TW202436341A - 嵌合抗原受體及抗體—ｎｋｇ２ｄ配位體域融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種嵌合抗原受體，其包含突變型NKG2D胞外域、IgG4鉸鏈域、跨膜域、胞內信號傳導域及協同刺激域。本發明進一步提供一種包含抗體重鏈及抗體輕鏈之抗體融合蛋白，其中該等重鏈或該等輕鏈在其N端處經由胺基酸連接子與A1-A2域融合，該A1-A2域包含與SEQ ID NO: 11具有至少95%一致性之胺基酸序列。本發明進一步提供一種套組，其包含一或多個包含該抗體融合蛋白之容器及/或包含一或多個包含免疫細胞之容器，並且亦提供使用方法。

Description

嵌合抗原受體及抗體-NKG2D配位體域融合蛋白

本發明係關於一種包含突變型NKG2D胞外域之嵌合抗原受體、一種包含非天然NKG2D配位體之A1-A2域的抗體融合蛋白，及相關方法。

對患者來源之T細胞進行工程改造以表現嵌合抗原受體（CAR）已改變過繼細胞療法之前景，向科學家及臨床醫師提供利用T細胞之強大細胞溶解能力及以獨立於MHC之方式將該等T細胞引導至表現特定抗原之目標的能力。其用於治療血液科惡性病之初始應用已引起驚人的反應，且激發出一股研究浪潮以推進其在非血液科適應症中之有效使用。然而，CAR-T細胞療法受到如下限制：其利用單一用途靶向域、缺乏劑量控制（此可能促成細胞介素釋放症候群）、無法解決導致疾病復發之腫瘤抗原丟失問題及導致缺乏持久性之非人類靶向域的免疫原性。此項技術中需要改良的基於CAR之細胞療法，用以解決當前療法選項之此等侷限性。

本發明內容僅意欲介紹本發明之一或多個實施之一些態樣的簡化概述。本發明之其他適用領域將自下文所提供的實施方式變得顯而易見。此概述並非廣泛綜述，既不意欲識別本教示內容之關鍵或重要元素，亦不意欲劃定本發明之範圍。實情為，其目的僅為以簡化形式呈現一或多個概念，作為下文的實施方式的序言。

本發明提供一種嵌合抗原受體，其包含突變型NKG2D胞外域、IgG4鉸鏈域、跨膜域、胞內信號傳導域及協同刺激域。在各種態樣中，該突變型NKG2D胞外域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或其變異體，該變異體包含在SEQ ID NO: 1內之胺基酸位置118處的取代。視情況，該IgG4鉸鏈域包含與SEQ ID NO: 2包含至少85%一致性（例如100%一致性）之胺基酸序列；該跨膜域包含與SEQ ID NO: 3包含至少85%一致性（例如100%一致性）之胺基酸序列；該胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO: 5包含至少85%一致性（例如100%一致性）之胺基酸序列；及/或該協同刺激域包含與SEQ ID NO: 4包含至少85%一致性（例如100%一致性）之胺基酸序列。提供一種核酸分子，其包含編碼該嵌合抗原受體之核酸序列；以及一種包含該核酸分子之表現載體及一種包含該表現載體之細胞。

本發明進一步提供一種包含抗體重鏈及抗體輕鏈之抗體融合蛋白，其中該等重鏈或該等輕鏈在其N端處經由胺基酸連接子與A1-A2域融合，該A1-A2域包含與SEQ ID NO: 11具有至少90%一致性（例如100%一致性）之胺基酸序列。視情況，該A1-A2域包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列，其在位置40、54及/或84中之一或多者處包含丙胺酸或麩醯胺酸。在各種態樣中，該連接子之長度為2-8個胺基酸、長度為9-17個胺基酸或長度為18-30個胺基酸。舉例而言，在一些態樣中，各重鏈在該N端處經由該胺基酸連接子與A1-A2域融合，且該連接子視情況長度為9-17個胺基酸或長度為18-30個胺基酸。在替代態樣中，各輕鏈在該N端處經由該胺基酸連接子與A1-A2域融合，且該連接子視情況長度為2-8個胺基酸或長度為9-17個胺基酸。提供一種核酸分子，其包含編碼該重鏈及/或該輕鏈之核酸序列；以及一種包含該核酸分子之表現載體及一種包含該表現載體之細胞。

另外，本發明提供一種套組，其包含一或多個包含本文所述之抗體融合蛋白的容器及使用說明書。該套組可進一步包含一或多個包含本文所述之免疫細胞的容器。本文亦揭示一種套組，其包含一或多個包含該免疫細胞之容器及使用說明書。

本發明進一步提供一種治療罹患癌症之個體的方法，該方法包含向該個體投與（i）本文所述之抗體融合蛋白及（ii）本文所述之免疫細胞，其中該抗體融合蛋白包含結合癌細胞上所呈現之細胞表面抗原的抗體。在各種態樣中，該癌症為CD19陽性癌症，且該抗體融合蛋白包含抗CD19抗體。

應理解，雖然本說明書中之各種實施例使用「包含」語言呈現，但在各種情況下，亦可使用「由……組成」或「基本上由……組成」語言來描述相關實施例。本發明考慮描述為「包含」特徵之實施例，以包括「由」特徵「組成」或「基本上由」特徵「組成」之實施例。術語「一（a）」或「一（an）」係指一或多個。因此，術語「一（a）」(或「一（an）」)、「一或多個（種）」及「至少一個（種）」可在本文中互換使用。術語「或」應理解為以替代或共同形式涵蓋項目，除非上下文另有明確要求。

除非本文另外指出，否則本文對值範圍之敍述僅意欲用作個別地提及屬於該範圍內之各個別值及各端點的簡寫方法，且各個別值及端點係併入本說明書中，如同其在本文中個別地敍述一般。然而，本說明亦考慮排除較低及/或較高端點之相同範圍。當使用術語「約」時，其意謂所述數值±彼所述數值之5%、10%或更大。可自上下文判定所意欲之實際變化。

除非本文另外指明或另外與上下文明顯矛盾，否則本文中所描述之所有方法均可以任何合適次序進行。除非另外主張，否則本文中所提供之任何及所有實例或例示性語言（例如，「諸如」）之使用僅意欲更好地闡明本發明，且不對本發明之範疇形成限制。僅在本文中描述為對於本發明而言關鍵之該等限制才應被視為限制；缺乏未在本文中描述為關鍵之限制的本發明之變化意欲作為本發明之態樣。

本發明之額外特徵及變化將自本申請案之全部內容（包括附圖及實施方式）而對熟習此項技術者顯而易見，且所有此類特徵意欲作為本發明之態樣。同樣地，本文中所描述之本發明之特徵可再組合成亦意欲作為本發明之態樣的額外實施例，而不管特徵之組合是否指定為本發明之態樣或實施例。整個文獻意欲以統一揭示內容形式相關，且應理解，即使未發現特徵組合在本文獻之相同句子或段落或章節中結合，亦考慮本文所描述之所有特徵組合（即使描述於分開的章節中）。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2023年2月7日申請之美國臨時專利申請案第63/483,747號之優先權，該申請案之內容特此以引用之方式併入。 以引用之方式併入以電子方式提交之材料

與之一起同時提交且標識如下之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表以全文引用之方式併入：58808_SeqListing.xml；大小：55,589位元組；創建日期：2024年1月18日。

