[go: up one dir, main page]

TW202504918A - 靶向ｂｃｍａ及ｃｄ２８的雙特異性抗體 - Google Patents

靶向ｂｃｍａ及ｃｄ２８的雙特異性抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW202504918A
TW202504918A TW113119794A TW113119794A TW202504918A TW 202504918 A TW202504918 A TW 202504918A TW 113119794 A TW113119794 A TW 113119794A TW 113119794 A TW113119794 A TW 113119794A TW 202504918 A TW202504918 A TW 202504918A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
bcma
antibody
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
TW113119794A
Other languages
English (en)
Inventor
瑪琳 比赫
亞歷山大 克里斯蒂安 布喬茲克
古提瑞斯 喜洛斯 亞歷山卓 卡皮
珍 埃克曼
坦嘉 佛蒂
艾爾吉拉德斯 葛雷維斯
卡瑞娜 黑吉
克里斯汀 克萊
茱利亞 克魯格
史蒂芬 落倫茲
多倫 席琳 馬爾本
帕洛 尤瑪那
Original Assignee
瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 filed Critical 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Publication of TW202504918A publication Critical patent/TW202504918A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明涉及新穎人源化 BCMA 抗體及與 BCMA 及 CD28 特異性結合的雙特異性抗體、其生產方法、含有該些抗體的醫藥組成物及使用其之方法。

Description

靶向　BCMA　及　CD28　的雙特異性抗體
本發明涉及新穎人源化 BCMA 抗體及與 BCMA 及 CD28 特異性結合的雙特異性抗體、其生產方法、含有該些抗體的醫藥組成物及使用其之方法。
癌症免疫療法正在成為一種日益有效的治療選擇，可在例如黑色素瘤、非小細胞肺癌和腎細胞癌等癌症類型中產生顯著且持久的反應。這主要是由於幾種免疫檢查點抑制劑成功，包括抗 PD-1 (例如 Keytruda，Merck；Opdivo，BMS)、抗 CTLA-4 (例如 Yervoy，BMS) 及抗 PD-L1 (例如 Tecentriq，Roche)。這些藥劑很可能作為許多癌症類型的標準照護，或作為組合療法的骨幹，然而，只有一小部分患者 (＜25%) 受益於此類療法。此外，各種癌症 (前列腺癌、結腸直腸癌、胰臟癌、肉瘤、非三陰性乳癌等) 都對該些免疫調節劑表現出初級抗性。許多報告指出，預先存在的抗腫瘤 T 細胞的缺失導致了一些患者缺乏反應或反應不佳。總之，儘管現有免疫療法具有令人印象深刻的抗癌效果，但對於解決大量癌症患者群體並開發目標為誘導並增強新穎腫瘤特異性 T 細胞反應的療法上，存在明顯的醫學需求。
多發性骨髓瘤 (MM) 是最常見的血液學惡性腫瘤中之一者，在歐盟及美國每年有約 75,000 名新患者，存在高度未滿足之醫療需求。多發性骨髓瘤 (亦稱為漿細胞骨髓瘤) 的特徵在於終末分化的漿細胞分泌非功能性單株免疫球蛋白。當癌性漿細胞在骨髓中積聚時，它們會幹擾正常血球之產生，導致各種症狀及併發症。多發性骨髓瘤之常見症狀包括骨痛 (尤其為背部或肋骨疼痛)、疲勞、虛弱、頻繁感染、體重減輕、極度口渴及增多的排尿。多發性骨髓瘤之治療選擇取決於多種因素，包括疾病之分期或患者的整體健康狀況。短期內，諸如來那度胺 (lenalidomide)、泊馬度胺 (pomalidomide) 等免疫調節藥物 (ImiD)，以及諸如卡非佐米 (carfilzomib) 或硼替佐米 (bortezomib) 等蛋白酶體抑制劑可能仍是多發性骨髓瘤之第 1 線治療的基幹 (Moreau 等人 The Lancet Oncology 2021, 22(3), e105-e118)。然而，這些藥物並不能特異性地靶定病變的腫瘤細胞，例如病變的漿細胞 (PC)。已經朝著選擇性地消耗多發性骨髓瘤的漿細胞的方向努力。缺乏特異性標記漿細胞的表面蛋白，阻礙了多發性骨髓瘤的抗體或細胞療法的開發。到目前為止，成功的生物製劑之案例很少，包括達雷木單抗 (daratumumab) (抗 CD38) 及埃羅妥珠單抗 (elotuzumab) (抗 CD319)，但需要注意，這兩種抗原亦在其他正常組織 (包括造血譜系及免疫效應細胞) 之上表現，這可能限制其臨床長期使用。
B 細胞成熟抗原 (BCMA) 作為腫瘤壞死因子受體超家族 17 (TNFRSF17) 中的跨膜醣蛋白係在所有患者 MM 細胞中以顯著較高水準表現，但在除正常漿細胞外的其他正常組織上並非如此表現。BCMA 嵌合抗原受體 (CAR) T 細胞已在患有復發/難治性 MM (RRMM) 的患者中顯示出顯著臨床活性，該等患者業已接受至少三種先前治療，包括利用蛋白酶體抑制劑及免疫調節藥物 (IMiD)。另外的方式 (包括抗 BCMA 抗體藥物結合物) 在至少三種先前治療法 (包括抗 CD38 抗體、蛋白酶體抑制劑及免疫調節藥物) 失敗的患者中亦取得了顯著之臨床反應 (Cho 等人，Front Immunolog.2018, 9, 1821)。然而，仍存在對更好的多發性骨髓瘤治療選擇之需求。
CD28 為共刺激分子次家族之創始成員，其特徵為成對的 V 組免疫球蛋白超家族 (immunoglobulin superfamily，IgSF) 域連接到包含關鍵信號傳導模體的單個跨膜域及細胞質域 (Carreno 及 Collins, Annu Rev Immunol.2002, 20, 29-53)。該次家族之其他成員包括 ICOS、CTLA-4、PD1、PD1H、TIGIT 及 BTLA (Chen 及 Flies, Nat Rev Immunol.2013, 13(4), 227-42)。CD28 表現僅限於 T 細胞，在所有初始的和大多數經歷過抗原的亞群中普遍存在，包括那些表現 PD-1 或 CTLA-4 的亞群。CD28 及 CTLA-4 高度同源並競爭結合相同的在樹突細胞、B 細胞、巨噬細胞及腫瘤細胞上表現之 B7 分子 CD80 及 CD86 (Linsley 等人，Proc Natl Acad Sci USA.1990, 87(13), 5031-5)。CTLA-4 對於 B7 配體家族的更高親和力允許 CTLA-4 在配體結合方面勝過 CD28，並抑制效應 T 細胞反應 (Engelhardt 等人，J Immunol 2006, 177, 1052-1061)。相較之下，PD-1 顯示藉由部分去磷酸化 CD28 之細胞質域來抑制 CD28 傳訊 (Hui 等人，Science 2017, 355, 1428-1433)。CD80 或 CD86 在專職抗原呈現細胞表面連接 CD28 是初始 T 細胞功能性從頭啟動、隨後的選殖擴增、細胞激素產生、靶細胞裂解和長期記憶形成所必需的。CD28 配體之結合亦促進表現誘導型共刺激受體，諸如 OX-40、ICOS 及 4-1BB (Acuto 及 Michel, Nat Rev Immunol 2003, 3, 939-951)。CD28 連接後，雙硫鍵連接的同源二聚體、膜近端 YMNM 模體及遠端 PYAP 模體已顯示與幾種激酶及轉接蛋白複合 (Boomer 及 Green, Cold Spring Harb Perspect Biol 2010, 2, a002436)。這些模體對於誘導 IL2 轉錄很重要，該轉錄係由 NFAT、AP-1 及 NFκB 家族轉錄因子的 CD28 依賴性活化媒介 (Fraser 等人，Science 1991, 251, 313-316)。然而，在 CD28 之細胞質域內發現另外的特徵較差的磷酸化及泛素化位點。正如 (Esensten 等人，Immunity 2016, 44, 973-988) 所評論的，CD28 啟動的路徑在促進習知 T 細胞之增生及效應功能上具有關鍵作用。CD28 連接亦促進調節性 T 細胞的抗炎功能。CD28 藉由部分增強來自 T 細胞受體的訊號來共同刺激 T 細胞，但亦顯示出媒介獨特傳訊事件 (Acuto 及 Michel, 2003；Boomer 及 Green, 2010)。由 CD28 特異性觸發的信號控制 T 細胞許多重要方面的功能，包括下游蛋白的磷酸化及其他轉譯後修飾 (例如，PI3K 介導的磷酸化)、轉錄變化 (例如 Bcl-xL 表現)、表觀遺傳改變 (例如 IL- 2 啟動子)、細胞骨架重塑 (例如微管組織中心的方向) 和醣解速率的變化 (例如醣解通量)。CD28 缺陷小鼠對傳染性病原體、同種異體移植抗原、移植物抗宿主疾病、接觸性過敏症和氣喘的反應降低 (Acuto 及d Michel, 2003)。缺乏 CD28 媒介的共刺激導致活體外及活體內減少之 T 細胞增生，嚴重抑制增殖中心形成及免疫球蛋白同種型轉換，減少 T 輔助 (Th) 細胞分化及 Th2-型細胞激素之表現。CD4 依賴性細胞毒性 CD8+ T 細胞反應亦受到影響。重要的是，CD28 缺陷的初始 T 細胞表現出減少之增生反應，特定而言在較低抗原濃度下。越來越多的文獻支持對 T 細胞上 CD28 的參與具有抗腫瘤潛力的觀點。最近的證據表明，PD-L1/PD-1 及 CTLA-4 檢查點抑制劑的抗癌作用取決於 CD28 (Kamphorst 等人，Science 2017, 355, 1423-1427)。研究 CTLA-4 和 PD-1 阻斷之治療效果的臨床研究顯示，在晚期黑色素瘤和其他癌症患者中取得了非常可觀的結果。此外，基因工程 T 細胞的輸注表現人工嵌合 T 細胞受體 (包含與細胞內 TCR 信號轉導域 (CD3z) 及細胞內共刺激域 (CD28 及/或 4-1BB 域) 融合的細胞外抗原識別域) 在 B 細胞癌和其他癌症中已顯示高比率和持久的反應。
CD28 促效的抗體可區分為兩類：(i) CD28 超激動抗體及 (ii) CD28 習用促效的抗體。通常，為了活化初始 T 細胞，需要 T 細胞抗原受體 (TCR，信號 1) 的接合與藉由 CD28 的共刺激信號傳導 (信號 2)。CD28 超級促效劑 (CD28SA) 為 CD28 特異性單株抗體，能夠自主活化 T 細胞而無需明顯的 T 細胞受體接合 (Hünig, Nat Rev Immunol 2012, 12, 317-318)。在囓齒動物中，CD28SA 活化習用 T 細胞及調節性 T 細胞。CD28SA 抗體在多種自身免疫、發炎及移植模型中具有治療效果。然而，人 CD28SA 抗體 TGN1412 的第 I 期研究在 2006 年造成一場危及生命的細胞激素風暴。後續的研究表明，毒性是由於人 T 細胞和臨床前動物模型的 T 細胞的 CD28 反應性差異導致的劑量錯誤所引起的。目前正在對 RA 患者及患有轉移性或不可切除的晚期實體惡性腫瘤的患者進行開放標示、多中心劑量遞增研究，對舍利珠單抗 (theralizumab) (TGN1412 或 TAB08) 進行重新評估。CD28 習用促效的抗體，諸如殖株 9.3，模擬 CD28 天然配體，只能在 T 細胞受體訊號 (訊號 1) 存在下增強 T 細胞活化。已發表的見解表明，抗體的結合表位對促效的抗體是超級促效劑或習用促效劑具有重大影響 (Beyersdorf 等人，Ann. Rheum. Dis. 2005, 64, iv91-iv95)。超促效的 TGN1412 結合 CD28 的橫向模體，而習用促效的分子 9.3 結合接近配體結合表位。由於結合表位不同，超促效的抗體和習用促效的抗體在 T 細胞表面形成 CD28 分子的線性複合物的能力不同。準確地說，TGN1412 能夠有效地形成 CD28 的線性陣列，這可能會導致聚集的信號傳導成分，其足以超過 T 細胞活化的閾值。另一方面，習用促效劑 9.3 導致複合物在結構上不是線性的。先前已公佈嘗試使用針對黑色素瘤相關蛋白聚醣及 CD28 的重組雙特異性單鏈抗體來轉化基於 9.3 殖株的習用促效的結合物 (Otz 等人，Leukemia 2009, 23(1), 71-77)。已報導基於雙特異性單鏈抗體形成多聚體構建物的內在趨勢，儘管使用習用 CD28 促效的結合物 9.3，但報導的雙特異性單鏈抗體仍能發揮「超促效」活性。
已經發現，當量有限的抗 CD3 雙特異性抗體，即 T 細胞雙特異性抗體 (TCB) 與促效的抗 CD28 分子組合時，可實現較佳的 T 細胞活化。鑑於 CD28 在多種腫瘤適應症的 T 細胞上以基線被表現且 CD28 傳訊的活化增強 T 細胞受體循環，組合 TCB 分子與靶向腫瘤的 CD28 分子可協同作用以誘導強而持久的抗腫瘤反應。WO 2020/127618 A1 描述了腫瘤靶向促效的 CD28 抗原結合分子。其中描述了多種腫瘤標靶。
多發性骨髓瘤中的 CD28 促效作用可對相應的免疫 MM 漿細胞發揮不同的生物學功能。雖然經由 CD28 共同活化 T 細胞有望驅動抗腫瘤反應，但 MM 細胞上的 CD28 促效作用經由調節 PI3K/Akt、FoxO3a 及 Bimm 來媒介促存活傳訊，這繼而被描述為誘導多發性骨髓瘤中的化療抵抗 (Murray 等人，Blood 2014, 123(24), 3770-3779)。新診斷的多發性骨髓瘤漿細胞上 CD28 之過度表現係描述為與較差的臨床結果相關。然而，CD28 活化可抑制骨髓瘤細胞增生 (Bahlis 等人，Blood 2007, 109(11), 5002-5010)。
在存在強免疫細胞媒介的反應 (諸如 T 細胞之 T 細胞雙特異性活化) 的情況下對 CD28 促效可進一步提高高效抗腫瘤反應。我們在此提供與 BCMA 特異性結合的雙特異性促效的 CD28 抗原結合分子。以靶向骨髓瘤細胞上的 BCMA 的 CD28 雙特異性抗體來增強 T 細胞反應可以是改善多發性骨髓瘤治療之選擇，且需要提供具有有利性質的靶向 BCMA 的抗 CD28 抗體。
本發明描述新穎靶向 BCMA 的雙特異性促效的 CD28 抗原結合分子，其實現腫瘤依賴性 T 細胞活化及腫瘤細胞毒殺，而無需形成多聚體。本發明的雙特異性 CD28 抗原結合分子的特徵在於與 CD28 的單價結合，且在於它們包含如本文所定義的能夠與 BCMA 特異性結合的特定抗原結合域。此外，它們具有由能夠穩定締合的第一次單元和第二次單元所構成的 Fc 域，包括一個或多個胺基酸取代，來降低抗原結合分子對 Fc 受體及/或效應功能的結合親和力。Fc 受體媒介的交聯因此被廢除並且藉由透過結合能夠與 BCMA 特異性結合之第二抗原結合域的交聯而實現腫瘤特異性活化。
因此，本文提供一種與 B 細胞成熟劑 (BCMA) 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有以下的第一抗原結合域： (i) 重鏈可變區 (V HBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 1 (GYTFTNYWMH) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 2 (IIHPNSGSTNYNEKFQG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 3 (GIYDYPFAY) 之 CDR-H3；以及 (ii) 輕鏈可變區 (V LBCMA)，其選自由以下所組成之群組： (a) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 5 (AASSLQS) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3；或 (b) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 7 (AASNLES) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3；或 (c) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 8 (AASNLQS) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 特異性結合之抗體，其中抗體包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 9 (VH1a) 及 SEQ ID NO: 10 (VH1b)，及/或該 V LBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 11 (VL1f)、SEQ ID NO: 12 (VL1a)、SEQ ID NO: 13 (VL1b)、SEQ ID NO: 14 (VL1c)、SEQ ID NO: 15 (VL1d) 及 SEQ ID NO:16 (VL1e)。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 特異性結合之抗體，其中抗體包含含有以下的第一抗原結合域： (a) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA。
在一個特定態樣中，第一抗原結合域為 Fab 分子。
在一個態樣中，與 BCMA 特異性結合之抗體包含由第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域。
在一個態樣中，與 BCMA 特異性結合之抗體包含與第二抗原特異性結合之第二抗原結合域，亦即，為雙特異性抗體。
在一個態樣中，與第二抗原特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1，特定而言可變域 VL 及 VH 係彼此替換。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 特異性結合之抗體，該抗體包含與 BCMA 特異性結合的第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中在恆定域 CL 中，位置 123 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 的胺基酸取代且位置 124 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經離胺酸(K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 獨立地取代，且其中在恆定域 CH1 中，位置 147 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 獨立地取代且位置 213 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 獨立地取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
在所有這些態樣中，與 BCMA 特異性結合之抗體包含 Fc 域，其中 Fc 為 IgG，特定而言 IgG1 Fc 域。在一個態樣中，Fc 域為人 Fc 域。
在一個態樣中，該 Fc 域包含促進該 Fc 域之該第一次單元及該第二次單元之締合的修飾。在一個態樣中，Fc 域包含杵臼修飾。在一個態樣中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (EU 編號)，且 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個進一步態樣中，Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應功能的一個或多個胺基酸取代。在一個特定態樣中，Fc 域屬於人 IgG1 亞類，且包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。
本文提供與 BCMA 特異性結合且包含與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域之進一步抗體。
在一個態樣中，與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 17 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 18 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 19 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 20 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 21 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 22 之 CDR-L3。
在一個態樣中，與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD28)，及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD28) (v8)。
在一個特定態樣中，如本文所描述之抗體包含：第一抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA；以及第二抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 V HCD28 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 V LCD28。
在一個態樣中，抗體包含含有 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的第一輕鏈、含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的第一重鏈、含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的第二重鏈及含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的第二輕鏈。
本文亦提供一種與 B 細胞成熟劑 (BCMA) 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 (A) 第一抗原結合域，其包含 (i) 重鏈可變區 (V HBCMA)，其選自由以下所組成之群組： (a) VH，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 30 (QITAKSNNYATYYADSVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；以及 (b) VH，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 32 (QITAKSNNYATYYAAPVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；以及 (ii) 輕鏈可變區 (V LBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 33 (RASEDIRNGLA) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 34 (NANSLHT) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 35 (EDTSKYPYT) 之 CDR-L3，以及 (B) 第二抗原結合域，其與 CD28 特異性結合。
在一個態樣中，抗體包含 (A) 與 BCMA 特異性結合的第一抗原結合域，其中 V HBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 36 (VH2a) 及 SEQ ID NO: 38 (VH1b)，及/或該 V LBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 37 (VL2a) 及 SEQ ID NO:39 (VL1a)。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中抗體包含含有以下的第一抗原結合域： (a) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中與 BCMA 結合的第一抗原結合域為 Fab 分子。
在一個態樣中，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體包含由第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域。
在一個態樣中，與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域為 Fab 分子。在一個態樣中，與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1，特定而言可變域 VL 及 VH 係彼此替換。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中與 BCMA 特異性結合的第一抗原結合域為 Fab 分子，其中在恆定域 CL 中，位置 123 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 的胺基酸取代且位置 124 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經離胺酸(K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 獨立地取代，且其中在恆定域 CH1 中，位置 147 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 獨立地取代且位置 213 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 獨立地取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
在所有這些態樣中，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體包含 Fc 域，其中 Fc 為 IgG，特定而言 IgG1 Fc 域。在一個態樣中，Fc 域為人 Fc 域。
在一個態樣中，該 Fc 域包含促進該 Fc 域之該第一次單元及該第二次單元之締合的修飾。在一個態樣中，Fc 域包含杵臼修飾。在一個態樣中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (EU 編號)，且 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個進一步態樣中，Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應功能的一個或多個胺基酸取代。在一個特定態樣中，Fc 域屬於人 IgG1 亞類，且包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。
在所有這些態樣中，與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 17 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 18 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 19 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 20 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 21 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 22 之 CDR-L3。
在一個特定態樣中，與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD28)，及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD28)。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含：第一抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA；以及第二抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 V HCD28 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 V LCD28。
在一個態樣中，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體包含含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的第一輕鏈、含有 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列的第一重鏈、含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的第二重鏈及含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的第二輕鏈。
根據本發明之另一態樣，提供一種或多種經分離之多核苷酸，其編碼如本文先前所描述之抗體。本發明進一步提供一種載體，特定而言表現載體，其包含本發明之經分離之多核苷酸，以及包含本發明之經分離之核酸或表現載體的宿主細胞。在一些態樣中，宿主細胞為真核細胞，特定而言為哺乳動物細胞。在另一態樣中，提供一種生產如本文先前所描述的與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體之方法，該方法包含以下步驟：a) 在適合表現抗體的條件下培養如上文所描述之宿主細胞，及視情況 b) 回收與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體。本發明亦涵蓋一種如藉由本發明之方法所生產之抗體或雙特異性抗體。
進一步提供一種醫藥組成物，其包含如本文先前所描述的與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。在一個態樣中，醫藥組成物包含額外的治療劑。
亦涵蓋如本文先前所描述的與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體或包含雙特異性 BCMA 抗體之醫藥組成物，其使用為藥物。
在一個態樣中，提供如本文先前所描述的與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體，或醫藥組成物，其使用於增強 (a) T 細胞活化或 (b) T細胞效應功能。
在一個態樣中，提供如本文先前所描述的與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體，或醫藥組成物，其使用於治療疾病。在一個態樣中，疾病為癌症，特定而言多發性骨髓瘤 (MM)。
在一個具體態樣中，提供如本文先前所描述的與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體，或醫藥組成物，其使用於治療癌症、特定而言多發性骨髓瘤。在另一具體態樣中，提供如本文先前所描述的與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體，其使用於治療癌症，其中該使用係供與化療劑、放射療法及/或使用於癌症免疫療法的其他藥劑組合投予。在一個態樣中，如本文先前所描述的與 BCMA 特異性結合之抗體或者雙特異性 BCMA 抗體係使用於治療癌症，其中該使用係供與 T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體組合投予。在一個特定態樣中，T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體為抗 GPRC5D/抗 CD3 抗體。
在又一態樣中，本發明提供一種抑制個體之腫瘤細胞生長之方法，該方法包含向個體投予有效量之如本文先前所描述的與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體，或本發明之醫藥組成物，以抑制腫瘤細胞之生長。在另一態樣中，本發明提供一種治療或延緩個體的癌症之方法，該方法包含向個體投予有效量之如本文先前所描述的與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體，或本發明之醫藥組成物。
亦提供如本文先前所描述的與 BCMA 雙特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體在製造用於治療有需要之個體的疾病的藥物、特定而言在製造用於治療癌症的藥物中之用途，以及治療個體的疾病之方法，該方法包含向該個體投予治療有效量之組成物，該組成物以醫藥上可接受之形式包含本發明的與 BCMA 特異性結合之抗體或雙特異性 BCMA 抗體。在具體態樣中，疾病為癌症。在上述態樣中任一項中，個體為哺乳動物，特定而言為人類。
定義
除非另有定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有與本發明所屬技術中通常使用的含義相同。為了解釋本說明書的目的，將應用以下定義，並且只要合適，以單數形式使用的術語亦將包括複數，反之亦然。
如本文中所使用，術語「 抗原結合分子」以其最廣的涵義是指特異性結合抗原決定位的分子。抗原結合分子的實例為抗體、多特異性抗體 (例如雙特異性抗體)、抗體片段及支架抗原結合蛋白。
如本文中所使用，術語「 結合腫瘤相關抗原的抗原結合域」或「能夠與腫瘤相關抗原特異性結合的部分」是指特異性結合腫瘤相關抗原 BCMA 的多肽分子。在一個態樣中，抗原結合域能夠透過 BCMA 活化傳訊。在一特定態樣中，抗原結合域能夠將其所附接的實體 (例如 CD28 抗體) 引導至表現 BCMA 的細胞，例如引導至特定類型之腫瘤細胞。能夠與 BCMA 特異性結合之抗原結合域包括本文所進一步定義之抗體及其片段。此外，能夠與腫瘤相關抗原特異性結合之抗原結合域可包括本文所進一步定義之支架抗原結合蛋白，例如基於設計的重複蛋白或設計的重複域的結合域 (參見例如 WO 2002/020565)。
關於抗原結合分子，即抗體或其片段，術語「抗原結合域」是指包含與抗原的部分或全部特異性結合並與之互補之區域的分子部分。可藉由例如一個或多個抗體可變域 (亦稱為抗體可變區) 提供能夠特異性抗原結合的抗原結合域。特定而言，能夠特異性抗原結合之抗原結合域包含抗體輕鏈可變區 (VL) 及抗體重鏈可變區 (VH)。於另一態樣中，「能夠與腫瘤相關抗原特異性結合的抗原結合域」亦可為 Fab 片段或交叉 Fab 片段。如本文中所使用的關於抗原結合域等的術語「第一」、「第二」或「第三」，係用於方便區分每一類型之部分何時存在多於一個。除非明確說明，否則使用此等術語並非旨在賦予部分特定之順序或方向。
本文中的術語「 抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體及多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等呈現期望的抗原結合活性即可。
如本文所用的術語「 單株抗體」是指獲自實質上同源抗體群體的抗體，即構成群體的個別抗體是相同的及/或結合相同的表位，除了可能的變異體抗體，例如，包含天然發生的突變或在單株抗體製劑的生產過程中產生的，此類變異體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。
如本文所用，術語「 單特異性」抗體表示具有一個或多個結合位點的抗體，各結合位點結合相同抗原的相同表位。術語「 雙特異性」意指抗原結合分子能夠特異性結合至少二個不同的抗原決定位。通常，雙特異性抗原結合分子包含二個抗原結合位點，各該抗原結合位點對不同抗原決定位具有特異性。然而，雙特異性抗原結合分子亦可包含結合其他抗原決定位的額外抗原結合位點。在某些態樣中，該雙特異性抗原結合分子能夠同時結合二個抗原決定位，特定而言在兩個不同的細胞或同一細胞上表現的兩個抗原決定位。因此，根據本發明的術語「 雙特異性」亦可包括三特異性分子，例如，包含 CD28 抗體和針對兩種不同靶細胞抗原的兩個抗原結合域的雙特異性分子。
本案中所使用的術語「 價」表示在抗原結合分子中存在特定數量的對一種不同抗原決定位特異的結合位點，該結合位點對一種不同抗原決定位具有特異性。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示在抗原結合分子中存在對某個抗原決定位特異的兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。在本發明的特定態樣中，根據本發明的雙特異性抗原結合分子對於某種抗原決定位可以是單價的，意指它們對於該抗原決定位僅具有一個結合位點，或者它們對於某種抗原決定位可以是二價或四價的，意指是它們分別具有針對該抗原決定位的兩個結合位點或四個結合位點。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，是指具有與天然抗體結構實質上類似之結構的抗體。「 天然抗體」指代具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，天然 IgG 級抗體為約 150,000 個道耳頓的異四聚體醣蛋白，其由二條輕鏈及二條重鏈經雙硫鍵鍵合所構成。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有可變區 (VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，接著為三個恆定域 (CH1、CH2 及 CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，從 N 端至 C 端，各輕鏈具有可變區 (VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，接著為輕鏈恆定域 (CL)，亦稱為輕鏈恆定區。抗體之重鏈可分配為五種類型之一，稱為 α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG) 或 μ (IgM)，其中一些可以進一步分為以下亞型，例如 γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1) 及 α2 (IgA2)。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可經指定為兩種類型中之一者，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
「 抗體片段」是指除完整抗體以外的分子，其包含完整抗體的一部分，該完整抗體結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段之實例包括，但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F (ab') 2；雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、交叉 Fab 片段、線性抗體；單鏈抗體分子 (例如 scFv)；及單域抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Hudson 等人，Nat Med 9，129-134 (2003)。關於 scFv 片段的綜述，請參見例如 Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269-315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有增加的活體內半衰期之 Fab 及 F(ab')2 片段的論述，參見美國專利號 5,869,046。雙抗體為具有兩個抗原結合位點的抗體片段，其可為二價或雙特異性的，參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat Med 9, 129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。Hudson 等人，Nat Med 9，129-134 (2003) 中亦描述三功能抗體及四功能抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌或噬菌體) 之產生。
木瓜酵素對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈可變域及輕鏈可變域以及輕鏈之恆定域和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，如本文所使用，術語「 Fab 片段」或「 Fab 分子」是指包含輕鏈片段的抗體片段，該輕鏈片段包含可變輕鏈(VL)域和輕鏈恆定域 (CL)，以及可變重鏈域 (VH) 和重鏈第一恆定域 (CH1)。Fab' 片段與 Fab 片段不同之處在於，在重鏈 CH1 域之羧基端添加少數殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab'-SH 為 Fab' 片段，其中恆定域之半胱胺酸殘基帶有一游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生 F(ab') 2片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區。「 習用 Fab 片段」由 VL-CL 輕鏈和 VH-CH1 重鏈構成。
術語「 交叉 Fab 片段 (crossFab fragment)」或「xFab 片段」或「互換型 Fab 片段 (crossover Fab fragment)」 是指其中重鏈及輕鏈之可變區或恆定區互換的 Fab 片段。可能存在交叉 Fab 分子之兩種不同鏈組成且包含於本發明之雙特異性抗體中：一方面，Fab 重鏈及輕鏈之可變區互換，亦即互換型 Fab 分子包含由輕鏈可變區 (VL) 及重鏈恆定域 (CH1) 構成之肽鏈，及由重鏈可變域 (VH) 及輕鏈恆定域 (CL) 構成之肽鏈。此互換型 Fab 分子亦稱為交叉 Fab (VLVH)。另一方面，當 Fab 重鏈及輕鏈之恆定區互換時，互換型 Fab 分子包含由重鏈可變域 (VH) 及輕鏈恆定域 (CL) 構成之肽鏈，及由輕鏈可變域 (VL) 及重鏈恆定域 (CH1) 構成之肽鏈。這種互換型 Fab 分子亦稱為交叉 Fab (CLCH1)。
「單鏈 Fab 片段」或「 scFab」為由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成之多肽，其中該抗體域及該連接子按 N 端至 C 端方向之次序具有以下中之一者：a) VH-CH1-連接子-VL-CL，b) VL-CL-連接子-VH-CH1，c) VH-CL-連接子-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為至少 30 個胺基酸，較佳為 32 與 50 個胺基酸之間的多肽。該單鏈 Fab 片段通過 CL 域與 CH1 域之間的天然雙硫鍵達到穩定。此外，此等單鏈 Fab 分子可經由插入半胱胺酸殘基 (例如可變重鏈中之位置 44 及可變輕鏈中之位置 100，根據 Kabat 編號) 而產生鏈間雙硫鍵來進一步穩定化。
「互換型單鏈 Fab 片段」或「 x-scFab」是由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成之多肽，其中該抗體域及該連接子按 N 端至 C 端方向之次序具有以下中之一者：a) VH-CL-連接子-VL-CH1 和 b) VL-CH1-連接子-VH-CL；其中 VH 和 VL 一起形成與抗原特異性結合的抗原結合位點，且其中該連接子為至少 30 個胺基酸之多肽。此外，此等 x-scFab 分子可經由插入半胱胺酸殘基 (例如可變重鏈中之位置 44 及可變輕鏈中之位置 100，根據 Kabat 編號) 而產生鏈間雙硫鍵來進一步穩定化。
「 單鏈可變片段( scFv)」為抗體之重鏈 (V H) 及輕鏈 (V L) 之可變區之融合蛋白質，其與十至約 25 個胺基酸之短連接子肽連接。連接子通常富含甘胺酸以具有可撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有可溶性，且可連接 V H之 N 端與 V L之 C 端，或 反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白質保持原始抗體之特異性。scFv 抗體例如描述於 Houston, J.S., Methods in Enzymol.203 (1991) 46-96)。此外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有 VH 域 (亦即能與 VL 域一起組裝至功能性抗原結合位點) 或 VL 域 (亦即能與 VH 域一起組裝至功能性抗原結合位點) 之特徵，且藉此提供全長抗體之抗原結合性質。
「 支架抗原結合蛋白」為技術中已知的，例如纖網蛋白及經設計之錨蛋白重複蛋白質 (DARPins) 已用作抗原結合域之替代性支架，參見例如 Gebauer 及 Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) 以及 Stumpp 等, Darpins: A new generation of protein therapeutics.Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。於本發明之一個態樣中，支架抗原結合蛋白係選自由以下所組成之群組：CTLA-4 (艾維伯迪 (Evibody))；脂質運載蛋白 (抗運載蛋白 (Anticalin))；蛋白質 A 衍生之分子，諸如蛋白質 A 之 Z 域 (親和抗體)；A 域 (高親和性多聚體/最大抗體)；血清運鐵蛋白 ( 反式-抗體)；經設計之錨蛋白重複蛋白質 (DARPin)；抗體輕鏈或重鏈之可變域 (單域抗體，sdAb)；抗體重鏈之可變域 (奈米抗體，aVH)；V NAR片段；纖網蛋白 (阿耐克汀(AdNectin))；C 型凝集素域 (四連接素 (Tetranectin))；新型抗原受體 β-內醯胺酶之可變域 (V NAR片段)；人 γ-晶狀體球蛋白或泛素 (阿菲林 (Affilin) 分子)；人蛋白酶抑制劑之庫尼茨 (kunitz) 型域，微體，諸如來自 knottin 家族之蛋白質、肽適體及纖網蛋白 (阿耐克汀 (adnectin))。CTLA-4 (細胞毒性 T 淋巴細胞相關抗原 4) 為表現於主要 CD4 +T 細胞上之 CD28 家族受體。其胞外域具有可變域類 Ig 摺疊。對應於抗體之 CDR 之環可經異源序列取代以賦予不同結合特性。經工程改造以具有不同結合特異性之 CTLA-4 分子亦稱為艾維伯迪 (Evibodies) (例如 US7166697B1)。艾維伯迪 (Evibody) 與抗體 (例如域抗體) 之經分離之可變區之尺寸大致相同。關於其他細節，參見 Journal of Immunological Methods 248 (1-2),31-45 (2001)。脂質運載蛋白為細胞外蛋白質之家族，其傳遞小型疏水性分子，諸如類固醇、後膽色素 (bilins)、類視色素及脂質。其具有剛性 β-片狀第二結構，其在圓錐結構之開放端具有許多環，其可經工程改造以結合不同標靶抗原。抗運載蛋白 (Anticalin) 的大小在 160-180 個胺基酸之間，且來源於脂質運載蛋白。關於其他細節，參見 Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)、US7250297B1 及 US20070224633。親和抗體為來源於金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 之蛋白質 A 的支架，其可經工程化以結合於抗原。該域由具有約 58 個胺基酸的三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化產生文庫。關於其他細節，參見 Protein Eng. Des.Sel.2004, 17, 455-462 及 EP 1641818A1。高親合性多聚體 (Avimers) 為來源於 A-域支架家族之多域蛋白質。約 35 個胺基酸之原生域採用既定雙硫鍵鍵結之結構。藉由改組由 A-域之家族呈現之天然變化來產生多樣性。關於其他細節，參見 Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) 及 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)。運鐵蛋白為單體血清運送醣蛋白。運鐵蛋白可藉由在允許的表面環中插入肽序列而經工程化以結合不同標靶抗原。經工程化之運鐵蛋白支架之實例包括反式體。關於其他細節，參見 J. Biol.Chem 274, 24066-24073 (1999)。經設計之錨蛋白重複蛋白質 (DARPins) 來源於錨蛋白，錨蛋白為介導整合膜蛋白質與細胞骨架之連接的蛋白質之家族。單一錨蛋白重複為由兩個 α 螺旋及 β 迴旋 (beta-turn) 組成之 33 殘基積蓄模體。其可藉由隨機化各重複之第一個 α 螺旋及 β 迴旋中之殘基而經工程化以結合不同標靶抗原。可藉由增加模組數目來增加其結合界面 (親和力成熟方法)。關於其他細節，參見 J. Mol.Biol.332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 及 J. Mol.Biol.369, 1015-1028 (2007) 及 US20040132028A1。單域抗體為由單一單體可變抗體域組成之抗體片段。第一個單域源自來自駱駝之抗體重鏈之可變域 (奈米抗體或 V HH 片段)。此外，術語單域抗體包括自主人重鏈可變域 (aVH) 或來源於鯊魚之 V NAR片段。纖網蛋白為可經工程化結合於抗原之支架。纖連蛋白由第 III 型人纖網蛋白 (FN3) 之 15 個重複單元的第 10 個域的天然胺基酸序列之主鏈組成。β-夾層結構之一端處的三個環可經工程化以使阿耐克汀 (Adnectin) 能夠特異性識別感興趣的治療標靶。關於其他細節，參見 Protein Eng. Des.Sel.18, 435- 444 (2005)、US20080139791、WO2005056764 及 US6818418B1。肽適體為組合性識別分子，其由恆定支架蛋白質 (通常為硫氧還蛋白 (TrxA)) 組成，該恆定支架蛋白質含有在活性位點處插入之限制性可變肽環。關於其他細節，參見 Expert Opin.Biol.Ther.5, 783–797 (2005)。微體來源於天然存在之長度為 25-50 個胺基酸之微型蛋白質，其含有 3-4 個半胱胺酸橋，微型蛋白質之實例包括 KalataBI 及芋螺毒素 (conotoxin) 及打結素 (knottin)。微型蛋白質具有環，其可經工程化以包括至多25個胺基酸而不影響微型蛋白質之整體摺疊。關於經工程化之打結素域之其他細節，參見 WO2008098796。
與參照分子「 結合至相同表位的抗體」係指一種抗體，其在競爭測定中阻斷參照分子與其抗原之結合達 50% 或更多，且相反地，參照分子在競爭測定中阻斷該抗原結合分子與其抗原之結合達 50% 或更多。
術語「 抗原結合域」係指抗原結合分子之一部分，其包含特異性結合於一部分或全部抗原且與其互補之區域。當抗原較大時，抗原結合分子可僅結合於抗原之特定一部分，該部分稱為表位。抗原結合域可由例如一或多個可變域 (亦稱為可變區) 提供。較佳地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變域 (VL) 及抗體重鏈可變域 (VH)。
如本文所使用，術語「 抗原決定位」與「抗原」及「表位」同義，且是指多肽大分子上與抗原結合部分結合，形成抗原結合部分-抗原錯合物的位點(例如，胺基酸之相鄰延伸或由非相鄰胺基酸之不同區域組成的構形組態)。例如，可用之抗原決定位可存在於腫瘤細胞之表面上、受病毒感染之細胞之表面上、其他患病細胞之表面上、免疫細胞的表面上，不存在於血清中，及/或存在於細胞外基質 (ECM) 中。除非另有指示，否則本文中適用作抗原之蛋白質可為來自任何脊椎動物來源 (包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如人類) 及嚙齒動物 (例如小鼠及大鼠)) 之蛋白質的任何原生形式。在特定實施例中，該抗原為人蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」、未處理之蛋白質及由在細胞中處理所產生之任何蛋白質形式。該術語亦涵蓋天然生成之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。
「 特異性結合」意謂結合對於抗原而言具有選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗原結合分子結合特異性抗原之能力可透過酶聯免疫吸附分析 (ELISA) 或所屬領域知識者所熟悉的其他技術，例如表面電漿子共振 (SPR) 技術 (於 BIAcore 儀器上分析) (Liljeblad 等, Glyco J 17, 323-329 (2000)) 及傳統的結合測定 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 來量測。在一個實施例中，抗原結合分子結合不相關的蛋白質之程度小於抗原結合分子結合抗原的約 10%，例如藉由 SPR。在某些實施例中，與抗原結合之分子所具有之解離常數 (Kd) 為 ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或≤ 0.001 nM (例如 10 -8M 或更低，例如 10 -8M 至 10 -13M，例如 10 -9至 10 -13M)。
「 親和力」或「結合親和力」是指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如抗原) 之間的非共價相互作用之總和強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對其搭配物 Y 之親和力通常可由解離常數 (Kd) 表示，解離常數為解離速率常數與締合速率常數 (分別為 koff 及 kon) 之比率。因此，等效親和力可包括不同速率常數，只要速率常數比保持相同即可。可以藉由本領域已知的習知方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。用於測定親和力之特定方法為表面電漿子共振 (SPR)。
如本文中所使用的「 活化 T 細胞抗原 (activating T cell antigen)」，係指在 T 淋巴細胞 (特定而言細胞毒性 T 淋巴細胞) 之表面上表現之抗原決定位，其能夠在與抗體交互作用時誘導 T 細胞活化。具體而言，抗體與活化 T 細胞抗原之交互作用可藉由觸發 T 細胞受體複合體之傳訊級聯來誘導 T 細胞活化。在特定實施例中，該活化 T 細胞抗原為 CD3，特定而言 CD3 之 ε 次單元 (參見 UniProt 編號 P07766 (第 189 版)，NCBI RefSeq 編號 NP_000724.1, SEQ ID NO: 167，針對人類序列；或 UniProt 編號 Q95LI5 (第 49 版)，NCBI GenBank 編號 BAB71849.1, SEQ ID NO: 168，針對獼猴 [石蟹獼猴] 序列)。
如本文中所使用的「 T 細胞活化」，係指 T 淋巴細胞 (特定而言細胞毒性 T 淋巴細胞) 之一或多種細胞反應，選自：增生、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應分子釋放、胞毒活性及活化標記之表現。量測 T 細胞活化之適宜測定係此項技術中已知的並在本文中描述。
術語「 T 細胞效應功能」係指在適應性免疫系統中發揮關鍵作用的 T 細胞之活動。T 細胞負責發起並協調身體對外來侵入物 (諸如病毒或細菌以及腫瘤細胞) 的免疫反應。效應功能係指 T 細胞為消除此等加害物而進行的各種活動，其包括釋放細胞激素、刺激其他細胞以及直接攻擊並消除受感染細胞。
如本文中所使用的「 腫瘤相關抗原」或 TAA，是指標靶細胞 (例如腫瘤中之細胞，諸如癌細胞、腫瘤基質之細胞、惡性 B 淋巴球、黑色素瘤細胞) 表面上所呈現的抗原決定位。於某些態樣中，標靶細胞抗原為腫瘤細胞表面上的抗原。在一個特定態樣中，TAA 為 BCMA。
術語「 BCMA」係指 B 細胞成熟抗原，亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族第 17 成員 (TNFRS17) 或 CD269，且是不具有信號肽並含有富含半胱胺酸的胞外域的第 III 型跨膜蛋白。BCMA 的配體包括 B 細胞活化因子 (BAFF) 及增生誘導配體 (APRIL)，其中 APRIL 對 BCMA 具有較高之親和力。BCMA 係優先 由成熟 B 淋巴球表現，在造血幹細胞或非造血組織中表現最少，且對於長壽命骨髓漿細胞之存活至關重要。膜結合的 BCMA 可經歷 γ 分泌酶媒介的自細胞表面的脫落，導致可溶性 BCMA (sBCMA) 之循環及減少的 APRIL 及 BAFF 對表面 BCMA 的活化。BCMA 在所有患者 MM 細胞中以顯著較高之水準過度表現，但在除正常漿細胞外的其他正常組織中並不如此表現。BCMA 與兩個相關 TNFR 超家族 B 細胞活化因子受體 (BAFF-R) 以及跨膜活化物及鈣調節物及親環素配體交互作用物 (TACI) 一起嚴格調節 B 細胞增生及存活，以及成熟及分化為漿細胞。此三種功能相關受體藉由與其同源配體 BAFF 及/或 APRIL 結合支援 B 細胞在不同發展階段的長期存活。除非另有說明，否則如本文所使用，BCMA 係指來自任何脊椎動物來源之任何 BCMA 蛋白，該脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如人類)、非人靈長類動物 (例如獼猴) 及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。人 BCMA 之胺基酸序列顯示於 UniProt (www.uniprot.org) 登錄號 Q02223 (SEQ ID NO:99)。
