TW202506996A

TW202506996A - 擴增ｃｄ５６＋／ｃｄ３－細胞之方法

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Publication number: TW202506996A
Application number: TW113115812A
Authority: TW
Inventors: 葛西義明; 関谷敬子; 石玺
Original assignee: 日商武田藥品工業股份有限公司
Priority date: 2023-04-27
Filing date: 2024-04-26
Publication date: 2025-02-16
Also published as: WO2024224359A1; CO2025014638A2; KR20260006559A; MX2025012798A; AU2024263914A1

Abstract

本揭示案係關於擴增或產生CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含使該等CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及/或CD30促效劑接觸。

Description

擴增CD56+/CD3-細胞之方法

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2024年3月29日申請之美國臨時申請案第63/572,039號及2023年4月27日申請之第63/498,773號的優先權及權益，該等申請案中之每一者特此以引用方式整體併入。

以電子方式提交的序列表之參考

電子提交之序列表(名稱：3817_188PC02_Seqlisting_ST26；大小：4,409個位元組；及創建日期：2024年4月19日)的內容以引用方式整體併入本文。

本揭示案係關於CD56⁺/CD3^-細胞之擴增。

自然殺手(NK)細胞對多種人類惡性腫瘤具有治療潛力，包括用於抗癌治療及其他適應症之過繼性免疫療法。NK細胞不需要初免階段且不受HLA限制，且因此代表「現成」有效抗腫瘤反應之潛力。誘導型多能幹細胞(iPSC)衍生之NK(Inducible pluripotent stem cells(iPSC)-derived NK，iNK)細胞已包括在用於治療血液惡性腫瘤以及用於治療實體腫瘤之多個臨床試驗中。由於NK細胞在活體外擴增不良，在活體內壽命有限，且僅佔人類外周血單核細胞(PBMC)之一小部分，因此獲得足夠細胞數為NK細胞免疫療法之主要障礙。因此，仍需要改良用於擴增NK細胞及iNK細胞之方法。

本揭示案之一些態樣係關於一種擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含：在NKp46促效劑存在下培養該CD56⁺/CD3^-細胞，其中該CD56⁺/CD3^-細胞包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子。本揭示案之一些態樣係關於一種擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含：在CD30促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。

在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞衍生自多能幹細胞(iPSC)。在一些態樣中，該方法進一步包含用編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子轉導多能幹細胞。在一些態樣中，多能幹細胞為誘導多能幹細胞(iPSC)。

在一些態樣中，NKp46促效劑為抗NKp46抗體。在一些態樣中，CD30促效劑為抗CD30抗體。在一些態樣中，在NKp46促效劑及至少一種細胞介素存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，至少一種細胞介素包含介白素-(IL)2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其任何組合。在一些態樣中，在CD30促效劑及至少一種細胞介素存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，至少一種細胞介素包含介白素-(IL)2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其任何組合。

在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞進一步包含至少一種外源核酸分子，其編碼(i)一或多種嵌合抗原受體(CAR)，及/或(ii)一或多種細胞介素或其模擬物。

在一些態樣中，細胞介素或其模擬物為IL-15。在一些態樣中，IL-15連接至IL-15Rα以形成融合蛋白。

本揭示案之一些態樣係關於一種產生經修飾CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含：(A)提供離體主體細胞產生，其包含造血前驅細胞(HPC)，其包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子，及(B)使該等HPC分化以產生一或多種CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含：(C)在NKp46促效劑及/或CD30促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。

在一些態樣中，HPC衍生自一或多種多能幹細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含用編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子來轉導一或多種多能幹細胞。在一些態樣中，多能幹細胞為iPSC。

在一些態樣中，NKp46促效劑為抗NKp46抗體。在一些態樣中，CD30促效劑為抗CD30抗體。在一些態樣中，在NKp46促效劑及至少一種細胞介素存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，至少一種細胞介素包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其任何組合。在一些態樣中，在CD30促效劑及至少一種細胞介素存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，至少一種細胞介素包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其任何組合。

本揭示案之一些態樣係關於一種CD56⁺/CD3^-細胞，其係經由本文所揭示之方法獲得。

本揭示案之一些態樣係關於一種醫藥組合物，其包含本文所揭示之CD56⁺/CD3^-細胞及賦形劑。

本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之疾病或疾患的方法，其包含向個體投與本文所揭示之CD56⁺/CD3^-細胞或本文所揭示之醫藥組合物。

圖1為流式細胞術結果之圖形表示，其例示NKp46在未經轉導之誘導多能幹細胞(iPSC)及經經由CAG啟動子表現NKp46之構築體轉導之iPSC中之表現。

圖2A及圖2B為流式細胞術結果之圖形表示，其例示自未轉導iPSC及CAG-NKp46轉導iPSC分化之iNK細胞中NKp46之表現。圖2A例示NKp46在經轉導細胞中之表現，且圖2B經由CD56⁺/CD3^-染色結果確認iNK表型。

圖3為自CAG-NKp46轉導之iPSC分化之iNK細胞在NKp46 Ab介導之(抗NKp46/抗CD2)活化後倍數擴增之圖形表示。

圖4A至圖4D為指示自CAG-NKp46轉導之iPSC分化之iNK細胞中之NKp46表現及CD56表現(圖4A)、CD3表現(圖4B)、NKG2D表現(圖4C)及CD16表現(圖4D)之流式細胞術結果之圖形表示。

圖5A及圖5B為CD30 Ab介導之活化後iNK細胞之倍數擴增的圖形表示。圖5A顯示第三次擴增後iNK細胞之倍數擴增，且圖5B顯示第四次擴增後iNK細胞之倍數擴增。

圖6為iNK細胞之活體內持久性之圖形表示，藉由在投與iNK細胞後四週，每週外周血中之人類CD45⁺細胞之數目來顯示。

圖7A及圖7B為在投與iNK-CD19 CAR細胞後評估腫瘤負荷之生物發光成像(BLI)之結果的圖示。圖7A係例示如藉由BLI總通量繪示之腫瘤負荷之量化的圖形表示。CAR #1為在如本文所述之抗CD3抗體、IL-7及IL15存在下培養之CD19 CAR-iNK株；且CAR #2為在如本文所述之抗CD16抗體、IL-2及IL15存在下培養之CD19 CAR-iNK株。圖7B為說明藉由BLI評估之腫瘤負荷的一係列照片。

圖7C顯示CD19-mbIL15 CAR-iNK在Nalm6/NSG小鼠模型中之活體內活性。圖7C為小鼠體重變化(變化百分比)之圖形表示。

圖8為活體外重複抗原刺激檢定結果之圖形表示，其例示在將未轉導之iNK細胞及iNK-間皮素(Meso)CAR細胞添加至各孔後，以每孔之每個圖像之總RFP陽性表面積量測之腫瘤細胞豐度。

圖9A及圖9B為在活體內投與iNK-間皮素CAR細胞後評估腫瘤負荷之BLI結果的圖示。圖9A為例示如藉由BLI總通量繪示之腫瘤負荷之量化的圖形表示。圖9B為說明藉由BLI評估之腫瘤負荷的一係列照片。

圖10A及圖10B為例示活體內iNK-間皮素CAR細胞增殖之圖形表示。圖10A顯示小鼠外周血中作為人類CD45⁺細胞之活細胞之百分比。圖10B顯示每μL小鼠外周血中人類CD45⁺細胞之絕對數目。

本揭示案之一些態樣係關於擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含：在NKp46促效劑存在下培養該CD56⁺/CD3^-細胞，其中該CD56⁺/CD3^-細胞包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子。在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞衍生自多能幹細胞(iPSC)。在一些態樣中，該方法進一步包含用編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸序列轉導多能幹細胞。

本揭示案之一些態樣係關於產生經修飾CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含：(a)提供離體主體細胞產生，其包含造血前驅細胞(HPC)，其包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子，及(b)使該等HPC分化以產生一或多種CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含(c)在NKp46促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。

本揭示案之一些態樣係關於擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含在CD30促效劑(例如抗CD30抗體)存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。

本揭示案之一些態樣係關於擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含在CD16促效劑(例如抗CD16抗體)存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含在IL-7中培養細胞。

在更詳細地描述本揭示案之前，應理解，本揭示案不限於所描述之特定組合物或製程步驟，因此當然可變化。如熟習此項技術者在閱讀本揭示案後將明瞭，本文描述及例示之個別態樣中之每一者具有離散組件及特徵，其可容易地與其他若干態樣中之任一者之特徵分離或組合而不脫離本揭示案之範疇或精神。任何所列舉之方法可以所列舉事件之次序或以邏輯上可能之任何其他次序來執行。

本文所提供之標題並非對本揭示案之各個態樣之限制，其可藉由參考整個說明書來定義。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述特定態樣之目的，且不意欲具有限制性。

I.術語

為使本發明可更容易理解，首先定義某些術語。如本申請案中所用，除非本文另有明確規定，否則以下術語中之每一者應具有下文所闡述之含義。在整個申請案中闡述額外的定義。

除非另有指示，如本文所述，任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括所列舉範圍內之任何整數之值，且在適當時，包括其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。

在整個本揭示案中，術語「一(a/an)」實體係指該實體中之一或多者；例如，「嵌合多肽」應理解為表示一或多種嵌合多肽。因此，術語「一」(或「一個」)、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。

此外，本文使用的「及/或」應被視為兩個指定特徵或部件中之每一個的具體揭示，有或沒有另一個。因此，本文中諸如「A及/或B」之片語中使用的術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，在諸如「A、B及/或C」之片語中使用的術語「及/或」意欲涵蓋以下各個態樣：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。另外，「或」用於意指清單中組分之開放清單。舉例而言，「其中X包含A或B」意指X包含A，X包含B，X包含A及B，或X包含A或B及任何其他組分。

術語「約」或「基本上由...組成」係指在如由普通熟習此項技術者測定之特定值或組成的可接受之誤差範圍內的值或組成，此將部分視量測或測定值或組成之方式(亦即量測系統之限制)而定。例如，「約」或「基本上由...組成」可意謂根據此項技術之實踐在1個標準偏差以內或大於1個標準偏差。替代地，「約」或「基本上由...組成」可意指高達10%之範圍。此外，特別係對於生物系統或過程，該等術語可意謂高達一個數量級或高達5倍之值。當在申請案及申請專利範圍中提供特定值或組成時，除非另外指出，否則「約」或「基本上由...組成」之含義應假定為在該特定值或組成之可接受誤差範圍內。

術語「活化之免疫細胞」、「活化之T細胞」及「活化之NK細胞」尤其係指正在進行細胞分裂之免疫細胞，例如T細胞及/或NK細胞。

「抗原」係指引起免疫反應或能夠由TCR結合之任何分子，例如肽。該免疫反應可能涉及抗體產生、特定免疫活性細胞之活化、或其組合。本領域技術人員將容易地理解任何大分子，包括幾乎所有蛋白質或肽，均可用作抗原。抗原可內源表現，亦即藉由基因體DNA表現，或可重組表現。抗原及/或抗原決定基可對特定組織(諸如癌細胞)具有特異性，或其可廣泛表現。另外，較大分子之片段可充當抗原。在一些態樣中，抗原為造血幹細胞(HSC)抗原。

如本文所用，「抗原呈遞細胞」或「APC」係指表現一或多種抗原之細胞或細胞樣抗原呈遞表面。在一些態樣中，抗原展示於APC之表面上。

如本文所用，術語「抗原結合域」係指具有與免疫球蛋白結合域同源之結合域之任何蛋白質。「抗原結合域」及「抗體」進一步包括多肽，其包含特異性結合且識別抗原，且包含至少一個CDR之免疫球蛋白或其部分之框架區。使用術語「抗原結合域」意在包括完整抗體、多株、單株及重組抗體、其部分，且進一步包括單鏈抗體、人類化抗體、鼠類抗體、嵌合抗體、小鼠-人類、小鼠-靈長類抗體、靈長類-人類單株抗體、抗個體遺傳型抗體、抗體構築體，諸如例如scFv、(scFv)2、Fab、Fab'及F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb、及Fd、二硫鍵連接之Fv(dsFc)及抗體相關多肽。

如本文所用，術語「主體細胞產生」係指使用細胞而無需藉由磁性、螢光、基於化學之方法或類似方法進行細胞選擇/分選。

如本文所用，術語「大約」在應用於一或多個感興趣之值時係指與所陳述之參考值類似之值。在某些態樣中，除非另外說明或自上下文另外顯而易見(除了此類數目超過可能值之100%)，否則術語「大約」係指在任一方向上(大於或小於)在所陳述之參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少內的一系列值。

