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TW202505030A - 用於遞送效應物至中樞神經系統之指環載體 - Google Patents

用於遞送效應物至中樞神經系統之指環載體 Download PDF

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TW202505030A
TW202505030A TW113121879A TW113121879A TW202505030A TW 202505030 A TW202505030 A TW 202505030A TW 113121879 A TW113121879 A TW 113121879A TW 113121879 A TW113121879 A TW 113121879A TW 202505030 A TW202505030 A TW 202505030A
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羅傑 喬瑟夫 哈捷爾
內森 勞倫斯 佑茲偉艾克
賽門 德拉葛瑞夫
達南傑 馬尼克拉爾 納彎達
布萊恩 Ｗ 沃特
克里斯多福 依恩 萊特
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美商旗艦先鋒創新公司
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Abstract

本發明大體上係關於指環病毒科(Anelloviridae)載體(例如，指環載體)以及其組合物及用途。

Description

用於遞送效應物至中樞神經系統之指環載體
持續需要研發適合之載體以向患者遞送治療性遺傳物質。
本揭露提供一種指環病毒科(Anelloviridae)載體(例如，指環載體)，例如合成性指環病毒科載體(例如，指環載體)，該載體可用作遞送運載體(vehicle)，例如用於遞送遺傳物質、用於遞送效應物(例如，有效負載)或用於遞送治療劑或治療效應物至真核生物細胞(例如，人類細胞或人類組織)。
在前述指環病毒科載體(例如，指環載體)、組合物或方法中之任一者的額外特徵包括以下所列舉之實施例中之一或多者。
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所描述之本發明特定實施例的許多等效物。此類等效物意欲由以下所列舉之實施例涵蓋。
所列舉實施例1.一種遞送外源效應物至個體之中樞神經系統(CNS)之方法，該方法包含向該個體之CNS投與指環病毒科載體(例如，指環載體)。 2.一種遞送能夠編碼(例如編碼)外源效應物之DNA至個體之CNS的方法，該方法包含向該個體之CNS投與指環病毒科載體(例如，指環載體)。 3.如實施例1或2之方法，其包含遞送該指環病毒科載體至該個體之腦。 4.如實施例1至3中任一項之方法，其包含在該個體之腦中產生該外源效應物及/或能夠編碼(例如編碼)該外源效應物之DNA。 5.一種調節個體之CNS中之生物功能的方法，該方法包含向該個體之CNS投與指環病毒科載體(例如，指環載體)。 6.如實施例5之方法，其包含遞送該指環病毒科載體至該個體之腦。 7.如實施例5或6之方法，其包含調節該個體之腦中的生物功能。 8.一種治療有需要個體之CNS疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與指環病毒科載體(例如，指環載體)。 9.如實施例8之方法，其中該CNS疾病或病症為腦疾病或病症。 10.如實施例8或9之方法，其中該CNS疾病或病症係選自：共濟失調不平衡(例如弗里德賴希氏共濟失調(Friedreich's ataxia))、脊髓性小腦萎縮症、額顳葉型失智症、阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease)、帕金森氏病(Parkinson's Disease)、路易體性失智症(Lewy body dementia)、遺傳性癲癇發作、杭丁頓氏病(Huntington's disease)、精神障礙(例如，精神分裂症、躁鬱症或抑鬱)、脊髓性肌肉萎縮症(spinal muscular atrophy；SMA)、多發性硬化症、創傷性腦損傷、腦腫瘤、遺傳性疾病(例如罕見遺傳性疾病)、巴登氏病(Batten disease)、雷特氏症候群(Rett syndrome)、杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy)、肌肉萎縮性側索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis；ALS)、神經發育疾病(例如，自閉症、雷特氏症候群或脆弱X染色體症候群(Fragile X syndrome))或腦白質失養症(例如，腎上腺腦白質失養症或異染性腦白質失養症)。 11.如實施例8至10中任一項之方法，其中該個體具有以下中之一或多者之障礙：記憶、行為或語言。 12.如實施例1至11中任一項之方法，其使得指環載體DNA遞送於一或多種選自以下之細胞類型中：神經元(例如，GABA激導性神經元、麩胺酸激導性神經元、脊髓運動神經元)、神經膠質細胞、微神經膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及星狀細胞。 13.如實施例1至12中任一項之方法，其使得該外源效應物在一或多種選自以下之細胞類型中表現：神經元(例如，GABA激導性神經元、麩胺酸激導性神經元、脊髓運動神經元)、神經膠質細胞、微神經膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及星狀細胞。 14.如實施例1至13中任一項之方法，其包含使該指環載體與一或多種選自以下之細胞類型接觸(例如，直接或間接接觸)：神經元(例如，GABA激導性神經元、麩胺酸激導性神經元、脊髓運動神經元)、神經膠質細胞、微神經膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及星狀細胞。 15.如實施例1至14中任一項之方法，其使得指環載體DNA遞送於以下中之一或多者中：小腦、額顳葉(例如於海馬體中)、頂葉、腦幹及脊髓。 16.如實施例1至15中任一項之方法，其使得該外源效應物在以下中之一或多者中表現：小腦、額顳葉(例如於海馬體中)、頂葉、腦幹及脊髓。 17.如實施例1至16中任一項之方法，其包含使該指環載體與以下中之一或多者接觸(例如，直接或間接接觸)：小腦、額顳葉(例如於海馬體中)、頂葉、腦幹及脊髓。 18.如實施例1至17中任一項之方法，其使得該外源效應物及/或編碼該外源效應物之該DNA至腦的遞送量大於至脊髓的遞送量。 19.如實施例1至18中任一項之方法，其中該指環病毒科載體(例如，指環載體)係根據選自以下之投與途徑投與：鞘內(IT)、腦室內(ICV)、大池內(ICM)或實質內(IPa)。 20.如實施例18之方法，其中該指環病毒科載體(例如，指環載體)係根據腦室內(ICV)投與途徑投與。 21.如前述實施例中任一項之方法，其中該指環病毒科載體為包含含有ORF1分子之蛋白質外殼(proteinaceous exterior)及由該蛋白質外殼包封之遺傳元件的指環載體，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼該外源效應物之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件。 22.如前述實施例中任一項之方法，其中該指環病毒科載體為包含蛋白質外殼之指環載體，該蛋白質外殼包含具有表A1至A3中之任一者中所列出之ORF1序列的ORF1分子，或包含與該ORF1序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。 23.如前述實施例中任一項之方法，其中該ORF1分子相對於表A1至A3之野生型ORF1蛋白包含至少一個差異。 24.如前述實施例中任一項之方法，其中該差異包含突變(例如，插入、取代或缺失)、化學修飾或酶修飾。 25.如前述實施例中任一項之方法，其中該突變包含缺失，例如缺失域(例如富精胺酸區、果凍卷域(jelly-roll domain)、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如本文所描述)。 26.如前述實施例中任一項之方法，其中該ORF1分子包含ORF1域及外源部分，例如外源表面部分。 27.如前述實施例中任一項之方法，其中該指環病毒科載體為包含蛋白質外殼之指環載體，該蛋白質外殼包含由表N1至N3中所列出之指環病毒ORF1核酸序列編碼的多肽，或由與該指環病毒ORF1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列編碼的多肽。 28.如前述實施例中任一項之方法，其中該遺傳元件包含指環病毒5' UTR保守域，其具有SEQ ID NO: 54之核苷酸323-393之反向互補序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列，或其功能部分。 29.如前述實施例中任一項之方法，其中該遺傳元件包含指環病毒富GC區，其具有SEQ ID NO: 54之核苷酸2868-2929之反向互補序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列，或其功能部分。 30.如實施例1至27之方法，其中該遺傳元件包含指環病毒5' UTR保守域，其具有SEQ ID NO: 1之核苷酸1-71之反向互補序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列，或其功能部分。 31.如實施例1至27或30之方法，其中該遺傳元件包含指環病毒富GC區，其具有SEQ ID NO: 1之核苷酸2515-2615之反向互補序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列，或其功能部分。 32.如前述實施例中任一項之方法，其中該指環病毒富GC區之部分為至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸。 33.如前述實施例中任一項之方法，其中該遺傳元件為DNA。 34.如前述實施例中任一項之方法，其中該遺傳元件為環狀單股DNA。 35.如實施例1至32中任一項之方法，其中該遺傳元件為RNA，例如mRNA。 36.如前述實施例中任一項之方法，其中該外源效應物包含：胞內肽或胞內多肽、分泌性多肽或蛋白質替代治療劑。 37.如前述實施例中任一項之方法，其中該指環病毒科載體(例如，指環載體)為乙型細環病毒(Betatorquevirus)。 38.如前述實施例中任一項之方法，其進一步包含向該個體之CNS投與額外劑量的指環病毒科載體(例如，指環載體)。 39.如實施例38之方法，其中該指環病毒科載體與該額外劑量之該指環病毒科載體相同。 40.如實施例38之方法，其中該指環病毒科載體與該額外劑量之該指環病毒科載體不同。 41.如前述實施例中任一項之方法，其使得編碼該外源效應物之該DNA至CNS的遞送量大於至肌肉的遞送量。 42.如前述實施例中任一項之方法，其使得編碼該外源效應物之該DNA至CNS的遞送量大於至肝臟的遞送量。 43.如前述實施例中任一項之方法，其使得編碼該外源效應物之該DNA至脊髓的遞送量大於至肌肉的遞送量。 44.如前述實施例中任一項之方法，其使得編碼該外源效應物之該DNA至脊髓的遞送量大於至肝臟的遞送量。 45.如實施例41至44中任一項之方法，其中該較大遞送量為高2倍、5倍或10倍。 46.一種適合於遞送至CNS之遞送系統，其中該遞送系統包含指環病毒科載體(例如，指環載體)。 47.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)，其中該蛋白質外殼(例如，該蛋白質外殼之ORF1分子)包含胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO:829)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。 48.如實施例47之指環病毒科載體(例如，指環載體)，其中該胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)包含於該ORF1分子之N22域中。 49.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)，其中該ORF1分子包含一或多個(例如，1、2、3、4或全部5個)以下指環病毒ORF1子域：例如表A1至A3中所列出之指環病毒ORF1蛋白(或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列)的富精胺酸區、果凍卷區域、高變區、N22域、C端域(CTD) (例如本文所描述)。 50.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)，其包含相對於野生型指環病毒基因體序列之至少一個差異，其中該至少一個差異包含缺失(例如，缺乏以下中之一或多者：指環病毒5' UTR保守域、ORF1基因、ORF2基因、指環病毒富GC區、ORF3基因，或其功能片段)。 51.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)，其中該遺傳元件進一步包含啟動子。 52.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)，其中該遺傳元件進一步包含poly A序列。 53.一種醫藥組合物，其包含如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)。 54.如實施例53之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有以下特徵中之一或多者： a) 該醫藥組合物符合醫藥或良好作業規範(GMP)標準； b) 該醫藥組合物係根據良好作業規範(GMP)製得； c) 該醫藥組合物具有低於預定參考值之病原體含量，例如實質上不含病原體； d) 該醫藥組合物具有低於預定參考值之污染物含量，例如實質上不含污染物； e) 該醫藥組合物具有預定含量之非感染性顆粒或預定比率之顆粒:感染性單元(例如，＜300:1、＜200:1、＜100:1或＜50:1)，或 f) 該醫藥組合物具有較低免疫原性或實質上為非免疫原性的，例如本文所描述。 55.如實施例53至54中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物具有低於預定參考值之污染物含量，例如實質上不含污染物。 56.如實施例55之醫藥組合物，其中該污染物係選自由以下組成之群：黴漿菌、內毒素、宿主細胞核酸(例如，宿主細胞DNA及/或宿主細胞RNA)、動物來源之過程雜質(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、複製勝任型藥劑(replication-competent agent；RCA)，例如複製勝任型病毒或非所要指環病毒科載體(例如，指環載體) (例如，除所需指環病毒科載體外的指環病毒科載體，例如本文所描述之合成性指環病毒科載體)、游離病毒衣殼蛋白、偶然性物質及聚集物。 57.如實施例55之醫藥組合物，其中該污染物為宿主細胞DNA，且臨限量為每劑量該醫藥組合物約10 ng宿主細胞DNA。 58.如實施例53至57中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含少於10重量% (例如，少於約10重量%、5重量%、4重量%、3重量%、2重量%、1重量%、0.5重量%或0.1重量%)污染物。 59.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件為單股的。 60.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件為環狀的。 61.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件包含DNA。 62.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件為負股DNA。 63.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件為雙股的。 64.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件為線性的。 65.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件包含RNA。 66.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件包含編碼指環病毒科衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1分子(例如，表A1至A3中所列出之ORF1蛋白或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)的核酸序列。 67.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件不包含編碼指環病毒科衣殼蛋白，例如指環病毒ORF1分子(例如，表A1至A3中所列出之ORF1蛋白或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)的核酸序列。 68.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件包含編碼指環病毒ORF2分子(例如表A1至A3中所列出之ORF2蛋白，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)的核酸序列。 69.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該遺傳元件不包含編碼指環病毒ORF2分子(例如，表A1至A3中所列出之ORF2蛋白或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)的核酸序列。 70.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件包含GC含量為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的至少20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個連續核苷酸。 71.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該蛋白質外殼包含胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。 72.如實施例71之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)包含於N22域中。 73.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該ORF1分子包含富精胺酸區(例如，與表A1至A3中所列出之ORF1蛋白之富精胺酸區序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性)。 74.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該蛋白質外殼包含至少15、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45或50個連續核苷酸之胺基酸序列，該等連續核苷酸包含至少40% (例如，至少40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、55%、60%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、90%或95%)精胺酸殘基。 75.如實施例73或74之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該富精胺酸區位於該ORF1分子之N端或C端末端處。 76.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件包含以下中之一或多者：TATA盒、起始元件、加帽位點、轉錄起始位點、ORF1/1編碼序列、ORF1/2編碼序列、ORF2/2編碼序列、ORF2/3編碼序列、ORF2/3t編碼序列、三個開放閱讀框架區、poly(A)信號、及/或來自本文所描述之指環病毒的富GC區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。 77.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件與本文所描述之指環病毒5' UTR保守域序列包含至少75% (例如，至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性。 78.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該遺傳元件與本文所描述之指環病毒富GC區序列包含至少75% (例如，至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性。 79.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該效應物編碼治療劑，例如治療性肽或多肽或治療性核酸。 80.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該效應物為外源效應物。 81.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該效應物為內源效應物(例如，其中該指環載體在目標細胞中過度表現該內源效應物)。 82.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該效應物調節基因或蛋白質之表現或活性，例如增加或減少該基因或蛋白質之表現或活性。 83.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該指環病毒科載體能夠自主複製。 84.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該指環病毒科載體為複製缺陷型(例如，不能自主複製)。 85.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該遺傳元件以小於進入真核細胞之遺傳元件之約0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%或2%的頻率整合至該細胞之基因體中。 86.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該指環病毒科載體為實質上非病原性的，例如在個體中不會誘導可偵測的有害症狀(例如，例如相對於未暴露於該指環載體之個體，細胞死亡或毒性升高)。 87.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該指環病毒科載體為實質上非免疫原性的，例如不會誘導可偵測及/或非所要的免疫反應。 88.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中至少1000個該等指環病毒科載體之群體能夠遞送該遺傳元件之至少約100個複本(例如，至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個複本)至一或多種真核細胞(例如哺乳動物細胞，例如人類細胞)中。 89.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)、核酸分子或方法，其中該等指環病毒科載體(例如，每細胞至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個基因體當量之該遺傳元件)的群體能夠遞送該遺傳元件至至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多的真核細胞(例如哺乳動物細胞，例如人類細胞)之群體中。 90.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該等指環病毒科載體(例如，每細胞至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個基因體當量之該遺傳元件)的群體能夠遞送該遺傳元件之每細胞至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、8,000、1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7個或更多個複本至真核細胞(例如哺乳動物細胞，例如人類細胞)之群體。 91.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該等指環病毒科載體(例如，每細胞至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個基因體當量之該遺傳元件)的群體能夠遞送該遺傳元件之每細胞1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、5至10、10至20、20至50、50至100、100至1000、1000至10 4、1×10 4至1×10 5、1×10 4至1×10 6、1×10 4至1×10 7、1×10 5至1×10 6、1×10 5至1×10 7或1×10 6至1×10 7個複本至真核細胞(例如哺乳動物細胞，例如人類細胞)之群體。 92.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該遺傳元件遞送至其中之該等目標細胞各自接收該遺傳元件之至少10、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000或更多個複本。 93.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中相對於包含外部脂質雙層之病毒顆粒，例如逆轉錄病毒，該指環病毒科載體對藉由清潔劑(例如溫和清潔劑，例如膽鹽，例如去氧膽酸鈉)進行之降解具有抗性。 94.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中由該蛋白質外殼包封之該遺傳元件對藉由核酸酶(例如，DNA酶)進行之降解具有抗性。 95.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該指環病毒科載體能夠例如活體外、活體內或離體感染哺乳動物細胞，例如人類細胞。 96.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該指環病毒科載體選擇性地遞送該效應物至所需細胞類型、組織或器官，或係以較高水平存在於(例如，優先積聚於)所需細胞類型、組織或器官中。 97.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該蛋白質外殼係以相對於該遺傳元件之順式形式提供。 98.如前述實施例中任一項之指環病毒科載體(例如，指環載體)或方法，其中該蛋白質外殼係以相對於該遺傳元件之反式形式提供。 99.如先前實施例中任一項之指環病毒科載體，其實質上不含野生型指環病毒基因體。
本發明之其他特徵、目標及優勢將自實施方式及圖式以及自申請專利範圍顯而易知。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同的含義。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以全文引用之方式併入。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。
相關申請案之交叉參考本申請案主張2023年6月14日申請之美國臨時申請案第63/508,149號之權益。前述申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
序列表本申請案含有序列表，該序列表已以XML檔案格式以電子方式提交且其以全文引用之方式併入本文中。該XML複本創建於2024年5月31日，命名為V2057-7031TW_SL.xml且大小為311,526位元組。
定義 將關於特定實施例及參考某些圖式描述本發明，但本發明不限於此，而僅受申請專利範圍限制。除非另外指示，否則下文所闡述之術語通常應按其常識來理解。
在術語「包含(comprising)」用於本說明書及申請專利範圍之情況下，其不排除其他要素。出於本發明之目的，術語「由…組成(consisting of)」被視為術語「包含(comprising of)」之較佳實施例。若在下文中將群組定義為包含至少某一數目之實施例，則此應理解為亦較佳揭示僅由此等實施例組成之群組。
除非另外具體陳述，否則若在提及單數名詞時使用不定冠詞或定冠詞，例如「一(a)」、「一(an)」或「該(the)」，則此包括複數個該名詞。
措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」應理解為係指適合於治療、調節等指定目的之化合物、組合物、產物等本身。措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」另外揭示，作為一實施例，此類化合物、組合物、產物等用於治療、調節等。
措辭「用於…之化合物、組合物、產物等」、「化合物、組合物、產物等在製造用於…之藥劑、醫藥組合物、獸醫組合物、診斷組合物等中的用途」或「用作藥劑…之化合物、組合物、產物等」指示此類化合物、組合物、產物等用於可在人體或動物體上實踐之治療方法中。其被視為等效地揭示關於治療方法等的實施例及申請專利範圍。若實施例或申請專利範圍因此係關於「用於治療疑似罹患疾病之人類或動物的化合物」，則此亦被視為揭示「化合物在製造用於治療疑似罹患疾病之人類或動物之藥劑中的用途」或「藉由向疑似罹患疾病之人類或動物投與化合物進行治療之方法」。措辭「用於治療、調節等的化合物、組合物、產物等」應理解為係指適合於治療、調節等指定目的之化合物、組合物、產物等本身。