除非另有說明，否則術語「 CD28」(分化簇 28，Tp44) 係指來自任何脊椎動物來源之任何 CD28 蛋白，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如人類)、非人靈長類動物 (例如獼猴) 及囓齒類動物 (例如小鼠和大鼠)。CD28 在 T 細胞上表現並提供 T 細胞活化和存活所需的共刺激信號。除了 T 細胞受體 (TCR) 之外，透過 CD28 刺激 T 細胞可為各種白細胞介質的產生提供有效的信號。CD28 是 CD80 (B7.1) 和 CD86 (B7.2) 蛋白的受體，並且是唯一在初始 T 細胞上組成性地表現的 B7 受體。人類 CD28 的胺基酸序列顯示於 UniProt (www.uniprot.org) 登錄號 P10747 (SEQ ID NO:100)。
「 促效的抗體」是指包含針對給定受體的促效的功能的抗體。一般而言，當促效劑配體 (因子) 與受體結合時，受體蛋白的三級結構發生變化，且受體被活化 (當受體是膜蛋白時，通常會轉導細胞生長信號等)。若受體是形成二聚體的類型，促效性抗體可在適當的距離及角度將受體二聚化，因此作用類似於配體。合適的抗受體抗體可模擬由配體進行的受體二聚化作用，因此成為促效的抗體。
「 CD28 促效性抗體」或「CD28 習用促效性抗體」是一種抗體，其模擬 CD28 天然配體 (CD80 或 CD86)在存在 T 細胞受體訊號 (「訊號 2」) 的情況下增強 T 細胞活化之角色。T 細胞需要兩個信號才能完全活化。在生理條件下，「訊號 1」來自 T 細胞受體 (TCR) 分子與抗原呈現細胞 (APC) 上的肽/主要組織相容性複合物 (MHC) 複合物的相互作用，且「訊號 2」係由共刺激受體 (例如 CD28) 的接合提供。CD28 促效性抗體能夠共刺激 T 細胞 (訊號 2)。它還能夠與對 TCR 複合物具有特異性的分子結合來誘導 T 細胞增生及細胞激素分泌，然而， CD28 促效性抗體並在沒有額外刺激 TCR 的情況下不能完全活化 T 細胞。然而，存在 CD28 特異性抗原結合分子的亞型，即所謂的 CD28 超促效性抗體。「 CD28 超促效性抗體」為 CD28 抗體，其能夠在沒有額外刺激 TCR 的情況下完全活化 T 細胞。CD28 超促效性抗體能夠誘導 T 細胞增生及細胞激素分泌，而無需事先活化 T 細胞 (訊號 1)。
術語「 可變域」或「可變區」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗原結合分子與抗原之結合的域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性骨架區 (FR) 及三個高度可變區 (HVR)。參見例如，Kindt 等人，Kuby Immunology，第 6 版，W.H.Freeman and Co.，第 91 頁 (2007)。單一 VH　或 VL 域可足以賦予抗原結合特異性。
如本文所使用之術語「高變區」或「HVR」是指在序列上高度可變異的並決定抗原結合特異性的抗原結合可變域的各區域，例如「互補決定區」 (「CDR」)。通常，抗原結合域包括六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，且三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 高度可變環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及 96-101 (H3) 處 (Chothia 及 Lesk， J. Mol.Biol.196:901-917 (1987))； (b) 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2) 及 95-102 (H3) 處之 CDR (Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；及 (c) 抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及 93-101 (H3) 處 (MacCallum 等人 J. Mol.Biol.262: 732-745 (1996))。
除非另有說明，否則 CDR 根據 Kabat 等人在上述文獻中所述之方法來確定。本領域之技術人員將理解，亦可根據 如上述的 Chothia、 如上述的 McCallum 或任何其他科學上接受之命名系統來確定 CDR 名稱。Kabat 等人亦定義適用於任何抗體之可變區序列編號系統。本領域普通技術人員可針對任何可變區序列明確地指定此「Kabat 編號」系統，而不依賴於除序列本身以外的任何實驗資料。如本文所使用，「Kabat 編號」係指由 Kabat 等人，U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983) 所闡述之編號系統。除非另有指明，否則提及抗體可變區中之特定胺基酸殘基位置的編號是依據 Kabat 編號系統。
如本文所使用，在抗原結合分子 (例如，抗體) 的上下文中，術語「 親和力成熟的」是指源自參考抗原結合分子 (例如藉由突變) 之抗原結合分子，其與參考抗體結合於相同抗原，較佳結合於相同表位；且與參考抗原結合分子相比對抗原具有較高親和力。親和力成熟通常涉及抗原結合分子之一個或多個 CDR 中一個或多個胺基酸殘基的修飾。通常，親和力成熟的抗原結合分子與初始參考抗原結合分子結合於相同表位。
「 骨架」或「FR」是指除高度可變區 (HVR) 殘基之外的可變域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，HVR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
就本文目的而言，「 接受者人骨架」是包含源自人免疫球蛋白骨架或人共同骨架的輕鏈可變域 (VL) 骨架或重鏈可變域 (VH) 骨架的胺基酸序列的骨架，如下定義。「衍生自」人類免疫球蛋白框架或人類共同骨架的受體人類框架可包含其相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化數為 10 或更少、9 或更少、8 或更少、7 或更少、6 或更少、5 或更少、4 或更少、3 或更少、或 2 或更少。在一些實施例中，VL 受體人類骨架與 VL 人類免疫球蛋白骨架序列或人共同骨架序列的序列相同。
術語「 嵌合」抗體是指其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「 類 (class)」是指其重鏈所具有的恆定域或恆定區的類型。存在五個主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為亞型 (同型 (isotype))，例如 IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及 IgA 2。對應於不同類之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。
「 人源化」抗體是指包含來自非人類 HVR 之胺基酸殘基及來自人類 FR 之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 HVR (例如 CDR) 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「 人源化形式」是指已經歷人源化的抗體。本發明所涵蓋的「人源化抗體 (humanized antibody)」之其他形式為其中恆定區已自原始抗體之形式另外修飾或改變者，以產生根據本發明之特性、尤其關於 C1q 結合及/或 Fc 受體 (FcR) 結合之性質。
「 人」抗體為一種抗體，其具有之胺基酸序列對應於由人或人細胞產生的胺基酸序列或來自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源所衍生之胺基酸序列。人類抗體之該定義特定地排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。特定而言，「人」或「人源化」抗體包含人來源，特定而言 IgG 同型，更特定而言 IgG1 同型之恆定區，該恆定區包含人 CH1、CH2、CH3 及/或 CL 域。
術語 「 CL 域」 表示抗體輕鏈多肽之恆定部分。人恆定域之例示性序列給出於 SEQ ID No：101 及 102 (分別為人 κ 及 λ CL 域)。
術語「 CH1 域」表示大約從 EU 位置 118 延伸至 EU 位置 215 (根據 Kabat 的 EU 編號系統) 的抗體重鏈多肽的部分。於一個態樣中，CH1 域具有 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV (SEQ ID NO: 103) 之胺基酸序列。通常，具有 EPKSC 胺基酸序列 (SEQ ID NO:104) 的區段隨後將 CH1 域連接到鉸鏈區。
術語「 鉸鏈區」表示在野生型抗體重鏈中連接 CH1 域和 CH2 域的抗體重鏈多肽部分，例如根據 Kabat 的 EU 編號系統，從約位置 216 到約位置 230，或根據 Kabat 的 EU 編號系統，從約位置 226 到約位置 230。其他 IgG 亞型的鉸鏈區可藉由與 IgG1 亞型序列的鉸鏈區半胱胺酸殘基比對來判定。鉸鏈區通常是由兩個具有相同胺基酸序列的多肽組成的二聚體分子。鉸鏈區通常包含多達 25 個胺基酸殘基並且是可撓性的，允許相關的目標結合位點獨立移動。鉸鏈區可細分為三個域：上部、中部和下部鉸鏈域 (參見例如 Roux, 等人, J. Immunol.161 (1998) 4083)。
在一個態樣中，鉸鏈區具有胺基酸序列 DKTHTCPXCP (SEQ ID NO: 105)，其中 X 為 S 或 P。在一個態樣中，鉸鏈區具有胺基酸序列 HTCPXCP (SEQ ID NO: 106)，其中 X 為 S 或 P。在一個態樣中，鉸鏈區具有胺基酸序列 CPXCP (SEQ ID NO:107)，其中 X 為 S 或 P。
本文之術語「 Fc 域」或「Fc 區」，用於定義含有至少一部分恆定區之抗體重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異體 Fc 區域。在已經由 Fab 片段 (包括 CH1 域) 定義的分子的上下文中，術語 「Fc 域」 可以僅指 IgG CH2 及 IgG CH3 域。
人 IgG Fc 區的「CH2 域」通常從約 EU 位置 231 處的胺基酸殘基延伸至約 EU 位置 340 處的胺基酸殘基 (根據 Kabat 的 EU 編號系統)。於一個態樣中，CH2 域具有 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK (SEQ ID NO: 108) 之胺基酸序列。CH2 域的獨特之處在於其沒有與另一域緊密配對。而是，兩個 N-連接的分支碳水化合物鏈插入完整的天然 Fc 區的兩個 CH2 域之間。經推測，碳水化合物可提供該域-域配對的替代物，並有助於穩定 CH2 域。Burton, Mol.Immunol.22 (1985) 161-206。在一實施例中，碳水化合物鏈附接至 CH2 域。本文的 CH2 域可為天然序列 CH2 域或變異體 CH2 域。
「CH3 域」包含 Fc 區中 CH2 域的 C 端延伸的殘基，指的是抗體重鏈多肽大約從 EU 位置 341 延伸至 EU 位置 446 的部分 (根據 Kabat 的 EU 編號系統)。在一個態樣中，CH3 域具有 GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 109) 之胺基酸序列。本文中，CH3 區可為天然序列 CH3 域或變異體 CH3 域 (例如在其一個鏈中具有引入之「隆凸」(「杵」)且在其另一個鏈中具有對應的引入之「凹穴」(「臼」) 之 CH3 域，參見美國專利號 5,821,333，其藉由引用方式明確併入本文中)。此類變異體 CH3 域可用於促進如本文中所描述之兩個非一致抗體重鏈之異二聚化。在一個實施例中，人 IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc 區域的 C 端離胺酸 (Lys447) 可以存在或可以不存在。除非本文另有說明，否則 Fc 區域或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據 EU 編號系統，亦稱為 EU 索引，如下列中所述：Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。
「 杵臼 (knob-into-hole)」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway 等, Prot Eng 9, 617-621 (1996)；及 Carter，J Immunol Meth 248，7-15 (2001)。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起 (「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔 (「臼」)，以使該突起可安置在空腔內，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。透過用較大側鏈 (例如酪胺酸或色胺酸) 替換第一多肽界面上之較小的胺基酸側鏈來構建突起。透過將較大胺基酸側鏈替換為較小的胺基酸側鏈 (例如丙胺酸或蘇胺酸)，在第二多肽之界面中形成與突起具有相同或相近大小的互補空腔。可透過改變編碼多肽的核酸 (例如透過針對特定位點之突變或透過胜肽合成) 來製備突起和空腔。在一特定實施例中，杵修飾包含 Fc 域之兩個次單元中之一者中的胺基酸取代 T366W，且臼修飾包含 Fc 域之兩個次單元中之另一者中的胺基酸取代 T366S、L368A 及 Y407V。在另一特定實施例中，包含杵修飾之 Fc 域之子單元額外包含胺基酸取代 S354C，且包含臼修飾之 Fc 域的次單元額外包含胺基酸取代 Y349C。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得 Fc 區之兩個子單元之間形成雙硫鍵結，由此進一步穩定二聚體 (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
「與免疫球蛋白之 Fc 區等效之區域」意指包括免疫球蛋白之 Fc 區的天然存在之對偶基因變異體以及具有變化之變異體，該等變化產生取代、添加或缺失，但不實質上降低免疫球蛋白媒介效應子功能 (例如抗體依賴性細胞毒性) 的能力。例如，免疫球蛋白 Fc 區之 N 端或 C 端可缺失一個或多個胺基酸而不實質上損失生物功能。該等變異體可根據本領域中已知的一般法則選擇以對活性具有最小影響 (參見例如， Bowie, J. U. 等人，Science 247:1306-10 (1990))。
術語「 野生型 Fc 域」表示與自然界中發現的 Fc 域的胺基酸序列相同的胺基酸序列。野生型人 Fc 區包括但不限於天然人 IgG1 Fc 區 (非 A 和 A 同種異型)；天然人 IgG2 Fc 區；天然人 IgG3 Fc 區；及天然人 IgG4 Fc 區，以及其天然生成之變異體。野生型 Fc 區表示於 SEQ ID NO: 110 (IgG1，高加索人同種異型)、SEQ ID NO: 111 (IgG1，非裔美國人同種異型)、SEQ ID NO: 112 (IgG2)、SEQ ID NO: 113 (IgG3) 及 SEQ ID NO:114 (IgG4)。
術語「 變異體 ( 人 ) Fc 域」表示胺基酸序列，其由於至少一個「胺基酸突變」而不同於「野生型」(人) Fc 域胺基酸序列。於一個態樣中，與天然 Fc 區相比，變異體 Fc 區具有至少一個胺基酸突變，例如在天然 Fc 區中從約 1 個到約 10 個胺基酸突變，且於一個態樣中從約 1 個到約 5 個胺基酸突變。於一個態樣中，(變異體) Fc 區與野生型 Fc 區具有至少約 95％ 的同源性。本文所揭露之特異性變異體 Fc 域係具有突變 L234A、L235A 及 P329G 之人 IgG1 重鏈恆定區，其包含 SEQ ID NO:115 之胺基酸序列。
術語「 效應子功能」是指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效用功能的實例包括：C1q 結合及補體依賴性細胞毒性 (CDC)、Fc 受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)、細胞激素分泌、抗原呈遞細胞攝取之免疫複合物介導抗原、細胞表面受體 (例如，B 細胞受體) 降調及 B 細胞活化。
Fc 受體結合依賴性效應功能可藉由抗體的 Fc 區與 Fc 受體 (FcR) 的交互作用來進行媒介，該 Fc 受體係造血細胞上的特化細胞表面受體。Fc 受體屬於免疫球蛋白超家族，並且已顯示其藉由免疫複合物的吞噬作用來中介抗體包覆之病原體的去除，以及其經由抗體依賴性的細胞介導之細胞毒性 (ADCC)，介導包覆有相應抗體之紅血球及各種其他細胞標的 (例如腫瘤細胞) 的裂解 (參見，例如Van de Winkel, J.G.和Anderson, C.L., J. Leukoc.Biol.49 (1991) 511-524)。FcR 由其對免疫球蛋白同型的特異性來定義：對於 IgG 抗體的 Fc 受體稱為 FcγR。Fc 受體結合描述於例如 Ravetch, J.V. 及 Kinet, J.P., Annu.Rev. Immunol.9 (1991) 457-492；Capel, P.J., 等人，Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas, M., 等人，J. Lab.Clin.Med.126 (1995) 330-341；以及 Gessner, J.E., 等人，Ann.Hematol.76 (1998) 231-248。
對於 IgG 抗體 (FcγR) 之 Fc 區域的受體交聯，可觸發廣泛多樣的效應功能，包括吞噬作用、抗體依賴性細胞毒性、及發炎介質的釋放以及免疫複合物的清除和抗體產生的調節。在人中，已鑑定出三類 FcγR，其為： - FcγRI (CD64) 與具有高親和力的單體 IgG 結合，並表現於巨噬細胞、單核球、嗜中性球和嗜酸性球上。在 Fc 區域的 IgG 中至少一個胺基酸殘基 E233-G236、P238、D265、N297、A327 及 P329 (根據 Kabat 的 EU 索引編號) 的修飾，會降低與 FcγRI 之結合。在位置 233-236 處的 IgG2 殘基經取代為 IgG1 及 IgG4，與 FcγRI 的結合會降低 10³ 倍，且消除了人單核球對抗體致敏之紅血球細胞的反應 (Armour, K.L.等人，Eur.J. Immunol.29 (1999) 2613–2624)。 - FcγRII (CD32) 以中至低的親和力與複合的 IgG 結合，並且廣泛地表現。此受體可分為兩種亞型，FcγRIIA 及 FcγRIIB。FcγRIIA 在涉及毒殺的許多細胞 (例如巨噬細胞、單核球、嗜中性球) 上被發現，且似乎能夠活化毒殺過程。FcγRIIB 似乎在抑制過程中起作用，並在 B 細胞、巨噬細胞以及肥大細胞和嗜酸性球上被發現。在 B 細胞上，它似乎具有抑制免疫球蛋白進一步產生和同型轉換為例如 IgE 類的功能。在巨噬細胞上，FcγRIIB 可抑制透過 FcγRIIA 媒介的吞噬作用。在嗜酸性球和肥大細胞上，B 型可能透過 IgE 與其獨立受體的結合而有助於抑制這些細胞的活化。例如，已發現包含 IgG Fc 區域的抗體與 FcγRIIA 的結合降低，該 Fc 區域具有至少一個胺基酸殘基 E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292 及 K414 (根據 Kabat EU 索引編號) 突變。 - FcγRIII (CD16) 以中至低的親和力與 IgG 結合，並以兩種類型存在。FcγRIIIA 在 NK 細胞、巨噬細胞、嗜酸性球以及一些單核球和T細胞上被發現，並介導 ADCC。FcγRIIIB在嗜中性球上高度表達。例如，發現包含 IgG Fc 區的抗體與 FcγRIIIA 的結合降低，該 Fc 區具有至少一個胺基酸殘基 E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338 及 D376 (根據 Kabat EU 索引編號) 的突變。
對人 IgG1 上與 Fc 受體的結合位點進行定位，上述突變位點以及測量與 FcγRI 及 FcγRIIA 結合的方法，描述於 Shields, R.L. 等人，J. Biol.Chem.276 (2001) 6591-6604。
術語「 ADCC」或「抗體依賴性細胞毒性」為一種免疫機制，導致免疫效應細胞裂解經抗體包覆的標靶細胞。標靶細胞為抗體或其衍生物包含 Fc 區的細胞，其通常經由作為 N 端的蛋白質部分與 Fc 區特異性結合。如本文中所使用的術語「減少 ADCC」，係指透過上文定義的 ADCC 機制在給定時間內以標靶細胞周圍之培養基中給定濃度的抗體在給定時間內裂解的標靶細胞數量的減少，及/或透過 ADCC 機制在給定時間內實現給定數量的標靶細胞之裂解所需的標靶細胞周圍之培養基中抗體濃度的增加。ADCC 的減少係相對於使用相同標準生產、純化、配製及儲存方法 (此項技術中具有通常知識者已知的方法) 由相同類型的宿主細胞所生產的相同抗體 (但尚未工程化) 所介導的 ADCC。例如，由 Fc 域中包含減少 ADCC 的胺基酸取代的抗體所介導的 ADCC 的減少為相對於在 Fc 域中不含此胺基酸取代的相同抗體所介導的 ADCC。用於測量 ADCC 的合適的測定法為本技術領域中熟知的 (參見例如 PCT 公開號 WO 2006/082515 或 PCT 公開號 WO 2012/130831)。例如，藉由測量抗體與 Fcγ 受體表現的細胞 (例如重組表現 FcγRI 及/或 FcγRIIA 的細胞或 NK 細胞 (實質上表現 FcγRIIIA)) 的結合來研究抗體誘導介導 ADCC 的初始步驟的能力。特定而言，測量與 NK 細胞上之 FcγR 的結合。
「 活化 Fc 受體」為 Fc 受體在與抗體之 Fc 區接合之後，引發信號傳導事件，刺激攜帶受體之細胞以進行效應子功能。活化 Fc 受體包括 FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32) 及 FcαRI (CD89)。特定活化 Fc 受體為人 FcγRIIIa (SEQ ID NO:116 UniProt 寄存編號 P08637，版本 141)。
「 胞外域」為膜蛋白質的延伸至細胞外空間 (亦即靶細胞以外之空間) 的域。胞外域通常為蛋白質中起始與表面之接觸 (其引起信號轉導) 之部分。
術語「 肽連接子」是指包含一個或多個胺基酸，通常約 2 至 20 個胺基酸的肽。肽連接子為此項技術中已知或描述於本文中。適合的非免疫原性連接肽為例如 (G 4S) n、(SG 4) n或 G 4(SG 4) n肽連接子，其中「n」通常為 1 與 5 之間的數值，通常在 2 與 4 之間，特定而言 2，亦即選自由以下所組成之群組之肽：GGGGS (SEQ ID NO:117)、GGGGSGGGG (SEQ ID NO:198)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:118)、SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:119) 及 GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:120)，但亦包括序列 GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:121)、(G4S) 3(SEQ ID NO:122)、(G4S) 4(SEQ ID NO:123)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:124)、GSGSGNGS (SEQ ID NO:125)、GGSGSGSG (SEQ ID NO:126)、GGSGSG (SEQ ID NO:127)、GGSG (SEQ ID NO:128)、GGSGNGSG (SEQ ID NO:129)、GGNGSGSG (SEQ ID NO:130) 及 GGNGSG (SEQ ID NO:131)。尤其受關注之肽連接子為 (G4S) (SEQ ID NO:117)、GGGGSGGGG (SEQ ID NO:198)、(G 4S) 2或 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:118)、(G4S) 3(SEQ ID NO:122) 及 (G4S) 4(SEQ ID NO:123)。
如本申請案所載之術語「 胺基酸」表示天然存在之羧基 α-胺基酸之群組，其包含丙胺酸 (三字母代碼：ala，一字母代碼：A)、精胺酸 (arg，R)、天冬醯胺酸 (asn，N)、天冬胺酸 (asp，D)、半胱胺酸 (cys，C)、麩醯胺酸 (gln，Q)、麩胺酸 (glu，E)、甘胺酸 (gly，G)、組胺酸 (his，H)、異白胺酸 (ile，I)、白胺酸 (leu，L)、離胺酸 (lys，K)、甲硫胺酸 (met，M)、苯丙胺酸 (phe，F)、脯胺酸 (pro，P)、絲胺酸 (ser，S)、蘇胺酸 (thr，T)、色胺酸 (trp，W)、酪胺酸 (tyr，Y) 及纈胺酸(val，V)。
「融合」或「連接」意指組分 (例如多肽及另一多肽) 直接或經由一個或多個肽連接子由肽鍵連接。
相對於參考多肽序列 (蛋白質) 之「 胺基酸序列同一性百分比 (%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列同一性百分比之後，且在不將保守性取代視為序列同一性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列同一性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如使用公開可用之電腦軟體，例如 BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI 或 Megalign (DNASTAR) 軟體。熟習此項技術者可判定用於比對序列之適當參數，包括在所比較之序列的全長上達成最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 產生 ％ 胺基酸序列同一性值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司 (Genentech，Inc.) 編寫，原始程式碼已與用戶文檔一起存檔於美國版權局，華盛頓特區，20559，並以美國版權註冊號 TXU510087 進行註冊。ALIGN-2 程式可從加利福尼亞南三藩市的建南德克公司 (Genentech，Inc.) 公眾可取得，亦可以從原始程式碼進行編譯。ALIGN-2 程式應編譯為在 UNIX 作業系統（包括數位 UNIX V4.0D）上使用。所有序列比較參數均由 ALIGN-2 程式設置，並且沒有變化。在使用 ALIGN-2 進行胺基酸序列比較的情況下，既定胺基酸序列 A 對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 的 % 胺基酸序列同一性 (其可替代性地表述為既定胺基酸序列 A，其對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 具有或包含一定 % 的胺基酸序列同一性) 計算如下：100 乘以分數 X/Y，其中 X 為在 A 與 B 之比對程式中藉由序列比對程式 ALIGN-2 以一致匹配形式所得到之胺基酸殘基數目，且其中 Y 為 B 中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列 A 之長度與胺基酸序列 B 之長度不相等之情況下， A 與 B 之胺基酸序列同一性 % 將不等於 B 與 A 之胺基酸序列同一性 %。除非另外特定陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列同一性 % 值係使用 ALIGN-2 電腦程式獲得，如前一段落中剛剛所述。
在某些實施例中，考慮到本文所提供之 BCMA 抗體或雙特異性 BCMA 抗體的 胺基酸序列變異體。例如，可能期望改善 BCMA 抗體或雙特異性 BCMA 抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。可藉由將適當修飾引入編碼分子之核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備 BCMA 抗體或雙特異性 BCMA 抗體之胺基酸序列變異體。此類修飾包括例如抗體之胺基酸序列中殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所期望之特徵，例如抗原結合特徵。用於取代性誘變之所關注位點包括 CDR 及骨架 (FR)。保守性取代以標題「較佳取代」提供於表 B 中，並在下文中參考胺基酸側鏈分類 (1) 至 (6) 進一步描述。可將胺基酸取代引入相關分子且針對所需活性篩選產物，例如保持/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之 ADCC 或 CDC。 表 A
原始 殘基 例示性 取代 較佳 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys，Ser、，Thr，Asn，Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
術語「 胺基酸序列變異體」包括實質性變異體，其中在親本抗原結合分子 ( 例如人源化或人抗體) 之一個或多個高度可變區殘基中存在胺基酸取代。通常，所選擇用於進一步研究的所產生之變異體與親代抗原結合分子相比將具有某些生物特性之修飾 (例如改良) (例如提高的親和力、降低的免疫原性) 及/或將實質上保持親本抗原結合分子之某些生物特性。例示性取代變異體為親和力成熟的抗體，其可以方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術，例如本文所述的那些。簡言之，一個或多個 CDR 殘基突變且變異體抗原結合分子在噬菌體上呈現並針對特定生物活性 (例如結合親和力) 進行篩選。在某些實施例中，一個或多個 CDR 內可存在取代、插入或缺失，只要此類變化不實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。例如，可在 CDR 中進行實質上不降低結合親和力的保守性改變 (例如，本文所提供之保守性取代)。鑑定可以靶向誘變的抗體的殘基或區域的可用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如下列所述：Cunningham 及 Wells (1989) Science, 244:1081-1085。在該方法中，識別殘基或目標殘基組 (例如，帶電荷的殘基，如 Arg、Asp、His、Lys 及 Glu)，並用中性或帶負電荷的胺基酸 (例如，丙胺酸或聚丙胺酸) 取代以確定抗體與抗原之交互作用是否受到影響。可在胺基酸位置處引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能敏感性。或者或另外地，抗原-抗原結合分子之晶體結構複合以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為用於取代的候選物而經靶向或消除。可篩選變異體以判定它們是否含有所期望之特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基到含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。插入的實例包括 BCMA 抗體或雙特異性 BCMA 抗體以 N 端或 C 端與多肽融合，這增加 CD28 抗原結合分子之血清半衰期。
在某些態樣中，改變本文所提供之 BCMA 抗體或雙特異性 BCMA 抗體以增加或減弱該抗體發生醣基化之程度。藉由改變胺基酸序列從而產生或移除一個或多個醣基化位點可便利地獲得分子之醣基化變異體。當促效的 ICOS 結合分子包含 Fc 域時，可改變與其附接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由 N-鍵聯接附至 Fc 區之 CH2 域的 Asn297。參見，例如，Wright 等人 TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露醣、N-乙醯基葡醣胺 (GlcNAc)、半乳醣及唾液酸以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中接附至 GlcNAc 的岩藻醣。在一些實施例中，可對 BCMA 抗體或雙特異性 BCMA 抗體中的寡醣進行修飾，以產生具有某些改善性質的變異體。在一個態樣中，提供具有缺少 (直接或間接地) 附接至 Fc 區之岩藻醣的碳水化合物結構之 BCMA 抗體或雙特異性 BCMA 抗體之變異體。此類岩藻醣基化變異體可具有改良之 ADCC 功能，參見例如，美國專利公開號 US 2003/0157108 (Presta, L.) 或 US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。BCMA 抗體或雙特異性 BCMA 抗體之其他變異體包括具有平分寡醣之變異體，例如，其中附接至 Fc 區之雙觸角寡醣係藉由 GlcNAc 平分。該等變異體可具有降低之岩藻糖苷化及/或改良之 ADCC 功能，參見例如，WO 2003/011878 (Jean-Mairet 等人)；美國專利號 6,602,684 (Umana 等人)；及 US 2005/0123546 (Umana 等人)。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與 Fc 區連接之變異體。該等抗體變異體可具有改良的 CDC 功能且描述於例如，WO 1997/30087 (Patel 等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及 WO 1999/22764 (Raju, S.) 中。
在某些實施例中，可能需要產生本發明之 CD28 抗原結合分子的 經半胱胺酸工程化之變異體，例如「thioMAbs」，其中分子之一個或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於分子之可達位點處。藉由用半胱胺酸取代此等殘基，藉此將反應性硫醇基置於抗體可達的位點，並可用於使抗體與其他部分 (諸如藥物部分或連接子-藥物部分) 結合以產生免疫結合物。在某些實施例中，以下任何一個或多個殘基可被半胱胺酸取代：輕鏈的 V205 (Kabat 編號)；重鏈的 A118 (EU 編號)；及重鏈 Fc 區的 S400 (EU 編號)。可例如美國專利號 7,521,541 中所述產生經半胱胺酸工程化的抗原結合分子。
在某些態樣中，可進一步修飾本文所提供之 BCMA 抗體或雙特異性 BCMA 抗體，以含有此項技術中已知且容易獲得的附加的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三㗁𠮿、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或隨機共聚物) 以及葡聚醣或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可係分支的或不分支的。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括，但不限於待改良抗體之特定性質或功能、雙特異性抗體衍生物是否將用於限定條件下之療法等考慮因素來判定。在另一態樣中，提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分是碳奈米管 (Kam, N.W. 等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括，但不限於不損害一般細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分附近之細胞之溫度的波長。在另一態樣中，可以獲得本文所提供之 BCMA 抗體或雙特異性 BCMA 抗體之免疫結合物。「 免疫結合物」為與一種或多種異源分子結合之抗體，例如小分子藥劑。
術語「 多核苷酸」是指分離之核酸分子或構建體，例如訊息 RNA (mRNA)、病毒源 RNA 或質體 DNA (pDNA)。多核苷酸可包含習知的磷酸二酯鍵或非習知的鍵 (例如醯胺鍵，諸如胜肽核酸 (PNA) 中所見)。術語「核酸分子」，是指任何存在於多核苷酸中之一個或多個核酸片段，例如 DNA 或 RNA 片段。各核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (亦即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (亦即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子係藉由鹼基之序列來描述，其中該等鹼基表示核酸分子之一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5' 至 3' 表示。在本文中，術語核酸分子涵蓋：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如互補 DNA (cDNA) 及基因組 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 之合成形式；以及包含兩種或更多種此等分子的混合聚合物。核酸分子可為線性或環狀的。此外，術語核酸分子包括有義股及反義股，以及單股形式及雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可含有天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的實例包括帶有經衍生之糖、磷酸主鏈鍵聯或經化學修飾之殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子亦涵蓋 DNA 及 RNA 分子，該等分子適於作為在活體外及/或活體內、例如在宿主或患者內直接表現本發明之抗體的載體。此類 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可為未修飾的或經修飾的。例如，mRNA 可經過化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或編碼分子之表現，從而將 mRNA 注入個體 活體內以產生抗體 (參見例如 Stadler 等人(2017) Nature Medicine 23:815-817 或 EP 2 101 823 B1)。
藉由「 經分離之」核酸分子或多核苷酸意在自原生環境中去移的核酸分子、DNA 或 RNA。例如，就本發明而言，編碼載體中所含之多肽的重組多核苷酸被視為是經分離。經分離之多核苷酸之更多實例包括在異源性宿主細胞中保持之重組多核苷酸或溶液中經純化之 (部分或基本上) 多核苷酸。經分離之多核苷酸包括通常包含多核苷酸分子之細胞中所含之多核苷酸分子，但是多核苷酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。分離的 RNA 分子包括本發明之活體內或活體外 RNA 轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。根據本發明之經分離之多核苷酸或核酸進一步包括合成產生之此等分子。此外，多核苷酸或核酸可以為或可包括調控元件，諸如啟動子、核醣體結合位點或轉錄終止子。
藉由與本發明之參考核苷酸序列具有至少例如 95%「同一性」的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指該多核苷酸的核苷酸序列與參考序列具有同一性，除了參考核苷酸序列的每 100 個核苷酸，多核苷酸序列可包括至多五個點突變。換言之，為了獲得與參考核苷酸序列具有至少 95% 的同一性的核苷酸序列的多核苷酸，可以刪除參考序列中最多 5% 的核苷酸或用另一個核苷酸取代，或者將參考序列中核苷酸總數最多 5% 的核苷酸數插入到參考序列中。參考序列的這些改變可能發生在參考核苷酸序列的 5’ 端或 3’ 端位置或這些末端位置之間的任何位置，既散佈在參考序列的殘基之間，也散佈在參考序列內的一個或多個連續基團中。實際上，任何特定的多核苷酸序列是否與本發明的核苷酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性可以使用已知的電腦程式習知地確定，諸如如上討論用於多肽的程式 (例如，ALIGN-2)。
術語「 表現匣」是指以重組或合成方式產生的多核苷酸，其具有允許標靶細胞中之特定核酸發生轉錄的一系列特定核酸元件。重組表現匣可被引入質體、染色體、粒線體 DNA、色素體 DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現匣部分除其他序列外還包括待轉錄之核酸序列和啟動子。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列。
術語「 載體」或「表現載體」與「表現構建體」同義，且是指用於導入特定基因並導引該基因表現的 DNA 分子，該 DNA 分子與該基因在標靶細胞中可操作地連接。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。本發明之表現載體包含表現匣。表現載體轉錄大量穩定的 mRNA。一旦表現載體進入標靶細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機構產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現匣，該表現匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列。
術語「 宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用，且是指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與在經初始轉化之細胞中所篩選或選擇的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變型子代細胞。宿主細胞為可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子的任何類型之細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如 CHO 細胞、BHK 細胞、NS0 細胞、SP2/0 細胞、YO 骨髓瘤細胞、P3X63 小鼠骨髓瘤細胞、PER 細胞、PER.C6 細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞 (僅舉數例)，但亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所含的細胞。
藥劑之「 有效量」是指使其所投與之細胞或組織中產生生理學變化所需的量。
藥劑 (例如醫藥組成物) 之「 治療有效量」是指在必需的劑量及時段情況下，有效達成所需治療或預防結果的量。治療有效量的藥劑例如消除、減少、延遲、最小化或防止疾病的不利影響。
「 個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物 (例如人類及非人靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。特定而言，受試者或個體為人。
術語「 醫藥組成物」是指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分。
「 醫藥上可接受之賦形劑」是指醫藥組成物中之除活性成分以外的對個體無毒的成分。醫藥上可接受之賦形劑包含，但不限於緩衝劑、穩定劑或防腐劑。
術語「 藥品仿單」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌及/或警告之資訊。
如本文所使用，「 治療 (treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療 (treat)」或「治療 (treating)」) 係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入，並可出於防治目的或在臨床病理學之病程期間進行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之分子用於延遲疾病發展或減慢疾病之進程。
術語「 療法」係指可用於預防、管控、治療並/或改善疾病 (或與其相關之症狀) 或癌症的任何方案、方法及/或藥劑。在某些態樣中，術語「各療法」及「療法」係指生物療法、支援療法及/或可用於預防、管控、治療並/或改善熟習此項技術者諸如醫師已知的疾病或癌症的其他療法。
如本文所述，術語「 組合治療」或「 共同投予」包括組合投予 (其中兩種或多種治療劑包含在相同或分開的調配物中) 和分開投予，在這種情況下，投予如本文所報導的抗體可在投予另外的一種或多種治療劑 (較佳為一種或多種抗體) 之前、同時及/或之後發生。
術語「 癌症」係指或描述為通常以不受調節的細胞生長/增生為特徵的哺乳動物生理病狀。因此，本文所使用的術語癌症是指增生性疾病，例如癌、淋巴瘤 (例如霍奇金氏 (Hodgkin) 和非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤和白血病。特定而言，術語癌症包括淋巴球性白血病、肺癌、非小細胞肺 (NSCL) 癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌 (stomach cancer)、胃癌 (gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病 (Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或尿管之癌症、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽癌、中樞神經系統 (CNS) 之贅瘤、脊柱軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、脊膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤文氏肉瘤 (Ewings sarcoma)、包括以上癌症中之任一者之頑抗性版本，或以上癌症中之一或多者之組合。於一個態樣中，癌症為實性腫瘤。於另一態樣中，癌症是血液學癌症，特定而言為白血病，最特定而言為急性淋巴母細胞性白血病 (ALL) 或急性髓性白血病 (AML)。在較佳態樣中，術語癌症係指其中表現 BCMA 的任何癌症。更較佳地，癌症為多發性骨髓瘤 (MM)。
例示性新穎 BCMA 抗體
本文提供與 B 細胞成熟抗原 (BCMA) 特異性結合之新穎抗體及/或抗體片段。提供與包含 SEQ ID NO:132 之胺基酸序列的人 BCMA 之細胞外域特異性結合之新穎抗體及/或抗體片段。因此，這些抗體與人類 BCMA 特異性結合。
此等抗體能夠與人 BCMA 以及與獼猴 BCMA 結合。
它們與人 BCMA 細胞外域 (SEQ ID NO: 132 之胺基酸序列之 ECD) 結合，其中如藉由表面電漿子共振 (SPR) 測量，K D值小於 5 nM (參見實例 1.3)。
如實例 3 所示，新穎抗體亦能夠結合突變型人 BCMA 變異體 hu BCMA_R27P (SEQ ID NO:210)、Hu BCMA_S30del (SEQ ID NO:211)、hu BCMA_P33S (SEQ ID NO:212) 及 hu BCMA_P34del (SEQ ID NO:213)。因此，它們不會受 BCMA 之 ECD 的點突變影響，亦不會像對諸如艾爾納單抗及特立妥單抗的其他 BCMA 靶向型分子所觀察到的那樣失去治療活性 ((Lee 等人，Nature Medicine 2023, 29, 2295-2306)。
新穎抗體係進一步特徵在於，它們係以大的量及高滴度可生產，特徵在於它們顯示出高熱穩定性 (如藉由聚集溫度 T agg測量)，或特徵在於它們具有高度人性，且因此可能在人體內具有較少免疫原性。相較於人生殖系列序列，VH 及 VL序列之人性百分比可以藉由描述於以下的方法來判定：Abhinandan，K.R. 及 Martin，Andrew C. R. 2007, J. Mol.Biol.2007, 369 ,852-862。
在一個態樣中，本文提供一種與 B 細胞成熟劑 (BCMA) 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 (i) 重鏈可變區 (V HBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 1 (GYTFTNYWMH) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 2 (IIHPNSGSTNYNEKFQG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 3 (GIYDYPFAY) 之 CDR-H3；以及 (ii) 輕鏈可變區 (V LBCMA)，其選自由以下所組成之群組： (a) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 5 (AASSLQS) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3；或 (b) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 7 (AASNLES) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3；或 (c) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 8 (AASNLQS) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3。
在一個態樣中，本文提供一種 BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域)，其中該抗體包含：V HBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 9 (VH1a) 及 SEQ ID NO: 10 (VH1b)；及/或 V LBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 11 (VL1f)、SEQ ID NO: 12 (VL1a)、SEQ ID NO: 13 (VL1b)、SEQ ID NO: 14 (VL1c)、SEQ ID NO: 15 (VL1d) 及 SEQ ID NO:16 (VL1e)。
在一個態樣中，提供一種 BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域)，其中該抗體 (或抗原結合域) 包含 (a) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (c) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (d) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (e) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (f) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (g) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:135 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (h) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:136 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (i) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (j) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (k) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (l) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (m) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (n) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (o) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:135 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (p) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:136 之胺基酸序列的 V LBCMA。
在一個態樣中，BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域) 包含 (a) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (c) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (d) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (e) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (f) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (g) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:135 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (h) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:136 之胺基酸序列的 V LBCMA。
在一個態樣中，BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域) 包含 (i) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (j) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (k) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (l) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (m) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (n) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (o) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:135 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (p) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:136 之胺基酸序列的 V LBCMA。
在一個特定態樣中，提供一種 BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域)，其中該抗體 (或抗原結合域) 包含 (a) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA。
更特定而言，BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域) 包含：V HBCMA，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；以及 V LBCMA，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本文提供一種與 B 細胞成熟劑 (BCMA) 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 (i) 重鏈可變區 (V HBCMA)，其選自由以下所組成之群組： (a) VH，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 30 (QITAKSNNYATYYADSVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；以及 (b) VH，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 32 (QITAKSNNYATYYAAPVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；以及 (ii) 輕鏈可變區 (V LBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 33 (RASEDIRNGLA) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 34 (NANSLHT) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 35 (EDTSKYPYT) 之 CDR-L3。