術語「自體」係指任何材料，例如免疫細胞、核酸序列、多肽或衍生自稍後將重新引入之相同來源之其他生物材料。舉例而言，自體T細胞療法包含向個體投與自同一個體分離之T細胞。術語「同種異體」係指衍生自一個個體之任何材料，然後將其引入同一物種之另一個體。舉例而言，同種異體T細胞移植包括向個體投與自除個體以外之供體獲得之T細胞。

如本文所用，術語「在物質存在下培養細胞群」係指例如在含有該物質之培養基中培養細胞群。此類培養可為例如在含有單獨物質或物質與其他分化誘導因子等共存之培養基中培養。當將物質添加至培養基中時，其可直接添加至培養基中，或其可在使用時將物質溶解於適當溶劑中後添加至培養基中。物質亦可固定於受質或載劑表面上以進行培養。如本文所用，術語「在物質存在下培養細胞群」及「使細胞群與物質接觸」可互換使用。

術語「內源性」係指在生物體內生長或源自生物體內之劑、細胞、基因、多肽或其部分。在本揭示案中，內源性HSC為源自個體或在個體內、或目前在個體內或內部的HSC或造血幹細胞。

術語「外源」及「異源」可互換使用且係指衍生自另一個體或物種或人工製造之任何材料，例如免疫細胞、核酸序列、基因、多肽或其他生物物質，即非天然基因序列、細胞、系統或個體所引入之基因序列。

術語「野生型」係指生物體之原始、天然、非突變或非截短基因或蛋白質序列。癌症係指一組廣泛的各種疾病，其特徵為體內異常細胞之不受控制生長。不受調控之細胞分裂及生長結果可導致形成惡性腫瘤或細胞，該等惡性腫瘤或細胞侵襲鄰近組織，且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠處部位。「癌症」或「癌組織」可包括腫瘤。可藉由本發明之方法治療的癌症之實例包括但不限於免疫系統之癌症，包括淋巴瘤、白血病、及其他白血球惡性腫瘤。在一些實施例中，本發明之方法可用於減小衍生自癌症之腫瘤之腫瘤大小，例如癌症包含骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、乳癌、前列腺癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌(NSCLC)或小細胞肺癌(SCLC))、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球性白血病、兒童實體瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發之癌症(包括石棉誘發之彼等癌症)或其任何組合。特定癌症可對化學療法或放射療法有反應，或癌症可為難治性的。難治性癌症係指無法藉由手術干預來修正之癌症，且該癌症最初對化學療法或放射療法無反應或隨著時間推移癌症變得無反應。

應當理解，在本文中用語言「包含」描述態樣之處，亦提供以「由...組成」及/或「基本上由...組成」描述之類似態樣。

如本文所用，「細胞介素」係指由一個細胞因應與特定抗原接觸而釋放之非抗體蛋白(或包含(i)非抗體蛋白及(ii)受體、受體次單元或受體之一部分等之融合蛋白)，其中該細胞介素與第二細胞相互作用以介導該第二細胞中之反應。細胞介素可由細胞內源性表現、添加至培養中之細胞中、投與個體或其任何組合。細胞介素可由免疫細胞(包括巨噬細胞、B細胞、T細胞及肥大細胞)釋放以傳播免疫反應。細胞介素可在受體細胞中誘導各種反應。細胞介素可包括穩態細胞介素、趨化介素、促發炎細胞介素、效應物及急性期蛋白。舉例而言，穩態細胞介素(包括介白素(IL)7及IL-15)促進免疫細胞存活及增殖，且促發炎細胞介素可促進發炎反應。穩態細胞介素之實例包括但不限於IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15、IL-21及乾擾素(IFN)γ。促發炎細胞介素之實例包括但不限於IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-13、IL-17a、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β、纖維母細胞生長因子(FGF)2、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、可溶性細胞間黏著分子1(sICAM-1)、可溶性血管黏著分子1(sVCAM-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D及胎盤生長因子(PLGF)。效應物之實例包括但不限於顆粒酶A、顆粒酶B、可溶性Fas配位體(sFasL)及穿孔蛋白。急性期蛋白之實例包括但不限於C反應蛋白(CRP)及血清類澱粉A(SAA)。

「趨化介素」係一類介導細胞趨化性或定向運動之細胞介素。趨化介素之實例包括但不限於IL-8、IL-16、嗜酸細胞活化趨化因子、嗜酸細胞活化趨化因子-3、巨噬細胞源性趨化介素(MDC或CCL22)、單核球趨化蛋白1(MCP-1或CCL2)、MCP-4、巨噬細胞發炎蛋白la(MIP-la、MIP-la)、MIP-Ib(MIP-lb)、γ誘導之蛋白10(IP-10)以及胸腺及活化調節之趨化介素(TARC或CCL17)。

細胞介素之其他實例包括但不限於趨化介素(C-C模體)配位體(CCL)1、CCL5、單核球特異性趨化介素3(MCP3或CCL7)、單核球化學吸引蛋白2(MCP-2或CCL8)、CCL13、IL-1、IL-3、IL-9、IL-11、IL-12、IL-14、IL-17、IL-20、IL-21、IL-23、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)、CD 154、淋巴毒素(LT)β、4-IBB配位體(4-1BBL)、增殖誘導配位體(APRIL)、CD30L、CD70、CD153、CD178、糖皮質激素誘導之TNFR相關配位體(GITRL)、腫瘤壞死因子超家族成員14(TNFSF14)、OX40L、TNF及ApoL相關白血球表現配位體1(TALL-1)或TNF相關凋亡誘導配位體(TRAIL)。在一些實施例中，細胞介素包括但不限於IL15與IL-15Rα之融合蛋白。

術語「模擬物」係指與另一劑、化合物、化學品、分子或類似物具有相同功能之任何劑。在本揭示案之一些態樣中，細胞介素模擬物包含具有與特定細胞介素相同功能之任何劑。

術語「工程化自體細胞療法」可縮寫為「eACT^TM」，亦稱為過繼細胞轉移，係收集患者自身免疫細胞(例如T細胞及/或NK細胞)之過程，且隨後經遺傳改變以識別且靶向在一或多種特定腫瘤細胞或惡性腫瘤之細胞表面上表現之一或多種抗原。免疫細胞(例如T細胞及/或NK細胞)可經工程改造以表現例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。CAR陽性(⁺)免疫細胞(例如T細胞或免疫細胞)經工程改造以表現對特定腫瘤抗原具有特異性之細胞外單鏈可變片段(scFv)，該特定腫瘤抗原連接至包含共刺激域及活化域之細胞內信號傳導部分。共刺激域可衍生自例如CD28，且活化域可衍生自例如CD3-ζ(圖1)。在某些實施例中，CAR經設計以具有兩個、三個、四個或更多個共刺激域。CARscFv可經設計以靶向例如CD19，CD19係由B細胞譜系中之細胞表現之跨膜蛋白，包括所有正常B細胞及B細胞惡性腫瘤，包括但不限於NHL、CLL及非T細胞ALL。在一些態樣中，CAR scFV可結合間皮素。間皮素係在許多實體腫瘤中表現之蛋白質，該等實體腫瘤包括但不限於間皮瘤、卵巢癌、胰臟腺癌以及肺及子宮惡性腫瘤。實例CAR⁺ T細胞療法及構築體描述於美國專利公開案第2013/0287748號、第2014/0227237號、第2014/0099309號及第2014/0050708號中，且此等公開案以引用方式整體併入。

「免疫反應」如此項技術中所理解，且通常係指脊椎動物體內針對外來物質或異常物質(例如癌細胞)之生物反應，該反應保護生物體免受此等物質之損害及由它們引起之疾病。免疫反應由免疫系統之一或多種細胞(例如，T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突細胞或嗜中性球)及由該等細胞中之任一種或肝臟產生之可溶性大分子(包括抗體、細胞介素及補體)之作用介導，導致選擇性靶向、結合、損害、破壞及/或消除脊椎動物體內的入侵病原體、受病原體感染之細胞或組織、癌細胞或其他異常細胞，或者在自體免疫或病理性炎症之情況下，正常人類細胞或組織。免疫反應包括，例如，活化或抑制T細胞，例如效應T細胞、Th細胞、CD4⁺細胞、CD8⁺ T細胞或Treg細胞，或活化或抑制免疫系統之任何其他細胞，例如NK細胞。在一些態樣中，免疫反應係指NK細胞介導之殺傷外來細胞，例如同種異體T細胞療法。

如本文所用，術語「引入」或「引入」係指在細胞中表現異源多核苷酸及/或多肽。在一些態樣中，藉由用感興趣之多核苷酸轉染細胞來達成引入。在一些態樣中，藉由例如使用包括但不限於CRISPR/Cas、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cpf1、鋅指、TALEN、Closver-Cas或其變異體之基因編輯工具來遺傳修飾該細胞來表現異源序列，從而達成引入。在一些態樣中，藉由使細胞與編碼感興趣之多肽之mRNA接觸，使得mRNA進入細胞或細胞核中來達成引入。在一些態樣中，引入包括用編碼多肽之多核苷酸轉染或轉導細胞。

如本文所用之術語「淋巴球」包括自然殺手(NK)細胞、T細胞、NKT細胞或B細胞。NK細胞為一類細胞毒性(cytotoxic)(細胞毒性(cell toxic))淋巴球，其代表先天免疫系統之主要組分。NK細胞藉由在靶細胞中誘導細胞凋亡或程式化細胞死亡來排斥腫瘤及病毒感染之細胞。NK細胞通常定義為CD3^-/CD56⁺/CD7⁺細胞。在某些實施例中，NK細胞亦可表現CD16(CD16⁺)及/或NKG2D(NKG2D⁺)。在某些實施例中，使用本文所述之方法產生之免疫細胞為NK細胞，其特徵為CD56⁺/CD3^-細胞。

如本文所定義之CD56⁺/CD3^-細胞係指包含功能性CD56且不包含功能性CD3之細胞。在某些實施例中，CD56⁺/CD3^-細胞可為NK細胞。在另一實例中，CD56⁺/CD3^-細胞可為NK細胞之前驅細胞。CD56⁺/CD3^-細胞可根據此項技術中已知之任何方法來製備(參見例如US2021/0292713，其以引用方式併入本文)。

如本文所用，術語「多能幹細胞」或「PS細胞」或「PSC」係指能夠藉由分裂及發育成構成人體之三個主要細胞群來自我更新之細胞，包括外胚層、內胚層及中胚層細胞。多能幹細胞能夠自所有此等三個基本身體層製造細胞，因此其可潛在地產生身體自我修復所需之任何細胞或組織。此性質可稱為多能性。

如本文所用，術語「誘導多能幹細胞」或「iPS細胞」或「iPSC」係指已去分化(或再編程)成更幼稚(例如多能)狀態之細胞。已知使細胞去分化之各種方法，包括但不限於在細胞中過表現Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc(「山中因子(Yamanaka factor)」)(參見例如Takahashi及Yamanaka,Cell 126：663-76(2006))。在一些態樣中，iPS細胞為多能細胞，例如能夠分化成有限數目之細胞類型。在一些態樣中，iPS細胞為全能細胞，例如能夠分化成任何細胞類型。在一些態樣中，iPS細胞可再分化成特定類型之細胞，例如免疫細胞。

術語「CD3」係指分化簇3，其為稱為T3複合物之多聚體蛋白複合物，其用作T細胞輔受體且為T細胞之定義特徵。CD3抗原對T細胞之特異性使其成為所有發育階段之T細胞的有用標記物。CD3亦由一些巨噬細胞弱表現，包括衍生自B細胞譜系之細胞，但不在天然NK細胞中表現。

術語「CD56」係指神經細胞黏著分子(NCAM)且係參與嗜同型及嗜異型相互作用之免疫球蛋白超家族之成員。CD56為NK細胞之表型標記物。此外，CD56⁺免疫細胞級分之缺陷及表型改變與對各種感染、自體免疫及惡性疾病之易感性增加相關。

術語「CD30」亦稱為「腫瘤壞死因子受體超家族成員8」或「TNFRSF8」，係指腫瘤壞死因子受體家族之細胞膜蛋白及腫瘤標記物。CD30通常在活化之T細胞、NK細胞及B細胞上表現。

術語「NKp46」(亦稱為CD335)係指由人類NK細胞表現之屬於天然細胞毒性受體(NCR)家族之受體。本發明中所用之NKp46多肽不限於野生型蛋白，只要其由下文所述之NKp46促效劑活化即可。瞭解此類NKp46多肽是否可由NKp46促效劑活化可藉由確認NKp46之下游分子(例如PI3K及ERK1/2)經磷酸化來偵測。在一些實施例中，NKp46多肽包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：2至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%一致的胺基酸序列。

