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TW202506178A - 包含與ｃｄ３０和ｃｄ３結合之抗體之醫藥組成物 - Google Patents

包含與ｃｄ３０和ｃｄ３結合之抗體之醫藥組成物 Download PDF

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TW202506178A
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李奧納多 羅沙多
麥可 達爾加德
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丹麥商珍美寶股份有限公司
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Abstract

本發明有關包含能與CD3和CD30結合之多特異性抗體之醫藥組成物。本發明進一步提供醫藥組成物於治療和診斷流程(特別是於癌症治療)之用途。

Description

包含與ＣＤ３０和ＣＤ３結合之抗體之醫藥組成物
本發明有關與CD3和CD30結合之多特異性抗體之醫藥組成物，以及有關此類醫藥組成物之用途。
CD30(也稱為Ki-1或TNFRSF8)是一種120 kD跨膜糖蛋白受體，且為腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的成員(Smith et al. (1994) Cell 76: 959-962)。CD30是一種單次I型膜蛋白，其胞外域具有六個富含半胱胺酸的重複序列(Durkop et al. (1992) Cell 68: 421-427)。此外，已在發炎性疾病患者的血清中檢測到可溶形式之CD30(sCD30)，包括潰瘍性結腸炎(UC)(Giacomelli et al. Clin Exp Immunol. 1998;111:532-5)和CD30陽性血液惡性腫瘤(Josimovic-Alasevic et al. (1989) Eur J Immunol)。sCD30代表CD30 胞外部分被細胞膜錨定金屬蛋白酶(例如，TACE/ADAM17和ADAM10)切割的產物(Nagata et al., PNAS 2005; Hansen et al., FASEB, 2004)。
在正常組織中，CD30表現主要限於活化之T和B淋巴球亞群(Bowen et al. (1996) J Immunol. 156:442-9; Shanebeck et al. (1995) Eur J Immunol. 25:2147-53)。在多種淋巴贅瘤中已檢測到CD30表現。典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)和間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)顯示高CD30表現水平。特別地，大多數李特斯頓伯格(Reed-Sternberg)(RS)細胞(通常在cHL中發現)呈現CD30陽性(Frizzera et al. (1992) Semin. Diagn. Pathol. 9: 291-296)。
例如，靶向CD30之抗體-藥物接合物本妥昔單抗(brentuximab vedotin)(BV；SGN-35)已用於或建議用於治療癌症(諸如，cHL、ALCL以及CTCL)(Younes et al. J Clin Oncol. 2012 Jun 20;30(18):2183-9; Pro et al. Blood. 2017 Dec 21;130(25):2709-2717; Shea et al. Curr Hematol Malig Rep. 2020 Feb;15(1):9-19)。正在開發用於cHL和CD30陽性淋巴瘤之NK細胞介導之免疫療法的四價雙特異性CD30xCD16A抗體AFM13(Rothe et al. Blood. 2015 Jun 25;125(26):4024-31)。
此外，正在開發針對 cHL和CD30陽性淋巴瘤的靶向CD30之CAR-T細胞療法。其他CD30抗體已描述於WO2003059282 (Medarex)、US8257706 (Seattle genetics)、US20100239571 (Seattle genetics)、WO2007040653 (US government & Health)以及WO20160177846 (Affimed)中。
Pohl等人(1993 Int. J. Cancer, 54: 820-827)描述CD3xCD30雙特異性抗體OKT-3/HRS-3，其係藉由將產生CD30單株抗體HRS-3之融合瘤細胞與產生CD3單株抗體OKT-3之融合瘤細胞融合而產生(雜交之融合瘤(hybrid hybridoma)技術)。
WO2008119567描述CD30和CD3跨物種特異性雙特異性單鏈分子之產生和表徵。
US20200095330描述由兩種抗CD30殖株(命名為8D10和10C2)與抗CD3 (Orthoclone OKT-3)化學異源接合(heteroconjugation)產生之CD3xCD30雙特異性抗體。
然而，此等CD3xCD30雙特異性抗體均尚未在臨床設定中測試。
因此，需要改善之靶向CD30之癌症療法。持續需要有效、安全、具有良好的可製造性及/或具有長儲存期限之靶向CD30之化合物。還需要用於此類治療的抗體的醫藥上可接受的調配物。
本發明之一個目的是提供與人類和食蟹獼猴CD30和CD3結合之T細胞銜接抗體之醫藥組成物。又一個目的是提供抗體之醫藥組成物，其調配物在寬範圍之抗體濃度及/或溫度下呈穩定的。又一個目的是提供抗體之醫藥組成物，其調配物在至少3個月或甚至更長的時期內呈穩定的。本發明之又一個目的是提供對於IV輸注以及皮下投予有良好耐受性之抗體之醫藥調配物。此外，鑑定具有功能性失活之Fc骨架之雙特異性抗體，由於其優異的穩定性和溶解性，適合開發成醫藥組成物。
於一態樣中，本發明有關一種醫藥組成物，其包含多特異性抗體，該多特異性抗體包含能與人類CD30結合之抗原結合區和能與人類CD3結合之抗原結合區；以及緩衝劑，其中該組成物之pH為4.0至8.0。業經發現此類醫藥組成物提供令人類驚訝地高抗體穩定性，諸如熱穩定性和儲存穩定性以及高溶解度。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物包含多特異性抗體，該多特異性抗體包含：(i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區之，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及(ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列。
於又一態樣中，本發明有關用作藥劑(例如，用於治療癌症)之根據本發明之醫藥組成物。
於仍又一態樣中，本發明有關一種部件套組(kit-of-parts)，其包含a)如本文中之醫藥組成物、b)用於醫藥組成物之容器以及c)所述套組之使用說明書。
於又一態樣中，本發明有關一種製備如本文中所定義之醫藥組成物之方法，其包含在水中混合之步驟：a)多特異性抗體、b)緩衝劑、視需要地c)非離子賦形劑以及視需要地d)界面活性劑；以及將pH調節至4.0至8.0。
定義
本文中所使用之術語「抗體」旨在意指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子之片段或其任一之衍生物，其在具有顯著時段之半衰期(諸如至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約一小時、至少約兩小時、至少約四小時、至少約8小時，至少約12小時、至少約24小時或更長、至少約48小時或更長，至少約3、4、5、6、7或更多天等)或任何其他相關的功能定義的時段(諸如，足以誘導、促進、增強及/或調節與抗體結合抗原相關的生理反應的時間及/或足以使抗體內化的時間)之典型的生理及/或腫瘤特異的條件下，具有與抗原特異性地結合之能力。抗體包含可與抗原交互作用之結合區(或可在本文中使用之結合域，兩者具有相同意義)、包含免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈可變區之結合區等。抗體可包含抗體(Ab)之恆定區，其可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞(諸如，效應細胞)和補體系統的組分(諸如，C1q(其為補體活化之典型途徑中之第一組分)。
在本發明之背景下，術語「抗體」包括單株抗體(mAb)、類抗體多肽、嵌合抗體、人類抗體、人源化抗體以及保留以任何已知技術提供的與抗原(抗原結合片段)特異性地結合的能力之「抗體片段」或「其片段」，諸如酵素切割、胜肽合成以及重組DNA技術。術語「抗體」包括雙特異性、三特異性或多特異性抗體及/或具有進一步修飾之抗體，例如抗體-藥物接合物及/或在IgG Fc域中具有修飾之抗體。除非本文中之揭露另有限制，否則根據本發明所定義之抗體可具有任何同型或不具有同型(例如，scFv抗體)。
業經證明抗體的抗原結合功能可由全長抗體之片段進行。術語「抗體」內涵蓋的結合片段之實例包括(i)Fab’或Fab片段，其為由輕鏈可變域(VL)、重鏈可變域(VH)、輕鏈恆定區(CL)以及重鏈恆定區域1(CH1)所組成之單價片段或如WO 2007/059782中所述之單價抗體；(ii) F(ab’) 2片段，其為包含在鉸鏈區處由二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)Fd 片段，其係基本上由VH和CH1域所組成；(iv)Fv片段，其係基本上由抗體單臂的VL和VH域所組成、(v)dAb片段(Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989))，其係基本上由VH域所組成，並且也稱為域抗體(Holt et al; Trends Biotechnol-. 2003 Nov; 21(11):484-90)；(vi)駱駝科動物或奈米抗體(Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5(1):111-24)以及(vii)單離之互補決定區(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個域VL和VH係由單獨的基因編碼，其可使用重組方法以合成連接子連接，使其能製成其中VL和VH區配對以形成單價分子之單一蛋白質鏈(稱為單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)，參見，例如，Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5(1):111-24以及Bird et al., Science 242, 423426 (1988)。此類單鏈抗體涵蓋在術語抗體內，除非另有說明或前後文明確指出。雖然此類片段通常包括在抗體的含義內，其共同且各自獨立地為本發明之獨特特徵，展現不同的生物性質和效用。本文中進一步討論本發明之背景下的此等和其他有用的抗體片段。
抗體(無論是作為最終產物還是作為通過受控之Fab臂交換(cFEA)產生例如雙特異性抗體之中間體)可在例如來自重組修飾之宿主細胞或融合瘤之不同的活體外或離體表現或生產系統或使用支持編碼抗體之核酸序列之活體外轉錄及/或轉譯之細胞萃取物之系統中生產和從該等系統中收集。
本文中所使用之術語「免疫球蛋白重鏈」或「免疫球蛋白之重鏈」旨在意指免疫球蛋白的重鏈中之一者。重鏈通常係由限定免疫球蛋白的同型之重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區(本文中縮寫為CH)所組成。IgG之重鏈恆定區通常係由三個域CH1、CH2以及CH3所組成。本文中所使用之術語「免疫球蛋白」旨在意指一類結構相關之糖蛋白，其通常係由兩對多肽鏈、一對輕(L)低分子量鏈以及一對重(H)鏈所組成，所有四者可能以二硫鍵相互連接。免疫球蛋白之結構已充分地的表徵(例如，參見Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2 nded. Raven Press, N. Y. (1989))。在免疫球蛋白之結構內，兩條重鏈在所謂「絞鏈區」中經由二硫鍵相互連接。與重鏈一樣，各輕鏈通常係由多個區域：輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區所組成。此外，VH和VL區可進一步細分為高變異區(或在序列及/或結構上限定之環的形式上可為高變異之高變異區)，也稱為互補決定區(CDR)，其中穿插更為保守的區，稱為框架區(FR)。各VH和VL通常係由三個CRD與四個FR所組成，其係依以下順序從胺基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
當本文中所使用時，術語「半分子」、「Fab臂」以及「臂」意指一對重鏈-輕鏈。當雙特異性抗體被描述為包含「衍生自」第一抗體之半分子抗體和「衍生自」第二抗體之半分子抗體時，術語「衍生自」表示該雙特異性抗體係以任何已知的方法，將來自所述第一與第二抗體之所述半分子重組到所得雙特異性抗體內而產生的。在此背景下，「重組」不旨在受限於任何特別的重組方法，因此包括用於產生本文中所述之雙特異性抗體的所有方法，包括例如藉由相同分子中之兩個半分子之半分子交換而重組，以及相同分子中之兩個半分子在核酸層級上之重組及/或共表現。
在本文中，當在抗體或其域或區域之背景下使用時，術語「第一」和「第二」時僅旨在便於參考，並不旨在表示特定的相對位置等。
本文中所使用之術語「抗原結合區」或「結合區」意指抗體之能與抗原結合之區域。抗原可為任何分子，諸如多肽、蛋白質、多醣或其組合。抗原可例如於細胞、細菌或病毒粒子上呈現。在本發明之背景下，術語「抗原」和「標靶」可互換地使用，除非與前後文矛盾。在本發明之背景下，術語「抗原結合區」和「抗原結合位點」可互換地使用，除非與前後文矛盾。
如本文中所使用，術語「 K D」(M)意指特定抗體-抗原交互作用的平衡解離常數，並且藉由將 k d除以 k a而獲得。 K D也可稱為「結合親和力」。
如本文中所使用，術語「 k d」(sec -1)意指特定抗體-抗原交互作用的解離速率常數。所述值也稱為k off值或解離速率。
如本文中所使用，術語「 k a」(M -1×sec -1)意指特定抗體-抗原交互作用的結合速率常數。所述值也稱為k on值或結合速率。
如本文中所使用，術語「結合」意指抗體與預定抗原或標靶的結合，當使用抗體作為配體和抗原作為分析物以生物層干涉測量法測定時，通常具有對應1E -6M或更低，例如5E -7M或更低、1E -7M或更低，諸如5E -8M或更低，諸如1E -8M或更低，諸如5E -9M或更低，諸如1E -9M或更低，諸如1E -10M或更低，諸如1E -11M或更低的 K D之結合親和力，並且抗體與預定抗原以對應比抗體與預定抗原或密切相關之抗原之外的非特異性抗原(例如，BSA、酪蛋白)之結合低至少十倍，諸如低至少100倍，例如低至少1,000倍，諸如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍之 K D的親和力結合。
本文中所使用之術語「冷凍-解凍循環」描述將醫藥組成物冷凍至更低溫度(諸如，-75℃)，然後在室溫下解凍的過程。
如本文中所使用，術語「 k D」意指擴散交互作用參數。
如本文中所使用，術語「 B 22」意指第二均功係數。
如本文中所使用，術語「穩定」意指醫藥產品在儲存時保持其物理穩定性及/或化學穩定性及/或生物活性的能力。因此，當醫藥組成物呈穩定的(亦即，穩定之醫藥組成物)時，即使在儲存給定時段後仍適合醫藥用途。當曝露於溫度、攪拌以及冷凍-解凍循環等因素時，抗體的品質會隨時間而改變。穩定之醫藥組成物在其整個儲存期限內保留其物理、化學以及生物性質或對其物理、化學和生物性質之影響僅為可忽略不計。作為實例，從生產到使用之物理、化學及/或生物性質之百分比變化只會在有限程度內改變。於一具體例中，當在5℃下保持至少12個月時，以HP-SEC測量之%單體不會減少超過5%，諸如4%，如3%，諸如2%。於又一具體例中，當在5℃下保持至少12個月時，%完整IgG不會減少超過10%，諸如5%。於另一具體例中，當在5℃下保持至少12個月時，以icIEF測量之酸性形式不會增加超過20%，諸如超過15%，如超過10%。
如本文中所使用，術語「緩衝劑」表示醫藥上可接受之緩衝劑。術語「緩衝劑」涵蓋彼等將溶液的pH值維持在例如可接受之範圍內之劑，並且包括但不限於乙酸鹽、組胺酸、TRIS ®(三(羥甲基)胺基甲烷)、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙醇酸鹽等。一般而言，本文中所使用之「緩衝劑」具有適合於約4至約8、諸如約5至約6.5、諸如約5.5至6之pH範圍的pKa和緩衝能力。
如本文中所使用，術語「非離子賦形劑」表示醫藥上可接受之非離子賦形劑。作為實例，非離子賦形劑可為糖或糖醇。糖和糖醇也可稱為單醣、雙醣以及多醣。實例包括但不限於蔗糖、葡萄糖、右旋糖、海藻糖、甘露醇以及山梨醇。
如本文中所使用，「界面活性劑」是通常用於醫藥調配物中以防止藥物吸附在表面及/或聚集之化合物。此外，界面活性劑會降低兩種液體之間或液體與固體之間之表面張力(或界面張力)。例如，當例示性界面活性劑以非常低的濃度(例如，5%w/w或更低，諸如3%w/w或更低，諸如1%w/w或更低)存在時，可顯著地降低表面張力。界面活性劑為兩親性的，這表示其通常由親水基和疏水基或親脂基所組成，因此能在水溶液中形成微胞或類似的自組裝結構。已知的醫藥用界面活性劑包括單油酸甘油酯、氯化苯索寧、多庫酯鈉、磷脂質、聚乙烯烷基醚、十二烷基硫酸鈉以及三辛酸甘油酯(陰離子界面活性劑)；苯扎氯銨、西曲溴銨、氯化十六烷基吡啶以及磷脂質(陽離子界面活性劑)；α生育醇、單油酸甘油酯、肉荳蔻醇、磷脂質、泊洛沙姆(poloxamer)、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧羥基硬脂酸酯、聚氧基甘油酯、聚山梨醇酐酯、丙二醇二-十二酸酯、丙二醇單十二酸酯、山梨醇酐酯蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖硬脂酸酯、三辛酸甘油酯以及TPGS(非離子和兩性離子界面活性劑)。
本文中感興趣的「稀釋劑」為醫藥上可接受的(對人類投予安全且無毒)，並且可用於製備醫藥組成物之稀釋液者。較佳地，本發明之組成物之此類稀釋液僅稀釋抗體濃度，而不稀釋緩衝劑和組成物之潛在其他組分。據此，於一較佳具體例中，稀釋劑含有相同的濃度的例如存在於本發明之醫藥組成物中之緩衝劑。另外的例示性稀釋劑包括無菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(較佳為乙酸鹽或組胺酸緩衝劑)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。於一具體例中，稀釋劑包含乙酸鹽緩衝劑和山梨醇或基本上由其所組成。在另一具體例中，稀釋劑包含組胺酸緩衝劑和蔗糖或基本上由其所組成。
如本文中所使用，術語「CD30」意指人類分化簇30蛋白，也稱為TNFRSF8(腫瘤壞死因子受體超家族成員8)。CD30存在於多種物種中，因此術語「CD30」可能不限於人類CD30，除非與前後文矛盾。人類CD30的序列係如SEQ ID NO：39所示。
如本文中所使用，術語「CD3」意指人類分化簇3蛋白，其為T細胞共受體蛋白複合體的一部分且由四條不同的鏈所組成。CD3存在於多種物種中，因此術語「CD3」可能不限於人類CD3，除非與前後文矛盾。在哺乳動物中，複合體含有CD3γ(伽瑪)鏈(人類CD3γ鏈UniProtKB/Swiss-Prot No P09693或食蟹獼猴CD3γ UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI7)、CD3δ(德爾塔)鏈(人類CD3δ UniProtKB/Swiss-Prot No P04234或食蟹獼猴CD3δ UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI8)，兩條CD3ε(艾普西隆)鏈(人類CD3ε:UniProtKB/Swiss-Prot No P07766，其序列係以SEQ ID NO：42納入本文中；食蟹獼猴CD3ε UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI5；或恆河猴CD3ε UniProtKB/Swiss-Prot No G7NCB9)，以及CD3ζ-鏈(澤塔)鏈(人類CD3ζUniProtKB/Swiss-Prot No P20963、食蟹獼猴CD3ζUniProtKB/Swiss-Prot No Q09TK0)。此等鏈與稱為T細胞受體(TCR)的分子結合，並在T 淋巴球中產生活化訊息。TCR和CD3分子共同構成TCR複合體。
術語「抗體結合區」意指抗原的區域，其包含與抗體結合的表位。抗體結合區可藉由使用生物層干涉測量法之表位框併(binning)、藉由丙胺酸掃描法或藉由域鏈曳步(shuffle)測定法(使用其中抗原的區域與另一物種的區域交換之抗原構築體，並測定抗體是否仍與抗原結合)而測定。抗體結合區內涉及與抗體交互作用之胺基酸可由氫/氘交換質譜術及/或由與其抗原結合之抗體之晶體學測定。
術語「表位」表示由抗體特異性地結合之抗原決定位。表位通常係由胺基酸、糖側鏈或其組合等分子之表面基團所組成，並且通常具有特定的三維結構特性以及特定的電荷特性。構形表位和非構形表位的區別在於在變性溶劑或破壞蛋白質或其多聚體的三維結構的其他劑之存在下，與前者之結合會喪失，而與後者之結合則否。表位可包含直接涉及結合的胺基酸殘基和不直接涉及結合的其他胺基酸殘基，諸如當抗體與抗原結合時被抗體有效地阻斷或覆蓋之胺基酸殘基。
如本文中所使用，術語「單株抗體」、「單株Ab」、「單株抗體組成物」、「mAb」等意指具有單一分子組成之抗體分子之製劑，並且通常對特定表位展現單一結合特異性和親和力。單株抗體通常可由相同的細胞所產生，該等細胞皆為獨特的親本細胞之殖株，諸如，例如，融合瘤、穩定細胞株等。據此，術語「人類單株抗體」意指展現單一結合特異性之抗體，其具有衍生自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列之可變區和恆定區。人類單株抗體可由融合瘤產生，該融合瘤包括從轉基因或轉染色體非人類動物(諸如，轉基因小鼠)獲得之B細胞，其具有與永生化細胞融合之包含人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因之基因組。人類單株抗體可衍生自人類B細胞或漿細胞。單株抗體也可從經重組修飾之宿主細胞或使用支持編碼抗體之核酸序列之活體外轉錄及/或轉譯之細胞萃取物之系統生產。
如本文中所使用，術語「同型」意指免疫球蛋白類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)或其任何異型，諸如由重鏈恆定區基因所編碼之IgG1m(za)和IgG1m(f)。又，各重鏈同型可與卡帕(κ)或拉目達(λ)輕鏈組合。
如本文中所使用，術語「全長抗體」意指包含一對重鏈和輕鏈或兩對重鏈和輕鏈之抗體(例如，親本抗體或變體抗體)，各對含有重鏈和輕鏈恆定和可變域，諸如通常在該同型之野生型抗體的重鏈-輕鏈對中發現的域。因此，例如，全長IgG1抗體含有VH、CH1、CH2、CH3、鉸鏈、VL以及CL域。在全長變體抗體中，重鏈和輕鏈恆定和可變域可特別含有胺基酸取代，其與全長親本或野生型抗體相比時，修飾及/或改善抗體的功能性質。根據本發明之全長抗體可由包含下列步驟之方法產生：(i)將CDR序列選殖入包含完整重鏈和輕鏈序列之一或多個合適的載體中，以及(ii)在合適的表現系統中表現所獲得之具有重鏈和輕鏈序列之合適的載體。當從CDR序列或完整可變區序列開始時，產生全長抗體為技術人員的知識範圍內。因此，技術人員知道如何產生根據本發明之全長抗體。
如本文中所使用，術語「人源化抗體」意指基因改造之非人類抗體，其含有人類抗體恆定域和經修飾以含有與人類可變域有高水平序列同源性之非人類可變域。這可藉由將一起形成抗原結合位點之非人類抗體互補決定區(CDR)移植到同源人類受體框架區(FR)上而達成(參見，尤其是WO92/22653和EP0629240)。為了完全重建親本抗體的結合親和力和特異性，可能需要經來自親本抗體(亦即，非人類抗體)的一些框架殘基取代一些人類框架殘基(回復突變)。結構同源性建模可能有助於識別框架區中對抗體結合性質為重要的之胺基酸殘基。因此，人源化抗體可包含非人類CDR序列、視需要地包含對非人類胺基酸序列之一或多個胺基酸回復突變之主要人類框架區以及完全人類恆定區。視需要地，可應用額外的胺基酸修飾(其不一定是回復突變)，以獲得具有較佳特性之人源化抗體，諸如特別有用的親和力和生化性質，例如，以包括避免脫醯胺及/或改善製造之修飾。此外，可修飾CDR及/或框架區以改善對抗原的親和力(例如，經由親和力成熟程序)。
如本文中所使用，術語「人類抗體」意指具有衍生自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。人類抗體可包括不由人類生殖細胞系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如，由活體外隨機或定點突變或活體內體細胞突變引入的突變)。然而，如本文中所使用，術語「人類抗體」不旨在包括其中衍生自另一種哺乳動物物種(諸如，小鼠)之生殖細胞系的CDR序列已被移植到人類框架序列上的抗體。本發明之人類單株抗體可由多種技術生產，包括傳統單株抗體方法，例如，Kohler and Milstein, Nature256: 495(1975)之標準體細胞雜交技術。雖然體細胞雜交方法為較佳的，但原則上，也可採用用於生產單株抗體之其他技術，例如，B淋巴球之病毒或致癌轉化或使用人類抗體基因庫的噬菌體展示技術。人類單株抗體可使用攜帶人類免疫系統之部分而非小鼠系統的轉基因或轉染色體小鼠生產，諸如HCo12小鼠(參見，例如，WO 03/059282)等。
如本文中所使用，術語「Fc區」意指從抗體的兩條重鏈多肽的N端至C端方向至少包含鉸鏈區、CH2區以及CH3區。Fc多肽通常經糖基化。抗體的Fc區域可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統的各種細胞(諸如，效應細胞)和補體系統之組分。Fc區通常也與FcRn和蛋白 A結合。
如本文中所使用，片語「對應…位置…處之胺基酸之胺基酸」等意指人類IgG1重鏈中之胺基酸位置編號。藉由與人類IgG1排比，可找到其他免疫球蛋白中對應的胺基酸位置。除非另有說明或與前後文矛盾，否則本文中恆定區序列之胺基酸係根據EU編號索引編號(描述於Kabat，E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition-US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662, 680, 689)。因此，一個序列中與另一個序列中的胺基酸或片段「對應」的胺基酸或片段是使用標準序列排比程式諸如ALIGN、ClustalW或類似者(通常為預設設定)與另一胺基酸或片段排比，並且與人類IgG1重鏈具有至少50%、至少80%、至少90%或至少95%同一性之胺基酸或片段。如何排比序列或序列中的片段並從而確定序列中與根據本發明之胺基酸位置對應的位置被認為是發明所屬技術領域中熟知的。
如本文中所使用，術語「鉸鏈區」意指免疫球蛋白重鏈的鉸鏈區。因此，例如，人類IgG1抗體的鉸鏈區對應根據Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition-US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662, 680, 689 (1991)中所述之EU編號。然而，鉸鏈區也可為本文中所述之任何其他亞型。
如本文中所使用，術語「CH1區」或「CH1域」意指免疫球蛋白重鏈的CH1區。因此，例如，人類IgG1抗體的CH1區對應根據Kabat中所述之Eu編號的胺基酸118至215(同上)。然而，CH1區也可為本文中所述之任何其他亞型。
如本文中所使用，術語「CH2區」或「CH2域」意指免疫球蛋白重鏈的CH2區。因此，例如，人類IgG1抗體的CH2區對應根據Kabat中所述之Eu編號的胺基酸231至340(同上)。然而，CH2區也可為本文中所述之任何其他亞型。
如本文中所使用，術語「CH3區」或「CH3域」意指免疫球蛋白重鏈的CH3區。因此，例如，人類IgG1抗體的CH3區對應根據Kabat中所述之Eu編號的胺基酸341至447(同上)。然而，CH3區也可為本文中所述之任何其他亞型。
如本文中所使用，術語「Fc介導之效應功能」旨在意指由於多肽或抗體與其在細胞膜上的標靶或抗原結合而產生的功能，其中Fc介導之效應功能可歸因於多肽或抗體之Fc區。Fc介導之效應功能之實例包括(i)C1q結合、(ii)補體活化、(iii)補體依賴性細胞毒性(CDC)、(iv)抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、(v)Fc-γ受體(FcgR)結合、(vi)抗體依賴性FcγR介導之抗原交聯、(vii)抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、(viii)補體依賴性細胞毒性(CDCC)、(ix)補體增強之細胞毒性，(x)與由抗體介導之調理抗體的補體受體之結合，(xi)調理作用，以及(xii)(i)至(xi)中任一者之組合。
如本文中所使用，術語「惰性(intertness)」、「惰性(inert)」或「非活化」意指一種Fc區，其不能或具有最小能力與任何FcγR結合、誘導Fc介導之FcγR交聯，誘導FcγR介導之效應功能(諸如，ADCC和ADCP)、經由個別抗體之兩個Fc區誘導FcγR介導之標靶抗原交聯及/或不能與C1q結合且誘導補體介導之效應功能(諸如，CDC和CDCC)之。抗體Fc區之惰性可使用單特異性或雙特異性形式之抗體測試。
在本發明之背景下，術語「單價抗體」意指可與抗原交互作用、僅具有一個抗原結合域(例如，一個Fab臂)之抗體分子。在多特異性抗體(諸如，雙特異性抗體)之背景下，「單價抗體結合」意指多特異性抗體與僅具有一個抗原結合域(例如，一個Fab臂)之一種抗原之結合。
在本發明之背景下，術語「單特異性抗體」意指僅對一種抗原、一個表位具有結合特異性的抗體。抗體可為單特異性、單價抗體(亦即，僅攜帶一個抗原結合區)、單特異性、二價抗體(例如，具有兩個相同抗原結合區之抗體)或單特異性、多價抗體(例如，具有超過兩個抗原結合區之抗體)。
術語「多特異性抗體」意指具有與二或更多個不同表位結合之二或更個多抗原結合域之抗體。術語「雙特異性抗體」意指具有與不同表位結合之兩個抗原結合域之抗體，例如，兩對不同的VH和VL區、兩個不同的Fab臂或兩個具有不同CDR區之Fab臂。在本發明之背景下，雙特異性抗體對兩個不同表位具有特異性，並且多特異性抗體對二或更多個不同表位具有特異性。此類表位可位於相同或不同的抗原或標靶上。若表位位於不同抗原上，則此類抗原可位於相同細胞或不同細胞、細胞類型或結構上，諸如細胞外基質或囊泡以及可溶性蛋白質。因此，多特異性和雙特異性抗體可能能與多種抗原(例如，兩種不同細胞)交聯。
術語「二價抗體」意指具有兩個抗原結合區之抗體，其中所述抗原結合區可為相同的且與相同的表位結合，或者可為不相同的且與可以位於(多個)相同或不同抗原上之不同表位結合。因此，二價抗體可為單特異性抗體或雙特異性抗體。
在本文中，術語「胺基酸」和「胺基酸殘基」可互換地使用，並且不應理解為限制性的。胺基酸為含有胺(-NH 2)和羧基(-COOH)官能基以及各胺基酸特有的側鏈(R 基團)之有機化合物。在本發明之背景下，胺基酸可基於結構和化學特性分類。因此，胺基酸之類別可反映在下表中中之一者或二者：
一種胺基酸取代另一種胺基酸可分為保守性或非保守性取代。在本發明之背景下，「保守性取代」是經具有相似結構及/或化學特性之另一個胺基酸取代一個胺基酸，此類經一個胺基酸殘基取代相同類別的另一個胺基酸殘基係如以上兩個表中的任一者中所定義：例如，保守性取代可為經異白胺酸取代白胺酸，因為皆為脂族支鏈疏水物。類似地，保守性取代之實例是經麩胺酸取代天冬胺酸，因為皆為小的、帶負電之殘基。
在本發明之背景下，抗體中之取代表示為：原始胺基酸-位置數-經取代之胺基酸；
參考公認的胺基酸命名法，使用三字母代碼或一字母代碼，包括代碼「Xaa」或「X」以表示任何胺基酸殘基。因此，Xaa或X通常可代表20種天然存在的胺基酸中的任一者。如本文中所使用，術語「天然存在的」意指下列胺基酸殘基中之任一者；甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、麩胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸以及半胱胺酸。
據此，符號「K409R」或「Lys409Arg」表示抗體包含在胺基酸位置409處之離胺酸經精胺酸之取代。在給定位置之胺基酸經任何其他胺基酸之取代稱為：原始胺基酸-位置；或，例如，「K409」。對於其中(多種)原始胺基酸及/或(多種)經取代之胺基酸可包含超過一個但不是所有胺基酸之修飾，該超過一個胺基酸可用「、」或「/」分開。例如，在位置409處之離胺酸經精胺酸、丙胺酸或苯丙胺酸之取代為：「Lys409Arg,Ala,Phe」或「Lys409Arg/Ala/Phe」或「K409R,A,F」或「K409R/A/F」或「K409成R、A或F」。在本發明之背景下，此類名稱可互換地使用，但具有相同的含義和目的。
此外，術語「取代」涵蓋取代入任一種或其他十九種天然胺基酸內，或取代入其他胺基酸內，諸如非天然胺基酸。例如，位置409之胺基酸K之取代包括下列各取代：409A、409C、409D、409E、409F、409G、409H、409I、409L、409M、409N、409Q、409R、409S、409T、409V、409W、409P以及409Y。此等取代也可指定為K409A、K409C等或K409A、C等或K409A/C/等。這同樣適用於本文中提及的各位置，以具體地包括本文中之此類取代之任一者。
如本文中所使用，術語「宿主細胞」旨在意指已引入核酸(諸如，表現載體)之細胞。應理解，此類術語不僅意旨在指特定的受試細胞，而且也可包括此類細胞的後代。因為由於突變或環境影響而某些修飾可能在後續世代中發生此類後代實際上可能與親本細胞不同，但仍包括在本文中所使用之術語「宿主細胞」之範疇內。重組宿主細胞(亦即，用於產生重組蛋白之宿主細胞)包括，例如，轉染瘤(諸如，CHO細胞、HEK-293細胞、Expi293F細胞、PER.C6細胞、NS0細胞以及淋巴細胞)，以及原核細胞(諸如，大腸桿菌)以及其他真核宿主(諸如，植物細胞和真菌)。
本文中所使用之術語「轉染瘤」包括表現抗體或標靶抗原的重組真核宿主細胞，諸如CHO細胞、PER.C6細胞、NS0細胞、HEK-293細胞、Expi293F細胞、植物細胞或真菌，包括酵母菌細胞。