在一個態樣中，提供一種 BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域)，其中該抗體 (或抗原結合域) 包含：重鏈可變區 (V HBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 30 (QITAKSNNYATYYADSVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V LBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 33 (RASEDIRNGLA) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 34 (NANSLHT) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 35 (EDTSKYPYT) 之 CDR-L3。
在一個態樣中，提供一種 BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域)，其中該抗體 (或抗原結合域) 包含：重鏈可變區 (V HBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 32 (QITAKSNNYATYYAAPVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V LBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 33 (RASEDIRNGLA) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 34 (NANSLHT) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 35 (EDTSKYPYT) 之 CDR-L3。
在一個態樣中，本文提供一種 BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域)，其中該抗體 (或抗原結合域) 包含：V HBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 36 (VH2a)、SEQ ID NO: 38 (VH1b)、SEQ ID NO:48 (VH1a)、SEQ ID NO:49 (VH1a_Y292D)、SEQ ID NO:50 (VH1c_hu CDR2) 及 SEQ ID NO:51 (VH1a_W197Y)；及/或 V LBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 37 (VL2a)、SEQ ID NO:39 (VL1a)、SEQ ID NO:52 (VL1a_L2_GL)、SEQ ID NO:53 (VL2a_L2_GL)、SEQ ID NO:54 (VL1a_L1_pGL)、SEQ ID NO:55 (VL1a_N651A)、SEQ ID NO:56 (VL1a_N651A_N695S)、SEQ ID NO:57 (VL1a_H698Q)、SEQ ID NO:58 (VL1a_T699S) 及 SEQ ID NO:59 (VL1a_H698Q_T699S)。
在一個態樣中，本文提供一種 BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域)，其中該抗體 (或抗原結合域) 包含：V HBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 36 (VH2a) 及 SEQ ID NO: 38 (VH1b)；及/或 V LBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 37 (VL2a) 及 SEQ ID NO:39 (VL1a)。
在一個態樣中，提供一種 BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域)，其中該抗體 (或抗原結合域) 包含 (a) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (c) 包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (d) 包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (e) 包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (f) 包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (g) 包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (h) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (i) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (j) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (k) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (l) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (m) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (n) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (o) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的 V LBCMA。
在一個特定態樣中，提供一種 BCMA 抗體 (或與 BCMA 特異性結合之抗原結合域)，其中該抗體 (或抗原結合域) 包含 (a) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA。
更特定而言，BCMA 抗體包含：V HBCMA，其包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列；以及 V LBCMA，其包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列。
在一個態樣中，與 BCMA 特異性結合的抗體為全長抗體，特定而言屬於人類 IgG1 亞類。在一個特定態樣中，其包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。
包含新穎 BCMA 抗體的雙特異性 CD28 促效抗體
本專利申請還提供新穎 BCMA 抗體，其包含與第二抗原、特定而言與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域。這些雙特異性 CD28 促效抗體具備有利的性質，諸如優異的可生產性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向效率、降低的毒性、可以給予患者並因此可以觀察到可能增強的功效的擴展的劑量範圍。新穎雙特異性 CD28 促效抗體包含由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應功能 (Fc 沉默) 的一個或多個胺基酸取代，因此避免經由 Fc 受體的非特異性交聯。反而，它們包含能夠與 BCMA 特異性結合之特異性抗原結合域，這在腫瘤部位引起交聯。出人意料的是，發明人已發現，基於其結合特性，本文所述之 BCMA 抗原結合域具有使其更適用於雙特異性型式的有利特性。此外，已發現包含這些 BCMA 抗原結合域的雙特異性促效的 CD28 抗原結合分子具有改進增加 T 細胞活化的功能及能力，特定而言在存在 T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體的情況下。因此，實現了增強的腫瘤特異性 T 細胞活化。
在一個態樣中，本文提供一種與 B 細胞成熟劑 (BCMA) 及 CD28 特異性結合之雙特異性抗體，其中該抗體包含 (A) 第一抗原結合域，其包含 (i) 重鏈可變區 (V HBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 1 (GYTFTNYWMH) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 2 (IIHPNSGSTNYNEKFQG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 3 (GIYDYPFAY) 之 CDR-H3；以及 (ii) 輕鏈可變區 (V LBCMA)，其選自由以下所組成之群組： (a) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 5 (AASSLQS) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3；或 (b) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 7 (AASNLES) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3；或 (c) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 8 (AASNLQS) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 之 CDR-L3 (QQSIEDPYT)；以及 (B) 第二抗原結合域，其與 CD28 特異性結合。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含：V HBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 9 (VH1a) 及 SEQ ID NO: 10 (VH1b)；及/或 V LBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 11 (VL1f)、SEQ ID NO: 12 (VL1a)、SEQ ID NO: 13 (VL1b)、SEQ ID NO: 14 (VL1c)、SEQ ID NO: 15 (VL1d) 及 SEQ ID NO:16 (VL1e)。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 (a) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (c) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (d) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (e) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (f) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (g) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:135 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (h) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:136 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (i) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (j) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (k) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (l) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (m) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (n) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (o) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:135 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (p) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:136 之胺基酸序列的 V LBCMA。
在一個態樣中，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體包含 (a) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (c) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (d) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (e) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (f) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (g) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:135 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (h) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:136 之胺基酸序列的 V LBCMA。
在一個態樣中，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體包含 (i) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (j) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (k) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (l) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (m) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (n) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (o) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:135 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (p) 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:136 之胺基酸序列的 V LBCMA。
在一個特定態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 (a) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA。
更特定而言，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體包含：V HBCMA，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列；以及 V LBCMA，其包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列。
在本文先前提到之所有這些態樣中，與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域可以為 Fab 分子。在一些態樣中，與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域可以為 cross-Fab 分子，亦即 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特定而言可變域 VL 及 VH 係彼此替換。
在特定態樣中，與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域為 Fab 分子，其中在恆定域 CL 中，位置 123 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 的胺基酸取代且位置 124 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經離胺酸(K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 獨立地取代，且其中在恆定域 CH1 中，位置 147 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 獨立地取代且位置 213 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 獨立地取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
在本文先前提到之所有這些態樣中，與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域可以為 Fab 分子。在特定態樣中，與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域為 cross-Fab 分子，亦即 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特定而言可變域 VL 及 VH 係彼此替換。
在一個態樣中，與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 17 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 18 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 19 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 20 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 21 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 22 之 CDR-L3。在一個態樣中，與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD28)，及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD28) (v8)。
在一個特定態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含：第一抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA；以及第二抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 V HCD28 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 V LCD28。
在一個態樣中，與 BCMA 及 CD28 特异性結合之抗體包含：與 SEQ ID NO:25 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:26 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:27 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽以及與 SEQ ID NO:28 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽。在一個特定態樣中，提供一种與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的第一輕鏈、含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的第一重鏈、含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的第二重鏈及含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的第二輕鏈。
在另一態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含：第一抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及含有 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA；以及第二抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 V HCD28 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 V LCD28。
在一個態樣中，與 BCMA 及 CD28 特异性結合之抗體包含：與 SEQ ID NO:92 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:26 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:27 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽以及與 SEQ ID NO:28 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽。在一個態樣中，提供一种與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有 SEQ ID NO:92 之胺基酸序列的第一輕鏈、含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的第一重鏈、含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的第二重鏈及含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的第二輕鏈。
在進一步態樣中，提供一種與 B 細胞成熟劑 (BCMA) 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 (A) 第一抗原結合域，其包含 (i) 重鏈可變區 (V HBCMA)，其選自由以下所組成之群組： (a) VH，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 30 (QITAKSNNYATYYADSVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；以及 (b) VH，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 32 (QITAKSNNYATYYAAPVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；以及 (ii) 輕鏈可變區 (V LBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 33 (RASEDIRNGLA) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 34 (NANSLHT) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 35 (EDTSKYPYT) 之 CDR-L3，以及 (B) 第二抗原結合域，其與 CD28 特異性結合。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區 (V HBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之 CDR-H1、SEQ ID NO: 30 (QITAKSNNYATYYADSVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V LBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 33 (RASEDIRNGLA) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 34 (NANSLHT) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 35 (EDTSKYPYT) 之 CDR-L3。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含：重鏈可變區 (V HBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之 CDR-H1、SEQ ID NO: 32 (QITAKSNNYATYYAAPVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V LBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 33 (RASEDIRNGLA) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 34 (NANSLHT) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 35 (EDTSKYPYT) 之 CDR-L3。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含：V HBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 36 (VH2a)、SEQ ID NO: 38 (VH1b)、SEQ ID NO:48 (VH1a)、SEQ ID NO:49 (VH1a_Y292D)、SEQ ID NO:50 (VH1c_hu CDR2) 及 SEQ ID NO:51 (VH1a_W197Y)；及/或 V LBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 37 (VL2a)、SEQ ID NO:39 (VL1a)、SEQ ID NO:52 (VL1a_L2_GL)、SEQ ID NO:53 (VL2a_L2_GL)、SEQ ID NO:54 (VL1a_L1_pGL)、SEQ ID NO:55 (VL1a_N651A)、SEQ ID NO:56 (VL1a_N651A_N695S)、SEQ ID NO:57 (VL1a_H698Q)、SEQ ID NO:58 (VL1a_T699S) 及 SEQ ID NO:59 (VL1a_H698Q_T699S)。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含：V HBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 36 (VH2a) 及 SEQ ID NO: 38 (VH1b)；及/或 V LBCMA，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 37 (VL2a) 及 SEQ ID NO:39 (VL1a)。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 (a) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (c) 包含 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (d) 包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (e) 包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:52 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (f) 包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (g) 包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (h) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (i) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:55 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (j) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:56 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (k) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (l) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (m) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (n) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:54 之胺基酸序列的 V LBCMA；或 (o) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:58 之胺基酸序列的 V LBCMA。
在一個特定態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 (a) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA。
更特定而言，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體包含：V HBCMA，其包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列；以及 V LBCMA，其包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列。
在本文先前提到之所有這些態樣中，與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域可以為 Fab 分子。在一些態樣中，與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域可以為 cross-Fab 分子，亦即 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特定而言可變域 VL 及 VH 係彼此替換。
在特定態樣中，與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域為 Fab 分子，其中在恆定域 CL 中，位置 123 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 的胺基酸取代且位置 124 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經離胺酸(K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 獨立地取代，且其中在恆定域 CH1 中，位置 147 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 獨立地取代且位置 213 處的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 獨立地取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。
在本文先前提到之所有這些態樣中，與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域可以為 Fab 分子。在特定態樣中，與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域為 cross-Fab 分子，亦即 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特定而言可變域 VL 及 VH 係彼此替換。
在一個態樣中，與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 17 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 18 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 19 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 20 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 21 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 22 之 CDR-L3。在一個態樣中，與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD28)，及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD28) (v8)。
在一個特定態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含：第一抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA；以及第二抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 V HCD28 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 V LCD28。
在一個態樣中，與 BCMA 及 CD28 特异性結合之抗體包含：與 SEQ ID NO:40 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:41 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:27 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽以及與 SEQ ID NO:28 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽。在一個特定態樣中，提供一种與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的第一輕鏈、含有 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列的第一重鏈、含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的第二重鏈及含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的第二輕鏈。
在另一態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含：第一抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及含有 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA；以及第二抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 V HCD28 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 V LCD28。
在一個態樣中，與 BCMA 及 CD28 特异性結合之抗體包含：與 SEQ ID NO:94 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:93 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:27 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽以及與 SEQ ID NO:28 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽。在一個特定態樣中，提供一种與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有 SEQ ID NO:94 之胺基酸序列的第一輕鏈、含有 SEQ ID NO:93 之胺基酸序列的第一重鏈、含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的第二重鏈及含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的第二輕鏈。
在上文提到之任意態樣中，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體包含 Fc 域。在一個態樣中，Fc 域為 IgG，特定而言 IgG1 Fc 域。在一個特定態樣中，Fc 域為人 Fc 域，特定而言人 IgG1 Fc 域。在上文所提到之任意態樣中，Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應功能的一個或多個胺基酸取代。在一個特定態樣中，其包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。
減少 Fc 受體結合及 / 或效應功能之 Fc 域修飾
與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體之 Fc 域由包含免疫球蛋白分子之重鏈域的一對多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白 G (IgG) 分子之 Fc 域為二聚體，其每個次單元包含 CH2 及 CH3 IgG 重鏈恆定域。Fc 域之兩個次單元能夠彼此穩定締合。Fc 域賦予本發明的抗原結合分子有利的藥物動力學特性，包括有助於在標靶組織中良好積累的長的血清半衰期和有利的組織-血液分佈比。然而，另一方面，它可能導致本發明的雙特異性抗體不期望地靶向表現 Fc 受體的細胞，而非較佳的攜帶抗原的細胞。
因此，相較於天然 IgG1 Fc 域，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體呈現與 Fc 受體的降低的結合親和力及/或降低的效應功能。在一個態樣中，Fc 域實質上不結合 Fc 受體且/或不誘導效應功能。於特定態樣中，該 Fc 受體為 Fcγ 受體。於一個態樣中，Fc 受體為人類 Fc 受體。於具體態樣中，Fc 受體為活化人 Fcγ 受體，更具體而言人 FcγRIIIa、FcγRI 或 FcγRIIa，最具體而言人 FcγRIIIa。於一個態樣中，Fc 域不誘導效應功能。降低之效應子功能可包括，但不限於以下中之一或多者：降低之補體依賴性細胞毒性 (CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性 (ADCC)、降低之抗體依賴性細胞吞噬 (ADCP)、降低之細胞激素分泌、降低之免疫錯合物介導之抗原呈現細胞之抗原捕捉、降低之與 NK 細胞之結合、降低之與巨噬細胞之結合、降低之與單核細胞之結合、降低之與多形核細胞之結合、降低之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、降低之樹突狀細胞成熟或降低之T細胞活化。
在某些態樣中，可在本文所提供之抗體的 Fc 區域中引入一個或多個胺基酸修飾，從而產生 Fc 區變異體。Fc 區域變異體可包含人 Fc 區域序列 (例如，人 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。
在一個特定態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中 Fc 區包含一個或多個胺基酸取代，其降低與 Fc 受體的結合，特定而言為對 Fcγ 受體的結合。在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中 Fc 區包含一個或多個胺基酸取代，且其中由抗體誘導的 ADCC 被減少至由包含野生型人 IgG1 Fc 區之抗體所誘導的 ADCC 的 0% 至 20%。
在一個態樣中，本文所描述之抗體之 Fc 域包含一個或多個胺基酸突變，其降低 Fc 域對 Fc 受體之結合親和力及/或效應功能。通常，在 Fc 域之兩個次單元中的每個中都存在相同的一個或多個胺基酸突變。特定而言，Fc 域在位置 E233、L234、L235、N297、P331 及 P329 (EU 編號) 處包含胺基酸取代。特別地，Fc 域包含 IgG 重鏈之位置 234 及 235 (EU 編號) 及/或 329 (EU 編號) 處的胺基酸取代。更特定而言，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，該抗體包含具有 IgG 重鏈中之胺基酸取代 L234A、L235A 及 P329G (「P329G LALA」，EU 編號) 之 Fc 域。胺基酸取代 L234A 及 L235A 是指所謂的 LALA 突變。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除了人類 IgG1 Fc 域的 Fcγ 受體結合並且在國際專利申請公開號 WO 2012/130831 A1 中進行描述，該文獻亦描述製備此類突變 Fc 域的方法以及用於確定其性質 (諸如 Fc 受體結合或效應功能) 的方法。
具有降低之 Fc 受體結合及/或效應功能之 Fc 域亦包括具有 Fc 域殘基 238、265、269、270、297、327 及 329 中之一者或多者之取代的域 (美國專利號 6,737,056)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
於另一態樣中，Fc 域為 IgG4 Fc 域。與 IgG1 抗體相比，IgG4 抗體呈現降低的對 Fc 受體之結合親和力及降低的效應功能。在一更具體方面，Fc 域為包含位置 S228 (Kabat 編號) 之胺基酸取代 (特定而言，胺基酸取代 S228P) 的 IgG4 Fc 域。在一更具體方面，Fc 域為 IgG4 Fc 域，其包含胺基酸取代 L235E 及 S228P 及 P329G (EU 編號)。此類 IgG4 Fc 域突變體及其 Fcγ 受體結合特性亦描述於 WO 2012/130831 中。
可使用此領域中所公知遺傳或化學方法，透過胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備變異體 Fc 域。遺傳方法可包括編碼 DNA 序列的位點特異性誘變、PCR、基因合成等。可透過例如測序來驗證核苷酸變化是否正確。
與 Fc 受體之結合可易於透過 ELISA 確定，或透過表面電漿共振 (SPR) 使用標準儀器例如 BIAcore 儀器 (GE Healthcare) 進行確定，並且 Fc 受體可透過例如重組表現來獲得。或者，Fc 域或包含 Fc 域的 細胞活化抗體對 Fc 受體的結合親和力可使用已知表現特定 Fc 受體的細胞株進行評估，例如表現 FcγIIIa 受體的人 NK 細胞。
Fc 域或包含 Fc 域之本發明之抗原結合分子的效應功能可藉由技術中已知之方法量測。適用於量測 ADCC 之分析描述於本文中。用以評定所關注之分子的 ADCC 活性的活體外測定的其他實例於下列文獻中描述：美國專利第 5,500,362 號；Hellstrom 等人Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) 及 Hellstrom 等人，Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第 5,821,337 號；Bruggemann 等人，J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)。可替代地，可採用非放射性分析方法 (參見例如：用於流式細胞分析技術的 ACTI™ 非放射性細胞毒性測定 (CellTechnology，Inc. Mountain View，CA)；及 CytoTox 96® 非放射性細胞毒性測定 (Promega，Madison，WI))。用於此等測定的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在例如 Clynes 等人, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998) 中揭示的動物模型中在活體內評估感興趣的分子之 ADCC 活性。
在一些態樣中，減少 Fc 域與補體組分之結合，具體而言減少與 C1q 之結合。因此，在一些態樣中，其中，Fc 域工程改造為具有降低的效應功能，該降低的效應功能包括降低的 CDC。可進行 C1q 結合分析以測定本發明之雙特異性抗體是否能夠結合 C1q 且因此具有 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro 等人，J Immunol Methods 202，163 (1996)；Cragg 等人，Blood 101，1045-1052 (2003)；及 Cragg 和 Glennie，Blood 103，2738-2743 (2004))。
在一個特定態樣中，相較於天然 IgG1 Fc 域，呈現與 Fc 受體的降低的結合親和力及/或降低的效應功能的 Fc 域為人 IgG1 Fc 域，其包含胺基酸取代 L234A、L235A 及視情況選用的 P329G，或為人 IgG4 Fc 域，其包含胺基酸取代 S228P、L235E 及視情況選用的 P329G (根據 Kabat EU 指數編號)。更特定而言，其為包含胺基酸取代 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號) 的人 IgG1 Fc 域。
促進異源性二聚化的 Fc 域修飾
與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體包含不同的抗原結合位點，與 Fc 域之兩個次單元中之一者或另一者融合，因此 Fc 域之兩個次單元可以包含在兩條不同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表現及隨後的二聚化導致兩種多肽具有若干可能的組合。為改善重組生產中本發明之雙特異性抗原結合分子之產率及純度，在本文所描述之抗體之 Fc 域中引入促進期望多肽之締合的修飾將是有利的。
因此，在特定態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，該抗體包含由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域，其中 Fc 域包含促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元之締合的修飾。人 IgG Fc 域之兩個次單元之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用位點在 Fc 域之 CH3 域中。因此，於一個態樣中，該修飾在 Fc 域之 CH3 域中進行。
於具體態樣中，該修飾為所謂的「杵臼 (knob-into-hole)」修飾，其包含 Fc 域的兩個次單元中之一者中的「杵 (knob)」修飾及 Fc 域之兩個次單元之另一者中的「臼 (hole)」。因此，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應功能的一個或多個胺基酸取代，其中根據杵臼方法，Fc 域之第一次單元包含杵且 Fc 域之第二次單元包含臼。在一特定態樣中，Fc 域的第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (EU 編號)，且 Fc 域的第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
「杵臼」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway 等人，Prot Eng 9，617-621 (1996)；及 Carter，J Immunol Meth 248，7-15 (2001)。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起 (「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔 (「臼」)，以使該突起可安置在空腔內，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。透過用較大側鏈 (例如酪胺酸或色胺酸) 替換第一多肽界面上之較小的胺基酸側鏈來構建突起。透過將較大胺基酸側鏈替換為較小的胺基酸側鏈 (例如丙胺酸或蘇胺酸)，在第二多肽之界面中形成與突起具有相同或相近大小的互補空腔。
因此，在一個態樣中，在與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體之 Fc 域的第一次單元之 CH3 域中，胺基酸殘基替換為具有較大側鏈體積的胺基酸殘基，從而在第一次單元之 CH3 域內產生突起，該突起可定位在第二次單元之 CH3 域內的空腔中，且在 Fc 域的第二次單元之 CH3 域中，胺基酸殘基替換為具有較小側鏈體積的胺基酸殘基，從而在第二次單元之 CH3 域內產生空腔，第一次單元之 CH3 域內的突起可定位在該空腔內。可透過改變編碼多肽的核酸 (例如透過針對特定位點之突變或透過胜肽合成) 來製備突起和空腔。於具體態樣中，在 Fc 域的第一次單元之 CH3 域中，位置 366 處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換 (T366W)，且在 Fc 域的第二次單元之 CH3 域中，位置 407 處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換 (Y407V)。於一個態樣中，另外在 Fc 域之第二次單元中，位置 366 處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換 (T366S)，且位置 368 處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換 (L368A)。
於再一態樣中，另外在 Fc 域的第一次單元中，位置 354 處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換 (S354C)，且另外在 Fc 域的第二次單元中，位置 349 處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換 (Y349C)。引入這兩個半胱胺酸殘基導致在 Fc 域的兩個次單元之間形成雙硫鍵結，進一步穩定二聚體 (Carter (2001), J Immunol Methods 248，7-15)。在一特定態樣中，Fc 域的第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (EU 編號)，且 Fc 域的第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
於一替代態樣中，促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元的締合的修飾包括介導靜電轉向作用的修飾，例如 PCT 公開 WO 2009/089004 中所述。通常，此方法涉及用帶電荷的胺基酸殘基取代兩個 Fc 域次單元界面上的一個或多個胺基酸殘基，從而使同源二聚體形成在靜電上不利，但異源二聚化在靜電上有利。
如本文所報告之抗體的重鏈之 C 末端可為以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 末端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一較佳方面，重鏈的 C 端是以 P 結尾的縮短的 C端。在一較佳方面，重鏈的 C 端是以 PG 結尾的縮短的 C 端。於本文所報告之所有態樣中之一個態樣中，包含包括如本文指定的 C 端 CH3 域之重鏈的 CD28 抗原結合分子，其包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，根據 Kabat EU 索引編號)。於本文所報告的所有態樣中之一個態樣中，包含包括如本文指定的 C 端 CH3 域之重鏈的 CD28 抗原結合分子，其包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 Kabat EU 索引編號)。
Fab 域中的修飾
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其特徵在於與 BCMA 及 CD28 單價結合，包含：(a) 能夠與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域，(b) 能夠與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應功能的一個或多個胺基酸取代，其中能夠與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 片段，且在該 Fab 片段中，可變域 VH 及 VL 或恆定域 CH1 及 CL 係根據 Crossmab 技術互換。
在另一態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其特徵在於與 BCMA 及 CD28 單價結合，包含：(a) 能夠與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域，(b) 能夠與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合之第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應功能的一個或多個胺基酸取代，其中能夠與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域為 Fab 片段，且在該 Fab 片段中，可變域 VH 及 VL 或恆定域 CH1 及 CL 係根據 Crossmab 技術互換。
在一個結合臂 (交叉 MabVH-VL 或 交叉 MabCH-CL) 中具有域置換/交換的多特異性抗體在 WO2009/080252 及 Schaefer, W. 等人，PNAS, 108 (2011) 11187-1191 中有詳細描述。它們明顯減少了由針對第一種抗原的輕鏈與針對第二種抗原的錯誤重鏈的錯配所引起的副產物 (與沒有這種域互換的方法相比)。
在一個態樣中，本發明涉及一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，該抗體包含 (a) 能夠與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域，(b) 能夠與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應功能的一個或多個胺基酸取代，其中在能夠與 CD28 特異性結合之 Fab 片段中，可變域 VL 及 VH 係彼此替換，使得 VH 域為輕鏈的一部分，且 VL 域為重鏈的一部分。在另一態樣中，本發明涉及一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，該抗體包含 (a) 能夠與 BCMA 特異性結合之第一抗原結合域，(b) 能夠與 CD28 特異性結合之第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應功能的一個或多個胺基酸取代，其中在能夠與 BCMA 特異性結合之 Fab 片段中，可變域 VL 及 VH 係彼此替換，使得 VH 域為輕鏈的一部分，且 VL 域為重鏈的一部分。
在另一態樣中且為了進一步改善正確配對，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體 (特徵在於與 CD28 單價結合) 包含：(a) 能夠與 BCMA 特異性結合的第一抗原結合域，(b) 能夠與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應功能的一個或多個胺基酸取代，該 Fc 域可包含不同帶電的胺基酸取代 (所謂的「帶電殘基」)。這些修飾被導入交叉或非交叉的 CH1 和 CL 域中。在特定態樣中，本發明涉及一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中在 CL 域中之一者中，位置 123 處之胺基酸 (EU 編號) 業經精胺酸 (R) 替換且位置 124 處之胺基酸 (EU 編號) 業經離胺酸 (K) 取代，且其中在 CH1 域中之一者中，位置 147 處之胺基酸 (EU 編號) 及位置 213 之胺基酸 (EU 編號) 業經麩胺酸 (E) 取代。在一個特定態樣中，在能夠與 CD28 特異性結合之 Fab 片段的 CL 域中，位置 123 (EU 編號) 處的胺基酸業經精胺酸 (R) 替換且位置 124 (EU 編號) 處的胺基酸業經離胺酸 (K) 取代，且在能夠與 CD28 特異性結合之 Fab 片段的 CH1 域中，位置 147 (EU 編號) 及位置 213 (EU 編號) 處的胺基酸業經麩胺酸 (E) 取代。