編碼NKp46之示範性核酸序列可包括SEQ ID NO：1(SEQ ID NO：1；表1)中所列示之核酸序列。在一些態樣中，多核苷酸包含與SEQ ID NO：1中列示之核酸序列具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性的核苷酸序列。在一些態樣中，核酸序列編碼包含與SEQ ID NO：2中列示之胺基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列一致性的胺基酸序列的NKp46多肽。在一些態樣中，核酸序列編碼包含SEQ ID NO：2中列示之胺基酸序列的NKp46多肽。

在一些實施例中，提供包含編碼NKp46之任何多核苷酸之載體。載體可為非病毒載體，諸如質體，或病毒載體，諸如腺病毒載體、腺病毒相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體及反轉錄病毒載體。作為非限制性實例，載體可包含SEQ ID NO：1之多核苷酸。載體可在編碼NKp46之部分的上游包含啟動子。本文所用之示範性啟動子可為CAG啟動子。在一些態樣中，載體包含編碼至少一種(例如，一或多種)NKp46之多核苷酸。在此類情況下，載體可包含一或多個連接子序列，諸如可裂解肽(例如E2A)。舉例而言，E2A肽可位於兩個NKp46之間。

在一些態樣中，載體包含編碼以下之多核苷酸：(i)一或多種嵌合抗原受體(CAR)，及/或(ii)一或多種細胞介素或其模擬物。在一些態樣中，載體包含編碼多種(例如兩種或更多種)CAR及/或其細胞介素或模擬物之多核苷酸。在此類情況下，載體可包含一或多個連接子序列，諸如可裂解肽(例如E2A)。舉例而言，E2A肽可位於CAR及/或細胞介素之間。

術語「NKG2D」係指在NK細胞、γδT細胞、CD8⁺ T細胞及一些自體反應性或免疫抑制性CD4⁺ T細胞上表現之C型凝集素樣受體，且代表用於偵測之主要識別受體。

術語「CD16」(FcγRIIIa)係指含有兩個在NK細胞中表現之細胞外Ig樣域之I型跨膜受體。CD16功能係介導NK細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之低親和力IgG受體。

術語「CD34」係指人類HSPC上之E-及P-選擇蛋白配位體，其以與其他已知選擇蛋白配位體相當之動力學結合。CD34通常用於鑑別及分離人類造血幹細胞/前驅細胞(HSPC)。

術語「CD2」係指糖蛋白，其為主要在T及NK細胞上表現之共刺激受體。

如本文所用，術語「原代NK細胞」係指直接取自個體之NK細胞或可為直接自個體分離之NK細胞之培養物。

如本文所用，術語「iNK細胞」或「誘導NK細胞」係指自iPS細胞分化之NK細胞。iNK細胞表現CD56。在另一實施例中，此iNK細胞可表現CD56及CD16。在另一個實例中，此iNK細胞可表現CD56且為CD3^-(CD56⁺/CD3^-)。

如本文所用，「造血幹細胞」或「HSC」或「造血前驅細胞」或「HPC」或「HPC」係指可發育成所有類型之血細胞(包括白血球、紅血球及血小板)之未成熟細胞之細胞。造血幹細胞存在於外周血及骨髓中，且亦稱為「血液幹細胞」。

如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有水性溶劑(例如水、醇/水溶液、鹽水溶液、非經腸媒劑，諸如氯化鈉、林格氏右旋糖等)、非水性溶劑(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有機酯諸如油酸乙酯)、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、藥物、藥物穩定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、流體及營養補充物，諸如類似材料及其組合，如熟習此項技術者已知。醫藥組合物中之各種組分之pH及精確濃度係根據熟知參數進行調整。

如本文所用，術語「重組」或「經修飾之」細胞意欲指代包含非天然存在於細胞中之核酸的細胞，例如免疫細胞，且可為重組表現載體已引入其中之細胞。應理解，此類術語不僅欲指代具體個體細胞，而且亦指代此細胞之後代。雖然後續各代中可能歸因於突變或環境影響而出現某些修飾，但此後代仍包括在如本文所用之術語「重組」或「經修飾之」範疇內。

如本文所用，術語「個體」及「患者」可互換使用且係指人類或非人類，諸如靈長類動物、哺乳動物及脊椎動物。在特定態樣中，個體係人類。

如本文所用，術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指具有與細胞內域偶合之抗原特異性細胞外域的重組融合蛋白，該細胞內域在抗原結合至細胞外域後，指導細胞執行專門功能。

如本文所用，「自殺基因」或「自殺開關」係指在由細胞表現後導致細胞經歷細胞凋亡之基因。自殺基因之非限制性實例包括誘導型半胱天冬酶-9自殺基因、病毒胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶、針對抗氧化酶(AOE)之細胞內抗體、細菌硝基還原酶、其他半胱天冬酶及DNA酶。

在一些態樣中，自殺基因包含誘導型半胱天冬酶-9自殺基因。誘導型半胱天冬酶-9(iCasp9)「安全開關」提供允許移除活化之CART細胞的解決方案。iCasp9之誘導取決於小分子二聚化藥物AP1903之投與，且二聚化導致經轉導細胞中之細胞凋亡之快速誘導，優先殺死表現高水準轉殖基因之活化細胞(參見例如Gargett,T等人Front.Pharmacol.,2014,10月28日,5：235)。

在一些態樣中，自殺基因包含病毒胸苷激酶(TK)。胸苷激酶為ATP-胸苷5'-磷酸轉移酶，其可將去氧胸苷轉化為去氧胸苷5'-單磷酸，後者進一步磷酸化為去氧胸苷二磷酸，此後分別藉由病毒胸苷激酶及核苷二磷酸激酶磷酸化為去氧胸苷三磷酸。去氧胸苷三磷酸藉由DNA聚合酶併入合成的DNA分子中。一些dNTP類似物，諸如更昔洛韋(GCV)，亦即2'-去氧鳥苷之合成類似物，在其併入合成DNA後能夠終止DNA合成。合成之終止觸發凋亡傳訊級聯。雖然GCV不為人類胸苷激酶所識別，但它經識別為一些病毒胸苷激酶之受質，諸如單純疱疹病毒1胸苷激酶(HSV-TK)。作為結果，表現HSV-TK之人類細胞將GCV轉化為GCV磷酸，後者進一步磷酸化並併入合成的DNA中，導致合成終止及細胞凋亡。雖然HSV-TK之變異體不受限制，但HSV-TK為例如TK007(參見Preuss等人,Hum Gene Ther.2010 Aug；21(8)：929-41)。

在一些態樣中，自殺基因為胞嘧啶去胺酶。胞嘧啶去胺酶將胞嘧啶水解為尿嘧啶並釋放氨。在生理條件下，經修飾之位點由核酸內切酶識別，接著DNA中的磷酸二酯鍵被破壞，藉由併入新的胞嘧啶開始修復。然而，胞嘧啶去胺酶亦可將5-氟胞嘧啶轉化為5-氟尿嘧啶(5-FU)。因此，在提供無毒前藥5- FC後，胞嘧啶去胺酶將其轉化為劇毒5-FU(亦即胸苷酸合成酶之自殺抑制劑)，從而抑制細胞生長及凋亡。

術語「誘導型」係指因應活化劑或起始劑之存在之反應或活性狀態。基因或酶可為誘導型，僅在特定分子存在下被活化或經歷表現。

術語「活化劑」或「起始劑」係指起始或活化基因、蛋白質或任何其他生物組分之活性或表現的分子、化學品、受質或劑。

術語「CAG啟動子」係指由融合至雞β-肌動蛋白(CAG)啟動子之钜細胞病毒(CMV)增強子組成之雜合核酸構築體。

術語「啟動子」係與蛋白質結合以起始自啟動子下游之DNA轉錄RNA之DNA序列。

「NKp46促效劑」係活化、上調或刺激NKp46之劑，無論是化學劑還是生物劑。NKp46促效劑可單獨使用或與兩種或更多種NKp46促效劑組合使用。在一些態樣中，NKp46促效劑包含可活化、上調或刺激NKp46之抗NKp46抗體(在本說明書中，可活化、上調或刺激NKp46之此類抗NKp46抗體有時稱為「抗NKp46抗體」或「抗NKp46促效抗體」)。此類抗NKp46抗體可包括但不限於純系9E2、4k12、n1D9、B-N40、B-L46、900、2B11A3、8F24及195314(R&D systems、Biolegend、Miltenyi biotec等)、NK細胞活化/擴增套組人類(Miltenyi biotec)及Cloudz人類NK細胞擴增套組(R&D systems)。此類抗體可為其功能片段，諸如Fd、Fv、Fab、F(ab')、F(ab)2、F(ab')2、單鏈Fv(scFv)、雙價抗體、三價抗體、F(ab)2、F(ab'2)、F(ab'2)、單鏈Fv(scFv)、雙價抗體、三價抗體、四價抗體及微型抗體。抗體可衍生自動物，諸如小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、綿羊、天竺鼠等。抗體之同型不受限制，且同型包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgD、IgE及IgM。

「CD30促效劑」係活化、上調或刺激CD30之劑，無論是化學劑還是生物劑。CD30促效劑可單獨使用或與兩種或更多種CD30促效劑組合使用。在一些態樣中，CD30促效劑包含可活化、上調或刺激CD30之抗CD30抗體(亦即，「抗CD30抗體」或「抗CD30促效抗體」)。此類抗CD30抗體可為但不限於純系#81316(R&D systems)。此類抗體可為其功能片段，諸如Fd、Fv、Fab、F(ab')、F(ab)2、F(ab')2、單鏈Fv(scFv)、雙價抗體、三價抗體、F(ab)2、F(ab'2)、F(ab'2)、單鏈Fv(scFv)、雙價抗體、三價抗體、四價抗體及微型抗體。抗體可衍生自動物，諸如小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、綿羊、天竺鼠等。抗體之同型不受限制，且同型包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgD、IgE及IgM。

抗體可為單株或多株抗體，較佳為單株抗體，且抗體亦可為人類化抗體、嵌合抗體及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。

此類抗體可藉由已知方法產生，例如藉由構築含有編碼抗體之核酸之表現載體、培養引入核酸之轉化體或培養產生抗體之雜交瘤。

術語「半胱天冬酶抑制劑」係指抑制半胱天冬酶之任何化學或生物劑。半胱天冬酶可以若干方式控制，包括藉由諸如FADD、APAF-1、Bcl-2家族成員、FLIP及IAP等分子之加工及活化調控。活性半胱天冬酶可由多種抑制劑控制，其中一些抑制劑包括病毒及細胞基因之產物，以及為研究及醫藥劑開發之人工半胱天冬酶抑制劑(Ekert等人Cell Death.Differ,1999年11月,6(11)：1081-6)。

如本文所用之「培養基(medium)」或「培養基(culture medium)」係指可用於使細胞長時間生長之營養物水溶液，亦即，用於細胞培養中之液體。

NK相關疾病可包含與異常NK功能相關之任何疾患或疾病。此類疾患或疾病可包括但不限於癌症、病毒感染，包括肺炎及其他病毒，諸如疱疹病毒及HIV、氣喘、I型糖尿病、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、發炎性腸病(潰瘍性結腸炎及克隆氏病(Crohn's disease))、乳糜瀉、皮肌炎、格雷夫斯病(Graves disease)、橋本甲狀腺炎、重症肌無力、牛皮癬、硬皮病、薛格連氏症候群(Sjogren's syndrome)及多發性硬化症。

如本文所用，術語疾病或疾患之「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指執行方案，該方案可包括向患者投與一或多種療法，以努力減輕疾病之徵像或症狀。在一些態樣中，治療降低疾病進展速率，改善或減輕疾病狀態，及/或促進緩解或改良預後。緩解可在疾病或疾患之徵像或症狀出現之前以及在其出現之後發生。因此，在一些態樣中，「治療(treating)」或「治療(treatment)」包括「預防(preventing)」或「預防(prevention)」疾病或不良疾患。然而，「治療(treating)」或「治療(treatment)」不需要完全緩解所有徵象及/或症狀，不需要治癒，且具體而言包括對患者僅具有邊際效應之方案。

在各個態樣中，可使用本文所述之經修飾細胞群體來治療有需要之個體之疾病或減輕與疾病(例如癌症)相關之症狀。在一些態樣中，經修飾細胞係NK或iNK細胞，其經CAR或TCR轉導及/或經修飾以展現內源MHC I類及MHC II類HLA基因之表現減少以及某些細胞中之異源基因之表現或表現增加，使得當此類細胞投與個體時，經修飾之細胞不太容易被個體之免疫系統殺死。

如本文所用，術語「ug」、「uL」及「uM」可分別與「μg」、「μL」及「μM」互換使用。

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習本揭示案所屬之技術者通常所理解相同的含義。例如，the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；及the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press為技術人員提供本揭示案中使用的許多術語之通用詞典。

單位、前綴及符號以其國際單位制(Système International de Unites，SI)接受之形式表示。數字範圍包括限定範圍之數字。除非另有指示，如本文所述，任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括所列舉範圍內之任何整數之值，且在適當時，包括其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。

