
一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中該抗體或其片段包含相對於SEQ ID NO：3之一或多個VH胺基酸變化及/或相對於SEQ ID NO：4之一或多個VL胺基酸變化，其中該一或多個VH胺基酸變化係選自T28Y、T30F、T30K、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、H32K、H32Y、Y33D、Y33L、Y33R、N52E、N52F、N52Q、N52R、N52Y、I54A、I54D、I54F、I54G、I54H、I54K、I54L、I54M、I54N、I54P、I54R、I54V、I54W、I54Y、S55E、S55F、S55I、S55Q、S55R、S55Y、S57E、S57F、S57R、S57Y、T58F、T58R、S59A、S59D、S59E、S59F、S59G、S59H、S59I、S59K、S59L、S59M、S59N、S59P、S59Q、S59R、S59T、S59V、S59W、S59Y、N60E、N60R、N60Y、A61F、A61R、A61Y、Q62L、Q62R、Q62Y、Q65E、Q65R、Q65Y、D99F、D99R、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100Y、V101A、V101D、V101E、V101F、V101G、V101H、V101I、V101K、V101L、V101M、V101N、V101P、V101Q、V101R、V101S、V101W、D102E、D102F、D102K、D102R、D102Y、A103D、A103F、A103G、A103H、A103I、A103K、A103L、A103M、A103N、A103P、A103R、A103S、A103T、A103V及A103W，且該一或多個VL胺基酸變化係選自Q27F、Q27R、G28D、G28Q、G28R、G28Y、I29F、I29L、S30D、S30E、S30F、S30L、S30Q、S30R、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31Q、S31Y、A32F、A32V、V34F、V34I、D50E、D50F、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、D50Y、A51V、S52A、S52D、S52E、S52F、S52G、S52H、S52I、S52K、S52L、S52M、S52N、S52P、S52Q、S52R、S52V、S52W、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53R、S53Y、L54E、L54Y、E55R、E55Y、S67E、S67R、S67Y、T69R、T69Y、F91E、F91R、F91Y、N92A、N92D、N92E、N92F、N92G、N92H、N92I、N92K、N92L、N92M、N92P、N92Q、N92R、N92S、N92T、N92V、N92W、N92Y、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94A、Y94D、Y94E、Y94F、Y94G、Y94H、Y94I、Y94K、Y94L、Y94M、Y94N、Y94P、Y94Q、Y94R、Y94S、Y94V及Y94W。
某些經工程改造之FGF23結合抗體之互補決定區
布羅索尤單抗具有如下定義之互補決定區(CDR)：具有胺基酸序列NHYMH(SEQ ID NO：11)之重鏈CDR1，在本文中稱為HCDR1-001；具有胺基酸序列IINPISGSTSNAQKFQG(SEQ ID NO：12)之重鏈CDR2，在本文中稱為HCDR2-001；具有胺基酸序列DIVDAFDF(SEQ ID NO：13)之重鏈CDR3，在本文中稱為HCDR3-001；具有胺基酸序列RASQGISSALV(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR1，在本文中稱為LCDR1-001；具有胺基酸序列DASSLES(SEQ ID NO：15)之輕鏈CDR2，在本文中稱為LCDR2-001；及具有胺基酸序列QQFNDYFT(SEQ ID NO：16)之輕鏈CDR3，在本文中稱為LCDR3-001。
相對於布羅索尤單抗之互補決定區，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可包含一或多個獨特的互補決定區(CDR)。亦即，該等經工程改造之FGF23結合抗體相對於SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及/或SEQ ID NO：16可具有一或多個胺基酸變化。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：22-32之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(HCDR1)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：33-65之胺基酸序列的重鏈互補決定區2(HCDR2)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：66-93之胺基酸序列的重鏈互補決定區3(HCDR3)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：94-126之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(LCDR1)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：127-158之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2(LCDR2)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：159-185之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3(LCDR3)。
在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中：該HCDR1包含選自SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：22-32之胺基酸序列；該HCDR2包含選自SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：33-65之胺基酸序列；該HCDR3包含選自SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：66-93之胺基酸序列；該LCDR1包含選自SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：94-126之胺基酸序列；該LCDR2包含選自SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：127-158之胺基酸序列；且該LCDR3包含選自SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：159-185之胺基酸序列。
某些經工程改造之FGF23結合抗體之可變區
布羅索尤單抗具有如下重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)：具有胺基酸序列SEQ ID NO：3之VH，在本文中稱為VH-001；及具有胺基酸序列SEQ ID NO：4之VL，在本文中稱為VL-001。
相對於布羅索尤單抗，本文所描述之FGF23結合抗體可具有一或多個獨特的可變區結構域。亦即，該等FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗之VH及/或VL序列可具有一或多個胺基酸變化。
舉例而言，該經分離抗體或其片段可包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，或其中該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH，該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列，或該抗體或其片段可包含VL，該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH，該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列，或該抗體或其片段可包含VL，該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH及VL，其中該VH可包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且該VL可包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH及VL，其中該VH可包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列，且該VL可包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH及VL，其中該VH可包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列，且該VL可包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH及VL，其中該VH可包含選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列，或該VL可包含選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列。
該經分離抗體或其片段可包含VH及VL，其中該VH可包含選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列，且該VL可包含選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列。
具有雙重胺基酸變化的某些經工程改造之FGF23結合抗體
本文所描述之FGF23結合抗體相對於天然布羅索尤單抗胺基酸序列可具有一或多個胺基酸變化。舉例而言，該等FGF23結合抗體相對於布羅索尤單抗可具有至少兩個胺基酸變化。在一些實施例中，該等FGF23結合抗體具有：相對於布羅索尤單抗，針對重鏈可變區之一個胺基酸變化，及相對於布羅索尤單抗，針對輕鏈可變區之一個胺基酸變化；相對於布羅索尤單抗，針對重鏈可變區之兩個胺基酸變化；或相對於布羅索尤單抗，針對輕鏈可變區之兩個胺基酸變化。
舉例而言，在一些實施例中，本揭示案提供一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之輕鏈可變區(VL)，但在該VH及VL序列中包含至少兩個胺基酸變化，其中該至少兩個胺基酸變化係選自VL：S31E/VL：D50F、VH：N31F/VH：S59F、VL：D50F/VL：S53E、VL：S31F/VL：S52E、VL：D50F/VH：V101I、VH：S59D/VH：V101I、VL：S31F/VL：S53E、VL：N92E/VL：D93F、VL：S31E/VL：S53E、VL：S31F/VL：D50F、VH：N31E/VH：S59E、VH：S57E/VH：S59D、VH：N31E/VH：I54F、VH：S59T/VH：V101L、VH：I54Y/VH：V101F、VH：N52F/VH：V101I、VL：N92D/VL：D93F、VH：N52F/VH：V101L、VL：S31F/VL：D50E、VL：Y94D/VH：S59D、VL：Y94D/VH：S59E、VL：N92F/VH：S59E、VL：N92Y/VH：S59E、VL：Y94E/VH：S59E、VL：S52D/VH：S59E及VL：S52E/VH：S59E。
前導序列
本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可在輕鏈之N末端及/或重鏈之N末端包含前導序列。在一些實施例中，前導序列為自裂解前導序列。在一些實施例中，前導序列促進當在細胞中表現時重鏈及/或輕鏈之表現、運輸、穩定性、分泌及/或純化。在一些實施例中，前導序列係改良重鏈及/或輕鏈之細胞外運輸之分泌信號。
在某些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可在重鏈之N末端包含前導序列，其中該前導序列包含胺基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO：369)。
在某些實施例中，本文所描述的經工程改造之FGF23結合抗體可在輕鏈之N末端包含前導序列，其中該前導序列包含胺基酸序列MVSSAQFLGLLLLCFQGTRC (SEQ ID NO：370)。
C末端離胺酸剪切
布羅索尤單抗之重鏈具有C末端離胺酸殘基。已知抗體重鏈C末端離胺酸殘基在生物製造期間通常被細胞培養物或細胞培養基中存在之羧肽酶剪切。此現象可產生可變量的製程相關電荷變異體及非均質抗體製劑，且由此使製造均質、安全且有效之抗體批次的努力變得複雜(參見例如Faid等人, Eur J Pharm Sci., 2021年4月1日：159：105730)。因此，在一些實施例中，本文所描述之抗體變異體經修飾以移除重鏈C末端離胺酸殘基。亦即，本文所提供之任何重鏈抗體序列，包括親本布羅索尤單抗重鏈序列(SEQ ID NO：1)在內，均可進一步經修飾以移除C末端離胺酸殘基(SEQ ID NO：371)。因此，經考慮，本申請案中所描述之所有變異重鏈可變區(VH)序列均被併入具有或不具有C末端離胺酸殘基之全長重鏈序列中。
IV. 醫藥調配物
本文所描述之人類FGF23結合抗體可以醫藥調配物形式提供。醫藥調配物能夠進行局部或全身投與。在某些態樣中，投與可藉由任何途徑進行，包括靜脈內、皮下、肺、肌肉內、腹膜內、經皮、經口、吸入或經鼻投與。
本揭示案之醫藥調配物可包括此項技術中已知之載劑、稀釋劑或賦形劑。醫藥調配物及方法之實例描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A.R. Gennaro編輯, 1985)，以及Remington, The Science and Practice of Pharmacy,第21版(2005)中。
用於醫藥調配物之賦形劑之實例包括抗氧化劑、懸浮劑、分散劑、防腐劑、緩衝劑、張力劑及界面活性劑。
在某些實施例中，本揭示案之醫藥調配物係供皮下注射用之溶液，其包含本文所提供之人類FGF23結合抗體及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑，該一或多種醫藥學上可接受之賦形劑係選自L-組胺酸、D-山梨糖醇E420、聚山梨醇酯80、L-甲硫胺酸、鹽酸(用於pH調節)及/或水。
V. 投與方法
布羅索尤單抗僅適於皮下使用。在6個月及以上之兒科XLH患者中，對於體重小於10 kg之患者，起始劑量方案為1 mg/kg體重，四捨五入至最接近之1 mg，每兩週(Q2W)投與。對於6個月及以上且體重為10 kg及以上之XLH患者，起始劑量方案為0.8 mg/kg體重，四捨五入至最接近之10 mg，每兩週(Q2W)投與。最低起始劑量為10 mg，直至最大劑量為90 mg。劑量可增加至約2 mg/kg(最大90 mg)，每兩週(Q2W)投與，以獲得正常血清磷。在成年XLH患者中，劑量方案為1 mg/kg體重，四捨五入至最接近之10 mg，直至最大劑量為90 mg，每四周(Q4W)投與。在2歲及以上之兒科TIO患者中，起始劑量為0.4 mg/kg體重，四捨五入至最接近之10 mg，每2週(Q2W)投與。劑量可增加至最大2 mg/kg，不超過180 mg，每兩週(Q2W)投與。在成年TIO患者中，起始劑量為0.5 mg/kg，每四週(Q4W)投與。劑量可增加至最大2 mg/kg，不超過180 mg，每兩週(Q2W)投與。
本揭示案之抗體可根據布羅索尤單抗之適合用途投與。
在一些實施例中，本揭示案之抗體或其醫藥調配物可以治療有效劑量投與。治療有效劑量可為足以在投與該治療有效劑量之個體中引起治療作用之劑或調配物之量。
治療有效劑量的本文所提供之人類FGF23結合抗體或其醫藥調配物將降低個體之血清FGF23；增加個體之腎磷酸鹽再吸收最大臨限值(TmP)；增加個體之血清無機磷(Pi)；增加個體之血清1,25二羥基維生素D (1,25[OH]2D)濃度；及/或可用於治療個體之低磷血疾患，包括XLH或骨軟化症。
治療有效劑量可分一或多次單獨投與且藉由不同途徑投與。此項技術中應了解，治療有效劑量或治療有效量在很大程度上基於醫藥調配物中所含治療劑之總量確定。一般而言，治療有效量足以達成對於個體有意義之益處(例如治療、調節、治癒、預防及/或改善低磷血症相關疾患)。舉例而言，治療有效量可為足以達成所需治療及/或預防效果之量。一般而言，向有需要之個體投與之治療劑(例如本揭示案之抗體或其功能活性片段)之量將取決於個體之特徵。此等特徵包括個體之疾患、疾病嚴重程度、一般健康狀況、年齡、性別及體重。一般熟習此項技術者將能夠根據此等及其他相關因素容易地確定適當劑量。另外，亦可視情況採用客觀及主觀分析兩者來鑑別最佳劑量範圍。
本文所提供之方法涵蓋單次及多次投與治療有效量的本文所描述之人類FGF23結合抗體及其醫藥調配物。包含人類FGF23結合抗體之醫藥調配物可按規律時間間隔投與，此取決於個體疾患之性質、嚴重程度及範圍(例如個體之疾病狀態之嚴重程度及低磷血症之相關症狀)。在一些實施例中，治療有效量的本揭示案之人類FGF23結合抗體及其醫藥調配物可以按規律時間間隔(例如每年一次、每六個月一次、每四個月一次、每三個月一次、每兩個月一次、每月一次)、每4週一次、每3週一次、每兩週一次、每週一次、每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次、每天五次、一天六次或持續地定期投與。舉例而言，治療有效量的本揭示案之人類FGF23結合抗體及其醫藥調配物可每週一次、每兩週一次或每月一次投與。
投與治療有效量的本文所提供之人類FGF23結合抗體或其調配物可包括向個體投與在約0.1毫克抗體/公斤(mg/kg)個體之體重與約100 mg/ kg個體之體重之間、在約0.1 mg/kg與約50 mg/kg之間、在約0.1 mg/kg與約20 mg/kg之間、在約0.1 mg/kg與約10 mg/kg之間、在約0.1 mg與約1 mg/kg之間、約0.1 mg/kg、約0.2 mg/kg、約0.3 mg/kg、約0.4 mg/kg、約0.5 mg/kg、約0.6 mg/kg、約0.7 mg/kg、約0.8 mg/kg、約0.9 mg/kg、約1 mg/kg、約1.1 mg/kg、約1.2 mg/kg、約1.3 mg/kg、約1.4 mg/kg、約1.5 mg/kg、約1.6 mg/kg、約1.7 mg/kg、約1.8 mg/kg、約1.9 mg/kg、約2 mg/kg、約2.1 mg/kg、約2.2 mg/kg、約2.3 mg /kg、約2.4 mg/kg、約2.5 mg/kg、約2.6 mg/kg、約2.7 mg/kg、約2.8 mg/kg、約2.9 mg/kg、約3 mg/kg、約3.1 mg/kg、約3.2 mg/kg、約3.3 mg/kg、約3.4 mg/kg、約3.5 mg/kg、約3.6 mg/kg、約3.7 mg/kg、約3.8 mg/kg、約3.9 mg/kg、約4 mg/kg、約4.1 mg/kg、約4.2 mg/kg、約4.3 mg/kg、約4.4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約4.6 mg/kg、約4.7 mg /kg、約4.8 mg/kg、約4.9 mg/kg或約5 mg/kg之劑量。在一些實施例中，投與治療有效量的本文所提供之人類FGF23結合抗體或其調配物可包括向個體投與小於4 mg/kg、小於3 mg/kg、小於2 mg/kg或小於1 mg/kg。
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在說明書通篇，當將組成物描述為具有、包括或包含特定組分時，或當將製程及方法描述為具有、包括或包含特定步驟時，經考慮，另外，本發明之組成物基本上由所列舉組分組成或由所列舉組分組成，且根據本揭示案之製程及方法基本上由所列舉步驟組成或由所列舉步驟組成。
在本申請案中，當提及一要素或組分包括在所列舉要素或組分之清單中及/或選自所列舉要素或組分之清單時，應理解，該要素或組分可為所列舉要素或組分中之任一者，或該要素或組分可選自由所列舉要素或組分中之兩者或更多者組成之群。
此外，應理解，本文所描述之組成物或方法之要素及/或特徵可在不脫離本揭示案之精神及範圍的情況下以多種方式組合，無論在本文中明示還是暗示。舉例而言，在提及特定化合物之情況下，除非自上下文另有理解，否則該化合物可用於本揭示案之組成物的各個實施例及/或本揭示案之方法中。換言之，在本申請案內，已以能夠書寫及繪製清晰且簡明之申請案的方式來描述及描繪實施例，但預期且應理解，可在不脫離本教示及揭示內容之情況下以各種方式組合或分開各實施例。舉例而言，應了解，本文所描述及描繪之所有特徵可適用於本文所描述及描繪之揭示內容的所有態樣。本說明書中所揭示的所有特徵可以組合成任何組合。本說明書中所揭示之各特徵可經用於相同、等效或相似目的之替代特徵替代。
應理解，除非自上下文及使用另外理解，否則表述「……中之至少一者」個別地包括該表述之後所列舉對象中之每一者及所列舉對象中之兩者或更多者的各種組合。除非自上下文另外理解，否則與三個或更多個所列舉對象相關之表述「及/或」將被理解為具有相同含義。
使用術語「包括(include)」、「包括(includes)」、「包括(including)」、「具有(have)」、「具有(has)」、「具有(having)」、「含有(contain)」、「含有(contains)」或「含有(containing)」，包括其語法等效形式，一般應理解為開放式且非限制性的，例如，不排除額外的未列舉之要素或步驟，除非上下文另有明確說明或理解。
本文中使用的任何及所有實例或例示性語言，例如，「舉例而言(for instance)」、「諸如」、「例如(for example)」、「例如(e.g.,)」或「包括」僅意欲更好地說明本揭示案，且除非主張，否則不會對本揭示案之範圍構成限制。本說明書中之任何語言均不應被解釋為指示任何未主張之要素對於本揭示案之主題之實踐為必不可少的。
應理解，本揭示案不限於所描述之特定方法、方案、材料及試劑，因為此等可變化。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且不意欲限制本揭示案之範圍，本揭示案之範圍將涵蓋在所附申請專利範圍內。
本說明書通篇提及的所有公開案、專利及專利申請案，包括其中之任何圖式、序列及附錄，均以引用的方式整體併入用於所有目的，其引用程度就如同特定地且個別地指示每一個別公開案、專利或專利申請案、圖式、序列或附錄以引用之方式整體併入以用於所有目的。
實例
現在一般性地描述之本揭示案藉由參照以下出於說明本揭示案之某些態樣及實施例而非限制本揭示案之目的而包括的實例將更容易地理解。
實例 1. 抗體結構編號 (ASN#) 系統
利用了各種編號方案來描述抗體胺基酸序列，包括線性編號、Kabat編號、Chothia編號及抗體結構編號(ASN#)系統。本文所描述之抗體殘基係根據ASN編號系統及/或線性編號系統呈現。為便利此等編號方案之間的轉換，表1以線性、Kabat及ASN編號系統顯示布羅索尤單抗親本輕鏈胺基酸序列，且表2以線性、Kabat及ASN編號系統顯示布羅索尤單抗親本重鏈胺基酸序列。在表1及表2中，「殘基」欄分別顯示來自SEQ ID NO：2之布羅索尤單抗輕鏈序列及SEQ ID NO：1之布羅索尤單抗重鏈序列的胺基酸殘基。在「Kabat編號」欄中，「L」名稱係指輕鏈且H名稱係指重鏈。在「ASN編號」欄中，「KV」係指輕鏈可變區，「KCnst-Ig」係指輕鏈恆定區，「HV」係指重鏈可變區，「HCnst-Ig」係指重鏈恆定區，「Fc-N」係指Fc之CH2區，「Fc-C」係指Fc之CH3區，「HCnst-Po」係指可能歸於重鏈恆定區之殘基且「鉸鏈」係指鉸鏈區殘基。
表1. 布羅索尤單抗輕鏈胺基酸序列編號方案轉換表
表2. 布羅索尤單抗重鏈胺基酸序列編號方案轉換表
實例 2 ：布羅索尤單抗 - 人類 FGF23 之抗原決定基定位
| 殘基 | 線性編號 | Kabat 編號 | ASN 編號 | 殘基 | 線性編號 | Kabat 編號 | ASN 編號 |
| A | 1 | L1 | KV：1 | F | 95 | L96 | KV：137 |
| I | 2 | L2 | KV：2 | T | 96 | L97 | KV：138 |
| Q | 3 | L3 | KV：3 | F | 97 | L98 | KV：139 |
| L | 4 | L4 | KV：4 | G | 98 | L99 | KV：140 |
| T | 5 | L5 | KV：5 | P | 99 | L100 | KV：141 |
| Q | 6 | L6 | KV：6 | G | 100 | L101 | KV：142 |
| S | 7 | L7 | KV：7 | T | 101 | L102 | KV：143 |
| P | 8 | L8 | KV：8 | K | 102 | L103 | KV：144 |
| S | 9 | L9 | KV：9 | V | 103 | L104 | KV：145 |
| S | 10 | L10 | KV：10 | D | 104 | L105 | KV：146 |
| L | 11 | L11 | KV：11 | I | 105 | L106 | KV：147 |
| S | 12 | L12 | KV：12 | K | 106 | L107 | KV：148 |
| A | 13 | L13 | KV：13 | R | 107 | L108 | KV：149 |
| S | 14 | L14 | KV：14 | - | 107.1 | KCnst-Ig：1 | |
| V | 15 | L15 | KV：15 | T | 108 | L109 | KCnst-Ig：2 |
| G | 16 | L16 | KV：16 | V | 109 | L110 | KCnst-Ig：3 |
| D | 17 | L17 | KV：17 | A | 110 | L111 | KCnst-Ig：4 |
| R | 18 | L18 | KV：18 | A | 111 | L112 | KCnst-Ig：5 |
| V | 19 | L19 | KV：19 | P | 112 | L113 | KCnst-Ig：6 |
| T | 20 | L20 | KV：20 | S | 113 | L114 | KCnst-Ig：7 |
| I | 21 | L21 | KV：21 | V | 114 | L115 | KCnst-Ig：8 |
| T | 22 | L22 | KV：22 | F | 115 | L116 | KCnst-Ig：9 |
| C | 23 | L23 | KV：23 | I | 116 | L117 | KCnst-Ig：10 |
| R | 24 | L24 | KV：24 | F | 117 | L118 | KCnst-Ig：11 |
| A | 25 | L25 | KV：25 | P | 118 | L119 | KCnst-Ig：12 |
| S | 26 | L26 | KV：26 | P | 119 | L120 | KCnst-Ig：13 |
| - | 26.1 | KV：27 | S | 120 | L121 | KCnst-Ig：14 | |
| - | 26.2 | KV：28 | D | 121 | L122 | KCnst-Ig：15 | |
| Q | 27 | L27 | KV：29 | E | 122 | L123 | KCnst-Ig：16 |
| G | 28 | L28 | KV：30 | - | 122.1 | KCnst-Ig：17 | |
| I | 29 | L29 | KV：31 | - | 122.2 | KCnst-Ig：18 | |
| S | 30 | L30 | KV：32 | Q | 123 | L124 | KCnst-Ig：19 |
| S | 31 | L31 | KV：33 | L | 124 | L125 | KCnst-Ig：20 |
| - | 31.1 | KV：34 | - | 124.1 | KCnst-Ig：21 | ||
| - | 31.2 | KV：35 | - | 124.2 | KCnst-Ig：22 | ||
| - | 31.3 | KV：36 | K | 125 | L126 | KCnst-Ig：23 | |
| - | 31.4 | KV：37 | S | 126 | L127 | KCnst-Ig：24 | |
| - | 31.5 | KV：38 | G | 127 | L128 | KCnst-Ig：25 | |
| - | 31.6 | KV：39 | T | 128 | L129 | KCnst-Ig：26 | |
| A | 32 | L32 | KV：40 | A | 129 | L130 | KCnst-Ig：27 |
| L | 33 | L33 | KV：41 | S | 130 | L131 | KCnst-Ig：28 |
| V | 34 | L34 | KV：42 | V | 131 | L132 | KCnst-Ig：29 |
| W | 35 | L35 | KV：43 | V | 132 | L133 | KCnst-Ig：30 |
| Y | 36 | L36 | KV：44 | C | 133 | L134 | KCnst-Ig：31 |
| Q | 37 | L37 | KV：45 | L | 134 | L135 | KCnst-Ig：32 |
| Q | 38 | L38 | KV：46 | L | 135 | L136 | KCnst-Ig：33 |
| K | 39 | L39 | KV：47 | N | 136 | L137 | KCnst-Ig：34 |
| P | 40 | L40 | KV：48 | N | 137 | L138 | KCnst-Ig：35 |
| G | 41 | L41 | KV：49 | F | 138 | L139 | KCnst-Ig：36 |
| K | 42 | L42 | KV：50 | Y | 139 | L140 | KCnst-Ig：37 |
| A | 43 | L43 | KV：51 | P | 140 | L141 | KCnst-Ig：38 |
| P | 44 | L44 | KV：52 | - | 140.1 | KCnst-Ig：39 | |
| K | 45 | L45 | KV：53 | - | 140.2 | KCnst-Ig：40 | |
| L | 46 | L46 | KV：54 | R | 141 | L142 | KCnst-Ig：41 |
| L | 47 | L47 | KV：55 | E | 142 | L143 | KCnst-Ig：42 |
| I | 48 | L48 | KV：56 | A | 143 | L144 | KCnst-Ig：43 |
| Y | 49 | L49 | KV：57 | K | 144 | L145 | KCnst-Ig：44 |
| D | 50 | L50 | KV：58 | V | 145 | L146 | KCnst-Ig：45 |
| - | 50.1 | KV：59 | Q | 146 | L147 | KCnst-Ig：46 | |
| - | 50.2 | KV：60 | W | 147 | L148 | KCnst-Ig：47 | |
| - | 50.3 | KV：61 | - | 147.1 | KCnst-Ig：48 | ||
| - | 50.4 | KV：62 | K | 148 | L149 | KCnst-Ig：49 | |
| - | 50.5 | KV：63 | V | 149 | L150 | KCnst-Ig：50 | |
| - | 50.6 | KV：64 | D | 150 | L151 | KCnst-Ig：51 | |
| - | 50.7 | KV：65 | N | 151 | L152 | KCnst-Ig：52 | |
| - | 50.8 | KV：66 | A | 152 | L153 | KCnst-Ig：53 | |
| A | 51 | L51 | KV：67 | L | 153 | L154 | KCnst-Ig：54 |
| S | 52 | L52 | KV：68 | Q | 154 | L155 | KCnst-Ig：55 |
| S | 53 | L53 | KV：69 | S | 155 | L156 | KCnst-Ig：56 |
| L | 54 | L54 | KV：70 | G | 156 | L157 | KCnst-Ig：57 |
| E | 55 | L55 | KV：71 | N | 157 | L158 | KCnst-Ig：58 |
| S | 56 | L56 | KV：72 | S | 158 | L159 | KCnst-Ig：59 |
| G | 57 | L57 | KV：73 | Q | 159 | L160 | KCnst-Ig：60 |
| V | 58 | L58 | KV：74 | E | 160 | L161 | KCnst-Ig：61 |
| P | 59 | L59 | KV：75 | S | 161 | L162 | KCnst-Ig：62 |
| S | 60 | L60 | KV：76 | V | 162 | L163 | KCnst-Ig：63 |
| R | 61 | L61 | KV：77 | T | 163 | L164 | KCnst-Ig：64 |
| F | 62 | L62 | KV：78 | E | 164 | L165 | KCnst-Ig：65 |
| S | 63 | L63 | KV：79 | Q | 165 | L166 | KCnst-Ig：66 |
| G | 64 | L64 | KV：80 | D | 166 | L167 | KCnst-Ig：67 |
| S | 65 | L65 | KV：81 | - | 166.1 | KCnst-Ig：68 | |
| G | 66 | L66 | KV：82 | - | 166.2 | KCnst-Ig：69 | |
| S | 67 | L67 | KV：83 | - | 166.3 | KCnst-Ig：70 | |
| G | 68 | L68 | KV：84 | - | 166.4 | KCnst-Ig：71 | |
| - | 68.1 | KV：85 | S | 167 | L168 | KCnst-Ig：72 | |
| - | 68.2 | KV：86 | K | 168 | L169 | KCnst-Ig：73 | |
| T | 69 | L69 | KV：87 | D | 169 | L170 | KCnst-Ig：74 |
| D | 70 | L70 | KV：88 | S | 170 | L171 | KCnst-Ig：75 |
| F | 71 | L71 | KV：89 | T | 171 | L172 | KCnst-Ig：76 |
| T | 72 | L72 | KV：90 | Y | 172 | L173 | KCnst-Ig：77 |
| L | 73 | L73 | KV：91 | S | 173 | L174 | KCnst-Ig：78 |
| T | 74 | L74 | KV：92 | L | 174 | L175 | KCnst-Ig：79 |
| I | 75 | L75 | KV：93 | S | 175 | L176 | KCnst-Ig：80 |
| S | 76 | L76 | KV：94 | S | 176 | L177 | KCnst-Ig：81 |
| S | 77 | L77 | KV：95 | T | 177 | L178 | KCnst-Ig：82 |
| L | 78 | L78 | KV：96 | L | 178 | L179 | KCnst-Ig：83 |
| Q | 79 | L79 | KV：97 | T | 179 | L180 | KCnst-Ig：84 |
| P | 80 | L80 | KV：98 | L | 180 | L181 | KCnst-Ig：85 |
| E | 81 | L81 | KV：99 | S | 181 | L182 | KCnst-Ig：86 |
| D | 82 | L82 | KV：100 | K | 182 | L183 | KCnst-Ig：87 |
| F | 83 | L83 | KV：101 | A | 183 | L184 | KCnst-Ig：88 |
| A | 84 | L84 | KV：102 | D | 184 | L185 | KCnst-Ig：89 |
| T | 85 | L85 | KV：103 | Y | 185 | L186 | KCnst-Ig：90 |
| Y | 86 | L86 | KV：104 | - | 185.1 | KCnst-Ig：91 | |
| Y | 87 | L87 | KV：105 | E | 186 | L187 | KCnst-Ig：92 |
| C | 88 | L88 | KV：106 | K | 187 | L188 | KCnst-Ig：93 |
| Q | 89 | L89 | KV：107 | H | 188 | L189 | KCnst-Ig：94 |
| Q | 90 | L90 | KV：108 | K | 189 | L190 | KCnst-Ig：95 |
| F | 91 | L91 | KV：109 | V | 190 | L191 | KCnst-Ig：96 |
| N | 92 | L92 | KV：110 | - | 190.1 | KCnst-Ig：97 | |
| - | 92.1 | KV：111 | - | 190.2 | KCnst-Ig：98 | ||
| - | 92.2 | KV：112 | Y | 191 | L192 | KCnst-Ig：99 | |
| - | 92.3 | KV：113 | A | 192 | L193 | KCnst-Ig：100 | |
| - | 92.4 | KV：114 | C | 193 | L194 | KCnst-Ig：101 | |
| - | 92.5 | KV：115 | E | 194 | L195 | KCnst-Ig：102 | |
| - | 92.6 | KV：116 | V | 195 | L196 | KCnst-Ig：103 | |
| - | 92.7 | KV：117 | T | 196 | L197 | KCnst-Ig：104 | |
| - | 92.8 | KV：118 | H | 197 | L198 | KCnst-Ig：105 | |
| - | 92.9 | KV：119 | Q | 198 | L199 | KCnst-Ig：106 | |
| - | 92.10 | KV：120 | G | 199 | L200 | KCnst-Ig：107 | |
| - | 92.11 | KV：121 | L | 200 | L201 | KCnst-Ig：108 | |
| - | 92.12 | KV：122 | S | 201 | L202 | KCnst-Ig：109 | |
| - | 92.13 | KV：123 | - | 201.1 | KCnst-Ig：110 | ||
| - | 92.14 | KV：124 | S | 202 | L203 | KCnst-Ig：111 | |
| - | 92.15 | KV：125 | P | 203 | L204 | KCnst-Ig：112 | |
| - | 92.16 | KV：126 | V | 204 | L205 | KCnst-Ig：113 | |
| - | 92.17 | KV：127 | T | 205 | L206 | KCnst-Ig：114 | |
| - | 92.18 | KV：128 | K | 206 | L207 | KCnst-Ig：115 | |
