TW202436347A - 抗ｉｌｔ４和抗ｐｄ－１雙特異性構建體 - Google Patents

Abstract

本文提供了新穎的抗ILT4和抗PD‑1的雙特異性構建體，及其相應的組合物。本文還提供了施用本文描述的構建體或組合物，誘導或增強免疫應答的方法，以及治療癌症的方法。

Description

抗ILT4和抗PD-1雙特異性構建體

本發明是有關於雙特異性構建體，以及雙特異性構建體可用於誘導或增強免疫應答的方法以及治療疾病或病況（例如，癌症）的方法。

抑制性免疫檢查點受體“免疫球蛋白樣轉錄子4”（ILT4）是非催化酪氨酸磷酸化受體家族的成員，表達於免疫細胞（例如T細胞、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和肥大細胞）。與此家族的其他受體一樣，ILT4包含位於胞質域的保守胺基酸序列，稱為基於免疫受體酪氨酸的抑制基序（ITIM）（Veillette et al. (2002) Annual Review of Immunology 20(1):669-707）。ILT4通過其同源配體（髓系細胞中的HLA-G和HLA I類）結合和啟動，通過多種機制發揮免疫抑制作用。ILT4也存在於各種癌症的腫瘤微環境中的腫瘤細胞和間質細胞中，已被證明可以調節腫瘤細胞的生物學行為，從而促進其免疫逃逸（Gao et al. (2018) Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on 20 Cancer 1869(2):278-285）。因此，ILT4在多種腫瘤類型上的表達與不良預後相關。

程式性細胞死亡蛋白1（PD-1）是細胞表面受體，屬於免疫球蛋白超家族，表達於T細胞和pro-B細胞。PD-1結合兩個配體，PD-L1和PD-L2。PD-1通過下調免疫系統和通過抑制T細胞炎症活性促進自身耐受來調節免疫系統對人體細胞的應答。這防止了自身免疫性疾病，但也可以阻止免疫系統殺死癌細胞。PD-1是免疫檢查點，通過兩種機制防止自身免疫：（a）促進淋巴結中抗原特異性T細胞的凋亡（程式性細胞死亡）以及（b）減少調節性T細胞（抗炎、抑制性T細胞）的凋亡。抑制PD-1可逆轉免疫抑制。

儘管在抗體療法方面取得了進展，但在本領域內，仍需要新的和改進的治療劑來治療例如需要刺激免疫應答的病況或疾病。因此，本發明的目的是提供改進方法，以治療具有所述病況或疾病（例如癌症）的個體。

本申請提供新穎的雙特異性構建體，其包含與抗PD-1結合結構域連接的抗ILT4結合結構域。如本申請所述，本發明的雙特異性構建體可用於誘導或增強免疫應答的方法以及治療疾病或病況（例如，癌症）的方法。

在一個實施方式中，雙特異性構建體包含與抗PD-1結合結構域連接的抗ILT4結合結構域，其中， （a）抗ILT4結合結構域包含重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3結構域，其具有下列序列： （i）含有選自共有序列的胺基酸序列：G Y T (I, M) H（SEQ ID NO: 21）的重鏈可變區CDR1，或其保守序列修飾； （ii）如SEQ ID NO: 3所示胺基酸序列的重鏈可變區CDR2，或其保守序列修飾； （iii）含有選自共有序列的胺基酸序列：E R P G G S Q F I Y Y Y (P, A) (M, L) D Y（SEQ ID NO: 22）的重鏈可變區CDR3，或其保守序列修飾； （iv）含有選自共有序列的胺基酸序列：R A S (A, E) N I Y S Y L A（SEQ ID NO: 23）的輕鏈可變區CDR1，或其保守序列修飾； （v）含有選自共有序列的胺基酸序列：N A (I, D) T L A E（SEQ ID NO: 24）的輕鏈可變區CDR2，或其保守序列修飾； （vi）如SEQ ID NO: 8所示胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3，或其保守序列修飾； （b）抗PD-1結合結構域包含： （i）分別如SEQ ID NOs: 31、36和41所示胺基酸序列的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾，和分別如SEQ ID NOs: 46、51和56所示胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾；或 （ii）抗PD-1結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 69、74和79所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾，和分別如SEQ ID NOs: 84、89和94所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾，以及人IgG1恒定區。

在另一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含： （a）分別如SEQ ID NOs: 11、13和15所示胺基酸序列的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18所示胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾，或 （b）分別如SEQ ID NOs: 1、3和5所示胺基酸序列的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾；以及分別如SEQ ID NOs: 6、7和8所示胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾。

在另一個實施方式中，雙特異性構建體包含與抗PD-1結合結構域連接的抗ILT4結合結構域，其中： （a）抗ILT4結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 11、13和15所示胺基酸序列的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18所示胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3；和 （b）抗PD1結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 31、36和41所示胺基酸序列的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 46、51和56所示胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3。

在另一個實施方式中，雙特異性構建體的抗ILT4結合結構域包含： （a）如SEQ ID NO: 19所示胺基酸序列的重鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列，以及如SEQ ID NO: 20所示胺基酸序列的輕鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列；或 （b）如SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列的重鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列，和如SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的輕鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列。

在另一個實施方式中，雙特異性構建體的抗PD-1結合結構域包含： （a）如SEQ ID NO: 59所示胺基酸序列的重鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列，以及如SEQ ID NO: 60所示胺基酸序列的輕鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列；或 （b）如SEQ ID NO: 61所示胺基酸序列的重鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列，以及如SEQ ID NO: 62所示胺基酸序列的輕鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列。

在另一個實施方式中，雙特異性構建體的抗ILT4結合結構域包含如SEQ ID NO: 19所示胺基酸序列的重鏈可變區以及如SEQ ID NO: 20所示胺基酸序列的輕鏈可變區。或者，雙特異性構建體的抗ILT4結合結構域包含如SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列的重鏈可變區和如SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的輕鏈可變區。

在另一個實施方式中，雙特異性構建體的抗PD-1結合結構域包含如SEQ ID NO: 59所示胺基酸序列的重鏈可變區和如SEQ ID NO: 60所示胺基酸序列的輕鏈可變區。或者，雙特異性構建體的抗PD-1結合結構域包含如SEQ ID NO: 61所示胺基酸序列的重鏈可變區以及如SEQ ID NO: 62所示胺基酸序列的輕鏈可變區。

在另一個實施方式中，雙特異性構建體的抗ILT4結合結構域包含如SEQ ID NO: 19所示胺基酸序列的重鏈可變區和如SEQ ID NO: 20所示胺基酸序列的輕鏈可變區；以及抗PD-1結合結構域包含如SEQ ID NO: 59所示胺基酸序列的重鏈可變區和如SEQ ID NO: 60所示胺基酸序列的輕鏈可變區。

雙特異性構建體可以是化學綴合物，其可通過抗ILT4結合結構域和抗PD-1結合結構域的化學綴合來製備。在一個實施方式中，所述抗PD-1結合結構域還包含人IgG1恒定結構域。在另一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域與抗PD-1結合結構域的重鏈C末端連接。在另一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域是scFv。

在一個具體的實施方式中，所述雙特異性構建體包含與抗ILT4 scFv連接的抗PD-1結合結構域，其中： （a）抗PD-1結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 31、36和41所示胺基酸序列的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，和分別如SEQ ID NOs: 46、51和56所示胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及IgG1恒定區；和 （b）抗ILT4 scFv包含分別如SEQ ID NOs: 11、13和15所示胺基酸序列的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18所示胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3。

例如，雙特異性構建體包含分別如SEQ ID NOs: 64和63所示序列的重鏈和輕鏈，或分別由SEQ ID Nos: 66和65所示的核苷酸序列編碼。

本發明還提供組合物，其包括本申請所述的任何雙特異性構建體和藥學上可接受的載體，以及包含本申請所述的任何雙特異性構建體和使用說明的試劑盒。

在另一個方面，還提供編碼本申請所述雙特異性構建體（或其部分）的分離的核酸分子，以及包含該核酸的表達載體、和包含該表達載體的宿主細胞。在另一個實施方式中，提供編碼本申請所述任何雙特異性構建體的核酸分子。在另一個實施方式中，所述核酸分子為表達載體的形式。在另一個實施方式中，當在體內施用於受試者時，核酸分子以表達載體的形式表達抗ILT4結合結構域、抗PD-1結合結構域、或這兩個結合結構域。在另一個實施方式中，當在體內施用於受試者時，所述核酸分子以表達載體的形式表達雙特異性構建體的重鏈、輕鏈、或重鏈和輕鏈。

例如，核酸分子包含編碼具有SEQ ID NO: 64所示胺基酸序列的重鏈、具有SEQ ID NO: 63所示胺基酸序列的輕鏈、SEQ ID NOs: 64和63所示的重鏈和輕鏈、或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列的核苷酸序列（例如，與一個或多個前述序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）。

在另一個實施方式中，核酸分子包含編碼重鏈的如SEQ ID NO: 66所示的核苷酸序列、編碼輕鏈的如SEQ ID NO: 65所示的核苷酸序列、編碼重鏈和輕鏈的核苷酸序列、或與其具有至少90%同一性的核苷酸序列（例如，與上述一個或多個序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）。

在另一個實施方式中，用於在受試者中誘導或增強免疫應答（例如，針對抗原）的方法，其包括以有效誘導或增強受試者免疫應答（例如，針對抗原）的量向受試者施用本申請所述任一雙特異性構建體或組合物。

在另一個實施方式中，提供了用於治療受試者的病況或疾病（例如，癌症）的方法，所述方法包括以有效治療病況或疾病的量向受試者施用本申請所述的任一雙特異性構建體或組合物。

在另一個實施方式中，提供了用於治療受試者的腫瘤（例如，表達ILT4、HLA-G、HLA-I型、血管生成素樣蛋白2、Nogo、或ILT4配體的腫瘤）的方法，所述方法包括將本申請所述任一雙特異性構建體或組合物以可有效治療腫瘤的劑量施用於受試者。

所述受試者可以是，例如患有需要免疫應答的刺激的病況或疾病的受試者。在一個實施方式中，需要免疫應答的刺激的病況或疾病是癌症。這種方法包括為受試者施用一種或多種治療劑，例如，其中治療劑是其他抗體，例如抗CD40抗體、抗PD-L1抗體和/或抗CTLA-4抗體。雙特異性構建體（或其組合物）與一種或多種治療劑可以同時、按序施用。

在受試者中誘導或增強免疫反應（例如，針對抗原）的方法可進一步包含為受試者施用抗原。與本申請所述的雙特異性構建體或組合物一起施用的較佳抗原是腫瘤抗原。

為確保更容易地理解本發明，首先定義一些術語。其他的定義貫穿具體描述而給出。

定義

本文所用的術語“免疫球蛋白樣轉錄子4”或“ILT4”是指抑制性免疫檢查點受體和非催化酪氨酸磷酸化受體家族的成員。ILT4又稱白細胞免疫球蛋白樣受體B2（LILRB2）、LIR2、MIR10、和CD85d。ILT4表達於免疫細胞，與抗原遞呈細胞上的MHC I類分子結合，轉導負信號，抑制免疫反應的刺激，例如通過控制炎性反應和細胞毒性以集中免疫反應，限制自身反應性。已鑑定出多種人ILT4亞型。亞型1（收錄號為Q8N423-1）表示標準序列，由598個胺基酸殘基構成。本發明的抗ILT4結合結構域（或其部分）可以與來自人以外物種的ILT4交叉反應。或者，抗ILT4結合結構域可以對人ILT4特異，而對其他物種表現出無交叉反應性。ILT4或任何變體和其亞型，可以從天然表達的細胞或組織中分離得到或使用本領域公知的技術和/或本文所述的技術重組產生。

結合ILT4的配體在本領域內公知，其中包括HLA-G、HLA I類、血管生成素樣蛋白2、b-澱粉樣蛋白、SEMA4A、CD1c/d、CSPs、以及髓鞘抑制劑例如Nogo66、MAG、OMgp。

術語“人類白細胞抗原G”或“HLA-G”（又稱“組織相容性抗原，I類，G”），是ILT4的配體。HLA-G屬於HLA非經典I類重鏈旁系同源物。這種I類分子是由重鏈和輕鏈（β-2微球蛋白）組成的異二聚體。重鏈錨定在膜中。HLA-G在胎兒來源的胎盤細胞上表達。重鏈約為45 kDa，其基因包含8個外顯子。

本文所用的術語“程式性死亡1”、“程式性細胞死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-I”可以互換使用，包括變體、亞型、人PD-1的物種同系物、和與PD-1具有至少一個相同表位的類似物。完整的PD-1序列可以在GenBank登錄號NP_005009中找到。

本文所用的術語“程式性細胞死亡1配體1”、“PD-L1”、“PDCD1配體1”、“程式性死亡配體1”、“B7同源物1”、“B7-H1”和“ILT44”可以互換使用，包括變體、亞型、人PD-L1的物種同系物、和與PD-L1具有至少一個相同表位的類似物。完整的PD-L1序列可以在GenBank登錄號NP_001254635中找到。PD-L1與PD-1的結合轉導抑制性信號，降低這些T細胞的增殖，也可以誘導凋亡，這是由基因Bcl-2的低調控進一步介導的。

本文所用的術語“受試者”包括任何人或非人動物。例如，本發明的方法和組合物可以用於治療免疫紊亂的受試者。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳類和非哺乳類，例如非人靈長類、羊、狗、牛、雞、兩栖類、爬行類等。

本文所用的術語“抗體”是指經二硫鍵而內部連接的至少兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）的蛋白，或其抗原結合部位。各重鏈可以由重鏈可變區（縮寫成VH）和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區可以由CH1、CH2和CH3這三個結構域組成。各輕鏈可以由輕鏈可變區（本文中縮寫成VL）和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區可以由CL這一個結構域組成。VH和VL區可以進一步細分為高變區，稱為互補決定區（CDR），其間穿插著更加保守的稱為骨架區（FR）的區域。各VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的順序排布。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因數，包括免疫系統的多種細胞（例如，效應細胞）和傳統補體系統的第一組分（C1q），的結合。

本文所用中的術語，抗體的“抗原結合部分”（或簡稱為“抗體部分”），是指抗體上保留有特異性結合抗原（例如，人ILT4）能力的一個或多個片段。這種“片段”是例如長度介於約8到1500個胺基酸，適宜地介於約8到745個胺基酸，適宜地介於約8到300個胺基酸，例如介於約8到200個胺基酸，或約10到約50或100個胺基酸的長度。已顯示出，抗體的抗原結合功能可以通過全長抗體的片段來實施。包含在術語抗體的“抗原結合部分”中的結合片段的例子包括（i）Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域構成的單價片段；（ii）F(ab')2片段，可以包含由鉸鏈區二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；（iii）由VH和CH1結構域構成的Fd片段；（iv）由抗體單臂VL和VH結構域構成的Fv片段；（v）由VH結構域構成的dAb片段（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）；和（vi）分離的互補決定區（CDR）；或（vii）兩個或多個分離的CDR的組合，所述分離CDR可任選地通過合成接頭連接。此外，儘管Fv片段的兩個結構域，VL和VH，由不同的基因編碼，它們可以通過重組的方法經合成接頭而連接，其中合成的接頭使得它們可以製備為單個蛋白鏈，其中VL和VH區配對形成單價分子（稱為單鏈Fv（sFv）；參見例如Bird et al., (1988) Science 242: 423-426；和Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883）。這樣的單鏈抗體也意在包括在術語抗體的“抗原結合部分”中。這些抗體片段通過所屬技術領域中具有通常知識者已知的常用技術而得到，且片段經與完整抗體相同的方式進行篩選以供使用。抗原結合部分可以通過重組DNA技術製備，或通過完整的免疫球蛋白的酶或化學裂解得到。

本文所用的，術語“結合結構域”是指蛋白質或抗體的包含與抗原相互作用的胺基酸殘基的部分。結合結構域包括但不限於，抗體（例如，全長抗體）及其抗原結合部分。所述結合結構域賦予結合劑其對抗原的特異性和親和力。該術語也涵蓋具有與免疫球蛋白結合結構域同源或大部分同源的結合結構域的任何蛋白質。這樣的蛋白質可以源自天然來源，或部分或全部合成產生。