若在下文中將術語、值、數目等的實例提供於括號中，則此應理解為指示括號中提及之實例可構成實施例。舉例而言，若其陳述為「在實施例中，核酸分子包含與表1之指環病毒ORF1編碼核苷酸序列(例如，表1之核酸序列的核苷酸571-2613)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列」，則一些實施例係關於包含與表1之核酸序列的核苷酸571-2613具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列的核酸分子。
如本文所用，術語「指環病毒科載體」係指衍生自或類似於指環病毒科病毒(例如，甲型細環病毒(Alphatorquevirus)、乙型細環病毒、丙型細環病毒(Gammatorquevirus)或雞貧血病毒)之運載體，其中該運載體包含包封於蛋白質外殼中之遺傳元件(例如，蛋白質外殼實質上保護遺傳元件免於DNA酶I消化)。在一些實施例中，指環病毒科載體包含衍生自甲型細環病毒、乙型細環病毒或丙型細環病毒之遺傳元件或與其高度類似(例如，與其至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致)之遺傳元件。在一些實施例中，指環病毒科載體包含蛋白質外殼，其包含衍生自甲型細環病毒、乙型細環病毒或丙型細環病毒(例如，甲型細環病毒ORF1、乙型細環病毒ORF1或丙型細環病毒ORF1)之衣殼蛋白或與其類似(例如，與其至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致)的蛋白質。在一些實施例中，包封於蛋白質外殼內涵蓋由蛋白質外殼100%覆蓋，以及小於100%覆蓋，例如95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更小。舉例而言，蛋白質外殼中可存在間隙或不連續處(例如使得蛋白質外殼可透過水、離子、肽或小分子)，只要遺傳元件保留在蛋白質外殼中或受保護免於經DNA酶I消化，例如在進入宿主細胞之前。在一些實施例中，指環病毒科載體經純化，例如其自其原始來源分離及/或實質上不含(＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%)其他組分。在一些實施例中，指環病毒科載體能夠將遺傳元件引入目標細胞(例如，經由感染)中。在一些實施例中，指環病毒科載體為感染性合成病毒顆粒。
如本文所用，術語「指環載體」係指一種運載體，其包含包封於蛋白質外殼中之遺傳元件，例如環狀DNA。如本文所用，「合成性指環載體」通常係指非天然存在的指環載體，例如具有不同於野生型病毒(例如本文所描述之野生型指環病毒)之序列。在一些實施例中，合成性指環載體經工程改造或重組，例如包含相對於野生型病毒基因體(例如本文所描述之野生型指環病毒基因體)含有差異或修飾的遺傳元件。在一些實施例中，包封於蛋白質外殼內涵蓋由蛋白質外殼100%覆蓋，以及小於100%覆蓋，例如95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更小。舉例而言，蛋白質外殼中可存在間隙或不連續處(例如使得蛋白質外殼可透過水、離子、肽或小分子)，只要遺傳元件保留在蛋白質外殼中，例如在進入宿主細胞之前。在一些實施例中，指環載體經純化，例如其自其原始來源分離及/或實質上不含(＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%)其他組分。
在一些實施例中，指環載體可包含核酸載體，其包含衍生自指環病毒基因體序列或其連續部分或與其高度類似(例如，與其至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致)之足夠的核酸序列，以允許封裝至蛋白質外殼(例如，衣殼)中，且進一步包含異源序列。在一些實施例中，核酸載體為病毒載體或裸核酸。在一些實施例中，核酸載體包含原生指環病毒序列或與其高度類似(例如，至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致)之序列的至少約50、60、70、71、72、73、74、75、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000或3500個連續核苷酸。在一些實施例中，指環載體進一步包含指環病毒ORF1、ORF2或ORF3中之一或多者。在一些實施例中，異源序列包含多選殖位點，包含異源啟動子，包含治療蛋白之編碼區，或編碼治療性核酸。在一些實施例中，衣殼為野生型指環病毒衣殼。在實施例中，指環載體包含本文所描述之遺傳元件，例如包含含有啟動子、編碼治療性效應物之序列及衣殼結合序列之遺傳元件。
如本文所用，術語「指環病毒非編碼區(NCR)」係指指環病毒基因體序列之非轉譯區序列，其在環狀基因體中僅自ORF2起始密碼子之上游延伸至僅在ORF3終止密碼子之下游的指環病毒基因體序列之非轉譯區。指環病毒NCR可包含「指環病毒5' NCR序列」及「指環病毒3' NCR序列」。在一些實施例中，指環病毒NCR序列為連續的。在一些實施例中，指環病毒NCR序列為非連續的。在一些實施例中，非連續指環病毒NCR序列之部分係藉由異源插入(例如包含重組酶雜合位點，例如本文所描述)間隔開。在一些實施例中，指環病毒NCR序列包含野生型指環病毒中發現之序列，且在其他實施例中，指環病毒NCR包含相對於最接近的指環病毒序列的一或多個突變。在一些實施例中，指環病毒NCR係由不包含指環病毒ORF2或ORF3編碼序列之核酸分子包含。在一些情況下，指環病毒NCR係指有義股、反義股或包含有義股及反義股兩者之雙股DNA。在一些情況下，本文中指環病毒NCR序列之列舉可指所列出之序列及/或其反向互補序列。
如本文所用，術語「指環病毒5' NCR」係指指環病毒基因體序列之非轉譯區序列，其僅自ORF2起始密碼子之上游通過5' UTR保守域延伸至指環病毒3' NCR序列；及與其具有同源性之序列。在一些實施例中，指環病毒5' NCR序列包含複製起點活性。在一些實施例中，指環病毒5' NCR序列為連續的。在一些實施例中，指環病毒5' NCR序列為非連續的。在一些實施例中，非連續指環病毒5' NCR序列之部分係藉由異源插入(例如包含重組酶雜合位點，例如本文所描述)間隔開。在一些實施例中，指環病毒5' NCR序列包含野生型指環病毒中發現之序列，且在其他實施例中，指環病毒5' NCR包含相對於最接近的指環病毒序列的一或多個突變。在一些情況下，指環病毒5' NCR係指有義股、反義股或包含有義股及反義股兩者之雙股DNA。在一些情況下，本文中指環病毒5' NCR序列之列舉可指所列出之序列及/或其反向互補序列。在環狀遺傳元件中，指環病毒5' NCR及指環病毒3' NCR可彼此直接相鄰(例如以形成指環病毒NCR)。展示指環病毒5' NCR與指環病毒3' NCR之間的例示性分割點，例如本文所描述。
如本文所用，術語「指環病毒3' NCR」係指指環病毒基因體序列之非轉譯區序列，其僅自ORF3終止密碼子之下游通過富GC區延伸至指環病毒5' NCR序列；及與其具有同源性之序列。在一些實施例中，指環病毒3' NCR序列為連續的。在一些實施例中，指環病毒3' NCR序列為非連續的。在一些實施例中，非連續指環病毒3' NCR序列之部分係藉由異源插入(例如包含重組酶雜合位點，例如本文所描述)間隔開。在一些實施例中，指環病毒3' NCR序列包含野生型指環病毒中發現之序列，且在其他實施例中，指環病毒3' NCR包含相對於最接近的指環病毒序列的一或多個突變。在一些情況下，指環病毒3' NCR係指有義股、反義股或包含有義股及反義股兩者之雙股DNA。在一些情況下，本文中指環病毒3' NCR序列之列舉可指所列出之序列及/或其反向互補序列。
如本文所用，術語「指環病毒富GC區」係指具有野生型指環病毒之富GC區或其功能片段之活性及結構特徵的野生型或經工程改造之序列。在一些實施例中，功能片段之長度為至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸。通常，包含指環病毒富GC區之負股封裝於本文所描述之顆粒(例如指環病毒科載體)中。在一些實施例中，指環病毒富GC區為野生型指環病毒富GC區。在一些實施例中，指環病毒富GC區為經工程改造之指環病毒富GC區，其具有相對於最接近的野生型指環病毒富GC區序列具有至少一個差異的核酸序列。
如本文所用，術語「指環病毒5' UTR保守域」係指具有野生型指環病毒之指環病毒5' UTR保守域或其功能片段之活性及結構特徵的野生型或經工程改造之序列。在一些實施例中，功能片段之長度為至少15、20、30、40、50、60或70個核苷酸。通常，包含指環病毒5' UTR保守域之負股封裝於本文所描述之顆粒(例如指環病毒科載體)中。在一些實施例中，指環病毒5' UTR保守域為野生型指環病毒5' UTR保守域。在一些實施例中，指環病毒5' UTR保守域為經工程改造之指環病毒5' UTR保守域，其具有相對於最接近的野生型指環病毒5' UTR保守域序列具有至少一個差異的核酸序列。
如本文所用，術語「抗體分子」係指包含至少一個免疫球蛋白可變域序列之蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段。術語「抗體分子」涵蓋全長抗體及抗體片段(例如scFv)。在一些實施例中，抗體分子為多特異性抗體分子，例如該抗體分子包含複數個免疫球蛋白可變域序列，其中該複數個免疫球蛋白可變域序列中之第一免疫球蛋白可變域序列對第一抗原決定基具有結合特異性，且該複數個免疫球蛋白可變域序列中之第二免疫球蛋白可變域序列對第二抗原決定基具有結合特異性。在實施例中，多特異性抗體分子為雙特異性抗體分子。雙特異性抗體分子之特徵通常在於對第一抗原決定基具有結合特異性的第一免疫球蛋白可變域序列及對第二抗原決定基具有結合特異性的第二免疫球蛋白可變域序列。
如本文關於指環病毒科載體或指環病毒樣顆粒(anelloVLP)所用，術語「活體外組裝」係指形成包含ORF1分子之蛋白質外殼，其中該形成不會發生於細胞內部(例如發生於無細胞系統，諸如無細胞懸浮液、溶解物或上清液中)。在一些情況下，指環病毒科載體之活體外組裝包含在細胞外將遺傳元件(例如本文所描述)包封於蛋白質外殼內。在一些情況下，指環病毒樣顆粒之活體外組裝包含在細胞外將效應物(例如外源效應物，例如本文所描述)與蛋白質外殼締合(例如包封於蛋白質外殼內)。在一些情況下，蛋白質外殼之活體外組裝可在適合於複數個ORF1分子多聚合之條件(例如非變性條件)下發生，例如以形成超過10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個ORF1分子之多聚體。在一些情況下，活體外組裝使得形成包含至少約20、30、40、50或60個ORF1分子或約20-30、30-40、40-50、50-60或60-70個ORF1分子之蛋白質外殼。在一些情況下，蛋白質外殼係藉由在細胞中產生且隨後自其純化之ORF1分子形成。在一些情況下，活體外組裝發生於不含細胞或其成分之溶液中。在其他情況下，活體外組裝發生於包含細胞碎片(例如來自溶解細胞)之溶液中。在一些情況下，活體外組裝發生於實質上不含細胞核酸分子(例如來自細胞的基因體DNA、粒線體DNA、mRNA及/或非編碼RNA)的溶液中。
如本文所用，「編碼」之核酸係指編碼胺基酸序列或功能性聚核苷酸(例如非編碼RNA，例如siRNA或miRNA)的核酸序列。
如本文所用，「外源」藥劑(例如效應物、核酸(例如RNA)、基因、有效負載、蛋白質)係指對應野生型病毒(例如本文所描述之指環病毒)不包含或不編碼的藥劑。在一些實施例中，外源藥劑(exogenous agent)並非天然存在，諸如具有相對於天然存在之蛋白質或核酸改變(例如藉由插入、缺失或取代)之序列的蛋白質或核酸。在一些實施例中，外源藥劑並不天然存在於宿主細胞中。在一些實施例中，外源藥劑天然存在於宿主細胞中，但對於病毒而言為外源性的。在一些實施例中，外源藥劑天然存在於宿主細胞中，但不以所需水平或在所需時間存在。
如本文關於另一藥劑或元件(例如效應物、核酸序列、胺基酸序列)所用的「異源」藥劑或元件(例如效應物、核酸序列、胺基酸序列)係指並非天然地一起存在於例如野生型病毒(例如，指環病毒)中的藥劑或元件。在一些實施例中，異源核酸序列可與天然存在之核酸序列(例如指環病毒中天然存在之序列)存在於相同核酸中。在一些實施例中，異源藥劑或元件相對於指環載體之其他元件(例如剩餘部分)所基於的指環病毒為外源性的。
如本文所用，術語「遺傳元件」係指核酸序列，通常在指環載體中。應理解，遺傳元件可以裸DNA形式產生且視情況進一步組裝成蛋白質外殼。亦應理解，指環載體可將其遺傳元件插入至細胞中，使得遺傳元件存在於細胞中且蛋白質外殼不一定進入細胞。
如本文所用，術語「ORF1分子」係指具有指環病毒ORF1蛋白(例如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白，例如表A1至A3中所列出)或其功能片段之活性及/或結構特徵的多肽。在一些情況下，ORF1分子可包含以下中之一或多者(例如1、2、3或4者)：包含至少60%鹼性殘基(例如至少60%精胺酸殘基)之第一區、包含至少約六條β股(例如至少4、5、6、7、8、9、10、11或12條β股)之第二區、包含指環病毒N22域(例如本文所描述，例如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白的N22域)之結構或活性的第三區、及/或包含指環病毒C端域(CTD) (例如本文所描述，例如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白的CTD)之結構或活性的第四區。在一些情況下，ORF1分子以N端至C端次序包含第一區、第二區、第三區及第四區。在一些情況下，指環載體包含以N端至C端次序包含第一區、第二區、第三區及第四區之ORF1分子。在一些情況下，ORF1分子可包含由指環病毒ORF1核酸(例如表N1至N3中之任一者中所列出)編碼之多肽。在一些情況下，ORF1分子可進一步包含異源序列，例如高變區(HVR)，例如來自指環病毒ORF1蛋白之HVR，例如本文所描述。如本文所用，「指環病毒ORF1蛋白」係指由指環病毒基因體(例如野生型指環病毒基因體，例如本文所描述)編碼的ORF1蛋白，例如具有表A1至A3中所列出之胺基酸序列或由表N1至N3中之任一者中所列出之ORF1基因編碼的ORF1蛋白。
如本文關於ORF1分子所用，術語「ORF1域」係指具有指環病毒ORF1蛋白之結構或功能之ORF1分子的一部分。ORF1域通常能夠與ORF1域(例如其他ORF1分子中)之其他複本或與其他ORF1分子形成多聚體，例如以形成蛋白質外殼(例如本文所描述之指環載體或指環病毒樣顆粒之蛋白質外殼)。在一些情況下，ORF1分子可包含除ORF1域以外的一或多個額外域(例如，包含或連接至表面效應物之域)。在一些情況下，ORF1域之胺基酸序列包含插入(例如編碼表面部分或能夠結合至表面部分之域的插入)，例如介於ORF1域之N端末端與C端末端之間。在某些情況下，插入實質上不破壞ORF1域之結構及/或功能，例如使得ORF1域仍能夠與其他ORF1域或ORF1分子形成多聚體。ORF1域序列內進行插入之位置在本文中稱為「插入點」。可藉由此項技術中已知之任何基因或多肽工程改造方法插入ORF1域中。在一些實施例中，ORF1分子由ORF1域組成。在其他實施例中，ORF1分子包含ORF1域及異源域(例如本文所描述之表面部分)。在一些實施例中，ORF1域藉由多肽連接子區連接至表面部分。
如本文所用，術語「ORF2分子」係指具有指環病毒ORF2蛋白(例如本文所描述之指環病毒ORF2蛋白，例如表A1至A3中所列出)或其功能片段之活性及/或結構特徵的多肽。如本文所用，「指環病毒ORF2蛋白」係指由指環病毒基因體(例如野生型指環病毒基因體，例如本文所描述)編碼的ORF2蛋白，例如具有表A1至A3中所列出之胺基酸序列或由表N1至N3中之任一者中所列出之ORF2基因編碼的ORF2蛋白。
如本文所用，術語「顆粒」係指直徑小於100 nm (例如約20-25、25-30、30-35或35-40 nm)的包含蛋白質外殼之運載體。在一些情況下，顆粒包含複數個ORF1分子。顆粒之蛋白質外殼通常形成能夠限制或阻止某些分子在蛋白質外殼的內部與外部之間的移動的包封。在一些實施例中，蛋白質外殼中可存在間隙或不連續處(例如使得蛋白質外殼可透過水、離子、肽或小分子)。在某些實施例中，空隙或不連續處的尺寸(例如直徑)足夠小，以便蛋白質外殼限制或阻止一或多個大型巨分子(例如肽、多肽、聚核苷酸、脂質或多醣)穿過蛋白質外殼。
如本文所用，術語「蛋白質外殼」係指主要為(例如＞50%、＞60%、＞70%、＞80%、＞90%)蛋白質之外部組分。
如本文所用，術語「調節核酸」係指修飾編碼表現產物之DNA序列之表現(例如轉錄及/或轉譯)的核酸序列。在實施例中，表現產物包含RNA或蛋白質。
如本文所用，術語「調節序列」係指修飾目標基因產物之轉錄的核酸序列。在一些實施例中，調節序列為啟動子或強化子。
如本文所用，術語「複製蛋白」係指在感染、病毒基因體複製/表現、病毒蛋白合成及/或病毒組分組裝期間利用的蛋白質，例如病毒蛋白。
如本文所用，「實質上非病原性」生物體、顆粒或組分係指例如在宿主生物體(例如哺乳動物，例如人類)中不會引起或誘導可偵測之疾病或病原性病狀的生物體、顆粒(例如病毒或指環載體，例如本文所描述)或其組分。在一些實施例中，向個體投與指環載體可引起作為照護標準之一部分可接受的輕微反應或副作用。
如本文所用，術語「非病原性」係指例如在宿主生物體(例如哺乳動物，例如人類)中不會引起或誘導可偵測之疾病或病原性病狀的生物體或其組分。
如本文所用，「實質上非整合型」遺傳元件係指一種遺傳元件，例如病毒或指環載體(例如本文所描述)中之遺傳元件，其中進入宿主細胞(例如真核細胞)或生物體(例如哺乳動物，例如人類)中的小於約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%或1%之遺傳元件整合至基因體中。在一些實施例中，遺傳元件不可偵測地整合至例如宿主細胞之基因體中。在一些實施例中，可使用本文所描述之技術，例如核酸定序、PCR偵測及/或核酸雜合來偵測遺傳元件於基因體中之整合。
如本文所用，「實質上非免疫原性」生物體、顆粒或組分係指例如在宿主組織或生物體(例如哺乳動物，例如人類)中不會引起或誘導非所需或非靶向免疫反應的生物體、顆粒(例如病毒或指環載體，例如本文所描述)或其組分。在一些實施例中，實質上非免疫原性生物體、顆粒或組分不產生可偵測的免疫反應。在一些實施例中，實質上非免疫原性指環載體不產生針對蛋白質的可偵測免疫反應，該蛋白質包含胺基酸序列或由表N1至N3中之任一者中所示的核酸序列編碼。在一些實施例中，免疫反應(例如，非所需或非靶向免疫反應)係藉由例如根據Tsuda等人(1999; J. Virol. Methods77: 199-206；以引用之方式併入本文中)中所描述之抗TTV抗體偵測方法及/或Kakkola等人(2008; Virology382: 182-189；以引用之方式併入本文中)中所描述的用於測定抗TTV IgG含量之方法，分析個體中之抗體存在或含量(例如抗指環載體抗體之存在或含量，例如針對本文所描述之指環載體之抗體的存在或含量)來偵測。針對指環病毒或基於指環病毒之指環載體的抗體亦可藉由此項技術中用於偵測抗病毒抗體之方法，例如偵測抗AAV抗體之方法，例如Calcedo等人(2013; Front. Immunol.4(341): 1-7；以引用之方式併入本文中)中所描述來偵測。
如本文所用，「子序列」係指分別包含於較大核酸序列或胺基酸序列中的核酸序列或胺基酸序列。在一些情況下，子序列可包含較大序列之域或功能片段。在一些情況下，子序列可包含較大序列的片段，該片段在自較大序列分離時能夠形成二級及/或三級結構，該等二級及/或三級結構類似於該子序列在與較大序列之其餘部分一起存在時所形成的二級及/或三級結構。在一些情況下，子序列可經另一序列(例如包含外源序列或與較大序列之其餘部分異源的序列的子序列，例如來自不同指環病毒之對應子序列)置換。
如本文所用，術語「表面部分」係指至少一部分暴露於顆粒外部表面(例如暴露於顆粒周圍之溶液)的部分。表面部分通常直接地或間接地連接至顆粒之蛋白質外殼的組分(例如ORF1分子)。在一些情況下，表面部分共價連接至顆粒之蛋白質外殼的組分(例如ORF1分子)。在一些情況下，表面部分非共價連接至顆粒之蛋白質外殼的組分(例如ORF1分子)。在一些情況下，表面部分結合至結合部分，該結合部分繼而連接(例如共價或非共價連接)至顆粒之蛋白質外殼的組分(例如ORF1分子)。在一些情況下，表面部分包含於ORF1分子(例如ORF1分子之異源域)中。在一些情況下，表面部分相對於指環病毒(例如衍生ORF1分子的指環病毒及/或其中ORF1蛋白與ORF1分子具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的指環病毒)係外源性的。在一些情況下，表面部分相對於顆粒感染之目標細胞(例如哺乳動物細胞，例如人類細胞)係外源性的。
如本文所用，「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其同源詞係指對意欲改善、減輕、穩定、預防或治癒疾病、病理性病狀或病症之個體的醫學管理。此術語包括主動性治療(針對改善疾病、病理性病狀或病症之治療)、病因性治療(針對相關疾病、病理性病狀或病症之病因的治療)、緩解性治療(針對症狀緩解而設計之治療)、預防性治療(針對預防、最小化或部分或完全地抑制相關疾病、病理性病狀或病症之發展的治療)及支援性治療(用於補充另一療法之治療)。
本發明大體上係關於指環病毒科載體(例如，指環載體)，例如合成性指環病毒科載體(例如，指環載體)，及其用途。本揭露提供指環病毒科載體(例如，指環載體)、包含指環病毒科載體(例如，指環載體)之組合物及製備或使用指環病毒科載體(例如，指環載體)之方法。指環病毒科載體(例如，指環載體)通常適用作遞送運載體，例如用於遞送治療劑至真核生物細胞。一般而言，指環病毒科載體(例如，指環載體)將包括包含包封於蛋白質外殼內之核酸序列(例如編碼效應物，例如外源效應物或內源效應物)的遺傳元件。指環病毒科載體(例如，指環載體)可包括相對於指環病毒序列(例如本文所描述)之序列(例如本文所描述之區域或域)的一或多個缺失。指環病毒科載體(例如，指環載體)可用作用於將遺傳元件或其中編碼之效應物(例如，多肽或核酸效應物，例如本文所描述)遞送至真核細胞中，例如以治療包含該等細胞之個體的疾病或病症的實質上非免疫原性運載體。
目錄 I.指環病毒科載體(例如，指環載體) A.指環病毒科病毒(例如，指環病毒) i.核酸序列 ii.由核酸序列編碼之胺基酸序列 iii.包含胺基酸序列之蛋白質 iv.包含胺基酸序列之多肽 B.衣殼蛋白(例如，ORF1分子) i. N22域中之保守ORF1模體 ii.例示性ORF1序列 iii.鑑別ORF1蛋白序列 C. ORF2分子 i.保守ORF2模體 D.遺傳元件 E.蛋白質結合序列 F. 5' UTR保守域 G.富GC區 H.效應物 I.表面部分 II.用於製備指環病毒科載體之組合物及方法 A.遺傳元件構築體 i.串聯構築體 ii.順式/反式構築體 B.遺傳元件及指環載體的基於重組酶之產生 i.自複製救援(SRR)構築體(例如SRR質體) ii.例示性位點特異性重組酶及重組酶識別位點 C.宿主細胞及使用宿主細胞產生指環載體之方法 i.將遺傳元件引入宿主細胞中 ii.例示性細胞類型 D.培養條件 E.收穫 F.活體外組裝方法 G.富集及純化 III.醫藥組合物 IV.使用方法 V.再給藥
I.指環病毒科載體(例如，指環載體) 在一些態樣中，本文所描述之本發明包含使用及製備指環病毒科載體(例如，指環載體)、指環病毒科載體(例如，指環載體)製劑及治療組合物的組合物及方法。在一些實施例中，指環載體具有基於指環病毒科病毒(例如，本文所描述之指環病毒)的序列、結構及/或功能。應理解，本文關於指環載體所描述之適用實施例亦可應用於指環病毒科載體(例如，基於或源自雞貧血病毒(chicken anemia virus；CAV)之載體，例如本文所描述)。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)包含含有表A1至A3 (例如，表A1、A2或A3)；或表N1至N3 (例如，表N1、N2或N3)中所示之序列或其片段或部分的核酸或多肽，或其他實質上非病原性病毒，例如共生病毒(symbiotic virus)、共生病毒(commensal virus)、原生病毒。在一些實施例中，基於指環病毒科病毒之載體包含至少一個對於該指環病毒科病毒具有外源性之元件，例如安置於載體之遺傳元件內的外源效應物或編碼外源效應物之核酸序列。在一些實施例中，基於指環病毒科病毒之載體包含至少一個與來自該指環病毒科病毒之另一元件異源的元件，例如與另一連接的核酸序列(諸如啟動子元件)異源之效應物編碼核酸序列。在一些實施例中，指環病毒科載體包含遺傳元件(例如環狀DNA，例如單股DNA)，其包含至少一個相對於遺傳元件之其餘部分及/或蛋白質外殼(例如，編碼例如本文所描述之效應物的外源元件)為異源的元件。指環病毒科載體可為用於有效負載至宿主(例如，人類)中之遞送運載體(例如，實質上非病原性遞送運載體)。在一些實施例中，指環病毒科載體能夠在真核生物細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞中複製。在一些實施例中，指環病毒科載體在哺乳動物(例如，人類)細胞中為實質上非病原性的及/或實質上非整合的。在一些實施例中，指環病毒科載體在哺乳動物(例如，人類)中為實質上非免疫原性的。在一些實施例中，指環病毒科載體為複製缺陷型。在一些實施例中，指環病毒科載體為複製勝任型。
在一個態樣中，本發明包括一種指環病毒科載體，其包含： a)遺傳元件，其包含(i)編碼外部蛋白質(例如非病原性外部蛋白質)之序列、(ii)將遺傳元件結合至非病原性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列及(iii)編碼效應物(例如內源或外源效應物)之序列；及 b)蛋白質外殼，其與遺傳元件締合，例如圍封或包封該遺傳元件。
在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)包括來自無包膜環狀單股DNA病毒(或與其具有＞70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、100%同源性)之序列或表現產物。動物環狀單股DNA病毒通常係指單股DNA (ssDNA)病毒之子組，其感染真核非植物宿主，且具有環狀基因體。因此，動物環狀ssDNA病毒可與感染原核生物之ssDNA病毒(亦即，微病毒科(Microviridae)及絲狀病毒科(Inoviridae))及感染植物之ssDNA病毒(亦即，雙生病毒科(Geminiviridae)及矮化病毒科(Nanoviridae))區分。其亦可與感染非植物真核生物之線性ssDNA病毒(亦即細小病毒科(Parvoviridiae))區分。
在一些實施例中，遺傳元件包含啟動子元件。在一些實施例中，啟動子元件係選自RNA聚合酶II依賴性啟動子、RNA聚合酶III依賴性啟動子、PGK啟動子、CMV啟動子、EF-1α啟動子、SV40啟動子、CAGG啟動子、或UBC啟動子、TTV病毒啟動子、組織特異性U6 (pollIII)、具有活化蛋白(TetR-VP16、Gal4-VP16、dCas9-VP16等)之上游DNA結合位點的最小CMV啟動子。在一些實施例中，啟動子元件包含TATA盒。在一些實施例中，啟動子元件對於例如本文所描述之野生型指環病毒科病毒(例如，指環病毒)為內源性的。
在一些實施例中，遺傳元件包含以下特徵中之一或多者：單股、環狀、負股及/或DNA。在一些實施例中，排除效應物之遺傳元件之部分的組合尺寸為約2.5-5 kb (例如約2.8-4 kb、約2.8-3.2 kb、約3.6-3.9 kb或約2.8-2.9 kb)、小於約5 kb (例如，小於約2.9 kb、3.2 kb、3.6 kb、3.9 kb或4 kb)或至少100個核苷酸(例如至少1 kb)。
在一些實施例中，複製缺乏型、複製缺陷型或複製非勝任型遺傳元件不編碼複製遺傳元件所需之所有必需機構或組件。在一些實施例中，複製缺乏型遺傳元件不編碼複製因子。在一些實施例中，複製缺陷型遺傳元件不編碼一或多個ORF (例如ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3及/或ORF2t/3，例如本文所描述)。在一些實施例中，不由遺傳元件編碼之機構或組件可以反式形式提供(例如使用輔助成分，例如輔助病毒或輔助質體，或編碼於宿主細胞所包含之核酸中，例如整合至宿主細胞之基因體中)，例如使得遺傳元件可在以反式形式提供之機構或組件存在下經歷複製。
在一些實施例中，封裝缺乏型、封裝缺陷型或封裝非勝任型遺傳元件無法封裝至蛋白質外殼(例如其中蛋白質外殼包含衣殼或其部分，例如包含由ORF1核酸編碼之多肽，例如本文所描述)中。在一些實施例中，封裝缺乏型遺傳元件係以與野生型指環病毒科病毒(例如，指環病毒) (例如本文所描述)相比低於10% (例如，低於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%)之效率封裝至蛋白質外殼中。在一些實施例中，封裝缺陷型遺傳元件不能封裝至蛋白質外殼中，即使在準許封裝野生型指環病毒科病毒(例如，指環病毒) (例如本文所描述)之遺傳元件的因子(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下。在一些實施例中，封裝缺乏型遺傳元件係以與野生型指環病毒科病毒(例如，指環病毒) (例如本文所描述)相比低於10% (例如，低於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%或0.001%)之效率封裝至蛋白質外殼中，即使在準許封裝野生型指環病毒科病毒(例如，指環病毒) (例如本文所描述)之遺傳元件的因子(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下。
在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件可封裝至蛋白質外殼(例如其中蛋白質外殼包含衣殼或其部分，例如包含由ORF1核酸編碼之多肽，例如本文所描述)中。在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件係以與野生型指環病毒科病毒(例如，指環病毒) (例如本文所描述)相比至少20% (例如，至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%或更高)之效率封裝至蛋白質外殼中。在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件可在準許封裝野生型指環病毒科病毒(例如，指環病毒) (例如本文所描述)之遺傳元件的因子(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下，封裝至蛋白質外殼中。在一些實施例中，封裝勝任型遺傳元件係在準許封裝野生型指環病毒科病毒(例如，指環病毒) (例如本文所描述)之遺傳元件的因子(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3)存在下，以與野生型指環病毒科病毒(例如，指環病毒) (例如本文所描述)相比至少20% (例如，至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%或更高)之效率封裝至蛋白質外殼中。
