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TW202506196A - 含有糖皮質激素的抗體藥物偶聯物的藥物組合物 - Google Patents

含有糖皮質激素的抗體藥物偶聯物的藥物組合物 Download PDF

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TW202506196A
TW202506196A TW113127912A TW113127912A TW202506196A TW 202506196 A TW202506196 A TW 202506196A TW 113127912 A TW113127912 A TW 113127912A TW 113127912 A TW113127912 A TW 113127912A TW 202506196 A TW202506196 A TW 202506196A
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TW
Taiwan
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antibody
pharmaceutical composition
seq
drug
preparation
Prior art date
Application number
TW113127912A
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English (en)
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周曉丹
李金宇
葉秀
孫瓊
盧韻
楊建
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大陸商江蘇恒瑞醫藥股份有限公司
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Abstract

本公開涉及一種含有糖皮質激素的抗體藥物偶聯物的藥物組合物。具體涉及一種藥物組合物，包含抗體藥物偶聯物和抗衡離子。本公開的藥物組合物具備良好的空氣動力學特徵，適合吸入給藥。

Description

含有糖皮質激素的抗體藥物偶聯物的藥物組合物
本公開屬於藥物製劑領域，具體涉及一種含有糖皮質激素的抗體藥物偶聯物的藥物組合物。
本申請要求申請日為2023/7/28的中國專利申請2023109382848的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
白介素4(Interleukin-4，IL-4)由153個胺基酸組成，分子量約為17kDa。最初，因為IL-4能夠刺激B細胞增殖而被發現，並被命名為B細胞刺激因子-1(BSF-1)。IL-4與IL-13一樣屬於I型細胞因子家族，具有4α螺旋的疏水束核心所構成的四級結構。IL-4由TH2細胞分泌，參與TH2介導的免疫應答，具有廣泛的生物學活性，包括刺激T細胞、肥大細胞、粒細胞、巨核細胞和紅細胞增殖。此外，IL-4還可以刺激B細胞表達主要組織相容性複合物2類分子。IL-13與IL-4具有大約30％的胺基酸序列同源性和多種相似的功能。IL-4和IL-13都能促進B細胞增殖，並聯合CD40/CD40L共刺激誘導IgM類型轉變成IgE。IL-4促進肥大細胞聚集，上調肥大細胞高親和力IgE受體和B細胞上IgE低親和力受體CD23(FcεRII)的表達，上調血管內皮細胞黏附分子(VCAM-1)表達，促進嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、單核細胞和嗜鹼性粒細胞的轉移。與IL-13不同的是，IL-4可以促進幼稚T細胞分化成TH2。
IL-4需要與膜受體結合而發揮生物學功能。人白介素受體(IL-4R)是由兩條多肽鏈形成的異二聚體，其中一條α鏈對IL-4有很高的親和力，由於在IL-4R複合物中IL-4Rα鏈對IL-4的結合起主導作用，因此很多科學研究和報導中常用IL-4Rα替代IL-4R。IL-4R在人B細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、巨噬細胞/單核細胞、DC細胞、纖維細胞、氣道上皮和平滑肌等多種細胞上都有表達。IL-4Rα可以與其他亞基形成兩類受體複合物，在造血幹細胞中主要表達由IL-4Rα和γc組成的I型受體。在非造血幹細胞中IL-4主要通過IL-4Rα和IL-13Rα1組成的II型受體發揮作用。II型受體是IL-4和IL-13的共同受體，IL-13與IL-13Rα1結合發揮功能。I型受體和II型受體都通過Jak/STAT通路轉導訊號，IL-4Rα、γc和IL-13Rα1分別與Jak1、Jak3和Tyk2結合啟動下游通路，IL-4和IL-13還可以通過胰島素受體受質家族(IRS)轉導訊號，最終啟動核內的PI3-K、NF-κB。阻斷IL-4R既可以抑制IL-4也可以抑制IL-13的生物學功能。
多項研究表明IL-4和IL-13與TH2免疫應答相關的疾病有關。特應性皮炎(AD)，又稱異位性皮炎或遺傳過敏性皮炎，是皮膚科常見疾病，多見於兒童和青少年，常與某些遺傳過敏性疾病如過敏性鼻炎、哮喘等併發。研究發現AD患者的TH2因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13水準上升，IgE水準升高，此外還發現，TH2因子與AD疾病進程相關，過表達IL-4、IL-13等TH2因子的小鼠表現出皮膚保護缺陷和類似AD病症 [14][15]。AD患者IL-4和IL-13水準升高阻礙了表皮分化和抗菌肽的產生。IL-4缺陷小鼠降低皮膚過敏性炎症的發生。這些研究表明阻斷IL-4R可能對治療AD有效。國外已經有抗IL-4R的單抗上市，對AD表現出良好的治療效果。
IL-13和IL-4在哮喘中也發揮重要作用。哮喘是一種常見的肺部炎症疾病，以氣道高反應性(AHR)、粘液分泌過多、纖維化和IgE水準升高為特徵。非特異性刺激如冷空氣等常常導致氣道高反應性加劇，AHR和粘液分泌過多導致氣道阻礙這是哮喘致死的主要原因。TH2因子在哮喘疾病進程中發揮重要作用，哮喘患者支氣管和肺泡灌洗液過表達IL-4和IL-13。儘管IL-13和IL-4具有某些功能相似性，但是一些研究表明IL-13在哮喘的疾病進展中發揮了比其他Th2細胞因子更為重要的作用。IL-13可以促進杯狀細胞的分化和纖維化。給未經過過敏原刺激的小鼠氣道注射重組IL-13會導致氣道炎症，粘液分泌過多和氣道高反應性，注射可溶性的IL13Rα2可以阻止小鼠AHR、粘液分泌過多和肺部炎症的發生。在哮喘模型中注射IL-4Rα抗體可以降低AHR和肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細胞。研究表明阻斷IL-4Rα可能對治療哮喘有效。
目前各國已有多家製藥公司正在研發針對IL-4R的單克隆抗體，相關專利申請如WO2010053751、WO2001092340、WO2008054606、WO2014031610、WO2020038454等。
糖皮質激素也是治療過敏性疾病、炎症等較為有效的藥物。作為代表性的糖皮質激素，已知皮質醇、皮質酮等在生物體內製成的糖皮質激素以及地塞米松、潑尼松、潑尼松龍、布地奈德等合成糖皮質激素。這些糖皮質激素由於具有類固醇結構，因此總稱為類固醇類，應用在各種疾病的治療中。但是，這些類固醇類由於其使用，有時會表現出類固醇消化性潰瘍、類固醇紫斑、類固醇胰炎、類固醇糖尿病、類固醇白內障、類固醇青光眼等副作用。
抗體藥物偶聯物（antibody drug conjugate，ADC），是指單克隆抗體或者抗體片段通過穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的藥物相連。臨床前和臨床開發中的大多數ADC都用於腫瘤適應症，其中細胞毒性有效載荷靶向表達抗原的癌細胞。但是，通過ADC介導的生物活性小分子的傳遞來調節病原性細胞活性對於非腫瘤學適應症也是有吸引力的，從而導致了該技術的廣泛應用。
現有技術已經公開了一些糖皮質激素的藥物偶聯物，例如WO2017210471，WO2019106609、WO2019136487等。
本發明提供一種藥物組合物，包含抗體藥物偶聯物和抗衡離子，其中所述抗體藥物偶聯物具有如式I所示的結構： 其中： 25G7-Fab包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含：如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 12所示的HCDR1，如SEQ ID NO: 2所示的HCDR2，如SEQ ID NO: 3所示的HCDR3，所述輕鏈可變區包含：如SEQ ID NO: 4所示的LCDR1，如SEQ ID NO: 5所示的LCDR2，如SEQ ID NO: 6所示的LCDR3； n為1至10。
在一些實施方案中，平均藥物載量（n）的範圍可以是每個25G7-Fab結合糖皮質激素藥物的平均數，非限制性的實施例包括每個25G7-Fab結合糖皮質激素藥物的平均個數為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及這些點值之間的任意範圍。例如可以是2-8，2-7，2-6，2-5，2-4，3-4，3-5，3.5~4.7，5-6，5-7，5-8和6-8。示例性的，平均藥物載量（n）可以為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的均值。n是小數或整數。
在一些實施方案中，所述25G7-Fab具有如SEQ ID NO: 8所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO: 7所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，所述25G7-Fab具有如SEQ ID NO: 11所示的重鏈，和如SEQ ID NO: 10所示的輕鏈。
25G7-Fab的CDR序列見表1： 表1 25G7-Fab的CDR序列
名稱 序列 編號
HCDR1 DYGMH SEQ ID NO: 1
HCDR2 FISSGSSIIYYADIVKG SEQ ID NO: 2
HCDR3 GNKRGFFDY SEQ ID NO: 3
LCDR1 RASSSVPYMY SEQ ID NO: 4
LCDR2 LTSNLAS SEQ ID NO: 5
LCDR3 QQWRAYPPMLT SEQ ID NO: 6
HCDR1 GFTFSDYGMH SEQ ID NO: 12
25G7-Fab的輕鏈可變區序列如SEQ ID NO: 7所示，重鏈可變區序列如SEQ ID NO: 8所示。 hu25G7-A LCVR（hu25G7-A輕鏈可變區） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVPYMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWRAYPPMLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 7 hu25G7-VH（hu25G7重鏈可變區） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSIIYYADIVKGRSTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGNKRGFFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 8
25G7-Fab的輕鏈序列如SEQ ID NO: 10所示，重鏈序列如SEQ ID NO: 11所示；hu25G7的重鏈序列如SEQ ID NO: 9所示，輕鏈序列如SEQ ID NO: 10所示。 hu25G7-IgG4 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSIIYYADIVKGRSTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGNKRGFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO: 9 hu25G7-A LC EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVPYMYWYQQKPGQAPRLLIYLTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWRAYPPMLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 10 hu25G7-24-IgG4 VH-CH1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSIIYYADIVKGRSTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGNKRGFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV SEQ ID NO: 11
在一些實施方案中，所述抗體藥物偶聯物的濃度以蛋白濃度計為0.1mg/mL-50mg/mL，非限制性的實施例包括0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2 .0mg/mL、2.5 mg/mL、3 .0mg/mL、3.5 mg/mL、4.0 mg/mL、4.5mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL、8.0 mg/mL、9.0 mg/mL、10.0 mg/mL、15.0mg/mL、20.0 mg/mL、25.0 mg/mL、30.0 mg/mL、35.0 mg/mL、40.0 mg/mL、45.0 mg/mL、50.0 mg/mL，以及這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物的濃度為0.5mg/mL-10 mg/mL。在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物的濃度為1mg/mL-5 mg/mL。
在一些實施方案中，所述抗衡離子包括但不限於硫酸鹽、磷酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、衣康酸鹽、氯化物、溴化物等。在一些實施方案中，所述抗衡離子選自硫酸鹽、檸檬酸鹽和氯化物中的一種或多種。在一些實施方案中，所述抗衡離子選自檸檬酸鈉、硫酸鈉、硫酸鋅、硫酸鎂、硫酸鉀、硫酸鈣、氯化鎂、氯化鈣和氯化鋅中的一種或多種。在一些實施方案中，所述抗衡離子為硫酸鈉和/或檸檬酸鈉。