本發明之較佳態樣之以下描述在本質上僅為例示性的且決不意欲限制本發明、其應用、或使用。

本發明提供一種嵌合抗原受體（CAR），其包含突變型非天然NKG2D胞外域、IgG4鉸鏈域、跨膜域、胞內信號傳導域及協同刺激域；以及在細胞表面上呈現CAR之免疫細胞。本發明進一步提供一種融合蛋白，其包含抗體（或其他抗原結合蛋白）及非天然NKG2D配位體之A1-A2域。非天然NKG2D配位體選擇性地結合非天然NKG2D受體。在本發明之各種態樣中，融合蛋白與呈現CAR之免疫細胞結合使用，該CAR包含A1-A2域所結合之非天然NKG2D胞外域，藉此提供用於遞送定製CAR-T細胞療法之強大系統，該療法克服當前基於CAR-T細胞之治療法的許多缺點。本發明之嵌合抗原受體、抗體融合蛋白及系統提供出乎意料地優良的活體內抗腫瘤活性。

NKG2D為活化受體，其表現為自然殺手（NK）細胞、一些骨髓細胞及某些T細胞上之II型均二聚體整合膜蛋白。人類NKG2D具有回應於多種應激在細胞表面上上調的八個不同天然MIC配位體（MICA、MICB、及ULBP1至ULBP6），且其差異調節為免疫系統提供回應於大範圍緊急提示（emergency cue）但附帶損傷最小的方式。Groh等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1996) 93:12445-12450；Zwirner等人, Hum. Immunol. (1999) 60:323-330；及Spies等人, Nat. Immunol. (2008) 9: 1013-1015。已解析NKG2D胞外域、若干可溶性配位體及配位體與胞外域之結合複合物的結構，從而揭示在均二聚體界面中之鞍形物樣凹槽（saddle-like groove），其接合另外具有不同胺基酸一致性之配位體的結構上保守的A1-A2域。Li等人, Nat. Immunol. (2001) 2:443-451；Radaev等人, Immunity (2001) 15:1039-1049；及McFarland等人, Immunity (2003) 19:803-812。亦參見Culpepper等人, Mol. Immunol. (2011) 48: 516-523。

「嵌合抗原受體」或「CAR」係指經工程改造以識別及結合由目標細胞（諸如腫瘤細胞）表現之抗原的人工免疫細胞受體。歷史上，CAR已針對T細胞加以設計且為T細胞受體（TCR）複合物之信號傳導域與抗原識別域（例如抗體或其他抗體片段之單鏈片段（scFv））的嵌合體。參見例如，Enblad等人, Human Gene Therapy (2015) 26(8):498-505。本發明之嵌合抗原受體包含不能接合天然配位體之突變型NKG2D胞外域作為CAR之「抗原結合域」。突變型NKG2D在本文中亦稱為「iNKG2D」。因為CAR為惰性的，所以當CAR「武裝（armed）」有非共價結合至其受體之同源抗體融合蛋白時，CAR可僅與呈現抗原之目標細胞形成富有成效的免疫突觸且活化細胞溶解。在各種態樣中，iNKG2D胞外域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或其變異體。就此而言，突變型NKG2D胞外域視情況包含與SEQ ID NO: 1包含至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在各種態樣中，突變型NKG2D胞外域包含在SEQ ID NO: 1內之胺基酸位置118處的取代。舉例而言，iNKG2D胞外域視情況包含在SEQ ID NO: 1中在位置118處代替Y之F。在各種態樣中，突變型NKG2D胞外域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。替代地，突變型NKG2D胞外域包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。

胞外域與IgG4鉸鏈、跨膜域及胞內信號傳導域締合。CAR亦較佳包含協同刺激域。CAR之鉸鏈區為位於抗原結合域與跨膜域之間的胺基酸域。在各種態樣中，IgG4鉸鏈域包含與SEQ ID NO: 2包含至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。視情況，IgG4鉸鏈包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。

本文所揭示之CAR包含跨膜域，亦即使抗原結合域連接至胞內信號傳導域之胺基酸域。跨膜域能夠跨越細胞（例如免疫細胞）之質膜。跨膜域之實例包括但不限於來源於CD28、CD3-ε、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCR-α、TCR-β、TCR-ζ、H2-Kb、GITR或CD3-ζ之域。在各種態樣中，跨膜域係選自CD3-ζ、CD28或CD8跨膜域。在較佳態樣中，跨膜域為CD8a跨膜域（例如，SEQ ID NO: 3之胺基酸序列）。在各種態樣中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 3具有至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。

當CAR與目標抗原接合時，CAR之胞內信號傳導域產生增殖及效應功能之刺激信號。許多胞內信號傳導域含有信號傳導模體，其稱為基於免疫受體酪胺酸之活化模體（ITAM）。含有細胞質信號傳導序列之ITAM的實例包括來源於CD8、CD3 ζ、CD3 γ、CD3 ε、CD32（Fc γ RIIa）、DAP10、DAP12、CD79a、CD79b、FcγRlγ、FcγRIIIγ、FcεRIβ（FCERIB）及FcεRIγ（FCERIG）之ITAM。在各種態樣中，胞內信號傳導域為CD3ζ衍生之域，其視情況包含SEQ ID NO: 5。在各種態樣中，胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO: 5具有至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。

在各種態樣中，CAR包含協同刺激域。協同刺激域提供例如增強免疫細胞增殖、細胞介素分泌、細胞毒性功能及其類似者之胞內信號。協同刺激域之實例包括但不限於CD27、4-1BB、CD28、CD134、ICOS、OX40、CD149、DAP10、CD30、IL2-R、IL7r6、IL21-R、NKp30、NKp44、CD40、CD137、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及DNAM-1協同刺激域。亦設想包含兩個、三個或更多個協同刺激域之構築體。協同刺激域進一步描述於例如美國專利第11,235,977號中，該專利特此以全文引用之方式且尤其關於CAR組分之揭示內容併入。視情況，本發明之CAR包含4-1BB域（例如SEQ ID NO: 4）。在各種態樣中，協同刺激域包含與SEQ ID NO: 4具有至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。

在本發明之例示性態樣中，CAR包含突變型NKG2D胞外域（例如，包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或由其組成）、IgG4鉸鏈（例如，包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列或由其組成）、CD8a跨膜域（例如，包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列或由其組成）、4-1BB域（例如，包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列或由其組成）及CD3ζ胞內信號傳導域（例如，包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列或由其組成）。在各種態樣中，CAR包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列或由其組成。本發明進一步考慮一種CAR構築，其包含與SEQ ID NO: 6具有至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。

亦提供經修飾以表現CAR且在細胞表面上呈現CAR之免疫細胞。此等細胞視情況獲自待治療之個體（亦即，為自體的）。然而，在一些實施例中，使用供體細胞（同種異體）。免疫細胞可獲自許多來源，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、肋膜積液、脾組織及腫瘤。免疫細胞可獲自使用任何數目的熟習此項技術者已知之技術，諸如Ficoll™分離自個體收集之血液。舉例而言，細胞可藉由血球分離術自個體之循環血液獲得。在一些實施例中，藉由溶解紅血球及耗竭單核球而使免疫細胞與周邊血液淋巴球分離，例如藉由PERCOLL™梯度進行離心或藉由逆流離心淘析。免疫效應細胞之特定亞群可藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離。舉例而言，可使用針對陽性選擇之細胞特有的表面標記之抗體組合來分離免疫效應細胞，例如藉由與抗體結合珠粒一起培育達足以陽性選擇所需免疫效應細胞之時段。表現CAR之細胞通常藉由在實驗室中生長進行擴增且接著向個體或患者或另一個體或患者投與。表現CAR之細胞將識別且殺滅在表面上表現靶向抗原之細胞（例如癌細胞）。