出於本發明之目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)演算法在參考序列的長度上測定兩個胺基酸序列之間之序列同一性(Needleman and Wunsch, 1970, J.Mol.Biol.48: 443-453)，如在EMBOSS套件(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)的尼德(Needle)程式中實現，較佳版本為5.0.0或更高版本。使用之參數係空隙開放罰分為10、空隙延伸罰分為0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62之EMBOSS版本)取代矩陣。將標記為「最長同一性」的尼德輸出(使用-nobrief 選項獲得)用作百分比同一性，並且計算如下： (相同殘基×100)/(排比長度-排比中的空隙總數)。
相似殘基之保留也可或替代地以相似性評分來測量，如使用BLAST程序(例如，可通過NCBI獲得的BLAST 2.2.8，該NCBI係使用標準設定BLOSUM62、開放空隙=11以及延伸空隙=1)測定。合適的變體通常展現至少約45%，諸如至少約55%、至少約65%、至少約75%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更多(例如，約99%)與親本或參考序列的相似性。 本發明之另外的態樣和具體例醫藥組成物
於一態樣中，本發明有關一種醫藥組成物，其包含： a)多特異性抗體，其包含能與人類CD30結合之抗原結合區和能與人類CD3結合之抗原結合區；以及 b)緩衝劑 其中該組成物之pH為約4.0至約8.0。
於一具體例中，緩衝劑係選自由乙酸鹽、組胺酸、TRIS ®(三(羥甲基)胺基甲烷)、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙醇酸鹽、麩胺酸鹽及其混合物所組成群組。於又一具體例中，緩衝劑為組胺酸、乙酸鹽及/或其混合物。於一較佳具體例中，緩衝劑為乙酸鹽。乙酸鹽緩衝劑可選自由乙酸鈉(natrium acetate)、乙酸鉀、乙酸鈉(sodium acetate)、其水合物及其混合物所組成群組。於一較佳具體例中，緩衝劑為乙酸鈉，諸如乙酸鈉三水合物。
設定緩衝劑的濃度以維持pH值。於一具體例中，緩衝劑以約5至約40 mM、諸如約10至約30 mM，諸如約15至約25 mM，諸如約18至約22 mM，較佳為約20 mM，諸如約17 mM之濃度存在。
醫藥組成物之pH在約4.0至約8.0之間。於一具體例中，組成物之pH為約4.5至約6.5，諸如約5.0至約6.0，諸如約5.2至約5.7，諸如約5.4至約5.6，較佳為約5.5。於一具體例中，組成物之pH為約5.5。於又一具體例中，組成物之pH為約6.0。
醫藥組成物之pH可用pH調節組分調節以獲得所期望之組成物之pH。因此，於一具體例中，醫藥組成物進一步包含pH調節組分。於又一具體例中，pH調節組分微酸。於甚至又一具體例中，酸為HCl及/或乙酸。於一較佳具體例中，酸為冰乙酸。
pH調節組分之濃度會取決於數個因素，諸如pH調節組分。然而，於一具體例中，pH調節組分以約0.1至30 mM，諸如約0.3至25mM，如約0.5至20 mM，諸如約0.6至15 mM，如約1至10 mM，諸如約2至5 mM，如約3 mM之濃度存在。於一較佳具體例中，醫藥組成物包含3 mM冰乙酸。
於一具體例中，緩衝劑為濃度為約5至40 mM，諸如約10至30mM，諸如約20 mM之乙酸鹽，並且組成物之pH為約5至6，諸如約5.5。於較佳具體例中，緩衝劑之濃度為約10至30 mM之乙酸鹽，並且組成物之pH為約5.5。於又一較佳具體例中，緩衝劑為濃度為約20 mM之乙酸鹽，並且組成物之pH為約5.5。於又一較佳具體例中，組成物包含約17 mM乙酸鈉和約3 mM冰乙酸，並且組成物之pH為約5.5。
醫藥組成物可有利地包含緩衝劑和多特異性抗體以外之另外的成分。因此，於又一具體例中，醫藥組成物進一步包含非離子賦形劑。
非離子賦形劑可為發明所屬技術領域中技術人員已的。然而，於較佳具體例中，非離子賦形劑為糖或糖醇。於又一具體例中，非離子賦形劑係選自蔗糖、海藻糖、甘露醇、木糖醇、山梨醇及其混合物。於一較佳具體例中，非離子賦形劑係選自山梨醇、蔗糖、海藻糖或其混合物。在更佳具體例中，非離子賦形劑為山梨醇或海藻糖。於最佳具體例中，非離子賦形劑為山梨醇。
非離子賦形劑會以醫藥用途可接受之濃度加入。於一具體例中，非離子賦形劑以約5至約450 mM，諸如約50至約400 mM，如約100至約350 mM，諸如約125至約300 mM，如約150至約275 mM，較佳為約250mM之濃度存在。
於又一具體例中，非離子賦形劑以約350 mM、或約340 mM、或約330 mM、或約320 mM、或約310 mM、或約300 mM、或約290 mM、或約280 mM、或約270 mM、或約260 mM、或約250 mM、或約240 mM、或約230 mM、或約220 mM、或約210 mM、或約200 mM、或約190 mM、或約180 mM、或約170 mM、或約160 mM、或約150 mM、或約140 mM、或約130 mM、或約120 mM、或約110 mM、或約100 mM、或約90 mM、或約80 mM、或約70 mM、或約60 mM、或約50 mM、或約40 mM、或約30 mM、或約20 mM、或約10 mM之濃度存在。
於一具體例中，醫藥組成物包含約100至350 mM山梨醇，諸如約200至300 mM山梨醇，諸如約250 mM山梨醇。因此，於又一具體例中，醫藥組成物包含乙酸鹽，諸如乙酸鈉和山梨醇，並且具有約5.5之pH。
於甚至又一具體例中，醫藥組成物中之乙酸鹽緩衝劑與山梨醇之濃度比為2：10與2：40之間，諸如2：15與2：35之間，諸如2：20與2：30之間，例如，2：25。
醫藥組成物可有利地包含甚至另外的成分。於一具體例中，醫藥組成物進一步包含界面活性劑。
界面活性劑可為已知用於醫藥組成物之一系列界面活性劑。於一具體例中，界面活性劑係選自單油酸甘油酯、氯化苯索寧、多庫酯鈉、磷脂質、聚乙烯烷基醚、十二烷基硫酸鈉和三辛酸甘油酯、苯扎氯銨、西曲溴銨、氯化十六烷基吡啶鎓和磷脂質、α生育醇、單油酸甘油酯、肉荳蔻醇、磷脂質、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧羥基硬脂酸酯、聚氧基甘油酯、聚山梨酐酯、丙二醇二-十二酸酯、丙二醇單十二酸酯、山梨醇酯蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖硬脂酸酯、三辛酸甘油酯和TPGS及其混合物。於較佳具體例中，界面活性劑為聚山梨醇酯。於更佳具體例中，界面活性劑為聚山梨醇酯20(PS20)或聚山梨醇酯80(PS80)。於最佳具體例中，界面活性劑為聚山梨醇酯80(PS80)。
以醫藥用途可接受之濃度加入界面活性劑。於一具體例中，界面活性劑以約0.01至約0.1% w/v，諸如約0.01至約0.09% w/v，諸如約0.01至約0.06% w/v，諸如約0.01至約0.05% w/v，諸如約0.02% w/v、約0.03% w/v、約0.04% w/v或約0.05% w/v，較佳為約0.02% w/v之濃度存在。
醫藥組成物之整體性質(諸如，滲透壓和黏度)受到醫藥組成物中之組分和組分濃度之影響。於一具體例中，醫藥組成物之滲透壓低於約600 mOsm/kg，諸如低於約550 mOsm/kg，諸如低於約500 mOsm/kg，諸如低於約450 mOsm/kg，諸如低於約400 mOsm/kg，諸如低於約350 mOsm/kg。
於又一具體例中，醫藥組成物之滲透壓在約100至500 mOsm/kg之範圍內，諸如在約200至400 mOsm/kg之範圍內，如在約250至350 mOsm/kg之範圍內。
於甚至又一具體例中，醫藥組成物之滲透壓為約250 mOsm/kg、或約260 mOsm/kg、或約270 mOsm/kg、或約280 mOsm/kg、或約290 mOsm/kg、或約300 mOsm/kg、或約310 mOsm/kg、或約320 mOsm/kg、或約330 mOsm/kg、或約340 mOsm/kg、或約350 mOsm/kg。
於仍又一具體例中，醫藥組成物之黏度低於約30 cP，諸如低於約25 cP，諸如低於約20 cP，諸如低於約18 cP，諸如低於約16 cP，諸如低於約14 cP，諸如低於約12 cP，諸如低於約10 cP，諸如低於約9 cP，諸如低於約8 cP，諸如低於約7 cP，諸如低於約6 cP，諸如低於約5 cP，諸如低於約4 cP，諸如低於約3 cP，諸如低於約2 cP。
於又一具體例中，醫藥組成物之黏度在約1至30 cP之範圍內，諸如在約1至25 cP之範圍內，如在約1至20 cP之範圍內，諸如在約1至18cP之範圍內，如在約1至15 cP之範圍內，諸如在約1至12 cP之範圍內，如約1至10cP，諸如約1至9 cP，如約1至8 cP，諸如約1至7 cP，如約1至6cP，諸如約1至5 cP，如約1至4 cP，諸如約1至3 cP。
於仍又一具體例中，醫藥組成物之黏度為約2 cP、或約2.5 cP、或約3 cP、或約3.5 cP、或約4 cP、或約4.5 cP、或約5 cP、或約5.5 cP、或約6 cP、或約6.5 cP、或約7 cP、或約7.5 cP、或約8 cP、或約8.5 cP、或約9 cP、或約9.5 cP、或約10 cP、或約10.5 cP、或約11 cP、或約11.5 cP、或約12 cP、或約12.5 cP、或約13 cP、或約13.5 cP、或約14 cP、或約14.5 cP、或約15 cP、或約15.5 cP、或約16 cP、或約16.5 cP、或約17 cP、或約17.5 cP、或約18 cP、或約18.5 cP、或約19 cP、或約19.5 cP、或約20 cP。
醫藥組成物包含能與CD30和CD3兩者結合之多特異性抗體。於一具體例中，抗體之濃度為約0.5至約250 mg/ml，諸如約1.0至約220 mg/ml，諸如約3至約190 mg/ml，諸如約5至約160 mg/ml，諸如約10至約130 mg/ml，或諸如約20至約120 mg/ml，諸如約30至約110 mg/ml，諸如約40至約100 mg/ml，諸如約50至約90 mg/ml，諸如約60至約80 mg/ml，或諸如約65至約75 mg/ml，如約70 mg/ml。
於又一具體例中，抗體之濃度為約50至約250 mg/ml，諸如約60至約240 mg/ml，諸如約70至約220 mg/ml，諸如約80至約210 mg/ml，諸如約100至約200 mg/ml，諸如約120至約190 mg/ml，諸如約130至約180 mg/ml，諸如約135至約165 mg/ml，或諸如約150至約190 mg/ml。
於又一具體例中，抗體之濃度為約10 mg/ml、或約12 mg/ml、或約14 mg/ml、或約16 mg/ml、或約18 mg/ml、或約20 mg/ml、或約22 mg/ml、或約24 mg/ml、或約26 mg/ml、或約28 mg/ml、或約30 mg/ml、或約32 mg/ml、或約34 mg/ml、或約36 mg/ml、或約38 mg/ml、或約40 mg/ml、或約42 mg/ml、或約44 mg/ml、或約46 mg/ml、或約48 mg/ml、或約50 mg/ml、或約52 mg/ml、或約54 mg/ml、或約56 mg/ml、或約58 mg/ml、或約60 mg/ml、或約62 mg/ml、或約64 mg/ml、或約66 mg/ml、或約68 mg/ml、或約70 mg/ml、或約72 mg/ml、或約74 mg/ml、或約76 mg/ml、或約78 mg/ml、或約80 mg/ml、或約82 mg/ml、或約84 mg/ml、或約86 mg/ml、或約88 mg/ml、或約90 mg/ml、或約92 mg/ml、或約94 mg/ml、或約96 mg/ml、或約98 mg/ml、或約100 mg/ml、或約102 mg/ml、或約104 mg/ml、或約106 mg/ml、或約108 mg/ml、或約110 mg/ml、或約112 mg/ml、或約114 mg/ml、或約116 mg/ml、或約118 mg/ml、或約120 mg/ml、或約122 mg/ml、或約124 mg/ml、或約126 mg/ml、或約128 mg/ml、或約130 mg/ml、或約132 mg/ml、或約134 mg/ml、或約136 mg/ml、或約138 mg/ml、或約140 mg/ml、或約142 mg/ml、或約144 mg/ml、或約146 mg/ml、或約148 mg/ml、或約150 mg/ml、或約152 mg/ml、或約154 mg/ml、或約156 mg/ml、或約158 mg/ml、或約160 mg/ml、或約162 mg/ml、或約164 mg/ml、或約166 mg/ml、或約168 mg/ml、或約170 mg/ml、或約172 mg/ml、或約174 mg/ml、或約176 mg/ml、或約178 mg/ml、或約180 mg/ml、或約182 mg/ml、或約184 mg/ml、或約186 mg/ml、或約188 mg/ml、或約190 mg/ml、或約192 mg/ml、或約194 mg/ml、或約196 mg/ml、或約198 mg/ml、或約200 mg/ml。
醫藥組成物較佳為液體組成物。因此，於一具體例中，醫藥組成物為液體組成物。於又一具體例中，醫藥組成物為水性組成物。
即使在儲存給定時段後，醫藥組成物較佳為用於醫藥用途之穩定組成物。於一具體例中，醫藥組成物為穩定之醫藥組成物。穩定之醫藥組成物將被解讀為與穩定之醫藥組成物為可互換的。
於一具體例中，醫藥組成物在至少2個月，諸如至少3個月，諸如至少6個月，諸如至少9個月，諸如至少12個月之期間內呈穩定的。
此外，醫藥組成物在約10 mg/ml至約250 mg/ml，諸如約20 mg/ml至約70 mg/ml、或約150 mg/ml或約175 mg/ml、或約175 mg/ml或約200 mg/ml之寬抗體濃度範圍內呈穩定的。於一具體例中，醫藥組成物在約10 mg/ml至約250 mg/ml，諸如約20 mg/ml至約200 mg/ml，諸如約50 mg/ml至之約170 mg/ml之寬抗體濃度範圍內呈穩定的。
又，醫藥組成物在諸如約2℃至約25℃之溫度範圍內呈穩定的。於一具體例中，醫藥組成物在諸如約2℃至約25℃之溫度範圍內呈穩定的。
令人類驚訝地，在溫度從約2℃改變至約25℃或甚至更高溫度下，調配物會在如此寬的抗體濃度範圍內呈穩定的。當在2℃至8℃之間儲存時，本發明之組成物呈穩定至少3個月，諸如至少6個月，或甚至至少9個月或至少12個月。在約2至8℃，諸如約5℃之儲存溫度下，組成物之醫藥用途較佳呈穩定至少2個月，諸如至少3個月，諸如至少4個月，諸如至少5個月，諸如至少6個月，諸如至少9個月或至少12個月。於一具體例中，在約2至8℃、諸如約5℃之儲存溫度下，醫藥組成物醫藥用途呈穩定12個月。
醫藥組成物可例如作為皮下或靜脈組成物投予。於一具體例中，醫藥組成物為皮下組成物，及/或其中該組成物用於皮下投予。於另一具體例中，醫藥組成物為靜脈組成物，及/或其中該組成物用於靜脈投予。
本文中所述之醫藥組成物可藉由在水中混合醫藥組成物之組分而製備。因此，本發明之另一態樣有關一種製備本文中所定義之醫藥組成物之方法，其包含在水中混合之步驟： a)多特異性抗體，諸如約0.5至約250 mg/ml之抗體， b)緩衝劑， 視需要地，c)非離子賦形劑，以及 視需要地，d)界面活性劑； 調節pH至4.0至8.0左右。
醫藥組成物和醫藥調配物在本文中可互換地使用。 多特異性抗體形式
本發明提供包含能與CD30和CD3結合之多特異性抗體之醫藥組成物。於一具體例中，多特異性抗體包含： (i)CD30結合區，其分別包含第一重鏈可變區與第一輕鏈可變異區域，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變異區域分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區與第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3。
於一具體例中，SEQ ID NO：9中之X為H。於另一具體例中，SEQ ID NO：9中之X為G。
於一具體例中，第一重鏈可變區為人類的或人源化的。在另一具體例中，第一輕鏈可變區為人類的或人源化的。於一具體例中，第二重鏈可變區為人類的或人源化的。於另一具體例中，第二輕鏈可變區為人類的或人源化的。於另一具體例中，第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區為人類的。於另一具體例中，第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區為人源化的。於另一具體例中，第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區為人類的。於另一具體例中，第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區為人源化的。於另一具體例中，第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區為人類的，並且第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區為人類的。於另一具體例中，第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區為人類的，並且第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區為人源化的。
如技術人員熟知的，抗體之各抗原結合區通常包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，並且各可變區包含三個CDR序列(分別為CDR1、CDR2以及CDR3)，並且可以包含四個框架序列(分別為FR1、FR2、FR3以及FR4)。較佳地，此結構也存在於根據本發明之抗體中。於一具體例中，所述四個框架序列中的一、二、三個或全部為人類框架序列。
如上所述，根據本發明之醫藥組成物包含多特異性抗體，該多特異性抗體包含能與人類CD30結合之抗原結合區，其序列係如SEQ ID NO：39所示。特別地，根據本發明之抗體為其中所述能與人類CD30結合之抗原結合區能與人類CD30 (諸如，細胞(更佳為腫瘤細胞)上表現之CD30分子)之胞外域結合。
如所述，醫藥組成物包含抗體，該抗體包含CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列。
可使用發明所屬技術領域中已知之方法從可變重鏈和輕鏈區識別CDR1、CDR2以及CDR3區。來自所述可變重鏈和輕鏈區之CDR區已根據IMGT註釋(參見Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, Developmental and Comparative Immunology, 27(1), 55-77 (2003))。
於一具體例中，與CD30結合之抗原結合區包含： ˙(第一)重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：13之序列或與SEQ ID NO：13之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%胺基酸序列同一性之序列；以及， ˙(第一)輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：14之序列或與SEQ ID NO：14之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%胺基酸序列同一性之序列。
於又一具體例中，根據本發明之醫藥組成物中所使用之抗體包含與本文中所定義之CD30結合之抗原結合區之重鏈可變(VH)區，其中該等序列包含與SEQ ID NO：13相比時，總共至多1、2、3、4或5個胺基酸取代。
於又一具體例中，根據本發明之醫藥組成物中所使用之抗體包含與本文中所定義之CD30結合之抗原結合區之輕鏈可變(VL)區，其中該等序列包含與SEQ ID NO：14相比時，總共至多1、2、3、4或5個胺基酸取代。
於又一具體例中，第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：13所示之序列，並且第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO：14所示之序列。
此類能與人類CD30結合之抗原結合區已尤其在WO03059282(Medarex)中描述，其係以引用方式納入本文中。
根據本發明之醫藥組成物中所使用之抗體可以與人類CD30結合之抗原結合區之間之平衡解離常數K D結合，並且人類CD30在0.1至20 nM之範圍內，例如在0.5至5 nM之範圍內，諸如在1.5至2 nM之範圍內(單價結合)。所述結合親和力可由生物層干涉測量法測定。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之抗體也可與食蟹獼猴CD30(SEQ ID NO：40)結合。
如上所述，根據本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體包含能與人類CD3結合之抗原結合區。此外，本發明提供能與人類CD3ε(艾普西隆)(諸如，SEQ ID NO：42中指定的人類CD3ε(艾普西隆))結合之根據本發明之醫藥組成物中所使用之抗體。此類抗原結合區能與於T細胞(諸如，初生人類T細胞)上呈現之人類CD3ε(艾普西隆)結合。
如所述，抗體包含CD3結合區，該CD3結合區包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列。
於一具體例中，與CD3結合之抗原結合區包含： ˙(第二)重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：15之序列或具有與SEQ ID NO：15之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%胺基酸序列同一性之序列；以及， ˙(第二)輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：16之序列或與所具有與SEQ ID NO：16之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%胺基酸序列同一性之序列。
於又一具體例中，根據本發明之醫藥組成物中所使用之抗體包含與本文中所定義之CD3結合之抗原結合區之重鏈可變(VH)區，其中該等序列包含與SEQ ID NO：15相比時，總共至多1、2、3、4或5個胺基酸取代。
於又一具體例中，根據本發明之醫藥組成物中所使用之抗體包含與本文中所定義之CD3結合之抗原結合區之輕鏈可變(VL)區，其中該等序列包含與SEQ ID NO：16相比時，總共至多1、2、3、4或5個胺基酸取代。
於又一具體例中，第二重鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示之序列，並且第二輕鏈可變區包含SEQ ID NO：16所示之序列。於一具體例中，SEQ ID NO：15中之X為H。於另一具體例中，SEQ ID NO：15中之X為G。
此類能與人類CD3結合之抗原結合區已在尤其於WO2015/001085(Genmab)中描述，其係以引用方式納入本文中。變體(諸如，包含SEQ ID NO：9所示之VH CDR3區之變體，其中X為G)對人類CD3結合之親和力比其中X為H之親本抗體低已於WO2017/009442(Genmab)之實施例2中描述，其係以引用方式納入本文中。
根據本發明之醫藥組成物中所使用之抗體可以與人類CD3結合之抗原結合區之間之平衡解離常數K D結合，並且人類CD3在5至30 nM之範圍內，諸如在10至20 nM之間(對於單價結合而言)。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之抗體也可與食蟹獼猴CD3(SEQ ID NO：43)結合。
於另一具體例中，醫藥組成物包含多特異性抗體，該多特異性抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：13所示之序列，以及該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO：14所示之序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示之序列，以及該第二輕鏈可變區包含SEQ ID NO：16所示之序列。 醫藥組成物內所包含之抗體形式
本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體可具有二或多種特異性，諸如二或三種或更多種特異性。此外，多特異性抗體可具有超過一個拷貝的用於CD3及/或CD30之抗原結合區。例如，於一具體例中，抗體具有能與CD3結合之兩個抗原結合區，諸如與CD3結合之兩個相同的結合區。例如，於另一具體例中，抗體具有與CD30結合之兩個抗原結合區，諸如與CD30結合之兩個相同的結合區。額外的抗原結合區可例如以與恆定區共價連接之scFv形式存在。
於較佳具體例中，本發明之醫藥組成物包含為雙特異性抗體之多特異性抗體。雙特異性抗體之許多不同形式和用途為發明所屬技術領域中已知的，並且由 Kontermann(Drug Discov Today, 2015 Jul; 20(7):838-47和MAbs, 2012 Mar-Apr;4(2):182-97)以及Labrijn et al. (2019 Nat Rev Drug Discov 18(8) 585-608)審查。根據本發明之雙特異性抗體可不限於任何特定之雙特異性形式或產生比之方法。
根據本發明之醫藥組成物中可包含之雙特異性抗體分子之實例包含(i) 單一抗體，其具有包含不同抗原結合區之兩個臂；(ii)單鏈抗體，其對兩個不同標靶具有特異性，例如，經由額外的胜肽連接子串聯連接之兩個scFv；(iii)雙可變域抗體(DVD-Ig)，其中各輕鏈和重鏈含有通過短胜肽鍵聯串聯之兩個可變域(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010))；(iv)化學連結之雙特異性(Fab’)2片段； (v)Tandab，其為導致對各標靶抗原具有兩個結合位點之四價雙特異性抗體之兩個單鏈雙抗體之融合物；(vi)可撓性體(flexibody)，其為導致多價分子之scFv與雙抗體之組合，；(vii)所謂「對接及鎖定(dock and lock)」分子，其係基於蛋白質激酶A中之「二聚合及對接域」，當將其施加至Fab時，其可得到由與不同Fab片段連接之兩個相同的Fab片段所組成之三價雙特異性結合蛋白；(viii)所謂蠍(Scorpion)分子，其包含例如與人類Fc臂之兩個末端融合之兩個scFv；以及(ix)雙抗體。
不同類別的雙特異性抗體的另外的實例包括但不限於(i)類IgG分子，其具有互補性CH3域以強制異二聚合；(ii)重組類IgG雙標靶分子，其中該分子兩側均含有至少兩種不同抗體之Fab片段或部分Fab片段；(iii)IgG融合分子，其中全長IgG抗體與額外的Fab片段或部分Fab片段融合；(iv) Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩定之雙抗體與重鏈恆定域、Fc區或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起，與重鏈恆定域、Fc區或其部分融合；(vi)scFv和雙抗體系及重鏈抗體(例如，域抗體、奈米抗體)，其中不同的單鏈Fv分子或不同的雙抗體或不同的重鏈抗體(例如，域抗體、奈米抗體)彼此融合，或與重鏈恆定域、Fc區或其部分融合的另一種蛋白質或載體分子融合。
具有互補性CH3域分子的類IgG分子之實例包括但不限於Triomab/Quadroma分子(Trion Pharma/ Fresenius Biotech; Roche, WO2011069104)、所謂「旋鈕入孔(Knobs-into-Holes)」分子(Genentech, WO9850431)、CrossMAbs(Roche, WO2011117329)和靜電匹配之分子(Amgen, EP1870459和WO2009089004；Chugai, US201000155133；Oncomed, WO2010129304)、LUZ-Y分子(Genentech, Wranik et al. J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi: 10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1)、DIG-body和PIG-body分子(Pharmabcine, WO2010134666, WO2014081202)、鏈交換工程域體(SEEDbody)分子(EMD Serono, WO2007110205)、Biclonics分子(Merus, WO2013157953、FcΔAdp分子(Regeneron, WO201015792)、雙特異性IgG1和IgG2分子(Pfizer/Rinat, WO11143545)、Azymetric支架分子(Zymeworks/Merck, WO2012058768)、mAb-Fv分子(Xencor, WO2011028952)、二價雙特異性抗體(WO2009080254)以及DuoBody ®分子(Genmab A/S, WO2011131746)。
重組類IgG雙標靶分子之實例包括但不限於雙標靶(DT)-Ig分子(WO2009058383)、二合一抗體(Genentech; Bostrom, et al 2009. Science 323, 1610-1614.)、交聯單株抗體(Karmanos Cancer Center)、mAb2 (F-Star, WO2008003116)、Zybody分子(Zyngenia; LaFleur et al. MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):208-18)與共同輕鏈接近(Crucell/Merus, US7,262,028)、κ/λ體 TM分子(NovImmune, WO2012023053)以及CovX-body(CovX/Pfizer; Doppalapudi, V.R., et al 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506.)。
IgG融合分子之實例包括但不限於雙可變域(DVD)-Ig分子(Abbott, US7,612,181)、雙域雙頭抗體(Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923)、類IgG雙特異性分子(ImClone/Eli Lilly, Lewis et al. Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8)、Ts2Ab(MedImmune/AZ; Dimasi et al. J Mol Biol. 2009 Oct 30;393(3):672-92)和BsAb分子(Zymogenetics, WO2010111625)、HERCULES分子(Biogen Idec, US007951918)、scFv融合分子(Novartis)、scFv融合分子(Changzhou Adam Biotech Inc,CN 102250246)以及TvAb分子(Roche, WO2012025525, WO2012025530)。
Fc融合分子之實例包括但不限於scFv/Fc融合(Pearce et al., Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep; 42(6):1179-88)、SCORPION分子(Emergent BioSolutions/ Trubion, Blankenship JW, et al. AACR 100th Annual meeting 2009 (Abstract # 5465); Zymogenetics/BMS, WO2010111625)、雙重親和力重靶向技術(Fc-based DART)分子(MacroGenics, WO2008157379, WO2010080538)以及Dual(scFv)2-Fab分子(National Research Center for Antibody Medicine-China)。
Fab融合雙特異性抗體之實例包括但不限於F(ab)2分子(Medarex/AMGEN; Deo et al., J Immunol. 1998 Feb15; 160(4):1677-86.)、雙重作用或雙Fab分子(Genentech, Bostrom, et al 2009. Science 323, 1610-1614.)、對接及鎖定(DNL)分子(ImmunoMedics, WO2003074569, WO2005004809)、雙價雙特異性分子(Biotecnol, Schoonjans, J Immunol. 2000 Dec 15;165(12):7050-7.)以及Fab-Fv分子(UCB-Celltech, WO 2009040562 A1)。
scFv、雙抗體系以及域抗體之實例包括但不限於雙特異性T細胞銜接(BiTE)分子(Micromet, WO2005061547)、串聯雙抗體分子(TandAb)(Affimed)Le Gall et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr; 17(4):357-66.)、DART分子(MacroGenics, WO2008157379, WO2010080538)、單股雙抗體分子(Lawrence, FEBS Lett. 1998 Apr 3; 425(3): 479-84)、類TCR抗體(AIT, ReceptorLogics)、人類血清白蛋白scFv融合(Merrimack, WO2010059315)以及COMBODY分子(Epigen Biotech, Zhu et al., Immunol Cell Biol. 2010 Aug; 88(6):667-75.)、雙重靶向奈米抗體(Ablynx, Hmila et al., FASEB J. 2010)以及僅雙重靶向重鏈之域抗體。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物包含雙特異性抗體，其為雙抗體、交叉抗體或經由受控之Fab臂交換獲得之雙特異性抗體(諸如，WO2011131746(Genmab)中所描述)。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物包含為雙特異性DuoBody ®分子之抗體(Genmab A/S, WO2011131746)。
本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體(諸如，雙特異性抗體)可為任何同型。例示性同型包括但不限於人類IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4同型中之任一者。較佳地，抗體可經選擇為具有人類IgG1同型，如實施例中所示。可使用人類輕鏈恆定區卡帕或拉目達中之任一或二者，例如，SEQ ID NO：53和54所示之序列。例如，於一具體例中，涉及CD30結合之輕鏈包含卡帕恆定區，以涉及CD3結合之輕鏈包含拉目達恆定區。