| - | 92.19 | KV：129 | S | 207 | L208 | KCnst-Ig：116 | |
| - | 92.20 | KV：130 | F | 208 | L209 | KCnst-Ig：117 | |
| - | 92.21 | KV：131 | N | 209 | L210 | KCnst-Ig：118 | |
| - | 92.22 | KV：132 | R | 210 | L211 | KCnst-Ig：119 | |
| - | 92.23 | KV：133 | G | 211 | L212 | KCnst-Ig：120 | |
| - | 92.24 | KV：134 | E | 212 | L213 | KCnst-Ig：121 | |
| D | 93 | L93 | KV：135 | C | 213 | L214 | KCnst-Ig：122 |
| Y | 94 | L94 | KV：136 | - | 213.1 | KCnst-Ig：123 |
| 殘基 | 線性編號 | Kabat 編號 | ASN 編號 | 殘基 | 線性編號 | Kabat 編號 | ASN 編號 | ||
| Q | 1 | H1 | HV：1 | T | 225 | H238 | 鉸鏈：112 | ||
| V | 2 | H2 | HV：2 | C | 226 | H239 | 鉸鏈：113 | ||
| Q | 3 | H3 | HV：3 | P | 227 | H240 | 鉸鏈：114 | ||
| L | 4 | H4 | HV：4 | P | 228 | H241 | 鉸鏈：115 | ||
| V | 5 | H5 | HV：5 | C | 229 | H242 | 鉸鏈：116 | ||
| Q | 6 | H6 | HV：6 | P | 230 | H243 | 鉸鏈：117 | ||
| S | 7 | H7 | HV：7 | A | 231 | H244 | 鉸鏈：118 | ||
| - | 7.1 | HV：8 | P | 232 | H245 | 鉸鏈：119 | |||
| G | 8 | H8 | HV：9 | E | 233 | H246 | 鉸鏈：120 | ||
| A | 9 | H9 | HV：10 | L | 234 | H247 | 鉸鏈：121 | ||
| E | 10 | H10 | HV：11 | L | 235 | H248 | 鉸鏈：122 | ||
| V | 11 | H11 | HV：12 | G | 236 | H249 | 鉸鏈：123 | ||
| K | 12 | H12 | HV：13 | - | 236.1 | Fc-N：1 | |||
| K | 13 | H13 | HV：14 | - | 236.2 | Fc-N：2 | |||
| P | 14 | H14 | HV：15 | - | 236.3 | Fc-N：3 | |||
| G | 15 | H15 | HV：16 | - | 236.4 | Fc-N：4 | |||
| A | 16 | H16 | HV：17 | G | 237 | H250 | Fc-N：5 | ||
| S | 17 | H17 | HV：18 | P | 238 | H251 | Fc-N：6 | ||
| V | 18 | H18 | HV：19 | S | 239 | H252 | Fc-N：7 | ||
| K | 19 | H19 | HV：20 | V | 240 | H253 | Fc-N：8 | ||
| V | 20 | H20 | HV：21 | F | 241 | H254 | Fc-N：9 | ||
| S | 21 | H21 | HV：22 | L | 242 | H255 | Fc-N：10 | ||
| C | 22 | H22 | HV：23 | F | 243 | H256 | Fc-N：11 | ||
| K | 23 | H23 | HV：24 | P | 244 | H257 | Fc-N：12 | ||
| A | 24 | H24 | HV：25 | P | 245 | H258 | Fc-N：13 | ||
| S | 25 | H25 | HV：26 | - | 245.1 | Fc-N：14 | |||
| G | 26 | H26 | HV：27 | K | 246 | H259 | Fc-N：15 | ||
| - | 26.1 | HV：28 | P | 247 | H260 | Fc-N：16 | |||
| Y | 27 | H27 | HV：29 | K | 248 | H261 | Fc-N：17 | ||
| T | 28 | H28 | HV：30 | - | 248.1 | Fc-N：18 | |||
| F | 29 | H29 | HV：31 | D | 249 | H262 | Fc-N：19 | ||
| T | 30 | H30 | HV：32 | T | 250 | H263 | Fc-N：20 | ||
| N | 31 | H31 | HV：33 | L | 251 | H264 | Fc-N：21 | ||
| - | 31.1 | HV：34 | M | 252 | H265 | Fc-N：22 | |||
| - | 31.2 | HV：35 | I | 253 | H266 | Fc-N：23 | |||
| - | 31.3 | HV：36 | S | 254 | H267 | Fc-N：24 | |||
| - | 31.4 | HV：37 | R | 255 | H268 | Fc-N：25 | |||
| - | 31.5 | HV：38 | T | 256 | H269 | Fc-N：26 | |||
| H | 32 | H32 | HV：39 | P | 257 | H270 | Fc-N：27 | ||
| Y | 33 | H33 | HV：40 | E | 258 | H271 | Fc-N：28 | ||
| M | 34 | H34 | HV：41 | V | 259 | H272 | Fc-N：29 | ||
| H | 35 | H35 | HV：42 | T | 260 | H273 | Fc-N：30 | ||
| W | 36 | H36 | HV：43 | C | 261 | H274 | Fc-N：31 | ||
| V | 37 | H37 | HV：44 | V | 262 | H275 | Fc-N：32 | ||
| R | 38 | H38 | HV：45 | V | 263 | H276 | Fc-N：33 | ||
| Q | 39 | H39 | HV：46 | V | 264 | H277 | Fc-N：34 | ||
| A | 40 | H40 | HV：47 | D | 265 | H278 | Fc-N：35 | ||
| P | 41 | H41 | HV：48 | V | 266 | H279 | Fc-N：36 | ||
| G | 42 | H42 | HV：49 | S | 267 | H280 | Fc-N：37 | ||
| Q | 43 | H43 | HV：50 | H | 268 | H281 | Fc-N：38 | ||
| G | 44 | H44 | HV：51 | E | 269 | H282 | Fc-N：39 | ||
| L | 45 | H45 | HV：52 | D | 270 | H283 | Fc-N：40 | ||
| E | 46 | H46 | HV：53 | P | 271 | H284 | Fc-N：41 | ||
| W | 47 | H47 | HV：54 | E | 272 | H285 | Fc-N：42 | ||
| M | 48 | H48 | HV：55 | V | 273 | H286 | Fc-N：43 | ||
| G | 49 | H49 | HV：56 | K | 274 | H287 | Fc-N：44 | ||
| I | 50 | H50 | HV：57 | F | 275 | H288 | Fc-N：45 | ||
| I | 51 | H51 | HV：58 | N | 276 | H289 | Fc-N：46 | ||
| N | 52 | H52 | HV：59 | W | 277 | H290 | Fc-N：47 | ||
| P | 53 | H52A | HV：60 | - | 277.1 | Fc-N：48 | |||
| - | 53.1 | HV：61 | Y | 278 | H291 | Fc-N：49 | |||
| - | 53.2 | HV：62 | V | 279 | H292 | Fc-N：50 | |||
| - | 53.3 | HV：63 | D | 280 | H295 | Fc-N：51 | |||
| I | 54 | H53 | HV：64 | G | 281 | H296 | Fc-N：52 | ||
| S | 55 | H54 | HV：65 | V | 282 | H299 | Fc-N：53 | ||
| G | 56 | H55 | HV：66 | E | 283 | H300 | Fc-N：54 | ||
| S | 57 | H56 | HV：67 | - | 283.1 | Fc-N：55 | |||
| T | 58 | H57 | HV：68 | - | 283.2 | Fc-N：56 | |||
| S | 59 | H58 | HV：69 | V | 284 | H301 | Fc-N：57 | ||
| N | 60 | H59 | HV：70 | H | 285 | H302 | Fc-N：58 | ||
| A | 61 | H60 | HV：71 | N | 286 | H303 | Fc-N：59 | ||
| Q | 62 | H61 | HV：72 | A | 287 | H304 | Fc-N：60 | ||
| K | 63 | H62 | HV：73 | K | 288 | H305 | Fc-N：61 | ||
| F | 64 | H63 | HV：74 | T | 289 | H306 | Fc-N：62 | ||
| Q | 65 | H64 | HV：75 | K | 290 | H307 | Fc-N：63 | ||
| G | 66 | H65 | HV：76 | P | 291 | H308 | Fc-N：64 | ||
| R | 67 | H66 | HV：77 | R | 292 | H309 | Fc-N：65 | ||
| V | 68 | H67 | HV：78 | E | 293 | H310 | Fc-N：66 | ||
| T | 69 | H68 | HV：79 | E | 294 | H311 | Fc-N：67 | ||
| M | 70 | H69 | HV：80 | Q | 295 | H312 | Fc-N：68 | ||
| T | 71 | H70 | HV：81 | - | 295.1 | Fc-N：69 | |||
| R | 72 | H71 | HV：82 | - | 295.2 | Fc-N：70 | |||
| D | 73 | H72 | HV：83 | - | 295.3 | Fc-N：71 | |||
| T | 74 | H73 | HV：84 | - | 295.4 | Fc-N：72 | |||
| S | 75 | H74 | HV：85 | Y | 296 | H313 | Fc-N：73 | ||
| T | 76 | H75 | HV：86 | N | 297 | H314 | Fc-N：74 | ||
| S | 77 | H76 | HV：87 | S | 298 | H317 | Fc-N：75 | ||
| T | 78 | H77 | HV：88 | T | 299 | H318 | Fc-N：76 | ||
| V | 79 | H78 | HV：89 | Y | 300 | H319 | Fc-N：77 | ||
| Y | 80 | H79 | HV：90 | R | 301 | H320 | Fc-N：78 | ||
| M | 81 | H80 | HV：91 | V | 302 | H321 | Fc-N：79 | ||
| E | 82 | H81 | HV：92 | V | 303 | H322 | Fc-N：80 | ||
| L | 83 | H82 | HV：93 | S | 304 | H323 | Fc-N：81 | ||
| S | 84 | H82A | HV：94 | V | 305 | H324 | Fc-N：82 | ||
| S | 85 | H82B | HV：95 | L | 306 | H325 | Fc-N：83 | ||
| L | 86 | H82C | HV：96 | T | 307 | H326 | Fc-N：84 | ||
| R | 87 | H83 | HV：97 | V | 308 | H327 | Fc-N：85 | ||
| S | 88 | H84 | HV：98 | L | 309 | H328 | Fc-N：86 | ||
| E | 89 | H85 | HV：99 | H | 310 | H329 | Fc-N：87 | ||
| D | 90 | H86 | HV：100 | Q | 311 | H330 | Fc-N：88 | ||
| T | 91 | H87 | HV：101 | D | 312 | H331 | Fc-N：89 | ||
| A | 92 | H88 | HV：102 | W | 313 | H332 | Fc-N：90 | ||
| V | 93 | H89 | HV：103 | - | 313.1 | Fc-N：91 | |||
| Y | 94 | H90 | HV：104 | L | 314 | H333 | Fc-N：92 | ||
| Y | 95 | H91 | HV：105 | N | 315 | H334 | Fc-N：93 | ||
| C | 96 | H92 | HV：106 | G | 316 | H335 | Fc-N：94 | ||
| A | 97 | H93 | HV：107 | K | 317 | H336 | Fc-N：95 | ||
| R | 98 | H94 | HV：108 | E | 318 | H337 | Fc-N：96 | ||
| D | 99 | H95 | HV：109 | - | 318.1 | Fc-N：97 | |||
| I | 100 | H96 | HV：110 | - | 318.2 | Fc-N：98 | |||
| V | 101 | H97 | HV：111 | Y | 319 | H338 | Fc-N：99 | ||
| - | 101.1 | HV：112 | K | 320 | H339 | Fc-N：100 | |||
| - | 101.2 | HV：113 | C | 321 | H340 | Fc-N：101 | |||
| - | 101.3 | HV：114 | K | 322 | H341 | Fc-N：102 | |||
| - | 101.4 | HV：115 | V | 323 | H342 | Fc-N：103 | |||
| - | 101.5 | HV：116 | S | 324 | H343 | Fc-N：104 | |||
| - | 101.6 | HV：117 | N | 325 | H344 | Fc-N：105 | |||
| - | 101.7 | HV：118 | K | 326 | H345 | Fc-N：106 | |||
| - | 101.8 | HV：119 | A | 327 | H346 | Fc-N：107 | |||
| - | 101.9 | HV：120 | L | 328 | H347 | Fc-N：108 | |||
| - | 101.10 | HV：121 | P | 329 | H348 | Fc-N：109 | |||
| - | 101.11 | HV：122 | - | 329.1 | Fc-N：110 | ||||
| - | 101.12 | HV：123 | - | 329.2 | Fc-N：111 | ||||
| - | 101.13 | HV：124 | A | 330 | H349 | Fc-N：112 | |||
| - | 101.14 | HV：125 | P | 331 | H350 | Fc-N：113 | |||
| - | 101.15 | HV：126 | I | 332 | H351 | Fc-N：114 | |||
| - | 101.16 | HV：127 | E | 333 | H352 | Fc-N：115 | |||
| - | 101.17 | HV：128 | K | 334 | H353 | Fc-N：116 | |||
| - | 101.18 | HV：129 | T | 335 | H354 | Fc-N：117 | |||
| - | 101.19 | HV：130 | I | 336 | H355 | Fc-N：118 | |||
| - | 101.20 | HV：131 | S | 337 | H357 | Fc-N：119 | |||
| - | 101.21 | HV：132 | K | 338 | H358 | Fc-N：120 | |||
| - | 101.22 | HV：133 | A | 339 | H359 | Fc-N：121 | |||
| D | 102 | H98 | HV：134 | K | 340 | H360 | Fc-N：122 | ||
| A | 103 | H99 | HV：135 | G | 341 | H361 | Fc-N：123 | ||
| F | 104 | H100 | HV：136 | - | 341.1 | Fc-C：1 | |||
| D | 105 | H101 | HV：137 | Q | 342 | H363 | Fc-C：2 | ||
| F | 106 | H102 | HV：138 | P | 343 | H364 | Fc-C：3 | ||
| W | 107 | H103 | HV：139 | R | 344 | H365 | Fc-C：4 | ||
| G | 108 | H104 | HV：140 | E | 345 | H366 | Fc-C：5 | ||
| Q | 109 | H105 | HV：141 | P | 346 | H367 | Fc-C：6 | ||
| G | 110 | H106 | HV：142 | Q | 347 | H368 | Fc-C：7 | ||
| T | 111 | H107 | HV：143 | V | 348 | H369 | Fc-C：8 | ||
| M | 112 | H108 | HV：144 | Y | 349 | H370 | Fc-C：9 | ||
| V | 113 | H109 | HV：145 | T | 350 | H371 | Fc-C：10 | ||
| T | 114 | H110 | HV：146 | L | 351 | H372 | Fc-C：11 | ||
| V | 115 | H111 | HV：147 | P | 352 | H373 | Fc-C：12 | ||
| S | 116 | H112 | HV：148 | P | 353 | H374 | Fc-C：13 | ||
| S | 117 | H113 | HV：149 | - | 353.1 | Fc-C：14 | |||
| - | 117.1 | HCnst-Ig：1 | S | 354 | H375 | Fc-C：15 | |||
| - | 117.2 | HCnst-Ig：2 | R | 355 | H376 | Fc-C：16 | |||
| A | 118 | H114 | HCnst-Ig：3 | D | 356 | H377 | Fc-C：17 | ||
| S | 119 | H115 | HCnst-Ig：4 | - | 356.1 | Fc-C：18 | |||
| T | 120 | H116 | HCnst-Ig：5 | E | 357 | H378 | Fc-C：19 | ||
| K | 121 | H117 | HCnst-Ig：6 | L | 358 | H381 | Fc-C：20 | ||
| G | 122 | H118 | HCnst-Ig：7 | - | 358.1 | Fc-C：21 | |||
| P | 123 | H119 | HCnst-Ig：8 | - | 358.2 | Fc-C：22 | |||
| S | 124 | H120 | HCnst-Ig：9 | T | 359 | H382 | Fc-C：23 | ||
| V | 125 | H121 | HCnst-Ig：10 | K | 360 | H383 | Fc-C：24 | ||
| F | 126 | H122 | HCnst-Ig：11 | N | 361 | H384 | Fc-C：25 | ||
| P | 127 | H123 | HCnst-Ig：12 | Q | 362 | H385 | Fc-C：26 | ||
| L | 128 | H124 | HCnst-Ig：13 | V | 363 | H386 | Fc-C：27 | ||
| A | 129 | H125 | HCnst-Ig：14 | S | 364 | H387 | Fc-C：28 | ||
| P | 130 | H126 | HCnst-Ig：15 | L | 365 | H388 | Fc-C：29 | ||
| - | 130.1 | HCnst-Ig：16 | T | 366 | H389 | Fc-C：30 | |||
| S | 131 | H127 | HCnst-Ig：17 | C | 367 | H390 | Fc-C：31 | ||
| - | 131.1 | HCnst-Ig：18 | L | 368 | H391 | Fc-C：32 | |||
| S | 132 | H128 | HCnst-Ig：19 | V | 369 | H392 | Fc-C：33 | ||
| K | 133 | H129 | HCnst-Ig：20 | K | 370 | H393 | Fc-C：34 | ||
| S | 134 | H130 | HCnst-Ig：21 | G | 371 | H394 | Fc-C：35 | ||
| T | 135 | H133 | HCnst-Ig：22 | F | 372 | H395 | Fc-C：36 | ||
| S | 136 | H134 | HCnst-Ig：23 | Y | 373 | H396 | Fc-C：37 | ||
| G | 137 | H135 | HCnst-Ig：24 | P | 374 | H397 | Fc-C：38 | ||
| G | 138 | H136 | HCnst-Ig：25 | - | 374.1 | Fc-C：39 | |||
| T | 139 | H137 | HCnst-Ig：26 | - | 374.2 | Fc-C：40 | |||
| A | 140 | H138 | HCnst-Ig：27 | S | 375 | H398 | Fc-C：41 | ||
| A | 141 | H139 | HCnst-Ig：28 | D | 376 | H399 | Fc-C：42 | ||
| L | 142 | H140 | HCnst-Ig：29 | I | 377 | H400 | Fc-C：43 | ||
| G | 143 | H141 | HCnst-Ig：30 | A | 378 | H401 | Fc-C：44 | ||
| C | 144 | H142 | HCnst-Ig：31 | V | 379 | H402 | Fc-C：45 | ||
| L | 145 | H143 | HCnst-Ig：32 | E | 380 | H405 | Fc-C：46 | ||
| V | 146 | H144 | HCnst-Ig：33 | W | 381 | H406 | Fc-C：47 | ||
| K | 147 | H145 | HCnst-Ig：34 | - | 381.1 | Fc-C：48 | |||
| D | 148 | H146 | HCnst-Ig：35 | E | 382 | H407 | Fc-C：49 | ||
| Y | 149 | H147 | HCnst-Ig：36 | S | 383 | H408 | Fc-C：50 | ||
| F | 150 | H148 | HCnst-Ig：37 | N | 384 | H410 | Fc-C：51 | ||
| P | 151 | H149 | HCnst-Ig：38 | G | 385 | H411 | Fc-C：52 | ||
| - | 151.1 | HCnst-Ig：39 | Q | 386 | H414 | Fc-C：53 | |||
| - | 151.2 | HCnst-Ig：40 | P | 387 | H415 | Fc-C：54 | |||
| E | 152 | H150 | HCnst-Ig：41 | - | 387.1 | Fc-C：55 | |||
| P | 153 | H151 | HCnst-Ig：42 | - | 387.2 | Fc-C：56 | |||
| V | 154 | H152 | HCnst-Ig：43 | E | 388 | H416 | Fc-C：57 | ||
| T | 155 | H153 | HCnst-Ig：44 | N | 389 | H417 | Fc-C：58 | ||
| V | 156 | H154 | HCnst-Ig：45 | N | 390 | H418 | Fc-C：59 | ||
| S | 157 | H156 | HCnst-Ig：46 | Y | 391 | H419 | Fc-C：60 | ||
| W | 158 | H157 | HCnst-Ig：47 | K | 392 | H420 | Fc-C：61 | ||
| - | 158.1 | HCnst-Ig：48 | T | 393 | H421 | Fc-C：62 | |||
| N | 159 | H162 | HCnst-Ig：49 | T | 394 | H422 | Fc-C：63 | ||
| S | 160 | H163 | HCnst-Ig：50 | P | 395 | H423 | Fc-C：64 | ||
| G | 161 | H164 | HCnst-Ig：51 | P | 396 | H424 | Fc-C：65 | ||
| A | 162 | H165 | HCnst-Ig：52 | V | 397 | H425 | Fc-C：66 | ||
| L | 163 | H166 | HCnst-Ig：53 | L | 398 | H426 | Fc-C：67 | ||
| T | 164 | H167 | HCnst-Ig：54 | D | 399 | H427 | Fc-C：68 | ||
| S | 165 | H168 | HCnst-Ig：55 | - | 399.1 | Fc-C：69 | |||
| G | 166 | H169 | HCnst-Ig：56 | - | 399.2 | Fc-C：70 | |||
| V | 167 | H171 | HCnst-Ig：57 | - | 399.3 | Fc-C：71 | |||
| H | 168 | H172 | HCnst-Ig：58 | - | 399.4 | Fc-C：72 | |||
| T | 169 | H173 | HCnst-Ig：59 | S | 400 | H428 | Fc-C：73 | ||
| - | 169.1 | HCnst-Ig：60 | D | 401 | H430 | Fc-C：74 | |||
| - | 169.2 | HCnst-Ig：61 | G | 402 | H433 | Fc-C：75 | |||
| - | 169.3 | H174 | HCnst-Ig：62 | S | 403 | H434 | Fc-C：76 | ||
| F | 170 | H175 | HCnst-Ig：63 | F | 404 | H435 | Fc-C：77 | ||
| P | 171 | H176 | HCnst-Ig：64 | F | 405 | H436 | Fc-C：78 | ||
| A | 172 | H177 | HCnst-Ig：65 | L | 406 | H437 | Fc-C：79 | ||
| V | 173 | H178 | HCnst-Ig：66 | Y | 407 | H438 | Fc-C：80 | ||
| L | 174 | H179 | HCnst-Ig：67 | S | 408 | H439 | Fc-C：81 | ||
| Q | 175 | HCnst-Ig：68 | K | 409 | H440 | Fc-C：82 | |||
| - | 175.1 | HCnst-Ig：69 | L | 410 | H441 | Fc-C：83 | |||
| - | 175.2 | HCnst-Ig：70 | T | 411 | H442 | Fc-C：84 | |||
| - | 175.3 | HCnst-Ig：71 | V | 412 | H443 | Fc-C：85 | |||
| - | 175.4 | HCnst-Ig：72 | D | 413 | H444 | Fc-C：86 | |||
| S | 176 | H180 | HCnst-Ig：73 | K | 414 | H445 | Fc-C：87 | ||
| S | 177 | H182 | HCnst-Ig：74 | S | 415 | H446 | Fc-C：88 | ||
| G | 178 | H183 | HCnst-Ig：75 | R | 416 | H447 | Fc-C：89 | ||
| L | 179 | H184 | HCnst-Ig：76 | W | 417 | H448 | Fc-C：90 | ||
| Y | 180 | H185 | HCnst-Ig：77 | - | 417.1 | Fc-C：91 | |||
| S | 181 | H186 | HCnst-Ig：78 | Q | 418 | H449 | Fc-C：92 | ||
| L | 182 | H187 | HCnst-Ig：79 | Q | 419 | H450 | Fc-C：93 | ||
| S | 183 | H188 | HCnst-Ig：80 | G | 420 | H451 | Fc-C：94 | ||
| S | 184 | H189 | HCnst-Ig：81 | N | 421 | H452 | Fc-C：95 | ||
| V | 185 | H190 | HCnst-Ig：82 | V | 422 | H453 | Fc-C：96 | ||
| V | 186 | H191 | HCnst-Ig：83 | - | 422.1 | Fc-C：97 | |||
| T | 187 | H192 | HCnst-Ig：84 | - | 422.2 | Fc-C：98 | |||
| V | 188 | H193 | HCnst-Ig：85 | F | 423 | H454 | Fc-C：99 | ||
| P | 189 | H194 | HCnst-Ig：86 | S | 424 | H455 | Fc-C：100 | ||
| S | 190 | H195 | HCnst-Ig：87 | C | 425 | H456 | Fc-C：101 | ||
| S | 191 | H196 | HCnst-Ig：88 | S | 426 | H457 | Fc-C：102 | ||
| S | 192 | H197 | HCnst-Ig：89 | V | 427 | H458 | Fc-C：103 | ||
| L | 193 | H198 | HCnst-Ig：90 | M | 428 | H459 | Fc-C：104 | ||
| - | 193.1 | HCnst-Ig：91 | H | 429 | H460 | Fc-C：105 | |||
| G | 194 | H199 | HCnst-Ig：92 | E | 430 | H461 | Fc-C：106 | ||
| T | 195 | H200 | HCnst-Ig：93 | A | 431 | H462 | Fc-C：107 | ||
| Q | 196 | H203 | HCnst-Ig：94 | L | 432 | H463 | Fc-C：108 | ||
| T | 197 | H205 | HCnst-Ig：95 | H | 433 | H464 | Fc-C：109 | ||
| - | 197.1 | HCnst-Ig：96 | - | 433.1 | Fc-C：110 | ||||
| - | 197.2 | HCnst-Ig：97 | - | 433.2 | Fc-C：111 | ||||
| - | 197.3 | HCnst-Ig：98 | N | 434 | H465 | Fc-C：112 | |||
| Y | 198 | H206 | HCnst-Ig：99 | H | 435 | H466 | Fc-C：113 | ||
| I | 199 | H207 | HCnst-Ig：100 | Y | 436 | H467 | Fc-C：114 | ||
| C | 200 | H208 | HCnst-Ig：101 | T | 437 | H468 | Fc-C：115 | ||
| N | 201 | H209 | HCnst-Ig：102 | - | 437.1 | Fc-C：116 | |||
| V | 202 | H210 | HCnst-Ig：103 | Q | 438 | H469 | Fc-C：117 | ||
| N | 203 | H211 | HCnst-Ig：104 | K | 439 | H470 | Fc-C：118 | ||
| H | 204 | H212 | HCnst-Ig：105 | S | 440 | H471 | Fc-C：119 | ||
| K | 205 | H213 | HCnst-Ig：106 | L | 441 | H472 | Fc-C：120 | ||
| P | 206 | H214 | HCnst-Ig：107 | S | 442 | H473 | Fc-C：121 | ||
| S | 207 | H215 | HCnst-Ig：108 | L | 443 | H474 | Fc-C：122 | ||
| N | 208 | H216 | HCnst-Ig：109 | S | 444 | H475 | Fc-C：123 | ||
| - | 208.1 | HCnst-Ig：110 | P | 445 | H476 | HCnst-Po：1 | |||
| - | 208.2 | HCnst-Ig：111 | G | 446 | H477 | HCnst-Po：2 | |||
| T | 209 | H217 | HCnst-Ig：112 | K | 447 | H478 | HCnst-Po：3 | ||
| K | 210 | H218 | HCnst-Ig：113 | - | 447.1 | HCnst-Po：4 | |||
| V | 211 | H219 | HCnst-Ig：114 | - | 447.2 | HCnst-Po：5 | |||
| D | 212 | H220 | HCnst-Ig：115 | - | 447.3 | HCnst-Po：6 | |||
| K | 213 | H221 | HCnst-Ig：116 | - | 447.4 | HCnst-Po：7 | |||
| - | 213.1 | HCnst-Ig：117 | - | 447.5 | HCnst-Po：8 | ||||
| K | 214 | H222 | HCnst-Ig：118 | - | 447.6 | HCnst-Po：9 | |||
| V | 215 | H223 | HCnst-Ig：119 | - | 447.7 | HCnst-Po：10 | |||
| - | 215.1 | HCnst-Ig：120 | - | 447.8 | HCnst-Po：11 | ||||
| - | 215.2 | HCnst-Ig：121 | - | 447.9 | HCnst-Po：12 | ||||
| - | 215.3 | HCnst-Ig：122 | - | 447.10 | HCnst-Po：13 | ||||
| - | 215.4 | HCnst-Ig：123 | - | 447.11 | HCnst-Po：14 | ||||
| - | 215.5 | 鉸鏈：1 | - | 447.12 | HCnst-Po：15 | ||||
| - | 215.6 | 鉸鏈：2 | - | 447.13 | HCnst-Po：16 | ||||
| - | 215.7 | 鉸鏈：3 | - | 447.14 | HCnst-Po：17 | ||||
| - | 215.8 | 鉸鏈：4 | - | 447.15 | HCnst-Po：18 | ||||
| - | 215.9 | 鉸鏈：5 | - | 447.16 | HCnst-Po：19 | ||||
| - | 215.10 | 鉸鏈：6 | - | 447.17 | HCnst-Po：20 | ||||
| - | 215.11 | 鉸鏈：7 | - | 447.18 | HCnst-Po：21 | ||||
| - | 215.12 | 鉸鏈：8 | - | 447.19 | HCnst-Po：22 | ||||
| - | 215.13 | 鉸鏈：9 | - | 447.20 | HCnst-Po：23 | ||||
| - | 215.14 | 鉸鏈：10 | - | 447.21 | HCnst-Po：24 | ||||
| - | 215.15 | 鉸鏈：11 | - | 447.22 | HCnst-Po：25 | ||||
| - | 215.16 | 鉸鏈：12 | - | 447.23 | HCnst-Po：26 | ||||
| - | 215.17 | 鉸鏈：13 | - | 447.24 | HCnst-Po：27 | ||||
| - | 215.18 | 鉸鏈：14 | - | 447.25 | HCnst-Po：28 | ||||
| - | 215.19 | 鉸鏈：15 | - | 447.26 | HCnst-Po：29 | ||||
| - | 215.20 | 鉸鏈：16 | - | 447.27 | HCnst-Po：30 | ||||
| - | 215.21 | 鉸鏈：17 | - | 447.28 | HCnst-Po：31 | ||||
| - | 215.22 | 鉸鏈：18 | - | 447.29 | HCnst-Po：32 | ||||
| - | 215.23 | 鉸鏈：19 | - | 447.30 | HCnst-Po：33 | ||||
| - | 215.24 | 鉸鏈：20 | - | 447.31 | HCnst-Po：34 | ||||
| - | 215.25 | 鉸鏈：21 | - | 447.32 | HCnst-Po：35 | ||||
| - | 215.26 | 鉸鏈：22 | - | 447.33 | HCnst-Po：36 | ||||
| - | 215.27 | 鉸鏈：23 | - | 447.34 | HCnst-Po：37 | ||||
| - | 215.28 | 鉸鏈：24 | - | 447.35 | HCnst-Po：38 | ||||
| - | 215.29 | 鉸鏈：25 | - | 447.36 | HCnst-Po：39 | ||||
| - | 215.30 | 鉸鏈：26 | - | 447.37 | HCnst-Po：40 | ||||
| - | 215.31 | 鉸鏈：27 | - | 447.38 | HCnst-Po：41 | ||||
| - | 215.32 | 鉸鏈：28 | - | 447.39 | HCnst-Po：42 | ||||
| - | 215.33 | 鉸鏈：29 | - | 447.40 | HCnst-Po：43 | ||||