指環病毒科病毒(例如，指環病毒) 在一些實施例中，例如本文所描述之指環病毒科載體包含源自指環病毒之序列或表現產物。在一些實施例中，指環病毒科載體包括相對於指環病毒為外源性的一或多種序列或表現產物。在一些實施例中，指環病毒科載體包括相對於指環病毒為內源性的一或多種序列或表現產物。在一些實施例中，指環病毒科載體包括相對於指環病毒科載體中之一或多種其他序列或表現產物為異源的一或多種序列或表現產物。指環病毒科病毒(例如，指環病毒)通常具有帶有負極性之單股環狀DNA基因體。
應理解，本文關於指環載體所描述之適用實施例亦可應用於指環病毒科載體(例如，基於或源自雞貧血病毒(CAV)之載體，例如本文所描述)。雞貧血病毒以及其組合物及用途之實例描述於PCT公開案第WO/2022/094238號中，其以全文引用的方式併入本文中，包括其中表1A及1B之序列。
在一些實施例中，遺傳元件包含編碼胺基酸序列或其功能片段或與本文所描述之胺基酸序列(例如指環病毒胺基酸序列)中之任一者具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的核苷酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之指環病毒科載體包含含有與例如本文所描述之指環病毒序列或其片段具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的一或多種核酸分子(例如，本文所描述之遺傳元件)。在實施例中，指環病毒科載體包含選自表N1至N3中之任一者中所示之序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的核酸序列。在實施例中，指環病毒科載體包含含有表A1至A3中所示之序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的多肽。
在一些實施例中，本文所描述之指環病毒科載體包含一或多種核酸分子(例如，本文所描述之遺傳元件)，該一或多種核酸分子包含與以下中之一或多者具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列：本文所描述之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) (例如，所標註的或由表N1至N3中之任一者中所列出之序列編碼的指環病毒科病毒(例如，指環病毒)序列)中之任一者的TATA盒、加帽位點、起始元件、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三個開放閱讀框架區、poly(A)信號、富GC區，或其任何組合。在一些實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白例如本文所描述之指環病毒(例如，所標註的或由表N1至N3中之任一者中所列出之序列編碼的指環病毒科病毒(例如，指環病毒)序列)中之任一者的ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白包含與指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1或ORF2蛋白(例如，表A1至A3中所示之ORF1或ORF2胺基酸序列，或由表N1至N3中之任一者中所示之核酸序列編碼的ORF1或ORF2胺基酸序列)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在實施例中，核酸分子包含編碼衣殼蛋白之序列，該衣殼蛋白包含與指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1蛋白(例如，表A1至A3中所示之ORF1胺基酸序列，或由表N1至N3中之任一者中所示之核酸序列編碼的ORF1胺基酸序列)具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
核酸序列 在一些實施例中，核酸分子包含與表N1至N3中之任一者之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表N1至N3中之任一者之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF2核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表N1至N3中之任一者之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF3核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表N1至N3中之任一者之指環病毒科病毒(例如，指環病毒)富GC區核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含與表N1至N3中之任一者之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) 5' UTR保守域核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。
應理解，本文中之表N1至N3提供對應於特定指環病毒之正股序列。然而，如本文所描述，遺傳元件通常為負股(例如，包含表N1至N3中之任一者中所列出之核酸序列之反向互補序列，或其部分)。因此，本文所描述之遺傳元件的5' UTR保守域可包含標註為5' UTR保守域(例如，在表N1至N3中之任一者中)之序列的反向互補序列。因此，本文所描述之遺傳元件的富GC區可包含標註為富GC區(例如，在表N1至N3中之任一者中)之序列的反向互補序列。
在一些實施例中，指環病毒為甲型細環病毒。在一些實施例中，指環病毒為乙型細環病毒。在一些實施例中，指環病毒為丙型細環病毒。
在一些實施例中，指環病毒為Ring1、Ring3.1、Ring4、Ring5.2、Ring6.0、Ring7、Ring9、Ring10或Ring20指環病毒。
Ring1指環病毒基因體序列揭示為國際申請案PCT/US2021/037076之SEQ ID NO: 16，且對應胺基酸序列揭示於同一國際申請案之表A2中，且序列以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2021/037076之SEQ ID NO: 16之富GC區的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2021/037076之SEQ ID NO: 16之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。Ring3.1指環病毒基因體序列揭示為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 878，且對應胺基酸序列揭示於同一國際申請案之表B4中，且序列以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 878之富GC區核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 878之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。Ring4指環病毒基因體序列揭示為國際申請案PCT/US2021/037076之SEQ ID NO: 886，且對應胺基酸序列揭示於同一國際申請案之表C2中，且序列以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2021/037076之SEQ ID NO: 886之富GC區核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2021/037076之SEQ ID NO: 886之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。Ring5.2指環病毒基因體序列揭示為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 894，且對應胺基酸序列揭示於同一國際申請案之表D2中，且序列以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 894之富GC區核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 894之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。Ring6.0指環病毒基因體序列揭示為國際申請案PCT/US2019/065995之SEQ ID NO: 903，且對應胺基酸序列揭示於同一國際申請案之表C4中，且序列以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2019/065995之SEQ ID NO: 903之富GC區核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2019/065995之SEQ ID NO: 903之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。Ring7指環病毒基因體序列揭示為國際申請案PCT/US2019/065995之SEQ ID NO: 911，且對應胺基酸序列揭示於同一國際申請案之表C5中，且序列以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2019/065995之SEQ ID NO: 911之富GC區核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2019/065995之SEQ ID NO: 911之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。Ring9指環病毒基因體序列揭示為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 1001，且對應胺基酸序列揭示於同一國際申請案之表F2中，且序列以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 1001之富GC區核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 1001之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。Ring10指環病毒基因體序列揭示為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 1008，且對應胺基酸序列揭示於同一國際申請案之表F4中，且序列以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 1008之富GC區核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 1008之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。Ring20指環病毒基因體序列揭示為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 1014，且對應胺基酸序列揭示於同一國際申請案之表F6中，且序列以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 1014之富GC區核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為國際申請案PCT/US2022/015499之SEQ ID NO: 1014之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。
由核酸序列編碼之胺基酸序列 在實施例中，核酸分子包含編碼與表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含編碼與表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF2胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的核酸序列。在實施例中，核酸分子包含編碼與表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF3胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，核酸為遺傳元件構築體或用於以反式形式提供多肽(例如ORF1分子及/或ORF2分子)之構築體。
包含胺基酸序列之蛋白質 在一些實施例中，本文所描述之指環病毒科載體包含指環病毒ORF或ORF分子(例如，指環病毒ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2)，其包括包含與例如本文所描述之對應指環病毒ORF序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的多肽。在實施例中，本文所描述之指環病毒科載體包含具有與表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的蛋白質。在實施例中，本文所描述之指環病毒科載體包含具有與表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF2胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的蛋白質。在實施例中，本文所描述之指環病毒科載體包含具有與表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF3胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列的蛋白質。
在一些實施例中，ORF1分子具有與國際申請案PCT/US2021/037076之表A2之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF1分子具有與國際申請案PCT/US2022/015499之表B4之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF1分子具有與國際申請案PCT/US2021/037076之表C2之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF1分子具有與國際申請案PCT/US2022/015499之表D2之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF1分子具有與國際申請案PCT/US2019/065995之表C4之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF1分子具有與國際申請案PCT/US2019/065995之表C5之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF1分子具有與國際申請案PCT/US2022/015499之表F2之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF1分子具有與國際申請案PCT/US2022/015499之表F4之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF1分子具有與國際申請案PCT/US2022/015499之表F6之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，ORF1分子(例如包含於指環病毒科載體中)包含由表N1至N3中之任一者之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1核酸序列編碼的多肽。在一些實施例中，ORF1分子(例如包含於指環病毒科載體中)包含表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1蛋白，或其剪接變異體或轉譯後處理(例如蛋白水解處理)變異體。在一些實施例中，ORF2分子(例如包含於指環病毒科載體中)包含由表N1至N3中之任一者之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF2核酸序列編碼的多肽。在一些實施例中，ORF2分子(例如包含於指環病毒科載體中)包含表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF2蛋白，或其剪接變異體或轉譯後處理(例如蛋白水解處理)變異體。在一些實施例中，ORF3分子(例如包含於指環病毒科載體中)包含由表N1至N3中之任一者之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF3核酸序列編碼的多肽。在一些實施例中，ORF3分子(例如包含於指環病毒科載體中)包含表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF3蛋白，或其剪接變異體或轉譯後處理(例如蛋白水解處理)變異體。
包含胺基酸序列之多肽 在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與本文所描述之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在實施例中，本文所描述之多肽包含與表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由本文所描述之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1核酸編碼之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由表N1至N3中所列出之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF1核酸編碼之ORF1分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與本文所描述之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF2胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在實施例中，本文所描述之多肽包含與表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF2胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由本文所描述之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF2核酸編碼之ORF2分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由表N1至N3中所列出之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF2核酸編碼之ORF2分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與本文所描述之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF3胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在實施例中，本文所描述之多肽包含與表A1至A3之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF3胺基酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由本文所描述之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF3核酸編碼之ORF3分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之多肽包含與由表N1至N3中所列出之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) ORF3核酸編碼之ORF3分子具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，多肽包含表A1至A3中所示之胺基酸序列(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3或ORF2t/3序列)，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
Ring19為自RPE細胞分離之指環病毒。在一些實施例中，本文所描述之方法包含遞送指環載體(例如與Ring19具有序列類似性之指環載體)至眼組織(例如個體之眼睛)，例如視網膜組織及/或RPE細胞。 表N1. 例示性指環病毒核酸序列(乙型細環病毒)。
名稱 RING 19
屬/ 進化枝 乙型細環病毒
來源組織 視網膜色素上皮
寄存編號 N/A
全序列：2876 bp
註釋：
推定域 鹼基範圍
ORF1 283 - 2250
ORF2 101 - 391
ORF3 2277 - 2462
富GC區 2515 - 2615
5' UTR保守域或其部分 1 - 71
表A1. 例示性指環病毒胺基酸序列(乙型細環病毒)
RING 19 (乙型細環病毒)
ORF1 MPWYPRRRYPRRRYRWLRRWRARRPFRPRYRRRYWVRNYSRKRKLFKITTKEWQPKVIRKTHVKGTYPLFLCTKHRINNNMIQYLDSIAPEHYYGGGGFSIMQFSLQALYEEFIKAKNWWTNTNCFLPLVRYMGCSFKFYKTEFYDYIVLIERCYPLACTDEMYLSTQPSIMMLTRKCIFVPCKQNSKGKKPYKKVRVRPPSQMTTGWHFSQDLANMPLVVLKTSVCSFDRYYTDSTAKSTTIGFKTLNTQTFRYHDWQEPPTTGYKPQNLLWFYGAENGSPVDPNNTIVSNLIYLGGTGPYEKGTPIKTNISNYFSEPKLWGNIFHDDYTSGTSPVFVTNKSPSEIKTAWNTIKDLTVKASGVFTLRTIPLWLPCRYNPFADKATNNKIWLVSIHSDHTEWKPIDNPLLQRTDLPLWLLVWGWQDWQKKNQQTSQPDINYLTVISSPYISCYPKLDYYVLLDEGFWEGHSTYIESITDSDKKHWYPKNRFQIETLNLIANTGPGTVKLRENQAAEGHMVYRFNFKLGGCPAPMEKICDPSKQSKYPIPNNQQQTTSLQSPENPIQTYLYDFDERRGLLTERATKRIKQDHTSEKTVLPFTGAATDLPILQTTSQEESSSEEEEEQQAEKKLLQLRRKQHRLRERILQLLDIQNT (SEQ ID NO: 2)
ORF2 MQIQPPIRTFKQTISDWKNLIVHVHDNICNCNKPLEHTIDTCITNPDELRLNKSTKQQLQKCLGTPEEDTQEDVIDGFADGELDALFAQDTEEDTG (SEQ ID NO: 173)
ORF3 MFGDTHVPNRRMTPEEFEQELIVAGVFRRPPCYYIKDRPTYPYVPKPTDEKCMVNFDLNFP (SEQ ID NO: 4)
表N2. 例示性指環病毒核酸序列(乙型細環病毒)。
名稱 Ring2
屬/進化枝 乙型細環病毒
寄存編號 JX134045.1
全序列：2797 bp
註釋：
推定域 鹼基範圍
TATA盒 237- 243
加帽位點 260 - 267
轉錄起始位點 267
5' UTR保守域 323 - 393
ORF2 424 - 723
ORF2/2 424 - 719; 2274 - 2589
ORF2/3 424 - 719; 2449 - 2812
ORF1 612 - 2612
ORF1/1 612 - 719; 2274 - 2612
ORF1/2 612 - 719; 2449 - 2589
三個開放閱讀框架區 2441 - 2586
Poly(A)信號 2808 - 2813
富GC區 2868 - 2929
表A2. 例示性指環病毒胺基酸序列(乙型細環病毒)
Ring2 ( 乙型細環病毒)
ORF2 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEG (SEQ ID NO: 55)
ORF2/2 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEGFNIPYPVTSMKQLRYRVQGKPQNPSYTPSTIDTGTTQQQLCHELAKTGHLKTLFLKLQSQIDSNCSNKPSNACKSRKKRRRKKKKKYSSSSATSDSSSSCTESE (SEQ ID NO: 56)
ORF2/3 MSDCFKPTCYNNKTKQTHWINNLHLTHDLICFCPTPTRHLLLALAEQQETIEVSKQEKEKITRCLITTEEDGTTTDVLDGMDEVGLDALFAEDFEEKEGARSTATAQTSPRMPANLGRNAGEKRKRSTAAHQQPQTAAAAVQRANNIIIKGPITFNCVKKVKLFDDKPKNRRFTPEEFETELQIAKWLKRPPRSFVNDPPFYPWLPPEPVVNFKLNFTE (SEQ ID NO: 57)
ORF1 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRVRPTYTTIPLKQWQPPYKRTCYIKGQDCLIYYSNLRLGMNSTMYEKSIVPVHWPGGGSFSVSMLTLDALYDIHKLCRNWWTSTNQDLPLVRYKGCKITFYQSTFTDYIVRIHTELPANSNKLTYPNTHPLMMMMSKYKHIIPSRQTRRKKKPYTKIFVKPPPQFENKWYFATDLYKIPLLQIHCTACNLQNPFVKPDKLSNNVTLWSLNTISIQNRNMSVDQGQSWPFKILGTQSFYFYFYTGANLPGDTTQIPVADLLPLTNPRINRPGQSLNEAKITDHITFTEYKNKFTNYWGNPFNKHIQEHLDMILYSLKSPEAIKNEWTTENMKWNQLNNAGTMALTPFNEPIFTQIQYNPDRDTGEDTQLYLLSNATGTGWDPPGIPELILEGFPLWLIYWGFADFQKNLKKVTNIDTNYMLVAKTKFTQKPGTFYLVILNDTFVEGNSPYEKQPLPEDNIKWYPQVQYQLEAQNKLLQTGPFTPNIQGQLSDNISMFYKFYFKWGGSPPKAINVENPAHQIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 58)
ORF1/1 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRIQYPIPRNEHETTSLQSPGEAPESILYSFDYRHGNYTTTALSRISQDWALKDTVSKITEPDRQQLLKQALECLQISEETQEKKEKEVQQLISNLRQQQQLYRERIISLLKDQ (SEQ ID NO: 59)
ORF1/2 MPYYYRRRRYNYRRPRWYGRGWIRRPFRRRFRRKRRSQIDSNCSNKPSNACKSRKKRRRKKKKKYSSSSATSDSSSSCTESE (SEQ ID NO: 60)
表N3. 例示性指環病毒核酸序列(甲型細環病毒)。
名稱 Ring18
屬/進化枝 甲型細環病毒
來源組織
寄存編號 N/A
全序列：3733 bp
註釋：
推定域 鹼基範圍
TATA盒 67 - 71
加帽位點 88 - 95
轉錄起始位點 95
5' UTR保守域 155 - 225
ORF2 325 - 687
TAIP 347 - 508
ORF2/2 325 - 683, 2295 - 2790
ORF2/3 325- 683, 2488 - 2962
ORF1 561 - 2771
ORF1/1 561 - 683, 2295 - 2771
ORF1/2 561 - 683, 2488 - 2790
三個開放閱讀框架區 2447 - 2771
Poly(A)信號 2958 - 2963
富GC區 3627 - 3718
表A3. Ring 18 (甲型細環病毒)之例示性指環病毒胺基酸序列
ORF1 MAWGFWGRRRRWRRWRPRRRRWRPRRRRRRRPARRFRARRRVRRRGGRWRRRYRKWRRGRRRRTHRKKIVIKQWQPNFIRRCYIIGYLPLIFCGENTTAQNYATHSDDMISKGPYGGGMTTTKFTLRILYDEFTRFMNFWTVSNEDLDLCRYVGCKLIFFKHPTVDFIVQINTQPPFLDTHLTAASIHPGIMMLSKRRILIPSLKTRPSRKHRVVVRVGAPRLFQDKWYPQSDLCDTVLLSIFATACDLQYPFGSPLTDNPCVNFQILGPQYKKHLSISSTMDTTNKQHYDSNLFNQTQLYNTFQTIAQLKETGQTANISPSWSAVQNNMALSNTGENATQSKDTWYKGNTYNNHITTLAQKTRERFKGATKAALQNYPTIMSTDLYEYHSGIYSSIFLSAGRSYFETTGAYSDIIYNPFTDKGTGNIIWIDYLTKEDTIFVKNKSKCEIMDMPLWAACTGYTEFCAKYTGDSAIIYNARVLIRCPYTEPMLIDHSDPNKGFVPYSFNFGNGKMPGGSSNVPIRMRAKWYVNIFHQKEVLETIVQSGPFGYKGDIKSAVLAMKYRFHWKWGGNPISKQVVRNPCSNSSSSAAHRGPRSVQAVDPKYNTPEVTWHSWDIRRGLFGKAGIKRMQQESDALYIPPGPFKRPRRDTNAQDPEEQNESSGFRVQQRLPWVHSSQETQSSQEETEAQGSVQDQLLLQLREQRVLRLQLQQLATQVLKVQAGHGIHPLLSSQA (SEQ ID NO: 1100)