多核苷酸
本發明進一步提供編碼如本文所描述的 BCMA 抗體或與 BCMA 及 CD28 特異性結合的抗體之經分離之多核苷酸。編碼 BCMA 抗體或與 BCMA 及 CD28 特異性結合的抗體之一種或多種經分離之多核苷酸可表現為編碼整個抗原結合分子之單一多核苷酸或表現為共表現之多種 (例如兩種或多於種) 多核苷酸。由共表現之多核苷酸所編碼的多肽可透過例如雙硫鍵或其他方式締合，以形成功能性抗原結合分子。例如，免疫球蛋白的輕鏈部分可由來自免疫球蛋白之重鏈部分的單獨多核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合以形成免疫球蛋白。在一些態樣中，經分離之多核苷酸編碼如本文所描述的與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體。在其他態樣中，經分離之多核苷酸編碼包含在如本文所描述的與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體中的多肽。在某些態樣中，多核苷酸或核酸為 DNA。在其他態樣中，本發明之多核苷酸為 RNA，例如，呈信使 RNA (mRNA) 的形式。本發明之 RNA 可以為單股或雙股 RNA。
重組方法
如本文所描述的 BCMA 抗體或與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體可以例如藉由固態肽合成 (例如 Merrifield 固相合成) 或重組生產來獲得。關於重組生產，分離編碼與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體或其多肽片段的一種或多種多核苷酸 (例如如上文所描述)，並將其插入一種或多種載體中以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等多核苷酸可易於使用習知方法進行分離和定序。在一個態樣中，提供包含本文所描述之多核苷酸中的一種或多種的載體，較佳地表現載體。可使用熟習此項技術者熟知的方法構築表現載體，該表現載體含有抗體 (片段) 以及適當的轉錄/轉譯控制信號。這些方法包括活體外重組 DNA 技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如以下所述之技術：Maniatis 等人, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1989)；及 Ausubel 等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.(1989)。表現載體可以為質體、病毒的一部分，也可以為核酸片段。表現載體包括表現匣，其中的編碼抗體或其多肽片段之多核苷酸 (亦即編碼區) 與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件以可操作締合之方式選殖。如本文所用的「編碼區」，為由翻譯成胺基酸的密碼子組成的核酸的一部分。儘管 「終止密碼子」 (TAG、TGA 或 TAA) 不翻譯成胺基酸，但可以將其視為編碼區的一部分 (如果存在)，但是任何側翼序列 (例如啟動子、核醣體結合位點、轉錄終止子、內含子、5’ 和 3’ 非翻譯區等) 不屬於編碼區的一部分。兩個或更多個編碼區可存在於單個多核苷酸構建體中，例如，存在於單個載體上，或存在於單獨的多核苷酸構建體中，例如，存在於單獨的 (不同的) 載體上。此外，任何載體可包含單個編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明之載體可編碼一個或多個多肽，該多肽經由蛋白水解後轉譯或共轉譯分離成最終蛋白。此外，本發明之載體、多核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，可以與編碼本發明之抗體或其多肽片段的多核苷酸或其變異體或衍生物融合或不融合。異源編碼區包括但不限於專門的元件或模體 (諸如分泌訊息肽) 或異源性功能域。可操作的締合是指基因產物的編碼區 (例如，多肽) 與一個或多個調控序列締合，從而使基因產物的表現處於調控序列的影響或控制之下。如果啟動子功能的誘導導致編碼所需基因產物的 mRNA 轉錄，並且兩個 DNA 片段之間的連接子性質不干擾表現調控序列指導基因產物表現的能力，也不干擾 DNA 模板被轉錄的能力，則兩個 DNA 片段 (例如多肽編碼區以及與之相締合的啟動子) 「可操縱地締合」。因此，如果啟動子能夠影響核酸的轉錄，則該啟動子區將與編碼多肽的核酸可操縱地締合。啟動子可以為細胞特異性啟動子，其僅指導預定細胞中 DNA 的大量轉錄。除啟動子外，其他轉錄控制元件，例如增強子、操縱子、抑制子和轉錄終止信號，可與多核苷酸可操縱地締合以指導細胞特異性轉錄。
本文公開了合適的啟動子及其他轉錄控制區。各種轉錄控制區為本領域的技術人員所公知的。此等區域包括 (但不限於) 在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，例如 (但不限於) 啟動子及增強子區段，其來自巨細胞病毒 (例如即刻早期啟動子，連同內含子 A)、猿猴病毒 40 (例如早期啟動子) 及反轉錄病毒 (例如勞斯肉瘤病毒 (Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因 (例如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔 â-血球蛋白) 之區域，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及誘導性啟動子 (例如啟動子誘導性四環素 (tetracyclins))。類似地，各種轉譯控制元件為本領域的普通技術人員所公知的。其中包括但不限於核醣體結合位點、翻譯起始和終止密碼子以及來源於病毒體系的元件 (特定而言內部核醣體進入位點或 IRES，也稱為 CITE 序列)。表現卡匣還可包含其他特徵，例如複製起點及/或染色體整合元件，例如逆轉錄病毒長末端重複序列 (LTR) 或腺相關病毒 (AAV) 反向末端重複序列 (ITR)。
如本文所描述之多核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌或訊號肽的其他編碼區締合，該分泌或訊號胜肽指導由本發明之多核苷酸編碼的多肽的分泌。例如，若期望分泌抗體或其多肽片段，則可將編碼信號序列之 DNA 放置於編碼如本文所描述之抗體或其多肽片段之核酸的上游。根據訊息假說，哺乳動物細胞所分泌之蛋白質具有訊息肽或分泌前導序列，其在增長的蛋白質鏈透過粗內質網輸出時從成熟蛋白質上裂解下來。本領域的普通技術人員將認識到，脊椎動物細胞所分泌之多肽通常具有與多肽之 N 端融合的信號肽，其從轉譯後的多肽上裂解下來以產生分泌或「成熟」形式的多肽。在某些態樣中，使用天然訊號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈訊號肽或該序列之功能性衍生物，該功能性衍生物保留指導與之可操縱地締合的分泌的能力。可替代地，可使用異源性哺乳動物訊息肽或其功能性衍生物。例如，野生型前導序列可被人組織胞漿素原活化物 (TPA) 或小鼠 β-葡萄醣醛酸苷酶的前導序列取代。編碼可用於促進較晚純化 (例如組胺酸標籤) 或幫助標記如本文所描述之抗體之短蛋白質序列的 DNA 可包括於編碼如本文所描述之抗體或其多肽片段的多核苷酸內或位於其末端處。
在進一步態樣中，提供一種包含如本文所描述之一種或多種多核苷酸的宿主細胞。在某些態樣中，提供一種包含如本文所描述之一種或多種載體的宿主細胞。多核苷酸和載體可分別單獨或組合結合本文中相對於多核苷酸和載體所述的任何特徵。在一個態樣中，宿主細胞包含載體 (例如轉型或經該載體轉染)，該載體包含編碼如本文所描述之抗體 (之一部分) 的多核苷酸。如本文中所使用，術語「宿主細胞」係指任何類型之可經工程改造以產生本發明之融合蛋白質或其片段的細胞系統。適用於複製及支持抗原結合分子之表現的宿主細胞為此項技術中熟知。可在適當情況下用特定的表現載體轉染或轉導此等細胞，並且可生長大量包含載體的細胞以接種大規模發酵劑，獲得足夠量的抗體以用於臨床應用。合適的宿主細胞包括原核微生物 (例如大腸桿菌) 或各種真核細胞 (例如中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)、昆蟲細胞等)。例如，多肽可能在細菌中產生，特定而言在無需醣基化的情況下。在表現後，多肽可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離，並可經過進一步純化。除原核生物以外，真核微生物 (如絲狀真菌或酵母菌) 也為合適的多肽編碼載體的選殖或表現宿主，包括其醣基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人醣基化模式的多肽的產生。參見：Gerngross，Nat Biotech 22，1409-1414 (2004)；及 Li 等人，Nat Biotech 24，210-215 (2006)。
用於表現 (醣基化) 多肽的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物 (無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特定而言用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 細胞。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如，美國專利號 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978 及 6,417,429 (描述在轉基因植物中生產抗體的 PLANTIBODIES TM技術)。脊椎動物細胞亦可用為宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株。可用的哺乳動物宿主細胞株的其他實例為：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham 等人，J Gen Virol 36，59 (1977) 中所述之 293 或 293T 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather，Biol Reprod 23，243-251 (1980) 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather 等人，Annals N.Y.Acad Sci 383，44-68 (1982) 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞系包括中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 dhfr- CHO 細胞 (Urlaub 等人, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，例如 YO、NS0、P3X63 和 Sp2/0。有關某些適用於蛋白質生產的哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如：Yazaki 及 Wu，Methods in Molecular Biology，第 248 卷 (B.K.C.Lo 主編，Humana Press，Totowa, NJ)，第 255-268 頁 (2003)。宿主細胞包括培養的細胞，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞和植物細胞等，還包括轉基因動物、轉基因植物或培養的植物或動物組織內的細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，較佳的是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞、人胚腎 (HEK) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。標準技術為此領域中所公知，可在這些系統中表現外源基因。表現包含免疫球蛋白之重鏈或輕鏈之多肽的細胞可經工程改造以亦表現免疫球蛋白鏈中之另一者，使得所表現產物為具有重鏈及輕鏈的免疫球蛋白。
在一個態樣中，提供一種生產與 BCMA 及 CD28 特異性結合的抗體或其多肽片段之方法，其中該方法包含在適用於表現抗體或其多肽片段之條件下培養包含多核苷酸之宿主細胞，該等多核苷酸編碼如本文中提供之抗體或其多肽片段，及自宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 回收如本文所描述之抗體或其多肽片段。
在某些態樣中，能夠與形成抗體的一部分的 BCMA (例如，Fab 片段) 特異性結合之抗原結合域至少包含能夠與抗原結合的免疫球蛋白可變區。可變區可形成並源自天然或非天然存在的抗體及其片段的一部分。用於生產多株抗體和單株抗體的方法為此技術領域中所公知 (參見例如 Harlow 和 Lane，"Antibodies, a laboratory manual"，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。非天然存在的抗體可使用固相肽合成來構建，可重組產生 (例如，如美國專利號 4,186,567 中所述)，或者可例如藉由篩選包含可變重鏈及可變輕鏈的組合文庫來獲得 (參見例如授予 McCafferty 的美國專利號5,969,108)。
任何動物種類的免疫球蛋白均可用於本文所描述之方法。可用的非限制性免疫球蛋白可為鼠、長類動物或人來源。若抗體意欲用於人用途，則可使用其中免疫球蛋白之恆定區來自人之免疫球蛋白之嵌合形式。亦可根據此項技術中熟知之方法製備免疫球蛋白之人源化或完全人類形式 (參見例如 Winter 之美國專利號 5,565,332)。人源化可以透過多種方法實現，這些方法包括但不限於：(a) 將非人類 (例如供體抗體) CDR 移植到人 (例如受體抗體) 骨架和恆定區上，其中保留或不保留關鍵骨架殘基 (例如，對於保持良好的抗原結合親和性或抗體功能很重要的那些)，(b) 僅將非人類特異性決定區 (SDR 或 a-CDR；對抗體-抗原相互作用至關重要的殘基) 移植到人骨架和恆定區，或 (c) 移植整個非人類可變域，但透過替換錶面殘基將其「隱藏」 (cloaking) 在仿人區段中。人源化抗體及其製造方法綜述於例如 Almagro 及 Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008) 中，且進一步揭示於例如以下各者中：Riechmann 等人, Nature 332, 323-329 (1988)；Queen 等人, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；美國專利號 5,821,337、7,527,791、6,982,321 及 7,087,409；Jones 等人, Nature 321, 522-525 (1986)；Morrison 等人, Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)；Morrison 及 Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)；Verhoeyen 等人, Science 239, 1534-1536 (1988)；Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)；Kashmiri 等人, Methods 36, 25-34 (2005) (描述 SDR (a-CDR) 移植)；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (描述「表面再修飾」)；Dall'Acqua 等人, Methods 36, 43-60 (2005) (描述「FR 混排」)；以及 Osbourn 等人, Methods 36, 61-68 (2005) 和 Klimka 等人, Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (描述 FR 混排之「導向選擇」方法)。根據本發明之特定免疫球蛋白為人免疫球蛋白。可使用本領域已知之各種技術生產人抗體及人可變區。人抗體一般性描述於：van Dijk 和 van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5，368-74 (2001)；及 Lonberg，Curr Opin Immunol 20，450-459 (2008)。人類可變區可形成藉由融合瘤方法製得之人類單株抗體的一部分且可源自藉由融合瘤方法製得之人類單株抗體 (參見例如 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。人類抗體及人類可變區亦可藉由如下製備：向經修飾之轉殖基因動物投予免疫原，從而回應於抗原挑戰而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體 (參見例如 Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005))。人類抗體及人類可變區亦可藉由分隔選自人類衍生之噬菌體呈現文庫的Fv純系可變區序列來產生(參見例如 Hoogenboom 等人, Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien 等人編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及 McCafferty等人, Nature 348, 552-554; Clackson 等人, Nature 352, 624-628 (1991))。噬菌體通常將抗體片段展示為單鏈 Fv (scFv) 片段或 Fab 片段。
在某些態樣中，包含在本文所描述之抗體中的抗原結合域係根據例如揭示於以下中之方法經工程化以具有增強之結合親和力：PCT 公佈 WO 2012/020006 (參見與親和力成熟相關的實例) 或美國專利申請公開號 2004/0132066。本發明之抗體結合於特異性抗原決定位之能力可透過酶聯結免疫吸附分析法 (ELISA) 或熟習此項技術者熟悉的其他技術 (例如表面電漿子共振技術) (Liljeblad 等人，Glyco J 17, 323-329 (2000)) 及傳統結合分析 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 測量。可使用競爭分析鑑別與參考抗體競爭結合於特定抗原之抗原結合分子。在某些態樣中，此類競爭抗原結合分子結合於與由參考抗原結合分子所結合相同的表位 (例如直鏈或構形表位)。抗原結合分子所結合之表位之定位的詳細例示性方法提供於 Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」, Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) 中。在例示性競爭分析中，在包含結合於抗原之第一標記抗原結合分子及測試與第一抗原結合分子競爭結合於抗原之能力的第二未標記抗原結合分子之溶液中培育固定抗原。第二抗原結合分子可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗原結合分子但不包含第二未標記抗原結合分子之溶液中培育固定抗原。在允許第一抗體與抗原結合之條件下培育後，移除過量的未結合抗體，且測量與固定抗原締合的標記物之量。若與對照樣品相比，測試樣品中與固定抗原相關之標記量實質上降低，則表明第二抗原結合分子與第一抗原結合分子競爭結合於抗原。參見 Harlow 及 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual 第 14 章 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。
按照本文所述之方法製備的雙特異性抗體可透過本領域中已知的技術進行純化，諸如高效能液相層析法、離子交換層析法、凝膠電泳、親和力層析法、粒徑篩析層析法等。用於純化特定蛋白質之實際條件將部分取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且對本領域的技術人員而言為顯而易見的。關於親和層析純化，可使用與抗原結合分子結合的抗體、配位體、受體或抗原。例如，關於本發明之抗原結合分子之親和層析純化，可使用具有蛋白質 A 或蛋白質 G 之基質。可使用序列蛋白質 A 或 G 親和層析及尺寸排阻層析來分離實質上如實例中所描述之抗原結合分子。抗體或其片段的純度可藉由多種熟知的分析方法 (包括凝膠電泳法、高壓液相層析法等) 中的任一種進行判定。例如，顯示如實例中所描述來表現之雙特異性抗體為完整的且經適當組裝，如藉由還原及非還原性 SDS-PAGE 證明。
測定
可藉由此項技術中已知之各種測定對本文中提供之 BCMA 抗體或與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體針對其物理/化學性質及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
1. 親和力測定
可使用標準測試設備 (例如蛋白質儀器 (Bio-rad)) 及例如可藉由重組表現獲得之受體或標靶蛋白質，根據實例中所闡述之方法，藉由表面電漿子共振 (SPR) 判定本文中所提供之抗原結合分子對相對目標的親和力。亦可使用標準測試設備 (例如蛋白質儀器 (Bio-rad)) 及例如可藉由重組表現獲得之受體或標靶蛋白質，藉由表面電漿子共振 (SPR) 測定抗原結合分子對標靶細胞抗原的親和力。根據一方面，在 25℃ 下使用 Proteon ® 機器 (Bio-Rad)，藉由表面電漿子共振測量 K D。
2. 結合測定及其他測定
本文中提供之抗體或雙特異性抗體與表現對應受體之細胞的結合可使用表現特定受體或標靶抗原之細胞株藉由例如流式細胞分析技術 (FACS) 來評估。在一個態樣中，在結合測定中使用表現人 CD28 的 CHO 細胞 (親代細胞系 CHO-k1 ATCC #CCL-61，經修飾以穩定過表現人 CD28)。
在進一步態樣中，癌細胞株表現 BCMA 係用於證明雙特異性抗原結合分子與靶細胞抗原之結合。
3. 活性測定
在一個態樣中，提供鑑定與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體的生物活性之測定。生物活性可包括，例如用如實例 4 所描述之方法測量的 T 細胞增生及細胞激素分泌。亦提供在 活體內及/或 活體外具有這種生物活性的抗原結合分子。
醫藥組成物、調配物及投予途徑
在進一步態樣中，本發明提供包含本文所提供之任意與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體的醫藥組成物，其例如用於以下任何治療方法。在一個態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體以及至少一種附加治療劑 (例如，如下文所述)。
如本文所揭示之醫藥組成物包含治療有效量之一種或多種溶解或分散於醫藥上可接受之賦形劑中的抗原結合分子。短語「醫藥上或藥理學上可接受」係指在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒的分子實體和組成物，即給予動物 (例如人) 時不產生不利的、過敏或其他不良反應 (在適當情況下)。根據本揭露，熟習此項技術者將認識到含有至少一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體以及視情況存在之附加活性成分的醫藥組成物之製備，如由 Remington 的 Pharmaceutical Sciences，第 18 版Mack Printing Company, 1990 所例示，該文獻以引用方式併入本文中。特定而言，組成物為凍乾調配物或水性溶液。如本文中所使用，「醫藥上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、緩衝液、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑 (例如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、鹽、穩定劑及其組合，如一般熟習此項技術者已知。
腸胃外組成物包括那些設計用於注射投予的組成物，例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹腔內注射。對於注射，可在水溶液中 (較佳地在生理相容性緩衝液中，諸如 Hanks 溶液、Ringer 溶液或生理鹽水緩衝液) 配製抗體或雙特異性抗體。該溶液可包含調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。替代地，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體可呈粉末形式，以在使用前利用合適載劑 (例如無菌無熱原水) 復原。藉由將所需量之本發明之融合蛋白質併入視需要具有多種下文列舉之其他成分之適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。無菌性可易於例如透過無菌濾膜過濾來實現。通常，藉由將各種滅菌後的活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌載劑中來製備分散液。對於用於製備無菌注射液、混懸劑或乳劑的無菌粉末，優選的製備方法是真空乾燥或冷凍乾燥技術，該技術可從先前過濾後的無菌液體介質中得到活性成分與任何其他所需成分的粉末。如有必要，應適當緩衝液體介質，並且在注射足夠的鹽水或葡萄糖之前先使液體稀釋劑等滲。組成物必須在製造和儲存條件下保持穩定，並且必須能夠抵抗諸如細菌和真菌等微生物的污染作用。應當理解，內毒素污染應最小限度地保持在安全濃度，例如，小於 0.5 ng/mg 蛋白質。適合的醫藥上可接受之賦形劑包括，但不限於：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約 10 個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸液可包含提高混懸劑黏度的化合物，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、右旋葡萄聚糖等。視情況，懸液還可包含合適的穩定劑或提高化合物溶解度的試劑，以製備高濃度溶液。另外，可將活性化合物的懸液製備為合適的油性注射懸液。合適的親脂性溶劑或載劑包括脂肪油 (例如芝麻油) 或合成脂肪酸酯 (例如油酸乙酯或甘油三酯) 或脂質體。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。此等技術揭示於 Remington's Pharmaceutical Sciences (第 18 版,Mack Publishing Company, 1990)。可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的適宜的實例包括含有多肽的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式，例如膜或微囊。在特定實施例中，可以透過在組成物中使用延遲吸收的物質 (例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合) 來產生可注射組成物的延長吸收。本文中之例示性醫藥上可接受之賦形劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白 (sHASEGP)，例如人可溶性 PH-20 玻尿酸酶醣蛋白，諸如 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及使用方法 (包括 rHuPH20) 描述於美國專利公開號 2005/0260186 和 2006/0104968 中。在一個態樣中，sHASEGP 與一種或多種額外的糖胺聚醣酶諸如軟骨素酶結合在一起。例示性凍乾抗體調配物如美國第 6,267,958 號專利所述。水溶性抗體調配物包括美國專利號 6,171,586 和 WO2006/044908 中所述的那些，後者之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。除先前描述的組成物外，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體亦可以配製為儲存製劑。此等長效製劑可以透過植入 (例如皮下或肌內) 或透過肌內注射投予。因此，例如，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體可利用合適聚合物質或疏水物質 (例如作為可用油中的乳液) 或離子交換樹脂配製，或配製為微溶的衍生物，例如配製為微溶的鹽。
包含與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體的醫藥組成物可以藉由習用的混合、溶解、乳化、包封、包載或凍幹方法來製造。可使用一種或多種有助於將蛋白質加工成可藥用製劑的生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑以習用方式配製藥學組成物。適宜的製劑視所選的給藥途徑而定。與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體可以游離酸或游離鹼、中性或鹽形式配製成組成物。藥學上可接受之鹽為基本上保持游離酸或鹼的生物活性的鹽類。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組成物之游離胺基形成的鹽，或與無機酸 (例如鹽酸或磷酸) 或有機酸 (例如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸) 形成的鹽。與游離羧基形成的鹽類還可以衍生自：無機鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因。藥用鹽趨向於比對應的游離鹼形式更易溶於水性溶劑和其他質子性溶劑。本文之組成物亦可含有一種以上為治療特定適應症所需之活性成分，較佳為具有互補活性不會對彼此產生不利影響之活性成分。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。用於活體內投予的調配物通常是無菌的。無菌性可易於例如透過無菌濾膜過濾來實現。
治療方法及組成物
本文所提供之任意與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體可以單獨或組合地使用於治療方法中。
在一個態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用為藥物。在進一步態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於治療癌症。在一個特定態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於治療血液學惡性腫瘤。術語「血液學惡性腫瘤」包括選自由以下所組成之群組的疾病：多發性骨髓瘤 (MM)、慢性淋巴球性白血病、急性 B 淋巴母細胞性白血病、非何杰金氏淋巴瘤 (NHL) 及何杰金氏淋巴瘤，以及急性骨髓性白血病及急性淋巴球性白血病。在一個特定態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於治療多發性骨髓瘤 (MM)。
在某些態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於治療方法中。在某些態樣中，本文提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於治療患有癌症之個體的方法中，該方法包含向個體投予有效量之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體。於一個此態樣中，該方法進一步包含對該個體投予有效量的至少一種另外的治療劑。
在一個態樣中，如本文所描述之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體係使用於抑制表現 BCMA 的癌細胞之生長。
在某些態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於治療方法中。在某些態樣中，本文提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於治療患有癌症之個體的方法中，該方法包含向個體投予有效量之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體。在另一態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於治療患有表現 BCMA 的癌症，特定而言選自由多發性骨髓瘤 (MM)、慢性淋巴球性白血病、急性 B 淋巴母細胞性白血病、非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、何杰金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病及急性淋巴母細胞性白血病所組成之群組的血液學惡性腫瘤的個體的方法中，該方法包含向個體投予有效量之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體。於一個此態樣中，該方法進一步包含對該個體投予有效量的至少一種另外的治療劑。
在進一步態樣中，本文提供如本文所描述之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體在製造或製備藥物中的用途。在一個實施例中，該藥物係用於治療癌症，特定而言 BCMA 表現癌。在進一步態樣中，該藥物用於治療癌症的方法中，該方法包含向患有癌症的個體投予有效量之藥物。在一個此類態樣中，該方法進一步包含向個體投予有效量之至少一種另外的治療劑，例如，如下文所述。在另一態樣中，該藥物係用於治療 BCMA 表現癌。在進一步態樣中，該藥物係用於治療癌症，特定而言 BCMA 表現癌的方法，該方法包含向患有癌症的個體投予有效量之藥物。在進一步態樣中，本文提供一種治療癌症，特定而言 BCMA 表現癌之方法。在一個態樣中，該方法包含向患有癌症的個體投予有效量之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體。在一個此類樣態中，如下所述，該方法進一步包含向個體投予有效量之至少一種另外的治療劑。根據上述態樣中任一者之「個體」可為人類。
在進一步態樣中，本文提供包含如本文所報道之任意與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體的醫藥調配物，其例如使用於以上任何治療方法。在一個態樣中，醫藥調配物包含如本文所報導之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體以及醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥調配物包含如本文所報導之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體以及至少一種附加治療劑。
如本文所報導之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體可單獨使用或與其他藥劑組合使用於療法。例如，如本文所報導之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體可與至少一種附加治療劑共同投予。因此，提供如本文所描述之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於癌症免疫療法。在某些態樣中，提供一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於癌症免疫療法的方法。根據上述態樣中任一者之「個體」較佳地為人類。
上述此類組合療法包括組合投予 (其中兩種或更多種治療劑包含在相同或單獨的調配物中) 和分別投予，在此情況下，如本文所報導的抗體可在投予另外的一種或多種治療劑之前、同時及/或隨後投予。在一個態樣中，投於與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體及投於附加治療劑彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、二天、三天、四天、五天、或六天內。
可藉由任何合適的方式投予如本文所報導之抗原結合分子 (和任何另外的治療劑)，包括腸胃外、肺內和鼻內，且如果需要局部治療，可在病灶內投予。腸胃道外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。給藥可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫投予還是長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予及脈衝輸注。
如本文所描述之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體將按照與良好醫學實踐一致的方式進行調配、給藥及投予。在這種情況下，所慮及之因素包括待治療之特定病症、待治療之特定哺乳動物、個別患者的臨床病症、病症之原因、遞送藥劑的部位、投予方法、投予日程及醫療從業者已知的其他因素。與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體並非必須、但可以視情況與一種或多種目前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此等其他治療劑的有效量取決於存在於調製劑中存在的抗體量、病症或治療的類型以及上文討論的其他因素。此等藥劑通常以與本文中所述者相同的劑量及投予途徑、或本文中所述劑量的約 1% 至 99%、或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量及藉由任意途徑使用。
為了預防或治療疾病，如本文所描述之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體 (當單獨使用或與一種或多種額外治療劑組合使用時) 的適當劑量將取決於待治療的疾病類型、抗體類型、疾病嚴重程度和病程、投予抗體是用於預防還是治療目的、先前的治療、患者的臨床病史及對抗體的反應，以及主治醫生的判斷。在一次或一系列的治療中合適地對患者投予與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體。根據疾病的類型及嚴重程度不同，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.5 mg/kg 至 10 mg/kg) 的雙特異性促效的 CD28 抗原結合分子可以是用於投予患者的初始候選劑量，例如藉由一次或多次分開投予，或藉由連續輸注。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複給藥，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。抗體的一種例示性劑量將在從 0.05 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。因此，可以對患者施用約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任意組合)。此等劑量可以間歇施用，例如每週或每三週施用 (例如，使得患者接受約 2 種至約 20 種或例如約 6 種劑量的抗體)。可投予初始較高的負載劑量，隨後投予一個或多個較低劑量。然而，可以使用其他劑量方案。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。
其他藥劑及治療
如前所描述，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體可在治療中與一種或多種其他藥劑組合投予。例如，如本文所描述之抗原結合分子可與至少一種附加治療劑共同投予。術語「治療劑」涵蓋可投與用於治療需要此類治療之個體中之症狀或疾病的任何藥劑。此等額外治療劑可包含適合於所治療的特定適應症的任何活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。在某些態樣中，該額外的治療劑為另一抗癌劑，例如微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、DNA 嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡啟動劑或抗血管生成劑。在某些方面，該額外的治療劑是免疫調節劑、細胞抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑或細胞抑制劑、細胞凋亡活化劑或增加細胞對凋亡誘導劑靈敏度的藥劑。
因此，提供如本文所描述之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體或包含它們的醫藥組成物，其使用於治療癌症，其中該雙特異性抗體係與化學治療劑、放射線及/或使用於癌症免疫療法的其他藥劑組合投予。
此類其他藥劑適宜地以對預期目的有效的量組合存在。此類其他藥劑之有效量視所使用之融合蛋白質之量、病症或治療之類型及如上文所述之其他因素而定。本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體通常以相同劑量及藉由如本文中所描述之投藥途徑使用，或本文中所描述之劑量之約1%至99%，或以任何劑量及藉由憑經驗/臨床上測定合適的任何途徑。上述此類組合療法包括組合投予 (其中兩種或更多種治療劑包含在相同或分開的組成物中) 和分開投予，在此情況下，投予本發明的雙特異性抗原結合分子或抗體可在投予額外的治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行。
在進一步態樣中，提供如本文所描述之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其使用於治療癌症，特定而言表現 BCMA 的癌症，其中該雙特異性抗原結合分子係與另一免疫調節劑組合投予。術語「免疫調節劑」是指包括影響免疫系統的單株抗體的任何物質。本發明的分子可被認為是免疫調節劑。免疫調節劑可用作治療癌症的抗腫瘤劑。在一個態樣中，免疫調節劑包括，但不限於抗 CTLA4 抗體 (例如伊匹木單抗 (ipilimumab))、抗 PD1 抗體 (例如納武利尤單抗 (nivolumab) 或帕博利珠單抗)、PD-L1 抗體 (例如阿替利珠單抗 (atezolizumab)、阿維魯單抗 (avelumab) 或度伐魯單抗 (durvalumab))、OX-40 抗體、4-1BB 抗體及 GITR 抗體。上述此類組合療法包括組合投予 (其中兩種或更多種治療劑包含在相同或分開的組成物中) 和分開投予，在此情況下，投予雙特異性抗原結合分子可在投予額外的治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行。
與 T 細胞雙特異性抗體組合
在一個態樣中，與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體可與 T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體組合投予。T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體對腫瘤相關抗原，例如 GPRC5D、CD38、FcRH5 或 BCMA 具有特異性。在一個態樣中，T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體為抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體。
在一個態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含能夠與 GPRC5D 特異性結合之至少一種抗原結合域，該至少一種抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HGPRC5D)，其包含 (i) 含有 SEQ ID NO:145 之胺基酸序列的 CDR-H1、(ii) 含有 SEQ ID NO:146 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (iii) 含有 SEQ ID NO:147 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LGPRC5D)，其包含 (iv) 含有 SEQ ID NO:148 之胺基酸序列的 CDR-L1、(v) 含有 SEQ ID NO:149 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (vi) 含有 SEQ ID NO:150 之胺基酸序列的 CDR-L3。在一個態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含能夠與 GPRC5D 特異性結合之至少一種抗原結合域，該至少一種抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HGPRC5D)，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154 及 SEQ ID NO:155；及輕鏈可變區 (V LGPRC5D)，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159 及 SEQ ID NO:160。
在一個態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含能夠與 GPRC5D 特異性結合之至少一種抗原結合域，該至少一種抗原結合域包含：含有與 SEQ ID NO:151 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列的重鏈可變區 (V HGPRC5D) 及含有與 SEQ ID NO:152 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LGPRC5D)。特定而言，能夠與 GPRC5D 特異性結合之抗原結合域包含含有 SEQ ID NO:151 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HGPRC5D)，及含有 SEQ ID NO:152 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LGPRC5D)。
在另一態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含能夠與 GPRC5D 特異性結合之至少一種抗原結合域，該至少一種抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HGPRC5D)，其包含 (i) 含有 SEQ ID NO:161 之胺基酸序列的 CDR-H1、(ii) 含有 SEQ ID NO:162 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (iii) 含有 SEQ ID NO:163 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LGPRC5D)，其包含 (iv) 含有 SEQ ID NO:164 之胺基酸序列的 CDR-L1、(v) 含有 SEQ ID NO:165 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (vi) 含有 SEQ ID NO:166 之胺基酸序列的 CDR-L3。在一個態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含能夠與 GPRC5D 特異性結合之至少一種抗原結合域，該至少一種抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HGPRC5D)，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171 及 SEQ ID NO:172；及輕鏈可變區 (V LGPRC5D)，其包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176 及 SEQ ID NO: 177。在另一態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含與 GPRC5D 特異性結合之至少一種抗原結合域，該至少一種抗原結合域包含 (a) 包含 SEQ ID NO:151 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HGPRC5D) 及包含 SEQ ID NO:152 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LGPRC5D)；或 (b) 包含 SEQ ID NO:155 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HGPRC5D) 及包含 SEQ ID NO:158 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LGPRC5D)；或 (c) 包含 SEQ ID NO:151 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HGPRC5D) 及包含 SEQ ID NO:158 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LGPRC5D)；或 (d) 包含 SEQ ID NO:167 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HGPRC5D) 及包含 SEQ ID NO:175 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LGPRC5D)；或 (e) 包含 SEQ ID NO:169 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HGPRC5D) 及包含 SEQ ID NO:174 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LGPRC5D)。
在一個態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含能夠與 CD3 特異性結合之抗原結合域，該抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 (i) 含有 SEQ ID NO:178 之胺基酸序列的 CDR-H1、(ii) 含有 SEQ ID NO:179 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (iii) 含有 SEQ ID NO:180 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 (iv) 含有 SEQ ID NO:181 之胺基酸序列的 CDR-L1、(v) 含有 SEQ ID NO:182 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (vi) 含有 SEQ ID NO:183 之胺基酸序列的 CDR-L3。在一個態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含能夠與 CD3 特異性結合之抗原結合域，該抗原結合域包含：含有 SEQ ID NO:184 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD3)；以及含有 SEQ ID NO:185 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD3)。
在另一態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含能夠與 CD3 特異性結合之抗原結合域，該抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD3)，其包含 (i) 含有 SEQ ID NO:186 之胺基酸序列的 CDR-H1、(ii) 含有 SEQ ID NO:187 之胺基酸序列的 CDR-H2 及 (iii) 含有 SEQ ID NO:188 之胺基酸序列的 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LCD3)，其包含 (iv) 含有 SEQ ID NO:189 之胺基酸序列的 CDR-L1、(v) 含有 SEQ ID NO:190 之胺基酸序列的 CDR-L2 及 (vi) 含有 SEQ ID NO:191 之胺基酸序列的 CDR-L3。在一個態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含能夠與 CD3 特異性結合之抗原結合域，該抗原結合域包含：含有 SEQ ID NO:192 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD3)；以及含有 SEQ ID NO:193 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD3)。
在一個態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含：能夠與 CD3 特異性結合之抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:184 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD3) 及含有 SEQ ID NO:185 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD3)；以及能夠與 GPRC5D 特異性結合之兩種抗原結合域，其中能夠與 GPRC5D 特異性結合之抗原結合域各自包含含有 SEQ ID NO:151 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HGPRC5D) 及含有 SEQ ID NO:152 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LGPRC5D)。在一個特定態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含：與 SEQ ID NO:137 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:138 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之兩個多肽、與 SEQ ID NO:139 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽以及與 SEQ ID NO:140 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽。在進一步特定態樣中，雙特異性抗體包含 SEQ ID NO: 137 之多肽序列、SEQ ID NO: 138 之兩個多肽序列及 SEQ ID NO: 139 之多肽序列及 SEQ ID NO: 140 之多肽序列 (GPRC5D CD3 TCB)。在一個特定態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體為福林塔米格 (forimtamig)。
在另一態樣中，抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體包含：與 SEQ ID NO:141 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:142 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽、與 SEQ ID NO:143 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽以及與 SEQ ID NO:144 之序列至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之多肽。在一個態樣中，雙特異性抗體包含 SEQ ID NO: 141 之多肽序列及 SEQ ID NO: 142 之多肽序列及 SEQ ID NO: 143 之多肽序列及 SEQ ID NO: 144 之多肽序列 (GPRC5D CD3 1+1 雙特異性抗體)。
在另一態樣中，T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體為抗 BCMA/抗 CD3 雙特異性抗體。在一個態樣中，抗 BCMA/抗 CD3 雙特異性抗體包含：SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列、SEQ ID NO: 199 之兩個胺基酸序列、SEQ ID NO: 200 之胺基酸序列及 SEQ ID NO: 201 之胺基酸序列。在另一態樣中，抗 BCMA/抗 CD3 雙特異性抗體包含：SEQ ID NO: 202 之胺基酸序列、SEQ ID NO: 203 之胺基酸序列、SEQ ID NO: 204 之胺基酸序列及 SEQ ID NO: 205 之胺基酸序列。在又一態樣中，抗 BCMA/抗 CD3 雙特異性抗體包含：SEQ ID NO: 206 之胺基酸序列、SEQ ID NO: 207 之胺基酸序列、SEQ ID NO: 208 之胺基酸序列及 SEQ ID NO: 209 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗 BCMA/抗 CD3 雙特異性抗體係選自由阿努克他單抗、艾爾納單抗及特立妥單抗所組成之群組。