| - | 215.34 | 鉸鏈：30 | - | 447.41 | HCnst-Po：44 | ||||
| - | 215.35 | 鉸鏈：31 | - | 447.42 | HCnst-Po：45 | ||||
| - | 215.36 | 鉸鏈：32 | - | 447.43 | HCnst-Po：46 | ||||
| - | 215.37 | 鉸鏈：33 | - | 447.44 | HCnst-Po：47 | ||||
| - | 215.38 | 鉸鏈：34 | - | 447.45 | HCnst-Po：48 | ||||
| - | 215.39 | 鉸鏈：35 | - | 447.46 | HCnst-Po：49 | ||||
| - | 215.40 | 鉸鏈：36 | - | 447.47 | HCnst-Po：50 | ||||
| - | 215.41 | 鉸鏈：37 | - | 447.48 | HCnst-Po：51 | ||||
| - | 215.42 | 鉸鏈：38 | - | 447.49 | HCnst-Po：52 | ||||
| - | 215.43 | 鉸鏈：39 | - | 447.50 | HCnst-Po：53 | ||||
| - | 215.44 | 鉸鏈：40 | - | 447.51 | HCnst-Po：54 | ||||
| - | 215.45 | 鉸鏈：41 | - | 447.52 | HCnst-Po：55 | ||||
| - | 215.46 | 鉸鏈：42 | - | 447.53 | HCnst-Po：56 | ||||
| - | 215.47 | 鉸鏈：43 | - | 447.54 | HCnst-Po：57 | ||||
| - | 215.48 | 鉸鏈：44 | - | 447.55 | HCnst-Po：58 | ||||
| - | 215.49 | 鉸鏈：45 | - | 447.56 | HCnst-Po：59 | ||||
| - | 215.50 | 鉸鏈：46 | - | 447.57 | HCnst-Po：60 | ||||
| - | 215.51 | 鉸鏈：47 | - | 447.58 | HCnst-Po：61 | ||||
| - | 215.52 | 鉸鏈：48 | - | 447.59 | HCnst-Po：62 | ||||
| - | 215.53 | 鉸鏈：49 | - | 447.60 | HCnst-Po：63 | ||||
| - | 215.54 | 鉸鏈：50 | - | 447.61 | HCnst-Po：64 | ||||
| - | 215.55 | 鉸鏈：51 | - | 447.62 | HCnst-Po：65 | ||||
| - | 215.56 | 鉸鏈：52 | - | 447.63 | HCnst-Po：66 | ||||
| - | 215.57 | 鉸鏈：53 | - | 447.64 | HCnst-Po：67 | ||||
| - | 215.58 | 鉸鏈：54 | - | 447.65 | HCnst-Po：68 | ||||
| - | 215.59 | 鉸鏈：55 | - | 447.66 | HCnst-Po：69 | ||||
| - | 215.60 | 鉸鏈：56 | - | 447.67 | HCnst-Po：70 | ||||
| - | 215.61 | 鉸鏈：57 | - | 447.68 | HCnst-Po：71 | ||||
| - | 215.62 | 鉸鏈：58 | - | 447.69 | HCnst-Po：72 | ||||
| - | 215.63 | 鉸鏈：59 | - | 447.70 | HCnst-Po：73 | ||||
| - | 215.64 | 鉸鏈：60 | - | 447.71 | HCnst-Po：74 | ||||
| - | 215.65 | 鉸鏈：61 | - | 447.72 | HCnst-Po：75 | ||||
| - | 215.66 | 鉸鏈：62 | - | 447.73 | HCnst-Po：76 | ||||
| - | 215.67 | 鉸鏈：63 | - | 447.74 | HCnst-Po：77 | ||||
| - | 215.68 | 鉸鏈：64 | - | 447.75 | HCnst-Po：78 | ||||
| - | 215.69 | 鉸鏈：65 | - | 447.76 | HCnst-Po：79 | ||||
| - | 215.70 | 鉸鏈：66 | - | 447.77 | HCnst-Po：80 | ||||
| - | 215.71 | 鉸鏈：67 | - | 447.78 | HCnst-Po：81 | ||||
| - | 215.72 | 鉸鏈：68 | - | 447.79 | HCnst-Po：82 | ||||
| - | 215.73 | 鉸鏈：69 | - | 447.80 | HCnst-Po：83 | ||||
| - | 215.74 | 鉸鏈：70 | - | 447.81 | HCnst-Po：84 | ||||
| - | 215.75 | 鉸鏈：71 | - | 447.82 | HCnst-Po：85 | ||||
| - | 215.76 | 鉸鏈：72 | - | 447.83 | HCnst-Po：86 | ||||
| - | 215.77 | 鉸鏈：73 | - | 447.84 | HCnst-Po：87 | ||||
| - | 215.78 | 鉸鏈：74 | - | 447.85 | HCnst-Po：88 | ||||
| - | 215.79 | 鉸鏈：75 | - | 447.86 | HCnst-Po：89 | ||||
| - | 215.80 | 鉸鏈：76 | - | 447.87 | HCnst-Po：90 | ||||
| - | 215.81 | 鉸鏈：77 | - | 447.88 | HCnst-Po：91 | ||||
| - | 215.82 | 鉸鏈：78 | - | 447.89 | HCnst-Po：92 | ||||
| - | 215.83 | 鉸鏈：79 | - | 447.90 | HCnst-Po：93 | ||||
| - | 215.84 | 鉸鏈：80 | - | 447.91 | HCnst-Po：94 | ||||
| - | 215.85 | 鉸鏈：81 | - | 447.92 | HCnst-Po：95 | ||||
| - | 215.86 | 鉸鏈：82 | - | 447.93 | HCnst-Po：96 | ||||
| - | 215.87 | 鉸鏈：83 | - | 447.94 | HCnst-Po：97 | ||||
| - | 215.88 | 鉸鏈：84 | - | 447.95 | HCnst-Po：98 | ||||
| - | 215.89 | 鉸鏈：85 | - | 447.96 | HCnst-Po：99 | ||||
| - | 215.90 | 鉸鏈：86 | - | 447.97 | HCnst-Po：100 | ||||
| - | 215.91 | 鉸鏈：87 | - | 447.98 | HCnst-Po：101 | ||||
| - | 215.92 | 鉸鏈：88 | - | 447.99 | HCnst-Po：102 | ||||
| - | 215.93 | 鉸鏈：89 | - | 447.100 | HCnst-Po：103 | ||||
| - | 215.94 | 鉸鏈：90 | - | 447.101 | HCnst-Po：104 | ||||
| - | 215.95 | 鉸鏈：91 | - | 447.102 | HCnst-Po：105 | ||||
| - | 215.96 | 鉸鏈：92 | - | 447.103 | HCnst-Po：106 | ||||
| - | 215.97 | 鉸鏈：93 | - | 447.104 | HCnst-Po：107 | ||||
| - | 215.98 | 鉸鏈：94 | - | 447.105 | HCnst-Po：108 | ||||
| - | 215.99 | 鉸鏈：95 | - | 447.106 | HCnst-Po：109 | ||||
| E | 216 | H226 | 鉸鏈：96 | - | 447.107 | HCnst-Po：110 | |||
| P | 217 | H227 | 鉸鏈：97 | - | 447.108 | HCnst-Po：111 | |||
| K | 218 | H228 | 鉸鏈：98 | - | 447.109 | HCnst-Po：112 | |||
| S | 219 | H232 | 鉸鏈：99 | - | 447.110 | HCnst-Po：113 | |||
| - | 219.1 | 鉸鏈：100 | - | 447.111 | HCnst-Po：114 | ||||
| - | 219.2 | 鉸鏈：101 | - | 447.112 | HCnst-Po：115 | ||||
| - | 219.3 | 鉸鏈：102 | - | 447.113 | HCnst-Po：116 | ||||
| - | 219.4 | 鉸鏈：103 | - | 447.114 | HCnst-Po：117 | ||||
| - | 219.5 | 鉸鏈：104 | - | 447.115 | HCnst-Po：118 | ||||
| - | 219.6 | 鉸鏈：105 | - | 447.116 | HCnst-Po：119 | ||||
| - | 219.7 | 鉸鏈：106 | - | 447.117 | HCnst-Po：120 | ||||
| C | 220 | H233 | 鉸鏈：107 | - | 447.118 | HCnst-Po：121 | |||
| D | 221 | H234 | 鉸鏈：108 | - | 447.119 | HCnst-Po：122 | |||
| K | 222 | H235 | 鉸鏈：109 | - | 447.120 | HCnst-Po：123 | |||
| T | 223 | H236 | 鉸鏈：110 | ||||||
| H | 224 | H237 | 鉸鏈：111 | ||||||
氫氘交換質譜法(HDX-MS)量測溶劑交換速率，亦即，具有較重氫同位素之構成溶劑的原子與主鏈醯胺鍵內之蛋白質原子交換的現象。此方法使得有可能藉由將蛋白質暴露於氘化溶劑規定之時間，淬滅溶劑交換反應且接著利用質譜法量測蛋白質之質量增加來測定蛋白質之溶劑攝取情況。通常，配位體結合事件引起配位體相互作用位點處氘化攝取之局部減少，由此能夠大致定位涉及例如抗體/靶標抗原決定基及互補位相互作用之區域。
為了對人類FGF23上布羅索尤單抗之抗原決定基進行定位，使用在HEK293S細胞中產生之FGF23 (R179Q)執行HDX-MS。在CHO細胞中產生布羅索尤單抗(而經工程改造之FGF23結合抗體在後續實例中係在HEK293S細胞中表現)。藉由在溶液中組合布羅索尤單抗及FGF23(R179Q)來形成抗原-抗體複合物，且接著在冰冷的氘化分析緩衝液中以1：10稀釋，保持60秒、600秒、1800秒或3600秒。簡言之，HDX-MS分析利用pH 7.4之PBS作為分析緩衝液。使用含1M甘胺酸、4M鹽酸胍及400 mM TCEP之pH 2.5淬滅緩衝液。一式兩份，以1：1之分析緩衝液與淬滅緩衝液比率注射100 pmol。標記期間之抗原濃度為1.5 µM，且標記期間之抗體濃度為1 µM。使用1：1添加的淬滅緩衝液(pH 2.5)來淬滅氘化反應，且隨後將溶液上樣至液相層析(LC)管柱上以進行管柱上蛋白水解消化，隨後進行LC分離及質譜分析。
HDX-MS結果示於圖1中。y軸顯示氘化%(D%)，亦即，經肽長度正規化的未結合之FGF23與結合抗體之FGF23之間的氘化差異。值小於零(0)反映氘化減少，亦即，抗體-抗原結合防止氘化反應。值大於零(0)反映氘化增加，亦即，暴露於氘化反應。x軸顯示FGF23胺基酸殘基1-251。彩色水平條表示每一所鑑別肽之氘標記時間點(黑色= 60秒，藍色= 600秒，橙色= 1800秒，品紅色= 3600秒)。由於包含約胺基酸殘基158至251之區域缺少序列覆蓋，故未表示FGF23之C末端區域。據信，蛋白質之此區域中的內源糖基化阻止了本分析中氘交換之準確量測。在FGF23酶促去糖基化後進行之重複實例證實此假設(資料未顯示)。總體而言，鑑別出氘化%相對較低及/或標記時間點相對較短的三個強受保護區域(紅色框)(受保護區域1、受保護區域2及受保護區域3)。受保護區域1(Y43至Y70)具有該三個強保護區域中最弱之保護作用。受保護區域2(A80至R92)具有比受保護區域1強之保護作用。受保護區域3(L135至F157)具有三者中最強之保護作用。
基於HDX-MS資料，假設FGF23上之受保護區域1-3參與抗體結合或因在抗體存在下之構形變化而受到保護。
將此三個受保護區域映射至FGF23(R179Q)之晶體結構上(「2P39」結構；參見Goetz等人，「Molecular insights into the klotho-dependent, endocrine mode of action of fibroblast growth factor 19 subfamily members」，Mol Cell Biol(2007)27，第3417-28頁)以使可能具有抗體結合相互作用之區域可視化。圖2顯示具有根據HDX-MS分析之發現而界定之受保護區域的FGF23之23P9晶體結構：胺基酸約43至約70位(受保護區域1)呈紫色，胺基酸約80至約92位(受保護區域2)呈綠色且胺基酸約135至約157位(受保護區域3)呈紅色。
總之，HDX-MS鑑別出在布羅索尤單抗存在下受保護之三個FGF23(R179Q)區域，如表3中所示：
表3. 藉由HDX-MS確定之FGF23受保護區域
| FGF23(R179Q) | 胺基酸位置(相對於SEQ ID NO：17或18) | 胺基酸序列 | 胺基酸序列SEQ ID NO |
| 受保護區域1 | 43-70 | YTATARNSYHLQIHKNGHVDGAPHQTIY | 19 |
| 受保護區域2 | 80-92 | AGFVVITGVMSRR | 20 |
| 受保護區域3 | 135-157 | LVSLGRAKRAFLPGMNPPPYSQF | 21 |
HDX-MS資料表明，最強的受保護區域(2及3)表示可能的布羅索尤單抗抗原決定基在FGF23(R179Q)之殘基82至90及136至140附近。在受保護區域3內，殘基L135、V136、S137、L138、G139、R140及A141表示最強之受保護區域，且因此可為FGF23-布羅索尤單抗相互作用所涉及之最重要殘基。
將此等發現與先前在人類FGF23上定位布羅索尤單抗抗原決定基之嘗試相比較，觀察到受保護區域1涵蓋由Yamazaki等人所鑑別的FN1-抗原決定基1及FN1-抗原決定基2之殘基(「Anti‐FGF23 neutralizing antibodies show the physiological role and structural features of FGF23」，Journal of Bone and Mineral Research 23.9(2008)：1509-1518)。然而，FN1-抗原決定基3及FN1-抗原決定基4落在本研究中所鑑別之受保護區域1、受保護區域2及受保護區域3之外，此表明與布羅索尤單抗相比，先前Yamazaki等人所表徵的FN1抗體識別FGF23上之不同面。此外，Kanhasut等人在2022年鑑別的抗原決定基與先前Yamazaki等人所描述之抗原決定基大體上相對應，進一步證明本綜合研究之意義，其中hFGF23：布羅索尤單抗結合表面已藉由結晶學分析明確界定且得到HDX-MS證實。
實例 3 ：布羅索尤單抗 - 人類 FGF23 之互補位定位
使用HDX-MS，以與實例2中所描述之FGF23抗原決定基定位相同之方式探詢布羅索尤單抗的結合人類FGF23之互補位殘基/區域。在HEK293S細胞中產生FGF23(R179Q)。在CHO細胞中產生布羅索尤單抗(而經工程改造之FGF23結合抗體在後續實例中係在HEK293S細胞中表現)。藉由在溶液中組合布羅索尤單抗及FGF23(R179Q)來形成抗原-抗體複合物，且接著在冰冷的氘化分析緩衝液中以1：10稀釋，保持60秒、600秒、1800秒或3600秒。使用1：1添加的淬滅緩衝液(pH 2.5)來淬滅氘化反應，且隨後將溶液上樣至液相層析(LC)管柱上以進行管柱上蛋白水解消化，隨後進行LC分離及質譜分析。
簡言之，HDX-MS分析利用pH 7.4之PBS作為分析緩衝液。使用含1M甘胺酸、4M鹽酸胍及400 mM TCEP之pH 2.5淬滅緩衝液。一式兩份，以1：1之分析緩衝液與淬滅緩衝液比率注射100 pmol。標記(氘化)進行15秒、60秒、600秒及3600秒。標記期間之抗原濃度為1.5 µM，且標記期間之抗體濃度為1 µM。
HDX-MS結果示於圖3中。y軸顯示氘化%(D%)，亦即，經肽長度正規化的未結合之抗體與結合FGF23之抗體之間的氘化差異。值小於0反映氘化減少，亦即，抗體-抗原結合防止氘化反應。值大於0反映氘化增加，亦即，暴露於氘化反應。x軸顯示布羅索尤單抗胺基酸殘基(左側之輕鏈與右側之重鏈由垂直條隔開)。彩色水平條表示每一所鑑別肽之氘標記時間點(黑色= 15秒，藍色= 60秒，橙色= 600秒，品紅色= 3600秒)。
觀察到對布羅索尤單抗抗體之保護，且認為其代表使受保護區域免於氘化及/或抗原(FGF23)結合之構形保護。具體而言，藉由HDX-MS將以下表4中所示布羅索尤單抗輕鏈及重鏈序列上之區域鑑別為顯示出減少之氘化。
表4. 藉由HDX-MS確定之布羅索尤單抗互補位
| 布羅索尤單抗 | 胺基酸位置(相對於SEQ ID NO：1) | 胺基酸序列 | 胺基酸序列SEQ ID NO |
| 重鏈互補位區域1 | 24-35 | ASGYTFTNHYMH | 5 |
| 重鏈互補位區域2 | 49-69 | GIINPISGSTSNAQKFQGRVT | 6 |
| 重鏈互補位區域3 | 148-163 | DYFPEPVTVSWNSGAL | 7 |
| 布羅索尤單抗 | 胺基酸位置(相對於SEQ ID NO：2) | 胺基酸序列 | 胺基酸序列SEQ ID NO |
| 輕鏈互補位區域1 | 23-33 | CRASQGISSAL | 8 |
| 輕鏈互補位區域2 | 50-70 | DASSLESGVPSRFSGSGSGTD | 9 |
| 輕鏈互補位區域3 | 103-122 | VDIKRTVAAPSVFIFPPSDE | 10 |
其中，假設布羅索尤單抗重鏈互補位區域1(SEQ ID NO：5)及輕鏈互補位區域1(SEQ ID NO：8)參與抗原結合。
實例 4 ：用於評價布羅索尤單抗 -FGF23 相互作用之分子對接
使用蛋白質-蛋白質對接來預測布羅索尤單抗-FGF23複合物之三維結構且鑑別抗體-抗原相互作用表面及參與結合之殘基。即使沒有Fab-抗原複合物之晶體結構，亦利用計算對接來深入了解布羅索尤單抗Fab片段與FGF23結構之相互作用。
可獲得與蔗糖八硫酸酯形成複合物之FGF23的晶體結構(「2P39」；參見Goetz等人,「Molecular insights into the klotho-dependent, endocrine mode of action of fibroblast growth factor 19 subfamily members」，Mol Cell Biol(2007)27，第3417-28頁，以引用之方式併入本文)。另外，同樣可獲得FGF23-FGFR1c-aKlotho三元復合物之晶體結構(「5W21」；參見Chen等人,「alpha-Klotho is a non-enzymatic molecular stems for FGF23 ethics signaling」，(2018)Nature 553：461-466，以引用之方式併入本文)。利用此等可用晶體結構執行人類FGF23與布羅索尤單抗Fab之已知晶體結構(「7VEN」；Heo, Y.S., 「Structure of burosumab Fab」DOI：10.2210/pdb7ven/pdb；2022年9月14日發布，以引用之方式併入本文)的分子對接研究。利用2P39 FGF23晶體結構及7VEN布羅索尤單抗晶體結構進行本文中之對接研究。
簡言之，使用在Molecular Operating Environment「MOE」(2022.02)中實施的基於FFT之搜索演算法來執行蛋白質-蛋白質對接。在分子製備(亦即，最小化、幾何形狀、質子化、加帽)後，最初用被視為剛體之抗體及抗原分子進行所有對接研究。使用低模式MD(LowModeMD)及常規MD對FGF23抗原中預期可撓性較高之個別環進行構形取樣。首先，遵循Basdevant等人(doi：10.1021/jp0727190.)提出之方案，將模型呈現為基於粗粒度(CG)殘基之表示，其中每一殘基由一至三個「聯合原子」珠粒組成。CG表示包括以下能量分量：凡得瓦力(van der Waals)、靜電及溶劑化，經由廣義玻恩體積積分(Generalized Born Volume Integral，GB/VI)形式得到。
在對接過程中，抗體被視為「配位體」且抗原FGF23被視為「受體」。該系統偏向於互補位側以將已發表的Kabat定義之布羅索尤單抗CDR視為主要相互作用位點；亦即，具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13(分別為HCDR1、HCDR2及HCDR3)以及SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16(分別為LCDR1、LCDR2及LCDR3)中所示之序列的重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。換言之，受限配位體位點固定於布羅索尤單抗CDR，而抗原決定基被視為整體(亦即，無偏向)或基於HDX資料具體選擇。在整個搜索及精修過程中利用疏水性補丁電位(hydrophobic patch potential)。對於位姿(pose)選擇，將位姿保持為有效之臨限值設定為置放前10,000，置放為1,000且精修為100。
出於對接目的，基於來自HDX-MS(本文中之實例2及實例3)之經驗資料結合以下來選擇抗原決定基：(i)使用布羅索尤單抗及來自不同物種之FGF23進行的跨物種反應性研究之比較分析；(ii)使用不同布羅索尤單抗突變型變異體之夾心SPR分析進行的動力學研究(Yamazaki等人, 2008)；及/或(iii)評價影響結合相互作用之FGF23及布羅索尤單抗之疏水性及極性表面之比對的補丁分析。
關於不同物種間布羅索尤單抗結合之比較分析，觀察到布羅索尤單抗展現「針對人類、食蟹獼猴及兔FGF23之類似高結合親和力(K
D10-11 mol/L)(研究r-12-0326)」及「與猴及人類FGF23之重組形式但不與小鼠FGF23(研究r-13-0026)，以及與來自人類及猴但不與來自狗或大鼠的血漿FGF23之交叉反應性(研究r-13-0027)」。(參見藥物評估與研究中心(Center for Drug Evaluation and Research)申請編號761068Orig1s000，生物製劑多學科審查許可申請(Multidisciplinary Review for Biologics License Application)761068，可見於www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2018/ 761068Orig1s000MultidisciplineR.pdf)。因此，比對來自人類、食蟹獼猴、兔、狗及大鼠之FGF23胺基酸序列且與HDX-MS資料重疊以鑑別在布羅索尤單抗交叉反應性物種中一致但不一定與非交叉反應性物種一致的潛在抗原決定基殘基或區域。
使用此等各種分析之發現指導五項獨立對接搜索(全部基於FFT且全部偏向於抗原側)中之不同偏向條件，以產生位姿及抗原-抗體接觸之多樣性：
搜索號1：無偏向
搜索號2：使用單獨考慮的每一HDX受保護區域1、受保護區域2或受保護區域3進行偏向分析
搜索號3：一起使用所有HDX受保護區域(1、2及3)進行偏向分析
搜索號4：使用Yamazaki等人, 2008中所描述之抗原決定基進行偏向分析
搜索號5：使用HDX受保護區域1、2及3及Yamazaki等人, 2008之間共有的抗原決定基進行偏向分析
每次搜索運行得到五個不同的簇，針對能量學及經驗資料(例如突變資料)對其全部進一步仔細檢查以進行驗證。將位姿視為有效命中之主要要求與可用HDX資料具有約30%~40%相關性，亦即，HDX提示的三個抗原決定基中殘基總數之至少約30%至約40%(基於4.5埃球體內之接觸)必須與來自布羅索尤單抗CDR之任何殘基有至少一次接觸。無偏向對接產生與HDX資料及由Yamazaki等人.(doi：10.1359/JBMR.080417)發現的小鼠抗體結合之抗原決定基具有低總體相關性的簇。就此而言，有偏向的運行更成功，且最佳命中(亦即，與HDX資料之相關性最高)係由偏向具有Yamazaki等人中所報導之小鼠Ab之抗原決定基的抗原側進行之操作(亦即，搜索號4)得到。基於以上設定之標準選擇兩種位姿作為指引：FGF23：Ab-位姿-1(1st-preferred.moe)及FGF23：Ab-位姿-2(2nd-preferred.moe)。進一步評價由對接操作3、4及5得到之若干額外位姿。
仔細檢查來自所有對接操作之有效位姿以鑑別常見的互補位位置。將資訊與來自實例2及實例3中所描述之表位及互補位定位研究之知識相結合。總體而言，18個布羅索尤單抗重鏈及18個布羅索尤單抗輕鏈殘基經鑑別為潛在的共同互補位位置。針對所有位置評價在此等位置處抗原-抗體接觸之能量學。建模及對接操作之彙總提供於表5中。
表5. 建模及對接操作彙總
實例 5. 基於分子對接、 HDX-MS 保護定位及比較突變分析進行之布羅索尤單抗之預測性突變誘發
| 對接方案(MOE) | 構形搜索 | 抗原決定基偏向 | 輸出位姿 | 平均抗原決定基覆蓋率% | 用於 突變掃描 |
| 無偏向 | 否 | 無選擇 | 接合 受保護區域2或3 | 30~50 | |
| 有偏向 | 否 | 僅受保護區域1 | 接合受保護區域1 | 60~75 | |
| 有偏向 | 否 | 僅受保護區域2 | 接合受保護區域2 | 60~75 | |
| 有偏向 | 低模式MD | 僅受保護區域3 | 接合受保護區域3 | 60~75 | |
| 有偏向 | 否 | 受保護區域2及3之組合 | 接合受保護區域2及3 | 約50 | |
| 有偏向 | 低模式MD | 受保護區域1+2+3 | 接合所有受保護區域 | 20~30 | 是 |
| 有偏向 | 低模式MD | Mu Ab | 接合所有受保護區域 | 20~30 | 是 |
| 有偏向 | 低模式MD | 受保護區域1+2+3+Mu Ab | 接合所有受保護區域 | 20~30 | 是 |
使用對跨5個平均簇之常見相互作用布羅索尤單抗位置進行的預測性突變誘發來設計布羅索尤單抗突變型變異體。考慮到來自接合至少約60%之HDX抗原決定基殘基的所有對接搜索之有效位姿，將共同的互補位位置(18個布羅索尤單抗VH殘基及18個布羅索尤單抗VL殘基)作為預測性突變誘發的目標。基於能量計算及基於MM之突變及在距突變位點4.5埃內進行之旋轉異構最佳化(延伸)來評價位置及突變型變異體。
使用預測性突變誘發進行之初始1X掃描產生520種經工程改造之FGF23結合抗體設計，各自相對於布羅索尤單抗之輕鏈(SEQ ID NO：2)或布羅索尤單抗之重鏈(SEQ ID NO：1)包含單個胺基酸變化。根據以下標準評價及篩選全部520種突變型變異體：d親和力(ΔΔG(kcal/mol))在-4.5 kcal/mol與0.4 kcal/mol之間；d穩定性(ΔΔS(kcal/ mol))小於3.0 kcal/mol；且基於dSASA(溶劑可及表面積之差異)重新評估冗餘位置，該dSASA係引入突變後埋入表面之獲得或損失之指標。ΔΔG係用於預測單點突變將如何影響蛋白質穩定性之度量。其係當存在點突變時折疊狀態與未折疊狀態之間的能量變化以及ΔG折疊之變化的量度。此度量用作點突變在蛋白質穩定性方面是否有利之預測因子。值越負，蛋白質越穩定。ΔΔG值＞ 0.5表明突變將不穩定；值0.5 ＞ ΔΔG ＞ -0.5表明應將變化視為中性或接近中性的；及ΔΔG ＜ -0.5：表明突變將產生更穩定之蛋白質。另一方面，ΔΔS係振動熵差之量度。正值指示可撓性增加，而負值指示剛性較高之蛋白質。其用於預測突變將如何改變蛋白質之熵。亦計算蛋白質之水可及表面積(「VdW SA」)、蛋白質之疏水性原子之水可及表面積(「疏水性SA」)及蛋白質之親水性原子之水可及表面積(「親水性SA」)。表6提供布羅索尤單抗輕鏈位置之全1X掃描預測性突變誘發結果之彙總，且表7提供布羅索尤單抗重鏈位置之全1X掃描預測性突變誘發結果之彙總。
根據全1X掃描結果，基於上文所描述之篩選標準，針對預測親和力有改良，同時對預測之穩定性或溶劑化之負面影響最小進行選擇，選出96種突變型變異體用於進一步評價。此96種突變型變異體在本文中稱為布羅索尤單抗變異體或經工程改造之FGF23結合抗體「設計組1(design panel 1)」。表8提供針對設計組1選擇的布羅索尤單抗輕鏈位置之1X掃描預測性突變誘發結果的彙總，且表9提供針對設計組1選擇的布羅索尤單抗重鏈位置之1X掃描預測性突變誘發結果的彙總。
表6. 布羅索尤單抗輕鏈全1X掃描預測性突變誘發結果
表7. 布羅索尤單抗重鏈全1X掃描預測性突變誘發結果
表8. 布羅索尤單抗輕鏈設計組1
表9. 布羅索尤單抗重鏈設計組1
實例 6. 基於分子對接研究的經工程改造之 FGF23 結合抗體合理設計組 1
| LC 突變(相對於SEQ ID NO：2) | ΔΔG (kcal/mol) | ΔΔS (kcal/mol) | VdW SA(Å 2) | 疏水性SA(Å 2) | 親水性SA(Å 2) |
| G30A | -1.08 | -0.37 | -63.95 | 0.33 | -61.95 |
| G30C | 0.12 | 0.13 | -39.47 | 1.83 | -39.84 |
| G30D | 1.90 | 0.98 | -66.97 | -12.15 | -51.79 |
| G30E | 0.79 | 1.37 | -51.29 | 23.50 | -83.41 |
| G30F | 2.29 | 0.23 | 52.36 | 40.51 | 9.03 |
| G30G | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| G30H | 4.44 | 1.47 | -26.20 | 3.15 | -29.23 |
| G30I | 3.09 | -0.19 | -12.10 | 5.94 | -16.62 |
| G30K | 1.64 | 1.12 | 7.07 | -12.95 | 11.50 |
| G30L | 2.81 | 1.76 | -34.42 | 50.57 | -91.40 |
| G30M | 2.15 | 1.00 | -70.00 | 12.67 | -84.98 |
| G30N | 0.33 | 0.52 | -66.45 | -21.05 | -44.73 |
| G30P | -0.88 | 0.23 | -83.92 | -20.74 | -71.30 |
| G30Q | 2.33 | 1.21 | -29.03 | -9.02 | -18.24 |
| G30R | -1.55 | 0.54 | 68.26 | 22.89 | 45.58 |
| G30S | -0.56 | 0.30 | -46.30 | 7.83 | -53.98 |
| G30T | -3.88 | -0.30 | -57.13 | -5.29 | -51.15 |
| G30V | 1.20 | 0.13 | -57.42 | -16.26 | -41.77 |
| G30W | 2.87 | 0.76 | 13.94 | 39.40 | -29.14 |
| G30Y | 1.24 | 0.63 | -20.15 | 1.31 | -14.59 |
| I31A | 0.06 | 3.21 | -5.87 | -13.07 | 6.42 |
| I31C | -0.09 | 2.31 | 0.87 | -0.85 | 1.73 |
| I31D | -0.04 | 3.61 | -10.07 | -16.86 | 8.48 |
| I31E | -1.08 | 2.17 | -6.42 | -11.39 | 6.18 |
| I31F | -0.39 | 1.50 | -1.00 | 0.00 | 3.00 |
| I31G | -1.71 | 3.86 | -1.37 | -8.42 | 7.08 |
| I31H | -0.40 | 1.80 | -2.97 | -0.96 | 0.00 |
| I31I | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| I31K | -0.96 | 2.85 | 0.00 | -0.81 | 1.68 |
| I31L | -1.65 | 0.85 | -2.03 | 0.87 | -2.03 |
| I31M | -1.01 | 1.29 | -0.83 | -2.94 | 4.97 |
| I31N | -1.59 | 2.43 | 1.39 | -0.06 | 2.67 |
| I31P | -0.26 | 2.92 | -3.59 | -10.87 | 10.62 |
| I31Q | -1.00 | 2.08 | -1.40 | -2.25 | 2.03 |
| I31R | -0.52 | 2.68 | -4.48 | -2.34 | -2.45 |
| I31S | -0.49 | 3.45 | -10.23 | -14.00 | 4.69 |
| I31T | -1.27 | 2.90 | 4.88 | -1.15 | 6.87 |
| I31V | -0.28 | 2.24 | -1.85 | -2.59 | 1.61 |
| I31W | 2.17 | 5.12 | -10.09 | -3.42 | -4.34 |
| I31Y | 2.76 | 2.53 | -6.15 | -6.61 | 3.03 |
| Q29A | 3.58 | 1.21 | 8.36 | 16.36 | -11.58 |
| Q29C | 1.31 | 1.06 | 10.76 | 13.01 | -12.00 |
| Q29D | 1.19 | 1.62 | -0.45 | -0.49 | -2.31 |
| Q29E | 2.31 | 1.41 | 1.79 | 14.42 | -16.97 |
| Q29F | -2.13 | 0.79 | 5.77 | 78.62 | -66.50 |
| Q29G | 4.08 | 1.94 | 28.49 | 24.75 | 1.76 |
| Q29H | -2.04 | 0.80 | -4.70 | 3.37 | -15.47 |
| Q29I | 0.67 | 0.41 | 4.66 | 48.06 | -38.55 |
| Q29K | -1.10 | 0.68 | -5.52 | 24.69 | -26.92 |
| Q29L | -0.46 | -0.01 | -10.49 | 21.41 | -36.24 |
| Q29M | -0.94 | 0.48 | -12.24 | 46.42 | -52.52 |
| Q29N | -1.91 | 0.69 | 2.51 | 6.49 | -8.07 |
| Q29P | 6.13 | 2.91 | -6.95 | 52.50 | -33.64 |
| Q29Q | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| Q29R | -1.95 | 0.90 | 16.97 | -12.44 | 33.58 |
| Q29S | 2.14 | 1.39 | 9.74 | 12.69 | 0.26 |
| Q29T | 1.56 | 0.99 | 7.72 | 7.81 | 0.26 |
| Q29V | 1.17 | 0.43 | 8.79 | 31.73 | -21.59 |
| Q29W | -3.73 | 0.60 | 13.78 | 86.64 | -73.10 |
| Q29Y | -1.06 | 0.87 | 15.15 | 30.63 | -16.45 |
| S26A | 1.22 | 0.24 | 19.75 | 11.17 | 13.17 |
| S26C | -0.26 | 0.31 | 1.85 | -23.46 | 0.59 |
| S26D | 2.08 | 0.80 | -19.24 | -19.39 | -7.40 |
| S26E | 2.54 | 0.14 | -79.86 | -34.05 | -52.03 |
| S26F | 1.30 | 0.37 | 82.49 | 98.00 | -15.18 |
| S26G | -0.30 | 0.66 | -11.94 | -17.30 | -3.57 |
| S26H | 1.12 | 1.13 | 40.54 | -11.65 | 29.49 |
| S26I | -0.48 | -0.32 | 14.88 | 30.28 | -11.87 |
| S26K | 1.28 | 0.90 | 2.27 | -4.62 | 10.95 |
| S26L | -0.63 | 0.13 | 62.63 | 79.30 | -12.14 |
| S26M | 1.37 | 0.16 | 21.44 | 18.30 | 5.84 |
| S26N | -0.49 | 0.92 | 21.55 | -29.43 | 43.81 |
| S26P | 0.24 | 1.09 | -7.97 | 9.25 | -23.82 |
| S26Q | -0.49 | 0.45 | 20.00 | -25.33 | 40.32 |
| S26R | 1.83 | 0.11 | 23.69 | -5.99 | 29.98 |
| S26S | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| S26T | 1.32 | 0.59 | 19.80 | 32.21 | -10.00 |
| S26V | 1.20 | -0.06 | 37.12 | 33.29 | 4.36 |
| S26W | 1.14 | 0.66 | 54.57 | 77.14 | -19.85 |
| S26Y | 1.28 | 0.46 | 92.65 | 54.87 | 38.20 |
| S32A | 2.49 | 0.43 | -4.77 | 11.84 | -10.00 |
| S32C | -0.03 | 0.29 | -6.61 | -0.67 | -7.54 |
| S32D | -2.66 | 0.44 | -9.12 | -1.80 | 0.03 |
| S32E | -0.80 | 0.12 | -5.77 | -39.70 | 34.24 |
| S32F | -4.69 | -0.56 | -3.27 | -13.45 | 14.81 |
| S32G | 4.69 | 1.32 | 14.29 | 21.55 | -5.77 |
| S32H | -6.44 | 0.20 | -20.75 | -14.86 | -7.11 |
| S32I | -2.25 | -1.07 | -42.54 | -7.75 | -27.30 |
| S32K | 1.07 | 0.60 | -14.15 | -36.86 | 28.89 |
| S32L | -4.17 | -1.11 | -18.80 | 4.45 | -15.84 |
| S32M | -3.15 | -0.78 | -25.54 | -4.30 | -13.99 |
| S32N | -2.94 | 0.57 | 10.54 | 1.42 | 10.66 |
| S32P | 1.18 | 0.63 | -11.06 | 2.69 | -11.04 |
| S32Q | 0.11 | 0.79 | -23.04 | -60.57 | 35.10 |
| S32R | -1.79 | -0.62 | -9.67 | -43.08 | 35.07 |
| S32S | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| S32T | -0.85 | 0.02 | -11.88 | 2.31 | -8.79 |
