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TW202402798A - 對新抗原具特異性之結合蛋白與工程化細胞及其用途 - Google Patents

對新抗原具特異性之結合蛋白與工程化細胞及其用途 Download PDF

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TW202402798A
TW202402798A TW112118979A TW112118979A TW202402798A TW 202402798 A TW202402798 A TW 202402798A TW 112118979 A TW112118979 A TW 112118979A TW 112118979 A TW112118979 A TW 112118979A TW 202402798 A TW202402798 A TW 202402798A
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蓋瑞 夏皮洛
星月 何
愛麗森 卓恩
紅靜 曲
米雪爾 霍夫曼
進聲 梁
湯瑪士 史齊米
菲力普 葛林伯格
帝尚納 馬丁諾福
瑞秋 佩瑞特
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美商艾費尼Ｔ醫療公司
弗莱德哈欽森癌症中心
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Abstract

本發明提供靶向新抗原以例如治療或預防癌症之組合物及方法。所揭示之實施例包括結合蛋白，諸如結合於新抗原:HLA複合物之T細胞受體。所揭示之結合蛋白對抗原高度敏感，從而能夠誘導宿主T細胞在低濃度肽抗原下活化。在某些實施例中，本發明之結合蛋白(i)對於來自人類蛋白質體的胺基酸序列及/或(ii)對於人類HLA對偶基因無同種異體反應性，實質上無同種異體反應性，及/或同種異體反應性的風險低。可將編碼此類結合蛋白之聚核苷酸引入諸如T細胞之宿主細胞中，且該細胞可用於治療各種癌症之免疫療法中。

Description

對新抗原具特異性之結合蛋白與工程化細胞及其用途
當在腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之群體中發現腫瘤反應性T細胞時開始研發基於T細胞之免疫療法。一種稱為授受性T細胞轉移之策略在一些情形下涉及分離針對腫瘤反應性預先選擇之腫瘤浸潤淋巴球，在IL-2存在下由抗CD3及抗CD28抗體誘發之腫瘤反應性T細胞的殖株擴增，及將經擴增之細胞群體輸注回負載腫瘤之患者。腫瘤反應性T細胞殖株之分離引起另一免疫治療方法之研發-產生對特定抗原具特異性之重組T細胞受體(TCR)，其可例如使用載體遞送系統引入T細胞中以賦予對所需目標(諸如由腫瘤細胞上表現之主要組織相容複合物(MHC)分子(人類中稱為人類白血球抗原(HLA)分子)呈現之腫瘤相關肽)的特異性。
在一些態樣中，本發明提供：一種聚核苷酸，其包含編碼以下之核酸序列：(a)結合蛋白，其中該結合蛋白包含：(i) T細胞受體(TCR)或其功能衍生物；或(ii)嵌合抗原受體(CAR)或其功能衍生物；及(b)融合蛋白，其中該融合蛋白包含：(i)包含CD95配位體(FasL)結合域之細胞外組分，該CD95配位體結合域包含CD95 (Fas)胞外域或其功能片段；及(ii)包含CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域之細胞內組分，其中編碼該結合蛋白之該核酸序列位於編碼該融合多肽之該核酸序列的上游。在一些實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼以下之核酸序列：(c) CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體，其中編碼該結合蛋白之序列位於編碼CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體之細胞外部分的序列的上游。在一些實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼以下之核酸序列：(c) CD8輔受體α及β鏈或其部分或變異體，其中編碼該結合蛋白之序列位於編碼該CD8輔受體α及β鏈或其部分或變異體之細胞外部分的序列的上游。在一些實施例中，編碼該融合蛋白之核酸序列進一步編碼：介於融合蛋白之細胞外組分與細胞內組分之間的疏水性組分。在一些實施例中，結合蛋白包含結合於肽:HLA複合物之結合域，其中該複合物包含新抗原肽及HLA蛋白。在一些實施例中，結合蛋白包含單鏈TCR (scTCR)或單鏈T細胞受體可變片段(scTv)。在一些實施例中，結合蛋白包含TCR α鏈可變(Vα)域或TCR β鏈可變(Vβ)域。在一些實施例中，結合蛋白包含TCR α鏈可變(Vα)域及TCR β鏈可變(Vβ)域。在一些實施例中，CD95 (Fas)配位體結合域為Fas胞外域或其功能片段。在一些實施例中，細胞內組分為CD137 (4-1BB)跨膜域或其功能片段。在一些實施例中，CD95 (Fas)胞外域或其功能片段包含與SEQ ID NO: 81具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列，或該CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO:82具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與SEQ ID NO: 80具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。在一些實施例中，編碼融合蛋白之核酸序列包含與SEQ ID NO: 83具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。在一些實施例中，CD95 (Fas)胞外域或其功能片段包含SEQ ID NO: 81之殘基R68、F97、K100、R102、R103、L106、F133、H142中的至少一者。在一些實施例中，CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域或其一部分或變異體包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列或SEQ ID NO: 66之胺基酸序列。在一些實施例中，新抗原肽為KRAS、HRAS、NRAS、p53或PIK3CA突變肽。在一些實施例中，KRAS突變肽包含x-V-G-A-x-G-x-x-K，其中x表示任何胺基酸。在一些實施例中，KRAS突變肽為KRAS G12V突變肽。在一些實施例中，KRAS G12V突變肽包含胺基酸序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO:2)或VVGAVGVGK (SEQ ID NO:3)。在一些實施例中，HLA蛋白由HLA-A*11或HLA-A*11:01對偶基因編碼。在一些實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼自裂解肽之核酸序列，該自裂解肽介於編碼TCR受體可變α (Vα)區之核酸序列與編碼TCR受體可變β (Vβ)區之核酸序列之間。在一些實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼自裂解肽之核酸序列，該自裂解肽安置於(a)與(b)之間或在存在(c)下安置於(b)與(c)之間。在一些實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼自裂解肽之核酸序列，該核酸序列介於編碼CD8輔受體α鏈之序列與編碼CD8輔受體β鏈之序列之間。在一些實施例中，聚核苷酸進一步包含編碼自裂解肽之核酸序列，該核酸序列安置於編碼結合蛋白之核酸序列與編碼包含CD8輔受體α鏈之細胞外部分之多肽的核酸序列之間；及/或安置於編碼結合蛋白之核酸序列與編碼包含CD8輔受體β鏈之細胞外部分之多肽的核酸序列之間。在一些實施例中，聚核苷酸進一步包含同框可操作地連接的以下各者：(i)     (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)-(pnFP)；(ii) (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)-(pnFP)；(iii)(pnBP)-(pnSCP 1)-(pnFP)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)；或(iv) (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnFP)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)；其中pnCD8α為編碼包含CD8輔受體α鏈之細胞外部分之多肽的核酸序列，其中pnCD8β為編碼包含CD8輔受體β鏈之細胞外部分之多肽的核酸序列，其中pnBP為編碼結合蛋白之核酸序列，其中pnFP為編碼融合蛋白之核酸序列，且其中pnSCP 1及pnSCP 2各自獨立地為編碼自裂解肽之聚核苷酸，其中該等聚核苷酸及/或所編碼的該等自裂解肽視情況相同或不同。在一些實施例中，自裂解肽為P2A、T2A、E2A或弗林蛋白酶肽。在一些實施例中，P2A、T2A或E2A肽分別包含SEQ ID NO:74、75或76之胺基酸序列。在一些實施例中，弗林蛋白酶肽包含胺基酸序列RAKR。在一些實施例中，結合蛋白及融合蛋白在單一構築體或連續基因體區段中進行編碼。在一些實施例中，結合蛋白、融合蛋白及CD8α或CD8β或兩者在單一構築體或連續基因體區段中進行編碼。在一些實施例中，結合蛋白及融合蛋白在單一開放閱讀框架中進行編碼。在一些實施例中，結合蛋白及融合蛋白可操作地連接於單一啟動子。在一些實施例中，結合蛋白及融合蛋白可操作地連接於不同啟動子。
在一些態樣中，本發明提供包含本文所描述之任一聚核苷酸的載體。在一些實施例中，載體係病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為慢病毒載體或γ-反轉錄病毒載體。
在一些態樣中，本發明提供包含本文所描述之任一聚核苷酸或任一載體的宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞在外源性細胞介素不存在之情況下不複製超過5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、24、36或48小時。在一些實施例中，宿主細胞為造血先驅細胞或人類免疫細胞。在一些實施例中，宿主細胞為人類免疫細胞，且人類免疫細胞包含T細胞、NK細胞、NK-T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球或其任何組合。在一些實施例中，人類免疫細胞包含T細胞，該T細胞包含CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、γδ T細胞、初始T細胞、中樞記憶T細胞、幹細胞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。
在一些態樣中，本發明提供一種用於治療個體之與KRAS G12V突變或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關之疾病或病症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之本文所描述之任一宿主細胞。在一些實施例中，疾病或病症包含癌症。在一些實施例中，癌症為實體癌症或血液惡性病。在一些實施例中，癌症為胰臟癌或癌瘤，視情況為胰管腺癌(PDAC)；結腸直腸癌或癌瘤；肺癌，視情況為非小細胞肺癌；膽癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，視情況為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(視情況為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良之甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突狀細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星形細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；被套細胞淋巴瘤；不可分類之骨髓發育不良/骨髓增生性贅瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；母細胞過量之難治性貧血-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關之AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。在一些實施例中，非經腸或靜脈內向個體投與有效量之宿主細胞。在一些實施例中，有效量包含約10 4個細胞/kg至約10 11個細胞/kg。在一些實施例中，有效量包含CD4 +T細胞及CD8 +T細胞。在一些實施例中，有效量包含大量CD4 +T細胞及CD8 +T細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含向個體投與細胞介素。在一些實施例中，細胞介素包含IL-2、IL-15或IL-21。在一些實施例中，個體已接受或正接受免疫檢查點抑制劑及/或免疫檢查點刺激劑之促效劑。在一些實施例中，個體已接受骨髓清除療法。在一些實施例中，投與有效量之宿主細胞後一段時間內，癌症降低至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在一些實施例中，該段時間包含少於或等於120天、少於或等於60天、少於或等於50天、少於或等於40天、少於或等於30天或少於或等於20天。在一些實施例中，該方法進一步包含投與至少第二劑量。
在一些態樣中，本發明提供一種引發針對表現新抗原之細胞之免疫反應的方法，該方法包含使該細胞與包含本文所描述之聚核苷酸或載體中之任一者的細胞接觸。
在一些態樣中，本發明提供一種引發針對表現新抗原之細胞之免疫反應的方法，該方法包含使該細胞與本文所描述之任一宿主細胞接觸。在一些實施例中，細胞為癌細胞。在一些實施例中，癌細胞為胰臟癌細胞、肺癌細胞或結腸直腸癌細胞。在一些實施例中，胰臟癌細胞為胰管腺癌細胞。在一些實施例中，肺癌細胞為非小細胞肺癌細胞。
在一些態樣中，本發明提供一種基因工程化免疫細胞之方法，該方法包含使該細胞與聚核苷酸接觸，該聚核苷酸包含編碼T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體、CD8α及/或CD8β輔受體或其功能片段或變異體及包含CD95 (Fas)胞外域或其功能片段及包含CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域之細胞內組分之融合蛋白的核酸序列，及擴增該免疫細胞。在一些實施例中，聚核苷酸為本文所描述之任一聚核苷酸或任一載體。
在一些態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含：(a)融合蛋白，其中該融合蛋白包含：(i)包含CD95配位體(FasL)結合域之細胞外組分，該CD95配位體結合域包含CD95 (Fas)胞外域或其功能片段；及(ii)包含CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域之細胞內組分，其中編碼該結合蛋白之核酸序列位於編碼融合多肽之核酸序列的上游；及(b)外源性CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體。在一些實施例中，外源性CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體自CD8輔受體α或β鏈之原生基因座以外之基因座表現。在一些實施例中，宿主細胞包含編碼包含非原生3'或5'非轉譯區(UTR)之外源性CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體之mRNA。在一些情況下，編碼外源性CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體之序列在與編碼融合多肽之序列相同的mRNA上。在一些實施例中，非原生3'或5' UTR為病毒UTR、腺病毒UTR或慢病毒UTR。在一些實施例中，宿主細胞包含原生TCR。外源性CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體。融合蛋白進一步編碼介於融合蛋白之細胞外組分與細胞內組分之間的疏水性組分。在一些實施例中，CD95 (Fas)配位體結合域為Fas胞外域或其功能片段。在一些實施例中，細胞內組分為CD137 (4-1BB)跨膜域或其功能片段。在一些實施例中，CD95 (Fas)胞外域或其功能片段包含與SEQ ID NO: 81具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列，或該CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO:82具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與SEQ ID NO: 80具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。在一些實施例中，CD95 (Fas)胞外域或其功能片段包含SEQ ID NO: 81之殘基R68、F97、K100、R102、R103、L106、F133、H142中的至少一者。在一些實施例中，CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域或其一部分或變異體包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列或SEQ ID NO: 66之胺基酸序列。在一些實施例中，宿主細胞進一步包括包含外源性TCR之結合蛋白。在一些實施例中，結合蛋白包含結合於肽:HLA複合物之結合域，其中該複合物包含新抗原肽及HLA蛋白。在一些實施例中，新抗原肽為KRAS、HRAS、NRAS、p53或PIK3CA突變肽。在一些實施例中，KRAS突變肽包含x-V-G-A-x-G-x-x-K，其中x表示任何胺基酸。在一些實施例中，新抗原肽為KRAS突變肽，其中該KRAS突變肽為KRAS G12V突變肽。在一些實施例中，KRAS G12V突變肽包含胺基酸序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO:2)或VVGAVGVGK (SEQ ID NO:3)。在一些實施例中，HLA蛋白由HLA-A*11或HLA-A*11:01對偶基因編碼。在一些實施例中，融合蛋白及CD8α或CD8β或兩者在單一構築體或連續基因體區段中進行編碼。在一些實施例中，融合蛋白及CD8α或CD8β或兩者在單一開放閱讀框架中進行編碼。在一些實施例中，宿主細胞在外源性細胞介素不存在之情況下不複製超過5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、24、36或48小時。在一些實施例中，宿主細胞為造血先驅細胞或人類免疫細胞。在一些實施例中，宿主細胞為人類免疫細胞，其中該人類免疫細胞包含T細胞、NK細胞、NK-T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球或其任何組合。在一些實施例中，人類免疫細胞為T細胞，其中該T細胞包含CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、γδ T細胞、初始T細胞、中樞記憶T細胞、幹細胞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。
在一些態樣中，本發明提供一種用於治療個體之癌症之方法，該方法包含向該個體投與有效量之本文所描述之任一宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞進一步包含針對由該癌症顯示之抗原的TCR。在一些實施例中，癌症為胰臟癌或癌瘤，視情況為胰管腺癌(PDAC)；結腸直腸癌或癌瘤；肺癌，視情況為非小細胞肺癌；膽癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，視情況為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金氏淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(視情況為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良之甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突狀細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星形細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；被套細胞淋巴瘤；不可分類之骨髓發育不良/骨髓增生性贅瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；母細胞過量之難治性貧血-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關之AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。在一些實施例中，非經腸或靜脈內向個體投與有效量之宿主細胞。在一些實施例中，有效量包含約10 4個細胞/kg至約10 11個細胞/kg。在一些實施例中，有效量包含CD4 +T細胞及CD8 +T細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含向個體投與細胞介素。在一些實施例中，細胞介素包含IL-2、IL-15或IL-21。在一些實施例中，個體已接受或正接受免疫檢查點抑制劑及/或免疫檢查點刺激劑之促效劑。在一些實施例中，個體已接受骨髓清除療法。在一些實施例中，在投與有效量之宿主細胞後一段時間內，癌症降低至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在一些實施例中，該段時間包含少於或等於120天、少於或等於60天、少於或等於50天、少於或等於40天、少於或等於30天或少於或等於20天。在一些實施例中，該方法進一步包含投與至少第二劑量。在一些實施例中，宿主細胞已藉由表3中所描述之方法中之任一者驗證。
在一些態樣中，本發明提供一種組合物，其包含複數個宿主細胞，其中該等宿主細胞包含針對新抗原(例如突變KRAS肽)或對其具特異性之T細胞，其中該組合物：(a)包含藉由流動式細胞量測術評定，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更多的用對突變KRAS肽具特異性之dextramer染色之CD3+細胞；(b)包含藉由流動式細胞量測術評定，至少80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或更多的CD3陽性T細胞；(c)包含藉由自動細胞計數評定，至少70%、75%、80%、85%、90%或更多的活細胞。在一些實施例中，宿主細胞為本文所描述之宿主細胞中之任一者。在一些實施例中，組合物包含藉由流動式細胞量測術評定，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更多的用對突變KRAS G12V肽具特異性之dextramer染色之CD3+細胞。在一些實施例中，組合物包含藉由流動式細胞量測術評定，至少80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或更多的CD3陽性T細胞。在一些實施例中，組合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些態樣中，本發明提供本文所描述之宿主細胞中之任一者或載體中之任一者及醫藥學上可接受之賦形劑。
根據以下實施方式，本發明之額外態樣及優點對於熟習此項技術者將變得顯而易見，其中僅顯示及描述本發明之說明性實施例。應認識到，本發明能夠具有其他及不同實施例，且其若干細節能夠在各種顯而易見的方面進行修改，該等修改皆不背離本發明。因此，附圖及說明在本質上應視為說明性而非限制性的。 以引用的方式併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同各個別的公開案、專利或專利申請案經特定及個別地指示以引用的方式併入一般。
交互參考
本申請案主張以下各者之權益：於2022年5月23日申請之美國臨時申請案第63/344,965號；於2022年10月21日申請之美國臨時申請案第63/380,527號；及於2023年5月12日申請之美國臨時申請案第63/501,973號，各以全文引用的方式併入本文中。
有效T細胞活化通常需要同時共刺激信號或藉由同時共刺激信號增強。在腫瘤微環境中，共刺激分子總體上下調。因此，需要用於授受性T細胞療法之細胞的組態，其抵消共刺激分子之此下調或總體上增強靶向抗原之受體對腫瘤微環境中之該等T細胞的作用。另外，腫瘤微環境可包含異質細胞類型(例如基質細胞、內皮細胞及腫瘤相關巨噬細胞、顆粒球及發炎性單核球)，該等細胞經由直接接觸及分泌可溶性抑制因子而促進T細胞抑制。
本發明之一些態樣大體上係關於表現以下各者之細胞(例如免疫效應細胞，諸如CD4+及/或CD8+ T細胞)：1)與新抗原肽:HLA複合物結合之外源性結合蛋白；2)融合蛋白(例如Fas-41BB融合蛋白)；及3) CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)。本發明之一些態樣大體上係關於一或多種構築體，其編碼1)與新抗原肽:HLA複合物結合之外源性結合蛋白，2)融合蛋白(例如Fas-41BB融合蛋白)，及3) CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)。
本發明之一些態樣大體上係關於將腫瘤微環境中之T細胞抑制信號轉化為T細胞活化或增殖信號的融合蛋白(例如融合受體或「開關」受體)。因此，本發明之一些態樣係關於融合蛋白，其包含與細胞內域連接之細胞外域，該細胞外域對可溶性或細胞錨定之抑制配位體具特異性，該細胞內域有助於T細胞活化(例如，4-1BB細胞內信號傳導域或CD28細胞內信號傳導域)。在一些情況下，此類蛋白質包含來源於Fas受體之細胞外域及來源於4-1BB受體之細胞內域(例如Fas-41BB融合蛋白)。
不希望受理論束縛，此類Fas-41BB融合蛋白可經由響應於腫瘤微環境中之Fas配位體(FASLG)而活化NF-κB、增加Bcl-2表現及活化PI3K及MEK-1/2信號傳導路徑，抑制T細胞凋亡，增強IL-2或IFN-γ分泌，促進記憶T細胞發育，增加T細胞代謝能力，及/或改良T細胞增殖、持久性及適合度。或者或另外，此類Fas-41BB融合蛋白可以顯性陰性方式起作用，或隔絕腫瘤、內皮及腫瘤微環境中之經刺激T細胞對Fas配位體之表現，防止腫瘤浸潤時T細胞之消除或細胞凋亡。已證明Fas配位體在許多實體腫瘤之腫瘤微環境中表現，且經考慮實體腫瘤之微環境中存在Fas配位體可造成T細胞授受性細胞療法之功效有限。
本發明之一些態樣大體上係關於對Ras新抗原具特異性之結合蛋白、表現其之經修飾之免疫細胞、編碼結合蛋白之聚核苷酸及相關用途。突變Ras蛋白(例如KRAS、NRAS、HRAS)可產生新生抗原，包括全長KRAS蛋白(SEQ ID NO: 1；UniProt KB P01116)之位置12或全長NRAS蛋白(SEQ ID NO: 78；Uniprot KB P01111)之位置12或全長HRAS蛋白(SEQ ID NO:79；Uniprot KB P01112)之位置12的G→V突變。
本發明之一些態樣大體上係關於對p53新抗原具特異性之結合蛋白、表現其之經修飾之免疫細胞、編碼結合蛋白之聚核苷酸及相關用途。突變p53蛋白可潛在地產生新抗原；例如在位置R175、G245、R248、R249、R273及R282 (相對於SEQ ID NO: 1039 (野生型p53))。誤義突變佔p53突變約70%-80%，且在大部分(若非全部)人類惡性病中發生野生型p53活性下調(Duffy等人, Seminars Cancer Bio., 79:58-67 (2022))。
本發明之一些態樣大體上係關於對PIK3CA新抗原具特異性之結合蛋白、表現其之經修飾之免疫細胞、編碼結合蛋白之聚核苷酸及相關用途。突變p53蛋白可潛在地產生新抗原；例如在位置R38、G106、C420、E453、E542、E545、M1043及H1047(相對於SEQ ID NO: 1040 (野生型PIK3CA))。誤義突變佔PIK3CA突變約70%-80%，且已在許多人類癌症中發現PIK3CA活性中之突變(Ligresti等人, Cell Cycle, 8(9):1352-58 (2009))。
在本發明中，提供能夠結合於新抗原之結合蛋白。在某些態樣中，提供包含TCR Vα域及TCR Vβ域之結合蛋白(及宿主細胞，諸如免疫細胞，其包含編碼本發明之結合蛋白的異源聚核苷酸)，其中該等結合蛋白能夠結合於新抗原肽:HLA複合物。
舉例而言，在本發明中，提供能夠結合於Ras新抗原之結合蛋白。在某些態樣中，提供包含TCR Vα域及TCR Vβ域之結合蛋白(及宿主細胞，諸如免疫細胞，其包含編碼本發明之Ras特異性結合蛋白的異源聚核苷酸)，其中該等結合蛋白能夠結合於Ras肽抗原:HLA複合物，其中該Ras肽抗原包含SEQ ID NO: 2或3中之任一者中所示的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。在某些實施例中，HLA包含HLA-A*11，諸如HLA-A*11:01。
所揭示之結合蛋白對抗原高度敏感，從而能夠誘導宿主T細胞在低濃度肽抗原下活化。在表現結合蛋白之(例如CD8+及/或CD4+) T細胞群或樣品的某些實施例中，T細胞在[LogEC50小於-9 M (例如在-9 M與-10 M之間)]肽存在下具有活化標記物 Nur77的半數最大表現。在表現結合蛋白之(例如CD8+及/或CD4+) T細胞群或樣品的某些實施例中，T細胞在[LogEC50小於-10 M (例如在-10 M與-11 M之間)]存在下具有CD137的半數最大表現。在表現結合蛋白之(例如CD8+及/或CD4+) T細胞群或樣品的某些實施例中，T細胞在[LogEC50小於-10 M (例如在-10 M與-11 M之間)]肽存在下具有IFN-γ的半數最大表現。
表現根據本發明之結合蛋白的宿主(例如T)細胞在結合蛋白識別之新抗原存在下活化(例如，藉由CD137之表現確定)。舉例而言，識別且結合突變KRAS之結合蛋白在表現突變KRAS之癌細胞株(例如，OVCAR5 (卵巢漿液性腺癌)、DAN-G (胰臟腺癌)、CFPAC1 (胰臟腺癌)、SW480 (結腸癌)、SW527 (乳癌)及NCI-H441 (肺腺癌)細胞株)存在下活化。
在一些實施例中，表現根據本發明之結合蛋白的宿主細胞(例如，T細胞，諸如CD4+ T細胞或CD8+ T細胞)能夠特異性殺死表現新抗原之細胞(例如，表現突變KRAS之細胞(例如，SW480細胞，諸如以8:1效應細胞:目標細胞比率、4:1效應細胞:目標細胞比率或2:1效應細胞:目標細胞比率))。在一些實施例中，表現根據本發明之結合蛋白的宿主細胞能夠在144內在活體外特異性殺死表現新抗原之細胞(例如表現突變KRAS之細胞)，包括當在再攻擊環境中以72小時添加額外腫瘤細胞時。
在某些實施例中，本發明之結合蛋白(i)對於來自人類蛋白質體的胺基酸序列及/或(ii)對於人類HLA對偶基因無同種異體反應性，實質上無同種異體反應性，及/或同種異體反應性的風險低。
在本文所揭示之任一實施例中，結合蛋白可為人類的、人源化的或嵌合的。亦提供編碼結合蛋白之聚核苷酸、包含聚核苷酸之載體及包含聚核苷酸及/或載體及/或表現結合蛋白之宿主細胞。本發明所揭示之結合蛋白及宿主細胞(例如T細胞、NK細胞、NK-T細胞)適用於治療與KRAS新生抗原相關之疾病或病症，諸如癌症。本發明所揭示之結合蛋白亦可結合於人類NRAS或人類HRAS中所產生之G12V抗原，該等蛋白質在殘基G12附近的區域中包含與KRAS一致的序列。因此，所揭示之組合物適用於治療與KRAS新抗原、包含G12V突變之NRAS新抗原或包含G12V突變之HRAS新抗原或其任何組合相關的疾病或病症。
亦提供本發明所揭示之結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞及相關組合物用於治療如本文所提供之與新抗原(例如KRAS、NRAS、HRAS、p53及/或PIK3CA)突變相關之疾病或病症的方法及用途。
在更詳細地闡述本發明之前，提供要被用於本文中之某些術語之定義可有助於理解本發明。額外定義闡述於整個本發明中。
在本說明書中，除非另外指示，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所列舉範圍內之任何整數值及(在適當時)其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。此外，除非另外指示，否則本文所敍述之與諸如聚合物次單元、尺寸或厚度之任何物理特點相關之任何數值範圍應理解為包括所敍述範圍內之任何整數。如本文所用，除非另外指示，否則術語「約」意謂指定範圍、值或結構±20%。應理解，如本文所使用之術語「一(a/an)」係指所列舉之組分之「一或多者」。應瞭解替代物(例如「或」)之使用意謂替代物之一者、兩者或其任何組合。如本文所用，術語「包括」、「具有」及「包含」同義地使用，該等術語及其變化形式意欲被理解為非限制性的。
另外，應理解，衍生自本文所描述之結構及取代基之各種組合的個別化合物或化合物群係由本申請案揭示，其程度與個別地闡述各化合物或化合物群相同。因此，特定結構或特定取代基之選擇係在本發明之範疇內。
術語「基本上由……組成」不等效於「包含」，且係指技術方案之指定材料或步驟，或不顯著地影響所主張之主題之基礎特徵的材料或步驟。舉例而言，當域、區、模組或蛋白質之特定胺基酸序列包括延伸、缺失、突變或其組合(例如位於胺基端或羧基端或各域之間的胺基酸)且其組合佔域、區、模組或蛋白質之長度的至多20% (例如至多15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)且基本上不影響域、區、模組或蛋白質之活性(例如結合蛋白之目標結合親和力或親合力)(亦即，活性降低不大於50%，諸如不大於40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%)時，蛋白質域、區或模組(例如結合域、鉸鏈區、連接子模組)或蛋白質(其可具有一或多個域、區或模組)「基本上由該胺基酸序列組成」。
如本文所用，「蛋白質」或「多肽」一般係指胺基酸殘基之聚合物。蛋白質適用於天然存在之胺基酸聚合物，以及適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸聚合物，及非天然存在之胺基酸聚合物。在一些實施例中，「肽」(例如肽抗原)係指長度約8-10個胺基酸殘基的聚合物。
如本文所用，「造血先驅細胞」一般係指可衍生自造血幹細胞或胎兒組織且能夠進一步分化成成熟細胞類型(例如，免疫系統細胞)之細胞。示例性造血先驅細胞包括具有CD24 LoLin -CD117 +表型之彼等細胞或在胸腺中發現之彼等細胞(稱為先驅胸腺細胞)。
如本文所用，「免疫系統細胞」一般係指免疫系統中來源於骨髓造血幹細胞之任何細胞，其產生二個主要譜系：骨髓先驅細胞(其產生骨髓細胞，諸如單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞、巨核細胞及顆粒球)及淋巴先驅細胞(其產生淋巴細胞，諸如T細胞、B細胞及自然殺手(NK)細胞)。示例性免疫系統細胞包括CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、γδ T細胞、調節T細胞、自然殺手細胞、自然殺手T細胞及樹突狀細胞。巨噬細胞及樹突狀細胞可稱為「抗原呈遞細胞」或「APC」，其為特化細胞，該等特化細胞在與肽複合之APC表面上的主要組織相容複合物(MHC)受體與T細胞表面上的TCR相互作用時可活化T細胞。
「T細胞」或「T淋巴球」為一種免疫系統細胞，其在胸腺中成熟且產生T細胞受體(TCR)。T細胞可為原生的(「T N」；不暴露於抗原；相較於T CM(本文所述)，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127及CD45RA之表現增強，及CD45RO之表現減少或無表現)；記憶T細胞(T M)(經歷且長期存活之抗原)，包括幹細胞記憶T細胞；以及效應細胞(經歷抗原，具細胞毒性)。T M可進一步分成中樞記憶T細胞亞群(T CM，表現CD62L、CCR7、CD28、CD95、CD45RO及CD127)及效應記憶T細胞亞群(T EM，表現CD45RO；CD62L、CCR7、CD28及CD45RA之表現減少)。效應T細胞(T E)係指遭遇過抗原的CD8+細胞毒性T淋巴球，其表現CD45RA，相較於T CM具有減少的CD62L、CCR7及CD28表現，且對顆粒酶及穿孔素呈陽性。輔助T細胞(T H)為CD4 +細胞，其藉由釋放細胞介素影響其他免疫細胞之活性。CD4 +T細胞可活化及抑制適應性免疫反應，而彼二種功能中之哪一者經誘導將視其他細胞及信號之存在而定。T細胞可使用已知技術收集，且各種亞群或其組合可藉由已知技術富集或耗乏，諸如藉由與抗體之親和力結合、流動式細胞量測術或免疫磁性選擇。其他示例T細胞包括調節性T細胞，諸如CD4 +CD25 +(Foxp3 +)調節性T細胞及Treg17細胞，以及Tr1、Th3、CD8 +CD28 -及Qa-1限制性T細胞。
「T細胞受體」(TCR)一般係指具有可變結合域、恆定域、跨膜區及短胞質尾區之免疫球蛋白超家族成員；參見例如Janeway等人, Immunobiology:  The Immune System in Health and Disease, 第3版, Current Biology Publications, 第433頁, 1997)，能夠特異性結合於與MHC受體結合之抗原肽。TCR可發現於細胞表面上或發現呈可溶形式且通常包含異二聚體，其具有α及β鏈(分別亦稱為TCRα及TCRβ)，或γ及δ鏈(分別亦稱為TCRγ及TCRδ)。在某些實施例中，編碼本發明之結合蛋白(例如TCR)的聚核苷酸可經密碼子最佳化，以增強在特定宿主細胞，諸如免疫系統細胞、造血幹細胞、T細胞、初代T細胞、T細胞株、NK細胞或自然殺手T細胞中之表現(Scholten等人, Clin . Immunol .119:135, 2006)。可表現本發明之結合蛋白及TCR的示例性T細胞包括CD4 +T細胞、CD8 +T細胞及其相關亞群(例如原生、中樞記憶、幹細胞記憶、效應記憶)。
如同其他免疫球蛋白(例如抗體)一般，TCR鏈(例如α-鏈、β-鏈)之細胞外部分含有兩個免疫球蛋白域、N端之可變域(例如α-鏈可變域或V α、β-鏈可變域或V β；基於Kabat編號(Kabat等人, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 第5版)，通常為胺基酸1至116)及與細胞膜相鄰之一個恆定域(例如α-鏈恆定域或C α，基於Kabat通常為5胺基酸117至259；β-鏈恆定域或C β，基於Kabat通常為胺基酸117至295)。另外，如同免疫球蛋白，可變域含有藉由構架區(FR)分隔之互補決定區(CDR)(參見例如Jores等人, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA87:9138, 1990；Chothia等人, EMBO J.7:3745, 1988；亦參見Lefranc等人, Dev. Comp. Immunol.27:55, 2003)。本發明中使用之TCR來源可來自各種動物物種，諸如人類、小鼠、大鼠、兔或其他哺乳動物。
術語「可變區」或「可變域」一般係指參與免疫球蛋白超家族結合蛋白(例如TCR)對抗原之結合的免疫球蛋白超家族結合蛋白之域(例如TCR α-鏈或β-鏈(或γδ TCR的γ鏈及δ鏈))。原生TCR之α-鏈及β-鏈的可變域(分別為Vα及Vβ)通常具有類似結構，各域包含一般保守的四個構架區(FR)及三個CDR。Vα域係由二個各別DNA區段、可變基因區段及接合基因區段(V-J)編碼；Vβ區域係由三個各別DNA區段、可變基因區段、多樣性基因區段及接合基因區段(V-D-J)編碼。單一Vα或Vβ域可足以賦予抗原結合特異性。另外，可使用來自結合特定抗原之TCR的Vα或Vβ域分別篩選互補Vα或Vβ域的文庫來分離出結合該抗原之TCR。
術語「互補決定區」及「CDR」一般與「高變區」或「HVR」同義且一般係指免疫球蛋白(例如TCR)可變區內之胺基酸序列。CDR賦予抗原特異性及結合親和力且一級胺基酸序列藉由構架區彼此隔開。一般而言，各TCR α-鏈可變區中存在三個CDR (αCDR1、αCDR2、αCDR3)且各TCR β-鏈可變區中存在三個CDR (βCDR1、βCDR2、βCDR3)。TCR中的CDR3被認為係負責識別經加工之抗原的主要CDR。一般而言，CDR1及CDR2主要或完全與MHC相互作用。
CDR1及CDR2係在TCR可變區編碼序列之可變基因區段內編碼，而CDR3係由跨越Vα之可變及接合區段的區域編碼或由跨越Vβ之可變、多樣性及接合區段的區域編碼。因此，若已知Vα或Vβ之可變基因區段的屬性，則可推導出其相應CDR1及CDR2之序列；例如根據如本文所述之編號方案來推導。由於在重組過程期間發生核苷酸添加及損失，因此相較於CDR1及CDR2，CDR3 (尤其是CDR3β)通常具有顯著更大的多樣性。
可根據編號方案(例如Kabat、Chothia、EU、IMGT、增強型Chothia及Aho)比對TCR可變域序列，從而允許對同等殘基位置進行註釋且使用例如ANARCI軟體工具比較不同分子(2016, Bioinformatics 15:298-300)。編號方案為TCR可變域中之構架區及CDR提供標準化定界。在某些實施例中，本發明之CDR係根據IMGT編號方案鑑別(Lefranc等人, Dev. Comp. Immunol.27:55, 2003；imgt.org/IMGTindex/V-QUEST.php)。在一些實施例中，CDR (例如CDR3)係根據IMGT接合定義鑑別或定義。在一些實施例中，CDR (例如CDR3)係根據IMGT定義鑑別或定義。在一些實施例中，本發明之CDR係根據Kabat編號方案或方法鑑別或定義。在一些實施例中，本發明之CDR係根據Chothia編號方案或方法鑑別或定義。在一些實施例中，本發明之CDR係根據EU編號方案或方法鑑別或定義。在一些實施例中，本發明之CDR係根據增強Chothia編號方案或方法鑑別或定義。在一些實施例中，本發明之CDR係根據Aho編號方案或方法鑑別或定義。
本發明中使用之TCR來源可來自多種動物物種中之任一者，諸如人類、小鼠、大鼠、兔或其他哺乳動物。TCR恆定域序列可來自例如人類、小鼠、有袋動物(例如負鼠、袋狸、袋鼠)、鯊魚或非人類靈長類動物。在某些實施例中，TCR恆定域序列為人類序列或包含人類序列之工程化變異體。TCR恆定域可經工程化以改良配對、表現、穩定性或此等之任何組合。參見例如Cohen等人 , Cancer Res,2007；Kuball等人 , Blood2007；及Haga-Freidman等人 , Journal of Immunology2009。TCR Cα及Cβ之工程化實例包括使天然胺基酸突變為半胱胺酸，以便在一個TCR恆定域之所引入半胱胺酸與另一TCR恆定域之天然半胱胺酸之間形成二硫鍵。此類突變可包括Cα中之T48C、Cβ中之T57C或兩者。改良穩定性之突變可包括Cα跨膜域中自序列LSVIGF至序列LLVIVL之突變(「L-V-L」突變；參見Haga-Friedman等人, J Immunol 188:5538-5546 (2012)，其中的TCR突變及突變TCR恆定域序列以引用的方式併入本文中)。
如本文所用，術語「CD8輔受體」或「CD8」一般係指細胞表面糖蛋白CD8，呈α-α同二聚體或α-β異二聚體形式。CD8輔受體有助於細胞毒性T細胞(CD8 +)之功能，且經由其細胞質酪胺酸磷酸化路徑進行信號傳導來發揮作用(Gao及Jakobsen, Immunol . Today21:630-636, 2000；Cole及Gao, Cell . Mol . Immunol .1:81-88, 2004)。存在五(5)種人類CD8β鏈同功型(參見UniProtKB標識符P10966)及單一人類CD8α鏈同功型(參見UniProtKB標識符P01732)。
「CD4」一般係指有助於TCR與抗原呈遞細胞通信之免疫球蛋白輔受體糖蛋白(參見Campbell及Reece, Biology 909 (Benjamin Cummings, 第六版, 2002))。CD4存在於免疫細胞之表面上，諸如T輔助細胞、單核球、巨噬細胞及樹突狀細胞，且包括在細胞表面表現之四個免疫球蛋白域(D1至D4)。在抗原呈遞期間，CD4連同TCR複合物一起募集以結合至MHCII分子之不同區域(CD4結合MHCII β2，而TCR複合物結合MHCII α1/β1)。不希望受理論束縛，咸信緊鄰TCR複合物允許CD4相關激酶分子使存在於CD3之細胞質域上的免疫受體酪胺酸活化模體(ITAM)發生磷酸化。此活性被認為擴增由活化TCR產生的信號，以便產生或募集各種類型之免疫系統細胞，包括T輔助細胞，及免疫反應。
在某些實施例中，TCR發現於T細胞(或T淋巴球)之表面上且與CD3複合物締合。「CD3」為六條鏈之多蛋白複合物(參見Abbas及Lichtman, 2003；Janeway等人, 第172及178頁, 1999)，其與T細胞中之抗原信號傳導相關。在哺乳動物中，複合物包含一條CD3γ鏈、一條CD3δ鏈、二條CD3ε鏈、及CD3ζ鏈之同二聚體。CD3γ、CD3β及CD3ε鏈為含有單一免疫球蛋白域的免疫球蛋白超家族之相關細胞表面蛋白。CD3γ、CD3β及CD3ε鏈之跨膜區帶負電，咸信此允許此等鏈與T細胞受體鏈之帶正電區締合。CD3γ、CD3β及CD3ε鏈之細胞內尾各自含有單個保守模體(已知為基於免疫受體酪胺酸之活化模體或ITAM)，而各CD3ζ鏈具有三個保守模體。不希望受理論束縛，咸信ITAM對於TCR複合物的信號傳導能力具有重要作用。如本發明中使用之CD3可來自多種動物物種，包括人類、小鼠、大鼠或其他哺乳動物。
如本文所用，「TCR複合物」一般係指CD3與TCR締合而形成的複合物。舉例而言，TCR複合物可包含CD3γ鏈、CD3β鏈、二條CD3ε鏈、CD3ζ鏈之同二聚體、TCRα鏈、及TCRβ鏈。或者，TCR複合物可包含CD3γ鏈、CD3β鏈、二條CD3ε鏈、CD3ζ鏈之同二聚體、TCRγ鏈、及TCRβ鏈。
如本文所用，「TCR複合物之組分」一般係指TCR鏈(亦即，TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ)、CD3鏈(亦即，CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ)，或由二條或更多條TCR鏈或CD3鏈形成的複合物(例如TCRα與TCRβ之複合物、TCRγ與TCRδ之複合物、CD3ε與CD3δ之複合物、CD3γ與CD3ε之複合物，或TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ及二條CD3ε鏈之子TCR複合物)。
「嵌合抗原受體」(CAR)一般係指經工程化以含有二個或更多個以不天然存在或不天然存在於宿主細胞中之方式連接在一起的天然存在之胺基酸序列、域或模體之融合蛋白，該融合蛋白在存在於細胞表面上時可充當受體。CAR可包括細胞外部分，其包含連接至跨膜域及一或多個胞內信號傳導域(視情況含有共刺激域)之抗原結合域(例如，獲自或源自免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子，諸如源自或獲自對癌症抗原具特異性之TCR的TCR結合域、源自或獲自抗體之scFv或源自或獲自來自NK細胞之殺手免疫受體之抗原結合域)(參見例如Sadelain等人 , Cancer Discov., 3(4):388 (2013)；亦參見Harris及Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220 (2016)；Stone等人 , Cancer Immunol. Immunother., 63(11):1163 (2014)；及Walseng等人, Scientific Reports 7:10713 (2017)，該等CAR構築體及其製備方法以引用的方式併入本文中)。本發明之特異性結合於Ras抗原(例如在肽:HLA複合物之情況下)的CAR包含TCR Vα區域及Vβ域。
本發明之任何多肽由聚核苷酸序列編碼時可包含「信號肽」(亦稱為前導序列、前導肽或過渡肽)。信號肽使新合成之多肽靶向至其在細胞內部或外部之適當位置。在一些情況下，信號肽長度為約15至約22個胺基酸。可在定位(例如插入膜)或分泌期間或在定位或分泌完成後自多肽移除信號肽。具有信號肽之多肽在本文中稱為「前蛋白」，而移除信號肽之多肽在本文中稱為「成熟」蛋白或多肽。在本文所揭示之任一實施例中，結合蛋白或融合蛋白包含或為成熟蛋白，或為或包含前蛋白。
「連接子」一般係指連接兩個蛋白質、多肽、肽、域、區或模體之胺基酸序列，且可提供與兩個子結合域之相互作用相容之間隔功能，使得所得多肽保持對目標分子之特異性結合親和力(例如scTCR)或保持信號傳導活性(例如TCR複合物)。在某些實施例中，連接子包含例如約2至約35個胺基酸，或約4至約20個胺基酸，或約8至約15個胺基酸，或約15至約25個胺基酸。示例連接子包括甘胺酸-絲胺酸連接子。
如本文所用，「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之免疫原性分子。此免疫反應可涉及抗體產生、特定免疫勝任細胞(例如T細胞)之活化或二者。抗原(免疫原性分子)可為例如肽、醣肽、多肽、醣多肽、聚核苷酸、多醣、脂質或其類似物。顯而易見的是，抗原可合成、重組產生或來源於生物樣品。可含有一或多種抗原之示例生物樣品包括組織樣品、腫瘤樣品、細胞、生物體液或其組合。抗原可由經修飾或經基因工程化以表現抗原或內源性(例如未經人工干預進行修飾或基因工程化)表現具有免疫原性之突變或多態性的細胞產生。
如本文所用，「新抗原」一般係指含有結構變化、改變或突變之宿主細胞產物，該結構變化、改變或突變產生一種先前在個體基因體中(亦即，在來自個體之健康組織樣品中)未曾觀測到或未曾由宿主免疫系統「發現」或識別的新的抗原或抗原抗原決定基，該新抗原：(a)由細胞之抗原加工及轉運機制加工且與MHC (例如HLA)分子締合呈遞在細胞表面上；及(b)引發免疫反應，(例如細胞(T細胞)反應)。新抗原可來源於例如具有產生改變或突變產物之改變(取代、添加、缺失)的編碼聚核苷酸；或來源於外源性核酸分子或蛋白質插入細胞，或來源於暴露於引起基因變化的環境因素(例如化學物質、放射)。新抗原可與腫瘤抗原分開產生，或可源自腫瘤抗原或與腫瘤抗原相關。「腫瘤新抗原」(或「腫瘤特異性新抗原」)係指包含與腫瘤細胞或腫瘤內之複數個細胞相關、源自其或在其內產生之新抗原決定子的蛋白質。腫瘤新抗原決定子發現於例如含有由腫瘤細胞(例如胰臟癌、肺癌、結腸直腸癌) DNA編碼之一或多種體細胞突變或染色體重排的抗原腫瘤蛋白或肽，以及來自與病毒相關腫瘤(例如子宮頸癌、一些頭頸癌)相關之病毒開放閱讀框的蛋白質或肽。當提及包含如本文所揭示之突變的Ras抗原時，術語「抗原」與「新抗原」在本文中可互換使用。在一些實施例中，新抗原包含RAS肽(例如KRAS、HRAS或NRAS)、BRAF肽、CALR肽、DNMT3A肽、EGFR肽、ERBB2肽、ESR1肽、FGFR3肽、FLT3肽、GNA11肽、GNAQ肽、IDH肽、MYD88肽、p53肽、PIK3CA肽或SF3B1肽。在一些實施例中，新抗原包含ALK肽、EGFR肽、HER2肽、KIT肽、MET肽、NRG1肽、NTRK肽、PDGFRα肽、RAF肽、RET肽或ROS1肽。[WH1]此清單並非詳盡的，因為還考慮其他新抗原。在一些實施例中，新抗原包含致癌驅動突變。不受理論束縛，咸信致癌驅動突變負責癌症之起始及維持。
術語「抗原決定基」或「抗原抗原決定基」一般包括由同源結合分子(諸如免疫球蛋白、T細胞受體(TCR)、嵌合抗原受體或其他結合分子、域或蛋白質)識別且特異性結合之任何分子、結構、胺基酸序列或蛋白質決定子。抗原決定基決定子一般含有分子，諸如胺基酸或糖側鏈之化學活性表面群組，且可具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。
如本文所用，術語「KRAS (或NRAS或HRAS)抗原(或新抗原)」或「KRAS (或NRAS或HRAS)肽抗原(或新抗原)」或「KRAS (或NRAS或HRAS)肽」一般係指KRAS或NRAS或HRAS蛋白之天然或以合成方式產生之肽部分，其長度範圍為約7個胺基酸、約8個胺基酸、約9個胺基酸、約10個胺基酸、多達約20個胺基酸，且包含由G12 (例如G12V)突變引起之至少一個胺基酸改變(其中位置12分別係參考SEQ ID NO: 1中所示之全長KRAS蛋白序列)；且亦參考SEQ ID NO:78及79中所示之全長NRAS及HRAS蛋白序列)，該肽可與MHC (例如HLA)分子形成複合物，且對KRAS或NRAS或HRAS肽:MHC (例如HLA)複合物具特異性之本發明之結合蛋白可特異性結合於此類複合物。示例KRAS (或NRAS或HRAS)抗原包含具有SEQ ID NO: 2或3之胺基酸序列之肽，基本上由其組成或由其組成。
「主要組織相容複合物」(MHC)一般係指將肽抗原遞送至所有有核細胞之細胞表面的醣蛋白。I類MHC分子為異二聚體，其具有跨膜α鏈(具有三個α域)及非共價締合之β 2微球蛋白。II類MHC分子由二個跨膜醣蛋白α及β構成，二者均跨膜。各鏈包含二個域。I類MHC分子將來源於胞溶質之肽遞送至細胞表面，在細胞表面上，肽:MHC複合物被CD8 +T細胞識別。II類MHC分子將來源於囊泡系統之肽遞送至細胞表面，在細胞表面上，其被CD4 +T細胞識別。人類MHC稱為人類白血球抗原(HLA)。對應於「I類」MHC之HLA呈遞來自細胞內部之肽且包括例如HLA-A、HLA-B及HLA-C。對偶基因包括例如HLA A*11，諸如HLA-A*11:01。對應於「II類」MHC之HLA呈遞來自細胞外部之肽且包括例如HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ及HLA-DR。