因此，於又一具體例中，能與人類CD30結合之抗原結合區包含在重鏈和輕鏈中，所述重鏈包含所述VH區和IgG1重鏈恆定區，以及所述輕鏈包含所述VL區和卡帕輕鏈恆定區；以及其中所述能與人類CD3結合之抗原結合區包含在重鏈和輕鏈中，所述重鏈包含所述VH區和IgG1重鏈恆定區，以及所述輕鏈包含所述VL區和拉目達輕鏈恆定區。於甚至又一具體例中，一個IgG1重鏈恆定區係如SEQ ID NO. 51所定義，並且另一個係如SEQ ID NO. 50所定義，以及其中所述卡帕輕鏈恆定區係如SEQ ID NO. 53所定義，以及所述拉目達輕鏈恆定區係如SEQ ID NO. 54所定義。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之抗體之兩條重鏈皆為IgG1同型。於一具體例中，雙特異性抗體之兩條重鏈分別為IgG1和IgG4同型。較佳地，雙特異性抗體可經選擇為具有人類IgG1同型，如實施例中所示。視需要地且較佳地，可修飾所選同型的重鏈及其Fc區序列，較佳在鉸鏈區、CH2及/或CH3區中修飾，以能產生雙特異性抗體及/或引入惰性。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體包含由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區。
於一具體例中，第一Fc多肽和第一重鏈可變區包含在相同多肽鏈內，並且第二Fc多肽和第二重鏈可變區包含在相同多肽鏈內。
第一和第二Fc多肽可各自具有任何同型，包括任何人類同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgD、IgM或IgA同型或混合同型。較佳地，Fc區為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同型或混合同型。於一具體例中，所述Fc區為人類IgG1 Fc區。
於又一具體例中，多特異性抗體係如本文中所定義之全長抗體。
根據本發明之醫藥組成物中所使用之抗體可包含在Fc區中之修飾，以使抗體成為惰性或非活化抗體。因此，在本文中所揭露之抗體中，可修飾一或兩條重鏈，使得相對於除了不包含所述修飾之外的相同抗體，該抗體誘導Fc介導之效應功能的程度更小。Fc介導之效應功能可藉由與Fcγ受體結合而測定T細胞上Fc介導之CD69表現(亦即，作為CD3抗體介導之Fcγ受體依賴性CD3交聯的結果之CD69表現，例如，WO2015001085中所述)，藉由與C1q結合，或藉由誘導Fc介導之FcγR交聯而測量。特別地，可修飾重鏈恆定序列，使得與野生型(未經修飾)之抗體相比時，Fc介導之CD69表現減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中所述Fc介導之CD69表現在基於PBMC之功能測定中測定，例如，藉由WO2015001085之實施例3中所述之流式細胞測量術。重鏈和輕鏈恆定序列之修飾也可導致C1q與所述抗體之結合減少。與未經修飾之抗體相比，減少可為至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%，並且C1q結合可由ELISA測定。又，Fc區可經修飾，使得與未經修飾之抗體相比，所述抗體介導Fc介導之T細胞增生減少至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%(例如，在曲線的直線部分中)，其中所述T細胞增生在基於PBMC之功能測定中測量。
業經開發廣範圍的不同的非活化抗體形式，其中胺基酸取代及其組合已被引入IgG1同型抗體之恆定重鏈區中以消除Fc介導之效應功能(例如，Chiu et al., Antibodies 2019 Dec; 8(4): 55; Liu et al., Antibodies, 2020 Nov 17;9(4):64; 29(10):457-66；Shields et al., J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604)。
可經修飾之胺基酸位置之實例(例如，在IgG1同型抗體中)包括位置L234和L235。於一具體例中，第一及/或第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234及/或L235處之胺基酸之胺基酸取代，其中該等取代較佳為分別取代成F和E，其中該等胺基酸位置係如Eu編號所定義。
應理解，除了胺基酸位置L234和L235之修飾之外，還可修飾另外的位置。因此，於又一具體例中，第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及第一及/或第二Fc多肽進一步包含對應人類IgG1重鏈中之位置G236處之胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳為取代成R。
於另一具體例中，第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及第一和第二Fc多肽進一步包含對應人類IgG1重鏈中之位置G236處胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳為取代成R。
於另一具體例中，第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，並且第一及/或第二Fc多肽進一步包含對應人類IgG1重鏈中之位置D265處之胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳為取代成A。
於另一具體例中，第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及第一和第二Fc多肽進一步包含對應人類IgG1重鏈中之位置D265處之胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳為取代成A。
於另一具體例中，第一和第二Fc多肽中之一者包含對應位置L234、L235以及G236處之胺基酸分別成F、E以及R之胺基酸取代，以及另一個Fc多肽包含對應位置L234、L235E以及D265處之胺基酸分別成F、E以及A之胺基酸取代。
在又一具體例中，第一Fc多肽包含對應位置L234、L235以及G236處之胺基酸分別至F、E和R之胺基酸取代，並且第二Fc多肽包含對應位置L234、L235E以及D265處之胺基酸分別成F、E以及A之胺基酸取代，其中該等胺基酸位置係由Eu編號所定義。
例如，尤其SEQ ID NO. 45、46、49、50、51以及52中提供具有此類Fc區取代之恆定區，其可與不具(多個)此類取代之SEQ ID NO. 44比較。於一具體例中，本發明之抗體包含選自由SEQ ID NO：45、46、49、50、51以及52所組成群組之序列。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性或雙特異性抗體包含Fc區，該Fc區包含不同的第一和第二CH3區，並且使得所述第一和第二CH3區之間之異二聚體交互作用比所述第一和第二CH3區之各者之同二聚體交互作用強。關於此等交互作用以及其如何達成之更多細節在WO2011131746和WO2013060867(Genmab)中提供，其係以引用方式納入本文中。可例如藉由WO 2008/119353和WO 2011/131746中所提供的所謂Fab臂交換以獲得高產率的穩定之異二聚體抗體，其係基於兩個同二聚體起始抗體在CH3區中僅含有少量不對稱突變。
因此，於一具體例中，於第一Fc多肽中，對應選自由下列各者所組成群組之位置的位置之至少一個胺基酸：人類IgG1 重鏈中之T366、L368、K370、D399、F405、Y407以及K409已經取代，以及於第二Fc多肽中，對應選自由下列各者所組成群組之位置的位置之至少一個胺基酸：人類IgG1重鏈中之T366、L368、K370、D399、F405、Y407以及K409已經取代，以及其中該第一和第二Fc多肽中之所述取代不在相同位置，其中該等胺基酸位置係如由Eu編號所定義。例如，尤其SEQ ID NO. 47、48、49、50、51以及52中提供具有此類Fc區取代之恆定區，其可與不具此取代之SEQ ID NO. 44比較。於一具體例中，本發明之抗體包含選自由SEQ ID NO：47、48、49、50、51以及52所組成群組之序列。
於特定具體例中，本發明提供一種包含抗體之醫藥組成物，其中所述第一Fc多肽中對應人類IgG1重鏈中之K409之位置之胺基酸為R，以及所述第二Fc多肽中對應人類IgG1重鏈中之F405之位置之胺基酸為L，或反之亦然。較佳地，第一Fc多肽中對應F405之位置之胺基酸為L，以及第二Fc多肽中對應K409之位置之胺基酸為R，或反之亦然。
於又一具體例中，在第一Fc多肽中對應K409之位置之胺基酸為R，以及其中第二Fc多肽中對應F405之位置之胺基酸為L。
因此，於一具體例中，第一和第二Fc多肽中之一者包含對應位置L234、L235、G236以及F405處之胺基酸分別成F、E、R和L之胺基酸取代，以及其他Fc多肽包含對應位置L234、L235E、D265以及K409處之胺基酸分別成F、E、A以及R之胺基酸取代。
於另一具體例中，第一和第二Fc多肽中之一者包含對應位置L234、L235、G236以及K409處之胺基酸分別成F、E、R以及R之胺基酸取代，以及其他Fc多肽包含對應位置L234、L235E、D265以及F405處之胺基酸分別成F、E、A以及L之胺基酸取代。
於另一具體例中，本發明有關一種包含多特異性抗體之醫藥組成物，該多特異性抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CD32； 其中該多特異性抗體為雙特異性抗體，並且包含由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區； 其中該第一Fc多肽和該第一重鏈可變區包含在相同多肽鏈內，以及其中該第二Fc多肽和該第二重鏈可變區包含在相同多肽鏈內； 其中該第一Fc多肽包含對應位置L234、L235以及G236處之胺基酸分別成F、E以及R之胺基酸取代，以及該第二Fc多肽包含對應位置L234、L235以及D265處之胺基酸分別成F、E以及A之胺基酸取代，其中該等胺基酸位置係由Eu編號所定義；以及 其中該第一Fc多肽中對應K409之位置處之胺基酸為R，以及其中該第二Fc多肽中對應F405之位置處之胺基酸為L。
於又一具體例中，本發明有關一種包含多特異性抗體之醫藥組成物，該多特異性抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3； 其中該多特異性抗體為雙特異性抗體，並且包含由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區； 其中該第一Fc多肽和該第一重鏈可變區包含在相同多肽鏈內，以及其中該第二Fc多肽和該第二重鏈可變區包含在相同多肽鏈內； 其中該第一Fc多肽包含對應位置L234、L235以及D265處之胺基酸分別成F、E以及A之胺基酸取代，以及該第二Fc多肽包含對應位置L234、L235以及D265處之胺基酸分別成F、E和A之胺基酸取代，其中該等胺基酸位置係由Eu編號所定義；以及 其中該第一Fc多肽中對應K409之位置處之胺基酸為R，以及其中該第二Fc多肽中對應F405之位置處之胺基酸為L。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之抗體包含SEQ ID NO：17和19所示之重鏈序列以及SEQ ID NO：18和20所示之輕鏈序列或由其所組成。
於又一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之抗體包含SEQ ID NO：17和19所示之重鏈序列以及SEQ ID NO：18和19所示之輕鏈序列或由其所組成。
於一具體例中，本發明醫藥組成物中所使用之抗體包含SEQ ID NO：17和35所示之重鏈序列以及SEQ ID NO：18和20所示之輕鏈序列或由其所組成。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之抗體包含SEQ ID NO：55和19所示之重鏈序列以及SEQ ID NO：18和20所示之輕鏈序列或由其所組成。
於一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之抗體包含SEQ ID NO：55和35所示之重鏈序列以及SEQ ID NO：18和20所示之輕鏈序列或由其所組成。
於仍又一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之抗體為bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR或bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR。在甚至又一具體例中，本發明之醫藥組成物中所使用之抗體為bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR。於仍又一具體例中，多特異性抗體為bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-MDX0060-FERR或其生物相似物。
SEQ ID NO：44至52和55中所列之恆定區序列不包括C端離胺酸(K)。然而，在此等Fc區所衍生之人類中發現的天然存在的序列中，此C端離胺酸可作為開放閱讀框之一部分存在。在重組抗體之細胞培養產生期間，此末端離胺酸可藉由(多種)內源性羧肽酶之蛋白質水解而切除，導致具有相同序列但缺乏C端離胺酸之恆定區。為了抗體之製造目的，可從序列中省略編碼此末端離胺酸之DNA，使得產生無離胺酸之抗體。自編碼抗體之序列中省略C端離胺酸可增加抗體相對於C端離胺酸之存在之同質性。由編碼或不編碼末端離胺酸之核酸序列產生之抗體在序列和功能上實質上相同，因為C端離胺酸之加工程度通常更高，例如，當使用基於CHO之生產系統產生的抗體時(Dick, L.W. et al. Biotechnol. Bioeng. 2008;100: 1132-1143)。因此，應理解，根據本發明之醫藥組成物中所使用之抗體可在不編碼或不具有諸如本文中所列之C端離胺酸之情況下產生。因此，出於製造目的，可在不具有C 端離胺酸之情況下產生抗體。
於另外的具體例中，根據本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體不為包含Fc區之典型全長抗體。例如，於一具體例中， (i)CD30結合區及/或CD3結合區為Fab， (ii)CD30結合區及/或CD3結合區為scFv， (iii)CD30結合區為Fab且CD3結合區為scFv，或 (iv)CD30結合區為scFv且CD3結合區為Fab。 結合、細胞毒性以及T細胞活化
包含如本文中所述之可與人類CD3及人類CD30結合之抗體(諸如，雙特異性抗體)之醫藥組成物可有利地用以將T細胞靶向表現人類CD30之癌細胞，從而誘導對所述癌症細胞之T細胞介導之殺傷。
如所述，較佳地，根據本發明之醫藥組成物中所使用之抗體呈惰性的，並且此外，抗體包含一或多種下列特性： a)當使用流式細胞測量術測試(例如，如本文中之實施例中所述)時，能與表現CD30之人類腫瘤細胞(諸如，SU-DHL-1細胞、SUP-M2細胞、DL-40細胞、KARPAS-299細胞、L-82細胞、SR-786細胞、L-540細胞、KM-H2細胞、L-1236細胞、JVM-2細胞、HH細胞、NCEB-1細胞及/或HDLM-2細胞)結合， b)當如本文中之實施例中所述進行測定時，當使用例如純化之PBMC、ADCC效應細胞或T細胞作為效應細胞時，能介導表現CD30之人類腫瘤細胞之濃度依賴性細胞毒性， c)當如本文中之實施例中所述進行測定時，當使用例如純化之PBMC或T細胞作為效應細胞時，能介導一或多種表現人類CD30之腫瘤細胞株之濃度依賴性細胞毒性，該一或多種表現人類CD30之腫瘤細胞株係選自由下列各者所組成群組：SU-DHL-1細胞、L-428細胞、KM-H2細胞、SUP-M2細胞、KI-JK細胞以及HDLM-2細胞， d)表現CD30之人類腫瘤細胞之存在下能活體外誘導T細胞增生；例如，當如本文中之實施例中所述進行測定時， e)當如本文中之實施例所述測定時，能在一或多種表現CD30之人類腫瘤細胞株之存在下活體外活化T細胞，該一或多種表現CD30之人類腫瘤細胞株係選自由下列各者所組成群組：SU-DHL-1細胞、L-428細胞、KI-JK細胞以及HDLM-2個細胞， f)當如本文中之實施例中所述測定時，能由T細胞活體外誘導細胞介質和顆粒酶B之劑量依賴性產生， g)如本文中之實施例中所述測定時，即使在活化之T細胞亞群上表現CD30，也不會導致T細胞誤殺，及/或 h)如本文中之實施例中所述測定時，即使在sCD30之存在下，也能誘導T細胞介導之細胞毒性。
於一具體例中，當如本文中之實施例中所述測定，諸如使用L-428腫瘤細胞並以流式細胞測量術測量時，本文中所述之抗體誘導T細胞介導之細胞毒性，其中EC 50濃度低於0.050 µg/ml，諸如低於0.045 µg/ml，如低於0.040 µg/ml，諸如低於0.035 µg/ml，如低於0.030 µg/ml，諸如低於0.025 µg/ml，如低於0.020 µg/ml。
在又一具體例中，當如本文中之實施例中所述測定，諸如使用L-428腫瘤細胞並以流式細胞測量術測量時，如本文中所述之抗體在誘導T細胞介導之細胞毒性時具有高於80%，諸如高於85%，如高於90%之最大溶解。
於一具體例中，當如本文中之實施例中所述測定，諸如使用L-428腫瘤細胞並以流式細胞測量術測量時，本文中所述之抗體誘導CD4 +T細胞活化，其具有CD25表現之EC 50濃度低於0.05 μg/ml，諸如低於0.045 μg/ml，如低於0.04 μg/ml，諸如低於0.035 µg/ml，如低於0.03 µg/ml。於又一具體例中，當如本文中之實施例中所述測定，諸如使用L-428腫瘤細胞並以流式細胞測量術測量時，本文中所述之抗體誘導CD8 +T細胞活化，其具有CD25表現之EC 50濃度低於0.005 μg/ml，諸如低於0.001 μg/ml，如低於0.0009 μg/ml，諸如低於0.0008 μg/ml，如低於0.0007 μg/ml。
於一具體例中，當如本文中之實施例中所述測定，諸如使用L-428腫瘤細胞並以流式細胞測量術測量時，本文中所述之抗體誘導CD4 +T細胞活化，其具有CD69表現之EC 50濃度低於0.004 μg/ml，諸如低於0.003 μg/ml，如低於0.002 μg/ml，諸如低於0.001 µg/ml，如低於0.0009 µg/ml。於又一具體例中，本文中所述之抗體誘導CD8 +T細胞活化，其CD69表現之EC 50濃度低於0.0035 μg/ml，諸如低於0.0030 μg/ml，如低於0.0025 μg/ml，諸如低於0.0020 μg/ml，如低於0.0015 μg/ml。
於一具體例中，當本文中之實施例中所述測定，諸如使用L-428腫瘤細胞並以流式細胞測量術測量時，本文中所述之抗體誘導CD4 +T細胞活化，其具有PD-1表現之EC 50濃度低於0.01 μg/ml，諸如低於0.008 μg/ml，如低於0.007 μg/ml，諸如低於0.006 μg/ml，如低於0.005 μg/ml。於又一具體例中，當如本文中之實施例中所述測定，諸如使用L-428腫瘤細胞並以流式細胞測量術測量時，本文中所述之抗體誘導CD8 +T細胞活化，其具有PD-1表現之EC 50濃度低於0.007 μg/ml，諸如低於0.006 μg/ml，如低於0.005 μg/ml，諸如低於0.004 µg/ml，如低於0.003 µg/ml。
測定可按照技術人員公知的方式進行，並且可視需要地包含4：1之效應細胞與標靶細胞之比率(E：T)及/或視需要地72 hr之培養期。例如，可藉由提供腫瘤細胞(較佳為標記之腫瘤細胞，諸如L-428腫瘤細胞)而進行測定；加入本文中所述之抗體，較佳為以連續稀釋之方式；提供T細胞(較佳為標記之T細胞，效應物與標靶之E：T比為4：1)，並且培養72 hr；視需要地，對相關參數(諸如，CD4、CD8、CD25、CD69及/或PD-1)染色，最後使用流式細胞測量術(如FACS)分析細胞。%活細胞及/或T細胞增生/活化可根據發明所屬技術領域中技術人員公知的分析所獲得之數據計算。 本發明之醫藥組成物中所使用之抗體之產生
傳統方法(諸如，融合瘤和化學接合方法(Marvin and Zhu(2005) Acta Pharmacol Sin 26:649)可用於製備多特異性抗體，諸如本發明之醫藥組成物中所使用之雙特異性抗體。由不同重鏈和輕鏈所組成之兩種抗體在宿主細胞中共表現，導致除了所欲雙特異性抗體之外之可能的抗體產物之混合物，其可接著藉由例如親和力層析術或類似方法單離。
如所提及的，也可使用有利於在不同抗體構築體共表現後形成功能性雙特異性產物的策略，例如Lindhofer等人所描述之方法(1995 J Immunol 155:219)。由於優先物種限制之重鏈/輕鏈配對，產生不同抗體的大鼠和小鼠融合瘤之融合導致有限數量的異二聚體蛋白質。促進相對於同二聚體之異二聚體形成之另一種策略為「旋鈕入孔」策略，其中在第一重鏈多肽上引入突起且在第二重鏈多肽中引入對應的空腔，使得突起可位於這兩條重鏈界面之空腔中，以促進異二聚體形成且阻礙同二聚體形成。「突起」係藉由以較大側鏈置換來自第一多肽界面之小胺基酸側鏈而構築的。藉由以較小的胺基酸側鏈置換較大的胺基酸側鏈，而在第二多肽之界面中產生與突起大小相同或相似的補償性「空腔」(美國專利5,731,168)。EP1870459(Chugai)和WO2009089004(Amgen)描述在宿主細胞中共表現不同抗體域時有利於異二聚體形成的其他策略。在此等方法中，構成兩個CH3域中之CH3-CH3界面的一或多個殘基以帶電荷之胺基酸置換，使得同二聚體形成為靜電上不利的，而異二聚合為靜電上有利的。WO2007110205(Merck)描述另一種策略，其中利用IgA和IgG CH3域之間之差異促進異二聚合。
WO2008119353(Genmab)中已描述另一種活體外產生雙特異性抗體之方法，其中在還原條件下培養後，以兩種單特異性IgG4或類IgG4抗體之間之「Fab臂」或「半分子」交換(重鏈和接附之輕鏈之交換)形成雙特異性抗體。所得產物為具有兩個Fab臂之雙特異性抗體，該等Fab臂可包含不同序列。
用於製備本發明之醫藥組成物中所使用之雙特異性CD3xCD30抗體之較佳方法包括WO2011131746和WO13060867(Genmab)中所述之方法，其包含下列步驟： a)提供包含Fc區之第一抗體，所述Fc區包含第一CH3區； b)提供包含第二Fc區之第二抗體，所述Fc區包含第二CH3區， 其中該第一抗體為CD30抗體且第二抗體為CD3抗體，或反之亦然； 其中所述第一和第二CH3區之序列不同，並且使得所述第一和第二CH3區之間之異二聚體交互作用比所述第一和第二CH3區之同二聚體交互作用中之各者強； c)在還原條件下將所述第一抗體與所述第二抗體一起培養；以及 d)獲得所述雙特異性CD3xCD30抗體。
類似地，根據本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體(諸如，雙特異性抗體)可由以下方法產生，其包含： a) 提供包含本文中所述之CD30結合區之第一同二聚體抗體和包含本文中所述之CD3結合區之第二同二聚體抗體，其中所述抗體包含Fc區且視需要地含有本文中所述之另外的特徵， 其中該第一和第二抗體之該第一和第二CH3區之序列不同，並且使得該第一和第二CH3區之間之異二聚體交互作用比該第一和第二CH3區之同二聚體交互作用中之各者強； b) 在足以使鉸鏈區中之半胱胺酸經歷二硫鍵異構化之還原條件下，將該第一抗體與該第二抗體一起培養；以及 c) 獲得如本文中所述之本發明之異二聚體多特異性抗體，其包含該第一抗體之第一免疫球蛋白重鏈和第一免疫球蛋白輕鏈以及該第二抗體之第二免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白輕鏈。
於一具體例中，所述第一抗體與所述第二抗體一起在足以允許鉸鏈區中之半胱胺酸經歷二硫鍵異構化之還原條件下培養，其中所得異二聚體抗體中之所述第一和第二抗體之間之異二聚體交互作用為使0.5 mM GSH在37℃下24小時後未發生Fab臂交換。
不受理論的限制，在步驟c)中，還原親本抗體之鉸鏈區中之重鏈二硫鍵，並且所得半胱胺酸接著能與另一個親本抗體分子(原本具有不同特異性)之半胱胺酸殘基形成重鏈間二硫鍵。於此方法之一具體例中，步驟c)中之還原條件包含加入還原劑，例如與選自由下列各者所組成群組之還原劑：2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤藻醣醇(DTE)、麩胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸以及β-巰基-乙醇，較佳為選自由下列各者所組成群組之還原劑：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇以及三(2-羧乙基)膦。於一較佳具體例中，還原劑為2-巰基乙胺。於又一具體例中，步驟c)包含例如藉由去除還原劑(例如，藉由脫鹽)而恢復條件以變成非還原性或還原性更低。
於又一態樣中，根據本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體可由包含下列步驟之方法產生： a) 提供第一單特異性CD30抗體，其包含 (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所列之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)Fc區，其係由第一和第二Fc多肽所組成，其中該第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及對應人類IgG1重鏈中之位置D265處之胺基酸成A之胺基酸取代；以及 b) 提供第二單特異性CD3抗體，其包含 (i)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3。 (ii)Fc區，其係由第一和第二Fc多肽所組成，其中該第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及對應人類IgG1重鏈中之位置D265處之胺基酸成A之胺基酸取代 其中該第一和第二抗體之第一和第二CH3區之序列不同，並且使得該第一和第二CH3區之間之異二聚體交互作用比該第一和第二CH3區之同二聚體交互作用中之各者強；其中較佳地，在該第一CH3區中對應F405之位置處之胺基酸為L，並且在該第二CH3區中對應K409之位置處之胺基酸為R，或反之亦然， c) 在足以允許鉸鏈區中之半胱胺酸經歷二硫鍵異構化之還原條件下，將第一抗體與第二抗體一起培養；以及 d) 獲得多特異性抗體，其包含第一抗體之第一免疫球蛋白重鏈和第一免疫球蛋白輕鏈以及第二抗體之第二免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白輕鏈。
於又一態樣中，根據本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體可由包括下列步驟之方法產生： a) 提供第一單特異性CD30抗體，其包含 (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)Fc區，其係由第一和第二Fc多肽所組成，其中該第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及對應人類IgG1重鏈中之位置G236處成R之胺基酸取代；以及 b) 提供第二單特異性CD3抗體，其包含 (i)CD3結合區，其第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3，以及 (ii)Fc區，其係由第一和第二Fc多肽所組成，其中該第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及對應人類IgG1重鏈中之D265處之胺基酸成A位置之胺基酸取代 其中該第一和第二抗體之第一和第二CH3區之序列不同，並且使得該第一和第二CH3區之間之異二聚體交互作用比該第一和第二CH3區之同二聚體交互作用中之各者強；其中較佳地，在該第一CH3區中對應K409之位置處之胺基酸為R，以及在該第二CH3區中對應F405之位置處之胺基酸為L， c) 在足以允許鉸鏈區中之半胱胺酸經歷二硫鍵異構化之還原條件下，將第一抗體與第二抗體一起培養；以及 d) 獲得包含第一抗體之第一免疫球蛋白重鏈和第一免疫球蛋白輕鏈以及第二抗體之第二免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白輕鏈之多特異性抗體。
本發明進一步有關根據本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體，其係由本文中所述之方法獲得。
於以上方法中，提供能與CD30及/或CD3結合之第一或第二同二聚體抗體之步驟可包含下列步驟： -提供含有用於產生一或多種所述抗體之表現載體之細胞；以及 -允許細胞產生一或多種所述抗體，並且隨後， -獲得一或多種所述抗體，從而提供一或多種所述抗體。
於此方法之一具體例中，所述第一及/或第二同二聚體抗體為全長抗體。
第一和第二同二聚體抗體之Fc區域可具有任何同型，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。於此方法之一實施例中，所述第一和所述第二同二聚體抗體之Fc區皆具有IgG1同型。於另一具體例中，所述同二聚抗體之Fc區中之一者具有IgG1同型，而另一者具有IgG4同型。於後一具體例中，所得雙特異性抗體包含IgG1之Fc區和IgG4之Fc區，並且可因此在效應功能之活化方面具有感興趣的中間體性質。
於又一具體例中，同二聚體起始抗體中之一者已被改造成不與蛋白A結合，因此允許藉由使產物通過蛋白A管柱、去除流出物以及自蛋白A管柱洗析異二聚體抗體而獲得純化之異二聚體抗體組成物。
如上所述，同二聚體起始抗體之第一和第二CH3區之序列可為不同的，並且使得所述第一和第二CH3區之間之異二聚體交互作用比所述第一和第二CH3區域中之各者更強。WO2011131746和WO2013060867(Genmab)中提供此等交互作用以及其如何達成之更多細節，其係以引用方式整體納入本文中。
特別地，基於分別與CD30和CD3結合且僅含有少量相當保守的兩個同二聚體起始抗體，可使用本發明之以上方法以獲得高產率之穩定之雙特異性CD3xCD30抗體。不對稱突變表示所述第一和第二CH3區之序列含有在不同位置處之胺基酸取代。
本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體(諸如，雙特異性抗體)也可藉由在單一細胞中共表現編碼第一和第二多肽之構築體而獲得。
因此，於又一態樣中，本發明有關一種編碼根據本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體之核酸構築體或核酸構築體之組合，以及有關一種包含此類(多種)核酸構築體之表現載體或表現載體之組合。
此外，本發明有關一種能產生根據本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體之重組宿主細胞，其中該宿主細胞包含編碼根據本發明之醫藥組成物中所使用之一或多種多特異性抗體之核酸構築體。
據此，本發明也有關一種用於產生根據本發明之醫藥組成物中所使用之多特異性抗體之方法，其包含 (i)在產生抗體之條件下培養本發明之重組宿主細胞，以及 (ii)從培養物中單離所產生之多特異性抗體。
於一具體例中，所述方法包括下列步驟： a)提供編碼第一多肽之第一核酸構築體，該第一多肽包含第一抗體重鏈之第一Fc區與第一抗原結合區，所述第一Fc區包含第一CH3區， b)提供編碼第二多肽之第二核酸構築體，該第二多肽包含第二抗體重鏈之第二Fc區與第二抗原結合區，所述第二Fc區包含第二CH3區， 其中該第一和第二CH3區之序列不同，並且使得所述第一和第二CH3區之間之異二聚體交互作用比所述第一和第二CH3區之同二聚體交互作用中之各者強，視需要地其中所術第一和第二核酸構築體編碼所述第一和第二抗體之輕鏈序列 c)在宿主細胞中共表現所述第一和第二核酸構築體，以及 d)從細胞培養物中獲得所述異二聚體蛋白質。
較佳地，在第一CH3區中對應F405之位置處之編碼胺基酸為L，以及在第二CH3區中對應K409之位置處之編碼胺基酸為R，或反之亦然。
用於產生抗體之合適的表現載體，包括啟動子、增強子等，以及合適的宿主細胞為發明所屬技術領域中熟知的。宿主細胞之實例包括酵母菌、細菌以及哺乳動物細胞(諸如，中國倉鼠卵巢細胞(CHO))或人類細胞(諸如，人類胚胎腎(HEK)細胞)。
本文中所定義之核酸或一或多種核酸可為RNA或DNA。如本文中所定義之核酸或一或多種核酸可用於在哺乳動物細胞中表現。因此，本發明也提供一或多種細胞，其包含如本文中所定義之核酸或包含一或多種核酸。
本發明之背景下之核酸可為表現載體，其可為任何合適的載體，包括染色體、非染色體以及合成核酸載體(包含一組適當的表現控制元件之核酸序列)。此類載體之實例包括SV40之衍生物、細菌質體、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母菌質體、衍生自質體和噬菌體DNA之組合之載體、以及病毒核酸(RNA或DNA)載體。於一具體例中，編碼CD30或CD3抗體之核酸包含在裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表現元件(如例如Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355 59(1997)中所述)、壓縮之核酸載體(如例如US 6,077,835及/或WO 00/70087中所述)、質體載體(諸如，pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119)、「蠓」最小尺寸之載體載體(如例如Schakowski et al., Mol Ther 3, 793 800 (2001)中所述)，或作為沉澱之核酸載體構築體，諸如CaPO4沉澱之構築體(如例如WO200046147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551 55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978)以及Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)中所述)。此類核酸載體及其用途為發明所屬技術領域中熟知的(參見例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
於一具體例中，載體適合在細菌細胞中表現CD30抗體及/或CD3抗體。此類載體之實例包括表現載體，諸如BlueScript (Stratagene)、pIN載體(Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503 5509(1989)、pET載體(Novagen, Madison WI)等)。
表現載體也可或替代性地適合於在酵母菌系統中表現之載體。可採用任何適合在酵母菌系統中表現之載體。合適的載體包括，例如包含組成型或誘導型啟動子之載體，諸如α因子、醇氧化酶以及PGH(綜述於：F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)和Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516 544 (1987))。