| S32V | -0.42 | -0.60 | -18.06 | 2.26 | -17.52 |
| S32W | -6.27 | -0.45 | -18.02 | -23.70 | 8.10 |
| S32Y | -5.79 | -0.37 | 0.57 | -37.64 | 40.23 |
| S33A | 0.42 | 1.04 | -19.60 | 3.17 | -23.86 |
| S33C | -1.78 | 0.70 | -30.85 | 15.97 | -44.48 |
| S33D | -1.23 | 1.44 | -33.47 | 14.96 | -44.59 |
| S33E | -3.97 | 0.61 | -58.52 | -14.16 | -40.81 |
| S33F | -1.23 | 0.62 | -60.92 | 22.56 | -75.92 |
| S33G | 0.12 | 1.65 | -27.32 | 7.55 | -30.28 |
| S33H | -4.61 | 0.61 | -47.58 | 14.15 | -53.65 |
| S33I | -2.49 | -0.10 | -64.49 | -16.97 | -49.90 |
| S33K | -4.60 | 0.52 | 16.06 | 8.18 | 3.00 |
| S33L | -4.30 | -0.51 | -53.17 | -10.39 | -36.81 |
| S33M | -5.46 | -0.23 | -54.79 | -7.60 | -41.30 |
| S33N | -6.15 | 0.42 | -42.16 | 3.36 | -41.24 |
| S33P | 1.64 | 0.69 | -35.76 | 7.61 | -36.38 |
| S33Q | -2.86 | 0.58 | -49.64 | -11.74 | -29.14 |
| S33R | -4.65 | -0.09 | 3.22 | -18.33 | 15.86 |
| S33S | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| S33T | -1.88 | 0.39 | -44.64 | 2.43 | -33.14 |
| S33V | -1.11 | 0.12 | -59.36 | -11.72 | -49.40 |
| S33W | -6.76 | 0.88 | -45.79 | 27.60 | -73.54 |
| S33Y | -4.14 | -0.36 | -72.63 | 1.47 | -67.33 |
| S83A | 0.22 | 0.92 | -6.72 | 38.16 | -42.08 |
| S83C | 0.29 | 1.10 | 4.76 | -10.56 | -46.40 |
| S83D | -1.30 | 1.16 | -2.26 | -3.69 | -1.50 |
| S83E | -0.17 | 1.82 | 16.44 | -2.49 | 18.89 |
| S83F | 0.02 | 1.30 | 70.68 | 128.97 | -53.32 |
| S83G | -0.42 | 1.04 | -20.68 | -21.10 | -6.99 |
| S83H | 0.89 | 1.69 | 12.07 | -18.61 | -5.30 |
| S83I | -0.46 | 0.39 | -3.21 | 52.92 | -47.57 |
| S83K | 0.29 | 1.84 | 82.80 | 61.47 | 25.24 |
| S83L | -0.30 | 0.82 | 32.04 | 86.55 | -49.87 |
| S83M | -0.31 | 1.58 | 70.71 | 123.15 | -46.29 |
| S83N | 0.08 | 1.30 | -4.21 | -28.74 | 29.15 |
| S83P | 0.45 | 1.96 | 20.25 | 62.78 | -39.59 |
| S83Q | 0.35 | 1.53 | 12.03 | 8.05 | 6.29 |
| S83R | 0.58 | 0.90 | 44.01 | 18.56 | 26.23 |
| S83S | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| S83T | -0.10 | 0.75 | 17.37 | 29.78 | -11.74 |
| S83V | -0.26 | 0.55 | -2.82 | 53.07 | -49.37 |
| S83W | 0.78 | 1.29 | 57.36 | 116.69 | -52.42 |
| S83Y | 0.46 | 0.97 | 42.34 | 47.97 | 3.36 |
| T87A | -0.64 | 1.14 | -18.97 | 22.19 | -30.86 |
| T87C | -2.50 | 1.18 | -8.75 | 33.33 | -61.14 |
| T87D | 0.20 | 1.27 | -4.04 | 7.63 | -4.53 |
| T87E | 2.35 | 0.76 | 26.67 | -30.54 | 45.87 |
| T87F | -2.28 | 0.53 | -13.05 | 87.51 | -99.87 |
| T87G | 0.99 | 1.69 | -23.87 | 17.34 | -45.19 |
| T87H | -2.75 | 1.18 | -25.21 | -10.02 | -48.75 |
| T87I | -1.18 | 0.21 | -36.31 | 33.07 | -74.65 |
| T87K | -3.26 | -0.18 | -3.48 | 14.78 | -24.84 |
| T87L | 3.89 | 0.27 | 8.67 | 16.55 | -13.64 |
| T87M | -2.76 | 0.12 | -28.64 | 28.49 | -63.56 |
| T87N | -0.24 | 1.16 | -11.62 | 11.93 | -23.03 |
| T87P | -2.12 | 1.57 | -28.90 | 42.05 | -68.33 |
| T87Q | -4.00 | -0.27 | -56.56 | 9.56 | -63.09 |
| T87R | 0.49 | 0.25 | 97.79 | 11.60 | 79.36 |
| T87S | 2.44 | 1.43 | -27.13 | -8.85 | -17.39 |
| T87T | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| T87V | -0.23 | 0.29 | -40.10 | 26.71 | -65.20 |
| T87W | -1.79 | 1.03 | 1.07 | 60.34 | -58.28 |
| T87Y | 2.45 | 0.53 | 41.40 | -1.95 | 35.47 |
| HC突變(相對於SEQ ID NO：1) | ΔΔG (kcal/mol) | ΔΔS (kcal/mol) | VdW SA(Å 2) | 疏水性SA(Å 2) | 親水性SA(Å 2) |
| A71A | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| A71C | -0.24 | 0.48 | -0.72 | -21.39 | 4.27 |
| A71D | 0.32 | 1.06 | 16.06 | -42.98 | 46.54 |
| A71E | 0.29 | 0.61 | 4.60 | -36.43 | 31.29 |
| A71F | -0.44 | -0.62 | -9.45 | -48.46 | 30.05 |
| A71G | -0.20 | 1.33 | 10.48 | -1.56 | 7.41 |
| A71H | -0.28 | 0.77 | -18.70 | -81.39 | 32.28 |
| A71I | -0.14 | -0.84 | -16.55 | -54.35 | 34.35 |
| A71K | 0.90 | -0.27 | -2.30 | -22.30 | 19.74 |
| A71L | -0.44 | -0.71 | 12.87 | -33.80 | 38.27 |
| A71M | 0.01 | 0.01 | -24.22 | -7.29 | -13.59 |
| A71N | -0.40 | 0.64 | 22.26 | -37.11 | 55.88 |
| A71P | -0.01 | 0.86 | 4.30 | -0.17 | 3.35 |
| A71Q | 0.11 | 0.45 | -13.00 | -15.99 | 4.53 |
| A71R | -0.11 | -0.47 | -43.20 | -25.75 | -8.14 |
| A71S | -0.40 | 0.68 | 1.48 | -10.95 | 7.87 |
| A71T | -0.25 | 0.40 | -1.24 | -6.85 | 3.63 |
| A71V | -0.23 | -0.11 | 2.42 | -26.12 | 28.84 |
| A71W | -0.25 | -0.71 | -8.16 | -37.88 | 21.91 |
| A71Y | -0.29 | -0.44 | -4.12 | -78.46 | 72.85 |
| D109A | 1.09 | 1.31 | -6.11 | -3.48 | 3.78 |
| D109C | 0.23 | 1.10 | -3.63 | -1.53 | 3.78 |
| D109D | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| D109E | 0.99 | 2.47 | -2.85 | -3.60 | 17.65 |
| D109F | -0.74 | 1.95 | -22.60 | -14.06 | 18.55 |
| D109G | 0.63 | 2.02 | -0.29 | -0.63 | 9.28 |
| D109H | 0.79 | 1.80 | -3.52 | -2.19 | 8.31 |
| D109I | 0.33 | 0.16 | -11.67 | -10.77 | 6.63 |
| D109K | 0.24 | 2.07 | -8.01 | 0.94 | 6.55 |
| D109L | 0.32 | 0.20 | -12.39 | -12.27 | 6.63 |
| D109M | -0.34 | 0.67 | -6.76 | -1.29 | 7.15 |
| D109N | -0.22 | 0.69 | -1.90 | -1.94 | 8.80 |
| D109P | 0.52 | 1.51 | 0.44 | -0.89 | 6.74 |
| D109Q | 0.74 | 1.17 | -9.52 | -4.71 | 3.29 |
| D109R | 2.29 | 0.82 | -9.27 | -5.93 | 8.72 |
| D109S | 0.56 | 0.86 | 0.06 | -1.02 | 9.28 |
| D109T | 0.36 | 1.09 | 6.75 | -0.48 | 10.97 |
| D109V | 0.37 | 0.38 | -6.17 | -10.64 | 9.77 |
| D109W | 0.25 | 1.59 | -6.48 | -9.44 | 6.56 |
| D109Y | 0.34 | 1.16 | -3.95 | -4.89 | 4.04 |
| D134A | 1.13 | 0.94 | -0.89 | -5.78 | 1.36 |
| D134C | 0.53 | 1.32 | -1.26 | -16.26 | 10.62 |
| D134D | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| D134E | -0.58 | 0.33 | 34.00 | -29.02 | 64.96 |
| D134F | -5.28 | -1.09 | -1.49 | -58.64 | 44.83 |
| D134G | 1.64 | 1.76 | 19.43 | 6.80 | 7.11 |
| D134H | -1.77 | 1.49 | -2.56 | -25.84 | -11.33 |
| D134I | -1.23 | -1.15 | -9.23 | 6.61 | -13.56 |
| D134K | -0.95 | 0.39 | 3.94 | -34.20 | 41.75 |
| D134L | -1.39 | -1.00 | -11.79 | 1.86 | -9.58 |
| D134M | -1.49 | 0.72 | -1.36 | 15.35 | -16.27 |
| D134N | -1.06 | 0.42 | -7.80 | -11.52 | 3.02 |
| D134P | 1.46 | 0.81 | 1.82 | 3.11 | -1.06 |
| D134Q | -0.56 | 0.73 | 26.93 | -38.77 | 66.46 |
| D134R | -3.70 | -0.60 | 6.07 | -30.65 | 42.00 |
| D134S | 1.08 | 1.60 | -6.50 | -14.68 | 1.74 |
| D134T | -0.07 | 0.61 | -1.67 | 2.87 | -4.67 |
| D134V | -0.55 | 0.08 | -10.96 | -7.73 | -5.71 |
| D134W | -4.83 | 0.33 | 8.34 | -2.89 | 7.63 |
| D134Y | -5.18 | -0.94 | -0.38 | -60.19 | 45.38 |
| H39A | 0.16 | 1.33 | 33.62 | 52.56 | -16.66 |
| H39C | 0.16 | 0.81 | 22.54 | -1.36 | 27.45 |
| H39D | 0.09 | 1.81 | 35.80 | 22.22 | 4.93 |
| H39E | -0.11 | 1.76 | 5.07 | 12.65 | -6.02 |
| H39F | -0.19 | 0.26 | 56.90 | 71.52 | -23.28 |
| H39G | 0.12 | 2.13 | 21.20 | 36.22 | -16.44 |
| H39H | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| H39I | 0.12 | -0.53 | 2.41 | 13.42 | -14.45 |
| H39K | 0.14 | 1.26 | 4.30 | 18.00 | -10.81 |
| H39L | 0.15 | 0.33 | 14.36 | 61.64 | -49.58 |
| H39M | -0.20 | 0.87 | 15.03 | 59.67 | -50.37 |
| H39N | 0.30 | 1.22 | 41.04 | 25.61 | 8.48 |
| H39P | -0.04 | 1.16 | 26.21 | -15.45 | 42.03 |
| H39Q | 0.12 | 0.76 | -12.43 | 13.28 | -25.82 |
| H39R | -0.06 | 0.29 | 23.54 | -1.64 | 22.15 |
| H39S | 0.09 | 1.46 | 15.65 | -4.91 | 22.49 |
| H39T | 0.10 | 0.67 | -1.67 | -2.52 | -0.55 |
| H39V | 0.02 | 0.03 | -5.04 | -2.30 | 0.92 |
| H39W | 0.04 | 0.28 | 28.21 | 33.64 | -4.07 |
| H39Y | -0.21 | 0.30 | 49.59 | 33.74 | 11.43 |
| I110A | 0.03 | 2.52 | 3.86 | -22.74 | 29.99 |
| I110C | -0.11 | 1.91 | 7.13 | -17.14 | 23.77 |
| I110D | -1.11 | 4.20 | 15.76 | -56.14 | 86.19 |
| I110E | -0.08 | 2.61 | -4.10 | -56.28 | 65.04 |
| I110F | -0.35 | 0.96 | -23.99 | -25.37 | 5.99 |
| I110G | 0.66 | 2.84 | 24.81 | -20.46 | 54.01 |
| I110H | -0.86 | 1.80 | -25.00 | -45.31 | 22.01 |
| I110I | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| I110K | -0.04 | 0.92 | -14.89 | -10.14 | 26.38 |
| I110L | -0.75 | 0.74 | -20.88 | -25.94 | 3.67 |
| I110M | -0.97 | 1.38 | -10.18 | -13.53 | 11.87 |
| I110N | -0.10 | 2.04 | 9.43 | -12.38 | 31.55 |
| I110P | 0.49 | 2.68 | -15.84 | -33.85 | 35.29 |
| I110Q | -1.22 | 1.59 | -21.18 | -62.41 | 63.88 |
| I110R | -0.24 | 1.42 | 5.96 | -48.18 | 53.29 |
| I110S | -0.94 | 2.52 | -2.78 | -33.44 | 45.29 |
| I110T | -0.20 | 1.50 | 9.40 | -31.40 | 44.59 |
| I110V | 0.22 | 1.91 | -7.61 | -14.51 | 5.64 |
| I110W | -3.68 | 1.40 | 14.00 | -3.39 | 24.52 |
| I110Y | -2.98 | 1.93 | 29.93 | -8.17 | 51.25 |
| N33A | -0.02 | 0.77 | -30.82 | 35.02 | -58.06 |
| N33C | 0.00 | 0.57 | -8.55 | 8.36 | -49.97 |
| N33D | -0.09 | 0.57 | 20.42 | 51.48 | -32.54 |
| N33E | -0.10 | 0.63 | -1.03 | -3.95 | 0.01 |
| N33F | -0.05 | 1.38 | 61.03 | 141.95 | -90.36 |
| N33G | -0.02 | 1.18 | -35.33 | 23.42 | -49.87 |
| N33H | -0.04 | 1.18 | 0.77 | 11.38 | -55.78 |
| N33I | -0.14 | 0.21 | 4.21 | 49.75 | -54.51 |
| N33K | 0.04 | 1.38 | 40.21 | 32.19 | -7.94 |
| N33L | -0.01 | 0.18 | 3.27 | 65.34 | -59.41 |
| N33M | 0.01 | 0.94 | 33.57 | 84.15 | -52.32 |
| N33N | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| N33P | -0.05 | 1.12 | -23.46 | 41.13 | -61.32 |
| N33Q | 0.01 | 0.64 | 18.36 | -8.17 | 22.72 |
| N33R | 0.12 | 1.04 | 62.06 | -4.16 | 62.99 |
| N33S | -0.03 | 0.82 | 7.00 | 55.14 | -51.31 |
| N33T | -0.08 | 0.58 | -24.68 | 36.49 | -70.86 |
| N33V | -0.09 | 0.13 | 5.70 | 36.04 | -29.54 |
| N33W | -0.02 | 1.33 | 62.07 | 108.12 | -62.31 |
| N33Y | -0.03 | 1.38 | 107.14 | 106.68 | 2.14 |
| N59A | 2.81 | 1.04 | 0.98 | -5.70 | 12.78 |
| N59C | 2.02 | 0.54 | 11.73 | 1.94 | 15.38 |
| N59D | 0.44 | 0.47 | -4.01 | -0.83 | 1.73 |
| N59E | 4.10 | 0.31 | -3.26 | -10.48 | 16.92 |
| N59F | 3.42 | -0.20 | -11.66 | -28.85 | 28.57 |
| N59G | 3.64 | 2.22 | -20.06 | -26.07 | 17.71 |
| N59H | 3.09 | 0.76 | -7.82 | -16.99 | 13.51 |
| N59I | 5.73 | 0.61 | -24.09 | -28.10 | 14.52 |
| N59K | 2.76 | 1.02 | 20.05 | 2.57 | 26.74 |
| N59L | 5.05 | -0.32 | -4.36 | -27.22 | 32.89 |
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| N59N | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| N59P | 3.64 | 2.10 | -17.39 | -8.28 | 1.58 |
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| N59R | 5.05 | 1.24 | 77.11 | -71.11 | 147.91 |
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| N70Q | 0.10 | 0.61 | -9.05 | -6.74 | 3.05 |
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| Q75V | 0.69 | 0.74 | 7.10 | 54.24 | -48.08 |
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| Q75Y | 0.35 | 0.32 | -31.53 | 3.48 | -45.08 |
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| S65H | -5.02 | 0.05 | -3.22 | -29.17 | 17.09 |
| S65I | -2.78 | -1.04 | 15.97 | 14.52 | -2.59 |
| S65K | 3.80 | 1.97 | 89.30 | 36.14 | 50.78 |
| S65L | 0.34 | 0.20 | 51.12 | 43.52 | 10.62 |
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| S65S | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| S65T | -4.54 | 0.04 | 0.58 | 15.66 | -25.65 |
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| T32G | 0.19 | 1.08 | -1.36 | -36.58 | 24.21 |
| T32H | 0.07 | 0.74 | 10.44 | -17.33 | 10.59 |
| T32I | 0.11 | -0.25 | -15.44 | -27.53 | 3.90 |
| T32K | 0.37 | 0.61 | -26.14 | -49.64 | 20.11 |
| T32L | 0.10 | -0.10 | 25.37 | 17.42 | 2.58 |
| T32M | 0.14 | 0.28 | 31.60 | -11.72 | 44.26 |
| T32N | 0.16 | 0.51 | -17.14 | -67.87 | 45.79 |
| T32P | 0.29 | -0.72 | -19.41 | -77.33 | 50.21 |
| T32Q | 0.31 | 0.31 | -19.90 | -72.23 | 41.94 |
| T32R | 0.18 | 0.72 | 63.76 | -22.60 | 80.26 |
| T32S | 0.20 | 0.53 | -16.27 | -47.27 | 24.69 |
| T32T | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| T32V | 0.13 | -0.21 | -16.86 | -32.39 | 11.90 |
| T32W | 0.16 | 0.22 | 37.36 | 36.07 | 3.94 |
| T32Y | 0.07 | -0.13 | 27.88 | 4.80 | 15.38 |
| T68A | -0.18 | 0.57 | -1.00 | -13.74 | 13.13 |
| T68C | -0.69 | 0.70 | -0.05 | -41.46 | 0.84 |
| T68D | -0.22 | 1.72 | -4.80 | -54.49 | 44.08 |
| T68E | -0.30 | 0.81 | -8.59 | -30.67 | 12.93 |
| T68F | 0.45 | -0.74 | -8.40 | -1.89 | -6.36 |
| T68G | -1.16 | 1.00 | -1.72 | -42.39 | 37.06 |
| T68H | -0.33 | 1.13 | 3.11 | -59.32 | 30.18 |
| T68I | 0.31 | -0.19 | -20.19 | -6.23 | -13.07 |
| T68K | -0.12 | 1.35 | 27.97 | -6.20 | 38.22 |
| T68L | 0.29 | -0.01 | -18.31 | -25.44 | 8.66 |
| T68M | -0.59 | 0.24 | -5.95 | 5.21 | -14.50 |
| T68N | -0.69 | 0.88 | -10.74 | -45.81 | 36.93 |
| T68P | 0.18 | 1.61 | 4.02 | 8.35 | -9.56 |
| T68Q | -0.39 | 0.86 | 1.34 | -42.99 | 45.85 |
| T68R | -1.44 | 1.39 | 21.36 | -20.24 | 30.08 |
| T68S | -0.31 | 0.79 | 7.63 | -35.17 | 42.84 |
| T68T | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| T68V | 0.46 | 0.08 | -10.52 | -8.51 | -0.07 |
| T68W | 0.47 | -0.45 | -6.62 | 23.33 | -28.66 |
| T68Y | 0.16 | -0.57 | -9.52 | -2.27 | -5.81 |
| V111A | 3.33 | 2.33 | -18.99 | -31.37 | 15.52 |
| V111C | 1.74 | 2.65 | -5.84 | -0.77 | -4.05 |
| V111D | 4.78 | 2.90 | -2.37 | 0.06 | 2.36 |
| V111E | 5.59 | 3.19 | -13.41 | -1.95 | -9.26 |
| V111F | 1.40 | 2.91 | -21.61 | -18.60 | -3.79 |
| V111G | 5.03 | 2.67 | 3.57 | -1.87 | 5.25 |
| V111H | 1.11 | 1.35 | 8.97 | 14.37 | -2.44 |
| V111I | 2.10 | 1.18 | 23.09 | -26.50 | 46.90 |
| V111K | -0.12 | 1.41 | -3.09 | 0.53 | -5.32 |
| V111L | 2.81 | 0.89 | -0.93 | 0.46 | 2.65 |
| V111M | 0.87 | 1.80 | -10.16 | -2.62 | -5.17 |
| V111N | 1.05 | 2.83 | -0.92 | 0.77 | -1.10 |
| V111P | 1.01 | 1.72 | -0.59 | 0.25 | 1.46 |
| V111Q | 0.83 | 2.23 | -10.49 | -3.02 | -5.92 |
| V111R | -1.55 | 1.47 | -9.66 | -2.37 | -6.33 |
| V111S | 2.86 | 2.08 | 3.15 | 4.38 | -0.72 |
| V111T | 3.45 | 1.54 | 13.58 | -31.54 | 48.63 |
| V111V | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| V111W | -0.88 | 2.30 | -36.42 | -27.02 | -7.00 |
| V111Y | 1.01 | 2.62 | -38.71 | -34.80 | 0.84 |
| Y40A | 1.39 | 1.09 | 17.94 | 12.69 | -3.82 |
| Y40C | 0.57 | 1.07 | 8.41 | 3.72 | -4.83 |
| Y40D | -2.54 | 1.59 | 25.93 | 10.84 | 6.17 |
| Y40E | -1.15 | 1.24 | 15.75 | 6.86 | -0.69 |
| Y40F | -0.27 | 0.03 | 3.07 | 4.87 | -4.15 |
| Y40G | 1.36 | 2.08 | 32.33 | 20.21 | -5.50 |
| Y40H | -0.79 | 0.87 | -3.02 | -4.37 | -3.48 |
| Y40I | -2.73 | -0.32 | 19.63 | 12.59 | 3.12 |
| Y40K | -1.63 | 0.63 | -3.55 | -1.51 | -2.20 |
| Y40L | -3.11 | -0.43 | 14.84 | 7.13 | 1.10 |
| Y40M | -1.14 | -0.19 | 20.57 | 10.21 | -1.65 |
| Y40N | 0.38 | 1.01 | 4.80 | -0.24 | 6.22 |
| Y40P | -1.54 | 1.35 | 18.71 | 9.01 | -0.62 |
| Y40Q | -0.63 | 0.78 | 15.18 | 8.32 | -3.20 |
| Y40R | -3.05 | -0.29 | 2.89 | 4.69 | -6.25 |
| Y40S | -0.94 | 1.21 | 26.63 | 14.15 | 2.19 |
| Y40T | -3.15 | 0.33 | 20.04 | 6.19 | 12.18 |
| Y40V | -1.94 | 0.02 | 15.85 | 11.13 | 2.19 |
| Y40W | -2.56 | -0.51 | -1.33 | 4.76 | -3.41 |
| Y40Y | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 突變(ASN#)(相對於SEQ ID NO：2) | ΔΔG(kcal/mol) | ΔΔS(kcal/mol) |
| G30A | -1.1 | -0.4 |
| G30P | -0.9 | 0.2 |
| G30S | -0.6 | 0.3 |
| I31E | -1.1 | 2.2 |
| I31K | -1.0 | 2.8 |
| I31M | -1.0 | 1.3 |
| I31Q | -1.0 | 2.1 |
| I31R | -0.5 | 2.7 |
| I31S | -0.5 | 3.5 |
| I31T | -1.3 | 2.9 |
| Q29K | -1.1 | 0.7 |
| Q29M | -0.9 | 0.5 |
| Q29Y | -1.1 | 0.9 |
| S26I | -0.5 | -0.3 |
| S26L | -0.6 | 0.1 |
| S26N | -0.5 | 0.9 |
| S26Q | -0.5 | 0.5 |
| S32D | -2.6 | 0.4 |
| S32F | -4.7 | -0.6 |
| S32I | -2.2 | -1.1 |
| S32L | -4.2 | -1.1 |
| S32M | -3.1 | -0.8 |
| S32R | -1.8 | -0.6 |
| S32T | -0.8 | 0.0 |
| S32V | -0.4 | -0.6 |
| S33D | -1.2 | 1.4 |
| S33F | -1.2 | 0.6 |
| S33L | -4.3 | -0.5 |
| S33V | -1.1 | 0.1 |
| S83D | -1.3 | 1.2 |
| T87A | -0.6 | 1.1 |
| T87I | -1.2 | 0.2 |
| 突變(ASN#)(相對於SEQ ID NO：1) | ΔΔG(kcal/mol) | ΔΔS(kcal/mol) |
| A71F | -0.4 | -0.6 |
| A71I | -0.1 | -0.8 |
| A71L | -0.4 | -0.7 |
| A71W | -0.2 | -0.7 |
| D109F | -0.7 | 2.0 |
| D134E | -0.6 | 0.3 |
| D134F | -5.3 | -1.1 |
| D134I | -1.2 | -1.1 |
| D134K | -1.0 | 0.4 |
| D134L | -1.4 | -1.0 |
| D134M | -1.5 | 0.7 |
| D134N | -1.1 | 0.4 |
| D134Q | -0.6 | 0.7 |
| D134R | -3.7 | -0.6 |
| D134V | -0.5 | 0.1 |
| D134Y | -5.2 | -0.9 |
| H39I | 0.1 | -0.5 |
| I110D | -1.1 | 4.2 |
| I110H | -0.9 | 1.8 |
| I110L | -0.7 | 0.7 |
| I110M | -1.0 | 1.4 |
| I110Q | -1.2 | 1.6 |
| I110S | -0.9 | 2.5 |
| N70H | -0.6 | 0.6 |
| N70K | -0.8 | 0.5 |
| N70R | -0.8 | -0.1 |
| N70W | 0.0 | -0.8 |
| N70Y | -0.6 | -0.3 |
| Q72K | -0.6 | 1.0 |
| Q72R | -1.5 | -0.1 |
| Q75R | -1.1 | 0.0 |
| Q75W | -1.4 | -0.5 |
| S65E | -1.1 | 0.4 |
| S65F | -4.4 | -1.0 |
| S65I | -2.8 | -1.0 |
| S65M | -3.9 | -1.2 |
| S65N | -1.5 | 0.5 |
| S65V | -2.0 | -0.9 |
| S65Y | -0.5 | 0.5 |
| S67F | -1.5 | -0.5 |
| S67H | -1.2 | -0.3 |
| S67I | 4.6 | -0.8 |
| S67L | -0.6 | -1.1 |
| S67M | -1.8 | -0.6 |
| S69F | -2.0 | -1.2 |
| S69I | 0.2 | -0.5 |
| S69K | -0.6 | 0.0 |
| S69L | 0.5 | -0.5 |
| S69M | -0.9 | -0.1 |
| S69N | -0.5 | 0.8 |
| S69R | -0.8 | 0.1 |
| S69W | -2.2 | -1.5 |
| S69Y | -1.5 | -1.3 |
| T32P | 0.3 | -0.7 |
| T68F | 0.4 | -0.7 |
| T68G | -1.2 | 1.0 |
| T68M | -0.6 | 0.2 |
| T68N | -0.7 | 0.9 |
| T68R | -1.4 | 1.4 |
| T68Y | 0.2 | -0.6 |
| V111W | -0.9 | 2.3 |
| Y40E | -1.2 | 1.2 |
| Y40H | -0.8 | 0.9 |
| Y40M | -1.1 | -0.2 |
| Y40Q | -0.6 | 0.8 |
| Y40S | -0.9 | 1.2 |
表10顯示由1X掃描得到的96種經工程改造之FGF23結合抗體設計。各變異體依序用編號自001至096的經工程改造之FGF23結合抗體結構ID標記且相對於親本布羅索尤單抗重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：1)或親本布羅索尤單抗輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：2)具有一個胺基酸變化。設計組1中未包括相對於親本序列之組合胺基酸變化，且未包括在輕鏈或重鏈中不止一者上具有胺基酸變化的變異體。在表10中，所有胺基酸編號均根據ASN編號系統呈現。
表10. 經工程改造之FGF23結合抗體之設計組1
實例 7. 布羅索尤單抗 -FGF23 相互作用之結構評價
| 經工程改造之FGF23結合抗體結構ID | 輕鏈突變(ASN#)(相對於SEQ ID NO：2) | 經工程改造之FGF23結合抗體結構ID | 重鏈突變(相對於SEQ ID NO：1) |
| UGX001 | Q29F | UGX044 | T30Y |
| UGX002 | Q29R | UGX045 | T32K |
| UGX003 | G30D | UGX046 | H39K |
| UGX004 | G30Q | UGX047 | H39Y |
| UGX005 | G30R | UGX048 | Y40D |
| UGX006 | G30Y | UGX049 | Y40L |
| UGX007 | S32D | UGX050 | Y40R |
| UGX008 | S32F | UGX051 | N59E |
| UGX009 | S32R | UGX052 | N59Q |
| UGX010 | S32Y | UGX053 | N59R |
| UGX011 | S33F | UGX054 | S65E |
| UGX012 | S33Y | UGX055 | S65F |
| UGX013 | D58E | UGX056 | S65I |
| UGX014 | D58Q | UGX057 | S65Q |
| UGX015 | D58R | UGX058 | S65R |
| UGX016 | D58Y | UGX059 | S65Y |
| UGX017 | S68E | UGX060 | S67E |
| UGX018 | S68Q | UGX061 | S67F |
| UGX019 | S68R | UGX062 | S67R |
| UGX020 | S68Y | UGX063 | S67Y |
| UGX021 | S69R | UGX064 | T68F |
| UGX022 | S69Y | UGX065 | T68R |
| UGX023 | L70E | UGX066 | S69F |
| UGX024 | L70Y | UGX067 | S69R |