抗原呈遞細胞(APC)(諸如樹突狀細胞、巨噬細胞、淋巴球或其他細胞類型)加工抗原且APC將抗原呈遞至T細胞(包括免疫相容性(例如共享與抗原呈遞相關之MHC基因的至少一種對偶基因形式) APC與T細胞之間的侷限於主要組織相容複合物(MHC)之呈遞)的原理已良好確立(參見例如Murphy, Janeway's Immunobiology (第8版) 2011 Garland Science, NY; 第6、9及16章)。舉例而言，來源於胞溶質之經加工抗原肽(例如腫瘤抗原、細胞內病原體)一般長度為約7個胺基酸至約11個胺基酸且將與I類MHC (HLA)分子締合，而在囊泡系統(例如細菌、病毒)中加工之肽長度將在約10個胺基酸至約25個胺基酸變化且與II類MHC (HLA)分子締合。
如本文所用，術語「KRAS特異性結合蛋白」一般係指結合於KRAS肽抗原或NRAS肽抗原或HRAS肽抗原(或結合於例如細胞表面上之KRAS或NRAS或HRAS肽抗原:HLA複合物)，且不結合不含KRAS或NRAS或HRAS肽抗原之肽且不結合於含有此類肽之HLA複合物的蛋白質或多肽，諸如TCR、scTv、scTCR或CAR。
本發明之結合蛋白，諸如TCR、scTCR及CAR，含有對目標具特異性之結合域。如本文所用，「結合域」(亦稱為「結合區」或「結合部分」)係指具有與目標(例如KRAS或NRAS或HRAS肽，或KRAS或NRAS或HRAS肽:MHC複合物)特異性及非共價締合、聯合或組合之能力的分子或其一部分(例如肽、寡肽、多肽、蛋白質)。結合域包括生物分子、分子複合物(亦即包含二個或更多個生物分子之複合物)或其他感興趣的目標的任何天然存在的、合成的、半合成的或重組產生的結合搭配物。示例結合域包括免疫球蛋白可變區或包含其之單鏈構築體(例如單鏈TCR (scTCR)或scTv)。
在某些實施例中，Ras特異性結合蛋白以小於約10 - 8M、小於約10 - 9M、小於約10 - 10M、小於約10 - 11M、小於約10 - 12M或小於約10 - 13M之K d或以與本文所提供之示例Ras特異性結合蛋白(諸如本文所提供之任一種Ras特異性TCR)展現的親和力大約相同、至少大約相同或大於該親和力或大於約該親和力的親和力結合於KRAS (或NRAS或HRAS)肽(或KRAS (或NRAS或HRAS):HLA複合物)，例如藉由相同分析所量測。在某些實施例中，Ras特異性結合蛋白包含Ras特異性免疫球蛋白超家族結合蛋白或其結合部分。
如本文所用，「特異性結合」或「對……具特異性」一般係指結合蛋白(例如TCR受體)或結合域(或其融合蛋白)與目標分子以等於或大於10 5M - 1(其等於此締合反應之締合速率[k on]與解離速率[k off]之比率)的親和力或K a(亦即，特定結合相互作用之平衡締合常數，單位為1/M)締合或聯合，同時不顯著與樣品中之任何其他分子或組分締合或聯合。結合蛋白或結合域(或其融合蛋白)可分類為「高親和力」結合蛋白或結合域(或其融合蛋白)或「低親和力」結合蛋白或結合域(或其融合蛋白)。「高親和力」結合蛋白或結合域係指K a為至少10 7M - 1、至少10 8M - 1、至少10 9M - 1、至少10 10M - 1、至少10 11M - 1、至少10 12M - 1或至少10 13M - 1之彼等結合蛋白或結合域。「低親和力」結合蛋白或結合域係指K a為至多10 7M - 1、至多10 6M - 1、至多10 5M - 1之彼等結合蛋白或結合域。或者，親和力可定義為特定結合相互作用之平衡解離常數(K d)，單位為M (例如10 - 5M至10 - 13M)。
在某些實施例中，受體或結合域可具有「增強之親和力」，增強之親和力一般係指與目標抗原之結合比野生型(或親本)結合域強的所選或經工程化之受體或結合域。舉例而言，增強之親和力可歸因於對目標抗原之K a(平衡締合常數)高於野生型結合域，歸因於對目標抗原之K d(解離常數)小於野生型結合域，歸因於對目標抗原之解離速率(k off)小於野生型結合域，或其組合。
已知多種分析用於鑑別特異性結合特定目標的本發明之結合域以及測定結合域或融合蛋白親和力，諸如西方墨點法、ELISA、分析型超速離心、光譜法及表面電漿子共振(Biacore®)分析(參見例如Scatchard等人, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949；Wilson, Science 295:2103, 2002；Wolff等人, Cancer Res. 53:2560, 1993；及美國專利第5,283,173號、第5,468,614號或等效物)。
在某些實施例中，單獨的新抗原(例如KRAS (或NRAS或HRAS)、p53及/或PIK3CA)特異性結合域(亦即，無新抗原(例如KRAS (或NRAS或HRAS)、p53及/或PIK3CA)特異性結合蛋白之任何其他部分)可為可溶的，且可以小於約10 - 8M、小於約10 - 9M、小於約10 - 10M、小於約10 - 11M、小於約10 - 12M或小於約10 - 13M之K d結合於新抗原(例如KRAS (或NRAS)或HRAS)、p53及/或PIK3CA)(或新抗原(例如KRAS (或NRAS或HRAS)、p53及/或PIK3CA)肽或新抗原(例如KRAS (或NRAS或HRAS)、p53及/或PIK3CA)肽:HLA複合物)。在特定實施例中，新抗原(例如KRAS (或NRAS或HRAS)、p53及/或PIK3CA)特異性結合域包括新抗原(例如KRAS (或NRAS或HRAS)、p53及/或PIK3CA)特異性scTCR (例如單鏈αβTCR蛋白，諸如Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vα或Vα-L-Vβ-Cβ，其中Vα及Vβ分別為TCRα及β可變域，Cα及Cβ分別為TCRα及β恆定域，且L為連接子，諸如本文所述之連接子)。
如本文所用，術語「功能親合力」一般係指活體外免疫細胞(例如T細胞、NK細胞、NK-T細胞)對給定濃度之配位體的反應的生物學量度或活化臨限值，其中該等生物學量度可包括細胞介素產生(例如IFN-γ產生、IL2產生等)、細胞毒活性、活化標記物(例如CD137、Nur77)及增殖。舉例而言，活體外對低抗原劑量作出生物學(免疫學)反應，例如產生細胞介素、展現細胞毒活性或增殖的T細胞被視為具有高功能親合力，而具有較低功能親合力之T細胞在類似於高親合力T細胞誘發免疫反應之前需要較高量的抗原。應理解，功能親合力不同於親和力及親合力。親和力係指結合蛋白與其抗原/配位體之間的任何指定鍵的強度。一些結合蛋白為多價的且結合於多種抗原，在此情況下，總連接強度為親合力。
功能親合力與免疫反應之有效性之間存在多種相關性。一些離體研究已顯示不同T細胞功能(例如增殖、細胞介素產生等)可以不同臨限值觸發(參見例如Betts等人, J. Immunol. 172:6407, 2004; Langenkamp等人, Eur. J. Immunol. 32:2046, 2002)。影響功能親合力之因素可包括(a) TCR對pMHC複合物之親和力，亦即，TCR與pMHC之間的相互作用強度(Cawthon等人, J. Immunol. 167:2577, 2001)；(b) TCR及在一些實施例中CD4或CD8輔受體於宿主細胞上的表現量；(c)信號傳導分子的分佈及組成(Viola及Lanzavecchia, Science 273:104, 1996)，以及減弱T細胞功能及TCR信號傳導之分子的表現量。
指定暴露時間之後，在基線與最大反應之間誘導半數最大反應(例如宿主細胞產生細胞介素或活化標記物；結合於經標記肽:HLA多聚體時的螢光強度)所需的抗原濃度被稱為「半數最大有效濃度」或「EC50」。EC50值一般呈現為莫耳濃度(莫耳/公升)量，但其通常轉化成如下對數值 - log 10(EC50)。舉例而言，若EC50等於1 µM (10 - 6M)，則log 10(EC50)值為-6。另一使用值為pEC50，其定義為EC50之負對數(-log 10(EC50))。在以上實例中，等於1 µM的EC50具有6的pEC50值。在某些實施例中，本發明之結合蛋白的功能親合力將包含結合蛋白促進T細胞活化及/或產生IFNγ之能力的量度，其可使用此項技術中已知及本文所述之分析量測。在某些實施例中，功能親合力將包含結合蛋白在結合於抗原後活化宿主細胞(諸如T細胞)之能力的量度。
本文所揭示之結合蛋白可包含高功能親合力，其可例如促進針對甚至更低水平之所呈遞新抗原肽，諸如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3之KRAS G12V突變肽的免疫細胞效應功能(例如活化、增殖、細胞介素產生及/或細胞毒性)的引發。
在一些實施例中，結合蛋白對新抗原肽之log10EC50為約-6.0或更小、約-6.1或更小、約-6.2或更小、約-6.3或更小、約-6.4或更小、約-6.5或更小、約-6.6或更小、約-6.7或更小、約-6.8或更小、約-6.9或更小、約-7.0或更小、約-7.1或更小、約-7.2或更小、約-7.3或更小、約-7.4或更小、約-7.5或更小、約-7.6或更小、約-7.7或更小、約-7.8或更小、約-7.9或更小、約-8.0或更小、約-8.1或更小、約-8.2或更小、約-8.3或更小、約-8.4或更小、約-8.5或更小、約-8.6或更小、約-8.7或更小、約-8.8或更小、約-8.9或更小、約-9或更小、約-9.1或更小、約-9.2或更小、約-9.3或更小、約-9.4或更小、約-9.5或更小、約-9.6或更小、約-9.7或更小、約-9.8或更小、約-9.9或更小或約-10或更小。
在一些實施例中，本文所揭示之宿主細胞包含一種結合蛋白(例如TCR)，該結合蛋白以如下EC50 (例如使T細胞群體達到半數最大活化時之肽劑量)結合結合蛋白之目標新抗原(例如KRAS G12突變肽，諸如KRAS G12V突變肽，例如存在於肽:HLA複合物中)：小於約100 mM、小於約10 mM、小於約1 mM、小於約500 μM、小於約100 μM、小於約50 μM、小於約10 μM、小於約5 μM、小於約4 μM、小於約3 μM、小於約2 μM、小於約1 μM、小於約900 nM、小於約800 nM、小於約700 nM、小於約600 nM、小於約500 nM、小於約400 nM、小於約300 nM、小於約200 nM、小於約100 nM、小於約90 nM、小於約80 nM、小於約70 nM、小於約60 nM、小於約50 nM、小於約40 nM、小於約30 nM、小於約20 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約1 nM、小於約900 pM、小於約800 pM、小於約700 pM、小於約600 pM、小於約500 pM、小於約400 pM、小於約300 pM、小於約200 pM、小於約100 pM、小於約90 pM、小於約80 pM、小於約70 pM、小於約60 pM、小於約50 pM、小於約40 pM、小於約30 pM、小於約20 pM、小於約10 pM、小於約5 pM或小於約1 pM。可藉由分析法測定EC50，以鑑別啥T細胞群達到半數最大活化時之肽劑量，例如在各種濃度之突變肽存在下暴露於目標細胞後的活化標記物(例如CD137、CD69、顆粒酶B、CD107a、IFN-γ、TNF-a、IL-12、細胞介素、介白素、干擾素)表現所反映。
在一些實施例中，本文所揭示之宿主細胞包含一種結合蛋白(例如TCR)，該結合蛋白以如下EC50 (例如使T細胞群體達到半數最大活化時之肽劑量)結合結合蛋白之目標新抗原(例如KRAS G12突變肽，諸如KRAS G12V突變肽，例如存在於肽:HLA複合物中)：至少約100 mM、至少約10 mM、至少約1 mM、至少約500 μM、至少約100 μM、至少約50 μM、至少約10 μM、至少約5 μM、至少約4 μM、至少約3 μM、至少約2 μM、至少約1 μM、至少約900 nM、至少約800 nM、至少約700 nM、至少約600 nM、至少約500 nM、至少約400 nM、至少約300 nM、至少約200 nM、至少約100 nM、至少約90 nM、至少約80 nM、至少約70 nM、至少約60 nM、至少約50 nM、至少約40 nM、至少約30 nM、至少約20 nM、至少約10 nM、至少約5 nM、至少約1 nM、至少約900 pM、至少約800 pM、至少約700 pM、至少約600 pM、至少約500 pM、至少約400 pM、至少約300 pM、至少約200 pM、至少約100 pM、至少約90 pM、至少約80 pM、至少約70 pM、至少約60 pM、至少約50 pM、至少約40 pM、至少約30 pM、至少約20 pM、至少約10 pM、至少約5 pM或至少約1 pM。
宿主細胞可包含編碼包含IL7R細胞內信號傳導域之嵌合融合蛋白之轉殖基因聚核苷酸。嵌合融合蛋白可包含例如介白素7受體A (IL7RA)多肽之細胞內部分或其能夠促成宿主細胞中之IL-7信號之部分或變異體。嵌合IL7R融合蛋白可例如提供「信號3」以增加STAT5磷酸化及宿主細胞功能性，增強宿主細胞增殖，增加宿主細胞存活(例如在腫瘤微環境中)及/或增強趨化因子受體表現。
介白素-7受體次單元α亦可稱為IL7R-α、IL7RA、IL-7R至α、ILRA、介白素-7受體-α、介白素7受體、分化簇127、CD127或CDW127。
IL7R細胞內信號傳導域可包含與 SEQ ID NO : 1041具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約95.5%、至少約96%、至少約96.5%、至少約97%、至少約97.5%、至少約98%、至少約98.5%、至少約99%、至少約99.5%或約100%序列一致性或序列相似性的胺基酸序列。
在一些實施例中，IL7R細胞內信號傳導域包含(a)當最佳比對時相對於 SEQ ID NO : 1041對應於殘基8-15 (VWPSLPDH)之BOX1模體之一或多個殘基；或(b)當最佳比對時相對於 SEQ ID NO : 1041之Y185。在一些實施例中，IL7R細胞內信號傳導域包含當最佳比對時相對於 SEQ ID NO : 1041對應於殘基1-6 (KKRIKPI)或殘基16-28 (KKTLEHLCKKPRK)之FERM域之一或多個殘基。
在一些實施例中，嵌合融合蛋白包含IL7R跨膜域。IL7R跨膜域可包含與 SEQ ID NO : 1042具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL7R跨膜域包含相對於 SEQ ID NO : 1042之突變。在一些實施例中，突變為或包含一或多個半胱胺酸及/或一或多個脯胺酸插入至 SEQ ID NO : 1042之胺基酸序列中。在一些實施例中，突變使得或促進受體之同二聚化。在一些實施例中，突變包含將半胱胺酸、脯胺酸、蘇胺酸(CPT)之三聚體肽插入跨膜域中。在一些實施例中，CPT插入之蘇胺酸不為蘇胺酸而為另一胺基酸，且在至少特定情況下，其他胺基酸為或不為半胱胺酸或脯胺酸。在一些實施例中，嵌合融合蛋白包含IL7R、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL14R、IL15R、IL9R、IL21R、CD2、CD40L、CD58、CD80或SIRPα之跨膜域。
在一些實施例中，嵌合融合蛋白包含細胞外組分，該細胞外組分包含：(i)分化簇80 (CD80)多肽之細胞外域或其能夠結合CD28或CTLA-4多肽之部分或變異體；(ii)分化簇58 (CD58)多肽之細胞外域或其能夠結合分化簇2 (CD2)多肽之部分或變異體；(iii)信號調節蛋白α (SIRPα)多肽之細胞外域或其能夠結合分化簇47 (CD47)多肽之部分或變異體；(iv)分化簇40L (CD40L)多肽之細胞外域或其能夠結合CD40多肽之部分或變異體；(v)分化簇2 (CD2)受體之細胞外域或其能夠結合CD58多肽之部分或變異體；；或(vi)分化簇34 (CD34)多肽之細胞外域。
在一些實施例中，嵌合融合蛋白包含細胞外組分，該細胞外組分包含分化簇80 (CD80)多肽之細胞外域或其能夠結合CD28或CTLA-4多肽之部分或變異體。在一些實施例中，CD80之細胞外域包含與 SEQ ID NO : 1043具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合融合蛋白包含細胞外組分，該細胞外組分包含分化簇58 (CD58)多肽之細胞外域或其能夠結合CD28或CTLA-4多肽之部分或變異體。在一些實施例中，CD80之細胞外域包含與 SEQ ID NO : 1044具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，嵌合融合蛋白包括包含CD34之細胞外域之細胞外組分。在一些實施例中，CD34之細胞外域包含與 SEQ ID NO : 1045具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，與對照細胞群體(例如缺乏Fas-41BB融合蛋白或嵌合IL7R多肽之對應細胞)相比，包含一或多個本文所揭示之修飾(例如本文所揭示之Fas-41BB融合蛋白或嵌合IL7R多肽之表現)的宿主細胞群體展現回應於目標細胞(例如呈遞KRAS G12D肽)之增殖增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍、至少500倍或至少1000倍。增殖可例如藉由活體外淋巴細胞增殖分析或在共同培育之後量測宿主細胞數目測定。宿主細胞可包含細胞外結合蛋白(例如，包含本文所揭示之Vα及Vβ區及/或CDR的TCR)，及/或引起內源性TRAC、TRBC1及/或TRBC2之表現降低的修飾。
在一些實施例中，與對照細胞群體(例如缺乏Fas-41BB融合蛋白或嵌合IL7R多肽之對應細胞)相比，包含一或多個本文所揭示之修飾(例如本文所揭示之Fas-41BB融合蛋白或嵌合IL7R多肽之表現)的宿主細胞群體展現目標細胞之殺死增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍、至少500倍或至少1000倍。目標細胞之殺死可例如藉由活體外細胞毒性分析測定。宿主細胞可包含細胞外結合蛋白(例如，包含本文所揭示之Vα及Vβ區及/或CDR的TCR)，及/或引起內源性TRAC、TRBC1及/或TRBC2之表現降低的修飾。
編碼本文所揭示之多肽(例如細胞外結合蛋白、CD8輔受體鏈或其細胞外部分、Fas-41BB融合蛋白或嵌合IL7R融合蛋白)的核酸可編碼信號肽。在一些情況下，本發明之多肽包含信號肽。信號肽可在多肽加工期間裂解，因此在一些情況下本文所揭示之成熟多肽不含信號肽。
蛋白質N端處之信號肽可參與將蛋白質轉運至膜或經由膜轉運、轉運至不同膜性細胞隔室或自細胞分泌蛋白質。編碼本發明之蛋白質之核酸可編碼信號肽以促進蛋白質之膜插入及表面定位。信號肽可根據其促進蛋白質之ER加工及細胞表面定位的能力加以選擇。可使用任何適合信號肽。在一些情況下，信號肽包含G-CSF信號肽或CD8α信號肽。信號肽之長度可為約10至約40個胺基酸。在一些情況下，信號肽之長度為至少約10、15、16、20、21、22、25或30個胺基酸或更多。在一些情況下，信號肽之長度為至多約15、16、20、21、22、25或30個胺基酸或更少。在一些情況下，信號肽之長度為約16-30個胺基酸。
在一些實施例中，結合蛋白(例如TCR)以小於約100 mM、小於約10 mM、小於約1 mM、小於約500 μM、小於約100 μM、小於約50 μM、小於約10 μM、小於約5 μM、小於約4 μM、小於約3 μM、小於約2 μM、小於約1 μM、小於約900 nM、小於約800 nM、小於約700 nM、小於約600 nM、小於約500 nM、小於約400 nM、小於約300 nM、小於約200 nM、小於約100 nM、小於約90 nM、小於約80 nM、小於約70 nM、小於約60 nM、小於約50 nM、小於約40 nM、小於約30 nM、小於約20 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約1 nM、小於約900 pM、小於約800 pM、小於約700 pM、小於約600 pM、小於約500 pM、小於約400 pM、小於約300 pM、小於約200 pM、小於約100 pM、小於約90 pM、小於約80 pM、小於約70 pM、小於約60 pM、小於約50 pM、小於約40 pM、小於約30 pM、小於約20 pM、小於約10 pM、小於約5 pM或小於約1 pM的KD結合目標(例如KRAS G12突變肽，諸如KRAS G12V突變肽，例如存在於肽:HLA複合物中)。
亦考慮融合蛋白，其包含連接於抗體(例如IgG (1、2、3、4)、IgE、IgD、IgA、IgM及其變異體)或其片段(例如在一些實施例中保留與一或多種Fc受體、C1q、蛋白A、蛋白G或其任何組合結合之片段)之恆定域的本發明之scTCR或scTv，且包括免疫球蛋白重鏈單體及多聚體，諸如Fc二聚體；參見例如Wong等人, J . Immunol .198:1 增刊(2017)。包含增強、減少或消除與例如FcRn或其他Fc受體之結合或被例如FcRn或其他Fc受體結合之突變的變異Fc多肽已為人所知且在本揭示案內予以考慮。
在某些實施例中，本發明之結合蛋白或融合蛋白(例如TCR、scTCR、CAR)係由宿主細胞(例如異源性表現結合蛋白或融合蛋白之T細胞、NK細胞或NK-T細胞)表現。此類宿主細胞對新抗原(例如KRAS (或NRAS或HRAS)、p53及/或PIK3CA)肽抗原或新抗原(例如KRAS (或NRAS或HRAS)、p53及/或PIK3CA)肽抗原:HLA複合物的親合力可藉由例如以下來測定：將宿主細胞暴露於肽，或暴露於肽:HLA複合物(例如經組織為四聚體)，或暴露於視情況以肽:HLA複合物向宿主細胞呈遞肽之抗原呈遞細胞(APC)，且接著量測宿主細胞之活性，諸如細胞介素(例如IFN-γ；TNFα)之產生或分泌；增加宿主細胞信號傳導或活化組分(例如CD137 (4-1BB))之表現；宿主細胞之增殖；或殺死APC (例如使用標記鉻釋放分析)。
如本文所用，「核酸」或「核酸分子」或「聚核苷酸」一般係指藉由例如聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)或藉由活體外轉譯而產生的去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、聚核苷酸、其片段中之任一者，且亦指藉由接合、斷裂、核酸內切酶作用或核酸外切酶作用中之任一者產生的片段。在某些實施例中，本發明之核酸係藉由PCR產生。核酸可由單體構成，該等單體為天然存在之核苷酸(諸如去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸)、天然存在之核苷酸的類似物(例如天然存在之核苷酸的α-鏡像異構形式)或二者的組合。經修飾之核苷酸可在糖部分、或嘧啶或嘌呤鹼部分中具有修飾或可具有糖部分或嘧啶或嘌呤鹼部分之置換。核酸單體可藉由磷酸二酯鍵或此類鍵聯之類似物連接。磷酸二酯鍵之類似鍵包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、胺基磷酸酯及其類似物。核酸分子可為單股或雙股。
術語「經分離」一般意謂材料自其原始環境(若其為天然存在的，則例如天然環境)移出。舉例而言，存在於活動物中之天然存在之核酸或多肽為未經分離的，但與天然系統中之一些或所有共存材料分離的相同核酸或多肽為經分離的。此類核酸可為載體之一部分及/或此類核酸或多肽可為組合物(例如細胞溶解產物)之一部分，且仍為經分離的，原因在於此類載體或組合物並非核酸或多肽之天然環境之一部分。術語「基因」意謂參與產生多肽鏈之DNA區段；其包括編碼區前後的區域(「前導及尾部序列」)以及個別編碼區段(外顯子)之間的介入序列(內含子)。
如本文所用，術語「重組」、「工程化」及「修飾」一般係指細胞、微生物、核酸分子、多肽、蛋白質、質體或載體已藉由引入外源性核酸分子而經修飾，或係指細胞或微生物已藉由人工干預而經基因工程化，亦即，藉由引入異源核酸分子而經修飾，或係指細胞或微生物已發生改變，使得內源性核酸分子或基因之表現受到控制、異常調節或具組成性，其中此類改變或修飾可藉由基因工程化引入。人類產生之基因改變可包括例如引入編碼一或多種蛋白質或酶之核酸分子(其可包括表現控制元件，諸如啟動子)，或其他核酸分子添加、缺失、取代，或細胞遺傳物質之其他功能破壞或添加。示例修飾包括來自參考分子或母分子之異源或同源多肽之編碼區或其功能片段中的修飾。
如本文所用，「突變」一般係指核酸分子或多肽分子序列分別相較於參考或野生型核酸分子或多肽分子的變化。突變可導致若干不同類型之序列變化，包括核苷酸或胺基酸之取代、插入或缺失。在某些實施例中，突變為一個或三個密碼子或胺基酸的取代、1個至約5個密碼子或胺基酸的缺失、或其組合。
「保守性取代」一般係指一個胺基酸取代具有類似特性之另一胺基酸。此類保守性取代為此項技術中所熟知(參見例如WO 97/09433 第10頁；Lehninger, Biochemistry, 第2版；Worth Publishers, Inc. NY, NY, 第71-77頁, 1975；Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA, 第8頁, 1990)。
在某些實施例中，相較於參考序列，根據本發明之蛋白質(例如結合蛋白、免疫原性肽)包含變異序列(例如變異TCR CDR (例如CDR3β相較於本文所揭示之參考TCR CDR3β)。如本文所用，「變異」胺基酸序列、肽或多肽係指相較於參考胺基酸序列具有一個、兩個或三個胺基酸取代、缺失及/或插入的胺基酸序列(或肽或多肽)。在某些實施例中，變異胺基酸序列、肽或多肽保持與參考分子實質上相同的功能(例如對肽:HLA複合物之結合特異性及親和力)；例如，如本文所揭示之變異TCR片段相較於參考TCR結合片段保持抗原結合特異性及親和力的約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%。
「改變域」或「改變蛋白質」一般係指與野生型模體、區域、域、肽、多肽或蛋白質(例如野生型TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRα恆定域、TCRβ恆定域)具有至少85% (例如至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%)之非一致序列一致性的模體、區域、域、肽、多肽或蛋白質。
改變域或改變蛋白質或衍生物可包括根據相同胺基酸之所有可能密碼子選擇及基於保守性胺基酸取代之密碼子選擇的彼等域或蛋白質或衍生物。例如，以下六組各含有彼此為保守性取代之胺基酸：1)丙胺酸(ala；A)、絲胺酸(ser；S)、蘇胺酸(thr；T)；2)天冬胺酸(asp；D)、麩胺酸(glu；E)；3)天冬醯胺(asn；N)、麩醯胺酸(gln；Q)；4)精胺酸(arg；R)、離胺酸(lys；K)；5)異白胺酸(ile；I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(met；M)、纈胺酸(val；V)；及6)苯丙胺酸(phe；F)、酪胺酸(tyr；Y)、色胺酸(trp；W)。(亦參見WO97/09433 第10頁, Lehninger, Biochemistry, 第2版, Worth Publishers, Inc., NY, NY, 第71-77頁, 1975；Lewin Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA, 第8頁, 1990; Creighton; Proteins; W.H. Freeman and Company 1984)。另外，使被編碼序列中之單個胺基酸或小百分比之胺基酸發生改變、添加或缺失的個別取代、缺失或添加亦為「保守性取代」。
術語「構築體」一般係指含有重組核酸分子之任何聚核苷酸。「轉殖基因」或「轉殖基因構築體」係指含有兩個或更多個依照自然界中未發現之佈置可操作地連接之基因的構築體。術語「可操作地連接(operably-linked)」(或本文中「可操作地連接(operably linked)」)一般係指兩個或更多個核酸分子在單一核酸片段上締合，使得一個核酸分子之功能受另一個核酸分子影響。舉例而言，當啟動子可影響編碼序列之表現時，啟動子與彼編碼序列可操作地連接(亦即，編碼序列處於啟動子之轉錄控制下)。「不連接」一般意謂相關遺傳元件彼此不緊密相關，且一者之功能不影響另一者。在一些實施例中，存在於轉殖基因中之基因可操作地連接於表現控制序列(例如啟動子)。
構築體(例如轉殖基因)可存在於載體(例如細菌載體、病毒載體)中或可整合至基因體中。「載體」一般係指為能夠轉運另一核酸分子之核酸分子。載體可為例如質體、黏質體、病毒、RNA載體或線性或環狀DNA或RNA分子，其可包括染色體、非染色體、半合成或合成核酸分子。示例載體為能夠自主複製(游離型載體)或表現所連接之核酸分子的載體(表現載體)。適用於本發明之組合物及方法中的載體進一步描述於本文中。
如本文所用，術語「表現」一般係指基於核酸分子(諸如基因)之編碼序列產生多肽之過程。該過程可包括轉錄、轉錄後控制、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後控制、轉譯後修飾或其任何組合。
在將核酸分子插入細胞中之情形下，術語「引入」一般意謂「轉染」或「轉型」或「轉導」，且包括指將核酸分子併入真核或原核細胞中，其中核酸分子可併入細胞之基因體(例如染色體、質體、色素體或粒線體DNA)中，轉化成自主複製子或暫時表現(例如經轉染mRNA)。
如本文所用，「異源」或「外源性」核酸分子、構築體或序列一般係指對於宿主細胞而言非原生但可與來自宿主細胞之核酸分子或核酸分子之一部分同源的核酸分子或核酸分子之一部分。異源或外源性核酸分子、構築體或序列之來源可來自不同屬或物種。在某些實施例中，異源或外源性核酸分子係藉由例如結合、轉型、轉染、轉導、電穿孔或類似方式添加(亦即，非內源性的，或非原生的)至宿主細胞或宿主基因體中，其中所添加的分子可整合至宿主基因體中或以染色體外遺傳物質形式存在(例如質體或自複製載體之其他形式)且可存在於多個複本中。另外，「異源」係指由引入宿主細胞中之外源性核酸分子編碼的非原生酶、蛋白質或其他活性，即使宿主細胞編碼同源蛋白質或活性。此外，包含「修飾」或「異源」聚核苷酸或結合蛋白之細胞包括該細胞之後代，不論該後代自身是否經轉導、經轉染或以另外方式被操縱或發生變化。
如本文所述，超過一種異源或外源性核酸分子可作為各別核酸分子、作為複數個個別控制之基因、作為多順反子核酸分子、作為編碼融合蛋白之單一核酸分子或其任何組合引入宿主細胞中。舉例而言，如本文所揭示，宿主細胞可經修飾以表現一或多種異源或外源性核酸分子，該等核酸分子編碼對Ras抗原肽具特異性之所需TCR (例如TCRα及TCRβ)且如本文所揭示，視情況亦編碼CD8輔受體多肽，該多肽包含α鏈、β鏈或其一部分，諸如能夠結合於MHC之細胞外部分。當兩個或更多個外源性核酸分子引入宿主細胞中時，應理解，兩個或更多個外源性核酸分子可作為單一核酸分子(例如於單一載體上)、於各別載體上引入，整合至宿主染色體中單個位點或多個位點，或其任何組合。所提及之異源核酸分子或蛋白質活性的數目係指編碼核酸分子之數目或蛋白質活性之數目，而非引入至宿主細胞中之單獨核酸分子之數目。
如本文所用，術語「內源性」或「原生」一般係指通常存在於宿主細胞中之基因、蛋白質或活性。此外，相較於親本基因、蛋白質或活性，突變、過度表現、改組、複製或以其他方式改變的基因、蛋白質或活性對於該特定宿主細胞而言，仍被視為內源性或原生的。舉例而言，來自第一基因之內源性控制序列(例如啟動子、轉譯衰減序列)可用於改變或調節第二原生基因或核酸分子的表現，其中第二原生基因或核酸分子之表現或調節不同於親本細胞的正常表現或調節。
術語「同源」或「同源物」一般係指在宿主細胞、物種或菌株中發現或來源於宿主細胞、物種或菌株之分子或活性。舉例而言，異源或外源性核酸分子可與原生宿主細胞基因同源，且可視情況具有改變之表現量、不同序列、改變之活性或其任何組合。
如本文所用，「序列一致性」一般係指在比對序列且視需要引入間隙以達成最大序列一致性百分比且不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分之後，一個序列中之胺基酸殘基或核鹼基(分別)與參考序列中之胺基酸殘基或核鹼基一致的百分比。可使用如Altschul等人(1997), Nucl . Acids Res .25:3389-3402所定義之NCBI BLAST 2.0軟體產生序列一致性百分比值，其中各參數設置成預設值。另外或可替代地，可測定兩個序列之間的序列一致性程度，例如使用針對此目的而設計之電腦程式，諸如全域或局部比對演算法來比較該兩個序列。非限制性實例包括BLASTp、BLASTn、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline、GAP、BESTFIT、Needle (EMBOSS)、Stretcher (EMBOSS)、GGEARCH2SEQ、Water (EMBOSS)、Matcher (EMBOSS)、LALIGN、SSEARCH2SEQ或另一種適合方法或演算法。諸如Needleman及Wunsch演算法之全局比對演算法可用於將兩個序列在其整個長度上進行比對，最大化匹配之數目且最小化間隙之數目。可使用預設設置。
為產生兩個胺基酸序列之相似度評分，可使用評分矩陣，其將正分賦予一些不一致胺基酸(例如保守性胺基酸取代、物理化學特性相似之胺基酸及/或在直系同源物、同源物或旁系同源物中展現頻繁取代的胺基酸)，評分矩陣之非限制性實例包括PAM30、PAM70、PAM250、BLOSUM45、BLOSUM50、BLOUM62、BLOSUM80及BLOSUM90。
亦考慮本發明之核酸分子之變異體。變異核酸分子與如本文所述之所定義或參考聚核苷酸之核酸分子至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%一致，且可至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.9%一致，或在0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉約65-68℃或0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉及50%甲醯胺約42℃之嚴格雜交條件下與聚核苷酸雜交。核酸分子變異體保持編碼具有本文所述之功能，諸如結合目標分子之結合蛋白或其結合域的能力。
術語「經分離」一般意謂材料自其原始環境(若其為天然存在的，則例如天然環境)移出。舉例而言，存在於活動物中之天然存在之核酸或多肽為未經分離的，但與天然系統中之一些或所有共存材料分離的相同核酸或多肽為經分離的。此類核酸可為載體之一部分及/或此類核酸或多肽可為組合物(例如細胞溶解產物)之一部分，且仍為經分離的，原因在於此類載體或組合物並非核酸或多肽之天然環境之一部分。術語「基因」意謂參與產生多肽鏈之DNA區段；其包括編碼區前後的區域(「前導及尾部序列」)以及個別編碼區段(外顯子)之間的介入序列(內含子)。
在一些情形下，如本文所用之術語「變異體」一般係指所提及之全長序列之至少一種片段，更具體言之，相對於全長序列，在一個或兩個末端截斷一或多個胺基酸之一或多種胺基酸或核酸序列。此類片段包括或編碼具有原始序列或其變異體之至少6、7、8、10、12、15、20、25、50、75、100、150或200個連續胺基酸的肽。變異體之總長度可為至少6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100個或更多個胺基酸。
在一些實施例中，術語「變異體」不僅指至少一種片段，而且指包括與所提及之參考胺基酸序列或其片段至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%一致之胺基酸序列的多肽或其片段，其中除多肽之生物活性或摺疊或結構所必需之胺基酸之外的胺基酸缺失或經取代，一或多個此類必需胺基酸係以保守方式置換，及/或胺基酸以保持多肽之生物活性的方式添加。目前先進技術包括可用於比對兩個給定核酸或胺基酸序列且計算一致性程度之各種方法(參見例如Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 第三版)。在一些實施例中，可使用預設設置使用Clustal W軟體(Larkin, M. A.等人, (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948)。
在某些實施例中，變異體可另外包括化學修飾，例如同位素標記或共價修飾，諸如糖基化、磷酸化、乙醯化、去羧基化、瓜胺酸化、羥基化及其類似修飾。已知且一般將使用多肽修飾方法，以免消除或實質上減少多肽之所需活性。
在一實施例中，術語核酸分子之「變異體」包括互補股與參考或野生型核酸例如在嚴格條件下雜交的核酸。一般技術者可容易確定雜交反應之「嚴格度」，且一般為經驗計算，視探針長度、洗滌溫度及鹽濃度而定。一般而言，探針愈長，則正確黏接需要之溫度愈高，而較短探針則非如此。雜交一般視變性DNA使存在於低於其解鏈溫度之環境中之互補股再黏接的能力而定：探針與可雜交序列之間的所需同源性程度愈高，則可使用的相對溫度愈高。因此，較高的相對溫度可使反應條件更嚴格，而較低溫度則非如此。關於雜交反應嚴格度的其他細節及解釋，參見Ausubel, F. M. (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc。此外，關於如何藉由雜交來鑑別DNA序列，熟習此項技術者可遵循以下手冊中所提供的說明：Boehringer Mannheim GmbH (1993) The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany及Liebl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W.,及Schleifer, K. H. (1991) International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260。在一實施例中，任何雜交均應用嚴格條件，亦即，僅當探針與目標序列70%或更大一致時才發生雜交。與目標序列一致性程度較低之探針可雜交，但此類雜交體不穩定且在洗滌步驟中、在嚴格條件下移除，例如將鹽濃度降低至2× SSC或視情況且隨後降低至0.5× SSC，而溫度為例如約50℃-68℃、約52℃-68℃、約54℃-68℃、約56℃-68℃、約58℃-68℃、約60℃-68℃、約62℃-68℃、約64℃-68℃或約66℃-68℃。在一實施例中，溫度為約64℃-68℃或約66℃-68℃。可將鹽濃度調節至0.2× SSC或甚至0.1× SSC。與參考或野生型序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少99.5%一致性程度的核酸序列可經分離。在一實施例中，如本文所用，術語核酸序列變異體係指根據遺傳密碼之簡併，與參考核酸序列編碼相同胺基酸序列及其變異體的任何核酸序列。
「功能變異體」一般係指與本發明之親本或參考化合物在結構上類似或實質上結構上類似但在一些情況下在組成(例如一個鹼基、原子或官能基不同，添加或移除一個鹼基、原子或官能基；或使一或多個胺基酸突變、插入或缺失)上略微不同的多肽或聚核苷酸，使得多肽或所編碼多肽能夠以親本多肽活性之至少50%效率或至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.9%或至少100%程度進行編碼之親本多肽之至少一種功能。換言之，當在所選分析中，諸如在用於量測宿主細胞之結合親和力(例如量測締合常數(Ka)或解離常數(KD)的Biacore®或四聚體染色)、親合力或活化的分析中，相較於親本或參考多肽，本發明之多肽或所編碼多肽之功能變異體顯示效能降幅不超過50%時，該功能變異體具有「相似的結合」、「相似的親和力」或「相似的活性」。如本文所用，「功能部分」或「功能片段」係指僅包含親本或參考化合物之域、模體、一部分或片段的多肽或聚核苷酸，且多肽或所編碼多肽保持與親本或參考化合物之域、一部分或片段相關的至少50%活性，較佳保持親本多肽之活性的至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.9%或至少100%程度，或提供生物學益處(例如效應功能)。
當在所選分析中，諸如用於量測結合親和力或量測效應功能(例如細胞介素釋放)之分析中，相較於親本或參考多肽，本發明之多肽或所編碼多肽之「功能部分」或「功能片段」顯示效能降幅不超過50%時(或者或另外，不超過20%或10%，或相較於親本或參考，關於親和力，不超過對數差異)，該功能部分或片段一般具有「相似的結合」或「相似的活性」。考慮特別揭示之結合蛋白及聚核苷酸的功能變異體。
「改變域」或「改變蛋白質」一般係指與野生型模體、區域、域、肽、多肽或蛋白質(例如野生型TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRα恆定域或TCRβ恆定域)具有至少85% (例如至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%)之非一致序列一致性的模體、區域、域、肽、多肽或蛋白質。
本發明包括本文所描述之任何結合蛋白(例如TCR α鏈或TCR β鏈或其片段，諸如Vα或Vβ鏈或CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β或CDR3β)經一或多個保守性胺基酸取代之變異體。此類保守性取代可在多肽之胺基酸序列中進行，而不會破壞多肽之三維結構或功能。保守性取代可藉由具有相似疏水性、極性及R鏈長度之胺基酸彼此取代來實現。另外或或者，藉由比較來自不同物種之同源蛋白質的比對序列，可藉由定位已在物種之間突變的胺基酸殘基(例如非保守殘基，不改變所編碼蛋白質之基本功能)來鑑別保守性取代。此類經保守取代之變異體可包括與本文所描述之系統中之任一者具有至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的變異體。在一些實施例中，此類經保守取代之變異體為功能變異體。
提供功能類似胺基酸之保守取代表可獲自多種參考文獻(參見例如Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 第2版(1993年12月)))。以下八個組各自含有彼此為保守性取代之胺基酸： a. 丙胺酸(A)、甘胺酸(G)； b. 天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)； c. 天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)； d. 精胺酸(R)、離胺酸(K)； e. 異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)； f. 苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)； g. 絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及 h. 半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)。
結合蛋白 在一個態樣中，本發明提供一種結合蛋白，其包含T細胞受體(TCR) α鏈可變(Vα)域及TCR β鏈可變(Vβ)域，其中該結合蛋白能夠結合於肽:HLA複合物，其中該肽包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成。在某些實施例中，HLA包含HLA-A*11，視情況包含HLA-A*11:01。在本發明所揭示之任一實施例中，結合蛋白可異源地由人類免疫系統細胞(諸如T細胞)表現。
在某些實施例中，Vα域及/或Vβ域各自獨立地係人類的、人源化的或嵌合的，且各自為人類的。在一些實施例中，Vα域為人類的且Vβ域為人類的。本文所揭示之結合蛋白、組合物及方法可利用來源於人類個體之Vα域、Vβ域或其CDR，例如經由對來自人類個體的經分離T細胞或其群體定序。相對於來自其他來源(諸如單一人類HLA對偶基因轉殖基因小鼠)之可變域及CDR，自人類個體分離出之TCR Vα域、Vβ域及其CDR可具有有利特性。舉例而言，來源於人類個體之Vα域、Vβ域及CDR可在活體內已針對一組完整人類HLA分子所呈遞之實質上完整人類多肽體進行負向胸腺選擇，此可降低結合蛋白與其他人類自體抗原交叉反應的可能性。在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白實質上對由一或多個HLA對偶基因呈遞之人類蛋白質體無反應。反應性可藉由任何適合方法測定。在一些實施例中，在500 nM或更低、400 nM或更低、300 nM或更低、200 nM或更低、100 nM或更低、50 nM或更低、10 nM或更低、5 nM或更低、或1 nM或更低的肽濃度下，觀測到或預測到經結合蛋白轉導之T細胞對一或多個HLA對偶基因所呈遞的人類蛋白質體無顯著反應。
在一些實施例中，結合蛋白包含來源於(例如在其中鑑別)患有疾病(諸如癌症)之個體(例如人類個體)之T細胞的一或多個可變域或一或多個CDR。在一些實施例中，結合蛋白包含來源於患有本文所揭示之癌症之人類個體之T細胞的一或多個可變域或一或多個CDR。在一些實施例中，結合蛋白包含來源於患有與新抗原(例如KRAS (或NRAS或HRAS)、p53及/或PIK3CA)突變，諸如KRAS G12V或G12D突變相關之疾病的個體(例如人類個體)之T細胞的一或多個可變域或一或多個CDR。在一些實施例中，結合蛋白包含來源於具有包含新抗原(例如KRAS (或NRAS或HRAS)、p53及/或PIK3CA)突變，諸如KRAS G12V或G12D突變之細胞的個體(例如人類個體)之T細胞的一或多個可變域或一或多個CDR。
在一些實施例中，結合蛋白包含來源於健康個體(例如健康人類個體)之T細胞的一或多個可變域或一或多個CDR。在一些實施例中，健康個體缺乏特定病理學診斷(例如疾病診斷，諸如癌症診斷)。在一些實施例中，健康個體缺乏特定病理學診斷，但包含不同的病理學診斷，例如缺乏癌症診斷，但包含高血壓或II型糖尿病之診斷。
本發明所揭示之結合蛋白能夠異源地由宿主細胞(諸如人類免疫細胞，諸如T細胞)表現。此外，本發明所揭示之結合蛋白之表現可賦予宿主細胞有利特性；例如對本發明之新抗原:HLA複合物具有結合特異性，在新抗原:HLA呈遞腫瘤細胞存在下提高活化、增殖或殺死活性，或其類似特性。
例如，在某些實施例中，當結合蛋白由免疫細胞(例如人類T細胞，視情況CD8+及/或CD4+ T細胞、NK細胞或NK-T細胞)表現時，免疫細胞能夠特異性殺死表現包含SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列或由其組成之肽的HLA-A*11:01 +腫瘤細胞。可測定目標細胞之殺死，例如用Incucyte®生物成像平台(Essen Bioscience)測定。在某些實施例中，此平台係使用活化之凋亡蛋白酶及經標記(例如RapidRed或NucRed)之腫瘤細胞信號，其中量測重疊面積且增加的重疊面積等同於細胞凋亡所致之腫瘤細胞死亡。亦可使用4小時分析來測定殺死，其中將標記鉻( 51Cr)負載於目標細胞，且量測上清液中之 51Cr，例如在與表現本發明之結合蛋白的免疫細胞共同培育4小時之後量測。在某些實施例中，可利用0.1:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、25:1、50:1或100:1或類似者之效應細胞:目標細胞比率進行殺死分析。
在本發明所揭示之任一實施例中，當結合蛋白由免疫細胞(例如人類T細胞，視情況CD8+及/或CD4+ T細胞、NK細胞或NK-T細胞)表現時，免疫細胞在表現新抗原肽(例如包含SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列或由其組成之肽)的腫瘤細胞(例如HLA-A11:01 +腫瘤細胞)存在下，視情況進一步在外源性IFN-γ存在下Nur77之表現升高，其中該Nur77表現與以下相比升高：(i)不表現該結合蛋白之參考免疫細胞之Nur77表現(亦即，與表現結合蛋白之免疫細胞相同細胞類型，且另外在表型及/或基因型上與表現結合蛋白之免疫細胞至少實質上一致或在功能上等同)，當參考免疫細胞在腫瘤細胞存在下時；及/或(ii)表現結合蛋白之免疫細胞在不存在腫瘤細胞下及/或在不存在表現新抗原肽:HLA複合物之抗原呈遞細胞(例如其中該肽包含SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成，且其中HLA視情況為HLA-A*11:01)下之Nur77表現。可測定Nur77表現，例如使用包含Nur77基因座之轉殖基因表現構築體測定，該基因座可操作地連接於編碼報導基因構築體之序列；例如dTomato (參見Ahsouri及Weiss, J Immunol 198(2):657-668 (2017))。
在本發明所揭示之任一實施例中，當結合蛋白由免疫細胞(例如人類T細胞，視情況CD8+及/或CD4+ T細胞、NK細胞或NK-T細胞)表現時，免疫細胞在表現新抗原肽(例如包含SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列或由其組成之肽)的HLA-A*02 +腫瘤細胞存在下，視情況進一步在外源性IFN-γ存在下CD137 (亦稱為41BB)之表現升高，其中該CD137表現與以下相比升高：(i)不表現該結合蛋白之參考免疫細胞之CD137表現，當參考免疫細胞在腫瘤細胞存在下時；及/或(ii)表現結合蛋白之免疫細胞在不存在腫瘤細胞下及/或在不存在表現新抗原肽:HLA複合物之抗原呈遞細胞(例如其中該肽包含SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成，且其中HLA視情況為HLA-A*11:01)下之CD137表現。可使用例如流動式細胞量測術、使用經標記之抗CD137抗體測定CD137表現。在某些實施例中，利用16小時分析來量測CD137，其中將免疫細胞與肽或表現該肽之目標細胞共同培育或用肽或表現該肽之目標細胞刺激。
在本發明所揭示之任一實施例中：(i)結合蛋白由對於免疫細胞而言異源之聚核苷酸編碼；(ii)免疫細胞包含人類CD8 +T細胞、人類CD4+ T細胞或兩者；(iii)表現新抗原肽(例如包含SEQ ID NO: 2或3中所示之胺基酸序列或由其組成的肽)之腫瘤細胞為HLA-A*11:01 +；及/或(iv)腫瘤細胞包含OVCAR5 (卵巢漿液性腺癌)、DAN-G (胰臟腺癌)、CFPAC1 (胰臟腺癌)、SW480 (結腸癌)、SW527 (乳癌)或NCI-H441 (肺腺癌)細胞。
在某些實施例中，結合蛋白能夠獨立於CD8或在CD8不存在下結合於肽:HLA複合物。非CD8依賴性結合可藉由在CD8陰性細胞(例如CD4 +T細胞、傑卡特細胞(Jurkat cell)或類似細胞)中表現結合蛋白且鑑別細胞對目標之結合來測定。在一些實施例中，提供一種結合蛋白，其包含：(a) T細胞受體(TCR) α鏈可變(Vα)域，其包含SEQ ID NO: 16、17、42及43中之任一者中所示之互補決定區3 (CDR3α)胺基酸序列，或其具有一個、兩個或三個、視情況保守性胺基酸取代之變異體；及/或(b) TCR β鏈可變(Vβ)域，其包含SEQ ID NO: 26、27、52及53中之任一者中所示之CDR3β胺基酸序列，或其具有一個、兩個或三個、視情況保守性胺基酸取代之變異體，其中該結合蛋白能夠結合於肽:HLA複合物，其中該肽包含胺基酸序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 2)或VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 3)、基本上由其組成或由其組成且其中HLA包含HLA-A*11。在某些實施例中，HLA包含HLA-A*11:01。
Vα域及/或Vβ域可為人類的、人源化的或嵌合的，且可為人類的。
在某些實施例中，結合蛋白包含(i)分別SEQ ID NO: 17及27中所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或其具有一個、兩個或三個視情況保守性胺基酸取代之變異體；(ii)分別SEQ ID NO: 16及26中所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或其具有一個、兩個或三個視情況保守性胺基酸取代之變異體；(iii)分別SEQ ID NO: 53及43中所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或其具有一個、兩個或三個視情況保守性胺基酸取代之變異體；或(iv)分別SEQ ID NO: 52及42中所示之CDR3α及CDR3β胺基酸序列，或其具有一個、兩個或三個視情況保守性胺基酸取代之變異體。
在一些實施例中，結合蛋白進一步：(i)在Vα域中包含SEQ ID NO: 14或40中所示之CDR1α胺基酸序列，或其具有一或兩個視情況保守性胺基酸取代之變異體；(ii)在Vα域中包含SEQ ID NO: 15或41中所示之CDR2α胺基酸序列，或其具有一或兩個視情況保守性胺基酸取代之變異體；(iii)在Vβ域中包含SEQ ID NO: 24或50中所示之CDR1β胺基酸序列，或其具有一或兩個視情況保守性胺基酸取代之變異體；(iv)在Vβ域中包含SEQ ID NO: 25或51中所示之CDR2β胺基酸序列，或其具有一或兩個視情況保守性胺基酸取代之變異體；或(v) (i)-(iv)之任何組合。
在某些實施例中，結合蛋白包含分別在SEQ ID NO: 14、15、16或17、24、25及26或27中所示之CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及CDR3β胺基酸序列。
在某些實施例中，結合蛋白包含分別在SEQ ID NO: 40、41、42或43、50、51及52或52中所示之CDR1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β及CDR3β胺基酸序列。