ORF1/1 MAWGFWGRRRRWRRWRSRRRRWRPRRRRRRRPARRFRARRRVVRNPCSNSSSSAAHRGPRSVQAVDPKYNTPEVTWHSWDIRRGLFGKAGIKRMQQESDALYIPPGPFKRPRRDTNAQDPEEQNESSGFRVQQRLPWVHSSQETQSSQEETEAQGSVQDQLLLQLREQRVLRLQLQQLATQVLKVQAGHGIHPLLSSQA (SEQ ID NO: 214)
ORF1/2 MAWGFWGRRRRWRRWRPRRRRWRPRRRRRRRPARRFRARRRDHSRDLAETRTPKTQKSKTKAQVSESSSDSRGSTPAKRRKAPKKKRRRRGRYKTNYSSSSESSEYSDSSSSNSQPKSSKSKQGTAYTPYYLPKRKQSLYV (SEQ ID NO: 215)
ORF2 MWQPPAHNVPGIERNWYESCFRSHAAVCGCGDFVGHLSYLATTLGRPPRPGPPGGPRTPQIRNLPALPAPQGEPGDRAPWRGASGADAAGGDGGDHGADGGDPADVGDDALLAAFELVEE (SEQ ID NO: 216)
ORF2/2 MWQPPAHNVPGIERNWYESCFRSHAAVCGCGDFVGHLSYLATTLGRPPRPGPPGGPRTPQIRNLPALPAPQGEPGDRAPWRGASGADAAGGDGGDHGADGGDPADVGDDALLAAFELVEESSGIPAPTPAPPRPIEDLAAYKQLTRNTIPQRSRGTRGTSDEDSLAKQVLKECNKNQMLFTFLQDHSRDLAETRTPKTQKSKTKAQVSESSSDSRGSTPAKRRKAPKKKRRRRGRYKTNYSSSSESSEYSDSSSSNSQPKSSKSKQGTAYTPYYLPKRKQSLYV (SEQ ID NO: 217)
ORF2/3 MWQPPAHNVPGIERNWYESCFRSHAAVCGCGDFVGHLSYLATTLGRPPRPGPPGGPRTPQIRNLPALPAPQGEPGDRAPWRGASGADAAGGDGGDHGADGGDPADVGDDALLAAFELVEETIQETSQRHERPRPRRAKRKLRFQSPAATPVGPLQPRDAKLPRRNGGAGVGTRPTTPPAPRAASTPTPAPATRNPSPQSPSRARHTPPIIFPSVNKVFMFEPHGPKPIQGYNDWLEEYTACKFWDRPPRKLHTDLPFYPWAPKPQDQVRVSFKLNFQ (SEQ ID NO: 218)
衣殼蛋白 ( 例如， ORF1 分子 )在一些實施例中，指環載體包含ORF1分子及/或編碼ORF1分子之核酸。
一般而言，ORF1分子包含具有指環病毒ORF1蛋白(例如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白，例如表A1至A3中所列出)或其功能片段之結構特徵及/或活性的多肽。在一些實施例中，ORF1分子包含相對於指環病毒ORF1蛋白(例如本文所描述之指環病毒ORF1蛋白，例如表A1至A3中所列出)之截斷。在一些實施例中，ORF1分子係截斷指環病毒ORF1蛋白之至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或700個胺基酸。在一些實施例中，ORF1分子包含與表A1至A3中所示之指環病毒ORF1蛋白序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF1分子包含與例如本文所描述之乙型細環病毒ORF1蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。ORF1分子通常可結合於核酸分子，諸如DNA (例如遺傳元件，例如本文所描述)。在一些實施例中，ORF1分子定位於細胞核。在某些實施例中，ORF1分子定位於細胞的核仁中。在一些實施例中，ORF1分子係由ORF1核酸編碼。在一些實施例中，ORF1核酸包含反義股，其可直接轉錄以產生編碼ORF1分子之mRNA。在一些實施例中，ORF1核酸包含有義股。
在一些實施例中，本文所描述之ORF1分子包含PCT公開案第WO2020/123816號(以全文引用的方式併入本文中)之表A2、A4、A6、A8、A10、A12、C1-C5、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20-37或D1-D10中之任一者所列出的胺基酸序列(例如ORF1序列，或富精胺酸區、果凍卷域、HVR、N22或C端域序列)，或與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性的序列。
在不希望受理論束縛之情況下，ORF1分子可能能夠結合至其他ORF1分子，例如以形成蛋白質外殼(例如本文所描述)。此類ORF1分子可描述為能夠形成衣殼。在一些實施例中，蛋白質外殼可用衣殼包裹核酸分子(例如本文所描述之遺傳元件)。在一些實施例中，複數個ORF1分子可形成多聚體，例如以產生蛋白質外殼。在一些實施例中，多聚體可為均多聚體。在其他實施例中，多聚體可為雜多聚體(例如包含複數個不同ORF1分子)。亦經考慮，ORF1分子可具有複製酶活性。
在一些實施例中，ORF1分子可包含以下中之一或多者：包含富精胺酸區之第一區，例如具有至少60%鹼性殘基(例如至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%鹼性殘基；例如60%-90%、60%-80%、70%-90%或70-80%之間的鹼性殘基)之區域；及包含果凍卷域，例如至少六條β股(例如4、5、6、7、8、9、10、11或12條β股)之第二區。
富精胺酸區 富精胺酸區(例如，包含本文所描述之ORF1分子)與本文所描述之富精胺酸區序列或包含至少60%、70%或80%鹼性殘基(例如，精胺酸、離胺酸或其組合)之至少約40個胺基酸的序列具有至少70% (例如，至少約70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列一致性。
在一些實施例中，本文所描述之ORF1分子包含富精胺酸區之缺失或截斷。在一些實施例中，缺失整個富精胺酸區。在一些實施例中，缺失富精胺酸區之一部分(例如，結構性富精胺酸區之N端部分)。在實施例中，ORF1分子不包含指環病毒ORF1富精胺酸區，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，具有富精胺酸區之缺失或截斷的ORF1分子進一步包含C端域(例如本文所描述)之至少一部分的缺失或截斷。
果凍卷域 果凍卷域或區域(例如，包含本文所描述之ORF1分子)包含多肽(例如，包含於較大多肽中之域或區域) (例如，由其組成)，該多肽包含一或多個(例如，1、2或3個)以下特徵： (i)果凍卷域之胺基酸中之至少30% (例如至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%或更多)為一或多個β片之一部分； (ii)果凍卷域之二級結構包含至少四條(例如至少4、5、6、7、8、9、10、11或12條) β股；及/或 (iii)果凍卷域之三級結構包含至少兩個(例如至少2、3或4個) β片；及/或 (iv)果凍卷域包含至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1之β片與α螺旋比率。
在某些實施例中，果凍卷域包含兩個β片。
在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含約八條(例如4、5、6、7、8、9、10、11或12條) β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含八條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含七條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含六條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含五條β股。在某些實施例中，β片中之一或多者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10者)包含四條β股。
在一些實施例中，果凍卷域包含與第二β片呈反平行取向之第一β片。在某些實施例中，第一β片包含約四條(例如3、4、5或6條) β股。在某些實施例中，第二β片包含約四條(例如3、4、5或6條) β股。在實施例中，第一β片及第二β片總共包含約八條(例如6、7、8、9、10、11或12條) β股。
在某些實施例中，果凍卷域為衣殼蛋白(例如本文所描述之ORF1分子)之組分。在某些實施例中，果凍卷域具有自組裝活性。在一些實施例中，包含果凍卷域之多肽結合於包含果凍卷域之多肽的另一複本。在一些實施例中，第一多肽之果凍卷域結合於多肽之第二複本的果凍卷域。
其他子域ORF1分子亦可包括包含指環病毒N22域(例如本文所描述，例如來自本文所描述之指環病毒ORF1蛋白之N22域)之結構或活性的第三區。
ORF1分子亦可包括包含指環病毒C端域(CTD) (例如本文所描述，例如來自本文所描述之指環病毒ORF1蛋白之CTD)之結構或活性的第四區。
在一些實施例中，本文所描述之ORF1分子包含C端域(CTD)之缺失或截斷。在一些實施例中，缺失整個CTD。在一些實施例中，缺失CTD之一部分(例如，CTD之C端部分)。在實施例中，ORF1分子不包含指環病毒ORF1 CTD，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，具有CTD之缺失或截斷的ORF1分子進一步包含富精胺酸區(例如本文所描述)之至少一部分的缺失或截斷。
在一些實施例中，ORF1分子以N端至C端次序包含第一區、第二區、第三區及第四區。
在一些實施例中，ORF1分子可進一步包含高變區(HVR)，例如來自指環病毒ORF1蛋白之HVR，例如本文所描述。在一些實施例中，HVR位於第二區與第三區之間。在一些實施例中，HVR包含至少約55個(例如至少約45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或65個)胺基酸(例如約45-160、50-160、55-160、60-160、45-150、50-150、55-150、60-150、45-140、50-140、55-140或60-140個胺基酸)。
在一些實施例中，第一區可結合於核酸分子(例如DNA)。在一些實施例中，鹼性殘基係選自精胺酸、組胺酸、或離胺酸，或其組合。在一些實施例中，第一區包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%精胺酸殘基(例如60%-90%、60%-80%、70%-90%或70%-80%之間的精胺酸殘基)。在一些實施例中，第一區包含約30-120個胺基酸(例如約40-120、40-100、40-90、40-80、40-70、50-100、50-90、50-80、50-70、60-100、60-90或60-80個胺基酸)。在一些實施例中，第一區包含病毒ORF1富精胺酸區(例如來自指環病毒ORF1蛋白之富精胺酸區，例如本文所描述)的結構或活性。在一些實施例中，第一區包含核定位信號。
在一些實施例中，第二區包含果凍卷域，例如病毒ORF1果凍卷域(例如來自指環病毒ORF1蛋白之果凍卷域，例如本文所描述)的結構或活性。在一些實施例中，第二區能夠結合至另一ORF1分子之第二區，例如以形成蛋白質外殼(例如衣殼)或其部分。
在一些實施例中，第四區暴露於蛋白質外殼(例如包含ORF1分子之多聚體的蛋白質外殼，例如本文所描述)之表面上。
在一些實施例中，第一區、第二區、第三區、第四區及/或HVR各自包含少於四個(例如0、1、2或3個) β片。
在一些實施例中，第一區、第二區、第三區、第四區及/或HVR中之一或多者可經異源胺基酸序列(例如來自異源ORF1分子之對應區域)置換。在一些實施例中，異源胺基酸序列具有所需功能性，例如本文所描述。
在一些實施例中，ORF1分子包含複數個保守模體(例如，包含約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多個胺基酸之模體)。在一些實施例中，保守模體可與一或多個野生型指環病毒進化枝(例如乙型細環病毒)之ORF1蛋白展示60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%序列一致性。在一些實施例中，保守模體之長度各自在1-1000個胺基酸之間(例如在5-10、5-15、5-20、10-15、10-20、15-20、5-50、5-100、10-50、10-100、10-1000、50-100、50-1000或100-1000之間)。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約2%-4% (例如約1%-8%、1%-6%、1%-5%、1%-4%、2%-8%、2%-6%、2%-5%或2%-4%)組成，且各自與野生型指環病毒進化枝之ORF1蛋白中之對應模體展示100%序列一致性。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約5%-10% (例如約1%-20%、1%-10%、5%-20%或5%-10%)組成，且各自與野生型指環病毒進化枝之ORF1蛋白中之對應模體展示80%序列一致性。在某些實施例中，保守模體由ORF1分子之序列的約10%-50% (例如約10%-20%、10%-30%、10%-40%、10%-50%、20%-40%、20%-50%或30%-50%)組成，且各自與野生型指環病毒進化枝之ORF1蛋白中之對應模體展示60%序列一致性。
在一些實施例中，ORF1分子相對於例如本文所描述(例如，表A1至A3中所示)之野生型ORF1蛋白包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)。
N22域中之保守ORF1模體 在一些實施例中，本文所描述之多肽(例如ORF1分子)包含胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。舉例而言，X 2指示任何兩個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)包含於例如本文所描述之ORF1分子之N22域內。在一些實施例中，本文所描述之遺傳元件包含編碼胺基酸序列YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)之核酸序列(例如編碼ORF1分子之核酸序列，例如本文所描述)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。
在一些實施例中，多肽(例如ORF1分子)包含保守二級結構，例如側接及/或包含例如N22域中之YNPX 2DXGX2N (SEQ ID NO: 829)模體之一部分。在一些實施例中，保守二級結構包含第一β股及/或第二β股。在一些實施例中，第一β股之長度為約5-6個(例如3、4、5、6、7或8個)胺基酸。在一些實施例中，第一β股包含在YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之N端末端處的酪胺酸(Y)殘基。在一些實施例中，YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體包含無規捲曲(例如約8-9個胺基酸之無規捲曲)。在一些實施例中，第二β股之長度為約7-8個(例如5、6、7、8、9或10個)胺基酸。在一些實施例中，第二β股包含在YNPX 2DXGX 2N (SEQ ID NO: 829)模體之C端末端處的天冬醯胺(N)殘基。
例示性ORF1序列 在一些實施例中，本文所描述之多肽(例如ORF1分子)包含與一或多個例如本文所描述之指環病毒ORF1子序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之指環病毒科載體(例如，指環載體))包含ORF1分子，其包含與一或多個例如本文所描述之指環病毒ORF1子序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，本文所描述之指環載體包含編碼ORF1分子之核酸分子(例如遺傳元件)，該ORF1分子包含與一或多個例如本文所描述之指環病毒ORF1子序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，一或多個指環病毒ORF1子序列包含以下中之一或多者：富含精胺酸(Arg)之域、果凍卷域、高變區(HVR)、N22域或C端域(CTD) (例如本文所列出)，或與其具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，ORF1分子包含複數個來自不同指環病毒之子序列。在一些實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、果凍卷域、N22域以及來自一種指環病毒科病毒(例如，指環病毒)之CTD及來自另一者之HVR。在一些實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：果凍卷域、HVR、N22域以及來自一種指環病毒科病毒(例如，指環病毒)之CTD及來自另一者的富含Arg之域。在一些實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、HVR、N22域以及來自一種指環病毒科病毒(例如，指環病毒)之CTD及來自另一者之果凍卷域。在一些實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、果凍卷域、HVR以及來自一種指環病毒科病毒(例如，指環病毒)之CTD及來自另一者之N22域。在一些實施例中，ORF1分子包含以下中之一或多者：富含Arg之域、果凍卷域、HVR以及來自一種指環病毒科病毒(例如，指環病毒)之N22域及來自另一者之CTD。
鑑別ORF1蛋白序列 在一些實施例中，ORF1蛋白序列或編碼ORF1蛋白之核酸序列可自指環病毒科病毒，例如指環病毒之基因體(例如，例如藉由核酸定序技術，例如深度定序技術鑑別之推定指環病毒科病毒基因體)中鑑別。在一些實施例中，ORF1蛋白序列係藉由一或多個(例如1、2或全部3個)以下選擇標準鑑別： (i) 長度選擇 ：蛋白質序列(例如符合下文(ii)或(iii)中所描述之標準的推定ORF1序列)可針對大於約600個胺基酸殘基之序列進行大小選擇，以鑑別推定ORF1蛋白。在一些實施例中，ORF1蛋白序列之長度為至少約600、650、700、750、800、850、900、950或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，甲型細環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，乙型細環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約650、660、670、680、690、700、750、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，丙型細環病毒ORF1蛋白序列之長度為至少約650、660、670、680、690、700、750、800、900或1000個胺基酸殘基。在一些實施例中，編碼ORF1蛋白之核酸序列的長度為至少約1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500個核苷酸。在一些實施例中，編碼甲型細環病毒ORF1蛋白序列之核酸序列的長度為至少約2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500個核苷酸。在一些實施例中，編碼乙型細環病毒ORF1蛋白序列之核酸序列的長度為至少約1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500或1000個核苷酸。在一些實施例中，編碼丙型細環病毒ORF1蛋白序列之核酸序列的長度為至少約1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2400或2500或1000個核苷酸。 (ii) ORF1 模體之存在 ：蛋白質序列(例如符合上文(i)或下文(iii)中所描述之標準的推定ORF1序列)可經過濾以鑑別在上文所描述之N22域中含有保守ORF1模體之蛋白質序列。在一些實施例中，推定的指環病毒ORF1序列包含序列YNPXXDXGXXN (SEQ ID NO: 829)。在一些實施例中，推定的指環病毒ORF1序列包含序列Y[NCS]P XXD X[GASKR] XX[NTSVAK]。 (iii) 富精胺酸區之存在 ：蛋白質序列(例如符合上文(i)及/或(ii)中所描述之標準的推定ORF1序列)可針對包括富精胺酸區(例如本文所描述)之蛋白質序列進行過濾。在一些實施例中，推定ORF1序列包含至少約30、35、40、45、50、55、60、65或70個胺基酸之連續序列，其包含至少30% (例如至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)精胺酸殘基。在一些實施例中，推定ORF1序列包含約35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65或65-70個胺基酸之連續序列，其包含至少30% (例如至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)精胺酸殘基。在一些實施例中，富精胺酸區位於推定ORF1蛋白之起始密碼子下游至少約30、40、50、60、70或80個胺基酸處。在一些實施例中，富精胺酸區位於推定ORF1蛋白之起始密碼子下游至少約50個胺基酸處。
在一些實施例中，在PCT公開案第WO2020/123816號(以全文引用的方式併入本文中)之實例36中所描述的指環病毒基因體序列中鑑別ORF1蛋白。
ORF2 分子在一些實施例中，指環載體包含ORF2分子及/或編碼ORF2分子之核酸。一般而言，ORF2分子包含具有指環病毒ORF2蛋白(例如本文所描述之指環病毒ORF2蛋白，例如表A1至A3中所列出)或其功能片段之結構特徵及/或活性的多肽。在一些實施例中，ORF2分子包含與表A1至A3中所示之指環病毒ORF2蛋白序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF2分子係由ORF2核酸編碼。在一些實施例中，ORF2核酸包含反義股，其可直接轉錄以產生編碼ORF2分子之mRNA。在一些實施例中，ORF2核酸包含有義股。
在一些實施例中，ORF2分子包含與甲型細環病毒、乙型細環病毒或丙型細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF2分子(例如，與甲型細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為250個或更少胺基酸(例如約150-200個胺基酸)。在一些實施例中，ORF2分子(例如，與乙型細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為約50-150個胺基酸。在一些實施例中，ORF2分子(例如，與丙型細環病毒ORF2蛋白具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之ORF2分子)的長度為約100-200個胺基酸(例如約100-150個胺基酸)。在一些實施例中，ORF2分子包含螺旋-轉角-螺旋模體(例如，包含兩個側接轉角區域之α螺旋的螺旋-轉角-螺旋模體)。在一些實施例中，ORF2分子不包含TTV分離株TA278或TTV分離株SANBAN之ORF2蛋白的胺基酸序列。在一些實施例中，ORF2分子具有蛋白質磷酸酶活性。在一些實施例中，ORF2分子相對於例如本文所描述(例如表A1至A3中所示)之野生型ORF2蛋白包含至少一個差異(例如，突變、化學修飾或表觀遺傳改變)。
保守ORF2模體 在一些實施例中，本文所描述之多肽(例如ORF2分子)包含胺基酸序列[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。在實施例中，X 7指示任何七個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，X 3指示任何三個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，X 1指示任何單一胺基酸。在一些實施例中，X 5指示任何五個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，[W/F]可為色胺酸或苯丙胺酸。在一些實施例中，[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)包含於例如本文所描述之ORF2分子之N22域內。在一些實施例中，本文所描述之遺傳元件包含編碼胺基酸序列[W/F]X 7HX 3CX 1CX 5H (SEQ ID NO: 949)之核酸序列(例如編碼ORF2分子之核酸序列，例如本文所描述)，其中X n 為任何 n個胺基酸之連續序列。
遺傳元件在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)包含遺傳元件。在一些實施例中，遺傳元件具有以下特徵中之一或多者：與宿主細胞之基因體實質上不整合；為游離型核酸；為單股DNA；為環狀；為約1至10 kb；存在於細胞核內；可藉由內源性蛋白質結合；產生靶向宿主或目標細胞之基因、活性或功能的效應物，諸如多肽或核酸(例如RNA、iRNA、微小RNA)。在一個實施例中，遺傳元件為實質上非整合DNA。在一些實施例中，遺傳元件包含封裝信號，例如結合衣殼蛋白之序列。在一些實施例中，在封裝或衣殼結合序列外部，遺傳元件與野生型指環病毒核酸序列具有小於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%序列一致性，例如與例如本文所描述之指環病毒核酸序列具有小於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%序列一致性。在一些實施例中，在封裝或衣殼結合序列外部，遺傳元件具有小於500、450、400、350、300、250、200、150或100個連續核苷酸，該等連續核苷酸與指環病毒核酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。在某些實施例中，遺傳元件為環狀單股DNA，其包含啟動子序列、編碼治療效應物之序列及衣殼結合蛋白。在一些實施例中，遺傳元件可包含包括DNA、RNA或人工核酸之其他序列。
在一些實施例中，遺傳元件與例如本文所描述(例如，表N1至N3中之任一者中所描述)之指環病毒核酸序列或其片段具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，或編碼與指環病毒胺基酸序列(例如，表A1至A3中之任一者中所描述)或其片段具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含編碼效應物(例如內源效應物或外源效應物，例如有效負載)，例如多肽效應物(例如蛋白質)或核酸效應物(例如非編碼RNA，例如miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反義RNA、gRNA)之序列。
在一些實施例中，遺傳元件之長度小於20 kb (例如小於約19 kb、18 kb、17 kb、16 kb、15 kb、14 kb、13 kb、12 kb、11 kb、10 kb、9 kb、8 kb、7 kb、6 kb、5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb或更小)。在一些實施例中，遺傳元件之長度獨立地或另外大於1000 b (例如，至少約1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb、1.5 kb、1.6 kb、1.7 kb、1.8 kb、1.9 kb、2 kb、2.1 kb、2.2 kb、2.3 kb、2.4 kb、2.5 kb、2.6 kb、2.7 kb、2.8 kb、2.9 kb、3 kb、3.1 kb、3.2 kb、3.3 kb、3.4 kb、3.5 kb、3.6 kb、3.7 kb、3.8 kb、3.9 kb、4 kb、4.1 kb、4.2 kb、4.3 kb、4.4 kb、4.5 kb、4.6 kb、4.7 kb、4.8 kb、4.9 kb、5 kb或更大)。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.5-4.6、2.8-4.0、3.0-3.8或3.2-3.7 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約1.5-2.0、1.5-2.5、1.5-3.0、1.5-3.5、1.5-3.8、1.5-3.9、1.5-4.0、1.5-4.5或1.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.0-2.5、2.0-3.0、2.0-3.5、2.0-3.8、2.0-3.9、2.0-4.0、2.0-4.5或2.0-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約2.5-3.0、2.5-3.5、2.5-3.8、2.5-3.9、2.5-4.0、2.5-4.5或2.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約3.0-5.0、3.5-5.0、4.0-5.0或4.5-5.0 kb。在一些實施例中，遺傳元件之長度為約1.5-2.0、2.0-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.1-3.6、3.2-3.7、3.3-3.8、3.4-3.9、3.5-4.0、4.0-4.5或4.5-5.0 kb。