本文所用的，術語“雙特異性構建體”、“雙特異性抗體”和“bsAb”是指具有可同時結合兩種不同抗原的連接結合結構域的構建物和抗體。對兩個不同表位具有親和力的雙特異性結構與兩個靶點結合，根據結構的不同，可以以單價或二價方式結合。雙特異性構建體可以通過多種方法產生，例如結合兩個現有的結合結構域，融合兩個雜交瘤細胞系形成一個細胞雜交瘤（Jain et al. (2007) Trends in Biotechnology 25(7), 307–316）或使用基因改造的重組蛋白（Kontermann (2012) Dual targeting strategies with bispecific antibodies. mAbs 4(2), 182–197）。

本文所用的，術語“連接的”是指兩個或更多個分子的締合。連接可以是共價的或非共價的。所述連接也可以是遺傳的（即，重組融合）。可以使用多種本領域公認的技術，例如化學綴合和重組蛋白生產，來實現這樣的連接。

本文所用的，術語“單殖株抗體”是指對特定表位表現出單一結合特異性和親和力的抗體。因此，術語“人單殖株抗體”是指表現出單一結合特異性並且具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和任選的恒定區的抗體。在一個實施方式中，人單殖株抗體由雜交瘤產生，所述雜交瘤包括獲自轉基因非人動物（例如，轉基因小鼠）的B細胞，所述B細胞具有包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組，其與永生化細胞融合的。

如本文所用，術語“重組人抗體”包括通過重組方式製備、表達、創造或分離的所有人抗體，例如（a）從人免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體的動物（例如小鼠）或由其製備的雜交瘤中分離的抗體，（b）從經轉化表達所述抗體的宿主細胞（例如從轉染瘤）中分離的抗體，（c）從重組的組合的人抗體文庫中分離的抗體，和（d）通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段製備、表達、創造或分離的抗體。這樣的重組人抗體包含可變區和恒定區，所述可變區和恒定區利用了特定的人種系免疫球蛋白序列，由種系基因編碼，但是包括隨後的重排和突變，其例如，在抗體成熟期間發生。如本領域中已知的（參見，例如，Lonberg (2005) Nature Biotech .23(9): 1117-1125），可變區包含抗原結合結構域，其由多種基因編碼，所述基因重排以形成對外源抗原特異性的抗體。除重排外，可以通過多個單胺基酸變化（稱為體細胞突變或超突變）進一步修飾可變區，以增加抗體與外源抗原的親和力。恒定區會對抗原的進一步應答中改變（即同種型轉換）。因此，在對抗原應答中，編碼輕鏈和重鏈免疫球蛋白多肽的重排和體細胞突變的核酸分子可與原始核酸分子不具有序列同一性，而會是基本上相同或相似（即，具有至少80％的同一性）。

術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區（如有）的抗體。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（例如，由體外隨機或定點誘變或由體內體細胞突變引入的突變）（參見，Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859)；Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93；以及Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546）。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，其中源自其他種類的哺乳動物物種（例如小鼠）的種系的CDR序列嫁接到人框架序列（即，嵌合的人源化抗體）。

“人源化的”抗體是指將一些、大多數、或所有非人抗體CDR結構域外的胺基酸替換成與人免疫球蛋白來源相關的胺基酸的抗體。在抗體的人源化形式的一個實施方式中，CDR結構域外的一些、大多數、或所有胺基酸已替換成人免疫球蛋白來源的胺基酸，然而在一個或多個CDR結構域內的一些、大多數、或所有胺基酸不變。只要不破壞抗體與特定抗原的結合能力，對胺基酸進行微小的添加、刪除、插入、替換或修飾是允許的。“人源化的”抗體保留了與原始抗體相似的抗原特異性。

如本文所用，“分離的抗體”意指基本上沒有其他具有不同抗原特異性的抗體的抗體（例如，特異性結合人ILT4的分離的抗體基本上沒有與除人ILT4以外的抗原特異性結合的抗體；特異性結合人PD-1的分離的抗體基本上沒有與除人PD-1以外的抗原的特異性結合抗體）。然而，特異性結合表位的分離的抗體可具有對來自不同物種的相同抗原的交叉反應性。另外，分離的抗體通常基本沒有其他細胞材料和/或化學物質。

術語“表位”或“抗原決定簇”指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由連續胺基酸形成和通過蛋白質三級折疊而並在一起的不連續的胺基酸形成。當暴露於變性溶劑時，由連續胺基酸形成的表位通常保留，而由三級折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理時丟失。表位通常包括形成獨特空間構型的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。確定給定抗體結合哪些表位的方法（即表位作圖）是本領域周知的，並且包括，例如免疫印跡和免疫沉澱測定法，其中用給定的抗體（例如，ILT4或抗PD-1抗體）測試來自抗原（例如ILT4或PD-1）的重疊或連續的肽。用於確定表位空間構象的方法包括本領域技術和本文所述的技術，例如X射線晶體學和2-維核磁共振（參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)）。

術語“結合相同表位的抗體”作為另一抗體旨在涵蓋與人ILT4上與參考抗ILT4抗體相同的結構區域相互作用（即結合）的抗體。抗體結合的“相同表位元”可以是線性表位元或通過抗原三級折疊形成的構象表位。

術語“競爭性抗體”是指與參考抗ILT4抗體競爭結合人ILT4的抗體，即競爭性抑制參考抗ILT4抗體與ILT4的結合。“競爭性抗體”可以結合在ILT4上與參考抗ILT4抗體相同的表位，可以與重疊表位結合或在空間上阻礙參考抗ILT4抗體與ILT4的結合。

可以使用常規技術鑑定識別相同表位或競爭結合的抗體。這樣的技術包括例如免疫測定，其顯示一種抗體阻斷另一種抗體與靶抗原結合的能力，即競爭性結合測定。在測定中確定競爭性結合，其中測試下的免疫球蛋白抑制參考抗體與共同抗原（例如ILT4）的特異性結合。已知多種類型的競爭性結合測定，例如：固相直接或間接放射免疫測定（RIA），固相直接或間接酶免疫測定（EIA），夾心競爭測定（參見Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)）；固相直接生物素-親和素EIA（參見Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)）；固相直接標記測定，固相直接標記夾心測定（參見Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)）；使用I-125標記的固相直接標記RIA（參見Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)）；固相直接生物素-親和素EIA（Cheung et al., Virology 176:546 (1990)）；以及直接標記RIA（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)）。通常，這種測定涉及使用純化的抗原，其結合至固體表面或結合帶有未標記的測試免疫球蛋白和標記的參考免疫球蛋白中任一種的細胞。在測試免疫球蛋白存在的情況下，通過確定結合至固體表面或細胞的標記物的量來測量競爭抑制。一般地，測試免疫球蛋白過量存在。一般地，當競爭性抗體過量存在時，它會抑制參考抗體與共同抗原的特異性結合至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。

其他技術包括例如表位作圖方法，例如對抗原:抗體複合物的晶體的X射線分析，其提供表位的原子級解析度。其他方法監測抗體與抗原片段或抗原的突變變體的結合，其中由於抗原序列內胺基酸殘基的修飾而導致的結合喪失通常被認為是表位成分的指示。另外，也可以使用用於表位元作圖的計算組合方法。這些方法依賴於感興趣的抗體從組合噬菌體展示肽文庫中親和分離特定短肽的能力。然後將此肽視為定義該表位的先導物，所述表位對應於用於肽文庫篩選的抗體。對於表位元作圖，還開發了計算演算法，已顯示其可作圖構象不連續的表位。

如本文所用，術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指與預定抗原上的表位結合的抗體。一般地，當在BIACORE 2000儀器中通過表面等離子體共振（SPR）確定（例如，使用重組人ILT4作為分析物和抗體作為配體）時，抗體以約小於10-7 M，例如約小於10-8 M，10-9 M或10-10M或甚至更低的平衡解離常數（KD）結合，並以比其結合非特異性抗原（例如，BSA，酪蛋白）（而不是預定抗原或緊密相關的抗原）大至少兩倍的親和力結合預定的抗原。術語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異性的抗體”在本文中可與術語“特異性結合抗原的抗體”互換使用。

如本文所用，術語“KD”是意圖指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。一般地，當在BIACORE 2000儀器中通過表面等離子體共振（SPR）技術確定（例如，使用重組人ILT4作為分析物和抗體作為配體）時，本發明的人抗體以約10-8 M或更小，例如小於10-9 M或10-10M或甚至更小的解離平衡常數（KD）結合ILT4。

如本文所用，術語“kd”是意圖指抗體從抗體/抗原複合物上解離的速率常數。

如本文所用，術語“ka”是意圖指抗體與抗原結合的速率常數。

如本文所用，術語“EC50”是指在體外或體內測定中誘導應答的抗體或其抗原結合部分的濃度，該濃度是最大應答的50％，即最大應答～基線的一半。

如本文所用，“同種型”是指由重鏈恒定區基因編碼的抗體類別（例如，IgM或IgG1）。在一個實施方式中，本發明的人單殖株抗體是IgG1同種型。在另一個實施方式中，本發明的人單殖株抗體是IgG2同種型。

如本文所用，術語“抑制”或“阻斷”（例如，指抑制/阻斷HLA-G配體與ILT4的結合和/或PD1與PD-L1配體的結合）可互換使用，並且涵蓋部分和完全抑制/阻斷兩者。抑制/阻斷較佳地降低或改變當結合發生而沒有抑制或阻斷時發生的正常的活性水準或類型。與不接觸抗ILT4結合結構域、抗體或抗體部分的HLA-G比較，抑制和阻斷還意圖包括與抗ILT4結合結構域、抗體或抗體部分接觸時HLA-G的結合親和力的任何可測量的降低，例如，抑制結合HLA-G至少約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一實施方式中，所述抗ILT4結合結構域抑制結合HLA-G至少約70％。在另一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域抑制結合HLA-G至少80％。與不接觸PD-L1結合結構域、抗體或抗體部分的PD1比較，抑制和阻斷還意圖包括與PD-L1結合結構域、抗體或抗體部分接觸時PD1的結合親和力的任何可測量的降低，例如，抑制結合PD1至少約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一個實施方式中，所述抗PD-1結合結構域抑制結合PD1至少約70％。在另一個實施方式中，所述抗PD-1結合結構域抑制結合PD1至少80％。

如本文所用，術語“交叉反應”是指本發明的抗ILT4結合結構域、抗體或抗體部分，或抗PD-1結合結構域、抗體或抗體部分分別結合來自不同物種的ILT4或PD-1的能力。例如，結合人ILT4的本發明的抗ILT4結合結構域也可以結合另一物種的ILT4。類似地，結合人PD-1的本發明的抗PD-1結合結構域也可以結合另一物種的PD-1。如本文所用，交叉反應性是通過在結合測定（例如，SPR，ELISA）中檢測與純化抗原的特異性反應性或與生理上表達ILT4的細胞結合、或功能性相互作用來測量的。用於確定交叉反應性的方法包括本文所述的標準結合測定，例如，使用BiacoreTM2000 SPR儀器（Biacore AB，Uppsala，Sweden）通過BiacoreTM表面等離子體共振（SPR）分析或流式細胞計數技術。

如本文所用，術語“天然存在”當用於一種物件時是指可以在自然界中發現所述物件的事實。例如，存在於生物體（包括病毒）中，可從天然的來源中分離，且未被人在實驗室中故意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。

如本文所用，術語“核酸分子”意圖包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。

如本文所用，術語“分離的核酸分子”是指編碼與ILT4和/或PD-1結合的結合結構域、抗體或抗體部分（例如，VH、VL、CDR3）的核酸分子，意圖指核酸分子，其中編碼結合結構域、抗體、或抗體部分的核苷酸序列沒有編碼結合除ILT4和/或PD-1以外的抗原的結合結構域、抗體、或抗體部分的其他核苷酸序列，其中所述其它序列可天然位於人基因組DNA中核酸的側翼。

核酸可存在於完整細胞、細胞裂解物或以部分純化或基本純的形式存在。通過本領域公知的標準技術，其包括鹼性/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳等，當從其他細胞成分或其他污染物（例如，其他細胞核酸或蛋白）中純化出時，核酸為“分離的”或“成為基本純化的”。參見F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)。

來自於cDNA、基因組或其混合物的本發明的核酸分子，雖然通常在天然序列（除修飾的限制性位點等以外）中，但可依據提供基因序列的標準技術進行突變。對於編碼序列，這些突變可影響所希望的胺基酸序列。具體地，考慮了與如本文所述的天然V、D、J、恒定、開關（switch）和其他此類序列基本上相同的DNA序列或源自其的DNA序列（其中“源自”表示一個序列與另一個序列相同或從另一個序列修飾而來）。

當核酸與另一核酸序列處於功能關係時，該核酸是“可操作地連接（operably linked）”或“可操作地連接（operatively linked）”的。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則其可操作地連接至編碼序列。關於轉錄調節序列，可操作地連接意指連接的DNA序列是連續的，並且其中必須連續且在閱讀框內連接兩個蛋白質編碼區。對於開關序列，可操作地連接表示所述序列能夠影響開關重組。

本發明還涵蓋對本文所示的任何序列的“保守序列修飾”，即核苷酸和胺基酸序列修飾不消除由所述核苷酸序列編碼或包含所述胺基酸序列的VH和VL序列與抗原的結合。這樣的保守序列修飾包括保守的核苷酸和胺基酸取代，以及核苷酸和胺基酸的添加和缺失。例如，例如，可以通過本領域已知的標準技術（例如，定點誘變和PCR介導的誘變）將修飾引入到序列。保守胺基酸取代包括其中胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基替代的胺基酸取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族在本領域中已經明確。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸（例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸），具有酸性側鏈的胺基酸（例如天冬氨酸、谷氨酸），具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸（例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），具有非極性側鏈的胺基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，具有β支鏈側鏈的胺基酸（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和具有芳香族側鏈的胺基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，抗ILT4結合結構域中預測的非必需胺基酸殘基較佳被來自相同側鏈家族的另一個胺基酸殘基替代。鑑定不消除抗原結合的核苷酸和胺基酸的保守取代的方法是本領域公知的（參見，例如，Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993)；Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)；和Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)）。

在某些實施方式中，保守胺基酸序列修飾指對本文所述的CDR序列最多1、2、3、4或5個保守胺基酸取代。例如，每個這樣的CDR可包含多達5個保守胺基酸取代，例如，多達（即不超過）4個保守胺基酸取代，例如多達（即不超過）3個保守胺基酸取代，例如，多達（即不超過）2個保守胺基酸取代，或不超過1個保守胺基酸取代。

或者，在另一個實施方式中，可以，例如通過飽和誘變，沿著抗ILT4或抗PD-1結合結構域、抗體或其抗體部分編碼序列的全部或部分隨機引入突變，可以篩選出具有結合活性的由此產生的改良的抗ILT4或抗PD-1結合結構域、抗體或抗體部分。

對於核酸，術語“基本同源性”表示在最佳比對和比較時，兩個核酸或其指定的序列與適當的核苷酸插入或缺失至少約80％的核苷酸，通常至少約90％至95％，更佳至少約98％至99.5％的核苷酸是相同的。或者，當所述片段在選擇性雜交條件下會與互補鏈雜交時，存在相當大的同源性。

對於胺基酸，術語“基本同源性”表示在最佳比對和比較時，兩個胺基酸序列或其指定的序列與適當的胺基酸插入或缺失至少約80％的胺基酸，通常至少約90％至95％，更佳地至少約98％至99％或99 .5％的胺基酸是相同的。

考慮到空位（gap）的數量和各空位的長度，兩個序列間百分比同一性是所述序列共用的相同位置的數量的函數（即，％同源性＝相同位置的數量/位置的總數x 100），這需引入以實現兩個序列的最佳比對。序列的比較和兩個序列之間百分比同一性的確定可以使用數學演算法來完成，如以下非限制性實例中所述。

兩個核苷酸序列之間的百分比同一性可以使用GCG套裝軟體（可在http://www.gcg .com獲得）的GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60，70或80的空位權重以及1、2、3、4、5或6的長度權重來確定。兩個核苷酸或胺基酸序列之間的百分比同一性也可以使用已併入ALIGN程式（2.0版）的E .Meyers和W .Miller（CABIOS, 4: 11-17(1989)）的演算法，使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分（penalty）12和空位罰分4來確定。此外，兩個胺基酸序列序列之間的百分比同一性可以使用已併入GCG套裝軟體（可在www.gcg.com獲得）的GAP程式的Needleman和Wunsch（J. Mol. Biol. (48): 444-453(1970)）演算法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的空位權重和1、2、3、4、5或6的長度權重來確定。