在進一步態樣中，T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體為抗 FcRH5/抗 CD3 雙特異性抗體。抗 FcRH5/抗 CD3 雙特異性抗體係例如描述於 WO 2016/205520 中。
上述此類組合療法包括組合投予 (其中兩種或更多種治療劑包含在相同或分開的調配物中) 及分開投予，在此情況下，治療劑可在投予另外的一種或多種治療劑之前、同時及/或隨後投予。在一個實施例中，投予治療劑及投予額外的治療劑彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、兩天、三天、四天、五天、或六天內。
製成品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或包裝說明書。合適的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。該等容器可以由多種材料例如，玻璃或塑膠形成。容器裝有單獨或與有效治療、預防及/或診斷症狀之另一組成物組合的組成物，且可具有無菌出入孔 (例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組成物中的至少一種活性藥劑為如本文所揭示之與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體。標籤或藥品仿單指示該組成物用於治療所選擇的病狀。此外，該製品可以包含 (a) 其中含有組成物的第一容器，其中該組成物包含與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體；及 (b) 其中包含有組成物的第二容器，其中該組成物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此實施例中的製品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的藥品仿單。替代性地或另外地，製品可進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，諸如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液及葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。 表 B ( 序列 ) ：
SEQ ID NO: 名稱 序列
1 BCMA (E04_VH1a)- CDR-H1 GYTFTNYWMH
2 BCMA (E04_VH1a)- CDR-H2 IIHPNSGSTNYNEKFQG
3 BCMA (E04_VH1a)- CDR-H3 GIYDYPFAY
4 BCMA (E04_VL1f)- CDR-L1 RASESVSIHGTHLMH
5 BCMA (E04_VL1f)- CDR-L2 AASSLQS
6 BCMA (E04_VL1f)- CDR-L3 QQSIEDPYT
7 BCMA (E04_VL1a)- CDR-L2 AASNLES
8 BCMA (E04_VL1c)- CDR-L2 AASNLQS
9 BCMA (E04_VH1a) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPNSGSTNYNEKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYDYPFAYWGQGTLVTVSS
10 BCMA (E04_VH1b) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPNSGSTNYNEKFQGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYDYPFAYWGQGTLVTVSS
11 BCMA (E04_VL1f) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK
12 BCMA (E04_VL1a) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK
13 BCMA (E04_VL1b) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK
14 BCMA (E04_VL1c) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK
15 BCMA (E04_VL1d) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK
16 BCMA (E04_VL1e) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK
17 CD28 (v8) - CDR-H1 SYYIH
18 CD28 (v8) - CDR-H2 SIYPGNVQTNYNEKFKD
19 CD28 (v8) - CDR-H3 SHYGLDFNFDV
20 CD28 (v8) - CDR-L1 HASQNIYVYLN
21 CD28 (v8) - CDR-L2 KASNLHT
22 CD28 (v8) - CDR-L3 QQGQTYPYT
23 CD28 (v8) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSS
24 CD28 (v8) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
25 BCMA (E04_VL1f) VL- CL (P1AG7191) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
26 BCMA (E04_VH1a) VH CH1 (EE)- Fc 臼 PGLALA (P1AG7191) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPNSGSTNYNEKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYDYPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
27 VL (CD28) CH1 - Fc 杵 PGLALA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
28 VH (CD28) –CL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
29 BCMA (54_VH2a)- CDR-H1 GFTFSNAWMD
30 BCMA (54_VH2a)- CDR-H2 QITAKSNNYATYYADSVKG
31 BCMA (54_VH2a)- CDR-H3 DGYH
32 BCMA (54_VH1b)- CDR-H2 QITAKSNNYATYYAAPVKG
33 BCMA (54_VL2a)- CDR-L1 RASEDIRNGLA
34 BCMA (54_VL2a)- CDR-L2 NANSLHT
35 BCMA (54_VL2a)- CDR-L3 EDTSKYPYT
36 BCMA (54_VH2a) - VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVSQITAKSNNYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS
37 BCMA (54_VL2a) - VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
38 BCMA (54_VH1b) - VH EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWIAQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS
39 BCMA (54_VL1a) - VL AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
40 BCMA (54_VL2a) VL- CL (P1AG7207) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
41 BCMA (54_VH2a) VH CH1 (EE)- Fc 臼 PGLALA (P1AG7207) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVSQITAKSNNYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
42 親代 BCMA (E04) VH QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGIIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGIYDYPFAYWGQGTLVTVSS
43 親代 BCMA (E04) VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSETDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPYTFGGGTKLEIK
44 BCMA-54 VH EVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKRLEWIAQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKKEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS
45 BCMA-54 VL AIQMTQSPSSLSASVGDRVTIACRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDEAIYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
46 BCMA CDR-H2 RIKSKTDGGTTDYAAPVKG
47 BCMA CDR-L2 AASSLQS
48 BCMA (54_VH1a) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVGQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS
49 BCMA (54_VH1a_Y292D) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVGQITAKSNNYATDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS
50 BCMA (54_VH1c_huCDR2) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS
51 BCMA (54_VH1a_W197Y) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAYMDWVRQAPGKGLEWVGQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS
52 BCMA (54_VL1a_L2_GL) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
53 BCMA (54_VL2a_L2_GL) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
54 BCMA (54_VL1a_L1_pGL) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
55 BCMA (54_VL1a_N651A) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYAANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
56 BCMA (54_VL1a_N651A_N695S) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
57 BCMA (54_VL1a_H698Q) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
58 BCMA (54_VL1a_T699S) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
59 BCMA (54_VL1a_H698Q_T699S) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK
60 BCMA (54_VH1a) VH-CH1-Fc 杵 PGLALA EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVGQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
61 BCMA (54_VL1a_L1_pGL) VL-Cκ AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
62 Fc 片段 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSP
63 BCMA (54_VH1a_Y292D) VH-CH1-Fc 杵 PGLALA EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVGQITAKSNNYATDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
64 BCMA (54_VL1a) VL-Cκ AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
65 BCMA (54_VL1a_T699S) VL-Cκ AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
66 BCMA (54_VL2a) VL-Cκ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
67 BCMA (54_VH1b) VH-CH1-Fc 杵 PGLALA EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWIAQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
68 BCMA (54_VL1a_N651A) VL-Cκ AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYAANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
69 BCMA (54_VL1a_N651A_N695S) VL-Cκ AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
70 BCMA (54_VH2a) VH-CH1-Fc 杵 PGLALA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVSQITAKSNNYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
71 BCMA (54) 重鏈 (Fc 杵 PGLALA) EVQLVESGGGLVKPGESLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKRLEWIAQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKKEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
72 BCMA (54) 輕鏈 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTIACRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDEAIYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
73 BCMA (E04_VH1a) VH-CH1-Fc 杵 PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPNSGSTNYNEKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYDYPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
74 BCMA (E04_VL1a) VL-Cκ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
75 BCMA (E04_VL1b) VL-Cκ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
76 BCMA (E04_VL1d) VL-Cκ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
77 BCMA (E04_VL1e) VL-Cκ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
78 BCMA (E04_VL1f) VL-Cκ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
79 BCMA (E04_VL1g) VL-Cκ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSIEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
80 BCMA (E04_VL1h) VL-Cκ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSIEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
81 BCMA (E04_VH1b) VH-CH1-Fc 杵 PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPNSGSTNYNEKFQGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYDYPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
82 BCMA (E04) 重鏈 (Fc 杵 PGLALA) QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGIIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGIYDYPFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
83 BCMA (E04) 輕鏈 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPARFSGSGSETDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
84 CD28 (v15) - CDR-H1 SYYIH
85 CD28 (v15) - CDR-H2 SIYPGNVQTNYNEKFKD
86 CD28 (v15) - CDR-H3 SHYGLDWNF
87 CD28 (v15) - CDR-L1 HASQNIYVFLN
88 CD28 (v15) - CDR-L2 KASNLHT
89 CD28 (v15) - CDR-L3 QQGQTYPYT
90 CD28 (v15) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
91 CD28 (v15) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
92 BCMA (E04_VL1a) VL- CL RK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
93 BCMA (54_VH1b) VH CH1 (EE)- Fc 臼 PGLALA (P1AG7282) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWIAQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
94 BCMA (54_VL1a) VL- CL (P1AG7282) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
95 BCMA (PR) VH CH1 (EE) –Fc 臼 PGLALA (P1AF7062) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAITASGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMSLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
96 BCMA (PR) VL-CL (RK) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSAYYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYERWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
97 CD28 v15 VL-CH1 hu IgG1 Fc 杵 PGLALA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
98 CD28 v15 VH-CL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
99 人 BCMA Uniprot 登錄號 Q02223 MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR
100 人 CD28 Uniprot 登錄號 P10747 MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
101 人 κ CL 域 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
102 人 λ CL 域 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
103 IgG CH1 域 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
104 CH1 域連接物 EPKSC
105 鉸鏈全 DKTHTCPXCP with X being S or P
106 鉸鏈中等 HTCPXCP with X being S or P
107 鉸鏈短 CPXCP with X being S or P
108 IgG CH2 域 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
109 IgG CH3 域 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
110 IgG1，高加索人同種異型 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
111 IgG1，非裔美國人同種異型 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
112 IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
113 IgG3 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
114 IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
115 具有突變 L234A、L235A 及 P329G 之 hu IgG1 重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
116 人 FcγRIIIa，Uniprot 登錄號 P08637 MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
117 肽連接子 (G4S) GGGGS
118 肽連接子 (G4S)2 GGGGSGGGGS
119 肽連接子 (SG4)2 SGGGGSGGGG
120 肽連接子 G4(SG4)2 GGGGSGGGGSGGGG
121 肽連接子 GSPGSSSSGS
122 (G4S)3 肽連接子 GGGGSGGGGSGGGGS
123 (G4S)4 肽連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
124 肽連接子 GSGSGSGS
125 肽連接子 GSGSGNGS
126 肽連接子 GGSGSGSG
127 肽連接子 GGSGSG
128 肽連接子 GGSG
129 肽連接子 GGSGNGSG
130 肽連接子 GGNGSGSG
131 肽連接子 GGNGSG
132 人 BCMA 細胞外域 MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA
133 獼猴 BCMA (石蟹獼猴) NCBI XP_005591343.1 mlqmarqcsqneyfdsllhdckpcqlrcsstppltcqrycnasmtnsvkgmnailwtclglsliislavfvltfllrkmsseplkdefkntgsgllgmanidlekgrtgdeivlprgleytveectcedciknkpkvdsdhcfplpameegatilvttktndycnslsaalsvteieksisar
134 獼猴 BCMA 細胞外域 mlqmarqcsqneyfdsllhdckpcqlrcsstppltcqrycnasmtnsvkgmna
135 BCMA (E04_VL1g) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK
136 BCMA (E04_VL1h) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK
137 GPRC5D (5E11) hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc 臼 PGLALA (P1AE6625) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
138 GPRC5D (5E11)VL-Cκ 「RK」 (P1AE6625) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
139 GPRC5D (5E11) VH-CH1(EE)-CD3 (Cl22) VL-CH1-Fc (杵，P329G LALA) (P1AE6625) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
140 CD3 (Cl22) VH-CL (P1AE6625) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
141 GPRC5D hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc 臼 PGLALA (P1AE3357) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMNWVRQAPGQGLEWMGLINPYNSDTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARVALRVALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
142 GPRC5D VL-Cκ 「RK」 (P1AE3357) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVATHVGWYQQKPGKAPKRLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISNLQPEDFATYYCQQYNRYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
143 CD3 VL-CH1-Fc (杵，P329G LALA) (P1AE3357) QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
144 CD3 VH-CL (P1AE3357) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
145 GPRC5D (5E11) - CDR-H1 KYAMA
146 GPRC5D (5E11) - CDR-H2 SISTGGVNTYYADSVKG
147 GPRC5D (5E11) - CDR-H3 HTGDYFDY
148 GPRC5D (5E11) - CDR-L1 RASQSVSISGINLMN
149 GPRC5D (5E11) - CDR-L2 HASILAS
150 GPRC5D (5E11) - CDR-L3 QQTRESPLT
151 GPRC5D (5E11) VH1c EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS
152 GPRC5D (5E11) VL2b EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
153 GPRC5D (5E11) VH1a EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS
154 GPRC5D (5E11) VH1b ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS
155 GPRC5D (5E11) VH1d ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS
156 GPRC5D (5E11) VL1a DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
157 GPRC5D (5E11) VL1c DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
158 GPRC5D (5E11) VL2a EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPRLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
159 GPRC5D (5E11) VL3a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGKQPKLLIYHASILASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
160 GPRC5D (5E11) VL3b DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
161 GPRC5D (5F11) - CDR-H1 NYGMA
162 GPRC5D (5F11) - CDR-H2 SISTGGGNTYYRDSVKG
163 GPRC5D (5F11) - CDR-H3 HDRGGLY
164 GPRC5D (5F11) - CDR-L1 RSSKSLLHSNGITYVY
165 GPRC5D (5F11) - CDR-L2 RMSNRAS
166 GPRC5D (5F11) - CDR-L3 GQLLENPYT
167 GPRC5D (5F11) VH1a QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
168 GPRC5D (5F11) VH1b EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
169 GPRC5D (5F11) VH1c QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
170 GPRC5D (5F11) VH1d EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
171 GPRC5D (5F11) VH2b EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
172 GPRC5D (5F11) VH2d EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
173 GPRC5D (5F11) VL1a DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
174 GPRC5D (5F11) VL1b DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGKSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
175 GPRC5D (5F11) VL2a DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPQLLIYRMSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
176 GPRC5D (5F11) VL2b DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQPPKLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
177 GPRC5D (5F11) VL2c EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQAPRLLIYRMSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
178 CD3 (Cl22) CDR-H1 SYAMN
179 CD3 (Cl22) CDR-H2 RIRSKYNNYATYYADSVKG
180 CD3 (Cl22) CDR-H3 HTTFPSSYVSYYGY
181 CD3 (Cl22) CDR-L1 GSSTGAVTTSNYAN
182 CD3 (Cl22) CDR-L2 GTNKRAP
183 CD3 (Cl22) CDR-L3 ALWYSNLWV
184 CD3 (Cl22) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSS
185 CD3 (Cl22) VL QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
186 CD3 (V9) CDR-H1 GYSFTGYTMN
187 CD3 (V9) CDR-H2 LINPYKGVSTYNQKFKD
188 CD3 (V9) CDR-H3 SGYYGDSDWYFDV
189 CD3 (V9) CDR-L1 RASQDIRNYLN
190 CD3 (V9) CDR-L2 YTSRLES
191 CD3 (V9) CDR-L3 QQGNTLPWT
192 CD3 (V9) VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
193 CD3 (V9) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK
194 人 IGHJ 生殖系列 IGHJ4*01 CDR3 後框架 YFDYWGQGTLVTVSS
195 人 IGKJ 生殖系列 IGKJ4*01 CDR3 後框架 LTFGGGTKVEIK
196 人 IGHJ 生殖系列 IGHJ1*01 CDR3 後框架 AEYFQHWGQGTLVTVSS
197 人 IGKJ 生殖系列 IGKJ2*01 CDR3 後框架 YTFGQGTKLEIK
198 阿努克他單抗 hu IgG1_Fc 臼 PGLALA (P1AF0105) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGPGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
199 阿努克他單抗 VL-Cκ TNFRSF17 (P1AF0105) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSDEYLSWYQQKPGQAPRLLIHSASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLAISRLEPEDFAVYYCQQYGYPPDFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
200 阿努克他單抗 hu IgG1_Fc 杵 PGLALA (P1AF0105) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDNAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGPGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVLGWFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
201 阿努克他單抗 VL-Cκ CD3 (P1AF0105) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
202 艾爾納單抗 hu IgG1_Fc 臼 PGLALA (P1AH5054) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGSLPYADIVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
203 艾爾納單抗 VL-Cκ TNFRSF17 (P1AH5054) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQSWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
204 艾爾納單抗 hu IgG1_Fc 杵 PGLALA (P1AH5054) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
205 艾爾納單抗 VL-Cκ CD3 (P1AH5054) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
206 特立妥單抗抗 TNFRSF17 重鏈 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGSYFWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGITYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDGAVAGLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
207 特立妥單抗抗 TNFRSF17 輕鏈 SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQPPGQAPVVVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEAVYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKGDSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
208 特立妥單抗抗 CD3 重鏈 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
209 特立妥單抗抗 CD3 輕鏈 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
210 huBCMA_R27P MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLPCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKISSEPLEDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISARTRTRPLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDKV
211 huBCMA_S30del MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCS_NTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKISSEPLEDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISARTRTRPLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDKV
212 huBCMA_P33S MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTSPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKISSEPLEDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISARTRTRPLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDKV
213 huBCMA_P34del MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTP_LTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKISSEPLEDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISARTRTRPLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDKV
有關人免疫球蛋白輕鍊和重鏈核苷酸序列的一般資訊，請參見：Kabat, E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗體鏈的胺基酸根據 Kabat 的編號系統如上述定義進行編號和引用 (Kabat, E.A., 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。
以下編號的段落 (paras) 描述本發明的方面： 1. 一種與 B 細胞成熟劑 (BCMA) 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有以下的第一抗原結合域： (i) 重鏈可變區 (V HBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 1 (GYTFTNYWMH) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 2 (IIHPNSGSTNYNEKFQG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 3 (GIYDYPFAY) 之 CDR-H3；以及 (ii) 輕鏈可變區 (V LBCMA)，其選自由以下所組成之群組： (a) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 5 (AASSLQS) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3；或 (b) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 7 (AASNLES) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3；或 (c) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 8 (AASNLQS) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3。 2. 如段落 1 之抗體，其中該 V HBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 9 (VH1a) 及 SEQ ID NO: 10 (VH1b)，及/或該 V LBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 11 (VL1f)、SEQ ID NO: 12 (VL1a)、SEQ ID NO: 13 (VL1b)、SEQ ID NO: 14 (VL1c)、SEQ ID NO: 15 (VL1d) 及 SEQ ID NO:16 (VL1e)。 3.一種與 BCMA 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有以下的第一抗原結合域： (a) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA。 4.如段落 1 至 3 中之任一者之抗體，其中該第一抗原結合域為 Fab 分子。 5.如段落 1 至 4 中之任一者之抗體，其包含由第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域。 6.如段落 1 至 5 中之任一者之抗體，其包含與第二抗原特異性結合的第二抗原結合域。 7.如段落 1 至 6 中之任一者之抗體，其中與第二抗原特異性結合的第二抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特定而言可變域 VL 及 VH 係彼此替換。 8.如段落 1 至 7 中之任一者之抗體，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中在恆定域 CL 中，位置 123 的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 係經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 的胺基酸取代以及位置 124 的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代，且其中在恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 係獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代且位置 213 的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 係獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。 9.如段落 5 至 8 中之任一者之抗體，其中該 Fc 域為 IgG、特定而言 IgG1 Fc 域。 10.如段落 5 至 9 中之任一者之抗體，其中該 Fc 域為人 Fc 域。 11.如段落 5 至 10 中之任一者之抗體，其中該 Fc 包含促進 Fc 域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾。 12.如段落 11 之抗體，其中該 Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (EU 編號)，且該 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。 13.如段落 5 至 12 中之任一者之抗體，其中該 Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代。 14.如段落 5 至 13 中之任一者之抗體，其中該 Fc 域屬於人 IgG1 亞類且包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。 15.如段落 6 至 14 中之任一者之抗體，其中該第二抗原為 CD28。 16.如段落 15 之抗體，其中與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 17 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 18 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 19 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 20 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 21 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 22 之 CDR-L3。 17.如段落 15 或 16 之抗體，其中與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD28) 及含有 SEQ ID NO:24 (v8) 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD28)。 18.如段落 1 至 17 中之任一者之抗體，其中該抗體包含：第一抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA；以及第二抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 V HCD28 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 V LCD28。 19.如段落 1 至 18 中之任一者之抗體，其包含含有 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的第一輕鏈、含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的第一重鏈、含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的第二重鏈及含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的第二輕鏈。 20.一種與 B 細胞成熟劑 (BCMA) 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 (A) 第一抗原結合域，其包含 (i) 重鏈可變區 (V HBCMA)，其選自由以下所組成之群組： (a) VH，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 30 (QITAKSNNYATYYADSVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；以及 (b) VH，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 32 (QITAKSNNYATYYAAPVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；以及 (ii) 輕鏈可變區 (V LBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 33 (RASEDIRNGLA) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 34 (NANSLHT) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 35 (EDTSKYPYT) 之 CDR-L3，以及 (B) 第二抗原結合域，其與 CD28 特異性結合。 21.如段落 20 之抗體，其中該 V HBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 36 (VH2a) 及 SEQ ID NO: 38 (VH1b)，及/或該 V LBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 37 (VL2a) 及 SEQ ID NO:39 (VL1a)。 22.一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有以下的第一抗原結合域： (a) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA。 23.如段落 20 至 22 中之任一者之抗體，其中該第一抗原結合域為 Fab 分子。 24.如段落 20 至 23 中之任一者之抗體，其包含由第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域。 25.如段落 20 至 24 中之任一者之抗體，其包含與第二抗原特異性結合的第二抗原結合域。 26.如段落 20 至 25 中之任一者之抗體，其中與第二抗原特異性結合的第二抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特定而言可變域 VL 及 VH 係彼此替換。 27.如段落 20 至 26 中之任一者之抗體，其中第一抗原結合域為 Fab 分子，其中在恆定域 CL 中，位置 123 的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 係經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 的胺基酸取代以及位置 124 的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代，且其中在恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 係獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代且位置 213 的胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 係獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代 (根據 Kabat EU 索引編號)。 28.如段落 20 至 27 中之任一者之抗體，其中該 Fc 域為 IgG、特定而言 IgG1 Fc 域。 29.如段落 24 至 28 中之任一者之抗體，其中該 Fc 域為人 Fc 域。 30.如段落 24 至 29 中之任一者之抗體，其中該 Fc 包含促進 Fc 域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾。 31.如段落 30 之抗體，其中該 Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (EU 編號)，且該 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。 32.如段落 24 至 31 中之任一者之抗體，其中該 Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代。 33.如段落 24 至 32 中之任一者之抗體，其中該 Fc 域屬於人 IgG1 亞類且包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。 34.如段落 20 至 33 中之任一者之抗體，其中與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 17 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 18 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 19 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 20 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 21 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 22 之 CDR-L3。 35.如段落 34 之抗體，其中與 CD28 特異性結合的第二抗原結合域包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD28) 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD28)。 36.如段落 20 至 35 中之任一者之抗體，其中該抗體包含：第一抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA；以及第二抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 V HCD28 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 V LCD28。 37.如段落 20 至 36 中之任一者之抗體，其包含含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的第一輕鏈、含有 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列的第一重鏈、含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的第二重鏈及含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的第二輕鏈。 38.一種或多種經分離之多核苷酸，其編碼如段落 1 至 37 中之任一者之抗體。 39.一種或多種載體，特別是表現載體，其包含如段落 38 之多核苷酸。 40.一種宿主細胞，其包含如段落 38 之多核苷酸或如段落 39 之載體。 41.一種生產與 BCMA 特異性結合的抗體之方法，其包含以下步驟：a) 在適於表現抗體的條件下培養如段落 40 之宿主細胞，及視情況 b) 回收抗體。 42.一種與 BCMA 特異性結合之抗體，其藉由如段落 41 之方法產生。 43.一種醫藥組成物，其包含如段落 1 至 37 或 42 中之任一者之抗體以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。 44.如段落 1 至 37 或 42 中之任一者之抗體或如段落 43 之醫藥組成物，其使用為藥物。 45.如段落 1 至 37 或 42 中之任一者之抗體或如段落 43 之醫藥組成物，其使用於增強 (a) T 細胞活化或 (b) T 細胞效應功能。 46.如段落 1 至 37 或 42 中之任一者之抗體或如段落 43 之醫藥組成物，其使用於治療疾病。 47.如段落 46 所使用之抗體或醫藥組成物，其中該疾病為癌症，特定而言多發性骨髓瘤。 48.如段落 1 至 37 或 42 中之任一者之抗體或如段落 43 之醫藥組成物，其使用於治療癌症，其中該使用係供與化學治療劑、放射療法及/或使用於癌症免疫療法的其他藥劑組合投予。 49.如段落 1 至 37 或 42 中之任一者之抗體或如段落 43 之醫藥組成物，其使用於治療癌症，其中該使用係供與 T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體組合投予。 50.如段落 49 之使用之抗體或醫藥組成物，其中該 T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體為抗 GPRC5D/抗 CD3 抗體。 52.一種如段落 1 至 37 或 42 中之任一者之抗體或如段落 43 之醫藥組成物在製造藥物中之用途，該藥物使用於治療疾病、特定而言用於治療癌症。 53.一種治療個體的疾病、特定而言癌症之方法，其包含向該個體投予有效量之如段落 1 至 37 或 42 之抗體或如段落 43 之醫藥組成物。 54.如段落 53 之方法，其進一步包含與化學治療劑、放射療法及/或使用於癌症免疫療法的其他藥劑組合、特定而言與 T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體組合投予。 *** 實例