| UGX025 | E71R | UGX068 | S69Y |
| UGX026 | E71Y | UGX069 | N70E |
| UGX027 | S83E | UGX070 | N70R |
| UGX028 | S83R | UGX071 | N70Y |
| UGX029 | S83Y | UGX072 | A71F |
| UGX030 | T87R | UGX073 | A71R |
| UGX031 | T87Y | UGX074 | A71Y |
| UGX032 | F109E | UGX075 | Q72L |
| UGX033 | F109R | UGX076 | Q72R |
| UGX034 | N110E | UGX077 | Q72Y |
| UGX035 | N110F | UGX078 | Q75E |
| UGX036 | N110Q | UGX079 | Q75R |
| UGX037 | N110R | UGX080 | Q75Y |
| UGX038 | N110Y | UGX081 | D109F |
| UGX039 | D135F | UGX082 | D109R |
| UGX040 | D135R | UGX083 | D109Y |
| UGX041 | D135Y | UGX084 | I110E |
| UGX042 | Y136E | UGX085 | I110F |
| UGX043 | Y136R | UGX086 | I110Y |
| UGX087 | V111E | ||
| UGX088 | V111F | ||
| UGX089 | V111L | ||
| UGX090 | V111Q | ||
| UGX091 | V111R | ||
| UGX092 | D134E | ||
| UGX093 | D134F | ||
| UGX094 | D134K | ||
| UGX095 | D134R | ||
| UGX096 | D134Y |
為進一步表徵人類FGF23-布羅索尤單抗相互作用，使用來自HEK293S細胞上清液的完全糖基化之人類FGF23(R179Q)與亦在HEK293S細胞中表現之布羅索尤單抗Fab片段的複合物來進行X射線結晶學研究。根據常規方法(Pierce™ Fab製備套組，Thermo Scientific™，目錄號44985)，對布羅索尤單抗IgG重鏈及輕鏈進行木瓜蛋白酶消化以分離Fc及Fab片段，接著經歷蛋白質A以分離出約50 kDa之Fab片段。將完全糖基化之人類FGF23(R179Q)及布羅索尤單抗Fab片段在冰上培育超過一小時(1：0.8莫耳比)，且藉由尺寸排阻層析法(SEC)分離穩定複合物，隨後藉由SDS-PAGE評價。匯集含有該複合物之SEC洗提份，濃縮，且在-80℃下儲存。
簡言之，在96孔蒸氣擴散坐滴板中，藉由混合200 nl蛋白質溶液(4.5 mg/ml於25 mM Hepes pH 7.5及150 mM NaCl中)及200 nl孔溶液(0.2M檸檬酸氫二銨及20%(w/v)PEG 3350)來執行結晶試驗。在高級光子源(Advanced Photon Source，APS)同步加速器處自單晶收集繞射資料且使用autoPROC(autoProc、XDS、POINTLESS、AIMLESS、CCP4及STARANISO)進行處理(參見Vonrhein C, Flensburg C, Keller P, Sharff A, Smart O, Paciorek W, Womack T, Bricogne G. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2011年4月；67(第4部分)：293-302. [doi：10.1107/S0907444911007773])。
使用Phaser(CCP4)獲得相解析(phase solution)(參見J. Agirre等人, Acta. Cryst. D79, 449-461(2023)「The CCP4 suite：integrative software for macromolecular crystallography」[doi：10.1107/S2059798323003595])，其中FGF23及布羅索尤單抗(PDB ID 2P32及7VEN)作為分子置換的模型。用RECMAC、BUSTER及COOT進行精修及模型建立(參見J. Agirre等人； Bricogne G., Blanc E., Brandl M., Flensburg C., Keller P., Paciorek W., Roversi P, Sharff A., Smart O.S., Vonrhein C., Womack T.O.(2017). Cambridge, United Kingdom：Global Phasing Ltd.；以及Emsley P, Lohkamp B, Scott WG, Cowtan K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2010；66：486–501. [doi：10.1107/S0907444910007493])。
藉由分子置換解析之3 Å複合物結構的資料收集及精修統計提供於圖4中。
圖5顯示hFGF23(R179Q)：布羅索尤單抗Fab晶體結構，其中兩個抗原：Fab複合物由FGF23：FGF23二聚體介接。值得注意的是，FGF23二聚化界面殘基不存在於晶體結構中所鑑別之抗原決定基中，但其中一些參與FGFR1c受體結合。還注意到，布羅索尤單抗與FGF23之結合與先前報導的硫酸肝素結合殘基重疊(Goetz, Regina等人,「Molecular insights into the klotho-dependent, endocrine mode of action of fibroblast growth factor 19 subfamily members.」Molecular and cellular biology 27.9(2007)：3417-3428。)。已知硫酸肝素係FGF23：aKlotho：FGFR1c複合物二聚化所必需的(Chen, G., Liu, Y., Goetz, R.等人,「α-Klotho is a non-enzymatic molecular scaffold for FGF23 hormone signalling.」Nature 553, 461-466(2018)。)。本發明晶體結構中之FGF23二聚化界面殘基對應於先前Chen等人2018在FGFR1c結合中所描述之殘基。此等發現表明，布羅索尤單抗與FGF23之結合可另外與受體結合競爭或以其他方式干擾受體結合以及二聚化。
圖6係FGF23：Fab複合物之飄帶模型，其中FGF23抗原決定基殘基以紫色球體標識且FGF23二聚體/FGFR1c結合殘基以青色球體標識，布羅索尤單抗輕鏈互補位殘基以綠色球體標識且布羅索尤單抗重鏈互補位殘基以黃色球體標識。藉由結晶學鑑別抗原決定基及互補位殘基使得能夠合理設計本文實例6中所描述之布羅索尤單抗變異體分子。
總體而言，3Å解析度的結晶學FGF23：布羅索尤單抗複合物結構提供對抗原：抗體界面之了解，該界面不同於先前報導的相關系統中之界面(例如FN1抗體)或預測之界面(Kanhasut等人, 2022)(比較抗原決定基殘基-紫色球體，圖6對比圖7)。表11及表12顯示發現參與抗體-抗原複合物之結構界面的人類FGF23(R179Q)以及布羅索尤單抗輕鏈及重鏈序列中之胺基酸殘基。在表11中：「類型」係指在一或多個主題胺基酸位置處預測相互作用之性質，「D」表示基於距離之相互作用，「H」表示基於氫鍵之相互作用，且「I」表示離子相互作用；「距離」係指以埃計之距離；「頻率」係指與配對(主鏈及側鏈)相關之原子-原子接觸的數目；「面積」以平方埃提供且係指改變指定胺基酸後表面積之差異。
表11. 晶體結構- Ab：FGF23界面接觸
表12. 作為抗體變異體設計目標的重要布羅索尤單抗位置
| 類型 | Ab 鏈 | Ab | FGF23 | 能量(kcal/mol) | 距離(Å) | 頻率 | 面積(Å 2) |
| D | L | Asn92 | Thr46 | 1.14 | 4.02 | 6 | 13.7 |
| DH | L | Asn92 | Ala47 | -1.75 | 4.07 | 3 | 7.94 |
| DH | L | Asp93 | Ala47 | -0.11 | 3.98 | 4 | 22.81 |
| D | L | Asp93 | Arg48 | -0.73 | 3.79 | 8 | 18.04 |
| D | L | Tyr94 | Arg48 | 25.87 | 3.88 | 21 | 41.23 |
| D | L | Phe95 | Arg48 | -0.3 | 4.16 | 2 | 8.3 |
| DH | L | Asp99 | Asn49 | -1.27 | 4.02 | 10 | 14.17 |
| D | H | Val101 | Asn49 | -0.28 | 3.96 | 4 | 12.04 |
| DIH | H | Asp102 | Arg140 | -18.75 | 3.81 | 17 | 20.08 |
| D | H | Ala103 | Arg140 | 0.26 | 3.97 | 1 | 5.27 |
| D | H | Asp105 | Arg140 | 0.13 | 4.39 | 1 | 3.01 |
| D | L | Asp50 | Ala141 | 0.3 | 3.58 | 3 | 16.01 |
| DH | L | Ser53 | Ala141 | -0.42 | 3.74 | 3 | 12.38 |
| DH | L | Asp102 | Ala141 | -1.13 | 3.99 | 2 | 7.29 |
| D | L | Ser31 | Arg143 | 0.68 | 3.91 | 6 | 15.4 |
| DIH | L | Asp50 | Arg143 | -10.44 | 3.69 | 15 | 29.33 |
| DH | L | Ser52 | Arg143 | -1.18 | 3.9 | 5 | 26.38 |
| DH | L | Ser30 | Asn150 | -1.24 | 3.85 | 18 | 33.28 |
| D | L | Ser30 | Pro151 | -0.14 | 3.69 | 6 | 10.28 |
| D | L | Ser30 | Pro152 | -0.07 | 3.78 | 6 | 10.01 |
| D | L | Ser31 | Pro152 | -0.32 | 3.93 | 6 | 14.28 |
| D | L | Ala32 | Pro152 | 0.1 | 4.48 | 1 | 2.63 |
| DH | L | Asp50 | Pro152 | -0.56 | 3.77 | 2 | 7.6 |
| D | L | Ala32 | Pro153 | 0.47 | 4.13 | 2 | 11.57 |
| D | L | Asn92 | Pro153 | 1.02 | 4.04 | 5 | 23.2 |
| D | L | Asp50 | Tyr154 | -1.11 | 3.84 | 12 | 22.08 |
| D | H | Val101 | Tyr154 | -0.37 | 4.1 | 6 | 21.93 |
| D | H | Asp102 | Tyr154 | 1 | 3.98 | 11 | 18.53 |
| D | H | Tyr33 | Arg48 | -0.26 | 3.86 | 4 | 19.34 |
| D | H | Trp47 | Arg48 | -0.17 | 3.98 | 1 | 6.28 |
| D | H | Ile50 | Arg48 | -0.45 | 3.95 | 4 | 16.24 |
| DH | H | Ser59 | Arg48 | -0.95 | 3.93 | 5 | 21.48 |
| D | H | Tyr33 | Asn49 | 0.21 | 4.11 | 11 | 9.8 |
| D | H | Ile50 | Asn49 | -0.46 | 4.26 | 3 | 6.76 |
| D | L | Phe91 | Asn49 | -0.43 | 4.04 | 4 | 11.07 |
| D | L | Phe95 | Asn49 | -0.6 | 4 | 6 | 13.54 |
| DH | H | Tyr33 | Ser50 | -1.76 | 3.75 | 11 | 18.51 |
| DH | H | Asn31 | Tyr51 | -0.72 | 4.01 | 5 | 11.3 |
| D | H | His32 | Tyr51 | -0.22 | 4.12 | 6 | 6.11 |
| D | H | Tyr33 | Tyr51 | 0.44 | 4.01 | 17 | 20.11 |
| DH | H | Asp99 | Tyr51 | -1.91 | 3.8 | 12 | 17.81 |
| DA | H | Val101 | Tyr51 | -0.84 | 4.17 | 14 | 38.24 |
| D | H | Asn31 | Gln54 | 0.14 | 4.35 | 2 | 7.88 |
| D | H | Asn31 | His56 | 0.07 | 4.43 | 1 | 5.83 |
| DH | H | Asn31 | Asp62 | -2.72 | 3.79 | 3 | 18.27 |
| D | H | Asn31 | Gly63 | -0.04 | 4.08 | 5 | 15.47 |
| D | H | Thr30 | Pro65 | -0.51 | 3.87 | 4 | 9.73 |
| D | H | Asn31 | Pro65 | -0.09 | 3.96 | 6 | 8.27 |
| D | H | His32 | Pro65 | 0.26 | 4.29 | 2 | 1.88 |
| D | H | Tyr33 | Pro65 | 0.31 | 4.19 | 11 | 15.76 |
| DH | H | Asn52 | Pro65 | -1.87 | 3.95 | 9 | 26.25 |
| D | H | Ile54 | Pro65 | -0.66 | 4.27 | 5 | 8.04 |
| D | H | Ile54 | His66 | -0.48 | 4.04 | 6 | 21.23 |
| D | H | Val101 | Leu138 | -0.94 | 3.85 | 8 | 23.59 |
| D | H | Val101 | Gly139 | -0.11 | 4.11 | 4 | 5.8 |
| D | H | Asp102 | Gly139 | -0.45 | 4.03 | 7 | 10.59 |
| D | L | Leu46 | Arg140 | -0.32 | 4.3 | 2 | 5.34 |
| D | H | Tyr49 | Arg140 | 0.61 | 4.1 | 21 | 27.29 |
| DIH | L | Glu55 | Arg140 | -11.85 | 3.54 | 6 | 21.48 |
| D | H | Ile100 | Arg140 | -0.85 | 3.9 | 9 | 33.99 |
| D | L | Tyr49 | Ala141 | 0.85 | 4.09 | 5 | 9.53 |
| D | H | Ser31 | Tyr154 | -0.15 | 3.74 | 2 | 3.82 |
| D | H | Ala32 | Tyr154 | -0.25 | 4.1 | 8 | 13.34 |
| 布羅索尤單抗 | 互補位胺基酸殘基 | 與FGF23之相互作用的類型 |
| 輕鏈可變區 | I29 | 空腔 |
| 輕鏈可變區 | S30 | 直接 |
| 輕鏈可變區 | S31 | 直接 |
| 輕鏈可變區 | A32 | 直接 |
| 輕鏈可變區 | V34 | 間接 |
| 輕鏈可變區 | D50 | 直接 |
| 輕鏈可變區 | A51 | 直接 |
| 輕鏈可變區 | S52 | 直接 |
| 輕鏈可變區 | S53 | 直接 |
| 輕鏈可變區 | F91 | 直接 |
| 輕鏈可變區 | N92 | 直接 |
| 輕鏈可變區 | D93 | 間接 |
| 輕鏈可變區 | Y94 | 直接 |
| 重鏈可變區 | T30 | 間接 |
| 重鏈可變區 | N31 | 直接 |
| 重鏈可變區 | N52 | 直接 |
| 重鏈可變區 | I54 | 直接 |
| 重鏈可變區 | S59 | 直接 |
| 重鏈可變區 | I100 | 直接 |
| 重鏈可變區 | V101 | 直接 |
| 重鏈可變區 | A103 | 直接 |
自表11及表12可知，發現在FGF23與布羅索尤單抗之間相互作用之胺基酸殘基屬於藉由HDX-MS(上文實例2)鑑別之受保護區域1殘基及受保護區域3殘基，由此驗證此等區域為FGF23-布羅索尤單抗相互作用之重要媒介。然而，未發現受保護區域2內之殘基參與該相互作用。關於互補位殘基，布羅索尤單抗重鏈內之介接殘基與描述重鏈互補位區域1及區域2之HDX-MS資料重疊，但未觀察到來自重鏈互補位區域3之相互作用殘基(參見上文實例3)。類似地，布羅索尤單抗輕鏈內之介接殘基與描述輕鏈互補位區域1及區域2之HDX-MS資料重疊，但未觀察到來自輕鏈互補位區域3之相互作用殘基(參見上文實例3)。
基於晶體結構，得出以下結論：實例2之HDX-MS資料正確地鑑別出結合布羅索尤單抗之FGF23分子的受保護區域；然而，晶體結構披露，受保護區域2不與布羅索尤單抗相互作用。而是，FGF23之此區域可能因結合布羅索尤單抗後FGF23結構之構形變化而受到保護(亦即，自保護)。因此，偏向於HDX-MS資料的電腦模擬對接操作(實例4)導致選擇的分子位姿不反映結晶學所闡明之實際結構。即便如此，實例4之分子對接研究仍產生在結構上與最終晶體結構非常相似之模型(資料未顯示)，但由於缺乏受保護區域2殘基之參與，最初未考慮該等模型。
晶體結構披露了參與布羅索尤單抗-FGF23相互作用之互補電荷及疏水性補丁。圖8顯示FGF23：Fab複合物之飄帶模型(左圖)及表面模型(右圖)，其中示出FGF23及布羅索尤單抗結合界面的旋轉視圖且詳細標繪疊加棍模型的胺基酸位置(最右圖)。帶正電荷之表面以藍色顯示，負電荷以紅色顯示，不帶電荷之表面以白色顯示。觀察到FGF23之帶正電荷區域(R143及R140)接觸布羅索尤單抗的帶負電荷之互補殘基，且觀察到布羅索尤單抗表面上之疏水性補丁接觸FGF23的不帶電荷之互補疏水性殘基(L138、Y51及H66)(參見圖8插圖，詳細描述結合界面)。
具體而言，在布羅索尤單抗與FGF23之間鑑別出某些氫鍵結殘基，該等殘基可作為靶標以改良抗體結合親和力。圖9顯示FGF23表面模型界面，其中布羅索尤單抗以飄帶及棍模型顯示。在所描繪的表面模型中，帶正電荷之表面以藍色顯示，負電荷以紅色顯示，不帶電荷之表面以白色顯示。圖A顯示FGF23：Fab複合物，其中FGF23部分旋轉90度以展示結合界面，其中顯示與FGF23接觸之所有布羅索尤單抗殘基。圖B顯示FGF23之表面模型(上圖)，其中布羅索尤單抗氫鍵結殘基位置以棍模型顯示(疊加及下圖)。圖C及圖D分別顯示在FGF23：布羅索尤單抗界面處之離子相互作用及芳族堆疊相互作用的近視圖。在圖B中，若干選定的布羅索尤單抗殘基被標記(黑色箭頭)為氫鍵相互作用位點，其可作為跨與FGF23之界面進行合理設計的靶標。圖C集中在布羅索尤單抗天冬胺酸及麩胺酸鹽殘基接觸FGF23之精胺酸殘基(R143及R140)之顯著離子相互作用。圖D集中在FGF23殘基Y51處與布羅索尤單抗纈胺酸及酪胺酸殘基相互作用之π-堆疊相互作用。
總之，HDX-MS(實例2及實例3)、電腦模擬建模(實例4)及結晶學資料(本實例7)之組合使得能夠生成FGF23：布羅索尤單抗複合物之高度準確且強預測性模型。全部三條證據係可靠地鑑別能經變化以改變布羅索尤單抗之親和力的布羅索尤單抗殘基所必需的。總之，此等發現闡明了可能與人類FGF23介接之布羅索尤單抗殘基(參見表12)，其可用作胺基酸變化(缺失、添加、取代)之候選殘基，以合理設計對FGF23具有改良之親和力之布羅索尤單抗變異體。
實例 8. 基於晶體結構進行的布羅索尤單抗之預測性突變誘發
基於上文在實例7中所描述之晶體結構及界面接觸殘基開發布羅索尤單抗之可變重鏈及可變輕鏈之候選胺基酸變化清單。使用基於分子力學之工具產生單個(1X)及雙重(2X)胺基酸變化且使其最佳化，該等胺基酸變化集中在接觸抗原之19個殘基位置及距抗原殘基一半遠(亦即，約6-8埃之第2殼層距離)處之10個殘基位置。簡言之，利用精修至3 Å解析度的與人類FGF23複合之抗體的晶體結構作為產生起始坐標之基礎，對該等起始坐標執行分子力學計算。評估結構之完整性，用相應殘基填充空位且對末端加帽。使所得結構經歷在MOE 2022.02(CCG)中所實施之質子化(pH 7)及能量最小化，且在電腦模擬突變誘發之前檢查結構幾何。
分析抗體-FGF23界面且基於抗體與抗原殘基之間的距離考慮相關接觸。選擇抗體上之殘基位置且分選成三組：緊密接觸(3~4 Å)、第二殼層接觸(高達4.5 Å)及空腔/VdW相互作用。
採用三種方法來改良親和力。第一種，設計直接相互作用發生變化之變異體。第二種，設計影響已建立之直接相互作用的間接變異體。第三種，設計將填充現有空腔的變異體。重點放在氫鍵結相互作用位點上，該等位點可藉由變化界面布羅索尤單抗殘基以將離子相互作用或疏水性堆積位點引入芳族π-π相互作用中進行修飾，從而增加親和力。舉例而言，與FGF23 Arg143形成氫鍵相互作用之布羅索尤單抗輕鏈VL殘基S52可用帶負電荷殘基(D、E)、大氫鍵殘基(Q、T)或堆疊殘基(F、Y)置換，由此可增強結合/堆積相互作用。類似地，與FGF23 Tyr51堆疊之重鏈殘基Val101可用更大的殘基(F、I、L、Y)或具有氫鍵結特性的殘基(T)置換。考慮但未直接用於選擇之其他特性為：每個殘基之相互作用數(連接性)、相互作用之Δ(SASA)及ΔG。圖10及圖11分別繪示布羅索尤單抗輕鏈及重鏈之相關界面位置，以及每一殘基與相鄰殘基相互作用之細節。
最初藉由利用各突變進行1X突變篩選，隨後進行旋轉異構最佳化及周圍環境之精修(4.5Å)來掃描各靶標位置。基於能量及結構特性對所得到的420種變異體之集合進行排序，且將最高命中(top hit)(亦即，ΔΔG ＜0及dSASA ＜0)組合成2X及3X變異體以供進一步篩選及排序。基於各解析之結構分析生成含96種變異體(1X及2X)之最終候選清單，且將該清單用作建立第二個擴增突變體清單之基礎，以進一步探索感興趣界面周圍之結構空間。
使用預測性突變誘發進行之初始1X掃描產生165種經工程改造之FGF23結合抗體設計，該等設計各自相對於布羅索尤單抗之輕鏈可變區(SEQ ID NO：4)或布羅索尤單抗之重鏈可變區(SEQ ID NO：3)包含單個胺基酸變化。根據d親和力(ΔΔG(kcal/mol))；d穩定性(ΔΔS(kcal/ mol))小於3.0 kcal/mol；及dSASA(溶劑可及表面積之差異)作為引入突變後埋入表面之獲得或損失之指標，來評價及篩選所有突變型變異體。ΔΔG係用於預測單點突變(亦即，1個胺基酸變化)將如何影響蛋白質穩定性之度量。其係當存在點突變時折疊狀態與未折疊狀態之間的能量變化以及ΔG折疊之變化的量度。此度量用作點突變在蛋白質穩定性方面是否有利之預測因子。值越負，蛋白質越穩定。ΔΔG值＞ 0.5表明突變將不穩定；值0.5 ＞ ΔΔG ＞ -0.5表明應將變化視為中性或接近中性的；及ΔΔG ＜ -0.5：表明突變將產生更穩定之蛋白質。另一方面，ΔΔS係振動熵差之量度。正值指示可撓性增加，而負值指示剛性較高之蛋白質。其用於預測變化給定胺基酸將如何改變蛋白質之熵。亦計算水可及表面積(「VdW SA」)。表13提供布羅索尤單抗輕鏈位置之全1X掃描預測性突變誘發結果的彙總，且表14提供布羅索尤單抗重鏈位置之全1X掃描預測性突變誘發結果之彙總。
表13. 布羅索尤單抗VL 1X預測性突變誘發結果
表14. 布羅索尤單抗VH 1X預測性突變誘發結果
| VL AA 變化(相對於SEQ ID NO：4) | ΔΔG(kcal/mol) | ΔΔS(kcal/mol) | VdW SA(Å 2) |
| A25L | 0.04 | 0.76 | 21.9 |
| A25V | -0.04 | -0.26 | 13.3 |
| I29F | 1.061050981 | 1.632365369 | -28.147844 |
| I29L | -0.0728879 | 1.31929151 | -46.247868 |
| I29V | 0.267352586 | 1.703597137 | -16.464167 |
| S30D | -3.6718843 | 0.83782641 | -22.677042 |
| S30E | -2.1534008 | 0.50762112 | -29.107056 |
| S30F | -6.4906206 | -0.0122742 | -48.530941 |
| S30I | 2.286957776 | 0.549990944 | 22.1998 |
| S30L | -2.0238975 | 0.40896165 | -44.38591 |
| S30Q | -5.4928488 | 0.42036524 | -28.00009 |
| S30T | 0.648508526 | 0.928468736 | 21.659073 |
| S30V | -0.093856649 | 0.305082747 | 20.52256 |
| S30Y | -5.1055876 | 0.32176219 | -49.158344 |
| S31D | 3.56996088 | 0.63202685 | -26.274542 |
| S31E | 1.94516954 | 0.28280798 | -36.922615 |
| S31F | -2.5842167 | -0.7461013 | -54.371635 |
| S31I | 1.78221214 | -0.612691345 | 10.200069 |
| S31L | -0.155463589 | -0.263952687 | 11.979135 |
| S31Q | -1.7550465 | 0.55191751 | -18.653433 |
| S31T | -1.062041542 | 0.082099018 | 1.1834005 |
| S31V | 1.667246701 | -0.014243701 | 0.004099946 |
| S31Y | -2.7935664 | -0.467704 | -62.977528 |
| A32F | -1.09483682 | -0.359228605 | -21.611805 |
| A32I | 0.770987725 | -0.23905564 | -11.13908 |
| A32L | -1.67783134 | -0.656360123 | -9.6421356 |
| A32T | 0.502542557 | 0.410571808 | 0.085010208 |
| A32V | 1.83750345 | 0.406704427 | -0.54136229 |
| A32Y | -1.232772705 | -0.190198481 | -15.123551 |
| V34F | 1.39938938 | 2.11635117 | 2.813026 |
| V34I | -0.0978386 | 0.83360469 | -0.5620861 |
| V34L | -0.169944874 | 0.771558986 | -0.26748687 |
| V34Y | 0.483978126 | 2.777714634 | 8.7362003 |
| D50E | -0.39974246 | 0.935434385 | 20.788279 |
| D50F | 0.247562478 | 0.341023073 | 18.485962 |
| D50I | 2.422160839 | 0.06896623 | 8.5886898 |
| D50L | 4.759496344 | 0.345141119 | 47.131916 |
| D50Q | -3.307256369 | 0.471066083 | 0.15281084 |
| D50R | 5.222100064 | -0.239035501 | -20.571472 |
| D50S | -1.345785356 | 1.05077198 | 29.196266 |
| D50T | -2.802816003 | 0.633723865 | 34.229179 |
| D50V | -1.24099163 | 0.574804443 | 22.772923 |
| A51F | -0.032679132 | 1.824740267 | -3.2918215 |
| A51I | -0.341956382 | 0.844136509 | 1.9812078 |
| A51L | -0.435326019 | 0.219154085 | 0.025151623 |
| A51S | 0.590189424 | 1.108058478 | -5.2083364 |
| A51T | 0.541854453 | 0.65930264 | -4.8948936 |
| A51V | -0.874069958 | 0.174575554 | 1.8586986 |
| S52D | -0.4703946 | 1.30649565 | 9.6926641 |
| S52E | -0.3021981 | 1.31177809 | 11.95747 |
| S52F | -2.875389 | -0.3494975 | -10.131303 |
| S52Q | -0.143493129 | 0.884475034 | 25.364239 |
| S52T | 0.128606217 | 0.530664437 | 1.207417 |
| S52Y | -3.133793831 | -0.150231438 | 57.616718 |
| S53D | -4.9779845 | 0.37701257 | 12.876547 |
| S53E | -1.5124636 | 0.85673251 | 12.985263 |
| S53F | -4.4610498 | 0.13567548 | -2.0610542 |
| S53I | -2.613199991 | -1.08626583 | 0.62171143 |
| S53L | -1.16483418 | -0.242817586 | 24.409243 |
| S53Q | -2.034307873 | 0.57250637 | 34.919781 |
| S53R | -0.9929227 | 0.2709468 | -4.0244999 |
| S53T | -0.237225711 | 0.282621034 | 3.6471076 |
| S53V | -2.33446696 | -0.812313395 | -3.5696123 |
| S53Y | -5.0495748 | -0.0684582 | -6.7887955 |
| Q90F | -2.1 | -0.03 | -9.8 |
| Q90Y | -2.47 | -0.07 | -13.3 |
| F91K | -2.02 | 1.46 | -1.37 |
| F91R | -2.5 | 0.69 | -3.24 |
| F91Y | 0.073 | 1.13 | -1.4 |
| N92D | -1.1543339 | 0.85687799 | 6.6619544 |
| N92E | 0.655305 | 0.92451717 | -17.099483 |
| N92F | 0.14072043 | -0.2581115 | -6.1453514 |
| N92Q | 0.846794726 | 0.397366739 | 2.1917546 |
| N92S | 2.78115842 | 0.88155805 | -3.7792108 |
| N92T | 4.790090325 | 0.834014183 | -28.341656 |
| N92Y | -0.4386895 | -0.121354 | 4.7035565 |
| D93E | -0.17027592 | 0.595523751 | 3.0977747 |
| D93F | 2.31451482 | -0.969308461 | -36.287567 |
| D93Q | -0.92803509 | 0.676351664 | 4.1740527 |
| D93R | 1.31 | 0.24 | 9.98 |
| D93S | 1.675917835 | 0.389550331 | -27.250326 |
| D93T | 3.624540183 | -0.031258601 | 0.62384415 |
| D93Y | 0.167244776 | -0.72587811 | -0.26277241 |
| Y94D | 1.87364442 | 1.00868027 | -18.932884 |
| Y94E | 2.30058187 | 1.24293306 | -38.1619 |
| Y94F | 0.26675234 | 0.54350757 | -12.910084 |
| Y94Q | 2.060892689 | 0.66556261 | -48.488823 |
| Y94S | 2.79793208 | 1.1990931 | -19.928265 |
| Y94T | 2.088321013 | 0.91544587 | -44.222107 |
| VH AA 變化(相對於SEQ ID NO：3) | ΔΔG(kcal/mol) | ΔΔS(kcal/mol) | VdW SA(Å 2) |
| T30E | 0.684137201 | 1.075241818 | 18.717197 |
| T30F | 0.18770538 | 0.83180798 | 15.709345 |
| T30Q | 0.329924618 | 0.977560421 | 18.959789 |
| T30S | 0.4350999 | 1.028327716 | -1.8230846 |
| T30Y | 0.181118285 | 0.677831651 | 55.050991 |
| N31D | 2.965937522 | 0.843428248 | 8.5089788 |
| N31E | 3.141789251 | 0.790633166 | 4.7221541 |
| N31F | 1.505071443 | 0.156433609 | -19.040478 |
| N31Q | -0.658144392 | 0.474920713 | -5.7396598 |
| N31R | -0.505348545 | -0.091904039 | -18.215101 |
| N31Y | -1.320720057 | 0.171386205 | 76.718956 |
| H32E | 0.531400637 | 1.365501752 | -37.351734 |
| H32F | -0.01862203 | -0.408667274 | -31.556114 |
| H32Q | -1.634162952 | 0.91749504 | -27.375647 |
| H32S | 0.200916565 | 1.429533882 | 14.526258 |
| H32T | 0.082050769 | 0.718451694 | -35.913139 |
| I50D | -3.728931574 | 3.567036759 | 19.925985 |
| I50E | -2.785319845 | 2.79166681 | -0.059334006 |
| I50F | -7.869489552 | 0.861678876 | -11.075091 |
| I50S | -3.535387748 | 3.347888483 | 19.529911 |
| I50T | -0.360198315 | 1.515972972 | 9.489028 |
| I50Y | -2.70969497 | 1.614834522 | -11.143722 |
| N52E | 0.51388448 | 0.79113671 | 38.100883 |
| N52F | 5.20131785 | 0.51759159 | -9.5689497 |
| N52Q | 1.635186438 | 0.928549811 | 19.386501 |
| N52Y | 4.89901696 | 0.84897734 | -7.5632229 |
| I54E | 4.723370263 | 2.798599057 | -13.66046 |
| I54F | 0.925662374 | 1.594214175 | 46.908218 |
| I54L | 2.609985936 | 1.638635049 | 6.9898171 |
| I54Q | 2.457363728 | 2.490175263 | 18.760778 |
| I54S | 2.674823664 | 2.12181984 | -26.007236 |
| I54T | 3.80950452 | 2.246885328 | -4.9698415 |
| I54V | 2.939266531 | 1.455407636 | -6.6988673 |
| I54Y | 0.214285677 | 1.82058734 | 41.796417 |
| S55E | 0.420372588 | 0.92585963 | 29.211838 |
| S55F | -1.053741554 | 0.889186473 | 90.757767 |
| S55Q | -2.385053801 | 0.153300959 | 42.401405 |
| S55T | -0.458709886 | 0.334143886 | 18.080853 |
| S55Y | -0.395620536 | 0.712916488 | 95.909492 |
| S59D | 0.86873275 | 0.93661783 | 11.031759 |
| S59E | 1.42930367 | 0.99314984 | -0.1969754 |
| S59F | -2.4419416 | -0.214348 | -3.5550513 |
| S59I | -3.9262363 | 0.07231091 | 3.0604253 |
| S59L | -5.0521902 | -0.0593502 | 11.594638 |
| S59Q | -4.7749639 | 0.34293134 | -18.870623 |
| S59T | -4.596499 | 0.41333773 | 6.0870099 |
| S59V | -4.7103284 | 0.03496928 | 4.5306883 |
| S59Y | -1.6484989 | 0.52900749 | 47.218006 |
| D99E | -0.232029036 | 0.837742101 | -10.336287 |
| D99Q | -0.515419631 | 1.354701357 | -4.7501192 |
| D99Y | 2.55 | -0.07 | -3.24 |
| I100D | 3.863436116 | 3.059680528 | 14.038824 |
| I100E | 1.24916155 | 3.7849893 | -6.1821141 |
| I100F | 1.413449602 | 1.211012567 | -3.7273011 |
| I100L | 3.025129226 | 1.291439304 | 11.713667 |
| I100Q | 1.457092754 | 2.276656577 | 30.016344 |
| I100V | 4.501027071 | 1.853071862 | 37.992546 |
| I100Y | 1.196847279 | 1.623909144 | 50.271866 |
| V101F | 2.3716018 | 0.65795356 | -68.693504 |
| V101I | -1.9797864 | 0.2883803 | -12.589581 |
| V101L | -0.6986304 | 0.70348261 | -6.3387203 |