本發明的核酸和蛋白質序列可進一步用作“查詢序列”，以針對公共資料庫進行搜索，以例如鑑定相關序列。這樣的搜索可以使用Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10的NBLAST和XBLAST程式（2.0）進行。BLAST核苷酸搜索可以使用NBLAST程式（分值＝100，字長＝12）進行以獲得與本發明的核酸分子相同的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可使用XBLAST程式進行（分值＝50，字長＝3），以獲得與本發明的蛋白分子相同的胺基酸序列。為獲得有空位的比對以用於比較的目的，可使用如Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402所述的Gapped BLAST。當使用BLAST和Gapped BLAST程式時，可以使用各個程式的缺省參數（例如XBLAST和NBLAST）。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

抗ILT4結合結構域

本文提供了新穎的雙特異性構建體，其包含抗ILT4結合結構域，例如源自抗體（例如人源化抗體）的結合結構域，其以特定的功能特徵或性質為特徵。例如，本發明的這種結合結構域具有一種或多種下述性質： a.  阻斷ILT4的配體（例如，HLA-G配體）與人ILT4的結合； b. 增強或增加人巨噬細胞釋放細胞因數或趨化因數； c.  增強LPS和IFNγ對巨噬細胞的活化作用； d. 促進M1巨噬細胞極化； e.  以10-9 M或更低的平衡解離常數Kd，或者，以10+9 M-1或更高的平衡結合常數Ka與人ILT4結合； f. 與其他ILT家族成員無交叉反應； g. 與猴ILT4有交叉反應；和/或 h. 抑制表達ILT4的腫瘤細胞。

在一個實施方式中，抗ILT4結合結構域源自為本文所述的抗體7A3。例如，抗ILT4結合結構域包含抗體7A3的重鏈和輕鏈CDR或可變區。在另一個實施方式中，結合結構域包含具有SEQ ID NO: 9中所述序列的抗體7A3重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區，以及具有SEQ ID NO: 10中所述序列的抗體7A3輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區。在另一個實施方式中，結合結構域包含分別具有SEQ ID NOs: 1、3和5所示的重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾，以及分別如SEQ ID NOs: 6、7和8所示的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾。或者，結合結構域包含分別具有SEQ ID NOs: 2、4和5所示的重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾，以及分別如SEQ ID NOs: 6、7和8所示的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾。在另一個實施方式中，結合結構域包含具有SEQ ID NO: 9中所述胺基酸序列的重鏈可變區。在另一個實施方式中，結合結構域包含具有SEQ ID NO: 10中所述胺基酸序列的輕鏈可變區。例如，抗ILT4結合結構域包含具有如SEQ ID NO: 9和10中所述胺基酸序列的重鏈和輕鏈可變區。

另一示例性抗ILT4結合結構域源自本文所述的抗體7B1。在一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含抗體7B1的重鏈和輕鏈CDR或可變區。在另一個實施方式中，結合結構域包含具有SEQ ID NO: 19中所述序列的抗體7B1重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區，以及具有SEQ ID NO: 20中所述序列的抗體7B1輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區。在另一個實施方式中，結合結構域包含分別具有SEQ ID NOs: 11、13和15中所述序列的重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18中所述序列的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾。或者，結合結構域包含分別具有SEQ ID NOs: 12、14和15中所述序列的重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18中所述序列的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾。在另一個實施方式中，結合結構域包含具有SEQ ID NO: 19中所述胺基酸序列的重鏈可變區。在另一個實施方式中，結合結構域包含具有SEQ ID NO: 20中所述胺基酸序列的輕鏈可變區。例如，結合結構域包含具有如SEQ ID NO: 19和20中所述胺基酸序列的重鏈和輕鏈可變區。

抗ILT4結合結構域也可以是抗體7B1和7A3的共有序列。例如，在一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含含有選自共有序列的胺基酸序列：G Y T (I, M) H（SEQ ID NO: 21）的重鏈可變區CDR1。在另一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 3的重鏈可變區CDR2。在另一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含含有選自共有序列的胺基酸序列：E R P G G S Q F I Y Y Y (P, A) (M, L) D Y（SEQ ID NO: 22）的重鏈可變區CDR3。在另一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含含有選自共有序列的胺基酸序列：R A S (A, E) N I Y S Y L A（SEQ ID NO: 23）的輕鏈可變區CDR1。在另一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含含有選自共有序列的胺基酸序列：N A (I, D) T L A E（SEQ ID NO: 24）的輕鏈可變區CDR2。在另一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區CDR3。

鑒於每種所述抗體均可與人ILT4結合，因此可以“混合和匹配”本文所述的VH和VL序列以創建各種抗ILT4結合結構域。所述“混合和匹配”的結合結構域與人ILT4的結合可使用本領域已知的結合測定法測試並且在實施例中描述（例如，ELISA）。例如，本發明的抗ILT4結合結構域包括本文所述的7B1和7A3抗體重鏈和輕鏈可變區序列的組合。

提供了與本文所述的抗ILT4結合結構域基本上相同的序列（例如，與前述序列至少80％、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列）。例如，在一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 9、19或與其至少80%同一性的序列（例如，與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）的重鏈可變區。在另一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 10、20或與其至少80%同一性的序列（例如，與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）的輕鏈可變區。在另一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域包含（a）含有SEQ ID NO: 9、19或與其至少80%同一性的序列（例如，與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）的重鏈可變區；以及（b）含有SEQ ID NO: 10、20或與其至少80%同一性的序列（例如，與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）的輕鏈可變區。例如，抗ILT4結合結構域包含SEQ ID NO: 9或與其至少80%同一性的序列（例如，與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性），以及SEQ ID NO: 19或與其至少80%同一性的序列（例如，與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）。或者，抗ILT4結合結構域包含SEQ ID NO: 10或與其至少80%同一性的序列（例如，與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性），以及SEQ ID NO: 20或與其至少80%同一性的序列（例如，與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）。

在一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 1、3和5所示的重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 6、7和8所示的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3。或者，抗ILT4結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 2、4和5所示的重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 6、7和8所示的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3。在另一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 9的重鏈可變區和含有SEQ ID NO: 19的輕鏈可變區或與其至少80%同一性的序列（例如，與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）。

在另一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 11、13和15所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3。或者，抗ILT4結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 12、14和15所示的重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18所示的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3。在另一個實施方式中，抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 10的重鏈可變區和含有SEQ ID NO: 20的輕鏈可變區或與其至少80%同一性的序列（例如，與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）。

PD-1結合結構域

本文提供其用於與本發明的抗ILT4結合結構域一起使用的抗PD-1結合結構域，（例如，在雙特異性構建體中），以及治療方法。這種抗PD-1結合結構域源自抗體，例如人源化抗體。本文所述的示例性PD-1抗體包括抗體E1A9C8A7-V8-3（本文又稱抗體“E1A9”）和抗體E1A9C8A7-V8。

在一個實施方式中，抗PD-1結合結構域包含抗體E1A9的重鏈和輕鏈CDR或可變區。在另一個實施方式中，結合結構域包含具有SEQ ID NO: 59或61中所述序列的抗體E1A9重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區，以及具有SEQ ID NO: 60或62中所述序列的抗體E1A9輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3區。在另一個實施方式中，結合結構域包含分別具有SEQ ID NOs: 31、36和41中所述的重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾，以及分別具有SEQ ID NOs: 46、51和56所述的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾。或者，結合結構域包含分別具有SEQ ID NOs: 69、74和79中所述的重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾，以及分別具有SEQ ID NOs: 84、89和94中所述的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，或其保守序列修飾。

在另一個實施方式中，結合結構域包含具有SEQ ID NO: 59或SEQ ID NO: 61中所述胺基酸序列的重鏈可變區。在另一個實施方式中，結合結構域包含具有SEQ ID NO: 60或SEQ ID NO: 62中所述胺基酸序列的輕鏈可變區。在另一個實施方式中，結合結構域包含分別具有SEQ ID NO: 59和SEQ ID NO: 60中所述胺基酸序列的重鏈和輕鏈可變區。可選地，結合結構域包含分別具有SEQ ID NO: 61和SEQ ID NO: 62中所述胺基酸序列的重鏈和輕鏈可變區。

本發明還包含與本文所述的抗PD-1結合結構域基本上相同的序列（例如，與前述序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性）。在一個實施方式中，抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61或與其至少90%同一性的序列（例如，與前述序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）的重鏈可變區。在另一個實施方式中，所述抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62或與其至少90%同一性的序列（例如，與前述序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）的輕鏈可變區。在另一個實施方式中，所述抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 59的重鏈可變區和SEQ ID NO: 60的輕鏈可變區或與其至少90%同一性的序列（例如，與前述序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）。

在另一個實施方式中，抗PD-1結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 31、36和41所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 46、51和56所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3。在另一個實施方式中，抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 59的重鏈可變區和含有SEQ ID NO: 60的輕鏈可變區或與其至少90%同一性的序列（例如，與前述序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列）。

在另一個實施方式中，抗PD-1結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 69、74和79所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，和分別如SEQ ID NOs: 84、89和94所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3。在另一個實施方式中，抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 61的重鏈可變區和含有SEQ ID NO: 62的輕鏈可變區或與其至少90%同一性的序列（例如，與前述序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）。

在另一個實施方式中，抗PD-1結合結構域具有一種或多種下述性質：（a）阻斷PD-1與PD-L1結合（例如，部分地或完全地）（b）誘導NFAT通路啟動，和/或（c）誘導混合淋巴細胞反應。

雙特異性構建體

雙特異性構建體可以通過多種方法製備，如結合兩個現有的結合結構域，融合兩個雜交瘤細胞系形成一個細胞雜交瘤（Jain et al. (2007) Trends in Biotechnology 25(7), 307–316）或使用基因改造的重組蛋白（Kontermann (2012) Dual targeting strategies with bispecific antibodies. mAbs 4(2), 182–197）。

就化學綴合而言，將兩個或多個結合結構域（例如，兩個或多個抗體或其片段）綴合在一起的適宜試劑和方法是本領域所公知的。多種綴合或交聯試劑是市售的，可用於綴合抗ILT4結合結構域和抗PD-1結合結構域。非限制性實例包括Sulfo-SMC、蛋白A、碳二亞胺、二馬來醯亞胺、二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）和N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸鹽（SPDP）。Sulfo-SMCC、SPDP和DTNB是較佳試劑，最佳Sulfo-SMCC。用交聯劑交聯組份（例如，抗體或其抗原結合片段）的其他合適的步驟是本領域所公知的。參見例如，Karpovsky, B. et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686；Liu, M. A. et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:8648；Segal, D. M. and Perez, P., U.S. Pat. No. 4,676,980；以及Brennan, M. (1986) Biotechniques 4:424。

對於基因工程化，可以使用標準重組DNA技術將編碼抗ILT4結合結構域的核酸分子插入適當的表達載體中。也可以將編碼抗PD-1結合結構域的核酸分子插入到相同的表達載體，以使其與抗ILT4結合結構域可操作地連接（例如，框內殖株），從而產生表達載體，其編碼雙特異性構建體的融合蛋白。較佳地，抗ILT4結合結構域可操作地連接至抗PD-1結合結構域的重鏈的C末端區域。在另一個實施方式中，抗PD-1結合結構域可操作地連接至抗ILT4結合結構域的重鏈的C末端區域。用於製備本文所述的雙特異性構建體的其他合適的表達載體和殖株策略是本領域已知的。

為了在宿主細胞中表達雙特異性構建體，將結合結構域的編碼區與殖株的啟動子，前導序列，翻譯起始，前導序列，恒定區，3'非翻譯的，聚腺苷酸化和轉錄終止序列組合以形成表達載體構建體。這些構建體可用於表達例如全長人IgG1κ或IgG4κ抗體。本文所述的雙特異性構建體中使用的全人抗體、人源化抗體和嵌合抗體還包括IgG2，IgG3，IgE，IgA，IgM和IgD抗體。可以構建相似的質粒用於其他重鏈同種型的表達，或用於含λ輕鏈抗體的表達。

在製備編碼雙特異性構建體的表達載體後，雙特異性構建體可通過標準轉染方法在宿主細胞中重組表達。例如，在一個實施方式中，編碼雙特異性構建體的核酸可以連接到表達載體中，例如真核表達質粒，例如在WO87/04462、WO89/01036和EP338841中公開的GS基因表達系統或本領域公知的其他表達系統所使用的。可以將具有殖株的雙特異性構建體基因的純化質粒引入真核宿主細胞，例如CHO細胞或NSO細胞，或者引入其他真核細胞，例如植物來源的細胞，真菌或酵母細胞。用於引入這些基因的方法可以是本領域中描述的方法，例如電穿孔、脂轉染（lipofectin），脂質體轉染（lipofectamine）或其他方法。將表達載體引入宿主細胞後，表達雙特異性構建體的細胞可以被鑑定和選擇。這些細胞代表轉染瘤，然後可以對其表達水準進行擴增並放大以產生雙特異性構建體。或者，這些殖株的雙特異性構建體可以表達在其他表達系統中，例如大腸桿菌或在完整的生物體中，或者可以合成表達。可以從這些培養上清液和/或細胞中分離和純化重組雙特異性構建體。

本發明的雙特異性構建體，無論是通過化學綴合還是通過遺傳工程化製備的，都可以使用本領域中已良好建立的用於蛋白質純化的一種或多種方法學來分離和純化。分離和純化的較佳方法包括但不限於凝膠過濾色譜法、親和色譜法、陰離子交換色譜法等。特別佳的方法是凝膠過濾色譜法，例如使用Superdex 200柱。分離的和純化的雙特異性構建體可以使用標準方法如SDS-PAGE分析進行評價。

因此，在一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域和抗PD-1結合結構域是基因融合的。在另一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域和抗PD-1結合結構域是化學綴合的。在一個實施方式中，所述抗PD-1結合結構域還包含人IgG1恒定結構域。在另一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域與抗PD-1結合結構域的重鏈的C末端連接。在另一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域是scFv。在另一個實施方式中，所述抗ILT4結合結構域還包含人IgG1恒定結構域。在另一個實施方式中，所述抗PD-1結合結構域與抗ILT4結合結構域的重鏈的C末端連接。在另一個實施方式中，所述抗PD-1結合結構域是scFv。

本文還提供雙特異性構建體，其包含與前述抗ILT4和抗PD-1結合結構域序列（例如，CDR和可變區序列）基本相同的序列（例如，具有保守序列修飾的序列和/或與前述序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列）。例如，在一個實施方式中，抗PD-1結合結構域和抗ILT4 scFv包含分別如SEQ ID NOs: 64和63所示的重鏈和輕鏈序列。在另一個實施方式中，抗PD-1結合結構域和抗ILT4 scFv的重鏈和輕鏈分別由SEQ ID NOs: 66和65所示的核苷酸序列編碼。

在另一個實施方式中，雙特異性構建體具有下述一種或多種性質： a.  阻斷ILT4配體（例如，HLA-G配體）與人ILT4結合； b. 增強或增加人巨噬細胞釋放細胞因數或趨化因數； c.  增強LPS和IFNγ對巨噬細胞的活化作用； d. 促進M1巨噬細胞極化； e.  以10-9 M或更低的平衡解離常數Kd，或者，以10+9 M-1或更高的平衡結合常數Ka與人ILT4結合； f. 與其他ILT家族成員無交叉反應； g. 與猴ILT4有交叉反應； h. 抑制表達ILT4的腫瘤細胞；和/或 i.  與單獨的抗體組合相比，增強MLR活性。

組合物

本文還提供了組合物，例如包含本文所述的雙特異性構建體的組合物，其與載體（例如，藥學上可接受的載體）配置在一起。

如本文所用，術語“載體”和“藥學上可接受的載體”包括任何和所有生理上相容的溶劑、鹽、分散介質、包被劑、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑。較佳地，所述載體適合於靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用（例如，通過注射或輸注）。根據施用途徑，活性化合物（即，本文所述的任何雙特異性構建體或組合物）可包被在一種材料中以保護所述化合物免受酸和可使化合物失活的其他自然條件的作用。