免疫細胞包括但不限於淋巴球、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、嗜中性白血球、嗜鹼性球、嗜酸性球或其任何組合。適用於本發明之情形下之免疫細胞的實例包括但不限於自然殺手（NK）細胞、T細胞（包括細胞毒性T細胞及/或調節性T細胞）、單核球、樹突狀細胞及先天性淋巴細胞（1-3型）。

在各種態樣中，免疫細胞為T細胞。T細胞或T淋巴球可藉由在細胞表面上存在T細胞受體（TCR）而區別於其他淋巴球，諸如B細胞及自然殺手細胞（NK細胞）。T輔助細胞（TH細胞）在免疫過程中輔助其他白血球，包括B細胞成熟為漿細胞及記憶B細胞以及細胞毒性T細胞及巨噬細胞之活化。由於此等細胞在其表面上表現CD4醣蛋白，因此其亦稱為CD4+ T細胞。當輔助T細胞藉由表現於抗原呈遞細胞（APC）之表面上的MHC II類分子呈遞肽抗原時，其變得活化。在活化後，其快速分裂且分泌調節或輔助活性免疫反應之稱為細胞介素的小型蛋白質。此等細胞可分化成若干亞型（包括TH1、TH2、TH3、TH7、TH9或TFH）中之一者，該等亞型分泌不同細胞介素以促進不同類型之免疫反應。細胞毒性T細胞（Tc細胞或CTL）破壞經病毒感染之細胞及腫瘤細胞。由於此等細胞在其表面處表現CD8醣蛋白，因此其亦稱為CD8+ T細胞。此等細胞藉由結合至與存在於所有成核細胞之表面上的MHC I類分子締合之抗原來識別其目標。自然殺手T（NKT）細胞（不與自然殺手（NK）細胞混淆）橋連適應性免疫系統與先天性免疫系統。不同於識別主要組織相容複合體（MHC）分子所呈遞之肽抗原之習知T細胞，NKT細胞識別稱作CD1d之分子所呈遞之糖脂抗原。可基於細胞表面表現富集用於修飾之T細胞群體的一或多個子集。在一些情況下，表現CAR之T細胞群體包括細胞毒性CD8+ T淋巴球及/或CD4+ T淋巴球。

自然殺手（NK）細胞為CD56+CD3-大顆粒狀淋巴球，其殺滅經病毒感染及轉型之細胞，且構成先天性免疫系統之關鍵細胞子集（Godfrey等人, Leuk Lymphoma (2012) 53:1666-1676）。不同於細胞毒性CD8+ T淋巴球，NK細胞在不需要先前致敏之情況下發起細胞毒性，且亦可根除MHC-I陰性細胞（Nami-Mancinelli等人, Int Immunol (2011) 23:427-431）。在一些實施例中，呈現本發明之CAR的免疫細胞為NK細胞。在一些態樣中，免疫細胞為巨噬細胞。免疫細胞（諸如T細胞、巨噬細胞及NK細胞）可使用基因轉移技術修飾以直接且穩定地表現於其表面跨膜信號傳導受體上，該等受體賦予新穎抗原特異性。參見例如，Gill & June, Immunological Reviews (2015) 263: 68-89；Glienke等人, Front. Pharmacol. (2015) 6, DOI=10.3389/fphar.2015.00021。

本發明亦提供一種包含抗體重鏈及抗體輕鏈之抗體融合蛋白，其中重鏈或輕鏈在其N端處經由胺基酸連接子與A1-A2域融合。在本發明之各種態樣中，A1-A2域包含與SEQ ID NO: 11具有至少90%一致性（例如至少95%或至少99%一致性）（例如與SEQ ID NO: 11具有100%一致性）之胺基酸序列。抗體融合蛋白中之元件的組合賦予構築體特別有利的特性，且產生結合目標抗原及突變型NKG2D胞外域兩者之雙特異性融合蛋白。此型式（與A1-A2域融合之抗體）亦稱為「MicAbody」。本發明之A1-A2域並非天然存在之A1-A2域，而是包含結合NKG2D胞外域之突變型式且不結合野生型NKG2D（wtNKG2D）（或至少不以使得活體內生物學上相關的方式結合wtNKG2D）的胺基酸序列。此A1-A2域包含與SEQ ID NO: 11具有至少90%一致性（例如與SEQ ID NO: 11具有至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性、至少96%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、至少99%一致性或100%一致性）之胺基酸序列。在各種態樣中，A1-A2域包含SEQ ID NO: 11之位置40、54及/或84中之一或多者處的丙胺酸或麩醯胺酸。此等位置處之取代例如減少某些宿主細胞類型（諸如HEK 293細胞及/或CHO細胞）中之N-糖基化，由此減少最終產物中之非所需異質性。就此而言，A1-A2域可包含位置40處之麩醯胺酸、位置40處之丙胺酸、位置54處之麩醯胺酸、位置54處之丙胺酸、位置40處之丙胺酸及位置54處之麩醯胺酸（視情況具有位置84處之麩醯胺酸或丙胺酸）、位置40處之丙胺酸及位置54處之丙胺酸（視情況具有位置84處之麩醯胺酸或丙胺酸）、位置40處之麩醯胺酸及位置54處之丙胺酸（視情況具有位置84處之麩醯胺酸或丙胺酸）、位置40處之麩醯胺酸及位置54處之麩醯胺酸（視情況具有位置84處之麩醯胺酸或丙胺酸）、位置40處之丙胺酸及位置84處之麩醯胺酸、位置40處之丙胺酸及位置84處之丙胺酸、位置40處之麩醯胺酸及位置84處之丙胺酸、位置40處之麩醯胺酸及位置84處之麩醯胺酸、位置54處之丙胺酸及位置84處之麩醯胺酸、位置54處之丙胺酸及位置84處之丙胺酸、位置54處之麩醯胺酸及位置84處之丙胺酸、或位置54處之麩醯胺酸及位置84處之麩醯胺酸，其中該位置係參考SEQ ID NO: 11內之胺基酸位置。舉例而言，本發明提供與SEQ ID NO: 11具有至少95%一致性之A1-A2域肽，其中該肽包含相對於SEQ ID NO: 11之序列在位置40及54處之麩醯胺酸殘基。視情況，A1-A2域包含SEQ ID NO: 11之位置84處之麩醯胺酸。替代地，在各種態樣中，A1-A2域可包含SEQ ID NO: 11之位置84處之丙胺酸。在各種態樣中，A1-A2域肽包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14（或由其組成）。在各種態樣中，A1-A2域肽包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14具有至少90%一致性（例如至少91%一致性、至少92%一致性、至少93%一致性、至少94%一致性、至少95%一致性、至少96%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性、至少99%一致性或100%一致性）之胺基酸序列（或由其組成）。A1-A2域進一步描述於例如美國專利第8,658,765號、第10,259,858號及第11,453,713號以及美國專利公開案第2019/0300594號中，該等專利中之各者以全文引用之方式且尤其關於與A1-A2域有關之揭示內容併入。

本文中之術語「抗體」係指具有全長重鏈及輕鏈之免疫球蛋白。本發明之抗體為IgG抗體，其包括四個高度保守子類（IgG1、IgG2、IgG3及IgG4），其一般在其恆定區中（例如在鉸鏈及/或CH2域中）不同。視情況，本發明之抗體融合蛋白包含IgG1抗體。抗體（例如IgG1抗體）之恆定區可經修飾以降低或鈍化抗體觸發抗體依賴性細胞溶解（ADCC）之能力（例如藉由將D265A/D297A取代引入Fc域中）。