| V101T | 0.332725095 | 1.418010059 | -3.6793778 |
| V101Y | 0.70072691 | 0.683377056 | -19.356924 |
| D102E | 7.977327323 | 0.609388647 | -7.7275596 |
| D102F | 5.034696184 | -0.615590492 | -32.069496 |
| D102I | 3.502175813 | -0.214283484 | -16.338041 |
| D102L | 0.032551406 | -0.396340168 | -19.263794 |
| D102Q | 9.600856797 | 1.604072636 | -6.4905972 |
| D102Y | 8.24642893 | -0.280662341 | -24.580505 |
| A103D | -2.96021076 | 2.462046405 | -5.0743966 |
| A103E | -3.769332308 | 2.929902207 | 13.589715 |
| A103F | -2.123937787 | 0.593947072 | -36.6259 |
| A103Q | -7.284866478 | 1.054712643 | 16.935923 |
| A103S | -3.532337047 | 0.779836492 | -1.1532063 |
| A103T | 0.030754857 | 0.821138114 | 2.9620366 |
| A103Y | -3.31726254 | 0.09784497 | -5.0800767 |
使用預測性突變誘發針對相對於布羅索尤單抗重鏈及輕鏈可變區之雙重胺基酸變化進行2X掃描，又產生20種經工程改造之FGF23結合抗體設計，該等設計各自相對於布羅索尤單抗之輕鏈可變區(SEQ ID NO：4)及/或布羅索尤單抗之重鏈可變區(SEQ ID NO：3)包含兩個胺基酸變化。表15提供2X掃描預測性突變誘發結果之彙總。
表15. 布羅索尤單抗2X掃描預測性突變誘發結果
實例 9. 基於晶體結構的經工程改造之 FGF23 結合抗體設計組 2
| AA 變化1 | AA 變化2 | ΔΔG(kcal/mol) | ΔΔS(kcal/mol) | VdW SA(Å 2) |
| VL：S31E | VL：D50F | -4.9818861 | -0.1303292 | 5.2358189 |
| VH：N31F | VH：S59F | -4.1762399 | -1.080179 | -17.86721 |
| VL：D50F | VL：S53E | -3.5323026 | 0.23339506 | 21.309801 |
| VL：S31F | VL：S52E | -3.3569123 | -0.3131565 | -29.340513 |
| VL：D50F | VH：V101I | -2.6177099 | 0.20896309 | -0.251417 |
| VH：S59D | VH：V101I | -2.3354685 | 0.43520707 | -18.403811 |
| VL：S31F | VL：S53E | -2.2152397 | -0.0631116 | -26.779749 |
| VL：N92E | VL：D93F | -1.372372 | -0.2463043 | -26.993782 |
| VL：S31E | VL：S53E | -0.366416 | 0.61385435 | -2.1146641 |
| VL：S31F | VL：D50F | -0.3102773 | -1.383143 | -38.363171 |
| VH：N31E | VH：S59E | 0.46434414 | 1.54769119 | 11.696677 |
| VH：S57E | VH：S59D | 0.95383059 | 1.34642839 | 33.086407 |
| VH：N31E | VH：I54F | 1.17787603 | 1.53083549 | 23.253418 |
| VH：S59T | VH：V101L | 1.93695757 | 0.72477322 | -18.162439 |
| VH：I54Y | VH：V101F | 2.69242757 | 1.60681199 | -29.235994 |
| VH：N52F | VH：V101I | 2.94986019 | 0.00652214 | -24.637529 |
| VL：N92D | VL：D93F | 2.9614789 | -0.573638 | -43.874622 |
| VH：N52F | VH：V101L | 3.54531105 | 0.55270088 | -54.158905 |
| VL：S31F | VL：D50E | - | - | - |
| VL：Y94D | VH：S59D | - | - | - |
表16顯示根據實例7及8之1X掃描得到的76種經工程改造之FGF23結合抗體設計。每一變異體依序用編號自101至176的經工程改造之FGF23結合抗體結構ID標記且相對於親本布羅索尤單抗重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：3)或親本布羅索尤單抗輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：4)具有一個胺基酸變化。為清楚起見，由抗體結構ID編號UGX101至UGX176表示之各抗體除所指示的相對於親本布羅索尤單抗重鏈序列(SEQ ID NO：1)及輕鏈序列(SEQ ID NO：2)的胺基酸變化外，具有該親本布羅索尤單抗重鏈序列及輕鏈序列。
表17顯示根據實例7及8併入兩個胺基酸變化(2X掃描)的20種經工程改造之FGF23結合抗體設計。每一變異體依序用編號自177至196的經工程改造之FGF23結合抗體結構ID標記且相對於親本布羅索尤單抗重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：3)及/或親本布羅索尤單抗輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：4)具有兩個胺基酸變化。為清楚起見，由抗體結構ID編號UGX177至UGX196表示之各抗體除所指示的相對於親本布羅索尤單抗重鏈序列(SEQ ID NO：1)及輕鏈序列(SEQ ID NO：2)的胺基酸變化外，具有該親本布羅索尤單抗重鏈序列及輕鏈序列。
表16. 經工程改造之FGF23結合抗體之1X設計組2
表17. 經工程改造之FGF23結合抗體之2X設計組2
實例 10. 有關對 FGF23 之親和力增加的所選變異體之活體外測試
| 經工程改造之FGF23結合抗體結構ID | VL AA 變化(相對於SEQ ID NO：4) | 經工程改造之FGF23結合抗體結構ID | VH AA 變化(相對於SEQ ID NO：3) |
| UGX101 | I29F | UGX148 | T30F |
| UGX102 | I29L | UGX149 | N31D |
| UGX103 | S30D | UGX150 | N31E |
| UGX104 | S30E | UGX151 | N31F |
| UGX105 | S30F | UGX152 | N31Q |
| UGX106 | S30L | UGX153 | N31R |
| UGX107 | S30Q | UGX154 | N52F |
| UGX108 | S30Y | UGX155 | N52Y |
| UGX109 | S31D | UGX156 | I54F |
| UGX110 | S31E | UGX157 | I54Y |
| UGX111 | S31F | UGX158 | S59D |
| UGX112 | S31Q | UGX159 | S59E |
| UGX113 | S31Y | UGX160 | S59F |
| UGX114 | A32F | UGX161 | S59I |
| UGX115 | A32V | UGX162 | S59L |
| UGX116 | V34F | UGX163 | S59Q |
| UGX117 | V34I | UGX164 | S59T |
| UGX118 | D50F | UGX165 | S59V |
| UGX119 | D50L | UGX166 | S59Y |
| UGX120 | D50Q | UGX167 | I100D |
| UGX121 | D50R | UGX168 | I100E |
| UGX122 | D50S | UGX169 | I100F |
| UGX123 | D50T | UGX170 | V101F |
| UGX124 | D50V | UGX171 | V101I |
| UGX125 | A51V | UGX172 | V101L |
| UGX126 | S52D | UGX173 | A103D |
| UGX127 | S52E | UGX174 | A103F |
| UGX128 | S52F | UGX175 | A103S |
| UGX129 | S53D | UGX176 | A103T |
| UGX130 | S53E | ||
| UGX131 | S53F | ||
| UGX132 | S53R | ||
| UGX133 | S53Y | ||
| UGX134 | F91Y | ||
| UGX135 | N92D | ||
| UGX136 | N92E | ||
| UGX137 | N92F | ||
| UGX138 | N92S | ||
| UGX139 | N92Y | ||
| UGX140 | D93F | ||
| UGX141 | D93Q | ||
| UGX142 | D93S | ||
| UGX143 | D93T | ||
| UGX144 | Y94D | ||
| UGX145 | Y94E | ||
| UGX146 | Y94F | ||
| UGX147 | Y94S |
| 經工程改造之FGF23結合抗體結構ID | VL AA 變化(相對於SEQ ID NO：4) | VH AA 變化(相對於SEQ ID NO：3) |
| UGX177 | S31E、D50F | |
| UGX178 | N31F、S59F | |
| UGX179 | D50F、S53E | |
| UGX180 | S31F、S52E | |
| UGX181 | D50F | V101I |
| UGX182 | S59D、V101I | |
| UGX183 | S31F、S53E | |
| UGX184 | N92E、D93F | |
| UGX185 | S31E、S53E | |
| UGX186 | S31F、D50F | |
| UGX187 | N31E、S59E | |
| UGX188 | S57E、S59D | |
| UGX189 | N31E、I54F | |
| UGX190 | S59T、V101L | |
| UGX191 | I54Y、V101F | |
| UGX192 | N52F、V101I | |
| UGX193 | N92D、D93F | |
| UGX194 | N52F、V101L | |
| UGX195 | S31F、D50E | |
| UGX196 | Y94D | S59D |
藉由表面電漿子共振(SPR)評價分別來自表16及表17中所示1X及2X抗體設計組之FGF23結合抗體設計以及相對於布羅索尤單抗具有1個或2個胺基酸變化之額外抗體變異體的親和力。
以小規模(3 ml)表現96種抗體變異體且藉由SPR分析在單一濃度(100 nM)下針對人類FGF23(R179Q)對其進行篩選。SPR分析之實驗設置：SPR裝置-8K+；晶片準備- CM5 hIgG晶片；通道-1-8；固定濃度-1.5 ug/ml；固定方法-捕獲；流動速率-5 µl/min；接觸時間-60秒；操作緩衝液-1x HBS-EP+ pH 7.4；溫度- 20℃；流動速率-50 µl/min；締合時間-270秒；解離時間-600秒；抗原- rhFGF23(R179Q)；最高濃度-0.1 µM。
根據解離速率k
d或平衡解離常數K
D對所有抗體變異體進行排序。用濃度反應曲線(CRC)確認相對於未經修飾之布羅索尤單抗具有最佳親和力改良之最高命中。針對CRC之SPR分析的實驗設置：SPR裝置-8K+；晶片準備-CM5 hIgG晶片；通道-1-8；固定濃度-1.5 ug/ml；固定方法-捕獲；流動速率-5 µl/min；接觸時間-60秒；操作緩衝液-1x HBS-EP+ pH 7.4；溫度- 20℃；流動速率-50 µl/min；締合時間–120秒；解離時間–1800秒；抗原- rhFGF23(R179Q)；最高濃度-0.1 µM，9點3倍單循環動力學。
SPR篩選及CRC評價之結果提供於表18中，該表顯示所選經工程改造之抗體變異體的K
D及最終動力學參數k
a及k
d之測定以及表面活性。在表18中，欄標題縮寫如下：「AS ID」係指「抗體結構ID」，其為本文所定義之各抗體之唯一標識符；「AA變化」係指相對於親本布羅索尤單抗重鏈(「HC」)可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：3)或親本布羅索尤單抗輕鏈(「LC」)可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：4)或兩者的胺基酸殘基變化；「CL」係指捕獲水準(RU)；「K
D」係指平衡解離常數(M)；「k
a」係指締合速率或常數(1/Ms)；「k
d」係指解離速率或常數(1/s)；「R
max」係指理論R
max或經計算之最大可觀測信號(相對單位)；「SA」係指表面活性(%)；且「比率」係指計算的變異型抗體K
D/布羅索尤單抗K
D之比率。
表18. 藉由SPR對所選抗體變異體進行之活體外測試
| AS ID | AA 變化 | CL | K D | K a | k d | RU | SA | 比率 |
| UGX205 | HC：S59E、LC：Y94D | 152.7 | 4.07E-12 | 1.53E+07 | 6.25E-05 | 59.2 | 93.9 | 5 |
| UGX201 | HC：S59E、LC：N92F | 79.6 | 5.17E-12 | 1.12E+07 | 5.81E-05 | 30.9 | 83.4 | 4 |
| UGX144 | LC：Y94D | 168.5 | 5.77E-12 | 1.09E+07 | 6.31E-05 | 65.4 | 89.5 | 4 |
| UGX157 | HC：I54Y | 184.1 | 7.58E-12 | 1.49E+07 | 1.13E-04 | 71.4 | 89.1 | 3 |
| UGX202 | HC：S59E、LC：N92Y | 146.3 | 7.59E-12 | 1.29E+07 | 9.80E-05 | 56.7 | 91.6 | 3 |
| UGX175 | HC：A103S | 188.5 | 7.72E-12 | 1.24E+07 | 9.61E-05 | 73.1 | 86.8 | 3 |
| UGX206 | HC：S59E、LC：Y94E | 51.8 | 7.87E-12 | 6.25E+06 | 4.92E-05 | 20.1 | 107.6 | 3 |
| UGX202 | HC：S59E、LC：N92Y | 131.9 | 8.07E-12 | 1.17E+07 | 9.45E-05 | 51.1 | 91.5 | 3 |
| UGX182 | HC：S59D、HC：V101I | 94.2 | 9.47E-12 | 1.49E+07 | 1.41E-04 | 36.5 | 100.5 | 2 |
| UGX156 | HC：I54F | 111.5 | 1.05E-11 | 5.94E+06 | 6.25E-05 | 43.2 | 105.9 | 2 |
| UGX206 | HC：S59E、LC：Y94E | 55.9 | 1.09E-11 | 7.69E+06 | 8.37E-05 | 21.7 | 85.9 | 2 |
| UGX203 | HC：S59E、LC：S52D | 118.5 | 1.15E-11 | 1.26E+07 | 1.45E-04 | 45.9 | 81.4 | 2 |
| UGX126 | LC：S52D | 145.0 | 1.24E-11 | 1.05E+07 | 1.30E-04 | 56.2 | 86.5 | 2 |
| UGX145 | LC：Y94E | 120.6 | 1.33E-11 | 6.42E+06 | 8.52E-05 | 46.8 | 87.4 | 2 |
| UGX204 | HC：S59E、LC：S52E | 120.2 | 1.33E-11 | 1.40E+07 | 1.86E-04 | 46.6 | 90.4 | 2 |
| UGX160 | HC：S59F | 155.2 | 1.42E-11 | 6.15E+06 | 8.70E-05 | 60.2 | 94.5 | 1 |
| UGX160 | HC：S59F | 143.0 | 1.47E-11 | 6.53E+06 | 9.61E-05 | 55.4 | 92.6 | 1 |
| UGX139 | LC：N92Y | 137.0 | 1.64E-11 | 6.32E+06 | 1.04E-04 | 53.1 | 86.2 | 1 |
| UGX127 | LC：S52E | 90.0 | 1.76E-11 | 6.93E+06 | 1.22E-04 | 34.9 | 85.0 | 1 |
| UGX188 | HC：S57E、HC：S59D | 158.7 | 1.83E-11 | 1.39E+07 | 2.53E-04 | 61.5 | 95.8 | 1 |
| UGX178 | HC：N31F、HC：S59F | 159.4 | 2.12E-11 | 6.33E+06 | 1.34E-04 | 61.8 | 85.6 | 1 |
| UGX166 | HC：S59Y | 176.8 | 2.24E-11 | 8.77E+06 | 1.96E-04 | 68.5 | 93.1 | 1 |
| UGX159 | HC：S59E | 212.3 | 2.26E-11 | 9.91E+06 | 2.24E-04 | 82.3 | 93.0 | 1 |
| UGX135 | LC：N92D | 101.3 | 2.35E-11 | 7.71E+06 | 1.81E-04 | 39.3 | 100.4 | 1 |
| UGX140 | LC：D93F | 135.0 | 2.42E-11 | 2.63E+06 | 6.37E-05 | 52.3 | 103.1 | 1 |
| UGX159 | HC：S59E | 163.3 | 2.51E-11 | 8.83E+06 | 2.22E-04 | 63.4 | 97.9 | 1 |
| UGX151 | HC：N31F | 193.3 | 2.55E-11 | 8.32E+06 | 2.12E-04 | 74.9 | 90.3 | 1 |
| UGX148 | HC：T30F | 157.8 | 2.72E-11 | 6.65E+06 | 1.81E-04 | 61.1 | 91.2 | 1 |
| UGX137 | LC：N92F | 137.2 | 3.19E-11 | 5.04E+06 | 1.61E-04 | 53.2 | 86.5 | 1 |
| UGX146 | LC：Y94F | 91.1 | 3.32E-11 | 5.14E+06 | 1.70E-04 | 35.3 | 89.9 | 1 |
| UGX164 | HC：S59T | 201.0 | 3.36E-11 | 5.64E+06 | 1.90E-04 | 77.9 | 91.9 | 1 |
| UGX130 | LC：S53E | 169.1 | 3.48E-11 | 1.03E+07 | 3.58E-04 | 65.5 | 88.4 | 1 |
| UGX165 | HC：S59V | 159.4 | 3.63E-11 | 4.82E+06 | 1.75E-04 | 61.9 | 95.4 | 1 |
| UGX131 | LC：S53F | 82.5 | 3.93E-11 | 6.78E+06 | 2.66E-04 | 31.9 | 95.7 | 1 |
| UGX152 | HC：N31Q | 97.2 | 4.16E-11 | 6.29E+06 | 2.62E-04 | 37.7 | 91.2 | 0 |
| UGX165 | HC：S59V | 166.7 | 4.48E-11 | 4.92E+06 | 2.20E-04 | 64.6 | 90.9 | 0 |
| UGX117 | LC：V34I | 120.5 | 5.04E-11 | 3.35E+06 | 1.69E-04 | 46.7 | 86.9 | 0 |
| UGX161 | HC：S59I | 236.6 | 6.10E-11 | 4.38E+06 | 2.67E-04 | 91.7 | 84.2 | 0 |
| UGX117 | LC：V34I | 152.5 | 7.03E-11 | 2.90E+06 | 2.04E-04 | 59.1 | 94.6 | 0 |
| UGX162 | HC：S59L | 174.5 | 9.86E-11 | 4.79E+06 | 4.72E-04 | 67.6 | 88.4 | 0 |
| UGX153 | HC：N31R | 422.9 | 1.12E-10 | 2.87E+06 | 3.22E-04 | 164.0 | 83.7 | 0 |
| UGX133 | LC：S53Y | 21.2 | 2.02E-10 | 3.63E+06 | 7.33E-04 | 8.2 | 84.8 | 0 |
| UGX190 | HC：S59T、HC：V101L | 160.4 | 3.08E-09 | 3.35E+06 | 1.03E-02 | 62.2 | 92.7 | 0 |
| UGX192 | HC：N52F、HC：V101I | 166.4 | 2.06E-08 | 1.15E+06 | 2.36E-02 | 64.5 | 82.3 | 0 |
| UGX201 | HC：S59E、LC：N92F | 38.6 | 4.52E-12 | 8.08E+06 | 3.65E-05 | 14.9 | 99.0 | 5 |
| UGX201 | HC：S59E、LC：N92F | 76.7 | 6.32E-12 | 9.99E+06 | 6.31E-05 | 29.7 | 85.3 | 3 |
| UGX144 | LC：Y94D | 175.3 | 6.58E-12 | 1.07E+07 | 7.03E-05 | 68.0 | 89.8 | 3 |
| UGX206 | HC：S59E、LC：Y94E | 91.1 | 6.62E-12 | 8.64E+06 | 5.72E-05 | 35.3 | 84.0 | 3 |
| UGX202 | HC：S59E、LC：N92Y | 121.5 | 7.53E-12 | 1.18E+07 | 8.91E-05 | 47.1 | 91.7 | 3 |
| UGX156 | HC：I54F | 196.5 | 9.24E-12 | 1.06E+07 | 9.77E-05 | 76.2 | 90.8 | 2 |
| UGX203 | HC：S59E、LC：S52D | 102.3 | 1.13E-11 | 1.28E+07 | 1.45E-04 | 39.7 | 83.5 | 2 |
| UGX203 | HC：S59E、LC：S52D | 61.5 | 1.24E-11 | 1.08E+07 | 1.34E-04 | 23.8 | 85.3 | 2 |
| UGX145 | LC：Y94E | 129.2 | 1.38E-11 | 7.07E+06 | 9.74E-05 | 50.1 | 86.4 | 1 |
| UGX204 | HC：S59E、LC：S52E | 107.9 | 1.40E-11 | 8.64E+06 | 1.21E-04 | 41.8 | 94.6 | 1 |
| UGX160 | HC：S59F | 129.9 | 1.46E-11 | 6.16E+06 | 9.01E-05 | 50.4 | 93.2 | 1 |
| UGX204 | HC：S59E、LC：S52E | 105.0 | 1.83E-11 | 7.57E+06 | 1.38E-04 | 40.7 | 95.3 | 1 |
| UGX140 | LC：D93F | 135.8 | 1.06E-10 | 2.27E+06 | 2.42E-04 | 52.6 | 74.0 | 0 |
此等資料顯示，經工程改造之布羅索尤單抗變異體之親和力改良最有可能歸因於解離速率(dissociation rate/off-rate或k
d)之改良，而締合速率(association rate/on-rate或k
a)在所有變異體中保持非常相似。此等資料亦展示至少13種不同的經工程改造之布羅索尤單抗變異體具有大於或等於2之K
D比率，意味著此等抗體變異體相較於布羅索尤單抗具有至少2倍之親和力改良(最多有5倍改良)。選擇相較於布羅索尤單抗顯示出較慢或相似解離速率之抗體，使用濃度反應曲線(CRC)進行進一步分析以確認動力學參數。
結果提供於表19中，根據解離速率排序。在表19中，欄標題縮寫如下：「AS ID」係指「抗體結構ID」，其為本文所定義之各抗體之唯一標識符；「AA變化」係指相對於親本布羅索尤單抗重鏈(「HC」)可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：3)或親本布羅索尤單抗輕鏈(「LC」)可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：4)或兩者的胺基酸殘基變化；「K
D」係指平衡解離常數(M)；「k
a」係指締合速率或常數(1/Ms)；「k
d」係指解離速率或常數(1/s)；「R
max」係指理論R
max或經計算之最大可觀測信號(相對單位)；「SA」係指表面活性(%)；且「比率」係指計算的變異型抗體K
D/布羅索尤單抗K
D之比率。為清楚起見，表19中由抗體結構ID編號UGX205、UGX201、UGX144、UGX157、UGX202、UGX175、UGX206、UGX182、UGX156、UGX203、UGX126、UGX145及UGX204表示之各抗體除指定的相對於親本布羅索尤單抗重鏈序列(SEQ ID NO：1)及輕鏈序列(SEQ ID NO：2)的胺基酸變化外，具有該親本布羅索尤單抗重鏈序列及輕鏈序列。
表19. K
D比率(計算的變異型抗體K
D/布羅索尤單抗K
D之比率)大於或等於2的所選抗體變異體。
| AS ID | AA 變化 | VH ID | VL ID | K D | k a | k d | RU | SA | 比率 |
| UGX205 | HC：S59E、LC：Y94D | VH-031 | VL-066 | 4.07E-12 | 1.53E+07 | 6.25E-05 | 59.2 | 93.9 | 5 |
| UGX201 | HC：S59E、LC：N92F | VH-031 | VL-050 | 5.17E-12 | 1.12E+07 | 5.81E-05 | 30.9 | 83.4 | 4 |
| UGX144 | LC：Y94D | VH-001 | VL-066 | 5.77E-12 | 1.09E+07 | 6.31E-05 | 65.4 | 89.5 | 4 |
| UGX157 | HC：I54Y | VH-029 | VL-001 | 7.58E-12 | 1.49E+07 | 1.13E-04 | 71.4 | 89.1 | 3 |
| UGX202 | HC：S59E、LC：N92Y | VH-031 | VL-054 | 7.59E-12 | 1.29E+07 | 9.80E-05 | 56.7 | 91.6 | 3 |
| UGX175 | HC：A103S | VH-061 | VL-001 | 7.72E-12 | 1.24E+07 | 9.61E-05 | 73.1 | 86.8 | 3 |
| UGX206 | HC：S59E、LC：Y94E | VH-031 | VL-067 | 7.87E-12 | 6.25E+06 | 4.92E-05 | 20.1 | 107.6 | 3 |
| UGX182 | HC：S59D、HC：V101I | VH-055 | VL-001 | 9.47E-12 | 1.49E+07 | 1.41E-04 | 36.5 | 100.5 | 2 |
| UGX156 | HC：I54F | VH-028 | VL-001 | 1.05E-11 | 5.94E+06 | 6.25E-05 | 43.2 | 105.9 | 2 |
| UGX203 | HC：S59E、LC：S52D | VH-031 | VL-027 | 1.15E-11 | 1.26E+07 | 1.45E-04 | 45.9 | 81.4 | 2 |
| UGX126 | LC：S52D | VH-001 | VL-027 | 1.24E-11 | 1.05E+07 | 1.30E-04 | 56.2 | 86.5 | 2 |
| UGX145 | LC：Y94E | VH-001 | VL-067 | 1.33E-11 | 6.42E+06 | 8.52E-05 | 46.8 | 87.4 | 2 |
| UGX204 | HC：S59E、LC：S52E | VH-031 | VL-030 | 1.33E-11 | 1.40E+07 | 1.86E-04 | 46.6 | 90.4 | 2 |
| 布羅索尤單抗 | - | VH-001 | VL-001 | 2.08E-11 | 7.22E+06 | 1.57E-04 | 66.2 | 88.8 | 1 |
SPR資料表明多個互補位殘基經由各種機制起作用以支持布羅索尤單抗：FGF23結合。具體而言，親本布羅索尤單抗輕鏈序列之胺基酸取代S52D/E、N92F/Y及Y94D/E以及親本布羅索尤單抗重鏈序列之胺基酸取代I54F/Y、S59D/E、V101I及A103S顯著影響抗體對FGF23之親和力，此主要藉由減慢解離速率k
d實現。
不希望受理論束縛，本案發明人假設：輕鏈Y94D/E取代可與抗原決定基殘基Arg48形成離子相互作用；重鏈S59E及輕鏈Y94D/E取代可協同作用以穩定與抗原決定基殘基Arg48之夾心相互作用；輕鏈N92F/Y取代看來會增強與諸如Pro153之抗原決定基殘基的疏水堆積相互作用，尤其與重鏈S59E取代一起；重鏈A103S取代可能引入與附近抗原決定基殘基(包括Arg140)之氫鍵；重鏈S59E及輕鏈S52D/E取代可分別與抗原決定基殘基Arg48及Arg143形成離子相互作用；重鏈V101I取代可能促進與抗原決定基殘基Tyr51、L138及Tyr154之較強疏水堆積相互作用；且重鏈I54F/Y取代可促進與抗原決定基殘基His66之堆疊相互作用(圖12)。
實例 11. 所選針對 cynoFGF23 之變異型抗體之表徵
表徵表19中所示之13種抗體變異體針對食蟹獼猴(
Macaca fascicularis)FGF23(R179Q)(亦即，「cynoFGF23」)(SEQ ID NO：372)之結合動力學。以小規模(3 ml)表現抗體變異體且藉由SPR分析，在單一濃度(100 nM)下對其進行篩選。針對CRC之SPR分析的實驗設置：SPR裝置-8K+；晶片準備- CM5 hIgG晶片；通道-1-8；固定濃度-1.5 ug/ml；固定方法-捕獲；流動速率-5 µl/min；接觸時間-60秒；操作緩衝液-1x HBS-EP+ pH 7.4；溫度- 20℃；流動速率-50 µl/min；締合時間–120秒；解離時間–1800秒；抗原- cynoFGF23(R179Q)；最高濃度-0.1 µM，9點3倍單循環動力學。結果提供於表20中，表中顯示各抗體變異體針對人類FGF23及cynoFGF23之K
D及計算的變異型抗體K
D/布羅索尤單抗K
D之比率。
表20. 所選針對cynoFGF23之抗體變異體的表徵
| 人類FGF23 | 食蟹獼猴FGF23 | ||||
| AS ID | AA變化 | K D(M) | K D比率 | K D(M) | K D比率 |
| UGX205 | S59E/Y94D | 4.07E-12 | 5 | 2.57E-12 | 9 |
| UGX201 | S59E/N92F | 5.17E-12 | 4 | 1.01E-11 | 2 |
| UGX144 | Y94D | 5.77E-12 | 4 | 6.86E-12 | 3 |
| UGX157 | I54Y | 7.58E-12 | 3 | 5.73E-12 | 4 |
| UGX202 | S59E/N92Y | 7.59E-12 | 3 | 6.93E-12 | 3 |
| UGX175 | A103S | 7.72E-12 | 3 | 6.17E-12 | 4 |
| UGX206 | S59E/Y94E | 7.87E-12 | 3 | 7.16E-12 | 3 |
| UGX182 | S59D/V101I | 9.47E-12 | 2 | 1.63E-11 | 1 |
| UGX156 | I54F | 1.05E-11 | 2 | 4.15E-12 | 6 |
| UGX203 | S59E/S52D | 1.15E-11 | 2 | 2.29E-11 | 1 |
| UGX126 | S52D | 1.24E-11 | 2 | 1.03E-11 | 2 |
| UGX145 | Y94E | 1.33E-11 | 2 | 1.29E-11 | 2 |
| UGX204 | S59E/S52E | 1.33E-11 | 2 | 1.60E-11 | 1 |
| UGX139 | N92Y | 1.64E-11 | 1 | 1.62E-11 | 1 |
所選抗體變異體與cynoFGF23之結合與所觀察到的與人類FGF23之結合相當。
實例 12. 藉由 SPR 分析確認 HDX-MS 抗原決定基 / 互補位定位
根據實例10中所描述的SPR資料重新評價分別在實例2及3中所描述之HDX-MS抗原決定基及互補位定位資料，以確認HDX-MS受保護區域內關鍵殘基變化之影響。抗原決定基定位鑑別出三個推定的抗原決定基(表3中之受保護區域1-3)，且互補位定位鑑別出六個可能參與抗原結合之區域(參見表4)。
SPR資料確認布羅索尤單抗輕鏈互補位區域2中之殘基S52(參見表4)及重鏈互補位區域2中之殘基I54及S59(參見表4)為布羅索尤單抗之HDX-MS受保護區域內的關鍵殘基，表明此等殘基係布羅索尤單抗-FGF23結合之重要媒介。
SPR資料亦確認布羅索尤單抗輕鏈殘基S52、N92及Y94以及布羅索尤單抗重鏈殘基S59及V101係與FGF23受保護區域1-3介接之關鍵殘基(表3)。
因此，在藉由SPR確定為可取代以改良布羅索尤單抗親和力的7個關鍵布羅索尤單抗殘基(輕鏈S52、N92、Y94以及重鏈I54、S59、V101及A103)中，藉由HDX-MS抗原決定基/互補位定位亦鑑別出其中6個。此顯示由初始HDX-MS研究與後續基於晶體結構之建模及抗體變異體設計得到的結果之間存在強相關性及一致性。
實例 13. 針對基於 SPR 分析確定之額外抗體變異體的電腦模擬建模
實例10至12鑑別並確認了至少7個可取代以改良抗體對FGF23之親和力的布羅索尤單抗殘基(輕鏈S52、N92、Y94以及重鏈I54、S59、V101及A103)。藉由電腦模擬建模進一步評價此等關鍵布羅索尤單抗殘基，以鑑別相較於親本布羅索尤單抗及/或表18及表19中鑑別之變異體具有等效或改良之親和力的額外抗體變異體。
簡言之，基於布羅索尤單抗Fab：FGF23晶體結構及SPR資料，藉由電腦模擬建模，使用預測性突變誘發來詢問全部7個關鍵布羅索尤單抗殘基。具體而言，使用Molecular Operating Environment「MOE」(2022.02)分析來自表18及表19的K
D比率(計算的變異型抗體K
D/布羅索尤單抗K
D之比率)大於2(亦即，3或更大)之抗體變異體(UGX205、UGX201、UGX202及UGX206)以界定結合之結構決定子(亦即，哪些單個殘基或殘基對可協同作用以改良親和力)。以計算方式生成該等抗體之7個關鍵布羅索尤單抗殘基之胺基酸變化的所有可能組合。接著，選擇與初始經驗SPR資料一致之某些胺基酸變化(根據胺基酸位置)進行進一步分析。自結構/計算角度預測將使親和力相對於親本布羅索尤單抗改良之所有胺基酸變異體組合示於表21中，其中：「AS ID」係指「抗體結構ID」，其為本文所定義之各抗體之唯一標識符；「AA變化」係指相對於親本布羅索尤單抗重鏈(「HC」)可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：3)或親本布羅索尤單抗輕鏈(「LC」)可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：4)或兩者之胺基酸殘基變化；「ΔΔG」係指經計算之d親和力(kcal/mol)；「ΔΔS」係指經計算之d穩定性(kcal/mol)；且「基本原理(Rationale)」係指在MOE評估期間注意到之關鍵觀察結果。
表21. 額外抗體變異體之結構計算評價
| AS ID | AA 變化 LC | AA 變化 HC | ΔΔG | ΔΔS | 基本原理 |
| UGX205 | Y94D | S59E | 4.07 | 1.98 | |
| UGX144 | Y94D | 2.35 | 1.07 | ||
| UGX201 | N92F | S59E | -5.8 | 1.87 | 電腦模擬得到的d親和力能量與SPR一致 |
| UGX157 | I54Y | 2.65 | 1.80 | ||
| UGX175 | A103S | -0.09 | 0.23 | 電腦模擬得到的d親和力能量與SPR一致 | |
| UGX206 | Y94E | S59E | -1.82 | 3.43 | 電腦模擬得到的d親和力能量與SPR一致 |
| UGX202 | N92Y | S59E | 1.34 | 0.24 | |
| UGX156 | I54F | 1.95 | 2.05 | ||
| UGX182 | S59D、V101I | -0.49 | 0.56 | 電腦模擬得到的d親和力能量與SPR一致 | |
| UGX203 | S52D | S59E | 0.56 | 1.8 | |
| UGX126 | S52D | -0.50 | 1.28 | 電腦模擬得到的d親和力能量與SPR一致 | |
| UGX145 | Y94E | 2.58 | 1.05 | ||
| UGX204 | S52E | S59E | 0.53 | 1.8 | |
| UGX301 | Y94D | S59D | 2.21 | 1.57 | S59D/E/Q可能接觸附近的R48，R48亦接合Y94D，從而產生靜電橋。假設可實現正確的幾何形狀，則此兩種相互作用可顯著增加親和力。 |
| UGX302 | Y94D | S59Q | 1.88 | 1.08 | |
| UGX303 | Y94E | S59D | 3.05 | 1.31 | |
| UGX304 | Y94E | S59Q | -5.5 | 2.24 | |
| UGX305 | Y94Q | S59D | 2.23 | 1.19 | |
| UGX306 | Y94Q | S59E | -3.17 | 2.93 | |
| UGX307 | Y94Q | S59Q | -3.81 | 2.75 | |
| UGX308 | S59E、I54Y | -1.82 | 2.24 | I54Y可能接觸附近的P65及H66。S59E可能接觸附近的R48。此兩種相互作用可增加KD比率且產生累加效應。 | |
| UGX309 | S59D、I54Y | -3.2 | 2.27 | ||
| UGX310 | S59Q、I54Y | 1.1 | 1.70 | ||
| UGX311 | Y94D | I54Y | 1.83 | 1.99 | I54Y可能接觸附近的P65及H66。Y94D/E/Q可能接觸附近的R48。此兩種相互作用可以協同方式增加KD比率。 |
| UGX312 | Y94E | I54Y | 3.30 | 2.04 | |
| UGX313 | Y94Q | I54Y | 2.32 | 1.84 | |