可與本文所述的雙特異性構建體和組合物一起使用的佐劑的實例包括，但不限於：弗氏不完全佐劑和完全佐劑（Dif co Laboratories, Detroit, Mich.)；默克佐劑65（Merck and Company, Inc., Rahway, NJ)；AS-2（SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.)；鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠（鋁）或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅的鹽；醯化酪氨酸的不溶性懸液；醯化糖；陽離子或陰離子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；細胞因數，例如GM-CSF、白介素-2、白介素-7、白介素-12，和其他類似因數；3D-MPL；CpG寡核苷酸；和單磷醯基脂質A，例如3-脫-O-醯化單磷醯基脂質A。

MPL佐劑可從Corixa公司（Seattle，Wash；參見，例如，美國專利號4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094）獲得。含CpG的寡核苷酸（其中CpG二核苷酸是未甲基化的）是公知的，並且描述於例如WO96/02555，WO99/33488和美國專利號6,008,200和5,856,462。免疫刺激性DNA序列也描述於例如Sato et al., Science 273:352, 1996。

其他替代性佐劑包括，例如，皂苷（例如Quil A）或其衍生物，包括QS21和QS7（Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA）；七葉素（Escin）；洋地黃皂苷；或滿天星或藜麥皂苷；Montanide ISA 720（Seppic，France）；SAF（(Chiron, California, United States）；ISCOMS（CSL），MF-59（Chiron）；SBAS系列佐劑（例如SBAS-2或SBAS-4，可獲自SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium）；Detox（EnhanzynTM）（Corixa, Hamilton, Mont.）；RC-529（Corixa, Hamilton, Mont.）和其他氨基烷基氨基葡萄糖苷4磷酸酯（AGP）；聚氧乙烯醚佐劑，例如WO99/52549A1中所述的那些；合成的咪唑喹啉，例如咪喹莫特 [S-26308，R-837] （Harrison, et al., Vaccine 19: 1820-1826, 2001）；和瑞喹莫德（Resiquimod） [S-28463，R-848]（Vasilakos, et al., Cellular immunology 204: 64-74, 2000）；在抗原提呈細胞和T細胞表面上組成性表達的羰基和胺的希夫堿（Schiff base），例如妥卡雷瑣（tucaresol）（Rhodes, J. et al., Nature 377: 71-75, 1995）；細胞因數、趨化因數和共刺激分子作為蛋白質或肽，包括例如促炎性細胞因數，（例如干擾素、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、TGF-α和TGF-β），Th1誘導劑（例如干擾素γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21），Th2誘導劑（例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13）以及其他趨化因數和共刺激基因（例如MCP-1，MIP-1α，MIP-1化，RANTES，TCA-3，CD80，CD86和CD40L）；靶向的配體（例如CTLA-4和L-選擇素）的免疫刺激劑，可刺激細胞凋亡的蛋白質和多肽（例如Fas）；基於合成脂質的佐劑（例如vaxfectin（Reyes et al., Vaccine 19: 3778-3786, 2001）、角鯊烯、α-生育酚、聚山梨醇酯80、DOPC和膽固醇）；內毒素、[LPS]、（Beutler, B., Current Opinion in Microbiology 3: 23-30, 2000）；觸發Toll受體產生Th1誘導細胞因數的配體（例如合成的分枝桿菌脂蛋白、分枝桿菌蛋白p19，肽聚糖，磷壁酸和脂質A）；和CT（霍亂毒素，亞基A和B）和LT（來自大腸桿菌的熱不穩定腸毒素，亞基A和B），熱休克蛋白家族（HSP）和LLO（李斯特菌溶血素O；WO01/72329）。這些和多種其他的Toll樣受體（TLR）激動劑描述於例如Kanzler et al, Nature Medicine, May 2007, Vol 13, No 5中。

“藥學上可接受的鹽”是指保留親本化合物所希望的生物活性並且不賦予任何不希望的毒理學作用的鹽（參見例如，Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19）。這樣的鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無機酸的那些，例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等，以及衍生自無毒有機酸的那些，例如脂肪一元和二元羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族羧酸、脂肪族和芳香族磺酸等。堿加成鹽包括衍生自鹼土金屬（例如鈉、鉀、鎂、鈣等）的鹽，以及無毒有機胺（例如N, N'-二苄基乙二胺，N-甲葡糖胺，氯普魯卡因，膽鹼，二乙醇胺，乙二胺，普魯卡因等）的鹽。

本發明的組合物可以通過本領域已知的多種方法施用。所屬技術領域中具有通常知識者會理解，所述施用的途徑和/或模式會根據所希望的結果而變化。可以用會保護化合物免於快速釋放的載體來製備活性化合物，例如控釋製劑，包括植入物、經皮貼劑和微囊遞送系統。可以使用可生物降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。製備此類製劑的許多方法已獲得專利或通常為所屬技術領域中具有通常知識者所知。參見，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。

為了通過某些施用途徑施用本發明的化合物，有必要用防止其失活的材料包被該化合物或與該化合物共同施用。例如，可以將化合物在合適的載體例如脂質體或稀釋劑中施用於受試者。可接受的稀釋劑包括鹽溶液和緩衝水溶液。脂質體包括水包油包水型CGF乳劑以及常規脂質體（Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27）。

載體包括無菌水溶液或分散液以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。這種介質和藥劑用於藥物活性物質的用途是本領域已知的。除非任何常規介質或藥劑與活性化合物不相容，否則可考慮將其用於本發明的藥物組合物中。補充活性化合物也可摻入所述組合物中。

治療組合物通常必須是無菌的且在製造和儲存條件下是穩定的。可以將組合物配製成溶液、微乳劑、脂質體或其他適合高藥物濃度的有序結構。所述載體可以是溶劑或分散介質，其包含例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其合適的混合物。可以例如通過使用例如卵磷脂的包被，通過在分散液的情況下維持所需的粒徑以及通過使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多情況下，會較佳在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇（例如甘露醇，山梨糖醇）或氯化鈉。通過在組合物中包含延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可以帶來可注射組合物的延長吸收。

無菌注射溶液可通過將所需量的活性化合物與上述成分的一種或組合摻入適當的溶劑（如所需的）中，然後進行滅菌微濾來製備。通常，通過將活性化合物摻入無菌運載體（vehicle）中來製備分散體，所述無菌運載體包含基本分散介質和所需的其他來自上文列舉的那些的成分。在用於製備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，較佳的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥（凍乾），其從其先前無菌過濾的溶液中產生活性成分和任何其他所希望的成分的粉末。

調整劑量方式以提供最佳期望應答（例如治療應答）。例如，可以施用單次推注，可以隨時間施用幾個分開的劑量，或者如治療情況的緊急程度所示，可以按比例減少或增加劑量。例如，本發明的雙特異性構建體（以及組合物）可以皮下或肌內注射每週一次或兩次，或者皮下或肌內注射每月一次或兩次。

為方便施用和劑量均一，以劑量單位形式配製腸胃外組合物是特別有利的。如本文所用，劑量單位形式是指適合作為待治療受試者的單位劑量的物理上離散的單位；每個單位含有預定量的活性化合物，所述活性化合物經計算可與所需的藥物運送載體一起產生所希望的治療效果。本發明的劑量單位形式的規範取決於或由（a）活性化合物的獨特特徵和要實現的特定治療作用，以及（b）將所述活性化合物組合用於個體敏感性治療的領域的固有局限性決定。

藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括：（1）水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；（2）油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚（BHA）、丁羥甲苯（BHT）、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；（3）金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

對於治療組合物，本發明的製劑包括適用於口服、鼻腔、局部（包括頰部和舌下）、直腸、陰道和/或腸胃外施用的製劑。所述製劑可以方便地以單位劑型存在並且可以通過藥學領域中已知的任何方法製備。可與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量會根據所治療的受試者和特定的施用方式變化。可與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量通常會是產生治療效果的組合物中所述活性成分的量。通常，在百分之一百中，所述活性成分的量會是約0.001％至約90％，較佳為約0.005％至約70％，最佳為約0.01％至約30％。

適用於陰道施用的本發明製劑還包括子宮托、塞子、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧製劑，其含有本領域已知的合適的載體。用於本發明的組合物的局部或經皮施用的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑。可以在無菌條件下將活性化合物與藥學上可接受的運送載體以及可能需要的任何防腐劑、緩衝劑或推進劑混合。

本文所用的術語“腸胃外施用”和“經腸胃外施用”是指除腸內和局部施用以外的施用方式，通常通過注射，並且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下腔、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。

可以在本發明的藥物組合物中使用的合適的水性和非水性運送載體的實例包括水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）及其合適的混合物，植物油，例如橄欖油和可注射的有機酯，例如油酸乙酯。例如，通過使用包被材料，例如卵磷脂，通過在分散液的情況下保持所需的粒徑，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當的流動性。

這些組合物還可包含佐劑，例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。可以通過滅菌程式（參照前文）以及通過包含多種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，來確保防止微生物的存在。還可能需要在組合物中包括等滲劑，例如糖、氯化鈉等。另外，可通過加入延遲吸收的藥劑（例如單硬脂酸鋁和明膠）來延長注射藥物形式的吸收。

當本發明的化合物作為藥物施用於人和動物時，它們可以單獨或作為藥物組合物給予，所述藥物組合物包含例如0.001至90％（更佳0.005至70％，例如0.01至30％）的活性成分，所述活性成分與藥學上可接受的載體組合。

不管選擇的施用途徑如何，可以以合適的水合形式使用的本發明化合物和/或本發明的藥物組合物，通過所屬技術領域中具有通常知識者已知的常規方法配製成藥學上可接受的劑型。

本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水準可以不同，從而獲得可有效實現對特定患者、組合物和施用方式所期望的治療應答的活性成分的量，而不對患者存在毒性。所選劑量水準會取決於多種藥代動力學因素，包括本發明所用的特定組合物或其酯、鹽或醯胺的活性，施用途徑，施用時間，所用的特定化合物的排泄速率，治療的持續時間，與所用的特定組合物結合使用的其他藥物、化合物和/或材料，年齡，性別，體重，病況，一般健康狀況和所治療患者的既往病史，等醫學領域公知的因素。具有本領域普通技術的醫師或獸醫可以容易地確定和開出所需藥物組合物的有效量。例如，醫師或獸醫可以在藥物組合物中以低於獲得所希望的治療效果的水準開始本發明化合物的劑量，並逐漸增加劑量直至獲得所希望的效果。一般地，本發明的組合物的合適的日劑量會是有效產生治療效果的最低劑量的化合物的量。這樣的有效劑量通常取決於上述因素。較佳以靜脈內、肌內、腹膜內或皮下施用，較佳在靶標部位附近施用。如所希望的，治療組合物的有效日劑量可以在一整天中以適當的間隔，以兩個、三個、四個、五個、六個或更多個亞劑量，任選地以單位劑型分開施用來施用。儘管可以單獨施用本發明的化合物，但是較佳以藥物製劑（組合物）的形式施用所述化合物。

可用本領域已知的醫療裝置施用治療組合物。例如，在一個較佳的實施方式中，本發明的治療組合物可用無針皮下注射裝置施用，例如在美國專利號5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公開的裝置。可用於本發明的公知的植入物和模組的實例包括：美國專利號4,487,603，其公開了一種用於以受控的速率分配藥物的可植入的微輸液泵；美國專利號4,486,194，其公開了一種用於通過皮膚施用藥物的治療裝置；美國專利號4,447 ,233其公開了一種用於以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵。美國專利號4,447,224，其公開了一種用於連續藥物遞送的流量可變的可植入輸注儀器。美國專利號4,439,196，其公開了一種具有多腔室的滲透藥物遞送系統。美國專利號4,475,196，其公開了一種滲透藥物遞送送系統。許多其他此類植入物、遞送系統和模組是所屬技術領域中具有通常知識者已知的。

在某些實施方式中，可以配製本發明的雙特異性構建體以確保體內適當分佈。例如，血腦屏障（BBB）排除了許多高度親水的化合物。為了確保本發明的治療化合物穿過BBB（如所希望的），可以將它們配製成例如脂質體。用於製造脂質體的方法，參見，例如，美國專利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。所述脂質體可以包含一個或多個部分，被選擇性地運輸到特定細胞或器官中，從而增強靶向藥物遞送（參見，例如V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685）。示例性的靶向部分包括葉酸或生物素（參見，例如Low et al.的美國專利5,416,016）；甘露糖醇（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗體（P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140；M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；表面活性劑蛋白A受體（Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134），其不同物種可以包括本發明的製劑，以及本發明分子的組分；p120（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）；還參見K. Keinanen；M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123；J.J. Killion；I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273。在本發明的一個實施方式中，將本發明的治療性化合物配製成脂質體；在一個更佳的實施方式中，所述脂質體包括靶向部分。在最佳的實施方式中，所述脂質體中的治療化合物通過推注注射遞送至接近腫瘤或感染的部位。組合物必須具有一定程度的流動性，以使其易於注射。它必須在製造和儲存條件下穩定，並且必須防止微生物（如細菌和真菌）的污染作用。

化合物抑制癌症的能力可以在預測人類腫瘤的功效的動物模型系統中來評價。或者，可以通過檢查化合物抑制的能力來評價化合物的這種特性，這種體外測定抑制是所屬技術領域中具有通常知識者已知的。治療有效量的治療化合物可以減小腫瘤的大小，或改善受試者的症狀。本領域普通技術人員能夠基於例如受試者的身材、受試者症狀的嚴重程度以及所選擇的特定組合物或施用途徑等因素來確定這些量。

該組合物必須是無菌的，並且其具有一定程度的流動性，使組合物可通過注射器遞送。除水以外，載體可以是等滲緩衝鹽溶液、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液態聚乙二醇等）及其合適的混合物。可以例如通過使用例如卵磷脂包被，在分散液的情況下通過維持所需的粒徑，以及通過使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多情況下，較佳在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇（例如甘露醇或山梨醇）和氯化鈉。可通過在組合物中包括延遲吸收的藥劑例如單硬脂酸鋁或明膠帶來可注射組合物的長期吸收。

如上所述，當適當地保護性化合物時，所述化合物可以例如與惰性稀釋劑或可同化的可食用載體一起口服施用。

核酸

本文還提供編碼雙特異性構建體、或其結合結構域的分離的核酸分子，以及包含此類核酸的表達載體和包含此類表達載體的宿主細胞。在一個實施方式中，提供了編碼本文所述的任何雙特異性構建體的核酸分子。在另一個實施方式中，所述核酸分子為表達載體的形式。在另一個實施方式中，所述核酸分子為表達載體的形式，當在體內施用於受試者時，其表達雙特異性構建體（或其部分）。

在一個實施方式中，所述核酸分子包含編碼本文所述雙特異性構建體的抗ILT4結合結構域（或其部分）、抗PD-1結合結構域（或其部分）、或這兩個結合結構域的核苷酸序列。在另一個實施方式中，所述核酸分子包含編碼分別在SEQ ID NOs: 64和63中所述的雙特異性構建體的重鏈和輕鏈序列或與其至少90%同一性的胺基酸序列（例如，與一個或多個前述序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）的核苷酸序列。在另一個實施方式中，重鏈和輕鏈分別由SEQ ID NOs: 66和65中所述的核酸序列編碼，或與其至少90%同一性的核苷酸序列（例如，與一個或多個前述序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性）。

如本文所用，術語“載體（Vector）”意圖指能夠轉運已經與其連接的另一核酸的核酸分子。載體的一種類型是“質粒”，其是指環狀雙鏈DNA環，其中可以連接入其他DNA區段。載體的另一種類型是病毒載體，其中可以將其他DNA區段連接入病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製（例如，具有細菌複製起點的細菌載體和游離型哺乳動物載體）。可以將其他載體（例如，非游離哺乳動物載體）在導入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，並且由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與其可操作連接的基因的表達。這樣的載體在本文中稱為“重組表達載體”（或簡稱為“表達載體”）。一般地，在重組DNA技術中有用的表達載體通常是質粒的形式。在本說明書中，“質粒”和“載體（vector）”可以互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明意圖包括其他形式的表達載體，例如病毒載體（例如複製缺陷型逆轉錄病毒，腺病毒和腺相關病毒），其具有等同的功能。

如本文所用，術語“重組宿主細胞”（或簡稱為“宿主細胞”）意圖指已將重組表達載體引入其中的細胞。應當理解，這些術語不僅意圖指特定的物件細胞，而且還指該細胞的後代。因為由於突變或環境影響，某些修飾可能在後代中發生，所以這樣的後代實際上可能與親本細胞不同，但是仍然包括在本文所用的術語“宿主細胞”的範圍內。