在各種態樣中，抗體為抗CD19抗體。CD19為屬於免疫球蛋白超家族之I型跨膜醣蛋白。醣蛋白表現於B細胞及濾泡性樹突狀細胞上且在B細胞癌症及自體免疫疾病中起作用。B細胞相關癌症之實例包括但不限於白血病（例如毛細胞白血病（HCL）及慢性淋巴球性白血病（CLL））及淋巴瘤（例如非何傑金氏淋巴瘤（Non-Hodgkins Lymphoma，NHL，諸如瀰漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、伯基特淋巴瘤（Burkitt Lymphoma，BL）、套細胞淋巴瘤（MCL）及濾泡性淋巴瘤）。CD19相關自體免疫疾病之實例包括例如多發性硬化症（MS）、類風濕性關節炎（RA）、全身性紅斑狼瘡及移植物抗宿主（GVH）疾病。抗CD19抗體之實例包括但不限於伊奈利珠單抗（inebilizumab）（MEDI-551），亦即無岩藻糖基化抗人類CD19單株抗體（進一步描述於Herbst等人, B-cell depletion in vitro and in vivo with an afucosylated anti-CD19 antibody. J Pharmacol Exp Ther. (2010) 335:213-22中）；MDX-1342，亦即人類抗CD19抗體（進一步描述於Cardarelli等人, A nonfucosylated human antibody to CD19 with potent B-cell depletive activity for therapy of B-cell malignancies. Cancer Immunol Immunother. (2010) 59:257-65中）；塔法西他單抗（tafasitamab），亦即包含影響效應細胞募集之胺基酸取代S239D/I332E的抗CD19抗體（進一步描述於Rosskopf等人, Enhancing CDC and ADCC of CD19 Antibodies by Combining Fc Protein-Engineering With Fc Glyco-Engineering. Antibodies (2020) 9(4):63中）；及FMC63，亦即對CD19具有特異性之IgG2a單株抗體（進一步描述於Zola等人, Preparation and characterization of a chimeric CD19 monoclonal antibody, Immunol Cell Biol (1991) 69(Pt 6):411-22中）。製備抗體及抗體融合蛋白之方法為此項技術中已知的。

A1-A2域經由胺基酸連接子與抗體（例如抗CD19抗體）之重鏈或輕鏈的N端融合。連接子之長度可為2-8個胺基酸、長度為9-17個胺基酸，或長度為18或更多（例如18-30或18-25）個胺基酸。連接子視情況富含甘胺酸以及絲胺酸、蘇胺酸或帶電荷胺基酸。連接子之實例包括[GGGS（SEQ ID NO: 45）]n，其中n為1-5，諸如GGGS（SEQ ID NO: 45）；[GGGGS（SEQ ID NO: 15）]n，其中n為1-5，諸如GGGGS（SEQ ID NO: 15）、APTSSSGGGGS（SEQ ID NO: 16）及KESGSVSSEQLAQFRSLD（SEQ ID NO: 17）。其他連接子包括例如(GGS)n，其中n為1-5，諸如GGSGGS（SEQ ID NO: 46）。在各種態樣中，融合蛋白之抗體之各重鏈在N端處經由胺基酸連接子與A1-A2域融合，且連接子之長度為9-17個胺基酸（例如SEQ ID NO: 16）或長度為18或更多個胺基酸（諸如長度為18-30或18-25個胺基酸）（例如SEQ ID NO: 17）。在本發明之各種替代態樣中，融合蛋白之抗體之各輕鏈在N端處經由胺基酸連接子與A1-A2域融合，且連接子之長度為2-8個胺基酸（例如SEQ ID NO: 15）或長度為9-17個胺基酸（例如SEQ ID NO: 16）。

雖然本發明在上文各種態樣中聚焦於抗CD19抗體作為A1-A2域肽之融合搭配物，但應瞭解本發明之A1-A2域肽可與其他抗體或抗體之抗原結合片段融合。以上關於抗CD19抗體之結構的揭示內容亦適用於其他抗原結合蛋白及抗體（亦即結合其他目標之抗體）。抗體可為單株抗體或多特異性抗體（例如雙特異性抗體）。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab') ₂及Fv片段。抗體或其片段可靶向任何其他適合的抗原，諸如表現於癌細胞表面上之抗原。抗原之實例包括但不限於CD20、BMCA、HER2、EGFR、EpCAM、CEA、BCMA、PSMA、CD19、CD20、CD22、CD33、CD37、CD38、CD123、CD276（B7-H3）、GPC2、GPC3、GPRC5D、WT-1、NY-ESO-1、CLDN4、CLDN6、CLDN18.2、PSCA及TSPAN8。

本發明亦提供一種套組，其包含一或多個包含本文所述之抗體融合蛋白的容器及/或本文所述之呈現CAR的免疫細胞。套組可進一步包含關於抗體融合蛋白之適應症及用量之說明書及書面資訊。亦考慮注射器，例如單次使用或預填充注射器；包含抗體融合蛋白或免疫細胞之無菌密封容器，例如小瓶、瓶、器皿及/或套組或封裝，視情況具有適合的使用說明書。在另一態樣中，本發明提供一種製品或單位劑型，其包含：（a）包含本文所述之抗體融合蛋白或本文所述之免疫細胞的物質組合物；（b）含有該組合物之容器；及（c）貼附至該容器之標籤或包括於該容器中之藥品說明書，其提及該抗體融合蛋白及/或免疫細胞在治療疾病或病症（例如，癌症）中之用途。本文亦提供包含抗體融合蛋白及/或表現如本文所述之CAR的細胞及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑的組合物。在例示性態樣中，該組合物為無菌組合物。

本發明考慮包含細胞療法方案之組分的系統或套組。在各種態樣中，第一組分為本文所述之抗體融合蛋白，亦即結合以下兩者的雙特異性、基於抗體之融合蛋白：（i）細胞表面抗原（例如癌細胞表面抗原，諸如CD19）及（ii）本文所述之CAR。第二組分為哺乳動物細胞（例如，人類細胞，諸如人類免疫細胞），其經遺傳修飾以表現本文所述之嵌合抗原受體（CAR），亦即包含以下之CAR：突變型NKG2D胞外域（例如，包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或其包含SEQ ID NO: 1內之胺基酸位置118處之取代的變異體）、IgG4鉸鏈域（例如，包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列）、跨膜域（例如，CD8a跨膜域，諸如包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的跨膜域）、胞內信號傳導域（例如，CD3ζ胞內信號傳導域，諸如包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列的胞內信號傳導域）及協同刺激域（例如，4-1BB協同刺激域，諸如包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列的協同刺激域）。在各種態樣中，細胞為淋巴球或巨噬細胞，例如人類淋巴球（諸如人類T細胞）或人類巨噬細胞。在各種態樣中，第二組分為人類自然殺手（NK）細胞（例如自體人類NK細胞）；本文中關於T細胞之揭示內容亦適用於NK細胞。套組包含一或多個包含表現CAR之細胞的容器，及一或多個包含抗體融合蛋白的容器。套組可進一步包含關於本文所述之組分之適應症及用量之說明書及書面資訊。