| UGX314 | N92Y | S59D | -5.05 | 1.38 | S59D/E/Q可能接觸附近的R48且為親和力增加之主要驅動因素。位置N92處之芳族殘基(亦即，F或Y)可藉由以下兩種可能機制進一步穩定R48之構形：1.推動附近A47之主鏈，此舉又可為R48提供更多空間以與F95形成堆疊相互作用。2.在空間上防止潛在的R48回擺。在任一情形中，N92Y或F均可與附近來自抗原之P153相互作用以完成局部相互作用網路。 |
| UGX315 | N92Y | S59Q | 1.34 | 1.98 | |
| UGX316 | N92F | S59D | -5.46 | 1.10 | |
| UGX317 | N92F | S59Q | -5.75 | 1.33 | |
| UGX318 | N92L | S59D | -2.07 | 1.10 | |
| UGX319 | N92L | S59E | -1.17 | 1.87 | |
| UGX320 | N92L | S59Q | -4.31 | 1.33 | |
| UGX321 | N92I | S59D | -2.78 | 1.30 | |
| UGX322 | N92I | S59E | -1.79 | 1.50 | |
| UGX323 | N92I | S59Q | -4.99 | 0.87 | |
| UGX324 | N92T | S59D | 1.90 | 1.98 | |
| UGX325 | N92T | S59E | 0.01 | 2.91 | |
| UGX326 | N92T | S59Q | -2.64 | 1.93 | |
| UGX327 | I54A | 3.55 | 1.96 | 與本文所提供之現有實驗資料一致。 | |
| UGX328 | I54L | 2.44 | 1.61 | ||
| UGX329 | I54V | 2.53 | 1.52 | ||
| UGX330 | I54R | 1.22 | 1.60 | ||
| UGX331 | I54D | 4.31 | 2.76 | ||
| UGX332 | I54G | 5.4 | 2.73 | ||
| UGX333 | I54H | 3.57 | 2.54 | ||
| UGX334 | I54K | 2.73 | 2.47 | ||
| UGX335 | I54M | 1.53 | 1.09 | ||
| UGX336 | I54N | 3.29 | 2.29 | ||
| UGX337 | I54P | 6.25 | 2.50 | ||
| UGX338 | I54W | 1.53 | 1.63 | ||
| UGX339 | S59A | 0.56 | 0.42 | 允許確認S59呈酸性為鎖定R48所必需的。 | |
| UGX340 | S59R | -1.23 | 0.51 | ||
| UGX341 | S59N | -0.38 | 1.08 | ||
| UGX342 | S59G | 0.74 | 0.82 | ||
| UGX343 | S59H | -1.34 | 1.00 | ||
| UGX344 | S59K | -0.36 | 1.23 | ||
| UGX345 | S59M | -1.15 | 0.38 | ||
| UGX346 | S59P | -2.83 | 0.55 | ||
| UGX347 | S59W | -3.39 | -0.53 | ||
| UGX348 | Y94A | 3.18 | 1.07 | 與本文所提供之現有實驗資料一致。 | |
| UGX349 | Y94N | 1.82 | 0.99 | ||
| UGX350 | Y94G | 2.87 | 1.78 | ||
| UGX351 | Y94H | 1.38 | 1.12 | ||
| UGX352 | Y94I | 2.77 | -0.18 | ||
| UGX353 | Y94L | 2.91 | 0.14 | ||
| UGX354 | Y94K | 6.05 | 1.56 | ||
| UGX355 | Y94M | 3.22 | 1.71 | ||
| UGX356 | Y94P | 1.32 | 1.03 | ||
| UGX357 | Y94W | -1.52 | 0.90 | ||
| UGX358 | Y94V | 1.67 | 0.31 | ||
| UGX359 | N92A | 4.44 | 1.36 | 與本文所提供之現有實驗資料一致。 | |
| UGX360 | N92R | 0.80 | 0.37 | ||
| UGX361 | N92G | 5.24 | 2.08 | ||
| UGX362 | N92H | -1.20 | 0.79 | ||
| UGX363 | N92I | 0.09 | -0.51 | ||
| UGX364 | N92L | -0.55 | -0.68 | ||
| UGX365 | N92K | 1.19 | 0.91 | ||
| UGX366 | N92M | -1.51 | 0.20 | ||
| UGX367 | N92P | 3.72 | 1.59 | ||
| UGX368 | N92W | -1.16 | 0.45 | ||
| UGX369 | N92V | 0.73 | -0.11 | ||
| UGX370 | A103I | -2.64 | -0.19 | 難以藉由電腦模擬捕獲，但可能有益於改良VH：VL界面之穩定性且對FGF23結合具有積極作用及/或提供與附近Arg140之直接接觸。由於可能存在雙重效應，除單個突變外，用位置103之累加組合中之一者進行測試亦可能有益(參見UGX418至UGX423)。 | |
| UGX371 | A103L | 1.0 | 1.98 | ||
| UGX372 | A103R | 5.39 | -0.29 | ||
| UGX373 | A103N | -0.27 | 0.58 | ||
| UGX374 | A103G | 0.02 | 1.62 | ||
| UGX375 | A103H | 2.93 | 0.09 | ||
| UGX376 | A103K | 0.23 | 0.57 | ||
| UGX377 | A103M | -0.14 | 0.56 | ||
| UGX378 | A103P | -0.04 | -0.12 | ||
| UGX379 | A103W | 7.92 | 0.41 | ||
| UGX380 | A103V | 0.8 | 0.84 | ||
| UGX381 | S52D | S59Q | -2.42 | 1.13 | 位置59及/或52處之較短酸性殘基可能與抗原決定基上之接觸殘基更相容。 |
| UGX382 | S52D | S59D | 0.03 | 1.77 | |
| UGX383 | S52E | S59Q | -2.41 | 1.06 | |
| UGX384 | S52E | S59D | 0.01 | 1.67 | |
| UGX385 | S52Q | S59E | 0.42 | 1.48 | |
| UGX386 | S52A | -0.2 | 0.57 | 與本文所提供之現有實驗資料一致。 | |
| UGX387 | S52R | -0.5 | -0.32 | ||
| UGX388 | S52N | -0.13 | 0.97 | ||
| UGX389 | S52G | -0.01 | 0.84 | ||
| UGX390 | S52H | -3.0 | 0.44 | ||
| UGX391 | S52I | -0.57 | -0.38 | ||
| UGX392 | S52L | -0.91 | -0.23 | ||
| UGX393 | S52K | -1.7 | 0.21 | ||
| UGX394 | S52M | -1.91 | -0.10 | ||
| UGX395 | S52P | 0.35 | 1.57 | ||
| UGX396 | S52W | -3.18 | -0.56 | ||
| UGX397 | S52V | -0.21 | -0.14 | ||
| UGX398 | S59E、V101I | -1.0 | 0.40 | 可能累加且＞ 3x KD改良。 | |
| UGX399 | S59D、V101L | 0.81 | 1.06 | ||
| UGX400 | S59Q、V101I | -6.8 | 0.33 | ||
| UGX401 | S59D、V101S | 2.87 | 2.44 | ||
| UGX402 | S59E、V101S | 2.46 | 2.21 | ||
| UGX403 | V101A | 4.38 | 1.97 | 與本文所提供之現有實驗資料一致。 | |
| UGX404 | V101R | -3.47 | 0.31 | ||
| UGX405 | V101N | 1.34 | 2.00 | ||
| UGX406 | V101D | -0.69 | 2.50 | ||
| UGX407 | V101Q | 0.55 | 1.46 | ||
| UGX408 | V101E | -0.31 | 1.73 | ||
| UGX409 | V101G | 6.56 | 2.84 | ||
| UGX410 | V101H | -1.65 | 1.69 | ||
| UGX411 | V101K | -3.46 | 0.91 | ||
| UGX412 | V101M | -1.42 | 0.77 | ||
| UGX413 | V101P | 1.70 | 1.95 | ||
| UGX414 | V101S | 2.68 | 2.22 | ||
| UGX415 | V101W | -2.91 | 0.13 | ||
| UGX416 | I54Y、A103S | 3.00 | 1.80 | 可能累加且＞ 3x KD改良。 | |
| UGX417 | I54F、A103S | 3.00 | 1.39 | ||
| UGX418 | Y94D | A103S | 0.46 | 0.24 | |
| UGX419 | Y94E | A103S | -0.55 | 0.39 | |
| UGX420 | N92F | A103S | -1.02 | -0.72 | |
| UGX421 | N92Y | A103S | 0.95 | -0.10 | |
| UGX422 | S52D | A103S | -1.76 | 1.29 | |
| UGX423 | S52E | A103S | -0.7 | 1.24 | |
| UGX424 | S59D、A103S | -0.36 | 0.39 | ||
| UGX425 | S59E、A103S | -0.23 | 0.53 | ||
| UGX426 | S59Q、A103S | -3.10 | -0.32 | ||
| UGX427 | N92Y | I54Y | 1.19 | 1.38 | |
| UGX428 | N92F | I54Y | 1.00 | 1.00 | |
| UGX429 | V101I、I54F | -1.01 | 1.58 | ||
| UGX430 | V101I、I54Y | -1.59 | 1.24 |
總之，使用結構計算方法分析來自重要抗體變異體(例如表19)之突變解決方案，且利用預測具有類似或優越親和力的設計產生一組新變異體。額外設計包括預測相較於親本布羅索尤單抗具有改良之親和力的若干布羅索尤單抗抗體變異體。
實例 14. 資料彙總
本文所描述之研究試圖藉由將一或多個胺基酸變化引入重鏈胺基酸序列、輕鏈胺基酸序列或重鏈胺基酸序列與輕鏈胺基酸序列兩者中來合理地設計對FGF23具有改良之親和力的布羅索尤單抗抗體變異體。
基於由以下得到的輸入，對胺基酸殘基變化進行建模：抗原決定基及互補位定位研究(實例2及3)、分子對接及預測性突變誘發研究(實例4)、藉由結晶學進行之結構分析(實例7)及基於所解析之晶體結構進行之預測性突變誘發(實例8)、用於鑑別對人類FGF23之親和力具有2倍或更大改良的最有希望之抗體結構變異體的抗體變異體設計之精修以及藉由SPR分析對所選變異體進行之活體外測試(實例9及10)。
本文所報導之研究進一步表徵某些重要抗體變異體對cynoFGF23之親和力(實例11)，且藉由以計算方式詢問在鑑別為對調節布羅索尤單抗-FGF23結合很重要之關鍵殘基處的替代性胺基酸取代來鑑別額外抗體變異體(實例13)。
表22列出根據本文所描述之研究設計的獨特布羅索尤單抗抗體變異體。在表22中，各變異型抗體歸屬於唯一「AS ID」編號。此外，各抗體變異體相對於SEQ ID NO：2之親本布羅索尤單抗輕鏈胺基酸序列具有一或多個輕鏈胺基酸變化(「LC AA變化」)，或相對於SEQ ID NO：4之親本布羅索尤單抗輕鏈可變區胺基酸序列具有一或多個輕鏈可變區胺基酸變化(「VL AA變化」)，及/或相對於SEQ ID NO：1之親本布羅索尤單抗重鏈胺基酸序列具有一或多個重鏈胺基酸變化(「HC AA變化」)或相對於SEQ ID NO：3之親本布羅索尤單抗重鏈可變區胺基酸序列具有一或多個重鏈可變區胺基酸變化(「VH AA變化」)。在表22中，「AKA」一欄係指分配給本文所提供之某些AS ID的替代標識符。提供本文所揭示之各別重鏈(HC)、輕鏈(LC)、重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)胺基酸序列之序列識別號(「SID#」)。
表22. 合理設計以對人類FGF23具有改良之親和力的布羅索尤單抗抗體變異體之彙總
| AS ID | LC/VL AA變化 | HC/VH AA變化 | AKA | HC SID# | LC SID# | VH SID# | VL SID# |
| UGX001 | Q27F | 親本 | - | 654 | 655 | 656 | 657 |
| UGX002 | Q27R | 親本 | - | 658 | 659 | 660 | 661 |
| UGX003 | G28D | 親本 | - | 662 | 663 | 664 | 665 |
| UGX004 | G28Q | 親本 | - | 666 | 667 | 668 | 669 |
| UGX005 | G28R | 親本 | - | 670 | 671 | 672 | 673 |
| UGX006 | G28Y | 親本 | - | 674 | 675 | 676 | 677 |
| UGX007 | S30D | 親本 | UGX103 | 678 | 679 | 680 | 681 |
| UGX008 | S30F | 親本 | UGX105 | 682 | 683 | 684 | 685 |
| UGX009 | S30R | 親本 | - | 686 | 687 | 688 | 689 |
| UGX010 | S30Y | 親本 | UGX108 | 690 | 691 | 692 | 693 |
| UGX011 | S31F | 親本 | UGX111 | 694 | 695 | 696 | 697 |
| UGX012 | S31Y | 親本 | UGX113 | 698 | 699 | 700 | 701 |
| UGX013 | D50E | 親本 | - | 702 | 703 | 704 | 705 |
| UGX014 | D50Q | 親本 | UGX120 | 706 | 707 | 708 | 709 |
| UGX015 | D50R | 親本 | UGX121 | 710 | 711 | 712 | 713 |
| UGX016 | D50Y | 親本 | - | 714 | 715 | 716 | 717 |
| UGX017 | S52E | 親本 | UGX127 | 718 | 719 | 720 | 721 |
| UGX018 | S52Q | 親本 | - | 722 | 723 | 724 | 725 |
| UGX019 | S52R | 親本 | UGX387 | 726 | 727 | 728 | 729 |
| UGX020 | S52Y | 親本 | - | 730 | 731 | 732 | 733 |
| UGX021 | S53R | 親本 | UGX132 | 734 | 735 | 736 | 737 |
| UGX022 | S53Y | 親本 | UGX133 | 738 | 739 | 740 | 741 |
| UGX023 | L54E | 親本 | - | 742 | 743 | 744 | 745 |
| UGX024 | L54Y | 親本 | - | 746 | 747 | 748 | 749 |
| UGX025 | E55R | 親本 | - | 750 | 751 | 752 | 753 |
| UGX026 | E55Y | 親本 | - | 754 | 755 | 756 | 757 |
| UGX027 | S67E | 親本 | - | 758 | 759 | 760 | 761 |
| UGX028 | S67R | 親本 | - | 762 | 763 | 764 | 765 |
| UGX029 | S67Y | 親本 | - | 766 | 767 | 768 | 769 |
| UGX030 | T69R | 親本 | - | 770 | 771 | 772 | 773 |
| UGX031 | T69Y | 親本 | - | 774 | 775 | 776 | 777 |
| UGX032 | F91E | 親本 | - | 778 | 779 | 780 | 781 |
| UGX033 | F91R | 親本 | - | 782 | 783 | 784 | 785 |
| UGX034 | N92E | 親本 | UGX136 | 786 | 787 | 788 | 789 |
| UGX035 | N92F | 親本 | UGX137 | 790 | 791 | 792 | 793 |
| UGX036 | N92Q | 親本 | - | 794 | 795 | 796 | 797 |
| UGX037 | N92R | 親本 | UGX360 | 798 | 799 | 800 | 801 |
| UGX038 | N92Y | 親本 | UGX139 | 802 | 803 | 804 | 805 |
| UGX039 | D93F | 親本 | UGX140 | 806 | 807 | 808 | 809 |
| UGX040 | D93R | 親本 | - | 810 | 811 | 812 | 813 |
| UGX041 | D93Y | 親本 | - | 814 | 815 | 816 | 817 |
| UGX042 | Y94E | 親本 | UGX145 | 818 | 819 | 820 | 821 |
| UGX043 | Y94R | 親本 | - | 822 | 823 | 824 | 825 |
| UGX044 | 親本 | T28Y | - | 826 | 827 | 828 | 829 |
| UGX045 | 親本 | T30K | - | 830 | 831 | 832 | 833 |
| UGX046 | 親本 | H32K | - | 834 | 835 | 836 | 837 |
| UGX047 | 親本 | H32Y | - | 838 | 839 | 840 | 841 |
| UGX048 | 親本 | Y33D | - | 842 | 843 | 844 | 845 |
| UGX049 | 親本 | Y33L | - | 846 | 847 | 848 | 849 |
| UGX050 | 親本 | Y33R | - | 850 | 851 | 852 | 853 |
| UGX051 | 親本 | N52E | - | 854 | 855 | 856 | 857 |
| UGX052 | 親本 | N52Q | - | 858 | 859 | 860 | 861 |
| UGX053 | 親本 | N52R | - | 862 | 863 | 864 | 865 |
| UGX054 | 親本 | S55E | - | 866 | 867 | 868 | 869 |
| UGX055 | 親本 | S55F | - | 870 | 871 | 872 | 873 |
| UGX056 | 親本 | S55I | - | 874 | 875 | 876 | 877 |
| UGX057 | 親本 | S55Q | - | 878 | 879 | 880 | 881 |
| UGX058 | 親本 | S55R | - | 882 | 883 | 884 | 885 |
| UGX059 | 親本 | S55Y | - | 886 | 887 | 888 | 889 |
| UGX060 | 親本 | S57E | - | 890 | 891 | 892 | 893 |
| UGX061 | 親本 | S57F | - | 894 | 895 | 896 | 897 |
| UGX062 | 親本 | S57R | - | 898 | 899 | 900 | 901 |
| UGX063 | 親本 | S57Y | - | 902 | 903 | 904 | 905 |
| UGX064 | 親本 | T58F | - | 906 | 907 | 908 | 909 |
| UGX065 | 親本 | T58R | - | 910 | 911 | 912 | 913 |
| UGX066 | 親本 | S59F | UGX160 | 914 | 915 | 916 | 917 |
| UGX067 | 親本 | S59R | UGX340 | 918 | 919 | 920 | 921 |
| UGX068 | 親本 | S59Y | UGX166 | 922 | 923 | 924 | 925 |
| UGX069 | 親本 | N60E | - | 926 | 927 | 928 | 929 |
| UGX070 | 親本 | N60R | - | 930 | 931 | 932 | 933 |
| UGX071 | 親本 | N60Y | - | 934 | 935 | 936 | 937 |
| UGX072 | 親本 | A61F | - | 938 | 939 | 940 | 941 |
| UGX073 | 親本 | A61R | - | 942 | 943 | 944 | 945 |
| UGX074 | 親本 | A61Y | - | 946 | 947 | 948 | 949 |
| UGX075 | 親本 | Q62L | - | 950 | 951 | 952 | 953 |
| UGX076 | 親本 | Q62R | - | 954 | 955 | 956 | 957 |
| UGX077 | 親本 | Q62Y | - | 958 | 959 | 960 | 961 |
| UGX078 | 親本 | Q65E | - | 962 | 963 | 964 | 965 |
| UGX079 | 親本 | Q65R | - | 966 | 967 | 968 | 969 |
| UGX080 | 親本 | Q65Y | - | 970 | 971 | 972 | 973 |
| UGX081 | 親本 | D99F | - | 974 | 975 | 976 | 977 |
| UGX082 | 親本 | D99R | - | 978 | 979 | 980 | 981 |
| UGX083 | 親本 | D99Y | - | 982 | 983 | 984 | 985 |
| UGX084 | 親本 | I100E | UGX168 | 986 | 987 | 988 | 989 |
| UGX085 | 親本 | I100F | UGX169 | 990 | 991 | 992 | 993 |
| UGX086 | 親本 | I100Y | - | 994 | 995 | 996 | 997 |
| UGX087 | 親本 | V101E | UGX408 | 998 | 999 | 1000 | 1001 |
| UGX088 | 親本 | V101F | UGX170 | 1002 | 1003 | 1004 | 1005 |
| UGX089 | 親本 | V101L | UGX172 | 1006 | 1007 | 1008 | 1009 |
| UGX090 | 親本 | V101Q | UGX407 | 1010 | 1011 | 1012 | 1013 |
| UGX091 | 親本 | V101R | UGX404 | 1014 | 1015 | 1016 | 1017 |
| UGX092 | 親本 | D102E | - | 1018 | 1019 | 1020 | 1021 |
| UGX093 | 親本 | D102F | - | 1022 | 1023 | 1024 | 1025 |
| UGX094 | 親本 | D102K | - | 1026 | 1027 | 1028 | 1029 |
| UGX095 | 親本 | D102R | - | 1030 | 1031 | 1032 | 1033 |
| UGX096 | 親本 | D102Y | - | 1034 | 1035 | 1036 | 1037 |
| UGX101 | I29F | 親本 | - | 1038 | 1039 | 1040 | 1041 |
| UGX102 | I29L | 親本 | - | 1042 | 1043 | 1044 | 1045 |
| UGX104 | S30E | 親本 | - | 1046 | 1047 | 1048 | 1049 |
| UGX106 | S30L | 親本 | - | 1050 | 1051 | 1052 | 1053 |
| UGX107 | S30Q | 親本 | - | 1054 | 1055 | 1056 | 1057 |
| UGX109 | S31D | 親本 | - | 1058 | 1059 | 1060 | 1061 |
| UGX110 | S31E | 親本 | - | 1062 | 1063 | 1064 | 1065 |
| UGX112 | S31Q | 親本 | - | 1066 | 1067 | 1068 | 1069 |
| UGX114 | A32F | 親本 | - | 1070 | 1071 | 1072 | 1073 |
| UGX115 | A32V | 親本 | - | 1074 | 1075 | 1076 | 1077 |
| UGX116 | V34F | 親本 | - | 1078 | 1079 | 1080 | 1081 |
| UGX117 | V34I | 親本 | - | 1082 | 1083 | 1084 | 1085 |
| UGX118 | D50F | 親本 | - | 1086 | 1087 | 1088 | 1089 |
| UGX119 | D50L | 親本 | - | 1090 | 1091 | 1092 | 1093 |
| UGX122 | D50S | 親本 | - | 1094 | 1095 | 1096 | 1097 |
| UGX123 | D50T | 親本 | - | 1098 | 1099 | 1100 | 1101 |
| UGX124 | D50V | 親本 | - | 1102 | 1103 | 1104 | 1105 |
| UGX125 | A51V | 親本 | - | 1106 | 1107 | 1108 | 1109 |
| UGX126 | S52D | 親本 | - | 1110 | 1111 | 1112 | 1113 |
| UGX128 | S52F | 親本 | - | 1114 | 1115 | 1116 | 1117 |
| UGX129 | S53D | 親本 | - | 1118 | 1119 | 1120 | 1121 |
| UGX130 | S53E | 親本 | - | 1122 | 1123 | 1124 | 1125 |
| UGX131 | S53F | 親本 | - | 1126 | 1127 | 1128 | 1129 |
| UGX134 | F91Y | 親本 | - | 1130 | 1131 | 1132 | 1133 |
| UGX135 | N92D | 親本 | - | 1134 | 1135 | 1136 | 1137 |
| UGX138 | N92S | 親本 | - | 1138 | 1139 | 1140 | 1141 |
| UGX141 | D93Q | 親本 | - | 1142 | 1143 | 1144 | 1145 |
| UGX142 | D93S | 親本 | - | 1146 | 1147 | 1148 | 1149 |
| UGX143 | D93T | 親本 | - | 1150 | 1151 | 1152 | 1153 |
| UGX144 | Y94D | 親本 | - | 1154 | 1155 | 1156 | 1157 |
| UGX146 | Y94F | 親本 | - | 1158 | 1159 | 1160 | 1161 |
| UGX147 | Y94S | 親本 | - | 1162 | 1163 | 1164 | 1165 |
| UGX148 | 親本 | T30F | - | 1166 | 1167 | 1168 | 1169 |
| UGX149 | 親本 | N31D | - | 1170 | 1171 | 1172 | 1173 |
| UGX150 | 親本 | N31E | - | 1174 | 1175 | 1176 | 1177 |
| UGX151 | 親本 | N31F | - | 1178 | 1179 | 1180 | 1181 |
| UGX152 | 親本 | N31Q | - | 1182 | 1183 | 1184 | 1185 |
| UGX153 | 親本 | N31R | - | 1186 | 1187 | 1188 | 1189 |
| UGX154 | 親本 | N52F | - | 1190 | 1191 | 1192 | 1193 |
| UGX155 | 親本 | N52Y | - | 1194 | 1195 | 1196 | 1197 |
| UGX156 | 親本 | I54F | - | 1198 | 1199 | 1200 | 1201 |
| UGX157 | 親本 | I54Y | - | 1202 | 1203 | 1204 | 1205 |
| UGX158 | 親本 | S59D | - | 1206 | 1207 | 1208 | 1209 |
| UGX159 | 親本 | S59E | - | 1210 | 1211 | 1212 | 1213 |
| UGX161 | 親本 | S59I | - | 1214 | 1215 | 1216 | 1217 |
| UGX162 | 親本 | S59L | - | 1218 | 1219 | 1220 | 1221 |
| UGX163 | 親本 | S59Q | - | 1222 | 1223 | 1224 | 1225 |
| UGX164 | 親本 | S59T | - | 1226 | 1227 | 1228 | 1229 |
| UGX165 | 親本 | S59V | - | 1230 | 1231 | 1232 | 1233 |
| UGX167 | 親本 | I100D | - | 1234 | 1235 | 1236 | 1237 |
| UGX171 | 親本 | V101I | - | 1238 | 1239 | 1240 | 1241 |
| UGX173 | 親本 | A103D | - | 1242 | 1243 | 1244 | 1245 |
| UGX174 | 親本 | A103F | - | 1246 | 1247 | 1248 | 1249 |
| UGX175 | 親本 | A103S | - | 1250 | 1251 | 1252 | 1253 |
| UGX176 | 親本 | A103T | - | 1254 | 1255 | 1256 | 1257 |
| UGX177 | S31E、D50F | 親本 | - | 1258 | 1259 | 1260 | 1261 |
| UGX178 | 親本 | N31F、S59F | - | 1262 | 1263 | 1264 | 1265 |
| UGX179 | D50F、S53E | 親本 | - | 1266 | 1267 | 1268 | 1269 |
| UGX180 | S31F、S52E | 親本 | - | 1270 | 1271 | 1272 | 1273 |
| UGX181 | D50F | V101I | - | 1274 | 1275 | 1276 | 1277 |
| UGX182 | 親本 | S59D、V101I | - | 1278 | 1279 | 1280 | 1281 |
| UGX183 | S31F、S53E | 親本 | - | 1282 | 1283 | 1284 | 1285 |
| UGX184 | N92E、D93F | 親本 | - | 1286 | 1287 | 1288 | 1289 |
| UGX185 | S31E、S53E | 親本 | - | 1290 | 1291 | 1292 | 1293 |
| UGX186 | S31F、D50F | 親本 | - | 1294 | 1295 | 1296 | 1297 |
| UGX187 | 親本 | N31E、S59E | - | 1298 | 1299 | 1300 | 1301 |
| UGX188 | 親本 | S57E、S59D | - | 1302 | 1303 | 1304 | 1305 |
| UGX189 | 親本 | N31E、I54F | - | 1306 | 1307 | 1308 | 1309 |
| UGX190 | 親本 | S59T、V101L | - | 1310 | 1311 | 1312 | 1313 |
| UGX191 | 親本 | I54Y、V101F | - | 1314 | 1315 | 1316 | 1317 |
| UGX192 | 親本 | N52F、V101I | - | 1318 | 1319 | 1320 | 1321 |
| UGX193 | N92D、D93F | 親本 | - | 1322 | 1323 | 1324 | 1325 |
| UGX194 | 親本 | N52F、V101L | - | 1326 | 1327 | 1328 | 1329 |
| UGX195 | S31F、D50E | 親本 | - | 1330 | 1331 | 1332 | 1333 |
| UGX196 | Y94D | S59D | UGX301 | 1334 | 1335 | 1336 | 1337 |
| UGX201 | N92F | S59E | - | 1338 | 1339 | 1340 | 1341 |
| UGX202 | N92Y | S59E | - | 1342 | 1343 | 1344 | 1345 |
| UGX203 | S52D | S59E | - | 1346 | 1347 | 1348 | 1349 |
| UGX204 | S52E | S59E | - | 1350 | 1351 | 1352 | 1353 |
| UGX205 | Y94D | S59E | - | 1354 | 1355 | 1356 | 1357 |
| UGX206 | Y94E | S59E | - | 1358 | 1359 | 1360 | 1361 |
| UGX302 | Y94D | S59Q | - | 1362 | 1363 | 1364 | 1365 |
| UGX303 | Y94E | S59D | - | 1366 | 1367 | 1368 | 1369 |
| UGX304 | Y94E | S59Q | - | 1370 | 1371 | 1372 | 1373 |
| UGX305 | Y94Q | S59D | - | 1374 | 1375 | 1376 | 1377 |
| UGX306 | Y94Q | S59E | - | 1378 | 1379 | 1380 | 1381 |
| UGX307 | Y94Q | S59Q | - | 1382 | 1383 | 1384 | 1385 |
| UGX308 | 親本 | S59E、I54Y | - | 1386 | 1387 | 1388 | 1389 |
| UGX309 | 親本 | S59D、I54Y | - | 1390 | 1391 | 1392 | 1393 |
| UGX310 | 親本 | S59Q、I54Y | - | 1394 | 1395 | 1396 | 1397 |
| UGX311 | Y94D | I54Y | - | 1398 | 1399 | 1400 | 1401 |
| UGX312 | Y94E | I54Y | - | 1402 | 1403 | 1404 | 1405 |
| UGX313 | Y94Q | I54Y | - | 1406 | 1407 | 1408 | 1409 |
| UGX314 | N92Y | S59D | - | 1410 | 1411 | 1412 | 1413 |
| UGX315 | N92Y | S59Q | - | 1414 | 1415 | 1416 | 1417 |
| UGX316 | N92F | S59D | - | 1418 | 1419 | 1420 | 1421 |
| UGX317 | N92F | S59Q | - | 1422 | 1423 | 1424 | 1425 |
| UGX318 | N92L | S59D | - | 1426 | 1427 | 1428 | 1429 |
| UGX319 | N92L | S59E | - | 1430 | 1431 | 1432 | 1433 |
| UGX320 | N92L | S59Q | - | 1434 | 1435 | 1436 | 1437 |
| UGX321 | N92I | S59D | - | 1438 | 1439 | 1440 | 1441 |
| UGX322 | N92I | S59E | - | 1442 | 1443 | 1444 | 1445 |
| UGX323 | N92I | S59Q | - | 1446 | 1447 | 1448 | 1449 |
| UGX324 | N92T | S59D | - | 1450 | 1451 | 1452 | 1453 |
| UGX325 | N92T | S59E | - | 1454 | 1455 | 1456 | 1457 |
| UGX326 | N92T | S59Q | - | 1458 | 1459 | 1460 | 1461 |
| UGX327 | 親本 | I54A | - | 1462 | 1463 | 1464 | 1465 |
| UGX328 | 親本 | I54L | - | 1466 | 1467 | 1468 | 1469 |
| UGX329 | 親本 | I54V | - | 1470 | 1471 | 1472 | 1473 |
| UGX330 | 親本 | I54R | - | 1474 | 1475 | 1476 | 1477 |
| UGX331 | 親本 | I54D | - | 1478 | 1479 | 1480 | 1481 |
| UGX332 | 親本 | I54G | - | 1482 | 1483 | 1484 | 1485 |
| UGX333 | 親本 | I54H | - | 1486 | 1487 | 1488 | 1489 |
| UGX334 | 親本 | I54K | - | 1490 | 1491 | 1492 | 1493 |
| UGX335 | 親本 | I54M | - | 1494 | 1495 | 1496 | 1497 |
| UGX336 | 親本 | I54N | - | 1498 | 1499 | 1500 | 1501 |
| UGX337 | 親本 | I54P | - | 1502 | 1503 | 1504 | 1505 |
| UGX338 | 親本 | I54W | - | 1506 | 1507 | 1508 | 1509 |
| UGX339 | 親本 | S59A | - | 1510 | 1511 | 1512 | 1513 |
| UGX341 | 親本 | S59N | - | 1514 | 1515 | 1516 | 1517 |
| UGX342 | 親本 | S59G | - | 1518 | 1519 | 1520 | 1521 |