聯合療法

本文所述的雙特異性構建體可以與其他的療法聯合施用，即與其他藥劑結合。本文所用的術語“共同施用”包括本文所述的雙特異性構建體與佐劑和其他藥劑的同時、分開或貫序施用中的任意或全部，包括作為給藥方式的一部分來施用。例如，所述組合療法可包括將本文所述的任何雙特異性構建體與至少一種或多種其他治療劑，例如抗炎劑、DMARD（改變疾病的病抗風濕藥物）、免疫抑制劑、化療劑、放療、其他抗體、細胞毒素和/或藥物、以及佐劑、免疫刺激劑和/或免疫抑制劑共同施用。

在腫瘤的治療中，適合與本文所述的雙特異性構建體共同施用的化學治療劑包括，例如：紫杉醇（taxol）、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿（emetine）、絲裂黴素、依託泊苷、替諾泊苷（tenoposide）、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、阿黴素、柔紅黴素（daunorubicin）、二羥蒽二酮（dihydroxy anthracin dione）、米托蒽醌、普卡黴素（mithramycin）、放線菌素D、1-脫氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘諾爾（propranolol）、以及嘌呤黴素及其類似物或同系物。其他藥劑還包括，例如抗代謝物（例如氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪）、烷基化劑（例如氮芥、噻替呱苯丁酸氮芥（thioepa chlorambucil）、美法侖、卡莫司汀（BSNU）和洛莫司汀（CCNU）、環磷醯胺（cyclothosphamide）、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C和順式二氯二胺鉑（II）（DDP）、順鉑）、蒽環類（例如柔紅黴素（舊稱道諾黴素（daunomycin））和阿黴素）、抗生素（例如，更生黴素（舊稱放線菌素）、博來黴素、普卡黴素和安麯黴素（AMC））、抗有絲分裂劑（例如，長春新堿和長春堿）和替莫唑胺。

例如，通過免疫細胞（例如調節性T細胞、NK T細胞、巨噬細胞、髓系來源的抑制細胞、未成熟或抑制性樹突狀細胞）或在腫瘤局部微環境中的腫瘤或宿主細胞產生的抑制因數（例如TGF β，吲哚胺2,3-加雙氧酶-IDO）消除或抑制免疫抑制活性的藥劑，也可與本文所述的雙特異性構建體共同施用。這種試劑包括抗體和小分子藥物，例如IDO抑制劑（例如1-甲基色氨酸或衍生物）。

與本文所述的雙特異性構建體共同施用的用於治療此類免疫疾病的合適藥劑包括，例如免疫抑制劑（例如雷帕黴素、環孢菌素和FK506）；抗TNF藥劑（例如依那西普，阿達木單抗和英夫利昔單抗）；和類固醇。具體的天然和合成類固醇的實例包括，例如：醛固酮、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯潑尼醇、可的松、可的伐唑、去氧皮質酮（deoxycortone）、地奈德（desonide）、去羥米松、地塞米松、二氟皮酮四醇（Difluorocortolone）、氟氯縮松（fluclorolone）、氟米松（flumethasone）、氟尼縮松、氟輕鬆、醋酸氟輕鬆（fluocinonide）、氟考丁酯、氟可的松、氟皮酮四醇（fluorocortolone）、氟米龍（fluorometholone）、氟氫縮松、氟替卡松、哈西奈德（halcinonide）、氫化可的松、艾可米松（icomethasone）、甲潑尼龍、甲基潑尼松龍（methylprednisolone）、帕拉米松、潑尼松龍、強的松、替可的松（tixocortol）和去炎松（triamcinolone）。

用於與本文所述的用於誘導或增強免疫應答的雙特異性構建體共同施用的合適藥劑包括，例如佐劑和/或免疫刺激劑，其非限制性實例已在上文公開。在一個實施方式中，所述免疫刺激劑是TLR3激動劑，例如Poly IC。

如本文所用，術語“免疫刺激劑”包括，但不限於，能夠刺激抗原提呈細胞（APC），例如樹突細胞（DC）和巨噬細胞的化合物。例如，用於本發明的合適的免疫刺激劑能夠刺激APC，從而加速APC的成熟過程，增加APC的增殖，和/或上調共刺激分子（例如CD80、CD86、ICAM-1、MHC分子和CCR7）和促炎細胞因數（例如IL-1β、IL-6、IL-12、IL-15和IFN-γ）的募集或釋放。合適的免疫刺激劑也能夠增加T細胞增殖。這類免疫刺激劑包括但不限於，CD40配體；FLT3配體；細胞因數（例如IFN-α、IFN-　、IFN-γ和IL-2）；集落刺激因數（例如G-CSF（粒細胞集落刺激因數）和GM-CSF（粒細胞巨噬細胞集落刺激因數））；激動型CD40抗體、CTLA-4抗體、PD1抗體（例如，第二種抗PD1抗體）、41BB抗體、或OX-40抗體；LPS（內毒素）；ssRNA；dsRNA；卡介苗（Bacille Calmette-Guerin，BCG）；鹽酸左旋咪唑；和靜脈注射免疫球蛋白。

在一個實施方式中，免疫刺激劑可以是具有激動特徵的CD40抗體。這種特徵包括，例如，T細胞活性的增加和/或B細胞活化的增加，通過例如HLA-DR V450、CD54 PE、CD86 APC、CD83 BV510、CD19 V500、CD54 PE、HLA-DR V450、CD23 PerCP-Cy5.5、CD69 APC、CD86 APC、CD38和CD71 PE等細胞表面標誌物的表達增加來測量。在另一個實施方式中，在表達CD40的細胞上，CD40抗體阻斷CD40與CD40L（CD154）的結合和/或誘導細胞凋亡，如通過CD95表達的增加來測定。本發明的特定激動性CD40抗體包括WO2017/184619中所述的抗體，例如激動性CD40抗體3C3（CDX-1140）。

在另一個實施方式中，免疫刺激劑可以是Toll樣受體（TLR）激動劑。例如，免疫刺激劑可以是TLR3激動劑（例如雙鏈肌苷:胞嘧啶多核苷酸（Poly I:C，例如獲自Hemispherx Bipharma, PA, US的AmpligenTM，或獲自Oncovir的Poly IC:LC）或Poly A:U；TLR4激動劑（例如單磷醯脂質A（MPL）或RC-529（例如，可獲自GSK，UK）；TLR5激動劑（例如鞭毛蛋白）；TLR7或TLR8激動劑（例如咪唑並喹啉）；TLR7或TLR8激動劑（例如咪喹莫特（例如AldaraTM）或瑞喹莫德）和相關的咪唑並喹啉藥劑（例如獲自3M公司）；或TLR9激動劑（例如具有未甲基化的CpG基序的去氧核苷酸（所謂的“CpGs”，例如可獲自Coley Pharmaceutical））。這些免疫刺激劑可以與本文所述的雙特異性構建體同時、分開或貫序施用。

本發明的用途和方法

本文提供了通過向有此需要的患者施用本文所述的雙特異性構建體或組合物以誘導或增強免疫應答的方法、以及治療癌症的方法。

術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，是指對特定抗原的免疫應答（即，被動的或適應性的）的刺激。

如本文所用，術語“處理（treat）”“處理（treating）”“治療（treatment）”是指本文所述的治療措施。所述“治療”的方法通過向需要這樣的治療的受試者，施用如本文所述的雙特異性構建體或組合物，例如，需要針對特定抗原增強免疫應答的受試者，或最終可得這種病症的受試者，從而治癒、延遲、減輕病症的嚴重性、改善疾病或復發性疾病的一個或多個症狀，或在沒有這樣的治療的情況下，超出預期延長受試者的存活期。

術語“有效劑量（effective dose）”或“有效劑量（effective dosage）”被定義為足以達到或至少部分達到所希望的效果的量。術語“治療有效劑量”定義為足以在已經患有該疾病的患者中治癒或至少部分阻止該疾病及其併發症的量。對於這種用途的有效量取決於所治療病症的嚴重程度以及患者自身免疫系統的一般狀態。

術語“患者”包括接受預防或治療的人類和其他哺乳動物受試者。

如本文所用，術語“抑制生長”（例如，指細胞）意在包括任何可測量的細胞的生長的減少，例如，抑制細胞的生長至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。

在另一方面，用於在受試者中誘導或增強免疫應答（例如，針對抗原）的方法，包括以有效誘導或增強受試者的免疫應答（例如，針對抗原）的量向受試者施用本文所述的任一種雙特異性構建體或組合物。

在另一方面，提供了用於治療受試者的癌症的方法，所述方法包括以有效治療病況或疾病的量向受試者施用本文所述的雙特異性構建體或組合物。

該受試者可以是例如患有希望免疫應答的刺激的病況或疾病的受試者。在一個實施方式中，所述病況或疾病是癌症。癌症的類型包括，但不限於，白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、幼粒細胞早幼粒單核細胞單核紅白血病、慢性白血病、慢性粒細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、套細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma）和邊緣區B細胞淋巴瘤、真性紅細胞增多症淋巴瘤、霍奇金病（Hodgkin 's disease）、非霍奇金病、多發性骨髓瘤、華氏巨球蛋白血症（Waldenstrom's macroglobulinemia）、重鏈疾病、實體瘤、肉瘤和癌、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏瘤（(Ewing's tumor）、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸肉瘤、結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、腎母細胞瘤、宮頸癌、子宮癌、睾丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌，非小細胞肺癌，膀胱癌，上皮性癌，膠質瘤，星形細胞瘤，髓母細胞瘤，顱咽管瘤，室管膜瘤，松果體瘤，血管母細胞瘤，聽神經瘤，少突膠質細胞瘤，腦膜瘤，黑色素瘤，神經母細胞瘤，視網膜母細胞瘤，鼻咽癌，食管癌，基底細胞癌，膽道腫瘤，膀胱癌，骨腫瘤，腦和中樞神經系統腫瘤，宮頸癌，絨毛膜癌、結直腸癌、結締組織癌、消化系統癌、子宮內膜癌、食管癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、上皮內瘤變、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌（小細胞、大細胞）、黑色素瘤、神經母細胞瘤；口腔癌（如唇、舌、口、咽）、卵巢癌、胰腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、直腸癌;呼吸系統癌症、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌和泌尿系統癌症。特殊的癌症包括表達ILT4的腫瘤，這些腫瘤選自慢性淋巴細胞白血病、套細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma）和邊緣區B細胞淋巴瘤。其他疾病適應症包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲感染性疾病。

在本文所述的受試者中誘導或增強免疫應答（例如，針對抗原）的方法可以進一步包括向受試者施用抗原。如本文所用，術語“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物質，例如蛋白質、肽、半抗原、多糖和/或脂質。可以同時施用本文所述的雙特異性構建體或組合物以及抗原，或者，可以在施用抗原之前或之後施用雙特異性構建體或組合物。

在一個實施方式中，將本文所述的雙特異性構建體或組合物與疫苗組合施用，以增強針對疫苗抗原的免疫應答，例如腫瘤抗原（由此增強對腫瘤的免疫應答）或來自傳染病病原體的抗原（由此增強對傳染病病原體的免疫應答）。因此，在一個實施方式中，疫苗抗原可包含例如能夠引發針對腫瘤或針對傳染病病原體（例如病毒、細菌、寄生蟲或真菌）的免疫應答的抗原或抗原組合物。一種或多抗原源自腫瘤，例如本文先前公開的多種腫瘤抗原。或者，所述一種或多種抗原可以源自病原體，例如病毒、細菌、寄生蟲和/或真菌。

與本文所述的雙特異性構建體或組合物共同施用的較佳的抗原包括腫瘤抗原和疫苗抗原（例如細菌、病毒或其他病原體抗原，為了疫苗接種的目的，希望在受試者中產生針對其的保護性免疫）。其他合適的病原體抗原的實例包括腫瘤相關抗原（TAA），其包括但不限於序列，所述序列包含EGFR、EGFRvIII、gp100或Pmel17、HER2/neu、間皮素、CEA、MART1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MUC-1、GPNMB、HMW-MAA、TIM1、ROR1、CD19和生殖細胞源性的腫瘤抗原的全部或部分序列。

其他合適的抗原包括用於預防或治療病毒性疾病的病毒抗原。病毒抗原的實例包括，但不限於，HIV-1env，HBsAg，HPV，FAS，HSV-1，HSV-2，p17，ORF2和ORF3抗原。另外，病毒抗原或抗原決定簇可以源自例如：巨細胞病毒（尤其是人，例如gB或其衍生物）；愛潑斯坦巴爾病毒（例如gp350）；黃病毒（例如黃熱病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒）；肝炎病毒例如乙型肝炎病毒（例如乙型肝炎表面抗原，例如EP-A-414 374、EP-A-0304 578和EP-A-198474中所述的PreS1、PreS2和S抗原），甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒；HIV-1，（例如tat、nef、gpl20或gpl60）；人皰疹病毒，例如gD或其衍生物，或即早蛋白（Immediate Early protein），例如來自HSV1或HSV2的ICP27；人乳頭瘤病毒（例如HPV6、11、16、18）；流感病毒（全活或滅活的病毒、裂解性流感病毒，其生長於卵或MDCK細胞，或Vero細胞或整個流感病毒體（如Gluck, Vaccine, 1992,10, 915-920所述），或其純化或重組蛋白，例如NP、NA、HA或M蛋白）；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；狂犬病毒；呼吸道合胞病毒（例如F和G蛋白）；輪狀病毒（包括減毒活病毒）；天花病毒；水痘帶狀皰疹病毒（例如gpI、II和IE63）；和對宮頸癌有責任的HPV病毒（例如，與蛋白D運送載體融合形成來自HPV 16的蛋白D-E6或E7融合體的早期蛋白E6或E7，或其組合；或E6或E7與L2的組合（參見例如WO96/26277）。

細菌抗原的例子包括，但不限於，弓形蟲或梅毒螺旋體。細菌抗原可用於治療或預防各種細菌性疾病，如炭疽、肉毒桿菌中毒、破傷風、衣原體、霍亂、白喉、萊姆病、梅毒和結核病。細菌抗原或抗原決定簇可以源自，例如：芽孢桿菌屬，包括炭疽桿菌（例如，肉毒桿菌毒素）；博多特菌屬（Bordetella spp.），包括百日咳博多特菌（例如百日咳桿菌粘附素、百日咳毒素、絲狀血凝素、腺苷酸環化酶、菌毛）；疏螺旋體屬（Borrelia spp.），包括博氏疏螺旋體（B.burgdorferi）（例如OspA、OspC、DbpA、DbpB），伽氏疏螺旋體（B.garinii）（例如OspA、OspC、DbpA、DbpB），阿弗西尼疏螺旋體（B.afzelii）（例如OspA、OspC、DbpA、DbpB），安德森疏螺旋體（B.andersonii）（例如OspA、OspC、DbpA、DbpB），赫姆斯氏疏螺旋體（B.hermsii）；彎曲桿菌屬（Campylobacter spp），包括空腸彎曲桿菌（例如毒素，粘附素和侵染素）和大腸彎曲桿菌（C.coli）；衣原體屬，包括沙眼衣原體（例如MOMP，肝素結合蛋白），肺炎衣原體（C.pneumonie）（例如MOMP，肝素結合蛋白），鸚鵡熱衣原體；梭菌屬，包括破傷風梭菌（C.tetani）（例如破傷風毒素），肉毒梭菌（例如肉毒桿菌毒素），難辨梭菌（例如梭菌毒素A或B）；棒桿菌屬，包括白喉棒桿菌（例如白喉毒素）；埃裡希體屬，包括馬埃裡希體（E.equi）和人粒細胞埃裡希體病的藥劑；立克次氏體屬，包括立氏立克次體（R.rickettsii）；腸球菌屬，包括糞腸球菌，屎腸球菌（E.faecium）；埃希氏菌屬，包括腸毒素大腸桿菌（enterotoxic E.coli）（例如定居因數、不耐熱毒素或其衍生物，或熱穩定毒素），腸出血性大腸桿菌（enterohemorragic E .coli），腸致病性大腸桿菌（例如志賀毒素樣毒素）；嗜血桿菌屬，包括B型流感嗜血桿菌（例如PRP），不可分型的流感嗜血桿菌，例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、蛋白質D和脂蛋白D，以及絲束蛋白和絲束蛋白衍生的肽（參見例如US5,843,464）；螺桿菌屬，包括幽門螺桿菌（例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素）；假單胞菌屬，包括銅綠假單胞菌；軍團菌屬，包括嗜肺軍團菌；鉤端螺旋體菌屬，包括問號鉤端螺旋體（L .interrogans）；李斯特菌屬，包括單核細胞增多性李斯特菌；摩拉克氏菌屬，包括卡他莫拉菌（M catarrhalis），也稱為粘膜炎布蘭漢氏球菌（Branhamella catarrhalis）（例如高分子量和低分子量粘附素和浸染素）；卡他莫拉菌（包括其外膜囊泡和OMP106（參見例如WO97/41731））；分枝桿菌屬，包括結核分枝桿菌（例如ESAT6、抗原85A，-B或-C）、牛分枝桿菌、麻風分枝桿菌、鳥分枝桿菌、副結核分枝桿菌、恥垢分枝桿菌；奈瑟球菌屬，包括淋病奈瑟球菌和腦膜炎奈瑟球菌（例如莢膜多糖及其綴合物、轉鐵蛋白結合蛋白、乳鐵蛋白結合蛋白、PilC、粘附素）；腦膜炎奈瑟球菌B（包括其外膜囊泡和NspA（參見例如WO 96/29412））；沙門氏菌屬，包括傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌；志賀氏菌，宋氏志賀菌（S.sonnei）、痢疾志賀菌、福氏志賀菌（S.flexnerii）；葡萄球菌屬，包括金黃色葡萄 球菌、表皮葡萄球菌；鏈球菌屬，包括肺炎鏈球菌（例如莢膜多糖及其綴合物、PsaA、PspA、鏈球菌溶血素、膽鹼結合蛋白）和蛋白抗原肺炎球菌溶血素（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007；Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）及其突變體脫毒衍生物（參見例如WO90/06951；WO99/03884）；密螺旋體屬，包括蒼白密螺旋體（例如外膜蛋白），齒垢密螺旋體（T.denticola）、豬痢疾密螺旋體；弧菌屬，包括霍亂弧菌（例如霍亂毒素）；和耶爾森菌屬，包括小腸結腸炎耶爾森菌（例如，Yop蛋白），鼠疫耶爾森菌，假結核病耶爾森菌。