在一些實施方案中，所述抗衡離子的濃度為0.01 mg/mL-10mg/mL，非限制性的實施例包括0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9 mg/mL、2.0 mg/mL、2.2 mg/mL、2.4 mg/mL、2.6 mg/mL、2.8 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0 mg/mL、9.0 mg/mL、10.0 mg/mL，以及這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，所述抗衡離子的濃度為0.05 mg/mL-5mg/mL。在一些實施方案中，所述抗衡離子的濃度為0.1 mg/mL-2mg/mL。
在一些實施方案中，所述藥物組合物還包含保護劑。在一些實施方案中，所述保護劑選自胺基酸和/或糖。
在一些實施方案中，所述胺基酸包括但不限於甘胺酸、組胺酸、精胺酸、賴胺酸、麩胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、天門冬胺酸等。在一些實施方案中，所述胺基酸為甘胺酸或組胺酸。
在一些實施方案中，所述胺基酸的濃度為0.01 mg/mL-10mg/mL，非限制性的實施例包括0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9 mg/mL、2.0 mg/mL、2.2 mg/mL、2.4 mg/mL、2.6 mg/mL、2.8 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0 mg/mL、9.0 mg/mL、10.0 mg/mL，以及這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，所述胺基酸的濃度為0.05 mg/mL-5mg/mL。在一些實施方案中，所述胺基酸的濃度為0.1 mg/mL-2mg/mL。
本公開的“醣”包含常規組合物 (CH 2O) n及其衍生物，包括單醣，二醣，三醣，多醣，糖醇，還原性糖，非還原性糖等等。在一些實施方案中，所述的糖包括但不限於山梨醇、甘露醇、木糖醇、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖等。在一些實施方案中，所述的糖為海藻糖。
在一些實施方案中，所述醣的濃度為0.01 mg/mL-10mg/mL，非限制性的實施例包括0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9 mg/mL、2.0 mg/mL、2.2 mg/mL、2.4 mg/mL、2.6 mg/mL、2.8 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0 mg/mL、9.0 mg/mL、10.0 mg/mL，以及這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，所述醣的濃度為0.05 mg/mL-5mg/mL。在一些實施方案中，所述醣的濃度為0.1 mg/mL-2mg/mL。
在一些實施方案中，所述藥物組合物還包含有機溶劑，所述有機溶劑包括但不限於甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇、叔丁醇、丁醇、丙酮、乙腈、乙酸、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲基叔丁基醚、二甲基亞碸等。在一些實施方案中，所述有機溶劑為異丙醇。
在一些實施方案中，所述有機溶劑的量為0.1%-50%v/v，非限制性的實施例包括0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、10.0%、11.0%、12.0%、13.0%、14.0%、15.0%、20.0%、25.0%、30.0%、35.0%、40.0%、45.0%、50.0%，以及這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，所述有機溶劑的量為0.5%-30%v/v。在一些實施方案中，所述有機溶劑的量為1%-10%v/v。
在一些實施方案中，所述藥物組合物的pH為3.0-8.0，非限制性的實施例包括3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0，以及這些點值之間的任意範圍。在一些實施方案中，pH為4.5-6.0。在一些實施方案中，pH為5.0或5.5。
在一些實施方案中，所述的藥物組合物，包含： a) 以蛋白濃度計，1mg/mL-5 mg/mL的所述抗體藥物偶聯物， b) 0.1 mg/mL-2mg/mL的抗衡離子，所述抗衡離子為檸檬酸鈉或硫酸鈉， c) 0.1 mg/mL-2mg/mL的胺基酸，所述胺基酸為組胺酸或甘胺酸， d) 0.1 mg/mL-2mg/mL的醣，所述醣為海藻糖, e) 1%-10%v/v的有機溶劑，所述有機溶劑為異丙醇； 所述藥物組合物的pH為4.5-5.5。
本公開還提供一種含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，其中所述製劑複溶後可形成如上所述的藥物組合物。
本公開還提供一種製備含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑的方法，其中包括將如上所述的藥物組合物經冷凍乾燥的步驟。
本公開還提供一種包含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，所述凍乾製劑通過將如上所述的抗體藥物偶聯物的藥物組合物冷凍乾燥獲得。
在一些實施方案中，所述凍乾製劑的形態為微球。在一些實施方案中，所述微球的空氣動力學粒徑為0.01-10.0μm。在一些實施方案中，所述微球的空氣動力學粒徑為0.5-5μm。
本公開還提供一種含抗體藥物偶聯物的複溶溶液，其中所述複溶溶液是通過將如上所述的凍乾製劑複溶製備獲得。
本公開還提供製備上述複溶溶液的方法，其中包括將前述凍乾製劑經複溶的步驟，其複溶所用溶液選自但不限於注射用水、生理鹽水或葡萄糖溶液。
本公開還提供了一種藥物組合物，其包含前述凍乾製劑，以及填充劑，所述填充劑包括但不限於海藻糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、右旋糖酐等。在一些實施方案中，所述填充劑為海藻糖。
本公開還提供一種製品，其包括容器，該容器中裝有如上所述的藥物組合物、凍乾製劑、複溶溶液或乾粉製劑。在一些實施方案中，該容器為中性硼矽玻璃管制注射劑瓶。
本公開還提供前述的藥物組合物、凍乾製劑、複溶溶液或製品在製備用於治療或預防免疫性疾病或病症的藥物中的用途。
本公開還提供一陣治療或預防免疫性疾病或病症的方法，所述方法包括向受試者施用有效量或預防有效量的前述藥物組合物、凍乾製劑、複溶溶液或製品。
在一些實施方案中，所述疾病或病症選自：哮喘、鼻息肉、慢性鼻竇炎、過敏性皮膚病、嗜酸細胞性食管炎、慢性阻塞性肺病、過敏性鼻炎、關節炎、炎症性疾病、變應性反應、自體免疫淋巴組織增生性症候群、自體免疫性溶血性貧血、巴雷特食道症、自體免疫葡萄膜炎、結核病和腎病。在一些實施方案中，所述疾病或病症選自哮喘或過敏性皮膚病。
術語
為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域具通常知識者理解的含義。
術語“抗體-藥物偶聯物”，指配體通過穩定的連接單元與具有生物活性的藥物相連。在本公開中“抗體-藥物偶聯物”（antibody drug conjugate，ADC），指把單克隆抗體或者抗體片段通過穩定的連接單元與具有生物活性的糖皮質激素相連。其中抗體或抗體片段可通過其中的特定基團（例如鏈間二硫鍵）與包含接頭的糖皮質激素分子相結合。
術語“抗衡離子”是指能夠啟動來自如蛋白質，核酸，脂質或低聚糖等大分子的微顆粒形成的帶電荷或電荷極性化的分子。帶電分子是否為抗衡離子可基於以下參數經驗性地確定：包括但不限於蛋白質種類、pH、離子強度、使用的有機溶劑的種類，和鹽和如活性試劑的其它成分的存在。如這裡提供和描述的，抗衡離子可為陰離子的或具有淨負電荷或電荷極性化的基團，陽離子的或具有淨正電荷或電荷極性化的基團，或兩性離子的和具有負和正電荷或電荷極性化的基團。
術語“微顆粒”與“微球”可互換並指包括大分子和傳送感興趣的試劑，如藥物或營養添加物到受治療者的顆粒，其尺寸範圍(平均長度，寬度或直徑)為約或正好0.001微米到約或正好500微米。所述試劑可為大分子，如蛋白質、核酸、脂質或多醣，或形成微顆粒的大分子可為活性試劑如藥物或營養添加物的載體。所述微顆粒也可包括合成大分子，所述大分子包括聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)和天然聚合物，如白蛋白、明膠、殼聚醣和葡聚醣。這裡描述的“微顆粒”可包括和可製備自一種特定的天然或合成大分子，或來自不止一種類型的同樣的天然或合成大分子(如不止一種類型的蛋白質)，或來自不止一種不同類型的天然或合成大分子的結合(如蛋白質和核酸或蛋白質和合成聚合物)。
這裡使用的術語“微顆粒”也通常指一種並不是其生產自的全部溶液的固體形態的顆粒，儘管這裡也考慮包含大分子的溶液的冷凍和/或乾燥的顆粒。而是，這裡使用的微顆粒通常是溶液組分的一部分的集合，其包括鹽、抗衡離子、溶劑和其它成分，這些由包括但不限於沉澱、沉降、相分離和膠體形成的方法形成。
本公開單抗分子大小變異體測定法（CE-SDS）可採用十二烷基硫酸鈉毛細管電泳（CE-SDS）紫外檢測方法，在還原和非還原條件下，依據分子量大小，毛細管電泳法（2015年版《中國藥典》0542），定量測定重組單克隆抗體產品的純度。
本公開的一個實施方式中，糖皮質激素通過連接單元偶聯在配體的N端胺基和/或賴胺酸殘基的ɛ-胺基上，一般地，偶聯反應中能與抗體偶聯的藥物分子數將小於理論上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制抗體-藥物偶聯物的載量，包括： (1) 控制連接試劑和單抗的莫耳比， (2) 控制反應時間和溫度， (3) 選擇不同的反應試劑。
術語“胺基酸”是指分子結構中含有胺基和羧基，並且胺基和羧基都直接連接在-CH-結構上的有機化合物。通式是H2NCHRCOOH，R為H、取代或未取代烷基等。根據胺基連結在羧酸中碳原子的位置，可分為α、β、γ、δ、 ε……-胺基酸。在生物界中，構成天然蛋白質的胺基酸具有其特定的結構特點，即其胺基直接連接在α-碳原子上，即α-胺基酸，包括甘胺酸（Glycine）、丙胺酸（Alanine）、纈胺酸（Valine）、亮胺酸（Leucine）、異亮胺酸（Isoleucine）、苯丙胺酸（Phenylalanine）、色胺酸（Tryptophan）、酪胺酸（Tyrosine）、天冬胺酸（Aspartic acid）、組胺酸（Histidine）、天冬醯胺（Asparagine）、麩胺酸（Glutamic acid）、賴胺酸（Lysine）、穀胺醯胺（Glutamine）、甲硫胺酸（Methionine）、精胺酸（Arginine）、絲胺酸（Serine）、蘇胺酸（Threonine）、半胱胺酸（Cysteine）、脯胺酸（Proline）等。非天然胺基酸如瓜胺酸。如本發明領域具通常知識者所公知的，非天然胺基酸並不構成天然蛋白質，因此也不參與本公開中抗體的合成。本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem, 243, p3558(1968)中所述。
術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈通過恒定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區（Fv區）；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恒定區。可變區包括3個高變區（HVR）和4個序列相對保守的骨架區（FR）。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區（CDR）。每條輕鏈可變區（LCVR）和重鏈可變區（HCVR）由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本公開的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體，優選人源化抗體和全人源抗體。
術語“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能用鼠製備抗體。製備時用特定抗原注射試驗物件，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。
術語“嵌合抗體（chimeric antibody）”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恒定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從鼠雜交瘤細胞中克隆可變區基因，再根據需要克隆人抗體的恒定區基因，將鼠可變區基因與人恒定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。
術語“人源化抗體（humanized antibody）”，也稱為CDR移植抗體（CDR-grafted antibody），是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA資料庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列資料庫（在網際網路www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得），以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。進一步描述參與人源化可使用小鼠抗體的方法的文獻包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature，321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。
術語“全人源抗體”、“全人抗體”或“完全人源抗體”，也稱“全人源單克隆抗體”，其抗體的可變區和恒定區都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。單克隆抗體的發展經歷了四個階段，分別為：鼠源性單克隆抗體、嵌合性單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人源單克隆抗體。本公開為全人源單克隆抗體。全人抗體製備的相關技術主要有：人雜交瘤技術、EBV 轉化 B 淋巴細胞技術、噬菌體顯示技術（phage display）、轉基因小鼠抗體製備技術（transgenic mouse）和單個B細胞抗體製備技術等。