在一些實施例中，遺傳元件包含本文所描述之特徵中之一或多者，例如編碼實質上非病原性蛋白質之序列、蛋白質結合序列、一或多個編碼調節核酸之序列、一或多個調節序列、一或多個編碼複製蛋白之序列，及其他序列。在一些實施例中，實質上非病原性蛋白質包含胺基酸序列或其功能片段，或與本文所描述之胺基酸序列中之任一者，指環病毒胺基酸序列(例如表A1至A3中之任一者中所列出)具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含一或多個質體元件(例如複製起點或可選標記物，例如抗性基因)。在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含質體主鏈。在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含一或多個細菌質體元件(例如細菌複製起點或可選標記物，例如細菌抗性基因)。在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含細菌質體主鏈。在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含一或多個哺乳動物質體元件(例如哺乳動物複製起點或可選標記物，例如哺乳動物抗性基因)。在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含哺乳動物質體主鏈。在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含一或多個昆蟲質體元件(例如昆蟲複製起點或可選標記物，例如昆蟲抗性基因)。在一些實施例中，雙股環狀DNA及/或遺傳元件不包含昆蟲質體主鏈。
在一些實施例中，本文所描述之遺傳元件包含PCT公開案第WO2020/123816號(以全文引用的方式併入本文中)之表A1、A3、A5、A7、A9、A11、B1-B5、1、3、5、7、9、11、13、15或17中之任一者所列出的序列(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開放閱讀框架(ORF)、poly(A)信號或富GC區序列)，或與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性之序列。
在一些實施例中，遺傳元件包含編碼效應物(例如外源效應物)之序列。在一些實施例中，將效應物編碼序列插入至指環病毒基因體序列(例如本文所描述)中。在一些實施例中，效應物編碼序列置換來自指環病毒基因體序列之連續序列(例如至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多個核苷酸之連續序列)。在一些實施例中，效應物編碼序列置換例如本文所描述之TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開放閱讀框架(ORF)、poly(A)信號或富GC區序列，或其部分(例如由至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多個核苷酸組成之部分)，或與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%核苷酸序列一致性之序列。
在一些實施例中，遺傳元件中所包含之第一核酸元件(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開放閱讀框架(ORF)、poly(A)信號或富GC區)的序列與第二核酸元件(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開放閱讀框架(ORF)、poly(A)信號或富GC區)之序列重疊，例如重疊至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400或500個核苷酸。在一些實施例中，遺傳元件中所包含之第一核酸元件(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開放閱讀框架(ORF)、poly(A)信號或富GC區)的序列與第二核酸元件(例如，TATA盒、加帽位點、轉錄起始位點、5' UTR、開放閱讀框架(ORF)、poly(A)信號或富GC區)之序列不重疊。
蛋白質結合序列在一些實施例中，遺傳元件編碼結合於實質上非病原性蛋白質之蛋白質結合序列。在一些實施例中，蛋白質結合序列有助於將遺傳元件封裝至蛋白質外殼中。在一些實施例中，蛋白質結合序列特異性結合實質上非病原性蛋白質之富精胺酸區。在一些實施例中，遺傳元件包含與指環病毒序列之5' UTR保守域或富GC域(例如，表N1至N3中之任一者中所標註之序列的反向互補序列)具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的蛋白質結合序列。
在實施例中，蛋白質結合序列與標註為表N1至N3中之任一者之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在實施例中，蛋白質結合序列與標註為表N1至N3中之任一者之富GC域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
5' UTR 保守域遺傳元件可包括指環病毒5' UTR保守域。通常，包含指環病毒5' UTR保守域之負股封裝於顆粒(例如本文所描述之指環病毒科載體)中。在一些實施例中，指環病毒5' UTR保守域為野生型指環病毒5' UTR保守域。在一些實施例中，指環病毒5' UTR保守域為經工程改造之指環病毒5' UTR保守域，其具有相對於最接近的野生型指環病毒5' UTR保守域序列具有至少一個差異的核酸序列。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為表N1至N3或表38中之任一者之5' UTR保守域核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。 表 38. 來自指環病毒之例示性 5' UTR 序列。
來源 序列 SEQ ID NO:
共有 CGGGTGCCGX 1AGGTGAGTTTACACACCGX 2AGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCX 3GGACTGGCCGGGCX 4X 5TGGG X 1= G或T X 2= C或A X 3= G或A X 4= T或C X 5= A、C或T 105
甲型細環病毒共有5' UTR CGGGTGCCGGAGGTGAGTTTACACACCGCAGTCAAGGGGCAATTCGGGCTCGGGACTGGCCGGGC X 1X 2TGGG；其中X 1包含T或C，且其中X 2包含A、C或T。 112
鑑別 5' UTR 序列在一些實施例中，指環病毒科病毒(例如，指環病毒) 5' UTR序列可在指環病毒科病毒(例如，指環病毒) (例如，例如藉由核酸定序技術，例如深度定序技術鑑別之推定指環病毒科病毒基因體)之基因體內鑑別。在一些實施例中，指環病毒科病毒(例如，指環病毒) 5' UTR序列係藉由以下步驟中之一者或兩者鑑別： (i) 鑑別環化接合點 ：在一些實施例中，5' UTR將位於全長環化指環病毒科病毒(例如，指環病毒)基因體之環化接合點附近。可例如藉由鑑別序列之重疊區域來鑑別環化接合點。在一些實施例中，序列之重疊區域可自序列修剪以產生已環化之全長指環病毒科病毒(例如，指環病毒)基因體序列。在一些實施例中，使用軟體以此方式使基因體序列環化。在不希望受理論束縛之情況下，以計算方式環化基因體可使得序列之起始位置以非生物方式定向。序列內之標誌可用於使序列在正確方向上再定向。舉例而言，標誌序列可包括與本文所描述之指環病毒科病毒(例如，指環病毒)基因體內之一或多個元件(例如，例如本文所描述之指環病毒科病毒(例如，指環病毒)的TATA盒、加帽位點、起始元件、轉錄起始位點、5' UTR保守域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三個開放閱讀框架區、poly(A)信號或富GC區中之一或多者)具有實質同源性的序列。 (ii)鑑別 5' UTR序列：一旦已獲得推定指環病毒科病毒(例如，指環病毒)基因體序列，則可將序列(或其部分，例如長度在約40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100個核苷酸之間)與一或多個指環病毒科病毒(例如，指環病毒) 5' UTR序列(例如本文所描述)相比較以鑑別與其具有實質同源性的序列。在一些實施例中，推定指環病毒科病毒(例如，指環病毒) 5' UTR區域與本文所描述之指環病毒科病毒(例如，指環病毒) 5' UTR序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
富 GC 區遺傳元件可包括指環病毒富GC區。通常，包含指環病毒富GC區之負股封裝於顆粒(例如本文所描述之指環病毒科載體)中。在一些實施例中，指環病毒富GC區為野生型指環病毒富GC區。在一些實施例中，指環病毒富GC區為經工程改造之指環病毒富GC區，其具有相對於最接近的野生型指環病毒富GC區序列具有至少一個差異的核酸序列。在一些實施例中，指環病毒富GC區包含至少20、25、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個連續核苷酸之連續序列，該等連續核苷酸之GC含量為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，遺傳元件包含與標註為表N1至N3或表39中之任一者之富GC區核苷酸序列的序列之反向互補序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核酸序列。 表 39. 來自指環病毒之例示性富 GC 序列。
來源 序列 SEQ ID NO:
共有 CGGCGGX 1GGX 2GX 3X 4X 5CGCGCTX 6CGCGCGCX 7X 8X 9X 10CX 11X 12X 13X 14GGGGX 15X 16X 17X 18X 19X 20X 21GCX 22X 23X 24X 25CCCCCCCX 26CGCGCATX 27X 28GCX 29CGGGX 30CCCCCCCCCX 31X 32X 33GGGGGGCTCCGX 34CCCCCCGGCCCCCC X 1= G或C X 2= G、C或不存在 X 3= C或不存在 X 4= G或C X 5= G或C X 6= T、G或A X 7= G或C X 8= G或不存在 X 9= C或不存在 X 10= C或不存在 X 11= G、A或不存在 X 12= G或C X 13= C或T X 14= G或A X 15= G或A X 16= A、G、T或不存在 X 17= G、C或不存在 X 18= G、C或不存在 X 19= C、A或不存在 X 20= C或A X 21= T或A X 22= G或C X 23= G、T或不存在 X 24= C或不存在 X 25= G、C或不存在 X 26= G或C X 27= G或不存在 X 28= C或不存在 X 29= G或A X 30= G或T X 31= C、T或不存在 X 32= G、C、A或不存在 X 33= G或C X 34= C或不存在 120
效應物在一些實施例中，遺傳元件編碼效應物，例如外源效應物。在一些實施例中，遺傳元件包含治療性表現序列，例如編碼效應物，諸如治療性肽或多肽(例如胞內肽或胞內多肽)、分泌性多肽或蛋白質替代治療劑之序列。在一些實施例中，胞內多肽為胞溶質多肽、調節性胞內肽或抗細胞凋亡劑。在一些實施例中，分泌性多肽為細胞介素、激素、生長因子、結合激素或生長因子之抗體分子、特異性結合至VEGF之多肽或凝血相關因子。在一些實施例中，本文所描述之效應物包含抗VEGF抗體分子。在一些實施例中，蛋白質替代治療劑為酶促效應物、非酶促效應物、紅血球生成素、微肌縮蛋白或野生型蛋白質之功能變異體。
在一些實施例中，遺傳元件包括編碼蛋白質(例如治療性蛋白質)之序列。治療性蛋白質之一些實例可包括但不限於激素、細胞介素、酶、抗體(例如至少編碼重鏈或輕鏈之一種或複數種多肽)、轉錄因子、受體(例如膜受體)、配位體、膜轉運體、分泌性蛋白、肽、載體蛋白、結構蛋白、核酸酶或其組分。
肽之一些實例包括但不限於螢光標籤或標記物、抗原、肽治療劑、來自天然生物活性肽之合成肽或類似肽、促效肽或拮抗肽、抗微生物肽、靶向或細胞毒性肽、一種降解或自毀肽及多種降解或自毀肽。
在一些實施例中，效應物包含再生、修復及纖維化因子(例如，生長因子、針對此生長因子之抗體或其片段、或促進再生及修復之miRNA)。在一些實施例中，效應物包含轉化因子(例如，將纖維母細胞轉化成分化細胞之蛋白因子或miRNA)。在一些實施例中，效應物包含刺激細胞再生之蛋白質。在一些實施例中，效應物包含分泌性STING調節劑(例如，STING抑制劑或STING活化劑)。
在一些實施例中，遺傳元件包含效應物編碼序列。在一些實施例中，效應物包含調節核酸(例如，miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、dsRNA、shRNA、RNA、DNA、反義RNA或gRNA)。
在一些實施例中，遺傳元件包含編碼小肽、肽模擬物(例如類肽)、胺基酸及胺基酸類似物之序列。
在一些實施例中，此章節中提及之效應物亦可為其功能變異體、同源物或片段。
在一些實施例中，遺傳元件包含編碼外源效應物之序列，例如PCT公開案第WO/2020/123753號第337-366頁、PCT公開案第WO/2020/123773號第334-361頁及PCT公開案第WO/2020/123795號第333-358頁中所描述，其各自以全文引用之方式併入本文中。
調節序列 在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接至編碼效應物之序列的調節序列，例如啟動子或強化子。
在一些實施例中，啟動子包括位於編碼表現產物之DNA序列附近的DNA序列。啟動子可操作地連接至相鄰DNA序列。相較於不存在啟動子時表現產物之量，啟動子通常增加由DNA序列表現之產物的量。來自一種生物體之啟動子可用於增強來源於另一生物體之DNA序列的產物表現。舉例而言，脊椎動物啟動子可用於在脊椎動物中表現水母GFP。另外，一個啟動子元件可增加串聯連接之多個DNA序列所表現之產物的量。因此，一個啟動子元件可增強一或多種產物之表現。多個啟動子元件為一般熟習此項技術者所熟知。
在一些實施例中，使用所關注之基因或核酸序列之原生啟動子。當期望基因或核酸序列之表現應模擬原生表現時，可使用原生啟動子。當基因或其他核酸序列之表現必須在時間上或發育上，或以組織特異性方式，或回應於特定轉錄刺激進行調節時，可使用原生啟動子。在另一實施例中，其他原生表現控制元件，諸如強化子元件、聚腺苷酸化位點或Kozak共有序列亦可用於模擬原生表現。
在一個實施例中，需要高水平組成性表現。此類啟動子之實例包括但不限於逆轉錄病毒勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus；RSV)長末端重複序列(LTR)啟動子/強化子、巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子/強化子(參見例如Boshart等人, Cell, 41:521-530 (1985))、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、細胞質β-肌動蛋白啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
在另一實施例中，可能需要誘導型啟動子。誘導型啟動子為藉由外源供應之化合物順式或反式調節之誘導型啟動子。可適用於此情形中之其他類型之誘導型啟動子為藉由特定生理狀態，例如溫度、急性期或僅在複製細胞中調節之啟動子。
在一些實施例中，遺傳元件包含可操作地連接至組織特異性啟動子之基因。
遺傳元件可包括強化子，例如位於編碼基因之DNA序列附近的DNA序列。強化子元件通常位於啟動子元件上游或可位於編碼DNA序列(例如轉錄或轉譯成一或多種產物之DNA序列)下游或位於其內。因此，強化子元件可位於編碼產物之DNA序列上游或下游100個鹼基對、200個鹼基對或300個或更多個鹼基對處。強化子元件可將由DNA序列表現之重組產物之量增加至高於由啟動子元件得到之增加表現。一般熟習此項技術者可容易地獲得多個強化子元件。
表面部分在一些情況下，本文所描述之指環病毒科載體可包括一或多個與其表面連接之部分(例如，可充當效應物及/或靶向劑之表面部分)。在一些情況下，指環病毒科載體包含多於一個獨特表面部分(例如，具有本文所描述之效應功能之第一表面部分及使指環病毒科載體靶向所關注之細胞或組織的第二表面部分)。在一些情況下，表面部分共價連接至指環病毒科載體之表面。舉例而言，表面部分可共價連接至蛋白質外殼或其組分(例如共價連接至蛋白質外殼之ORF1分子)。在某些實施例中，表面部分與ORF1分子融合。在一些情況下，表面部分非共價連接至指環病毒科載體之表面。舉例而言，表面部分可非共價結合至蛋白質外殼或其組分(例如非共價結合至蛋白質外殼之ORF1分子)。在某些實施例中，表面部分包含特異性結合至ORF1分子上之同源部分或連接至該分子的區域。在一實施例中，ORF1分子包含特異性識別表面部分上之區域上之抗原決定基的結合部分(例如抗體分子)。在一實施例中，表面部分包含特異性識別ORF1分子上之抗原決定基的結合部分(例如抗體分子)。
在一些情況下，表面部分可包含多肽。在一些情況下，表面部分可包含核酸分子(例如，DNA及/或RNA)。在一些情況下，表面部分可包含小分子。在一些情況下，表面部分包含抗原(例如藉由指環病毒科載體所遞送的個體之免疫系統識別的抗原)。在一些情況下，本文所描述之表面部分包含配位體(例如特異性結合至目標細胞上之受體的配位體)。
在一些情況下，表面部分包含效應功能(例如本文所描述)。舉例而言，表面部分可調節生物活性，例如目標細胞或器官之生物活性。在一些情況下，表面部分經由結合至目標細胞上之同源部分誘導生物活性之調節。舉例而言，表面部分可包含與目標細胞表面上之受體結合的配位體，例如其中表面部分與受體之結合起始所關注之下游傳訊級聯。在一些情況下，效應物活性包含增加或減少目標細胞或器官內的酶活性、基因表現、細胞傳訊及/或細胞或器官功能。效應物活性亦可包括結合調控蛋白以調節調控因子之活性，諸如轉錄或轉譯。效應物活性亦可包括活化或抑制功能。
在一些情況下，表面部分可使指環病毒科載體靶向目標細胞。舉例而言，表面部分可特異性結合至目標細胞表面上之同源部分。目標細胞表面上之同源部分可為例如由目標細胞特異性表現或優先表現的分子。同源部分可為例如多肽、脂質、糖或小分子。在某些實施例中，同源部分為跨膜蛋白(例如，包含與指環病毒科載體之表面部分結合之胞外域)。在某些實施例中，同源部分係系拴至細胞表面(例如經由GPI錨)。在一些情況下，表面部分向指環病毒科載體提供趨向性(例如，趨向目標組織或目標細胞類型)。
在一態樣中，本揭露提供一種ORF1分子，其包含：(i)指環病毒ORF1蛋白之胺基酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列；及(ii)點擊手柄(例如NHS點擊手柄或順丁烯二醯亞胺點擊手柄，例如本文所描述)。在某些實施例中，點擊手柄共價連接至ORF1分子。在某些實施例中，點擊手柄非共價連接至ORF1分子。在某些實施例中，點擊手柄用於將ORF1分子連接至表面部分，例如經由點擊反應，例如本文所描述。
如本文所用之術語「點擊手柄」係指能夠與第二點擊手柄在點擊反應中反應的化學部分。在一些實施例中，點擊手柄包含NHS部分及/或順丁烯二醯亞胺部分。在某些實施例中，點擊手柄包含DBCO部分。在某些實施例中，點擊手柄包含疊氮部分。在一些實施例中，點擊手柄連接至多肽(例如ORF1分子)。在其他實施例中，點擊手柄包含能夠與多肽(例如ORF1分子)形成共價鍵之反應性基團。如本文所用之術語「點擊反應」係指用於使第一部分與第二部分共價連接以適宜產生連接產物的一系列反應。其通常具有以下特徵中之一或多者：快速；具有特異性；高產率；有效；自發；不顯著改變連接實體之生物相容性；具有高反應速率；產生穩定產物；有利於產生單一反應產物；具有高原子經濟性；具有化學選擇性；模組化；具有立體選擇性；對氧不敏感；對水不敏感；純度高；僅生成無害或相對無毒的副產物，該等副產物可藉由非層析方法(例如結晶或蒸餾)移除；不需要溶劑或可在良性或生理學上相容的溶劑(例如水)中進行；在生理條件下穩定。實例包括炔烴/疊氮化物反應、二烯烴/親二烯物反應或硫醇/烯烴反應。可使用其他反應。
II. 用於製備指環病毒科載體之組合物及方法 在一些態樣中，本揭露提供指環病毒科載體(例如，指環載體)及其遞送效應物之方法。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)或其組分可如下文所描述進行製備。在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於產生遺傳元件或遺傳元件構築體。在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於產生一或多種指環病毒科病毒衣殼蛋白(例如，指環病毒ORF)分子(例如，ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1或ORF1/2分子，或其功能片段或剪接變異體)。在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可用於例如在宿主細胞中產生蛋白質外殼或其組分(例如ORF1分子)。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)或其組分可使用串聯構築體製備，例如PCT公開案第WO 2021252955號中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)或其組分(例如指環病毒科多肽，例如ORF1、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1/1及/或ORF1/2分子，或其功能片段或剪接變異體)可使用桿狀病毒質體(bacmid)/昆蟲細胞系統製備，例如PCT公開案第WO 2021/252943號中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。使用宿主細胞產生指環載體之方法描述於例如以下標題為「宿主細胞及使用宿主細胞產生指環載體之方法」的章節中。在無細胞系統中產生指環載體之方法描述於例如以下標題為「活體外組裝方法」之章節中。
在不希望受理論束縛之情況下，滾環擴增可經由Rep蛋白與Rep結合位點(例如包含5' UTR，例如包含髮夾環及/或複製起點，例如本文所描述)之結合而發生，該結合位點位於相對於遺傳元件區域之5'處(或在5'區域內)。Rep蛋白隨後可繼續通過遺傳元件區域，使得合成遺傳元件。遺傳元件隨後可環化且隨後包封於蛋白質外殼內以形成指環病毒科載體(例如，指環載體)。
例如用於組裝指環病毒科載體之遺傳元件構築體在本文所描述之一些製備方法中，遺傳元件係使用遺傳元件構築體製備，其中遺傳元件構築體可充當用於產生遺傳元件之模板。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含遺傳元件區域及視情況選用之其他序列(諸如載體主鏈)。遺傳元件構築體可為適合於將遺傳元件之序列遞送至宿主細胞中之任何核酸構築體，其中遺傳元件可包封於蛋白質外殼內。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含啟動子。在一些實施例中，遺傳元件構築體為線性核酸分子。在一些實施例中，遺傳元件構築體為環狀核酸分子(例如質體、病毒核酸、桿狀病毒質體、人工染色體或微型環，例如本文所描述)。在一些實施例中，雙股環狀核酸(例如，微型環)可自質體切除(例如，藉由活體外環化)。在一些實施例中，活體外環化DNA構築體可藉由消化所封裝之遺傳元件構築體(例如包含遺傳元件之序列的質體)，使得該遺傳元件序列作為線性DNA分子切除來產生。所得線性DNA隨後可例如使用DNA連接酶接合，以形成雙股環狀DNA (例如，微型環)。在實施例中，可將雙股環狀核酸構築體(例如，微型環)引入宿主細胞中，其中其可轉化成或用作用於產生例如本文所描述之單股環狀遺傳元件的模板。在一些實施例中，遺傳元件係藉由聚合酶基於核酸構築體中之模板序列來產生。在一些實施例中，聚合酶產生遺傳元件序列之單股複本，其可視情況環化以形成本文所描述之遺傳元件。
在一些實施例中，遺傳元件構築體可為雙股的。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含RNA。在一些實施例中，遺傳元件構築體包含一或多個經修飾之核苷酸。
串聯構築體在一些實施例中，遺傳元件構築體包含串聯排列的遺傳元件序列(例如遺傳元件之核酸序列，例如本文所描述)之第一複本及遺傳元件序列(例如相同遺傳元件之核酸序列，或不同遺傳元件之核酸序列)之第二複本的至少一部分。具有此類結構之遺傳元件構築體在本文中通常稱為串聯構築體。此串聯構築體用於產生指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件。在一些情況下，遺傳元件序列之第一複本及遺傳元件序列之第二複本在遺傳元件構築體上可彼此緊鄰。在其他情況下，遺傳元件序列之第一複本及遺傳元件序列之第二複本可例如藉由間隔子序列間隔開。在不受理論束縛之情況下，在一些實施例中，本文所描述之串聯構築體可藉由滾環複製進行複製。在一些實施例中，串聯構築體為質體。在一些實施例中，串聯構築體為環狀。在一些實施例中，串聯構築體為線性的。在一些實施例中，串聯構築體為單股的。在一些實施例中，串聯構築體為雙股的。在一些實施例中，串聯構築體為DNA。
可用於本發明中之串聯構築體的額外描述描述於例如PCT公開案第WO 2021252955號中，其以全文引用的方式併入本文中。
順式 / 反式構築體在一些實施例中，本文所描述之遺傳元件構築體包含編碼一或多個指環病毒科病毒ORF，例如蛋白質外殼組分(例如，由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如本文所描述)的一或多個序列。舉例而言，遺傳元件構築體可包含編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列。此遺傳元件構築體可適合於將遺傳元件及一或多種指環病毒科病毒ORF以順式形式引入宿主細胞中。在其他實施例中，本文所描述之遺傳元件構築體不包含編碼一或多個指環病毒科病毒ORF，例如蛋白質外殼組分(例如，由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如本文所描述)的序列。舉例而言，遺傳元件構築體可不包含編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列。此遺傳元件構築體可適合於將遺傳元件引入宿主細胞中，其中一或多種指環病毒科病毒ORF以反式形式提供(例如，經由引入編碼指環病毒科病毒ORF中之一或多者的第二核酸構築體，或經由整合至宿主細胞基因體中之指環病毒科病毒ORF卡匣)。在一些實施例中，ORF1分子係以反式形式提供，例如本文所描述。在一些實施例中，ORF2分子係以反式形式提供，例如本文所描述。在一些實施例中，ORF1分子及ORF2分子均以反式形式提供，例如本文所描述。
在一些實施例中，遺傳元件構築體包含編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段(例如果凍卷區，例如本文所描述)的序列。在實施例中，不包含遺傳元件序列之遺傳元件的部分包含編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段的序列(例如在包含啟動子及編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段之序列的卡匣中)。在其他實施例中，包含遺傳元件序列之構築體的部分包含編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段(例如果凍卷區，例如本文所描述)的序列。在實施例中，包封蛋白質外殼(例如本文所描述)中之此類遺傳元件產生複製勝任型指環病毒科載體(例如，指環載體) (例如指環病毒科載體，其在感染細胞之後使得細胞能夠在不將例如編碼一或多個本文所描述之指環病毒科病毒ORF的其他核酸構築體引入細胞中的情況下產生指環載體之額外複本)。
在其他實施例中，遺傳元件不包含編碼指環病毒ORF1分子或其剪接變異體或功能片段(例如果凍卷區，例如本文所描述)的序列。在實施例中，包封蛋白質外殼(例如本文所描述)中之此類遺傳元件產生複製非勝任型指環病毒科載體(例如，指環載體) (例如指環病毒科載體，其在感染細胞之後使得感染細胞無法產生例如編碼一或多個本文所描述之指環病毒ORF的額外指環病毒科載體，例如在不存在一或多個額外構築體之情況下)。
遺傳元件及指環載體的基於重組酶之產生指環病毒科載體(例如，指環載體)之遺傳元件可經由遺傳元件構築體之位點特異性重組產生，以產生包含遺傳元件序列之環狀核酸分子。在一些實施例中，環狀核酸分子為雙股DNA微型環。在一些實施例中，環狀核酸分子繼而轉化為環狀單股DNA分子，其繼而可充當本文所描述之指環病毒科載體(例如，指環載體)之遺傳元件。一般而言，遺傳元件構築體包含側接指環病毒科載體之遺傳元件之序列的一組重組酶識別序列。重組酶識別位點可由位點特異性重組酶識別。在一些情況下，遺傳元件構築體之其餘部分可包含載體主鏈，其包含用於在細胞(諸如哺乳動物細胞)中複製構築體的元件。
使遺傳元件構築體與位點特異性重組酶接觸(例如在宿主細胞中)可使得自構築體之其餘部分切除遺傳元件序列，且形成兩個環狀核酸分子，一者包含遺傳元件序列且另一者包含載體主鏈之其餘部分。在一些實施例中，包含遺傳元件序列之環狀核酸分子(例如微型環)在宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中轉化為cssDNA，且隨後囊封於包含ORF1分子之蛋白質外殼(例如本文所描述)中，以產生指環病毒科載體。
在一些實施例中，用於產生遺傳元件的基於位點特異性重組酶之系統包含三種質體：(1)第一質體(例如，載體質體)，其包含側接一對重組酶識別位點之遺傳元件之序列；(2)表現質體，其包含編碼能夠識別重組酶識別位點之位點特異性重組酶(例如本文所描述)的卡匣；及(3)第二質體(例如，自複製救援(self-replicating rescue；SRR)質體)，其提供一或多種指環病毒科病毒蛋白(例如，指環病毒ORF1、ORF3及/或ORF3分子)，包括衣殼蛋白(例如ORF1分子，例如本文所描述)。
在一些實施例中，用於產生遺傳元件的基於位點特異性重組酶之系統包含兩種質體：(1)第一質體(例如，載體質體)，其包含側接一對重組酶識別位點之遺傳元件之序列；及(2)第二質體(例如，自複製救援(SRR)質體)，其提供一或多種指環病毒科病毒蛋白(例如，指環病毒ORF1、ORF3及/或ORF3分子)，包括衣殼蛋白(例如ORF1分子，例如本文所描述)。