本發明進一步提供一種治療有需要之個體之疾病或病症的方法。就此而言，本發明考慮抗體融合蛋白及免疫細胞以用作藥物，以及抗體融合蛋白及免疫細胞在製備供治療有需要之個體之疾病或病症用之藥物中的用途。抗體融合蛋白包含結合目標細胞上之細胞表面抗原（諸如癌細胞上所呈現之細胞表面抗原）的抗體。視情況，該疾病或病症為癌症，但本發明亦考慮治療其他疾病或病症，包括與表現CD19之細胞相關的疾病或病症。該方法包含向該個體投與本文所述之表現CAR之細胞（例如表現本文所述之基於iNKG2D之CAR的T細胞或NK細胞）且向該個體投與本文所述之抗體融合蛋白。視情況，該癌症為CD19陽性癌症，且該抗體融合蛋白包含抗CD19抗體。亦視情況，所投與之融合蛋白之抗體的各重鏈在N端處經由長度為9-17個胺基酸（例如SEQ ID NO: 16）或長度為18-30個胺基酸（例如SEQ ID NO: 17）之胺基酸連接子與A1-A2域融合。替代地，向該個體投與之融合蛋白之抗體的各輕鏈可在N端處經由長度為2-8個胺基酸（例如SEQ ID NO: 15）或長度為9-17個胺基酸（例如SEQ ID NO: 16）之胺基酸連接子與A1-A2域融合。癌症之實例包括但不限於白血病及淋巴瘤，諸如毛細胞白血病、慢性淋巴球性白血病及非何傑金氏淋巴瘤（例如瀰漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套細胞淋巴瘤及濾泡性淋巴瘤）。

本文所述之抗體融合蛋白能夠僅在表現由抗體融合蛋白識別之目標抗原之細胞的存在下活化表現iNKG2D-CAR之細胞（例如T細胞）。當與靶向其他抗原之額外抗體融合蛋白（亦即具有結合不同細胞表面抗原之不同可變區的抗體融合蛋白）一起使用時，免疫細胞可同時或依序靶向不同抗原以介導細胞溶解；此方法可幫助解決例如由於目標抗原丟失引起之腫瘤抗性及逃逸問題，而不必產生、擴增及輸注多個不同自體CAR細胞。此高度模組化系統擴大過繼細胞療法之潛力且克服現有細胞療法之許多缺點，包括嚴重全身性毒性、抗原逃逸亦即當前CAR-T及CAR-NK細胞治療法之受限及不可控的持久性。

如本文所用，術語「治療」以及與其相關之字組未必暗示100%或完全治療或緩解。相反，存在不同程度之治療，一般熟習此項技術者認可該等程度之治療具有潛在益處或治療作用。就此而言，治療疾病或病症之方法可提供任何量或任何水平之治療。此外，藉由該方法提供之治療可包括待治療之疾病之一或多種病狀或症狀或病徵的治療。舉例而言，本發明之治療方法可抑制疾病之一或多種症狀。另外，藉由本發明之方法提供之治療可涵蓋減緩疾病之進程。

針對癌症之治療可以藉由多種方式中之任一者確定。考慮個體健康方面之任何改善（例如本文所述之任何參數的至少或約10%減輕、至少或約20%減輕、至少或約30%減輕、至少或約40%減輕、至少或約50%減輕、至少或約60%減輕、至少或約70%減輕、至少或約80%減輕、至少或約90%減輕或至少或約95%減輕）。舉例而言，治療反應將係指疾病方面之以下改善中之一或多者：（1）贅生性細胞之數目減少；（2）贅生性細胞死亡增加；（3）贅生性細胞存活之抑制；（5）腫瘤生長之抑制（亦即，在一定程度上減緩，較佳停止）或新病灶出現；（6）腫瘤大小或負荷減小；（7）不存在臨床上可偵測疾病，（8）癌症標記水平降低；（9）患者存活率提高；及/或（10）與疾病或病狀（例如，疼痛）相關之一或多個症狀的一定緩解。另外，治療功效亦可根據對其他免疫療法治療或化學療法之反應性來表徵。在各種態樣中，本發明之方法進一步包含監測個體中之治療。

在各種態樣中，個體為哺乳動物，包括但不限於嚙齒目（Rodentia）哺乳動物，諸如小鼠及倉鼠；及兔形目（Logomorpha）哺乳動物，諸如兔；食肉目（Carnivora）哺乳動物，包括貓科動物（貓）及犬科動物（犬）；偶蹄目（Artiodactyla）哺乳動物，包括牛科動物（牛）及豬科動物（豬）或奇蹄目（Perssodactyla）哺乳動物，包括馬科動物（馬）。在一些態樣中，哺乳動物屬於靈長目、猿目或猴目（猴）或類人目（人類及猿）。在一些態樣中，哺乳動物為人類。可使用多種途徑中之任一者向個體遞送治療組合物，包括非經腸、局部、經口、鞘內或局部投與。實際上，組合物可經皮下、皮內（intracutaneously）、皮內（intradermally）、靜脈內、動脈內、瘤內、非經腸、腹膜內、肌肉內、眼內、骨內、硬膜外、硬膜內、瘤內及其類似方式投與。

本發明亦提供編碼本文所述之嵌合抗原受體的核酸分子。本發明亦提供（i）編碼本文所述之抗體融合蛋白之輕鏈的核酸分子（亦即，經分離之核酸）及（ii）編碼本文所述之抗體融合蛋白之重鏈的核酸分子（亦即，經分離之核酸），以及包含（i）及/或（ii）之組合物。本發明進一步提供核酸分子，其包含編碼本發明之抗體融合蛋白之重鏈及輕鏈兩者的核酸序列。本發明之核酸包括編碼本文中所揭示之胺基酸序列中之任一者的核酸，以及包含與本發明之核酸（亦即序列表中所闡述之核酸序列）具有至少80%、更佳至少約90%、更佳至少約95%且最佳至少約98%一致性之核苷酸序列的核酸。本發明之核酸包括編碼本文所揭示之胺基酸序列中之任一者的核酸，以及編碼與本發明之胺基酸序列（亦即序列表中闡述之胺基酸序列）具有至少80%、更佳至少約90%、更佳至少約95%且最佳至少約98%一致性之胺基酸序列的核酸。

本發明之核酸可選殖至表現載體，諸如質體、黏質體、桿狀病毒質體（bacmid）、噬菌體、人工染色體（BAC、YAC）或病毒中，另一基因序列或元件（DNA或RNA）可插入至該表現載體中以便引起所連接之序列或元件之複製。在一些實施例中，表現載體含有組成型活性啟動子區段（諸如但不限於CMV、SV40、延長因子或LTR序列）或誘導型啟動子序列，諸如類固醇誘導型pIND載體（Invitrogen），其中核酸之表現可經調節。本發明之表現載體可進一步包含調節序列，例如內部核糖體進入位點。分泌信號肽序列亦可視情況由可操作地連接至相關編碼序列之表現載體編碼，使得經表現之多肽可由重組宿主細胞分泌，以更便捷地自細胞分離相關多肽。舉例而言，表現載體可藉由轉染引入至細胞中。

亦提供包含核酸分子（視情況包含於表現載體中）之宿主細胞。宿主細胞可為原核細胞，例如大腸桿菌（ E . coli）細胞，或真核細胞，例如哺乳動物細胞或酵母細胞。酵母細胞包括例如釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe）及巴斯德畢赤酵母（ Pichia pastoris）細胞。哺乳動物細胞包括例如VERO、HeLa、中國倉鼠卵巢（CHO）、W138、嬰兒倉鼠腎（BHK）、COS-7、MDCK、人類胚腎細胞株293、非洲綠猴腎細胞及COS細胞。本發明之重組蛋白產生細胞亦包括已知之任何昆蟲表現細胞株，諸如例如草地黏蟲（ Spodoptera frugiperda）細胞。在一個實施例中，細胞為哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。在本發明之抗體融合蛋白的情形下，本發明提供（i）宿主細胞，其包含：包含編碼在N端處與A1A2域融合的抗體重鏈之核苷酸序列的核酸分子；及包含編碼抗體融合蛋白之輕鏈之核苷酸序列的核酸分子，以及（ii）宿主細胞，其包含：包含編碼在N端處與A1A2域融合的抗體輕鏈之核苷酸序列的核酸分子；及包含編碼抗體融合蛋白之重鏈之核苷酸序列的核酸分子。