| UGX343 | 親本 | S59H | - | 1522 | 1523 | 1524 | 1525 |
| UGX344 | 親本 | S59K | - | 1526 | 1527 | 1528 | 1529 |
| UGX345 | 親本 | S59M | - | 1530 | 1531 | 1532 | 1533 |
| UGX346 | 親本 | S59P | - | 1534 | 1535 | 1536 | 1537 |
| UGX347 | 親本 | S59W | - | 1538 | 1539 | 1540 | 1541 |
| UGX348 | Y94A | 親本 | - | 1542 | 1543 | 1544 | 1545 |
| UGX349 | Y94N | 親本 | - | 1546 | 1547 | 1548 | 1549 |
| UGX350 | Y94G | 親本 | - | 1550 | 1551 | 1552 | 1553 |
| UGX351 | Y94H | 親本 | - | 1554 | 1555 | 1556 | 1557 |
| UGX352 | Y94I | 親本 | - | 1558 | 1559 | 1560 | 1561 |
| UGX353 | Y94L | 親本 | - | 1562 | 1563 | 1564 | 1565 |
| UGX354 | Y94K | 親本 | - | 1566 | 1567 | 1568 | 1569 |
| UGX355 | Y94M | 親本 | - | 1570 | 1571 | 1572 | 1573 |
| UGX356 | Y94P | 親本 | - | 1574 | 1575 | 1576 | 1577 |
| UGX357 | Y94W | 親本 | - | 1578 | 1579 | 1580 | 1581 |
| UGX358 | Y94V | 親本 | - | 1582 | 1583 | 1584 | 1585 |
| UGX359 | N92A | 親本 | - | 1586 | 1587 | 1588 | 1589 |
| UGX361 | N92G | 親本 | - | 1590 | 1591 | 1592 | 1593 |
| UGX362 | N92H | 親本 | - | 1594 | 1595 | 1596 | 1597 |
| UGX363 | N92I | 親本 | - | 1598 | 1599 | 1600 | 1601 |
| UGX364 | N92L | 親本 | - | 1602 | 1603 | 1604 | 1605 |
| UGX365 | N92K | 親本 | - | 1606 | 1607 | 1608 | 1609 |
| UGX366 | N92M | 親本 | - | 1610 | 1611 | 1612 | 1613 |
| UGX367 | N92P | 親本 | - | 1614 | 1615 | 1616 | 1617 |
| UGX368 | N92W | 親本 | - | 1618 | 1619 | 1620 | 1621 |
| UGX369 | N92V | 親本 | - | 1622 | 1623 | 1624 | 1625 |
| UGX370 | 親本 | A103I | - | 1626 | 1627 | 1628 | 1629 |
| UGX371 | 親本 | A103L | - | 1630 | 1631 | 1632 | 1633 |
| UGX372 | 親本 | A103R | - | 1634 | 1635 | 1636 | 1637 |
| UGX373 | 親本 | A103N | - | 1638 | 1639 | 1640 | 1641 |
| UGX374 | 親本 | A103G | - | 1642 | 1643 | 1644 | 1645 |
| UGX375 | 親本 | A103H | - | 1646 | 1647 | 1648 | 1649 |
| UGX376 | 親本 | A103K | - | 1650 | 1651 | 1652 | 1653 |
| UGX377 | 親本 | A103M | - | 1654 | 1655 | 1656 | 1657 |
| UGX378 | 親本 | A103P | - | 1658 | 1659 | 1660 | 1661 |
| UGX379 | 親本 | A103W | - | 1662 | 1663 | 1664 | 1665 |
| UGX380 | 親本 | A103V | - | 1666 | 1667 | 1668 | 1669 |
| UGX381 | S52D | S59Q | - | 1670 | 1671 | 1672 | 1673 |
| UGX382 | S52D | S59D | - | 1674 | 1675 | 1676 | 1677 |
| UGX383 | S52E | S59Q | - | 1678 | 1679 | 1680 | 1681 |
| UGX384 | S52E | S59D | - | 1682 | 1683 | 1684 | 1685 |
| UGX385 | S52Q | S59E | - | 1686 | 1687 | 1688 | 1689 |
| UGX386 | S52A | 親本 | - | 1690 | 1691 | 1692 | 1693 |
| UGX388 | S52N | 親本 | - | 1694 | 1695 | 1696 | 1697 |
| UGX389 | S52G | 親本 | - | 1698 | 1699 | 1700 | 1701 |
| UGX390 | S52H | 親本 | - | 1702 | 1703 | 1704 | 1705 |
| UGX391 | S52I | 親本 | - | 1706 | 1707 | 1708 | 1709 |
| UGX392 | S52L | 親本 | - | 1710 | 1711 | 1712 | 1713 |
| UGX393 | S52K | 親本 | - | 1714 | 1715 | 1716 | 1717 |
| UGX394 | S52M | 親本 | - | 1718 | 1719 | 1720 | 1721 |
| UGX395 | S52P | 親本 | - | 1722 | 1723 | 1724 | 1725 |
| UGX396 | S52W | 親本 | - | 1726 | 1727 | 1728 | 1729 |
| UGX397 | S52V | 親本 | - | 1730 | 1731 | 1732 | 1733 |
| UGX398 | 親本 | S59E、V101I | - | 1734 | 1735 | 1736 | 1737 |
| UGX399 | 親本 | S59D、V101L | - | 1738 | 1739 | 1740 | 1741 |
| UGX400 | 親本 | S59Q、V101I | - | 1742 | 1743 | 1744 | 1745 |
| UGX401 | 親本 | S59D、V101S | - | 1746 | 1747 | 1748 | 1749 |
| UGX402 | 親本 | S59E、V101S | - | 1750 | 1751 | 1752 | 1753 |
| UGX403 | 親本 | V101A | - | 1754 | 1755 | 1756 | 1757 |
| UGX405 | 親本 | V101N | - | 1758 | 1759 | 1760 | 1761 |
| UGX406 | 親本 | V101D | - | 1762 | 1763 | 1764 | 1765 |
| UGX409 | 親本 | V101G | - | 1766 | 1767 | 1768 | 1769 |
| UGX410 | 親本 | V101H | - | 1770 | 1771 | 1772 | 1773 |
| UGX411 | 親本 | V101K | - | 1774 | 1775 | 1776 | 1777 |
| UGX412 | 親本 | V101M | - | 1778 | 1779 | 1780 | 1781 |
| UGX413 | 親本 | V101P | - | 1782 | 1783 | 1784 | 1785 |
| UGX414 | 親本 | V101S | - | 1786 | 1787 | 1788 | 1789 |
| UGX415 | 親本 | V101W | - | 1790 | 1791 | 1792 | 1793 |
| UGX416 | 親本 | I54Y、A103S | - | 1794 | 1795 | 1796 | 1797 |
| UGX417 | 親本 | I54F、A103S | - | 1798 | 1799 | 1800 | 1801 |
| UGX418 | Y94D | A103S | - | 1802 | 1803 | 1804 | 1805 |
| UGX419 | Y94E | A103S | - | 1806 | 1807 | 1808 | 1809 |
| UGX420 | N92F | A103S | - | 1810 | 1811 | 1812 | 1813 |
| UGX421 | N92Y | A103S | - | 1814 | 1815 | 1816 | 1817 |
| UGX422 | S52D | A103S | - | 1818 | 1819 | 1820 | 1821 |
| UGX423 | S52E | A103S | - | 1822 | 1823 | 1824 | 1825 |
| UGX424 | 親本 | S59D、A103S | - | 1826 | 1827 | 1828 | 1829 |
| UGX425 | 親本 | S59E、A103S | - | 1830 | 1831 | 1832 | 1833 |
| UGX426 | 親本 | S59Q、A103S | - | 1834 | 1835 | 1836 | 1837 |
| UGX427 | N92Y | I54Y | - | 1838 | 1839 | 1840 | 1841 |
| UGX428 | N92F | I54Y | - | 1842 | 1843 | 1844 | 1845 |
| UGX429 | 親本 | V101I、I54F | - | 1846 | 1847 | 1848 | 1849 |
| UGX430 | 親本 | V101I、I54Y | - | 1850 | 1851 | 1852 | 1853 |
當前揭示之系統及方法的前述以及其他目標、特徵及優點將自附圖中所繪示之較佳實施例之以下描述而變得顯而易見。相同參考元件標識對應圖式中之共同特徵。
[圖1]係顯示在布羅索尤單抗存在下在有關FGF23之HDX-MS分析中量測之氘化百分比的圖。三個加框區域標識藉由防止氘化作用增加所證明的可能涉及抗體結合之胺基酸殘基。
[圖2]係本文藉由HDX-MS分析疊加在FGF23之2P39晶體結構上所界定的受保護區域1、受保護區域2及受保護區域3之描繪。
[圖3]係顯示在FGF23存在下在有關布羅索尤單抗之HDX-MS分析中量測之氘化百分比的圖。標識出六個低氘化區域，暗示胺基酸殘基參與抗原結合。
[圖4]顯示使用可用結構(2P39.PDB及2VEN.PDB)，藉由分子置換方法測定的FGF23(R179Q)：布羅索尤單抗Fab複合物之結晶資料收集及精修統計。
[圖5]係呈不對稱單元形式的hFGF23 (R179Q)：布羅索尤單抗Fab複合物之兩個3Å晶體結構分子。兩個複合物分子藉由FGF23二聚體保持在一起，該二聚體係由已知參與FGFR1c結合之殘基形成。
[圖6]係FGF23：Fab複合物(僅顯示可變區)之飄帶模型，其中FGF23抗原決定基殘基(C-α原子)以紫色球體標識且FGF23-二聚體/FGFR1c結合殘基(C-α原子)以青色球體標識，布羅索尤單抗輕鏈互補位殘基以綠色球體標識且布羅索尤單抗重鏈互補位殘基以黃色球體標識。
[圖7]顯示先前報導的在相關系統中鑑別之抗原決定基(Yamazaki等人, JBMR. 2008；及Kanhasut等人, Sci Report. 2022)，該等抗原決定基映射至FGF23：布羅索尤單抗晶體結構上以說明此等抗原決定基不同於本研究中鑑別之抗原決定基(圖6)。
[圖8]顯示FGF23：Fab複合物之飄帶模型(左圖)及表面模型(右圖)，其中示出FGF23及布羅索尤單抗結合界面的旋轉視圖且詳細標繪疊加棍模型的胺基酸位置(最右圖)。
[圖9]顯示FGF23表面模型界面，其中布羅索尤單抗以飄帶及棍模型顯示。圖A顯示FGF23：Fab複合物，其中FGF23部分旋轉90度以展示在結合界面處與FGF23接觸之所有布羅索尤單抗殘基。圖B顯示FGF23之表面模型(上圖)，其中布羅索尤單抗氫鍵結殘基以棍模型顯示(疊加及下圖)。圖C及圖D分別顯示在FGF23：Fab界面處之離子相互作用及芳族堆疊相互作用的近視圖。黑色箭頭指示用於親和力最佳化的基於結構之合理設計所針對的布羅索尤單抗殘基之實例。
[圖10]繪示基於FGF23：Fab複合物之晶體結構的布羅索尤單抗輕鏈與人類FGF23之相關界面位置。
[圖11]繪示基於FGF23：Fab複合物之晶體結構的布羅索尤單抗重鏈與人類FGF23之相關界面位置。
[圖12]顯示圖6中所示FGF23：Fab複合物之飄帶模型(左上一欄)，突出顯示假設會使變異型抗體之親和力相較於親本布羅索尤單抗改良的某些胺基酸取代。布羅索尤單抗輕鏈殘基以綠色顯示且重鏈殘基以黃色顯示。FGF23殘基以紫色顯示。布羅索尤單抗與FGF23之間的棍模型界面，重點在於當單獨或組合修飾時引起對FGF23之親和力增加的所選互補位殘基，該親和力係藉由SPR量測。此等經修飾殘基與附近FGF23抗原決定基殘基形成的潛在新形成之相互作用描述於各框中。
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Claims (53)
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3但相對於SEQ ID NO：3包含一或多個胺基酸變化之重鏈可變區(VH)胺基酸序列，其中該一或多個胺基酸變化係選自T30E、T30F、T30Q、T30S、T30Y、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、N31Y、H32E、H32F、H32Q、H32S、H32T、I50D、I50E、I50F、I50S、I50T、I50Y、N52E、N52F、N52Q、N52Y、I54E、I54F、I54L、I54Q、I54S、I54T、I54V、I54Y、S55E、S55F、S55Q、S55T、S55Y、S59D、S59E、S59F、S59I、S59L、S59Q、S59T、S59V、S59Y、D99E、D99Q、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100L、I100Q、I100V、I100Y、V101F、V101I、V101L、V101T、V101Y、D102E、D102F、D102I、D102L、D102Q、D102Y、A103D、A103E、A103F、A103Q、A103S、A103T及A103Y。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：4但相對於SEQ ID NO：4包含一或多個胺基酸變化之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中該一或多個胺基酸變化係選自A25L、A25V、I29F、I29L、I29V、S30D、S30E、S30F、S30I、S30L、S30Q、S30T、S30V、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31I、S31L、S31Q、S31T、S31V、S31Y、A32F、A32I、A32L、A32T、A32V、A32Y、V34F、V34I、V34L、V34Y、D50E、D50F、D50I、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、A51F、A51I、A51L、A51S、A51T、A51V、S52D、S52E、S52F、S52Q、S52T、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53I、S53L、S53Q、S53R、S53T、S53V、S53Y、Q90F、Q90Y、F91K、F91R、F91Y、N92D、N92E、N92F、N92Q、N92S、N92T、N92Y、D93E、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94D、Y94E、Y94F、Y94Q、Y94S及Y94T。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之VH胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之VL胺基酸序列，其中該VH胺基酸序列包含一或多個選自以下之胺基酸變化：T30E、T30F、T30Q、T30S、T30Y、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、N31Y、H32E、H32F、H32Q、H32S、H32T、I50D、I50E、I50F、I50S、I50T、I50Y、N52E、N52F、N52Q、N52Y、I54E、I54F、I54L、I54Q、I54S、I54T、I54V、I54Y、S55E、S55F、S55Q、S55T、S55Y、S59D、S59E、S59F、S59I、S59L、S59Q、S59T、S59V、S59Y、D99E、D99Q、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100L、I100Q、I100V、I100Y、V101F、V101I、V101L、V101T、V101Y、D102E、D102F、D102I、D102L、D102Q、D102Y、A103D、A103E、A103F、A103Q、A103S、A103T及A103Y，且其中該VL胺基酸序列包含一或多個選自以下之胺基酸變化：A25L、A25V、I29F、I29L、I29V、S30D、S30E、S30F、S30I、S30L、S30Q、S30T、S30V、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31I、S31L、S31Q、S31T、S31V、S31Y、A32F、A32I、A32L、A32T、A32V、A32Y、V34F、V34I、V34L、V34Y、D50E、D50F、D50I、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、A51F、A51I、A51L、A51S、A51T、A51V、S52D、S52E、S52F、S52Q、S52T、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53I、S53L、S53Q、S53R、S53T、S53V、S53Y、Q90F、Q90Y、F91K、F91R、F91Y、N92D、N92E、N92F、N92Q、N92S、N92T、N92Y、D93E、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94D、Y94E、Y94F、Y94Q、Y94S及Y94T。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：22-32之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(HCDR1)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：33-65之胺基酸序列的重鏈互補決定區2(HCDR2)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：66-93之胺基酸序列的重鏈互補決定區3(HCDR3)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：94-126之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(LCDR1)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：127-158之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2(LCDR2)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據選自SEQ ID NO：159-185之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3(LCDR3)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： 該HCDR1包含選自SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：22-32之胺基酸序列； 該HCDR2包含選自SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：33-65之胺基酸序列； 該HCDR3包含選自SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：66-93之胺基酸序列； 該LCDR1包含選自SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：94-126之胺基酸序列； 該LCDR2包含選自SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：127-158之胺基酸序列；且 該LCDR3包含選自SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：159-185之胺基酸序列。
- 如請求項1至10中任一項之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)， 其中該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，或 其中該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至11中任一項之經分離抗體或其片段，其中 該抗體或其片段包含VH，該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列，或 該抗體或其片段包含VL，該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至12中任一項之經分離抗體或其片段，其中 該抗體或其片段包含VH，該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列，或 該抗體或其片段包含VL，該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至13中任一項之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含VH及VL，且其中 該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列，且 該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至14中任一項之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含VH及VL，且其中 該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列，且 該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至15中任一項之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含VH及VL，且其中 該VH包含與選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列，且 該VL包含與選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至16中任一項之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含VH及VL，且其中 該VH包含選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列，或 該VL包含選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列。
- 如請求項1至16中任一項之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含VH及VL，且其中 該VH包含選自SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：186-270之胺基酸序列，且 該VL包含選自SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：271-368之胺基酸序列。
- 如請求項1至18中任一項之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之輕鏈可變區(VL)，但在該VH序列及/或該VL序列中包含至少兩個胺基酸變化，其中該至少兩個胺基酸變化係選自VL：S31E/VL：D50F、VH：N31F/VH：S59F、VL：D50F/VL：S53E、VL：S31F/VL：S52E、VL：D50F/VH：V101I、VH：S59D/VH：V101I、VL：S31F/VL：S53E、VL：N92E/VL：D93F、VL：S31E/VL：S53E、VL：S31F/VL：D50F、VH：N31E/VH：S59E、VH：S57E/VH：S59D、VH：N31E/VH：I54F、VH：S59T/VH：V101L、VH：I54Y/VH：V101F、VH：N52F/VH：V101I、VL：N92D/VL：D93F、VH：N52F/VH：V101L、VL：S31F/VL：D50E、VL：Y94D/VH：S59D、VL：Y94D/VH：S59E、VL：N92F/VH：S59E、VL：N92Y/VH：S59E、VL：Y94E/VH：S59E、VL：S52D/VH：S59E及VL：S52E/VH：S59E。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之VH胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之VL胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：3相比，該VH胺基酸序列包含一或多個選自I54F、I54Y、S59D、S59E、V101I及A103S之胺基酸變化。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之VH胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之VL胺基酸序列，其中與SEQ ID NO：4相比，該VL胺基酸序列包含一或多個選自S52D、S52E、N92F、N92Y、Y94D及Y94E之胺基酸變化。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-001之重鏈可變區(VH)及根據VL-027之輕鏈可變區(VL)(UGX126)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-001之重鏈可變區(VH)及根據VL-066之輕鏈可變區(VL)(UGX144)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-001之重鏈可變區(VH)及根據VL-067之輕鏈可變區(VL)(UGX145)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-028之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(UGX156)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-029之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(UGX157)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-061之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(UGX175)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-055之重鏈可變區(VH)及根據VL-001之輕鏈可變區(VL)(UGX182)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-050之輕鏈可變區(VL)(UGX201)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-054之輕鏈可變區(VL)(UGX202)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-027之輕鏈可變區(VL)(UGX203)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-030之輕鏈可變區(VL)(UGX204)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-066之輕鏈可變區(VL)(UGX205)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據VH-031之重鏈可變區(VH)及根據VL-067之輕鏈可變區(VL)(UGX206)。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：1之重鏈(HC)胺基酸序列及根據SEQ ID NO：2之輕鏈(LC)胺基酸序列，其中該抗體或其片段包含相對於SEQ ID NO：1之一或多個HC胺基酸變化及/或相對於SEQ ID NO：2之一或多個LC胺基酸變化，其中該一或多個HC胺基酸變化係選自T28Y、T30F、T30K、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、H32K、H32Y、Y33D、Y33L、Y33R、N52E、N52F、N52Q、N52R、N52Y、I54A、I54D、I54F、I54G、I54H、I54K、I54L、I54M、I54N、I54P、I54R、I54V、I54W、I54Y、S55E、S55F、S55I、S55Q、S55R、S55Y、S57E、S57F、S57R、S57Y、T58F、T58R、S59A、S59D、S59E、S59F、S59G、S59H、S59I、S59K、S59L、S59M、S59N、S59P、S59Q、S59R、S59T、S59V、S59W、S59Y、N60E、N60R、N60Y、A61F、A61R、A61Y、Q62L、Q62R、Q62Y、Q65E、Q65R、Q65Y、D99F、D99R、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100Y、V101A、V101D、V101E、V101F、V101G、V101H、V101I、V101K、V101L、V101M、V101N、V101P、V101Q、V101R、V101S、V101W、D102E、D102F、D102K、D102R、D102Y、A103D、A103F、A103G、A103H、A103I、A103K、A103L、A103M、A103N、A103P、A103R、A103S、A103T、A103V及A103W，且該一或多個LC胺基酸變化係選自Q27F、Q27R、G28D、G28Q、G28R、G28Y、I29F、I29L、S30D、S30E、S30F、S30L、S30Q、S30R、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31Q、S31Y、A32F、A32V、V34F、V34I、D50E、D50F、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、D50Y、A51V、S52A、S52D、S52E、S52F、S52G、S52H、S52I、S52K、S52L、S52M、S52N、S52P、S52Q、S52R、S52V、S52W、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53R、S53Y、L54E、L54Y、E55R、E55Y、S67E、S67R、S67Y、T69R、T69Y、F91E、F91R、F91Y、N92A、N92D、N92E、N92F、N92G、N92H、N92I、N92K、N92L、N92M、N92P、N92Q、N92R、N92S、N92T、N92V、N92W、N92Y、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94A、Y94D、Y94E、Y94F、Y94G、Y94H、Y94I、Y94K、Y94L、Y94M、Y94N、Y94P、Y94Q、Y94R、Y94S、Y94V及Y94W。
- 一種特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含根據SEQ ID NO：3之重鏈可變區(VH)胺基酸序列及根據SEQ ID NO：4之輕鏈可變區(VL)胺基酸序列，其中該抗體或其片段包含相對於SEQ ID NO：3之一或多個VH胺基酸變化及/或相對於SEQ ID NO：4之一或多個VL胺基酸變化，其中該一或多個VH胺基酸變化係選自T28Y、T30F、T30K、N31D、N31E、N31F、N31Q、N31R、H32K、H32Y、Y33D、Y33L、Y33R、N52E、N52F、N52Q、N52R、N52Y、I54A、I54D、I54F、I54G、I54H、I54K、I54L、I54M、I54N、I54P、I54R、I54V、I54W、I54Y、S55E、S55F、S55I、S55Q、S55R、S55Y、S57E、S57F、S57R、S57Y、T58F、T58R、S59A、S59D、S59E、S59F、S59G、S59H、S59I、S59K、S59L、S59M、S59N、S59P、S59Q、S59R、S59T、S59V、S59W、S59Y、N60E、N60R、N60Y、A61F、A61R、A61Y、Q62L、Q62R、Q62Y、Q65E、Q65R、Q65Y、D99F、D99R、D99Y、I100D、I100E、I100F、I100Y、V101A、V101D、V101E、V101F、V101G、V101H、V101I、V101K、V101L、V101M、V101N、V101P、V101Q、V101R、V101S、V101W、D102E、D102F、D102K、D102R、D102Y、A103D、A103F、A103G、A103H、A103I、A103K、A103L、A103M、A103N、A103P、A103R、A103S、A103T、A103V及A103W，且該一或多個VL胺基酸變化係選自Q27F、Q27R、G28D、G28Q、G28R、G28Y、I29F、I29L、S30D、S30E、S30F、S30L、S30Q、S30R、S30Y、S31D、S31E、S31F、S31Q、S31Y、A32F、A32V、V34F、V34I、D50E、D50F、D50L、D50Q、D50R、D50S、D50T、D50V、D50Y、A51V、S52A、S52D、S52E、S52F、S52G、S52H、S52I、S52K、S52L、S52M、S52N、S52P、S52Q、S52R、S52V、S52W、S52Y、S53D、S53E、S53F、S53R、S53Y、L54E、L54Y、E55R、E55Y、S67E、S67R、S67Y、T69R、T69Y、F91E、F91R、F91Y、N92A、N92D、N92E、N92F、N92G、N92H、N92I、N92K、N92L、N92M、N92P、N92Q、N92R、N92S、N92T、N92V、N92W、N92Y、D93F、D93Q、D93R、D93S、D93T、D93Y、Y94A、Y94D、Y94E、Y94F、Y94G、Y94H、Y94I、Y94K、Y94L、Y94M、Y94N、Y94P、Y94Q、Y94R、Y94S、Y94V及Y94W。
- 一種經分離抗體或其片段，與布羅索尤單抗(burosumab)相比，其以較高結合親和力特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽，其中該抗體或其片段包含根據表22的重鏈可變區(VH)胺基酸序列及輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
- 一種經分離抗體或其片段，與布羅索尤單抗相比，其以較高結合親和力特異性結合至人類纖維母細胞生長因子23(FGF23)多肽，其中該抗體或其片段包含根據表22的重鏈(HC)胺基酸序列及輕鏈(LC)胺基酸序列。
- 如請求項1至38中任一項之經分離抗體或其片段，其中與布羅索尤單抗相比，該抗體或其片段對人類FGF23具有增加之親和力。
- 如請求項1至39中任一項之經分離抗體或其片段，其中與布羅索尤單抗相比，該抗體或其片段對人類FGF23具有增加約2倍至約10倍之結合親和力。
- 如請求項1至40中任一項之經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段對人類FGF23之該結合親和力(K D)在約1×10 -12M至約7×10 -12M之間。
- 如請求項1至41中任一項之經分離抗體或其片段，其用於降低有需要之個體之血清FGF23之方法中。
- 如請求項1至41中任一項之經分離抗體或其片段，其用於增加有需要之個體之腎磷酸鹽再吸收最大臨限值(TmP)之方法中。
- 如請求項1至41中任一項之經分離抗體或其片段，其用於增加有需要之個體之血清無機磷(Pi)之方法中。
- 如請求項1至41中任一項之經分離抗體或其片段，其用於增加有需要之個體之血清1,25二羥基維生素D(1,25[OH]2D)濃度之方法中。
- 如請求項1至41中任一項之經分離抗體或其片段，其用於治療有需要之個體之低磷血疾患之方法中。
- 如請求項42至46中任一項之供使用之經分離抗體或其片段，其中該個體經診斷患有X性聯低磷血症(XLH)或腫瘤誘發之骨軟化症(TIO)。
- 一種降低有需要之個體之血清FGF23的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至41中任一項之經分離抗體或其片段。
- 一種增加有需要之個體之腎磷酸鹽再吸收最大臨限值(TmP)的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至41中任一項之經分離抗體或其片段。
- 一種增加有需要之個體之血清無機磷(Pi)的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至41中任一項之經分離抗體或其片段。
- 一種增加有需要之個體之血清1,25二羥基維生素D(1,25[OH]2D)濃度的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至41中任一項之經分離抗體或其片段。
- 一種治療有需要之個體之低磷血疾患的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至41中任一項之經分離抗體或其片段。
- 如請求項48至52中任一項之方法，其中該個體經診斷患有X性聯低磷血症(XLH)或腫瘤誘發之骨軟化症(TIO)。
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