自複製救援 (SRR) 構築體 ( 例如 SRR 質體 )在一些實施例中，救援構築體可用於提供一或多種指環病毒科病毒蛋白，或其功能片段或變異體(例如，指環病毒ORF1、ORF2及/或ORF3分子中之一或多者)。在一些實施例中，救援構築體能夠在宿主細胞中自複製(例如自複製救援(SRR)質體)。在一些實施例中，SRR質體可用於基於位點特異性重組酶之系統中。
在一些實施例中，救援構築體包括表現卡匣，其包含指環病毒科病毒(例如本文所描述之指環病毒)之蛋白質編碼序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列。在一些實施例中，救援構築體包括編碼複製蛋白(例如，大T抗原、PCV Rep或PCV Rep')之序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列。在一些實施例中，救援構築體包括外源複製起點(例如病毒起點，例如SV40、PCV或AAV起點)。在某些實施例中，複製蛋白質編碼序列係在位於包含指環病毒科病毒之蛋白質編碼序列的表現卡匣下游的內部核糖體進入位點(IRES)下游。在某些實施例中，複製蛋白質編碼序列包含於與包含指環病毒科病毒之蛋白質編碼序列的表現卡匣不同的卡匣中。在一些實施例中，救援構築體進一步包含一或多個額外表現卡匣，其例如編碼位點特異性重組酶、指環病毒科病毒蛋白(例如指環病毒ORF1分子)、複製蛋白及/或病毒起點(例如本文所描述)或另一所關注轉殖基因。
在一些實施例中，救援構築體包含單一表現卡匣(例如上文所描述)。在一些實施例中，救援構築體包含兩個表現卡匣。在一些實施例中，救援構築體包含三個表現卡匣。在一些實施例中，救援構築體包含四個表現卡匣。在一些實施例中，救援構築體包含五個或更多個表現卡匣。本文所描述之例示性表現卡匣可以任何次序安置於救援構築體內。在一些實施例中，表現卡匣中之一或多者相對於其他表現卡匣中之一或多者呈相反定向。在其他實施例中，救援構築體中之所有表現卡匣相對於彼此呈相同定向。
在一些實施例中，救援構築體不含有指環病毒NCR序列(例如不含有指環病毒5' NCR序列及/或指環病毒3' NCR序列)。在一些實施例中，救援構築體不包含指環病毒5' UTR保守域。在一些實施例中，救援構築體不包含指環病毒富GC區。在一些實施例中，救援構築體不含有與載體質體同源之指環病毒序列(例如，與載體質體中具有相同長度之任何指環病毒序列具有序列一致性的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400或500個核苷酸之連續序列)。
在一些實施例中，可用於本文所描述之位點特異性重組酶系統(例如本文所描述之雙質體系統或三質體系統)中的例示性SRR質體提供於表W1中。 表 W1. 例示性 Ring19 SRR 質體 (pRTx-3525)
名稱 pRTx-3525
類型 質體
描述 phEF1a_Ring19-UTR-FullORF_SVLT_SV40ori。
長度 9391 bp
註釋：
區域 / 元件 鹼基範圍
pHEf1A啟動子 436-1609
EF-1-α核心啟動子 457-668
EF-1-α內含子A 669-1607
起始元件 1614-1618
5' UTR保守域 1670-1740
內含子1 1682-1769
ORF2/3編碼序列 1770-2056, 3756-4131
ORF2/2編碼序列 1770-2056, 3629-3902
ORF2編碼序列 1770-2060
ORF1編碼序列 1952-3919
ORF1/1編碼序列 1952-2056, 3629-3919
ORF1/2編碼序列 1952-2056, 3756-3902
IRES-SV大T抗原-SV40起點-pUC57-Kan串接序列1 4131-9391, 1-435
EMCV內部核糖體進入位點(IRES) 4203-4789
SV40大T抗原編碼序列 4790-6916
SV40 polyA序列(互補序列) 6947-7068
SV40複製起點 7108-7243
LacI抑制因子蛋白結合位點(互補序列) 7325-7341
Lac操縱子啟動子(互補序列) 7349-7379
CAP結合位點(互補序列) 7394-7415
pUC複製起點(互補序列) 7644-8317
ColE1/pMB1/pBR322/pUC複製起點 7703-8291
胺基醣苷磷酸轉移酶(Kan/G418抗性蛋白)編碼序列(互補序列) 8469-9278
例示性 SV40 大 T 抗原胺基酸序列 ：
例示性位點特異性重組酶及重組酶識別位點 本文所描述之基於重組酶之系統利用位點特異性重組酶誘導載體質體在重組酶識別位點處重組，藉此產生雙股DNA分子(例如微型環)，其包含重組酶識別位點之間的序列(例如，包含本文所描述之指環病毒科載體之遺傳元件的序列)。
在一些實施例中，位點特異性重組酶包含Cre重組酶(例如本文所描述，例如在表V2中)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，位點特異性重組酶包含表V2中所列出之Cre之胺基酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，位點特異性重組酶包含表V2中所列出之SV40-NLS-iCre之胺基酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
在某些實施例中，重組酶識別位點中之至少一者(例如，一者或兩者)包含表V3中所列出之lox66位點，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。在某些實施例中，重組酶識別位點中之至少一者(例如，一者或兩者)包含表V3中所列出之lox71位點，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。在某些實施例中，在Cre重組事件(例如，本文所描述)之後產生的環狀雙股核酸分子(例如，微型環)包含表V3中所列出之loxP位點，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。在某些實施例中，在Cre重組事件(例如，本文所描述)之後產生的環狀雙股核酸分子(例如，微型環)包含表V3中所列出之lox72位點，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。
在一些實施例中，位點特異性重組酶包含Bxb1重組酶(例如本文所描述，例如在表V2中)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，位點特異性重組酶包含表V2中所列出之Bxb1之胺基酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，位點特異性重組酶包含表V2中所列出之SV40-NLS-HA_Bxb1之胺基酸序列，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
在某些實施例中，重組酶識別位點中之至少一者包含表V4中所列出之attB位點，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。在某些實施例中，重組酶識別位點中之至少一者包含表V4中所列出之attP位點，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。在某些實施例中，一個重組酶識別位點包含表V4中所列出之attB位點或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列，且另一重組酶識別位點包含表V4中所列出之attP位點或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。在某些實施例中，在Bxb1重組事件(例如本文所描述)之後產生的環狀雙股核酸分子(例如，微型環)包含表V4中所列出之attL位點，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。在某些實施例中，在Bxb1重組事件(例如本文所描述)之後產生的環狀雙股核酸分子(例如，微型環)包含表V4中所列出之attR位點，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核酸序列。 表V2. 例示性位點特異性重組酶多肽
位點特異性重組酶 胺基酸序列( 加下劃線=SV40 NLS 序列；加粗斜體=HA 標籤序列 )
SV40-NLS_iCre MV PKKKRKVSNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGD* (SEQ ID NO: 1101)
Cre (與iCre相同) MSNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGD (SEQ ID NO: 1102)
SV40-NLS-HA_Bxb1 M PKKKRKV YPYDVPDYA GSRALVVIRLSRVTDATTSPERQLESCQQLCAQRGWDVVGVAEDLDVSGAVDPFDRKRRPNLARWLAFEEQPFDVIVAYRVDRLTRSIRHLQQLVHWAEDHKKLVVSATEAHFDTTTPFAAVVIALMGTVAQMELEAIKERNRSAAHFNIRAGKYRGSLPPWGYLPTRVDGEWRLVPDPVQRERILEVYHRVVDNHEPLHLVAHDLNRRGVLSPKDYFAQLQGREPQGREWSATALKRSMISEAMLGYATLNGKTVRDDDGAPLVRAEPILTREQLEALRAELVKTSRAKPAVSTPSLLLRVLFCAVCGEPAYKFAGGGRKHPRYRCRSMGFPKHCGNGTVAMAEWDAFCEEQVLDLLGDAERLEKVWVAGSDSAVELAEVNAELVDLTSLIGSPAYRAGSPQREALDARIAALAARQEELEGLEARPSGWEWRETGQRFGDWWREQDTAAKNTWLRSMNVRLTFDVRGGLTRTIDFGDLQEYEQHLRLGSVVERLHTGMS* (SEQ ID NO: 1103)
Bxb1 MRALVVIRLSRVTDATTSPERQLESCQQLCAQRGWDVVGVAEDLDVSGAVDPFDRKRRPNLARWLAFEEQPFDVIVAYRVDRLTRSIRHLQQLVHWAEDHKKLVVSATEAHFDTTTPFAAVVIALMGTVAQMELEAIKERNRSAAHFNIRAGKYRGSLPPWGYLPTRVDGEWRLVPDPVQRERILEVYHRVVDNHEPLHLVAHDLNRRGVLSPKDYFAQLQGREPQGREWSATALKRSMISEAMLGYATLNGKTVRDDDGAPLVRAEPILTREQLEALRAELVKTSRAKPAVSTPSLLLRVLFCAVCGEPAYKFAGGGRKHPRYRCRSMGFPKHCGNGTVAMAEWDAFCEEQVLDLLGDAERLEKVWVAGSDSAVELAEVNAELVDLTSLIGSPAYRAGSPQREALDARIAALAARQEELEGLEARPSGWEWRETGQRFGDWWREQDTAAKNTWLRSMNVRLTFDVRGGLTRTIDFGDLQEYEQHLRLGSVVERLHTGMS (SEQ ID NO: 1104)
表V3. Cre重組酶之例示性重組酶識別序列及重組酶雜合位點
重組酶識別位點名稱 核酸序列
loxP ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT (SEQ ID NO: 1105)
lox66 Ataacttcgtatagcatacattatacgaacggta (SEQ ID NO: 1106)
lox71 Taccgttcgtatagcatacattatacgaagttat (SEQ ID NO: 1107)
lox72 ( 雜合) TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTA (SEQ ID NO: 1108)
表V4. Bxb1重組酶之例示性重組酶識別序列
重組酶識別位點名稱 核酸序列
attB TCGGCCGGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCCGTCGTCAGGATCATCCGGGC (SEQ ID NO: 1109)
attP GTCGTGGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGTCTCAGTGGTGTACGGTACAAACCCCGAC (SEQ ID NO: 1110)
attL TCGGCCGGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCAGTGGTGTACGGTACAAACCCCGAC (SEQ ID NO: 1111)
attR GTCGTGGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGTCTCCGTCGTCAGGATCATCCGGGC (SEQ ID NO: 1112)
如本文所用，術語「重組酶雜合位點」係指具有當呈雙股形式時能夠由重組兩個重組酶識別位點之位點特異性重組酶產生之序列的DNA位點。不暗示特定製造過程：重組酶雜合位點可由位點特異性重組酶或另一方法，諸如現有序列之DNA複製產生。在一些實施例中，藉由一種方法產生包含重組酶雜合位點之單股DNA，其中位點特異性重組酶產生包含重組酶雜合位點之雙股DNA，隨後將雙股DNA轉化為單股DNA。在一些實施例(例如，使用Cre重組酶)中，重組酶雜合位點具有與對應重組酶識別位點中之一者相同的序列。在一些實施例(例如，使用Bxb1重組酶)中，重組酶雜合位點具有與兩個對應重組酶識別位點中之任一者不同的位點。在一些實施例中，重組酶雜合位點為loxP位點、attL位點或attR位點。
如本文所用，術語「重組酶識別位點」係指具有能夠由位點特異性重組酶識別且與第二重組酶識別位點重組，藉此產生重組酶雜合位點之序列的DNA位點。在一些實施例中，由重組酶識別之兩個重組酶識別位點具有相同序列，且在其他實施例中，其具有不同序列。在一些實施例中，重組酶識別位點為loxP位點、attB位點或attP位點。
宿主細胞及使用宿主細胞產生指環載體之方法本文所描述之指環病毒科載體(例如，指環載體)可例如在宿主細胞中產生。一般而言，提供一種宿主細胞，其包含指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件及指環病毒科載體(例如，指環載體)蛋白質外殼之組分(例如，由指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，或指環病毒ORF1分子)。舉例而言，在一些實施例中，宿主細胞包含核酸序列，該核酸序列編碼指環病毒ORF1分子，例如指環病毒ORF1多肽之剪接變異體或功能片段(例如野生型指環病毒ORF1蛋白或由野生型指環病毒ORF1核酸編碼之多肽，例如本文所描述)。在實施例中，編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列包含於核酸構築體(例如質體、病毒載體、病毒、微型環、桿狀病毒質體或人造染色體)中，該核酸構築體包含於宿主細胞中。在實施例中，將編碼指環病毒ORF1分子之核酸序列整合至宿主細胞之基因體中。
使用本文所描述之組合物或方法產生指環病毒科載體(例如，指環載體)亦可涉及指環病毒ORF2分子(例如本文所描述)或其剪接變異體或功能片段之表現。在一些實施例中，指環載體不包含ORF2分子或其剪接變異體或功能片段，及/或編碼ORF2分子或其剪接變異體或功能片段之核酸。在一些實施例中，產生指環載體包含ORF2分子或其剪接變異體或功能片段之表現，但ORF2分子係由除指環病毒科載體以外之核酸表現。
接著在適合於將遺傳元件包封於蛋白質外殼內之條件(例如本文所描述之培養條件)下培育宿主細胞。在一些實施例中，在適合於將指環病毒科載體(例如，指環載體)自宿主細胞中釋放至例如周圍上清液中之條件下進一步培育宿主細胞。在一些實施例中，溶解宿主細胞以自細胞溶解物收穫指環病毒科載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，可將指環病毒科載體(例如，指環載體)引入生長至較高細胞密度之宿主細胞株中。在一些實施例中，宿主細胞為Expi-293細胞。
在一態樣中，本揭露提供一種宿主細胞(例如本文所描述)。在一些實施例中，宿主或宿主細胞為植物、昆蟲、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物(例如人類)或其他生物體或細胞。
將遺傳元件引入宿主細胞中
可將遺傳元件或包含遺傳元件序列之核酸構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，將遺傳元件本身引入宿主細胞中。在一些實施例中，將包含遺傳元件(例如本文所描述)之序列的遺傳元件構築體引入宿主細胞中。遺傳元件或遺傳元件構築體可例如使用此項技術中已知之方法引入宿主細胞中。舉例而言，可藉由轉染(例如穩定轉染或短暫轉染)將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在實施例中，藉由脂染胺(lipofectamine)轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在實施例中，藉由磷酸鈣轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，藉由電穿孔將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，使用基因槍將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，藉由核轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，藉由PEI轉染將遺傳元件或遺傳元件構築體引入宿主細胞中。在一些實施例中，遺傳元件藉由使宿主細胞與包含遺傳元件之指環病毒科載體(例如，指環載體)接觸而引入宿主細胞中。在一些實施例中，將細胞懸浮於2S Chica緩衝液中。
在實施例中，一旦引入宿主細胞中，則遺傳元件構築體能夠複製。在實施例中，一旦引入宿主細胞中，則遺傳元件可由遺傳元件構築體產生。在一些實施例中，在宿主細胞中藉由聚合酶，例如使用遺傳元件構築體作為模板來產生遺傳元件。
在一些實施例中，將遺傳元件或包含遺傳元件之載體引入(例如，轉染)至表現病毒聚合酶蛋白之細胞株中，以便達成指環病毒科載體(例如，指環載體)之表現。為此目的，表現指環病毒科載體(例如，指環載體)聚合酶蛋白之細胞株可用作適當宿主細胞。宿主細胞可類似地經工程改造以提供其他病毒功能或額外功能。
為了製備本文所揭示之指環病毒科載體(例如，指環載體)，遺傳元件構築體可用於轉染提供指環病毒科載體(例如，指環載體)蛋白以及複製及產生所需之功能的細胞。替代地，細胞可經第二構築體(例如病毒)轉染，從而在藉由本文所揭示之遺傳元件或包含遺傳元件之載體轉染之前、期間或之後提供指環病毒科載體(例如，指環載體)蛋白及功能。在一些實施例中，第二構築體可適用於補充不完全病毒顆粒之產生。第二構築體(例如病毒)可具有條件性生長缺陷，諸如宿主範圍限制或溫度敏感性，例如其允許後續選擇轉染病毒。在一些實施例中，第二構築體可提供宿主細胞所用之一或多種複製蛋白質以達成指環病毒科載體(例如，指環載體)之表現。在一些實施例中，宿主細胞可經編碼病毒蛋白(諸如一或多種複製蛋白)之載體轉染。在一些實施例中，第二構築體包含抗病毒靈敏度。
在一些情況下，本文所揭示之遺傳元件或包含遺傳元件之載體可使用此項技術中已知之技術複製且產生至指環病毒科載體(例如，指環載體)中。舉例而言，各種病毒培養方法描述於例如美國專利第4,650,764號；美國專利第5,166,057號；美國專利第5,854,037號；歐洲專利公開案EP 0702085A1；美國專利申請案第09/152,845號；國際專利公開案PCT WO97/12032；WO96/34625；歐洲專利公開案EP-A780475；WO 99/02657；WO 98/53078；WO 98/02530；WO 99/15672；WO 98/13501；WO 97/06270；及EPO 780 47SA1中，其各自以全文引用之方式併入本文中。
例示性細胞類型適合於產生指環病毒科載體(例如，指環載體)之例示性宿主細胞包括但不限於哺乳動物細胞，例如人類細胞及昆蟲細胞。在一些實施例中，宿主細胞為人類細胞或細胞株。在一些實施例中，細胞為免疫細胞或細胞株，例如T細胞或細胞株、癌細胞株、肝臟細胞或細胞株、神經元、膠質細胞、皮膚細胞、上皮細胞、間葉細胞、血球、內皮細胞、眼睛細胞(例如，感光受體細胞、視網膜細胞、後眼杯(posterior eye cup；PEC)細胞、視網膜神經節細胞、視神經細胞、視神經頭細胞或視網膜色素上皮(RPE)細胞)、胃腸道細胞、祖細胞、前驅細胞、幹細胞、肺細胞、心臟細胞或肌肉細胞。在一些實施例中，宿主細胞為動物細胞(例如小鼠細胞、大鼠細胞、兔細胞、或倉鼠細胞、或昆蟲細胞)。
在一些實施例中，宿主細胞為人類細胞。在實施例中，宿主細胞為HEK293T細胞、HEK293F細胞、A549細胞、Jurkat細胞、Raji細胞、Chang細胞、HeLa細胞、Phoenix細胞、MRC-5細胞、NCI-H292細胞或Wi38細胞。在一些實施例中，宿主細胞為非人類靈長類細胞(例如Vero細胞、CV-1細胞或LLCMK2細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為鼠類細胞(例如McCoy細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為倉鼠細胞(例如CHO細胞或BHK 21細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為MARC-145、MDBK、RK-13或EEL細胞。在一些實施例中，宿主細胞為上皮細胞(例如上皮譜系之細胞株)。
在一些實施例中，宿主細胞為淋巴細胞。在一些實施例中，宿主細胞為T細胞或永生化T細胞。在實施例中，宿主細胞為Jurkat細胞。在實施例中，宿主細胞為MOLT細胞(例如MOLT-4或MOLT-3細胞)。在實施例中，宿主細胞為MOLT-4細胞。在實施例中，宿主細胞為MOLT-3細胞。在一些實施例中，宿主細胞為急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞，例如MOLT細胞，例如MOLT-4或MOLT-3細胞。在一些實施例中，宿主細胞為B細胞或永生化B細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含遺傳元件構築體(例如本文所描述)。
在一些實施例中，宿主細胞為MOLT細胞(例如MOLT-4或MOLT-3細胞)。
在一些實施例中，宿主細胞為急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞，例如MOLT細胞，例如MOLT-4或MOLT-3細胞。
在一些實施例中，宿主細胞為293細胞(例如HEK293細胞、HEK293T細胞或Expi-293細胞)。在一些實施例中，宿主細胞為Expi-293F細胞。
在一態樣中，本揭露提供一種製造包含包封於蛋白質外殼中之遺傳元件之指環病毒科載體(例如，指環載體)的方法，該方法包含提供包含指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件之Expi-293細胞，及在允許指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件在Expi-293細胞中變為包封於蛋白質外殼中的條件下培育Expi-293細胞。在一些實施例中，Expi-293細胞進一步包含一或多種形成蛋白質外殼之一部分或全部的指環病毒蛋白(例如指環病毒ORF1分子)。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件係在Expi-293細胞中例如由遺傳元件構築體(例如本文所描述)產生。在一些實施例中，該方法進一步包含將指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件構築體引入Expi-293細胞中。
在一態樣中，本揭露提供一種製造包含包封於蛋白質外殼中之遺傳元件之指環病毒科載體(例如，指環載體)的方法，該方法包含提供包含指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件之MOLT-4細胞，及在允許指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件在MOLT-4細胞中變為包封於蛋白質外殼中的條件下培育MOLT-4細胞。在一些實施例中，MOLT-4細胞進一步包含一或多種形成蛋白質外殼之一部分或全部的指環病毒蛋白(例如指環病毒ORF1分子)。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件係在MOLT-4細胞中例如由遺傳元件構築體(例如本文所描述)產生。在一些實施例中，該方法進一步包含將指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件構築體引入MOLT-4細胞中。
在一態樣中，本揭露提供一種製造包含包封於蛋白質外殼中之遺傳元件之指環病毒科載體(例如，指環載體)的方法，該方法包含提供包含指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件之MOLT-3細胞，及在允許指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件在MOLT-3細胞中變為包封於蛋白質外殼中的條件下培育MOLT-3細胞。在一些實施例中，MOLT-3細胞進一步包含一或多種形成蛋白質外殼之一部分或全部的指環病毒蛋白(例如指環病毒ORF1分子)。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件係在MOLT-3細胞中例如由遺傳元件構築體(例如本文所描述)產生。在一些實施例中，該方法進一步包含將指環病毒科載體(例如，指環載體)遺傳元件構築體引入MOLT-3細胞中。
在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)係在連續動物細胞株(例如，可連續繁殖之永生化細胞株)中培養。
培養條件包含遺傳元件及蛋白質外殼組分之宿主細胞可在適合於將遺傳元件包封在蛋白質外殼內之條件下培育，藉此產生指環病毒科載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，宿主細胞在液體培養基(例如，格里斯氏補充培養基(Grace's Supplemented) (TNM-FH)、IPL-41、TC-100、施奈德氏果蠅培養基(Schneider's Drosophila)、SF-900 II SFM或/及EXPRESS-FIVE™ SFM)中培育。在一些實施例中，宿主細胞係以貼壁培養方式培育。在一些實施例中，宿主細胞係以懸浮培養方式培育。在一些實施例中，宿主細胞係在管、瓶、微載體或燒瓶中培育。在一些實施例中，宿主細胞係在培養皿或孔(例如培養盤上之孔)中培育。在一些實施例中，宿主細胞係在適合於宿主細胞增殖之條件下培育。在一些實施例中，在適合於宿主細胞之條件下培育宿主細胞以將其中產生之指環病毒科載體(例如，指環載體)釋放至周圍上清液中。
產生根據本發明之含有指環病毒科載體(例如，指環載體)之細胞培養物可以不同規模(例如，在燒瓶、滾瓶或生物反應器中)進行。用於培養待感染之細胞之培養基通常包含細胞生存力所需之標準營養物，且亦可包含額外營養物，此視細胞類型而定。視情況，培養基可不含蛋白質及/或不含血清。視細胞類型而定，可在懸浮液中或在受質上培養細胞。在一些實施例中，不同培養基用於生長宿主細胞且用於產生指環病毒科載體(例如，指環載體)。
收穫可例如根據此項技術中已知之方法收穫由宿主細胞產生之指環病毒科載體(例如，指環載體)。舉例而言，可自上清液收穫藉由培養物中之宿主細胞釋放至周圍上清液中之指環病毒科載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，上清液與宿主細胞分離，以獲得指環病毒科載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，在收穫之前或期間溶解宿主細胞。在一些實施例中，自宿主細胞溶解物收穫指環病毒科載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，自宿主細胞溶解物及上清液兩者收穫指環病毒科載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)之純化及分離係根據病毒產生中已知之方法進行，例如Rinaldi等人, DNA Vaccines: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), 第3版 2014, Humana Press (以全文引用的方式併入本文中)中所描述。在一些實施例中，在與醫藥賦形劑一起調配之前，可基於生物物理學特性，例如離子交換層析或切向流過濾，藉由分離溶質來收穫及/或純化指環病毒科載體(例如，指環載體)。
活體外組裝方法可例如藉由活體外組裝，例如在不含細胞之懸浮液中或在上清液中產生指環病毒科載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，遺傳元件與ORF1分子活體外接觸，例如在允許組裝之條件下。
在一些實施例中，桿狀病毒構築體用於產生指環病毒科病毒(例如，指環病毒)蛋白質。此等蛋白質隨後可用於例如活體外組裝以用衣殼包裹遺傳元件，例如包含RNA之遺傳元件。在一些實施例中，編碼一或多種指環病毒科病毒(例如，指環病毒)蛋白質之聚核苷酸與啟動子融合，以在宿主細胞(例如昆蟲或動物細胞)中表現。在一些實施例中，將聚核苷酸選殖至桿狀病毒表現系統中。在一些實施例中，宿主細胞，例如昆蟲細胞經桿狀病毒表現系統感染且培育一段時間。在一些實施例中，將感染細胞培育約1、2、3、4、5、10、15或20天。在一些實施例中，將感染細胞溶解以回收指環病毒科病毒(例如，指環病毒)蛋白質。