在一些實施例中：(i) Vα域包含與SEQ ID NO:13或39中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成；及/或(ii) Vβ域包含與SEQ ID NO:23或49中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，Vα域包含與SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成，且其中Vβ域包含與SEQ ID NO:23中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，Vα域包含與SEQ ID NO:39中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成，且其中Vβ域包含與SEQ ID NO:49中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。
在某些實施例中，Vα域包含SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成且Vβ域包含SEQ ID NO:23中所示之胺基酸序列或由其組成。
在某些實施例中，Vα域包含SEQ ID NO:39中所示之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成且Vβ域包含SEQ ID NO:49中所示之胺基酸序列或由其組成。
在一些實施例中，可變域包含相對於SEQ ID NO: 13、23、39及49中之任一者具有一或多個插入、缺失及/或取代的胺基酸序列。
舉例而言，可變域可包含相對於SEQ ID NO: 13、23、39及49中之任一者，具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸插入之胺基酸序列。
在一些實施例中，可變域包含相對於SEQ ID NO: 13、23、39及49中之任一者，具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸插入之胺基酸序列。
在一些實施例中，可變域相對於SEQ ID NO: 13、23、39及49中之任一者包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸插入。
一或多個插入可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個插入可為相連的、非相連的或其組合。
在一些實施例中，可變域包含相對於SEQ ID NO: 13、23、39及49中之任一者具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸缺失之胺基酸序列。
在一些實施例中，可變域包含相對於SEQ ID NO: 13、23、39及49中之任一者，具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸缺失之胺基酸序列。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 13、23、39及49中之任一者，可變域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸缺失。
一或多個缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個缺失可為相連的、非相連的或其組合。
在一些實施例中，可變域包含相對於SEQ ID NO: 13、23、39及49中之任一者具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸取代的胺基酸序列。
在一些實施例中，可變域包含相對於SEQ ID NO: 13、23、39及49中之任一者，具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸取代之胺基酸序列。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 13、23、39及49中之任一者，可變域包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸取代。
一或多個取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個取代可為相連的、非相連的或其組合。
結合蛋白可進一步包含TCR α鏈恆定域(Cα)及/或TCR β鏈恆定域(Cβ)。TCR α鏈恆定域(Cα)及/或TCR β鏈恆定域(Cβ)可為人類的。TCR α鏈恆定域(Cα)及/或TCR β鏈恆定域(Cβ)可為哺乳動物的。TCR α鏈恆定域(Cα)及/或TCR β鏈恆定域(Cβ)可經工程化。
在一些實施例中，Cα包含與SEQ ID NO:18、19、44、45及69中之任一者中所示之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性或包含SEQ ID NO:18、19、44、45及69中之任一者中所示之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，Cβ包含與SEQ ID NO: 28、29、54、55及70-73中之任一者中所示之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性或包含SEQ ID NO: 28、29、54、55及70-73中之任一者中所示之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。
在某些實施例中，Cα及Cβ包含與以下中所示之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性或包含以下中所示之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列或由其組成：(i)分別SEQ ID NO: 18及28；(ii)分別SEQ ID NO: 19及29；(iii)分別SEQ ID NO: 44及54；或(iv)分別SEQ ID NO: 45及55。
結合蛋白可包含(i) TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈或TCR δ鏈之細胞外域；(ii) TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈或TCR δ鏈之跨膜域；及/或(iii) TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈或TCR δ鏈之細胞質域。結合蛋白可包含全長或基本上全長TCR α鏈、TCR β鏈、TCR γ鏈及/或TCR δ鏈。
在一些實施例中，結合蛋白包含相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，具有一或多個插入、缺失及/或取代之胺基酸序列。
舉例而言，結合蛋白可包含相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸插入的胺基酸序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多50個胺基酸插入的胺基酸序列。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，結合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸插入。
一或多個插入可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個插入可為相連的、非相連的或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸缺失的胺基酸序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45,或至多50胺基酸缺失的胺基酸序列。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，結合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸缺失。
一或多個缺失可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個缺失可為相連的、非相連的或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個或至少30個胺基酸取代的胺基酸序列。
在一些實施例中，結合蛋白包含相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者具有至多1個、至多2個、至多3個、至多4個、至多5個、至多6個、至多7個、至多8個、至多9個、至多10個、至多11個、至多12個、至多13個、至多14個、至多15個、至多16個、至多17個、至多18個、至多19個、至多20個、至多25個、至多30個、至多35個、至多40個、至多45個或至多個50胺基酸取代的胺基酸序列。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 12、18-22、28-30、38、44-46、48、54-56及69中之任一者，結合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸取代。
一或多個取代可發生於N端、C端、胺基酸序列內，或其組合。一或多個取代可為相連的、非相連的或其組合。
在一些實施例中，結合蛋白包含TCR α鏈及TCR β鏈，其中TCR α鏈及TCR β鏈包含與以下中所示之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性或包含以下中所示之胺基酸序列或由其組成的胺基酸序列或由其組成：(i)分別SEQ ID NO:12及22；(ii)分別SEQ ID NO: 20及30；(iii)分別SEQ ID NOS:12及30；(iv)分別SEQ ID NO:20及22；(v)分別SEQ ID NO:38及48；(vi)分別SEQ ID NO: 46及56；(vii)分別SEQ ID NO:38及56；或(viii)分別SEQ ID NO:46及48。
在本發明所揭示之任一實施例中，結合蛋白可包含TCR、單鏈TCR (scTCR)、scTv或嵌合抗原受體(CAR)。用於產生工程化TCR之方法描述於例如Bowerman等人, Mol . Immunol ., 46(15):3000 (2009)中，其技術以引用的方式併入本文中。用於製備CAR之方法係此項技術中已知的且描述於例如美國專利第6,410,319號；美國專利第7,446,191號；美國專利公開案第2010/065818號；美國專利第8,822,647號；PCT公開案第WO 2014/031687號；美國專利第7,514,537號；及Brentjens等人, 2007, Clin . Cancer Res . 13:5426，該等文獻中之技術以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，結合蛋白包含可溶性TCR，該可溶性TCR視情況與對CD3蛋白具特異性之結合域(例如scFv)融合。 參見 Elie Dolgin, Nature Biotechnology 40:441-449 (2022)。
結合蛋白之一些實例包括於 表 2中。在一些實施例中，結合蛋白包含 表 2中之胺基酸序列。在一些實施例中，結合蛋白包含與 表 2中之序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，結合蛋白包含與 表 2中之序列具有至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的胺基酸序列。與 表 2中之序列99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，結合蛋白包含具有與 表 2中之序列至多99.9%、至多99.8%、至多99.7%、至多99.6%、至多99.5%、至多99.4%、至多99.3%、至多99.2%或至多99.1%的序列。在一些實施例中，結合蛋白包含與 表 2中之序列具有至多99%、至多98%、至多97%、至多96%、至多95%、至多94%、至多93%、至多92%或至多91%的序列。在一些實施例中，結合蛋白包含與 表 2中之序列具有至多90%、至多85%、至多80%、至多75%、至多70%、至多65%或至多60%序列的序列。在一些實施例中，結合蛋白包含與 表 2中之序列具有約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約99.1%、約99.2%、約99.3%、約99.4%、約99.5%、約99.6%、約99.7%、約99.8%或約99.9%序列一致性的序列，或前述百分比中之任兩者所界定之範圍。在一些實施例中，結合蛋白包括任一前述序列之片段。在一些實施例中，結合蛋白包括任一前述序列之任何組合。前述結合蛋白或結合蛋白序列中之任一者可適用於本文所描述之方法或組合物。舉例而言，結合蛋白可包括於具有融合蛋白之細胞中，該融合蛋白包括CD95 (Fas)及CD137 (4-1BB)及/或CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)之組分。
在本發明所揭示之任一實施例中，編碼結合蛋白之聚核苷酸可進一步包含：(i)編碼包含CD8輔受體α鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中視情況，所編碼多肽為或包含CD8輔受體α鏈；(ii)編碼包含CD8輔受體β鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中視情況，所編碼多肽為或包含CD8輔受體β鏈；或(iii) (i)之聚核苷酸及(ii)之聚核苷酸。不受理論束縛，在某些實施例中，相較於單獨結合蛋白之表現，結合蛋白與具有結合於HLA分子之功能的CD8輔受體蛋白質或其一部分的共表現或並行表現可改良宿主細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞，視情況CD4 +T細胞)的一或多種所需活性。應理解，編碼結合蛋白之聚核苷酸及編碼CD8輔受體多肽之聚核苷酸可存在於單一核酸分子上(例如在同一表現載體中)，或可存在於宿主細胞中之各別核酸分子上。
在本發明所揭示之任一實施例中，CD8輔受體α鏈可包含SEQ ID NO.: 87或信號肽移除之SEQ ID NO.: 87、基本上由其組成或由其組成。編碼SEQ ID NO.: 87之聚核苷酸之一實例提供於SEQ ID NO.: 88中。在一些實施例中，CD8輔受體α鏈包含與SEQ ID NO.: 87或信號肽移除之SEQ ID NO.: 87之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。
在本發明所揭示之任一實施例中，CD8輔受體β鏈可包含SEQ ID NO.: 89或信號肽移除之SEQ ID NO.: 89、基本上由其組成或由其組成。編碼SEQ ID NO.: 89之聚核苷酸之一實例提供於SEQ ID NO.: 90中。在一些實施例中，CD8輔受體β鏈包含與SEQ ID NO.: 89或信號肽移除之SEQ ID NO.: 89之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。
在某些其他實施例中，聚核苷酸包含：(a)編碼包含CD8輔受體α鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸；(b)編碼包含CD8輔受體β鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸；及(c)編碼自裂解肽之聚核苷酸，該自裂解肽安置於(a)之聚核苷酸與(b)之聚核苷酸之間。在其他實施例中，聚核苷酸包含編碼自裂解肽且安置於以下兩者之間的聚核苷酸：(1)編碼結合蛋白之聚核苷酸與編碼包含CD8輔受體α鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸之間；及/或(2)編碼結合蛋白之聚核苷酸與編碼包含CD8輔受體β鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸之間。
在其他實施例中，聚核苷酸可包含同框可操作地連接之以下各者：(i) (pnCD8α)-(pnSCP1)-(pnCD8β)-(pnSCP2)-(pnBP)；(ii) (pnCD8β)-(pnSCP1)-(pnCD8α)-(pnSCP2)-(pnBP)；(iii) (pnBP)-(pnSCP1)-(pnCD8α)-(pnSCP2)-(pnCD8β)；(iv) (pnBP)-(pnSCP1)-(pnCD8β)-(pnSCP2)-(pnCD8α)；(v)    (pnCD8α)-(pnSCP1)-(pnBP)-(pnSCP2)-(pnCD8β)；或(vi) (pnCD8β)-(pnSCP1)-(pnBP)-(pnSCP2)-(pnCD8α)，其中pnCD8α為編碼包含CD8輔受體α鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中pnCD8β為編碼包含CD8輔受體β鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中pnBP為編碼結合蛋白之聚核苷酸，且其中pnSCP1及pnSCP2各自獨立地為編碼自裂解肽之聚核苷酸，其中該等聚核苷酸及/或所編碼自裂解肽視情況相同或不同(例如P2A、T2A、F2A、E2A)。
應理解，自裂解肽可包含其N端及/或C端之連接子。連接子之一實例為GSG。在一些實施例中，提供包含N端GSG連接子之T2A肽。在一些實施例中，GSG-T2A序列包含GSG及SEQ ID NO.:75之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成。在一些實施例中，GSG-P2A序列包含SEQ ID NO.:74、基本上由其組成或由其組成。
在某些實施例中，所編碼結合蛋白包含TCRα鏈及TCRβ鏈，其中聚核苷酸包含編碼自裂解肽之聚核苷酸，該自裂解肽安置於編碼TCRα鏈之聚核苷酸與編碼TCRβ鏈之聚核苷酸之間。在其他實施例中，聚核苷酸包含同框可操作地連接之以下各者：(i) (pnCD8α)-(pnSCP1)-(pnCD8β)-(pnSCP2)-(pnTCRβ)-(pnSCP3)-(pnTCRα)；(ii)    (pnCD8β)-(pnSCP1)-(pnCD8α)-(pnSCP2)-(pnTCRβ)-(pnSCP3)-(pnTCRα)；(iii)    (pnCD8α)-(pnSCP1)-(pnCD8β)-(pnSCP2)-(pnTCRα)-(pnSCP3)-(pnTCRβ)；(iv)   (pnCD8β)-(pnSCP1)-(pnCD8α)-(pnSCP2)-(pnTCRα)-(pnSCP3)-(pnTCRβ)；(v)     (pnTCRβ)-(pnSCP1)-(pnTCRα)-(pnSCP2)-(pnCD8α)-(pnSCP3)-(pnCD8β)；(vi)     (pnTCRβ)-(pnSCP1)-(pnTCRα)-(pnSCP2)-(pnCD8β)-(pnSCP3)-(pnCD8α)；(vii) (pnTCRα)-(pnSCP1)-(pnTCRβ)-(pnSCP2)-(pnCD8α)-(pnSCP3)-(pnCD8β)；(viii) (pnTCRα)-(pnSCP1)-(pnTCRβ)-(pnSCP2)-(pnCD8β)-(pnSCP3)-(pnCD8α)，其中pnCD8α為編碼包含CD8輔受體α鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中pnCD8β為編碼包含CD8輔受體β鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中pnTCRα為編碼TCR α鏈之聚核苷酸，其中pnTCRβ為編碼TCR β鏈之聚核苷酸，且其中pnSCP1、pnSCP2及pnSCP3各自獨立地為編碼自裂解肽之聚核苷酸，其中該等聚核苷酸及/或所編碼自裂解肽視情況相同或不同。
在某些實施例中，本發明之所編碼多肽包含一或多個接合胺基酸。「接合胺基酸」或「接合胺基酸殘基」係指多肽之兩個相鄰模體、區或域之間(諸如結合域與相鄰恆定域之間或TCR鏈與相鄰自裂解肽之間)的一或多個(例如2至約10個)胺基酸殘基。接合胺基酸可由以下各者產生：編碼融合蛋白之構築體的設計(例如在編碼融合蛋白之核酸分子構築期間，使用限制酶部位而產生之胺基酸殘基)；或與本發明之所編碼結合蛋白之一或多個域相鄰的例如自裂解肽裂解(例如安置於TCR α鏈與TCR β鏈之間的P2A肽，其自裂解可使α鏈、TCR β鏈或二者中留下一或多個接合胺基酸)。
在其他實施例中，結合蛋白作為轉殖基因構築體之一部分表現，該構築體編碼及/或本發明之宿主細胞可編碼：一或多種其他輔助蛋白，諸如安全開關蛋白；標籤、選擇標記物；CD8輔受體β鏈；CD8輔受體α鏈或二者；或其任何組合。適用於編碼且表現結合蛋白及輔助組分(例如安全開關蛋白、選擇標記物、CD8輔受體β鏈或CD8輔受體α鏈中之一或多者)的聚核苷酸及轉殖基因構築體描述於PCT申請案PCT/US2017/053112中，其中的聚核苷酸、轉殖基因構築體及輔助組分(包括核苷酸及胺基酸序列)以引用的方式併入本文中。應理解，本發明之任何或所有結合蛋白、安全開關蛋白、標籤、選擇標記物、CD8輔受體β鏈或CD8輔受體α鏈可由單一核酸分子編碼或可由位於或存在於各別核酸分子上之聚核苷酸序列編碼。
示例安全開關蛋白包括例如缺乏細胞外N端配位體結合域及細胞內受體酪胺酸激酶活性但保留其原生胺基酸序列、具有I型跨膜細胞表面定位且具有構形完整之結合醫藥級抗EGFR單株抗體西妥昔單抗(cetuximab，Erbitux)tEGF受體之抗原決定基的截短EGF受體多肽(huEGFRt)(tEGFr；Wang等人, Blood118:1255-1263, 2011)；凋亡蛋白酶多肽(例如iCasp9；Straathof等人, Blood105:4247-4254, 2005；Di Stasi等人, N . Engl . J . Med .365:1673-1683, 2011；Zhou及Brenner, Exp . Hematol .pii:S0301-472X(16)30513-6. doi:10.1016/j.exphem.2016.07.011)、RQR8 (Philip等人, Blood124:1277-1287, 2014)；來源於人類c-myc蛋白(Myc)之10胺基酸標籤(Kieback等人, Proc . Natl . Acad . Sci . USA105:623-628, 2008)；及標記物/安全開關多肽，諸如RQR (CD20 + CD34；Philip等人, 2014)。
適用於本發明之經修飾宿主細胞的其他輔助組分包含允許鑑別、分選、分離、富集或追蹤細胞的標籤或選擇標記物。舉例而言，可自樣品中分選出具有所需特徵之經標記宿主細胞(例如抗原特異性TCR及安全開蛋白質)以脫離未標記之細胞且更有效地活化且擴增以便包括於所需純度之產物中。
如本文所用，術語「選擇標記物」包含賦予細胞可鑑別之變化的核酸構築體(及所編碼之基因產物)，從而允許偵測及正向選擇經包含選擇標記物之聚核苷酸轉導的免疫細胞。RQR為包含CD20之主要細胞外環及兩個最小CD34結合部位的選擇標記物。在一些實施例中，編碼RQR之聚核苷酸包含編碼16胺基酸CD34最小抗原決定基之聚核苷酸。在一些實施例中，CD34最小抗原決定基在CD8輔受體柄域(Q8)之胺基端位置併入。在其他實施例中，CD34最小結合部位序列可與CD20之目標抗原決定基組合以形成T細胞的緊湊標記物/自殺基因(RQR8)(Philip等人, 2014，該文獻以引用的方式併入本文中)。此構築體允許選擇表現該構築體之宿主細胞，例如使用結合於磁性珠粒(Miltenyi)之CD34特異性抗體且利用臨床上公認之醫藥抗體利妥昔單抗(rituximab)，從而選擇性地使表現轉殖基因之工程化T細胞缺失(Philip等人, 2014)。
其他示例選擇標記物亦包括通常不在T細胞上表現之若干種截短I型跨膜蛋白：截短低親和力神經生長因子、截短CD19及截短CD34 (參見例如Di Stasi等人, N . Engl . J . Med .365:1673-1683, 2011；Mavilio等人, Blood83:1988-1997, 1994；Fehse等人, Mol . Ther .1:448-456, 2000；該等文獻各自全文併入本文中)。CD19及CD34之適用特徵為現成Miltenyi CliniMACs TM選擇系統的可獲得性，其在臨床級分選中可靶向此等標記物。然而，CD19及CD34為相對較大的表面蛋白，其可對載體封裝容量及整合載體之轉錄效率產生重負。亦可使用含有細胞外非信號傳導域或各種蛋白質(例如CD19、CD34、LNGFR)的表面標記物。可採用任何選擇標記物(例如為優良製造規範(Good Manufacturing Practices)可接受的)。在某些實施例中，選擇標記物與編碼所關注之基因產物(例如本發明之結合蛋白，諸如TCR或CAR)的聚核苷酸一起表現。選擇標記物之其他實例包括例如報導因子，諸如GFP、EGFP、β-gal或氯黴素(chloramphenicol)乙醯基轉移酶(CAT)。在某些實施例中，選擇標記物(諸如CD34)係由細胞表現且CD34可用於選擇、富集或分離(例如藉由免疫磁性選擇)用於本文所描述方法中之所關注之經轉導細胞。如本文所用，CD34標記物有別於抗CD34抗體，或例如scFv、TCR或結合於CD34之另一抗原識別部分。
在某些實施例中，選擇標記物包含RQR多肽、截短低親和力神經生長因子(tNGFR)、截短CD19 (tCD19)、截短CD34 (tCD34)或其任何組合。
關於RQR多肽，不希望受理論束縛，咸信距宿主細胞表面之距離對於RQR多肽充當選擇標記物/安全開關而言具有重要作用(Philip等人, 2010 (同上))。在一些實施例中，所編碼RQR多肽含於所編碼之CD8輔受體的β鏈、α鏈或二者中，或任一者或二者的片段或變異體中。在特定實施例中，經修飾之宿主細胞包含編碼iCasp9之異源聚核苷酸及編碼重組CD8輔受體蛋白質之異源聚核苷酸，該輔受體蛋白質包含含有RQR多肽之β鏈且進一步包含CD8 α鏈。
在一些實施例中，所編碼之CD8輔受體包括α鏈或其片段或變異體。人類CD8輔受體α鏈前驅體之胺基酸序列係已知的且提供於例如UniProtKB-P30433 (亦參見UniProtKB-P31783；UniProtKB-P10732；及UniProtKB-P10731)。在一些實施例中，所編碼之CD8輔受體包括β鏈或其片段或變異體。人類CD8輔受體β鏈前驅體之胺基酸序列係已知的且提供於例如UniProtKB-P10966 (亦參見UniProtKB-Q9UQ56；UniProtKB-E9PD41；UniProtKB-Q8TD28；及UniProtKB-P30434；及UniProtKB-P05541)。
本發明之經分離之聚核苷酸可進一步包含編碼如本文所揭示之安全開關蛋白、選擇標記物、CD8輔受體β鏈或CD8輔受體α鏈的聚核苷酸，或可包含編碼其任何組合之聚核苷酸。
在本發明所揭示之任一實施例中，聚核苷酸可經密碼子最佳化以便在宿主細胞中表現。在一些實施例中，宿主細胞包含人類免疫系統細胞，諸如T細胞、NK細胞或NK-T細胞(Scholten等人, Clin . Immunol .119:135, 2006)。密碼子最佳化可使用已知之技術及工具進行，例如使用GenScript® OptimumGene TM工具或GeneArt (Life Technologies)。經密碼子最佳化之序列包括經部分密碼子最佳化之序列(亦即一或多個密碼子經最佳化以在宿主細胞中表現)及經完全密碼子最佳化之序列。應瞭解，在其中聚核苷酸編碼超過一種多肽(例如TCR α鏈、TCR β鏈、CD8輔受體α鏈、CD8輔受體β鏈及一或多種自裂解肽)的實施例中，各多肽可獨立地完全密碼子最佳化、部分密碼子最佳化或未經密碼子最佳化。
胺基酸及聚核苷酸序列，例如結合蛋白「11N4A」及「11N6」展示於表1中。
表1 ： 與TCR 11N4A 及11N6 有關之某些聚核苷酸及胺基酸序列 TCR
   11N4A 11N6
聚核苷酸序列
TCR α鏈具有信號肽，原始聚核苷酸 5 33
TCR β鏈具有信號肽，原始聚核苷酸 6 34
TCRβ-P2A-TCRα，密碼子最佳化(A) 7 35
TCRβ-P2A-TCRα，密碼子最佳化(B) 8 --
CD8α-T2A-CD8β-P2A-TCRβ-P2A-TCRα，密碼子最佳化(A) 9 36
CD8α-T2A-CD8β-P2A-TCRβ-P2A-TCRα，密碼子最佳化(B) 10 --
胺基酸序列
TCR α鏈具有信號肽，原始 11 37
TCR α鏈無信號肽，原始 12 38
TCR α鏈可變域，無信號肽 13 39
TCR α鏈可變域，CDR1α 14 40
TCR α鏈可變域，CDR2α 15 41
TCR α鏈可變域，CDR3α-IMGT接合 16 42
TCR α鏈可變域，CDR3α-IMGT 17 43
TCR α鏈恆定域，原始 18 44
TCR α鏈恆定域，經cys修飾 19 45
TCR α鏈無信號肽，經cys修飾 20 46
TCR β鏈具有信號肽，原始 21 47
TCR β鏈無信號肽，原始 22 48
TCR β鏈可變域，無信號肽 23 49
TCR β鏈可變域，CDR1β 24 50
TCR β鏈可變域，CDR2β 25 51
TCR β鏈可變域，CDR3β-IMGT接合 26 52
TCR β鏈可變域，CDR3β-IMGT 27 53
TCR β鏈恆定域，原始 28 54
TCR β鏈恆定域，經cys修飾 29 55
TCR β鏈無信號肽，經cys修飾 30 56
TCRβ-P2A-TCRα 31 57
CD8α-T2A-CD8β-P2A-TCRβ-P2A-TCRα 32 58
載體
在另一態樣中，本發明提供一種表現載體，其包含可操作地連接於表現控制序列的如本文所提供之任何聚核苷酸。
本文亦提供包含本發明之聚核苷酸或轉殖基因構築體的載體。載體之一些實例包括質體、病毒載體、黏質體及其他。一些載體可能能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)，而其他載體可整合至宿主細胞之基因體中，或在引入宿主細胞中後促進聚核苷酸插入物之整合，從而與宿主基因體一起複製(例如慢病毒載體、反轉錄病毒載體)。此外，一些載體能夠指導其可操作地連接之基因的表現(此等載體可稱為「表現載體」)。根據有關實施例，應進一步理解，若將一或多種藥劑(例如編碼如本文所述之多肽的聚核苷酸)共投與個體，則各藥劑可駐存於各別或同一載體中，且可將多個載體(各含有不同藥劑或相同藥劑)引入細胞或細胞群中或投與個體。
在某些實施例中，本發明之聚核苷酸可操作地連接於載體之某些元件。舉例而言，可將實現所連接之編碼序列之表現及加工所需的聚核苷酸序列可操作地連接。表現控制序列可包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；增強轉譯功效之序列(亦即克紮克共有序列(Kozak consensus sequence))；增強蛋白質穩定性之序列；及可能時增強蛋白質分泌之序列。若表現控制序列與所關注之基因鄰接且表現控制序列以異側作用或以一定距離作用以控制所關注之基因，則表現控制序列可為可操作地連接的。
在某些實施例中，載體包含質體載體或病毒載體(例如選自慢病毒載體或γ-反轉錄病毒載體之載體)。病毒載體包括反轉錄病毒；腺病毒；微小病毒(例如腺相關病毒)；冠狀病毒；負股RNA病毒，諸如正黏病毒(例如流感病毒)、棒狀病毒(例如狂犬病及水泡性口炎病毒)、副黏病毒(例如麻疹及仙台)；正股RNA病毒，諸如小核糖核酸病毒及α病毒；及雙股DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如1型及2型單純疱疹病毒、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、巨細胞病毒)及痘病毒(例如牛痘、禽痘及金絲雀痘)。其他病毒包括例如諾沃克病毒(Norwalk virus)、披衣病毒(togavirus)、黃病毒、里奧病毒(reovirus)、乳多泡病毒(papovavirus)、嗜肝DNA病毒及肝炎病毒。反轉錄病毒之實例包括禽白血病-肉瘤病毒、哺乳動物C型病毒、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV病毒群、慢病毒及泡沫病毒屬(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, Fundamental Virology, 第三版, B. N. Fields等人編輯, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。
「反轉錄病毒」為具有RNA基因體之病毒，其使用反轉錄酶反轉錄成DNA，隨後反轉錄之DNA併入宿主細胞基因體中。「γ反轉錄病毒」係指反轉錄病毒科之一屬。γ反轉錄病毒之實例包括小鼠幹細胞病毒、鼠類白血病病毒、貓白血病病毒、貓肉瘤病毒及禽類網狀內皮細胞增生病毒。如本文所用，「慢病毒載體」意謂用於基因遞送之基於HIV之慢病毒載體，其可為整合的或非整合的，具有相對較大的封裝能力，且可轉導一系列不同的細胞類型。慢病毒載體通常在將三個(封裝、包膜及轉移)或更多個質體瞬時轉染至生產細胞中之後產生。與HIV一樣，慢病毒載體經由病毒表面糖蛋白與細胞表面上之受體的相互作用而進入目標細胞。在進入後，病毒RNA進行反轉錄，此係由病毒反轉錄酶複合物介導。反轉錄之產物為雙股線性病毒DNA，其為病毒整合至受感染細胞之DNA中的受質。
在某些實施例中，病毒載體可為γ反轉錄病毒，例如莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MLV)衍生之載體。在其他實施例中，病毒載體可為更複雜的反轉錄病毒衍生之載體，例如慢病毒衍生之載體。HIV-1衍生之載體屬於此類別。其他實例包括衍生自HIV-2、FIV、馬類感染性貧血病毒、SIV及梅迪-威司奈病病毒(Maedi-Visna virus) (綿羊慢病毒)之慢病毒載體。使用反轉錄病毒及慢病毒病毒載體及封裝細胞以用含有TCR或CAR轉殖基因之病毒顆粒轉導哺乳動物宿主細胞的方法係此項技術中已知的且先前已描述於例如：美國專利8,119,772；Walchli等人 , PLoS One 6:327930, 2011；Zhao等人 , J. Immunol. 174:4415, 2005；Engels等人 , Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003；Frecha等人 , Mol. Ther. 18:1748, 2010；及Verhoeyen等人 , Methods Mol. Biol. 506:97, 2009。反轉錄病毒及慢病毒載體構築體及表現系統亦可購得。其他病毒載體亦可用於包括DNA病毒載體之聚核苷酸遞送，該等DNA病毒載體包括例如基於腺病毒之載體及基於腺相關病毒(AAV)之載體；衍生自單純疱疹病毒(HSV)之載體，包括擴增子載體、複製缺陷型HSV及毒性減弱HSV (Krisky等人, Gene Ther. 5:1517, 1998)。
經開發用於基因療法用途之其他載體亦可與本發明之組合物及方法一起使用。此類載體包括衍生自桿狀病毒及α-病毒之載體(Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. 第209-40頁,  Friedmann T.編輯 The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab)或質體載體(諸如睡美人或其他轉位子載體)。
當病毒載體基因體包含複數個欲在宿主細胞中作為單獨轉錄物表現之聚核苷酸時，病毒載體亦可在兩個(或更複數個)轉錄物之間包含允許雙順反子或多順反子表現的額外序列。用於病毒載體之此類序列的實例包括內部核糖體入口位點(IRES)、弗林蛋白酶裂解位點、病毒2A肽或其任何組合。
在某些實施例中，載體能夠將聚核苷酸或轉殖基因構築體遞送至宿主細胞(例如造血先驅細胞或人類免疫系統細胞)。在特定實施例中，載體能夠將聚核苷酸或轉殖基因構築體遞送至人類免疫系統細胞，諸如CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、幹細胞記憶T細胞、γδ T細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞或其任何組合。在其他實施例中，載體能夠將轉殖基因構築體遞送至初始T細胞、中樞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。在一些實施例中，編碼本發明之聚核苷酸或轉殖基因構築體的載體可進一步包含一種聚核苷酸，該聚核苷酸編碼可用於在宿主細胞中進行染色體剔除的核酸酶(例如CRISPR-Cas核酸內切酶或如本文所揭示之另一種核酸內切酶)或編碼可用於在基因置換療法或基因修復療法中將治療性聚核苷酸或轉殖基因或其一部分遞送至宿主細胞的核酸酶。或者，用於染色體剔除或基因置換或基因修復療法之核酸酶可獨立於編碼本發明之聚核苷酸或轉殖基因構築體的載體遞送至宿主細胞。
在某些實施例中，載體能夠將聚核苷酸遞送至宿主細胞。在其他實施例中，宿主細胞為造血先驅細胞或人類免疫系統細胞。在另外其他實施例中，人類免疫系統細胞為CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD4-CD8-雙陰性T細胞、γδ T細胞、自然殺手細胞、自然殺手T細胞、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞或其任何組合。在又其他實施例中，T細胞為初始T細胞、中樞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。
在本發明所揭示之任一實施例中，載體為病毒載體。在某些實施例中，病毒載體為慢病毒載體或γ-反轉錄病毒載體。
宿主細胞
本文亦提供編碼及/或表現結合蛋白(及視情況，一或多種輔助蛋白，諸如轉導標記物、CD8輔受體多肽或類似物，如本文所提供)之宿主細胞。在某些實施例中，提供經修飾以包含本發明之聚核苷酸及/或表現載體及/或表現本發明之結合蛋白的宿主細胞。
任何適合宿主細胞可經修飾以包括編碼本發明之結合蛋白之異源聚核苷酸，包括例如免疫細胞，諸如T細胞、NK細胞或NK-T細胞。在一些實施例中，經修飾之免疫細胞包含CD4 +T細胞、CD8 +T細胞或兩者。已描述用所需核酸轉染/轉導T細胞之方法(例如美國專利申請公開案第US 2004/0087025號)為使用具有所需目標特異性之T細胞的授受性轉移程序(例如Schmitt等人, Hum . Gen . 20:1240, 2009；Dossett等人, Mol . Ther . 17:742, 2009；Till等人, Blood 112:2261, 2008；Wang等人, Hum . Gene Ther . 18:712, 2007；Kuball等人, Blood 109:2331, 2007；US 2011/0243972；US 2011/0189141；Leen等人, Ann . Rev . Immunol . 25:243, 2007)，使得基於本文中之教示，考慮將此等方法調適至當前所揭示之實施例。
任何適當方法可用於轉染或轉導細胞，例如T細胞，或投與本發明方法之聚核苷酸或組合物。用於遞送聚核苷酸至宿主細胞之已知方法包括例如使用陽離子聚合物、脂質樣分子及某些商業產品，諸如IN-VIVO-JET PEI。其他方法包括離體轉導、注射、電穿孔、DEAE-聚葡萄糖、音波負載、脂質體介導之轉染、受體介導之轉導、微彈轟擊、轉位子介導之轉移及其類似方法。轉染或轉導宿主細胞之其他方法係採用本文中更詳細描述之載體。
在某些實施例中，宿主細胞或經修飾之細胞可為周邊血液單核細胞(PBMC)。宿主細胞可為淋巴細胞。宿主細胞可為淋巴球。在一些實施例中，宿主細胞或經修飾之細胞可為造血先驅細胞及/或人類免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞包含T細胞、NK細胞、NK-T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球或其任何組合。在一些實施例中，宿主或經修飾之細胞為哺乳動物細胞(例如人類細胞或小鼠細胞)。在其他實施例中，免疫細胞包含CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD4- CD8-雙陰性T細胞、γδ T細胞或其任何組合。在某些其他實施例中，免疫細胞包含CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。在某些其他實施例中，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或二者包含：(i)編碼包含CD8輔受體α鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中視情況，所編碼多肽為或包含CD8輔受體α鏈；(ii)編碼包含CD8輔受體β鏈之細胞外部分之多肽的聚核苷酸，其中視情況，所編碼多肽為或包含CD8輔受體β鏈；或(iii) (i)之聚核苷酸及(ii)之聚核苷酸。
在前述實施例中之任一者中，宿主細胞(例如免疫細胞)可經修飾以減少或消除編碼涉及免疫信號傳導或其他相關活性之多肽的一或多種內源性基因之表現。示例基因剔除包括編碼PD-1、LAG-3、CTLA4、TIM3、TIGIT、FasL、HLA分子、TCR分子或類似物之彼等基因。不希望受理論束縛，接受經修飾之免疫細胞的同種異體宿主可將某些內源性表現之免疫細胞蛋白質識別為外來物質，從而可引起經修飾之免疫細胞(例如HLA對偶基因)消除，或可下調經修飾之免疫細胞(例如PD-1、LAG-3、CTLA4、FasL、TIGIT、TIM3)的免疫活性，或可干擾本發明之異源性表現之結合蛋白的結合活性(例如經修飾之T細胞的內源性TCR，其結合非Ras抗原且從而干擾經修飾之免疫細胞結合表現例如Ras抗原之細胞)。
因此，減少或消除此類內源性基因或蛋白質之表現或活性可改良經修飾之細胞在自體或同種異體宿主環境中之活性、耐受性或持久性，且可允許該等細胞的投與成為通用的(例如投與任何接受者，不論HLA類型)。在某些實施例中，經修飾之細胞為供體細胞(例如同種異體)或自體細胞。在某些實施例中，本發明之經修飾之細胞包含編碼PD-1、LAG-3、CTLA4、TIM3、TIGIT、FasL、HLA組分(例如編碼α1巨球蛋白、α2巨球蛋白、α3巨球蛋白、β1微球蛋白或β2微球蛋白之基因)或TCR組分(例如編碼TCR可變區或TCR恆定區之基因)之一或多種基因的染色體基因剔除(參見例如Torikai等人, Nature Sci. Rep. 6:21757 (2016)；Torikai等人, Blood 119(24):5697 (2012)；及Torikai 等人 , Blood 122(8):1341 (2013)，其基因編輯技術、組合物及授受性細胞療法以全文引用的方式併入本文中)。
如本文所用，術語「染色體基因剔除」一般係指基因改變劑或所引入的抑制劑在宿主細胞中阻止(例如減少、延遲、抑制或消除)宿主細胞產生功能活性內源性多肽產物。導致染色體基因剔除之改變可包括例如引入無義突變(包括過早終止密碼子之形成)、錯義突變、基因缺失及股斷裂，以及抑制宿主細胞中之內源性基因表現之抑制性核酸分子的異源表現。
在某些實施例中，染色體基因剔除或基因嵌入係藉由對宿主細胞之染色體編輯來實現。染色體編輯可使用例如核酸內切酶進行。如本文所用，「核酸內切酶」係指能夠催化裂解聚核苷酸鏈內之磷酸二酯鍵的酶。在某些實施例中，核酸內切酶能夠裂解目標基因，從而使目標基因不活化或「基因剔除」。核酸內切酶可為天然存在、重組、經基因修飾或融合的核酸內切酶。由核酸內切酶引起之核酸股斷裂通常經由同源重組或非同源末端接合(NHEJ)之不同機制修復。在同源重組期間，供體核酸分子可用於供體基因「嵌入」、目標基因「剔除」，且視情況經由供體基因嵌入或目標基因剔除事件使目標基因不活化。NHEJ為易錯修復過程，通常導致裂解位點之DNA序列發生變化，例如取代、缺失或添加至少一個核苷酸。NHEJ可用於「剔除」目標基因。核酸內切酶之實例包括鋅指核酸酶、TALE核酸酶、CRISPR-Cas核酸酶、大範圍核酸酶及megaTAL。
如本文所用，「鋅指核酸酶」(ZFN)一般係指包含與非特異性DNA裂解域(諸如FokI核酸內切酶)融合之鋅指DNA結合域的融合蛋白。約30個胺基酸之各鋅指模體結合於DNA之約3個鹼基對，且可改變某些殘基處之胺基酸以改變三重序列特異性(參見例如Desjarlais等人, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:2256-2260, 1993；Wolfe等人, J. Mol. Biol. 285:1917-1934, 1999)。多個鋅指模體可以串聯方式連接以對所需DNA序列，諸如長度在約9至約18個鹼基對範圍內之區域產生結合特異性。作為背景，ZFN藉由催化基因體中位點特異性DNA雙股斷裂(DSB)之形成來介導基因體編輯，且藉由同源定向修復來促進包含與基因體同源之側接序列的轉殖基因在DSB位點之靶向整合。或者，由ZFN產生之DSB可經由非同源末端接合(NHEJ)修復導致目標基因之基因剔除，非同源末端接合為一種易錯細胞修復途徑，導致裂解位點處之核苷酸插入或缺失。在某些實施例中，基因剔除包含使用ZFN分子進行之插入、缺失、突變或其組合。
如本文所用，「轉錄活化子樣效應物核酸酶」(TALEN)一般係指包含TALE DNA結合域及DNA裂解域(諸如FokI核酸內切酶)之融合蛋白。「TALE DNA結合域」或「TALE」包含一或多個TALE重複域/單元，各域/單元一般具有高度保守的33-35個胺基酸的序列，其中第12及第13個胺基酸相異。TALE重複域參與TALE與目標DNA序列之結合。相異的胺基酸殘基，稱為重複可變二殘基(RVD)，與特定的核苷酸識別相關。已確定此等TALE之DNA識別的天然(規範)代碼，使得TALE之位置12及13處之HD (組胺酸-天冬胺酸)序列導致TALE與胞嘧啶(C)結合，NG (天冬醯胺-甘胺酸)與T核苷酸結合，NI (天冬醯胺-異白胺酸)與A結合，NN (天冬醯胺-天冬醯胺)與G或A核苷酸結合，及NG (天冬醯胺-甘胺酸)與T核苷酸結合。非規範(非典型) RVD亦為已知的(參見例如美國專利公開案第US 2011/0301073號，其中的非典型RVD以全文引用的方式併入本文中)。TALEN可用於指導T細胞基因體中之位點特異性雙股斷裂(DSB)。非同源末端接合(NHEJ)自雙股斷裂之二側連接DNA，其中很少或沒有用於黏接之序列重疊，從而引入剔除基因表現之錯誤。或者，同源定向修復可在DSB位點處引入轉殖基因，其限制條件為轉殖基因中存在同源側接序列。在某些實施例中，基因剔除包含插入、缺失、突變或其組合，且使用TALEN分子進行。
如本文所用，「成簇規律間隔短回文重複序列/Cas」(CRISPR/Cas)核酸酶系統一般係指一種如下系統，其採用CRISPR RNA (crRNA)引導之Cas核酸酶經由鹼基配對互補性識別基因體內之目標位點(稱為原型間隔子)，且隨後若短的保守原型間隔子相關模體(PAM)緊隨互補目標序列之3'之後，則裂解DNA。基於Cas核酸酶之序列及結構，CRISPR/Cas系統分類為三種類型(亦即I型、II型及III型) I型及III型之crRNA引導之監控複合物需要多個Cas次單元。研究最多的II型系統包含至少三個組分：RNA引導之Cas9核酸酶、crRNA及異側作用crRNA (tracrRNA)。tracrRNA包含雙螺旋體形成區。crRNA及tracrRNA形成雙螺旋體，其能夠與Cas9核酸酶相互作用，且經由crRNA上之間隔子與目標DNA上之PAM上游的原型間隔子之間的瓦生-克立克鹼基配對(Watson-Crick base-pairing)，將Cas9/crRNA:tracrRNA複合物引導至目標DNA上之特定位點。Cas9核酸酶在由crRNA間隔子定義之區域內裂解雙股斷裂。藉由NHEJ之修復導致插入及/或缺失，從而破壞靶向基因座之表現。或者，可經由同源定向修復在DSB之位點處引入具有同源側接序列之轉殖基因。crRNA及tracrRNA可經工程化為單引導RNA (sgRNA或gRNA) (參見例如Jinek等人, Science 337:816-21, 2012)。此外，與目標位點互補之嚮導RNA之區域可經改變或程式化以靶向所需序列(Xie等人, PLOS One 9:e100448, 2014；美國專利申請公開案第US 2014/0068797號、美國專利申請公開案第US 2014/0186843號；美國專利第8,697,359號及PCT公開案第WO 2015/071474號；其中之各者以引用的方式併入本文中)。在某些實施例中，基因剔除包含插入、缺失、突變或其組合，且使用CRISPR/Cas核酸酶系統進行。
示例gRNA序列及使用其剔除編碼免疫細胞蛋白質之內源性基因的方法包括Ren等人, Clin . Cancer Res . 23(9):2255-2266 (2017)中描述之彼等gRNA序列及方法，其中之gRNA、CAS9 DNA、載體及基因剔除技術以全文引用的方式併入本文中。
如本文所用，「大範圍核酸酶」亦稱為「歸巢核酸內切酶」，一般係指以大的識別位點(約12至約40個鹼基對之雙股DNA序列)為特徵的去氧核糖核酸內切酶。大範圍核酸酶可基於序列及結構模體分成五個家族：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒及PD-(D/E)XK。示例大範圍核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII及I-TevIII，其識別序列已知(參見例如美國專利第5,420,032號及第6,833,252號；Belfort等人, Nucleic Acids Res. 25:3379-3388, 1997；Dujon等人, Gene 82:115-118, 1989；Perler等人, Nucleic Acids Res. 22:1125-1127, 1994；Jasin, Trends Genet. 12:224-228, 1996；Gimble等人, J. Mol. Biol. 263:163-180, 1996；Argast等人, J. Mol. Biol. 280:345-353, 1998)。
在某些實施例中，天然存在之大範圍核酸酶可用於促進目標之位點特異性基因體修飾，該目標選自PD-1、LAG3、TIM3、CTLA4、TIGIT、FasL、HLA編碼基因或TCR組分編碼基因。在其他實施例中，對目標基因具有新穎結合特異性之工程化大範圍核酸酶用於位點特異性基因體修飾(參見例如Porteus等人, Nat. Biotechnol. 23:967-73, 2005；Sussman等人, J. Mol. Biol. 342:31-41, 2004；Epinat等人, Nucleic Acids Res. 31:2952-62, 2003；Chevalier等人, Molec. Cell 10:895-905, 2002；Ashworth等人, Nature 441:656-659, 2006；Paques等人, Curr. Gene Ther. 7:49-66, 2007；美國專利公開案第US 2007/0117128號；第US 2006/0206949號；第US 2006/0153826號；第US 2006/0078552號；及第US 2004/0002092號)。在其他實施例中，使用已經TALEN之模組化DNA結合域修飾之歸巢核酸內切酶產生染色體基因剔除，以製造稱為megaTAL之融合蛋白。MegaTAL不僅可用於剔除一或多個目標基因，且亦在與編碼所關注多肽之外源供體模板組合使用時，引入(嵌入)異源或外源性聚核苷酸。
在某些實施例中，染色體基因剔除包含將抑制性核酸分子引入包含異源聚核苷酸之宿主細胞(例如免疫細胞)中，該異源聚核苷酸編碼特異性結合於腫瘤相關抗原之抗原特異性受體，其中該抑制性核酸分子編碼目標特異性抑制劑且其中所編碼之目標特異性抑制劑抑制宿主細胞中之內源性基因表現(例如PD-1、TIM3、LAG3、CTLA4、TIGIT、FasL、HLA組分或TCR組分，或其任何組合)。
在某些實施例中，基因剔除包含插入、缺失、突變或其組合且使用CRISPR/Cas核酸酶系統或鹼基編輯系統產生(Komor, A. C.; Kim, Y. B.; Packer, M. S.; Zuris, J. A.; Liu, D. R. Nature 533, 420-424 (2016)。簡言之，鹼基編輯為一種基因體編輯方法，其使用CRISPR系統之組分以及其他酶以將點突變直接引入細胞DNA或RNA中而不產生雙股DNA斷裂。某些DNA鹼基編輯劑包含與核鹼基去胺酶融合的催化失能核酸酶且一些情況下包含DNA醣苷酶抑制劑。RNA鹼基編輯劑使用靶向RNA之組分發揮類似的功能。鹼基編輯劑使一個鹼基或鹼基對直接轉化成另一個鹼基或鹼基對，從而能夠在非分裂細胞中高效安裝點突變而不產生非所需的過量編輯副產物。參見例如Rees H等人 Nature Reviews Genetics(2018)。
在使用基因剔除程序或藥劑後，可藉由宿主免疫細胞之DNA定序直接確認染色體基因剔除。染色體基因剔除亦可自基因剔除後不存在基因表現(例如不存在由基因編碼之mRNA或多肽產物)來推斷。
在某些實施例中，染色體基因剔除包含HLA組分基因之剔除，該HLA組分基因選自α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因或β2微球蛋白基因。
在某些實施例中，染色體基因剔除包含TCR組分基因之剔除，該TCR組分基因選自TCR α可變區基因、TCR β可變區基因、TCR恆定區基因或其組合。
在一些實施例中，相較於對照細胞群體(例如表現對相同目標抗原具特異性之對照結合蛋白的細胞)，包含本文所揭示之結合蛋白的宿主細胞群體對結合蛋白之目標抗原展現的功能親合力增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1000倍或至少5000倍。宿主細胞可包含結合目標抗原(例如新抗原(例如p53 PIK3CA、NRAS、HRAS或KRAS(例如KRAS G12突變肽，諸如KRAS G12V突變肽，例如存在於肽:HLA複合物中) )之結合蛋白(例如包含本文所揭示之Vα區及Vβ區及/或CDR的TCR)。親合力的增加可例如藉由以下分析測定：在暴露於表現或呈遞目標抗原之目標細胞後，用於測定活化標記物(例如CD137、CD69、顆粒酶B、CD107a、IFN-γ、TNF-a、IL-12、細胞介素、介白素、干擾素)表現之分析；及/或測定EC50 (例如T細胞群體達到半數最大活化時之肽劑量)的分析。