本文所用之縮寫在本揭示案通篇中定義。本揭示案之各種態樣在以下小節中進一步詳細描述。

本文所述之各種態樣在以下小節中進一步詳細描述。

II.本揭示案之組合物

本揭示案之一些態樣係關於一種擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含：在NKp46促效劑存在下培養該CD56⁺/CD3^-細胞，其中該CD56⁺/CD3^-細胞包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子。本揭示案之一些態樣係關於一種擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含：在CD30促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞衍生自多能幹細胞(iPSC)。

本揭示案之一些態樣係關於一種產生經修飾CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含：(A)提供離體主體細胞產生，其包含造血前驅細胞(HPC)，其包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子，及(B)使該等HPC分化以產生一或多種CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含(C)在NKp46促效劑及/或CD30促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，HPC衍生自一或多種多能幹細胞。

II.A.本揭示案之方法

II.A.1.NKp46促效劑

本揭示案之一些態樣係關於產生及/或擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法。在一些態樣中，該方法包含在NKp46促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。任何NKp46促效劑均可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，NKp46促效劑為多肽。在一些態樣中，NKp46促效劑為特異性結合NKp46之抗體或其抗原結合部分(「抗NKp46抗體」)。在一些態樣中，NKp46促效劑包含小分子。

在一些態樣中，NKp46促效劑包含抗NKp46抗體。任何抗NKp46抗體均可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約100ng/ml至約10μg/ml抗NKp46抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約500ng/ml至約5μg/ml抗NKp46抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約100ng/ml、約150ng/ml、約200ng/ml、約250ng/ml、約300ng/ml、約350ng/ml、約400ng/ml、約450ng/ml、約500ng/ml、約600ng/ml、約700ng/ml、約800ng/ml、約900ng/ml、約1μg/ml、約2μg/ml、約3μg/ml、約4μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約7μg/ml、約8μg/ml、約9μg/ml或約10 μg/ml抗NKp46抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1μg/ml抗NKp46抗體接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進一步與至少一種細胞介素接觸。在一些態樣中，至少一種細胞介素選自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及IL-21。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-21接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-2及IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-2及IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-2及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-2及IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-2及IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-2、IL-10及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及IL-2、IL-7、IL-12、IL-15及IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑(較佳地，抗NKp46促效抗體)及IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及IL-21接觸。

本揭示案之一些態樣係關於一種產生iNK細胞之方法，該方法包含：(A)提供離體主體細胞產生，其包含造血前驅細胞(HPC)，其包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子，及(B)使該等HPC分化以產生一或多種CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含(C)在NKp46促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約1天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約2天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約3天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約4天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約5天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約6天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約7天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約8天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約9天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約10天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約11天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約12天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約13天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約14天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約15天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約16天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約17天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約18天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約19天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約20天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑接觸約21天。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與(i)NKp46促效劑、IL-2、IL-7、IL-15及IL-21、IL12及IL-18中之一或多者接觸以進行第一培養；且接著使 CD56⁺/CD3^-細胞與(ii)NKp46促效劑、IL-2、IL-7及IL-15接觸以進行第二培養。在一些態樣中，第一培養持續約1天。在一些態樣中，第一培養持續約2天。在一些態樣中，第一培養持續約3天。在一些態樣中，第一培養持續約4天。在一些態樣中，第一培養持續約5天。在一些態樣中，第一培養持續約6天。在一些態樣中，第一培養持續約7天。在一些態樣中，第一培養持續約8天。在一些態樣中，第一培養持續約9天。在一些態樣中，第一培養持續約10天。在一些態樣中，第一培養持續約11天。在一些態樣中，第一培養持續約12天。在一些態樣中，第一培養持續約13天。在一些態樣中，第一培養持續約14天。在一些態樣中，第二培養持續約1天。在一些態樣中，第二培養持續約2天。在一些態樣中，第二培養持續約3天。在一些態樣中，第二培養持續約4天。在一些態樣中，第二培養持續約5天。在一些態樣中，第二培養持續約6天。在一些態樣中，第二培養持續約7天。在一些態樣中，第二培養持續約8天。在一些態樣中，第二培養持續約9天。在一些態樣中，第二培養持續約10天。在一些態樣中，第二培養持續約11天。在一些態樣中，第二培養持續約12天。在一些態樣中，第二培養持續約13天。在一些態樣中，第二培養持續約14天。

在一些態樣中，重複第二培養以增加所產生細胞之數目。在一些態樣中，第二培養進行兩次。在一些態樣中，第二培養進行三次。在一些態樣中，第二培養進行四次。在一些態樣中，第二培養進行五次。在一些態樣中，第二培養進行六次。在一些態樣中，第二培養進行七次。在一些態樣中，第二培養進行八次。在一些態樣中，第二培養進行九次。在一些態樣中，第二培養進行十次。在一些態樣中，第二培養進行超過十次。

II.A.2.CD30促效劑

在一些態樣中，該方法包含在CD30促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。任何CD30促效劑均可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，CD30促效劑為多肽。在一些態樣中，CD30促效劑為特異性結合CD30之抗體或其抗原結合部分(「抗CD30抗體」)。在一些態樣中，CD30促效劑包含小分子。

在一些態樣中，CD30促效劑包含抗CD30抗體。任何抗CD30抗體均可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約100ng/ml至約10μg/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約250ng/ml至約2.5μg/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約100ng/ml、約150ng/ml、約200ng/ml、約250ng/ml、約300ng/ml、約350ng/ml、約400ng/ml、約450ng/ml、約500ng/ml、約600ng/ml、約700ng/ml、約800ng/ml、約900ng/ml、約1μg/ml、約2μg/ml、約3μg/ml、約4μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約7μg/ml、約8μg/ml、約9μg/ml或約10μg/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約200ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約225ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約250ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約275ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約300ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約325ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約350ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約375ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約400ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約500ng/ml抗CD30 抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約600ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約700ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約800ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約900ng/ml抗CD30抗體接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1μg/ml抗CD30抗體接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進一步與至少一種細胞介素接觸。在一些態樣中，至少一種細胞介素選自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及IL-21。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-21接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-2及IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-2及IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-2及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-2及IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-2及IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-2、IL-10、及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑及IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、及IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑(例如，抗CD30促效抗體)及IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及IL-21接觸。

本揭示案之一些態樣係關於一種產生iNK細胞之方法，該方法包含：(A)提供離體主體細胞產生，其包含造血前驅細胞(HPC)，其包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子，及(B)使該等HPC分化以產生一或多種CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含(C)在CD30促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸1天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸2天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸3天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸4天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸5天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸6天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸7天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸8天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸9天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸10天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸11天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸12天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸13天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸14天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸15天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸16天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸17天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸18天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸19天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸20天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸21天。

本揭示案之一些態樣係關於一種產生iNK細胞之方法，該方法包含：(A)提供離體主體細胞產生，其包含造血前驅細胞(HPC)，及(B)使該等HPC分化以產生一或多種CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含(C)在CD30促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸1天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸2天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸3天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸4天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸5天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸6天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸7天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸8天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸9天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸10天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸11天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸12天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸13天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸14天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸15天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸16天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸17天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸18天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸19天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸20天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD30促效劑接觸21天。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與(i)CD30促效劑、IL-2、IL-7、IL-15及IL-21、IL12及IL-18中之一或多者接觸以進行第一培養；且接著使CD56⁺/CD3^-細胞與(ii)CD30促效劑、IL-2、IL-7及IL-15接觸以進行第二培養。在一些態樣中，第一培養持續約1天。在一些態樣中，第一培養持續約2天。在一些態樣中，第一培養持續約3天。在一些態樣中，第一培養持續約4天。在一些態樣中，第一培養持續約5天。在一些態樣中，第一培養持續約6天。在一些態樣中，第一培養持續約7天。在一些態樣中，第一培養持續約8天。在一些態樣中，第一培養持續約9天。在一些態樣中，第一培養持續約10天。在一些態樣中，第一培養持續約11天。在一些態樣中，第一培養持續約12天。在一些態樣中，第一培養持續約13天。在一些態樣中，第一培養持續約14天。在一些態樣中，第二培養持續約1天。在一些態樣中，第二培養持續約2天。在一些態樣中，第二培養持續約3天。在一些態樣中，第二培養持續約4天。在一些態樣中，第二培養持續約5天。在一些態樣中，第二培養持續約6天。在一些態樣中，第二培養持續約7天。在一些態樣中，第二培養持續約8天。在一些態樣中，第二培養持續約9天。在一些態樣中，第二培養持續約10天。在一些態樣中，第二培養持續約11天。在一些態樣中，第二培養持續約12天。在一些態樣中，第二培養持續約13天。在一些態樣中，第二培養持續約14天。在一些態樣中，第二培養持續約15天。

在一些態樣中，該方法包含在NKp46促效劑及CD30促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，NKp46促效劑包含抗NKp46抗體，且CD30促效劑包含抗CD30抗體。任何抗NKp46抗體或抗CD30抗體均可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，用抗NKp46抗體擴增CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，抗NKp46抗體為板結合的。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約100ng/ml至約10μg/ml抗NKp46抗體及/或CD30促效劑接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約500ng/ml至約5μg/ml抗NKp46抗體及/或CD30促效劑接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約100ng/ml、約150ng/ml、約200ng/ml、約250ng/ml、約300ng/ml、約350ng/ml、約400ng/ml、約450ng/ml、約500ng/ml、約600ng/ml、約700ng/ml、約800ng/ml、約900ng/ml、約1μg/ml、約2μg/ml、約3μg/ml、約4μg/ml、約5μg/ml、約6μg/ml、約7μg/ml、約8μg/ml、約9μg/ml或約10μg/ml抗NKp46抗體及/或CD30促效劑接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1μg/ml抗NKp46抗體及/或CD30促效劑接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與板結合之NKp46抗體及約300ng/ml抗CD30抗體接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進一步與至少一種細胞介素接觸。在一些態樣中，至少一種細胞介素選自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及IL-21。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-21接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-2及IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-2及IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-2及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-2及IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-2及IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-2、IL-10及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑、CD30促效劑、及IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、及IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑(較佳地，抗NKp46促效性抗體)、CD30促效劑(較佳地，抗CD30促效性抗體)及IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及IL-21接觸。

本揭示案之一些態樣係關於一種產生iNK細胞之方法，該方法包含：(A)提供離體主體細胞產生，其包含造血前驅細胞(HPC)，其包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子，及(B)使該等HPC分化以產生一或多種CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含(C)在NKp46促效劑及CD30促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約1天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約2天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約3天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約4天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約5天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約6天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約7天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約8天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約9天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約10天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約11天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約12天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約13天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約14天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約15天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約16天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約17天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約18天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約19天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約20天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與NKp46促效劑及CD30促效劑接觸約21天。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與(i)NKp46促效劑、CD30促效劑、IL-2、IL-7、IL-15及IL-21、IL12及IL-18中之一或多者接觸以進行第一培養；且接著使CD56⁺/CD3^-細胞與(ii)NKp46促效劑、CD30促效劑、IL-2、IL-7及IL-15接觸以進行第二培養。在一些態樣中，第一培養持續約1天。在一些態樣中，第一培養持續約2天。在一些態樣中，第一培養持續約3天。在一些態樣中，第一培養持續約4天。在一些態樣中，第一培養持續約5天。在一些態樣中，第一培養持續約6天。在一些態樣中，第一培養持續約7天。在一些態樣中，第一培養持續約8天。在一些態樣中，第一培養持續約9天。在一些態樣中，第一培養持續約10天。在一些態樣中，第一培養持續約11天。在一些態樣中，第一培養持續約12天。在一些態樣中，第一培養持續約13天。在一些態樣中，第一培養持續約14天。在一些態樣中，第二培養持續約1天。在一些態樣中，第二培養持續約2天。在一些態樣中，第二培養持續約3天。在一些態樣中，第二培養持續約4天。在一些態樣中，第二培養持續約5天。在一些態樣中，第二培養持續約6天。在一些態樣中，第二培養持續約7天。在一些態樣中，第二培養持續約8天。在一些態樣中，第二培養持續約9天。在一些態樣中，第二培養持續約10天。在一些態樣中，第二培養持續約11天。在一些態樣中，第二培養持續約12天。在一些態樣中，第二培養持續約13天。在一些態樣中，第二培養持續約14天。在一些態樣中，第二培養持續約15天。