術語“抗原結合片段”是指抗體的保持特異性結合抗原的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab 片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab') 2片段，包含通過鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab 片段的二價片段；(iii) 由VH 和CH1 結構域組成的Fd 片段；(iv) 由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v) 單結構域或dAb片段(Ward 等人,(1989)Nature341: 544-546)，其由VH 結構域組成；和(vi) 分離的互補決定區(CDR)或(vii) 可任選地通過合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR 的組合。此外，雖然Fv 片段的兩個結構域VL 和VH 由分開的基因編碼，但可使用重組方法，通過合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL 和VH 區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv) ；參見，例如，Bird 等人(1988)Science242 :423-426 ；和Huston 等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本發明領域具通常知識者已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可通過重組DNA 技術或通過酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM 抗體。
Fab是通過用蛋白酶木瓜蛋白酶（切割H鏈的224位的胺基酸殘基）處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈通過二硫鍵結合在一起。
F(ab')2是通過用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。
Fab'是通過切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。
此外，可以通過將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產所述Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH 2-VL-接頭-VH-COOH或NH 2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體 (Holliger 等人(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan 等人(1995)，Protein  Eng.8:725-731，Choi 等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31:94-106，Hu 等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov 等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56 和Roovers 等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。所述6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A. 等人，(1991)Sequences  of  proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。通常，每個重鏈可變區中存在三個CDR (HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每個輕鏈可變區中存在三個CDR (LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各種公知方案中的任何一種來確定CDR的胺基酸序列邊界，包括“Kabat”編號規則（參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD）、“Chothia”編號規則（參見Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948）和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則（參見Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc， M.P.等，Dev. Comp. Immunol.， 27，55-77(2003)）等。例如，對於經典格式，遵循Kabat規則，所述重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia規則，VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且VL中的胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通過組合Kabat和Chothia兩者的CDR定義，CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)構成。遵循IMGT規則，VH中的CDR胺基酸殘基編號大致為26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT規則，抗體的CDR區可以使用程式IMGT/DomainGap Align確定。
術語“抗體框架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。
“與IL-4R結合”，指能與人IL-4R（或其表位、片段）相互作用。本文的術語“抗原結合位點”指由本文抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸（參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66 卷，G.E.Morris，Ed.(1996) ）。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10 -7M，例如：大約小於10 -8M、10 -9M或10 -10M或更小的親和力(KD)結合。
術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至所述編碼序列。
術語“載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以通過比對IMGT人類抗體可變區種系基因資料庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http://imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae) 的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以克隆並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。陽性的克隆在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
胺基酸序列“同一性”指在比對胺基酸序列及必要時引入間隙，以達成最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，第一序列中與第二序列中的胺基酸殘基同一的胺基酸殘基的百分比。為測定胺基酸序列同一性百分比的目的，比對可以通過屬於本領域技術的範圍內的多種方式來實現，例如使用公開可得到的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。本發明領域具通常知識者可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何演算法。
術語“抗IL-4R抗體”或“與IL-4R結合的抗體”是指能夠例如以足夠的親和力結合IL-4R的抗體，使得該抗體可用作靶向IL-4R的治療劑。抗IL-4R抗體與不相關的非IL-4R蛋白的結合程度可以小於如，例如，通過放射免疫測定(RIA)所測量的抗體與IL-4R的結合的約10％。在一些實施方案中，與IL-4R結合的抗體具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解離常數(Kd)。
術語“肽”是指介於胺基酸和蛋白質之間的化合物片段，由2個或2個以上胺基酸分子通過肽鍵相互連接而成，是蛋白質的結構與功能片段，如激素、酶類等本質上都是肽。
術語“醣”是指由C、H、O三種元素組成的生物大分子，可分為單醣、二醣和多醣等。
“藥物組合物”表示含有一種或多種本文所述抗體藥物偶聯物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是保持抗體活性成分的穩定性，促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
本公開中，“藥物組合物”和“製劑”並不互相排斥。
本公開中所述藥物組合物的溶液形式，若無特殊說明，其中的溶劑均為水。
“凍乾製劑”表示液體或溶液形式的藥物組合物或液體或溶液製劑經真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或藥物組合物。
本文所用術語“約”、“大約”是指數值在由本領域一般技術人員所測定的具體值的可接受誤差範圍內，所述數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本申請和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。
本公開中數值為儀器測量值或儀器測量後計算值，存在一定程度的誤差，一般而言，正負10%均屬於合理誤差範圍內。當然需要考慮該數值所用之處的上下文，例如，總雜質的含量，該數值為測量後誤差變化不超過正負10%，可以為正負9%、正負8%、正負7%、正負6%、正負5%、正負4%、正負3%、正負2%或正負1%，優選正負5%。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，優選為最多5個，更優選為1～3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，本發明領域具通常知識者能夠在不付出過多努力的情況下確定（通過實驗或理論）可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和（如烯屬）鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
常規的藥物組合物的製備見中國藥典。
“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指通過試劑、診斷、結合組合物或通過另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開的任一種結合化合物的組合物，所述患者具有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量（也稱作“治療有效量”）可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。通過醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案（例如治療方法或製品）在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗（H檢驗）、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“置換”是指溶解抗體蛋白或抗體藥物偶聯物的溶劑體系的置換，例如，使用穩定製劑的緩衝體系經物理操作方式將含抗體蛋白或抗體藥物偶聯物的高鹽或高滲溶劑體系置換，從而使抗體蛋白或抗體藥物偶聯物存在於穩定製劑中。所稱物理操作方式包括但不限於超濾、透析或離心後複溶。
以下結合實施例進一步描述本公開，但這些實施例並非是對本公開範圍的限制。本公開實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件，如參照冷泉港實驗室出版的《抗體技術實驗手冊》，《分子克隆手冊》；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
NMR位移(δ)以10 -6(ppm)的單位給出。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO- d 6)，氘代氯仿(CDCl 3)，氘代甲醇(CD 3OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)。
MS的測定用Shimadzu 2010 Mass Spectrometer或Agilent 6110A MSD質譜儀。
HPLC的測定使用Shimadzu LC-20A systems、Shimadzu LC-2010HT series或安捷倫Agilent 1200 LC高壓液相色譜儀(Ultimate XB-C18 3.0*150mm色譜柱或Xtimate C18 2.1*30mm色譜柱)。
手性HPLC分析測定使用Chiralpak IC-3 100×4.6mm I.D., 3um、Chiralpak AD-3 150×4.6mm I.D., 3um、Chiralpak AD-3 50×4.6mm I.D., 3um、Chiralpak AS-3 150×4.6mm I.D., 3um、Chiralpak AS-3 100×4.6mm I.D., 3μm、ChiralCel OD-3 150×4.6mm I.D., 3um、Chiralcel OD-3 100×4.6mm I.D., 3μm、ChiralCel OJ-H 150×4.6mm I.D., 5um、Chiralcel OJ-3 150×4.6mm I.D., 3um色譜柱；    薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15 mm～0.2 mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4 mm～0.5 mm。
柱層析一般使用煙臺黃海矽膠100~200目、200~300目或300~400目矽膠為載體。
手性製備柱使用DAICEL CHIRALPAK IC (250mm*30mm,10um) 或Phenomenex-Amylose-1 (250mm*30mm,5um)。
CombiFlash快速製備儀使用Combiflash Rf150 (TELEDYNE ISCO)。
激酶平均抑制率及IC 50值的測定用NovoStar酶標儀(德國BMG公司)。
本公開的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co. KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。
實施例中無特殊說明，反應能夠均在氬氣氛或氮氣氛下進行。
氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。
氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。
加壓氫化反應使用Parr 3916EKX型氫化儀和清藍QL-500型氫氣發生器或HC2-SS型氫化儀。
氫化反應通常抽真空，充入氫氣，反覆操作3次。
微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。
實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。
實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫，為20℃～30℃。
實施例中的反應進程的監測採用薄層色譜法(TLC)，反應所使用的展開劑，純化化合物採用的柱層析的洗脫劑的體系和薄層色譜法的展開劑體系包括：A：二氯甲烷/甲醇體系，B：正己烷/乙酸乙酯體系，C：石油醚/乙酸乙酯體系，D：石油醚/乙酸乙酯/甲醇，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等鹼性或酸性試劑進行調節。
1.0 M Tris buffer  pH=8.30±0.1的配製： 50mL容量瓶中稱取tris 6.0 g，加入40mL純化水，振盪溶解，滴加入濃鹽酸1.2 mL，調pH至8.30，再用純化水定容。
Buffer A 的配製： 在2.0 L的容器中，加入KH 2PO4（8.50 g）、K 2HPO4 (8.56 g)、NaCl (5.86 g)和EDTA (1.50 g)，加入1.6 L注射用水，攪拌半小時，完全溶解後再用注射用水定容至2.0 L，測定pH為6.30±0.1。
下述實驗中所用縮寫代表的含義如下： DAST：二乙胺基三氟化硫；THF：四氫呋喃；NMP： N-甲基吡咯烷酮；DCM：二氯甲烷； m-CPBA：間氯過氧苯甲酸；DIEA： N,N-二異丙基乙胺；TEA：三乙胺；Boc：叔丁氧羰基，MeOH：甲醇；Et 2O：乙醚。
本申請中25G7、7B10抗體的製備、純化方法已在申請號為WO2020038454A1專利檔中記載，25G7-Fab及ADC的製備方法已在申請號為PCT/CN2023/073057專利檔中記載，前述申請檔的全部內容均引入本公開。
實施例1：N-((10 S)-10-苄基-1-((6a R,6b S,7 S,8a S,8b S,11a R,12a S,12b S)-7-羥基 -6a,8a-二甲基-4-氧代-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8b H-萘並[2',1':4,5]茚並[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五氧-3-氧代-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)-1-(2-溴乙醯胺基)-3,6,9,12-四氧代十五烷-15-醯胺（化合物1）的製備
步驟1） (((9 H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸叔丁基酯（化合物1b）的製備 將化合物1a (5.14 g，20.0 mmol，1.0 eq) 和L-苯丙胺酸叔丁酯鹽酸鹽（7.08 g，20.0 mmol，1.0 eq）置入250 mL三口燒瓶中，加入無水DMF（60 mL）溶清。冰浴冷卻， 再加入HATU（9.12 g, 24.0 mmol, 1.2 eq） 和DIEA（7.74 g，60.0 mmol，3.0 eq），保持冰浴反應2小時。 向反應液中加入水，乙酸乙酯萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，乾燥，減壓濃縮得化合物1b（11.5 g, 100% yield），粗品可直接投入下一步。 MS (ESI): m/z 580.3 [M+Na] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.21-8.16(m, 1H), 8.12-8.05 (m, 1H), 7.91-7.87 (m, 2H), 7.72-7.68 (m, 2H), 7.64-7.59 (m, 1H), 7.44-7.38 (m, 2H), 7.36-7.25 (m, 4H), 7.23-7.18 (m, 3H), 4.41-4.18 (m, 4H), 3.76-3.72 (m, 2H), 3.68-3.61 (m, 2H), 2.98-2.89 (m, 2H), 2.69 (s, 2H), 1.30 (s, 9H).
步驟2）甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸叔丁酯（化合物1c）的製備 將化合物1b (5.57 g，10.0 mmol，1.0 eq)置入250 mL三口燒瓶中，加入無水DCM（60 mL）溶清，冰浴冷卻。 緩慢加入哌啶（8.5 g，100.0 mmol，10.0 eq），加畢之後維持室溫攪拌反應約2小時。 直接將反應液濃縮至乾，粗品經柱層析純化得化合物1c（2.70 g，81% yield） MS (ESI): m/z 358.3[M+H] +。
步驟3）(1-(9 H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16-五氧-4-四聚乙二醇-19-氧基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸叔丁酯（化合物1d）的製備 100 mL三口燒瓶中加入原料1-(9 H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16-五氧-4-四聚乙二醇-19-油酸 (1.0 g，2.05 mmol，1.0 eq；來源於通萊生化) 和1c（0.69 g，2.05 mmol，1.0 eq），加入無水DMF（25 mL）溶清，冰浴冷卻。 加入HATU （1.01 g, 2.67 mmol, 1.3 eq）和DIEA（529 mg，4.10 mmol，2.0 eq），維持冰浴反應1小時。 向反應液中加入水，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，乾燥且減壓濃縮得化合物1d（1.60 g, 97% yield）。 MS (ESI): m/z 805.3 [M+H] +。
步驟4） (1-(9 H-芴-9-基)-3-氧代-2,7,10,13,16-五氧-4-四聚乙二醇-19-氧基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸（化合物1e）的製備 100 mL單口瓶中加入化合物1d (1.60 g，1.99 mmol，1.0 eq)，加入無水二氯甲烷（16 mL）溶解。室溫下加入三氟乙酸（8 mL），維持攪拌反應2小時。 將反應液直接濃縮至乾，加入乙酸乙酯溶解，飽和食鹽水洗滌，乾燥，減壓濃縮得化合物1e（1.23 g，83% yield）； MS (ESI): m/z 749.3 [M+H] +。
步驟5）(9 H-芴-9-基)甲基(2-(((2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-氧代-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘並[2',1':4,5]茚並[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-2-氧代乙氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)胺基甲酸酯（化合物1f）的製備 100 mL三口瓶中加入原料布地奈德(1.29g，3.0 mmol，1.0 eq) 和(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)乙酸甲酯（1.16 g，3.15 mmol，1.0 eq；參考文獻 “Tetrahedron, 2018, 74(15), 1951–1956”的方法製備）及對甲苯磺酸吡啶鹽（75 mg，0.30 mmol，0.1 eq）。 室溫下加入加入無水四氫呋喃（20 mL），回流加熱反應4小時。 直接將反應液濃縮至乾，粗品柱層析純化得1f（0.54 g，24% yield）。 MS (ESI): m/z 739.4 [M+H] +。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.76-8.69 (m, 1H), 7.91-7.84 (m, 2H), 7.73-7.67 (m, 2H), 7.63-7.57 (m, 1H), 7.43-7.58 (m, 2H), 7.35-7.23 (m, 3H), 6.13 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 5.91 (s, 2H), 5.15-4.97 (m, 1H), 4.73-4.45 (m, 5H), 4.30-4.09 (m, 5H), 3.65-3.59 (m, 2H), 2.29-2.21 (m, 1H), 2.11-1.87 (m, 2H), 1.74-1.21 (m, 11H), 1.09-0.77 (m, 8H).
步驟6）2-胺基-N-((2-((6a R,6b S,7 S,8a S,8b S,11a R,12a S,12b S)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-氧代-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘並[2',1':4,5]茚並[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-2-氧代乙氧基)甲基)乙醯胺（化合物1g）的製備 25 mL單口瓶中置入化合物1f (540 mg，0.73 mmol，1.0 eq)，加入無水二氯甲烷（10 mL）溶解。冰浴冷卻，加入DBU（167 mg，1.10 mmol，1.5 eq），維持攪拌反應30分鐘。 加入水分液，水相用二氯甲烷萃取兩次，飽和食鹽水洗滌，減壓濃縮得化合物1g（450 mg，100% yield），粗品可以直接用於下一步反應。 MS (ESI): m/z 517.4 [M+H] +。
步驟7）(9 H-芴-9-基)甲基((10 S)-10-苄基-1-((6a R,6b S,7 S,8a S,8b S,11a R,12a S,12b S)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-氧代-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8b H-萘並[2',1':4,5]茚並[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15,18-六氧代-3,21,24,27,30-五氧代-5,8,11,14,17-五胺雜三十烷-32-基)胺基甲酸酯（化合物1h）的製備 100 mL三口燒瓶中置入化合物1g (0.45 g粗品，折算為0.73 mmol，1.0 eq) 和1e（0.55 g，0.73 mmol，1.0 eq），加入無水DMF（9 mL）溶清。 冰浴冷卻，再依次加入HATU（361 mg, 0.95 mmol, 1.3 eq）和DIEA（189 mg，1.46 mmol，2.0 eq），維持攪拌反應1小時。 向反應液中加入水，二氯甲烷萃取兩次，合併有機相，飽和食鹽水洗滌一次，乾燥且減壓濃縮得粗品。將粗品在混合溶劑石油醚和乙酸乙酯中打漿純化，得化合物1h（710 mg，78% yield）。 MS (ESI): m/z 1269.7 [M+Na] +。
步驟8）1-胺基- N-((10 S)-10-苄基-1-((6a R,6b S,7 S,8a S,8b S,11a R,12a S,12b S)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-氧代-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8b H-萘並[2',1':4,5]茚並[1,2-d][1,3] 二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧代-5,8,11,14-聚四乙二醇-16-基-3,6,9,12-四氧代十五烷-15-醯胺（化合物1i）的製備 25 mL單口瓶中置入化合物1h (350 mg，0.28 mmol，1.0 eq)，加入無水二氯甲烷（10 mL）溶清。冰浴冷卻，加入DBU（64 mg，0.42 mmol，1.5 eq），維持攪拌反應1小時。直接將反應液濃縮至乾，得粗品，再經柱層析純化得化合物1i（289 mg，89% yield）。 MS (ESI): m/z 1025.6 [M+H] +。
步驟9）N-((10 S)-10-苄基-1-((6a R,6b S,7 S,8a S,8b S,11a R,12a S,12b S)-7-羥基 -6a,8a-二甲基-4-氧代-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8b H-萘並[2',1':4,5]茚並[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五氧-3-氧代-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)-1-(2-溴乙醯胺基)-3,6,9,12-四氧代十五烷-15-醯胺（化合物1）的製備 25 ml Schlenk-Tube中置入溴乙酸固體 (35.2 mg，0.127 mmol，1.0 eq) 和EEDQ（63 mg，0.25 mmol，2.0 eq），加入無水DMF（5 mL）溶清。維持室溫攪拌反應1小時。化合物1i（130 mg，0.127 mmol，1.0 eq）溶解在DMF（2 mL）中，將此溶液逐滴加入到上述製備的活性酯溶液中，加畢再維持室溫反應2小時。 向反應體系中加入水，乙酸乙酯萃取兩次，合併有機相，飽和食鹽水洗滌， 乾燥且減壓濃縮得粗品，再經柱層析純化得化合物1 (39 mg, 27% yield)。 MS (ESI): m/z 1145.5/1147.6 [M+1] +。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.62-8.57 (m, 1H), 8.34-8.28 (m, 2H), 8.19-8.11(m, 2H), 8.03-7.99(m, 1H), 7.30-7.17(m, 6H), 6.15 (d, J= 9.6 Hz, 1H), 5.92 (s, 2H), 5.18-5.03 (m, 1H), 4.72-4.47 (m, 5H), 4.29-4.15 (m, 2H), 3.78-3.42 (m, 27H), 3.27-3.21 (m, 2H), 3.06-2.84 (m, 2H), 2.41-2.28 (m, 3H), 2.06-1.73 (m, 2H), 1.60-1.24 (m, 10H), 1.01-0.82 (m, 8H).