宿主細胞組合物及單位劑量
在另一態樣中，本文提供包含本發明之經修飾之宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的組合物及單位劑量。
在某些實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量包含(i)包含至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%經修飾之CD4 +T細胞的組合物，以及(ii)包含至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%經修飾之CD8 +T細胞的組合物，比率為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.5:1、0.1:1、1:0.1、1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，其中該單位劑量含有減少量或實質上不含初始T細胞(亦即，相較於具有相當數目周邊血液單核細胞(PBMC)之患者樣品，具有小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%、小於約10%、小於約5%或小於約1%群體之初始T細胞存在於單位劑量中。
在一些實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量包含(i)包含至少約50%經修飾之CD4 +T細胞的組合物，以及(ii)包含至少約50%經修飾之CD8 +T細胞的組合物，比率為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.5:1、0.1:1、1:0.1、1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，其中該宿主細胞組合物或單位劑量含有減少量或實質上不含初始T細胞。在其他實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量包含(i)包含至少約60%經修飾之CD4 +T細胞的組合物，以及(ii)包含至少約60%經修飾之CD8 +T細胞的組合物，比率為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.5:1、0.1:1、1:0.1、1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，其中該單位劑量含有減少量或實質上不含初始T細胞。在又一實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量包含(i)包含至少約70%工程化CD4 +T細胞的組合物，以及(ii)包含至少約70%工程化CD8 +T細胞的組合物，比率為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.5:1、0.1:1、1:0.1、1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9,或1:10，其中該單位劑量含有減少量或實質上不含初始T細胞。在一些實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量包含(i)包含至少約80%經修飾之CD4 +T細胞的組合物，以及(ii)包含至少約80%經修飾之CD8 +T細胞的組合物，比率為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.5:1、0.1:1、1:0.1、1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，其中該宿主細胞組合物或單位劑量含有減少量或實質上不含初始T細胞。在一些實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量包含(i)包含至少約85%經修飾之CD4 +T細胞的組合物，以及(ii)包含至少約85%經修飾之CD8 +T細胞的組合物，比率為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.5:1、0.1:1、1:0.1、1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，其中該宿主細胞組合物或單位劑量含有減少量或實質上不含初始T細胞。在一些實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量包含(i)包含至少約90%經修飾之CD4 +T細胞的組合物，以及(ii)包含至少約90%經修飾之CD8 +T細胞的組合物，比率為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.5:1、0.1:1、1:0.1、1:0.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，其中該宿主細胞組合物或單位劑量含有減少量或實質上不含初始T細胞。
在一些實施例中，組合物包含CD4+細胞群體，該細胞群體包含(i)至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%經修飾之CD4+ T細胞。在一些實施例中，組合物進一步包含CD8+細胞群體，該細胞群體包含(ii)至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%經修飾之CD8+ T細胞。
在一些實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量包含約1:1比率、約1:2比率、約1:3比率、約1:4比率、約1:5比率、約1:6比率、約1:7比率、約1:8比率、約1:9比率、約1:10比率、約2:1比率、約3:1比率、約4:1比率、約5:1比率、約6:1比率、約7:1比率、約8:1比率、約9:1比率、約10:1比率、約3:2比率或約2:3比率之CD4+與CD8+ T細胞(例如經修飾以包含或表現本文所揭示之結合蛋白的CD4+ T細胞與經修飾以包含或表現本文所揭示之結合蛋白的CD8+ T細胞)。
在一些實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量的CD4+與CD8+ T細胞之比率為至少1:1、至少1:2、至少1:3、至少1:4、至少1:5、至少1:6、至少1:7、至少1:8、至少1:9、至少1:10、至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少3:2或至少2:3。
在一些實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量的CD4+與CD8+ T細胞之比率為至多1:1、至多1:2、至多1:3、至多1:4、至多1:5、至多1:6、至多1:7、至多1:8、至多1:9、至多1:10、至多2:1、至多3:1、至多4:1、至多5:1、至多6:1、至多7:1、至多8:1、至多9:1、至多10:1、至多3:2或至多2:3。
在一些實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量的CD4+與CD8+ T細胞之比率介於約1:10與10:1、1:10與8:1、1:10與7:1、1:10與6:1、1:10與5:1、1:10與4:1、1:10與3:1、1:10與2:1、1:10與1:1、1:10與1:2、1:10與1:3、1:10與1:4、1:10與1:5、1:10與1:7、1:5與10:1、1:5與8:1、1:5與7:1、1:5與6:1、1:5與5:1、1:5與4:1、1:5與3:1、1:5與2:1、1:5與1:1、1:5與1:2、1:5與1:3、1:5與1:4、1:3與10:1、1:3與8:1、1:3與7:1、1:3與6:1、1:3與5:1、1:3與4:1、1:3與3:1、1:3與2:1、1:3與1:1、1:3與1:2、1:2與10:1、1:2與8:1、1:2與7:1、1:2與6:1、1:2與5:1、1:2與4:1、1:2與3:1、1:2與2:1、1:2與1:1、1:1與10:1、1:1與8:1、1:1與7:1、1:1與6:1、1:1與5:1、1:1與4:1、1:1與3:1、1:1與2:1、2:1與10:1、2:1與8:1、2:1與7:1、2:1與6:1、2:1與5:1、2:1與4:1、2:1與3:1、3:1與10:1、3:1與8:1、3:1與7:1、3:1與6:1、3:1與5:1、3:1與4:1、5:1與10:1、5:1與8:1、5:1與7:1或5:1與6:1之間。
組合物、宿主細胞組合物或單位劑量中之CD4+ T細胞可為經修飾或經工程化(例如使用本文所揭示之載體或聚核苷酸)以表現本文所揭示之CD8輔受體的CD4+ T細胞。
應瞭解，本發明之宿主細胞組合物或單位劑量可包含如本文所述之任何宿主細胞或宿主細胞之任何組合。在某些實施例中，舉例而言，宿主細胞組合物或單位劑量包含經修飾之CD8+ T細胞、經修飾之CD4+ T細胞或兩者，其中此等T細胞經修飾以編碼對Ras肽:HLA-A*11:01複合物具特異性之結合蛋白。另外或替代地，本發明之宿主細胞組合物或單位劑量可包含如本文所述之任何宿主細胞或宿主細胞組合，且可進一步包含表現結合蛋白的經修飾之細胞(例如免疫細胞，諸如T細胞)，該結合蛋白對不同抗原具特異性(例如不同Ras抗原，或來自不同蛋白質或目標之抗原，諸如BCMA、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙醯基GD2、O-乙醯基GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、路易斯A (Lewis A)、路易斯Y (Lewis Y)、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A (例如包括MAGE-A1、MAGE-A3及MAGE-A4)、間皮素、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、HLA、結合於HLA之腫瘤或病原體相關肽、結合於HLA之hTERT肽、結合於HLA之酪胺酸酶肽、結合於HLA之WT-1肽、LTβR、LIFRβ、LRP5、MUC1、OSMRβ、TCRα、TCRβ、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、HA 1-H、Robo1、α-胎蛋白(AFP)、Frizzled、OX40、PRAME及SSX-2，或類似物)。在一些實施例中，結合蛋白結合於與HLA蛋白(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K或HLA-L)複合的肽(例如以上呈遞之不同抗原)。舉例而言，單位劑量可包含表現特異性結合於Ras-HLA複合物之結合蛋白的經修飾之CD8 +T細胞及表現特異性結合於PSMA抗原之結合蛋白(例如CAR)的經修飾之CD4 +T細胞(及/或經修飾之CD8 +T細胞)。亦應瞭解，本文所揭示之任一種宿主細胞可以組合療法投與。
在本文所描述之任一實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量包含數目相等或大致相等的工程化CD45RA -CD3 +CD8 +及經修飾之CD45RA -CD3 +CD4 +T M細胞。
在本文所描述之任一實施例中，宿主細胞組合物或單位劑量包含一或多種細胞群體(例如CD4+或CD8+細胞)，該等細胞群體已經歷CD62L正向選擇，例如以改良活體內持久性。
宿主細胞可離體、活體外或活體內經基因工程化以包含或表現結合蛋白。
用途
在其他態樣中，本發明提供用於治療或預防個體之與KRAS G12V或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關之疾病或病症復發的方法。此類疾病或病症包括例如癌症，諸如實體癌及血液惡性病。在某些示例實施例中，疾病或病症包含胰臟癌或癌瘤，視情況為胰管腺癌(PDAC)；結腸直腸癌或癌瘤；肺癌，視情況為非小細胞肺癌；膽癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，視情況為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金氏淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(視情況為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良之甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突狀細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星形細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；被套細胞淋巴瘤；不可分類之骨髓發育不良/骨髓增生性贅瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；母細胞過量之難治性貧血-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關之AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。
「治療(treat)」或「治療(treatment)」或「改善(ameliorate)」一般係指對個體(例如人類或非人類哺乳動物，諸如靈長類動物、馬、貓、犬、山羊、小鼠或大鼠)之疾病、病症或病狀的醫學管理。一般而言，包含本發明之組合物(例如包含結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞、宿主細胞組合物、單位劑量及/或免疫原性多肽)的適當劑量或治療方案係以足以誘發治療或預防益處之量投與。治療性或預防性/預防性益處包括改善臨床結果；減輕或緩解與疾病相關之症狀；減少症狀之發生；改善生活品質；無病狀態更長；疾病程度減弱；疾病病況穩定；延遲疾病進展；緩解；存活；存活期延長；或其任何組合。
如本文所用，「治療有效量」或「有效量」一般係指足以產生治療作用之組合物之量，包括統計學上顯著的臨床結果改善；與疾病相關之症狀減輕或緩解；症狀之發生減少；生活品質改善；無病狀態更長；疾病程度減弱；疾病病況穩定；疾病進展延遲；緩解；存活；或存活期延長。當提及單獨投與的個別活性成分或表現單一活性成分之細胞時，治療有效量係指單獨該成分或表現該成分之細胞的作用。當提及組合時，治療有效量係指活性成分或組合輔助活性成分與表現活性成分之細胞的組合量，不論連續或同時投與均產生治療作用。組合亦可為表現超過一種活性成分之細胞。
術語「醫藥學上可接受之賦形劑或載劑」或「生理學上可接受之賦形劑或載劑」係指適用於向人類或其他非人類哺乳動物個體投與，且一般認為安全或不引起嚴重不良事件的生物學上相容之媒劑，例如生理鹽水，其在本文中更詳細地描述。
如本文所用，「統計學上顯著」一般係指當使用史都登氏t檢驗(Students t-test)計算時0.050或更低之p值或使用另一適當統計檢驗之統計顯著性之值或指示物，且指示所量測之特定事件或結果不大可能偶然出現。
一般而言，可根據本發明治療之個體一般為人類及其他靈長類動物個體，諸如用於獸醫學目的之猴及猿。在前述實施例中之任一者中，個體可為人類個體。個體可為哺乳動物。個體可為男性或女性且可為任何適合的年齡，包括嬰兒、幼年、青年、成年及老年個體。根據本發明之組合物可以熟習醫學技術者所確定的適於治療疾病、病狀或病症的方式投與。在任一上述實施例中，如本文所述的經修飾之宿主細胞、宿主細胞組合物或單位劑量靜脈內、腹膜內、腫瘤內投與骨髓、淋巴結或腦脊髓液以便遇到目標細胞(例如白血病細胞)。組合物的適當劑量、適合持續時間及投與頻率將依據諸如以下因素確定：患者之病狀；疾病、病狀或病症之尺寸、類型及嚴重度；活性成分之特定形式；及投與方法。
如本文所用，術語「授受性免疫療法」或「授受性免疫療法」一般係指投與天然存在或經基因工程化之疾病或抗原特異性免疫細胞(例如T細胞)。授受性細胞免疫療法可為自體的(免疫細胞來自受體)、同種異體的(免疫細胞來自同一物種之供體)或同基因型的(免疫細胞來自與接受者基因相同的供體)。
在一些實施例中，個體表現包含SEQ ID NO: 2-3或由其組成之任一者中所示之胺基酸序列的Ras抗原。
在一些實施例中，個體為HLA-A +、HLA-B +或HLA-C +。在一些實施例中，個體為HLA-A*11:01 +。
在某些實施例中，方法包含在投與根據本發明之療法之前，測定個體之一或多種HLA類型及/或鑑別新抗原之存在。
HLA對偶基因之表現可藉由例如基因定序(例如高通量次世代定序(NGS))測定。HLA表現之此基因測定在本文中稱為「HLA分型」且可在授權進行HLA分型之臨床實驗室中經由分子方法測定。在一些實施例中，使用PCR擴增、隨後高通量NGS及隨後HLA測定來執行HLA分型。本文中，可確定主要HLA基因座(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C等)的HLA單倍型。
可使用任何已知方法(包括例如蛋白質或核酸測試)執行HLA分型。核酸測試之實例包括基於序列之分型(SBT)及使用序列特異性寡核苷酸探針(SSOP)或序列特異性引子(SSP)。在某些實施例中，使用PCR擴增、隨後高通量次世代定序(NGS)及隨後HLA測定來執行HLA分型。在一些實施例中，在一些實施例中，使用可經由Scisco Genetics (sciscogenetics.com/pages/technology.html，其內容以全文引用的方式併入本文中)獲得的系統執行序列分型。用於HLA分型之其他方法包括例如Mayor等人, PLoS One 10(5):e0127153 (2015)中所揭示之彼等方法，該等方法及試劑以引用的方式併入本文中。
在特定實施例中，方法包含投與包含經修飾之CD8+及/或經修飾之CD4+ T細胞之組合物，該等經修飾之CD8+及/或經修飾之CD4+ T細胞包含編碼如本文所提供之第二結合蛋白之異源聚核苷酸。
在宿主細胞組合物或單位劑量的情況下，其中細胞之量為至少一個細胞(例如一個經修飾之CD8 +T細胞亞群(例如視情況包含記憶及/或初始CD8 +T細胞)；一個經修飾之CD4 +T細胞亞群(例如視情況包含記憶及/或初始CD4 +T細胞)，或更通常大於10 2個細胞，例如多達10 4個、多達10 5個、多達10 6個、多達10 7個、多達10 8個、多達10 9個或超過10 10個細胞。在某些實施例中，細胞在約10 4個至約10 10個細胞/m 2範圍內或在約10 5個至約10 9個細胞/m 2範圍內投與。在一些實施例中，投與之劑量包含多達約3.3×10 5個細胞/kg。在一些實施例中，投與之劑量包含多達約1×10 6個細胞/kg。在一些實施例中，投與之劑量包含多達約3.3×10 6個細胞/kg。在一些實施例中，投與之劑量包含多達約1×10 7個細胞/kg。在某些實施例中，經修飾之免疫細胞係以包含多達約5×10 4個細胞/kg、5×10 5個細胞/kg、5×10 6個細胞/kg或多達約5×10 7個細胞/kg的劑量投與個體。在某些實施例中，經修飾之免疫細胞係以包含至少約5×10 4個細胞/kg、5×10 5個細胞/kg、5×10 6個細胞/kg或多達約5×10 7個細胞/kg的劑量投與個體。細胞數目視組合物預定的最終用途及其中包括的細胞類型而定。舉例而言，經修飾以含有結合蛋白之細胞將包含含有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更多此類細胞之細胞群體。對於本文提供之用途，細胞之體積一般為一公升或更少、500 ml或更少、250 ml或更少、或100 ml或更少。在實施例中，所需細胞之密度通常大於10 4個細胞/ml且一般大於10 7個細胞/ml，一般為10 8個細胞/ml或更大。細胞可以單次輸注形式或在一定時間範圍內以多次輸注形式投與。臨床上相關數目之免疫細胞可分配至多次輸注中，其累積等於或超過10 6、10 7、10 8、10 9、10 10或10 11個細胞。在某些實施例中，經修飾之免疫細胞的單位劑量可與來自同種異體供者之造血幹細胞共投與(例如同時或同期)。在一些實施例中，單位劑量中所包含之經修飾之免疫細胞中的一或多者對個體而言為自體的。
在一些實施例中，接受經修飾之免疫細胞之個體先前已接受淋巴球耗乏化學療法。在其他實施例中，淋巴球耗乏化學療法包含環磷醯胺(cyclophosphamide)、氟達拉濱(fludarabine)、抗胸腺細胞球蛋白或其組合。
在一些實施例中，方法進一步包含將如本文所揭示之免疫檢查點分子抑制劑投與個體。
亦考慮醫藥組合物(亦即，組合物)，其包含如本文所揭示之組合物(結合蛋白、聚核苷酸、載體、宿主細胞、宿主細胞組合物、單位劑量及/或免疫原性多肽)及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。適合的賦形劑包括水、鹽水、右旋糖、甘油或其類似物及其組合。在實施例中，包含如本文所揭示之融合蛋白或宿主細胞的組合物進一步包含適合的輸注介質。適合的輸注介質可為任何等張性介質調配物，通常可利用標準生理鹽水、Normosol R (Abbott)或Plasma-Lyte A (Baxter)、5%右旋糖水溶液或林格氏乳酸鹽(Ringer's lactate)。輸注介質可補充有人類血清白蛋白或其他人類血清組分。
醫藥組合物可以適合於待治療(或預防)之疾病或病況的方式投與，由醫學領域之技術人員決定。組合物之適當劑量及適合持續時間及投與頻率將依據諸如以下因素來確定：患者的健康狀況、患者之體型(亦即，體重、質量或身體面積)、患者病狀之類型及嚴重度、活性成分之特定形式及投與方法。一般而言，適當的劑量及治療方案以足以提供治療及/或預防益處(諸如本文所述，包括改善的臨床結果，諸如更頻繁的完全或部分緩解，或更長的無病及/或總存活期，或症狀嚴重程度減輕)之量提供組合物。
醫藥組合物之有效量係指在必需之劑量及時段的情況下，足以達成如本文所述之所需臨床結果或有益治療的量。有效量可以一或多次投與遞送。若投與已知或確認患有疾病或疾病狀態之個體，則在提及治療時可使用術語「治療量」，而「預防有效量」可用於描述向易患或有風險罹患疾病或疾病狀態(例如復發)之個體投與有效量作為預防過程。
本文所述之醫藥組合物可提供於單位劑量或多劑量容器，諸如密封安瓿或小瓶中。此類容器可加以冷凍以便在輸注至患者之前保持調配物的穩定性。劑量將變化，但投與如本文所述之經修飾之免疫細胞的劑量可為約10 4個細胞/m 2、約5×10 4個細胞/m 2、約10 5個細胞/m 2、約5×10 5個細胞/m 2、約10 6個細胞/m 2、約5×10 6個細胞/m 2、約10 7個細胞/m 2、約5×10 7個細胞/m 2、約10 8個細胞/m 2、約5×10 8個細胞/m 2、約10 9個細胞/m 2、約5×10 9個細胞/m 2、約10 10個細胞/m 2、約5×10 10個細胞/m 2或約10 11個細胞/m 2。在某些實施例中，單位劑量包含劑量為約10 4個細胞/m 2至約10 11個細胞/m 2的如本文所述之經修飾之免疫細胞。開發適合的給藥及治療方案以在多種治療方案中使用本文所述之特定組合物，包括例如非經腸或靜脈內投與或調配物。
若主題組合物係非經腸投與，則該組合物亦可包括無菌水性或油性溶液或懸浮液。適合的非經腸可接受之無毒稀釋劑或溶劑包括水、林格氏溶液、等張鹽溶液、1,3-丁二醇、乙醇、丙二醇或與水混合之聚乙二醇。水性溶液或懸浮液可進一步包含一或多種緩衝劑，諸如乙酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉或酒石酸鈉。當然，用於製備任何劑量單位調配物之任何材料可為醫藥學上純的且在所用量下基本上無毒。另外，活性化合物可併入持續釋放製劑及調配物中。如本文所用，單位劑型係指作為單位劑量適用於待治療之個體的實體不連續單元；各單元可含有經計算可產生所需效果的預定量之工程化免疫細胞或活性化合物與適當醫藥載劑。
一般而言，適當的劑量及治療方案以足以提供益處之量提供活性分子或細胞。此類反應可藉由在所治療之個體中建立與未治療之個體相比改善的臨床結果(例如更頻繁的完全或部分緩解，或更長的無病存活期)來監測。對腫瘤蛋白之預先存在的免疫反應的增加通常與改善的臨床結果相關。此類免疫反應一般可使用例行的標準增殖、細胞毒性或細胞介素分析來評價。
對於預防用途，劑量應足以預防與疾病或病症相關之疾病、延遲其發作或減輕其嚴重程度。根據本文所述之方法投與的免疫原性組合物之預防益處可藉由進行臨床前(包括活體外及活體內動物研究)及臨床研究，且藉由適當的統計學、生物學及臨床方法及技術分析自其獲得之資料來確定，該等方法及技術皆可由熟習此項技術者容易地實踐。
如本文所用，組合物之投與係指將其遞送至個體，而不考慮遞送之途徑或模式。投與可連續地或間歇地及非經腸進行。組合物可局部(例如腫瘤內)或全身性(例如靜脈內)投與。投與可用於治療已確認為患有公認病況、疾病或疾病狀態之個體，或用於治療易患或有風險罹患此類病況、疾病或疾病狀態之個體。與輔助療法共同投與可包括同時及/或以任何順序及任何給藥時程依序遞送多種藥劑(例如具有一或多種細胞介素的經修飾之免疫細胞；免疫抑制療法，諸如鈣調磷酸酶抑制劑、皮質類固醇、微管抑制劑、低劑量之黴酚酸前藥或其任何組合)。
在某些實施例中，向個體投與複數個劑量的本文所述之組合物，其可以約二週至約四週之間的投與間隔投與。
本發明之治療或預防方法可作為治療過程或方案之一部分投與個體，該治療過程或方案可包含在本發明所揭示之單位劑量、細胞或組合物投與之前或之後的額外療法。舉例而言，在某些實施例中，接受單位劑量之經修飾之免疫細胞的個體正接受或先前已接受造血細胞移植(HCT；包括清髓性及非清髓性HCT)。用於執行HCT之技術及方案係此項技術中已知的且可包含移植任何適合的供體細胞，諸如來源於臍帶血、骨髓或周邊血液之細胞、造血幹細胞、動員之幹細胞或來自羊膜液之細胞。因此，在某些實施例中，本發明之經修飾之免疫細胞可與使用造血幹細胞之經改良HCT療法一起或在其之後不久投與。在一些實施例中，HCT包含供體造血細胞，該供體造血細胞包含編碼HLA組分之基因的染色體剔除、編碼TCR組分之基因的染色體剔除，或二者。
在其他實施例中，個體在接受組合物或HCT之前，先前已接受淋巴球耗乏化學療法。在某些實施例中，淋巴球耗乏化學療法包含調理方案，該調理方案包含環磷醯胺、氟達拉濱、抗胸腺細胞球蛋白或其組合。
根據本發明之方法可進一步包括在組合療法中投與一或多種額外藥劑來治療疾病或病症。舉例而言，在某些實施例中，組合療法包含聯合免疫檢查點抑制劑(並行、同時或依序)投與本發明之組合物。在一些實施例中，組合療法包含聯合免疫檢查點刺激劑之促效劑投與本發明之組合物。在其他實施例中，組合療法包含聯合第二療法(諸如化學治療劑、放射療法、手術、抗體或其任何組合)投與本發明之組合物。
如本文所用，術語「免疫抑制劑(immune suppression agent/immunosuppression agent)」係指提供抑制信號以幫助控制或抑制免疫反應的一或多種細胞、蛋白質、分子、化合物或複合物。舉例而言，免疫抑制劑包括部分或完全阻斷免疫刺激，減少、防止或延遲免疫活化，或增加、活化或上調免疫抑制的彼等分子。靶向(例如使用免疫檢查點抑制劑)的示例免疫抑制劑包括PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4、B7-H3、B7-H4、CD244/2B4、HVEM、BTLA、CD160、TIM3、GAL9、KIR、PVR1G (CD112R)、PVRL2、腺苷、A2aR、免疫抑制性細胞介素(例如IL-10、IL-4、IL-1RA、IL-35)、IDO、精胺酸酶、VISTA、TIGIT、LAIR1、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、Treg細胞或其任何組合。
免疫抑制劑抑制劑(亦稱為免疫檢查點抑制劑)可為化合物、抗體、抗體片段或融合多肽(例如Fc融合物，諸如CTLA4-Fc或LAG3-Fc)、反義分子、核酶或RNAi分子或低分子量有機分子。在本文所揭示之任一實施例中，方法可包含單獨或呈任何組合形式的本發明之組合物與以下免疫抑制組分中之任一者的一或多種抑制劑。
在某些實施例中，本發明之醫藥組合物與PD-1抑制劑組合使用，例如PD-1特異性抗體或其結合片段，諸如皮立珠單抗(pidilizumab)、納武利尤單抗(nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、MEDI0680 (先前為AMP-514)、AMP-224、BMS-936558或其任何組合。在其他實施例中，本發明之組合物與PD-L1特異性抗體或其結合片段組合使用，諸如BMS-936559、度伐魯單抗(durvalumab) (MEDI4736)、阿替利珠單抗(atezolizumab) (RG7446)、阿維魯單抗(avelumab) (MSB0010718C)、MPDL3280A或其任何組合。亦考慮賽咪單抗(cemiplimab)；IBI-308；納武利尤單抗 + 瑞拉利單抗(relatlimab)；BCD-100；卡瑞利珠單抗(camrelizumab)；JS-001；斯巴達珠單抗(spartalizumab)；替雷利珠單抗(tislelizumab)；AGEN-2034；BGBA-333 + 替雷利珠單抗；CBT-501；多塔利單抗(dostarlimab)；度伐魯單抗 + MEDI-0680；JNJ-3283；鹽酸帕唑帕尼(pazopanib hydrochloride) + 帕博利珠單抗(pembrolizumab)；匹地利珠單抗(pidilizumab)；REGN-1979 + 賽咪單抗；ABBV-181；ADUS-100 + 斯巴達珠單抗；AK-104；AK-105；AMP-224；BAT-1306；BI-754091；CC-90006；賽咪單抗 + REGN-3767；CS-1003；GLS-010；LZM-009；MEDI-5752；MGD-013；PF-06801591；Sym-021；替雷利珠單抗 + 帕米帕尼(pamiparib)；XmAb-20717；AK-112；ALPN-202；AM-0001；拮抗阿茲海默症(Alzheimer's disease)之PD-1的抗體；BH-2922；BH-2941；BH-2950；BH-2954；拮抗實體腫瘤之CTLA-4及PD-1的生物製劑；靶向腫瘤之PD-1及LAG-3的雙特異性單株抗體；BLSM-101；CB-201；CB-213；CBT-103；CBT-107；細胞免疫療法 + PD-1抑制劑；CX-188；HAB-21；HEISCOIII-003；IKT-202；JTX-4014；MCLA-134；MD-402；mDX-400；MGD-019；拮抗腫瘤之PDCD1的單株抗體；拮抗腫瘤之PD-1的單株抗體；抑制腫瘤之PD-1的溶瘤病毒；OT-2；PD-1拮抗劑 + 羅派干擾素(ropeginterferon) α-2b；PEGMP-7；PRS-332；RXI-762；STIA-1110；TSR-075；靶向腫瘤之HER2及PD-1的疫苗；靶向腫瘤及自體免疫病症之PD-1的疫苗；XmAb-23104；抑制腫瘤之PD-1的反義寡核苷酸；AT-16201；抑制腫瘤之PD-1的雙特異性單株抗體；IMM-1802；拮抗實體腫瘤及血液腫瘤之PD-1及CTLA-4的單株抗體；納武利尤單抗生物類似藥；促效腫瘤之CD278及CD28且拮抗腫瘤之PD-1的重組蛋白質；促效自體免疫病症及發炎病症之PD-1的重組蛋白；SNA-01；SSI-361；YBL-006；AK-103；JY-034；AUR-012；BGB-108；抑制實體腫瘤之PD-1、Gal-9及TIM-3的藥物；ENUM-244C8；ENUM-388D4；MEDI-0680；拮抗轉移性黑色素瘤及轉移性肺癌之PD-1的單株抗體；抑制腫瘤之PD-1的單株抗體；靶向腫瘤之CTLA-4及PD-1的單株抗體；拮抗NSCLC之PD-1的單株抗體；抑制腫瘤之PD-1及TIM-3的單株抗體；抑制腫瘤之PD-1的單株抗體；抑制血液惡性病及實體腫瘤之PD-1及VEGF-A的重組蛋白；拮抗腫瘤之PD-1的小分子；Sym-016；英比利珠單抗(inebilizumab) + MEDI-0680；靶向轉移性黑色素瘤之PDL-1及IDO的疫苗；針對神經膠母細胞瘤的抗PD-1單株抗體 + 細胞免疫療法；拮抗腫瘤之PD-1的抗體；抑制血液惡性病及細菌感染之PD-1/PD-L1的單株抗體；抑制HIV之PD-1的單株抗體；或抑制實體腫瘤之PD-1的小分子。
在某些實施例中，本發明之組合物與LAG3抑制劑組合使用，諸如LAG525、IMP321、IMP701、9H12、BMS-986016或其任何組合。
在某些實施例中，本發明之組合物與CTLA4抑制劑組合使用。在特定實施例中，本發明之組合物與CTLA4特異性抗體或其結合片段組合使用，諸如伊匹單抗(ipilimumab)、曲美單抗(tremelimumab)、CTLA4-Ig融合蛋白(例如阿巴西普(abatacept)、貝拉西普(belatacept))或其任何組合。
在某些實施例中，本發明之組合物與以下組合使用：B7-H3特異性抗體或其結合片段，諸如伊諾貝利圖珠單抗(enoblituzumab) (MGA271)、376.96或二者。B7-H4抗體結合片段可為例如Dangaj等人, Cancer Res . 73:4820, 2013中所描述之scFv或其融合蛋白以及美國專利第9,574,000號及PCT專利公開案第WO/201640724A1號及第WO 2013/025779A1號中所描述之彼等物。
在某些實施例中，本發明之組合物與CD244抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明之組合物與BLTA、HVEM、CD160或其任何組合之抑制劑組合使用。抗CD160抗體描述於例如PCT公開案第WO 2010/084158號中。
在某些實施例中，本發明之組合物與TIM3抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明之組合物與Gal9抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明之組合物與諸如誘餌腺苷受體之腺苷信號傳導抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明之組合物與A2aR抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明之組合物與諸如利瑞路單抗(lirilumab) (BMS-986015)之KIR抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明之組合物與抑制性細胞介素(通常為除TGFβ以外之細胞介素)或Treg發育或活性之抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明之組合物與以下組合使用：IDO抑制劑，諸如左-1-甲基色胺酸、艾卡哚司他(epacadostat) (INCB024360；Liu等人, Blood 115:3520-30, 2010)、依布硒啉(ebselen) (Terentis等人, Biochem .49:591-600, 2010)、吲哚莫德(indoximod)、NLG919 (Mautino等人, American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; 2013年4月6-10日)、1-甲基-色胺酸(1-MT)-替拉紮明(1-methyl-tryptophan (1-MT)-tira-pazamine)或其任何組合。
在某些實施例中，本發明之組合物與以下組合使用：精胺酸酶抑制劑，諸如N(ω)-硝基-L-精胺酸甲酯(L-NAME)、N-ω-羥基-正-l-精胺酸(正NOHA)、L-NOHA、2(S)-胺基-6-硼己酸(ABH)、S-(2-硼乙基)-L-半胱胺酸(BEC)或其任何組合。
在某些實施例中，本發明之組合物與以下組合使用：VISTA抑制劑，諸如CA-170 (Curis, Lexington, Mass.)。
在某些實施例中，本發明之組合物與以下組合使用：TIGIT抑制劑，諸如COM902 (Compugen, Toronto, Ontario Canada)；CD155抑制劑，諸如COM701 (Compugen)；或二者。
在某些實施例中，本發明之組合物與PVRIG、PVRL2或二者之抑制劑組合使用。抗PVRIG抗體描述於例如PCT公開案第WO 2016/134333號中。抗PVRL2抗體描述於例如PCT公開案第WO 2017/021526號中。
在某些實施例中，本發明之醫藥組合物與LAIR1抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明之組合物與CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5或其任何組合之抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明之組合物與刺激性免疫檢查點分子之活性增加劑(亦即促效劑)組合使用。舉例而言，本發明之組合物可與以下組合使用：CD137 (41BB)促效劑(諸如烏瑞蘆單抗(urelumab))、CD134 (OX-40)促效劑(諸如MEDI6469、MEDI6383或MEDI0562)、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、CD27促效劑(諸如CDX-1127)、CD28促效劑(諸如TGN1412、CD80或CD86)、CD40促效劑(諸如CP-870,893、rhuCD40L或SGN-40)、CD122促效劑(諸如IL-2)、GITR促效劑(諸如PCT專利公開案第WO 2016/054638號中所述之人源化單株抗體)、ICOS (CD278)促效劑(諸如GSK3359609、mAb 88.2、JTX-2011、Icos 145-1、Icos 314-8或其任何組合)。在本文所揭示之任一實施例中，方法可包含單獨或以任何組合形式投與本發明之組合物與一或多種刺激性免疫檢查點分子之促效劑，促效劑包括前述促效劑中之任一者。
在某些實施例中，組合療法包含本發明之組合物及第二療法，該第二療法包含以下中之一或多者：對由非發炎實體腫瘤所表現之癌症抗原具特異性之抗體或其抗原結合片段、放射治療、手術、化學治療劑、細胞介素、RNAi或其任何組合。
在某些實施例中，組合療法方法包含投與本發明之組合物及進一步投與放射治療或手術。放射療法為此項技術中熟知的且包括X射線療法，諸如γ-輻射及放射性藥物療法。適合於治療個體之既定癌症的手術及手術技術為一般技術者所熟知的。
在某些實施例中，組合療法方法包含投與本發明之組合物及進一步投與化學治療劑。化學治療劑包括但不限於染色質功能抑制劑、拓樸異構酶抑制劑、微管抑制藥物、DNA損傷劑、抗代謝物(諸如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及經糖修飾之類似物)、DNA合成抑制劑、DNA交互劑(諸如嵌入劑)及DNA修復抑制劑。例示性化學治療劑包括但不限於以下之群：抗代謝物/抗癌劑，諸如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)及阿糖胞苷(cytarabine))及嘌呤類似物；葉酸拮抗劑及有關抑制劑(巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噴司他汀(pentostatin)及2-氯去氧腺苷(克拉屈濱(cladribine)))；抗增殖/抗有絲分裂劑，包括天然產物，諸如長春花生物鹼(長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)及長春瑞濱(vinorelbine))；微管干擾劑，諸如紫杉烷(紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel))、長春新鹼(vincristin)、長春鹼(vinblastin)、諾考達唑(nocodazole)、埃博黴素(epothilones)及溫諾平(navelbine)、表鬼臼毒素(epidipodophyllotoxin)(依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、DNA損傷劑(放線菌素(actinomycin)、安吖啶(amsacrine)、蒽環黴素(anthracyclines)、博萊黴素(bleomycin)、白消安(busulfan)、喜樹鹼(camptothecin)、卡鉑(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、賽特杉(Cytoxan)、更生黴素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、六甲密胺(hexamethylmelamine)奧沙利鉑(oxaliplatin)、異環磷醯胺(iphosphamide)、美法侖(melphalan)、甲基二(氯乙基)胺(merchlorehtamine)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、亞硝基脲(nitrosourea)、普卡黴素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇(taxol)、紫杉德(taxotere)、替莫唑胺(temozolamide)、替尼泊苷(teniposide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)及依託泊苷(VP 16))；抗生素，諸如更生黴素(放線菌素D (actinomycin D))、道諾黴素、多柔比星(阿黴素(adriamycin))、艾達黴素(idarubicin)、蒽環黴素(anthracycline)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博萊黴素、普卡黴素(光神黴素(mithramycin))及絲裂黴素(mitomycin)；酶(L-天冬醯胺酶，其使L-天冬醯胺全身性代謝且使細胞喪失合成其自身天冬醯胺的能力)；抗血小板藥劑；抗增殖/抗有絲分裂烷基化劑，諸如氮芥(nitrogen mustard)(二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、環磷醯胺及類似物、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil))、乙烯亞胺(ethylenimine)及甲基三聚氰胺(methylmelamine)(六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)及噻替派(thiotepa))、烷基磺酸鹽-白消安(busulfan)、亞硝基脲(nitrosourea)(卡莫司汀(carmustine)(BCNU)及類似物、鏈脲菌素(streptozocin))、三氮烯-達卡巴仁(dacarbazinine)(DTIC)；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝物，諸如葉酸類似物(甲胺喋呤(methotrexate))；鉑配位錯合物(順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin))、丙卡巴肼(procarbazine)、羥脲(hydroxyurea)、米托坦(mitotane)、胺魯米特(aminoglutethimide)；激素、激素類似物(雌激素、他莫昔芬(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、比卡魯胺(bicalutamide)、尼魯米特(nilutamide))及芳香酶抑制劑(來曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole))；抗凝劑(肝素、合成肝素鹽及凝血酶之其他抑制劑)；纖維蛋白溶解劑(諸如組織纖維蛋白溶酶原活化因子、鏈球菌激酶(streptokinase)及尿激酶(urokinase))、阿司匹靈(aspirin)、雙吡大莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、克羅匹多(clopidogrel)、阿昔單抗(abciximab)；抗遷移藥劑；抗分泌藥劑(布瑞汀(breveldin))；免疫抑制劑(環孢靈(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))、硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil))；抗血管生成化合物(TNP470、染料木素(genistein))及生長因子抑制劑(血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑、纖維母細胞生長因子(FGF)抑制劑)；血管收縮素受體阻斷劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體(曲妥珠單抗(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab))；嵌合抗原受體；細胞週期抑制劑及分化誘導劑(維甲酸(tretinoin))；mTOR抑制劑、拓樸異構酶抑制劑(多柔比星(阿黴素)、安吖啶(amsacrine)、喜樹鹼(camptothecin)、道諾黴素、更生黴素、艾尼西德(eniposide)、表柔比星、依託泊苷、艾達黴素、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)及米托蒽醌、拓朴替康(topotecan)、伊立替康)、皮質類固醇(皮質酮(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氫化可的松(hydrocortisone)、甲基普賴松濃(methylpednisolone)、普賴松(prednisone)及潑尼龍(prenisolone))；生長因子信號轉導激酶抑制劑；粒線體功能障礙誘導劑；毒素，諸如霍亂毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)腺苷酸環化酶毒素或白喉毒素(diphtheria toxin)，及凋亡蛋白酶活化劑；及染色質干擾劑。
細胞介素可用於操控宿主免疫反應朝向抗癌活性。參見例如Floros及Tarhini, Semin. Oncol. 42(4):539-548, 2015。適用於促進免疫抗癌或抗腫瘤反應之細胞介素包括例如單獨的或與本發明之組合物呈任何組合的IFN-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-24及GM-CSF。
本文亦提供用於調節授受性免疫療法之方法，其中該等方法包含將安全開關蛋白之同源化合物以有效地消除個體中之先前投與之經修飾宿主細胞的量投與先前已接受本發明之經修飾之宿主細胞的個體，該經修飾之宿主細胞包含編碼安全開關蛋白之異源聚核苷酸。
在某些實施例中，安全開關蛋白包含tEGFR且同源化合物為西妥昔單抗(cetuximab)，或安全開關蛋白包含iCasp9且同源化合物為AP1903 (例如二聚AP1903)，或安全開關蛋白包含RQR多肽且同源化合物為利妥昔單抗，或安全開關蛋白包含myc結合域且同源化合物為對myc結合域具特異性之抗體。
在其他態樣中，提供製造本發明之組合物或單位劑量的方法。在某些實施例中，方法包含將(i)經本發明之載體轉導之宿主細胞的等分試樣與(ii)醫藥學上可接受之載劑組合。在某些實施例中，本發明之載體用於轉染/轉導供授受性轉移療法(例如靶向癌症抗原)使用之宿主細胞(例如T細胞)。
在一些實施例中，方法進一步包含在等分之前，培養經轉導之宿主細胞且選擇已併入(亦即，表現)該載體之經轉導之細胞。在其他實施例中，方法包含在培養及選擇之後且在等分之前擴增經轉導之宿主細胞。在本發明方法之任一實施例中，可將製成之組合物或單位劑量冷凍(例如冷凍保存)以便後續使用。任何適當的宿主細胞可用於製造根據本發明方法之組合物或單位劑量，包括例如造血幹細胞、T細胞、初代T細胞、T細胞株、NK細胞或NK-T細胞。在特定實施例中，方法包含之宿主細胞為CD8 +T細胞、CD4 +T細胞或二者。
亦提供單獨或以任何組合服用的結合蛋白、聚核苷酸、表現載體、宿主細胞、宿主細胞組合物、單位劑量及免疫原性多肽中之任一者，用於治療個體之與KRAS G12D突變或KRAS G12V或NRAS G12D突變或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變或HRAS G12D突變相關的疾病或病症。
亦提供單獨或以任何組合服用的結合蛋白、聚核苷酸、表現載體、宿主細胞、宿主細胞組合物、單位劑量及免疫原性多肽中之任一者，用於製造供治療個體之疾病或病症用的藥劑，該疾病或病症與KRAS G12D突變或KRAS G12V或NRAS G12D突變或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變或HRAS G12D突變相關。
在某些實施例中，疾病或病症包含癌症。在一些實施例中，癌症為實體癌症或血液惡性病。在某些實施例中，疾病或病症係選自胰臟癌或癌瘤，視情況為胰管腺癌(PDAC)；結腸直腸癌或癌瘤；肺癌，視情況為非小細胞肺癌；膽癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，視情況為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金氏淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(視情況為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良之甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突狀細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星形細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；被套細胞淋巴瘤；不可分類之骨髓發育不良/骨髓增生性贅瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；母細胞過量之難治性貧血-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關之AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。在一些實施例中，方法包含非經腸或靜脈內投與本發明之組合物。在一些實施例中，方法包含向個體投與複數個劑量之結合蛋白、聚核苷酸、表現載體、宿主細胞、宿主細胞組合物、單位劑量及/或免疫原性多肽。
在某些實施例中，以約二週至約四週之間的投與間隔投與複數個劑量。
在某些實施例中，組合物包含經修飾之宿主細胞。在一些實施例中，方法包含將經修飾之宿主細胞以約10 4個細胞/kg至約10 11個細胞/kg之劑量投與個體。
在某些實施例中，方法進一步包含向個體投與細胞介素。在一些實施例中，細胞介素包含IL-2、IL-15或IL-21。
在某些實施例中，個體已接受或正接受免疫檢查點抑制劑及/或免疫檢查點刺激劑之促效劑。
亦提供包含將編碼本發明之結合蛋白的聚核苷酸引入宿主(例如T)細胞中的方法。