寄生蟲/真菌抗原或抗原決定簇可以源自，例如：巴貝蟲菌屬，包括微小巴貝蟲菌；念珠菌屬，包括白色念珠菌；隱球菌屬，包括新型隱球菌；內阿米巴屬，包括溶組織內阿米巴（E.histolytica）；賈第蟲屬，包括藍氏賈第蟲（G.lamblia）、利什曼原蟲屬，包括大型利什曼原蟲（L.major）；惡性瘧原蟲（在瘧原蟲屬中的MSP1，AMA1，MSP3，EBA，GLURP，RAP1，RAP2，Sequestrin，PfEMP1，Pf332，LSA1，LSA3，STARP，SALSA，PfEXP1，Pfs25，Pfs28，PFS27/25，Pfs16，Pfs48/45，Pfs230及其類似物）；肺囊蟲屬，包括卡氏肺囊蟲（P.carinii）；血吸蟲屬，包括曼氏血吸蟲（S.mansoni）；毛滴蟲屬，包括陰道毛滴蟲；弓形蟲屬，包括剛地弓形蟲（例如TAG2、SAG3、Tg34）；錐蟲屬，包括克魯斯錐蟲（T.cruzi）。

應當理解，根據本發明的這個方面，抗原和抗原決定簇可以以許多不同形式使用。例如，抗原或抗原決定簇可以作為分離的蛋白質或肽存在（例如，在所謂的“亞基疫苗”中），或者例如作為細胞相關或病毒相關的抗原或抗原決定簇（例如在活的或死的病原體菌株中）存在。活的病原體最好以已知方式減毒。或者，抗原或抗原決定簇可以通過使用編碼抗原或抗原決定簇的多核苷酸在受試者中原位生成（如在所謂的“DNA疫苗接種”種），儘管應當理解可以用於這種方法的多核苷酸不限於DNA，也可以包括如上文討論的RNA和修飾的多核苷酸。

在一個實施方式中，疫苗抗原也可以靶向，例如特定的細胞類型或特定的組織。例如，疫苗抗原可以靶向抗原提呈細胞（APC），例如通過使用藥劑，例如靶向APC表面受體的抗體（例如DEC-205），例如在WO2009/061996（Celldex Therapeutics）中所討論的，或甘露糖受體（CD206），例如在WO03040169（Medarex，Inc.）中討論的。

試劑盒

還提供了試劑盒（例如，診斷試劑盒），其包含一個或多個本文所述的雙特異性構建體或組合物，任選地包含使用說明書。試劑盒還包括資訊手冊，例如，告知如何使用試劑來實踐本文公開的方法的手冊。術語“手冊”包括在試劑盒上提供或隨試劑盒一起提供的，或另外隨附試劑盒的任何書面、行銷材料或記錄材料。

本申請通過以下實施例進一步闡明，實施例不應當解讀為進一步的限制。所有圖式和本申請中引用的參考文獻、專利和公開的專利申請的內容通過引用的方式明確地全部併入本文。

實施例

實施例1：雙特異性構建體的生成

用靶向ILT4和PD-1的抗體（例如，結合結構域）構建雙特異性構建體，從而形成雙特異性構建體CDX-585。利用抗PD1抗體的全人源IgG1 AQQYTE κ骨架和抗ILT4抗體的單鏈Fv片段（scFv）開發了四價結構（每個靶點均為雙價），其中scFv以VL-VH的方向遺傳連接於抗PD1抗體重鏈的C末端。重鏈（HC）的Fc區含有6個額外的胺基酸修飾：L234A、L235Q、K322Q（AQQ）以消除與Fc受體的所有Fc相互作用，以及M252Y、S254T、T256（YTE）以延長血清半衰期。為穩定CDX-585的scFv部分，通過將成熟重鏈558位元（根據Kabat編號系統，位置為VL100）的Gly突變成Cys，以及成熟重鏈629位元（根據Kabat編號系統，位置為VH44）的Gly突變成Cys，在VL和VH之間引入二硫鍵。

將編碼CDX-585的輕鏈和重鏈的DNA序列插入到含pH2535-HDP穀氨醯胺合成酶（GS）的表達載體（Horizon Discovery）中，以構建表達CDX-585的質粒。然後將線性化質粒轉染至Horizon Discovery HD-BIOP3細胞系中，其中使用重組的腺相關病毒（rAAV）技術，敲除內源性穀氨醯胺合成酶（GS）基因。通過在無穀氨醯胺和無動物成分的培養基中生長選擇轉染池，用蛋白A柱色譜從池中純化出雙特異性構建體產品。

使用VIPS（Verified In-situ Plate Seeding）設備，表達量最高的池也是單細胞殖株（SCC）。研究細胞庫（RCB）是為最高產量的殖株產生的，然後再次使用蛋白A柱色譜純化最終的雙特異性構建體產品。

雙特異性構建體（CDX-585）的示意圖如圖3所示。用還原性SDS-PAGE在4-15%的Tris-HCL凝膠上分析純化的構建體，所得凝膠的圖像用IgG1亞型比較結果如圖1所示。在TSK3000柱上注射含20µg構建體的PBS進行SEC-HPLC分析，與IgG1亞型比較的結果如圖2所示。

實施例2：用ELISA檢測CDX-585與人PD-1的結合

用於PBS中的重組人PD-1-msFc包被微量滴定板，然後用5%牛血清白蛋白的PBS封閉。以不同的濃度加入蛋白A純化的抗PD-1單殖株抗體E1A9、雙特異性構建體CDX-585（來自實施例1）和亞型對照，於37ºC孵育。平板用PBS/吐溫沖洗，然後與辣根過氧化物酶結合的山羊抗人IgG Fc特異的多殖株試劑於37ºC孵育。沖洗後，用HRP底物顯色，用微量平板檢測儀在OD 450處分析。代表性結合曲線如圖4所示。

實施例3：CDX-585與表達人PD-1的細胞的結合

蛋白A純化的單殖株抗體7B1和E1A9、雙特異性構建體CDX-585（來自實施例1）和亞型對照與表達人PD-1的HEK293細胞在孔板振盪器上室溫孵育。20分鐘後，用含有0.1% BSA和0.05% NaN3的PBS（PBA）沖洗細胞，用PE標記的山羊抗人IgG Fc特異性探針孵育細胞，以檢測結合的抗體。用PBA將多餘的探針從細胞上清洗下來，根據製造商的用法說明書，使用FACSCanto IITM儀器（BD Biosciences, NJ, USA）分析測定細胞相關的螢光。代表性結合曲線如圖5A所示。

實施例4：CDX-585與表達人ILT4的細胞的結合

蛋白A純化的單殖株抗體7B1和E1A9、雙特異性構建體CDX-585（來自實施例1）和亞型對照與表達人ILT4的HEK293細胞在孔板振盪器上室溫孵育。20分鐘後，用含有0.1% BSA和0.05% NaN3的PBS（PBA）沖洗細胞，用PE標記的山羊抗人IgG Fc特異性探針孵育細胞，以檢測結合的抗體。用PBA將多餘的探針從細胞中清洗出來，根據製造商的用法說明書，使用FACSCanto IITM儀器（BD Biosciences, NJ, USA）分析細胞相關的螢光。代表性結合曲線如圖5B所示。

實施例5：CDX-585與細胞表達的人ILT4和人PD-1的雙功能結合

使用表達人ILT4的HEK293細胞檢測CDX-585與ILT4和PD-1的結合。簡單地說，在加入用PE標記的山羊抗小鼠IgG Fc特異性探針檢測的人PD-1-msFc之前，將CDX-585稀釋液與表達ILT4的細胞結合。CDX-585的代表性結合曲線如圖6A所示，顯示了其與ILT4和PD-1顯著結合。

實施例6：CDX-585與人單核細胞的雙功能結合

使用人單核細胞評估CDX-585與ILT4和PD-1的結合。簡單地說，在用抗CD14 APC標記的抗體對單核細胞染色之前，用CDX-585稀釋液孵育人PBMC。加入人PD-1-msFc，並用PE標記的山羊抗小鼠IgG Fc特異性探針檢測。CDX-585的代表性結合曲線如圖6B所示，顯示了其與ILT4和PD-1顯著結合。

實施例7：用生物膜干涉法（BLI）測定人bsAbs的親和力和速率常數

根據製造商的用法說明書，使用OctetTM QKe設備（Sartorius BioAnalytical Instruments）通過生物膜干涉法（BLI）分析CDX-585的結合親和力和結合動力學。CDX-585用抗人Fc捕獲（AHC）生物感測器（Sartorius）捕獲。每個抗體製備於pH 7.2的動力學檢測稀釋緩衝液中，並以0.5ug/mL的濃度負載在新鮮水合和預處理的AHC生物感測器上，在30℃和1000rpm平板振盪速度下作用300秒。在一次檢測中，8個生物感測器負載相同的抗體。通過將7個負載抗體的生物感測器暴露於分析物：可溶性人ILT4-HIS（Celldex內部試劑）或人PD-1-HIS（R&D Systems）來確定結合。在30℃和1000rpm平板振盪速度下，在稀釋緩衝液中使用2倍梯度稀釋（從50nM到0.4nM）的分析物，進行親和力測定。通過實驗測定每個抗體-抗原檢測的適當稀釋範圍。將負載抗體的生物感測器在分析孔中結合300秒，然後將生物感測器移動到稀釋緩衝液孔中1500秒，用於解離測量。在每種情況下進行相應的對照，將生物感測器與捕獲的抗體保持在稀釋緩衝液孔中，用於結合和解離步驟。對照生物感測器的資料用於去掉背景，並說明生物感測器漂移和抗體從生物感測器解離。在每種情況下，使用Octet BLI分析軟體12.2.0.2版本（Sartorius BioAnalytical Instruments）從稀釋緩衝液中的與捕獲的抗體結合的分析物的濃度梯度獲得動力學參數。根據製造商的用法說明書，使用資料分析軟體將結合和解離曲線擬合到1:1的結合模型中。

所測定的親和力和動力學參數（扣除背景）如圖7所示，其中kon=結合速率，kdis=解離速率，以及KD=親和力常數，由kdis/kon比值決定。

實施例8：CDX-585與人Fcγ和FcRn受體結合的動力學分析

根據製造商的用法說明書，使用OctetTM QKe設備（Sartorius BioAnalytical Instruments）進行親和力測定。生物素化的人FcγRs和FcRn（Acro Biosystems）被鏈黴親和素（SA）生物感測器（Sartorius）捕獲。每個huFcγ受體在pH 7.2的動力學檢測稀釋緩衝液中製備至0.2ug/ml並負載於4個SA生物感測器上300秒。通過將兩個負載huFcγ受體的生物感測器暴露於CDX-585來確定結合。使用於pH 7.2的動力學檢測稀釋緩衝液中800nM和400nM濃度的稀釋液測定親和力。通過實驗測定每個抗體-huFcγR檢測的適當稀釋範圍。對於每個檢測的huFcγR，將含有100nM未修飾的HuIgG1的陽性對照孔暴露於一個負載huFcγR的感測器。在每種情況下進行相應的對照，將生物感測器與捕獲的huFcγ保持在稀釋緩衝液中，用於結合和解離步驟。在pH 6.0和pH 7.2的動力學檢測稀釋緩衝液中測定抗體與huFcRn的結合。在一個檢測中，8個生物感測器負載生物素化huFcRn（Acro Biosystems），在pH 7.2的動力學檢測稀釋緩衝液中稀釋至0.3ug/ml。通過將7個負載huFcRn的生物感測器暴露於CDX-585來測定結合。在30℃和1000rpm平板振盪速度下，在適當的pH稀釋緩衝液中使用2倍梯度稀釋（從200nM到0.8nM）的分析物，進行親和力測定。通過實驗測定每個緩衝液pH的適當稀釋範圍。將負載抗體的生物感測器在分析孔中結合120秒，然後將生物感測器移動到相應的pH稀釋緩衝孔中180秒，用於解離測量。在每種情況下進行相應的對照，將生物感測器與捕獲的huFcRn保持在相應的pH稀釋緩衝孔中，用於結合和解離步驟。緩衝液對照生物感測器的資料用於去除背景和說明huFcγR和huFcRn檢測的生物感測器漂移和抗體從生物感測器的解離。在每種情況下，使用Octet BLI分析軟體12.2.0.2版本（Sartorius BioAnalytical Instruments）從稀釋緩衝液中的結合捕獲的huFcγR或FcRn的分析物的濃度梯度獲得動力學參數。根據製造商的用法說明書，使用資料分析軟體將結合和解離曲線擬合到1:1的結合模型中。

所測定的親和力和動力學參數（扣除背景）如圖7所示，其中kon=結合速率，kdis=解離速率，以及KD=親和力常數，由kdis/kon比值決定。

實施例9：T細胞PD1/PD-L1阻斷生物測定

使用Promega市售的PD-1/PD-L1阻斷試劑，測定CDX-585對PD1/PD-L1相互作用的阻斷作用。在抗體存在下，將兩種工程化的細胞系（PD1效應細胞和PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞）共培養6小時。PD1/PD-L1相互作用的阻斷導致TCR啟動，並且通過NFAT通路誘導發光。通過添加Bio-Glo試劑檢測發光，並在Perkin Elmer Victor X4光度計上定量。如圖8所示，抗PD-1抗體E1A9和CDX-585有效地阻斷細胞間的PD1/PD-L1相互作用，導致NFAT通路的啟動。

實施例10：CDX-585誘導TNF-α的產生

巨噬細胞和樹突狀細胞由人單核細胞衍生，如下：將PMBC添加到T175cm2燒瓶中，讓單核細胞在37℃、6% CO2的條件下黏附約2小時。去除未貼壁的細胞，將單核細胞在含10% FBS和50 ng/mL M-CSF（R&D Systems）的RPMI中培養7天製備巨噬細胞。將單核細胞在含10% FBS、100 ng/mL GM-CSF和10 ng/mL IL-4（R&D Systems）的RPMI中培養7天製備樹突狀細胞。

然後，在CDX-585和合適的抗體對照與50ng/mL LPS（Invivogen）的存在下，於37oC，6%CO2孵育細胞。24小時後，收集細胞，收集並儲存上清液用於細胞因數分析。用ELISA（R&D Systems）評估收集的上清液中TNF-α的誘導作用。TNF-α生成量的增加如圖9A和9B所示。