II.A.3.培養試劑

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約0.1至約100ng/ml IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約100ng/ml、約1至約90ng/ml、約1至約80ng/ml、約1至約70ng/ml、約1至約60ng/ml、約1至約50ng/ml、約1至約40ng/ml、約1至約30ng/ml、約1至約20ng/ml或約1至約10ng/ml IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約20ng/ml IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約10ng/ml IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約10至約20ng/ml IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約5至約15ng/ml IL-2接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1ng/ml、約2ng/ml、約3ng/ml、約4ng/ml、約5ng/ml、約6ng/ml、約7ng/ml、約8ng/ml、約9ng/ml、約10ng/ml、約11ng/ml、約12ng/ml、約13ng/ml、約14ng/ml、約15ng/ml、約16ng/ml、約17ng/ml、約18ng/ml、約19ng/ml、約20ng/ml、約30ng/ml、約40ng/ml、約50ng/ml、約60ng/ml、約70ng/ml、約80ng/ml、約90ng/ml或約100ng/ml IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約10ng/ml IL-2接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約0.1至約100ng/ml IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約100ng/ml、約1至約90ng/ml、約1至約80ng/ml、約1至約70ng/ml、約1至約60ng/ml、約1至約50ng/ml、約1至約40ng/ml、約1至約30ng/ml、約1至約20ng/ml或約1至約10ng/ml IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約20ng/ml IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約10ng/ml IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約10至約20ng/ml IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約5至約15ng/ml IL-7接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1ng/ml、約2ng/ml、約3ng/ml、約4ng/ml、約5ng/ml、約6ng/ml、約7ng/ml、約8ng/ml、約9ng/ml、約10ng/ml、約11ng/ml、約12ng/ml、約13ng/ml、約14ng/ml、約15ng/ml、約16ng/ml、約17ng/ml、約18ng/ml、約19ng/ml、約20ng/ml、約30ng/ml、約40ng/ml、約50ng/ml、約60ng/ml、約70ng/ml、約80ng/ml、約90ng/ml或約100ng/ml IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約10ng/ml IL-7接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約0.1至約100ng/ml IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約100ng/ml、約1至約90ng/ml、約1至約80ng/ml、約1至約70ng/ml、約1至約60ng/ml、約1至約50ng/ml、約1至約40ng/ml、約1至約30ng/ml、約1至約20ng/ml或約1至約10ng/ml IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約20ng/ml IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約10ng/ml IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約10至約20ng/ml IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約5至約15ng/ml IL-15接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1ng/ml、約2ng/ml、約3ng/ml、約4ng/ml、約5ng/ml、約6ng/ml、約7ng/ml、約8ng/ml、約9ng/ml、約10ng/ml、約11ng/ml、約12ng/ml、約13ng/ml、約14ng/ml、約15ng/ml、約16ng/ml、約17ng/ml、約18ng/ml、約19ng/ml、約20ng/ml、約30ng/ml、約40ng/ml、約50ng/ml、約60ng/ml、約70ng/ml、約80ng/ml、約90ng/ml 或約100ng/ml IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約10ng/ml IL-15接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約0.1至約100ng/ml IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約100ng/ml、約1至約90ng/ml、約1至約80ng/ml、約1至約70ng/ml、約1至約60ng/ml、約1至約50ng/ml、約1至約40ng/ml、約1至約30ng/ml、約1至約20ng/ml或約10至約20ng/ml IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約10至約30ng/ml IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約10至約20ng/ml IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約20至約30ng/ml IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約15至約25ng/ml IL-21接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約10ng/ml、約11ng/ml、約12ng/ml、約13ng/ml、約14ng/ml、約15ng/ml、約16ng/ml、約17ng/ml、約18ng/ml、約19ng/ml、約20ng/ml、約21ng/ml、約22ng/ml、約23ng/ml、約24ng/ml、約25ng/ml、約26ng/ml、約27ng/ml、約28ng/ml、約29ng/ml、約30ng/ml、約40ng/ml、約50ng/ml、約60ng/ml、約70ng/ml、約80ng/ml、約90ng/ml或約100ng/ml IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約20ng/ml IL-21接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約0.1至約100ng/ml IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約100ng/ml、約1至約90ng/ml、約1至約80ng/ml、約1至約70ng/ml、約1至約60ng/ml、約1至約50ng/ml、約10至約90ng/ml、約20至約80ng/ml、約30至約70ng/ml或約40至約60ng/ml IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約40至約60ng/ml IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約40至約50ng/ml IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約50至約60ng/ml IL-12接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約45至約55ng/ml IL-12接觸。

在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞與約40ng/ml、約41ng/ml、約42ng/ml、約43ng/ml、約44ng/ml、約45ng/ml、約46ng/ml、約47ng/ml、約48ng/ml、約49ng/ml、約50ng/ml、約51ng/ml、約52ng/ml、約53ng/ml、約54ng/ml、約55ng/ml、約56ng/ml、約57ng/ml、約58ng/ml、約59ng/ml、約30ng/ml、約40ng/ml、約50ng/ml、約60ng/ml、約70ng/ml、約80ng/ml、約90ng/ml、或約400ng/ml IL-12接觸。在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞與約50ng/ml IL-12接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約0.1至約100ng/ml IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約100ng/ml、約1至約90ng/ml、約1至約80ng/ml、約1至約70ng/ml、約1至約60ng/ml、約1至約50ng/ml、約10至約90ng/ml、約20至約80ng/ml、約30至約70ng/ml或約40至約60ng/ml IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約40至約60ng/ml IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約40至約50ng/ml IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約50至約60ng/ml IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約45至約55ng/ml IL-18接觸。

在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞與約40ng/ml、約41ng/ml、約42ng/ml、約43ng/ml、約44ng/ml、約45ng/ml、約46ng/ml、約47ng/ml、約48ng/ml、約49ng/ml、約50ng/ml、約51ng/ml、約52ng/ml、約53ng/ml、約54ng/ml、約55ng/ml、約56ng/ml、約57ng/ml、約58ng/ml、約59ng/ml、約 30ng/ml、約40ng/ml、約50ng/ml、約60ng/ml、約70ng/ml、約80ng/ml、約90ng/ml、或約400ng/ml IL-18接觸。在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞與約50ng/ml IL-18接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進一步與半胱天冬酶抑制劑接觸。任何半胱天冬酶抑制劑均可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，半胱天冬酶抑制劑包含Z-VAD-FMK。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1至約100μM Z-VAD-FMK接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約1μM、約2μM、約3μM、約4μM、約5μM、約6μM、約7μM、約8μM、約9μM、約10μM、約15μM、約20μM、約25μM、約30μM、約35μM、約40μM、約45μM、約50μM、約60μM、約70μM、約80μM、約90μM或約100μM Z-VAD-FMK接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與約10μM Z-VAD-FMK接觸。

在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞在封閉系統中擴增。

在一些態樣中，該方法包含使CD56⁺/CD3^-細胞擴增至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天或至少約21天。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進行第一培養約4天，且接著使CD56⁺/CD3^-細胞進行第二培養約10天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進行第一培養約3天，且接著使CD56⁺/CD3^-細胞進行第二培養約10天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進行第一培養約2天，且接著使CD56⁺/CD3^-細胞進行第二培養約10天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進行第一培養約4天，且接著使CD56⁺/CD3^-細胞進行第二培養約9天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進行第一培養約4天，且接著使CD56⁺/CD3^-細胞進行第二培養約8天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進行第一培養約4天，且接著使CD56⁺/CD3^-細胞進行第二培養約7天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進行第一培養約4天，且接著使CD56⁺/CD3^-細胞進行第二培養約11天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進行第一培養約4天，且接著使CD56⁺/CD3^-細胞進行第二培養約12天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進行第一培養約4天，且接著使CD56⁺/CD3^-細胞進行第二培養約13天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進行第一培養約4天，且接著使CD56⁺/CD3^-細胞進行第二培養約14天。

II.A.4.製造iNK細胞之新穎方法

本揭示案之一些態樣係關於產生及/或擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法。在一些態樣中，該方法包含在CD16促效劑存在下培養CD56⁺/CD3^-細胞。任何CD16促效劑均可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，CD16促效劑為多肽。在一些態樣中，CD16促效劑為特異性結合CD16之抗體或其抗原結合部分(「抗CD16抗體」)。在一些態樣中，CD16促效劑包含小分子。

在一些態樣中，CD16促效劑包含抗CD16抗體。任何抗CD16抗體均可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與塗佈有抗CD16抗體之培養容器接觸。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.1μg/cm²至約1μg/cm²抗CD16抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.4μg/cm²至約0.8μg/cm²抗CD16抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.5μg/cm²至約0.7μg/cm²抗CD16抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.6μg/cm²抗CD16 抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.1μg/cm²、0.2μg/cm²、0.3μg/cm²、0.4μg/cm²、0.5μg/cm²、0.6μg/cm²、0.7μg/cm²、0.8μg/cm²、0.9μg/cm²、1μg/cm²、1.5μg/cm²或2μg/cm²抗CD16抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.3μg/cm²抗CD16抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.4μg/cm²抗CD16抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.5μg/cm²抗CD16抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.6μg/cm²抗CD16抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.7μg/cm²抗CD16抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.8μg/cm²抗CD16抗體。在一些態樣中，培養容器塗佈有約0.9μg/cm²抗CD16抗體。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞進一步與至少一種細胞介素接觸。在一些態樣中，至少一種細胞介素選自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18及IL-21。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑及IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑及IL-7接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑及IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑及IL-21接觸。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑及IL-7及/或IL-2接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑及IL-7及IL-15接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑及IL-7及IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑及IL-7及IL-21接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑及IL-7、IL-15、及IL-18接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑(例如，抗CD16促效性抗體)及IL-7、IL-15、IL-18、及IL-21接觸。

本揭示案之一些態樣係關於一種產生iNK細胞之方法，該方法包含：(A)提供離體主體細胞產生，其包含造血前驅細胞(HPC)，及(B)使該等HPC分化以產生一或多種CD4^-細胞。在一些態樣中，該方法進一步包含(C)NK細胞之轉導。在一些態樣中，步驟(C)之方法包含使CD4^-細胞分化以產生一或多種NK細胞，活化及擴增NK細胞，及γ反轉錄病毒轉導NK細胞。在一些態樣中，步驟(C)之方法包含活化及擴增NK細胞及NK細胞之γ反轉錄病毒轉導。

在一些態樣中，該方法包含在CD16促效劑存在下，培養CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約1天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約2天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約3天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約4天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約5天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約6天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約7天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約8天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約9天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約10天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約11天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約12天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約13天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約14天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約15天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約16天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約17天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約18天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約19天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約20天。在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與CD16促效劑接觸約21天。

在一些態樣中，使CD56⁺/CD3^-細胞與(i)CD16促效劑、IL-7、IL-15、IL-18及IL-21接觸以進行第一培養；且接著使CD56⁺/CD3^-細胞與(ii)IL-7及IL-15接觸以進行第二培養。在一些態樣中，第一培養持續約1天。在一些態樣中，第一培養持續約2天。在一些態樣中，第一培養持續約3天。在一些態樣中，第一培養持續約4天。在一些態樣中，第一培養持續約5天。在一些態樣中，第一培養持續約6天。在一些態樣中，第一培養持續約7天。在一些態樣中，第一培養持續約8天。在一些態樣中，第一培養持續約9天。在一些態樣中，第一培養持續約10天。在一些態樣中，第一培養持續約11天。在一些態樣中，第一培養持續約12天。在一些態樣中，第一培養持續約13天。在一些態樣中，第一培養持續約14天。在一些態樣中，第二培養持續約1天。在一些態樣中，第二培養持續約2天。在一些態樣中，第二培養持續約3天。在一些態樣中，第二培養持續約4天。在一些態樣中，第二培養持續約5天。在一些態樣中，第二培養持續約6天。在一些態樣中，第二培養持續約7天。在一些態樣中，第二培養持續約8天。在一些態樣中，第二培養持續約9天。在一些態樣中，第二培養持續約10天。在一些態樣中，第二培養持續約11天。在一些態樣中，第二培養持續約12天。在一些態樣中，第二培養持續約13天。在一些態樣中，第二培養持續約14天。

II.B.本揭示案之細胞

任何細胞類型均可用於本文所揭示之組合物及方法中。在一些態樣中，細胞為免疫細胞。在一些態樣中，細胞為多能幹細胞(iPSC)。在一些態樣中，細胞為誘導多能幹細胞(iPSC)。在一些態樣中，細胞為胚胎幹細胞(ESC)。在一些態樣中，細胞為選自T細胞、NK細胞、NKT細胞或腫瘤浸潤淋巴球之免疫細胞。

在一些態樣中，細胞為自iPSC分化之細胞。在一些態樣中，細胞為自iPSC分化之免疫細胞。在一些態樣中，細胞為自iPSC分化之CD56⁺/CD3^-細胞。在一些態樣中，細胞為自iPSC分化之NK細胞。在一些態樣中，細胞為自iPSC分化之NKT細胞。

在一些態樣中，細胞為自iPSC分化之CD56⁺/CD3^-細胞，其中用編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子轉導iPSC。在一些態樣中，在iPSC細胞分化為CD56⁺/CD3^-細胞之前轉導iPSC細胞。因此，本揭示案之一些態樣係關於擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其中該細胞包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子。