序列 SEQ ID NO:1 - wt KRAS 完整 (UniProt: P01116)MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLLDILDTAG QEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHHYREQI KRVKDSEDVP MVLVGNKCDL PSRTVDTKQA QDLARSYGIP FIETSAKTRQ RVEDAFYTLV REIRQYRLKK ISKEEKTPGC VKIKKCIIM SEQ ID NO:2 - KRAS 7-16 G12VVVVGAVGVGK SEQ ID NO:3 - KRAS 8-16 G12VVVGAVGVGK SEQ ID NO:4 - TCR 11N4A 之 KRAS 8-16 G12V 結合模體x-V-G-A-x-G-x-x-K SEQ ID NO:5 - 具有信號肽之 TCR 11N4A α 鏈 - 原始 (WT) 核苷酸序列atggccatgctcctgggggcatcagtgctgattctgtggcttcagccagactgggtaaacagtcaacagaagaatgatgaccagcaagttaagcaaaattcaccatccctgagcgtccaggaaggaagaatttctattctgaactgtgactatactaacagcatgtttgattatttcctatggtacaaaaaataccctgctgaaggtcctacattcctgatatctataagttccattaaggataaaaatgaagatggaagattcactgtcttcttaaacaaaagtgccaagcacctctctctgcacattgtgccctcccagcctggagactctgcagtgtacttctgtgcagcaagtggggtttcaggaaacacacctcttgtctttggaaagggcacaagactttctgtgattgcaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagctga SEQ ID NO:6 - 具有信號肽之 TCR 11N4A β 鏈 - 原始 (WT) 核苷酸序列atgggctccaggctgctctgttgggtgctgctttgtctcctgggagcaggcccagtaaaggctggagtcactcaaactccaagatatctgatcaaaacgagaggacagcaagtgacactgagctgctcccctatctctgggcataggagtgtatcctggtaccaacagaccccaggacagggccttcagttcctctttgaatacttcagtgagacacagagaaacaaaggaaacttccctggtcgattctcagggcgccagttctctaactctcgctctgagatgaatgtgagcaccttggagctgggggactcggccctttatctttgcgccagcagcgtcgggactgtggagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcacagaggacctgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggcttcacctccgagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgctgatggccatggtcaagagaaaggattccagaggctag SEQ ID NO:7 - TCR 11N4A TCRβ-P2A-TCRα 聚核苷酸 - 密碼子最佳化 AATGGGCTCTAGACTGTTGTGTTGGGTTCTGCTGTGTCTGCTTGGAGCTGGACCTGTGAAAGCTGGAGTTACCCAGACACCCAGATATCTGATCAAGACCAGAGGACAGCAGGTGACACTGAGCTGTAGCCCTATTTCTGGCCACAGGAGCGTTAGCTGGTATCAGCAAACACCCGGGCAGGGACTACAATTTCTATTCGAGTACTTCAGCGAGACCCAGCGGAATAAGGGCAATTTTCCTGGCAGATTTAGCGGCAGGCAGTTCAGCAACAGCAGAAGCGAGATGAACGTGAGCACCCTGGAATTAGGCGATTCTGCTCTGTACCTGTGTGCCTCTTCTGTGGGAACAGTGGAGCAGTACTTTGGCCCCGGCACGAGACTGACAGTGACAGAGGACCTGAAGAACGTGTTCCCCCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTAGCGAGGCCGAGATCAGCCACACCCAGAAAGCCACCCTCGTGTGCCTGGCCACCGGCTTTTACCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTCTGCACCGACCCCCAGCCCCTGAAAGAGCAGCCCGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGTCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACCGGGCCAAGCCCGTGACCCAGATCGTGTCTGCTGAGGCCTGGGGCAGAGCCGATTGCGGCTTCACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGAGCGCCACCATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCCGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACAGCCGGGGCGGTTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATGGCCATGTTACTAGGAGCGAGCGTGCTGATTCTGTGGTTACAGCCTGATTGGGTGAACTCTCAGCAGAAGAACGACGATCAGCAGGTGAAGCAGAATAGCCCCTCTCTGTCTGTGCAGGAGGGCAGAATCTCTATCCTGAATTGCGACTACACCAACAGCATGTTCGACTATTTTCTGTGGTACAAAAAATACCCCGCCGAGGGCCCTACATTCCTGATCAGCATCAGCTCTATCAAGGACAAGAACGAGGATGGCAGATTTACCGTGTTCCTGAACAAGAGCGCCAAGCACCTGAGCCTGCACATTGTGCCTTCTCAACCTGGCGATTCTGCTGTGTACTTTTGTGCTGCCTCTGGAGTGAGCGGCAATACACCTCTAGTGTTCGGGAAGGGCACAAGACTGTCTGTTATTGCAAACATTCAAAACCCCGACCCTGCTGTGTACCAGCTGCGGGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGATAAGTGCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGCCCCGAGAGCAGCTGCGACGTGAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAACCTCAGCGTGATCGGCTTCCGGATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGCTTCAACCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA SEQ ID NO:8 -11N4A TCRβ-P2A-α 聚核苷酸 密碼子最佳化 BATGGGATCTAGATTGCTTTGTTGGGTGCTGCTGTGCCTGCTCGGAGCCGGACCTGTGAAAGCTGGCGTTACCCAGACACCTAGATACCTGATCAAGACCAGAGGCCAGCAAGTGACCCTGAGCTGCTCTCCTATCAGCGGCCACAGAAGCGTGTCCTGGTATCAGCAGACACCTGGACAGGGCCTGCAGTTCCTGTTCGAGTACTTCAGCGAGACACAGCGGAACAAGGGCAACTTCCCCGGCAGATTTTCCGGCAGACAGTTCAGCAACAGCCGCAGCGAGATGAACGTGTCCACACTGGAACTGGGCGACAGCGCCCTGTATCTGTGTGCCTCTTCTGTGGGCACCGTGGAACAGTACTTTGGCCCTGGCACCAGACTGACCGTGACCGAGGATCTGAAGAACGTGTTCCCACCTGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTGAGGCCGAGATCAGCCACACACAGAAAGCCACACTCGTGTGTCTGGCCACCGGCTTCTATCCCGATCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACAGCGGCGTCTGTACCGATCCTCAGCCTCTGAAAGAGCAGCCCGCTCTGAACGACAGCAGATACTGCCTGAGCAGCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCAGAAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTCTACGGCCTGAGCGAGAACGATGAGTGGACCCAGGATAGAGCCAAGCCTGTGACACAGATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGCAGAGCCGATTGTGGCTTTACCAGCGAGAGCTACCAGCAGGGCGTGCTGTCTGCCACAATCCTGTACGAGATCCTGCTGGGCAAAGCCACTCTGTACGCCGTGCTGGTTTCTGCCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGATTCTAGAGGCGGATCCGGAGCCACCAACTTCAGCCTGCTTAAACAGGCCGGCGACGTGGAAGAGAACCCTGGACCTATGGCTATGCTGCTGGGAGCCTCTGTGCTGATCCTGTGGCTGCAACCCGATTGGGTCAACAGCCAGCAGAAGAACGACGACCAGCAAGTCAAGCAGAACAGCCCCAGCCTGAGCGTGCAAGAGGGCAGAATCAGCATCCTGAACTGCGACTACACCAACTCTATGTTCGACTACTTTCTGTGGTACAAGAAGTACCCCGCCGAGGGACCCACCTTCCTGATCAGCATCAGCAGCATCAAGGACAAGAACGAGGACGGCCGGTTCACCGTGTTTCTGAACAAGAGCGCCAAGCACCTGAGCCTGCACATCGTGCCTTCTCAGCCTGGCGATAGCGCCGTGTACTTTTGTGCTGCCAGCGGCGTGTCAGGCAACACCCCTCTGGTTTTTGGCAAGGGCACACGCCTGTCCGTGATCGCCAACATTCAGAACCCTGATCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACAGCAAGAGCAGCGACAAGAGCGTGTGCCTGTTCACCGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGTCCCAGAGCAAGGACAGCGACGTGTACATCACCGATAAGTGCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGTCCGATTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATTATCCCCGAGGACACATTCTTCCCAAGTCCTGAGTCCAGCTGCGACGTGAAGCTGGTGGAAAAGAGCTTCGAGACAGACACCAACCTGAACTTCCAGAATCTGAGCGTGATCGGCTTCAGAATCCTGCTGCTGAAGGTGGCCGGATTCAACCTGCTGATGACCCTCAGACTGTGGTCCAGCTGA SEQ ID NO:9 - 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原始蛋白質，信號肽用下劃線表示 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:22 -11N4A TCR β 鏈 - 原始蛋白質，無信號肽GVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:23-11N4A TCR β 鏈可變域，無信號肽GVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVT SEQ ID NO:24 - 11N4A TCR β 鏈可變域 CDR1βSGHRS SEQ ID NO:25 - 11N4A TCR β 鏈可變域 CDR2βYFSETQ SEQ ID NO:26 - 11N4A TCR β 鏈可變域 CDR3β - IMGT 接合CASSVGTVEQYF SEQ ID NO:27 - 11N4A TCR β 鏈可變域 CDR3β - IMGTASSVGTVEQY SEQ ID NO:28 - 11N4A TCR β 鏈恆定域 ( 原始蛋白質 )EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG* SEQ ID NO:29 -11N4A TCR β 鏈恆定域 ( 經 cys 修飾之蛋白質 )EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:30 -11N4A TCR β 鏈，無信號肽 ( 經 cys 修飾之蛋白質 )GVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:31 -11N4A TCRβ-P2A-α - 蛋白質，信號肽用下劃線表示 MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGVSGNTPLVFGKGTRLSVIANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:32 CD8α-T2A-CD8β-P2A-11N4A TCRβ-P2A-α - 蛋白質，信號肽用下劃線表示 MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQFYKGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSVGTVEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGVSGNTPLVFGKGTRLSVIANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:33 -- 11N6 TCR α - 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IMGTASSPYGGSVSYEQY SEQ ID NO:54 11N6 TCR β 鏈恆定域 ( 原始蛋白質 )EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:55 -11N6 TCR β 鏈恆定域 ( 經 cys 修飾之蛋白質 )EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:56 -11N6 TCR β 鏈 ( 經 cys 修飾之蛋白質 )GVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSPYGGSVSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO:57 -11N6 TCRβ-P2A-α - 蛋白質，信號肽用下劃線表示 MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSPYGGSVSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDPMNTNAGKSTFGDGTTLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:58 - CD8α-T2A-CD8β-P2A-11N6 TCRβ-P2A-α - 蛋白質，信號肽用下劃線表示 MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYVGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQFYKGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSPYGGSVSYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGV CTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDPMNTNAGKSTFGDGTTLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDK CVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS* SEQ ID NO:59 - TCR BNT Vβ ，具有信號肽MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSLADIYEQYFGPGTRLTVT SEQ ID NO:60 - TCR BNT Vα ，具有信號肽METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDRQSSGDKLTFGTGTRLAVRP SEQ ID NO:61 -(TCR 220_21 Vα)GEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEPIIGGNTPLVFGKGTRLSVIAN SEQ ID NO:62 (TCR 220_21 Vβ)GAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPEFLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCASSSEGLAGGPTAGELFFGEGSRLTVL SEQ ID NO:63 (TCR 129_5 Vα)AQSVTQPDIHITVSEGASLELRCNYSYGATPYLFWYVQSPGQGLQLLLKYFSGDTLVQGIKGFEAEFKRSQSSFNLRKPSVHWSDAAEYFCAVGASGTYKYIFGTGTRLKVLAN SEQ ID NO:64 (TCR 129_5 Vβ)DAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSLALSYEQYFGPGTRLTVT SEQ ID NO:65 - CD8α ( 智人， UniProt 登錄 P01732 ，信號肽用下劃線表示 ) MALPVTALLLPLALLLHAARPSQFRVSPLDRTWNLGETVELKCQVLLSNPTSGCSWLFQPRGAAASPTFLLYLSQNKPKAAEGLDTQRFSGKRLGDTFVLTLSDFRRENEGYYFCSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV SEQ ID NO:66 - CD8β ( 智人， UniProt 登錄 P10966 ，信號肽用下劃線表示 ) MRPRLWLLLAAQLTVLHGNSVLQQTPAYIKVQTNKMVMLSCEAKISLSNMRIYWLRQRQAPSSDSHHEFLALWDSAKGTIHGEEVEQEKIAVFRDASRFILNLTSVKPEDSGIYFCMIVGSPELTFGKGTQLSVVDFLPTTAQPTKKSTLKKRVCRLPRPETQKGPLCSPITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCCRRRRARLRFMKQFYK SEQ ID NO:67 -[ 保留 ] SEQ ID NO:68 -[ 保留 ] SEQ ID NO:69 - 經工程化以包括蘇胺酸 - 至 - 半胱胺酸及 LVL 突變的 TCR Cα 胺基酸序列NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO:70 -- TRBC1 胺基酸序列 (UniProt KB P01850)EDLNKVFPPEV AVFEPSEAEI SHTQKATLVC LATGFFPDHV ELSWWVNGKE VHSGVSTDPQ PLKEQPALND SRYCLSSRLR VSATFWQNPR NHFRCQVQFY GLSENDEWTQ DRAKPVTQIV SAEAWGRADC GFTSVSYQQG VLSATILYEI LLGKATLYAV LVSALVLMAM VKRKDF SEQ ID NO:71 -- TRBC1 胺基酸序列 ( 經 cys 修飾 )EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF SEQ ID NO:72 - TRBC2 胺基酸序列 (UniProt KB A0A5B9)EDLKNVFPPKV AVFEPSEAEI SHTQKATLVC LATGFYPDHV ELSWWVNGKE VHSGVSTDPQ PLKEQPALND SRYCLSSRLR VSATFWQNPR NHFRCQVQFY GLSENDEWTQ DRAKPVTQIV SAEAWGRADC GFTSESYQQG VLSATILYEI LLGKATLYAV LVSALVLMAM VKRKDSRG SEQ ID NO:73 - TRBC2 胺基酸序列 ( 經 cys 修飾 )EDLKNVFPPKV AVFEPSEAEI SHTQKATLVC LATGFYPDHV ELSWWVNGKE VHSGVCTDPQ PLKEQPALND SRYCLSSRLR VSATFWQNPR NHFRCQVQFY GLSENDEWTQ DRAKPVTQIV SAEAWGRADC GFTSESYQQG VLSATILYEI LLGKATLYAV LVSALVLMAM VKRKDSRG (SEQ ID NO:74) 具有 N 端 GSG 連接子之豬捷申病毒 -1 2A (P2A)自裂解肽 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO:75) 東亞細亞病毒 2A (T2A) 自裂解肽LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR (SEQ ID NO:76) 馬鼻炎 A 型病毒 (ERAV) 2A (E2A) 自裂解肽QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:77) 具有 N 端 G-S-G 連接子之 口蹄疫病毒 2A (F2A) 自裂解肽GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO:78) NRAS (Uniprot KB P01111)MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLLDILDTAG QEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNSKSF ADINLYREQI KRVKDSDDVP MVLVGNKCDL PTRTVDTKQA HELAKSYGIP FIETSAKTRQ GVEDAFYTLV REIRQYRMKK LNSSDDGTQG CMGLPCVVM (SEQ ID NO:79) HRAS (Uniprot KB P01112)MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLLDILDTAG QEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHQYREQI KRVKDSDDVP MVLVGNKCDL AARTVESRQA QDLARSYGIP YIETSAKTRQ GVEDAFYTLV REIRQHKLRK LNPPDESGPG CMSCKCVLS (SEQ ID NO: 80)    Fas-41BB 融合物 ( 胺基酸 )MLGIWTLLPLVLTSVARLSSKSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSSKCRRCRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCTKCEHGIIKECTLTSNTKCKEEGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 81) 含 FAS 細胞外域之片段MLGIWTLLPLVLTSVARLSSKSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSSKCRRCRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCTKCEHGIIKECTLTSNTKCKEEGSRSN (SEQ ID NO: 82) 含 41BB 細胞內域之片段LCLLLLPIPLIVWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 83)  FAS-41BB 融合物 ( 核苷酸編碼序列 )ATGCTGGGCATCTGGACCCTGCTGCCCTTGGTGCTGACTAGCGTGGCTAGACTGAGCAGCAAGAGCGTGAACGCCCAAGTGACCGACATCAACAGCAAGGGCCTGGAGCTGAGAAAGACCGTGACCACCGTGGAGACACAGAACCTGGAGGGCCTGCACCACGACGGGCAGTTCTGCCACAAGCCCTGCCCCCCCGGCGAGAGAAAGGCTAGAGACTGCACCGTGAACGGCGACGAGCCCGACTGCGTGCCCTGCCAAGAGGGCAAGGAGTACACCGACAAGGCCCACTTCAGCAGCAAGTGCAGAAGATGCAGACTGTGCGACGAGGGCCACGGCCTGGAGGTGGAGATCAACTGCACGCGTACGCAGAATACCAAATGCCGCTGCAAGCCCAACTTCTTCTGCAACAGCACCGTGTGCGAGCACTGCGACCCCTGCACCAAGTGCGAGCACGGCATCATCAAGGAGTGCACCCTGACAAGCAACACCAAGTGTAAGGAAGAGGGCTCACGGAGCAACCTGGGCTGGCTGTGCCTGCTGCTGCTGCCCATCCCCCTGATCGTGTGGGTGAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAAGAGGAGGACGGGTGCAGCTGTAGATTCCCCGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGTGAGCTT 表 2 ：本文所描述之多肽及核酸組分的額外序列
SEQ ID NO 目標 序列( 胺基酸或DNA)
84 KRAS LVVVGAAGV
85 KRAS LLVVGAAGV
86 KRAS LMVVGAAGV
87 KRAS LVVVGACGV
88 KRAS LLVVGACGV
   89 KRAS LMVVGACGV
90 KRAS LVVVGAVGV
91 KRAS LLVVGAVGV
92 KRAS LMVVGAVGV
93 PIK3CA GLKDLLNPI
94 PIK3CA GLKDLLNPV
95 PIK3CA GMKDLLNPV
96 PIK3CA ILNREIDFA
97 PIK3CA ILNREIDFV
98 PIK3CA IMNREIDFV
99 PIK3CA ILNREIDFL
100 PIK3CA HAGLSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSEITEQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKW
101 PIK3CA HAGLSNRLARDNELRENDKEQLKAI STRDPLSKITEQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKW
102 PIK3CA LSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSEITEQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKWNSR
103 PIK3CA LSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSEITKQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKWNSR
104 PIK3CA KTLALDKTEQEALEYFMKQMNDAHHGGWTTKMDWIFHTIKQHALN
105 PIK3CA KTLALDKTEQEALEYFMKQMNDARHGGWTTKMDWIFHTIKQHALN
106 PIK3CA KTLALDKTEQEALEYFMKQMNDALHGGWTTKMDWIFHTIKQHALN
107 PIK3CA DSAIYN
108 PIK3CA IQSSQRE
109 PIK3CA CAVKGSDDYKLSF
110 PIK3CA KGHSH
111 PIK3CA KGHSH
112 PIK3CA CASSPVNLAGVSRADTQYF
113 PIK3CA METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVKGSDDYKLSFGAGTTVTVRA
114 PIK3CA    METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVKGSDDYKLSFGAGTTVTVRANIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
115 PIK3CA    MDTRVLCCAVICLLGAGLSNAGVMQNPRHLVRRRGQEARLRCSPMKGHSHVYWYRQLPEEGLKFMVYLQKENIIDESGMPKERFSAEFPKEGPSILRIQQVVRGDSAAYFCASSPVNLAGVSRADTQYFGPGTRLTVL
116 PIK3CA MDTRVLCCAVICLLGAGLSNAGVMQNPRHLVRRRGQEARLRCSPMKGHSHVYWYRQLPEEGLKFMVYLQKENIIDESGMPKERFSAEFPKEGPSILRIQQVVRGDSAAYFCASSPVNLAGVSRADTQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
117 PIK3CA TSGFNG
118 PIK3CA NVLDGL
119 PIK3CA CAVTSWGKLQF
120 PIK3CA SGHTA
121 PIK3CA FQGNSA
122 PIK3CA CASSPRGYQPQHF
123 PIK3CA MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNGLFWYQQHAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYLCAVTSWGKLQFKLQFGAGTQVVVTP
124 PIK3CA MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNGLFWYQQHAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYLCAVTSWGKLQFKLQFGAGTQVVVTPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
125 PIK3CA MGTRLLFWVAFCLLGAYHTGAGVSQSPSNKVTEKGKDVELRCDPISGHTALYWYRQRLGQGLEFLIYFQGNSAPDKSGLPSDRFSAERTGESVSTLTIQRTQQEDSAVYLCASSPRGYQPQHFGDGTRLSIL
126 PIK3CA MGTRLLFWVAFCLLGAYHTGAGVSQSPSNKVTEKGKDVELRCDPISGHTALYWYRQRLGQGLEFLIYFQGNSAPDKSGLPSDRFSAERTGESVSTLTIQRTQQEDSAVYLCASSPRGYQPQHFGDGTRLSILEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
127 PIK3CA TSDQSYG
128 PIK3CA QGSYDEQN
129 PIK3CA CAMREVLDNTDKLIF
130 PIK3CA KGHSH
131 PIK3CA LQKENI
132 PIK3CA CASSPPEAGLDTEAFF
133 PIK3CA MSLSSLLKVVTASLWLGPGIAQKITQTQPGMFVQEKEAVTLDCTYDTSDQSYGLFWYKQPSSGEMIFLIYQGSYDEQNATEGRYSLNFQKARKSANLVISASQLGDSAMYFCAMREVLDNTDKLIFGTGTRLQVFP
134 PIK3CA MSLSSLLKVVTASLWLGPGIAQKITQTQPGMFVQEKEAVTLDCTYDTSDQSYGLFWYKQPSSGEMIFLIYQGSYDEQNATEGRYSLNFQKARKSANLVISASQLGDSAMYFCAMREVLDNTDKLIFGTGTRLQVFPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
135 PIK3CA MDTRVLCCAVICLLGAGLSNAGVMQNPRHLVRRRGQEARLRCSPMKGHSHVYWYRQLPEEGLKFMVYLQKENIIDESGMPKERFSAEFPKEGPSILRIQQVVRGDSAAYFCASSPPEAGLDTEAFFGQGTRLTVV
136 PIK3CA MDTRVLCCAVICLLGAGLSNAGVMQNPRHLVRRRGQEARLRCSPMKGHSHVYWYRQLPEEGLKFMVYLQKENIIDESGMPKERFSAEFPKEGPSILRIQQVVRGDSAAYFCASSPPEAGLDTEAFFGQGTRLTVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
137 PIK3CA NSAFQY
138 PIK3CA TYSSGN
139 PIK3CA CAMNSGGYQKVTF
140 PIK3CA DFQATT
141 PIK3CA SNEGSKA
142 PIK3CA CSAREQGPLEEQYF
143 PIK3CA MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMNSGGYQKVTFGIGTKLQVIP
144 PIK3CA MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMNSGGYQKVTFIFTKLQVIPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
145 PIK3CA MLLLLLLLGPAGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSACSAREQGPLEEQYFGPGTRLTVT
146 PIK3CA MLLLLLLLGPAGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSACSAREQGPLEEQYFGPGTRLTVTEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
147 PIK3CA TISGNEY
148 PIK3CA GLKNN
149 PIK3CA CIVRVAGSARQLTF
150 PIK3CA SGHDT
151 PIK3CA YYEEEE
152 PIK3CA CASSFGTATYEQYF
153 PIK3CA MRLVARVTVFLTFGTIIDAKTTQPPSMDCAEGRAANLPCNHSTISGNEYVYWYRQIHSQGPQYIIHGLKNNETNEMASLIITEDRKSSTLILPHATLRDTAVYYCIVRVAGSARQLTFGSGTQLTVLP
154 PIK3CA MRLVARVTVFLTFGTIIDAKTTQPPSMDCAEGRAANLPCNHSTISGNEYVYWYRQIHSQGPQYIIHGLKNNETNEMASLIITEDRKSSTLILPHATLRDTAVYYCIVRVAGSARQLTFGSGTQLTVLPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
155 PIK3CA MGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSFGTATYEQYFGPGTRLTVT
156 PIK3CA MGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSFGTATYEQYFGPGTRLTVTEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
157 PIK3CA DSASNY
158 PIK3CA IRSNVGE
159 PIK3CA CAASIPGTASKLTF
160 PIK3CA MNHEY
161 PIK3CA SMNVEV
162 PIK3CA CASSPYRQGSYGYTF
163 PIK3CA MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASIPGTASKLTFGTGTRLQVTL
164 PIK3CA MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAASIPGTASKLTFGTGTRLQVTLNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCSATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
165 PIK3CA MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSPYRQGSYGYTFGSGTRLTVV
166 PIK3CA MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSPYRQGSYGYTFGSGTRLTVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
167 PIK3CA NTAFDY
168 PIK3CA IRPDVSE
169 PIK3CA CAASTGNFNKFYF
170 PIK3CA SGHNS
171 PIK3CA FNNNVP
172 PIK3CA CASNRQGTVTEAFF
173 PIK3CA MDKILGASFLVLWLQLCWVSGQQKEKSDQQQVKQSPQSLIVQKGGISIINCAYENTAFDYFPWYQQFPGKGPALLIAIRPDVSEKKEGRFTISFNKSAKQFSLHIMDSQPGDSATYFCAASTGNFNKFYFGSGTKLNVKP
174 PIK3CA MDKILGASFLVLWLQLCWVSGQQKEKSDQQQVKQSPQSLIVQKGGISIINCAYENTAFDYFPWYQQFPGKGPALLIAIRPDVSEKKEGRFTISFNKSAKQFSLHIMDSQPGDSATYFCAASTGNFNKFYFGSGTKLNVKPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
175 PIK3CA MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASNRQGTVTEAFFGQGTRLTVV
176 PIK3CA MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASNRQGTVTEAFFGQGTRLTVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
177 P53 KTYPVQLWV
178 P53 KLYPVQLWV
179 P53 KMYPVQLWV
180 P53 KMYPVQLWL
181 P53 KLYPVQLWI
182 P53 GLAPPQLLI
183 P53 GLAPPQLLV
184 P53 GMAPPQLLV
185 P53 GLAPPQYLI
186 P53 GLAPPQYLV
187 P53 GMAPPQYLV
188 P53 ALNNMFCQL
189 P53 ALNNMFCQV
190 P53 ANINNMFCQV
191 P53 NMFCQLAKT
192 P53 NLFCQLAKV
193 P53 QLWVDSTPL
194 P53 QLWVDSTPI
195 P53 QLWVDSTPV
196 P53 RLILTIITL
197 P53 RLILTIITV
198 P53 YQGSYGFLL
199 P53 YQGSYGFLI
200 P53 YQGSYGFLV
201 P53 SVTCTYFPA
202 P53 SMTCTYFPL
203 P53 SLTCTYFPV
204 P53 SMTCTYFPV
205 P53 SLTCTYFPL
206 P53 SMTCTYFPI
207 P53 LLGRNSFEM
208 P53 LLGRNSFEL
209 P53 LLGRNSFEI
210 P53 LLGRNSFEV
211 P53 VVPCEPPEV
212 P53 VLPCEPPEV
213 P53 VMPCEPPEV
214 KRAS METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAPNDYKLSFGAGTTVTVRANIQNPDPAVYQLRDS
215 KRAS MGCRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSFSSDNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFE
216 KRAS METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDSNDYKLSFGAGTTVTVRANIQNPDPAVYQLRDS
217 KRAS MDIWLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVTKRGQDVALRCDPISGHVSLYWYRQALGQGPEFLTYFNYEAQQDKSGLPNDRFSAERPEGSISTLTIQRTEQRDSAMYRCASSWGGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFE
218 KRAS MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYRSDAGGTSYGKLTFGQGTILTVHPNIQNPDPAVYQLRDS
219 KRAS MSIGLLCWVLLCLLGAGSVETGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSSQSGHNTVSWYQQALGQGPQFIFQYYREEENGRGNFPPRFSGLQFPNYSSELNVNALELDDSALYLCASSPRTGGAGNTIYFGEGSWLTVVEDLNKVFPPEVAVFE
220 KRAS MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDIEVVNAGNMLTFGGGTRLMVKPHIQNPDPAVYQLRDS
221 KRAS MDIWLVCWVLLCLLGAGSVETGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSSQSGHNTVSWYQQALGQGPQFIFQYYREEENGRGNFPPRFSGLQFPNYSSELNVNALELDDSALYLCASTDRVRYEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFE
222 KRAS MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCAFLGSGNTGKLIFGQGTTLQVKPDIQNPDPAVYQLRDS
223 KRAS MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSAIRPSGGAFEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFE
224 KRAS MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAARATSGTYKYIFGTGTRLKVLANIQNPDPAVYQLRDS
225 KRAS MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKKSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSASFSRDIETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFE
226 KRAS MWGAFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNGLFWYQQHAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYLCAVRLGDAGNMLTFGGGTRLMVKPHIQNPDPAVYQLRDS
227 KRAS MGTRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVGRGMNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFE
228 KRAS MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIQLVKSGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCADNAGNMLTFGGGTRLMVKPHIQNPDPAVYQLRDS
229 KRAS MLLLLLLLGPAGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARDPGRNYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFE
230 KRAS MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIQLVKSGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCGDNAGNMLTFGGGTRLMVKPHIQNPDPAVYQLRDS
231 KRAS MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARDEDRPYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFE
232 KRAS MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLGSHVSVSEGALVLLRCNYSSSVPPYLFWYVQYPNQGLQLLLKYTSAATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCAVSDGGATNKLIFGTGTLLAVQPNIQNPDPAVYQLRDS
233 KRAS MGTRLLCCVVLCLLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSSGGRASFTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFE
234 KRAS MNYSPGLVSLILLLLGRTRGNSVTQMEGPVTLSEEAFLTINCTYTATGYPSLFWYVQYPGEGLQLLLKATKADDKGSNKGFEATYRKETTSFHLEKGSVQVSDSAVYFCALSDPNNQGGKLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDS
235 KRAS MGTRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWYKQDSKKFLKIMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASSQVRGTTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFE
236 KRAS MKKLLAMILWLQLDRLSGELKVEQNPLFLSMQEGKNYTIYCNYSTTSDRLYWYRQDPGKSLESLFVLLSNGAVKQEGRLMASLDTKARLSTLHITAAVHDLSATYFCAEPNTDKLIFGTGTRLQVFPNIQNPDPAVYQLRDS
237 KRAS MGPGLLHWMALCLLGTGHGDAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNHNVMYWYQQKSSQAPKLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLGDTAMYLCATNYDRGYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFE
238 KRAS MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVWATGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDS
239 KRAS MGPGLLHWMALCLLGTGHGDAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNHNVMYWYQQKSSQAPKLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLGDTAMYLCATSFDRGYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFE
240 KRAS MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNSASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSATYLCVVNERNSGYALNFGKGTSLLVTPHIQNPDPAVYQLRDS
241 KRAS MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSGPDSNQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFE
242 KRAS MLLEHLLIILWMQLTWVSGQQLNQSPQSMFIQEGEDVSMNCTSSSIFNTWLWYKQEPGEGPVLLIALYKAGELTSNGRLTAQFGITRKDSFLNISASIPSDVGIYFCAGQLRYGGATNKLIFGTGTLLAVQPNIQNPDPAVYQLRDS
243 KRAS MGCRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIHYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVGGASYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFE
244 KRAS MRQVARVIVFLTLSTLSLAKTTQPISMDSYEGQEVNITCSHNNIATNDYITWYQQFPSQGPRFIIQGYKTKVTNEVASLFIPADRKSSTLSLPRVSLSDTAVYYCLVGPTYNQGGKLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDS
245 KRAS MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKKSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARTAEVELFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFE
246 KRAS MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAVASWGSGSARQLTFGSGTQLTVLPDIQNPDPAVYQLRDS
247 KRAS MGTRLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSLDAGYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFE
248 KRAS METVLQVLLGILGFQAAWVSSQELEQSPQSLIVQEGKNLTINCTSSKTLYGLYWYKQKYGEGLIFLMMLQKGGEEKSHEKITAKLDEKKQQSSLHITASQPSHAGIYLCGADMLDYQKVTFGIGTKLQVIPNIQNPDPAVYQLRDS
249 KRAS MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHDYLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASRRGGSEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFE
250 KRAS MSLSSLLKVVTASLWLGPGIAQKITQTQPGMFVQEKEAVTLDCTYDTSDPSYGLFWYKQPSSGEMIFLIYQGSYDQQNATEGRYSLNFQKARKSANLVISASQLGDSAMYFCAMREGQDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPDPAVYQLRDS
251 KRAS MGTRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVLGPNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFE
252 KRAS MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSNAGGTSYGKLTFGQGTILTVHPNIQNPDPAVYQLRDS
253 KRAS MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSRRLPPPYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFE
254 KRAS MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSESSNTGKLIFGQGTTLQVKPDIQNPDPAVYQLRDS