下列為本發明之方法及組成物之實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他態樣。
重組 DNA 技術：使用標準方法操作 DNA，如敘述於 Sambrook 等人, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。根據製造商之說明使用分子生物試劑。關於人免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊提供於：Kabat, E.A. 等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH 公開號 91-3242。
DNA 定序：透過雙股測序測定 DNA 序列。
基因合成：在需要時，所需的基因片段使用適當模板藉由 PCR 產生，或藉由自動化基因合成法，在 Geneart AG (Regensburg, Germany) 或 Genscript (New Jersey, USA) 自合成的寡核苷酸及 PCR 產物合成。將位於單個限制內切酶切割位點側翼的基因片段克隆到標準克隆/測序載體中。從轉化的細菌中純化質體 DNA，並透過 UV 光譜確定濃度。藉由 DNA 定序來確認亞選殖基因片段的 DNA 序列。基因片段設計有合適的限制位點，以允許亞選殖到各自的表現載體中。所有構建體均設計有用於前導肽的 5’ 端 DNA 序列編碼，該前導肽靶向蛋白質以在真核細胞中分泌。
IgG 及雙特異性抗體之生產：使用習知選殖技術，將編碼 BCMA 抗體 (以及如果適用，CD28 抗體) 的重鏈可變區及輕鏈可變區的 DNA 序列選殖到哺乳動物表現載體中。本文所描述之抗體係使用振盪燒瓶以 FedBatch 模式生產的。藉由在成分確定的無血清培養基中瞬時轉染 Expi293™ 細胞來進行重組生產。使用 ExpiFectamine™ 293 轉染套組 (Gibco) 進行轉染。在轉染後 7 至 12 天收穫細胞培養上清液。
蛋白質滴度之定量：藉由親和層析使用 POROS A 20 µm 管柱，2.1 x 30 mm (Life Technologies，Carlsbad，CA，USA) 在高效液相層析系統 (Ultimate 3000 HPLC 系統，Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 上判定清液樣品之蛋白質滴度。將上清液負載至用 0.2 M Na 2HPO 4(pH 7.4) 平衡的管柱上，之後用 0.1 M 檸檬酸、0.2 M NaCl (pH 2.5) 溶析。藉由測量 280 nm 處的吸光度來對滴度進行定量，隨後藉由將分析物之溶析峰面積 (曲線下) 與參照標準曲線進行比較來計算蛋白質濃度。
替代地，藉由蛋白質 A – HPLC 在帶有 UV 檢測器的安捷倫 HPLC 系統 (Agilent HPLC System) 進行上清液中含有 Fc 的構建體之定量。將上清液注射到 POROS A 20 µm (Applied Biosystems) 上，以 10 mM Tris、50 mM 甘胺酸、100 mM NaCl、pH 8.0 洗滌，並在 pH 2.0 的相同緩衝液中溶析。藉由測量 280 nm 處的吸光度來對滴度進行定量，隨後藉由將分析物之溶析峰面積 (曲線下) 與參照標準曲線進行比較來計算蛋白質濃度。
IgG 及雙特異性抗體之純化：參照標準方案從細胞培養上清液中純化蛋白質。簡而言之，藉由蛋白 A-親和層析法從細胞培養上清液中純化含 Fc 的蛋白質 (平衡緩衝液：20 mM 檸檬酸鈉、20 mM 磷酸鈉、pH 7.5 或 PBS；溶析緩衝液：20 mM、25 mM 或 50 mM 檸檬酸鈉，pH 3.0)。在 pH 3.0 下完成洗脫，然後立即中和樣品的 pH。蛋白質係藉由離心 (Millipore Amicon® ULTRA-15, #UFC903096) 濃縮，且藉由粒徑篩析層析法在 20 mM 組胺酸，140 mM 氯化鈉，pH 6.0 中將聚集的蛋白質與單體蛋白質分離。
IgG 及雙特異性抗體之分析：通過使用根據 Pace 等人，Protein Science, 1995, 4, 2411-1423 基於胺基酸序列計算的質量消光係數來量測在 280 nm 處的吸收來測定純化蛋白質之濃度。在存在和不存在還原劑的情況下，使用 LabChipGXII 或 LabChip GX Touch (Perkin Elmer)，透過 CE-SDS 來分析蛋白質的純度和分子量。聚集體含量的測定是在 25℃ 下使用在運行緩衝液 (200 mM KH 2PO 4，250 mM KCl pH 6.2，0.02% NaN 3) 中平衡的分析粒徑篩析管柱 (TSKgel G3000 SW XL 或 UP-SW3000，Tosoh Bioscience) 透過 HPLC 層析進行的。對於單體含量從約 70% 至幾乎 100% 不等且 CE-SDS 純度 ＞90% 的所有分子而言，最終質量都很好。綜上所述，所有 IgG 及雙特異性抗體均以高質量生產。
質譜 ：此章節描述具有 VH/VL 交換 (VH/VL 交叉 Mab) 之多特異性抗體之表徵，其中強調其正確組裝。藉由去醣基化完整 交叉 Mab 及去醣基化/纖維蛋白溶酶消化或以其他方式去醣基化/限制性 LysC 消化 交叉 Mab 之電噴霧電離質譜 (ESI-MS) 來分析預期主要結構。在 1 mg/ml 之蛋白質濃度下，VH/VL 交叉 Mab 在磷酸鹽或 Tris 緩衝液中，在 37℃ 下用 N-糖苷酶 F 去醣基化 17 小時。纖維蛋白溶酶或限制性 LysC (Roche) 消化用 100 µg 去醣基化 VH/VL 交叉 Mab 分別在 Tris 緩衝液 pH 8 中，在室溫下進行 120 小時及在 37℃ 下進行 40 分鐘。在質譜分析之前，在 Sephadex G25 管柱 (GE Healthcare) 上經由 HPLC 對樣品進行脫鹽。在配備 TriVersa NanoMate 源 (Advion) 的 maXis 4G UHR-QTOF MS 系統 (Bruker Daltonik) 上經由 ESI-MS 確定總質量。
使用表面電漿子共振 (SPR)(BIACORE) 判定多特異性抗體與各別抗原之結合及結合親和力：使用 BIACORE 儀器 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden) 藉由表面電漿子共振研究所產生之抗體與各別抗原之結合。簡言之，對於親和力測量，山羊抗人 IgG、JIR 109-005-098 抗體經由胺偶合固定在 CM5 晶片上以用於針對各別抗原之抗體之呈現。在 HBS 緩衝液 (HBS-P)(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20，ph 7.4) 中，在 25℃ 下 (或在 37℃ 下) 量測結合。在溶液中以多種濃度添加抗原 (R&D Systems 或內部純化)。藉由 80 秒至 3 分鐘之抗原注射來量測締合；藉由用 HBS 緩衝液洗滌晶片表面 3 - 10 分鐘來量測解離且使用 1:1 朗格繆爾結合模型 (Langmuir binding model) 來評估 KD 值。自樣品曲線減去陰性對照資料 (例如緩衝液曲線) 以用於系統內源性基線偏移之校正及雜訊信號降低。使用各別 Biacore Evaluation 軟體進行感測圖譜之分析及親和力資料之計算。 實例 1 最佳抗 BCMA 抗體之產生及生產 1.1 抗 BCMA 抗體 E04 之人源化變異體之產生 1.1.1 方法
抗 BCMA 抗體 E04 揭示於 WO 2012/163805 中且具有 SEQ ID NO:42 之 VH 域及 SEQ ID NO:43 之 VL 域。如下所述形成其最佳化變異體。為了在人源化期間鑑定合適的人受體框架，使用兩種方法之組合。一方面，藉由查詢人 V 區及 J 區序列的 BLASTp 資料庫中的鼠輸入序列 (裁剪為可變部分)，進行經典方法。選擇人受體框架的選擇標準為序列同源性、相同或相似的 CDR 長度、人種系的估計頻率以及 VH-VL 域介面的某些胺基酸的保守性。在種系鑑定步驟之後，將鼠輸入序列的 CDR 移植到人受體框架區。評估這些初始 CDR 移植物與親代抗體之間每個胺基酸的差異，以評估可能對相應可變區的結構完整性的影響，並在認為適當時引入針對親代序列的「反向突變」。結構評估基於親本抗體和人源化變異體的 Fv 區域同源性模型，這些模型使用內部抗體結構同源性建模方案建立，該方案使用 BIOVIA Discovery Studio Environment 17R2 版實現。在某些人源化變異體中，包括「正向突變」，即，胺基酸交換將在親本結合劑的給定 CDR 位置上發生的原始胺基酸改變為在人受體種系的等效位置上發現的胺基酸。目的在於增加人源化變異體的總體人類特徵 (超出框架區域)，以進一步降低免疫原性風險。
另一方面，使用內部開放的 電腦運行的工具來預測配對的 VH 及 VL 人源化變異體之 VH-VL 域取向 (WO 2016/062734)。將結果與親代結合物的預測的 VH-VL 域取向進行比較，以選擇幾何形狀與原始抗體接近的構架組合。合理的做法為檢測 VH-VL 介面區域中可能的胺基酸交換，這些交換可能導致兩個域的配對發生破壞性變化，進而對結合特性產生不利影響。 1.1.2 受體框架之選擇及其調適
對受體框架的選擇如下 表 1所示： 表 1 ：受體框架
小鼠 (mus musculus) V 區生殖系列 人受體 V 區種系的選擇
VH1ab IGHV1-64*01 IGHV1-46*01
VL1abcdef IGKV3-3*01 IGKV1-39*01
CDR3 後框架區係來自人 IGHJ 種系 IGHJ4*01 (YFDY WGQGTLVTVSS，SEQ ID NO:194) 及人 IGKJ 種系 IGKJ4*01 (LT FGGGTKVEIK，SEQ ID NO:195)。與受體框架相關的部分以下劃線顯示。
基於結構上的考慮，在 E04 人源化變異體的某些位置引入從人受體框架到親代殖株中胺基酸的反向突變。此外，某些位置被確定為正向突變的有前景的候選位置，其中親本結合劑的 CDR 中的胺基酸被人受體種系中發現的胺基酸取代。改變詳述於下 表 2中。 表 2 ：變異體之列表
變異體名稱 突變 與人 V 區種系 (BLASTp) 的同一性
VH1a fK64Q、fS65G 91.8
VH1b fK64Q, fS65G, bR71V, bT73K 89.8
VL1a - 84.8
VL1b bG68E 83.8
VL1c fE55Q 85.9
VL1d fE55Q、bG68E 84.8
VL1e fN53S、fE55Q 86.9
VL1f fN53S, fE55Q, bG68E 85.9
註：反向突變以 b為前綴，反向突變以 f為前綴，例如 bS49A 指位置 49 發生從絲胺酸到丙胺酸的反向突變 (人種系胺基酸到親代抗體胺基酸)。所有殘基索引在 Kabat 編號中給出。 1.1.3 T 細胞表位預測
為了評定人源化序列中潛在 T 細胞表位之出現，採用 NetMHCIIpan 4.0 預測器 (Reynisson B 等人：NetMHCpan-4.1 及 NetMHCIIpan-4.0：improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data, Nucl.Acids Res., 48(W1): W449–W454 (2020))。對以下人 MHC 第 II 型等位基因進行預測：DRB1*01:01、DRB1*03:01、DRB1*04:01、DRB1*07:01、DRB1*08:01、DRB1*09:01、DRB1*11:01、DRB1*13:01 及 DRB1 * 15:01。
強結合及弱結合 15mer 肽的閾值分別設定為百分位排名 1 及 5。不考慮百分位排名高於 5 的結合 15mer 肽。同樣，不考慮 10 個或更多個人 V 區生殖系列中出現的具有 9mer 核心肽的所有結合 15mer 肽。生殖系列序列獲自 IMGT 資料庫 (Giudicelli, V. 等人：IMGT/LIGM-DB, the IMGT® comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences.Nucl.Acids Res., 34(S1):D781-D784 (2006))。由於許多預測的 15mer 結合物共享相同的 9mer 核心肽，下 表 3也詳細介紹了相應序列中存在的獨特 9mer 核心的數目，並預測在 ≤ 5 的百分位範圍內結合。 表 3 ： T 細胞表位
序列 # 強結合 15mer 肽 # 弱結合 15mer 肽 # 總結合 15mer 肽 # 獨特 9mer 肽核心
E04_VH_親代 6 53 59 9
VH1a 0 12 12 5
VH1b 0 17 17 7
E04_VL_親代 10 37 47 8
VL1a 10 29 39 7
VL1b 10 29 39 7
VL1c 11 28 39 7
VL1d 11 28 39 7
VL1e 8 21 29 5
VL1f 8 21 29 5
1.1.4 所得人源化 BCMA 抗體之 VH 及 VL 域
所得人源化 BCMA 抗體之 VH 域可見於下 表 4，且所得人源化 BCMA 抗體之 VL 域列於下 表 5。 表 4 ：人源化 BCMA 抗體之 VH 域之胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
BCMA (E04_VH1a) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPNSGSTNYNEKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYDYPFAYWGQGTLVTVSS 9
BCMA (E04_VH1b) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPNSGSTNYNEKFQGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIYDYPFAYWGQGTLVTVSS 10
表 5 ：人源化 BCMA 抗體之 VL 域之胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
BCMA (E04_VL1a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK 12
BCMA (E04_VL1b) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK 13
BCMA (E04_VL1c) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK 14
BCMA (E04_VL1d) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK 15
BCMA (E04_VL1e) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK 16
BCMA (E04_VL1f) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK 11
BCMA (E04_VL1g) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK 135
BCMA (E04_VL1h) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSIEDPYTFGGGTKVEIK 136
E04 人源化變異體之重鏈及輕鏈可變域的人源化胺基酸序列與具有效應沉默 Fc 域 (P329G；L234A、L235A) 的單臂人 IgG1 骨架/人 CH1-鉸鏈-CH2-CH3 融合以廢除根據 WO 2012/130831 A1 中描述之方法與 Fcγ 受體結合並形成輕鏈。為了正確組裝單臂 IgG1，使用含有效應沉默 Fc 域的人 Fc。將胺基酸序列反向轉譯為 DNA，且合成所得 cDNA (GeneArt 或 Twist Biosciences)，然後選殖到重鏈表現載體中作為與人 IgG1 骨架表現載體的融合蛋白，作為與人 C-κ 的融合蛋白。然後將輕鏈 (LC) 及重鏈 (HC) 質粒共轉染至 HEK293 細胞中，並在 7 天後藉由抗體純化的標準方法從上清液中純化。 1.2 抗 BCMA 抗體 54 之人源化變異體之產生 1.2.1 方法
抗 BCMA 抗體 54 揭示於 WO 2013/072415 中且具有 SEQ ID NO:44 之 VH 域及 SEQ ID NO:45 之 VL 域。BCMA-54 為人源化抗體，與最相似的人 HV 生殖系列 (IGHV3-15*01) 具有 84.8% 之同一性，且與最相似的人 KV 生殖系列 (IGKV1-6*01) 具有 83.2% 之同一性。儘管 BCMA-54 之可變區係基於人類來源之框架區，但這些區中存在不對應於人生殖系列胺基酸的若干個位置。其實例包括位置 VH-16 (Ala)、VH-44 (Arg)、VH-84 (Lys)、VL-22 (Ala)、VL-83 (Glu) 及 VL-95 (Ile)。此外，存在將 CDR 之部分人源化以降低此結合物的免疫原性潛力並減少潛在 T 細胞表位之數目的可能性。
為了實現這種最佳化潛力，藉由查詢人 V 區及 J 區序列的 BLASTp 資料庫中的原始 BCMA-54 序列來鑑定合適的人受體框架。選擇人受體框架的選擇標準為序列同源性、相同或相似的 CDR 長度、人種系的估計頻率以及 VH-VL 域介面的某些胺基酸的保守性。在生殖系列鑑定步驟之後，將 BCMA-54 輸入序列的 CDR 移植到人受體框架區。評估這些初始 CDR 移植物與親本抗體之間每個胺基酸的差異，以評估可能對相應可變區的結構完整性的影響，並在認為適當時引入針對親本序列的「反向突變」。結構評估基於 BCMA-54 及最佳化變異體的 Fv 區域同源性模型，這些模型使用內部抗體結構同源性建模方案建立，該方案使用 BIOVIA Discovery Studio Environment 17R2 版實現。在某些人源化變異體中，包括「正向突變」，即，胺基酸交換將在親本結合劑的給定 CDR 位置上發生的原始胺基酸改變為在人受體種系的等效位置上發現的胺基酸。
使用內部開放的 電腦運行的工具來預測配對的 VH 及 VL 人源化變異體之 VH-VL 域取向 (WO 2016/062734)。將結果與親代結合物的預測的 VH-VL 域取向進行比較，以選擇幾何形狀與原始抗體接近的構架組合。合理的做法為檢測 VH-VL 介面區域中可能的胺基酸交換，這些交換可能導致兩個域的配對發生破壞性變化，進而對結合特性產生不利影響。 1.2.2 受體框架之選擇及其調適
對以下受體框架的選擇如下 表 6所示： 表 6 ：受體框架
BCMA-54 中的 V 區生殖系列 人受體 V 區種系的選擇
VH1ab IGHV3-15*01 IGHV3-15*01
VH2a IGHV3-23*01
VL1a IGKV1-6*01 IGKV1-6*01
VL2a IGKV1-39*01
CDR3 後框架區係來自人 IGHJ 生殖系列 IGHJ1*01 (AEYFQHWGQGTLVTVSS, SEQ ID NO:196) 及人 IGKJ 生殖系列 IGKJ2*01 (YTFGQGTKLEIK, SEQ ID NO:197)。與受體框架相關的部分以下劃線顯示。
基於結構上的考慮，在最佳化變異體的某些位置引入從人受體框架到原始 BCMA-54 序列中胺基酸的反向突變。此外，某些位置被確定為正向突變的有前景的候選位置，其中親代結合物的 CDR 中的胺基酸被人受體生殖系列中發現的胺基酸取代。在基礎變異體 (VH1a、VH1b、VH2a、VL1a 及 VL2a) 之上，定義附加序列變異體，其通常在相應基礎序列之各個位置或者延伸段引入附加正向突變(「生殖系列化」)。一種變異體 (VH1a_W197Y) 旨在改善預測的疏水性表面斑塊，從而潛在地改善 VH 區之生物物理性質。改變詳述於下 表 7中。 表 7 ：變異體之列表
變異體名稱 突變 與人 V 區種系 (BLASTp) 的同一性
VH1a bT94D 89.9
VH1b bV48I, bG49A, bT94D 87.9
VH2a fA61D, fP62S, bA93T, bK94D 87.8
VH1a_Y292D bT94D、fY58D 90.9
VH1c_huCDR2 bT94D 及 CDR-H2 經生殖系列化為 RIKSKTDGGTTDYAAPVKG (SEQ ID NO:46) (IGHV3-15*01) 99.0
VH1a_W197Y bT94D、fW33Y 88.9
VL1a 86.3
VL2a 86.2
VL1a_L2_GL CDR-L2 經生殖系列化為 AASSLQS (SEQ ID NO:47) (IGKV1-6*01) 90.5
VL2a_L2_GL CDR-L2 經生殖系列化為 AASSLQS (SEQ ID NO:47) (IGKV1-39*01) 90.4
VL1a_L1_pGL fG32D、fA34G 88.4
VL1a_N651A fN40A 87.4
VL1a_N651A_N695S fN40A、fN52S 88.4
VL1a_H698Q fH55Q 87.4
VL1a_T699S fT56S 87.4
VL1a_H698Q_T699S fH55Q、fT56S 88.4
註：反向突變以 b為前綴，反向突變以 f為前綴，例如 bS49A 指位置 49 發生從絲胺酸到丙胺酸的反向突變 (人種系胺基酸到親代抗體胺基酸)。所有殘基索引在 Kabat 編號中給出。 1.2.3 T 細胞表位預測
為了評定人源化序列中潛在 T 細胞表位之出現，採用 NetMHCIIpan 4.0 預測器 (Reynisson B 等人：NetMHCpan-4.1 及 NetMHCIIpan-4.0：improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data, Nucl.Acids Res., 48(W1): W449–W454 (2020))。對以下人 MHC 第 II 型等位基因進行預測：DRB1*01:01、DRB1*03:01、DRB1*04:01、DRB1*07:01、DRB1*08:01、DRB1*09:01、DRB1*11:01、DRB1*13:01 及 DRB1 * 15:01。
強結合及弱結合 15mer 肽的閾值分別設定為百分位排名 1 及 5。不考慮百分位排名高於 5 的結合 15mer 肽。同樣，不考慮 10 個或更多個人 V 區生殖系列中出現的具有 9mer 核心肽的所有結合 15mer 肽。生殖系列序列獲自 IMGT 資料庫 (Giudicelli, V. 等人：IMGT/LIGM-DB, the IMGT® comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences.Nucl.Acids Res., 34(S1):D781-D784 (2006))。由於許多預測的 15mer 結合物共享相同的 9mer 核心肽，下 表 8也詳細介紹了相應序列中存在的獨特 9mer 核心的數目，並預測在 ≤ 5 的百分位範圍內結合。 表 8 ： T 細胞表位
序列 # 強結合 15mer 肽 # 弱結合 15mer 肽 # 總結合 15mer 肽 # 獨特 9mer 肽核心
54_VH_親代 15 60 75 8
VH1a 15 52 67 6
VH1b 15 53 68 6
VH2a 7 54 61 6
VH1a_Y292D 14 54 68 5
VH1c_huCDR2 10 24 34 4
VH1a_W197Y 14 53 67 6
54_VL_親代 12 17 29 5
VL1a 12 15 27 5
VL2a 12 15 27 5
VL1a_L2_GL 9 12 21 4
VL2a_L2_GL 9 12 21 4
VL1a_L1_pGL 12 23 35 7
VL1a_N651A 11 23 34 6
VL1a_N651A_N695S 9 19 28 6
VL1a_H698Q 12 16 28 6
VL1a_T699S 13 16 29 5
VL1a_H698Q_T699S 14 15 29 6
1.2.4 所得人源化 BCMA 抗體之 VH 及 VL 域
所得人源化 BCMA 抗體之 VH 域可見於下 表 9，且所得人源化 BCMA 抗體之 VL 域列於下 表 10。 表 9 ：人源化 BCMA 抗體之 VH 域之胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
BCMA (54_VH1a) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVGQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS 48
BCMA (54_VH1b) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWIAQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS 38
BCMA (54_VH2a) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVSQITAKSNNYATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS 36
BCMA (54_VH1a_Y292D) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVGQITAKSNNYATDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS 49
BCMA (54_VH1c_huCDR2) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMDWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS 50
BCMA (54_VH1a_W197Y) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAYMDWVRQAPGKGLEWVGQITAKSNNYATYYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTDDGYHWGQGTLVTVSS 51
表 10 ：人源化 BCMA 抗體之 VL 域之胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
BCMA (54_VL1a) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK 39
BCMA (54_VL2a) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK 37
BCMA (54_VL1a_L2_GL) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK 52
BCMA (54_VL2a_L2_GL) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK 53
BCMA (54_VL1a_L1_pGL) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK 54
BCMA (54_VL1a_N651A) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYAANSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK 55
BCMA (54_VL1a_N651A_N695S) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK 56
BCMA (54_VL1a_H698Q) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK 57
BCMA (54_VL1a_T699S) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK 58
BCMA (54_VL1a_H698Q_T699S) AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASEDIRNGLAWYQQKPGKAPKLLIYNANSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCEDTSKYPYTFGQGTKLEIK 59
E04 人源化變異體之重鏈及輕鏈可變域的人源化胺基酸序列與具有效應沉默 Fc 域 (P329G；L234A、L235A) 的單臂人 IgG1 骨架/人 CH1-鉸鏈-CH2-CH3 融合以廢除根據 WO 2012/130831 A1 中描述之方法與 Fcγ 受體結合，並根據杵臼技術含有杵突變並形成輕鏈。為了正確組裝單臂 IgG1，使用含有效應沉默 Fc 域的人 Fc。將胺基酸序列反向轉譯為 DNA，且合成所得 cDNA (GeneArt 或 Twist Biosciences)，然後選殖到重鏈表現載體中作為與人 IgG1 骨架表現載體的融合蛋白，作為與人 C-κ 的融合蛋白。然後將輕鏈 (LC) 及重鏈 (HC) 質粒共轉染至 HEK293 細胞中，並在 7 天後藉由抗體純化的標準方法從上清液中純化。 1.3 人源化抗 BCMA 變異體之表徵
為了表徵抗 BCMA 抗體變異體，所有殖株都表現為單價單臂 IgG 樣構建體 ( 圖 1A)。選擇這種型式是為了在 1:1 模型中表徵與 BCMA 的結合。
為了選擇抗 BCMA 抗體 E04 之兩種較佳人源化變異體及抗 BCMA 抗體 54 之兩種較佳人源化變異體，生產 76 個變異體。從此等 76 個變異體中，預先選擇對 huBCMA 具有最高親和力的 29 個變異體 (15 個 BCMA 54 變異體及 14 個 BCMA E04 變異體)，並藉由測量對 cyBCMA 的親和力進一步表徵。
29 個變異體及親代抗體之對應 VH/VL 對、構建體 ID (TaPIR ID) 及對應 SEQ ID NO: 列於下 表 11。 表 11 ：表現的單價抗 BCMA 變異體之總結
變異體 VH/VL (單臂 IgG 構建體) Tapir ID SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:
BCMA (54_VH1a) / BCMA (54_VL1a_L1_pGL) P1AG5067 60 61 62
BCMA (54_VH1a_Y292D) / BCMA (54_VL1a) P1AG5057 63 64 62
BCMA (54_VH1a_Y292D) / BCMA (54_VL1a_L1_pGL) P1AG5014 63 61 62
BCMA (54_VH1a_Y292D) / BCMA (54_VL1a_T699S) P1AG5065 63 65 62
BCMA (54_VH1a_Y292D) / BCMA (54_VL2a) P1AG5080 63 66 62
BCMA (54_VH1b) / BCMA (54_VL1a) P1AG5072 67 64 62
BCMA (54_VH1b) / BCMA (54_VL1a_L1_pGL) P1AG5027 67 61 62
BCMA (54_VH1b) / BCMA (54_VL1a_N651A) P1AG5056 67 68 62
BCMA (54_VH1b) / BCMA (54_VL1a_N651A_N695S) P1AG5064 67 69 62
BCMA (54_VH1b) / BCMA (54_VL1a_T699S) P1AG5046 67 65 62
BCMA (54_VH1b) / BCMA (54_VL2a) P1AG5030 67 66 62
BCMA (54_VH2a) / BCMA (54_VL1a) P1AG5028 70 64 62
BCMA (54_VH2a) / BCMA (54_VL1a_L1_pGL) P1AG5013 70 61 62
BCMA (54_VH2a) / BCMA (54_VL1a_T699S) P1AG5071 70 65 62
BCMA (54_VH2a) / BCMA (54_VL2a) P1AG5031 70 66 62
BCMA (54) 親代 P1AG5061 71 72 62
BCMA (E04_VH1a) /BCMA (E04_VL1a) P1AG5063 73 74 62
BCMA (E04_VH1a) / BCMA (E04_VL1b) P1AG5004 73 75 62
BCMA (E04_VH1a) / BCMA (E04_VL1d) P1AG5043 73 76 62
BCMA (E04_VH1a) / BCMA (E04_VL1e) P1AG5007 73 77 62
BCMA (E04_VH1a) / BCMA (E04_VL1f) P1AG5036 73 78 62
BCMA (E04_VH1a) / BCMA (E04_VL1g) P1AG5059 73 79 62
BCMA (E04_VH1a) / BCMA (E04_VL1h) P1AG5053 73 80 62
BCMA (E04_VH1b) / BCMA (E04_VL1a) P1AG5026 81 74 62
BCMA (E04_VH1b) / BCMA (E04_VL1b) P1AG5044 81 75 62
BCMA (E04_VH1b) / BCMA (E04_VL1d) P1AG5078 81 76 62
BCMA (E04_VH1b) / BCMA (E04_VL1e) P1AG5034 81 77 62
BCMA (E04_VH1b) / BCMA ((E04_VL1f) P1AG5060 81 78 62
BCMA (E04_VH1b) / BCMA (E04_VL1g) P1AG5021 81 79 62
BCMA (E04_VH1b) / BCMA (E04_VL1h) P1AG5076 81 80 62
BCMA (E04) 親代 P1AG5062 82 83 62
根據 Pace 等人，Protein Science 1995 (4) 2411-1423，使用基於胺基酸序列所計算的質量消光係數，藉由測量在 280 nm 處的光密度 (OD) 來判定純化的構建體的蛋白質濃度。在存在及不存在還原劑的情況下，使用 LabChipGXII (Perkin Elmer)，藉由 CE-SDS 分析蛋白質之純度及分子量。藉由 HPLC 層析，於 25℃ 使用在運行緩衝液 (分別為 25 mM K 2HPO 4、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽，pH 6.7；或者 200 mM KH 2PO 4、250 mM KCl pH 6.2) 中平衡的分析性粒徑篩析管柱 (TSKgel G3000 SW XL 或 UP-SW3000) 進行凝集體含量之判定。 表 12中給出所有單價抗 BCMA 變異體之產物量及純化參數的總結。
使用 BIACORE T200 儀器 (GE Healthcare) 藉由表面電漿子共振 (SPR) 研究單價人源化 BCMA 抗體變異體與人 BCMA 及獼猴 BCMA 的結合動力學。所有實驗均使用 HBS-P 緩衝液 (10 mM HEPES、150 mM NaCl pH 7.4、0.05% 界面活性劑 P20) 作為運行緩衝液及稀釋緩衝液於 25℃ 進行。抗 Fc IgG 捕獲抗體 (對 PGLALA 變異體 Fc 區具有特異性) 藉由使用標準胺偶合化學固定在系列 S Sensor Chip CM5 (Cytiva) 上，得到大約 15000 個共振單位 (RU) 之表面密度。抗 BCMA 抗體以 5 μl/min 中流速在表面捕獲 30 s，產生捕獲反應 50 至 200 RU。將一系列稀釋抗原 (分別為人 BCMA Fc 同二聚體 (R&D Systems) 或獼猴 BCMA Fc 同二聚體 (R&D Systems)) 以 3 至 300 nM 之濃度以 30 μl/min 注射至表面持續 120 s (關聯階段)。藉由用運行緩衝液洗滌來監測解離階段 300 至 600 秒。藉由注射 5 mM NaOH (新鮮製備) 2 x 30 秒來再生表面。藉由減去空白注射並藉由減去從沒有捕獲抗體的參照流通池獲得的反應來校正整體折射率差異。使用 BIAevaluation 軟體，將得出之曲線擬合至 1:1 Langmuir 結合模型。
包括 29 個較佳 BCMA 變異體的單價構建體的 K D值顯示於下 表 12。 表 12 ：表現的單價抗 BCMA 變異體之生產、純化及結合性質
Tapir ID 產物量 [µg] 分析物 SEC 單體 [%] CE SDS 主峰 [%] K D[M] huBCMA K D[M] cyBCMA
P1AG5067 2231 97.2 93.7 3.4E-09 1.7E-09
P1AG5057 1184 96.7 90.6 1.7E-09 4.0E-09
P1AG5014 1246 97 92.2 1.7E-09 1.1E-10
P1AG5065 1110 95.8 88.9 2.6E-09 6.4E-09
P1AG5080 2195 97 89.9 1.3E-09 4.3E-09
P1AG5072 3394 97.2 93.8 1.3E-09 3.2E-09
P1AG5027 3492 98.3 95.4 1.7E-09 1.2E-09
P1AG5056 3200 97.4 94 4.2E-09 1.3E-08
P1AG5064 1760 100 89.7 3.5E-09 1.3E-08
P1AG5046 2685 97.9 92.6 1.9E-09 3.9E-09
P1AG5030 3344 97.6 91 1.3E-09 2.2E-09
P1AG5028 3405 98.7 96.1 2.7E-09 3.8E-09
P1AG5013 2900 97.6 94.5 2.4E-09 1.9E-09
P1AG5071 2508 96.5 91.4 3.4E-09 6.5E-09
P1AG5031 3155 97.5 91.1 2.4E-09 4.7E-09
P1AG5061 3481 95.5 82.6 1.4E-09 1.9E-09
P1AG5063 3041 99.6 96.3 1.6E-09 2.8E-08
P1AG5004 2454 98.6 95.2 2.5E-09 1.6E-08
P1AG5043 2485 100 96.7 2.6E-09 1.4E-08
P1AG5007 393 98.6 100 3.0E-09 1.2E-08
P1AG5036 2735 99.6 97.4 2.9E-09 9.5E-09
P1AG5059 2520 99.1 95.4 2.3E-09 3.0E-08
P1AG5053 1222 99.6 99.3 2.4E-09 1.3E-08
P1AG5026 569 98.9 93.1 2.7E-09 3.3E-08
P1AG5044 1398 97.7 91.8 1.8E-09 2.0E-08
P1AG5078 1236 99.8 96 2.4E-09 2.2E-08
P1AG5034 286 100 96.5 3.2E-09 3.2E-08
P1AG5060 702 96.4 86.5 3.2E-09 1.4E-08
P1AG5021 344 97.3 92.2 2.8E-09 3.5E-08
P1AG5076 944 99.7 99.5 1.9E-09 2.3E-08
P1AG5062 1995 99.8 97.2 3.1E-09 3.3E-08
基於用 NetMHCIIpan 4.0 預測器對人源化序列中的潛在 T 細胞表位的出現進行電腦運行評定之結果 (參見實例 1.2.3)，選擇抗體 P1AG5080、P1AG5072、P1AG5028、P1AG5031、P1AG5063 及 P1AG5036 (4 個 BCMA 54 變異體及 2 個 BCMA E04 變異體) 作為具有最低潛在 T 細胞表位的分子。與其結合行為相組合，選擇 P1AG5072 及 P1AG5031 作為 BCMA 54 變異體，選擇 P1AG5063 及 P1AG5036 作為 BCMA E04 變異體抗體，以包括在雙特異性抗體中。 實例 2 靶向 BCMA 之雙特異性抗原結合分子之產生及生產 2.1 靶向 BCMA 及 CD28 之雙特異性抗原結合分子之選殖
用於產生表現質粒，使用各自可變域之序列及於具有各自恆定區之框架中次選殖，該等恆定區經預先插入各自受體哺乳動物表現載體中。在 Fc 域中，已將 Pro329Gly、Leu234Ala 及 Leu235Ala 突變 (PG-LALA) 導入人 IgG1 重鏈之恆定區以廢除與 Fcγ 受體之結合，根據國際專利申請公開號 WO 2012/130831 所述的方法。為產生雙特異性抗體，Fc 片段含有「杵」(S354C/T366W 突變，根據 Kabat EU 索引編號) 或「臼」突變 (Y349C/T366S/L368A/Y407V 突變，根據 Kabat EU 索引編號) 以避免重鏈錯配。為避免在雙特異性抗原結合分子中輕鏈的錯配，將 VH/VL 或 CH1/Cκ 域之互換導入一個結合部分中 (CrossFab 技術)。在另一結合部分中，將電荷導入 CH1 及 Cκ 域中，如國際專利申請公開號 WO 2015/150447 所描述。
國際專利申請公佈號 WO 2020/127618 A1 中描述了如本文所描述之抗 CD28 抗體 CD28 v.8 及 CD28 v.15 之產生及製備。CD28 v.8 具有 SEQ ID NO:23 之 VH 及 SEQ ID NO:24 之 VL。CD28 v.15 具有 SEQ ID NO: 90 之 VH 及 SEQ ID NO:91 之 VL。
雙特異性抗體結構之示意性圖示顯示於 圖 1B 或 1C中。 表 13總結所製備之特異性抗 BCMA/抗 CD28 雙特異性抗體、其標識符以及重鏈 (HC1 杵及 HC2 臼) 及輕鏈 (LC1 及 LC2) 之序列。 表 13 ：經表現之抗 BCMA/ 抗 CD28 雙特異性抗體之總結
描述 TAPIR ID SEQ ID NO: (LC1) SEQ ID NO: (HC1 杵) SEQ ID NO: (HC2 臼) SEQ ID NO: (LC2)
BCMA (E04_VH1a/VL1f)-CD28 v8 (經畫橫線) P1AG7191 28 27 26 25
BCMA (E04-VH1a/VL1a)-CD28 v8 (經畫橫線) P1AG7215 28 27 26 92
BCMA (54_VH2a/VL2a)-CD28 v8 (經畫橫線) P1AG7207 28 27 41 40
BCMA (54_VH1b/VL1a)-CD28 v8 (經畫橫線) P1AG7182 28 27 93 94
BCMA PR – CD28 v8 (經畫橫線) P1AF7062 28 27 95 96
BCMA (E04_VH1a/VL1f)-CD28 v15 (經畫橫線) P1AG7285 98 97 26 25
BCMA (E04_VH1a/VL1a)-CD28 v15 (經畫橫線) P1AG7200 98 97 26 92
BCMA (54_VH2a/VL2a)-CD28 v15 (經畫橫線) P1AG7196 98 97 41 40
BCMA (54_VH1b/VL1a)-CD28 v15 (經畫橫線) P1AG7153 98 97 93 94
BCMA PR – CD28 v15 (經畫橫線) P1AE9053 98 97 95 96
2.2 靶向 BCMA 及 CD28 之雙特異性抗原結合分子之生產及純化
使用習知選殖技術，將編碼 BCMA 及 CD28 抗原結合域的重鏈可變區及輕鏈可變區的 DNA 序列選殖到哺乳動物表現載體中。本文所描述之雙特異性抗體係使用振盪燒瓶以 FedBatch 模式生產的。藉由在成分確定的無血清培養基中瞬時轉染 Expi293™ 細胞來進行重組生產。使用 ExpiFectamine™ 293 轉染套組 (Gibco) 進行轉染。在轉染後 7 至 12 天收穫細胞培養上清液。
蛋白質滴度之定量：藉由親和層析使用 POROS A 20 µm 管柱，2.1 x 30 mm (Life Technologies，Carlsbad，CA，USA) 在高效液相層析系統 (Ultimate 3000 HPLC 系統，Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 上判定清液樣品之蛋白質滴度。將上清液負載至用 0.2 M Na 2HPO 4(pH 7.4) 平衡的管柱上，之後用 0.1 M 檸檬酸、0.2 M NaCl (pH 2.5) 溶析。藉由測量 280 nm 處的吸光度來對滴度進行定量，隨後藉由將分析物之溶析峰面積 (曲線下) 與參照標準曲線進行比較來計算蛋白質濃度。
雙特異性抗體之純化：參照標準方案從細胞培養上清液中純化蛋白質。簡而言之，藉由蛋白 A-親和層析法從細胞培養上清液中純化含 Fc 的蛋白質 (平衡緩衝液：20 mM 檸檬酸鈉、20 mM 磷酸鈉、pH 7.5 或 PBS；溶析緩衝液：20 mM、25 mM 或 50 mM 檸檬酸鈉，pH 3.0)。在 pH 3.0 下完成洗脫，然後立即中和樣品的 pH。蛋白質係藉由離心 (Millipore Amicon® ULTRA-15, #UFC903096) 濃縮，且藉由粒徑篩析層析法在 20 mM 組胺酸，140 mM 氯化鈉，pH 6.0 中將聚集的蛋白質與單體蛋白質分離。
雙特異性抗體之分析：通過使用根據 Pace 等人，Protein Science, 1995, 4, 2411-1423 基於胺基酸序列計算的質量消光係數來量測在 280 nm 處的吸收來測定純化蛋白質之濃度。在存在和不存在還原劑的情況下，使用 LabChipGXII 或 LabChip GX Touch (Perkin Elmer)，透過 CE-SDS 來分析蛋白質的純度和分子量。聚集體含量的測定是在 25℃ 下使用在運行緩衝液 (200 mM KH 2PO 4，250 mM KCl pH 6.2，0.02% NaN 3) 中平衡的分析粒徑篩析管柱 (TSKgel G3000 SW XL 或 UP-SW3000，Tosoh Bioscience) 透過 HPLC 層析進行的。
表 14中給出所選擇分子之純化參數之總結。 表 14 ：雙特異性 CD28 抗原結合分子之生產及純化概述
TAPIR ID 描述 產率 [mg/l] 分析型 SEC (HMW/單體/LMW) [%] 藉由 CE-SDS 量測之純度 [%]
P1AG7215 BCMA (E04_VH1a/VL1a)-CD28 v8 (經畫橫線) 382.68 99.76 99.16
P1AG7191 BCMA (E04-VH1a/VL1f)-CD28 v8 (經畫橫線) 309.17 100 99.43
P1AG7207 BCMA (54_VH2a/VL2a)-CD28 v8 (經畫橫線) 359.47 100 98.29
P1AG7282 BCMA (54_VH1b/VL1a)-CD28 v8 (經畫橫線) 416.78 100 98.67
P1AG7200 BCMA (E04_VH1a/VL1a)-CD28 v15 (經畫橫線) 359.95 100 99.03
P1AG7285 BCMA (E04-VH1a/VL1f)-CD28 v15 (經畫橫線) 405.41 99.3 98.12
P1AG7196 BCMA (54_VH2a/VL2a)-CD28 v15 (經畫橫線) 495.86 100 97.46
P1AG7153 BCMA (54_VH1b/VL1a)-CD28 v15 (經畫橫線) 382.68 100 100
2.3 靶向 BCMA 及 CD28 的雙特異性抗體之生物物理及生化表徵
為了預測雙特異性抗體之可開發性，藉由計算方法及測定來評定其生物物理及生化性質。
使用標準軟體 (例如 EMBOSS 工具) 基於序列預測蛋白質隨 pH 變化之淨電荷，並且因此其等電點 (計算 pI) 有助於估計雙特異性抗體是否適合結合及不結合陽離子及陰離子交換層析介質，並因此適合生產期間的一般純化方法。所有生產的 BCMA-CD28 bsAb 都具有 ＞8 之範圍內的有利 pI 值 (參見下表 15)。
所製備之 BCMA-CD28 bsAb 的熱穩定性藉由動態光散射 (DLS) 進行監測，並藉由使用 Optim 2 儀器 (Avacta Analytical, UK) 應用溫度斜坡監測溫度依賴性內源蛋白質螢光來監測。將 10 µg 蛋白質濃度為 1 mg/ml 的過濾後蛋白質樣品施加至 Optim 2 儀器上，並一式兩份。溫度以 0.1℃/min 的速率從 25℃ 升至 85℃，收集 350 nm/330 nm 下之螢光強度比及 266 nm 下之散射強度。結果顯示於表 15 中。所產生的所有經測試之 BCMA-CD28 bsAb 之聚集溫度 (T agg) 都為有利的。
雙特異性抗體之表觀疏水性藉由疏水性交互作用層析 (HIC) 評定為與疏水性標準相比的相對滯留時間 (IVIG 製劑中 90% 之免疫球蛋白具有相對滯留時間 ＜0.35)。詳細而言，將 20 μg 之樣品注射到用 25 mM 磷酸鈉、1.5 M 硫酸銨 (pH 7.0) 平衡的 HIC-Ether-5PW (Tosoh) 管柱上。利用 0% 至 100% 緩衝液 B (25 mM 磷酸鈉，pH 7.0) 的線性梯度在 60 分鐘內進行溶析。然後將滯留時間與已知疏水性的蛋白質標準品 (例如 Avastin) 進行比較。
對於 FcRn 親和層析，如 (Schlothauer 等人，MAbs 2013, 5(4), 576-86) 所描對 FcRn 進行表現、純化及生物素化。為了進行偶合，將製備的受體添加至卵白素-瓊脂糖 (GE Healthcare) 中。將所得 FcRn-瓊脂糖基質填充在管柱殼體中。此管柱以 20 mM 2-(N-嗎啉)-乙磺酸 (MES) 及 140 mM NaCl (pH 5.5) (溶析液 A) 以 0.5 ml/min 流速平衡。30 μg 之抗體樣品以體積比 1: 1 用溶析液 A 稀釋並施加至 FcRn 管柱。將管柱以 5 倍管柱體積的溶析液 A 洗滌，之後以 35 倍管柱體積利用 20% 至 100% 20 mM Tris/HCl 及 140 mM NaCl，pH 8.8 (溶析液 B) 的線性梯度進行溶析。於 25℃ 的管柱烘箱中進行分析。藉由連續測量 280 nm 處的吸光度來監測溶析曲線。將滯留時間與已知親和力的蛋白質標準品進行比較。
藉由將 30 至 50 μg 之樣品注射到用 50 mM Tris (pH 7.4) 平衡的 TSKgel Heparin-5PW (Tosoh) 管柱上來判定肝素親和力。利用 0% 至 100% 緩衝液 B (50 mM Tris、1M NaCl，pH 7.4 mM) 的線性梯度在 37 分鐘內進行溶析。將滯留時間與已知親和力的蛋白質標準品進行比較。特定 BCMA-CD28 bsAb 之滯留時間及經測量的滯留時間之預期值係如表 15 所顯示。 表 15 ：靶向 BCMA 及 CD28 的雙特異性抗體之 活體外可開發性評定
參數 「理想」抗體之預期值 P1AG7215BCMA E04 1a 1aCD28 v8 P1AG7191BCMA E04 1a 1fCD28 v8 P1AG7207BCMA 54 2a 2aCD28 v8 P1AG7282BCMA 54 1b 1aCD28 v8
計算的 pI，電荷分佈 ＞8：OK 7…8：橙色標誌 ＜7：紅色標誌 8.96 8.96 8.89 9.03
熱穩定性 (T agg) T agg＞ 64℃ 66.8 67.6 71.6 71.5
表觀疏水性 (HIC) 1 Rel. ret. ＜0.34 (＜Avastin) 0.21 0.21 0.12 0.12
FcRn 2 肝素 0 ＜rel. ret. 時間＜2.75 0 ＜rel. ret. 時間＜0.8 0.23 0.53 0.11 0.55 -0.01 0.57 -0.04 0.56
親和層析
1 - 相對於通用疏水性標準。IVIG 製劑中 90% 之免疫球蛋白具有相對滯留時間 ＜0.35。 2 – 相對於通用 FcRn 親和力標準。正常 IgG 具有的相對滯留時間在 0 與 2.75 之間。
利用特定 BCMA-CD28 bsAb 在應激後藉由表面電漿子共振 (SPR) 來表徵結合效力。結果顯示於表 16 中。使用 Biacore T200 儀器 (GE Healthcare) 藉由表面電漿子共振對分子在 37℃、pH 7.4 及 40℃、pH 6 下孵化 14 天所引起的結合效力降低進行定量。使用儲存於 -80℃、pH 6 下的樣品用為參照。參照樣品及在 20 mM 組胺酸緩衝液、140 mM NaCl、pH 6.0 中於 40℃ 應激之樣本，以及於 37℃ 在 PBS 緩衝液 pH 7.4 中應激之樣本，濃度皆為 1.0 mg/ml。在應力期 (14 天) 後，將 PBS 緩衝液中之樣品透析回 20 mM 組胺酸緩衝液、140 mM NaCl、pH 6.0 中進行進一步分析。
所有 SPR 實驗均使用 BIACORE 儀器 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden)，於 25℃ 以 HBS-P+ 緩衝液 (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20) 作為運行及稀釋緩衝液進行。在溶液中以多種濃度添加抗原 (R&D Systems 或內部純化)。將生物素化人 BCMA 及 CD28 以及生物素化抗 hu IgG (Capture Select, Thermo Scientific, #7103262100) 固定於 S 系列感測芯片 SA (GE Healthcare, #29104992) 上，使表面密度達到至少 1000 共振單位 (RU)。以 5 μl/min 之流速在 30 s 內注入濃度為 2 μg/ml 的 BCMA-CD28 雙特異性抗體，並監測 120 s 內之解離。藉由在 60 s 內注入 pH 1.5 的 10 mM 甘胺酸緩衝液，使表面再生。藉由扣除空白進樣並扣除由空白對照流通池獲得之響應來校正本體折射率差。在評估時，取注射結束後 5 秒之結合反應。
為使結合訊號標準化，將 BCMA 及 CD28 結合除以抗 hu IgG 反應 (捕獲固定化抗 huI gG 抗體上之 BCMA-CD28 bsAb 後獲得的訊號 (RU))。藉由比較每個溫度應力處理後之樣品與相應的未經應力處理之樣品，計算相對結合活性。如表 16 所示，所有 BCMA-CD28 bsAb 在應激後均顯示出與 BCMA 及 CD28 之穩定結合。 表 16 ：靶向 BCMA 及 CD28 的雙特異性抗體之 活體外可開發性評定
參數 「理想抗體」之預期值 抗體 P1AG7215BCMA E04 1a 1aCD28 v8 P1AG7191BCMA E04 1a 1fCD28 v8 P1AG7207BCMA 54 2a 2aCD28 v8 P1AG7282BCMA 54 1b 1aCD28 v8
CE-SDS [%] 單體 (非紅色) 參照 相較於參照 ＜2%。 94.5 96.6 96.3 96.5