在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞進一步包含至少一種編碼一或多種嵌合抗原受體(CAR)之外源核酸分子。在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞進一步包含編碼一或多種細胞介素或其模擬物之至少一種外源核酸分子。在一些態樣中，CD56⁺/CD3^-細胞進一步包含(i)編碼嵌合抗原受體(CAR)之至少一種外源核酸分子，及(ii)編碼細胞介素或其模擬物之至少一種外源核酸分子。在一些態樣中， CD56⁺/CD3^-細胞自iPSC分化，其中iPSC用(i)至少一種編碼嵌合抗原受體(CAR)之外源核酸分子，(ii)至少一種編碼細胞介素或其模擬物之外源核酸分子、(iii)自殺開關、或(iv)(i)-(iii)之任何組合轉導。

在一些態樣中，編碼細胞介素或其模擬物之至少一種外源核酸分子編碼IL-15多肽。在一些態樣中，IL-15多肽包含與人類IL-15(UniProt P40933)之胺基酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性的胺基酸序列。在一些態樣中，IL-15多肽包含人類IL-15(UniProt P40933)。在一些態樣中，編碼細胞介素或其模擬物之至少一種外源核酸分子編碼IL-15多肽模擬物。在一些態樣中，編碼細胞介素或其模擬物之至少一種外源核酸分子編碼包含IL-15之IL-15多肽，該IL-15連接至IL-15Rα以形成融合蛋白(IL-15Ra/IL-15複合物)(例如，US2021/0292713中所揭示之IL-15Ra/IL-15複合物，其以引用方式併入本文)。

II.C.治療方法

本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之疾病或疾患的方法，其包含向個體投與本文所揭示之組合物。在一些態樣中，該方法包含投與本文所揭示之經修飾或經工程改造之細胞。在一些態樣中，該方法包含投與本文所揭示之細胞群體。在一些態樣中，該方法包含投與包含CD56⁺/CD3^-細胞或iNK細胞、或CD56⁺/CD3^-細胞或iNK細胞之組合物以及醫藥學上可接受之載劑。

在一些態樣中，疾病或疾患包含NK相關疾病。

在一些態樣中，疾病或疾患包含癌症，例如，個體罹患有癌症。在一些態樣中，癌症包含骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球性白血病、兒童實體瘤、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發之癌症(包括石棉誘發之彼等癌症)或其任何組合。在一些態樣中，癌症為局部晚期的。在一些態樣中，癌症為轉移的。在一些態樣中，癌症為難治的。在一些態樣中，癌症為復發的。在一些態樣中，癌症在一或多種先前的抗癌療法後為難治的或復發的。在一些態樣中，該一或多種先前的抗癌療法包括標準護理療法。

在一些態樣中，本文所揭示之組合物與另外的抗癌療法組合投與。在一些態樣中，另外的抗癌療法包括化學療法、免疫療法、放射療法、手術或其任何組合。在一些態樣中，另外的抗癌療法包括化學療法。在一些態樣中，另外的抗癌療法包括免疫檢查點抑制劑。在一些態樣中，另外的抗癌療法包括PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、CTLA-4拮抗劑、LAG-3拮抗劑、GITR拮抗劑或其任何組合。在一些態樣中，抗癌療法包括特異性結合且抑制PD-1之抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，抗癌療法包括特異性結合且抑制PD-L1之抗體或其抗原結合部分。

在一些態樣中，該方法進一步包含在投與免疫細胞群之前預治療個體。在一些態樣中，在投與免疫細胞群之前向個體投與化學療法。在一些態樣中，在投與免疫細胞群之前向個體投與免疫耗竭化學療法。在一些態樣中，免疫耗竭化學療法包含環磷醯胺、氟達拉濱或兩者。

在一些態樣中，該方法包含向個體投與(i)擴增細胞群體及(ii)細胞介素。在一些態樣中，細胞介素包括IL-2、其類似物、其變異體或其片段。

在一些態樣中，本揭示案之細胞以至少約1 x 10⁶個細胞、至少約2 x 10⁶個細胞、至少約3 x 10⁶個細胞、至少約4 x 10⁶個細胞、至少約5 x 10⁶個細胞、1 x 10₇個細胞、至少約2 x 10⁷個細胞、至少約3 x 10⁷個細胞、至少約4 x 10⁷個細胞、至少約5 x 10⁷個細胞、1 x 10⁸個細胞、至少約2 x 10⁸個細胞、至少約3 x 10⁸個細胞、至少約4 x 10⁸個細胞、至少約5 x 10⁸個細胞、1 x 10⁹個細胞、至少約2 x 10⁹個細胞、至少約3 x 10⁹個細胞、至少約4 x 10⁹個細胞或至少約5 x 10⁹個細胞之劑量向個體投與。

本揭示案之細胞具有低毒性且因此可以任何便利方式安全地投與，包括藉由氣溶膠吸入、注射、攝取、輸液、植入或移植。本文所述之組合物可皮下、皮內、瘤內、結內、髓內、肌肉內、藉由靜脈內或淋巴內注射或腹膜內投與患者。在一個實施例中，本發明之細胞組合物較佳藉由靜脈內注射投與。

在本發明之某些實施例中，用於臨床態樣之本發明方法與有效治療包含如上所述NK相關疾病之疾病或疾患的其他劑組合。

II.D.細胞治療產品

本揭示案之一些態樣係關於一種包含複數個本文所揭示之經修飾細胞的細胞群體。本揭示案之一些態樣係關於一種包含本文所揭示之經修飾細胞群體的細胞群。在一些態樣中，細胞群體經冷凍保存。細胞(例如免疫細胞)之任何冷凍保存方法均可用於本文所揭示之方法及組合物中。在一些態樣中，細胞在DMSO存在下冷凍保存。在一些態樣中，細胞療法經冷凍保存以利於細胞之運輸。

本文所揭示之細胞療法及/或細胞群體可進一步與一或多種賦形劑一起調配。可保存細胞之任何賦形劑均可用於本文所揭示之方法及組合物中。在一些態樣中，細胞療法及/或細胞群體與一或多種允許冷凍保存細胞之賦形劑(例如DMSO)一起調配。

在一些態樣中，細胞群體包含複數個本文所揭示之經修飾細胞及一或多種額外細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、或至少約95%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約10%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約20%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約25%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約30%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約40%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約50%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約60%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約65%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約70%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約75%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約80%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。在一些態樣中，細胞群體中至少約90%之細胞包含複數個本文所揭示之經修飾細胞。

除非另有說明，否則本揭示案之實踐將採用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉殖基因生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習知技術，它們在此項技術範圍內。此類技術在文獻中有充分解釋。參見例如Sambrook等人編(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人編(1992)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover編,(1985)DNA Cloning,第I及II卷；Gait編(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning；the treatise,Methods In Enzymology (Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller及Calos編(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人編,Methods In Enzymology,第154及155卷；Mayer及Walker編(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir及Blackwell編,(1986)Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986))；Crooke,Antisense drug Technology：Principles,Strategies and Applications,第2版 CRC Press(2007)以及Ausubel等人.(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。

上面引用之所有參考文獻以及本文引用之所有參考文獻均以引用方式整體併入本文。

以下實例以例示而非限制之方式提供。

實例

實例1

NKp46轉導之誘導多能幹細胞之產生

為產生NKp46轉導之誘導多能幹細胞(iPSC)，將iPSC株Ff101s04以1 x 10⁴個細胞/孔接種於具有StemFit AK03N培養基(含有50μM Y-27632(一種選擇性p160ROCK抑制劑))的iMatrix511塗佈24孔板中。第二天，用StemFit AK03N替換培養基，且將在CAG啟動子控制下表現NKp46基因(SEQ ID NO：1)之慢病毒載體感染iPSC以產生FfI01s04/CAG-NKp46細胞。將增殖之FfI01s04/CAG-NKp46細胞用偶聯有抗別藻藍蛋白之抗NKp46抗體(APC,BioLegend)染色，且藉由流式細胞術進行分析以量化表現NKp46之細胞的數目。在未轉導之iPSC及CAG-NKp46轉導之iPSC中表現NKp46之細胞的數目示於圖1中。

實例2

iNK細胞自NKp46轉導之iPSC分化

為了將不變的自然殺手(invariant natural killer，iNK)細胞自NKp46轉導之iPSC分化，於第0天將FfI01s04/NKp46細胞分散於StemFit AK03N培養基中，且在低氧(5% O₂)條件下，以5x10⁵個細胞/孔接種於超低黏附處理之6孔板中。StemFit AK03N培養基包括10μM CHIR99021(GSK-3抑制劑)及10μM Y-27632。第二天(第1天)，將細胞分散於人類多能幹細胞(HPC)誘導培養基(Invitrogen)中，其含有骨形態發生蛋白4(BMP4)之(50ng/ml，R&D systems)、血管內皮生長因子(VEGF，50ng/ml，R&D systems)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF，50ng/ml，Wako)及抗壞血酸2-磷酸鹽(50mg/ml，Sigma Aldrich)。HPC誘導培養基包括補充有L-麩醯胺酸(4mM,Sigma Aldrich)、青黴素(100U/ml,Sigma Aldrich)、鏈黴素(100mg/ml,Sigma Aldrich)、人類胰島素(10mg/ml,Invitrogen)、人類運鐵蛋白(5.5mg/ml,Invitrogen)、亞硒酸鈉(6.7ng/ml,Invitrogen)、Glutamax(1x,Invitrogen)及α-單硫代甘油(0.4mM,Invitrogen)的StemPro34。在第2天，將活化素受體樣激酶受體之SB431542抑制劑(培養基中之6μM，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)直接添加至培養基中，且將細胞培養2天。第4天，將細胞重新分散於另一種含有VEGF(50ng/ml)、bFGF(50ng/ml)、SCF(50ng/ml，R&D systems)及抗壞血酸2-磷酸鹽(50mg/ml)之HPC誘導培養基中，且再培養3天。在第7天，將細胞暴露於另一種含有VEGF(50ng/ml)、bFGF(50ng/ml)、SCF(50ng/ml)、抗壞血酸2-磷酸鹽(50mg/ml)、TPO(30ng/ml,Peprotech)及Flt3L(10ng/ml,Peprotech)的HPC誘導培養基，且使用該培養基再培養7天。在此7天培養期期間，每2-3天更換一次培養基。

在第14天，收穫細胞且藉由CD34-微珠(Miltenyi Biotech)分離CD34陽性細胞且以1.16 x 10⁵個細胞/皿接種於10cm培養皿中。每個10cm培養皿都塗佈有rh-DLL4/Fc嵌合體(Sino Biological)及RetroNectin(Takara Bio Inc.)。在此培養期期間，每2-3天更換一次培養基。補充有15%胎牛血清(FBS，Hyclone)、1x Glutamax、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100mg/ml鏈黴素、55μM 2-巰基乙醇、50mg/ml抗壞血酸2-磷酸鹽、10mg/ml人類胰島素、5.5mg/ml人類轉鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7(Peprotech)、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580(Tocris)、30nM基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α，Peprotech)之MEMα培養基(Gibco，Thermo Fisher Scientific)用作培養此等細胞之培養基。在第21天，收穫細胞且以1 x 10⁶個細胞/皿接種於新鮮塗佈有hDLL4/RetroNectin之新的15cm培養皿中，且在第35天收穫所有細胞。

第35天，將收穫細胞以5 x 10⁵個細胞/皿接種於48孔板中的補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100mg/ml鏈黴素、50mg/ml抗壞血酸2-磷酸鹽、10mg/ml人類胰島素、5.5mg/ml人類轉鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、10ng/ml IL-2(Peprotech)及10ng/ml IL-7的MEMα培養基中。在第39天，每孔中更換一半培養基，且在第42天，收穫所有細胞作為分化iNK細胞。用如表2中所列之抗體對iNK細胞染色，且藉由流式細胞儀分析表現NKp46之細胞之數目及CD56⁺/CD3^-表型細胞之細胞數目，分別如圖2A及圖2B中所示。結果指示，表現NKp46之細胞佔細胞群體之良好百分比，且CD56⁺/CD3^-佔細胞群之約83.2%。