255 KRAS MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLRQIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSRREPPPYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFE
256 KRAS MSLSSLLKVVTASLWLGPGIAQKITQTQPGMFVQEKEAVTLDCTYDTSDPSYGLFWYKQPSSGEMIFLIYQGSYDQQNATEGRYSLNFQKARKSANLVISASQLGDSAMYFCAMREIRDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPDPAVYQLRDS
257 KRAS MGTRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQHYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSPAGPNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFE
258 RAS/ P53 gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggcggtgtactactgcgcaagagccgagatgggagccgtattcgacatatggggtcagggtacaatggtcaccgtctcctca
259 RAS/ P53 caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcgtatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggcggtgtactactgcgccagagacggtacttatctaggtggtctctggtacttcgacttatgggggagaggtaccttggtcaccgtctcctca
260 RAS/ P53 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctggtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggcggtgtactactgcgccagagagagttggccaatggacgtatggggccagggaacaactgtcaccgtctcctca
261 RAS/ P53 cagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagcagtagtagttactactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctcctatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagttctgtgaccgccgcagacacggcggtgtactactgcgccagaggcaggggatatgcaaccagcttagccttcgatatctggggtcagggtacaatggtcaccgtctcctca
262 RAS/ P53 gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatagcatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtttcaaccattagtagtagtagtagtaccatatactacgcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggcggtgtactactgcgccagaggttctcaggagcacctgattttcgattattggggacagggtacattggtcaccgtctcctca
263 RAS/ P53 caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcgtatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggcggtgtactactgcgccagaactgacttctggagcggatcccctccaggcttagattactggggacagggtacattggtcaccgtctcctca
264 RAS/ P53 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggcaccttcagcagctatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagggatcatccctatctttggtacagcaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacgaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggcggtgtactactgcgccagaactcctgaatactcctccagcatatggcactattactacggcatggacgtatggggccagggaacaactgtcaccgtctcctca
265 RAS/ P53 caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcgtatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggcggtgtactactgcgtcaaggggccgttgcaggagccgccatacgattatggaatggacgtatggggccagggaacaactgtcaccgtctcctca
266 RAS/ P53 gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcaggtacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagagaatctcctggcctttcacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaa
267 RAS/ P53 gatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagtaatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcagggactcggcctccctctcacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaa
268 RAS/ P53 gaaatagtgatgacgcagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtacgccgcctaccctacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaa
269 RAS/ P53 gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagagacacgtctggcctcctacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaa
270 RAS/ P53 gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcaggtacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagagattctactacccttggacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaa
271 RAS/ P53 gacatccagttgacccagtctccatcttccgtgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtattagcagctggttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatggtgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcagcagatatacaccttccctttcacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaa
272 RAS/ P53 gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagccagagtgttttatacagctccaacaataagaactacttagcttggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttactgggcatctacccgggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcagttcgcccacactcctttcacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaa
273 RAS/ P53 gaaatagtgatgacgcagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatagcgcatccaccagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcaccacgtctggcctctcacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaa
274 RAS/ P53 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAEMGAVFDIWGQGTMVTVSS
275 RAS/ P53 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGTYLGGLWYFDLWGRGTLVTVSS
276 RAS/ P53 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPGGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARESWPMDVWGQGTTVTVSS
277 RAS/ P53 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGRGYATSLAFDIWGQGTMVTVSS
278 RAS/ P53 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSTISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSQEHLIFDYWGQGTLVTVSS
279 RAS/ P53 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTDFWSGSPPGLDYWGQGTLVTVSS
280 RAS/ P53 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTPEYSSSIWHYYYGMDVWGQGTTVTVSS
281 RAS/ P53 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKGPLQEPPYDYGMDVWGQGTTVTVSS
282 RAS/ P53 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRISWPFTFGGGTKVEIK
283 RAS/ P53 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLGLPLTFGGGTKVEIK
284 RAS/ P53 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYAAYPTFGGGTKVEIK
285 RAS/ P53 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRHVWPPTFGGGTKVEIK
286 RAS/ P53 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRFYYPWTFGGGTKVEIK
287 RAS/ P53 DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQIYTFPFTFGGGTKVEIK
288 RAS/ P53 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQFAHTPFTFGGGTKVEIK
289 RAS/ P53 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYSASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQHHVWPLTFGGGTKVEIK
290 RAS/ P53 caggtgcagctgcaggaatccggaccggggctggtgaagcccagcgagactctgagtctcacgtgtacagtttctggaggtagcattagctcctactattggtcatggataaggcagccccccgggaagggattggaatggatcggctatatttactacagtgggagcaccaattacaacccctcactgaagtctagagttacaatcagcgttgacacctcaaagaatcagttcagtttgaaattgtctagcgtcacagcagctgatacagccgtctattattgtgtttctctggtctattgcggtggggattgttacagtggctttgactattgggggcagggtactctggttacagtttcttcc
291 RAS/ P53 caggtacagctgcaggaatctgggcccggacttgtcaagccaagtcagacactttctcttacatgtaccgtgagcggcggaagtataagcagtggaggcttttactggtcttggatacggcagcacccaggcaaaggcttggagtggattggatacattcatcattcaggatctacacactataatccatcccttaagtcccgggtcaccattagcattgatacgtctaagaatctgttcagtctcaggctgtcctccgtcactgctgccgacacagccgtgtactactgcgcctccttggtttactgcggaggcgactgttatagcggctttgattattgggggcaggggaccctcgtaaccgtgagctct
292 RAS/ P53 caggtccaactggtgcagtccggagccgaagtcaagaaaccaggtgcctccgttaaagtgagttgcaaagtctctggatacactctgaccgagctctctatgcactgggtccggcaggcccccggcaagggattggaatggatgggcgggttcgatcctgaggacggagagactatctacgctcaaaaattccagggacgagtgactgtgaccgaagacactagtaccgacactgcctacatggaactttcctctctgcgatcagaagataccgcagtgtactactgtgctactgaatctaggggcattggatggccctacttcgattactggggtcagggaactctggtgactgtctccagc
293 RAS/ P53 caggtccagttggtcgaaagtggcggtggtgtagtgcagccgggccgcagtttgaggctttcctgtgcggcttcaggctttactttttccagctatggaatgcactgggtgcggcaggcccccggcaaaggacttgagtgggtggccgtcatttcttatgacggatcagataagtactacgtggacagcgtcaagggcagattcaccatctctagggacaacagtaaaaatagactctacctccagatgaatagcctcagagctgaagacacggccgtctactattgtgctcgggagcggtatagtggcagagactactgggggcagggcacactcgttacagtgagtagc
294 RAS/ P53 gacatccagttgacacagagcccgagttccttgtccgcctccgtcggggatagagtgtcatttacctgtcaggcctctcaggatattaataactttctgaattggtatcagcaaaagcccggaaaggcacccaagctgttgatttacgacgccagtaacctggagacaggcgtgccctcccggtttagtggtagcggaagcggtacggattttacctttactatcagctctctccaacccgaagacattgcaacctactattgtcaacaatatggaaacctgccttttacatttggcggcggcaccaaggtggagattaagcgg
295 RAS/ P53 gatatccagctcactcaaagcccctctagtctctctgcctcagtgggggatcgggtcagttttacttgtcaagcttcacaggatatcaacaacttccttaattggtatcagcagaagccaggaaaagcacccaagctgctcatctatgatgcctcaaatttggagacgggtgttcccagtcgattctctgggtcagggtccgggaccgactttacgtttacgatctcctctctgcagcccgaagacatcgccacatactattgtcaacagtacggcaacttgcctttcacatttgggggcgggactaaggttgaaatcaagagg
296 RAS/ P53 gatattcagatgactcaatctccttcttctctgtccgcttccgtgggcgatagagtgaccattacttgtagggcgtcccagtcaatctccagttatttgaattggtatcagcagaagcccgggaaagcacctaagctgttgatcagcggggcttctagcctgaagagtggggtaccttcacggttcagcggaagcggaagcggaaccgatttcaccctgactatcagcagcctgccacctgaggactttgcaacttactactgccaacagtcatacagcactccgatcactttcggccagggcacccggctcgaaatcaagcgc
297 RAS/ P53 gagattgttatgacccagagtcctgcgaccctctcagtcagccccggggagcgcgcaactttgtcttgcagagctagtcagtccgtgtcctctcttctgacatggtaccagcaaaagcccgggcaggctccgcgccttttgatctttggggcttcaacaagagccactgggattcccgcacgattctctggctccgggagcggtactggtttcaccctgacgattagcagtctccagagcgaggacttcgccgtatactactgccagcagtacgatacgtggccattcacttttggaccagggactaaagtggattttaagcgc
298 RAS/ P53 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVSLVYCGGDCYSGFDYWGQGTLVTVSS
299 RAS/ P53 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGFYWSWIRQHPGKGLEWIGYIHHSGSTHYNPSLKSRVTISIDTSKNLFSLRLSSVTAADTAVYYCASLVYCGGDCYSGFDYWGQGTLVTVSS
300 RAS/ P53 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTVTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATESRGIGWPYFDYWGQGTLVTVSS
301 RAS/ P53 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKYYVDSVKGRFTISRDNSKNRLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERYSGRDYWGQGTLVTVSS
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303 RAS/ P53 DIQLTQSPSSLSASVGDRVSFTCQASQDINNFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGNLPFTFGGGTKVEIKR
304 RAS/ P53 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLISGASSLKSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLPPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIKR
305 RAS/ P53 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSLLTWYQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTGFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDTWPFTFGPGTKVDFKR
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307 RAS/P53/PIK3CA ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg
308 RAS/P53/PIK3CA tctctcatatggatggtggaattactcaatccccaa
309 RAS/P53/PIK3CA tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc
310 RAS/P53/PIK3CA MEKMLECAFIVLWLQLGWLSGEDQVTQSPEALRLQEGESSSLNCSYTVSGLRGLFWYRQDPGKGPEFLFTLYSAGEEKEKERLKATLTKKESFLHITAPKPEDSATYLCAVQGENSGYSTLTFGKGTMLLVSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
311 RAS/P53/PIK3CA MEKMLECAFIVLWLQLGWLSG
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313 RAS/P53/PIK3CA VSGLRG
314 RAS/P53/PIK3CA LYS
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320 RAS/P53/PIK3CA MNHEY
321 RAS/P53/PIK3CA SMNVEV
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323 RAS/P53/PIK3CA YNEQFFGPGTRLTVL
324 RAS/P53/PIK3CA EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
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358 RAS/P53 atccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc
359 RAS/P53 atccagaaccctgatcctgccgtgtaccagctgcgggatagcaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcccagagcaaggactccgacgtgtacatcaccgataagtgcgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaactccgccgtggcctggtccaacaagtccgatttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcattatccccgaggacacattcttcccaagcagcgacgtgccctgcgacgtgaagctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctgagcgtgatcggcttcagaatcctgctgctgaaagtggccggctttaacctgctgatgaccctgcggctgtggtccagc
360 RAS/P53 atccagaaccctgatcctgccgtgtaccagctgcgggatagcaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcccagagcaaggactccgacgtgtacatcaccgataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaactccgccgtggcctggtccaacaagtccgatttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcattatccccgaggacacattcttcccaagccccgagagcagctgcgacgtgaagctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctgagcgtgatcggcttcagaatcctgctgctgaaagtggccggctttaacctgctgatgaccctgcggctgtggtccagc
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369 RAS/P53 atccagaaccctgaacctgccgtgtaccagctgaaggaccccagaagccaggacagcaccctgtgcctgttcaccgacttcgacagccagatcaacgtgcccaagacaatggaaagcggcaccttcatcaccgacaagaccgtgctggacatgaaggctatggacagcaagagcaacggcgccattgcctggtccaaccagaccagcttcacatgccaggacatcttcaaagagacaaacgccacctacccctccagcgacgtgccctgtgacgccaccctgaccgagaagtccttcgagacagacatgaacctcaacttccagaacctgagcgtgatgggcctgcgaatcctgctgctgaaagtggccggcttcaacctgctgatgaccctgcggctgtggtccagc
370 RAS/P53 gtgcaggaccctgaccctagcgtgtaccagatgagaagccccaagaccggcaggaccgtgtgcctgttcaccgacttcgacagccaggccgacttccagaagcctgagggggccaccgtgatctccctgaacagcaccgtgctggacatgaaagtgatggacagcaagagcaacggcgctctgacctggaacagcgagacaaacatcgagtgcaaagagaacttccagcagcccttctaccccagcagcaactactcctgcgacgccaagctgatcgagaagtccttcgagacagacatggacctgaacttctacaacctgctggtcatcggcctgagaatcctgctgctgaaagtgatcggcttcaacctgttcatgaccctgaggctgtggtcctgc
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374 RAS/P53 gaggacctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttcgagcctagcgaggccgagatcagccacacccagaaagccaccctcgtgtgcctggctaccggcttctaccccgaccatgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtgtgtaccgacccccagccactgaaagaacagcccgccctgaacgacagccggtactgcctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacccagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgcggctttaccagcgagagctaccagcagggcgtgctgagcgccaccatcctgtacgagatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgccctggtgctgatggctatggtcaagcggaaggacagccgggga
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411 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSSDSSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
412 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCGTQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
413 RAS/P53 IQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
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417 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
418 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
419 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSKAEIAHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
420 RAS/P53 DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
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432 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSGLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
433 RAS/P53 EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRACGITSSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
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435 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
436 RAS/P53 GCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALG SHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSRLRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA
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438 RAS/P53 TPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPV
439 RAS/P53 DKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDIIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGIDQEIIFPPIKTDVTTVDPKYNYSKDANDVITMDPKDNWSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLGRTAFCCNGEKS
440 RAS/P53 DKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
441 RAS/P53 SQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
442 RAS/P53 SQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
443 RAS/P53 IQNPDPAVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
444 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSRAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
445 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSRAEIAHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
446 RAS/P53 atccagaaccctgatcctgccgtgtaccagctgcgggattgcaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcccagagcaaggactccgacgtgtacatcaccgataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaactccgccgtggcctggtccaacaagtccgatttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcattatccccgaggacacattcttcccaagccccgagagcagctgcgacgtgaagctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctgagcgtgatcggcttcagaatcctgctgctgaaagtggccggctttaacctgctgatgaccctgcggctgtggtccagc
447 RAS/P53 atccagaaccctgatcctgccgtgtaccagctgcgggatagcaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcccagagcaaggactccgacgtgtacatctgcgataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaactccgccgtggcctggtccaacaagtccgatttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcattatccccgaggacacattcttcccaagccccgagagcagctgcgacgtgaagctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctgagcgtgatcggcttcagaatcctgctgctgaaagtggccggctttaacctgctgatgaccctgcggctgtggtccagc
448 RAS/P53 gaggacctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttctgccctagcgaggccgagatcagccacacccagaaagccaccctcgtgtgcctggctaccggcttctaccccgaccatgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtgtctaccgacccccagccactgaaagaacagcccgccctgaacgacagccggtactgcctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacccagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgcggctttaccagcgagagctaccagcagggcgtgctgagcgccaccatcctgtacgagatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgccctggtgctgatggctatggtcaagcggaaggacagccgggga
449 RAS/P53 gaggacctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttcgagccttgcgaggccgagatcagccacacccagaaagccaccctcgtgtgcctggctaccggcttctaccccgaccatgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtgtctaccgacccccagccactgaaagaacagcccgccctgaacgacagccggtactgcctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacccagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgcggctttaccagcgagagctaccagcagggcgtgctgagcgccaccatcctgtacgagatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgccctggtgctgatggctatggtcaagcggaaggacagccgggga
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462 RAS/P53 gaggacctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttcgagcctagcaaggccgagatcgcccacacccagaaagccaccctcgtgtgcctggctaccggcttctaccccgaccatgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtgtgtaccgacccccagccactgaaagaacagcccgccctgaacgacagccggtactgcctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacccagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgcggatcccagagcttcggcctgctggaccccaagctgtgctacctgctggatggcatcctgttcatctacggcgtgatcctgaccgccctgttcctgagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccaactgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggcagggaccctgagatgggcggaaagccccagcggagaaagaacccccaggaaggactgtataacgaactccagaaagacaagatggccgaagcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggagaagaggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctatgacgccctgcacatgcaggccctgcctccaaga
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465 RAS/P53 gaggacctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttcgagccttgcgaggccgagatcagccacacccagaaagccaccctcgtgtgcctggctaccggcttctaccccgaccatgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtgtctaccgacccccagccactgaaagaacagcccgccctgaacgacagccggtactgcctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacccagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgcggatcccagagcttcggcctgctggaccccaagctgtgctacctgctggatggcatcctgttcatctacggcgtgatcctgaccgccctgttcctgaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccaactgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggcagggaccctgagatgggcggaaagccccagcggagaaagaacccccaggaaggactgtataacgaactccagaaagacaagatggccgaagcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggagaagaggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctatgacgccctgcacatgcaggccctgcctccaaga
466 RAS/P53 gaggacctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttcgagcctagcgaggccgagatcagccacacccagaaagccaccctcgtgtgcctggctaccggcttctaccccgaccatgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtgtctacctgcccccagccactgaaagaacagcccgccctgaacgacagccggtactgcctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacccagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgcggatcccagagcttcggcctgctggaccccaagctgtgctacctgctggatggcatcctgttcatctacggcgtgatcctgaccgccctgttcctgaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccaactgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggcagggaccctgagatgggcggaaagccccagcggagaaagaacccccaggaaggactgtataacgaactccagaaagacaagatggccgaagcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggagaagaggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctatgacgccctgcacatgcaggccctgcctccaaga
467 RAS/P53 gaggacctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttcgagcctagcgaggccgagatcagccacacccagaaagccaccctcgtgtgcctggctaccggcttctaccccgaccatgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtgtctaccgacccccagccactgaaagaacagcccgccctgaacgacagccggtactgcctgtgcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacccagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgcggatcccagagcttcggcctgctggaccccaagctgtgctacctgctggatggcatcctgttcatctacggcgtgatcctgaccgccctgttcctgaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccaactgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggcagggaccctgagatgggcggaaagccccagcggagaaagaacccccaggaaggactgtataacgaactccagaaagacaagatggccgaagcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggagaagaggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctatgacgccctgcacatgcaggccctgcctccaaga
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489 RAS/P53 IQNPDPAVCQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
490 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDCKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
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492 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFCPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
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494 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTCPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
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497 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSKAEIAHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADC
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499 RAS/P53 QSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFL
500 RAS/P53 QSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
501 RAS/P53 QSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
502 RAS/P53 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
503 RAS/P53 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
504 RAS/P53 KNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
505 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
506 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSKAEIAHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
507 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
508 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFCPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
509 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPCEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
510 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTCPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
511 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLCSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
512 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
513 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
514 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
515 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCGTQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
516 RAS/P53 IQNPDPAVCQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCGTQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
517 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDCKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCGTQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
518 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYICDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCGTQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
519 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCGTQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
520 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCGTQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
521 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCGTQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVQNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