PBS 37℃ 95.1 95.3 95.1 95.0
His 40℃ 95.5 95.6 95.1 95.7
CE-SDS [%] LC+HC (紅色) 參照 相較於參照 ＜2%。 99.6 99.7 99.6 99.6
PBS 37℃ 98.9 98.9 98.7 98.8
His 40℃ 99.4 99.4 99.3 99.3
SEC 單體 [%] 參照 相較於參照 ＜2%。 98.9 97.7 98.1 97.6
PBS 37℃ 98.4 98.3 98.0 97.5
His 40℃ 98.3 98.3 98.1 97.7
靶結合 ± 應力。按 SPR RAC [%] 參照 ＞90% 100 100 100 100 100 100 100 100
PBS 37℃ 90.6 93.9 106.3 103.3 99.8 98.9 100.1 99.0
His 40℃ 101.1 98.8 106.1 104.9 99.3 100.5 100.4 99.9
BCMA CD28 BCMA CD28 BCMA CD28 BCMA CD28
2.4 靶向 BCMA 及 CD3 之雙特異性抗原結合分子之生產及純化
為了進行比較，製備詳細描述的 BCMA 靶向型 CD3 T 細胞接合物阿努克他單抗及艾爾納單抗。阿努克他單抗為 2+1 型式之 BCMA x CD3 雙特異性抗體，其基於具有 L234A/L235A/P329G (EU 編號) 突變的 IgG1 Fc。序列在國際非專有命名清單中進行鑑定 (建議的 INN：清單 85；WHO 藥物資訊，第 35 卷，第 1 期，2021 年)。阿努克他單抗包含 SEQ ID NO: 198 之胺基酸序列、SEQ ID NO: 199 之兩個胺基酸序列、SEQ ID NO: 200 之胺基酸序列及 SEQ ID NO: 201 之胺基酸序列 (2+1 型式)。
艾爾納單抗為 1+1 型式之 BCMA x CD3 雙特異性抗體。序列在國際非專有命名清單中進行鑑定 (建議的 INN：清單 87，WHO 藥物資訊，第 36 卷，第 1 期，2022 年)。艾爾納單抗包含 SEQ ID NO: 202 之胺基酸序列、SEQ ID NO: 203 之胺基酸序列、SEQ ID NO: 204 之胺基酸序列及 SEQ ID NO: 205 之胺基酸序列。
為了生產阿努克他單抗 (P1AF0105)，使用習知選殖技術將編碼相應結合域之可變重鏈區及可變輕鏈區的 DNA 序列選殖到哺乳動物表現載體中。藉由瞬時轉染 Expi293F 細胞來產生抗體。將細胞以 2.5 x 10 6/mL 的密度接種在 Expi293 培養基 (Gibco，#1435101) 中。將表現質體及 ExpiFectamine (Gibco，ExpiFectamine 轉染套組，#13385544) 分別混合在 OptiMEM (Gibco, #11520386) 中。5 分鐘後，將兩種溶液合併，藉由移液管混合並在室溫孵化 15 至 20 分鐘。將細胞添加至質體/ExpiFectamine 溶液中，並在 37℃ 及 5% CO 2環境的振盪培養箱中孵化 24 小時。轉染一天後，添加補充劑 (增強劑 1+2，ExpiFectamine 轉染套組)。4 至 5 天後，藉由離心及隨後的過濾 (0.2 μm 過濾器) 收穫細胞上清液，並藉由如下所示之標準方法從收穫的上清液中純化蛋白質。
艾爾納單抗 (P1AH5054) 由 Proteros 根據其標準方法及方案生產並純化。
藉由蛋白質 A – HPLC 在帶有 UV 檢測器的安捷倫 HPLC 系統 (Agilent HPLC System) 進行上清液中含有 Fc 的構建體之定量。將上清液注射到 POROS 20 A (Applied Biosystems) 上，以 10 mM Tris、50 mM 甘胺酸、100 mM NaCl、pH 8.0 洗滌，並在 pH 2.0 的相同緩衝液中溶析。藉由測量 280 nm 處的吸光度來對滴度進行定量，隨後藉由將分析物之溶析峰面積 (曲線下) 與參照標準曲線進行比較來計算蛋白質濃度。
參照標準方案從過濾的細胞培養上清液中純化蛋白質。  簡而言之，藉由蛋白 A-親和層析法從細胞培養上清液中純化含 Fc 的蛋白質 (平衡緩衝液：20 mM 檸檬酸鈉、20 mM 磷酸鈉、pH 7.5；洗脫緩衝液：20 mM 檸檬酸鈉，pH 3.0) 。在 pH 3.0 下完成洗脫，然後立即中和樣品的 pH。蛋白質係藉由離心使用 Millipore Amicon® ULTRA-15 (Merck, #UFC903096) 濃縮，且藉由粒徑篩析層析法在 20 mM 組胺酸，140 mM 氯化鈉，pH 6.0 中將聚集的蛋白質與單體蛋白質分離。通過使用根據 Pace 等人，Protein Science, 1995, 4, 2411-1423 基於胺基酸序列計算的質量消光係數來量測在 280 nm 處的吸收來測定純化蛋白質之濃度。在存在和缺乏還原劑的情況下，使用 LabChipGXII 或 LabChip GX Touch (Perkin Elmer)，透過 CE-SDS 來分析蛋白質的純度和分子量。在 25℃ 下使用於運行緩衝液 (200 mM KH 2PO 4，250 mM KCl pH 6.2，0.02% NaN 3) 中平衡的分析型粒徑排阻管柱 (TSKgel G3000 SW XL 或 UP-SW3000)，藉由 HPLC 層析法進行聚集內容物之測定。表 16A 中給出純化參數之總結。 表 16A: 雙特異性 BCMA x CD3 抗原結合分子之生產及純化的總結
TAPIR ID 描述 產率 [mg/l] 分析性 SEC (單體) [%] 藉由 CE-SDS 量測之純度 [%]
P1AF0105 阿努克他單抗 16.8 94.8 88.7
P1AH5054 艾爾納單抗 7.6 ＞99 ＞98
特立妥單抗為 BCMA x CD3 雙特異性抗體，具有 IgG4-F234A/L235A/S228P ( EU 編號) Fc。序列在國際非專有命名清單中進行鑑定 (建議的 INN：清單 82，WHO 藥物資訊，第 33 卷，第 3 期，2019 年)。它獲自供應商 (FarmaMondo，批號 AT1334P1)。特立妥單抗包含 SEQ ID NO: 206 之胺基酸序列、SEQ ID NO: 207 之胺基酸序列、SEQ ID NO: 208 之胺基酸序列及 SEQ ID NO: 209 之胺基酸序列。 實例 3 靶向 BCMA 的雙特異性 CD28 促效抗原結合分子與表現 CD28 及 BCMA 的細胞之結合
為了測量與 BCMA 或 CD28 之結合，我們對 CHO 轉染株進行基於 FACS 的結合測定，這些轉染株係經轉導為穩定過表現人 BCMA 或人 CD28。
表現 BCMA 胞外域非截短突變體的 CHO-K1 細胞株產生如下：將編碼人 BCMA (UniProt: Q02223) 及其對應突變體 (R27P、S30del、P33S 及 P34del) 的全長 cDNA 次選殖到由 CMV 啟動子控制的慢病毒轉移載體。根據製造商的方案使用 LV-MAX 轉染套組 (Gibco，#A35346) 以轉移質體及慢病毒封裝混合物 (pRSV-Rev、pCgpV 及 pCMV-VSV-G) 瞬時共轉染 HEK 293 衍生的病毒生產細胞 (Gibco，#A35347) 來製備慢病毒顆粒。轉染後 48 h 收穫病毒上清液，透過 0.45 μm 低蛋白結合過濾器過濾並儲存於 -80℃ 直至使用。
轉導前一天，將 5 x 10 4個 CHO-K1 (ATCC CRL-9618) 細胞接種至 24 孔平盤中的每個孔中。第二天，將培養基替換為 300 µL 之純化的慢病毒上清液及 100 µL 之新鮮培養基 DMEM/F-12 (Gibco，#11320033)，並補充 10% 胎牛血清 (Gibco，#16140063) 及 1% GlutaMAX 補充劑 (Gibco；#31331-028)。為了促進病毒轉導，對感染性培養基進一步補充 2.5 µL 之 TransDux™ 試劑及 100 µL 之 MAX Enhancer (SBI；# LV860A-1)。然後將細胞於 37℃ 孵化 24 小時。孵化期後，丟棄病毒培養基，並隨後將細胞維持在新鮮培養基中。
轉導後三天的時候，對培養基補充 6 µg/mL 嘌呤黴素 (Invivogen；#ant-pr-1)。初步選擇後，藉由 BD FACSAria III 細胞分選儀 (BD Biosciences) 分離展現出人 BCMA 表面表現的細胞，並隨後培養以產生穩定的殖株。經過 4 週穩定性測試後，使用小鼠 PE 結合的抗人 BCMA (BioLegend，#357503) 藉由流式細胞儀分析驗證表面表現及其穩定性。
將穩定 CHO 轉染株 (親代細胞株 CHO-k1 ATCC #CCL-61) 在補充下列的 DMEM/F-12 (Gibco ，#10565018) 中培養：10 份胎牛血清 (Gibco，#16140063 或 Sigma-Aldrich，如果為 F4135) 及 1% GlutaMAX 補充劑 (Gibco；#31331-028)，包括 6 μg/ml 嘌呤黴素 (Invivogen；#ant-pr-1)。使用細胞解離緩衝液 (Gibco，#13151014) 或胰蛋白酶 (ThermoFisher Scientific 的 Gibco，TrypLE™Express Enzyme #2605-010) 分離附著 CHO 細胞，計數並檢查活力。所有後續步驟均在 4℃ 下進行。
CD28 結合方案
為了評定與 CD28 之結合，將 CHO-huCD28 細胞以每 ml 1 Mio 細胞重懸於 FACS 緩衝液 (PBS，2% 胎牛血清；1% 0.5 M EDTA pH 8；0.25% NaN 3疊氮化鈉) 中。將 0.1 Mio 細胞鋪於圓底 96 孔平盤之每個孔中，並以每孔 150 μl FACS 緩衝液洗滌，並棄去上清液。將細胞以每孔 50 μl 之總體積以及增加濃度 (0.48 pM 至 2000 nM) 之所指示 BCMA-CD28 雙特異性分子於 4℃ 染色 60 分鐘。此後，由於 CD28 抗原結合域之低親和力——不洗滌細胞，而是立即藉由在抗體溶液之頂部添加 150 μl 之 4% PFA (PBS 中) 並將平盤於 4℃ 孵化 15 min 來固定。接下來，將平盤離心 (5 min，450xg) 並用 150 μl FACS 緩衝液洗滌兩次。在配備軟體 FACS Diva 的 BD Canto 流式細胞分析儀上分析平盤。使用 GraphPadPrism6 獲得結合曲線及 EC 50值。如針對各種 BCMA-CD28 bsAb 及對照所測量之資料係顯示於圖 2A及圖 2B。
BCMA 結合方案
為了評定與 BCMA 之結合，將 CHO-huBCMA 細胞以每 ml 1 Mio 細胞重懸於 FACS 緩衝液 (PBS，2% 胎牛血清；1% 0.5 M EDTA pH 8；0.25% NaN 3疊氮化鈉) 中。將 0.1 Mio 細胞鋪於圓底 96 孔平盤之每個孔中，並以每孔 150 μl FACS 緩衝液洗滌，並棄去上清液。將細胞以每孔 50 μl 至總體積以及增加濃度 (0.48 pM 至 2000 nM) 之所指示 BCMA-CD28 雙特異性分子於 4℃ 染色 30 分鐘。然後，將細胞離心並以 150 μl FACS 緩衝液洗滌兩次。
以每孔共 25 μl 添加預稀釋二級抗體 (PE-AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗人 IgG，Fcγ 片段特異性；Jackson Immunoresearch, 109-116-170，在 FACS 緩衝液中以 1:50 稀釋) 並將平盤於 4℃ 孵化 30 分鐘。將細胞洗滌兩次，並然後藉由添加 50μl 1% PFA (在 PBS 中) 並於室溫孵化 20 min 來固定。將細胞用 150 μl FACS 緩衝液洗滌兩次，並在配備軟體 FACS Diva 的 BD Fortessa 流式細胞分析儀上進行分析。使用 GraphPadPrism6 獲得結合曲線及 EC 50值。如針對各種 BCMA-CD28 bsAb 及對照所測量之資料 (例如「2 級抗體」僅指僅含有經螢光團標記之二級抗體的樣品) 係顯示於 圖 3A及 3B。
所測試之雙特異性抗體分別包括 CD28 抗體 CD28v8 或 CD28v15。 圖 2A及 3A(包含抗體 CD28v8 的分子)以及 圖 2B及 3B(包含抗體 CD28v15 的分子) 顯示所有雙特異性 CD28 分子均能夠以濃度依賴性方式結合人 CD28 (圖 2A 及 2B) 以及人 BCMA (圖 3A 及 3B) 兩者。由於低親和力結合物，與人 CD28 之結合並未達到飽和，且分別在 CD28v8 雙特異性抗體 ( 圖 2A) 及 CD28v15 雙特異性抗體 ( 圖 2B) 當中為相當的。當涉及 BCMA 結合時，相較於如本文所描述之具有新穎 BCMA 抗體的分子，描述於 WO 2020/127618 A1 中之具有 BCMA 抗體 PR 的分子具有較低之 EC 50值，但最大結合 (Emax) 在所有所測試之分子當中為相當的。EC 50值列出於下 表 17中。 表 17 ：所指示雙特異性 BCMA-CD28 bsAb 與細胞上表現的 BCMA 之結合的 EC50 值 (nM) 及 Emax
CD28 抗體 BCMA 抗體 名稱 與 BCMA結合的 EC 50 (nM) Emax BCMA
CD28v8 BCMA (PR) 先前技術 (CD28v8) 5.546 7602
BCMA (E04_1a1f) P1AG7191 19.83 7855
BCMA (54_2a2a) P1AG7207 16.28 6695
BCMA (E04_1a1a) P1AG7215 16.52 6855
- 陰性參照 (CD28v8) - -
CD28v15 BCMA (PR) 先前技術 (CD28v15) 7.63 7915
BCMA (E04_1a1f) P1AG7285 25.62 7594
BCMA (54 2a2a) P1AG7196 18.15 6512
BCMA (E04_1a1a) P1AG7200 13.84 7722
- 陰性參照 (CD28v15) - -
在第二測定中，所測試之雙特異性抗體包含 CD28 抗體 CD28v8 及 BCMA 結合物 BCMA (54 2a2a) 或 BCMA (E04_1a1f)。由於 MM 的複發機制中之一者可能為 BCMA 之胞外域中的非截短、錯義突變或框內缺失，因此將上述分子與詳細描述的 BCMA 靶向型 CD3 T 細胞接合物特立妥單抗、阿努克他單抗及艾爾納單抗進行頭對頭比較 (Lee 等人，Nature Medicine 2023, 29, 2295-2306)。
為了評定與 hu BCMA 細胞外域中具有所指示點突變的 BCMA 變異體的結合，將 CHO 轉染子重懸於 PBS (ThermoFisher Scientific 的 Gibco，#20012050) 並計數。藉由以下進行靶細胞之活死染色：將細胞以 1:1000 稀釋的 Zombie Aqua Viability 染料 (BioLegend #423102) 在 PBS 中以每 ml 1.5 x 10 6個細胞避光孵化 10 分鐘，之後進行利用 PBS 的洗滌步驟並於 4℃ 以 400 x g 離心 4 分鐘。將 CHO-K1 細胞在 PBS 中調整為每 ml 1.25 x 10 6個細胞，並在 384 U 底孔平盤 (ThermoFisher Scientific #264573) 的每孔中接種 40 μl。將平盤於 4℃ 以 400 x g 再次離心 4 分鐘，並去除 20 μl 上清液。
藉由添加 20 μl 之所指示 BCMA-CD28 抗原結合分子的 2x 濃縮稀釋液 (最終濃度範圍為 0.008 至 125 nM)，以每孔 40 μl 之總體積對細胞進行染色。然後將細胞於 4℃ 避光孵化 30 分鐘。然後，離心細胞並以 40 μl FACS 緩衝液洗滌三次。
將每孔共 20 μl 之預稀釋二級抗體 (R-藻紅素 AffiniPure Fab 片段山羊抗人 IgG，Fcγ 片段特異性；Jackson Immunoresearch, 109-117-008，在 PBS 中經 1:100 稀釋) 添加至已含有 20 ul (最終稀釋度 1:200) 的平盤。將細胞於 4℃ 孵化 30 分鐘，然後以每孔 40 μl PBS 洗滌兩次，然後藉由添加 40 μl 之 1% PFA (在 PBS 中) 而於 4℃ 固定過夜。將細胞以 40 μl FACS 緩衝液洗滌兩次，並在 BD FACSymphony™ A5 細胞分析儀上分析。使用 GraphPadPrism6 獲得結合曲線及 EC 50值。如針對各種 BCMA-CD28 抗原結合分子及對照所測量之資料 (例如「僅 2 級抗體」僅指僅含有經螢光團標記之二級抗體的樣品) 係顯示於 圖 3C至 3H。各種 BCMA 靶向型分子的結合性質總結於 表 17A。
BCMA 靶向型 CD28v8 雙特異性分子以及「阿努克他單抗」兩者均能夠以濃度依賴性方式與野生型及與所有突變形式之人 BCMA 結合。相較之下，艾爾納單抗與點突變 R27P 的結合顯著減少，其僅在最高濃度時轉化為微弱的結合訊號。特立妥單抗不能夠與點突變 R27P 及 S30del 結合。與 BCMA 的高效結合對於 BCMA 靶向型雙特異性分子之治療活性至關重要，表明對於不受 BCMA 之 ECD 中的點突變影響的分子具有優勢。野生型與突變型 BCMA 轉染子的最大值的差異係由於轉染子上人 BCMA 野生型及變異體之表現水準不同，並且對於所有所測試之分子而言一致。 表 17A: 所指示 BCMA 靶向型分子與人野生型 (wt) BCMA 或人 BCMA 之細胞外域中所指示點突變的結合性質的高階總結
BCMA 抗體 名稱 wt BCMA CHO-K1-BCMA R27P_ 殖株_12 CHO-K1-BCMA P34del_ 殖株_C10 CHO-K1-BCMA P33S_ 殖株_D5 CHO-K1-BCMA S30del_ 殖株_H1
BCMA (54_2a2a) P1AG7207 是 是 是 是 是
BCMA (E04_1a1f) P1AG7191 是 是 是 是 是
艾爾納單抗 P1AH5054 是 減少且僅在高濃度下 是 是 是
特立妥單抗 FarmaMondoLot 編號 AT1334P1 是 否 是 是 否
阿努克他單抗 P1AF0105 是 是 是 是 是
「是」意指與 BCMA 變異體結合。 實例 4 靶向 BCMA 的雙特異性 CD28 促效的抗原結合分子的 活體外功能性表徵
進行幾種基於細胞的 活體外及 離體測定，以評估雙特異性 BCMA-CD28 分子促進 T 細胞雙特異性媒介的活化的能力。如藉由流式細胞分析技術判定的 (Jurkat 及) T 細胞活化及增生為主要讀出。
1.在 Jurkat IL2 報道細胞測定中評定 BCMA-CD28 雙特異性抗體之活性，其中分子與 Jurkat IL-2 細胞上的人 CD28 及所指示 MM 細胞株上表現的 BCMA 同時結合。 在存在 CD3/TCR 媒介的第一活化訊號的情況下，BCMA-CD28 雙特異性抗體與 Jurkat 及 MM 細胞之交聯會誘導活化的 Jurkat 細胞釋放 IL-2，這進而驅動 IL-2 啟動子驅動的螢光素酶基因之表現，該基因可以使用習知微量盤讀取儀藉由螢光素酶之判定來定量。
2.在另一讀出中，在表現 BCMA 的 MM 細胞株及固定濃度之抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體 (GPRC5D TCB，P1AE6625) 的存在下，以 PBMC 共培養測定評估 BCMA-CD28 雙特異性抗體之功能性，為 T 細胞活化提供同步的第 1 訊號。如所指示，讀出為 T 細胞上表面活化標誌物之上調以及 T 細胞增生。
3.使用類似的設定，利用含有自體 T 效應細胞及表現 BCMA 及 GPRC5D 的 MM 靶細胞的未經處理之 MM 患者骨髓抽吸樣品來評定 BCMA-CD28 雙特異性抗體在 離體環境中存在 GPRC5D TCB 的情況下的功能活性。 4.1 T 細胞活化－ Jurkat IL2 報道細胞 活體外測定
Jurkat IL2 報道細胞測定用於討論不同 BCMA-CD28 雙特異性抗體在藉由 GPRC5D TCB (P1AE6625) 活化後如何共刺激 T 細胞。測定已依如下所描述進行：
細胞培養物：將 NCI-H929 細胞在補充 10% FCS (PAN-biotech)、2 mM L-麩醯胺酸 (Sigma-Aldrich)、1 mM 丙酮酸鈉 (Thermofisher) 及 50 μM 2-巰基乙醇 (Thermofisher) 的 RPMI1640 (Gibco) 中培養。將細胞每週培養兩次，以維持密度在 0.5 與 2.0 x10 6個細胞/ml 之間。將 Jurkat IL2 報道細胞及 Jurkat NF-κB/4-1BB 報道細胞株在補充 10% FCS、25 mM HEPES (Thermofisher)、2 mM L-麩醯胺酸、0.1 mM 非必需胺基酸 (Thermofisher) 及 1 mM 丙酮酸鈉的 RPMI1640 培養基中生長。此外，對於 Jurkat IL2 報道細胞株，培養基補充有 200 µg/ml 之潮黴素 B (Roche)，而對於 Jurkat NF-κB/4-1BB 報道細胞株，培養基補充有 400 µg/ml 之潮黴素 B 及 600 µg/mL 之遺傳黴素 (geneticin) (Sigma-Aldrich)。將 Jurkat 細胞每週培養兩次，以維持密度在 0.1 與 0.5 x10 6個細胞/ml 之間。
收穫靶細胞 (NCI-H929) 及效應細胞 (Jurkat IL2 報道細胞) 並重懸於測定培養基 (不含抗生素的 Jurkat 細胞培養基) 中，以獲得細胞密度為 6 x10 6個細胞/ml 的靶細胞及細胞密度為 3 x10 6個細胞/ml 的效應細胞。然後將細胞以 E:T 1:2 之比率混合，並將 20 μl 之效應細胞-靶細胞混合物鋪到白壁 384 孔平底平盤 (Falcon™ 384 孔白色平底組織培養微盤) 的每孔中。接下來，將 10 μl 之滴定量 (200.0 至 0.05 nM) 的 BCMA-CD28 雙特異性抗體 (BsAb) 添加至平盤，一式三份。此外，將 10 μl 之固定濃度 (2000、200 或 20 pM) GPRC5D-TCB 添加至平盤，達到每孔 40 μl 之最終體積。此外，還準備三種單獨的對照條件，其中僅含靶細胞及效應細胞，以便指示在無刺激的情況下效應細胞誘導的 IL2 傳訊。將具有 BCMA-CD28 BsAb 但不具有 GPRC5D-TCB 的靶細胞及效應細胞添加在一起，以解決在沒有第一訊號的情況下效應細胞之非特異性活化。製備具有 GPRC5D-TCB (2000、200 或 20 pM) 且不具有 BCMA-CD28 BsAb 的最後對照細胞、靶細胞及效應細胞，以指示效應細胞訊號中 IL2 傳訊之基線。使用測定培養基達到對照孔的最終體積 (40 μl)。將測定平盤以 350 g 離心 1 min，並在加濕的 CO 2孵化箱中於 37℃ 孵化 24 小時。將測定平盤於室溫 (RT) 孵化 5 min，然後添加 20 μl 之 ONE-Glo 溶液 (Promega)。此外，將平盤以 350g 離心 1 min，並於室溫避光孵化 10 min 以實現細胞之完全溶解。藉由以下測量發光 (讀取：每孔 1 秒)：使用 Tecan Spark10M。
簡而言之，將表現高位準之 BCMA 的靶 NCI-H929 細胞株以 1:2 (E:T) 比率與以 IL2 啟動子依賴性方式表現螢光素酶之效應 Jurkat IL 2 報道細胞株混合。然後，將滴定的 (200.0 至 0.04 nM) BCMA-CD28 BsAb 及 (2000、200 或 20 pM GPRC5D-TCB 一起添加，並在 24 小時後測量發光。結果顯示，所有經測試之 BCMA-CD28 BsAb (包括 CD28 抗體 v8 或 v15) 以劑量依賴性方式誘導 T 細胞之共刺激 ( 圖 4A 至 4F)。一般來說，針對 CD28 v15 的兩種變異體 P1AG7200 及 P1AG7282 以及針對 CD28 v8 的兩種變異體 P1AG7215 及 P1AG7282 優於其他變異體且與先前技術分子 P1AE9053 (BCMA(PR)-CD28 v15) 及 P1AF7062 (BCMA(PR)-CD28 v8) 同樣出色地共刺激 T 細胞 ( 圖 4A 至 4C)。資料針對圖 4A 至 4C 中的先前技術分子 P1AE9053 及 圖 4D 至 4F中的 P1AF7062 標準化，且將 GPRC5D-TCB 誘導的訊號作為底物。在 表 18中將獲得的資料顯示為三個獨立實驗中的一式三份地進行的一個獨立實驗之均值 ± s.d.。 表 18 ：如在 Jurkat IL2 報道細胞測定中測量的 T 細胞活化的 EC50 值 (nM) 及 Emax (%)
TaPIR ID EC 50(nM) 功效 (Emax(%))
GPRC5D-TCB 2000 pM GPRC5D-TCB 200 pM GPRC5D-TCB  20 pM GPRC5D-TCB  2000 pM GPRC5D-TCB 200 pM GPRC5D-TCB 20 pM
P1AG7200 3.78 4.299 5.309 116.6 108.6 93.9
P1AG7196 3.916 5.75 5.459 84.55 76.2 78.09
P1AG7285 5.551 6.536 6.667 106.3 97.08 88.55
P1AG7153 9.526 5.233 4.473 126.6 90.61 83.69
P1AE9053 2.228 3.144 2.402 103.7 100 104.4
P1AG0760 15.01 7.086 3.986 37.79 32.66 27.97
P1AG7215 7.765 7.691 6.783 138.3 126.5 102.9
P1AG7207 15.95 17.1 14.8 109.9 101.5 102.8
P1AG7191 10.02 10.09 9.513 122.7 117.1 97.52
P1AG7282 9.526 10.92 10.76 116.8 113.3 106.7
P1AF7062 3.945 4.958 4.549 113.8 114.5 115.1
P1AF8794 179.5 463.8 236.1 29.86 50.59 35.67
圖 5A至 5D顯示從 Jurkat NFkB 報道細胞測定獲得的資料之總結。分別相較於非靶向的 CD28 對照 P1AG0760 及 P1AF8794，圖 5A 比較各種 BCMA-CD28 (v15) BsAb 的 EC 50值，而圖 5B 比較其功效，且圖 5C 比較各種 BCMA-CD28 (v8) BsAb 的 EC 50值而圖 5D 比較其功效，並由一式三份進行的三個獨立實驗計算得出。根據以不同濃度 (20, 200 或 2000 pM) 之 GPRC5D-TCB 進行之實驗將圖 5A 及 5C 之 EC 50資料加在一起，且針對功效資料亦如此應用。所有資料均顯示為均值 ± s.d.。藉由 ANOVA 及 Tukey 多重比較校正對資料進行分析。星標指示 p＜0.05 (*)，p＜0.001 (***) 且 p＜0.0001 (***)。
總之，對於所有 BCMA-CD28 bsAb 觀察到對 GPRC5D-TCB 媒介的 T 細胞 (Jurkat IL2 報道細胞) 活化的強烈促進。沒有觀察到功效 (Emax) 及 EC 50值之顯著差異。整體而言，效率 (Emax) 及 EC50 值處於相似的範圍內，不同之處為 P1AG7207 在效力上顯著小於 P1AF7062。 4.2 在存在表現 BCMA 的 MM 細胞株的情況下 PBMC 共培養測定
為了評定 BCMA-CD28 bsAb 在存在表現 BCMA 的細胞的情況下在 PBMC 共培養測定中起作用的能力，執行以下方法。
靶細胞：NCI-H929 及 NCI-H929 BCMAko，分別如圖所指示。
NCI-H929 (ATCC® CRL-9068™) 為表現 BCMA 的人多發性骨髓瘤細胞株。為了評定 BCMA-CD28 BsAb 之潛在標靶獨立性活性，還測試 NCI-H929 細胞株之 BCMA 剔除變異體 (使用 CRISPR/Cas9 技術產生)。將細胞在補充以下的 RPMI 1640 (Gibco™ 31870074) 中培養：10% FCS (Gibco™ 16140-071)、10 mM HEPES (Gibco™ 15630056)、2 mM GlutaMAX-I (Gibco™ 35050-038)、1 mM 丙酮酸鈉 (Gibco™ 11360039) 及 50 μM 2-巰基乙醇 (Gibco™ 31350010)。藉由添加新鮮培養基將細胞每週傳代 2 至 3 次以維持 0.5x10 6/ml 與 2.5x10 6/ml 之間的密度。將細胞於 37℃ 以 5% CO 2孵化。在測定當天，收穫靶細胞，計數並重懸於測定培養基 (RPMI 1640 w/ HEPES、w/GlutaMax Gibco™ 31870074 加 10% FCS) 中，以獲得細胞密度 1.2 x10 6個細胞/ml。
效應細胞：PBMC
來自 CPD 中的人類全血的冷凍人類週邊血單核細胞 (PBMC) 係獲自 Cambridge bioscience。將 PBMC 儲存在氮蒸氣相中並在測定當天解凍。對細胞進行計數，且然後用細胞增生染料 eFluor™ 450 (65-0842-90，eBioscience™) 進行標記。簡言之，將 PBMC 以 DPBS (Gibco) 洗滌一次，棄去上清液並使用 DPBS 將細胞重懸至每孔 2 Mio 個細胞。將 10 ml 之細胞懸浮液添加至 50 ml-falcon 管，然後添加 10 ml 之 10 μM 濃縮細胞增生染料 eFluor™ 450，同時小心進行渦旋 (最終染料濃度為 5 μM)。於 37℃ 孵育 10 min (水浴) 後，提那家 30 ml 之冷測定培養基。將細胞離心、計數並重懸於測定培養基中以獲得 1.2 x10 6個 PBMC/ml 之細胞密度。
共培養物之製備
將 50 μl (0.06x10 6) NCI-H929 或 NCI-H929 BCMAko 細胞及 50 μl (0.06x10 6PBMC) 鋪在 96 孔圓底平盤 (TPP) 的每個孔中，得到 1:1 比率。接下來，將 50 μl 之滴定量 (0.12 至 500 nM) 的 BCMA-CD28 雙特異性抗體 (BsAb) 添加至平盤，一式三份。此外，將 50 μl 之固定濃度 (0.32 pM) GPRC5D-TCB (P1AE6625) 添加至平盤，達到每孔 200 μl 之最終體積。此外，準備三种單獨的對照條件。添加具有 BCMA-CD28 BsAb 且不具有 GPRC5D-TCB 的靶細胞及效應細胞，以解決在沒有第一訊號的情況下 CD28 雙特異性分子對效應細胞的潛在活化。在另一對照中，將靶細胞及效應細胞單獨用 GPRC5D-TCB 處理以指示基線。最後，製備具有靶細胞及效應細胞的其中不添加抗體的對照 (未處理)。使用測定培養基達到對照孔的最終體積 (200 μl)。將測定平盤以 350 g 離心 1 min，並在加濕的 CO 2孵化箱中於 37℃ 孵化 4 天。
FACS 染色及讀出
孵化後，對細胞進行染色以評估 T 細胞活化及增生。先用 200 μL PBS 洗滌細胞一次，然後用 LIVE/DEAD™ 可固定近紅外線死細胞染色劑 (1:500) (ThermoFisher Scientific Catalog No. L34976)、FITC 抗人 CD4 (殖株 RPA-T4)、BV711 抗人 CD8 (殖株 RPA-T8)、APC 抗人 CD25 (殖株 BC96)、PerCP-Cy5.5 抗人 CD137 (殖株 4B4-1) 在 PBS 中於 4℃ 染色 30 min，該染色劑及該等殖株皆來自 BioLegend。流式細胞術採集在客製化設計的 BD Biosciences Fortessa 上進行，並使用 FlowJo 軟體 (Tree Star，Ashland，OR) 及 GraphPad Prism 軟體進行分析。
結果
如 圖 6A及 6B、圖 7A及 7B、圖 8A及 8B以及圖 9A及 9B所示，所有 BCMA-CD28 雙特異性抗體都能夠在存在表現 BCMA 的靶細胞及由低濃度之 GPRC5D-TCB 提供的第一訊號 ( 圖 6A、 7A、 8A及 9A) 的情況下顯著促進 CD8 +及 CD4 +T 細胞之活化 (CD25 上調) 以及 CD4 +T 細胞之增生。在所測試之濃度 (500 nM 及更低) 下，在沒有第一訊號/TCB 的情況下，BCMA-CD28 分子均不誘導 T 細胞活化。此外，在不存在表現 BCMA 的標靶的情況下，在高達 125 nM 的濃度下，對 T 細胞的 TCB 媒介的活化不存在促進 ( 圖 6B、 7B、 8B及 9B)。在不存在標靶表現的情況下，只有分子 BCMA(PR)-CD28 v15 導致 對TCB 媒介的 T 細胞活化及增生的促進，因此能夠實現標靶獨立性活化，如 圖 8B及 9B所展示。
表 19 至 22 總結來自 圖 6A至 9A所示資料的 EC 50值，以及最大值。EC 50值使用 GraphPadPrism6 來計算。 表 19：EC 50值 (nM)：CD28 v8 雙特異性抗體與 BCMA (PR)-CD28 雙特異性抗體
讀出 供體 TCB + P1AE9053 (BCMA PR- CD28 v15) TCB + P1AF7062 (BCMA PR – CD28 v8) TCB + P1AG7215 TCB + P1AG7191 TCB + P1AG7282 TCB + P1AG7207
CD8 CD25 MFI 1 2.867 - ~ 3.932 6.404 8.506 15.98
2 ~ 2.067 ~ 2.301 6.085 6.689 10.66 ~ 8.769
3 0.6776 - 10.18 6.601 36.49 76.18
CD4 CD25 MFI 1 3.546 - 9.212 12.07 20.25 29.45
2 ~ 2.327 6.072 ~ 8.224 10.65 25.78 19.4
3 6.819 - 20.19 ~ 12.74 61.83 171
增生的 CD4 的 % 1 4.579 - 8.331 7.147 21.48 21.89
2 2.428 4.297 6.237 6.367 14.72 17.34
3 4.856 - 10.72 10.82 19.65 23.65
表 20：EC 50值 (nM)：CD28 v15 雙特異性抗體與 BCMA (PR)-CD28 v15 雙特異性抗體
讀出 供體 TCB + P1AE9053 TCB + P1AG7200 TCB + P1AG7285 TCB + P1AG7153 TCB + P1AG7196
CD8 CD25 MFI 1 2.809 3.362 4.641 2.044 5.901
2 ~ 2.110 2.582 4.427 3.931 13.99
3 0.6776 2.221 3.217 2.834 4.53
CD4 CD25 MFI 1 12.25 13.51 25.08 19.17 42.54
2 ~ 2.354 5.447 7.171 13.38 29.4
3 6.819 8.932 15.72 17.63 35.45
增生的 CD4 的 % 1 8.703 7.26 13.49 16.14 ~ 30.54
2 ~ 2.068 3.191 3.451 4.647 4.504
3 4.856 5.991 8.782 7.147 7.694
表 21：最大值：CD28 v8 雙特異性抗體與 BCMA (PR)-CD28 雙特異性抗體
讀出 D TCB + 陰性參照 = 基線 TCB + P1AE9053 TCB + P1AF7062 TCB + P1AG7215 TCB + P1AG7191 TCB + P1AG7282 TCB + P1AG7207
CD8 CD25 MFI 1 1793.7 3642.7 5091.7 4745.3 4322.3 4805.3
2 1342.3 3802.0 3329.7 4110.3 3894.0 3750.3 3396.3
3 1746.7 4226.3 5408.0 5295.0 5386.7 4731.0
CD4 CD25 MFI 1 906.3 20206.0 18163.0 18782.3 17380.3 16616.3
2 532.3 8432.0 6682.0 9113.0 8517.0 7732.7 6360.0
3 762.7 15970.0 15645.7 13388.7 10927.3 10413.0
增生的 CD4 的 % 1 25.3 62.2 53.7 52.9 52.5 49.2
2 25.0 77.4 66.5 74.2 72.1 67.4 70.9
3 11.6 72.0 69.6 65.6 54.4 47.2
D = 供體 表 22：最大值：CD28 v15 雙特異性抗體與 BCMA (PR)-CD28 v15 雙特異性抗體
讀出 Dr TCB + 陰性參照 = 基線 TCB + P1AE9053 TCB + P1AG7200 TCB + P1AG7285 TCB + P1AG7153 TCB + P1AG7196
CD8 CD25 MFI 1 2417.0 4161.7 6687.0 6209.7 6260.0 5302.3
2 1463.3 4355.0 6866.0 6373.7 5870.7 7672.3
3 1802.7 4226.3 4596.3 5628.7 3828.7 4841.7
CD4 CD25 MFI 1 1818.3 22987.0 26055.7 26108.3 21489.3 21039.7
2 916.0 10323.7 15332.0 13679.3 11074.7 14977.7
3 856.0 14952.0 16520.3 16434.3 10682.3 12738.7
增生的 CD4 的 % 1 24.2 60.5 49.6 49.1 46.3 46.9
2 22.9 61.5 59.5 58.8 57.1 48.9
3 13.5 72.0 64.3 64.0 55.8 53.2
D = 供體 4.3 靶向 EpCAM 的雙特異性 CD28 促效的抗原結合分子的 離體功能性表徵
在萃取後 48 小時內獲得的肝素化原發性 MM 患者骨髓抽吸 (BMA) 樣品中，測試雙特異性 BCMA-CD28 抗體與 GPRC5D-TCB 在組合療法中的治療功效。
藉由流式細胞分析技術分析基線處的細胞量、其活力及表型以及病態 MM 漿細胞之百分比。接下來，將至少 10 萬個 MM 漿細胞 (MM PC) 接種在 24 或 48 孔平盤中。單獨地或與增加劑量之不同 BCMA-CD28 雙特異性抗體組合地測試固定濃度之 GPRC5D-CD3 雙特異性分子 (GPRC5D-TCB，如圖所示的 1 或 10 nM)。作為陰性參照，添加 TCB 同型，分別為非靶向的 CD28 分子。96 小時後，將細胞轉移至 15 ml falcon 管中。添加無菌 PBS 至 1 mL。根據標準方法，將細胞以 540 g 離心 5 min，並使紅血球溶解 15 分鐘。將細胞以 800 g 離心 10 分鐘，用無菌 PBS 洗滌一次，並於室溫與馬來亞醯胺一起孵化 20 分鐘，以對死細胞與活細胞進行染色。用 12 ml PBS (包括 0.09% NaN 3及 0.5% BSA) 洗滌細胞以去除未結合的馬來亞醯胺。此後，將細胞沉澱重懸於 500 μL PBS 中，並透過帶有細胞過濾器蓋的 5 ml 聚苯乙烯圓底管過濾，以丟棄細胞凝塊並去除潛在的膜聚集體。將細胞再次以 540 g 離心 5 分鐘。最後，對照不同表面標誌物用所指示抗體於室溫避光下將細胞染色 20 min ( 表 23及 表 24)，如上文所描述進行洗滌並重懸於無菌 PBS 中。總樣品藉由流動獲取。 表 23 ：用於分析預處理樣品的抗體組合
BB515 BB700 PE APC APCR700 APC/Cy7 BV421 BV480
CD38ME CYT-38F/CYT-38F2 Cytognos CD138 殖株 MI15 BD Bioscienes BCMA 殖株 19F2 Biolegend GPRC5D 來自 Roche 的殖株 CD56 殖株 N901 (NKH-1) BC CD45 殖株 2D1 Biolegend CD137 殖株 4B4-1 Biolegend CD3 殖株 SK7 BD Biosciences
BV605 BV650 BUV395 BUV496
4-1BBL 殖株 C65-485 BD Biosciences CD28 殖株 CD28.2 BD Biosciences HLADR 殖株 Tu39 BD Biosciences CD8 殖株 HIT8a BD Biosciences
表 24 ：用於判定 MM-PC 溶解及效應細胞活化的抗體組合
BB515 BB700 PE PE-CF594 APC PC7 APCR700 APC/Cy7
CD38ME CYT-38F/CYT-38F2, Cytognos CD138，殖株 MI15，BD Bioscienes CD127，殖株 A019D5，Biolegend CD57，殖株 NK-1，BD Biosciences CD25，殖株 2A4，BD Biosciences CD13，殖株 L138，BD Biosciences CD56 殖株 N901 (NKH-1), BC CD45，殖株 2D1，Biolegend
BV421 BV480 BV605 BV650 BUV395 BUV496
CD4 B49197 CD16， 殖株 3G8，BD Biosciences CD3 殖株 SK7，BD Biosciences PD1 殖株 EH12，BD Biosciences HLADR 殖株 Tu39，BD Biosciences CD14 殖株 MɸP9，BD Biosciences
在另一實驗中，如下文所描述，使用冷凍且解凍的原發性 MM 骨髓單核細胞 (BMMNC) 來測試雙特異性 BCMA-CD28 抗體與 GPRC5D-TCB 在組合療法中的治療功效。
第一天，將樣品解凍並重懸於 StemSpan SFEMII (StemCell) 培養基中，該培養基包括 20% 人血清、55 uM β-巰基乙醇 (Gibco 目錄編號 11528926)、以及 100 U/ml 青黴素及 100 µg/ml 鏈黴素 (Gibco，100x 儲備液)。將 3 Mio 個細胞鋪到包括 100 ng/mL 之重組人 IL-6 的 12 孔平盤的每個孔中，並於 37℃ 以 5% CO 2保存在孵化箱中持續 24 小時。
此後，收穫樣品並使用 0.1 Mio 個細胞進行基線表徵。將剩餘的細胞用無菌 PBS 洗滌兩次，並用 NIR 活/死染色劑染色，然後使用 FACS BD Aria 分選儀針對活力進行分選。將活細胞重懸於培養基中並將 0.1 Mio 個細胞鋪於 96 孔平盤的每個孔中。在不存在或存在所指示抗體的情況下，將細胞以每孔 150 uL 之總體積於 37℃ 以 5% CO 2孵化 96 小時。樣品用無菌 PBS 洗滌兩次並如下染色：首先，使用 NIR 染料 (ThermoFisher) 於室溫避光進行活/死染色 20 分鐘。一個洗滌步驟後，將人 TruStain Fcx Blocking 添加在 FACS 緩衝液 (含 2% 胎牛血清、1% 0.5M EDTA pH 8、0.25% NaN 3疊氮化鈉的 PBS) 中，並將細胞於室溫 (RT) 避光再孵化 10 分鐘，然後添加相應抗體混合物 (參見表 25)。
於室溫避光進行表面染色 20 分鐘。將細胞用 FACS 緩衝液洗滌一次，並在含有 2% 多聚甲醛 (PFA) 的 PBS 中於室溫避光固定 10 分鐘。將樣品用 FACS 緩衝液洗滌，重懸於 FACS 緩衝液中，並在添加計數小珠後藉由流式細胞分析技術進行分析來判定細胞之絕對數目。 表 25 ：用於進行基線表徵及效應細胞活化的抗體組合
基線組：
標記 螢光染料
hCD45 BUV395
T 細胞 CD3 BV510
CD8 BUV737
CD4 PerCPCy5.5
B 細胞 CD19 FITC
活化細胞/骨髓細胞 HLA-DR BV786
活化 T 細胞 4-1BB PE-Cy5
CD25 Pe-Dazzle594
CD28 BV650
CD69 PE-Cy7
多發性骨髓瘤 (+ 惡性程度) CD138 BV421
CD38 BV711
BCMA PE
GPR5CD AF647
NK 細胞/惡性細胞 CD56 BV605
活/死 NIR
同型組
標記 螢光染料
hCD45 BUV395
CD3 BV510
CD8 BUV737
CD4 PerCPCy5.5
CD19 FITC
同型 BV786
同型 PE-Cy5
同型 Pe-Dazzle594
同型 BV650
同型 PE-Cy7
CD138 BV421
CD38 BV711
同型 PE
同型 AF647/APC
CD56 BV605
活/死 NIR
活化組：
標記 螢光染料
hCD45 BUV395
CD3 BV510
T 細胞 CD8 BUV737
CD4 PerCPCy5.5
B 細胞 CD19 FITC
活化細胞/骨髓細胞 HLA-DR BV786
活化 T 細胞 4-1BB PE-Cy5
CD25 Pe-Dazzle594
CD28 BV650
CD69 PE-Cy7
PD-1 PE
CD39 APC
TIM-3 BUV615
多發性骨髓瘤 (+ 惡性程度) CD138 BV421
CD38 BV711
NK 細胞/惡性細胞 CD56 BV605
活/死 NIR
FACS 表面抗體係購自 BD Biosciences、Miltenyi 或 LuBiosciences，並根據製造商的建議使用。針對人 GPRC5D 的檢測試劑抗體由 Roche 生產。
結果： 圖 10及 表 26表明所有 BCMA-CD28 雙特異性抗體能夠顯著促進 CD8+ T 細胞之活化 (CD25 上調)，超過 GPRC5D 靶向型 CD3 接合物 (GPRC5D-TCB) 媒介的活化。200 nM 時最強的附加活化係由 BCMA-CD28 bsAb P1AG7215 誘導，其次係由 BCMA-CD28 P1AG7191 及 BCMA-CD28 P1AG7207 誘導。在存在 200 nM 之非靶向的 CD28 的情況下，沒有誘導超過 TCB 的活化，這表明 CD28 分子需要經由腫瘤抗原靶向型部分交聯才能具有活性。 表 26 ：如藉由流式細胞分析技術評定的，將原發性 MM BM 抽吸樣品與所指示分子一起孵化 96 小時後 CD8+ T 細胞上活化標誌物 CD25 之上調
治療 %CD25+ CD8+ T 細胞
未經治療 0.04
TCB 同型 0
僅 GPRC5D-TCB 26.66
GPRC5D-TCB + 非靶向的 CD28 25.24
GPRC5D-TCB + BCMA-CD28 P1AG7215 73.78
GPRC5D-TCB + BCMA-CD28 P1AG7207 38.26
GPRC5D-TCB + BCMA-CD28 P1AG7191 50.99
將樣品標準化為用 T 細胞雙特異性 (TCB) 同型對照 (TCB 同型 = 0) 處理的孔。
這亦可以用另一原發性 MM 患者 BM 抽吸樣品得到證實，如 圖 11及表 27 所描繪。在這裡，在存在 400 nM 之 BCMA 靶向型分子 P1AG7191 的情況下可以觀察到對 TCB 媒介的原發性惡性 MM 漿細胞之溶解的促進，但在存在非靶向的 CD28 的情況下則觀察不到。在存在 400 nM BCMA (PR)-CD28 v8 的情況下，除 TCB 媒介的原發性 MM 漿細胞之溶解以外，僅觀察到較小的附加效應，指示 BCMA-CD28 雙特異性抗體 7191 之 離體功效強於 BCMA (PR)-CD28 v8。 表 27 ：如藉由流式細胞分析技術評定的，將原發性 MM BM 抽吸樣品與所指示分子孵化 96 小時後對 MM 漿細胞溶解 (MM PC) 的誘導
治療 MM PC 溶解 %
未經治療 0
TCB 同型 14.57
僅 GPRC5D-TCB 77.12
GPRC5D-TCB + 非靶向的 CD28 P1AG8497 78.52
GPRC5D-TCB + BCMA-CD28 P1AG7191 84.12
GPRC5D-TCB + BCMA-CD28 P1AG7062 (先前技術，具有 CD28v8) 80.38
將樣品標準化至具有未經處理之 BM 抽吸樣品 (未經處理者 = 0) 的孔。
圖 12A至圖 12D及表 28 描繪在存在所指示 BCMA-CD28 雙特異性抗體的情況下但不存在非靶向的陰性參照的情況下 T 細胞活化的 BCMA 標靶依賴性上調 (CD4+ 或 CD8+ T 細胞上之 CD25) 以及超過 TCB 媒介的活化/去顆粒作用的 CD4+ 及 CD8+ T 細胞上之去顆粒作用標誌物 CD107 的增加。在 200 nM 下，BCMA-CD28 雙特異性抗體 P1AG7215 對 T 細胞的活化產生與 BCMA (PR)-CD28 v8 及 BCMA (PR)-CD28 v15 類似的效果，而 BCMA-CD28 P1AG7282 誘導稍微較更溫和之效果，超過 TCB 媒介的效果。此外，該實驗揭示由 200 nM BCMA-CD28 雙特異性抗體誘導的類似效果，該等效果僅在其 CD28 變異體中有所不同：CD28v8 (7062) 或 CD28v15 (9053)。CD4+ T 細胞上 CD107 之水準指示超過由 BCMA (PR)-CD28 v8 及 BCMA-CD28 P1AG7215 誘導的 TCB 的最強效果，其次為由 BCMA-CD28 P1AG7282 誘導的。在 CD8+ T 細胞上，只有 BCMA-CD28 P1AG7282 揭示超過由 TCB 誘導之水準的 CD107 之增加的水準。對 T 細胞活化 (CD25) 及去顆粒作用 (CD107) 的效果之間觀察到的差異可能基於彼等標誌物的不同動力學特徵。總體而言，資料顯示所有經評定之 BCMA-CD28 雙特異性抗體都能夠超過向 T 細胞提供第一個訊號的 TCB 進一步促進 T 細胞活化及去顆粒作用。 表 28 ：如藉由流式細胞分析技術評定的，將原發性 MM BM 抽吸樣品與所指示分子一起孵化 96 小時後 CD4+ 或 CD8+ T 細胞上活化標誌物 CD25 或去顆粒標誌物 CD107 之上調
治療 CD25 +CD4 +% CD25 +CD8 +% CD107 +CD4 +% CD107 +CD8 +%
無抗體 13.81 25.98 1.47 1.8
針對 TCB 的陰性參照 15.15 27.82 1.78 2.2
GPRC5D TCB 31.65 54.17 5 8.64
GPRC5D-TCB + 針對 CD28 雙特異性的陰性參照 31.88 50.15 4.43 9.21
GPRC5D-TCB + BCMA-CD28v15 (P1AE9053) 86.5 83.7 6.25 9.08
GPRC5D-TCB + BCMA-CD28v8 (P1AG7062) 85.89 86.6 8.44 8.77
GPRC5D-TCB + BCMA-CD28v8 (P1AG7215) 85.78 87 8.05 9.89
GPRC5D-TCB + BCMA-CD28v8 (P1AG7282) 75.38 77.06 7.65 11.63
另一系列實驗係使用原發性 MM 患者解凍後的 BM MNC 進行的。如 圖 13A及 13B以及 表 29所指示，在所有三個所評定之樣品中，BCMA-CD28 P1AG7191 超過 GPRC5D TCB 誘導惡性 MM 漿細胞之顯著溶解以及 CD25 陽性 CD8+ T 細胞之頻率的上調。由 TCB 以及由 GPRC5D TCB 與 BCMA-CD28 雙特異性抗體之組合誘導的最大效果在 MM 患者樣品之間存在差異，表明免疫細胞組成、效應細胞與靶細胞比率以及 T 細胞適應性可能影響整體結果。 表 29 ：如藉由流式細胞分析技術評定的，將原發性 MM BM MNC 與所指示分子一起孵化 96 小時後原發性惡性 MM 漿細胞之增加的溶解、CD8+ T 細胞上活化標誌物 CD25 之相應上調
MM BM MNC ， 供體 1 MM BM MNC ，供體 2 MM BM MNC ，供體 3
治療 活 MM 細胞 % CD8+ 上 CD25 之 % 活 MM 細胞 % CD8+ 上 CD25 之 % 活 MM 細胞 % CD8+ 上 CD25 之 %
未經治療 1 1 1 1 1 1
僅 GPRC5D-TCB 0.837306 10.14409 0.86115 11.36364 1.227273 1.020833
GPRC5D-TCB + P1AG7191 0.716062 16.65706 0.514727 41.02273 0.168182 18.89583
將樣品標準化至具有未經處理之 BM MNC (未經處理者 = 1) 的孔。 實例 5 靶向 BCMA 的雙特異性 CD28 促效的抗原結合分子的 活體內功能性表徵
本文所描述之功效研究旨在了解 BCMA-CD28 雙特異性抗體與抗 GPRC5D/抗 CD3 雙特異性抗體 (GPRC5D x CD3) 之組合的效力。
細胞培養物：將人 NCI-H929 細胞 (獲自 Roche Nutley) 在含有 10% FCS、2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES 及 1 mM 丙酮酸鈉的 RPMI1640 高葡萄糖培養基中培養 (37℃，5% CO 2)。為了產生荷瘤小鼠，將 50 微升細胞懸浮液 (2.5 x10 6個細胞) 與 50 µl 基質膠皮下地共同注射至經麻醉之人源化 NSG 小鼠之右腹中。
小鼠模型：人源化 NSG 小鼠由 Jackson Laboratories, Sacramento USA 提供。為了進行植入，動物經輻照 (140cGy) 並注射來自健康供體 (造血幹細胞；HSC) 的 CD34 +臍帶血細胞 (9x10 4個細胞)。收到動物之後，將動物飼養一周以適應新環境並進行觀察。根據約定的指南 (GV-Solas; Felasa; TierschG)，將小鼠維持在無特定病原體的條件下，使用 12 h 光照/12 h 黑暗之日循環。定期進行持續的健康狀況監測。實驗研究方案已經由地方政府審查並批准 (ROB-55.2-2532.Vet_03-20-170)。
隨機化及治療：當皮下腫瘤之腫瘤體積達到 200 mm³ 時，則基於腫瘤體積及體重將人源化小鼠隨機化為不同的治療群組 (n=10/群組)。所有抗體及媒劑 (組胺酸緩衝液) 每週一次靜脈 (i.v.) 投予。GPRC5D x CD3 處理後 48 小時 ( 圖 14A至 14F) 或 24 小時 ( 圖 15A至 15L 、圖 16A至 16G) 的時候注射共刺激分子。
動物之監測：每天對動物進行的臨床症狀控制及不良效應之檢測。每週兩次監測體重及腫瘤生長 (卡尺測量)。根據終止標準或在實驗結束時處死動物。
統計：坐標圖係使用 GraphPad prism 軟體生成。使用內部工具 DOPSa (基於軟體 R) 進行到事件的時間 (time-to-event) 分析。臨界腫瘤體積被選為最大觀察到的基線腫瘤體積加上基線腫瘤體積之標準差 (四捨五入至最接近的十之倍數)。使用對數秩檢定對研究組進行比較，且使用 Bonferroni-Holm 方法對多重檢定的 p 值進行校正。相較於對照群組 (GPRC5D x CD3)，p＜0.05 的顯著變化以星標表示 (* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001)。
GPRC5D x CD3 與 BCMA-CD28 之組合
為了將 GPRC5D x CD3 單一療法及與 BCMA-CD28 雙特異性抗體的組合進行比較，在人源化 NSG 小鼠中建立 NCI-H929 腫瘤並評估 活體內功效。結果顯示於 圖 14A至 14F中。總之，GPRC5D x CD3 單一療法 (1 mg/kg P1AE3357) 誘導中度且不均勻的腫瘤生長抑制 (圖 14B)。儘管在腫瘤生長抑制方面沒有觀察到統計學上的顯著差異，但 GPRC5D x CD3 與 P1AG7215 以及尤其與 P1AG7282 (10 mg/kg；GPRC5D x CD3 後 48 小時) 之組合似乎相比單一療法產生更均勻且總體更強的反應 (圖 14C 及 14D)。
在第二 活體內研究中，對不同劑量的 BCMA-CD28 雙特異性抗體 (P1AG7215：20 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg，以及 P1AG7200：20 mg/kg、10 mg/kg、2 mg/kg；GPRC5D x CD3 (P1AE3357) 後 48 小時且相較於 BCMA (PR)-CD28 雙特異性抗體 (P1AE9053：10 mg/kg 及 P1AF7062 10 mg/kg；GPRC5D x CD3 後 48 小時) 進行測試，測試其在與 GPRC5D x CD3 療法之組合中的共刺激功效。結果顯示於 圖 15A至 15L中。發現 P1AG7215 與 P1AG7200 之組合與 GPRC5D x CD3 協同作用並改善 NCI-H929 模型中的腫瘤生長抑制 (圖 15E 至 15J)。相較於包含先前技術 BCMA 抗體 PR 的 BCMA-CD28 雙特異性抗體，經評定之新穎 BCMA-CD28 雙特異性抗體之 活體內功效處於相似的範圍內。P1AG7215 (20 mg/kg，參見圖 15E) 及 P1AG7200 (20 mg/kg，參見圖 15H) 的治療群組在終止時顯示最低腫瘤體積。
在第三 活體內研究中，對高劑量的 BCMA-CD28 共刺激物 P1AG7207 及 P1AG7191 (20 及 30 mg/kg P1AG7207 以及 20 mg/kg P1AG7191；GPRC5D x CD3 P1AE3357 後 24 小時預定) 進行測試，其中每個治療群組 10 個動物。相較於 GPRC5D x CD3 單一療法，兩種分子皆誘導顯著的腫瘤生長抑制 ( 圖 16A至 16G 、表 31)。相較於 20 mg/kg 組合，更高劑量之 P1AG7207 誘導更多數目之反應者 (分別相較於 n=4 或 n=2，n=5) 且在終止時誘導總體更小的腫瘤體積 ( 表 30)。 表 30 ：終止時的腫瘤體積 (mm 3)
治療組 GPRC5D x CD3 (1 mg/kg) + P1AG7207 (20 mg/kg) GPRC5D x CD3 (1 mg/kg) + P1AG7207 (30 mg/kg) GPRC5D x CD3 (1 mg/kg) + P1AG7191 (20 mg/kg)
研究日 第 57 天 第 54 天 第 57 天 第 36 天 第 57 天
動物 X01 212.42 - 1.88 1368 -
動物 X02 539.02 - 2.36 - 9.19
動物 X03 271.66 - 14.27 - 1629.15
動物 X04 1285.3 - 229.83 - 964.48
動物 X05 37.49 - 390.77 - 1150.83
動物 X06 7.14 2516.09 - - 5.56
動物 X07 190.88 - 1082.47 - 1154.1
動物 X08 259.3 - 9.32 - 1429.73
動物 X09 5.36 - 540.65 - 207.35
動物 X10 303.14 - 222.87 - 988.44
表 31 ：組合群組相較於 GPRC5D x CD3 的 P 值
與 GPRC5D x CD3 之比較 P 值  顯著性
P1AG7207 (20 mg/kg) 0.0002 ***