在一些實施例中，純化經分離之指環病毒科病毒(例如，指環病毒)蛋白質。在一些實施例中，指環病毒蛋白質使用純化技術，包括但不限於螯合純化、肝素純化、梯度沉降純化及/或SEC純化來純化。在一些實施例中，將經純化之指環病毒科病毒(例如，指環病毒)蛋白質與遺傳元件混合以用衣殼包裹遺傳元件，例如包含RNA之遺傳元件。在一些實施例中，使用ORF1蛋白、ORF2蛋白或其修飾形式來用衣殼包裹遺傳元件。在一些實施例中，用衣殼包裹兩種核酸。舉例而言，第一核酸可為mRNA，例如經化學修飾之mRNA，且第二核酸可為DNA。
在一些實施例中，編碼指環病毒(AV) ORF1之DNA (例如野生型ORF1蛋白、含有突變例如以改良組裝效率、產量或穩定性之ORF1蛋白、嵌合ORF1蛋白或其片段)表現於昆蟲細胞株(例如Sf9及/或HighFive)、動物細胞株(例如雞細胞株(MDCC))、細菌細胞(例如大腸桿菌)及/或哺乳動物細胞株(例如293expi及/或MOLT4)中。在一些實施例中，編碼AV ORF1之DNA可不經標記。在一些實施例中，編碼AV ORF1之DNA可含有N端及/或C端融合之標籤。在一些實施例中，編碼AV ORF1之DNA可在ORF1蛋白內具有突變、插入或缺失以引入標籤，例如以例如透過免疫染色分析(包括但不限於ELISA或西方墨點法)來輔助純化及/或鑑別確定。在一些實施例中，編碼AV ORF1之DNA可單獨或與任何數目之輔助蛋白質組合表現。在一些實施例中，編碼AV ORF1之DNA與AV ORF2及/或ORF3蛋白組合表現。
在一些實施例中，具有突變以改良組裝效率之ORF1蛋白可包括但不限於具有引入N端精胺酸臂(ARG臂)中之突變以改變ARG臂之pI的ORF1蛋白，從而允許pH敏感性核酸結合以觸發顆粒組裝。在一些實施例中，具有改良穩定性之突變的ORF1蛋白可包括互原聚體之突變，其使得典型果凍卷β圓筒之β股F與G接觸，以改變原聚體表面之疏水性狀態且改良衣殼形成之熱力學有利性。
在一些實施例中，本揭露描述一種製備指環載體之方法，該方法包含：(a)提供包含以下之混合物：(i)遺傳元件及(ii)ORF1分子；及(b)在適合於將遺傳元件包封在包含ORF1分子之蛋白質外殼內的條件下培育混合物，藉此製備指環載體；視情況，其中該混合物不包含於細胞中。在一些實施例中，該方法進一步包含在提供(a)之前，例如在宿主細胞(例如昆蟲細胞或哺乳動物細胞)中表現ORF1分子。在一些實施例中，該表現包含在適合於產生ORF1分子之條件下培育宿主細胞(例如昆蟲細胞或哺乳動物細胞)，該宿主細胞包含編碼ORF1分子之核酸分子(例如桿狀病毒表現載體)。在一些實施例中，該方法進一步包含在提供(a)之前，純化由宿主細胞表現之ORF1分子。在一些實施例中，該方法係在無細胞系統中進行。在一些實施例中，本揭露描述一種製造指環載體組合物之方法，其包含：(a)提供根據任一前述實施例之複數種指環載體或組合物；(b)視情況針對以下中之一或多者評估該複數種指環載體或組合物：本文所描述之污染物、光學密度量測(例如OD 260)、顆粒數(例如藉由HPLC)、感染性(例如顆粒:感染單元比率，例如藉由螢光及/或ELISA所測定)；及(c)將複數種指環載體調配為例如適合於投與個體的醫藥組合物，例如在(b)之一或多個參數滿足指定臨限值時。
富集及純化可純化及/或富集收穫之指環病毒科載體，例如以產生指環載體製劑。在一些實施例中，收穫之指環載體係例如使用此項技術中已知用於純化病毒顆粒之方法(例如藉由沉降、層析及/或超濾進行純化)而與收穫溶液中存在之其他成分或污染物分離。在一些實施例中，純化步驟包含自製劑移除以下中之一或多者：血清、宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白質、缺乏遺傳元件之顆粒及/或酚紅。在一些實施例中，收穫之指環病毒科載體相對於收穫溶液中存在之其他組分或污染物富集，例如使用此項技術中已知用於富集病毒顆粒之方法富集。
在一些實施例中，所得製劑或包含製劑之醫藥組合物在可接受之時段及溫度內將為穩定的，及/或與所需投與途徑及/或此投與途徑所必需之任何裝置(例如針或注射器)相容。
III.醫藥組合物 本文所描述之指環病毒科載體、指環載體或其他載體亦可包括於具有例如本文所描述之醫藥賦形劑的醫藥組合物中。在一些實施例中，醫藥組合物包含至少10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、10 14或10 15個指環病毒科載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含約10 5-10 15、10 5-10 10或10 10-10 15個指環病毒科載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含約10 8(例如，約10 5、10 6、10 7、10 8、10 9或10 10)個基因體當量/毫升的指環病毒科載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含10 5-10 10、10 6-10 10、10 7-10 10、10 8-10 10、10 9-10 10、10 5-10 6、10 5-10 7、10 5-10 8、10 5-10 9、10 5-10 11、10 5-10 12、10 5-10 13、10 5-10 14、10 5-10 15或10 10-10 15個基因體當量/毫升之指環病毒科載體。在一些實施例中，醫藥組合物包含足夠的指環病毒科載體，以遞送包含於指環病毒科載體中之遺傳元件的每細胞至少1、2、5、或10、100、500、1000、2000、5000、8,000、1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7個或更多個複本至真核細胞群體。在一些實施例中，醫藥組合物包含足夠的指環病毒科載體，以遞送包含於指環病毒科載體中之遺傳元件的每細胞至少約1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7、或約1×10 4-1×10 5、1×10 4-1×10 6、1×10 4-1×10 7、1×10 5-1×10 6、1×10 5-1×10 7或1×10 6-1×10 7個複本至真核細胞群體。
在一些實施例中，醫藥組合物具有以下特徵中之一或多者：醫藥組合物符合醫藥或良好作業規範(GMP)標準；醫藥組合物係根據良好作業規範(GMP)製備；醫藥組合物具有低於預定參考值之病原體含量，例如實質上不含病原體；醫藥組合物具有低於預定參考值之污染物含量，例如實質上不含污染物；或醫藥組合物具有較低免疫原性或實質上無免疫原性，例如本文所描述。
在一些實施例中，醫藥組合物包含低於臨限量之一或多種污染物。醫藥組合物中宜排除或降至最低之例示性污染物包括但不限於宿主細胞核酸(例如，宿主細胞DNA及/或宿主細胞RNA)、動物來源之組分(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、複製勝任型病毒、無感染性顆粒、游離病毒衣殼蛋白、偶然性物質及聚集物。在實施例中，污染物為宿主細胞DNA。在實施例中，組合物包含每劑量低於約10 ng之宿主細胞DNA。在實施例中，組合物中之宿主細胞DNA的含量藉由過濾及/或酶降解宿主細胞DNA而降低。在實施例中，醫藥組合物由低於10重量% (例如，低於約10重量%、5重量%、4重量%、3重量%、2重量%、1重量%、0.5重量%或0.1重量%)之污染物組成。
在一個態樣中，本文所描述之本發明包括一種醫藥組合物，其包含： a)指環病毒科載體(例如，指環載體)，其包含：遺傳元件，其包含(i)編碼非病原性外部蛋白質之序列、(ii)將該遺傳元件結合至非病原性外部蛋白質之外部蛋白質結合序列及(iii)編碼調節核酸之序列；及蛋白質外殼，其與該遺傳元件締合，例如圍封或包封該遺傳元件；及 b)醫藥賦形劑。
IV.使用方法 本文所描述的指環病毒科載體(例如，指環載體)及包含指環病毒科載體(例如，指環載體)之組合物可用於治療例如有需要個體(例如，哺乳動物個體，例如人類個體)之病症、疾病或病狀的方法中。投與本文所描述之醫藥組合物可為例如藉助於非經腸投與。在一些實施例中，本文所描述之指環病毒科載體(例如，指環載體)或醫藥組合物係視網膜下投與。在一些實施例中，本文所描述之指環病毒科載體(例如，指環載體)或醫藥組合物係玻璃體內投與。在一些實施例中，本文所描述之指環病毒科載體(例如，指環載體)或醫藥組合物係脈絡膜上投與。指環載體可單獨投與或調配為醫藥組合物。
指環病毒科載體(例如，指環載體)可以單位劑量組合物，諸如單位劑量非經腸組合物之形式投與。此類組合物通常藉由混合來製備且可適當地適於非經腸投與。此類組合物可呈例如可注射及可輸注溶液或懸浮液或栓劑或氣溶膠形式。
在一些實施例中，投與例如本文所描述之指環病毒科載體(例如，指環載體)或包含其之組合物可使得指環病毒科載體(例如，指環載體)所包含之遺傳元件遞送至例如個體中之目標細胞。
本文所描述之指環病毒科載體(例如，指環載體)或其組合物，例如包含效應物(例如，內源或外源效應物)可用於遞送效應物至細胞、組織或個體。在一些實施例中，效應物為治療性效應物。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)或其組合物用於遞送效應物至個體，例如哺乳動物個體，例如人類個體之眼睛。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)或其組合物用於遞送效應物至個體，例如哺乳動物個體，例如人類個體之眼睛細胞。在某些實施例中，眼睛之細胞為感光受體細胞、視網膜細胞、後眼杯(PEC)細胞、視網膜神經節細胞、視神經細胞、視神經頭細胞或視網膜色素上皮(RPE)細胞。在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)或其組合物用於遞送效應物至骨髓、血液、心臟、GI或皮膚。藉由投與本文所描述之指環病毒科載體(例如，指環載體)組合物來遞送效應物可調節(例如增加或降低)細胞、組織或個體中之非編碼RNA或多肽的表現量。以此方式調節表現量可使得效應物遞送到之細胞的功能活性改變。在一些實施例中，經調節之功能活性在本質上可為酶促、結構性或調控性的。
在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)或其複本在遞送至細胞中之後24小時(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、30天或1個月)在細胞中可偵測。在實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體)或其組合物介導對目標細胞之作用，且該作用持續至少1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4週，或1、2、3、6或12個月。在一些實施例(例如，其中指環病毒科載體(例如，指環載體)或其組合物包含編碼外源蛋白質之遺傳元件)中，該作用持續少於1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4週，或1、2、3、6或12個月。
V.再給藥 在一些情況下，本文所描述之指環病毒科載體(例如，指環載體)可用作遞送運載體，其可以多次劑量(例如分開投與之劑量)投與。雖然不希望受理論束縛，但在一些實施例中，指環病毒科載體(例如，指環載體) (例如本文所描述)誘導相對較低的免疫反應(如所量測，例如量測為50% GMT值)，例如允許個體重複給藥一或多個指環病毒科載體(例如，指環載體) (例如，多個劑量的相同指環病毒科載體(例如，指環載體)或不同指環病毒科載體(例如，指環載體))。在一態樣中，本發明提供一種遞送效應物之方法，其包含向個體投與第一複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)及隨後投與第二複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)。在一些實施例中，第二複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)包含與第一複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)相同的蛋白質外殼。在另一態樣中，本發明提供一種選擇個體(例如，人類個體)接受效應物之方法，其中該個體先前接受或鑑別為已接受包含編碼效應物之遺傳元件的第一複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)，其中該方法涉及選擇該個體接受包含編碼效應物(例如與由第一複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)之遺傳元件編碼之效應物相同的效應物，或與由第一複數多個指環病毒科載體(例如，指環載體)之遺傳元件編碼之效應物不同的效應物)之遺傳元件的第二複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)。在另一態樣中，本發明提供一種將個體(例如，人類個體)鑑別為適合於接受第二複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)的方法，該方法包含鑑別該個體先前已接受包含編碼效應物之遺傳元件的第一複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)，其中該個體鑑別為已接受該第一複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)指示該個體適合於接受該第二複數個指環病毒科載體(例如，指環載體)。
本文所引用之所有參考文獻及公開案均以引用之方式併入本文中。
提供以下實例以進一步說明本發明之一些實施例，但並不意欲限制本發明之範疇；藉由其例示性性質應理解，可替代地使用熟習此項技術者已知之其他程序、方法或技術。
實例 目錄實例1：用於CNS之活體內轉導之指環載體產生 實例2：經由腦室內(ICV)投與指環載體之腦活體內轉導(研究#1) 實例3：經由鞘內(IT)投與活體內遞送指環載體至脊髓(研究#2) 實例4：經由IT投與活體內遞送指環載體至脊髓及再給藥 實例5：經由ICV投與活體內遞送指環載體至腦及再給藥
實例 1 ： 用於 CNS 之活體內轉導之指環載體產生此實例描述用於CNS之活體內轉導的用於下文研究#1 (實例2)及研究#2 (實例3)之指環載體及AAV對照載體的產生。
AAV9-fCMV-eGFP 對照AAV9-fCMV-eGFP為基於質體pRTx-2770 (SEQ ID NO: 501)之腺相關病毒，該質體具有的有效負載在5'至3'方向包含AAV2 ITR、Ring2 5' NCR、CMV啟動子、eGFP、SV40pA、Ring2 3' NCR及AAV2 ITR (表Z6)。有效負載藉由Packgene Biotech Inc (Houston, Texas)封裝至AAV9中，且以1×10 13個病毒基因體(vgs)/毫升之效價產生。在注射之前，將AAV9-fCMV-eGFP在無菌1×PBS中稀釋至所需效價。 表 Z6. pRTx-2770
名稱 pRTx-2770
類型 質體
長度 5128 bp
註釋：
區域 / 元件 鹼基範圍
大腸桿菌CAP蛋白結合位點 130..151
Lac操縱子啟動子 166..196
LacI抑制因子蛋白結合位點 204..220
AAV2反向末端重複序列 269..409
Ring2 5'NCR 421..844
CMV強化子 881..1260
全CMV啟動子 896..1465
CMV啟動子 1261..1464
惰性5' UTR 1477..1507
Kozak序列 1506..1515
eGFP編碼序列 1512..2231
SV40 poly(A)序列 2262..2383
Ring2 3'NCR 2411..2575
AAV2反向末端重複序列 2589..2729
AmpR啟動子 3246..3350
β內醯胺酶氨苄西林(ampicillin)抗性編碼序列 3351..4211
高複本數ColE1/pMB1/pBR322/pUC複製起點 4382..4970
例示性 eGFP 胺基酸序列 ( 例如由表 Z6 之核苷酸 1512-2231 編碼 ) ： 例示性 β 內醯胺酶胺基酸序列 ( 例如由表 Z6 之核苷酸 3351-4211 編碼 ) ：
Ring19-fCMV-eGFP 指環載體 指環病毒載體產生：親本細胞培養物MOLT-4細胞係獲自國家癌症研究所(National Cancer Institute)。使細胞按比例擴大且在37℃及5% CO 2下維持於完全生長培養基(具有10%胎牛血清(FBS)之Gibco的RPMI 1640，其補充有1 mM丙酮酸鈉、Pluronic F-68 [0.1%]及2 mM L-麩醯胺酸)中之懸浮培養物中。將細胞以0.1E+06個活細胞/毫升之密度接種至各自具有800 mL工作體積之搖瓶(2 L，平底，錐形燒瓶)中，且在37℃及90 rpm以及＞85%相對濕度(RH)下於定軌振盪器(New Brunswick Innova 2100，19 mm圓形軌道)中培養4天。
指環病毒載體產生 ： 轉染 MOLT-4 細胞使用表E0中所列出之三種質體之獨特組合產生Ring19-fCMV-eGFP指環載體。經由電穿孔，用三種質體轉染MOLT-4細胞。
對於各病毒載體產生培養物製備，使5E+08個MOLT-4細胞粒化且再懸浮於Opti-MEM I減少血清培養基中。將800 μg質體添加至各再懸浮細胞中且使用MaxCyte STx電穿孔器及CL1.1電穿孔器總成(MaxCyte目錄號SCL1)進行電穿孔。隨後將各批次之電穿孔細胞轉移至含有預溫熱之完全生長培養基的各別燒瓶中。使經轉染細胞在37℃及5% CO 2下培育且電穿孔後72小時經由離心收穫。用EVOS (M7000，ThermoFisher Scientific之英傑)捕獲10×影像(圖1A及圖1B)。 表 E0. 經轉染以產生 Ring19-fCMV-eGFP 指環載體之質體
指環載體 質體
Ring19-fCMV-eGFP (「R19-eGFP」) pRTx-2847 (R19-eGFP載體) (SEQ ID NO: 502) pRTx-2848 (iCre質體) (SEQ ID NO: 503) pRTx-3525 (R19 SRR) (SEQ ID NO: 500)
遺傳元件構築體質體Ring19遺傳元件構築體pRTX-2847 (SEQ ID NO: 502)經設計成具有側接RING19非編碼區(NCR)及CMV::egfp::WPRE::bGH-pA有效負載卡匣之lox66及lox 71位點。構築體之序列提供於下文。 表 Z1. 用於三質體系統之例示性「 floxed」 Ring19 載體質體 (pRTx-2847)
名稱 pRTx-2847
類型 質體
描述 pLox-Ring19∆ORF::fCMV_EGFP_WPRE_bGH-pA-Rand100。
長度 5452 bp
註釋：
區域/ 元件 鹼基範圍
Lox71 (loxP位點) 432-465
富GC區 529-640
起始元件 813-828
5' UTR保守域 880-950
內含子1 892-979
全CMV啟動子 1004-1573
惰性5' UTR 1585-1619
eGFP編碼序列 1620-2339
WPRE 2343-2934
bGHpA終止子序列 2939-3166
100 bp隨機填充序列 3167-3266
Lox66 (loxP位點) 3271-3304
LacI抑制因子結合位點(互補序列) 3384-3406
Lac操縱子操作員(lacO) 3386-3402
Lac操縱子啟動子(互補序列) 3410-3440
C標籤 3418-3429
大腸桿菌分解代謝物活化因子蛋白質結合位點(互補序列) 3455-3476
複製起點(pUC起點) (互補序列) 3705-4378
卡那黴素抗性(KanR) CDS (互補序列) 4530-5339
Cre 表現質體pRTX-2848 (SEQ ID NO: 503)自CMV啟動子表現iCre。此構築體之序列提供於下文。 表 Z5. 例示性 Cre 重組酶表現質體 (pRTx-2848)
名稱 pRTx-2848
類型 質體
描述 CMV_iCre_pcDNA3.1(+)。
長度 6473 bp
註釋：
區域 / 元件 鹼基範圍
CMV強化子 235-614
CMV啟動子 615-818
T7 RNA聚合酶啟動子 863-880
iCre編碼序列 964-2019
bGHpA終止子序列 2070-2293
複製起點 2962-3097
SV40 polyA序列 4146-4267
Lac操縱子操作員(lacO) 4340-4356
Lac操縱子啟動子(互補序列) 4364-4394
C標籤 4372-4383
分解代謝物活化子蛋白質結合位點 4409-4430
複製起點(互補序列) 4718-5306
氨苄西林抗性基因啟動子(互補序列) 6338-6442
指環病毒載體產生：細胞溶解使細胞沉澱物(pellet)再懸浮於含有以下之溶解緩衝液中：50 mM Tris pH 8.0、0.5% Triton-X100、100 mM NaCl、100× Halt蛋白酶抑制劑混合物(Thermo Fisher Scientific目錄號78439)及200U mSAN核酸酶(ArcticZyme目錄號NC1920045)。藉由在4℃下以12,500 × g離心30分鐘來使細胞溶解物澄清。
指環病毒載體產生 ： 等密度離心為了製備碘克沙醇線性梯度，在26.3 mL聚碳酸酯管中使13 mL之60% OptiPrep (Sigma-Aldrich目錄號D1556)疊加有13 mL之20% OptiPrep，隨後使用Gradient Master (BioComp)以46度角度及20 rpm之速度旋轉16分鐘。在產生碘克沙醇線性梯度之後，自各梯度之頂部移除2 mL碘克沙醇，且在梯度之頂部添加2 mL澄清溶解物。使用70型Ti轉子(Beckman Coulter)在347,000 × g及20℃下旋轉含有樣品之管持續3小時。自管之頂部收集1 mL溶離份且將其轉移至96孔2.2 ml容量盤中。隨後使各溶離份經受下文所描述之DNA酶保護之qPCR分析。
指環病毒載體產生 ： 物質之濃度所關注之溶離份係基於病毒效價判定(圖2A及圖2B)。隨後將匯集之碘克沙醇溶離份1:50稀釋於調配緩衝液(1 × DPBS，0.001% Pluronic F-68)中且使用Vivaspin 20 100K MWCO離心式過濾單元(Fisher Scientific目錄號1455810)濃縮。
指環病毒載體產生 ： 對最終物質之 DNA 酶保護分析將待滴定之5 µl樣品在20 µl反應物中與20 U DNA酶I核酸內切酶(Thermo Fisher Scientific目錄號18047019)一起培育。將反應物在37℃下培育30分鐘。在DNA酶處理之後，使各樣品經受蛋白酶K (Fisher Scientific目錄號FEREO0491)及蛋白酶K緩衝劑(1% SDS、0.1M EDTA、0.1M Tris pH 8.0、0.1% Pluronic F-68)。將反應物在37℃下培育30分鐘，隨後在95℃下蛋白酶K不活化15分鐘。根據製造商之方案，使4 µl之1:10稀釋的DNA酶反應物在20 µl反應物中使用TaqMan Fast通用PCR主混合物(Thermo Fisher Scientific目錄號44-449-63)經受qPCR分析(圖3A及圖3B)。在表E1中列出引子及探針序列。 表 E1. 經設計以定量 eGFP 之引子及探針
目標 標籤 序列(5 3')
eGFP 正向引子 GAACCGCATCGAGCTGAA (SEQ ID NO: 1115)
反向引子 TGCTTGTCGGCCATGATATAG (SEQ ID NO: 1116)
探針(FAM) ATCGACTTCAAGGAGGACGGCAAC (SEQ ID NO: 1117)
指環病毒載體產生 ： 對最終物質之內毒素測試將2.2 μl樣品1:50稀釋於調配緩衝液(1 × DPBS，0.001% Pluronic F-68)中且根據製造商之方案，使樣品經受LAL偵測測試(Charles River)。
指環病毒載體產生 ： 對最終物質之 SDS-PAGE 及考馬斯染色將2 µl樣品1:10稀釋於調配緩衝液(1 × DPBS，0.001% Pluronic F-68)中且將樣品與負載染料及Bolt樣品還原劑(Thermo Fisher Scientific目錄號B0009) 1:1混合，隨後在95℃下沸騰10分鐘。將蛋白質在Bolt 4%-12% Bis-Tris凝膠上在1 × Bolt MOPS SDS操作緩衝液(Thermo Fisher Scientific目錄號B0001)中分離。根據製造商之方案，使用InstantBlue考馬斯蛋白質染劑(ABCAM目錄號ab119211)對經分離之蛋白質進行染色。在染色之後，用diH2O洗滌凝膠三次。使用Chemidoc成像系統(BioRad)觀測到染色凝膠(圖4A及圖4B)。
指環病毒載體產生 ： 二 辛可寧酸 分析 (Bicinchonic Acid Assay ； BCA)將5 μl樣品1:10稀釋於調配緩衝液(1 × DPBS，0.001% Pluronic F-68)中且根據製造商之方案，使樣品經受Pierce BCA蛋白質分析套組(ThermoScientific目錄號23227)。
實例 2 ： 經由腦室內 (ICV) 投與指環載體之腦活體內轉導 ( 研究 #1)此實例證實指環載體經由ICV投與活體內轉導腦。
材料及方法此研究#1中所使用的AAV9-fCMV-eGFP對照及Ring19-fCMV-eGFP指環載體之產生描述於實例1中。
動物之照護及使用所有小鼠研究均由Ring Therapeutics實驗動物照護及使用委員會批準及管理。7至8週齡之雌性FVB/NJ小鼠係獲自Jackson Laboratories以用於此等研究。
腦室內注射小鼠用2%-3%異氟醚麻醉且與加熱墊一起置於立體定位架(Neurotar GmbH)上。將眼部軟膏施加至兩隻眼睛。在施加無菌必妥碘(betadine)及70%酒精之後，製造切口以暴露顱骨。藉由微型鑽孔機進行頭剖開術。將5-10 µL Hamilton注射器緩慢移動至目標座標(側腦室，AP +0.25 mm, ML, ±0.7 mm, DV, -2 mm)。以大約0.02 µL/min之速度注射0.5-3 µL測試品。使用已建立之小鼠腦座標將測試品兩側地或單側地注射至特定腦區域中。用可吸收縫合線(縫合線CT-13.0 coated Vicryl 27")或藉由在皮膚切口或縫合線上施加手術膠來縫合切口。在程序之一週期間，各動物接受ICV注射一次且在ICV注射之後接受丁丙諾啡(buprenorphine)之SC注射一次以用於鎮痛目的。
用於 DNA 及 RNA 萃取之組織收穫解剖出腦且接著在矢狀面定向上切成兩半。一半腦用於DNA處理且另一半來自同一動物之腦用於RNA處理。冷凍腦且將其儲存於2 ml強化珠粒均質器管中用於DNA及RNA萃取兩者。亦收集脊髓樣品且將其儲存於All-prep試劑中用於All-prep DNA及RNA萃取(Qiagen)。
DNA 分離將冷凍組織樣品用自動化組織均質器(Geno/Grinder SPEX Sample Prep)在緩衝液ATL (Qiagen, USA)及蛋白酶K (Qiagen, USA)中以1250 rpm溶解，進行(2個) 30秒輪次。將均質化組織在56℃下在加熱塊上消化約4小時。將基因體DNA用緩衝液AL (Qiagen, USA)及乙醇沉澱，隨後用Qiagen DNeasy 96血液及組織套組分離。使用NanoDrop 8000分光光度計(Thermofisher, USA)定量經分離之DNA。
qPCR使用TaqMan基因表現主混合物(Thermofisher, USA)藉由qPCR在QuantStudio 5即時PCR系統(Thermo Fisher, USA)上分析基因體DNA。由Integrated DNA Technologies, USA合成此研究中所使用之序列偵測引子及FAM定製探針。eGFP引子/探針序列在表E1中。
包括DNA樣品以及已知數量之線性化eGFP及Ring19質體標準物之不同稀釋液的所有反應均一式三份地在相同盤上運行。標準曲線方法用於計算病毒/載體DNA之量，其用各樣品之基因體DNA之總量標準化(使用上文所描述之nanodrop定量)。
RNA 分離將冷凍組織樣品用自動化組織均質器(Geno/Grinder SPEX Sample Prep, USA)在QIAzol溶解試劑(Qiagen, USA)中以1250 rpm溶解，進行(2個) 30秒輪次。藉由添加苯酚氯仿(Thermofisher, USA)在水相中分離RNA，且在4℃下以6000 rpm離心15分鐘。將上部水相轉移至新制S嵌段(Qiagen, USA)中。隨後藉由添加1體積之70%乙醇使RNA沉澱且用Qiagen RNeasy 96套組分離。RNA濃度經由Qubit RNA高敏感性分析套組(Thermofisher, USA)定量。
All-prep DNA 及 RNA 萃取為了自脊髓樣品萃取DNA及RNA，將10 μL BME/1 mL緩衝液RLT Plus添加至樣品中。使用350 μL RLT Plus/BME使組織均質化。減速旋轉Spex管，且將溶解物轉移至潔淨的Eppendorf管中。溶解物在室溫下以6000 rpm自旋4分鐘。將150 μL上清液轉移至All-Prep DNA小型管柱(Qiagen)中且將剩餘上清液溶解物轉移至新標記之Eppendorf中以便在 -80℃下長期儲存。將DNA管柱以最大速度自旋30秒。接著將DNA管柱置放於新收集管中且在4℃下儲存以供後續DNA純化。將14 μL蛋白酶K添加至來自最後一個步驟之流過物(flowthrough)中。將58 μL 100%乙醇添加至流過物中，且充分混合樣品且在室溫下培育10 min。添加115 μL 100%乙醇且充分混合。將所有內含物轉移至RNeasy小型自旋管柱中。在離心之後，將500 μL緩衝液RPE添加至RNeasy小型自旋管柱中。將80 μL DNA酶I轉移且混合至RNeasy管柱中，同時在室溫下培育15 min。添加FRN、緩衝液RPE及100%乙醇以便洗滌管柱。將30 μL不含RNA酶之水直接添加至管柱中且在室溫下培育2至5分鐘。將樣品以最大速度自旋1分鐘以溶離RNA。
一步驟 RT-ddPCR將RNA稀釋於不含核酸酶之水中且與來自一步驟RT-ddPCR高階探針套組(Bio-Rad, USA；目錄號1864022)及eGFP引子/探針組(其中最終引子濃度為900 nM且探針濃度為250 nM)之試劑組合，以量測轉殖基因表現。在RT-ddPCR反應設置之後，根據製造商之說明書，使用自動化液滴產生器(Bio-Rad, USA)將各反應物轉化成液滴。在液滴產生之後，液滴在以下循環條件下經受終點PCR熱循環：1個48℃持續1小時的逆轉錄循環，隨後為1個95℃持續10分鐘的循環；40個95℃持續30秒、60℃持續1 min的循環；及1個98℃持續10 min且最後保持4℃的循環。隨後將循環的盤轉移至QX200液滴讀取器(Bio-Rad, USA)且使用QX管理者軟體(Bio-Rad, USA)分析。