核酸及/或表現載體也可包含編碼分泌/定位序列之核酸序列，其可將多肽(諸如，新生多肽鏈)靶向周質空間或入細胞培養基中。此類序列為發明所屬技術領域中已知的，並且包括分泌前導肽或訊息肽。核酸及/或表現載體可包含促進表現之任何合適的元件(亦即，核酸之轉錄及/或轉譯)，使得(雙特異性)抗體之組分表現。核酸及/或載體可與任何合適的啟動子、增強子以及其他表現促進元件結合。此類元件之實例包括強表現啟動子(例如，人類CMV IE啟動子/增強子以及RSV、SV40、SL3 3、MMTV以及HIV LTR啟動子)、有效的多聚腺苷酸終止序列、大腸桿菌中之質體產物之複製起點、作為可篩選標記之抗生素抗性基因及/或方便的選殖位點(例如，多連接子)。核酸也可包含與組成型啟動子相對之誘導型啟動子，諸如CMV IE。 (醫療)用途
醫藥組成物可以任何適當的途徑和模式投予。於一具體例中，醫藥組成物係靜脈或皮下注射或輸注投予。
根據本發明之醫藥組成物較佳用作藥物。
根據本發明之醫藥組成物較佳用於治療疾病之方法中。
特別地，本發明之醫藥組成物可用於治療各種形式之癌症。於一態樣中，本發明有關本文中所術之醫藥組成物用於治療癌症之用途。於又一態樣中，本發明有關一種治療疾病之方法，該方法包含向有需要之個體投予本文中所定義之醫藥組成物。於甚至又一態樣中，本發明有關一種治療個體之癌症之方法，其包含向有需要之個體投予本文中之醫藥組成物持足以治療癌症之時間。
於一態樣中，本發明提供一種治療個體之癌症之方法，該方法包含投予治療有效量的本發明之醫藥組成物。於又一具體例中，本發明提供一種治療個體之涉及表現CD30之細胞之病症之方法，該方法包含投予治療有效量的本發明之醫藥組成物。
如所述，根據本發明之方法和用途中可考慮的合適的疾病為癌症。所述癌症最佳為特徵為CD30之表現。可使用發明所屬技術領域中已知之方法(諸如，PCR、免疫染色或FACS分析)輕易地測定癌症中之CD30表現，亦即，檢測CD30轉錄物及/或蛋白質之表現。可使用本文中所述之能與人類CD30結合之抗體，例如，免疫染色及/或FACS分析等。
於一態樣中，本發明有關一種根據本發明之醫藥組成物於治療何杰金氏淋巴瘤或間變性大細胞淋巴瘤之用途。
於又一態樣中，本發明有關根據本發明之醫藥組成物於治療何杰金氏淋巴瘤(HL)或非何杰金氏淋巴瘤(NHL)之用途。
於一具體例中，何杰金氏淋巴瘤為典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)。
於一具體例中，非何杰金氏淋巴瘤為T細胞非何杰金氏淋巴瘤(T-NHL)或B細胞非何杰金氏淋巴瘤(B-NHL)。於又一具體例中，非何杰金氏淋巴瘤為T細胞非何杰金氏淋巴瘤(T-NHL)。
於又一具體例中，T細胞非何杰金氏淋巴瘤為周邊T細胞淋巴瘤(PTCL)或皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)。於仍又一具體例中，T細胞非何杰金氏淋巴瘤(T-NHL)為間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)。於仍又一具體例中，周邊T細胞淋巴瘤(PTCL)為間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)。
於一具體例中，B細胞非何杰金氏淋巴瘤(B-NHL)為被套細胞淋巴瘤(MCL)。
於甚至又一具體例中，何杰金氏淋巴瘤(HL)為復發型和頑固型何杰金氏淋巴瘤。於又一具體例中，何杰金氏淋巴瘤(HL)為CD30+何杰金氏淋巴瘤。於仍又一具體例中，何杰金氏淋巴瘤(HL)為復發型和頑固型CD30+何杰金氏淋巴瘤。於甚至又一具體例中，何杰金氏淋巴瘤(HL)為復發型和頑固型CD30+典型何杰金氏淋巴瘤。
於甚至又一具體例中，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)為復發型且頑固型非何杰金氏淋巴瘤。於又一具體例中，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)為CD30+非何杰金氏淋巴瘤。於仍又一具體例中，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)為復發型和頑固型CD30+非何杰金氏淋巴瘤。
於又一具體例中，用於治療何杰金氏淋巴瘤(HL)或非何杰金氏淋巴瘤(NHL)之根據本發明之醫藥組成物係或已被靜脈及/或皮下投予，較佳為皮下投予。
於又一具體例中，可對被診斷患有癌症之患者進行癌細胞中CD30表現之評估，並且當檢測到CD30(可在從低到高之範圍內)時，此類患者可選擇根據本發明之醫藥組成物進行治療。然而，在選擇治療之患者時可能不一定需要包括此類評估。
本發明之包含多特異性抗體之醫藥組成物具有涉及病症的診斷和治療之數種活體外和活體內診斷和治療用途表現CD30之細胞之。例如，可向培養物中之細胞(例如，活體外或離體)或個體(例如，活體內)投予多特異性抗體，以治療、預防及/或診斷多種病症。如本文中所使用，術語「個體」旨在包括人類和非人類個體。
於一態樣中，本發明有關一種診斷組成物，其包含根據本文中所揭露之具體例中之任一例之醫藥組成物。
於一具體例中，診斷組成物為伴隨式診斷，其係用於篩選和選擇彼等將從醫藥組成物治療中受益之患者。 套組
本發明進一步提供一種包含包括如上所揭露之抗體之醫藥組成物之部件套組，諸如用作伴隨式診斷/用於在患者群體內識別彼等具有對用如上文中所定義之抗體之治療有反應之傾向之患者或預測當用於治療患者時所述抗體之效力或抗腫瘤活性，該套組包含如上所定義之抗體；以及用於所述套組之使用說明書。於一態樣中，部件套組包含本文中所述之醫藥組成物、用於醫藥組成物之容器以及用於所述套組之使用說明書。於又一具體例中，部件套組進一步包含稀釋劑。
於一具體例中，本發明提供一種用於診斷癌症之套組，其包含用於醫藥組成物之容器，該醫藥組成物包含多特異性CD3xCD30抗體和視需要地一或多種用於檢測表現CD30之細胞與表現CD3之細胞之交聯的試劑。試劑可包括例如螢光標籤、酶標籤或其他可檢測標籤。試劑可進一步包括用於酶反應之二級或三級抗體或試劑，其中該等酶反應產生可為視覺化之產物。
於又一個態樣中，本發明有關一種用於檢測在投予具體例中之任一例之根據本文中所揭露之包含多特異性抗體之醫藥組成物後在衍生自患者之樣本中是否發生表現CD30與CD3之細胞之間的交聯之方法，其包含下列步驟： (i)在允許所述雙特異性抗體與表現CD30之細胞和表現CD3之細胞之間形成複合體之條件下，使該樣本與具體例中之任一例之根據本文中所揭露之包含多特異性抗體之醫藥組成物接觸；以及 (ii)分析是否已形成複合體。 醫藥組成物之具體例
於下列實施例中，多特異性抗體或抗體意指包含能與人類CD30結合之抗原結合區和能與人類CD3結合之抗原結合區之多特異性抗體。
於一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250 mg/ml的多特異性抗體(諸如，約20至200 mg/ml的多特異性抗體)、b)緩衝劑、c)視需要之非離子賦形劑，以及d)視需要之界面活性劑；其中該組成物之pH為約5.0至約6.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250 mg/ml的多特異性抗體(諸如，約20至200 mg/ml的多特異性抗體)、b)乙酸鹽或組胺酸，c)山梨醇、海藻糖或蔗糖以及d)聚山梨醇酯；其中該組成物之pH為約5.0至約6.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250 mg/ml的多特異性抗體(諸如，約20至200 mg/ml的多特異性抗體)、b)組胺酸、c)蔗糖以及d)聚山梨醇酯；其中該組成物之pH為約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250 mg/ml的多特異性抗體(諸如，約20至200 mg/ml的多特異性抗體)、b)乙酸鹽、c)海藻糖以及d)聚山梨醇酯；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250 mg/ml的多特異性抗體(諸如，約20至200 mg/ml的多特異性抗體)、b)乙酸鹽、c)山梨醇以及d)聚山梨醇酯；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約60至80 mg/ml的多特異性抗體、b)組胺酸、c)蔗糖以及d)聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約60至80 mg/ml的多特異性抗體、b)乙酸鹽、c)山梨醇以及d)聚山梨醇酯80； 其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約60至80 mg/ml的多特異性抗體、b)乙酸鹽、c)海藻糖以及d)聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約135至165 mg/ml的多特異性抗體、b)組胺酸、c)蔗糖以及d)聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約135至165 mg/ml的多特異性抗體、b)乙酸鹽、c)山梨醇以及d)聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約135至165 mg/ml的多特異性抗體、b)乙酸鹽、c)海藻糖以及d)聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150至190 mg/ml的多特異性抗體、b)組胺酸、c)蔗糖以及d)聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150至190 mg/ml的多特異性抗體、b)乙酸鹽、c)山梨醇以及d)聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一個具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150至190 mg/ml的多特異性抗體、b)乙酸鹽、c)海藻糖以及d)聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
在又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250mg/ml的多特異性抗體(諸如，約20至200 mg/ml的多特異性抗體)、b)約5至40 mM乙酸鹽或組胺酸，c)約100至350 mM山梨醇、海藻糖或蔗糖以及d)約0.01至0.1% w/v聚山梨醇酯；其中該組成物之pH為約5.0至約6.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約60至80 mg/ml的多特異性抗體、b)約5至40 mM乙酸鹽或組胺酸(較佳為乙酸鹽)、c)約100至350 mM山梨醇、海藻糖或蔗糖(較佳為山梨醇)以及d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5至約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約135至165 mg/ml的多特異性抗體、b)約5至40 mM乙酸鹽或組胺酸(較佳為乙酸鹽)、c)約100至350 mM山梨醇、海藻糖或蔗糖(較佳為山梨醇)以及d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5至約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150至190 mg/ml的多特異性抗體、b)約5至40 mM乙酸鹽或組胺酸(較佳為乙酸鹽)、c)約100至350 mM山梨醇、海藻糖或蔗糖(較佳為山梨醇)以及d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5至約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約70 mg/ml的多特異性抗體、b)約20 mM乙酸鹽、c)約250 mM山梨醇以及d)約0.02% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150 mg/ml的多特異性抗體、b)約20 mM乙酸鹽、c)約250 mM山梨醇以及d)約0.02% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約170 mg/ml的多特異性抗體、b)約20 mM乙酸鹽、c)約250 mM山梨醇以及d)約0.02% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約70 mg/ml的多特異性抗體、b)約17 mM乙酸鹽(諸如，乙酸鈉)、c)約250 mM山梨醇、d)約0.02% w/v聚山梨醇酯80以及e)約3 mM冰乙酸酸；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150 mg/ml的多特異性抗體，b)約20 mM乙酸鹽(諸如，乙酸鈉)、c)約250 mM山梨醇以及d)約0.02% w/v聚山梨醇酯80、e)約3 mM冰乙酸酸；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約170 mg/ml的多特異性抗體、b)約20 mM乙酸鹽(諸如，乙酸鈉)、c)約250 mM山梨醇以及d)約0.02% w/v聚山梨醇酯80、e)約3 mM冰乙酸酸；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約60至80 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM組胺酸、c)約200至300 mM蔗糖以及視需要地d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約60至80 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽、c)約200至300 mM山梨醇以及視需要地d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約60至80 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽、c)約200至300 mM海藻糖以及視需要地d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約135至165 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM組胺酸、c)約200至300 mM蔗糖以及視需要地d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約135至165 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽，c)約200至300 mM山梨醇以及視需要地(d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約135至165 mg/ml的多特異性抗體，b)約10至30mM乙酸鹽，c)約200至300 mM海藻糖以及視需要地(d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150至190 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM組胺酸、c)約200至300 mM蔗糖以及視需要地(d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150至190 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽、c)約200至300 mM山梨醇以及視需要地(d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150至190 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽、c)約200至300 mM海藻糖以及視需要地(d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約70 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30mM組胺酸、c)約200至300 mM蔗糖以及視需要地(d)約0.01至0.03% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約70 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽，c)約200至300 mM山梨醇以及視需要地(d)約0.01至0.03% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約70 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽、c)約200至300 mM海藻糖以及視需要地(d)約0.01至0.03% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30mM組胺酸、c)約200至300 mM蔗糖以及視需要地(d)約0.01至0.03% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽、c)約200至300 mM山梨醇以及視需要地(d)約0.01至0.03% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約150 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽、c)約200至300 mM海藻糖以及視需要地(d)約0.01至0.03% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約170 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM組胺酸、c)約200至300mM蔗糖以及視需要地(d)約0.01至0.03% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約6.0。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約170 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽、c)約200至300 mM山梨醇以及視需要地(d)約0.01至0.03% w/v聚山梨醇酯80；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約170 mg/ml的多特異性抗體、b)約10至30 mM乙酸鹽、c)約200至300 mM海藻糖以及視需要地(d)約0.01至0.03% w/v聚山梨醇酯80 ；其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250 mg/ml的多特異性抗體(諸如，約20至200 mg/ml)的多特異性抗體， 其中該抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3；視需要地，其中SEQ ID NO：9中之X為H； b)緩衝劑(諸如組胺酸或乙酸鹽)， c)視需要地，非離子賦形劑(諸如，蔗糖、海藻糖或山梨醇)，以及 d)視需要地，界面活性劑(諸如，聚山梨醇酯)； 其中該組成物之pH為約5.0至約6.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250 mg/ml的多特異性抗體(諸如，約20至200 mg/ml的多特異性抗體)，其中該抗體包含SEQ ID NO：17和19所示之重鏈序列以及SEQ ID NO：18和20所示之輕鏈序列或由其組成，其中該多特異性抗體為雙特異性抗體， b)緩衝劑(諸如，組胺酸或乙酸鹽)， c)視需要地，非離子賦形劑(諸如，蔗糖、海藻糖或山梨醇)，以及 d)視需要地，界面活性劑(諸如，聚山梨醇酯)； 其中該組成物之pH為約5.0至約6.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250 mg/ml的多特異性抗體(諸如，約20至200 mg/ml的多特異性抗體)，其中該抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3；視需要地，其中SEQ ID NO：9中之X為H； b)乙酸鹽(諸如，約10至30 mM乙酸鹽)， c)視需要地，山梨醇(諸如，約200至300 mM山梨醇)，以及 d)視需要地，聚山梨醇酯(諸如，約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80)； 其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約65至75 mg/ml的多特異性抗體(諸如，約70 mg/ml的多特異性抗體)，其中該抗體包含或SEQ ID NO：17和19所示之重鏈序列以及SEQ ID NO：18和20所示之輕鏈序列或由其所組成，其中該多特異性抗體為雙特異性抗體， b)緩衝劑(諸如，組胺酸或乙酸鹽)， c)視需要地，非離子賦形劑(諸如，蔗糖、海藻糖或山梨醇)，以及 d)視需要地，界面活性劑(諸如，聚山梨醇酯)； 其中該組成物之pH為約5.0至約6.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約65至75 mg/ml的多特異性抗體(諸如，約70 mg/ml的多特異性抗體)，其中該抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3；視需要地，其中SEQ ID NO：9中之X為H； b)乙酸鹽(諸如，約10至30 mM乙酸鹽)， c)視需要地，山梨醇(諸如，約200至300 mM山梨醇)，以及 d)視需要地，聚山梨醇酯(諸如，約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80)； 其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約60至80 mg/ml的多特異性抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：17和19所示之重鏈序列以及SEQ ID NO：18和20所示之輕鏈序列或由其組成，其中該多特異性抗體為雙特異性抗體， b)約10至30 mM乙酸鹽， c)約200至300 mM山梨醇，以及 d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80； 其中該組成物之pH為約5.5。
於又一具體例中，本文中所述之醫藥組成物包含下列各者或基本上由其所組成： a)約60至80 mg/ml的多特異性抗體，其中該抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3；視需要地，其中SEQ ID NO：9中之X為H； b)約10至30 mM乙酸鹽， c)約200至300 mM山梨醇，以及 d)約0.01至0.05% w/v聚山梨醇酯80； 其中該組成物之pH為約5.5。
本發明係進一步以下列實施例闡釋本發明，該等實施例不應被解釋為限制本發明之範疇。 實施例 實施例 1- 由 2-MEA 誘導之 F ab 臂交換產生 CD3xCD30 雙特異性抗體
實施例中所使用之下列抗體： 人源化之 CD3 抗體
IgG1-huCD3-H1L1係如WO2015/001085(Genmab)之實施例1中所述。在本文中，將IgG1-huCD3-H1L1稱為「IgG1-huCD3」。
IgG1-huCD3-H1L1-H101G係如WO2017/009442 (Genmab)之實施例2中所述。在本文中，將IgG1-huCD3-H1L1-H101G稱為「IgG1-huCD3-H101G」。 CD30 抗體
MDX-060(也稱為HuMab 5F11)已於WO2003/ 059282(Medarex)中揭露。hAC10(或SGN-30)已於US 8257706和US20100239571(Seattle genetics)中揭露。HRS-3已於WO2016/0177846(Affimed)中揭露。HeFi-I、T405、T105、T408以及T215已於WO 2007/040653(US government & Health)中揭露。 抗體表現
將抗體序列選殖入pcDNA3.3表現載體(Invitrogen, US)中，並且以IgG1, κ或IgG1, λ表現且在Fc域中帶有或不帶有Fc沉默及/或DuoBody ®技術之胺基酸取代(見下文)。所有抗體均在無血清條件下藉由使用ExpiFectamine TM293(Thermo Fisher Scientific, US; cat. no. A14525)共轉染 Expi293F TM細胞(Thermo Fisher Scientific, US; cat. no. A14527)中的相關重鏈和輕鏈表現載體而產生，其係基本上如廠商所描述。 雙特異性抗體之產生
將DuoBody ®平台技術(亦即，如WO2011147986、WO2011131746以及WO2013060867(Genmab)以及Labrijn等人(Labrijn et al., PNAS 2013, 110: 5145-50; Gramer et al., MAbs 2013, 5:962-973)中所述之2-MEA誘導之受控之Fab臂交換(cFAE)用以在活體外產生雙特異性抗體。為了能由此方法產生雙特異性抗體，產生在CH3域中攜帶單突變之IgG1分子：於一親本IgG1抗體中為F405L突變(亦即，CD3抗體或對照、HIV-1 gp120特異性抗體)，而其他親本IgG1抗體中為K409R突變(亦即，CD30或對照抗體)。除了此等突變之外，親本IgG1抗體還包括導致Fc域無法與IgG Fc受體(Fc伽瑪受體)及/或補體因子(諸如，C1q)交互作用之取代：L234F、L235E、D265A(FEA; US 2015/0337049)或L234F、L235E、G236R(FER)。
Fc沉默和DuoBody ®技術之突變之組合指定如下： L234F、L235E、D265A以及F405L：FEAL L234F、L235E、D265A以及K409R：FEAR L234F、L235E、G236R以及K409R：FERR
親本抗體之重鏈(HC)和輕鏈(LC)序列係於SEQ ID NO所示： IgG1-huCD3-FEAL：SEQ ID NO：19(HC)和SEQ ID NO：20(LC)。 IgG1-huCD3-H101G-FEAL：SEQ ID NO：35(HC)和SEQ ID NO：20(LC)。 IgG1-CD30-MDX060-FERR：SEQ ID NO：17(HC)和SEQ ID NO：18(LC)。 IgG1-CD30-MDX060-FEAR：SEQ ID NO：55(HC)和SEQ ID NO：18(LC)。 IgG1-CD30-hAC10-FEAR：SEQ ID NO：21(HC)和SEQ ID NO：22(LC)。 IgG1-CD30-HRS-3-FEAR：SEQ ID NO：23(HC)和SEQ ID NO：24(LC)。 IgG1-CD30-HeFi-I-FEAR：SEQ ID NO：25(HC)和SEQ ID NO：26(LC)。 IgG1-CD30-T405-FEAR：SEQ ID NO：27(HC)和SEQ ID NO：28(LC)。 IgG1-CD30-T105-FEAR：SEQ ID NO：29(HC)和SEQ ID NO：30(LC)。 IgG1-CD30-T408-FEAR：SEQ ID NO：31(HC)和SEQ ID NO：32(LC)。 IgG1-CD30-T215-FEAR：SEQ ID NO：33(HC)和SEQ ID NO：34(LC)。
為了產生雙特異性抗體，將兩種親本抗體以等莫耳比在PBS緩衝劑(磷酸鹽緩衝鹽水；8.7 mM HPO 4 2-、1.8 mM HPO 4 2-、163.9 mM Na +、140.3 mM Cl -，pH 7.4)中混合。加入2-巰基乙胺-HCl(2-MEA)直到最終濃度為75 mM，並且將反應混合物於31℃下培養5 h。根據廠商之規程，藉由使用10 kDa分子量截取 Slide-A-Lyzer架(Thermo Fisher Scientific)透析入PBS緩衝劑內而去除2-MEA。將樣本於4℃下保存過夜，以便二硫鍵再氧化並形成完整的雙特異性抗體。如Gramer 等人所述(MAbs. 2013 Nov 1; 5(6): 962-973.)，以電灑離子化質譜(ESI-MS) 評估，cFAE之效率(efficacy) ＞ 95%。 非結合之對照抗體 b12
IgG1-b12為HIV-1 gp120特異性抗體(Barbas, CF. J Mol Biol. 1993 Apr 5; 230(3):812-23)，其係於一些實施例中用作陰性、非結合之對照抗體。在本文中，重鏈序列和輕鏈序列分別以SEQ ID NO：36和37(FEAL)或分別以SEQ ID NO：38和37(FERR)而包括在內。 實施例 2- 人類何杰金氏淋巴瘤 (HL) 、間變性大細胞淋巴瘤 (ALCL) 以及 TLL 細胞株之 CD30 表現
將定量流式細胞測量術(Human IgG Calibrator kit, BiCellx, cat. no. CP010)用以評估一組HL、ALCL以及TLL細胞株(表4)中之CD30表面表現水平。在4℃下，將細胞(5x10 4個細胞/孔)在聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one, cat. no. 650180)中與10 µg/mL IgG1-CD30-MDX060-FERR於50 μL染色緩衝劑(PBS [Lonza, cat. no. BE17-517Q]中一起培養30 min，該染色緩衝劑補充有0.1%牛血清白蛋白[BSA, fractionV, Roche, cat. no. 10735086001]和0.02% NaN3 [Sigma Aldrich, cat. no. 13412])。同時，基本上根據廠商之說明，使用Human IgG Calibrator Kit (BiCellx, cat. no. CP010)產生標準曲線。每個珠粒含有明確數量的人類IgG 單株抗體之校準珠粒與相同的R-PE接合之二級抗體(Jackson Nutrition,UK; cat. no. 109-116-098; 1：500稀釋)於4℃下一起避光培養30 min。將細胞和珠粒在FACS緩衝劑中洗滌，並在FACSCelesta流式細胞儀(BD Biosciences, USA)上以流式細胞測量術分析。將使用Human IgG Calibrator Kit獲得之標準曲線使用GraphPad Prism Software對每個細胞(ABC)結合之IgG1-CD30-MDX060-FERR抗體數量插值，代表細胞表面表現之CD30分子數量之估計值。
表 4和5顯示在除了SUP-T1之外之所有細胞株中觀察到高於定量下限(LLOQ)之CD30表現。 實施例 3-CD3xCD30 雙特異性抗體與人類何杰金氏淋巴瘤 (HL) 及非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)( 諸如，間變性大細胞淋巴瘤 (ALCL)) 細胞之結合
以流式細胞測量術分析CD3xCD30雙特異性抗體與兩種表現CD30之人類腫瘤細胞株SU-DHL-1(ALCL; ATCC, cat. no. ACC 356)和HDLM-2(HL; ATCC, cat. no. CRL-2965)之結合。
在4℃下，將細胞(3x10 4個細胞/孔)在聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one, cat. no. 650180)中與抗體之連續稀釋液(範圍為0.0046至10 μg/mL，以3倍稀釋步驟)於50 μL染色緩衝劑中一起培養30 min。在染色緩衝劑中洗滌兩次後，將細胞與50 μL二級抗體在4℃下一起培養30 min。作為二級抗體，使用於染色緩衝劑中以1：400稀釋之與R-PE接合之山羊抗人類IgG(Jackson ImmunoResearch, UK; cat. no. 109-116-098)。接下來，將細胞於染色緩衝劑中洗滌兩次，重新懸浮於100 μL補充TO-PRO-3碘化物(Thermo Fisher Scientific; cat. no. T3605; 1：8000稀釋)之染色緩衝劑中，並且在FACSCelesta流式細胞儀(BD Biosciences, USA)上分析。基於FSC/SSC及TOPRO-3染色之不存在圈選活細胞。以使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)之對數轉換數據(具有可變斜率之S形劑量-反應，四個參數)之非線性回歸分析結合曲線。 結果
圖 1顯示CD3xCD30雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR(A)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR(B)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR(C)、BsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR(D)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR(E)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR(F)、BisIgG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR(G)以及bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR(H)與SU-DHL-1(左圖)和HDLM-2(右圖)腫瘤細胞之劑量-反應結合曲線。
在濃度為1.11 µg/mL時，當與單特異性二價CD30親本抗體IgG1-CD30-MDX060-FEAR、IgG1-CD30-hAC10-FEAR、IgG1-CD30-HRS-3-FEAR以及IgG1-CD30-T105-FEAR之結合相比，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR顯示相似的結合(圖1I)。