實施例11：CDX-585抑制HLA-G與ILT4結合

在孔板振盪器上，用CDX-585和抗體對照的稀釋液與表達人ILT4的HEK293細胞於室溫孵育。30分鐘後，沖洗細胞，加入PE標記的HLA-G四聚物（FredHutch）。再過30分鐘後，用PBA沖洗細胞，根據製造商的說明，使用FACSCanto IITM設備（BD Biosciences, NJ, USA）分析確定細胞相關螢光。代表性的阻斷曲線如圖10所示。

實施例12：CDX-585誘導M1型巨噬細胞極化

如實施例10中所述製備巨噬細胞。在M-CSF存在下，將巨噬細胞與6.7 nM的CDX-585和抗體對照培養6天。加入50ng/mL的LPS（Invitrogen）過夜，收集細胞用於分析。收集上清液用於細胞因數分析。

細胞用PE標記的抗PD-L1抗體染色，然後用PBA沖洗，根據製造商的說明，使用FACSCanto IITM儀器（BD Biosciences, NJ, USA）分析確定細胞相關螢光。PD-L1表達的下調如圖11所示。另外，用ELISA（R&D Systems）評估收集的上清液中TNF-α和IL-10的表達。圖12A顯示CDX-585增加TNF-α的生成，圖12B顯示IL-10的分泌下調。

實施例13：通過混合淋巴細胞反應的T細胞活化

用Ficoll分離法從血沉棕黃層製劑中分離出人外周血單核細胞，並使用來自Miltenyi Biotec的磁珠分離技術從PBMC中進一步分離CD4+細胞。同種異基因樹突狀細胞的產生如下：將PMBC添加到T175cm2燒瓶中，讓單核細胞在37℃、6% CO2的條件下黏附約2小時。去除未貼壁的細胞，將單核細胞在含10% FBS、10 ng/mL IL-4（R&D Systems）和100 ng/mL GM-CSF（R&D Systems）的RPMI中培養7天。在抗體稀釋液的存在下，CD4+細胞與DC細胞以10:1的比率共培養4天。收集上清液，用ELISA（R&D Systems）分析IFN-γ和IL-2的產生。如圖13A和13B所示，CDX-585能夠誘導明顯的混合淋巴反應。

實施例14：CDX-585對ILT4和PD-1雙重抑制的T細胞活化

將人PBMC與33nM的CDX-585和抗體對照孵育過夜。加入次優劑量的抗CD3抗體（OKT3, eBioscience），並將細胞再孵育3日。收集上清液，評估IFN-g的誘導。如圖14所示，CDX-585雙特異性抗體和單獨抗體的組合都增加了IFN-g，表明ILT4和PD-1抗體的組合的協同作用。

實施例15：小鼠腫瘤模型中的體內抗腫瘤活性

將來自兩個捐獻者的20只HuCD34-NCG小鼠（Charles River Laboratories）分成4組，每組5只。將2×107 SKMEL-5細胞植入小鼠皮下。從植入當天開始，對小鼠進行如下處理：組1：人IgG1 AQQ（0.5 mg/只小鼠），組2：CDX-585（0.5 mg/只小鼠），組3：7B1（0.375 mg/只小鼠），組4：E1A9（0.375 mg/只小鼠）和7B1（0.375 mg/只小鼠）。每週注射1次，連續注射5周。定期測量腫瘤體積。與huIgG1對照組比較，採用student’s T檢驗，差異有統計學意義。結果如圖15和16所示，其中，* = p ＜ 0.05，** = p ＜ 0.01。

實施例16：在食蟹猴中的初步研究

向食蟹猴單次靜脈注射CDX-585（10 mg/kg）。CDX-585的血清濃度經ELISA檢測，細胞因數/趨化因數的血清濃度經MesoScale Discovery（MSD）分析。無明顯的不良實驗室或臨床表現。結果如圖17和18所示。

實施例17：通過混合淋巴細胞反應的T細胞活化

用Ficoll分離法從血沉棕黃層製劑中分離出人外周血單核細胞，並使用來自Miltenyi Biotec的磁珠分離技術從PBMC中進一步分離CD4+細胞。同種異基因樹突狀細胞（DC）的產生如下：將PMBC添加到T175cm2燒瓶中，讓單核細胞在37℃、6% CO2的條件下黏附約2小時。去除未貼壁的細胞，將單核細胞在含10% FBS、10 ng/mL IL-4（R&D Systems）和100 ng/mL GM-CSF（R&D Systems）的RPMI中培養7天。用50 ng/mL LPS或0.5 mg/mL的如WO2017/184619中所述的抗CD40抗體（CDX-1140）將DC細胞孵育過夜。沖洗預處理的DC細胞，在5 mg/mL的抗體存在下，以10:1的比率與CD4+細胞共培養4天。收集上清液，用ELISA（R&D Systems）分析IFN-g的分泌。結果如圖19所示。

實施例18：小鼠腫瘤模型的體內抗腫瘤活性

使用其他對照重複實施例15的小鼠腫瘤模型。結果顯示在圖20中。

序列表的匯總

表1: 7A3和7B1人源化序列

SEQ ID NO:1 7A3 V HCDR1 (Kabat)	GYTIH
SEQ ID NO:2 7A3 V HCDR1 (Chothia)	GYSFTGY
SEQ ID NO:3 7A3 V HCDR2 (Kabat)	LINPYTGGTDYNQKFKG
SEQ ID NO:4 7A3 V HCDR2 (Chothia)	NPYTGG
SEQ ID NO:5 7A3 V HCDR3	ERPGGSQFIYYYPMDY
SEQ ID NO:6 7A3 V LCDR1	RASANIYSYLA
SEQ ID NO:7 7A3 V LCDR2	NAITLAE
SEQ ID NO:8 7A3 V LCDR3	QHHYGTPFT
SEQ ID NO:9 7A3 VH Hu-VH2	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMHWVRQAPGQGLEWMGLINPYTGGTDYNQKFQGRVTMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERPGGSQFIYYYPMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:10 7A3 VL Hu-VL1	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASANIYSYLAWYQQKPGKAPKFLVYNAITLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:11 7B1 V HCDR1 (Kabat)	GYTMH
SEQ ID NO:12 7B1 V HCDR1 (Chothia)	GYSFTGY
SEQ ID NO:13 7B1 V HCDR2 (Kabat)	LINPYTGGTDYNQKFKG
SEQ ID NO:14 7B1 V HCDR2 (Chothia)	NPYTGG
SEQ ID NO:15 7B1 V HCDR3	ERPGGSQFIYYYALDY
SEQ ID NO:16 7B1 V LCDR1	RASENIYSYLA
SEQ ID NO:17 7B1 V LCDR2	NADTLAE
SEQ ID NO:18 7B1 V LCDR3	QHHYGTPFT
SEQ ID NO:19 7B1 VH Hu-VH2	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMHWVRQAPGQGLEWMGLINPYTGGTDYNQKFQGRVTMTVDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERPGGSQFIYYYALDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:20 7B1 VL Hu-VL1	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKFLVYNADTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:21 VH CDR1 Consensus	G Y T (I,M) H
SEQ ID NO:22 VH CDR3 Consensus	E R P G G S Q F I Y Y Y (P,A) (M,L) D Y
SEQ ID NO:23 VL CDR1 Consensus	R A S (A,E) N I Y S Y L A
SEQ ID NO:24 VL CDR2 Consensus	N A (I,D) T L A E
SEQ ID NO:25 7A3 AQQ HC 胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMHWVRQAPGQGLEWMGLINPYTGGTDYNQKFQGRVTMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERPGGSQFIYYYPMDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AQGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC QVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:26 7A3 LC胺基酸	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASANIYSYLAWYQQKPGKAPKFLVYNAITLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:27 7B1 AQQ HC胺基酸	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMHWVRQAPGQGLEWMGLINPYTGGTDYNQKFQGRVTMTVDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERPGGSQFIYYYALDYWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AQGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC QVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:28 7B1 LC胺基酸	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKFLVYNADTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

PD-1抗體序列 表2A: VH CDRs - PD1-HuAb-E1A9C8A7-V8-3

區域	編號系統	胺基酸序列
CDR-H1
SEQ ID NO:29	Chothia	GYTFTDY---
SEQ ID NO:30	AbM	GYTFTDYVMH
SEQ ID NO:31	Kabat	----------DYVMH
SEQ ID NO:32	Contact	--------TDYVMH
SEQ ID NO:33	IMGT	GYTFTDYV--
CDR-H2
SEQ ID NO:34	Chothia	-----------STYHIP---------
SEQ ID NO:35	AbM	--------VISTYHIPAV-------
SEQ ID NO:36	Kabat	--------VISTYHIPAVYNQKFKG
SEQ ID NO:37	Contact	WMGVISTYHIPAV-------
SEQ ID NO:38	IMGT	----------ISTYHIPA--------
CDR-H3
SEQ ID NO:39	Chothia	----EVYGESYYFDV
SEQ ID NO:40	AbM	----EVYGESYYFDV
SEQ ID NO:41	Kabat	----EVYGESYYFDV
SEQ ID NO:42	Contact	AREVYGESYYFD-
SEQ ID NO:43	IMGT	AREVYGESYYFDV

表2B: VL CDRs - PD1-HuAb-E1A9C8A7-V8-3

區域	編號系統	胺基酸序列
CDR-L1
SEQ ID NO:44	Chothia	RSSQSIVHSAGNTYLE--
SEQ ID NO:45	AbM	RSSQSIVHSAGNTYLE--
SEQ ID NO:46	Kabat	RSSQSIVHSAGNTYLE--
SEQ ID NO:47	Contact	----------VHSAGNTYLEWY
SEQ ID NO:48	IMGT	-----QSIVHSAGNTY----
CDR-L2
SEQ ID NO:49	Chothia	----KVSNRFS
SEQ ID NO:50	AbM	----KVSNRFS
SEQ ID NO:51	Kabat	----KVSNRFS
SEQ ID NO:52	Contact	LLIYKVSNRF-
SEQ ID NO:53	IMGT	-------KV-----
CDR-L3
SEQ ID NO:54	Chothia	FQGSHVPYT
SEQ ID NO:55	AbM	FQGSHVPYT
SEQ ID NO:56	Kabat	FQGSHVPYT
SEQ ID NO:57	Contact	FQGSHVPY-
SEQ ID NO:58	IMGT	FQGSHVPYT

表2C: VH CDRs - PD1-HuAb-E1A9C8A7-V8

區域	編號系統	胺基酸序列
CDR-H1
SEQ ID NO:67	Chothia	GYTFTDY---
SEQ ID NO:68	AbM	GYTFTDYVMH
SEQ ID NO:69	Kabat	----------DYVMH
SEQ ID NO:70	Contact	--------TDYVMH
SEQ ID NO:71	IMGT	GYTFTDYV--
CDR-H2
SEQ ID NO:72	Chothia	-----------STYHIP---------
SEQ ID NO:73	AbM	--------VISTYHIPAV-------
SEQ ID NO:74	Kabat	--------VISTYHIPAVYNQKFKG
SEQ ID NO:75	Contact	WMGVISTYHIPAV-------
SEQ ID NO:76	IMGT	----------ISTYHIPA--------
CDR-H3
SEQ ID NO:77	Chothia	----EVYGDSYYFDV
SEQ ID NO:78	AbM	----EVYGDSYYFDV
SEQ ID NO:79	Kabat	----EVYGDSYYFDV
SEQ ID NO:80	Contact	AREVYGDSYYFD-
SEQ ID NO:81	IMGT	AREVYGDSYYFDV

表2D: VL CDRs - PD1-HuAb-E1A9C8A7-V8

區域	編號系統	胺基酸序列
CDR-L1
SEQ ID NO:82	Chothia	RSSQSIVHSNGNTYLE--
SEQ ID NO:83	AbM	RSSQSIVHSNGNTYLE--
SEQ ID NO:84	Kabat	RSSQSIVHSNGNTYLE--
SEQ ID NO:85	Contact	----------VHSNGNTYLEWY
SEQ ID NO:86	IMGT	-----QSIVHSNGNTY----
CDR-L2
SEQ ID NO:87	Chothia	----KVSNRFS
SEQ ID NO:88	AbM	----KVSNRFS
SEQ ID NO:89	Kabat	----KVSNRFS
SEQ ID NO:90	Contact	LLIYKVSNRF-
SEQ ID NO:91	IMGT	-------KV-----
CDR-L3
SEQ ID NO:92	Chothia	FQGSHVPYT
SEQ ID NO:93	AbM	FQGSHVPYT
SEQ ID NO:94	Kabat	FQGSHVPYT
SEQ ID NO:95	Contact	FQGSHVPY-
SEQ ID NO:96	IMGT	FQGSHVPYT

表2E: VH/VL序列

VH	胺基酸序列（PD1-HuAb-E1A9C8A7-V8-3 ）
SEQ ID NO:59	QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYVMHWVRQAPGQSLEWMGVISTYHIPAVYNQKFKGKATMTVDTSTSTVYLELSSLRSEDTAVYYCAREVYGESYYFDVWGQGTTVTVSS
VL	胺基酸序列（PD1-HuAb-E1A9C8A7-V8-3 ）
SEQ ID NO:60	DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSAGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK
VH	胺基酸序列（PD1-HuAb-E1A9C8A7-V8 ）
SEQ ID NO:61	QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYVMHWVRQAPGQSLEWMGVISTYHIPAVYNQKFKGKATMTVDTSTSTVYLELSSLRSEDTAVYYCAREVYGDSYYFDVWGQGTTVTVSS
VL	胺基酸序列（PD1-HuAb-E1A9C8A7-V8 ）
SEQ ID NO:62	DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK

表3: 雙特異性構建體序列

區域	胺基酸序列
SEQ ID NO:63 CDX-585 LC胺基酸	可變區（底線） 恒定區（雙底線） DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSAGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
SEQ ID NO:64 CDX-585 HC胺基酸	可變區（底線） 恒定區（雙底線） scFv（虛線底線） 底線：連接子（粗體斜體） 修改的堿基（粗體） QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYVMHWVRQAPGQSLEWMGVISTYHIPAVYNQKFKGKATMTVDTSTSTVYLELSSLRSEDTAVYYCAREVYG ESYYFDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AQGGPSVFLFPPKPKDTL YI TR EPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC QVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GSSGGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKFLVYNADTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFG CGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGG SQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYTMHWVRQAPGQ CLEWMGLINPYTGGTDYNQKFQGRVTMTVDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARERPGGSQFIYYYALDYWGQGTTVTVSS *
區域	胺基酸序列
SEQ ID NO:65 E1A9-7B1 (CDX-585) LC核苷酸	可變區（底線） 恒定區（雙底線） GACATCGTGATGACCCAGACACCATTGTCGTTGCCTGTTACTCCAGGAGAACCCGCATCAATTAGCTGCAGAAGCAGCCAGTCCATTGTGCATAGTGCCGGTAACACCTATCTGGAGTGGTACCTACAGAAGCCCGGCCAGTCTCCTCAGCTTCTTATCTACAAAGTGAGCAATAGGTTTTCTGGGGTGCCTGATCGGTTTAGCGGTAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACACTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGACGTTGGAGTGTACTACTGTTTTCAGGGCAGCCACGTGCCTTATACATTTGGTGGCGGCACAAAGGTCGAGATCAAA CGTACGGTGGCCGCTCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTTCTGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCTCTGCAGTCTGGCAATTCCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCTAAGGATTCCACATATAGCCTGAGCTCTACCCTGACACTGTCTAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCTTGCGAGGTGACCCATCAGGGCCTGTCCAGCCCAGTGACAAAGTCCTTCAATCGCGGCGAGTGTtga
SEQ ID NO:66 E1A9-7B1 (CDX-585) HC核苷酸	可變區（底線） 恒定區（雙底線） scFv（虛線底線） 底線：連接子（粗體斜體） 修改的堿基（粗體） CAAGTACAGCTCGTGCAATCTGGCGCCGAGGTAGTTAAACCTGGAGCATCCGTCAAAATTAGCTGTAAGGCAAGTGGCTACACTTTCACCGATTACGTCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGACAGAGTCTGGAGTGGATGGGCGTAATATCAACCTACCATATACCCGCCGTGTACAATCAGAAATTTAAGGGTAAGGCAACCATGACCGTTGACACCTCCACCTCTACAGTCTATCTGGAATTGTCTTCCCTAAGATCAGAGGACACTGCCGTCTACTACTGTGCCCGCGAAGTTTATGGAGAGTCATATTACTTCGATGTTTGGGGTCAGGGAACTACAGTAACTGTGAGCAGC GCTAGCACAAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCACTGGCTCCCAGCTCTAAGTCCACCAGCGGAGGAACAGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCAGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCATACATTTCCTGCTGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACCGTGCCAAGCTCTTCCCTGGGCACCCAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCATCCAATACAAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGATAAGACCCATACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCAGAG GCTCAGGGAGGACCATCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCTAAGGACACCCTG TACATC ACAAGG GAGCCAGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGATCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCAAGGGAGGAGCAGTACAATAGCACCTATCGGGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGC CAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCACAGGTGTACACACTGCCTCCAAGCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCTGATATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGTTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAATCATTACACACAGAAGAGCCTGTCTCTGTCCCCTGGCAAA GGC TCGAGCGGGGGAGGAGGTAGC GACATCCAGATGACACAGAGCCCAAGCTCTCTGAGCGCCAGCGTGGGAGATAGGGTGACAATCACTTGTAGGGCCAGCGAGAACATCTACAGCTATCTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCAAAGTTTCTGGTGTACAACGCCGACACTCTCGCTGAGGGCGTCCCTTCTAGGTTTTCCGGCAGCGGCTCCGGCACTGACTTCACACTGACTATCAGCTCTCTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACATACTACTGCCAGCACCACTACGGCACTCCTTTCACATTCGGC TGCGGCACTAAGCTGGAGATCAAG GGAGGGGGCGGTTCCGGAGGAGGCGGCAGCGGGGGAGGAGGTAGCGGCGGAGGTGGGTCT CAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAAGTGAGCTGTAAGGCCTCCGGCTACAGCTTCACTGGCTACACTATGCACTGGGTCAGACAAGCCCCCGGCCAA TGCCTGGAGTGGATGGGACTGATCAACCCTTACACTGGCGGCACTGACTACAACCAGAAGTTCCAAGGAAGGGTGACTATGACTGTGGATAGGTCCACAAGCACAGCCTACATGGAGCTGTCCTCTCTGAGATCCGAGGACACTGCCGTGTACTACTGTGCTAGGGAGAGACCCGGCGGCAGCCAGTTCATCTACTACTACGCTCTGGACTACTGGGGCCAAGGCACAACAGTCACAGTGAGCAGC tga

等同方式

僅通過常規實驗，所屬技術領域中具有通常知識者會認識到或能夠確定本文描述的本發明的具體實施方式的許多均等方式。通過以下申請專利範圍旨在涵蓋這些均等方式。

（無）

圖1是與IgG1相比較的雙特異性構建體CDX-585的SDS凝膠電泳圖。

圖2是與IgG1相比較的雙特異性構建體CDX-585的HPLC痕量分析圖。

圖3是本發明雙特異性構建體的示意圖。

圖4是使用ELISA顯示雙特異性構建體CDX-585與人PD-1的代表性結合曲線圖。

圖5A-5B是雙特異性構建體CDX-585與表達人PD-1的細胞（圖2A）和表達人ILT4的細胞（圖2B）的代表性結合曲線圖。

圖6A-6B是雙特異性構建體CDX-585與細胞表達的人ILT4（圖3A）和人PD-1（圖3B）的結合曲線圖。

圖7是通過生物層干涉測量法（BLI）顯示雙特異性構建體CDX-585的親和力和速率常數的表。

圖8是顯示雙特異性構建體CDX-585阻斷PD1/PD-L1相互作用的圖。

圖9A和9B是顯示雙特異性構建體CDX-585誘導樹突狀細胞（圖6A）和巨噬細胞（圖6B）產生TNF-α的圖。

圖10是顯示雙特異性構建體CDX-585對HLA-G結合ILT4的代表性阻斷曲線圖。

圖11是顯示雙特異性構建體CDX-585下調PD-L1表達的圖。

圖12A和12B是顯示雙特異性構建體CDX-585增加TNF-α生成（圖9A）和下調IL-10分泌（圖9B）的圖。

圖13A和13B是顯示通過IFN-γ（圖10A）的產生測定雙特異性構建體CDX-585誘導的混合淋巴細胞反應以及通過IL-2（圖10B）的產生測定的混合淋巴細胞反應的圖。

圖14是顯示雙特異性構建體CDX-585增加IFN-γ產生的圖，顯示抗ILT4和抗PD-1結合結構域的組合的協同作用。

圖15是在小鼠腫瘤模型中的體內抗腫瘤活性的圖。

圖16A-16D是顯示在小鼠腫瘤模型中（A）人IgG1 AQQ（0.5 mg/只小鼠）、（B）7B1（0.375 mg/只小鼠）、（C）E1A9（0.375 mg/只小鼠）和7B1（0.375 mg/只小鼠）和（D）CDX-585（0.5 mg/只小鼠）的體內抗腫瘤活性圖。

圖17A-17C是食蟹猴在單次靜脈注射（10 mg/kg）CDX-585後血清中細胞因數/趨化因數（A）MCP-1（CCL2）、（B）MIP-1β（CCL4）、和（C）MDC（CCL22）的濃度圖。

圖18是食蟹猴在單次靜脈注射（10 mg/kg）CDX-585後血清中CDX-585的濃度圖。

圖19是在經LPS或抗CD40抗體（CDX-1140）孵育的樹突狀細胞（DCs）中，抗體7B1、E1A9、7B1和E1A9的組合、以及CDX-585產生IFN-γ的圖。

圖20是在小鼠腫瘤模型中的體內抗腫瘤活性的圖。

TW202436347A_112109064_SEQL.xml

Claims (45)

1. 一種雙特異性構建體，其包含與抗PD-1結合結構域連接的抗ILT4結合結構域，其中： （a）所述抗ILT4結合結構域包含： （i）重鏈可變區CDR1，其胺基酸序列選自共有序列：G Y T (I, M) H（SEQ ID NO: 21），或其保守序列修飾； （ii）重鏈可變區CDR2，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，或其保守序列修飾； （iii）重鏈可變區CDR3，其胺基酸序列選自共有序列：E R P G G S Q F I Y Y Y (P, A) (M, L) D Y（SEQ ID NO: 22），或其保守序列修飾； （iv）輕鏈可變區CDR1，其胺基酸序列選自共有序列：R A S (A, E) N I Y S Y L A（SEQ ID NO: 23），或其保守序列修飾； （v）輕鏈可變區CDR2，其胺基酸序列選自共有序列：N A (I, D) T L A E（SEQ ID NO: 24），或其保守序列修飾； （vi）輕鏈可變區CDR3，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 8所示，或其保守序列修飾；以及 （b）所述抗PD-1結合結構域包含： （i）分別如SEQ ID NOs: 31、36和41所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾，以及分別如SEQ ID NOs: 46、51和56所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾；或 （ii）分別如SEQ ID NOs: 69、74和79所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾，以及分別如SEQ ID NOs: 84、89和94所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾。
2. 如請求項1所述的雙特異性構建體，其中： （a）抗ILT4結合結構域包含： （i）分別如SEQ ID NOs: 11、13和15所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾；或 （ii）分別如SEQ ID NOs: 1、3和5所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾；以及分別如SEQ ID NOs: 6、7和8所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾；和 （b）抗PD-1結合結構域包含： （i）分別如SEQ ID NOs: 31、36和41所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾，以及分別如SEQ ID NOs: 46、51和56所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾；或 （ii）分別如SEQ ID NOs: 69、74和79所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾，以及分別如SEQ ID NOs: 84、89和94所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，或其保守序列修飾。
3. 如請求項1或2所述的雙特異性構建體，其中： （a）抗ILT4結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 11、13和15所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3；和 （b）抗PD-1結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 31、36和41所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 46、51和56所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3。
4. 如請求項1至3中任一項所述的雙特異性構建體，其中： （a）抗ILT4結合結構域包含： （i）如SEQ ID NO: 19所示胺基酸序列的重鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列，以及如SEQ ID NO: 20所示胺基酸序列的輕鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列；或 （ii）如SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列的重鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列，以及如SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的輕鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列；和 （b）抗PD-1結合結構域包含： （i）如SEQ ID NO: 59所示胺基酸序列的重鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列，以及如SEQ ID NO: 60所示胺基酸序列的輕鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列；或 （ii）如SEQ ID NO: 61所示胺基酸序列的重鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列，以及如SEQ ID NO: 62所示胺基酸序列的輕鏈可變區，或與其至少95%同一性的序列。
5. 如請求項1至4中任一項所述的雙特異性構建體，其中抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 19的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 20的輕鏈可變區。
6. 如請求項1至4中任一項所述的雙特異性構建體，其中抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 9的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 10的輕鏈可變區。
7. 如請求項1至6中任一項所述的雙特異性構建體，其中抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 59的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 60的輕鏈可變區。
8. 一種雙特異性構建體，其包含與抗PD-1結合結構域連接的抗ILT4結合結構域，其中： （a）抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 19的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 20的輕鏈可變區；以及 （b）抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 59的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 60的輕鏈可變區。
9. 一種雙特異性構建體，其包含與抗PD-1結合結構域連接的抗ILT4結合結構域，其中： （a）抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 9的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 10的輕鏈可變區；以及 （b）抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 59的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 60的輕鏈可變區。
10. 一種雙特異性構建體，其包含與抗PD-1結合結構域連接的抗ILT4結合結構域，其中： （a）抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 19的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 20的輕鏈可變區；以及 （b）抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 61的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 62的輕鏈可變區。
11. 一種雙特異性構建體，其包含與抗PD-1結合結構域連接的抗ILT4結合結構域，其中： （a）抗ILT4結合結構域包含含有SEQ ID NO: 9的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 10的輕鏈可變區；以及 （b）抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 61的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 62的輕鏈可變區。
12. 如前述請求項中任一項所述的雙特異性構建體，其中抗PD-1結合結構域進一步包含人IgG1恒定結構域。
13. 如前述請求項中任一項所述的雙特異性構建體，其中抗ILT4結合結構域連接至抗PD-1結合結構域的重鏈的C末端。
14. 如前述請求項中任一項所述的雙特異性構建體，其中抗ILT4結合結構域是scFv。
15. 如前述請求項中任一項所述的雙特異性構建體，其中抗ILT4結合結構域與抗PD-1結合結構域是基因融合的。
16. 如請求項1至14中任一項所述的雙特異性構建體，其中抗ILT4結合結構域與抗PD-1結合結構域是化學綴合的。
17. 一種雙特異性構建體，其包含與抗ILT4 scFv連接的抗PD-1結合結構域，其中： （a）抗ILT4 scFv包含分別如SEQ ID NOs: 11、13和15所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3；以及 （b）PD-1結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 31、36和41所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，和分別如SEQ ID NOs: 46、51和56所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及人IgG1恒定區。
18. 如請求項17所述的雙特異性構建體，其中： （a）抗ILT4 scFv包含含有SEQ ID NO: 19的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 20的輕鏈可變區；以及 （b）抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 59的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 60的輕鏈可變區。
19. 一種雙特異性構建體，其包含與抗ILT4 scFv連接的抗PD-1結合結構域，其中： （a）抗ILT4 scFv包含分別如SEQ ID NOs: 11、13和15所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 16、17和18所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3；和 （b）抗PD-1結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 69、74和79所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，和分別如SEQ ID NOs: 84、89和94所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及人IgG1恒定結構域。
20. 如請求項19所述的雙特異性構建體，其中： （a）抗ILT4 scFv包含含有SEQ ID NO: 19的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 20的輕鏈可變區；以及 （b）抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 61的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 62的輕鏈可變區。
21. 一種雙特異性構建體，其包含與抗ILT4 scFv連接的抗PD-1結合結構域，其中： （a）抗ILT4 scFv包含分別如SEQ ID NOs: 1、3和5所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 6、7和8所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3；以及 （b）抗PD-1結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 31、36和41所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，和分別如SEQ ID NOs: 46、51和56所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及人IgG1恒定區。
22. 如請求項21所述的雙特異性構建體，其中： （a）抗ILT4 scFv包含含有SEQ ID NO: 9的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 10的輕鏈可變區；以及 （b）抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 59的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 60的輕鏈可變區。
23. 一種雙特異性構建體，其包含與抗ILT4 scFv連接的抗PD-1結合結構域，其中： （a）抗ILT4 scFv包含分別如SEQ ID NOs: 1、3和5所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及分別如SEQ ID NOs: 6、7和8所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3；以及 （b）抗PD-1結合結構域包含分別如SEQ ID NOs: 69、74和79所示的重鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，和分別如SEQ ID NOs: 84、89和94所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3，以及人IgG1恒定結構域。
24. 如請求項23所述的雙特異性構建體，其中： （a）抗ILT4 scFv包含含有SEQ ID NO: 9的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 10的輕鏈可變區；以及 （b）抗PD-1結合結構域包含含有SEQ ID NO: 61的重鏈可變區，和含有SEQ ID NO: 62的輕鏈可變區。
25. 如請求項17所述的雙特異性構建體，其中抗PD-1結合結構域和抗ILT4 scFv包含分別如SEQ ID NOs: 64和63所示序列的重鏈和輕鏈。
26. 如請求項17所述的雙特異性構建體，其中抗PD-1結合結構域和抗ILT4 scFv的重鏈和輕鏈分別由SEQ ID NOs: 66和65所示的核苷酸序列編碼。
27. 一種組合物，其包含請求項1至26中任一項所述的雙特異性構建體和藥學上可接受的載體。
28. 如請求項27所述的組合物，還包括一種或多種治療劑。
29. 如請求項27或28所述的組合物，其中所述治療劑是另一種抗體。
30. 如請求項27至29中任一項所述的組合物，其中所述抗體是抗PD-L1抗體和/或抗CTLA-4抗體。
31. 一種試劑盒，其包含如請求項1至26中任一項所述的雙特異性構建體，或如請求項27至30中任一項所述的組合物，以及使用說明。
32. 一種啟動巨噬細胞的方法，其包括用請求項1至26中任一項所述的雙特異性構建體，或請求項27至-30中任一項所述的組合物接觸巨噬細胞。
33. 一種用於誘導或增強受試者免疫應答的方法，其包括以有效誘導或增強所述受試者的免疫應答的量向所述受試者施用請求項1至26中任一項所述的雙特異性構建體，或請求項27至30中任一項所述的組合物。
34. 一種用於治療受試者的病況或疾病的方法，所述方法包括以有效治療所述病況或疾病的量向所述受試者施用請求項1至26中任一項所述的雙特異性構建體，或請求項27至30中任一項所述的組合物。
35. 如請求項34所述的方法，其中所述受試者患有需要免疫應答刺激的病況或疾病。
36. 如請求項34或35所述的方法，其中病況或疾病是癌症。
37. 如請求項36所述的方法，其中癌症是皮膚癌、結直腸癌、卵巢癌、腎細胞癌、頭頸部鱗狀細胞癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、婦科癌、肉瘤、淋巴瘤、或膠質母細胞瘤。
38. 一種治療受試者的腫瘤的方法，所述方法包括以有效治療所述腫瘤的量向所述受試者施用請求項1至26中任一項所述的雙特異性構建體，或請求項27至30中任一項所述的組合物。
39. 如請求項38所述的方法，其中所述腫瘤表達ILT4、HLA-G、HLA I類、血管生成素樣蛋白2、Nogo、ILT4配體、PD-L1或PD-L2。
40. 如請求項33至39中任一項所述的方法，還包括向受試者施用一種或多種治療劑。
41. 如請求項40所述的方法，其中所述治療劑是另一種抗體。
42. 如請求項41所述的方法，其中所述抗體是抗PD-L1抗體和/或抗CTLA-4抗體。
43. 如請求項40至42中任一項所述的方法，其中所述雙特異性構建體和一種或多種治療劑是同時施用的。
44. 如請求項40至42中任一項所述的方法，其中雙特異性構建體和一種或多種治療劑是按序施用的。
45. 如請求項1至26中任一項所述的雙特異性構建體，或請求項27至30中任一項所述的組合物，在製備用於治療癌症的藥物中的用途。