522 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDCKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSSDVPCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
523 RAS/P53 IQNPDPAVYQLRDCKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSSDVPCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
524 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFCPSKAEIAHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
525 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFCPSKAEIAHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
526 RAS/P53 atccagaaccctgatcctgccgtgtaccagctgcgggattgcaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcccagagcaaggactccgacgtgtacatcaccgataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaactccgccgtggcctggtccaacaagtccgatttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcattatccccgaggacacattcttcccaagcagcgacgtgccctgcgacgtgaagctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctgagcgtgatcggcttcagaatcctgctgctgaaagtggccggctttaacctgctgatgaccctgcggctgtggtccagc
527 RAS/P53 atccagaaccctgatcctgccgtgtaccagctgcgggattgcaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgacagccagaccaacgtgtcccagagcaaggactccgacgtgtacatcaccgataagtgcgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaactccgccgtggcctggtccaacaagtccgatttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcattatccccgaggacacattcttcccaagcagcgacgtgccctgcgacgtgaagctggtggaaaagagcttcgagacagacaccaacctgaacttccagaacctgagcgtgatcggcttcagaatcctgctgctgaaagtggccggctttaacctgctgatgaccctgcggctgtggtccagc
528 RAS/P53 gaggacctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttctgccctagcaaggccgagatcgcccacacccagaaagccaccctcgtgtgcctggctaccggcttctaccccgaccatgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtgtctaccgacccccagccactgaaagaacagcccgccctgaacgacagccggtactgcctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacccagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgcggcatcaccagcgccagctaccaccagggcgtgctgagcgccaccatcctgtacgagatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgccctggtgctgatggctatggtcaagcggaaggacagccgggga
529 RAS/P53 gaggacctgaagaacgtgttcccacctgaggtggccgtgttctgccctagcaaggccgagatcgcccacacccagaaagccaccctcgtgtgcctggctaccggcttctaccccgaccatgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcacagcggcgtgtgtaccgacccccagccactgaaagaacagcccgccctgaacgacagccggtactgcctgagcagcagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttctacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacccagatcgtgtctgccgaagcctggggcagagccgattgcggcatcaccagcgccagctaccaccagggcgtgctgagcgccaccatcctgtacgagatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgccctggtgctgatggctatggtcaagcggaaggacagccgggga
530 RAS/P53 cagtctgtgctgacacagcctcctagtgtgtctggcgctcctggacagagagtgaccatcagctgtacaggcagcagcagcaatatcggagccggctatgacgtgcactggtatcagcagctgcctggcacagcccctaaactgctgatctacggcaacagcaacagacccagcggcgtgcccgatagattttccggctctaagagcggcacaagcgccagcctggctattactggactccaggccgaggacgaggccgactactactgtcagagctacgacagcagcctgagcggctctgtgtttggcacaggcacaaaggtgctggtgctt
531 RAS/P53 aacttcatgctgacccagcctcacagcgtgtccgagtctccaggcaagaccgtgaccatcagctgtacaggcagcagcggctctatcgccagcaactacgtgcagtggtatcagcagaggccaggcagcgcccctaccatcctgatctacgaggataacaagcggcctagcggcgtgcccgatagattttctggcagcatcgacagcagcagcaacagcgccagcctgacaatcagcggcctgaaaacaggcgacgaggccgactactactgccagagctacgacgacatcaaccactgggttttcggcggaggcaccaagctgacagttcttgga
532 RAS/P53 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGTGTKVLVL
533 RAS/P53 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTILIYEDNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTGDEADYYCQSYDDINHWVFGGGTKLTVLGQ
534 RAS/P53 SSNIGAGYD
535 RAS/P53 SGSIASNY
536 RAS/P53 GNSN
537 RAS/P53 EDNK
538 RAS/P53 QSYDSSLSGSV
539 RAS/P53 QSYDDINHWV
540 RAS/P53 caagttcagctggttcagagcggagccgaagtgaagaaacctggcagcagcgtgaaggtgtcctgcaaagcaagcggcggcaccttcagcagctacaccatcaacgtttggagacaggccccaggccagggccttgaatggatgggaggcttcatccctatcagcggcaccgtgaactacgcccagaaattccagggcagagtgacaatcaccgccgacgagagcacaagcaccgcctacatggaactgtccagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgtgccagacctctggattggaccgaggacatctggggccagggaacactggtcacagtgtctagt
541 RAS/P53 gaagttcagctggttcagagcggagccgaagtgaagaaacctggggcctctgtgaaggtgtcctgcaaggcttccggctacacctttaccgcctactacctgcactggctgagacaggctccaggccaaggactggaatggatgggctggatgaacaccaacaacggggccaccagatacgcccagaaattccaggacagagtgaccatgaccagagacaccagcatcaacaccgcctacatggaaatgagcggcctgtcctccgacgacaccgccatgtactattgtgccagaggcgacatcagccaggacttcgctgatgtgtggggccagggaacactggtcacagtgtcatct
542 RAS/P53 vH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYTINVWRQAPGQGLEWMGGFIPISGTVNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPLDWTEDIWGQGTLVTVSS
543 RAS/P53 vH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTAYYLHWLRQAPGQGLEWMGWMNTNNGATRYAQKFQDRVTMTRDTSINTAYMEMSGLSSDDTAMYYCARGDISQDFADVWGQGTLVTVSS
544 RAS/P53 GGTFSSYT
545 RAS/P53 GYTFTAYY
546 RAS/P53 FIPISGTV
547 RAS/P53 MNTNNGAT
548 RAS/P53 ARPLDWTEDI
549 RAS/P53 ARGDISQDFADV
550 RAS/P53 RASQDISKYLN
551 RAS/P53 SRLHSGV
552 RAS/P53 GNTLPYTFG
553 RAS/P53 DYGVS
554 RAS/P53 VIWGSETTYYNSALKS
555 RAS/P53 YAMDYWG
556 RAS/P53 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
557 RAS/P53 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
558 RAS/P53 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
559 RAS/P53 KASQNVGTNVA
560 RAS/P53RAS/P53 SATYRNS
561 RAS/P53 QQYNRYPYT
562 RAS/P53 SYWMN
563 RAS/P53 QIYPGDGDTNYNGKFKG
564 RAS/P53 KTISSVVDFYFDY
565 RAS/P53 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSS
566 RAS/P53 DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR
567 RAS/P53 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR
568 RAS/P53 HYYYGGSYAMDY
569 RAS/P53 HTSRLHS
570 RAS/P53 QQGNTLPYT
571 RAS/P53 gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc
572 PIK3CA DRGSQS
573 PIK3CA IYSNGD
574 PIK3CA CAGNTGTASKLTF
575 PIK3CA SGDLS
576 PIK3CA YYNGEE
577 PIK3CA CASSGLAGGPVSGANVLTF
578 PIK3CA MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAGNTGTASKLTFGTGTRLQVTL
579 PIK3CA MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAGNTGTASKLTFGTGTRLQVTLNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
580 PIK3CA MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSGLAGGPVSGANVLTFGAGSRLTVL
581 PIK3CA MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSGLAGGPVSGANVLTFGAGSRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
582 PIK3CA NIATNDY
583 PIK3CA GYKTK
584 PIK3CA CLVGGAYTGGFKTIF
585 PIK3CA SGHAT
586 PIK3CA FQNNGV
587 PIK3CA CASSLVAETYEQYF
588 PIK3CA MRQVARVIVFLTLSTLSLAKTTQPISMDSYEGQEVNITCSHNNIATNDYITWYQQFPSQGPRFIIQGYKTKVTNEVASLFIPADRKSSTLSLPRVSLSDTAVYYCLVGGAYTGGFKTIFGAGTRLFVKA
589 PIK3CA MRQVARVIVFLTLSTLSLAKTTQPISMDSYEGQEVNITCSHNNIATNDYITWYQQFPSQGPRFIIQGYKTKVTNEVASLFIPADRKSSTLSLPRVSLSDTAVYYCLVGGAYTGGFKTIFGAGTRLFVKANIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
590 PIK3CA MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSLVAETYEQYFGPGTRLTVT
591 PIK3CA MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSLVAETYEQYFGPGTRLTVTEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
592 PIK3CA ATGYPS
593 PIK3CA ATKADDK
594 PIK3CA CALTVGGSYIPTF
595 PIK3CA MGHRA
596 PIK3CA YSYEKL
597 PIK3CA CASSQGGQGWRETQYF
598 PIK3CA MNYSPGLVSLILLLLGRTRGDSVTQMEGPVTLSEEAFLTINCTYTATGYPSLFWYVQYPGEGLQLLLKATKADDKGSNKGFEATYRKETTSFHLEKGSVQVSDSAVYFCALTVGGSYIPTFGRGTSLIVHP
599 PIK3CA MNYSPGLVSLILLLLGRTRGDSVTQMEGPVTLSEEAFLTINCTYTATGYPSLFWYVQYPGEGLQLLLKATKADDKGSNKGFEATYRKETTSFHLEKGSVQVSDSAVYFCALTVGGSYIPTFGRGTSLIVHPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
600 PIK3CA MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSQGGQGWRETQYFGPGTRLLVL
601 PIK3CA MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSQGGQGWRETQYFGPGTRLLVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
602 PIK3CA NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
603 PIK3CA NIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
604 PIK3CA EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
605 PIK3CA EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
606 PIK3CA EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
607 RAS CAVSVGPGNTGKLIF
608 RAS CASSLGVLGLRYF
609 RAS CAENSGGSNYKLTF
610 RAS CASSWERAGKAFF
611 RAS CAMSVFIYSTFIF
612 RAS CASSGRQETQYF
613 RAS CATDAYTRQLTF
614 RAS CASGGPGANRPQHF
615 RAS CAYRSLWGSGYALNF
616 RAS CSVEKGAQETQYF
617 RAS CAALFGNEKLTF
618 RAS CATLQGWSYNEQFF
619 RAS CALSTGGFKTIF
620 RAS CSVLGPGTGGRGANYGYTF
621 RAS CATTIDGQKLLF
622 RAS CSASDRGSGELFF
623 RAS CATDAYNARLMF
624 RAS CSVVASGSVDTQYF
625 RAS CAGPAGAQKLVF
626 RAS CASSPVPYSGNTIYF
627 RAS CAVSKSDKIIF
628 RAS CATSEGGSTGTEAFF
629 RAS CALNRNTGNQFYF
630 RAS CASSIPQGNGYTF
631 RAS MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLGSHVSVSEGALVLLRCNYSSSVPPYLFWYVQYPNQGLQLLLKYTSAATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCAVSVGPGNTGKLIFGQGTTLQVKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
632 RAS MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSLGVLGLRYFGPGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
633 RAS MAGIRALFMYLWLQLDWVSRGESVGLHLPTLSVQEGDNSIINCAYSNSASDYFIWYKQESGKGPQFIIDIRSNMDKRQGQRVTVLLNKTVKHLSLQIAATQPGDSAVYFCAENSGGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
634 RAS MGPGLLCWVLLCLLGAGSVETGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSSQSGHNTVSWYQQALGQGPQFIFQYYREEENGRGNFPPRFSGLQFPNYSSELNVNALELDDSALYLCASSWERAGKAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
635 RAS MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYLCAMSVFIYSTFIFGSGTRLSVKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
636 RAS MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSGRQETQYFGPGTRLLVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
637 RAS METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDAYTRQLTFGSGTQLTVLPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
638 RAS MSNQVLCCVVLCLLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASGGPGANRPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
639 RAS MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYRSLWGSGYALNFGKGTSLLVTPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
640 RAS MLSLLLLLLGLGSVFSAVISQKPSRDICQRGTSLTIQCQVDSQVTMMFWYRQQPGQSLTLIATANQGSEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLCSVEKGAQETQYFGPGTRLLVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
641 RAS MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAALFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
642 RAS MGTRLLFWVAFCLLGADHTGAGVSQSPSNKVTEKGKDVELRCDPISGHTALYWYRQSLGQGLEFLIYFQGNSAPDKSGLPSDRFSAERTGGSVSTLTIQRTQQEDSAVYLCATLQGWSYNEQFFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
643 RAS MKPTLISVLVIIFILRGTRAQRVTQPEKLLSVFKGAPVELKCNYSYSGSPELFWYVQYSRQRLQLLLRHISRESIKGFTADLNKGETSFHLKKPFAQEEDSAMYYCALSTGGFKTIFGAGTRLFVKANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
644 RAS MLSLLLLLLGLGSVFSAVISQKPSRDICQRGTSLTIQCQVDSQVTMMFWYRQQPGQSLTLIATANQGSEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLCSVLGPGTGGRGANYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
645 RAS METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATTIDGQKLLFARGTMLKVDLNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
646 RAS MLLLLLLLGPAGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKKSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSASDRGSGELFFGEGSRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
647 RAS METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDAYNARLMFGDGTQLVVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
648 RAS MLSLLLLLLGLGSVFSAVISQKPSRDICQRGTSLTIQCQVDSQVTMMFWYRQQPGQSLTLIATANQGSEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLCSVVASGSVDTQYFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
649 RAS MVLKFSVSILWIQLAWVSTQLLEQSPQFLSIQEGENLTVYCNSSSVFSSLQWYRQEPGALEGPVLLVTVVTGGEVKKLKRLTFQFGDARKDSSLHITAAQPGDTGLYLCAGPAGAQKLVFGQGTRLTINPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
650 RAS MSISLLCCAAFPLLWAGPVNAGVTQTPKFRLKIGQSMTLQCTQDMNHNYMYWYRQDPGMGLKLIYYSVGAGITDKGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLELAAPSQTSVYFCASSPVPYSGNTIYFGEGSWLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
651 RAS MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLGSHVSVSEGALVLLRCNYSSSVPPYLFWYVQYPNQGLQLLLKYTSAATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCAVSKSDKIIFGKHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
652 RAS MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHDRMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYFCATSEGGSTGTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
653 RAS MNYSPGLVSLILLLLGRTRGNSVTQMEGPVTLSEEAFLTINCTYTATGYPSLFWYVQYPGEGLQLLLKATKADDKGSNKGFEATYRKETTSFHLEKGSVQVSDSAVYFCALNRNTGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
654 RAS MSNQVLCCVVLCLLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSIPQGNGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
655 RAS atgctcctgctgctcgtcccagtgctcgaggtgatttttaccctgggaggaaccagagcccagtcggtgacccagcttggcagccacgtctctgtctctgaaggagccctggttctgctgaggtgcaactactcatcgtctgttccaccatatctcttctggtatgtgcaataccccaaccaaggactccagcttctcctgaagtacacatcagcggccaccctggttaaaggcatcaacggttttgaggctgaatttaagaagagtgaaacctccttccacctgacgaaaccctcagcccatatgagcgacgcggctgagtacttctgtgctgtgagtgtaggtcctggcaacacaggcaaactaatctttgggcaagggacaactttacaagtaaaaccagatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaaggtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagcTAA
656 RAS atgggaatcaggctcctgtgtcgtgtggccttttgtttcctggctgtaggcctcgtagatgtgaaagtaacccagagctcgagatatctagtcaaaaggacgggagagaaagtttttctggaatgtgtccaggatatggaccatgaaaatatgttctggtatcgacaagacccaggtctggggctacggctgatctatttctcatatgatgttaaaatgaaagaaaaaggagatattcctgaggggtacagtgtctctagagagaagaaggagcgcttctccctgattctggagtccgccagcaccaaccagacatctatgtacctctgtgccagcagtttgggggttctaggcctgcggtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcacagaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttcTAA
657 RAS atggcaggcattcgagctttatttatgtacttgtggctgcagctggactgggtgagcagaggagagagtgtggggctgcatcttcctaccctgagtgtccaggagggtgacaactctattatcaactgtgcttattcaaacagcgcctcagactacttcatttggtacaagcaagaatctqqaaaaqqtcctcaattcattataqacattcqttcaaatatqqacaaaaqqcaaqqccaaagagtcaccgttttattgaataagacagtgaaacatctctctctgcaaattgcagctactcaacctggagactcagctgtctacttttgtgcagagaatagtggaggtagcaactataaactgacatttggaaaaggaactctcttaaccgtgaatccaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagcTAA
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719 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSKAEIAHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
720 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSGLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
721 RAS/P53 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGSQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
722 RAS/P53 GCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSRLRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA
723 RAS/P53 TPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA
724 RAS/P53 TPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPV
725 RAS/P53 DKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDIIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGIDQEIIFPPIKTDVTTVDPKYNYSKDANDVITMDPKDNWSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLGRTAFCCNGEKS
726 RAS/P53 DKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
727 RAS/P53 SQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
728 RAS/P53 SQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL
729 RAS/P53 KNQVEQSPQSLIILEGKNCTLQCNYTVSPFSNLRWYKQDTGRGPVSLTIMTFSENTKSNGRYTATLDADTKQSSLHITASQLSDSASYICVVSDRGSTLGRLYFGRGTQLTVWPD
730 RAS/P53 DIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSQYLCASSENIGTAYEQYFGPGTRLTV
731 RAS/P53 GVTQSPTHLIKTRGQQATLRCSPISGHTSVYWYQQALGLGLQFLLWYDEGEERNRGNFPPRFSGRQFPNYSSELNVNALELEDSALYLCASSLGGPRGLAGLRGDEQFFGPGTRLTVLE
732 RAS/P53 GVTQSPTHLIKTRGQQATLRCSPISGHTSVYWYQQALGLGLQFLLWYDEGEERNRGNFPPRFSGRQFPNYSSELNVNALELEDSALYLCASSLGGDELGADGNEQFFGPGTRLTVLE
733 RAS/P53 AQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYRSAVNARLMFGDGTQLVVKPN
734 RAS/P53 EADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDKMYWYQQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTSQYLCASSEARGLAEFTDTQYFGPGTRLTVLE
735 RAS/P53 QEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPY
736 RAS/P53 NAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVAIQTTDQGEVPNGYNVSRSTIEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYLGNTGELFFGEGSRLTVLE
737 RAS/P53 ILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCARNTGNQFYFGTGTSLTVIP
738 RAS/P53 GVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSFQTGASYGYTFGSGTRLTVLE
739 RAS/P53 AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDTLGMGGEYTDKLIFGKGTRVTVEPR
740 RAS/P53 AGHLEQPQISSTKTLSKTARLECVVSGITISATSVYWYRERPGEVIQFLVSISYDGTVRKESGIPSGKFEVDRIPETSTSTLTIHNVEKQDIATYYCALWEAQQELGKKIKVFGPGTKLIITDKQL
741 P53 QDVNTA
742 P53 SAS
743 P53 SAY
744 P53 QQYSRYSPVTF
745 P53 QQQSSTPVTF
746 P53 QQSSYYPNTF
747 P53 QQQWSSPDTF
748 P53 QQSNAYPITF
749 P53 GFNVYASGM
750 P53 GFNVYQSDM
751 P53 GFNLYQRDM
752 P53 GFNLSYYDM
753 P53 GFNLNSYYM
754 P53 KIYPDSDYTY
755 P53 TIWPYSGYTY
756 P53 GLLYGSDHTE
757 P53 LIYYGSGYTY
758 P53 MIIPGYGYTN
759 P53 SRDSSFYYVYAMDY
760 P53 SRDGMYAFDY
761 P53 SRATYEEAFDY
762 P53 SRGYVSGMDY
763 P53 SRSYYMYMDY
764 RAS QDVNTA
765 RAS SAS
766 RAS QQVIYYPFTF
767 RAS QQYDYYPFTF
768 RAS QQSIYYPFTF
769 RAS QQSSYSPWTF
770 RAS QQSFSTPITF
771 RAS QQGEYSPLTF
772 RAS QQTYYTPVTF
773 RAS GFNLYSYAI
774 RAS GFNISYEAM
775 RAS GFNLYTSQM
776 RAS GFNVFGYAI
777 RAS GFNISPWDM
778 RAS GFNISEYLM
779 RAS GFNVFESAM
780 RAS GFNISHYVM
781 RAS LLYPDYGVTS
782 RAS LIYPNHGITS
783 RAS LVYPGYYVTS
784 RAS EVYPGYDVTS
785 RAS QLYPSSGYTN
786 RAS LLPPGLSYTN
787 RAS WVYGSYDYTY
788 RAS DFYPHSDSTY
789 RAS SRYRSYEYSVSSYSYSAMDY
790 RAS SRYSSSAMDY
791 RAS SRGAYYYSSAMDY
792 RAS SRYSWAGAFDY
793 RAS SRSVYWSLDY
794 RAS SRYGYYAFDY
795 RAS SRSFAYFQAMDY
796 RAS SRYQSYSFDY
797 RAS QQASRQPYTF
798 RAS QQAVSYPWTF
799 RAS QQTSSYPITF
800 RAS QQSWYSPSTF
801 RAS QQSYYAPITF
802 RAS QQSYYSPWTF
803 RAS QQAYYPPWTF
804 RAS QQSYSSGPVTF
805 RAS QQTYYYPFTF
806 RAS QQSYYPYYPWTF
807 RAS QQYDRPITF
808 RAS GFNFSESGM
809 RAS GFNISSSGI
810 RAS GFNIYWYGM
811 RAS GFNISASGM
812 RAS GFNFSYYGM
813 RAS GFNISYSNI
814 RAS GFNVSRWAM
815 RAS GFNFSYGGI
816 RAS GFNLYAWGM
817 RAS GFNVSHSAM
818 RAS GFNIYYEAM
819 RAS HFSGDSGYTY
820 RAS MVYGGSGYTN
821 RAS QVYPWSGFTY
822 RAS WIWGGSSYTY
823 RAS WIYPFSGYTN
824 RAS MIYGTRGGTY
825 RAS RVYPSGYLTY
826 RAS MIYPLTGYTN
827 RAS LVYGGWGSTS
828 RAS TVHPDWGNTY
829 RAS QIYPWNDYTY
830 RAS SRYMYYSGYFDY
831 RAS SRWAHYSAYMDY
832 RAS SRDYYSYSLDY
833 RAS SRGQYLSYMDY
834 RAS SREYYSRAFDY
835 RAS SRYYSYAMDY
836 RAS SRNMQSYMDY
837 RAS SRDYYYSVDV
838 RAS SRAGSSKMSAGAFDY
839 RAS SRWQQYYYSFDY
840 RAS SRNYYAATMDY
841 RAS QQSYTSPLTF
842 RAS QQYWYYYPITF
843 RAS QQSYYAPITF
844 RAS QQYYLYQPITF
845 RAS QQYSNYPLTF
846 RAS QQYASDPITF
847 RAS QQYSYDPITF
848 RAS QQYIYDPVTF
849 RAS QQLMYDPITF
850 RAS GFNIYYGVM
851 RAS GFNIYSYDM
852 RAS GFNVQWSHM
853 RAS GFNIGMYTM
854 RAS GFNVFYGSM
855 RAS GFNLDYGWM
856 RAS GFNFSYSAM
857 RAS GFNVDWAWM
858 RAS GFNFGTYWM
859 RAS MIYPDSSWTY
860 RAS ISPGGSYTY
861 RAS RLSPPSGYTN
862 RAS LVYPDSGYTN
863 RAS FIGPDSTYTY
864 RAS WVVPGSDYTD
865 RAS DVVPDGDWTY
866 RAS WVVGGSDYTY
867 RAS WFLPDYDYTL
868 RAS SRDQDFHYMNYYLSYALDY
869 RAS SRSAFTGYFDV
870 RAS SRLILSKGGYGWAMDY
871 RAS SRYTWQSMDY
872 RAS SRDLGSAYAMDY
873 RAS SRFHYTAFDV
874 RAS SRGWYALDY
875 RAS SRSYYYAFDY
876 RAS SRHGEYAFDY
877 P53 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSAYFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSRYSPVTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNVYASGMHWVRQAPGKGLEWVAKIYPDSDYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRDSSFYYVYAMDYWGQGTLVTVSS
878 P53 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQQSSTPVTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNVYQSDMHWVRQAPGKGLEWVATIWPYSGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRDGMYAFDYWGQGTLVTVSS
879 P53 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSYYPNTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLYQRDMHWVRQAPGKGLEWVAGLLYGSDHTEYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRATYEEAFDYWGQGTLVTVSS
880 P53 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTITSLQPEDFATYYCQQQWSSPDTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLSYYDMHWVRQAPGKGLEWVALIYYGSGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGSYVSGMDYWGQGTLVTVSS
881 P53 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNAYPITFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLNSYYMHWVRQAPGKGLEWVAMIIPGYGYTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSYYMYMDYWGQGTLVTVSS
882 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVIYYPFTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLYSYAIHWVRQAPGKGLEWVALLYPDYGVTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRYRSYEYSVSSYSYSAMDYWGQGTLVTVSS
883 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDYYPFTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNISYEAMHWVRQAPGKGLEWVALIYPNHGITSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRYSSSAMDYWGQGTLVTVSS
884 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSIYYPFTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLYTSQMHWVRQAPGKGLEWVALVYPGYYVTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGAYYYSSAMDYWGQGTLVTVSS
885 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDYYPFTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNVFGYAIHWVRQAPGKGLEWVAEVYPGYDVTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRYSWAGAFDYWGQGTLVTVSS
886 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSSYSPWTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNISPWDMHWVRQAPGKGLEWVAQLYPSSGYTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSVYWSLDYWGQGTLVTVSS
887 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSTPITFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNISEYLMHWVRQAPGKGLEWVALLPPGLSYTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRYGYYAFDYWGQGTLVTVSS
888 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGEYSPLTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNVFESAMHWVRQAPGKGLEWVAWVYGSYDYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSFAYFQAMDYWGQGTLVTVSS
889 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYYTPVTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNISHYVMHWVRQAPGKGLEWVADFYPHSDSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRYQSYSFDYWGQGTLVTVSS
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891 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAVSYPWTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNISSSGIHWVRQAPGKGLEWVAMVYGGSGYTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWAHYSAYMDYWGQGTLVTVSS
892 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTANAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTSSYPITFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIYWYGMHWVRQAPGKGJEWVAQVYPWSGFTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRDYYSYSLDYWGQGTLVTVSS
893 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWYSPSTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNISASGMHWVRQAPGKGLEWVAWIWGGSSYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRGQYTSYMDYWGQGTLVTVSS
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908 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTITDPVTFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNVDWAWMHWVRQAPGKGLEWVAWVVGGSDYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSYYYAFDYWGQGTLVTVSS
909 RAS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLMYDPITFGQGTKVEIKRTGGGSGGGGSGGGASEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNFGTYWMHWVRQAPGKGLEWVAWFLPDYDYTLYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRHGEYAFDYWGQGTLVTVSS
910 RAS MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