實例3

iNK細胞之擴增

將iNK細胞以5x10⁴個細胞/孔接種於96孔板中，且藉由抗NKp46/CD2抗體偶聯之珠粒(Miltenyi)在補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、50μg/ml抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、10ng/ml IL-2、10ng/ml IL-7、10ng/ml IL-15(Peprotech)、20ng/ml IL-21(Peprotech)、50ng/ml IL-12(Peprotech)、50ng/ml IL-18(MBL)、300ng/ml抗CD30抗體(R&D systems)及10μM Z-VAD-FMK(半胱天冬酶抑制劑，R&D systems)之Iscove改良達爾伯克培養基(IMDM)中擴增。培養4天之後，將細胞以1 x 10⁶個細胞/孔轉移至G-Rex24中的補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、50μg/ml抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、10ng/ml IL-2、10ng/ml IL-7、10ng/ml IL-15之IMDM培養基中。在另外10天之培養期間，每2-3天更換一次培養基。iNK細胞之重複可擴增性繪製成圖，如圖3所示。以相同方法擴增自NKp46未轉導iPSC分化之iNK細胞。如表3中所示，在此條件下，iNK細胞之擴增速率較低。

如表4中所指示，將擴增之iNK細胞用抗體染色，且藉由流式細胞儀分析NKG2D、CD56、CD16及CD3之表現，如圖4A至圖4D中所示。如圖4A所示，NKp46⁺及CD56⁺細胞佔細胞群之約98.3%。如圖4B所示，NKp46⁺及CD3^-細胞佔細胞群之約97.2%。如圖4C所示，NKp46⁺及NKG2D⁺細胞佔細胞群之約52%。如圖4D所示，NKp46⁺及CD16⁺細胞佔細胞群之約50.9%。

實例4

抗CD30抗體對iNK細胞擴增之影響

在第1天，在藉由實例3中之方法進行兩次擴增後，將冷凍保存且收穫之第13天iNK細胞在補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、50μg/ml抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、10ng/ml IL-2、10ng/ml IL-7、10ng/ml IL-15(Peprotech)之Iscove改良達爾伯克培養基(IMDM)中培養1天。將iNK細胞以2 x 10⁶個細胞/孔接種於T25燒瓶中，且在第0天，在存在或不存在300ng/ml抗CD30抗體(81316，R&D systems)的情況下，在補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、50μg/ml抗壞血酸2-磷酸鹽、 10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、10ng/ml IL-2、10ng/ml IL-7、10ng/ml IL-15(Peprotech)、20ng/ml IL-21(Peprotech)、50ng/ml IL-12(Peprotech)、50ng/ml IL-18(MBL)及10μM Z-VAD-FMK(半胱天冬酶抑制劑，R&D systems)之IMDM中藉由板結合之抗NKp46抗體(單株小鼠IgG2B純系#195314，R&D systems)擴增。

培養3天之後，將細胞以5 x 10⁶個細胞/孔轉移至G-Rex6中的補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、50μg/ml抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、10ng/ml IL-2、10ng/ml IL-7、及10ng/ml IL-15之IMDM培養基中。在另外11天培養期間每2-3天更換一次培養基，且在第14天檢查可擴增性(第3次擴增)。自實例4之第0天至第14天藉由相同方案檢查重複可擴增性(第4次擴增)。

在存在或不存在抗CD30抗體之情況下，iNK細胞之可擴增性示於圖5A及圖5B中。如表5中所示，與具有抗CD30抗體條件相比，不具有抗CD30抗體之iNK細胞之擴增速率較低。

實例5

抗CD30抗體對iNK細胞之活體內持久性之影響

在第4次擴增之第0天，將所收穫第3次擴增第14天iNK細胞以1x 10⁷個細胞/孔接種於T75燒瓶中，且在存在或不存在300ng/ml抗CD30抗體(81316，R&D systems)的情況下，在補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、50μg/ml抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、10ng/ml IL-2(Peprotech)、10ng/ml IL-7(Peprotech)、10ng/ml IL-15(Peprotech)、20ng/ml IL-21(Peprotech)、50ng/ml IL-12(Peprotech)、50ng/ml IL-18(MBL)及10μM Z-VAD-FMK(半胱天冬酶抑制劑，R&D systems)之Iscove改良達爾伯克培養基(IMDM)中藉由板結合之抗NKp46抗體(R&D systems)活化。

培養3天後，在存在或不存在300ng/ml抗-CD30抗體(81316,R&D systems)的情況下，將細胞以5 x 10⁶個細胞/孔轉移至G-Rex6中的補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、50μg/ml抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、10ng/ml IL-2、10ng/ml IL-7、10ng/ml IL-15(Peprotech)、20ng/ml IL-21(Peprotech)、50ng/ml IL-12(Peprotech)、及50ng/ml IL-18(MBL)之IMDM培養基中。

在第5天，在活化後，將細胞以2 x 10⁷個細胞/孔轉移至G-Rex6中且在第7天收穫。將此等細胞冷凍保存於CS10(BioLife Solutions)中且在即將靜脈內投與8週齡NOG小鼠(0.5或1 x 10⁷個細胞/小鼠，N=3)前解凍。投與後每週，收集外周血且藉由FACS溶解溶液(BD)固定，然後用小鼠CD45-PE抗體(BioLegend)及人類CD45-BV510抗體(BioLegend)染色。藉由流式細胞儀計算iNK細胞在活體內持續存在時小鼠CD45陰性及人類CD45陽性細胞之數目。如圖6所示，用抗CD30抗體擴增之iNK細胞顯示出更高之活體內持久性。

實例6

iPS細胞分化成HP細胞主體

QHJI細胞為iPS細胞株，衍生自健康個體之外周血單核細胞。在第0天，將分散於StemFit完全培養基中之QHJI細胞在低氧(5% O₂)條件下以6x 10⁵個細胞/孔接種在超低黏附處理之6孔板中。StemFit完全培養基包括10μM CHIR99021及50μM Y-27632。在第1天，將QHJI細胞分散於含有BMP4(50ng/mL)、VEGF(50ng/ml)、bFGF(50ng/mL)及抗壞血酸2-磷酸鹽(50μg/mL)之造血前驅細胞(HPC)分化培養基中。HPC誘導培養基包括補充有人類胰島素(10μg/mL)、人類轉鐵蛋白(5.5μg/mL)、亞硒酸鈉(6.7ng/mL)、L-麩醯胺酸(2mM)及α-單硫代甘油(0.4mM)的StemPro34。

在第2天，將SB431542(培養基中6μM)添加至培養基(亦即含有細胞之HPC分化培養基)中，且將細胞培養2天。在第4天，將細胞重新分散於另一種含有VEGF(50ng/mL)、bFGF(50ng/mL)、SCF(50ng/mL)及抗壞血酸2-磷酸鹽(50μg/mL)之培養基中，且再培養3天。在第7天，將細胞暴露於另一種含有VEGF(50ng/mL)、bFGF(50ng/mL)、SCF(50ng/mL)、抗壞血酸2-磷酸鹽 (50μg/mL)、TPO(30ng/mL)及Flt3L(10ng/mL)的培養基，且使用該培養基再培養7天。在此7天培養期期間，每2-3天更換一次培養基。

實例7

使HP細胞主體分化為包含CD4 ^- 細胞之群體

在第14天，將未進行任何細胞分離之自實例6獲得之細胞群(「HP細胞主體」)以3.12 x 10⁶個細胞/皿接種在15cm培養皿中，且在37℃、5% O₂下培養。值得注意地，可使用各種接種密度，且前述接種密度為一個實例。每個15cm培養皿都塗佈有rh-DLL4/Fc嵌合體(Sino Biological)及RetroNectin(Takara Bio Inc)。在此培養期期間，每2-3天更換一次培養基。補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/mL青黴素、100μg/ml鏈黴素、55μM 2-巰基乙醇、50μg/mL抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/mL人類胰島素、5.5μg/mL人類轉鐵蛋白、6.7ng/mL亞硒酸鈉、50ng/mL SCF、50ng/mL IL-7、50ng/mL Flt3L、100ng/mL TPO、15μM SB203580、30nM SDF-1α之MEMα(Thermo Fisher Scientific(Gibco))用作培養此等細胞之培養基。在第21天，將細胞傳代到新鮮塗佈有hDLL4/RetroNectin之15cm培養皿中。在第28天，將細胞進一步傳代到新鮮塗佈有hDLL4/RetroNectin之15cm培養皿中。在第35天，收穫包括CD4^-細胞在內之所有細胞。

實例8

NK細胞之轉導

A.主體分化為NK細胞主體

在第35天，將包含CD4^-細胞之細胞群(亦即未經任何細胞分離之自實例7獲得之細胞)以1 x 10⁶個細胞/孔接種在48孔板中，且在37℃下在5% CO₂下培養三天。補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/mL青黴素、100ng/mL鏈黴素、50μg/mL抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/mL人類胰島素、5.5μg/mL人類轉鐵蛋白、6.7ng/mL亞硒酸鈉、500ng/mL抗CD3抗體(UCHT1,R&D Systems)、10ng/mL IL-2及10ng/mL IL-7之MEMα培養基用作培養基。

在第38天，將細胞分散於另一MEMα培養基，其補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/mL青黴素、100ng/mL鏈黴素、50μg/mL抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/mL人類胰島素、5.5μg/mL人類轉鐵蛋白、6.7ng/mL亞硒酸鈉、10ng/mL IL-2及10ng/mL IL-7，用作培養基。在第42天，收穫所有細胞，包括NK細胞(「NK細胞主體」)。

B.NK細胞之活化及擴增

在第41天，在4℃下用纖維連接蛋白(0.15ug/cm²)及抗CD3抗體(UCHT1，R&D Systems)(0.6μg/cm2)或抗CD16抗體(3G8，Biogems)(0.6μg/cm²)塗佈組織培養容器16h。在第42天，將自實例8A收穫之NK細胞重懸浮於補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/mL青黴素、100ng/mL鏈黴素、50μg/mL抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/mL人類胰島素、5.5μg/mL人類轉鐵蛋白、6.7ng/mL亞硒酸鈉、500ng/mL抗CD3抗體(UCHT1)、10ng/mL IL-7、50ng/mL IL-15、50ng/mL IL-18、20ng/mL IL-21、10μM Z-VAD-FMK半胱天冬酶抑制劑及300ng/mL抗CD30抗體(81316,R&D Systems)之IMDM培養基(Thermo Fisher Scientific(Gibco))中至1x10⁵個細胞/mL且轉移至經抗CD3塗佈之容器中培養三天。

在第45天，收集細胞且轉移至經γ反轉錄病毒塗佈之容器用於病毒轉導，如下文實例8C中所述，或分散於補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/mL青黴素、100ng/mL鏈黴素、50μg/mL抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/mL人類胰島素、5.5μg/mL人類轉鐵蛋白、6.7ng/mL亞硒酸鈉、10ng/mL IL-7或10ng/mL IL-2及10ng/mL IL-15之新IMDM培養基中，且轉移至G-Rex容器(Wilson Wolf)中再培養11天。IL-7與抗CD3抗體一起使用，且IL-2與抗CD16抗體一起使用。每2-3天用相同培養基組成進行50-80%新鮮培養基更換，且若細胞濃度超過4 x 10⁷個細胞/cm²，則將細胞分流至額外G-Rex容器中。在第56天，收穫細胞以供最終使用。

若有必要獲得足夠數目之細胞，則將本文所述之15天過程(第41天-第56天)重複多次以增加所產生之NK細胞之總數。對於iNK-CD19 CAR細胞，細胞經歷5輪活化(5 x 15天過程)，且在第2次活化中進行CAR轉導。對於iNK-Meso CAR細胞，細胞經歷4輪活化(4 x 15天過程)，且在第3次活化中進行CAR轉導。

C.NK細胞之γ反轉錄病毒轉導。

對於NK細胞之γ反轉錄病毒轉導，在第44天，組織培養容器在4℃下用纖維連接蛋白(10.5μg/cm²)塗佈16h。在第45天，將γ反轉錄病毒在32℃下在纖維連接蛋白塗佈之容器上培育2h，且隨後收穫。在第45天，將實例8B中所述之NK細胞在32℃下以300 x g離心至經纖維連接蛋白/γ反轉錄病毒塗佈之容器上持續5分鐘且培養隔夜。若需要達成更高百分比之經轉導細胞，則重複第44天至第45天所述之步驟以進行兩次γ反轉錄病毒轉導。第46天(或若進行兩次γ反轉錄病毒轉導，第47天)，將細胞收集、分散於補充有15% FBS、4mM L-麩醯胺酸、100U/mL青黴素、100ng/mL鏈黴素、50μg/mL抗壞血酸2-磷酸鹽、10μg/mL人類胰島素、5.5μg/mL人類轉鐵蛋白、6.7ng/mL亞硒酸鈉、 10ng/mL IL-7或10ng/mL IL-2及10ng/mL IL-15之IMDM培養基中，且轉移至G-Rex容器(Wilson Wolf)中。隨後，每2-3天用相同培養基組成進行75%培養基更換，且若細胞濃度超過4 x 10⁷個細胞/cm²，則將細胞分流至額外G-Rex容器中。在第56天，收穫細胞以供最終使用。