用於免疫組織化學之組織收穫將腦收集於4% PFA中且固定24小時。腦樣品自PFA變成30%蔗糖且在蔗糖中靜置至少2夜直至組織沉降至底部為止。將腦嵌入於OCT化合物中用於切片。將腦在Leica低溫恆溫器中以30 μm切片，且立即安裝於塗覆聚-L-離胺酸之載片上。切片在處理之前儲存在-80℃下。
免疫組織化學將載片風乾20分鐘且接著用1×PBS洗滌三次，各次5分鐘。將載片在室溫下與含10%山羊血清之TBST一起培育2小時，隨後在4℃下與1:500之初級抗體(具有10%山羊血清的GFP重組兔單株抗體, ThermoFisher G10362, TBST)一起培育48小時。載片用PBS洗滌三次，各次5分鐘且在室溫下於1:2000二級抗體(具有10%山羊血清的山羊抗兔IgG (H+L)交叉吸收之二級抗體Alexa-fluor 488 (ThermoFisher A11008) TBST)中培育2小時，避光。載片用PBS洗滌三次，各次5分鐘。將DAPI安裝培養基(ThermoFisher P36966)添加至載片中且覆蓋有蓋玻片。用EVOS (M7000, ThermoFisher Scientific之Invitrogen)捕獲2×影像，且用共焦顯微鏡(Zeiss LSM900)捕獲20×影像。
結果 指環載體 R19-fCMV-eGFP ( 「 R19-eGFP 」 ) 在腦中 之感染性藉由腦室內(ICV)注射向小鼠投與製備之病毒製劑，如表E2中所示。向小鼠注射PBS、R19-eGFP或劑量匹配之AAV9-eGFP。在注射後21天，收集且處理腦及脊髓。 表 E2. ICV 投與之研究設計 #1 。
群組 處理 第0 天 劑量 / 眼睛 (vg) 途徑 ( 體積) N ( 小鼠) 終止日
1 PBS 0 ICV (2×2 μl) 7 21
2 R19-fCMV-eGFP (「R19-eGFP」) 3.6e+8 ICV (2×2 μl) 7 21
3 AAV9-fCMV-eGFP (「AAV9-eGFP」) 3.6e+8 ICV (2×2 μl) 7 21
自左側腦半球收集DNA。在經R19-eGFP指環載體及AAV9-eGFP轉導之腦中藉由qPCR偵測到eGFP基因體，而在PBS對照組中未偵測到eGFP基因體(圖5A)。相比之下，所投與之劑量下的PBS組、R19-eGFP指環載體組及AAV9-eGFP組中之脊髓中的eGFP基因體含量低於qPCR之偵測限(圖5B)。
藉由 ICV 注射投與 Ring19-eGFP 指環載體誘導腦中之 eGFP mRNA 表現為判定投與R19-eGFP指環載體是否可誘導eGFP mRNA表現，在感染後21天自右側腦半球收集RNA (n=5個腦半球/組)。接著藉由RT-ddPCR定量eGFP mRNA。在經R19-eGFP及AAV9-eGFP感染後21天，在腦中偵測到eGFP mRNA，而在PBS對照組中未偵測到eGFP mRNA (圖6)。
藉由 ICV 注射投與 R19-eGFP 指環載體誘導腦中之 eGFP 蛋白表現為判定投與R19-eGFP指環載體是否可在腦中活體內產生eGFP蛋白，在感染固定及免疫組織化學之後第21天收集腦組織(n=2個腦/組)。針對eGFP對ICV注射之小鼠之代表性腦切片進行染色。圖7A、圖7B及圖7C顯示在2×放大率下，針對分別來自PBS對照組、R19-eGFP組及AAV9-eGFP組之eGFP染色之腦切片的影像。紅色方塊中之區域放大至20× (圖7D、圖7E及圖7F)。雖然PBS對照未顯示eGFP染色(圖7D)，但在R19-eGFP (圖7E)及AAV9-eGFP (圖7F)處理之腦之海馬體中偵測到eGFP陽性神經元。此等資料顯示投與R19-eGFP指環載體引起eGFP蛋白在腦中之表現。
實例 3 ： 經由鞘內 (IT) 投與活體內遞送指環載體至脊髓 ( 研究 #2)此實例描述活體內遞送Ring19-eGFP指環載體至脊髓。
材料及方法此研究#2中所使用的AAV9-fCMV-eGFP對照及Ring19-fCMV-eGFP指環載體之產生描述於實例1中。
除了如下文所描述進行鞘內注射以外，所有其他方法均根據上述實例2。
鞘內注射小鼠用3%異氟醚麻醉，直至其顯示無翻正反射(righting reflex)跡象。另外，檢查尾部及/或爪捏反射(pinch reflex)以進一步確保麻醉之狀態。在約2 cm 2之區域中對動物靠近尾部基部的後端進行刮毛，以促進針插入期間的較好可視化。將小鼠置放於鼻錐體(nose cone)中用於在程序期間繼續異氟醚投與。在程序期間，將異氟醚減少至1.5%且小鼠之眼睛覆蓋有眼睛潤滑劑以防止眼睛損傷。10至50 μl具有26號針之Hamilton用於定位脊髓之L5-L6區域。將針插入於L5與L6脊椎之凹槽之間。甩尾(tail flick)指示針成功進入硬膜內空間。一旦觀測到甩尾，則立即但謹慎地用一隻手固定針位置且使用另一隻手緩慢注射所需體積之物質。每隻小鼠注射不超過5 μl。一旦進行注射，則將小鼠移動回到籠中以自麻醉恢復。各動物接受每週一次IT注射持續2週，隨後在程序週期間視需要接受鎮痛藥物皮下注射一次。
藉由鞘內(IT)注射將病毒製劑投與至小鼠中，如表E3中所示。向小鼠注射PBS、R19-eGFP或劑量匹配之AAV9-eGFP。在注射後21天，收集且處理脊髓及腦。 表 E3. IT 投與之研究設計 #2 。
群組 處理 第0 天 劑量/ 眼睛 (vg) 途徑 ( 體積) N ( 小鼠) 終止日
1 PBS 0 IT (50 μL) 7 21
2 R19-fCMV-eGFP 9.6e+9 IT (50 μL) 7 21
3 AAV9-fCMV-eGFP 9.6e+9 IT (50 μL) 7 21
結果如實例2中所描述自脊髓及腦收集DNA，且在脊髓(圖8A)及腦(圖8B)中藉由qPCR偵測到eGFP基因體。eGFP基因體經與劑量匹配之AAV9-eGFP類似的含量的R19-eGFP指環載體轉導，而在PBS對照中未偵測到eGFP基因體。
實例 4 ： 經由 IT 投與活體內遞送指環載體至脊髓及再給藥此實例描述將Ring19-eGFP指環載體活體內再給藥至脊髓。
材料及方法如上文所描述產生AAV9-fCMV-eGFP對照。
藉由經由電穿孔使用表E0中所示之三種質體(pRTx-3525；pRTx-2847；pRTx-2848)轉染MOLT-4細胞來產生R19-fCMV-eGFP指環載體。電穿孔後72小時收穫經轉染細胞且離心。丟棄上清液，且在-80℃下冷凍沉澱物。將細胞解凍且再懸浮於緩衝液中。溶解物最初藉由離心澄清，接著無菌過濾。澄清的收穫物池使用切向流過濾(tangential flow filtration；TFF)進行緩液沖交換。在緩衝液交換之後，匯集物(pool)經無菌過濾。
將緩衝液交換之澄清的收穫物池分成2個相等體積池以在CIMultus DEAE單石(Monolith) (Sartorius AG)上進行兩次層析循環。平衡單石，且將第一池負載至單石上。在載體溶離之後，剝離管柱且層析製程接著用第二半收穫物池重複，且匯集各所得溶離物以供進一步處理。
使用Triton緩衝液對上述溶離匯集物進行Triton相分離以自匯集物移除內毒素。離心匯集物，且經由移液自各管收集頂部水相且經匯集。
triton相分離後匯集物經由肝素親和性層析進一步純化。溶離載體且收集所得50 mL溶離匯集物以供進一步處理。
將肝素溶離匯集物負載至100kDa TFF濾筒(Formulatrix)上且進行緩衝液交換。接著進行最終2.5×濃縮至4 mL最終體積。無菌過濾緩衝液交換之TFF匯集物且等分以在-80℃下儲存。
實驗設計PBS對照、AAV9-fCMV-eGFP (「AAV9-eGFP」或「AAV-eGFP」)及Ring19-fCMV-eGFP (「Ring19-eGFP」)係根據表E4藉由鞘內(IT)注射投與至FVB/NJ小鼠中。如實例2中所描述分析eGFP的DNA、RNA及免疫組織化學。 表 E4. 研究設計
群組 處理 第0 天 處理 第21 天 載體劑量 (vg/ml) 劑量/ 動物 (vg) 途徑 N ( 動物) 終止日
1 PBS 取出(Takedown) 0 0 IT (50 μl) 5 21
2 PBS NA 0 0 IT (50 μl) 5 42
3 PBS PBS 0/0 0/0 IT (50 μl) 5 42
4 RING19-fCMV-eGFP 取出 1.55E+10 7.75E+8 IT (50 μl) 5 21
5 RING19-fCMV-eGFP NA 1.55E+10 7.75E+8 IT (50 μl) 5 42
6 RING19-fCMV-eGFP RING19-fCMV-eGFP 2.4E+10/2.4E+10 7.75E+8/7.75E+8 IT (50 μl) 5 42
7 AAV9-fCMV-eGFP 取出 2.4E+10 1.2E+9 IT (50 μl) 5 21
8 AAV9-fCMV-eGFP NA 2.4E+10 1.2E+9 IT (50 μl) 5 42
9 AAV9-fCMV-eGFP AAV9-fCMV-eGFP 2.4E+10/2.4E+10 1.2E+9/1.2E+9 IT (50 μl) 5 42
結果如表E4中所概述在處理後第21天或第42天自脊髓、腦、肝臟及肌肉收集DNA，且藉由qPCR偵測eGFP基因體。如圖9A中所示，在接受PBS對照之動物中之任一者的脊髓中未偵測到eGFP基因體，而在第21天(「R19-eGFP-D21」及第42天(「R19-eGFP ×1 D42」)在投與單一劑量之Ring19-eGFP指環載體之動物的脊髓中偵測到eGFP基因體，其中在第42天偵測到基因體含量增加。在用Ring19-eGFP初始處理後21天接受第二劑量之Ring19-eGFP (「R19-eGFP ×2 D42」)的動物中，脊髓中之eGFP基因體含量大於僅接受單一劑量之動物。雖然相較於AAV9-eGFP，動物接受略微較低劑量的Ring19-eGFP指環載體，但相較於接受單一劑量之AAV9-eGFP (「AAV9-eGFP ×1 D42」)的動物及接受兩個劑量之AAV9-eGFP (「AAV9 eGFP ×2 D42」)的動物，接受單一劑量之R19-eGFP指環載體(「R19-eGFP ×1 D42」)的動物及接受兩個劑量之Ring19-eGFP (「R19-eGFP ×2 D42」)的動物在第42天之脊髓中的eGFP基因體含量較高。
如圖9B中所示，在接受PBS對照之動物中之任一者的腦中或在投與單一劑量之Ring19-eGFP指環載體之動物在第21天(「R19-eGFP-D21」)及第42天(「R19-eGFP ×1 D42」)之腦中未偵測到eGFP基因體。然而，在用Ring19-eGFP初始處理後21天接受第二劑量之Ring19-eGFP (「R19-eGFP ×2 D42」)之一隻動物的腦中偵測到一些eGFP基因體，類似於接受第二劑量之AAV9-eGFP (「AAV-eGFP ×2 D42」)之動物中的eGFP基因體含量。
如圖9C中所示，在接受PBS對照之動物中之任一者的肝臟中未偵測到eGFP基因體。在投與單一劑量之Ring19-eGFP指環載體之動物之肝臟中，在第21天(「R19-eGFP-D21」)及第42天(「R19-eGFP ×1 D42」)之肝臟中偵測到eGFP基因體。在用Ring19-eGFP初始處理後21天接受第二劑量之Ring19-eGFP (「R19-eGFP ×2 D42」)之動物之肝臟中偵測到的eGFP基因體含量高於接受單一劑量之Ring19-eGFP指環載體之動物。
如圖9D中所示，在接受PBS對照之動物中之任一者的肌肉中或在投與單一劑量之Ring19-eGFP指環載體之動物在第21天(「R19-eGFP-D21」)及第42天(「R19-eGFP ×1 D42」)之肌肉中未偵測到eGFP基因體。然而，在用Ring19-eGFP初始處理後21天接受第二劑量之Ring19-eGFP (「R19-eGFP ×2 D42」)之動物的肌肉中偵測到一些eGFP基因體。雖然在接受AAv9-eGFP之單一劑量(「AAV9-eGFP-D21」及「AAV-eGFP ×1 D42」)之動物的肌肉中偵測到eGFP基因體，但eGFP基因體含量並未隨著投與第二劑量之AAV9-eGFP (「AAV-eGFP ×2 D42」)而增加。
在處理後第21天或第42天自脊髓及肝臟收集RNA以用於藉由RT-ddPCR進行eGFP mRNA偵測。如圖10A中所示，PBS對照及用處於所投與之劑量下之Ring19-eGFP處理之小鼠之脊髓中的eGFP mRNA含量低於偵測限，而在用AAV9-eGFP處理之小鼠之脊髓中偵測到eGFP mRNA。類似地，如圖10B中所示，PBS對照及用Ring19-eGFP處理之小鼠之肝臟中的eGFP mRNA含量低於偵測限，而在用AAV9-eGFP處理之小鼠之肝臟中偵測到eGFP mRNA。
在處理後第21天自來自第4組及第7組之小鼠的腦及肌肉收集RNA以用於藉由RT-ddPCR進行eGFP mRNA偵測。如圖10C中所示，PBS對照及用處於所投與之劑量下之Ring19-eGFP處理之小鼠之腦中的eGFP mRNA低於偵測限，而在用AAV9-eGFP處理之小鼠之腦中偵測到eGFP mRNA。類似地，如圖10D中所示，PBS對照及用處於所投與之劑量下之Ring19-eGFP處理之小鼠之肌肉中的eGFP mRNA低於偵測限，而在用AAV9-eGFP處理之小鼠之肌肉中偵測到eGFP mRNA。
在處理後第21天或第42天亦收集脊髓以用於固定及免疫組織化學。針對eGFP對處理小鼠之代表性脊髓切片進行染色。圖11A、圖11B及圖11C顯示在20×放大率下，針對來自PBS對照(分別為第1組、第2組及第3組)之eGFP染色之脊髓切片的影像。圖11D、圖11E及圖11F顯示在20×放大率下，針對分別來自第4組、第5組及第6組中的用Ring19-eGRP處理之小鼠之eGFP染色之脊髓的影像。圖11G、圖11H及圖11I顯示在20×放大率下，針對分別來自第7組、第8組及第9組中的用AAV9-eGFP處理之小鼠之eGFP染色之脊髓的影像。圖11J (2×放大率)中之紅色方塊中之區域顯示圖11I中放大至20×之區域。在PBS對照中之任一者中未偵測到eGFP染色(圖11A至圖11C)。在以所投與之劑量單次給藥之後，在Ring19-eGFP處理之小鼠中未偵測到eGFP染色(圖11D及圖11E)。在AAV9-eGFP處理之小鼠之脊髓中偵測到eGFP蛋白(圖11G至圖11I)。
實例 5 ： 經由 ICV 投與活體內遞送指環載體至腦及再給藥此實例描述將Ring19-eGFP指環載體活體內再給藥至腦。
材料及方法AAV9-fCMV-eGFP為基於上文所描述之質體pRTx-2770的腺相關病毒且將其封裝至AAV9中。藉由用表E0中所示之三種質體(pRTx-3525；pRTx-2847；pRTx-2848)轉染MOLT-4細胞來產生Ring19-fCMV-eGFP。
根據表E5，藉由腦室內(ICV)注射將PBS對照、AAV9-fCMV-eGFP (「AAV9-eGFP」)及Ring19-fCMV-eGFP (「Ring19-eGFP」)投與至FVB/NJ小鼠中。如實例2中類似描述分析腦中之eGFP的DNA、RNA及免疫組織化學。 表 E5. 研究設計
群組 第0 天處理 第21 天處理 劑量/ 動物(vg) 途徑 N ( 動物) 終止日
1 PBS 取出 0 ICV ~6 21
2 PBS NA 0 ICV ~5 42
3 PBS PBS 0/0 ICV ~5 42
4 RING19-fCMV-eGFP 取出 E7-E10 ICV ~6 21
5 RING19-fCMV-eGFP NA E7-E10 ICV ~5 42
6 RING19-fCMV-eGFP RING19-fCMV-eGFP E7-E10/E7-E10 ICV ~5 42
7 AAV9-fCMV-eGFP 取出 E7-E10 ICV ~6 21
8 AAV9-fCMV-eGFP NA E7-E10 ICV ~5 42
9 AAV9-fCMV-eGFP AAV9-fCMV-eGFP E7-E10/E7-E10 ICV ~5 42
根據表E5中所示之排程，在初始投與後第21天或第42天，將動物取出，且收集及處理來自腦之DNA及RNA。qPCR用於偵測DNA樣品中之eGFP基因體，且RT-ddPCR用於偵測RNA樣品中之eGFP RNA。亦可進行免疫組織化學以偵測eGFP蛋白。
當結合附圖閱讀時，將更好地理解本發明之實施例的以下詳細描述。出於說明本發明之目的，在圖式中展示本發明例示之實施例。然而，應理解，本發明不限於圖式中所展示之實施例之確切配置及工具。 圖1A及圖1B為電穿孔後72小時的經pRTx-2847 (R19-eGFP載體，SEQ ID NO: 502)、pRTx-2848 (iCre質體，SEQ ID NO: 503)及pRTx-3525 (R19 SRR，SEQ ID NO: 500)轉染之MOLT4細胞的代表性合併(GFP及亮場)影像。在10×下獲取研究#1生產細胞(圖1A)及研究#2生產細胞(圖1B)之影像。白血球展現GFP表現。 圖2A及圖2B為描述關於研究#1 Ring19-eGFP指環載體物質(圖2A)及研究#2 Ring19-eGFP指環載體物質(圖2B)之碘克沙醇後溶離份的每份細胞溶解物之DNA酶保護之eGFP複本數的圖。 圖3A及圖3B為描述研究#1 Ring19-eGFP指環載體物質(圖3A)及研究#2 Ring19-eGFP指環載體物質(圖3B)之病毒物質之濃縮前及濃縮後的DNA酶保護之Ring19-eGFP複本數的圖。 圖4A及圖4B描述展示關於研究#1 Ring19-eGFP指環載體物質(圖4A)及研究#2 Ring19-eGFP指環載體物質(圖4B)之濃縮前及濃縮後病毒物質之考馬斯染色的凝膠。 圖5A及圖5B描述展示藉由qPCR對小鼠腦(圖5A)及脊髓(圖5B)中之eGFP gDNA進行定量的圖。各點表示一個腦半球或脊髓。每組n = 5。 圖6描述展示藉由RT-ddPCR對小鼠腦中之eGFP mRNA進行定量的圖。各點表示一個腦半球。n = 5個腦半球/組。 圖7A至圖7F描述針對來自PBS對照組(圖7A、圖7D)、R19-eGFP組(圖7B、圖7E)及AAV9-eGFP組(圖7C、圖7F)之eGFP蛋白質染色的ICV注射之小鼠之代表性腦切片的螢光顯微影像。在2×(圖7A至圖7C)或20×(圖7D至圖7F)放大率下獲取影像。圖7A至圖7C中之白色方塊指示各別2×影像中之20×放大率的位置。在R19-eGFP組及AAV9-eGFP組中偵測到eGFP蛋白質表現，而在PBS對照組中未偵測到染色。n= 2個腦/組。 圖8A及圖8B描述展示藉由qPCR對藉由鞘內(IT)注射投與PBS、R19-fCMV-eGFP或AAV9-fCMV-eGFP之小鼠中的脊髓(圖8A)及腦(圖8B)中之eGFP gDNA進行定量的圖。每組n=5。 圖9A至圖9D描述展示藉由qPCR對來自以下之小鼠中之脊髓(圖9A)、腦(圖9B)、肝臟(圖9C)及肌肉(圖9D)中之eGFP gDNA進行定量的圖：群組1 (「PBS-D21」)、群組2 (「PBS ×1 D42」)、群組3 (「PBS ×2 D42」)、群組4 (「R19-eGFP-D21」)、群組5 (「R19-eGFP ×1 D42」)、群組6 (「R19-eGFP ×2 D42」)、群組7 (「AAV9-eGFP-D21」)、群組8 (「AAV-eGFP ×1 D42」)及群組9 (「AAV-eGFP ×2 D42」)。 圖10A至圖10D描述展示藉由RT-ddPCR對來自以下之小鼠中之脊髓(圖10A)、肝臟(圖10B)、腦(圖10C)及肌肉(圖10D)中之eGFP mRNA進行定量的圖：群組1 (「PBS-D21」)、群組2 (「PBS ×1 D42」)、群組3 (「PBS ×2 D42」)、群組4 (「R19-eGFP-D21」)、群組5 (「R19-eGFP ×1 D42」)、群組6 (「R19-eGFP ×2 D42」)、群組7 (「AAV9-eGFP-D21」)、群組8 (「AAV-eGFP ×1 D42」)或群組9 (「AAV-eGFP ×2 D42」)。在圖10C及圖10D中，「PBS」對應於群組1，「Ring19-eGFP」對應於群組4，且「AAV9-eGFP」對應於群組7。 圖11A至圖11J描述針對來自以下之eGFP蛋白質染色的IT注射之小鼠之代表性脊髓切片的螢光顯微影像：群組1 (「PBS 21天」) (圖11A)、群組2 (「PBS 42天」) (圖11B)、群組3 (「PBS再給藥」) (圖11C)、群組4 (「R19 21天」) (圖11D)、群組5 (「R19 42天」) (圖11E)、群組6 (「R19再給藥」) (圖11F)、群組7 (「AAV 21天」) (圖11G)、群組8 (「AAV 42天」) (圖11H)及群組9 (「AAV再給藥」) (圖11I及圖11J)。圖11A至圖11I係以20×放大率展示。圖11J (2×放大率)中之方塊指示圖11I中放大至20×之組織的位置。
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Claims (46)

  1. 一種遞送外源效應物至個體之中樞神經系統(CNS)之方法，該方法包含向該個體之CNS投與指環病毒科(Anelloviridae)載體(例如，指環載體)。
  2. 一種遞送能夠編碼(例如編碼)外源效應物之DNA至個體之CNS的方法，該方法包含向該個體之CNS投與指環病毒科載體(例如，指環載體)。
  3. 如請求項1或2之方法，其包含遞送該指環病毒科載體至該個體之腦。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其包含在該個體之腦中產生該外源效應物及/或能夠編碼(例如編碼)該外源效應物之DNA。
  5. 一種調節個體之CNS中之生物功能的方法，該方法包含向該個體之CNS投與指環病毒科載體(例如，指環載體)。
  6. 如請求項5之方法，其包含遞送該指環病毒科載體至該個體之腦。
  7. 如請求項5或6之方法，其包含調節該個體之腦中的生物功能。
  8. 一種治療有需要個體之CNS疾病或病症之方法，該方法包含向該個體投與指環病毒科載體(例如，指環載體)。
  9. 如請求項8之方法，其中該CNS疾病或病症為腦疾病或病症。
  10. 如請求項8或9之方法，其中該CNS疾病或病症係選自：共濟失調不平衡(例如弗里德賴希氏共濟失調(Friedreich's ataxia))、脊髓性小腦萎縮症、額顳葉型失智症、阿茲海默氏症(Alzheimer's Disease)、帕金森氏病(Parkinson's Disease)、路易體性失智症(Lewy body dementia)、遺傳性癲癇發作、杭丁頓氏病(Huntington's disease)、精神障礙(例如，精神分裂症、躁鬱症或抑鬱)、脊髓性肌肉萎縮症(spinal muscular atrophy；SMA)、多發性硬化症、創傷性腦損傷、腦腫瘤、遺傳性疾病(例如罕見遺傳性疾病)、巴登氏病(Batten disease)、雷特氏症候群(Rett syndrome)、杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy)、肌肉萎縮性側索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis；ALS)、神經發育疾病(例如，自閉症、雷特氏症候群或脆弱X染色體症候群(Fragile X syndrome))或腦白質失養症(例如，腎上腺腦白質失養症或異染性腦白質失養症)。
  11. 如請求項8至10中任一項之方法，其中該個體具有以下中之一或多者之障礙：記憶、行為或語言。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其使得指環載體DNA遞送於一或多種選自以下之細胞類型中：神經元(例如，GABA激導性神經元、麩胺酸激導性神經元、脊髓運動神經元)、神經膠質細胞、微神經膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及星狀細胞。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其使得該外源效應物在一或多種選自以下之細胞類型中表現：神經元(例如，GABA激導性神經元、麩胺酸激導性神經元、脊髓運動神經元)、神經膠質細胞、微神經膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及星狀細胞。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其包含使該指環載體與一或多種選自以下之細胞類型接觸(例如，直接或間接接觸)：神經元(例如，GABA激導性神經元、麩胺酸激導性神經元、脊髓運動神經元)、神經膠質細胞、微神經膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及星狀細胞。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其使得指環載體DNA遞送於以下中之一或多者中：小腦、額顳葉(例如於海馬體中)、頂葉、腦幹及脊髓。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其使得該外源效應物在以下中之一或多者中表現：小腦、額顳葉(例如於海馬體中)、頂葉、腦幹及脊髓。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其包含使該指環載體與以下中之一或多者接觸(例如，直接或間接接觸)：小腦、額顳葉(例如於海馬體中)、頂葉、腦幹及脊髓。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其使得該外源效應物及/或編碼該外源效應物之該DNA至腦的遞送量大於至脊髓的遞送量。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該指環病毒科載體(例如，指環載體)係根據選自以下之投與途徑投與：鞘內(IT)、腦室內(ICV)、大池內(ICM)或實質內(IPa)。
  20. 如請求項18之方法，其中該指環病毒科載體(例如，指環載體)係根據腦室內(ICV)投與途徑投與。
  21. 如前述請求項中任一項之方法，其中該指環病毒科載體為包含含有ORF1分子之蛋白質外殼(proteinaceous exterior)及由該蛋白質外殼包封之遺傳元件的指環載體，其中該遺傳元件包含可操作地連接至編碼該外源效應物之核酸序列(例如，DNA序列)的啟動子元件。
  22. 如前述請求項中任一項之方法，其中該指環病毒科載體為包含蛋白質外殼之指環載體，該蛋白質外殼包含具有表A1至A3中之任一者中所列出之ORF1序列的ORF1分子，或包含與該ORF1序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列的多肽。
  23. 如前述請求項中任一項之方法，其中該ORF1分子相對於表A1至A3之野生型ORF1蛋白包含至少一個差異。
  24. 如前述請求項中任一項之方法，其中該差異包含突變(例如，插入、取代或缺失)、化學修飾或酶修飾。
  25. 如前述請求項中任一項之方法，其中該突變包含缺失，例如缺失域(例如富精胺酸區、果凍卷域(jelly-roll domain)、HVR、N22或CTD中之一或多者，例如本文所描述)。
  26. 如前述請求項中任一項之方法，其中該ORF1分子包含ORF1域及外源部分，例如外源表面部分。
  27. 如前述請求項中任一項之方法，其中該指環病毒科載體為包含蛋白質外殼之指環載體，該蛋白質外殼包含由表N1至N3中所列出之指環病毒ORF1核酸序列編碼的多肽，或由與該指環病毒ORF1核酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列編碼的多肽。
  28. 如前述請求項中任一項之方法，其中該遺傳元件包含指環病毒5' UTR保守域，其具有SEQ ID NO: 54之核苷酸323-393之反向互補序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列，或其功能部分。
  29. 如前述請求項中任一項之方法，其中該遺傳元件包含指環病毒富GC區，其具有SEQ ID NO: 54之核苷酸2868-2929之反向互補序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列，或其功能部分。
  30. 如請求項1至27之方法，其中該遺傳元件包含指環病毒5' UTR保守域，其具有SEQ ID NO: 1之核苷酸1-71之反向互補序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列，或其功能部分。
  31. 如請求項1至27或30之方法，其中該遺傳元件包含指環病毒富GC區，其具有SEQ ID NO: 1之核苷酸2515-2615之反向互補序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸序列，或其功能部分。
  32. 如前述請求項中任一項之方法，其中該指環病毒富GC區之部分為至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸。
  33. 如前述請求項中任一項之方法，其中該遺傳元件為DNA。
  34. 如前述請求項中任一項之方法，其中該遺傳元件為環狀單股DNA。
  35. 如請求項1至32中任一項之方法，其中該遺傳元件為RNA，例如mRNA。
  36. 如前述請求項中任一項之方法，其中該外源效應物包含：胞內肽或胞內多肽、分泌性多肽或蛋白質替代治療劑。
  37. 如前述請求項中任一項之方法，其中該指環病毒科載體(例如，指環載體)為乙型細環病毒(Betatorquevirus)。
  38. 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含向該個體之CNS投與額外劑量的指環病毒科載體(例如，指環載體)。
  39. 如請求項38之方法，其中該指環病毒科載體與該額外劑量之該指環病毒科載體相同。
  40. 如請求項38之方法，其中該指環病毒科載體與該額外劑量之該指環病毒科載體不同。
  41. 如前述請求項中任一項之方法，其使得編碼該外源效應物之該DNA至CNS的遞送量大於至肌肉的遞送量。
  42. 如前述請求項中任一項之方法，其使得編碼該外源效應物之該DNA至CNS的遞送量大於至肝臟的遞送量。
  43. 如前述請求項中任一項之方法，其使得編碼該外源效應物之該DNA至脊髓的遞送量大於至肌肉的遞送量。
  44. 如前述請求項中任一項之方法，其使得編碼該外源效應物之該DNA至脊髓的遞送量大於至肝臟的遞送量。
  45. 如請求項41至44中任一項之方法，其中該較大遞送量為高2倍、5倍或10倍。
  46. 一種適合於遞送至CNS之遞送系統，其中該遞送系統包含指環病毒科載體(例如，指環載體)。
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