實施例2： N-((10 S)-10-苄基-1-((6a R,6b S,7 S,8a S,8b S,11a R,12a S,12b S)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-氧代-10-丙基l-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8b H-萘並[2',1':4,5]茚並[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五氧-3-氧代-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1 H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧代十五烷-15-醯胺
步驟1）(((9 H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸（化合物2a）的製備 100 mL單口瓶中置入化合物1b (1.50 g，2.69 mmol，1.0 eq)，加入4M HCl 的1,4-二氧六環溶液（20 mL）溶解。 室溫下維持攪拌4小時至原料1b反應完全。 將反應液直接濃縮至乾，得化合物1a（1.34 g，100% yield）。 MS (ESI): m/z 502.3 [M+1] +
步驟2）(9 H-芴-9-基)甲基-((10 S)-10-苄基-1-((6a R,6b S,7 S,8a S,8b S,11a R,12a S,12b S)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-氧代-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8b H-萘並[2',1':4,5]茚並[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五氧代-3-氧-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)胺基甲酸酯（化合物2b）的製備 將化合物2a（0.97 g，1.63 mmol，1.0 eq）和1g（1.0 g， 1.95 mmol，1.2 eq） 置於100 mL三口燒瓶中。 加入DMF （20 mL），冰浴冷卻。 依次加入HATU （927 mg，2.44 mmol，1.5 eq）和DIEA（420 mg，3.26 mmol，2.0 eq），加完後，維持冰浴反應1-2小時。 將反應液濃縮，經柱層析純化得化合物2b（860 mg，53% yield）。 MS (ESI): m/z 1000.5 [M+1] +
步驟3(2 S)-2-(2-(2-胺乙醯胺基)乙醯胺基- N-(2-(((2-((6a R, 6b S, 7 S, 8a S, 8b S, 11a R, 12a S, 12b S)-7-羥基-6a, 8a-二甲基-4-氧代-10-丙基-1,2,4,6a, 6b, 7,8,8a, 11a, 12,12a, 12b-十二氫-8b H-萘並[2',1':4,5]茚並 [1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-2-氧代乙氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-3-苯丙醯胺（化合物2c）的製備 25 mL單口瓶中置入化合物2b (860 mg，0.86 mmol，1.0 eq)，加入無水DMF烷（10 mL）溶清。 冰浴冷卻，加入DBU（196 mg，1.29 mmol，1.5 eq），維持攪拌反應30分鐘。 直接將反應液濃縮，經柱層析純化得化合物2c（485 mg，72% yield）。 MS (ESI): m/z 778.4 [M+1] +
步驟4） N-((10 S)-10-苄基-1-((6a R,6b S,7 S,8a S,8b S,11a R,12a S,12b S)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-氧代-10-丙基l-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8b H-萘並[2',1':4,5]茚並[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五氧-3-氧代-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1 H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧代十五烷-15-醯胺（化合物2d）的製備 100 mL三口燒瓶中置入化合物2c (480 mg，0.62 mmol，1.0 eq) 和1-（2,5-二氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基）-3,6,9,12-四氧戊二酸-15-油酸 （213 mg，0.62 mmol，1.0 eq；來源於通萊生化），加入無水DMF（10 mL）溶清。 冰浴冷卻，再依次加入HATU（352 mg, 0.93 mmol, 1.5 eq）和DIEA（159 mg，1.23 mmol，2.0 eq），維持攪拌反應1小時。直接將反應液濃縮，經柱層析純化得化合物2d（360 mg，53% yield）。 MS (ESI): m/z 1105.6 [M+1] + 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.61-8.56 (m, 1H), 8.32-8.26 (m, 1H), 8.22-8.13 (m, 2H), 8.03-7.96(m, 1H), 7.39-7.20(m, 6H), 7.02 (s, 2H), 6.17-6.13 (m, 1H), 5.92 (s, 2H), 5.16-4.99 (m, 1H), 4.76-4.40 (m, 6H), 4.29-4.16 (m, 2H), 3.64-3.19 (m, 26H), 3.09-3.02 (m, 1H), 2.86-2.79 (m, 1H), 2.41-2.26 (m, 3H), 2.12-1.90 (m, 2H), 1.78-1.25 (m, 10H), 1.03-0.83 (m, 8H).
實施例3：25G7-Fab蛋白製備流程 合成抗體的基因序列，亞克隆至pcDNA3.4載體。連接產物轉化Top10感受態細胞，挑取陽性克隆擴大培養。克隆接種於培養基中擴大培養，大量抽提含25G7-Fab抗體的去氧核糖核酸序列的質粒。採用脂質體轉染，將表達質粒與轉染試劑混合後，加入Expi 293細胞中，恒溫培養箱培養5天后收穫細胞培養物。將細胞培養物離心後取上清，過濾除去細胞碎片，收集澄清液。使用kappa select層析柱捕獲目的蛋白。目的蛋白經過濾，用Nanodrop測定A280吸光度值並除以消光係數的方法得到蛋白濃度，乘以體積以確定最終產量，凝膠電泳、體積排阻色譜法對蛋白進行SDS-PAGE、SEC-HPLC及內毒素檢測，得到最終產物是25G7-Fab。
實施例4：AZD1402-TAG蛋白製備流程 AZD1402-TAG（蛋白序列來自於專利WO2020200960A1中SEQ ID NO1，為了便於蛋白製備純化，該序列C端融合了His tag，最終命名為AZD1402-TAG）。 AZD1402-TAG ASDEEIQDVSGTWYLKAMTVDSRCPRAVYNSVTPMTLTTLEGGNLEAKFTAQRKGRWQKYKLVLEKTDEPGKYTASGGRHVAYIIRSHVKDHYIFHSEGLCPGQPVPGVWLVGRDPKNNLEALEDFEKAAGARGLSTESILIPRQSETSSPGSDHHHHHH SEQ ID NO: 13 合成上述蛋白的編碼基因序列，亞克隆至pcDNA3.4。將表達質粒與轉染試劑混合後37℃孵育15分鐘，將混合液逐滴加入HEK293細胞液中，細胞液37℃搖床培養一周後，將細胞培養物離心後取上清。使用不含咪唑的緩衝液平衡鎳親和層析柱，然後將蛋白樣品流經鎳親和層析柱進行上樣，再次使用不含咪唑的緩衝液平衡後，用含有高濃度咪唑的緩衝液洗脫柱結合蛋白。並將洗脫蛋白轉移至透析袋於1×PBS中透析，置換為PBS存儲緩衝液。經檢測，獲得目的蛋白。
實施例5：抗體藥物偶聯物ADC-1的製備 Buffer A 的配製：在2.0 L的容器中，加入KH 2PO 4（8.50 g）、K 2HPO 4(8.56 g)、NaCl (5.86 g)和EDTA (1.50 g)，加入1.6 L注射用水，攪拌半小時，完全溶解後再用注射用水定容至2.0 L，測定pH為6.30±0.1。 於37℃，向抗體25G7-Fab（重鏈序列如SEQ ID NO: 11所示，輕鏈序列如SEQ ID NO: 10所示）的buffer A緩衝水溶液 (pH=6.3的0.05 M緩衝水溶液；10.0 mg/ml，0.5 mL，0.125 mmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(2.5 mM，100.0 uL，0.250 mmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。 將1.0 M Tris buffer(50 uL)加入至上述反應液中，再將化合物1(1.43 mg，1.250 mmol)溶解於25 ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：buffer A)，並用超濾管濃縮得到標題產物ADC-1的buffer A緩衝液(6.06mg/mL，0.60mL)，於4℃冷凍儲存。
實施例6：抗體藥物偶聯物ADC-2的製備 於37℃，向抗體25G7-Fab的buffer A緩衝水溶液 (pH=6.3的0.05 M緩衝水溶液；10.0 mg/ml，6.0 mL，1.50 mmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10.0 mM，1.50 mL，15.0 mmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。 將化合物2 (12.2 mg，12.0 mmol)溶解於300 ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：buffer A)，並用超濾管濃縮得到標題產物ADC-2的buffer A緩衝液(3.65mg/mL，12.8mL)，於4℃冷凍儲存。
生物學評價 以下結合測試例進一步描述解釋本公開中，但這些實施例並非意味著限制本公開中的範圍。