本發明進一步提供一種產生抗體融合蛋白之方法。該方法包含培養宿主細胞（經分離之宿主細胞），該宿主細胞包含：包含編碼抗體融合蛋白之輕鏈之核苷酸序列的核酸分子；及包含編碼抗體融合蛋白之重鏈之核苷酸序列的核酸分子。該方法進一步包含回收抗體融合蛋白。用於產生重組蛋白（諸如抗體蛋白）之培養條件及方法為此項技術中已知的。類似地，蛋白質純化方法為此項技術中已知的且在本文中用於自細胞培養基回收重組蛋白。在一些態樣中，用於蛋白質及抗體純化之方法包括過濾、親和管柱層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析及濃縮。視情況，該方法包含調配抗體融合蛋白。

本文亦提供一種產生呈現本發明之CAR之免疫細胞的方法。該方法包含在允許CAR在細胞表面上表現及呈現（亦即允許加工CAR蛋白及將其併入細胞膜中以使得胞外域呈遞於細胞表面上）之條件下將編碼CAR之核酸分子引入免疫細胞中。視情況，該方法包含調配免疫細胞。

以下實例僅為說明本發明而給出，且不以任何方式限制其範疇。 實例

本文所述之此實例及其他實施係例示性的，且並不意欲在描述本發明之組合物及方法之完整範疇方面為限制性的。可在本發明之範疇內對特定實施、材料、組合物及方法進行等效改變、修改及變化，具有實質上類似的結果。

此實例證實抗體融合蛋白（包含與抗體重鏈或抗體輕鏈之N端或C端融合的A1-A2域）結合包含本發明之嵌合抗原受體之CAR-T細胞的能力，及抗體融合蛋白及CAR-T細胞組合活體內殺滅癌細胞之能力。包含與親本抗體之兩條輕鏈之N端融合的A1-A2域的抗體融合蛋白展現出人意料地優良活性。

使用抗CD19抗體FMC63（SEQ ID NO: 21及22包含信號序列，SEQ ID NO: 23及24不具有信號序列）作為親本抗體來構築抗體融合蛋白。SEQ ID NO: 11之A1-A2域與親本抗體之κ輕鏈或重鏈之N端或C端融合。產生構築體，其中A1-A2域經由代表性「短」連接子（GGGGS；SEQ ID NO: 15）、代表性「中等」連接子（APTSSSGGGGS；SEQ ID NO: 16）或代表性「長」連接子（KESGSVSSEQLAQFRSLD；SEQ ID NO: 17）與重鏈或輕鏈融合。另外，將D265A/N297A（Kabat編號）突變引入抗體重鏈之CH2域中，消除抗體依賴性細胞毒性（ADCC）功能。構築體之序列闡述於SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42及44中。

亦產生包含本發明之CAR的CAR-T細胞。構築CAR，其包含CD8α鏈信號序列、NKG2D變異體胞外域（在本文中亦稱為「iNKG2D」）、CD8a鉸鏈或IgG4鉸鏈、CD8a跨膜域、4-1BB協同刺激域、CD3ζ胞內信號傳導域。產生包括與eGFP（綠色螢光蛋白）連接之CAR序列的構築體。域及全長構築體之序列闡述於SEQ ID NO: 1-9中。FMC63之VH域及VL域取代NKG2D胞外域以產生基於FMC63 scFv之CAR（FMC63scFv CAR）（SEQ ID NO: 20）。

檢驗各種構築體殺滅癌細胞之能力。拉莫斯人類B細胞淋巴瘤細胞（ATCC #CRL-1596）經工程改造以表現螢火蟲螢光素酶，且與在CAR構築體中包含CD8a-鉸鏈或IgG4-鉸鏈之iNKG2D CAR-T細胞共培養。將細胞與增加濃度之抗CD19抗體融合蛋白一起培育隔夜。定量螢光素酶信號之量且使資料相對於在僅CAR-T細胞處理（0 nM抗體融合蛋白）對照組情況下觀測到之信號進行正規化。誤差條對應於分析中一式三份樣品之標準差。

圖2A繪示三種具有不同鉸鏈長度（CD8a-鉸鏈（45個胺基酸）與IgG4-鉸鏈（12個胺基酸））之CAR-T細胞之抗體融合蛋白型式的直接比較。相比於包含與N端融合之A1-A2域的型式，由LC.S3及HC.S3抗體融合蛋白型式（其包含與重鏈或輕鏈之C端融合的A1-A2域）介導之細胞溶解水平更差。FMC63-S3中等.LC對應於如下抗體融合蛋白，其中A1-A2域經由長度包含11個胺基酸之「中等」連接子與輕鏈之N端融合。在CD8-鉸鏈CAR及IgG4-鉸鏈CAR兩者情況下，N端融合之A1-A2域均增強了細胞毒性。A1-A2域之N端融合物及CAR構築體中之IgG4-鉸鏈之組合產生優良結果。圖2B比較跨兩種不同CAR-T鉸鏈長度具有N端A1-A2域融合之抗體融合蛋白。所有N端融合HC分子均展現細胞殺滅活性。A1-A2域與輕鏈N端融合之構築體介導更強健的細胞毒性，其中包含「短」連接子及「中等」連接子之型式展現更優良活性。

亦進行研究以確認各種抗體融合蛋白靶向細胞之能力。將拉莫斯人類B細胞淋巴瘤細胞與不同濃度之基於FMC63之抗體融合蛋白一起培育隔夜，且次日用抗人類Fc抗體偵測結合的抗體。圖3展示各型式之中值螢光強度（MFI）曲線。在GraphPad Prism中計算EC50值。外源域與抗體N端之融合可能阻斷或妨礙Fv區域結合其抗原決定基之能力。結合之減少可能會或可能不會影響細胞溶解。此研究之資料證明，大部分所測試之抗體融合蛋白能夠在無顯著結合親和力損失的情況下接合其目標抗原決定基。

亦檢驗本發明之系統活體內控制腫瘤負荷之能力。向小鼠靜脈內（IV）注射5×10 ⁵個經穩定轉染以組成性表現螢光素酶（Perkin Elmer RediFect Red-FLuc-GFP #CLS960003）之Raji B細胞淋巴瘤細胞（ATCC #CCL-86）。兩天後以每隻小鼠20 μg投與抗體融合蛋白，之後，次日（研究第0天，對於圖4A為5×10 ⁶個iNKG2D CAR-T細胞，或對於圖4B為3×10 ⁶個iNKG2D CAR-T細胞）靜脈內輸注CAR-T細胞。在接受抗體融合蛋白之各組中，每兩天向小鼠再給藥，總共五次劑量。出於比較目的，向一組個體投與FMC63scFv CAR-T細胞而無抗體融合蛋白（對於圖4A為3×10 ⁶個FMC63scFv CAR-T細胞，或對於圖4B為3×10 ⁶個FMC63scFv CAR-T細胞）。用抗體融合蛋白及包含CD8a鉸鏈之iNKG2D CAR-T細胞處理未顯著控制腫瘤負荷。參見圖4A。相比之下，N端融合之抗體融合物型式（在此處為具有「中等」連接子）在與包含IgG4鉸鏈之iNKG2D CAR-T細胞一起投與時展現出腫瘤控制方面之顯著改善。