相反地，在濃度為1.11 μg/mL時，bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR與SU-DHL-1和HDLM-2細胞之結合低於單特異性二價CD30親本抗體IgG1-CD30-T405-FEAR、IgG1-CD30-T408-FEAR以及IgG1-CD30-T215-FEAR與SU-DHL-1和HDLM-2細胞之結合(圖1I)。
整體而言，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR、BsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR於1.11 µg/mL之濃度結合高於bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR 於相同濃度之結合(圖1I)。
此等實驗中包括之陰性對照抗體BsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR未顯示與SU-DHL-1和HDLM-2細胞之結合，顯示SU-DHL-1和HDLM-2細胞均未表現CD3。
總之，與二價形式相比，CD30抗體殖株T405、T408以及T215顯示單價結合降低，而殖株MDX060、hAC10、HRS-3以及T105顯示單價和二價形式與表現CD30之腫瘤細胞之有效率的結合。
圖 2顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與(A)HDLM-2(HL)、(B)L-428(HL)、(C)DEL (ALCL)以及(D) KI-JK(ALCL)細胞之劑量/反應結合曲線。與單特異性二價CD30親本抗體IgG1-CD30-MDX060-FERR相比，BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR展現相似的最大結合。陰性對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、IgG1-huCD3-FEAL以及IgG1-b12-FEAL未顯示與任何此等細胞株之結合，顯示此等細胞在細胞表面上未表現 CD3。此等數據證實bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEER與HL和ALCL細胞株的有效率的結合。
表 6顯示兩個獨立實驗中評估的bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR與HDLM-2、L-428、DEL以及KI-JK細胞結合之EC 50值。EC 50值的範圍在0.05至0.30 µg/mL之間。
圖 8 、 9 以及 10顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與表現CD30之HL細胞株( 圖 8)、ALCL細胞株( 圖 9)以及NHL細胞株( 圖 10)之劑量-反應結合曲線(圖10)。在所有細胞株中，與單價對照抗體BsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR相比，BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR展現相似的最大組合。單特異性二價CD30親本抗體IgG1-CD30-MDX060-FERR顯示與所有細胞株之劑量依賴性結合，但與BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR相比，顯示更低的最大結合。陰性對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、IgG1-huCD3-FEAL以及IgG1-b12-FEAL未顯示與任何此等細胞株的結合，顯示此等細胞在細胞表面上未表現CD3。此等數據證實bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與HL細胞株、T-NHL(諸如，ALCL和CTCL細胞株)；以及B-NHL(諸如，MCL細胞株)的有效率的結合。
表 7顯示在2或3個獨立實驗中評估的bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與HL、T-NHL以及B-NHL細胞株結合之EC 50值。EC 50值的範圍在0.12至0.35 μg/mL之間。 實施例 4-CD3xCD30 雙特異性抗體活體外誘導 T 細胞介導之細胞毒性及 T 細胞增生
使用CD30陽性腫瘤細胞株作為標靶細胞和T細胞作為效應細胞，在活體外細胞毒性測定中測試CD3xCD30雙特異性抗體。作為T細胞的來源，將CD3陽性ADCC效應細胞IV型(Clean Cells, Montaigu, France)或純化之T細胞(如實施例5中所述)用以評估CD3依賴性腫瘤細胞殺傷。
SU-DHL-1(ALCL)、HuT78(ALCL)、HDLM-2(HL)、NCEB-1(MCL)或L540(HL)細胞以10,000個細胞/孔之密度接種入聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one, cat. no. 650180)內。效應細胞以0.5 µM CFSE(羧基螢光素琥珀醯亞胺酯; Cell Signaling Technology, Danvers, MA; cat. no. C34554)在37℃下標記20分鐘，並以E：T比=10：1(ADCC效應細胞)或7：1(純化之T細胞)加入腫瘤細胞中。加入雙特異性CD3xCD30、b12xCD30或CD3xb12抗體或單特異性二價CD30抗體之連續稀釋液(最終濃度範圍為10至0.041 µg/mL；3倍稀釋)，並將細胞在37℃下培養72小時。於一些實驗中，將bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR之變體與含有H101G突變之CD3結合臂一起使用，該突變對CD3具有降低之親和力(WO2017/009442, Genmab)。以100 μL染色緩衝劑洗滌兩次後，將細胞重新懸浮於含有TO-PRO-3碘化物(Thermo Fisher Scientific; cat. no. T3605; 1：4000稀釋)之染色緩衝劑中，並在FACSCelesta流式細胞儀(BD Biosciences, USA)上分析。
將以5 μM星形孢菌素(Sigma-Aldrich, USA, cat. no. S6942)處理的腫瘤細胞樣本的生存力設定為0%，並且將未經處理之腫瘤細胞樣本的生存力設定為100%。
「活細胞百分比」計算如下： %活細胞=([樣本細胞數-經星形孢菌素處理之標靶細胞之細胞數量]/[未經處理之標靶細胞之細胞數量-經星形孢菌素處理之標靶細胞之細胞數量]) ×100。
將CFSE陽性細胞計數作為T細胞之絕對數量的量度以評估T細胞增生。
使用GraphPad Prism V8軟體(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)以非線性迴歸(具有可變斜率之S形劑量-反應)分析劑量-反應曲線。 結果
使用CD30陽性腫瘤細胞株SU-DHL-1細胞或HDLM-2細胞作為標靶細胞和ADCC效應細胞IV型細胞(Clean Cells, Montaigu, France)作為效應細胞在活體外細胞毒性測定中測試CD3xCD30雙特異性抗體。
圖 3顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR(A)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR(B)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR(C)、BsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR(D)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR(E)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR(F)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR(G)以及bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR(H)誘導SU-DHL-1(左圖)或HDLM-2(右圖)之劑量依賴性T細胞介導之細胞毒性(顯示為%活細胞百分比減少)細胞。
單特異性二價CD30抗體IgG1-MDX060-FEAR (A)、IgG1-CD30-hAC10-FEAR(B)、IgG1-CD30-HRS-3-FEAR(C)、IgG1-CD30-HeFi-I-FEAR(D)、IgG1-CD30-T405-FEAR(E)、IgG1-CD30-T105-FEAR(F)、IgG1-CD30-T408-FEAR(G)以及IgG1-CD30-T215-FEAR(H)未誘導T細胞介導之細胞毒性。對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR也不會誘導T細胞介導之SU-DHL-1或HDLM-2細胞之細胞毒性。
此外，使用不同的MCL、ALCL以及HL細胞株作為標靶細胞和純化之T細胞或ADCC效應細胞IV型細胞作為效應細胞在活體外細胞毒性測定中測試CD3xCD30雙特異性抗體。 圖 4A 至 B 顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR誘導之SU-DHL-1、HuT78或NCEB-1細胞之T細胞介導之細胞毒性比具有降低之親和力之具有CD3結合臂的此抗體的變體(bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR)更有效(potent)。bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR和bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR誘導類似的HDLM-2細胞之最大T細胞介導之細胞毒性( 圖 4B)。將與作為對照而包括在內之二價單特異性抗體IgG1-huCD3-FEAL或IgG1-b12-FEAR一起培養未在此等細胞株中誘導細胞毒性。bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR和bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR在最低測試濃度(0.014 µg/mL； 圖 4C)下誘導L540細胞之有效且相似的T細胞介導之細胞毒性。對照抗體bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR或IgG1-MDX060-FEAR未誘導L540細胞之T細胞介導之細胞毒性。
總之，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR誘導對各種表現CD30之MCL、ALCL以及HL腫瘤細胞株之有效殺傷。與具有更低親和力之CD3臂(位置101處含有G)的變體相比，在CD3臂之VH CDR3之位置101處含有H之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR更有效地殺傷表現CD30之MCL和ALCL腫瘤細胞。
在使用HDLM-2細胞(左圖)或NCEB-1細胞(右圖)作為標靶細胞之細胞毒性測定中，將CFSE陽性細胞之數量評估為絕對T細胞計數之量度。 圖 4D顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR或bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR誘導之HDLM-2和NCEB-1細胞之T細胞介導之細胞毒性(參見 圖 4B)與T細胞計數呈劑量依賴性增加相關。通常，在此測定中，與bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR或bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR一起培養後，計數相似的T細胞數量。在將濃度高於1 µg/mL之bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR與NCEB-1細胞培養之共培養物中，注意到T細胞數量減少。於此等實驗中，對照抗體IgG1-b12-FEAL不影響T細胞數量。
總之，BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR誘導在各種表現CD30之ALCL、HL以及MCL腫瘤細胞株存在下之T細胞增生。 實施例 5-CD3xCD30 雙特異性抗體與 Expi293F 細胞中表現之人類、食蟹獼猴或恆河猴 CD30 之結合
以流式細胞測量術分析雙特異性CD3xCD30抗體和單特異性二價CD30抗體與以人類CD30或食蟹獼猴CD30瞬時轉染之Expi293細胞的細胞膜之結合。 人類、食蟹獼猴或恆河猴 CD30 在 HEK-293F 或 HEK-293 細胞中之瞬時表現
產生下列用於表現各種全長CD30變體之密碼子優化之構築體：人類(智人)CD30(huCD30；Uniprot登錄號P28908)、食蟹獼猴(長尾獼猴(Macaca fascicularis)) CD30(mfCD30；Uniprot登錄號A0A2K5VW07)(SEQ ID NO：40)以及恆河猴(普通獼猴(Macaca mulatta))CD30 (mmCD30；Uniprot登錄號A0A1D5RK03)(SEQ ID NO：41)。構築體含有適合選殖之限制性位點和最佳之Kozak(GCCGCCACC)序列(Kozak, M., Gene 1999; 234(2): 187-208)。將全長人類CD30、食蟹獼猴以及恆河猴CD30密碼子優化之構築體選殖到哺乳動物表現載體pcDNA3.3 (Invitrogen)中，並基本上如製造商所述，使用Expi293F表現平台(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, cat. no. A14527)表現。於另一組實驗中，在HEK-293細胞中表現全長人類CD30或食蟹獼猴CD30構築體。 CD3xCD30 雙特異性抗體與 Expi293 細胞中表現之人類、食蟹獼猴或恆河猴 CD30 之結合
在4℃下，將細胞(3x10 4個細胞/孔)在聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one, cat. no. 650180)中與抗體之連續稀釋液(範圍為0.005至10 μg/mL，以3倍稀釋步驟)於100 μL染色緩衝劑中一起培養30 min。實驗以技術二重複進行。在染色緩衝劑中洗滌兩次後，將細胞於50 μL二級抗體中在4℃下培養30 min。作為二級抗體，使用於染色緩衝劑中以1：400稀釋之與R-PE接合之山羊抗人類IgG(Jackson ImmunoReseach, UK; cat. no. 109-116-098)。將細胞在染色緩衝劑中洗滌兩次，重新懸浮於含30 μL有0.4% EDTA之染色緩衝劑中，並在iQue Screener(Intellicyt Corporation, USA)上分析。使用非線性迴歸(具有可變斜率之S形劑量-反應)分析結合曲線，該非線性迴歸係使用GraphPad Prism V9.0.0軟體(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)。 CD3xCD30 雙特異性抗體與 HEK293 細胞中表現的人類、食蟹獼猴或恆河猴 CD30 之結合
在4℃下，將細胞(3x10 4個細胞/孔)在聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one, cat. no. 163320)中與抗體之連續稀釋液(範圍為0.0002至50 μg/mL，以4倍稀釋步驟)100 μL染色緩衝劑中一起培養30 min。實驗以技術二重複進行。在染色緩衝劑中洗滌兩次後，將細胞於50 μL二級抗體中在4℃下培養30 min。作為二級抗體，使用於染色緩衝劑中以1：200稀釋之與R-PE接合之山羊抗人類IgG(Jackson ImmunoReseach, UK; cat. no. 109-116-098)。將細胞在染色緩衝劑中洗滌兩次，重新懸浮於30 μL含有0.4% EDTA和ToPro-3生存力標記(Invitrogen, cat. No. T3605)之染色緩衝劑中。將細胞在iQue Screener(Intellicyt Corporation, USA)上分析。使用非線性迴歸(具有可變斜率之S形劑量-反應)分析結合曲線，該非線性迴歸係使用GraphPad Prism V9.0.0軟體(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)。 CD3xCD30 雙特異性抗體與人類 T 細胞或食蟹獼猴 PBMC 之結合
將食蟹獼猴PBMC(Tebu-Bio, The Netherlands; cat. no. PBCMFA-10)或純化之人類T細胞平板培養於聚苯乙烯96孔圓底盤中。T細胞衍生自人類捐贈者膚色血球層(Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)，並根據廠商之使用說明書使用RosetteSep Human TT Cell Enrichment Cocktail(Stemcell Technologies, France, cat. no. 15061)單離。在4℃下，將細胞(3x10 4個細胞/孔)與抗體IgG1-CD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR之連續稀釋液(範圍為0.0001至10 μg/mL，以3倍稀釋步驟)在50 μL染色緩衝劑中一起培養30 min。在4℃下，在染色緩衝劑中洗滌兩次後，將細胞在50 μL與R-PE接合之山羊抗人類IgG二級抗體中培養30 min(1：400稀釋)。在染色緩衝劑中洗滌兩次後，將T細胞進行T細胞標記CD3(1：100；Miltenyi Biotec，殖株10D12，與APC接合)、CD4(1：50；eBioscience，殖株OKT4，與APC-Cy7接合)、CD8(1：100；Biolegend，殖株RPA-T8，與AF700接合)以及T細胞活化標記CD69(1：50；BD Biosciences，殖株AB2439，與FITC接合)、CD25(1：50；eBioscience，殖株BC96，與PE-Cy7接合)以及CD279/PD1(1：50；BD Biosciences，殖株AEH12.2H7，與BV605接合)染色。將具有Ultracomp珠粒(5 µL; Invitrogen, cat. no. 01-2222-42)之單一染色之樣本用於流式細胞儀之補償調整。在4℃下培養30 min後，以染色緩衝劑洗滌細胞兩次，重新懸浮於100 µL染色緩衝劑中，以及使用FACS Fortessa(BD Biosciences)分析。將數據用FlowJo (BD Biosciences)處理。 結果
靶向CD30之雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-H101G- FEALxCD30-MDX060-FEAR以及bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR顯示與野生型Expi293F細胞無結合( 圖 5A)，但與以huCD30( 圖 5B)或mfCD30( 圖 5C)轉染之Expi293F細胞呈現劑量依賴性結合。此等雙特異性抗體之結合與單特異性二價CD30抗體IgG1-CD30-MDX060-FEAR之結合相當。如所預期，陰性對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR顯示與野生型或以huCD30或mfCD30轉染之Expi293F細胞無結合。類似地，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR顯示與以huCD30( 圖 11A)或mfCD30( 圖 11B)轉染之HEK293細胞呈劑量依賴性結合，陰性對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR顯示與以huCD30或mfCD30轉染之HEK293細胞無結合。這顯示靶向CD30之抗體MDX060與HEK細胞中以二價和單價形式表現之人類和食蟹獼猴CD30有效率地結合。
圖 5D顯示CD3xCD30雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR和對照雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR與初生人類和食蟹獼猴T細胞有效率地結合。這顯示此等靶向CD3之雙特異性抗體與T細胞上內源性地表現之人類和食蟹獼猴CD3有效率地結合。IgG1-CD30-MDX060二價親本抗體未與人類或食蟹獼猴T細胞結合，顯示此等細胞上未表現CD30。
以流式細胞測量術評估CD3xCD30雙特異性抗體和單特異性親本CD30抗體與以huCD30或mmCD30轉染之Expi293F細胞之結合。CD3xCD30雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR( 圖 6A)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR( 圖 6B)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR( 圖 6C)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR ( 圖 6E)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR( 圖 6F)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR( 圖 6G)以及bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR( 圖 6H)顯示與表現huCD30或mmCD30之細胞有相同的結合。類似地，親本單特異性 CD30抗體殖株顯示與表現huCD30或mmCD30之細胞有相同的結合。相反地，bsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR和親本單特異性CD30抗體IgG1-CD30-HeFi-I_FEAR顯示與huCD30結合，但未與mmCD30結合( 圖 6D)。 實施例 6- 以 DSF 分析評估單特異性和雙特異性非活化抗體變體之構形穩定性
使用差示掃描螢光測定術(DSF)評估在恆定重鏈區中攜帶(harboring)非活化突變之二價單特異性CD30、CD3和雙特異性CD3xCD30 IgG1抗體變體之蛋白質穩定性特性。
將IgG1-CD30-MDX060-FEAR、IgG1-CD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL以及BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR樣本以大約1 mg/mL的濃度調配於PBS pH 7.4中。
為了評估構形穩定性，DSF在iQ5Multicolor Real-Time PCR檢測系統(Bio-Rad)中進行，該系統能檢測由外在染料Sypro-Orange(5000x濃縮於DMSO, Cat # S5692, Sigma-Aldrisch中)與IgG反摺疊後曝露之疏水性區域之結合所引起之螢光強度變化。Sypro-Orange於PBS pH 7.4 (Hyclone GE Healthcare)中稀釋 320倍。熱熔融曲線可由測量分析之IgG之受控、逐步熱變性期間不斷增加之螢光而導出。因此，將5 µL的抗體溶液(1 mg/mL於PBS)之二重複樣本加入iQ 96孔PCR盤中之20 µL的於PBS pH 7.4稀釋之Sypro-Orange中。在25℃至95℃之不斷增加之溫度範圍內記錄螢光，每次增量逐步增量為0.5℃，持續時間為15秒，加上記錄所有孔之螢光所需的時間。將Bio-Rad CFX Manager Software 3.0用以分析數據，並以軟體由螢光與溫度圖確定熔點。 結果
圖 7和 表 8顯示IgG1-CD30-MDX060-FERR的熔化溫度(T m)為69.0℃，高於IgG1-CD30-MDX060-FEAR在pH 7.4時之T m(64.5℃)。這表示IgG1-CD30-MDX060-FERR具有比IgG1-CD30-MDX060-FEAR高的構形穩定性，暗示含有FER骨架之IgG1-CD30-MDX060具有比含有FEA骨架之IgG1-CD30-MDX060高的構形穩定性。BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之熔化溫度測定為64.5℃，其係介於針對兩個親本抗體IgG1-huCD3-FEAL(62.5℃)和IgG1-CD30-MDX060-FERR測定之T m 之間(69.0℃)。 實施例 7-bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 與 T 細胞和腫瘤細胞之 同時結合
研究了bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與腫瘤細胞和初始T細胞之同時結合。
解凍從健康捐贈者單離之冷凍T細胞，並在37℃下以0.25 mM Celltrace Violet(Pacific Blue; Invitrogen, cat. no. C34557A)標記15 min。將L-428腫瘤細胞以Celltrace FarRed(APC; Invitrogen cat. no. C34564A)在37℃下標記15 min，並以1：1之E：T比加入T細胞。加入bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、bsG1b12FEALxCD30MDX060-FERR或IgG1-b12-FEAL之連續稀釋液(最終濃度範圍為6×10 -5至10 µg/mL；3倍稀釋)，並將細胞在4℃下培養2小時。培養後，加入生存力標記7-AAD(BD Bioscience, cat. no. 559925)(100x最終稀釋液)，並在FACS Celesta流式細胞儀(BD Biosciences)上分析細胞。 結果
圖 12顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導CD3 +CD30 +雙陽性事件(在流式細胞測量術染色中表現CellTrace Far Red和CellTrace Violet兩者之細胞)之形成，作為腫瘤細胞與T細胞之bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR介導之交聯(同時結合)之量度。雙陽性事件之增加係抗體濃度依賴性，並顯示鐘形曲線。在與對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、bsG1b12FEALxCD30MDX060-FERR或IgG1-b12-FEAL一起培養之樣本中或在沒有抗體培養之樣本中，未觀察到腫瘤細胞和T細胞交聯之增加(A)。 圖 12B顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與腫瘤細胞和初始T細胞之同時結合，如由表現CellTrace Far Red和CellTrace Violet之細胞百分比所檢測的(B)。
此等數據顯示bsG1huCD3FEALxCD30-MDX060-FERR可與CD30 +腫瘤細胞和CD3 +T細胞同時結合和交聯。 實施例 8- 由 CD3xCD30 雙特異性抗體活體外誘導 T 細胞介導之細胞毒性及 T 細胞活化
評估Karpas-299腫瘤細胞之T細胞介導之細胞毒性以及由一組CD3xCD30雙特異性抗體引起之相關的T細胞活化。評估下列抗體：bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR。
T細胞獲自健康人類捐贈者膚色血球層(Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)，並根據廠商之使用說明書使用RosetteSep™ HumanTT Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies, France, cat. no. 15061)單離。在37℃下，將T細胞以Celltrace Violet (Invitrogen, cat. no. C34557A; 最終濃度為5 µM)標記15 min。同時，在37℃下，以Celltrace FarRed(Invitrogen, cat. no. C34564A; 最終濃度為2 µM)標記Karpas-299腫瘤細胞15 min。標記後，加入5x體積的冰冷DBSI，並在RT下培養5分鐘。將細胞團塊化，重新懸浮於培養基中，並將腫瘤細胞以50,000個細胞/孔之密度接種入96孔盤(Greiner-bio-one, The Netherlands, cat. no. 655180)內。加入雙特異性CD3xCD30抗體之連續稀釋液(最終濃度範圍為1,000至0.051 ng/mL；3倍稀釋)，並將盤在RT下培養15 min。將T細胞以4：1之效應物與標靶(E：T)之比率加入腫瘤細胞，並將盤在37℃下培養72小時。以PBS/0.1% BSA/0.02%疊氮化物(染色緩衝劑)洗滌2次後，將細胞進行T細胞標記CD4(1：50; Biolegend, cat. no. 300521,與Pacific Blue接合)、CD8(1：100; BD Biosciences,與FITC接合)以及T細胞活化標記CD69(1：50; Biolegend, cat. no. 310934,與BV650接合)、CD25(1：100; Invitrogen, cat. no. 25-0259-42,與PE-Cy7接合)以及CD279/PD-1(1:50; Biolegend, cat. no. 329930,與BV605接合)。包括具有Ultracomp珠粒(5 µL; Invitrogen，cat. no. 01-2222-42)之單一染色之樣本，並用於流式細胞儀之補償調整。在4℃下培養30 min後，以染色緩衝劑洗滌盤兩次，並且將細胞以7-AAD(以1：100於染色緩衝劑中稀釋)在4℃下染色10 min。使用FACS Fortessa (BD Biosciences)分析細胞。使用FlowJo (BD Biosciences)處理數據。
使用非線性迴歸分析(具有可變斜率之S形劑量-反應)產生劑量-反應曲線，該非線性迴歸係使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)。 結果
圖 13A 和 B顯示所有CD3xCD30抗體誘導Karpas-299細胞之T細胞介導之細胞毒性。與所有其他測試之殖株相比，使用CD30殖株MDX060(bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR)產生之CD3xCD30雙特異性抗體在殺傷Karpas-299細胞方面更有效。事實上，與使用CD30殖株HRS-3、HeFi-I、T105、T405、T408或T215(bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR； 圖 13A)產生之CD3xCD30雙特異性抗體相比，基於MDX060之CD3xCD30雙特異性抗體顯示顯著更低的IC 50值。此外，與使用CD30殖株hAC10、HeFi-I、T405、T408或T215(bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR； 圖 13B)產生之CD3xCD30雙特異性抗體相比，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR誘導更高的最大殺傷。 圖 13C 和 D顯示作為CD4 +細胞( 圖 13C)或CD8 +T細胞( 圖 13D)中之T細胞活化之量度，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR在誘導CD25表現方面比任何其他CD3xCD30雙特異性抗體更有效(更低的EC 50值)。PD-1( 圖 13E 和 F)和CD69(數據未顯示)的表現觀察到類似的結果。在含有FEAR或FERR突變的兩種基於MDX060之CD3xCD30雙特異性抗體之間，未觀察到 T細胞介導之殺傷或T細胞活化之差異。
與測試的其他組的CD3xCD30雙特異性抗體相比，雙特異性抗體bsG1-huCD3xCD30-MX060在誘導L-428細胞之T細胞介導之細胞毒性方面也更有效(數據未顯示)。
此等實驗中所使用之一組CD3xCD30雙特異性抗體誘導之T細胞介導之細胞毒性之平均IC 50濃度和最大溶解百分比以及T細胞活化(CD25表現)之EC 50濃度總結於 表 9。
總之，此等數據證明bsG1huCD3xCD30-MDX060在誘導T細胞介導之細胞毒性方面比所評估之任何其他CD3xCD30雙特異性抗體更有效。 實施例 9-bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 活體外誘導 T 細胞介導之細胞毒性、 T 細胞增生以及 T 細胞活化
在HL和ALCL細胞株中評估bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之腫瘤細胞之T細胞介導之細胞毒性以及相關的T細胞增生和活化。