測試例1：抗體藥物偶聯物ADC-2與人源IL-4Rα蛋白的親和力檢測 1、受試蛋白 抗體藥物偶聯物ADC-2，25G7-Fab，AZD1402-TAG 2、實驗方法 採用表面等離子共振技術（surface plasmon resonance, SPR）檢測抗體藥物偶聯物ADC-2、25G7-Fab及AZD1402-TAG與人源IL-4Rα抗原蛋白的親和力。Biacore 8K（Cytiva）中放入SA感測器晶片（Cytiva），Biotin標記的人源IL-4Rα蛋白（SinoBiological，CAT# 10402-H08H-B）捕獲於SA感測器晶片上，流動相採用HBS-EP+緩衝溶液（10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% surfactant P20）。各受試蛋白用HBS-EP+緩衝溶液進行2倍梯度稀釋後作為分析物進樣，設置流速為30 µL/min，ADC-2、25G7-Fab和AZD1402-TAG的檢測時間為結合100秒，解離600秒。採用Biacore 8K evaluation software軟體（Cytiva）進行分析，獲得各受試蛋白的親和力資料。 3、實驗結果 表1 受試蛋白與人源IL-4Rα蛋白結合的親和力KD值
捕獲蛋白 受試蛋白 Kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (pM)
hIL-4Rα ADC-2 8.78E+06 9.62E-05 11.0
25G7-Fab 4.69E+06 2.06E-04 43.9
AZD1402-TAG 4.77E+06 1.02E-04 21.3
結果如表1所示，ADC-2結合人源IL-4Rα抗原蛋白的KD值為11.0 pM，略優於AZD1402-TAG和25G7-Fab。
測試例2：抗體藥物偶聯物ADC-2與人源IL-4Rα表達細胞的全細胞結合活性 1、受試蛋白 抗體藥物偶聯物ADC-2，25G7-Fab，hu25G7（重鏈序列如SEQ ID NO: 9所示，輕鏈序列如SEQ ID NO: 10所示），AZD1402-TAG。 2、實驗方法 TF-1及Karpas 299細胞株經鑒定可表達IL-4Rα。將處於對數生長期的TF-1和Karpas299細胞收集後，計數並調整細胞密度，以1×10 5細胞/孔接入圓底96孔板。將細胞與不同濃度的抗IL-4R抗體(25G7、裸抗25G7-Fab)、抗體藥物偶聯物ADC-2及AZD1402-TAG在4℃條件下孵育45分鐘，用FACS Buffer（含2% FBS的PBS）洗去抗體後，加入螢光標記二抗進行染色，25G7-Fab、hu25G7及ADC-2採用FITC偶聯的抗人IgG（Fab特異性）二抗（Sigma，CAT#F5512-1ML），AZD1402-TAG採用FITC偶聯的抗His抗體（GenScript，CAT#A01620）。將細胞與二抗在4℃條件下孵育30分鐘，隨後用FACS Buffer洗滌兩次，流式細胞儀進行檢測（BD，FACS Celesta），檢測結果採用FlowJo（FlowJo, LLC）軟體進行分析。 3、實驗結果 表2 受試蛋白與人源IL-4Rα表達細胞的全細胞結合活性EC 50值
受試蛋白 ADC-2 25G7-Fab hu25G7 AZD1402-TAG
檢測二抗 Anti-hFab-FITC Anti-His-FITC
EC 50(nM, TF-1) 0.107 0.243 0.247 0.0124
結果如圖1及表2所示，ADC-2結合TF-1胞的EC 50值為0.107 nM，與裸抗25G7-Fab和hu25G7相當。AZD1402-TAG與TF-1細胞的結合作用強，但因檢測抗體不同，資料與ADC-2、25G7-Fab等不具有可比性。
測試例3：抗體藥物偶聯物ADC-2對IL-4/IL-13訊號通路的阻斷作用 1、受試蛋白 抗體藥物偶聯物ADC-2，25G7-Fab。 2、實驗方法 STAT6的活化是IL-4/IL-13訊號通路啟動的關鍵步驟。本實施例中，ADC-2對IL-4/IL-13訊號通路的阻斷作用通過HEK-Blue™ IL-4/IL-13報告基因細胞株進行評估。該細胞購自Invivogen（Cat#hkb-il413），其中過表達了人源STAT6基因及由磷酸化STAT6誘導表達的分泌型鹼性磷酸酶報告基因（Secreted alkaline phos-phatase，SEAP），可通過SEAP受質QUANTI-Blue檢測細胞培養上清中分泌的SEAP的含量以評估IL-4/IL-13訊號通路的活化水準。 將處於對數生長期的HEK-Blue™ IL-4/IL-13細胞收集後調整密度為5×10 5細胞/ml，每孔100 μL加入96孔平底培養板中，於37℃，5% CO 2條件下培養24小時，而後每孔加入20 μL梯度稀釋的受試蛋白和20 μL重組人IL-4或IL-13，將細胞培養板放在37℃，5% CO 2培養箱中繼續孵育20~24小時。培養結束後，取出細胞培養板，每孔吸取20 μL細胞培養上清轉移至另一塊96孔板，加入37 ℃預熱的QUANTI-Blue顯色液180 μL/孔，在37 ℃孵育1小時後，檢測620 nm 波長下的光吸收值。 3、實驗結果 表3 受試蛋白對IL-4/IL-13訊號通路阻斷作用的IC 50值
受試蛋白 ADC-2 25G7-Fab
阻斷IL-4訊號通路的IC 50值（nM） 0.68 0.61
阻斷IL-13訊號通路的IC 50值（nM) 10.60 14.59
結果如圖2及表3所示，各受試蛋白對重組人IL-4和IL-13誘導的STAT6的活化均有阻斷作用，ADC-2阻斷IL-4訊號通路的IC 50值為0.68 nM，與25G7-Fab的IC 50值0.61 nM接近；ADC-2阻斷IL-13訊號通路的IC 50值為10.60 nM，與25G7-Fab的IC 50值14.59 nM相當。
測試例4：抗體藥物偶聯物ADC-2在TF-1細胞中的內吞活性 1、受試蛋白 抗體藥物偶聯物ADC-2，25G7-Fab，hu25G7，AZD1402-TAG。 2、實驗方法 將生長狀態良好的TF-1細胞收集後調整密度為1×10 6細胞/mL，100 μL/孔加入96孔細胞培養板中並置於4℃，加入終濃度為2 nM的各受試蛋白，於4℃孵育1小時後放入細胞培養箱於4℃分鐘，5% CO 2條件下繼續培養，每個時間點單點設置一塊培養板，期間按不同孵育時間取出培養板，FACS buffer清洗並離心，隨後加入螢光標記二抗進行孵育。25G7-Fab、hu25G7及ADC-2採用FITC偶聯的抗人IgG（Fab特異性）二抗進行標記，AZD1402-TAG採用FITC偶聯的抗His抗體進行標記。將細胞與二抗在4℃條件下孵育30分鐘，隨後用FACS Buffer洗滌兩次，流式細胞儀進行檢測（BD，FACS Celesta），檢測結果採用FlowJo（FlowJo, LLC）軟體進行分析。特定時間點的內吞率計算公式為： (gMFI Test Ab at time X- gMFI ISO Ab at time X)/( gMFI Test Ab at time zero- gMFI ISO Ab at time zero)*100% 3、實驗結果 實驗結果如圖3所示，各受試蛋白均可檢測到其在TF-1細胞中的內吞訊號。ADC-2和hu25G7的內吞作用活性相當，3小時內吞率在70%左右；25G7-Fab的內吞作用更快，內吞率也更高。相比於AZD1402-TAG，ADC-2、25G7-Fab和hu25G7的內吞速率和內吞率均顯著優於AZD1402-TAG約在2小時左右達到平台，ADC-2的內吞活性比25G7-Fab稍弱。
測試例5：抗體藥物偶聯物ADC-2在小鼠模型上的藥代動力學測試 1、受試蛋白 抗體藥物偶聯物ADC-2 2、實驗方法 2.1實驗動物 C57BL6/J小鼠，8周齡，雄性，賽業（蘇州）生物科技有限公司 2.2小鼠給藥操作 小鼠接受氣管內霧化給藥（intratracheal，i.t.），於給藥後的不同時間點進行下頜採血300-400 μL，靜置2小時後，7500 rpm，4 ℃離心10 min，採集血清。採血後將小鼠進行麻醉並固定，將小鼠頸部肌肉進行鈍性分離，暴露出氣管，將氣管橫向開口，緩慢插入灌洗針，將預先抽裝好的4 ℃預冷生理鹽水緩慢推入肺組織進行灌洗，並收集肺泡灌洗液（BALF）。一共灌洗3次，前兩次分別用300 μL生理鹽水灌洗，第3次用400 μL灌洗。收集好的肺泡灌洗液1000 rpm，4 ℃離心10 min，採集上清液。安樂死小鼠後，剖開小鼠胸腔，分離並收集完整小鼠肺組織，用PBS沖洗掉肺組織表面的血漬，紙巾蘸乾表面PBS後，對肺組織稱重。將肺組織置於2 mL離心管中，加入1 mL細胞裂解液（CST，#9803），勻漿器（Shanghai Jing Xin，Tissuelyser-48）60 Hz研磨2 min後，10, 000 ×g，4 ℃離心10 min，上清液即為肺組織勻漿液，檢測勻漿液蛋白濃度（Pierce, 23227）。血清、BALF和肺組織勻漿液置於-80℃保存。給藥方案見表4，採樣方案見表5。 表4 給藥方案
組別 動物數（只） 受試蛋白 劑量（μg） 給藥途徑 給藥頻率
ADC-2組 15 ADC-2 100 i.t. 1次
表5 採樣方案
給藥後時間
5min 1 h 6 h 24 h 48 h Pre-dose 30min
動物編號
1、2、3 4、5、6 7、8、9 10、11、12 13、14、15 10、11、12 13、14、15
該時間點先採集血清，處死動物後再採集BALF與肺組織 該時間點僅採集血清
2.3 ADC-2含量檢測 (1) 包被：用碳酸鹽緩衝液稀釋抗原hIL-4Rα至1 μg/mL,（Acro，ILR-H5221），向ELISA板中每孔加入100 μL，4 ℃過夜孵育（16-18h）。 (2) 洗板：ELISA板恢復至室溫，每孔加入300 μL 0.05% PBST（PBS+0.05% Tween20）緩衝液洗板，共洗板3次。 (3) 封閉：每孔加入300 μL含3% BSA的PBS，400 rpm室溫搖板孵育2 h。 (4) 洗板：每孔加入300 μL 0.05% PBST，洗板3次。 (5) 樣品孵育：將100 μL稀釋後的血清、BALF或肺組織勻漿液加入ELISA板中，400 rpm室溫搖板孵育1.5 h。 (6) 洗板：每孔加入300 μL 0.05% PBST，洗板3次。 (7) 檢測：用Assay buffer（含0.5% BSA的0.05% PBST）將檢測抗體（Invitrogen，A18811）稀釋10000倍後加入ELISA板中，每孔100 μL，400 rpm室溫搖板孵育1 h。 (8) 洗板：每孔加入300 μL 0.05% PBST，洗板3次。 (9) 顯色：每孔加入100 μL TMB受質（Sera care，5120-0080），室溫孵育15 min。 (10) 終止：每孔加入100 μL受質反應終止液（Solarbio，C1058），檢測620 nm波長下的光吸收值。 2.4 游離Budesonide含量檢測 取30 μL血清、BALF或肺組織勻漿液，加入30.0 μL內標工作溶液（5.00 ng/mL布地奈德-D8）和120 μL乙腈，渦流1 min，13,000 rpm，4 ℃離心5 min，取上清100 μL至96孔板中，加入100 μL 0.3% FA稀釋液，1,000 rpm室溫搖板孵育15 min，取20 μL進行LC-MS/MS分析（日本島津，島津液相色譜系統；AB Sciex，Triple Quad 6500 +型三重四極杆串聯質譜儀）。 3、實驗結果 抗體藥物偶聯物ADC-2和游離Budesonide的藥代動力學參數如表6所示，藥時曲線如圖4所示。 表6 ADC-2和游離Budesonide的PK參數