該實例描述特許的CAR-配位體配對（iNKG2D.IgG4鉸鏈及包含經由連接子在重鏈或輕鏈之N端處融合之經修飾A1-A2域的抗體融合蛋白）之工程改造，從而提供用於細胞療法之通用且廣泛可控制的平台。該系統之各組分（基於iNKG2D之CAR受體及抗體融合蛋白）自身在功能上為惰性的。配對時，該系統介導對癌細胞之強力細胞溶解。本發明鑑別出一種CAR構築體及抗體融合物形式，其出乎意料地優於其他構築體及型式，尤其當一起使用時。本文所述之系統已證明活體內控制腫瘤負荷（在此處為表現CD19之癌細胞）之能力得到增強。

本文中所引用之所有參考文獻，包括公開案、專利申請案及專利均特此以引用之方式併入，其引用程度就如同個別及特定地指示各參考文獻以引用之方式併入且全文闡述於本文中一般。以下專利公開案以全文（包括其序列表）引用之方式明確併入：美國專利第8,658,765號、第10,259,858號、第11,440,948號及第11,453,713號；以及國際專利公開案第WO 2019/191243號、第WO 2020/097064號及第WO 2022/261121號。

雖然已參考若干實施例描述了本發明，該等實施例已出於形成本發明之完整揭示內容的目的相當詳細地加以闡述，但此等實施例僅為例示性的且並不意欲為限制性的或表示本發明之所有態樣的詳盡列舉。本發明之範疇係由在此隨附之申請專利範圍確定。此外，熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本發明之精神及原理的情況下對此類細節進行諸多改變。

圖1為抗體融合蛋白之各種型式的示意圖，該等抗體融合蛋白包含經由胺基酸連接子與抗體重鏈或抗體輕鏈之N端或C端融合的A1-A2域。

圖2A為繪示藉由以下介導之對拉莫斯（Ramos）細胞之細胞溶解的百分比（y軸）的條形圖：（i）包含在融合蛋白上不同位置處融合之A1-A2域的抗CD19抗體融合蛋白，及（ii）呈現嵌合抗原受體（CAR）之T細胞，該等嵌合抗原受體包含經修飾之NKG2D胞外域、CD8鉸鏈或IgG4鉸鏈、CD3ζ胞內信號傳導域及4-1BB協同刺激域。相比於包含與N端融合之A1-A2域的型式，由LC.S3及HC.S3抗體融合蛋白型式（其包含與重鏈或輕鏈之C端融合的A1-A2域）介導之細胞溶解水平更差。FMC63-S3中等.LC對應於與抗體輕鏈之N端融合物，其具有長度包含11個胺基酸之「中等」連接子。使用包含含CD8a-鉸鏈（45個胺基酸）之CAR的T細胞以及包含含IgG4-鉸鏈（12個胺基酸）之CAR的T細胞進行實驗。在CD8-鉸鏈CAR及IgG4-鉸鏈CAR兩者情況下，N端融合之A1-A2域均增強了細胞毒性。A1-A2域之N端融合物及CAR構築體中之IgG4-鉸鏈之組合產生優良結果。

圖2B為繪示藉由以下介導之對拉莫斯細胞之細胞溶解的百分比（y軸）的條形圖：（i）包含在融合蛋白上不同位置處融合之A1-A2域的抗CD19抗體融合蛋白，及（ii）呈現CAR之T細胞，該等CAR包含NKG2D胞外域、CD8鉸鏈或IgG4鉸鏈、CD3ζ胞內信號傳導域及4-1BB協同刺激域。使用不同連接子長度將A1-A2域與抗CD19抗體之重鏈或輕鏈之N端融合。S3短.LC對應於與抗體輕鏈之N端融合物，其具有長度包含五個胺基酸之「短」連接子；S3中等.LC對應於與抗體輕鏈之N端融合物，其具有長度包含11個胺基酸之「中等」連接子；S3長.LC對應於與抗體輕鏈之N端融合物，其具有長度包含18個胺基酸之「長」連接子；S3短.HC對應於與抗體重鏈之N端融合物，其具有長度包含五個胺基酸之「短」連接子；S3中等.HC對應於與抗體重鏈之N端融合物，其具有長度包含11個胺基酸之「中等」連接子；且S3長.HC對應於與抗體重鏈之N端融合物，其具有長度包含18個胺基酸之「長」連接子。LC.S3對應於包含與抗CD9抗體之輕鏈之C端融合的A1-A2域的融合物。利用呈現CD8a-鉸鏈（45個胺基酸）CAR之T細胞以及呈現IgG4-鉸鏈（12個胺基酸）CAR之T細胞進行研究。所有N端融合HC分子均展現細胞殺滅活性。A1-A2域與輕鏈N端融合之構築體介導更強健的細胞毒性，其中包含「短」連接子及「中等」連接子之型式展現更優良活性。

圖3為藉由使拉莫斯細胞與各種濃度（x軸，nM）之抗CD19抗體融合蛋白一起培育隔夜所產生之中值螢光強度（MFI）曲線，該等融合蛋白包含經由各種長度之連接子在該等融合蛋白上之不同位置處融合之A1-A2域。該圖表明，抗體融合蛋白保留結合目標抗原決定基之能力而無顯著結合親和力損失。

圖4A繪示活體內研究之結果，其中將5×10 ⁵個Raji.luc細胞注射至小鼠中，且小鼠稍後接受抗CD19抗體融合蛋白，其包含在該等融合蛋白上之不同位置處融合之A1-A2域。隨後向小鼠投與5×10 ⁶個包含CD8a鉸鏈之iNKG2D CAR-T細胞。總通量（p/s；y軸）表示冷光輸出，其對應於腫瘤負荷。出於比較目的，向一組個體投與5×10 ⁶個FMC63scFv CAR-T細胞而無抗體融合蛋白。用抗體融合蛋白及包含CD8a鉸鏈之iNKG2D CAR-T細胞處理並未顯著控制腫瘤負荷；相比之下，FMC63scFv CAR-T細胞處理控制腫瘤生長。

圖4B繪示活體內研究之結果，其中將5×10 ⁵個Raji.luc細胞注射至小鼠中，且小鼠稍後接受抗CD19抗體融合蛋白及3×10 ⁶個包含IgG4鉸鏈之iNKG2D CAR-T細胞，該融合蛋白包含經由長度為11個胺基酸之「中等」連接子在輕鏈之N端處融合之A1-A2域。出於比較目的，向一組個體投與3×10 ⁶個FMC63scFv CAR-T細胞而無抗體融合蛋白。當與包含IgG4鉸鏈之CAR-T細胞一起投與時，具有「中等」連接子之N端融合型式展現出腫瘤控制方面之顯著改善。FMC63scFv CAR-T細胞處理亦控制腫瘤生長。