T細胞獲自健康人類捐贈者膚色血球層(Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)，並根據廠商之說明使明書使用RosetteSep™ HumanTT Cell Enrichment Cocktail(Stemcell Technologies, France, cat. no. 15061)單離。在37℃下，將T細胞以Celltrace Violet(Invitrogen, cat. no. C34557A; 最終濃度為5 µM)標記15 min。同時，在37℃下，以Celltrace FarRed(Invitrogen, cat. no. C34564A; 最終濃度為2 µM)標記L-428、KI-JK、KM-H2或SUP-M2 15 min。標記後，加入5x體積的冰冷DBSI，並在RT下培養5分鐘。將細胞團塊化，重新懸浮於培養基中，並將腫瘤細胞以50,000個細胞/孔之密度接種入96孔盤(Greiner-bio-one, The Netherlands, cat. no. 655180)內。加入bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或對照抗體IgG1-huCD3-FEAL、bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-b12-FEAL之連續稀釋液(最終濃度範圍為1,000至0.051 ng/mL；3倍稀釋)，並將盤在RT下培養15 min。將T細胞以4：1之效應物與標靶(E：T)之比率加入腫瘤細胞，並將盤在37℃下培養72小時。以PBS/0.1% BSA/0.02%疊氮化物(染色緩衝劑)洗滌2次後，將細胞進行T細胞標記CD4(1：50; Biolegend, cat. no. 300521,與Pacific Blue接合)、CD8(1：100; BD Biosciences, cat. no. 345772,與FITC接合)以及T細胞活化標記CD69(1：50; Biolegend, cat. no. 310934,與BV650接合)、CD25(1：100; Invitrogen, cat. no. 25-0259-42,與PE-Cy7接合)以及CD279/PD-1(1：50; Biolegend, cat. no. 329930,與BV605接合)。包括具有Ultracomp珠粒(5 µL; Invitrogen, cat. no. 01-2222-42)之單一染色之樣本，並用於流式細胞儀之補償調整。在4℃下培養30 min後，以染色緩衝劑洗滌盤兩次，並且將細胞以7-AAD(以1：100於染色緩衝劑中稀釋)在4℃下染色10 min。使用FACS Fortessa (BD Biosciences)分析細胞，並且使用FlowJo (BD Biosciences)處理數據。
活標靶細胞之百分比使用以下公式計算： %活標靶細胞=(各種條件下活的單一Celltrace FarRed標記之細胞的絕對數量/僅含有標靶細胞和T細胞而不加入任何抗體之條件下活的單一Celltrace FarRed標記之細胞的絕對數量)x100。
T細胞增生係藉由以稀釋之Celltrace Violet染色圈選CD4 +或CD8 +T細胞而評估。使用FlowJo的增生建模工具計算擴增指數。自動擬合世代(generation)峰，並根據以下公式計算擴增指數值： 擴增指數=細胞總量/培養開始時的細胞數量=(G0+ G1+G2+G3+G4+G5+G6)/(G0+G1：2+G2：4+G3：8+G4：16+G5：32+G6：64)。 Gn=第n代峰之細胞數量(n=0至6)。
使用非線性迴歸分析(具有可變斜率之S形劑量-反應)分析劑量-反應曲線，該非線性迴歸係使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)。 結果
圖 14顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在L-428(HL)、KM-H2(HL)、SUP-M2(ALCL)以及KI-JK(ALCL)細胞株中活體外誘導劑量依賴性T細胞介導之細胞毒性。L-428和KI-JK細胞中之bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之T細胞介導之細胞毒性的平均IC 50濃度總結於表10中。在與對照抗體IgG1-huCD3-FEAL、bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-b12-FEAL一起培養的細胞或不與抗體一起培養的樣本中未觀察到細胞毒性。
圖 15 、 16 、 17 以及 18顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之L-428和KI-JK細胞之T細胞介導之細胞毒性與CD4 +和CD8 +T細胞增生( 圖 15)和T細胞活化標記CD69( 圖 16)、CD25( 圖 17)以及PD-1(圖18)之表現相關。此等實驗中之bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之T細胞增生和活化的平均EC 50濃度總結於 表 10。
因此，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在活體外誘導HL和ALCL細胞株中之劑量依賴性T細胞介導之細胞毒性，這與T細胞增生和活化相關。 實施例 10-bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 活 體外誘導細胞介質產生
在使用L-428標靶細胞和健康捐贈者T細胞之活體外T細胞介導之細胞毒性實驗期間收集的上清液中評估bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之細胞介質和顆粒酶B之產生，如實施例9中所述。將上清液儲存於-20℃下，並解凍以進行分析。使用R&D 系統定制的基於珠粒之多重免疫測定(luminex)測量14種不同細胞介質(CD40、IFNγ、IL-10、IL-12、IL-13、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、PDL-1、TNFα)和顆粒酶 B之濃度。 結果
在bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之存在下，來自L-428細胞和T細胞共培養之上清液中，主要觀察到顆粒酶B和細胞介質IFNγ、IL-13以及TNFα之濃度增加(＞2000 pg/mL)。當與對照抗體IgG1-b12-FEAL相比時，觀察到CD40、IL-10、IL-12、IL-1β、IL-2、IL-4、IL6以及IP-10細胞介質濃度適度增加。與對照抗體IgG1-b12-FEAL相比，IL-8、MCP-1以及PDL1之水平未經調節( 圖 19)。
因此，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之T細胞介導之細胞毒性和T細胞活化與細胞介質和顆粒酶 B之劑量依賴性產生相關。 實施例 11- 使用純化之 T 細胞作為效應細胞，在不同的效應物與標靶之比率時， bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 活體外誘導 T 細胞介導之細胞毒性
為了測定在雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR的存在下之T細胞介導之腫瘤細胞殺傷之最佳效應細胞與標靶細胞之比率，在不同的效應物與標靶細胞(E：T)之比率時，使用CD30陽性腫瘤細胞株L-428作為標靶細胞和純化之T細胞作為效應細胞進行活體外細胞毒性測定。
基本上如實施例9中所述評估T細胞介導之細胞毒性，除了以1：1、2：1、4：1或8：1之不同效應物與標靶(E：T)細胞比將T細胞加入腫瘤細胞。 結果
圖 20A顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在所有E：T比時誘導劑量依賴性T細胞介導之細胞毒性，其中在4：1和8：1之E：T比時觀察到最大的腫瘤細胞殺傷(小於20%活腫瘤細胞)。與此一致，在所有E：T細胞比時觀察到CD4+和CD8+T細胞增生，最顯著的是在4：1和8：1之E：T比時( 圖 20B 至 C)。對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR在測試之任何E：T 比時均未誘導特異性 T細胞介導之細胞毒性或T細胞增生。
總的來說，此等數據顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR活體外誘導之L-428腫瘤細胞之T細胞介導之細胞毒性在4：1和8：1之E：T比時最有效。 實施例 12-bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 活體外誘導之 T 細胞介導之細胞毒性及 T 細胞增生之動力學
為了評估bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之存在下T細胞介導之腫瘤細胞殺傷之動力學，使用CD30陽性腫瘤細胞株L-428作為標靶細胞和純化之T細胞作為效應細胞在不同的培養期時間進行活體外細胞毒性測定。
基本上如實施例9中所述評估T細胞介導之細胞毒性，除了在24 h、48 h以及72 h後評估腫瘤細胞細胞毒性和T細胞增生。 結果
圖 21顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在48 h和72 h後誘導劑量依賴性T細胞介導之細胞毒性，而在24 h後未觀察到顯著的T細胞介導之細胞毒性。bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在72 h後誘導劑量依賴性CD4 +和CD8 +T細胞增生，而在24 h或48 h後未觀察到T細胞增生( 圖 21B 和 C)。
總的來說，此等數據顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR以時間依賴性方式誘導腫瘤細胞之T細胞介導之細胞毒性和T細胞增生。 實施例 13-CD30 表現水平與 bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 活體外誘導之 T 細胞介導之細胞毒性的相關性
bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR對八種表現CD30之腫瘤細胞株之T細胞介導之殺傷係如實施例9中所述之活體外細胞毒性測定(使用4:1之E：T比)來測定。使用下列細胞株：L-428、KM-H2、DEL、KI-JK、KARPAS-299、SUP-M2、NCEB-1以及JVM-2。對於此等腫瘤細胞株，由定量流式細胞儀評估CD30表現水平，如實施例2中詳述。 結果
圖 22顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在活體外誘導所有細胞株中之T細胞介導之細胞毒性，其中最大標靶細胞殺傷在68%和98%之間。bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之最大T細胞介導之腫瘤細胞殺傷與CD30表現水平顯著相關( 圖 22A)(斯皮爾曼r=0.8571；p值=0.0107)。
在 圖 22B中，針對CD30表現水平繪製了在bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR的存在下之各細胞株之T細胞介導之殺傷的EC 50，顯示負的，但不顯著的趨勢(斯皮爾曼r=-0.6190；p值=0.1150)。
因此，此等數據顯示CD30表現水平與bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR活體外誘導之最大T細胞介導之細胞毒性之間呈正相關。 實施例 14-BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 誘導之 活化 之 T 細胞的誤殺
評估BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR活體外誘導之活化之CD30 +T細胞T細胞之誤殺。
以100 µL的1 µg/mL抗人類CD3(殖株OKT3, Invitrogen, cat. no. 16-0037-85)於PBS之溶液塗佈96孔盤(Greiner-bio-one, The Netherlands, cat. no. 655180)。將盤在37℃下培養4小時。除去抗體溶液後，以100 µL的PBS洗滌孔。T細胞獲自健康人類捐贈者膚色血球層(Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)，並根據廠商之使用說明書使用RosetteSep™ HumanT Cell Enrichment Cocktail(Stemcell Technologies, France, cat. no. 15061)單離。將純化之T細胞以2x10 6個細胞/mL 100 µL的T細胞懸浮液(含有200,000個T細胞)之濃度重新懸浮於具有25 mM HEPES和L-麩醯胺酸(Lonza, cat. no. BE12-115F)之T細胞培養基(Roswell Park Memorial Institute [RPMI]-1640 培養基(其補充具有鐵之10%熱滅活之供血牛血清(DBSI; Gibco, cat. no. 20731-030)和青黴素/鏈黴素(pen/strep; Lonza, cat. no. DE17-603E))，並加入塗佈抗CD3之盤之各孔中。此外，100 µL的T細胞培養基補充有2 µg/mL抗 CD28(殖株CD28.2, Invitrogen, cat. no. 16-0289-85)和0.05 µg/mL IL-15(ThermoFisher, cat. no. PHC9151)加到各孔中。接著，將T細胞在37℃下培養96小時。
96小時後，收集T細胞並以2x10 6個細胞/mL之濃度重新懸於T細胞培養基中。進行流式細胞測量術分析以測量CD30和T細胞活化標記的表現。簡而言之，以PBS/0.1% BSA/0.02% 疊氮化物(染色緩衝液)洗滌等分試樣之細胞，以50 µl的1000x稀釋之FVS510生存力染料(BD Biosciences, cat. no. 564406)染色，以及在室溫下培養15分鐘。接著，以染色緩衝液洗滌細胞，並進行CD30(1：50; Biolegend, cat. no. 333906,與PE接合)、T細胞標記CD4(1：50; Biolegend, cat. no. 300506,與FITC接合)、CD8(1：100; BD Biolegend, cat. no. 301028,與AF700接合)以及T細胞活化標記CD69(1：50; Biolegend，cat. no. 310910,與APC接合)、CD25(1：100; Invitrogen, cat. no. 25-0259-42,與PE-Cy7接合)以及CD279/PD-1 (1：50; Biolegend, cat. no. 329924,與BV605接合)。包括具有Ultracomp珠粒(5 µL; Invitrogen, cat. no. 01-2222-42)之單一染色之樣本，並用於流式細胞儀之補償調整。在4℃下培養30 min後，以染色緩衝劑洗滌盤兩次。使用FACS Celesta(BD Biosciences)分析細胞，並使用FlowJo (BD Biosciences)處理數據。
為了評估BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR是否可誘導活化之T細胞之誤殺，將受刺激之T細胞以200,000個細胞/孔的密度接種在96孔盤中。隨後，將50 µL的BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或對照抗體(亦即，bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsG1-huCD3-FEALxb12-MDX060-FERR或IgG1-b12)加入各孔(T細胞培養基中之最終濃度範圍為0.003至3.3 µg/mL，以3倍稀釋步驟)。將盤在37℃下培養48小時。
以染色緩衝劑洗滌2次後，將細胞以FVS510生存力染料染色，並隨後進行T細胞標記CD4和CD8以及T細胞活化標記CD69、CD25以及CD279/PD1染色。使用FACS Celesta(BD Biosciences)進行流式細胞儀分析，並使用FlowJo (BD Biosciences)處理數據。
使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)產生劑量-反應曲線。 結果
圖 23顯示培養72小時後，T細胞中分別表現54至63%和21至27%的細胞標記CD25(T細胞活化) (A)和CD30 (B)。培養96小時後進一步誘導CD25和CD30之表現(CD25：80至83%和CD30：27至33%)。 圖 23C顯示BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsG1-huCD3-FEALxb12-MDX060-FERR或IgG1-bsG12之不斷增加的劑量與活化之T細胞的降低之生存力不相關。
因此，與BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR一起培養後，活化之T細胞亞群上的CD30表現不會導致T細胞之誤殺。 實施例 15-sCD30 對 BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 之 抗腫瘤活性 之 干擾
在17種不同的血液CD30 +腫瘤細胞株中評估細胞表面CD30之脫落和可溶性CD30(sCD30)之產生。
遵照廠商之使用說明書，使用「人類sCD30 ELISA套組」(Invitrogen, cat. no. BMS240)，以ELISA測定定量檢測人類CD30而測量新鮮培養基中接種細胞三天後，從細胞培養物中收集的25 µL未稀釋之上清液中之sCD30之濃度。 結果
圖 24A顯示細胞培養物上清液中之sCD30之濃度。如所示，在來自不同細胞株之細胞培養物上清液中檢測到不同濃度的sCD30。 圖 24B顯示細胞培養物上清液中之sCD30之濃度與CD30膜表現水平顯著相關(斯皮爾曼r=0.5912；p值=0.0260)，如先前實施例2中所述之定量流式細胞儀(Human IgG Calibrator Kit, Biocytex, cat. no. CP010)所測。
為了評估sCD30是否可阻斷有效的BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之T細胞介導之細胞毒性，評估DEL腫瘤細胞(ALCL)中BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之T細胞介導之細胞毒性，其在上清液中顯示出高水平之sCD30(129 ng/mL)。如先前所述(實施例8)進行T細胞介導之細胞毒性測定。 圖 24C顯示BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在此細胞株中誘導有效的T細胞介導之細胞毒性，其中最大腫瘤細胞殺傷率為86%，顯示BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR仍可在sCD30之存在下誘導有效的T細胞介導之細胞毒性。
因此，sCD30濃度因細胞類型而異，並且與細胞表面上之CD30表現水平相關。此外，在sCD30之存在下，BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 仍可活體外誘導有效的T細胞介導之細胞毒性。 實施例 16- 使用衍生自患者之周邊血單核 T 細胞作為效應細胞之 bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 之離體細胞毒性
使用CD30陽性腫瘤細胞株作為標靶細胞和衍生自初級患者來源的T細胞作為效應細胞，在離體細胞毒性測定中測試CD3xCD30雙特異性抗體。作為T細胞的來源，將衍生自何杰金氏淋巴瘤(HL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)以及急性髓性白血病(AML)患者之周邊血單核細胞(PBMC, Discovery Life Sciences, 表11)用以評估CD3-依賴性腫瘤細胞殺傷。
在37℃下，將L-428腫瘤細胞以Celltrace FarRed(Invitrogen, cat. no. C34564A; 最終濃度為2 μM)標記15分鐘。標記後，加入5x體積的冰冷DBSI，並在RT下培養5分鐘。將細胞團塊化，重新懸浮於培養基中，並將腫瘤細胞以50,000個細胞/孔之密度接種入96孔盤(Greiner-bio-one, The Netherlands, cat. no. 655180)內。加入bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和對照抗體IgG1-b12-FEAL之連續稀釋液(最終濃度範圍為1,000至0.051 ng/mL；3倍稀釋)，並將盤在RT下培養15 min。將T細胞以8：1之效應物與標靶(E：T)之比率加入腫瘤細胞並將盤在37℃下培養72小時前，將PBMC解凍、計數以及重新懸浮於培養基中(RPM1640/10% FBS/1%青黴素-鏈黴素/1%麩胺酸鹽。以PBS/0.1% BSA/0.02%疊氮化物(染色緩衝劑)洗滌2次後，使用CD3(T細胞; Invitrogen, cat. no. 48-0037)、CD14(單核細胞/巨噬細胞; Biolegend; cat. no. 48-0037)、CD14(單核細胞/巨噬細胞；Biolegend；cat. no. 301834)、CD19(B細胞; Biolegend; cat. no. 302246)、CD16(單核細胞/巨噬細胞; BD Biosciences; cat. no. 556618)、CD56(NK細胞; BD Biosciences; cat. no. 564849)以及CD66b(粒細胞；Biolegend; cat. no. 305116)將細胞染色以區分不同的細胞群體。將細胞額外地進行T細胞標記CD4(1：50; Biolegend, cat. no. 300521,與Pacific Blue接合)、CD8(1：100; BD Biosciences, cat. no. 345772,與FITC接合)以及T細胞活化標記CD69(1：50; Biolegend，cat. no. 310934,與BV650接合)、CD25(1：100; Invitrogen, cat. no. 25-0259-42,與PE-Cy7接合)以及CD279/PD-1(1：50; Biolegend, cat. no. 329930,與BV605接合)。包括具有Ultracomp珠粒(5 µL; Invitrogen, cat. no. 01-2222-42)之單一染色之樣本，並用於流式細胞儀之補償調整。在4℃下培養30 min後，以染色緩衝劑洗滌盤兩次，並且將細胞以7-AAD(以1：100於染色緩衝劑中稀釋)在4℃下染色10 min，並使用FACS Celesta(BD Biosciences)分析細胞。使用FlowJo(BD Biosciences)處理數據。使用非線性迴歸分析(具有可變斜率之S形劑量-反應)產生劑量-反應曲線，該非線性迴歸係使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)。
使用以下公式計算活標靶細胞之百分比： %活標靶細胞=(各種條件下活的單一Celltrace FarRed標記之細胞的絕對數量/僅含有標靶細胞和T細胞而不加入任何抗體之條件下活的單一Celltrace FarRed標記之細胞的絕對數量)x100。 結果
圖 25A顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在72 h後誘導L-428腫瘤細胞之劑量依賴性細胞毒性，其係由衍生自健康對照捐贈者和不同HL和NHL患者捐贈者之T細胞介導。細胞毒性與T細胞活化和增生有關，係由CD69、CD25以及PD-1的上調而說明( 圖 25B 至 D)。對於對照抗體IgG1-b12-FEAL，未觀察到T細胞介導之細胞毒性。對於捐贈者E(AML)，未觀察到L-428腫瘤細胞之T細胞介導之細胞毒性，這可能歸因於PBMC 樣本內T細胞的低頻率( 表 11)。
總的來說，此等數據說明來自HL和NHL患者的周邊血T細胞能在bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之存在下誘導腫瘤細胞株之T細胞介導之細胞毒性。 實施例 17-BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 在 SCID 小鼠 中之 藥物動力學性質的評 估
將11至12週齡雌性無腫瘤SCID小鼠(C.B-17/IcrHan®Hsd-Prkdcscid小鼠，Envigo)(每組3隻小鼠)靜脈注射(IV)單劑量1 μg(0.05 mg/kg) 10 µg(0.5 mg/kg)或100 µg(5 mg/kg)的BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR。實驗旨在研究在不存在標靶介導之清除下之抗體清除率，因為BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 不會與小鼠蛋白質發生交叉反應。
在抗體投予後10分鐘、4至6小時、24小時、2天、7天、14天以及21天，從頰靜脈穿刺或隱靜脈穿刺收集40μL血液樣本。將血液收集入含有K2-EDTA之小瓶中(Sarstedt, Microvette CB300, cat. no. 16.444.100)，並在10,000 g下離心10分鐘。將血漿上清液轉移至標記之Eppendorf小瓶中，並儲存於-80℃下直到測定血漿IgG濃度。
使用總人類IgG酵素連結免疫吸附測定(ELISA)測定人類IgG濃度。小鼠抗人類IgG-卡帕殖株MH16(CLB Sanquin, The Netherlands; cat. no. M1268)在4℃下以2 µg/mL之濃度用100 μL PBS(BioTrading, cat. no. K654F500PP)塗佈於96孔Microlon ELISA盤過夜(Greiner, Germany)，並用作捕獲抗體。在室溫(RT)下以PBSA(具有0.2%牛血清白蛋白[BSA]之PBS)封閉盤1小時後，加入樣本，在PBSA中連續稀釋，以及在盤振盪器上在RT下培養1小時。以300 μL PBST(補充有0.05% Tween 20之PBS)洗滌盤3次，隨後與山羊抗人類IgG免疫球蛋白(Jackson, West Grace, PA; cat. no. 109-035-098; 1：10.000於補充有0.2% BSA之PBST)在RT下培養1小時。將盤在與2,2’-聯氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS; Roche, cat. no. 11112422001和11112597001)一起避光培養前，以300 μL PBST洗滌3次。藉由加入100 μL 2%草酸(Sigma-Aldrich, cat. no. 33506)而終止反應，並在RT下培養10分鐘。在ELx808吸光度微盤讀數機(Biotek, Winooski, VT)上測量405 nm處之吸光度。
從參考抗體人類IgG1λ(純蛋白 30C，cat. no. BP078)產生標準曲線(濃度範圍：1 mg/mL [3 μL])，並在PBSTA中以3倍稀釋進一步稀釋。將注射之材料用以產生第二條標準曲線，並從濃度為1 mg/mL(3.6 μL抗體)之5 mg/kg劑量製備以在PBSTA中以3倍稀釋進一步稀釋。 結果
藉由使用Microsoft Excel中的4個參數邏輯擬合曲線插值未知數，而根據參考標準計算校準曲線。血漿樣本中之人類IgG1濃度係由繪製之校準曲線方程式計算( 圖 26A)，並使用GraphPad Prism軟體計算曲線下面積(AUC)。直到血採樣最後一天(第21天)之IgG清除率係由式D*1.000/AUC測定，其中D為注射劑量(1 mg/kg)( 圖 26B)。
BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR不與小鼠蛋白質交叉反應，因此會預期藥物動力學性質與其他非結合之野生型人類IgG1分子相當。所有劑量組的預期人類IgG 血漿濃度經計算為約100 µg/mL(~5 mg/kg)、10 µg/mL(~0.5 mg/kg)或1 µg/mL(~0.05 mg/kg)。對於所有時間點，來自經0.05 mg/kg處理之動物的樣本均無法測量。
BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR的血漿清除率與常規人類IgG1的預測之血漿清除率相當。平均最大人類IgG 血漿濃度(Cmax)與常規人類IgG1的預測之Cmax相當。
因此，在不存在標靶結合下，BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之藥物動力學概況與在非荷瘤SCID小鼠中預測之常規人類IgG1之藥物動力學概況相當。 實施例 18-C1q 與 BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 結合 之 評估
評估使用表現CD3或CD30之細胞評估補體蛋白C1q與膜結合之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或產生BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之親本抗體(亦即，IgG1-huCD3-FEAL和IgG1-CD30-MDX060-FERR)之結合。 A. 與和表現 CD3 之細胞結合之 BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 之 C1q 結合
使用受刺激之人類CD8 +T細胞測試補體蛋白C1q與和CD3結合之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-huCD3-FEAL之結合。包括IgG1-CD52-E430G作為陽性對照，該IgG1-CD52-E430G具有基於CD52抗體CAMPATH-1H之VH和VL域，並具有已知當與細胞表面結合時與C1q有效率地結合之Fc增強之骨架。作為非結合之陰性對照抗體，包括IgG1-b12-FERR和IgG1-b12。
根據廠商之使用說明書，藉由使用RosetteSep™ Human CD8 +T Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies, cat. no. 15023C.2)之負向選擇，而從獲自健康志願者(Sanquin)之膚色血球層中純化(富集)人類CD8 +T細胞。將純化之T細胞重新懸浮於T細胞培養基(Roswell Park Memorial Institute [RPMI]-1640 培養基，其具有25 mM HEPES和L-麩醯胺酸(Lonza，cat. no. BE12-115F)(補充有10%熱滅活之供血牛血清含鐵(DBSI；Gibco，cat. no. 20731-030)和青黴素/鏈黴素(pen/strep; Lonza, cat. no. DE17-603E)。以PBS洗滌抗CD3/CD28珠粒(Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28; ThermoFisher Scientific, cat. no. 11132D)，並重新懸浮於T細胞培養基中。將珠粒以1：1之比率加入富集之人類CD8 +T細胞中，並在37℃下、5% CO 2下培養48h。接下來，使用磁鐵去除珠粒，並將細胞在PBS中洗滌兩次及再次計數。
使用與BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-huCD3-FEAL(30 µg/mL)及與R-藻紅素(PE)接合之山羊抗人類IgG F(ab’)2(以1：200於GMB FACS緩衝劑; Jackson Nutrition Research, cat. no. 109-116-098)，以流式細胞術證實BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-huCD3-FEAL與活化之CD8 +T細胞之結合。
將活化之CD8 +T細胞接種於圓底96孔盤(30,000個細胞/孔)中，團塊化以及重新懸浮於30 μL測定培養基(RPMI-1640，其具有25mM HEPES和L-麩醯胺酸，補充有0.1 % [w/v]牛血清白蛋白部分V(BSA; Roche, cat. no. 10735086001)和青黴素/鏈黴素)。隨後，加入50 μL的BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL、IgG1-b12-FERR、IgG1-CD52-E430G或IgG1-b12(測定培養基中之最終濃度為1.7×10 -4至30 μg/mL，以3倍稀釋步驟)加入各孔，並在37℃下培養15 min以使抗體與細胞結合。
加入人類血清(20 μL/孔; Sanquin, lot 20L15-02)作為C1q之來源，最終濃度為20%。將細胞在冰上培養45 min，然後以冷GMB FACS緩衝劑洗滌兩次，以及在與異藻藍蛋白接合之小鼠抗CD8(BD Biosciences, cat. no. 555369;以1：50於GMB FACS緩衝劑中稀釋)之存在或不存在下，在4℃下與50 μL與螢光異硫氰酸鹽(FITC)接合之兔抗人類C1q(最終濃度為20 μg/mL(DAKO, cat. no. F0254);以1：75於GMB FACS緩衝劑中稀釋)一起黑暗培養；培養30 min。將細胞以冷GMB FACS緩衝劑洗滌兩次，重新懸浮於補充有2 mM乙二胺四乙酸(EDTA; Sigma-Aldrich, cat. no. 03690)及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)生存力染料(1:5,000; BD Pharmingen, cat. no. 564907)之20 μL的GMB FACS緩衝劑中)。由流式細胞儀在iQue3 Screener (Intellicyt Corporation)上分析C1q與活細胞之結合(由DAPI排除法鑑定)。使用iQue軟體(Intellicyt Corporation, ForeCyt ®Enterprise Client Edition 6.2 [R3]，Version 6.2.652)分析數據。使用非線性迴歸分析(具有可變斜率之S形劑量-反應)分析結合曲線，該非線性迴歸係使用GraphPad Prism軟體。 結果
圖 27A顯示雖然觀察到與和膜結合之IgG1-CD52-E430G之劑量依賴性C1q結合，未觀察到與和膜結合之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或IgG1-huCD3-FEAL之C1q結合或與非結合之對照抗體結合。 B. 與 和 表現 CD30 之 細胞 結合之 BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 之 C1q 結合
使用NCEB-1被套細胞淋巴瘤細胞測試補體蛋白質C1q與和CD30結合之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-huCD30-MDX060-FERR之結合。作為陽性對照，包括IgG1-7D8-E430G(抗CD20)，其不含有惰性突變並保留與C1q結合之能力。作為非結合之陰性對照抗體，包括IgG1-b12-FERR。