ADC-2 游離Budesonide
藥代參數 血清 BALF 肺組織 血清 BALF 肺組織
藥物峰值濃度（C max, ng /mL） 2427 31377 7293 0.7 1.1 1.88
藥物峰值時間（T max, h） 1.0 1.0 1.0 1.0 0.083 6.0
藥時曲線面積（AUC last, ng/mL·h） 28526 451418 133942 3.43 0.046 53.72
半衰期（T 1/2, h） 9.4 13.8 10.7 / / /
清除率（CL, g/h） 3.41 0.20 0.72 / / /
表觀分佈容積（Vz, g） 46.46 4.06 11.17 / / /
實驗結果表明，抗體藥物偶聯物ADC-2氣管內給藥後，藥物主要分佈於血清和BALF，血清暴露量低。各組織中Budesonide的暴露量均很低。
測試例6：ADC-2在OVA誘導的小鼠哮喘模型上的體內藥效 1、受試物 抗體藥物偶聯物ADC-2，25G7-Fab，AZD1402-TAG，Budesonide。 2、實驗方法 2.1實驗動物 IL-4 hu/hu-IL-4Rα hu/hu雙轉基因C57BL6/J小鼠，8周齡，雌性，賽業（蘇州）生物科技有限公司 2.2小鼠給藥操作 將動物隨機分為正常對照動物和造模動物。於Day 0，7和14分別腹腔注射100 μL含200 μg OVA（Sigma，A5503）的PBS溶液，並使用等體積的氫氧化鋁作為佐劑對小鼠進行致敏。於Day 21-27，小鼠每天吸入一次3% OVA的霧化溶液，每次持續35 min。於Day 21開始，吸入OVA霧化溶液前半小時，小鼠接受氣管內霧化給藥。具體給藥方案見表7。 在Day 28，小鼠安樂死後，將小鼠頸部肌肉進行鈍性分離，暴露出氣管，將氣管橫向開口，緩慢插入灌洗針，將預先抽裝好的4 ℃預冷生理鹽水緩慢推入肺組織進行灌洗，並收集肺泡灌洗液。一共灌洗3次，前兩次分別用300 μL生理鹽水灌洗，第3次用400 μL灌洗。1,000 rpm，4 ℃離心10 min，細胞沉澱用350 μL預冷生理鹽水重懸後，用全自動血液分析儀進行白細胞與分型細胞計數。 表7 給藥方案
組別 動物數（只） 受試蛋白 給藥劑量（μg） 給藥途徑 給藥頻率
正常對照組 6 PBS / i.t. QD
造模組 6 PBS / i.t. QD
ADC-2組 8 ADC-2 100 i.t. QD
AZD1402-TAG組 8 AZD1402-TAG 30 i.t. QD
25G7-Fab組 8 25G7-Fab 100 i.t. QD
Budesonide組 6 Budesonide 1 i.t. QD
2.3實驗指標 BALF內白細胞與分型細胞的數量。 2.4統計學分析 除非特別說明，兩組別細胞計數之間的比較採用one-way ANOVA檢驗，p＜ 0.05定義為有統計學顯著性差異。 3、實驗結果 實驗結果如圖5所示。相比於造模組，在等莫耳劑量下，抗體藥物偶聯物ADC-2顯著降低了BALF內白細胞、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞的數量，對單核細胞的數量也有一定的抑制，藥效優於AZD1402-TAG，並明顯優於25G7-Fab和Budesonide。ADC-2在藥效上體現出了25G7-Fab和Budesonide的協同效應。
測試例7：ADC-2在OVA誘導的小鼠哮喘模型上體內藥效的劑量探索 1、受試物 抗體藥物偶聯物ADC-2，AZD1402-TAG，Budesonide。 2、實驗方法 2.1實驗動物 IL-4 hu/hu-IL-4Rα hu/hu雙轉基因C57BL6/J小鼠，8周齡，雌性，賽業（蘇州）生物科技有限公司 2.2小鼠給藥操作 給藥和BALF採樣操作同測試例6。具體給藥方案見表8。 表8 給藥方案
組別 動物數（只） 受試蛋白 給藥劑量（μg） 給藥途徑 給藥頻率
正常對照組 8 PBS / i.t. QD
造模組 8 PBS / i.t. QD
ADC-2低劑量組 8 ADC-2 10 i.t. QD
ADC-2中劑量組 8 ADC-2 30 i.t. QD
ADC-2高劑量組 8 ADC-2 100 i.t. QD
AZD1402-TAG組 8 AZD1402-TAG 30 i.t. QD
Budesonide組 6 Budesonide 1 mpk i.t. QD
2.3實驗指標 BALF內白細胞與分型細胞的數量。 2.4統計學分析 除非特別說明，兩組別細胞計數之間的比較採用one-way ANOVA檢驗，p＜ 0.05定義為有統計學顯著性差異。 3、實驗結果 實驗結果如圖6所示。相比於造模組，10 μg ADC-2就能將肺泡灌洗液內嗜酸性粒細胞的數量顯著降低，與AZD1402-TAG相當，並略優於遠高於臨床等效使用劑量的布地奈德。此外，10 μg ADC-2對白細胞數量的抑制能力也非常顯著，對單核細胞和中性粒細胞的數量也有一定程度的抑制。這些結果表明，1/10莫耳劑量的ADC-2就能實現與AZD1402-TAG相當的藥效。
實施例7：吸入乾粉a-d的製備 表9 處方a-d組成
編號 a b c d
ADC-2 2mg/ml 2mg/ml 2mg/ml 2mg/ml
硫酸鈉 0.426mg/ml 0.426mg/ml N/A N/A
檸檬酸鈉 N/A N/A 0.426mg/ml 0.426mg/ml
海藻糖 0.3mg/ml 0.3mg/ml 0.3mg/ml 0.3mg/ml
組胺酸 0.1824mg/ml 0.3mg/ml 0.3mg/ml 0.3mg/ml
鹽酸組胺酸 0.1176mg/ml N/A N/A N/A
異丙醇 5% v/v 5% v/v 5% v/v 5% v/v
純化水 95% v/v 95% v/v 95% v/v 95% v/v
pH 5.0 5.0 5.0 5.5
製備過程： 1）按表9中的處方組成加水配製輔料溶液，加入處方量的ADC-2緩衝液（實施例6製備得到），輕柔攪拌均勻，加入處方量的異丙醇，輕柔攪拌均勻（可根據需要用鹽酸調節pH）； 2）冷凍乾燥。 採用SYMPATEC粒徑測定儀進行粒徑測定，分散壓力為4bar，粒徑結果見表10。 表10 吸入乾粉a-c的幾何粒徑測定結果
編號 X10(μm) X50(μm) X90(μm)
a 0.50 1.42 3.14
b 0.56 1.40 2.95
c 0.53 1.46 3.75
將製備得到的含藥吸入乾粉填充至透明HPMC膠囊（3號）中，10mg裝量，將膠囊樣品使用COPLEY公司的NGI撞擊器按照中國藥典2015版四部通則0951[吸入製劑微細粒子空氣動力學特性測定法]規定進行APSD測試。將APSD各級分佈結果輸入CITDAS version 3.10軟體（COPLEY）得出FPF（＜5μm）、MMAD、GSD等值，結果見表11。 表11 吸入乾粉空氣動力學粒徑（APSD）測試結果
60L/min a b c d
FPD ＜5μm（mg） 2.708 2.533 1.834 2.285
ED（mg） 4.37 4.21 4.80 4.03
FPF(＜5μm),%（比ED） 62.0% 60.1% 38.2% 56.7%
MMAD（μm） 3.005 3.012 3.691 3.266
GSD 2.012 1.995 2.175 1.869
30L/min a b c d
FPD ＜5μm（mg） 1.382 1.116 1.119 1.500
ED（mg） 3.67 3.32 5.09 3.96
FPF(＜5μm),%（比ED） 37.7% 33.7% 22.0% 37.8%
MMAD（μm） 4.709 4.972 5.863 4.619
GSD 2.028 1.985 1.966 1.976
將樣品放置於不同穩定性測試條件下，通過方法SEC（大小排阻色譜）進行藥物穩定性分析，結果見表12。結果顯示，處方c和d在穩定性過程中單體下降幅度最小，處方中加入檸檬酸鈉使大分子性質更穩定。 表12 活性成分純度測定（SEC）結果(%)
編號 穩定性條件 聚集體 裸抗 單體 碎片 未知雜質
a 0天 0.83 1.90 96.6 0.68 N/A
40℃.35天 3.78 1.89 87.24 1.04 6.05
25℃. 35天 1.59 2.00 95.71 0.70 N/A
2~8℃. 35天 1.14 1.78 96.25 0.83 N/A
b 0天 0.72 1.8 96.8 0.61 N/A
40℃ 35天 3.43 2.18 86.81 1.19 6.39
25℃ 35天 1.39 1.99 95.44 1.17 N/A
2~8℃35天 1.01 1.87 95.96 1.15 N/A
c 0天 0.52 1.80 97.2 0.49 N/A
40℃ 35天 2.25 2.77 91.42 0.81 2.75
25℃ 35天 0.68 2.41 96.14 0.76 N/A
2~8℃35天 0.60 2.01 96.86 0.53 N/A
d 0天 0.49 1.80 97.2 0.49 N/A
40℃ 35天 3.14 1.95 90.67 0.97 3.28
25℃ 35天 1.18 1.92 96.25 0.65 N/A
2~8℃ 35天 0.85 1.79 96.66 0.70 N/A
實施例8：吸入乾粉e、f、g的製備 採用與實施例7處方b相同的處方組成和製備方法，區別在於對有機溶劑的用量進行調整，如表13所示。 表13 製備吸入乾粉e、f、g時水與異丙醇的用量
編號 異丙醇v/v 水v/v
e 2% 98%
f 5% 95%
g 10% 90%
採用SYMPATEC粒徑測定儀進行粒徑測定，分散壓力為4bar，粒徑結果見表14。 表14 吸入乾粉e、f、g的幾何粒徑測定結果
編號 X10(μm) X50(μm) X90(μm)
e 0.48 1.59 3.66
f 0.51 1.45 3.94
g 0.49 1.46 4.33
實施例9：吸入乾粉h-k的製備 採用與實施例7相同的配製及凍乾程序，按照表15中的處方組成製備吸入粉末。 表15 處方h~k組成