若有必要，將實例8B所述之15天過程(第41天至第56天)另外重複多次以增加所產生之iNK細胞之總數。對於iNK-CD19 CAR細胞，細胞經歷5輪活化(5 x 15天過程-與第41天至第56天相同之過程)，且在第2次活化進行CAR及IL-15Ra/IL-15基因轉導。對於iNK-Meso CAR細胞，細胞經歷4輪活化(4 x 15天過程-與第41天至第56天相同之過程)，且在第3次活化進行CAR及IL-15Ra/IL-15基因轉導。

表6示出不同培養條件及基於各培養條件之CAR⁺及總細胞計數。彼等細胞用於實例10中之活體內研究。

實例9

CAR-NK細胞製備

NK細胞進一步經修飾以表現一或多種CAR。NK細胞藉由以下各者經修飾：(1)合成抗CD19 CAR基因或抗間皮素CAR基因及IL-15Rα/IL-15基因；(2)製備含有抗CD19 CAR基因或抗間皮素CAR基因及IL-15Rα/IL-15基因之逆轉錄病毒載體；及(3)用含有抗CD19 CAR基因或抗間皮素CAR基因及IL-15Rα/IL-15基因之逆轉錄病毒載體轉導NK細胞。

CAR/IL15-NK細胞製備

抗CD19 CAR基因藉由合成經設計以自N端排列之寡肽來製備，如表6所示。

根據US2021/0292713構築抗CD19 CAR，該文獻以引用方式整體併入本文。根據WO2023/009700構築抗間皮素CAR，該文獻以引用方式整體併入本文。

實例10

iNK-CD19 CAR之活體內抗腫瘤活性

經由尾靜脈將表現螢光素酶之Nalm6細胞(ATCC；癌細胞)(5 x 105個細胞)移植至NOD/Shi-scid、IL-2Rγ空小鼠(「NSG小鼠」)中。8-9週齡之雌性NSG小鼠來源於The Jackson Laboratory。在第4天，在移植Nalm6細胞四天後，經由尾靜脈向移植Nalm6之NSG小鼠投與分散於0.2ml PBS中之iNK-CD19 CAR細胞(10 x 10⁶個CAR⁺細胞)或無細胞之僅0.2ml PBS。在投與iNK-CD19 CAR細胞或PBS後，經由尾靜脈向小鼠投與螢光素。使用IVIS成像系統(PerkinElmer)量測螢光素酶活性持續42天。

圖7A及圖7B示出(1)PBS治療(媒劑對照)、(2)用實例6-8中所述之細胞培養物及抗CD3抗體活化產生之iNK-CD19 CAR細胞(「iNK-CD19 CAR #1)及(3)用實例6-8中所述但不包括實例8A之細胞培養方法且用抗CD-16抗體活化產生之iNK-CD19 CAR細胞(「iNK-CD19 CAR #2)。雖然截至腫瘤細胞輸注後第14天在PBS媒劑治療組中觀察到可偵測之腫瘤生長且自該時間點開始逐漸增加，但在兩個iNK-CD19 CAR組中，直至第28天才觀察到腫瘤細胞之顯著擴增。圖7C繪示在研究過程中小鼠之體重變化百分比。雖然PBS對照組截至第28天展現顯著(>20%)體重減輕，但iNK-CD19 CAR#1組直至第42天才達成此終點，且iNK-CD19 CAR#2組從未達到此水準體重減輕。總之，此等資料證明iNK-CD19 CAR細胞減少活體內Nalm6腫瘤細胞增殖之能力。

實例11

iNK-間皮素CAR細胞之活體外重複殺傷能力

使用表現高水準間皮素蛋白之表現紅色螢光蛋白(RFP)之GSU腫瘤細胞及iNK-間皮素CAR細胞(iNK-Meso CAR細胞)進行重複抗原刺激(RAS)檢定。將GSU-RFP細胞以每孔1 x 10⁵個細胞接種於96孔板中，且使其生長隔夜。第二天，將(1)無細胞、(2)1 x 10⁵個未轉導(UTD)iNK或(3)1 x 10⁵個iNK-Meso CAR細胞添加至各孔中。藉由Incucyte每4小時量測各孔之RFP陽性表面積。

為重複攻擊iNK細胞，每2-3天將額外1 x 10⁵個細胞GSU-GFP細胞添加至各孔中。此過程在本文中稱為「攻擊」。總共進行四次攻擊。

圖8繪示在研究過程中GSU腫瘤細胞之生長，其經由每孔每影像之總RFP陽性表面積來量測。GSU細胞在僅腫瘤細胞條件下連續生長，直至約120小時，此時孔變得過度融合。相比之下，UTD及iNK-Meso CAR細胞顯著降低腫瘤細胞生長速率。UTD iNK細胞在一次攻擊中完全抑制腫瘤生長，而iNK-Meso CAR細胞在兩次攻擊中控制腫瘤細胞生長。此等結果證明，雖然UTD iNK細胞具有一定的先天性腫瘤控制能力，但CAR轉導進一步增加iNK細胞殺死腫瘤細胞之能力。

實例12

iNK-Meso CAR之活體內抗腫瘤活性

經由腹膜內注射將表現螢光素酶之GSU細胞(1 x 10⁶個細胞)移植至NOD/Shi-scid、IL-2R γ空小鼠(「NSG小鼠」)中。8-9週齡之雌性NSG小鼠來源於The Jackson Laboratory。

在移植Nalm6細胞四天後，經由尾靜脈向移植GSU之NSG小鼠投與分散於0.2ml PBS中之iNK-Meso CAR細胞(20 x 10⁶個細胞)或無細胞之0.2ml PBS。在投與iNK-Meso細胞或PBS後，經由腹膜內注射向小鼠投與螢光素。使用IVIS成像系統(PerkinElmer)量測螢光素酶活性持續31天。下表8示出兩個研究組：單獨PBS及iNK-Meso CAR細胞。

圖9A及圖9B示出在用(1)PBS(媒劑對照)或(2)iNK-Meso CAR細胞治療之小鼠中藉由螢光素酶活性量測之腫瘤生長。相對於PBS對照，用iNK- Meso CAR細胞治療顯著延遲了腫瘤生長，此指示iNK-Meso CAR細胞具有抗腫瘤活性。

另外，收集外周血樣品以藉由流式細胞術評估人類CD45之活體內iNK-Meso CAR細胞增殖，該CD45僅存在於輸注之iNK-Meso CAR細胞上。圖10A及圖10B示出iNK-Meso CAR細胞隨時間推移之細胞生長動力學，其由人類CD45⁺細胞之總活細胞之百分比及每μL小鼠外周血之人類CD45⁺細胞之絕對數目指示。在第4天(評估之最早時間點)時可偵測到一些iNK-Meso CAR細胞。然而，iNK-Meso CAR細胞水準繼續增加，最終在第11天達到峰值。自第4天至第11天可偵測到之iNK細胞之增加指示iNK-Meso CAR細胞可在活體內小鼠模型系統中增殖。

應瞭解，實施方式部分而非發明內容及摘要部分意欲用於解釋申請專利範圍。發明內容及摘要部分可闡述如發明人所設想之本揭示案之一或多個但非全部示範性實施例，且因此不意欲以任何方式限製本揭示案及所附申請專利範圍。

特定實施例之前述描述將如此充分地揭示本揭示案之一般性質，以致其他人可在不背離本揭示案之一般概念的情況下藉由應用所屬領域之技術內之知識，容易地修改及/或改編此類特定實施例之各種應用，而無需過度實驗。因此，基於本文所呈現之教示及指導，此類改編及修改意欲在所揭示實施例之等效物之含義及範圍內。應理解，本文中之措辭或術語係出於描述而非限制之目的，使得本說明書之術語或措辭將由熟習此項技術者根據教示及指導來解釋。

本揭示案之廣度及範疇不應受上述示範性實施例中之任一者限制，而應僅根據所附申請專利範圍及其等效物來定義。

本申請案通篇引用之所有引用之參考文獻(包括文獻參考文獻、美國或外國專利或專利申請案及網站)之內容特此以引用方式明確併入，如同出於任何目的其全文書寫於本文中，其中所引用之參考文獻亦如此。在出現任何不一致之處，以本文字面揭示之材料為準。

雖然已例示及描述各種特定態樣，但以上說明書並非限制性的。應瞭解，可在不脫離本發明之精神及範疇之情況下進行各種改變。熟習此項技術者在閱讀本說明書後將明瞭許多變化。

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Claims

一種擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含：

在NKp46促效劑存在下培養該CD56⁺/CD3^-細胞，其中，該CD56⁺/CD3^-細胞包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子。
如請求項1所述之方法，其中，該CD56⁺/CD3^-細胞衍生自多能幹細胞。
如請求項2所述之方法，其進一步包含用編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子轉導該多能幹細胞。
如請求項2或3所述之方法，其中，該多能幹細胞為誘導多能幹細胞(iPSC)。
如請求項1至4中任一項所述之方法，其中，該NKp46促效劑為抗NKp46抗體。
如請求項1至5中任一項所述之方法，其中，在該NKp46促效劑及至少一種細胞介素存在下培養該CD56⁺/CD3^-細胞。
如請求項6所述之方法，其中，該至少一種細胞介素包含介白素-(IL)2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其任何組合。
如請求項1至7中任一項所述之方法，其中，該CD56⁺/CD3^-細胞進一步包含至少一種外源核酸分子，其編碼(i)一或多種嵌合抗原受體(CAR)，及/或(ii)一或多種細胞介素或其模擬物。
如請求項8所述之方法，其中，該細胞介素或其模擬物為IL-15。
如請求項9所述之方法，其中，該IL-15連接至IL-15Rα以形成融合蛋白。
一種產生經修飾CD56⁺/CD3^-細胞之方法，該方法包含：

(A)提供包含造血前驅細胞(HPC)之離體主體細胞產生，其包含編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子，及

(B)使該等HPC分化以產生一或多種CD56⁺/CD3^-細胞。
如請求項11所述之方法，其進一步包含：

(C)在NKp46促效劑存在下培養該等CD56⁺/CD3^-細胞。
如請求項11或12所述之方法，其中，該等HPC衍生自一或多種多能幹細胞。
如請求項13所述之方法，其進一步包含用編碼一或多種NKp46多肽之至少一種外源核酸分子來轉導該一或多種多能幹細胞。
如請求項13或14所述之方法，其中，該等多能幹細胞為iPSC。
如請求項11至15中任一項所述之方法，其中，該NKp46促效劑為抗NKp46抗體。
如請求項11至16中任一項所述之方法，其中，在該NKp46促效劑及至少一種細胞介素存在下培養該CD56⁺/CD3^-細胞。
如請求項17所述之方法，其中，該至少一種細胞介素包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其任何組合。
如請求項11至18中任一項所述之方法，其中，該等CD56⁺/CD3^-細胞進一步包含至少一種外源核酸分子，其編碼(i)一或多種嵌合抗原受體(CAR)，及/或(ii)一或多種細胞介素或其模擬物。
如請求項19所述之方法，其中，該細胞介素或其模擬物為IL-15。
如請求項20所述之方法，其中，該IL-15連接至IL-15Rα以形成融合蛋白。
如請求項1至21中任一項所述之方法，其進一步包含在CD30促效劑存在下培養該CD56⁺/CD3^-細胞。
如請求項22所述之方法，其中，該CD30促效劑為抗CD30抗體。
一種CD56⁺/CD3^-細胞，其係經由如請求項1至23中任一項所述之方法獲得。
一種醫藥組合物，其包含如請求項24所述之CD56⁺/CD3^-細胞及賦形劑。
一種治療有需要之個體之疾病或疾患之方法，其包含向該個體投與如請求項24所述之CD56⁺/CD3^-細胞或如請求項25所述之醫藥組合物。
一種擴增CD56⁺/CD3^-細胞之方法，其包含在CD30促效劑存在下培養該CD56⁺/CD3^-細胞。
如請求項27所述之方法，其中，該CD56⁺/CD3^-細胞衍生自多能幹細胞。
如請求項28所述之方法，其中，該多能幹細胞為誘導多能幹細胞(iPSC)。
如請求項27至29中任一項所述之方法，其中，該CD30促效劑為抗CD30抗體。
如請求項27至30中任一項所述之方法，其中，在該CD30促效劑及至少一種細胞介素存在下培養該CD56⁺/CD3^-細胞。
如請求項31所述之方法，其中，該至少一種細胞介素包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其任何組合。
一種CD56⁺/CD3^-細胞，其係經由如請求項27至32中任一項所述之方法獲得。
一種醫藥組合物，其包含如請求項33所述之CD56⁺/CD3^-細胞及賦形劑。
一種治療有需要之個體之疾病或疾患之方法，其包含向該個體投與如請求項33所述之CD56⁺/CD3^-細胞或如請求項34所述之醫藥組合物。