將NCEB-1細胞以2×10 6個細胞/mL之濃度懸浮於含有0.1%牛血清白蛋白(BSA, fractionV, Roche, cat. no. 10735086001)和1%青黴素/鏈黴素(Gibco, cat. no. 15140-122)之測定培養基(RPMI-1640(Lonza, Switzerland, cat. no. BE12-115F)中。將腫瘤細胞(在50 µL中100,000個細胞)加入96孔圓底盤(Greiner Bio, cat. no. 650180)中。接下來，將30 μL的BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR或對照抗體(最終濃度為5.6×10 -5至10 µg/mL，以3倍稀釋步驟於測定培養基中稀釋)加入各孔中，並在37℃下培養15 min以使抗體與細胞結合。
將一半細胞(40 μL的細胞懸浮液，含有抗體)於不同盤中平板培養以檢查抗體結合。使用與R-藻紅素(PE)接合之山羊抗人類IgG F(ab’) 2，以流式細胞測量術證實BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-CD30-MDX060-FERR與NCEB-1細胞之結合(以1：500於FACS緩衝劑中稀釋; Jackson ImmunoResearch, cat. no. 109-116-098)。
將人類血清(10 µL/孔; Sanquin, lot 21K04-01)加入剩餘的40 µL的細胞懸浮液(最終濃度之20%)，並在冰上培養45min，然後以FACS緩衝劑洗滌並與25 µL與FITC接合之兔抗C1q抗體(最終濃度為20 µg/mL(DAKO, cat no. F0254)；於FACS緩衝劑中稀釋)在4℃下一起黑暗培養30 min。以冷的FACS緩衝劑洗滌細胞，重新懸浮於補充有TO-PRO™-3生存力染料(1：5000; ThermoFisher, cat. no. T3605)之30 µL的FACS緩衝劑中，並在iQue3 Screener (Intellicyt Corporation)上測量。使用iQue軟體(Intellicyt Corporation, ForeCyt ®Enterprise Client Edition 6.2 [R3], Version 6.2.652)分析數據。使用非線性迴歸分析(具有可變斜率之S形劑量-反應)分析結合曲線，該非線性迴歸係使用GraphPad Prism軟體。 結果
圖 27B顯示雖然觀察到與和膜結合之IgG1-CD20-E430G之劑量依賴性C1q結合，未觀察到與和膜結合之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或IgG1-CD30-MDX060-FERR之C1q結合或與非結合之對照抗體之C1q結合。
因此，此等結果證明bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR未與結合C1q，證實功能惰性骨架。 實施例 19- 三種調配物；基本特性及穩定性 材料和方法 測試調配物之製備
三種測試之調配物的組成如 表 12所示。
藉由將L-組胺酸一鹽酸鹽一水合物和蔗糖溶解於水中而製備調配物1。使用NaOH或HCl將pH調節至6.0。接著，將溶液通過流動櫃(flow cabinet)中的0.22 µm 瓶頂過濾器過濾。對於具有聚山梨醇酯80之調配物，加入10%聚山梨醇酯80，並輕輕混合直到完全溶解。
藉由將乙酸鈉三水合物溶解於水中而製備調配物2和3。將冰乙酸以逐步的方式加入水中，之後逐步加入乙酸鈉三水合物溶液中。加入D-山梨醇(調配物2)或海藻糖(調配物3)，並以NaOH或HCl將pH調節至5.5。接著，將溶液通過流動櫃中的0.22 µm 瓶頂過濾器過濾。對於具有聚山梨醇酯80之調配物，加入10%聚山梨醇酯80，並輕輕混合直到完全溶解。 樣本製備
樣本中所使用之抗體為雙特異性 huCD3xCD30-MDX060(bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR)。其製備係如實施例1中所述。
穩定性研究是在調配物1、2以及3(具有聚山梨醇酯80)中之抗體濃度為20 mg/mL和100 mg/mL時進行的。
在具有或不具有聚山梨醇酯80之調配物1、2以及3中，以20 mg/mL之抗體濃度進行冷凍-解凍和攪拌研究。
對於調配物1、2及3(具有聚山梨醇酯80)中之20至200 mg/mL之範圍內之抗體濃度進行高濃度研究。
對於調配物1、2及3(具有聚山梨醇酯80)中之2.5至20 mg/mL之範圍內之抗體濃度進行B22/k D測量。
收到了樣本為冷凍的，並在5℃下解凍。完全解凍樣本塊所需的時間為24 h至72 h。
將具有調配物緩衝劑(具有聚山梨醇酯80)之小瓶用作穩定性測試、外觀以及滲透壓的空白樣本。專用於冷凍和解凍、攪拌以及高濃度研究之小瓶在執行前保存在5℃下。 具有 20 mg/mL 抗體的樣本 ( 對於各種調配物 ) 之製備
如下使用Thermo Scientific™ Slide-A-Lyzer™ G2 Dialysis Cassettes(3.5K MWCO, 70 mL)對抗體進行透析。所有後續步驟分別使用不具有聚山梨醇酯80之特定調配物(亦即，調配物1、2或3)執行。首先，將盒式薄膜(cassette membrane)在透析緩衝劑(亦即，不具有聚山梨醇酯80之特定調配物)中水合至少2 min。取出透析盒，並輕輕除去過量的緩衝劑。將樣本轉移至透析盒。將透析盒放入1L的所需緩衝劑中，並且輕輕混合並培養2h。取出透析盒，丟棄緩衝劑，將1L的新鮮緩衝劑加入容器中並培養過夜。所有培養均在5℃和溫和攪拌下進行。第二天，取出樣本，並以A280對蛋白質濃度定量。若需要，藉由加入所需緩衝劑體積而體積校正或使用Pierce™ Protein Concentrator (PES, 30K MWCO, 20至100 mL)濃縮樣本，以將濃度調整至20±2 mg/mL。將剩餘體積無菌過濾，並以A280對蛋白質濃度定量，顯示實際濃度(測量之濃度)為約20 mg/mL。
對於具有聚山梨醇酯80之樣本，在透析和濃縮後加入聚山梨醇酯80(10%)，以達到0.02%(w/v)之最終濃度。
在無菌條件下，將等分試樣裝入2 mL玻璃冷凍管(Fluid X小瓶)小瓶中，最終體積為1.5mL。 具有 100 mg/mL 抗體之樣本之製備 ( 對於各種調配物 )
使用Pierce™ Protein Concentrators(PES, 30K MWCO, 20-100)將20 mg/mL的抗體樣本濃縮至100 mg/mL之最終濃度。濃縮前，以不具有聚山梨醇酯80之特定調配物沖洗蛋白質濃縮器。以A280對蛋白質濃度定量，並體積校正至100±10 mg/mL。接下來，使用Thermo Scientific™ Slide-A-Lyzer™ G2 Dialysis Cassettes(3.5K MWCO, 70 mL)對樣本進行透析。所有後續步驟均使用不具有聚山梨醇酯80之特定調配物執行。首先，將盒式薄膜在透析緩衝劑(亦即，不具有聚山梨醇酯80之特定調配物)中水合至少2 min。取出透析盒，並輕輕除去過量的緩衝劑。將樣本轉移至透析盒。將透析盒放入1L的所需緩衝劑中，並且輕輕混合並培養2hr。取出透析盒，丟棄緩衝劑，將1L的新鮮緩衝劑加入容器中並培養過夜。所有培養均在5℃和溫和攪拌下進行。隔天取出樣本，並以A280對蛋白質濃度定量。若需要，藉由加入所需緩衝劑體積而體積校正或藉由使用Pierce™ Protein Concentrators(PES, 30K MWCO, 20至100 mL)而濃縮樣本，而將濃度調整至100±2 mg/mL。將剩餘體積無菌過濾，並以A280定量，顯示實際濃度(測量之濃度)為約70 mg/mL(調配物1、2以及3分別為66 mg/mL、74 mg/mL以及79 mg/mL)。所有三種調配物之初始目標濃度均為100 mg/mL。然而，由於引起凝膠形成之程序期間之蛋白質流失，決定濃縮至約70 mg/mL，以盡量減少樣本流失。
對於具有聚山梨醇酯80之樣本，在透析和濃縮後加入聚山梨醇酯80(10%)以達到0.02%(w/v)之最終濃度。
在無菌條件下將等分試樣裝入2 mL玻璃冷凍管(Fluid X小瓶)小瓶中，最終體積為1.5mL。 樣本處理
於指定之時間和數量從培養箱中取出小瓶。樣本在預定截止日之3天內從培養箱中取出。將多餘的小瓶保存在指定的儲存條件下，並在需要多餘的樣本體積時使用。將截止日之樣本(pulled sample)之剩餘體積保持在5℃下。 冷凍 - 解凍
使濃度為20mg/mL之抗體經歷五個冷凍-解凍循環。製備了具有和不具有聚山梨醇酯80之所有三種調配物。執行前將小瓶保存在5℃下。
各種調配物使用三個等分試樣。將一等分試樣在無冷凍-解凍壓力下作為對照以測試，亦即，樣本保存在5℃(5℃對照)之控制條件下、一等分試樣經歷五個模擬循環(5℃至RT)、一等分試樣經歷五個冷凍-解凍循環(-75℃至RT)。樣本製備後，將等分試樣儲存在5℃下，然後一起進行分析。
一個冷凍-解凍循環係由在-75℃下冷凍過夜，並將等分試樣在RT下(在RT下2 h至4 h)解凍。將對照樣本從5℃之儲存條件下取出，並與-75℃之樣本在室溫下放置相同的時間。 攪拌
對濃度為20 mg/mL之抗體進行一個攪拌循環。製備了具有和不具聚山梨醇酯80的所有三種調配物。執行前將小瓶保存在5℃下。
將各種調配物以兩等分試樣使用。將一等分試樣在無攪拌壓力下作為對照以測試。將一等分試樣在室溫下以500 rpm進行24 h攪拌。將小瓶垂直定向放置。樣本製備後，將等分試樣儲存在5℃下，並一起分析。從5℃之儲存條件中取出對照樣本，並在室溫下放置24 h(與攪拌時間相同)。 高濃度
進行高濃度研究。將樣本濃縮成一系列範圍為20至200 mg/mL之抗體濃度。測試具有聚山梨醇酯80之所有三種調配物。
使用Amicon Ultra-4 Centrifuge Filter Unit (10kDa)濃縮樣本，並以A280濃縮和定量。 以螢光 / 靜態光散射測定熱穩定性
在UNcle儀器(Unchained Labs, LLC)上之合併之螢光/靜態光散射(SLS)測量來測定構形和膠體穩定性，其係藉由增加熱應力來誘導蛋白質反摺疊和聚集。
藉由測定由增加之熱應力引起之反摺疊狀態轉變而評估構形穩定性，該熱應力引起之反摺疊狀態轉變係由於蛋白質反摺疊時局部環境的變化而導致的蛋白質之Trp(和Tyr)殘基之固有螢光之變化而檢測。當包埋之色胺酸殘基曝露時，最大發射波長位移為更長的波長。繪製波長350/330 nm之螢光比，顯示蛋白質隨著溫度之構形變化。螢光分析提供蛋白質開始反摺疊之溫度(反摺疊起始溫度-T onset)以及蛋白質從摺疊狀態到反摺疊狀態之位移中點(熔化溫度-T m)。
UNcle儀器也以逐漸升高溫度時之SLS測量的方式提供膠體穩定性。以溶液中的分子散射之雷射照射樣本。靜態光散射之強度與溶液中物質之平均分子量成正比。因此，此分析對隨著溫度斜坡(ramp)之蛋白質聚集敏感。在266 nm處測量靜態光散射以偵測較小的聚集體，以及在473 nm處測量以偵測較大的聚集體物質。使用266 nm處之結果，根據此等數據確定聚集起始溫度(T agg)，亦即，蛋白質開始聚集之溫度。此等數據最佳由計數強度之巨大變化來分析-計數越高顯示由於蛋白質聚集體之形成而散射更多的光。T agg係基於從基線算起之10%的count.nm增加而確定。
基於內在抗體螢光和靜態光散射，同時確定測摺疊中點(熔化溫度，T m)和聚集起始溫度(T agg)。
抗體批次在PBS pH 7.4中稀釋至1 mg/mL，並在分析前離心。將樣本以三重複分析。在以0.5℃/分鐘之溫度斜坡從25℃升高至95℃時，測量螢光和SLS。T m係由UNcle軟體基於螢光比(350/330 nm)法所測定。T agg係由UNcle軟體基於SLS 266 nm數據所測定。 k D 和 B 22 之測定
k D和B 22皆為研究膠體穩定性和聚集傾向之參數，這對於選擇防止聚集之條件係有用的。B 22(第二個病毒係數)為溶液中蛋白質-蛋白質之交互作用之熱力學量度，並且由基於散射強度計算之德拜圖(Debye plot)之斜率測定。k D(也稱為擴散交互作用參數(Diffuction Interaction Parameter)係使用不同蛋白質濃度下之DLS確定之擴散係數而測量。兩個參數均在25℃下使用0至20 mg/mL之濃度範圍，以DLS測量同時測定。使用UNcle Analysis軟體進行數據分析。負k D和B 22值表示增強之自相關(self-association)，而正 k D和B 22值表示蛋白質之間之排斥交互作用。 外觀
由視覺評估確定外觀。 黏度
根據廠商之使用說明書，使用Viscosizer TD System(Malvern Panalytical Ltd)測量黏度。 滲透壓
根據廠商之使用說明書，使用A20高級自動化滲透壓計(Advanced Instruments, LLC)測量滲透壓。 粒徑
根據廠商之使用說明書，使用基於MFI 5200成像之粒子計數器(Protein Simple, Inc.)測量粒徑。 以吸光度 A 280 測定蛋白質濃度
「A280」為一種測量280 nm處紫外線吸光度之分光光度方法。由紫外線吸收(280 nm)測定蛋白質濃度係取決於蛋白質中之芳香族胺基酸之存在。溶液之濃度可用比爾-朗伯(Beer-Lambert)定律計算：(c= A/ Ɛ • l)；其中c為莫耳濃度， l為比色管之光程(單位cm)， Ɛ 為莫耳消光係數(單位M -1cm -1)以及，A為280 nm處之吸光度。
以UV/Vis光譜術測定蛋白質濃度(使用NanoDrop ND-2000c Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific)在280 nm(A280)處測量吸光度)。 尺寸排阻層析術 (SEC)
使用HPSEC測量單體純度%。SEC為一種層析方法，其中溶液中之分子以其大小及/或分子量分離。非壓力之樣本之SEC層析圖通常顯示一個對應單體抗體之主峰，佔總峰面積之超過90%。這一主SEC 峰反映了各調配物中之抗體大小之均質性。為了比較不同調配物之間之SEC 數據，將主峰前洗脫之物質之峰面積值合併，並報告為HMW(高分子量)物質百分比且通常代表聚合形式。類似地，將主峰後洗脫之物質之峰面積值合併，並報告為LMW(低分子量)物質百分比且通常表示降解形式。
尺寸排除層析術在Agilent 1100和1200 HPLC系統上，使用TOSOH、TSK-gel G3000SWxL(7.8×300 mm)管柱(Sigma, cat. no. 08541)進行。 成像毛細管等電聚焦 (icIEF) 和陽離子交換層析術 (CIEX)
使用cIEF和CIEX測量酸性%和鹼性%。
使用配備有PrinCE Autosampler之iCE 3 Analyzer進行成像之毛細管等電聚焦。具體地，icIEF以等電點(pI)之差異分離抗體異構物，而等電點(pI)係由於分子上之總電荷為其周圍環境 pH 值之函數而產生的。
使用配備有CIEX管柱和UV檢測器之Waters Alliance HPLC進行陽離子交換層析術。使用Proteomix® WCX-NP5 Weak Cation Exchange Column(4.6×250 mm)。將pH和鹽梯度用於分離溶液中的物質。 還原與非還原之微晶片毛細管電泳 - 十二烷基硫酸鈉
使用CE-SDS測量完整IgG純度%和(HC+LC)純度%。根據廠商之使用說明書，使用PA800 Plus(Sciex)儀器進行毛細管電泳(還原和非還原)。 結果 1. 滲透壓和黏度
以0、20以及100 mg/mL的抗體濃度測試三種調配物。0個月(t=0M)時之調配物之滲透壓和黏度如 表 13和 表 14所示。
滲透壓在200至600 mOsm/Kg之可接受範圍內，並且在300 mOsm/Kg之目標滲透壓內。又，所有調配物均展現低黏度(低於＜10 cP)。不同調配物之黏度相當。 2. 攪拌和冷凍 - 解凍
在0個月(t=0M)時，使濃度為20 mg/mL之抗體在具有或不具有PS80之三種不同調配物中經歷一個攪拌循環或五個冷凍-解凍循環( 表 15)。無論具有或不具有PS80，冷凍-解凍循環(-75℃至RT)和對照(5℃至RT)後，未觀察到抗體品質有差異。 3. T m 、 T agg 以及 k D
藉由研究T m、T agg、B 22以及k D而測量不同調配物中之雙特異性抗體在0個月(t=0M)時之穩定性係如 表 16 至 18所示。
T m係在0個月(t=0M)時以螢光比350/330nm方法測量的。數據顯示所有3種緩衝劑調配物中之BisG1-huCD3-FEAL/CD30-MDX60-FERR之T m相當。
T agg係由0個月(t=0M)25℃下時從閾值算起10%的count.nm增加而測定。數據顯示對於雙特異性抗體，與組胺酸緩衝劑相比，乙酸鹽/山梨醇和乙酸鹽/海藻糖緩衝劑之聚集之T起始增加。
在0個月(t=0M)時，使用B 22和k D進一步研究蛋白質聚集。測定B 22和k D之抗體濃度範圍為2.5、5、10、15以及20 mg/mL。
乙酸鹽/山梨醇緩衝劑和乙酸鹽/海藻糖緩衝劑之正B 22/k D值暗示與組胺酸緩衝劑調配物相比，乙酸鹽緩衝劑調配物中之抗體溶解度增加。 實施例 20- 三種調配物中之雙特異性抗體之長期穩定性
以兩種濃度(20 mg/mL和100 mg/mL)製備bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-FERR之三種調配物，並在不同溫度(5℃、25℃以及40℃)下保存十二個月。在0個月(t=0M)、1個月(t=1M)、2個月(t=2M)、3個月(t=3M)、6個月(t=6M)、9個月(t=9M)和12個月(t=12M)時分析樣本。
如實施例19中所述進行材料與方法。
測試之三種調配物之組成詳述於實施例19中之 表 12。 1. 目視檢查和粒子
總的來說， 表 19顯示樣本在所有時間點基本上不含可見粒子(EFVP)。顏色的微小變化是由於不同的解讀分析師造成的。
對於所有調配物，樣本濃度在5、25以及40℃下保持穩定12個月。 2. 單體純度
以%多聚體、%單體以及%降解測量之單體純度之測量值顯示在 表 22 至 24中。所有調配物之單體純度皆相當。對於濃度為20和100 mg/mL之樣本，單體純度%在5和25℃下呈穩定12個月，其中單體純度%高於95%。在25℃下時觀察到略有下降，但仍被認為呈穩定的。然而，在40℃下，2個月後單體純度%低於95%，顯示聚集和斷裂增加。 3. % 完整 IgG 和 %LC+HC
所有調配物之完整IgG純度%相當。對於濃度為20和100 mg/mL之樣本，完整IgG純度在5℃下呈穩定12個月。在25℃下，觀察到IgG純度%略有下降。
在40℃下3個月後，隨著低分子量種類(LMWS)和高分子量種類(HMWS)的增加，完整的IgG純度%下降至約90%，如表25所證明。
表 26顯示所有調配物之(HC+LC)純度%相當。對於濃度為20和100 mg/mL之樣本，(HC+LC)純度%在5℃下呈穩定至少9個月。在25℃下和5℃下12個月時觀察到(HC+LC)純度%略有下降。
在40℃下3個月後，(HC+LC)純度%低於95%，而LMWS和HMWS 增加。 4. % 酸性和 % 鹼性形式
如 表 27 至 30所示，所有調配物之酸性%相當。對於濃度為20和100 mg/mL之樣本，酸性%在5℃下呈穩定12個月，而在25℃下觀察到略有增加。在40℃下3個月後，與0個月(t=0M)時相比，酸性%增加，而與起始水平(亦即，40℃下0個月(t=0M))時相比，鹼性%保持相對恆定。這是由電泳圖重疊和層析圖重疊顯示。
此外，在5℃、25℃以及40℃下維持12個月(12M)、6個月(6M)以及3個月(3M)之調配物中，測量抗體濃度為20 mg/mL和100 mg/mL之調配物1+PS80、2+PS80以及3+PS80之pH。結果顯示對於兩種抗體濃度，在不同溫度下，調配物之pH 值隨著時間維持穩定(數據未顯示)。 實施例 21- 高濃度調配物
以五種濃度(20 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL以及200mg/mL)製備bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-FERR之三種調配物。樣本在製備後(亦即，在t=0M時)分析。
如實施例19中所述進行材料與方法。
測試之三種調配物詳述於實施例19中之 表 12。 1. 目視觀察
表 31顯示對於更高的抗體濃度，觀察到更高的黏度。然而，未檢測到可見粒子。 2. 實際濃度
調配物之加工可能導致調配物中之抗體濃度之變化。因此，靶向濃度(亦即，作為預期濃度之濃度)可能與在加工之調配物中測量之實際濃度(測量之濃度)不同。這可能取決於抗體之濃度以及調配物之組成。
表 32顯示在最終回收率分別為64%和69%時，達到調配物2和3之最高目標濃度(亦即，靶向濃度)(200mg/mL±10%)。與乙酸鹽緩衝劑相比，以調配物1(組胺酸緩衝劑)獲得之最大蛋白質濃度(142.1 mg/mL)和回收率(49%)更低。 3. 純度
表 33 至 35顯示雖然在更高濃度下觀察到多聚體之適度增加，所有調配物之單體純度被認為是相當的。又，所有調配物均觀察到相似的IgG純度和(HC+LC)純度，並且調配物之間之%酸性、中性和鹼性百分比相當。
總之，在三種不同的緩衝劑調配物中達到更高的濃度似乎是可行的。然而，數據證明乙酸鹽緩衝劑比組胺酸緩衝劑具有更好的回收率。
[ 圖 1] ：雙特異性 CD3xCD30 抗體及其單特異性二價 CD3 和 CD30 對應物與 SU-DHL-1 或 HDML-2 細胞結合。(A)bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR以及IgG1-CD30-MDX060-FEAR，(B)bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR以及IgG1-CD30-hAC10-FEAR，(C)bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR以及IgG1-CD30-HRS-3-FEAR，(D)BsIgG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR，(E)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR以及IgG1-CD30-T405-FEAR，(F)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR以及IgG1-CD30-T105-FEAR，(G)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR以及IgG1-CD30-T408-FEAR，以及(H)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR以及IgG1-CD30-T215-FEAR與SU-DHL-1細胞(左圖)或HDLM-2細胞(右圖)之劑量依賴性結合。(I)CD3xCD30雙特異性抗體和CD30單特異性抗體以1.11 µg/mL之濃度與SU-DHL-1(左圖)或HDLM-2細胞(右圖)結合。x軸顯示用於CD30臂之抗體殖株。顯示之數據係以流式細胞測量術測定之一個代表性實驗的平均螢光強度(MFI)值。
[ 圖 2] ： bsG1-huCD3xCD30-MDX060 與 HL 和 ALCL 細胞株結合。以流式細胞測量術評估bsG1-huCD3xCD30-MDX060與(A)HDLM-2(HL)、(B)L-428(HL)、(C)DEL(ALCL)或(D)KI-JK(ALCL)細胞之結合。包括雙特異性抗體bsG1-huCD3xb12和bsG1-b12xCD30-MDX060和單特異性抗體IgG1-CD30-MDX060、IgG1-huCD3以及IgG1-12作為對照。如所示，所有抗體之Fc域中均含有FEAL 及/或FERR Fc沉默和DuoBody®技術突變。顯示之數據係以流式細胞測量術測定之一個代表性實驗的平均螢光強度(MFI)值。
[ 圖 3] ： CD3xCD30 雙特異性抗體活體外誘導 SU-DHL-1 或 HDML-2 細胞中之細胞毒性。使用CD30陽性腫瘤細胞株SU-DHL-1細胞(左圖)或HDLM-2細胞(右圖)作為標靶細胞和T細胞(CD3陽性ADCC效應細胞IV型細胞；Clean Cells, Montaigu, France)作為效應細胞在活體外細胞毒性測定中測試CD3xCD30雙特異性抗體；Clean Cells, Montaigu, France)。測試下列抗體：(A)bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR以及IgG1-CD30-MDX060-FEAR，(B)bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR和IgG1-CD30-hAC10-FEAR，(C)bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR和IgG1-CD30-HRS-3-FEAR，(D)BsIgG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR和IgG1-CD30-HeFi-I-FEAR，(E)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR和IgG1-CD30-T405-FEAR，(F)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR和IgG1-CD30-T105-FEAR，(G)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR和IgG1-CD30-T408-FEAR，或(H)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR和IgG1-CD30-T215-FEAR。所有實驗中包括抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR作為對照。顯示之數據是活細胞之百分比；各圖之數據均來自一個代表性實驗。
[ 圖 4] ： CD3xCD30 雙特異性抗體活體外誘導數種 ALCL 和 HL 細胞株中之 T 細胞介導之細胞毒性和 T 細胞增生。(A至C)使用不同的ALCL和HL細胞株作為標靶細胞以及純化之T細胞(A、B)或ADCC效應細胞IV型細胞(C)或作為效應細胞，在活體外細胞毒性測定中測試CD3xCD30雙特異性抗體。CD3xCD30雙特異性抗體含有huCD3-FEAL Fab臂或huCD3-H101G-FEAL變體(其對CD3具有更低親和力)以及CD30特異性MDX060-FEAR Fab臂。包括IgG1-huCD3與IgG1-b12(A、B)或bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR與IgG1-CD30-MDX060-FEAR(C)作為對照。顯示之數據為活細胞之百分比；各圖之數據均來自一個代表性實驗。(D)在使用HDLM-2細胞(左圖)或NCEB-1細胞(右圖)作為標靶細胞之細胞毒性測定中，將CFSE陽性細胞之數量評估為絕對T細胞計數之量度。
[ 圖 5] ： CD3xCD30 雙特異性抗體與轉染入 Expi293F 細胞內之全長人類和食蟹獼猴 CD30 結合。(A至C)單價和二價CD30抗體與野生型Expi293F細胞(A)或以全長人類CD30(B)或食蟹獼猴CD30(C)瞬時轉染之Expi293F細胞之結合。將細胞與濃度不斷增加的下列抗體一起培養：IgG1-CD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR。數據以由兩次技術重複之流式細胞測量術測定平均螢光強度(MFI)值表示。(D)抗體IgG1-CD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR以及bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR與人類T細胞或食蟹獼猴T細胞之結合。數據係以流式細胞測量術測定之一個代表性實驗的平均螢光強度(MFI)值呈現。
[ 圖 6] ： CD3xCD30 雙特異性抗體與轉染入 Expi293F 細胞內之全長人類和恆河猴 CD30 結合。以流式細胞測量術評估單價和二價CD30抗體與以全長人類CD30(左圖)或恆河猴CD30(右圖)瞬時轉染之Expi293F細胞之結合。評估下列抗體：(A)bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR和IgG1-CD30-MDX060-FEAR，(B)bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR和IgG1-CD30-hAC10-FEAR，(C)bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR和IgG1-CD30-HRS-3-FEAR，(D)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR和IgG1-CD30-HeFi-I-FEAR，(E)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR和IgG1-CD30-T405-FEAR，(F)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR和IgG1-CD30-T105-FEAR，(G)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR和IgG1-CD30-T408-FEAR，或(H)bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR和IgG1-CD30-T215-FEAR。所有實驗中包括抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR作為陰性對照。顯示之數據係以流式細胞測量術測定之一個代表性實驗的平均螢光強度(MFI)值。
[ 圖 7] ：以差示掃描螢光測定術 (DSF) 測定之具有不同非活化突變之抗體的熱穩定性。DSF對逐漸升高之溫度下的構形蛋白穩定性評估兩次。顯示下列抗體之熔化曲線 ：(A)IgG1-CD30-MDX060-FEAR(pH 7.4)、(B)IgG1-CD30-MDX060-FERR(pH 7.4)、(C)IgG1-huCD3-FEAL(pH 7.4)以及(D)BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR(pH 7.4)。
[ 圖 8] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 與 HL 細胞株結合。以流式細胞測量術評估bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與HL細胞株L-540(A)、KM-H2(B)以及L-1236(C)之結合。包括雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR與bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR以及單特異性抗體IgG1-CD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL以及IgG1-12-FEAL作為對照。顯示之數據係以流式細胞測量術測定之一個代表性實驗的平均螢光強度(MFI)值。
[ 圖 9] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 與 ALCL 細胞株結合。以流式細胞儀評估bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與ALCL細胞株SUP-M2(A)、DL-40(B)、KARPAS-299(C)、L-82(D)以及SR-786(E)之結合。包括雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR與bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR以及單特異性抗體IgG1-CD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL以及IgG1-12-FEAL作為對照。顯示之數據係以流式細胞測量術測定之一個代表性實驗的平均螢光強度(MFI)值。
[ 圖 10] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 與 NHL 細胞株結合。以流式細胞儀評估bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與(A)SUP-T1(TLL)、(B)JVM-2(MCL)、(C)HH(CTCL)以及(D)NCEB-1(MCL)細胞株之結合。包括雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR與bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR以及單特異性抗體IgG1-CD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL以及IgG1-12-FEAL作為對照。顯示之數據係以流式細胞測量術測定之一個代表性實驗的平均螢光強度(MFI)值。
[ 圖 11] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 與轉染入 HEK293 細胞內之全長人類和恆河猴 CD30 結合。以流式細胞測量術評估bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與以全長人類CD30(A)或恆河猴CD30(B)瞬時轉染之之HEK293細胞之結合。包括bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR作為陰性對照。顯示之數據係以流式細胞測量術測定之一個代表性實驗的平均螢光強度(MFI)值。
[ 圖 12] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 與 T 細胞和腫瘤細胞同時結合。以流式細胞測量術研究bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與螢光標記之腫瘤細胞和初始T細胞之同時結合。(A)在6×10 -5至10 µg/mL bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR或IgG1-b12-FEAL之存在下，雙陽性事件顯示為總活細胞之百分比。沒有與抗體一起培養之樣本中之雙陽性事件之百分比以虛線顯示。(B)與0.12 µg/mL bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR一起培養之樣本中之雙陽性細胞的圈選(gating)策略實例。