圖5為提供本文所述之各種序列的圖表。就SEQ ID NO: 1-10、18及19而言，序列之斜體部分對應於A1-A2域，序列之加粗及加下劃線的部分對應於鉸鏈序列，加粗及斜體部分對應於跨膜域序列，斜體及加下劃線的部分對應於協同刺激域序列，且加粗部分對應於胞內域區域。單純加下劃線的區域對應於信號序列。SEQ ID NO: 18及19對應於進一步包含甘胺酸-絲胺酸連接子（雙下劃線）及綠色螢光蛋白之胺基酸序列的CAR構築體。在SEQ ID NO: 21-44中，加虛線下劃線表示可變區序列，加深色（加粗）下劃線表示恆定區序列，具有波浪下劃線之加粗文字表示連接子序列，且無下劃線之純文字表示A1-A2域序列。本發明考慮各種域以及全長構築體作為本發明之態樣。

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Claims (53)

1. 一種嵌合抗原受體，其包含突變型NKG2D胞外域、IgG4鉸鏈域、跨膜域、胞內信號傳導域及協同刺激域。
2. 如請求項1之嵌合抗原受體，其中該突變型NKG2D胞外域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或其變異體，該變異體包含在SEQ ID NO: 1內之胺基酸位置118處的取代。
3. 如請求項1之嵌合抗原受體，其中該突變型NKG2D胞外域包含與SEQ ID NO: 1包含至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
4. 如請求項1至3中任一項之嵌合抗原受體，其中該IgG4鉸鏈域包含與SEQ ID NO: 2包含至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
5. 如請求項1至4中任一項之嵌合抗原受體，其中該跨膜域為CD8a跨膜域。
6. 如請求項1至5中任一項之嵌合抗原受體，其中該跨膜域包含與SEQ ID NO: 3包含至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
7. 如請求項1至6中任一項之嵌合抗原受體，其中該胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO: 5包含至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
8. 如請求項1至7中任一項之嵌合抗原受體，其中該協同刺激域包含與SEQ ID NO: 4包含至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
9. 一種核酸分子，其包含編碼如請求項1至8中任一項之嵌合抗原受體的核酸序列。
10. 一種表現載體，其包含如請求項9之核酸分子。
11. 一種細胞，其包含如請求項10之表現載體。
12. 一種免疫細胞，其呈現如請求項1至8中任一項之嵌合抗原受體。
13. 如請求項12之免疫細胞，其為T細胞、巨噬細胞或自然殺手（NK）細胞。
14. 一種包含抗體重鏈及抗體輕鏈之抗體融合蛋白，其中該等重鏈或該等輕鏈在其N端處經由胺基酸連接子與A1-A2域融合，該A1-A2域包含與SEQ ID NO: 11包含至少90%、至少95%或至少99%一致性之胺基酸序列。
15. 如請求項14之抗體融合蛋白，其中該A1-A2域包含與SEQ ID NO: 11包含至少90%、至少95%或至少99%一致性且進一步在位置40、54及/或84中之一或多者處包含丙胺酸或麩醯胺酸的胺基酸序列。
16. 如請求項15之抗體融合蛋白，其中該A1-A2域包含SEQ ID NO: 11之位置40及54處之麩醯胺酸殘基。
17. 如請求項15或請求項16之抗體融合蛋白，其中該A1-A2域包含SEQ ID NO: 11之位置84處之麩醯胺酸。
18. 如請求項15或請求項16之抗體融合蛋白，其中該A1-A2域包含SEQ ID NO: 11之位置84處之丙胺酸。
19. 如請求項14之抗體融合蛋白，其中肽包含SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14。
20. 如請求項14之抗體融合蛋白，其中該A1-A2域包含SEQ ID NO: 11。
21. 如請求項14至20中任一項之抗體融合蛋白，其中該連接子之長度為2-8個胺基酸。
22. 如請求項14至20中任一項之抗體融合蛋白，其中該連接子之長度為9-17個胺基酸。
23. 如請求項14至20中任一項之抗體融合蛋白，其中該連接子之長度為18-30個胺基酸。
24. 如請求項14至20中任一項之抗體融合蛋白，其中連接子包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。
25. 如請求項14至20中任一項之抗體融合蛋白，其中連接子包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。
26. 如請求項14至20中任一項之抗體融合蛋白，其中該連接子包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。
27. 如請求項14至26中任一項之抗體融合蛋白，其中該抗體為抗CD19抗體。
28. 如請求項14至27中任一項之抗體融合蛋白，其中各重鏈在該N端處經由該胺基酸連接子與A1-A2域融合。
29. 如請求項28之抗體融合蛋白，其中該連接子之長度為9-17個胺基酸或長度為18-30個胺基酸。
30. 如請求項14至27中任一項之抗體融合蛋白，其中各輕鏈在該N端處經由該胺基酸連接子與A1-A2域融合。
31. 如請求項30之抗體融合蛋白，其中該連接子之長度為2-8個胺基酸或長度為9-17個胺基酸。
32. 一種核酸分子，其包含編碼如請求項28之抗體融合蛋白之該重鏈的核苷酸序列。
33. 一種核酸分子，其包含編碼如請求項30之抗體融合蛋白之該輕鏈的核苷酸序列。
34. 一種表現載體，其包含如請求項32或請求項33之核酸分子。
35. 一種組合物，其包含如請求項32之核酸分子及包含編碼如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白之該輕鏈的核苷酸序列之核酸分子。
36. 一種組合物，其包含如請求項33之核酸分子及包含編碼如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白之該重鏈的核苷酸序列之核酸分子。
37. 一種宿主細胞，其包含如請求項32之核酸分子及包含編碼如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白之該輕鏈的核苷酸序列之核酸分子。
38. 一種宿主細胞，其包含如請求項33之核酸分子及包含編碼如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白之該重鏈的核苷酸序列之核酸分子。
39. 一種產生抗體融合蛋白之方法，該方法包含： 培養如請求項37或請求項38之宿主細胞，及 回收該抗體融合蛋白。
40. 一種套組，其包含一或多個包含如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白的容器及使用說明書。
41. 如請求項40之套組，其進一步包含一或多個包含如請求項12或請求項13之免疫細胞的容器。
42. 一種套組，其包含一或多個包含如請求項12或請求項13之免疫細胞的容器及使用說明書。
43. 如請求項40至42中任一項之套組，其中該嵌合抗原受體包含SEQ ID NO: 1-5。
44. 一種治療罹患癌症之個體的方法，該方法包含向該個體投與（i）如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白及（ii）如請求項12或請求項13之免疫細胞，其中該抗體融合蛋白包含結合癌細胞上所呈現之細胞表面抗原的抗體。
45. 如請求項44之方法，其中該癌症為CD19陽性癌症，且該抗體融合蛋白包含抗CD19抗體。
46. 如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白及如請求項12或請求項13之免疫細胞，其用作藥物。
47. 如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白及如請求項12或請求項13之免疫細胞，其用於治療有需要之個體的癌症，其中該抗體融合蛋白包含結合癌細胞上所呈現之細胞表面抗原的抗體。
48. 如請求項47之抗體融合蛋白及免疫細胞，其中該癌症為CD19陽性癌症，且該抗體融合蛋白包含抗CD19抗體。
49. 一種如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白及如請求項12或請求項13之免疫細胞的用途，其用作藥物。
50. 一種如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白及如請求項12或請求項13之免疫細胞的用途，其用於治療有需要之個體的癌症。
51. 如請求項50之用途，其中該癌症為CD19陽性癌症，且該抗體融合蛋白包含抗CD19抗體。
52. 一種如請求項14至31中任一項之抗體融合蛋白及如請求項12或請求項13之免疫細胞的用途，其用於製備供治療有需要之個體之癌症用的藥物。
53. 如請求項52之用途，其中該癌症為CD19陽性癌症，且該抗體融合蛋白包含抗CD19抗體。

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