P1AG7207 (3 0mg/kg) 0 ***
P1AG7191 (20 mg/kg) 0.006 **
在第四 活體內研究中，對 P1AG7191 以不同劑量 (40、10 及 1 mg/kg) 與 GPRC5D x CD3 (0.05 mg/kg P1AE6625) 之組合進行測試，並與 GPRC5D x CD3 單一療法以及與包含 BCMA 殖株 PR 的分子 P1AE9053 (10 mg/kg) 之組合進行比較。GPRC5D x CD3 後 24 小時的時候注射 P1AG7191 及 P1AE9053。GPRC5D x CD3 單一療法在 NCI-H929 模型中誘導強烈的腫瘤生長抑制 ( 圖 17A)。然而，腫瘤在第 4 個治療週期後開始復發 ( 表 31)。P1AG7191 之兩個最高劑量 (40 及 10 mg/kg) 延遲腫瘤復發的時間，且抑制腫瘤再生。實驗終止時 (第 64 天)，P1AG7191 40 mg/kg 及 10 mg/kg 組合群組中分別剩下 6 及 8 個反應者。在 GPRC5D x CD3 單一療法群組中以及在與 1 mg/kg P1AG7191 群組之組合中，僅剩下 2 個反應者。相較於 P1AG7191，分子 P1AE9053 顯示更低的組合效果，因為在終止時僅剩下僅 5 個反應者，且更多腫瘤在較早時間點逃脫 ( 表 32)。 表 32 ：腫瘤逃脫時間點
組 無反應 第 4 個週期後 第 5 個週期後 第 6 個週期後 第 7 個週期後 緩解者
GPRC5D x CD3 (0.05 mg/kg) 4 4 4 1 2
GPRC5D x CD3 (0.05 mg/kg) + P1AG7191 (40 mg/kg) 2 3 2 3 5
GPRC5D x CD3 (0.05 mg/kg) + P1AG7191 (10 mg/kg) 1 3 3 1 7
GPRC5D x CD3 (0.05 mg/kg) + P1AG7191 (1 mg/kg) 1 1 10 2
GPRC5D x CD3 (0.05 mg/kg) + P1AE9053 (10 mg/kg) 1 7 1 1 5
總而言之，從此等 活體內研究獲得的結果提供臨床前證據，表明 可藉由 BCMA-CD28 雙特異性抗體增強對 GPRC5D x CD3 之治療反應。 實例 6 靶向 BCMA 及 CD28 的雙特異性抗原結合分子之藥理性質 6.1 huFcRn 基因轉殖小鼠之 PK 性質
攜帶人 FcRn 而非小鼠 FcRn 的基因轉殖小鼠被認為比野生型小鼠 (C57/Bl6) 更能預測人類至的清除率。雌性 huFcRn Tg32 純合子 SCID 小鼠 (n = 3) 接受 5 mg/kg 的單一 IV 推注劑量之 P1AG7207。雌性 huFcRn Tg32 純合子 BL6 小鼠 (n = 3) 分別接受 5 mg/kg 的單一 IV 推注劑量之 P1AG7282、P1AG7191 或 P1AG7215。在接受劑量後 0.17、7、24、48、72、168、336、408 及 504 小時的時候採集血液樣品，並在生物分析前處理成血清。使用抗人 FCpan (CH2) 或 kCH 捕獲及檢測試劑進行免疫測定來分析血清樣品。如 圖 18及 表 33所示，所有經測試之 BCMA-CD28 雙特異性抗體在此等小鼠品系中具有相似的血漿濃度-時間曲線及範圍在 4 至 7 mL/kg/天之間的清除率值。 表 33 ：hu FcRn 基因轉殖小鼠之藥動學資料
分子 Cmax (μg/mL) Tmax (小時) AUClast (天*μg/mL)
P1AG7215 102 0.167 686
P1AG7191 96 0.167 588
P1AG7207 128 0.167 893
P1AG7282 106 0.167 706
6.2 脫靶結合評定測定
細胞微陣列技術 (Charles River Laboratories) 用於篩選潛在的脫靶結合交互作用。針對與表現 6019 種個體全長人質膜蛋白及細胞表面栓繫的人分泌型蛋白以及另外 397 種人異二聚體的固定 HEK293 細胞的結合，對雙特異性 IgG1 抗體進行篩選。使用 ImageQuant 軟體 (GE Healthcare，版本 8.2) 來分析斑點細胞之螢光影像。
表 34將目視檢查斑點強度後的篩選的結果報告為強、中等、弱或無交互作用。 表 34 ：細胞微陣列檢測之結果
TAPIR ID BCMA 交互作用 CD28 交互作用 LDLR 交互作用 REN 交互作用
P1AE9053 強 強 沒有 弱/中等
P1AG7191 強 強 非常弱/沒有
P1AG7207 強 強 沒有
P1AG7215 強 強 培養基 沒有
P1AG7282 強 強 沒有 沒有
作為結論，所有抗體均顯示出與其主要標靶 (即 BCMA 及 CD28) 的強交互作用。P1AE9053 顯示出與 REN (腎素) 的額外交互作用。P1AG7191 及 P1AG7215 顯示出與 LDLR (低密度脂蛋白受體) 的非常弱或中等的交互作用。對於 P1AG7215 及 P1AG7282，沒有檢測到其他交互作用，指示這些分子對其主要標靶具有高特異性。 6.3 免疫原性測試 6.3.1 MAPPs 測定
MAPPs 測定用於鑑定來自以下四種 BCMA-CD28 雙特異性抗體的潛在 T 細胞表位：P1AG7191、P1AG7215、P1AG7207 及 P1AG7282 ( 圖 19)。主要組織相容性複合物 II (MHC-II) 相關肽蛋白質體學 (MAPP) 為基於質譜的方法，用以鑑定並相對定量經自然加工及呈現的 MHC-II 相關肽，這些肽可潛在地活化 T 細胞並有助於藥物之免疫原性。
人單核細胞衍生的 DC 之產生及測定程序：使用 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland) 藉由梯度密度離心從健康供體的膚色血球層分離週邊血單核細胞 (PBMC)。使用抗 CD14 包被的微珠及磁力分離器 (MACS, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany) 藉由陽性免疫選擇來分離單核細胞。然後將 CD14 +細胞以 0.3 × 10 6個細胞/mL 的濃度在 100 mm 超低附著培養皿 (Corning Inc.，Corning，NY，USA) 中在含有 1% GlutaMAX、1% 青黴素/鏈黴素的無血清 Cellgro 培養基中培養。於 37℃ 以 5% CO 2用 50 ng/mL GM-CSF 及 5 ng/mL IL-4 將單核球分化為未成熟 DC，持續 5 天，然後在存在 1 μg/mL 來自馬流產沙氏桿菌的脂多醣 (LPS) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland) 的情況下用 50 μg/mL 的測試蛋白進行攻擊持續 24 h。收穫成熟 DC，用磷酸鹽緩衝生理鹽水 (PBS) 洗滌，並在隨後的免疫沉澱之前將細胞沉澱冷凍於 -80℃。
HLA-DR 呈現的肽之分離：將細胞沉澱在含有 1% (v/v) Triton X-100 及蛋白酶抑制劑 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 的 20 mM Tris 緩衝溶液 pH 7.8 中在 ThermoMixer 上以 1100 rpm 於 4℃ 溶解 1 h。使用生物素結合的抗人 HLA-DR 抗體 (殖株 L243，RayBiotech) 藉由免疫沉澱來分離 HLA-DR 免疫複合物。將溶解物與抗體在旋轉器上於 4℃ 孵化過夜。將樣品用含有 20 mM N-(2-羥乙基)哌𠯤- N'-2-乙磺酸-NaOH (pH 7.9)、150 mM KCl、1 mM MgCl 2、0.2 mM CaCl 2、0.2 mM 乙二胺四乙酸鹽、10% (v/v) 甘油及 0.1% (v/v) 毛地黃皂苷的緩衝液洗滌五次，並用純化水洗滌五次。藉由添加 18 μL 0.1% 三氟乙酸，將 MHC-II 肽從 HLA-DR 分子中溶析兩次。收集溶析液並在質譜分析前保存於 4℃。
資料獲取：資料獲取及資料處理基本上如以下所描述進行：Steiner 等人J. Proteome Res.2020, 19, 3792-3806。每個樣品從約 3 × 10 6個人單核細胞衍生的 DC (moDC) 中獲得的 MHC-II 肽製劑係在奈米毛細管液相層析系統 (UltiMate 3000 RSLC，Thermo Scientific，CA，USA) 上使用自裝熔融石英 C18 反向管柱 (內徑 75 μm× 170 mm，ReproSil-Pur C18-AQ，3 μm，Dr. Maisch GmbH) 經由電噴霧電離 (LC-ESI-MS/MS) 來分離的，該管柱連接到 Q-Exactive HFX Orbitrap 質譜儀 (Thermo Scientific)。將樣品 (15 μL 體積溶解在 2% (v/v) 乙腈/水中的 0.5% (v/v) 甲酸中) 以 8 μL/min 負載到 Acclaim PepMap C18 捕獲管柱 (直徑 100 μm× 20 mm，Thermo Scientific) 上持續 2 至 3 min，該管柱使用通風三通設計。然後將肽使用 2% 至 45% B 之非線性 39 min 梯度以 250 nL/min 之流速溶析，之後進行 11 min 管柱洗滌，並重新平衡 10 min [緩衝液 A：2% (v/v) 乙腈/水中的 0.1% (v/v) 甲酸；緩衝液 B：乙腈中的 0.1% (v/v) 甲酸]。使用標準操作參數藉由串聯 MS 來分析 MHC-II 肽。在啟用鎖定質量選項的情況下，在 Orbitrap 質量分析儀中以 60,000 的解析度記錄檢查掃描 (掃描範圍 m/z 400 至 1650)。來自檢查掃描的 18 種最豐富離子的資料依賴型 MS/MS 譜圖以 15,000 的解析度記錄在 Orbitrap 池中。針對 MS/MS 選擇的靶離子被動態排除 7 s。使用當時可用的最新 PEAKS Studio 版本 (X Pro 版本，Bioinformatics Solutions Inc., ON, Canada) 對肽進行鑑定。對照人蛋白質資料庫 UniProtKB (http://www.uniprot.org，2015_10，大約 88,500 個 TrEMBL 及 SwissProt 條目，含有測試治療蛋白之胺基酸序列) 搜索原始 MS 資料，其中質量公差對於先質離子為 ±10 ppm，而對於碎片離子為 ±0.025 Da。Met-亞碸、Asn/Gln 脫醯胺基 N 端焦谷胺醯化被認為是差異修飾。在沒有酶特異性的情況下搜尋資料，且肽結果以 1% specFDR 截止值報道。給定供體的所有LC-MS/MS 運行均進行批量處理，並將鑑定特徵之曲線下面積 (2 min 滯留時間偏移容差；特徵報道選項：全部) 匯出到欄標定界的表中，無需進一步標準化。
統計學分析：DataMAPPs 為 Roche 創建的資料分析工具，用以幫助以熱圖的形式視覺化原本複雜的質譜衍生的資料。該程式可在 https://www.R-project.org/ 上公開獲取，且可以利用標準 R 安裝來執行。請參見參考文獻 (Steiner 等人，2020) 來了解該套件的詳盡描述。用 PEAKS 軟體處理 LC-MS/MS 資料並以合適的表格式匯出結果後，會調用 DataMAPPs。簡而言之，dataMAPPs 處理管線由以下組成：(1) 資料匯入及一致性檢查：將樣品註釋及肽定量 (PEAKS 輸出) 檔案讀入記憶體中並檢查一致性。僅考慮長度為 10 至 30 個胺基酸的肽進行分析，並對照所研究的生物製劑之序列進行映射。進行進一步過濾，以僅保留給定 LC-MS/MS 分析中所研究分子特有的抗體相關訊號。最後一步消除重複的條目，並對來自經鑑定具有不同電荷狀態的肽的訊號進行求和。在處理之前，峰面積將換算為 log2 尺度；(2) 資料 QC：管線對已鑑定肽數目較少 (截止值通常設定為相應供體的中位肽計數的一半) 或低相似性 (與來自同一供體的所有其他樣品的中值皮爾森相關性 ＜0.8) 的樣品加標誌。使用者可以在檢查一系列 QC 圖後修改截止值，這允許進行適當的、特定於資料集的處理，同時能夠以可再現的方式重新運行該程式；(3) 資料標準化：肽豐度 (基於峰面積) 基於 GRSN (全域等級不變集標準化) 程序的經調整版本進行標準化。(4) 重複聚合：可對技術重複 (即針對同一供體、相同處理、相同劑量運行的樣品) 求平均，以保留關於在重複中之至少一者中檢測到的所有肽的資訊；(5) 肽映射：將抗體相關肽映射到所測試生物製品的蛋白質胺基酸序列上。此外，將具有相鄰胺基酸位置的肽分箱到不同的表位簇 (熱點)，其豐度反映組成型 MHC-II 肽中之每一者的總強度；(6) 資料匯出及視覺化：dataMAPPs 工作流程包含產生若干個熱圖 (表位簇或單一肽水準、每個抗體或全域實驗總結) 的標準功能性，以實現快速視覺化及結果比較
結果：對 BCMA-CD28 雙特異性抗體 P1AG7191 之分析揭示三個結合簇。其中，一個簇 (C5) 含有非生殖系列殘基。儘管對於此簇頻率似乎較低 (1/12 供體)。總共 1/12 供體 (8.3%) 呈現可能有助於化合物之免疫原性的潛在免疫原性 T 細胞表位。
對 P1AG7215 之分析揭示一個不含有任何非生殖系列殘基的結合簇。因此，供體均不呈現可能有助於化合物之免疫原性的潛在免疫原性 T 細胞表位。
對 P1AG7207 之分析揭示三個結合簇。其中，兩個簇 (C1 及 C2) 包含頻率分別為 2/12 及 5/12 的非生殖系列殘基。總共 5/12 供體 (41.6%) 呈現可能有助於化合物之免疫原性的潛在免疫原性 T 細胞表位。
對 P1AG7282 之分析揭示三個結合簇。其中，一個簇 (C1) 含有非生殖系列殘基，同時頻率為 1/12 供體。總共 1/12 供體 (8.3%) 呈現可能有助於化合物的免疫原性的潛在免疫原性 T 細胞表位。 6.3.2 DC:T 細胞測定 ( 由 Lonza 開發的 Epibase® DC:CD4 再刺激測定 )
T 細胞活化為治療蛋白的免疫反應的重要組成部分，且通常是臨床開發抗藥物抗體所必需的。DC-T 細胞測定用於評定四種 BCMA-CD28 雙特異性抗體：P1AG7191、P1AG215、P1AG7207、P1AG7282 在藉由 APC 呈現 T 細胞表位後誘導 CD4 +T 細胞之能力。
材料：供體係在英國的第 I 期臨床試驗單位招募的。所有樣品均根據當地 REC (研究倫理委員會) 批准的倫理協定收集，並在樣品捐贈前獲得每個供體的書面知情同意。所有樣品均根據 Lonza 的 HTA (人體組織管理局) 研究中使用樣品許可證的條款進行儲存。來自健康供體的 PBMC 係在抽血後六小時內用全血製備的。將細胞冷凍保存在氣相氮中直至用於測定。藉由用諸如 KLH 的陽性對照活化七天來分析每種 PBMC 製劑的品質及功能性，以評定天然 T 細胞反應。
匙孔帽貝血藍蛋白 (KLH) 用為技術對照，根據製造商的建議在無菌條件下以單次使用等分試樣於 -80℃ 下復原並儲存。另外，貝伐珠單抗 (bevacizumab) (Avastin®) 亦被列為陽性基準蛋白。所有樣品均以 0.3 μM 之終濃度進行 DC 刺激階段及 APC 再刺激階段的測試。
方法：藉由磁珠選擇從冷凍的 PBMC 樣品中分離單核球，並使用 GM-CSF 及 IL-4 分化為未成熟的 DC (iDC)。然後收穫、洗滌 iDC，並於 37℃ 負載每個單獨的測試蛋白/肽持續 4 小時。然後添加含有 TNFα 及 IL-1β 的 DC 成熟混合物再持續 40 至 42 小時以使 DC (mDC) 活化/成熟。藉由流式細胞分析技術評定未成熟階段及成熟階段兩者時關鍵 DC 表面標誌物 (CD11c、CD14、CD40、CD80、CD83、CD86、CD209 及 HLA-DR) 之表現，以確保 DC 在 T 細胞交互作用之前活化。然後將 mDC 與自體 CD4 +T 細胞 (藉由磁珠選擇分離) 於 37℃ 以 5% CO 2在加濕氣氛中共培養 6 天。在第 6 天，使用磁珠選擇從 PBMC 分離自體單核球，並負載初始用於負載 DC 的所選擇蛋白質/肽。於 37℃ 以 5% CO 2在加濕氣氛中孵化 4 小時後，將單核球添加至抗 IFNγ 預包被的 FluoroSpot 平盤 (Mabtech) 中，並進行對於的 DC:CD4 共培養，一式四份。將 FluoroSpot 平盤於 37℃ 以 5% CO 2在加濕氣氛中孵化 40 至 42 小時。孵化後，使用內部程序開發 FluoroSpot 平盤，並在每種測試條件下針對每種細胞激素進行每孔點形成細胞 (SFC) 評定。
在未成熟階段及成熟階段兩者時對單核球衍生的 DC 進行表面標誌物 QC 檢查，以評定測試產品對 DC 分化的任何可能影響，並允許在隨後與 CD4+ T 共培養之前評定 DC 之品質。使用經螢光標記之抗體及 Guava® easyCyte™ 8HT 流式細胞儀藉由流式細胞分析技術來判定表面標誌物。
資料分析：資料管理及統計分析已用R程式語言進行的 (https://www.R-project.org/，v. 3.6.1)。資料換算為 log2 尺度，並應用廣義線性模型 (GLM) 來定量 SI (倍數變化及 95% CI)。對資料集進行調整 (調整的指數型異方差性、SFU 量表之低端的高斯雜訊注入、每個 SI 的線性迴歸及外推至空白值 0) 並產生 QC 圖 (DC 分化標誌物、化合物及供體水準之再現性、供體之相對刺激)。
為了幫助進行免疫原性風險評定，針對每個供體的每種測試條件計算刺激指數 (SI) (SFU/孔與匹配空白之間的比率)。如果建立至少2倍的SI變化且 p＜0.05 (GLM 的未調整 p 值)，則算作陽性供體反應。30 個健康供體的分群中對治療的積極供體反應的數目給出相對於此治療的反應率。
結果：此測定中使用的 DC 品質高，並且表現高水準之 T 細胞之活化所需的 T 細胞共刺激分子。基於 DC-T 細胞測定之讀出，所有四種 BCMA-CD28 雙特異性抗體 P1AG7191、P1AG215、P1AG7207 及 P1AG7282 均與 CD4 +T 細胞反應的較低的序列相關免疫原性風險 (低於 10% 之閾值，如 Siegel 等人，Pharmaceutics 2022, 14(12), 2672 所描述) 相關聯。 6.3.3 免疫原性之綜合風險
投予治療性抗體可能導致抗藥物抗體 (ADA) 之形成，這可能對治療結果之安全性產生負面影響 (例如，過敏反應、免疫複合物媒介的疾病)。透過如之前本文所描述的非臨床測定 (MAPPs 及 DC-T 細胞測定) 之組合評定四種 BCMA-CD28 雙特異性抗體 P1AF7191、P1AF215、P1AF7207 及 P1AF7282 誘導意外免疫反應之風險以及此等反應之後果。整體而言，BCMA-CD28 雙特異性抗體可依免疫原性最低至最高風險排名如下：P1AG215、P1AG7191、P1AG7282 及 P1AG7207。 6.4 活體外人全血測定中對細胞激素釋放風險的評估
為了評估與人體首次給藥時的細胞激素釋放相關的潛在安全風險，使用來自健康供體的新鮮未稀釋人全血樣品對由 BCMA-CD28 雙特異性抗體媒介的細胞激素分泌進行 活體外非 GLP 測試。Erbitux® (抗 EGFR IgG1 mAb) 用作陰性比較物，Lemtrada® (人源化抗 CD52 IgG1，已知會在大於 90% 之接受者中誘導首次輸注反應 (IRR)) 用作陽性比較物。
將來自 6 個健康供體的靜脈血液收集在具有肝素鋰作為抗凝劑的真空採血管 (Roche Infirmary Services, Switzerl 及 Roche) 中，並於室溫保存，直到測定起始，該起始是在抽血後 3 小時內。將 195 μl 之全血添加至圓底 96 孔平盤中的測試物品 (體積 5 μL，一式三份)，之後於 37℃ 以 5% CO 2孵化 24 小時。藉由以 1800 g 離心 5 min 來分離細胞及血漿，並將血漿樣品 (體積 70 μL) 於 -80℃ 儲存直至分析細胞激素含量。
所有化合物均以 0.1、1、10 及 100 μg/mL 之濃度進行測試。此外，PBS (杜爾貝科磷酸緩衝生理鹽水，Gibco No.14190，技術陰性對照) 及濃度為 0.1 μg/ml 的 LPS (源自流產沙門氏桿菌的脂多醣，Sigma, Product.編號 L5886，技術陽性對照) 亦包括在測定中。
細胞激素分析：對以 1:5 稀釋的冷凍血漿樣品進行細胞激素濃度之判定。預測試揭示，新鮮樣品與解凍樣品之間的細胞激素水準沒有差異。使用人細胞激素化學發光測定套組 (Aushon Ciraplex，目錄編號101-269-1-AB) 藉由 ELISA 判定分析物濃度，該套組具有 SignaturePLUS™ 成像系統及 Cirasoft 分析軟體。結果以 pg/ml 表示。高於 ULOQ 濃度的值被如下分配最高標準之濃度：IFN-γ，500 pg/mL；IL-2，200 pg/mL；IL-6，2000 pg/mL；IL-8，4000 pg/mL；TNF-α，1000 pg/ml。低於 LLOQ 濃度的樣品值被分配 LLOQ 濃度：IFN-γ，0.24 pg/mL；IL-2，98 fg/mL；IL-6，0.98 pg/mL；IL-8，1.95 pg/mL；TNF-α，0.49 pg/mL。
以 JMP 12.1.10 軟體 (SAS Institute AG) 使用以下進行統計分析：客製化腳本 (Sabine Wilson，PS BiOmics/Pathology)，用於資料匯入、描述性分析、複製及樣品異常值去除、切點判定以及視覺化結果 (頻率及比率圖)。PBS 資料用於判定群體分佈、技術背景、每種細胞激素的決策極限 (Lc) 以及統計異常值之識別。Lc 表示細胞激素訊號，對於該細胞激素訊號，預計實際陰性 (類似 PBS) 樣品只有 5% 的機會超過此值。Lc 值係基於來自健康供體的 PBS 樣品判定的。換言之，真實空白呈現 ＞ Lc 訊號的機會為 5%。為了將測試物品與臨床上充分表徵的對照 Erbitux® 進行比較，基於 Erbitux® 誘導的值之分佈來計算每種濃度及細胞激素的截止值。這是藉由測量的 Erbitux® 值的 95% 分位數方法來完成的。因此，來自「陰性」樣品的值有 5% 的機會超過此等截止值。
雖然 BCMA-CD28 雙特異性抗體 P1AG7215 及 P1AG7062 沒有觸發任何高於 Erbitux® 媒介的水準的細胞激素釋放，但在 50% 之供體中，分子 P1AE9053 (BCMA (PR)- CD28 v15) 觸發 IL-6 及 IL-8 之釋放。 ***
在 圖 1A 至 1C中示出如本文所述的例示性分子之示意圖。 圖 1A顯示作為單價 hu IgG1 PGLALA 同型 (「Fc沉默」) 的 CD28 促效的抗體變異體的示意圖。 圖 1B顯示 1+1 型式的雙特異性 BCMA-CD28 抗原結合分子，其中在包含 CD28 抗原結合域的 Fab 分子中，VH 域及 VL 域係彼此互換 (VH/VL crossfab)，且其中在包含 BCMA 抗原結合域的 Fab 分子中，CH1 域及 CL 域中的某些胺基酸係經互換 (荷電變異體) 以允許與輕鏈更好地配對。 圖 1C顯示 1+1 型式的雙特異性 BCMA-CD28 抗原結合分子，其中在包含 BCMA 抗原結合域的 Fab 分子中，VH 及 VL 域彼此互換 (VH/VL crossfab)，且其中在包含 CD28 抗原結合域的 Fab 分子中，CH1 及 CL 域中的某些胺基酸係經互換 (荷電變異體) 以允許與輕鏈更好地配對。 圖 2A及 圖 2B顯示各種 BCMA-CD28 雙特異性抗原結合分子與表現 CD28 的 CHO 細胞 (CHO-k1-huCD28 細胞) 的結合。藉由流式細胞分析技術所評定，所有 BCMA-CD28 雙特異性抗原結合分子都能夠以濃度依賴性方式與 CHO-k1-huCD28 細胞上的人 CD28 結合。然而，由於低親和力結合物，與人 CD28 之結合並未達到飽和，且分別在 CD28v8 雙特異性抗體 ( 圖 2A) 及 CD28v15 雙特異性抗體 ( 圖 2B) 當中為相當的。 圖 3A及 圖 3B顯示各種 BCMA-CD28 雙特異性抗原結合分子與表現 BCMA 的 CHO 細胞 (CHO-huBCMA 細胞) 的結合。藉由流式細胞分析技術所評定，所有 BCMA-CD28 雙特異性抗原結合分子都能夠以濃度依賴性方式與人 BCMA 結合。相較於如本文所描述之具有新穎 BCMA 抗體的分子，描述於 WO 2020/127618 A1 中之具有 BCMA 抗體 PR 的分子具有較低之 EC 50值，但最大結合 (Emax) 在所有所測試之分子當中為相當的。 圖 3C至圖 3H顯示兩種 BCMA-CD28 雙特異性抗原結合分子 P1AG7191 及 P1AG7207 以及靶向 BCMA 的 CD3 T 細胞接合物阿努克他單抗 (Alnuctamab) 與表現具有所指示點突變的人 BCMA 的 CHO 細胞之結合。所顯示的是在不存在 BCMA 的情況下之結合 ( 圖 3C) 以及與人 wt BCMA ( 圖 3D) 以及與 BCMA 變異體人 BCMA P33S ( 圖 3E)、人 BCMA P343del ( 圖 3F)、人 BCMA R27P ( 圖 3G)、人 BCMA S30del ( 圖 3H) 之結合。另一 BCMA 靶向型 CD3 T 細胞接合物特立妥單抗 (teclistamab) 不結合兩種突變的 BCMA 變異體，亦即 R27P ( 圖 3G) 及 S30del ( 圖 3H)，而艾爾納單抗 (elranatamab) 僅在高濃度下與具有 R27P 突變的 BCMA 微弱結合。經測試之雙特異性分子均未與 BCMA 陰性 CHOk1 細胞結合 (3C)。 圖 4A至圖 4F顯示 Jurkat IL2 報道細胞中 IL2 傳訊之劑量依賴性活化。將滴定量 (200.0-0.5 nM) 之 BCMA-CD28 v15 BsAb (圖 4A 至圖 4C) 及 BCMA-CD28 v8 BsAb (圖 4D 至圖 4F) 與三種不同濃度 (20、200 及 2000 pM) 之 GPRC5D-TCB 一起添加至靶細胞 (NCI-H929) 與效應細胞 (Jurkat IL2 報告基因) 之混合物。 圖 5A至圖 5D提供從 Jurkat NFkB 報道細胞測定獲得的資料之總結。圖 5A 顯示各種 BCMA-CD28 v15 BsAb 及非標靶 CD28 v15 對照的 EC 50值而圖 5B 比較其功效，且圖 5C 顯示各種 BCMA-CD28 v8 BsAb 及非標靶 CD28 對照的 EC 50值而圖 5D 比較其功效。資料係根據一式三份地進行的三個獨立實驗計算得出。根據以不同濃度之 GPRC5D-TCB 進行之實驗將圖 5A 及圖 5C 之 EC 50資料加在一起，且針對功效資料亦如此應用。所有資料均顯示為均值 ± s.d.。 圖 6A及圖 6B顯示，僅在存在第一訊號 (TCB) 及 BCMA 表現的情況下，才發生 CD8 +T 細胞透過 BCMA-CD28 v15 雙特異性抗體 (BsAb) 之劑量依賴性活化。將表現 BCMA 的 MM 細胞株 NCI-H929 (圖 6A) 與健康供體 PBMC 共培養 (比率為 1:1)。替代地，使用 NCI-H929 BCMAko 細胞 (不表現 BCMA 的剔除細胞) 作為靶細胞 (圖 6B)。以 GPRC5D-TCB (提供第 1 訊號) 單獨地或與 BCMA-CD28 BsAb 或非靶向的 CD28 (陰性參照) 組合來處理共培養物，將其從 500 nM 滴定至 0.03 nM (1:4 稀釋步驟)，並孵化 4 天。對照不進行處理或以 BCMA-CD28 BsAb 單獨地進行處理 (3 個最高濃度)。資料顯示為一個供體之三次重複之均值 ± s.d. (表示 3 個所測試之供體；BCMA ko N=1)。 圖 7A及圖 7B顯示 CD8 +T 細胞透過 BCMA-CD28 v8 雙特異性抗體 (BsAb) 之劑量依賴性活化。僅在存在第一訊號 (TCB) 及 BCMA 表現的情況下才發生活化。將表現 BCMA 的 MM 細胞株 NCI-H929 (圖 7A) 與健康供體 PBMC 共培養 (比率為 1:1)。替代地，使用 NCI-H929 BCMAko 細胞 (不表現 BCMA 的剔除細胞) 作為靶細胞 (圖 7B)。以 GPRC5D-TCB (提供第 1 訊號) 單獨地或與 BCMA-CD28 BsAb 或非靶向的 CD28 (陰性參照) 組合來處理共培養物，將其從 500 nM 滴定至 0.12 nM (1:4 稀釋步驟)，並孵化 4 天。對照不進行處理或以 BCMA-CD28 BsAb 單獨地進行處理。資料顯示為一個供體之三次重複之均值 ± s.d. (表示 3 個所測試之供體；BCMA ko N=1)。 圖 8A及圖 8B顯示，僅在存在第一訊號 (TCB) 及 BCMA 表現的情況下，才發生 CD4 +T 細胞透過 BCMA-CD28 v8 雙特異性抗體 (BsAb) 之劑量依賴性活化。將表現 BCMA 的 MM 細胞株 NCI-H929 (圖 8A) 與健康供體 PBMC 共培養 (比率為 1:1)。替代地，使用 NCI-H929 BCMAko 細胞 (不表現 BCMA 的剔除細胞) 作為靶細胞 (圖 8B)。以 GPRC5D-TCB (提供第 1 訊號) 單獨地或與 BCMA-CD28 BsAb 或非靶向的 CD28 (陰性參照) 組合來處理共培養物，將其從 500 nM 滴定至 0.12 nM (1:4 稀釋步驟)，並孵化 4 天。對照不進行處理或以 BCMA-CD28 BsAb 單獨地進行處理 (3 個最高濃度)。資料顯示為一個供體之三次重複之均值 ± s.d. (表示 3 個所測試之供體；BCMA ko N=1)。 圖 9A及圖 9B顯示 CD4 +T 細胞透過 BCMA-CD28 v8 雙特異性抗體 (BsAb) 之劑量依賴性增生。僅在存在第一訊號 (TCB) 及 BCMA 表現的情況下才發生增生。將表現 BCMA 的 MM 細胞株 NCI-H929 (圖 9A) 與健康供體 PBMC 共培養 (比率為 1:1)。替代地，使用 NCI-H929 BCMAko 細胞 (不表現 BCMA 的剔除細胞) 作為靶細胞 (圖 9B)。以 GPRC5D-TCB (提供第 1 訊號) 單獨地或與 BCMA-CD28 BsAb 或非靶向的 CD28 (陰性參照) 組合來處理共培養物，將其從 500 nM 滴定至 0.12 nM (1:4 稀釋步驟)，並孵化 4 天。對照不進行處理或以 BCMA-CD28 BsAb 單獨地進行處理。資料顯示為一個供體之三次重複之均值 ± s.d. (表示 3 個所測試之供體；BCMA ko N=1)。 圖 10顯示使用原發性 MM 患者的骨髓樣品的示例性離體測試之結果，如實例 4.3 所描述。藉由流式細胞分析技術判定 T 細胞活化，評定在不存在或存在 200 nM 之所指示 BCMA-CD28 雙特異性抗體或非靶向的陰性參照分子的情況下以 1 nM GPRC5D-TCB 孵化 96 小時後 CD8 +T 細胞上 CD25 之上調。所有所顯示之資料均指每種條件下之單管測量。 圖 11顯示使用原發性 MM 患者的骨髓樣品的示例性 離體測試之結果。藉由流式細胞分析技術判定腫瘤細胞溶解 (TCL)，在不存在或存在 400 nM 之所指示 BCMA-CD28 雙特異性抗體或非靶向的陰性參照分子的情況下以 1 nM GPRC5D-TCB 孵化 96 小時後將具有低 FSC 的馬來亞醯胺陽性細胞定義為死細胞。所有所顯示之資料均指每種條件下之單管測量。 圖 12A至圖 12D顯示使用原發性 MM 患者的骨髓樣品的 離體實驗之結果 。藉由流式細胞分析技術判定 T 細胞活化、相應去顆粒作用，評定在不存在或存在 200 nM 之所指示 BCMA-CD28 雙特異性抗體或參照分子的情況下以 10 nM GPRC5D-TCB 孵化 96 小時後 CD4 +(參見圖 12A 及圖 12C) 或 CD8 +(參見圖 12B 及圖 12D) 上 CD25 (參見圖 12A 及圖 12B)、相應 CD107A (參見圖 12C 及圖 12D) 之上調。 圖 13A及圖 13B顯示使用原發性 MM 患者的骨髓樣品的 BM MNC 的 離體測試之結果。藉由流式細胞分析技術判定腫瘤細胞溶解、相應 T 細胞活化，評定在不存在或存在 800 nM 之所指示 BCMA-CD28 雙特異性抗體或參照分子的情況下以 0.01 nM GPRC5D-TCB 孵化 96 小時後活 MM PC 之百分比 (圖 13A) 或 CD8+ T 細胞上 CD25 之上調 (圖 13B)。 圖 14A至圖 14F描繪來自測試 GPRC5D x CD3 單一療法及其與 BCMA-CD28 雙特異性抗體 (10 mg/kg P1AG7215 及 10 mg/kg P1AG7282) 之組合在 NCI-H929 腫瘤模型中之功效的 活體內實驗的結果。圖 14A 至圖 14D 顯示單一動物中的腫瘤生長抑制，且圖 14E 將腫瘤體積顯示為每個治療群組的中位數 (+/- IQR)。最終腫瘤負荷低於治療開始時之大小的動物定義為反應者。針對 GPRC5D x CD3 單一療法群組顯示終止時 (研究第 41 天) 的腫瘤體積，且兩種組合均以中位數 (+/- IQR) 顯示在圖 14F 中。 圖 15A至圖 15L顯示來自測試 GPRC5Dx CD3 單一療法及其與 BCMA-CD28 var8 雙特異性抗體 P1AG7215 (20 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg)、BCMA-CD28 var15 雙特異性抗體 P1AG7282 (20 mg/kg、10 mg/kg、2 mg/kg) 及 BCMA(PR)-CD28 雙特異性抗體 P1AE9053 (10 mg/kg) 及 P1AF7062 (10 mg/kg) 之組合在 NCI-H929 腫瘤模型中之功效的 活體內實驗的結果。顯示單一動物中的腫瘤生長抑制 (圖 15A 至圖 15J) 及作為每個治療群組的中位數 (+/-IQR) 的腫瘤生長抑制 (圖 15K)。最終腫瘤負荷低於治療開始時之大小的動物定義為反應者。顯著差異顯示為星標。針對 GPRC5D x CD3 單一療法及組合群組將 NCI-H929 腫瘤模型中終止時 (研究第 40 天) 的腫瘤體積顯示為中位數 (+/- IQR)(C)。圖 15A 至圖 15J 顯示單一動物中的腫瘤生長抑制，且圖 15K 將腫瘤體積顯示為每個治療群組的中位數 (+/- IQR)。最終腫瘤負荷低於治療開始時之大小的動物定義為反應者。針對 GPRC5D x CD3 單一療法群組顯示終止時 (研究第 41 天) 的腫瘤體積，且兩種組合均以中位數 (+/- IQR) 顯示在圖 15L 中。 圖 16A至圖 16G顯示測試 GPRC5D x CD3 單一療法 (1 mg/kg) 及與 BCMA-CD28 (20 及 30 mg/kg)、P1AG7207 (20 及 30 mg/kg) 及 P1AG7191 (20 mg/kg) 之組合分別在 NCI-H929 腫瘤模型中的功效的 活體內實驗之結果。圖 16A 至 16E 顯示單一動物中的腫瘤生長抑制。圖 16F 將腫瘤體積顯示為每個治療群組的中位數 (+/- IQR)。最終腫瘤負荷低於治療開始時之大小的動物定義為反應者。以 GPRC5D x CD3 與 20 mg/kg P1AG7207 之組合進行治療產生 4 個反應者，且以其與 30 mg/kg P1AG7207 進行治療產生 5 個反應者。在以 GPRC5D x CD3 及 20 mg/kg P1AG7191 治療的群組中觀察到 2 個反應者。在圖 16G 中，針對 GPRC5D x CD3 單一療法群組及組合，將終止時 (研究第 57 天) 的腫瘤重量顯示為中位數 +/- IQR。 圖 17A至圖 17G顯示測試 GPRC5D x CD3 單一療法及與 BCMA-CD28 雙特異性抗體 P1AG7191 (40、10 及 1 mg/kg) 及 P1AE9053 (10 mg/kg) 之組合在 NCI-H929 腫瘤模型中的功效的 活體內實驗之結果。顯示作為每個治療群組的中位數 (+/- IQR) 的腫瘤生長抑制 (圖 17A) 及單一動物中的腫瘤生長抑制 (圖 17B 至圖 17G)。最終腫瘤負荷低於治療開始時之大小的動物定義為反應者。相較於單一療法，P1AG7191 之兩個最高劑量 (40 及 10 mg/kg) 延遲腫瘤復發的時間，且抑制腫瘤再生。 圖 18顯示雙特異性抗體 P1AG7282、P1AG7215、P1AG7191 及 P1AG7207 的如在 HuFcRN 基因轉殖小鼠中測量的血漿濃度-時間曲線的比較 (PK 研究)。 圖 19顯示雙特異性抗體 P1AG7282、P1AG7215、P1AG7191 及 P1AG7207 的 MAPPs 測定 (實例 6.3.1) 中觀察到的結果的比較性 heatMAPPS 表示。在每個域中發現的簇都會經反白顯示。
TW202504918A_113119794_SEQL.xml

Claims (35)

  1. 一種與 B 細胞成熟劑 (BCMA) 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有以下的第一抗原結合域： (i) 重鏈可變區 (V HBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 1 (GYTFTNYWMH) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 2 (IIHPNSGSTNYNEKFQG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 3 (GIYDYPFAY) 之 CDR-H3；以及 (ii) 輕鏈可變區 (V LBCMA)，其選自由以下所組成之群組： (a) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 5 (AASSLQS) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3；或 (b) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 7 (AASNLES) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3；或 (c) VL，其包含 SEQ ID NO: 4 (RASESVSIHGTHLMH) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 8 (AASNLQS) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 6 (QQSIEDPYT) 之 CDR-L3。
  2. 如請求項 1 之抗體，其中該 V HBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 9 (VH1a) 及 SEQ ID NO: 10 (VH1b)，及/或該 V LBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 11 (VL1f)、SEQ ID NO: 12 (VL1a)、SEQ ID NO: 13 (VL1b)、SEQ ID NO: 14 (VL1c)、SEQ ID NO: 15 (VL1d) 及 SEQ ID NO:16 (VL1e)。
  3. 一種與 BCMA 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有以下的第一抗原結合域： (a) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列的 V LBCMA。
  4. 如請求項 1 至 3 中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域為 Fab 分子。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項之抗體，其包含由第一次單元及第二次單元所構成的 Fc 域。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之抗體，其包含與第二抗原特異性結合的第二抗原結合域。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之抗體，其中與第二抗原特異性結合的該第二抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特定而言可變域 VL 及 VH 係彼此替換。
  8. 如請求項 6 或 7 中任一項之抗體，其中該第二抗原為 CD28。
  9. 如請求項 8 之抗體，其中與 CD28 特異性結合的該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 17 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 18 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 19 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 20 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 21 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 22 之 CDR-L3。
  10. 如請求項 8 或 9 之抗體，其中與 CD28 特異性結合的該第二抗原結合域包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD28) 及含有 SEQ ID NO:24 (v8) 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD28)。
  11. 如請求項 1 至 10 中任一項之抗體，其中該抗體包含：第一抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的 V HBCMA 及含有 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列的 V LBCMA；以及第二抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 V HCD28 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 V LCD28。
  12. 如請求項 1 至 11 中任一項之抗體，其包含含有 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的第一輕鏈、含有 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列的第一重鏈、含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的第二重鏈及含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的第二輕鏈。
  13. 一種與 B 細胞成熟劑 (BCMA) 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 (A) 第一抗原結合域，其包含 (i) 重鏈可變區 (V HBCMA)，其選自由以下所組成之群組： (a) VH，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 30 (QITAKSNNYATYYADSVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；以及 (b) VH，其包含 SEQ ID NO: 29 (GFTFSNAWMD) 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 32 (QITAKSNNYATYYAAPVKG) 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 31 (DGYH) 之 CDR-H3；以及 (ii) 輕鏈可變區 (V LBCMA)，其包含 SEQ ID NO: 33 (RASEDIRNGLA) 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 34 (NANSLHT) 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 35 (EDTSKYPYT) 之 CDR-L3，以及 (B) 第二抗原結合域，其與 CD28 特異性結合。
  14. 如請求項 13 之抗體，其中該 V HBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 36 (VH2a) 及 SEQ ID NO: 38 (VH1b)，及/或該 V LBCMA 包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：SEQ ID NO: 37 (VL2a) 及 SEQ ID NO:39 (VL1a)。
  15. 一種與 BCMA 及 CD28 特異性結合之抗體，其中該抗體包含含有以下的第一抗原結合域： (a) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA，或 (b) 包含 SEQ ID NO:38 之胺基酸序列的 V HBCMA 及包含 SEQ ID NO:39 之胺基酸序列的 V LBCMA。
  16. 如請求項 13 至 15 中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域為 Fab 分子。
  17. 如請求項 13 至 16 中任一項之抗體，其中與第二抗原特異性結合的該第二抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特定而言可變域 VL 及 VH 係彼此替換。
  18. 如請求項 13 至 17 中任一項之抗體，其中與 CD28 特異性結合的該第二抗原結合域包含：重鏈可變區 (V HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 17 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 18 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 19 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 20 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 21 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 22 之 CDR-L3。
  19. 如請求項 18 之抗體，其中與 CD28 特異性結合的該第二抗原結合域包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V HCD28) 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V LCD28)。
  20. 如請求項 13 至 19 中任一項之抗體，其中該抗體包含：第一抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的 V HBCMA 及含有 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的 V LBCMA；以及第二抗原結合域，其包含含有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 V HCD28 及含有 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列的 V LCD28。
  21. 如請求項 13 至 20 中任一項之抗體，其包含含有 SEQ ID NO:40 之胺基酸序列的第一輕鏈、含有 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列的第一重鏈、含有 SEQ ID NO:27 之胺基酸序列的第二重鏈及含有 SEQ ID NO:28 之胺基酸序列的第二輕鏈。
  22. 一種或多種經分離之多核苷酸，其編碼如請求項 1 至 21 中任一項之抗體。
  23. 一種或多種載體、特定而言表現載體，其包含如請求項 22 之多核苷酸。
  24. 一種宿主細胞，其包含如請求項 22 之多核苷酸或如請求項 23 之載體。
  25. 一種生產與 BCMA 特異性結合的抗體之方法，其包含以下步驟：a) 在適於表現該抗體的條件下培養如請求項 24 之宿主細胞，及視情況 b) 回收該抗體。
  26. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 21 中任一項之抗體及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
  27. 如請求項 1 至 21 中任一項之抗體或如請求項 26 之醫藥組成物，其使用為藥物。
  28. 如請求項 1 至 21 中任一項之抗體或如請求項 26 之醫藥組成物，其使用於增強 (a) T 細胞活化或 (b) T 細胞效應功能。
  29. 如請求項 1 至 21 中任一項之抗體或如請求項 26 之醫藥組成物，其使用於治療癌症、特定而言多發性骨髓瘤。
  30. 如請求項 1 至 21 中任一項之抗體或如請求項 26 之醫藥組成物，其用於如請求項 29 之使用，其中該使用係供與化學治療劑、放射療法及/或使用於癌症免疫療法的其他藥劑組合投予。
  31. 如請求項 1 至 21 中任一項之抗體或如請求項 26 之醫藥組成物，其用於如請求項 29 之使用，其中該使用係供與 T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體組合投予。
  32. 如請求項 31 之使用之抗體或醫藥組成物，其中該 T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體為抗 GPRC5D/抗 CD3 抗體。
  33. 一種如請求項 1 至 21 中任一項之抗體或如請求項 26 之醫藥組成物在製造藥物中之用途，該藥物用於治療疾病、特定而言用於治療癌症。
  34. 一種治療個體的疾病、特定而言癌症之方法，其包含向該個體投予有效量之如請求項 1 至 21 之抗體或如請求項 26 之醫藥組成物。
  35. 如請求項 34 之方法，其進一步包含與化學治療劑、放射療法及/或使用於癌症免疫療法的其他藥劑組合、特定而言與 T 細胞活化抗 CD3 雙特異性抗體組合投予。
TW113119794A 2023-06-01 2024-05-29 靶向ｂｃｍａ及ｃｄ２８的雙特異性抗體 TW202504918A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP23176608.0 2023-06-01
EP23176608 2023-06-01
EP23189801 2023-08-04
EP23189801.6 2023-08-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202504918A true TW202504918A (zh) 2025-02-01

Family

ID=91375677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW113119794A TW202504918A (zh) 2023-06-01 2024-05-29 靶向ｂｃｍａ及ｃｄ２８的雙特異性抗體

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN121241068A (zh)
TW (1) TW202504918A (zh)
WO (1) WO2024246083A1 (zh)

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1096187A (en) 1977-04-18 1981-02-24 Souhei Monden Ornament adapted to be fixed by permanent magnets
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2421447C (en) 2000-09-08 2012-05-08 Universitat Zurich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
ATE416190T1 (de) 2003-07-04 2008-12-15 Affibody Ab Polypeptide mit bindungsaffinität für her2
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
DK2380910T3 (en) 2003-11-05 2015-10-19 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
JP5006651B2 (ja) 2003-12-05 2012-08-22 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー ２型血管内皮増殖因子受容体の阻害剤
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
PL1737891T3 (pl) 2004-04-13 2013-08-30 Hoffmann La Roche Przeciwciała przeciw selektynie p
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
NZ553500A (en) 2004-09-23 2009-11-27 Genentech Inc Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates withCysteine engineered antibodies and conjugates with a free cysteine amino acid in the heavy chain a free cysteine amino acid in the heavy chain
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
RU2488597C2 (ru) 2005-02-07 2013-07-27 Гликарт Биотехнологи Аг Антигенсвязывающие молекулы, которые связывают egfr, кодирующие их векторы и их применение
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
KR101780131B1 (ko) 2010-08-13 2017-09-19 로슈 글리카트 아게 항-fap 항체 및 이의 사용 방법
KR101614195B1 (ko) 2011-03-29 2016-04-20 로슈 글리카트 아게 항체 Fc 변이체
HUE063461T2 (hu) 2011-05-27 2024-01-28 Glaxo Group Ltd BCMA (CD269/TNFRSF17)-kötõ fehérjék
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
KR20170070070A (ko) 2014-10-24 2017-06-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 Vh-vl-도메인간 각도 기반 항체 인간화
HUE063270T2 (hu) 2015-06-16 2024-01-28 Hoffmann La Roche Az FcRH5 elleni humanizált és affinitásérett antitestek és alkalmazási eljárások
US11608376B2 (en) 2018-12-21 2023-03-21 Hoffmann-La Roche Inc. Tumor-targeted agonistic CD28 antigen binding molecules

Also Published As

Publication number Publication date
CN121241068A (zh) 2025-12-30
WO2024246083A1 (en) 2024-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7304921B2 (ja) Ｐｄ１及びｌａｇ３に特異的に結合する二重特異性抗体
US12240911B2 (en) Bispecific antibodies specific for OX40
TWI810541B (zh) 靶向ｏｘ４０及ｆａｐ之雙特異性抗原結合分子
US20190211113A1 (en) Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory tnf receptor
US11453722B2 (en) Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory TNF receptor
US20230416366A1 (en) Anti-cd3/anti-cd28 bispecific antigen binding molecules
AU2018357923A1 (en) Bispecific 2+1 contorsbodies
CN113286822A (zh) 靶向肿瘤的超激动性cd28抗原结合分子
KR20240122864A (ko) 효현성 ltbr 항체 및 이들을 포함하는 이중특이적 항체
JP7792438B2 (ja) ＥｐＣＡＭを標的とするアゴニストＣＤ２８抗原結合分子
TW202504918A (zh) 靶向ｂｃｍａ及ｃｄ２８的雙特異性抗體
TW202502811A (zh) 與ｂｃｍａ特異性結合之免疫刺激性抗原結合分子
RU2854454C1 (ru) Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, нацеливающиеся на ox40 и fap
HK40106274A (zh) 靶向epcam的激动性cd28抗原结合分子
HK40088605A (zh) 靶向her2的激动性cd28抗原结合分子
HK40114510A (zh) 激动性ltbr抗体以及包含它们的双特异性抗体
HK40059020A (zh) 靶向肿瘤的超激动性cd28抗原结合分子
HK40018436A (zh) 特异性结合pd1和lag3的双特异性抗体