[ 圖 13] ： CD3xCD30 雙特異性抗體活體外誘導 T 細胞介導之細胞毒性和 T 細胞活化。使用CD30陽性腫瘤細胞株Karpas-299作為標靶細胞及從健康人類捐贈者膚色血球層(buffy coat)純化之T細胞作為效應細胞，在活體外細胞毒性測定中測試一組CD3xCD30雙特異性抗體。在此等測定中，評估CD4 +和CD8 +細胞中之CD25表現以作為T細胞活化之量度。測試下列抗體：bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR、BsIgG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR以及bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR。(A)CD3xCD30抗體對Karpas-299細胞之細胞毒性之IC 50值。(B)測試抗體對Karpas-299細胞之最大細胞毒性之百分比。(C至F)CD3xCD30抗體誘導CD4 +(C、E)或CD8 +(D、F)T細胞中之CD25(C至D)或PD-1(E至F)表現之EC 50值。數據獲得自兩個獨立實驗，其係使用從6位不同的捐贈者獲得之T細胞進行。統計值代表指定選殖與bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之間之魏克生(Wilcoxon)配對符號等級檢定的結果。NS：不顯著，*：p＜0.05。
[ 圖 14] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 活體外細胞株之 T 細胞介導之細胞毒性。使用L-428(A)、KM-H2(B)、SUP-M2(C)或KI-JK(D)細胞株作為標靶細胞及純化之T細胞作為效應細胞，活體外測試bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR介導之劑量依賴性T細胞毒性。包括IgG1-huCD3-FEAL、bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR以及IgG1-b12-FEAL作為對照。顯示之數據為活細胞之百分比，各圖之數據係針對一個代表性實驗所獲得的。
[ 圖 15] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 活體外 L-428 和 KI-JK 細胞株中之 T 細胞增生。使用L-428(A、B)或KI-JK(C、D)作為標靶細胞，在T細胞介導之細胞毒性測定中評估T細胞增生。將有稀釋之CelltraceViolet染色之CD4 +(A、C)或CD8 +(B、D)T細胞圈選，並使用FlowJo之增生建模工具計算擴增指數以作為T細胞增生之量度。
[ 圖 16] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 活體外 L-428 和 KI-JK 細胞株中之 T 細胞活化標記 CD69 之表現。使用L-428(A、B)或KI-JK(C、D)作為標靶細胞，在T細胞介導之細胞毒性測定中評估T細胞活化。在CD4 +(A、C)或CD8 +(B、D)T細胞中評估T細胞活化標記CD69之表現。
[ 圖 17] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 活體外 L-428 和 KI-JK 細胞株中之 T 細胞活化標記 CD25 之表現。使用L-428(A、B)或KI-JK(C、D)作為標靶細胞，在T細胞介導之細胞毒性測定中評估T細胞活化。在CD4 +(A、C)或CD8+(B、D)T細胞中評估T細胞活化標記CD25之表現。
[ 圖 18] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 活體外 L-428 和 KI-JK 細胞株中之 T 細胞活化標記 PD-1 之表現。使用L-428(A、B)或KI-JK(C、D)作為標靶細胞，在T細胞介導之細胞毒性測定中評估T細胞活化。在CD4 +(A、C)或CD8 +(B、D)T細胞中評估T細胞活化標記PD-1之表現。
[ 圖 19] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 活體外細胞介質和顆粒酶 B 之產生。在於使用L-428作為標靶細胞之活體外T細胞介導之細胞毒性實驗期間收集的上清液中評估14種不同的細胞介質(CD40、IFNγ、IL-10、IL-12、IL-13、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、PDL-1、TNFα)和顆粒酶B之濃度。顯示以不同濃度的bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR或對照抗體IgG1-b12-FEAL處理之樣本的細胞介質和顆粒酶B濃度。
[ 圖 20] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 以不同的效應物與標靶之比率活體外 T 細胞介導之細胞毒性和 T 細胞增生。(A)使用L-428腫瘤細胞作為標靶細胞和純化之T細胞作為效應細胞，以1：1、2：1、4：1或8：1之E：T比在活體外測試bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR介導之劑量依賴性T細胞毒性。包括bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR作為對照抗體。顯示之數據是從一個代表性實驗中獲得的活細胞百分比。(B、C)有稀釋之CelltraceViolet染色之CD4 +(B)或CD8 +(C)T細胞之百分比顯示為增生T細胞之量度。
[ 圖 21] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 活體外 T 細胞介導之細胞毒性和 T 細胞增生之動力學。(A)使用L-428腫瘤細胞作為標靶細胞和純化之T細胞作為效應細胞，以4：1之E：T比在活體外測試bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之T細胞介導之細胞毒性之動力學。24 h、48 h以及72 h後評估細胞毒性。包括bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR作為對照抗體。顯示之數據是從一個代表性實驗中獲得的活細胞百分比。(B、C)將有稀釋之Celltrace Violet染色之CD4 +(B)或CD8 +(C)T細胞圈選，並使用FlowJo增生建模工具計算擴增指數以作為細胞毒性測定中T細胞增生之量度。
[ 圖 22] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 活體外 T 細胞介導之細胞毒性以及與 CD30 表現水平之相關性。在八種腫瘤細胞株中評估bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之最大T細胞介導之殺傷(A)或T細胞介導之細胞毒性的IC 50濃度(B)與CD30表現水平之間之相關性。使用斯皮爾曼(Spearman)等級相關檢定(GraphPad Prism軟體)評估T細胞介導之細胞毒性(最大殺傷或IC 50)與CD30表現之間之相關程度的統計顯著性。
[ 圖 23] ： bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060 -FERR 的活化之 T 細胞之誤殺 (fratricide) 。以1 µg/mL抗CD3(OKT-3)、1 µg/mL抗CD28以及0.025 µg/mL IL-15刺激單離之健康捐贈者T細胞4天。確認活化(CD25上調)後，T細胞與不斷增加之濃度的bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsIgG1-b12-FEALxCD30-MDX-060-FERR、bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FERR或IgG1-b12-FEAL一起培養48小時。將BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之活化之CD30 +T細胞的T細胞誤殺測量為各種條件下活T細胞之百分比相對於在不加入任何抗體的條件下活T細胞之數量。(A至B)由流式細胞測量術測定以抗CD3、抗CD28以及IL-15刺激後72小時和96小時，CD4 +或CD8 +T細胞中之CD25 +(A)或CD30 +(B)細胞之百分比。(C)T細胞誤殺顯示為相對於不加入任何抗體的條件下T細胞存活之百分比。顯示一位代表性T細胞捐贈者之數據。
[ 圖 24] ： CD30 + 細胞培養物上清液中之可溶性 CD30 及其對 BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 之抗腫瘤活性之干擾。(A)顯示如ELISA測量之不同血液腫瘤細胞株上清液中之可溶性CD30(sCD30)濃度。(B)如使用定量流式細胞測量術(人類IgG校準套組-Biocytex)測定在不同的血液腫瘤細胞株中的sCD30濃度與細胞表面CD30分子數量之間之相關性，並以斯皮爾曼等級相關檢定(GraphPad軟體)評估。(C)使用CD30陽性ALCL腫瘤細胞株DEL作為標靶細胞和健康捐贈者單離之T細胞作為效應細胞，在活體外細胞毒性測定中測試BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR。包括下列對照抗體：BsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR、BsG1-huCD3-FEALxb12-FERR、IgG1-huCD30-FEAL以及IgG1-b12-FEAL。顯示之數據是從一個代表性實驗中獲得的活細胞百分比。
[ 圖 25] ： bsG1-huCD3- FEALxCD30-MDX060- FERR 離體誘導 L-428 腫瘤細胞中之 T 細胞介導之細胞毒性和 T 細胞增生。(A)使用L-428腫瘤細胞作為標靶細胞和衍生自初級患者之T細胞作為效應細胞，在離體細胞毒性測定中測試bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR。將衍生自何杰金氏淋巴瘤(HL)、急性髓性白血病(AML)以及周邊T細胞淋巴瘤(PTCL)患者之周邊血單核細胞(PBMC)用作T細胞來源，以評估CD3依賴性腫瘤細胞殺傷。包括IgG1-b12-FEAL作為對照。顯示之數據為活標靶細胞之百分比。(B至D)藉由上調PBMC亞群內CD4 +/CD8 +T細胞上之CD69(B)、CD25(C)以及PD-1(D)標記而評估T細胞活化，以陽性細胞百分比顯示。
[ 圖 26] ： SCID 小鼠靜脈注射後 BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 之血漿濃度。SCID小鼠單次靜脈注射10 µg(0.5 mg/kg)或100 µg(5 mg/kg)的BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR。(A)以ELISA測定總人類IgG，並繪製隨時間的推移之平均人類IgG1濃度。(B)繪製0.5或5 mg/kg劑量水平的平均清除率。虛線顯示以小鼠中非結合之常規人類IgG1的標準分布體積為基準計之估計清除率。
[ 圖 27] ： C1q 與膜結合之 bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR 之結合。以使用FITC標記之兔抗C1q抗體之流式細胞測量術評估C1q與bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR調理之活化之人類CD8 +T細胞或CD30 +NCEB-1細胞之結合。(A)在作為C1q來源之正常人類血清之存在下，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL或陽性對照抗體IgG1-CD52-E430G與以抗CD3/CD28珠刺激之人類CD8 +T細胞之結合。顯示之數據為來自一個代表性實驗之重複孔的幾何平均螢光強度(gMFI)±SD。(B)在作為C1q來源之正常人類血清之存在下，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR或陽性對照抗體IgG1-7D8-E430G與CD30 +NCEB-1細胞之結合。顯示之數據是來自一個代表性實驗之gMFI。
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Claims (88)

  1. 一種醫藥組成物，其包含： a) 多特異性抗體，其包含能與人類CD30結合之抗原結合區和能與人類CD3結合之抗原結合區；以及 b) 緩衝劑 其中該組成物之pH為4.0至8.0。
  2. 如請求項1之醫藥組成物，其中該緩衝劑係選自由乙酸鹽、組胺酸、TRIS®(三(羥甲基)胺基甲烷)、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙醇酸鹽、麩胺酸鹽及其混合物所組成群組。
  3. 如請求項2之醫藥組成物，其中該緩衝劑為組胺酸、乙酸鹽及/或其混合物。
  4. 如請求項3之醫藥組成物，其中該緩衝劑為乙酸鹽。
  5. 如請求項4之醫藥組成物，其中該緩衝劑係選自由乙酸鈉(natrium acetate)、乙酸鉀、乙酸鈉(sodium acetate)、其水合物及其混合物所組成群組。
  6. 如請求項5之醫藥組成物，其中該緩衝劑為乙酸鈉，諸如乙酸鈉三水合物。
  7. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該緩衝劑以約5至約40 mM，諸如約10至約30 mM，諸如約15至約25 mM，諸如約18至約22 mM，較佳為約20 mM，諸如約17 mM之濃度存在。
  8. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該組成物之該pH為約4.5至約6.5，諸如約5.0至約6.0，諸如約5.2至約5.7，諸如約5.4至約5.6，較佳為約5.5。
  9. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該組成物之該pH為約5.5。
  10. 如請求項1至8中任一項之醫藥組成物，其中該組成物之該pH為約6.0。
  11. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物進一步包含pH調節組分。
  12. 如請求項11之醫藥組成物，其中該pH調節組分為酸。
  13. 如請求項12之醫藥組成物，其中該酸為HCl及/或乙酸，諸如冰乙酸。
  14. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物進一步包含非離子賦形劑。
  15. 如請求項14之醫藥組成物，其中該非離子賦形劑為糖或糖醇。
  16. 如請求項15之醫藥組成物，其中該非離子賦形劑係選自蔗糖、海藻糖、甘露醇、木糖醇、山梨醇及其混合物。
  17. 如請求項16之醫藥組成物，其中該非離子賦形劑係選自山梨醇、蔗糖、海藻糖或其混合物。
  18. 如請求項17之醫藥組成物，其中該非離子賦形為山梨醇或海藻糖。
  19. 如請求項18之醫藥組成物，其中該非離子賦形劑為山梨醇。
  20. 如請求項14至19中任一項之醫藥組成物，其中該非離子賦形劑係以約5至約450 mM，諸如約50至約400 mM，如約100至約350mM，諸如約125至約300 mM，如約150至約250 mM，較佳為約250 mM之濃度存在。
  21. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含乙酸鹽，諸如乙酸鈉，以及山梨醇，並且具有約5.5之pH。
  22. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物之滲透壓低於約600 mOsm/kg，諸如低於約550 mOsm/kg，諸如低於約500 mOsm/kg，諸如低於約450 mOsm/kg，諸如低於約400 mOsm/kg，諸如低於約350 mOsm/kg。
  23. 如請求項1至21中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物之滲透壓在約100至500 mOsm/kg之範圍內，諸如在約200至400 mOsm/kg之範圍內，如在約250至350 mOsm/kg之範圍內。
  24. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物之黏度低於約30cP，諸如低於約25 cP，諸如低於約20 cP，諸如低於約18 cP，諸如低於約16 cP，諸如低於約14 cP，諸如低於約12 cP，諸如低於約10 cP，諸如低於約9 cP，諸如低於約8 cP，諸如低於約7 cP，諸如低於約6 cP，諸如低於約5 cP，諸如低於約4 cP，諸如低於約3 cP，諸如低於約2 cP。
  25. 如請求項1至23中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物之黏度在約1至30 cP之範圍內，諸如在約1至25 cP之範圍內，如在約1至20 cP之範圍內，諸如在約1至18 cP之範圍內，如在約1至15 cP之範圍內，諸如在約1至12 cP之範圍內，如約1至10 cP，諸如約1至9 cP，如約1至8 cP，諸如約1至7 cP，如約1至6 cP，諸如約1至5 cP，如約1至4 cP，諸如約1至3 cP。
  26. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物進一步包含界面活性劑。
  27. 如請求項26之醫藥組成物，其中該界面活性劑係選自由單油酸甘油酯、氯化苯索寧、多庫酯鈉、磷脂質、聚乙烯烷基醚、十二烷基硫酸鈉和三辛酸甘油酯、苯扎氯銨、西曲溴銨、氯化十六烷基吡啶和磷脂質、α生育醇、單油酸甘油酯、肉荳蔻醇、磷脂質、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧羥基硬脂酸酯、聚氧基甘油酯、聚山梨醇酯、丙二醇二-十二酸酯、丙二醇單十二酸酯、山梨醇酐酯蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖硬脂酸酯、三辛酸甘油酯和TPGS以及其混合物所組成群組。
  28. 如請求項27之醫藥組成物，其中該界面活性劑為聚山梨醇酯。
  29. 如請求項28之醫藥組成物，其中該界面活性劑為聚山梨醇酯20(PS20)或聚山梨醇酯80(PS80)，較佳為聚山梨醇酯80(PS80)。
  30. 如請求項26至29中任一項之醫藥組成物，其中該界面活性劑以約0.01至約0.1% w/v，諸如約0.01至約0.09%w /v，諸如約0.01至約0.06% w/v，諸如約0.01至約0.05% w/v，諸如約0.02% w/v、約0.03% w/v、約0.04% w/v或約0.05 % w/v，較佳為約0.02% w/v之濃度存在。
  31. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該抗體之濃度為約0.5至約250 mg/ml，諸如約1.0至約220 mg/ml，諸如約3至約190 mg /ml，諸如約5至約160 mg/ml，諸如約10至約130 mg/ml，諸如約20至約120 mg/ml，諸如約30至約110 mg/ml，諸如約40至約100 mg/ml，諸如約50至約90 mg/ml，諸如約60至約80 mg/ml，或諸如約65至約75mg/ml，或諸如約20至約200 mg/ml。
  32. 如請求項1至31中任一項之醫藥組成物，其中該抗體之該濃度為約50至約250 mg/ml，諸如約60至約240 mg/ml，或諸如約70至約220 mg/ml，諸如約80至約210 mg/ml，諸如約100至約200 mg/ml，諸如約120至約190 mg/ml，諸如約140至約180 mg/ml，或諸如約150至約170 mg/ml。
  33. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物為液體組成物。
  34. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物為水性組成物。
  35. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物為穩定之醫藥組成物。
  36. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物在至少2個月，諸如至少3個月，諸如至少6個月，諸如至少9個月，諸如至少12個月之期間內呈穩定的。
  37. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物在約10 mg/ml至約250 mg/ml，諸如約20 mg/ml至約200 mg/ml，如約50 mg/ml至約170 mg/ml之寬抗體濃度範圍內呈穩定的。
  38. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物在諸如約2℃至約25℃之溫度範圍內呈穩定的。
  39. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該組成物在2至8℃，諸如5℃之儲存溫度下呈穩定至少2個月，諸如至少3個月，諸如至少4個月，諸如至少5個月，諸如至少6個月，諸如至少9個月或至少12個月。
  40. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物在約5℃之儲存溫度下呈穩定至少12個月。
  41. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250 mg/ml的多特異性抗體，諸如約20至200 mg/ml的多特異性抗體， b)緩衝劑， c)視需要之非離子賦形劑， d)視需要之界面活性劑 其中該組成物之該pH為約5.0至約6.5。
  42. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該組成物為皮下組成物，及/或其中該組成物用於皮下投予。
  43. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該組成物為靜脈組成物，及/或其中該組成物用於靜脈投予。
  44. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該多特異性抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3。
  45. 如請求項44之醫藥組成物，其中該第一重鏈可變區及/或該第一輕鏈可變區為人類的。
  46. 如請求項44至45中任一項之醫藥組成物，其中該第二重鏈可變區及/或該第二輕鏈可變區為人源化的。
  47. 如請求項44至46中任一項之醫藥組成物，其中SEQ ID NO：9中之X為H。
  48. 如請求項44至47中任一項之醫藥組成物，其中該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：13所示之序列，並且該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO：14所示之序列。
  49. 如請求項44至48中任一項之醫藥組成物，其中該第二重鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示之序列，並且該第二輕鏈可變區包含SEQ ID NO：16所示之序列。
  50. 如請求項49中任一項之醫藥組成物，其中SEQ ID NO：15中之X為H。
  51. 如請求項44至50中任一項之醫藥組成物，其中該多特異性抗體為雙特異性抗體。
  52. 如請求項44至51中任一項之醫藥組成物，其中該多特異性抗體包含由第一Fc多肽和第二Fc多肽所組成之Fc區。
  53. 如請求項44至52中任一項之醫藥組成物，其中該Fc區為IgG1 Fc區，較佳為人類IgG1 Fc區。
  54. 如請求項44至53中任一項之醫藥組成物，其中該多特異性抗體為全長抗體。
  55. 如請求項44至54中任一項之醫藥組成物，其中該多特異性抗體包含惰性Fc區。
  56. 如請求項44至55中任一項之醫藥組成物，其中該第一及/或第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234及/或L235處之胺基酸之胺基酸取代，其中該等取代較佳為分別取代成F和E，其中該等胺基酸位置係如Eu編號所定義。
  57. 如請求項55至56中任一項之醫藥組成物，其中該第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及其中該第一及/或第二Fc多肽進一步包含對應人類IgG1重鏈中之位置G236處之胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳為取代成R，其中該等胺基酸位置係如Eu編號所定義。
  58. 如請求項57之醫藥組成物，其中該第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及其中該第一及第二Fc多肽進一步包含對應人類IgG1重鏈中之位置G236處之胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳為取代成R。
  59. 如請求項55至56中任一項之醫藥組成物，其中該第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及其中該第一及/或第二Fc多肽進一步包含對應人類IgG1重鏈中之位置D265處之胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳為取代成A，其中該等胺基酸位置係如Eu編號所定義。
  60. 如請求項59之醫藥組成物，其中該第一和第二Fc多肽包含對應人類IgG1重鏈中之位置L234和L235處之胺基酸分別成F和E之胺基酸取代，以及其中該第一及第二Fc多肽進一步包含對應人類IgG1重鏈中之位置D265處之胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳為取代成A。
  61. 如請求項56至60中任一項之醫藥組成物，其中該第一和第二Fc多肽中之一者包含對應位置L234、L235以及G236處之胺基酸分別成F、E以及R之胺基酸取代，以及另一個Fc多肽包含對應位置L234、L235E以及D265處之胺基酸分別成F、E以及A之胺基酸取代，其中該等胺基酸位置係如Eu編號所定義。
  62. 如請求項61之醫藥組成物，其中該第一Fc多肽和該第一重鏈可變區包含在相同多肽鏈內，以及其中該第二Fc多肽和該第二重鏈可變區包含在相同多肽鏈內。
  63. 如請求項62之醫藥組成物，其中該第一Fc多肽包含對應位置L234、L235以及G236處之胺基酸分別成F、E以及R之胺基酸取代，以及該第二Fc多肽包含對應位置L234、L235E以及D265處之胺基酸分別成F、E以及A之胺基酸取代，其中該等胺基酸位置係如Eu編號所定義。
  64. 如請求項44至63中任一項之醫藥組成物，其中於該第一Fc多肽中，對應選自由下列各者所組成群組之位置的位置之至少一個胺基酸：人類IgG1 重鏈中之T366、L368、K370、D399、F405、Y407以及K409已經取代，以及於該第二Fc 多肽中，對應選自由下列各者所組成群組之位置的位置之至少一個胺基酸：人類IgG1重鏈中之T366、L368、K370、D399、F405、Y407以及K409已經取代，以及其中該第一和第二Fc多肽中之該等取代不在相同位置，其中該等胺基酸位置係如由Eu編號所定義。
  65. 如請求項64之醫藥組成物，其中該第一Fc多肽中對應F405之位置之胺基酸為L，以及其中該第二Fc多肽中對應K409之位置之胺基酸為R，或反之亦然。
  66. 如請求項65之醫藥組成物，其中該第一Fc多肽中對應K409之位置之胺基酸為R，以及其中該第二Fc多肽中對應F405之位置之胺基酸為L。
  67. 如請求項44至66中任一項之醫藥組成物，其中該多特異性抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列； 其中該多特異性抗體為雙特異性抗體，並包含由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區； 其中該第一Fc多肽和該第一重鏈可變區包含在相同多肽鏈內，以及其中該第二Fc多肽和該第二重鏈可變區包含在相同多肽鏈內； 其中該第一Fc多肽包含對應位置L234、L235以及G236處之胺基酸分別成F、E以及R之胺基酸取代，以及該第二Fc多肽包含對應位置L234、L235以及D265處之胺基酸分別成F、E以及A之胺基酸取代，其中該等胺基酸位置係如Eu編號所定義；以及 其中該第一Fc多肽中對應K409之位置之胺基酸為R，以及其中該第二Fc多肽中對應F405之位置之胺基酸為L。
  68. 如請求項44至67中任一項之醫藥組成物，其中該多特異性抗體包含SEQ ID NO：17和19所示之重鏈序列以及SEQ ID NO：18和20所示之輕鏈序列或由其組成。
  69. 如請求項44至68中任一項之醫藥組成物，其中該多特異性抗體包含SEQ ID NO：17和19所示之重鏈序列以及SEQ ID NO：18和20所示之輕鏈序列或由其組成，其中該抗體為雙特異性抗體。
  70. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該多特異性抗體包含拉目達(λ)輕鏈和卡帕(κ)輕鏈；例如，一種抗體，其具有包含能與CD3結合之結合區之重鏈和拉目達輕鏈，以及包含能與CD30結合之結合區之重鏈和卡帕輕鏈。
  71. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該能與人類CD30結合之抗原結合區包含在重鏈和輕鏈中，該重鏈包含該VH區和IgG1重鏈恆定區，以及該輕鏈包含該VL區和卡帕輕鏈恆定區，以及其中該能與人類CD3結合之抗原結合區包含在重鏈和輕鏈中，該重鏈包含該VH區和IgG1重鏈恆定區，以及該輕鏈包含該VL區和拉目達輕鏈恆定區。
  72. 如請求項71之醫藥組成物，其中一個IgG1重鏈恆定區係如SEQ ID NO. 51所定義，並且另一個係如SEQ ID NO. 50所定義，以及其中該卡帕輕鏈恆定區係如SEQ ID NO. 53所定義，以及該拉目達輕鏈恆定區係如SEQ ID NO. 54所定義。
  73. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3，其中SEQ ID NO：9中之X為H； 其中該多特異性抗體為雙特異性抗體，並包含由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區； 其中該第一Fc多肽和該第一重鏈可變區包含在相同多肽鏈內，以及其中該第二Fc多肽和該第二重鏈可變區包含在相同多肽鏈內； 其中該第一Fc多肽包含對應位置L234、L235以及G236處之胺基酸分別成F、E以及R之胺基酸取代，以及該第二Fc多肽包含對應位置L234、L235以及D265處之胺基酸分別成F、E以及A之胺基酸取代，其中該等胺基酸位置係如Eu編號所定義；以及 其中該第一Fc多肽中對應K409之位置之胺基酸為R，以及其中該第二Fc多肽中對應F405之位置之胺基酸為L。
  74. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其中該抗體為bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-FERR或其生物相似物。
  75. 如前述請求項中任一項之醫藥組成物，其包含下列各者或基本上由其所組成： a)約0.5至250 mg/ml的該抗體，諸如約20至200 mg/ml的該抗體，其中該抗體包含： (i)CD30結合區，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，該第一重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：1、2以及3所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第一輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：4、5以及6所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及 (ii)CD3結合區，其包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，該第二重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：7、8以及9所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列，以及該第二輕鏈可變區分別包含SEQ ID NO：10、11以及12所示之CDR1、CDR2以及CDR3序列；視需要地，其中SEQ ID NO：9中之X為H； b)緩衝劑，諸如組胺酸或乙酸鹽， c)視需要地，非離子賦形劑，諸如蔗糖、海藻糖或山梨醇， d)視需要地，界面活性劑，諸如聚山梨醇酯， 其中該組成物之該pH為約5.0至約6.5。
  76. 一種如請求項1至75中任一項所定義之用作藥劑之醫藥組成物。
  77. 如請求項76之用作藥劑之醫藥組成物，其係用於治療疾病之方法。
  78. 一種如請求項1至75中任一項所定義之用於治療癌症之醫藥組成物。
  79. 如請求項78之醫藥組成物，其係用於治療何杰金氏淋巴瘤，諸如典型何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。
  80. 如請求項79之所使用之醫藥組成物，其中該非何杰金氏淋巴瘤為T細胞非何杰金氏淋巴瘤(T-NHL)。
  81. 如請求項80之所使用之醫藥組成物，其中T-NHL為皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)或周邊T細胞淋巴瘤(PTCL)。
  82. 如請求項79至81中任一項之所使用之醫藥組成物，其中T細胞非何杰金氏淋巴瘤(T-NHL)為間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)。
  83. 如請求項78所使用之醫藥組成物，其中該非何杰金氏淋巴瘤為B細胞非何杰金氏淋巴瘤(B-NHL)。
  84. 如請求項78至83中任一項之所使用之醫藥組成物，其中該醫藥組成物已靜脈及/或皮下投予，較佳為皮下投予。
  85. 一種如請求項1至75中任一項之醫藥組成物於治療癌症之用途。
  86. 一種部件套組，其包含： a.如請求項1至75中任一項之醫藥組成物， b.用於該醫藥組成物之容器，以及 c.用於該套組之使用說明書。
  87. 如請求項86之部件套組，其中該部件套組進一步包含稀釋劑。
  88. 一種製備如請求項1至75中任一項之醫藥組成物之方法，其包含在水中混合之步驟： a)多特異性抗體，諸如約0.5至約250 mg/ml的該抗體， b)緩衝劑， 視需要地，c)非離子賦形劑，以及 視需要地，d)界面活性劑； 以及將pH調節至約4.0至8.0左右。
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