編號 h i j k
ADC-2 2mg/ml 2.5mg/ml 3mg/ml 3.5mg/ml
硫酸鈉 0.426mg/ml 0.5325mg/ml 0.639mg/ml 0.7455mg/ml
海藻糖 0.3mg/ml 0.375mg/ml 0.45mg/ml 0.525mg/ml
組胺酸 0.3mg/ml 0.375mg/ml 0.45mg/ml 0.525mg/ml
異丙醇 5% v/v 5% v/v 5% v/v 5% v/v
純化水 95% v/v 95% v/v 95% v/v 95% v/v
pH 5.5 5.5 5.5 5.5
採用SYMPATEC粒徑測定儀進行粒徑測定，分散壓力為4bar，粒徑結果見表16。結果顯示，藥物濃度由2mg/ml提高至3.5mg/ml幾何粒徑變化不大。 表16 吸入乾粉h~k的幾何粒徑測定結果
編號 X10(μm) X50(μm) X90(μm)
h 0.55 1.53 3.77
i 0.49 1.78 4.22
j 0.49 1.89 4.62
k 0.55 1.94 4.67
空氣動力學粒徑測定方法與實施例7中相同，APSD結果見表17。結果顯示，藥物濃度在2~3.5mg/ml範圍內變化對FPF、MMAD等空氣動力學粒徑結果影響不大。 表17 吸入乾粉空氣動力學粒徑（APSD）測試結果
30L/min h i j k
FPD ＜5μm（mg） 1.616 1.658 1.63 1.68
ED（mg） 4.71 4.42 4.61 5.13
FPF(＜5μm),%（比ED） 34.3 37.5 35.4 32.8
MMAD（μm） 4.831 4.666 4.694 4.765
GSD 2.118 2.072 2.094 2.066
實施例10：吸入乾粉形態觀察 採用掃描電子顯微鏡（SEM）對吸入乾粉c和f的形態進行觀察，結果見圖7和8。可以看出吸入乾粉c和f均是由幾個奈米級別的光滑球體聚集而成。
實施例11：不同規格吸入乾粉的製備 吸入乾粉m（0.4mg規格）的製備：稱取表18中處方量的組胺酸、檸檬酸鈉和0.06mg的海藻糖，加入水配製成輔料溶液，加入處方量的ADC-2緩衝液（實施例6製備得到），輕柔攪拌均勻，加入處方量的異丙醇，輕柔攪拌均勻。採用與實施例7相同的凍乾程序製備凍乾粉，再添加剩餘處方量的海藻糖作為填充劑，填充至羥丙甲纖維素空心膠囊。 吸入乾粉n（2mg規格）的製備：採用與實施例7相同的配製及凍乾程序，按照表18中的處方組成製備吸入粉末m，直接填充至羥丙甲纖維素空心膠囊。 表18 處方m和n組成
編號 m n
ADC-2 0.4mg 2mg
海藻糖 7.46mg 0.30 mg
組胺酸 0.06mg 0.30 mg
檸檬酸鈉 0.085mg 0.426 mg
異丙醇 0.01ml 0.05ml
純化水 0.19ml 0.95ml
pH 5.5 5.5
空氣動力學粒徑測定方法與實施例7中相同，APSD結果見表19。 表19 吸入乾粉空氣動力學粒徑（APSD）測試結果
吸入乾粉n 低流速30L/min 中流速60L/min 高流速90L/min
FPD ＜5μm（mg） 0.626 0.946 0.838
ED（mg） 1.48 1.58 1.55
FPF(＜5μm),%（比ED） 42.1% 59.9% 54.2%
MMAD（μm） 4.364 3.109 2.763
GSD 2.084 2.065 2.091
吸入乾粉m 低流速30L/min 中流速60L/min 高流速90L/min
FPD ＜5μm（mg） 0.066 0.083 0.093
ED（mg） 0.26 0.29 0.29
FPF(＜5μm),%（比ED） 25.6% 28.1% 32.6%
MMAD（μm） 5.773 4.845 4.351
GSD 1.838 1.977 2.047
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1為受試蛋白與人源IL-4Rα表達細胞的全細胞結合活性劑量-響應曲線。 圖2為受試蛋白對IL-4/IL-13訊號通路阻斷作用的劑量-回應曲線。 圖3為受試蛋白在TF-1細胞中的內吞率-時間曲線。 圖4為氣管內給藥後ADC-2和游離Budesonide在各組織的時間-濃度曲線 。 圖5為測試例6肺泡灌洗液內白細胞與分型細胞計數。 圖6為測試例7肺泡灌洗液內白細胞與分型細胞計數。 圖7為吸入乾粉處方c的掃描電鏡圖。 圖8為吸入乾粉處方f的掃描電鏡圖。
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Claims (21)

  1. 一種藥物組合物，包含抗體藥物偶聯物和抗衡離子，其中所述抗體藥物偶聯物具有如式I所示的結構： ； 其中： 25G7-Fab包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含：如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 12所示的HCDR1，如SEQ ID NO: 2所示的HCDR2，如SEQ ID NO: 3所示的HCDR3，所述輕鏈可變區包含：如SEQ ID NO: 4所示的LCDR1，如SEQ ID NO: 5所示的LCDR2，如SEQ ID NO: 6所示的LCDR3； n為1至10。
  2. 如請求項1所述的藥物組合物，其中所述25G7-Fab具有如SEQ ID NO: 8所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO: 7所示的輕鏈可變區。
  3. 如請求項1或2所述的藥物組合物，其中所述25G7-Fab具有如SEQ ID NO: 11所示的重鏈，和如SEQ ID NO: 10所示的輕鏈。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的藥物組合物，其中所述抗體藥物偶聯物的濃度以蛋白濃度計為0.1mg/mL-50mg/mL，優選0.5mg/mL-10 mg/mL，更優選1mg/mL-5 mg/mL。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的藥物組合物，其中所述抗衡離子選自硫酸鹽、磷酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、衣康酸鹽、氯化物和溴化物中的一種或多種，優選硫酸鹽、檸檬酸鹽和氯化物中的一種或多種，更優選檸檬酸鈉、硫酸鈉、硫酸鋅、硫酸鎂、硫酸鉀、硫酸鈣、氯化鎂、氯化鈣和氯化鋅中的一種或多種，最優選硫酸鈉和/或檸檬酸鈉。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的藥物組合物，其中所述抗衡離子的濃度為0.01 mg/mL-10mg/mL，優選0.05 mg/mL-5mg/mL，更優選0.1 mg/mL-2mg/mL。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物還包含保護劑。
  8. 如請求項7所述的藥物組合物，其中所述保護劑選自胺基酸和/或醣。
  9. 如請求項8所述的藥物組合物，其中所述胺基酸選自甘胺酸、組胺酸、精胺酸、賴胺酸、麩胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、天門冬胺酸中的一種或多種，更優選甘胺酸或組胺酸。
  10. 如請求項8或9所述的藥物組合物，其中所述胺基酸的濃度為0.01 mg/mL-10mg/mL，優選0.05 mg/mL-5mg/mL，更優選0.1 mg/mL-2mg/mL。
  11. 如請求項8所述的藥物組合物，其中所述醣選自山梨醇、甘露醇、木糖醇、海藻糖、乳糖、果糖、麥芽糖和蔗糖中的一種或多種，優選海藻糖。
  12. 如請求項11所述的藥物組合物，其中所述醣的濃度為0.01 mg/mL-10mg/mL，優選0.05 mg/mL-5mg/mL，更優選0.1 mg/mL-2mg/mL。
  13. 如請求項1-12中任一項所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物還包含有機溶劑，所述有機溶劑優選甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇、叔丁醇、丁醇、丙酮、乙腈、乙酸、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲基叔丁基醚和二甲基亞碸中的一種或幾種，更優選異丙醇。
  14. 如請求項13所述的藥物組合物，其中所述有機溶劑的量為0.1%-50%v/v，優選0.5%-30%v/v，更優選1%-10%v/v。
  15. 如請求項1-14中任一項所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物的pH為3.0-8.0，優選4.5-6.0。
  16. 如請求項1-15中任一項所述的藥物組合物，包含： a) 以蛋白濃度計，1mg/mL-5 mg/mL的所述抗體藥物偶聯物， b) 0.1 mg/mL-2mg/mL的抗衡離子，所述抗衡離子為檸檬酸鈉或硫酸鈉， c) 0.1 mg/mL-2mg/mL的胺基酸，所述胺基酸為組胺酸或甘胺酸， d) 0.1 mg/mL-2mg/mL的醣，所述醣為海藻糖, e) 1%-10%v/v的有機溶劑，所述有機溶劑為異丙醇； 所述藥物組合物的pH為4.5-6.0。
  17. 一種含抗體藥物偶聯物的凍乾製劑，其中所述凍乾製劑通過將請求項1至16中任一項所述的藥物組合物冷凍乾燥獲得。
  18. 一種含抗體藥物偶聯物的複溶溶液，其中所述複溶溶液是通過將請求項17所述的凍乾製劑複溶製備獲得。
  19. 一種藥物組合物，其包含如請求項17所述的凍乾製劑，以及填充劑，所述填充劑選自海藻糖、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、右旋糖酐中的一種或多種，優選海藻糖。
  20. 一種製品，其包括容器，該容器中裝有如請求項1至16中任一項所述的藥物組合物、請求項17所述的凍乾製劑、請求項18所述的複溶溶液或請求項19所述的乾粉製劑。
  21. 根據請求項1至16中任一項所述的藥物組合物、請求項17所述的凍乾製劑、請求項18所述的複溶溶液、請求項19所述的乾粉製劑或請求項20所述的製品在製備用於治療或預防免疫性疾病或病症的藥物中的用途，所述疾病或病症優選：哮喘、鼻息肉、慢性鼻竇炎、過敏性皮膚病、嗜酸細胞性食管炎、慢性阻塞性肺病、過敏性鼻炎、關節炎、炎症性疾病、變應性反應、自體免疫淋巴組織增生性症候群、自體免疫性溶血性貧血、巴雷特食道症、自體免疫葡萄膜炎、結核病和腎病，更優選哮喘或過敏性皮膚病。
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