911 PIK3CA MPPRPSSGELWGIHLMPPRILVECLLPNGMIVTLECLREATLITIKHELFKEARKYPLHQLLQDESSYIFVSVTQEAEREEFFDETRRLCDLRLFQPFLKVIEPVGNREEKILNREIGFAIGMPVCEFDMVKDPEVQDFRRNILNVCKEAVDLRDLNSPHSRAMYVYPPNVESSPELPKHIYNKLDKGQIIVVIWVIVSPNNDKQKYTLKINHDCVPEQVIAEAIRKKTRSMLLSSEQLKLCVLEYQGKYILKVCGCDEYFLEKYPLSQYKYIRSCIMLGRMPNLMLMAKESLYSQLPMDCFTMPSYSRRISTATPYMNGETSTKSLWVINSALRIKILCATYVNVNIRDIDKIYVRTGIYHGGEPLCDNVNTQRVPCSNPRWNEWLNYDIYIPDLPRAARLCLSICSVKGRKGAKEEHCPLAWGNINLFDYTDTLVSGKMALNLWPVPHGLEDLLNPIGVTGSNPNKETPCLELEFDWFSSVVKFPDMSVIEEHANWSVSREAGFSYSHAGLSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSEIEQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKWNSRDEVAQMYCLVKDWPPIKPEQAMELLDCNYPDPMVRGFAVRCLEKYLTDDKLSQYLIQLVQVLKYEQYLDNLLVRFLLKKALTNQRIGHFFFWHLKSEMHNKTVSQRFGLLLESYCRACGMYLKHLNRQVEAMEKLINLTDILKQEKKDETQKVQMKFLVEQMRRPDFMDALQGFLSPLNPAHQLGNLRLEECRIMSSAKRPLWLNWENPDIMSELLFQNNEIIFKNGDDLRQDMLTLQIIRIMENIWQNQGLDLRMLPYGCLSIGDCVGLIEVVRNSHTIMQIQCKGGLKGALQFNSHTLHQWLKDKNKGEIYDAAIDLFTRSCAGYCVATF1LGIGDRHNSNIMVKDDGQLFHIDFGHFLDHKKKKFGYKRERVPFVLTQDFLIVISKGAQECTKTREFERFQEMCYKAYLAIRQHANLFINLFSMMLGSGMPELQSFDDIAYIRKTLALDKTEQEALEYFMKQMNDAHHGGWTTKMDWIFHTIKQ HALN
912 P53 MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFIEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRIFEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKIEGPDSD
913 RAS SARDRGLVSLPSVEAFF
914 RAS CAGRNFGNEKLTF
915 RAS MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARDRGLVSLPSVEAFFGQGTRLTVVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDFGGSG
916 RAS MLLEHLLIILWMQLTWVSGQQLNQSPQSMFIQEGEDVSMNCTSSSIFNTWLWYKQDPGEGPVLLIALYKAGELTSNGRLTAQFGITRKDSFLNISASIPSDVGIYFCAGRNFGNEKLTFGTGTRLTIIPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*
917 RAS ASYLSGSIYNEQFF
918 RAS CAVRDQSGANNLFF
919 RAS MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQDPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASYLSGSIYNEQFFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDFGGSG
920 RAS MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDQSGANNLFFGTGTRLTVIPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
921 RAS ASSYSTERGTIY
922 RAS AASGGGGADGLT
923 RAS MRSQNDFLESPVPLSSMHRYRRPLRPGAPAMSISLLCCAAFPLLWAGPVNAGVTQTPKFRILKIGQSMTLQCTQDMNHNYMYWYRQDPGMGLKLIYYSVGAGITDKGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLELAAPSQTSVYFCASSYSTERGTIYFGEGSWLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
924 RAS MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGGGGADGLTFGKGTHLIIQPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
925 RAS ASSLADIYEQY
926 RAS ATDRQSSGDKLT
927 RAS MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSLADIYEQYFGPGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
928 RAS METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDRQSSGDKLTFGTGTRLAVRPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
929 RAS CASSARNDEAFF
930 RAS CAPGDNFNKFYF
931 RAS MGSRLLCWVLLCLLGAGPVKAGVTQTPRYLIKTRGQQVTLSCSPISGHRSVSWYQQTPGQGLQFLFEYFSETQRNKGNFPGRFSGRQFSNSRSEMNVSTLELGDSALYLCASSARNDEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
932 RAS MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNGLFWYQQHAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYLCAPGDNFNKFYFGSGTKLNVKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
933 RAS CASSLGDSEQYF
934 RAS CAVKSRAGSYQLTF
935 RAS MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSLGDSEQYFGPGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
936 RAS MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVKSRAGSYQLTFGKGTKLSVIPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
937 RAS CASSQRSNTGELFF
938 RAS CVVSGGGSSNTGKLIF
939 RAS MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSQRSNTGELFFGEGSRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDFGGSG
940 RAS MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLDSHVSVSEGTPVLLRCNYSSSYSPSLFWYVQHPNKGLQLLLKYTSAATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCVVSGGGSSNTGKLIFGQGTTLQVKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
941 RAS CASGGRDSTDTQYF
942 RAS CATDAGGGADGLTF
943 RAS MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASGGRDSTDTQYFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
944 RAS METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDAGGGADGLTFGKGTHLIIQPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
945 RAS ASSTSFWEVNTEAF
946 RAS AGGPNTGNQFY
947 RAS MGPGLLCWVLLCLLGAGSVETGVTQSPTALIKTRGQQVTLRCSSQSGHNTVSWYQQALGQGPQFIFQYYREEENGRGNFPPRFSGLQFPNYSSELNVNALELDDSALYLCASSTSFWEVNTEAFFGQGTRLTVVKDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKRKDSRGGGSG
948 RAS MVLKFSVSILWIQLAWVSTQLLEQSPQFLSIQEGENLTVYCNSSSVFSSLQWYRQEPGEGPVLLVTVVTGGEVKKLKRLTFQFGDARKDSSLHITAAQPGDTGLYLCAGGPNTGNQFYFGTGTSLTVIPNDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
949 RAS ASSKRGWPYEQY
950 RAS AVREEVLYNQGGKLI
951 RAS MSNQVLCCVVLCLLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSKRGWPYEQYFGPGTRLTVTKDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKRKDSRGGGSG
952 RAS MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNGLFWYQQHAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYLCAVREEVLYNQGGKLIFGQGTELSVKPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
953 RAS ASSLADIYEQY
954 RAS ATDRQSSGDKLT
955 RAS MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSLADIYEQYFGPGTRLTVTKDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS
956 RAS METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDRQSSGDKLTFGTGTRLAVRPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*
957 RAS ASSSTDRIEAF
958 RAS ALYIYGGSQGNLI
959 RAS ASTTFKTGRAIEKLF
960 RAS ATYNFNKFY
961 RAS ASSSRGHSGTEAF
962 RAS AVRDRGGSYIPT
963 RAS ASSSRGHSGTEAF
964 RAS AGLYSSASKII
965 RAS ATYKVGDEQF
966 RAS LANTGGFKTI
967 RAS ASSDWLAGAKDEQY
968 RAS AETGFQKLV
969 RAS MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSDWLAGAKDEQYFGPGTRLTVTKDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKRKDFGGSG
970 RAS MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAETGFQKLVFGTGTRLLVSPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
971 RAS ASSLVASNEQF
972 RAS ATDPLDYKLS
973 RAS ASSLGLLLYNEQF
974 RAS ACQGGSEKLV
975 RAS ASSLGDSYEQYF
976 RAS ATDAQTGANNLF
979 RAS ASSEWGSTGELF
978 RAS AANAGGTSYGKLT
979 RAS ASSEWGSTGELF
980 RAS AVDIIGGKST
981 RAS ASSEYTMGTQY
982 RAS AASAVGQEYGNKLV
983 RAS MSNTAFPDPAWNTTLLSWVALFLLGTSSANSGVVQSPRYIIKGKGERSILKCIPISGHLSVAWYQQTQGQELKFFIQHYDKMERDKGNLPSRFSVQQFDDYHSEMNMSALELEDSAVYFCASSLTDPLDSDYTFGSGTRLLVIEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKDSRGGGSG
984 RAS MQRNLGAVLGILWVQICWVRGDQVEQSPSALSLHEGTDSALRCNFTTTMRSVQWFRQNSRGSLISLFYLASGTKENGRLKSAFDSKERRYSTLHIRDAQLEDSGTYFCAADSSNTGYQNFYFGKGTSLTVIPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
985 RAS CASSYGPGQHNSPLHF
986 RAS CALSGPSGAGSYQLTF
987 RAS MSLGLLCCGAFSLLWAGPVNAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASSYGPGQHNSPLHFGNGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQDPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDFGGSG
988 RAS MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSGPSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSVDYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
989 RAS CASSVAGGGQETQY
990 RAS CALSEAGTYKYIF
991 RAS MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVAGGGQETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGGSG
992 RAS MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSEAGTYKYIFGTGTRLKVLANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
993 RAS CASSLSFRQGLREQYF
994 RAS CAVNPPDTGFQKLVF
995 RAS MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSLSFRQGLREQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGGSG
996 RAS MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNSASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSATYLCAVNPPDTGFQKLVFGTGTRLLVSPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
997 RAS CASKVYGYTF
998 RAS CLVGDFNSNSGYALNF
999 RAS MGTRLLFWVAFCLLGAYHTGAGVSQSPSNKVTEKGKDVELRCDPISGHTALYWYRQRLGQGLEFLIYFQGNSAPDKSGLPSDRFSAERTGESVSTLTIQRTQQEDSAVYLCASKVYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDFGGSG
1000 RAS MRQVARVIVFLTLSTLSLAKTTQPISMDSYEGQEVNITCSHNNIATNDYITWYQQFPSQGPRFIIQGYKTKVTNEVASLFIPADRKSSTLSLPRVSLSDTAVYYCLVGDFNSNSGYALNFGKGTSLLVTPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
1001 RAS CSASPRAGQLSSYNSPLHF
1002 RAS CAVDKDGGYQKVTF
1003 RAS MLLLLLLLGPGISLLLPGSLAGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSASPRAGQLSSYNSPLHFGNGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDFGGSG
1004 RAS MKKLLAMILWLQLDRLSGELKVEQNPLFLSMQEGKNYTIYCNYSTTSDRLYWYRQDPGKSLESLFVLLSNGAVKQEGRLMASLDTKARLSTLHITAAVHDLSATYFCAVDKDGGYQKVTFGTGTKLQVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
1005 RAS CASSLYGGSISYEQYF
1006 RAS CATDPGGFKTIF
1007 RAS MGTRLLCWAALCLLGAELTEAGVAQSPRYKIIEKRQSVAFWCNPISGHATLYWYQQILGQGPKLLIQFQNNGVVDDSQLPKDRFSAERLKGVDSTLKIQPAKLEDSAVYLCASSLYGGSISYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGGSG
1008 RAS METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDPGGFKTIFGAGTRLFVKANIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
1009 RAS CAISESERYYEQYF
1010 RAS CATFPNFGNEKLTF
1011 RAS MGTRLFFYVALCLLWTGHMDAGITQSPRHKVTETGTPVTLRCHQTENHRYMYWYRQDPGHGLRLIHYSYGVKDTDKGEVSDGYSVSRSKTEDFLLTLESATSSQTSVYFCAISESERYYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRGGSGG
1012 RAS METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATFPNFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
1013 RAS SARDRGLVSLPSVEAFF
1014 RAS ASYLSGSIYNEQFF
1015 RAS ASSYSTERGTIY
1016 RAS ASSLADIYEQY
1017 RAS CASSARNDEAFF
1018 RAS CASSLGDSEQYF
1019 RAS CASSORSNTGELFF
1020 RAS CASGGRDSTDTQYF
1021 RAS ASSTSFWEVNTEAF
1022 RAS ASSKRGWPYEQY
1023 RAS ASSLADIYEQY
1024 RAS ASSSTDRIEAF
1025 RAS ASTTFKTGRAIEKLF
1026 RAS ASSSRGHSGTEAF
1027 RAS ASSSRGHSGTEAF
1028 RAS ATYKVGDEQF
1029 RAS ASSDWLAGAKDEQY
1030 RAS ASSLVASNEQF
1031 RAS ASSLGLLLYNEQF
1032 RAS ASSLGDSYEQYF
1033 RAS ASSEWGSTGELF
1034 RAS ASSEWGSTGELF
1035 RAS ASSEYTMGTQY
1036 RAS ASSLDFVLAGSYSYNEQ
1037 RAS ASSQSGQGPYEQY
1038 RAS ASSRTAMNTEAF
SEQ ID NO: 1039 ：人類 p53 胺基酸序列MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD SEQ ID NO:1040 ：人類 PIK3CA 胺基酸序列MPPRPSSGELWGIHLMPPRILVECLLPNGMIVTLECLREATLITIKHELFKEARKYPLHQLLQDESSYIFVSVTQEAEREEFFDETRRLCDLRLFQPFLKVIEPVGNREEKILNREIGFAIGMPVCEFDMVKDPEVQDFRRNILNVCKEAVDLRDLNSPHSRAMYVYPPNVESSPELPKHIYNKLDKGQIIVVIWVIVSPNNDKQKYTLKINHDCVPEQVIAEAIRKKTRSMLLSSEQLKLCVLEYQGKYILKVCGCDEYFLEKYPLSQYKYIRSCIMLGRMPNLMLMAKESLYSQLPMDCFTMPSYSRRISTATPYMNGETSTKSLWVINSALRIKILCATYVNVNIRDIDKIYVRTGIYHGGEPLCDNVNTQRVPCSNPRWNEWLNYDIYIPDLPRAARLCLSICSVKGRKGAKEEHCPLAWGNINLFDYTDTLVSGKMALNLWPVPHGLEDLLNPIGVTGSNPNKETPCLELEFDWFSSVVKFPDMSVIEEHANWSVSREAGFSYSHAGLSNRLARDNELRENDKEQLKAISTRDPLSEITEQEKDFLWSHRHYCVTIPEILPKLLLSVKWNSRDEVAQMYCLVKDWPPIKPEQAMELLDCNYPDPMVRGFAVRCLEKYLTDDKLSQYLIQLVQVLKYEQYLDNLLVRFLLKKALTNQRIGHFFFWHLKSEMHNKTVSQRFGLLLESYCRACGMYLKHLNRQVEAMEKLINLTDILKQEKKDETQKVQMKFLVEQMRRPDFMDALQGFLSPLNPAHQLGNLRLEECRIMSSAKRPLWLNWENPDIMSELLFQNNEIIFKNGDDLRQDMLTLQIIRIMENIWQNQGLDLRMLPYGCLSIGDCVGLIEVVRNSHTIMQIQCKGGLKGALQFNSHTLHQWLKDKNKGEIYDAAIDLFTRSCAGYCVATFILGIGDRHNSNIMVKDDGQLFHIDFGHFLDHKKKKFGYKRERVPFVLTQDFLIVISKGAQECTKTREFERFQEMCYKAYLAIRQHANLFINLFSMMLGSGMPELQSFDDIAYIRKTLALDKTEQEALEYFMKQMNDAHHGGWTTKMDWIFHTIKQHALN SEQ ID NO: 1041 ： IL7R 信號傳導域KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEA YVTMSSFYQNQ SEQ ID NO: 1042 ： IL7R 跨膜域PILLTISILSFFSVALLVILACVLW SEQ ID NO: 1043 ： CD80 細胞外域MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDN SEQ ID NO: 1044 ： CD58 細胞外域MVAGSDAGRALGVLSVVCLLHCFGFISCFSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVAELENSEFRAFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESPNITDTMKFFLYVLESLPSPTLTCALTNGSIEVQCMIPEHYNSHRGLIMYSWDCPMEQCKRNSTSIYFKMENDLPQKIQCTLSNPLFNTTSSIILTTCIPSSGHSRHR SEQ ID NO: 1045 ： CD34 細胞外域MLVRRGARAGPRMPRGWTALCLLSLLPSGFMSLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKFTSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATSPTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVASHQSYSQKT
實例 實例 1 自健康供者之 T 細胞 譜系中鑑別出 KRAS G12V 特異性 TCR產生來源於HLA-A11陽性健康供體周邊血液單核細胞(PBMC)之樹突狀細胞，進行輻照，且用KRAS-G12V 7 - 16及KRAS-G12V 8 - 16肽進行脈衝。將此等細胞與自體CD8 +T細胞一起培育8-10天以誘導抗原特異性CD8+ T細胞之活化/擴增。此等多株T細胞株接著用經肽進行脈衝且經輻照的自體PBMC再刺激且擴增，8至10天兩次，以進一步擴增抗原特異性殖株。對來自15位HLA匹配供體中之各者的所有十種CD8+ T細胞株執行此方法。(Ho WY等人, J Immunol Methods. 2006; 310(1):40-52. doi:10.1016/j.jim.2005.11.023) ( 圖 1A)。
為鑑別與在HLA-A11之情況下呈遞的同源肽(亦即KRAS肽)具有強結合之TCR，使用滴定濃度之同源KRAS G12V肽刺激T細胞隔夜且藉由流動式細胞量測術評估CD137上調。藉由流動式細胞量測術細胞分選來分離出表現CD137之細胞且執行TCR β譜系分析(Adaptive Biotechnologies, Seattle, WA)。鑑別出CD137+群體中高度富集且對低濃度肽有反應的TCR殖株型，且藉由對類似分選之群體進行10x單一細胞RNAseq分析(10x Genomics, Pleasanton, CA)來測定TCR α/β配對。相較於經低濃度肽及高濃度肽處理之所有未分選細胞，對CD137+分選群體中之殖株型富集的代表性分析展示於 圖 1B。以P2A連接之表現卡匣形式組裝且合成來自經鑑別之殖株型的成對TCRα/β序列且經由慢病毒轉導至報導體Jurkat細胞中，該等細胞在 Nur77基因座的控制下表現GFP ( Nur77-GFP-Jurkat)。與經所指示遞減濃度之肽進行脈衝的A11目標細胞培養隔夜之後，藉由分析GFP表現來評估各種TCR的肽劑量依賴性反應( 圖 1C)。藉由非線性回歸來擬合劑量反應曲線，且使用Graphpad Prism (Boston, MA)計算EC50值( 圖 1D 、 1E)。
實例 2 初代 CD8 + T 細胞中所 表現之 KRAS - G12V 特異性 TCR 的 功能親合力初代CD8+ T細胞用編碼KRAS-G12V特異性TCR之聚核苷酸轉導，分選純化且擴增。分選純化之T細胞接著與遞減濃度之KRAS-G12V 8 - 16肽一起培養隔夜且藉由流動式細胞量測術評估CD137表現。藉由非線性回歸來擬合劑量反應曲線，且使用Graphpad Prism計算EC50值( 圖 2A 、 2B)。在此實驗中，將TCR 11N4A與KRAS G12V特異性TCR「220_21」(本文中參見SEQ ID NO:61及62)及美國公開案第US 2021/0340215A1號之具有由SEQ ID NO: 54 (Vα)及57 (Vβ)編碼之可變域的TCR「BNT」(本文中亦參見SEQ ID NO:59及60)進行比較。所有TCR均由TCRβ-P2A-TCRα表現卡匣中之慢病毒編碼。
利用類似分析對TCR 11N4A與220_21及其他TCR進行比較，量測肽抗原劑量反應以獲知IFN-γ表現( 圖 2C)。
實例 3 經 KRAS - G12V 特異性 TCR 轉導之 T 細胞 識別表現 KRAS - G12V 之 腫瘤細胞株初代CD8+ T細胞用KRAS-G12V特異性TCR轉導，分選純化且擴增。經分選純化之T細胞與表現突變KRAS-G12V之腫瘤細胞株一起培養隔夜。與1 mg/ml KRAS-G12V 8 - 16肽一起培養之T細胞作為陽性對照納入。藉由量測回應於TCR信號傳導之CD137表現來評估T細胞反應( 圖 3A - 3B)。必要時首先轉導腫瘤株系以表現HLA-A11且根據HLA-A11表現進行分選純化。
實例 4 表現 KRAS - G12V 特異性 TCR 之 CD8 + T 細胞 特異性殺死表現 KRAS - G12V 之 腫瘤細胞株將紅色螢光SW480細胞(一種表現KRAS-G12V之腫瘤細胞株，其經轉導以表現HLA-A11)與如所示經TCR轉導之T細胞共培養且藉由活細胞成像、使用IncuCyte S3顯微鏡及套裝軟體隨時間進行計數。藉由每孔紅色目標細胞總面積相較於未處理孔之減小來指示CD8 +T細胞的細胞毒性。第72小時添加額外的腫瘤細胞以評估TCR介導經轉導之T細胞在持久性抗原存在下對腫瘤細胞的溶解。( 圖 4A)。在另一實驗中，使用三種愈來愈嚴格之效應細胞:目標細胞比率，在T細胞具限制性時的條件下量測相對的TCR介導之腫瘤溶解。資料展示於 圖 4B中。
實例 5 表徵 TCR 11N4A 之肽結合模體的突變掃描為評估TCR 11N4A之潛在交叉反應性，執行突變掃描以鑑別對於TCR結合而言關鍵的肽殘基。合成其中同源KRAS-G12V肽之各殘基改變成丙胺酸的肽。同源9聚體肽之位置4 (10聚體肽之位置5)已含有丙胺酸，因此產生在此位置含有甘胺酸或蘇胺酸之肽。將經TCR 11N4A轉導之Nur77-GFP-Jurkat與經1 mg/ml各種肽進行脈衝之HLA-A11 +B-LCL細胞一起培養隔夜，隨後對GFP表現進行流動式細胞量測分析。在9聚體之位置1、5、7或8處含有取代及在10聚體之對應位置含有取代的肽能夠自表現TCR 11N4A之細胞引發反應，表明TCR 11N4A可能識別在此等位置處具有其他胺基酸之肽( 圖 5A 及 5B)。使用ScanProsite (prosite.expasy.org/scanprosite/)、利用搜尋字串：x-V-G-A-x-G-x-x-K (SEQ ID NO:4)搜尋人類蛋白質體中的相似模體。所得潛在交叉反應性肽展示於 圖 5C中，其中自IEDB (NetPanMHC4.1)預測的HLA-A11結合資料用百分等級(愈低則愈佳)及評分(愈高則愈佳)展示。此等資料包括各以多種蛋白質出現之兩種肽(RASE及RSLBB；野生型RAS蛋白RASH、RASK及RASN)。
實例 6 TCR 11N4A 對 潛在交叉反應性肽之反應性的分析將經TCR 11N4A轉導之供體來源之CD8 +T細胞與所鑑別之潛在交叉反應性肽中之各者或同源KRAS-G12V肽(1 mg/ml)一起培養隔夜，且藉由流動式細胞量測術評估活化誘導之CD137表現。除RAB7B衍生之肽的反應程度低(＜20%)之外，未偵測到任何肽的反應( 圖 6A 、 6B)。為進一步評估TCR 11N4A針對RAB7B肽之功能親合力，將分選純化的經TCR 11N4A轉導之T細胞與遞減濃度之KRAS-G12V 8 - 16肽或RAB7B肽一起培養隔夜且藉由流動式細胞量測術評估CD137表現。藉由非線性回歸來擬合劑量反應曲線( 圖 6C 及 6H)，且使用Graphpad Prism計算EC50值( 圖 6D)。
RAB7B肽之所計算EC50為約35 mg/ml，此係極高肽濃度，在目標細胞表面上引起的負載肽之MHC的密度比典型細胞表面上所呈遞之任何特定肽/HLA-A11複合物的密度大若干數量級。細胞通常以據報導在每個細胞10-150個肽/MHC複合物(就呈遞良好之若干自身肽而言)範圍內的密度呈遞一系列不同的經加工之細胞蛋白質(Bossi等人, Oncoimmunology. 2013; 2(11):e26840；Liddy等人, Nat Med. 2012; 18(6):980-7；Purbhoo等人, J Immunol. 2006; 176(12):7308-16)。為具體表徵肽濃度與T2細胞之抗原決定基呈遞之間的關係，使用與單分子螢光顯微法聯合的可溶性高親和力TCR定量經肽進行脈衝之T2細胞上的經充分表徵之若干自身肽。(Bossi等人)。此分析之結果表明，為接近於所呈遞抗原之生理含量，肽濃度必需在低奈莫耳濃度範圍(1-10 nM)內。
相比之下，即使在10 mg/ml (約10 mM)的高劑量下，觀測到經TCR 11N4A轉導之T細胞僅出現低反應程度(約25% T細胞有反應，相比之下，＞80%的T細胞對同源KRAS-G12V肽有反應)。重要的是，在100 nM或更低的肽濃度下，觀測到經TCR 11N4A轉導之T細胞無反應。此等資料證實，經TCR 11N4A轉導之T細胞對RAB7B肽不具有足以識別經天然加工及呈遞之抗原決定基的親和力。
為進一步評估TCR交叉反應性之可能性，表現TCR 11N4A之CD8+ T細胞與在同源KRAS G12V肽之各位置處含有每一可能胺基酸之取代的一組全面的位置掃描肽一起培養隔夜(合成跨參考肽(VVGAVGVGK)之所有可能胺基酸取代達90%純度的172個肽之文庫)。丙胺酸掃描突變誘發評估丙胺酸在肽位置中之各者處的連續取代，而XScan評估目標KRAS G12V肽之各位置處的所有其他19個胺基酸(Border等人 (2019) Oncoimmunology, 8(2): e1532759；doi.org/10.1080/2162402X.2018.1532759)。對各種肽有反應的表現CD137之T細胞的百分比展示於 圖 6E中，根據肽位置進行組織。
根據此等資料確定潛在交叉反應性肽模體，且藉由使用ScanProsite (prosite.expasy.org/scanprosite/)搜尋人類蛋白質體來鑑別與彼模體匹配之肽。在此分析中，引發大於15%之反應的肽視為陽性。利用ScanProsite搜尋而鑑別出的潛在交叉反應性肽展示於表( 圖 6F)中。RAB7B，在突變掃描分析中經鑑別具有交叉反應性的唯一肽，亦為驗證此分析類型之效用的Xscan分析中鑑別出的唯一肽。合成所鑑別之額外肽且以100 ng/ml添加至經轉導以表現TCR 11N4A或TCR 11N4A+CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)之經分選純化的初代CD8 +T細胞。培養隔夜之後，藉由流動式細胞量測術評估活化誘導之CD137表現。對於其他所鑑別出之肽中的任一者均未偵測到反應性( 圖 6G)。
實例 7 具有或不具有 CD8 αβ 之 TCR 11N4A 的 同種異體反應性篩選顯示對表現共同 HLA 對偶基因之 B - LCL 無同種異體反應性為確定TCR 11N4A是否展現針對共同非A11 HLA對偶基因之同種異體反應性，經分選純化之初代CD8+ T細胞經單獨的編碼TCR 11N4A之聚核苷酸或除TCR 11N4A α鏈及β鏈以外亦含有CD8α及CD8β編碼序列的替代性構築體轉導，且與表現一組通常發現於美國群體中之不同HLA對偶基因之一組B-LCL細胞株一起培養隔夜( 圖 7A)。培養隔夜之後，藉由流動式細胞量測術評估活化誘導之CD137表現( 圖 7B)。
實例 8 表現 TCR 11N4A 及 CD8 輔受體之 CD4 + T 細胞的 特異性殺滅活性CD4+及CD8+ T細胞經轉導以表現TCR 11N4A及CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)。使用IncuCyte分析評估工程化T細胞之殺滅活性( 圖 8)。
實例 9 藉由向表現靶向 KRAS 之 TCR 的 T 細胞添加 FAS / 41BB 融合蛋白來增強 T 細胞存活及功能本文所描述之宿主細胞亦包括包含Fas之細胞外域或其一部分及41BB之細胞內信號傳導域的融合蛋白的宿主細胞。細胞外組分可包含Fas之細胞外域之全部或一部分。在一些實施例中，跨膜組分可包含Fas、41BB或CD28之域或其部分。細胞外組分可包含Fas之細胞外域之全部或一部分或可截短以在受體-配位體相互作用後保持細胞之間的短空間距離(-9 aa)。在一些其他示例Fas-41BB融合蛋白中，跨膜組分包含41BB之跨膜域。另外，Fas-41BB構築體能夠將Fas與其目標結合而引起之信號轉換成藉由41BB細胞內信號傳導域產生之正(例如共刺激)信號。圖11 (圖11)說明根據本發明Fas-41BB融合蛋白與TCR一起包括的一些潛在優勢。
Fas-41BB融合蛋白及轉殖基因TCR (例如，TCR 11N4A)可在經轉導之鼠類T細胞中共表現。因此，使用本文所描述之通用方法產生包含此類融合蛋白(例如，SEQ ID NO: 83之核苷酸序列或SEQ ID NO: 80之蛋白質序列)及TCR 11N4A之細胞。
圖 11表明經負載TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白之慢病毒構築體轉導之細胞成功地表現全部三種標記物。展示未經轉導(左)或經工程化以表現A11 G12V TCR + CD8αβ + FAS41BB (右)之初代人類CD4/CD8 T細胞中工程化TCR表現(G12V四聚體，頂部)、FAS-41BB融合蛋白(FAS，中間)及外源性CD8 (CD8經由CD4+閘控，底部)之代表性流動式細胞量測圖。細胞內2A染色(x軸)經由區分慢病毒構築體內之個別參數的2A元件鑑別經轉導細胞。CD8分析僅包括CD4+ T細胞，因此排除內源性CD8+ T細胞。T細胞經抗CD3/CD28珠粒活化2天，進行慢病毒轉導，且在擴增3天之後藉由流動式細胞量測術分析。
為證實經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白轉導之T細胞能夠對內源性表現及呈遞之KRAS G12V有反應，測試來源於不同適應症且表現HLA-A*11:01及KRAS G12V抗原之一組腫瘤細胞株(圖12)。藉由與所測試之所有表現KRAS G12V之腫瘤細胞株共同培養來活化來源於2個不同供體之研究級別產物，而來自相同供體之未轉導T細胞(UTD)展現最小活化，藉由CD137 FACS染色所評估。CD4+及CD8+ T細胞藉由腫瘤細胞小組之活化程度類似，表明CD8α/β輔受體能夠實現CD4+ T細胞中之I類MHC限制反應的能力( 圖 12A 、 12B)。
如 圖 13( 圖 13)中所示，FAS-41BB融合蛋白改善經再刺激之T細胞對經KRAS工程化之T細胞的敏感性。在此實驗中，包含針對KRAS之TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及根據SEQ ID NO: 80之FAS/41BB融合蛋白(與所指示之對照一起)的T細胞用遞增之G12V肽濃度處理以刺激T細胞，且評估經刺激以表現CD137受體之細胞的百分比。包括FAS-41BB融合蛋白有效增加對G12V肽之刺激反應的程度。
另外， 圖 14A - 14D( 圖 14A - 14D)證實FAS-41BB融合蛋白改善活體外KRAS工程化之T細胞腫瘤殺死(例如Fas配位體表現量高之細胞)。在此實驗中，包含針對KRAS之TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及根據SEQ ID NO: 80之FAS-41BB融合蛋白(與所指示之對照一起)之CD4及CD8 T細胞與攜有KRAS G12突變之SW527腫瘤細胞以5:1及2:1效應細胞:目標細胞比率共培養。如在2:1條件下可見，FAS-41BB融合蛋白與KRAS TCR一起包括相對於僅單獨的KRAS TCR提高KRAS陽性腫瘤細胞之殺死。在2:1目標細胞:效應細胞比率下，大的誤差條指示T細胞在不同速率下損失腫瘤功效。
將未經轉導之T細胞(UTD)、經TCRKRASG12V + CD8α/β輔受體轉導之T細胞或經TCRKRASG12V、CD8α/β及FAS-41BB轉導之研究級別AFNT-211 T細胞與1×10 4個過度表現FASLG及NucLight紅色螢光蛋白之HLA-A*11:01 SW620腫瘤細胞(A、B)或HLA-A*11:01 COR-L23腫瘤細胞(C、D)以5:1效應細胞:目標細胞比率共培養長達8天。將培養物大致每72小時用相等數目之腫瘤細胞再刺激以模擬慢性抗原刺激(▲)。在同一研究內測試兩種不同供體。藉由總NucLight紅色目標面積量測之腫瘤匯合報導為整個研究中之腫瘤細胞生長/活力之量度。
額外活體外實驗亦證明FAS-41BB融合蛋白在活體外再攻擊分析中改善攜有KRAS TCR之細胞的擴增，如 圖 15A及 圖 15B中所示。該圖之左圖為如下流程，其中包含針對KRAS之TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及根據SEQ ID NO: 80之FAS/41BB融合蛋白(與所指示之對照一起)的T細胞與SW527細胞共培養3-4天，隨後計數且轉移至SW527細胞之新鮮細胞培養盤；按照所指示，重複轉移至SW527細胞之新鮮培養盤。右圖展示所轉移T細胞隨時間推移之擴增的圖。如右圖中可見，包括FAS-41BB融合蛋白與KRAS TCR可改善負載KRAS TCR之細胞的增殖。
另外，在 圖 15B中，進行活體外再攻擊分析以證明當細胞包含CD4 +及CD8 +T細胞兩者時負載KRAS TCR、CD8α/CD8β及FAS-41BB融合蛋白之細胞的擴增得到改善。展示與表現HLA-A*11:01及KRAS突變G12V之SW527細胞株共培養的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+混合物或相應未轉導之對照初代T細胞之累積擴增倍數的圖。T細胞用抗CD3/CD28抗體活化，未經轉導或經A11 G12V TCR + CD8αβ + FAS-41BB進行慢病毒轉導，擴增7天，且冷凍保存。將冷凍T細胞解凍且與SW527以1:1之初始比率共培養。每3-4天(由箭頭指示)，自培養物收穫T細胞，藉由流動式細胞量測術定量，且轉移至含有新塗鋪之SW527腫瘤細胞之第二培養物中。此外，經TCR工程化之細胞展示在一系列不同腫瘤細胞株中回應於KRAS G12V抗原之內源性加工及呈遞，相對於未經轉導之細胞，增殖速率得到提高( 圖 15C)。
實例 10 在投與添加 FAS / 41BB 融合蛋白之工程化 CD4 / CD8 T 細胞後負載腫瘤小鼠之活體內抗腫瘤功效及卡普蘭 - 邁耶存活曲線如 圖 16A - 圖 16D中所示之活體內資料證實FAS-41BB融合蛋白改善表現KRAS TCR之細胞在使用SW527細胞之活體內異種移植腫瘤模型中的治療功效。在此實驗中，10×10 6個包含針對KRAS之TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白(SEQ ID NO: 80) (與所指示之對照一起)的T細胞靜脈內投與至負載皮下SW527腫瘤之免疫缺陷小鼠且隨著時間推移量測腫瘤體積。 如圖 16A中所示，相對於單獨KRAS TCR，FAS-41BB融合蛋白與KRAS TCR共表現提高活體內SW527腫瘤之殺死( 圖 16A)。
圖 16B為負載表現HLA-A*11:01及內源性KRAS突變G12V之SW527異種移植模型之小鼠的卡普蘭-邁耶存活曲線。負載腫瘤小鼠接受初代CD4/CD8 T細胞，該等T細胞未經轉導或經A11 G12V TCR + CD8αβ或A11 G12V TCR、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS-41BB進行慢病毒轉導，且在轉導之後用抗CD3/CD28珠粒擴增7天。當腫瘤達到約100 mm 3時，在SW527皮下接種之後10天靜脈內投與10×10 6個經轉導之T細胞。冷凍保存T細胞且解凍，隨後投與。
在 圖 16C中，大部分小鼠在用所揭示之表現FAS-41BB融合蛋白的工程化T細胞處理時實現完全反應。在此實驗中，初代CD4/CD8 T細胞用A11 G12V TCR、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白進行慢病毒轉導。經轉導之T細胞在轉導之後用抗CD3/CD28珠粒擴增7天。此外，當腫瘤達到約100 mm 3時，在SW527皮下接種之後10天靜脈內投與10×10 6個經轉導之T細胞。在約60天連續量測後，大多數接受經A11 G12V TCR、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS-41BB轉導之T細胞之小鼠實現腫瘤體積完全減小。
經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS-41BB融合蛋白轉導之細胞允許負載腫瘤小鼠相對於投與未經轉導之細胞的小鼠存活更長時間。 圖 16D為負載表現HLA-A*11:01及內源性KRAS突變G12V之SW527異種移植物之小鼠在投與工程化CD4/CD8 T細胞後的卡普蘭-邁耶存活曲線。負載腫瘤小鼠接受未經轉導或經A11 G12V TCR、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS-41BB進行慢病毒轉導之初代CD4+/CD8+ T細胞。細胞在轉導之後用抗CD3/CD28珠粒擴增7天。為起始實驗，當腫瘤達到約100 mm 3時，在SW527細胞皮下接種之後10天靜脈內投與10×10 6個經轉導之T細胞。冷凍保存T細胞且解凍，隨後投與。
實例 11 經協調之 CD4 / CD8 反應進行慢病毒轉導以表現KRAS TCR、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS-41BB融合蛋白之T細胞在其包含CD4 +及CD8 +T細胞兩者時相對於單獨的CD4+或CD8+ T細胞，具有改善之抗腫瘤活性。 圖 17為表現紅色螢光蛋白、HLA-A*11:01及內源性KRAS突變G12V之SW527腫瘤細胞株的匯合之曲線圖，在活腫瘤目測分析法中監測，定量隨時間推移之紅色螢光信號。培養物包含SW527單培養物(「單獨腫瘤細胞」)或與未經轉導之CD4+/CD8+混合T細胞或經A11 G12V TCR、CD8αβ輔受體、FAS-41BB進行慢病毒轉導之CD4+、CD8+或CD4+/CD8+混合T細胞共培養。初代T細胞用抗CD3/CD28珠粒活化，轉導後擴增5天，且與SW527細胞以0.5:1之初始比率共培養。將額外的新鮮SW527細胞每3天(由箭頭指示)添加至培養物中。
實例 12 經 A11 G12V TCR + CD8αβ + FAS - 41BB 轉導之初代 T 細胞的安全概況經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白轉導之細胞在不存在外源性細胞介素支持下無法增殖，從而增強其安全概況。 圖 19為藉由在外源性細胞介素不存在之情況下每2-4天定量細胞來監測之CD4+/CD8+ T細胞之持久性(藉由細胞計數量測)的圖。展示未經轉導(頂部線)或經A11 G12V TCR、CD8αβ輔受體及FAS-41BB轉導(底部線)之初代T細胞，其已在含有IL2/IL7/IL15之培養基中用抗CD3/CD28珠粒擴增7-10天且轉移至無細胞介素之培養基中。每2-4天補充一半培養基(無細胞介素)。
實例 13 慢病毒載體設計已確定包含抗KRAS TCR (例如TCR 11N4A)及FAS/41BB融合蛋白兩者之T細胞的品質優於僅具有TCR之T細胞，設計包含抗KRAS TCR及FAS-41BB融合蛋白(與CD8α/CD8β輔受體一起)之單一慢病毒載體(參見例如圖19)。大部分設計考慮在單個轉譯RNA上表現抗KRAS TCR (「TCRb」或「TCRa」)、CD8α/CD8β (「CD8a」或「CD8b」)及FAS-41BB (「FasBB」)，其中使用編碼自裂解肽(「P2A」、「T2A」、「F-P2A」)之同框序列將編碼各別多肽之區域隔開。考慮在單一載體或單一順反子上具有多個元件之此類構築體將在製造簡易性或成本、多肽表現、T細胞治療功效或此等事物之任何組合方面具有優勢。
慢病毒設計測試 首先，相對於涉及抗KRAS TCR及FAS-41BB融合蛋白在各別載體上之策略，評估涉及包含抗KRAS TCR、FAS-41BB融合蛋白及CD8α/CD8β之單一載體的製造策略之效能( 圖 20A - 20C)。產生慢病毒載體，且如先前所描述對T細胞進行轉染，且進行FACS分析以評估表現包含抗KRAS TCR之順反子之細胞的細胞百分比(「2A+%」)、表現功能性TCR及包含抗KRAS TCR之順反子之細胞百分比(「Tet+2A+%」)、總功能性TCR表現(「Tet MFI」)、FAS-41BB融合蛋白表現(「Fas MFI」)及CD4+細胞之CD8α/CD8β輔受體表現(「CD4+下CD8 MFI」)。FACS分析表明，單一慢病毒策略(「22992-4」)及雙重慢病毒策略(「2慢病毒」)均能夠表現TCR及CD8α/CD8β轉殖基因。
在轉染T細胞之後，相對於包含抗KRAS TCR及FAS-41BB融合蛋白之細胞(「2慢病毒」)，在藉由抗原肽活化方面( 圖 21A)及腫瘤細胞殺死( 圖 21B)，評估在單一構築體上包含抗KRAS TCR、FAS-41BB融合蛋白及CD8α/CD8β之細胞(「22992-4」)。與優良表現一致，經單一慢病毒載體(「22992-4」)轉染之細胞等效於或優於雙重慢病毒載體(「2慢病毒」)。
亦在重複刺激及細胞殺死( 圖 22A)及異種移植模型之活體內功效( 圖 22B)方面，如先前所描述，評估類似轉染之細胞。在此等評估中，與優良表現一致，經單一慢病毒載體(「22992-4」)轉染之細胞等效於或優於雙重慢病毒載體(「2慢病毒」)。
經編碼抗KRAS G12D TCR、Fas-41BB融合蛋白及CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)之慢病毒載體轉染的CD4+及CD8+ T細胞亦顯示異種移植模型中之活體內功效( 圖 22C)。
實例 14 臨床開發計劃 ( 預示性 )將在患有晚期或轉移性實體腫瘤之個體中，進行一項首次人用(FIH)、單臂、開放標記、多中心I期研究，評估自體、HLA-A*11:01限制之KRASG12V靶向TCRT細胞療法，該研究包含劑量發現部分，繼之以劑量擴增部分，以評估經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白轉導之細胞的安全性、耐受性及初步抗腫瘤功效。為符合條件，個體在腫瘤中呈KRASG12V突變陽性(例如經由KRAS定序或基因分型測試)且呈現HLA-A*11:01對偶基因。
慢病毒載體之製造 編碼HLA-A*11:01、KRASG12V特異性TCRα/β、FAS-41BB融合蛋白及CD8α/β輔受體之慢病毒載體為製造方法中所用之關鍵原料藥中間物(DSI)。DSI在cGMP條件下製造且包含編碼HLA-A*11:01、KRASG12V特異性TCRα/β、FAS-41BB融合蛋白及CD8α/β輔受體(呈該順序，除了KRAS TCR之β鏈在α鏈上游外)之質體。慢病毒載體將使用短暫轉染方法產生。
細胞轉導 ( 功能 ) 效價評估 慢病毒載體(LVV)轉導效價(以TU/mL報導)用於計算轉導患者T細胞以達成靶向感染倍率(MOI)所需的LVV之體積。
藉由表現量測之效力 Jurkat E6-1細胞不表現內源性CD8且內源性TCRα及TCRβ表現已另外破壞(TRAC及TRBC基因座之雙重基因剔除)以評估LVV驅動之TCR表現。將經轉導之細胞培養3天且接著進行螢光抗體染色及流動式細胞量測術分析以評估經轉導之CD8鏈之表現。CD8鏈為由LVV編碼之所得轉殖基因卡匣之組分，且因此其表現可視為上游轉殖基因(TCRα、TCRβ及FAS-41BB)之表現的替代物。
載體基因體 ( 基因體 ) 效價評估 使用反轉錄介導之液滴式數位PCR (RT-ddPCR)測定每單位體積存在之LVV基因體複本之數目來量測LVV基因體效價。所編碼轉殖基因進行密碼子最佳化且可與其細胞對應物區分。引子/探針組經設計以偵測及定量對TCRα密碼子最佳化之核酸序列具特異性之核酸序列。結果報導為載體基因體/mL(VG/mL)。物理效價(P24)亦將作為表徵之部分進行分析。 表 1 ： 慢病毒載體之建議 I 期說明
測試 方法 可報導
效力
轉導 ( 功能 )效價 基於細胞之分析 TU/mL
藉由表現量測之效力 流動式細胞量測術 CD8+ %
強度
基因體與功能比率 計算 比率(VG/TU)
LVV基因體(基因體)效價 RT-ddPCR VG/mL
身分
前病毒定序[1] 桑格定序 序列匹配%
安全性
無菌性 USP ＜71＞ / Ph. Eur 2.6.1 無活細菌及真菌污染
內毒素 USP ＜85＞ / Ph. Eur 2.6.14 EU/mL
黴漿菌(Mycoplasma) [2] USP ＜63＞ / Ph. Eur 2.6.7 無黴漿菌污染證據
RCL[3] C8166細胞分析/Q-PERT 未偵測到RCL
外來病毒劑[4] 基於細胞/用顯微鏡 未觀測到細胞病變效應或血球吸附
純度[5]
殘餘核酸酶 ELISA pg/mL核酸酶
殘餘質體DNA ddPCR 複本/µL質體DNA
殘餘宿主細胞DNA ddPCR pg/µL基因體DNA
殘餘宿主細胞蛋白質 ELISA ng/mL HCP
Ad5 E1A ddPCR pg/µL基因體DNA
外觀 目視檢查 顏色及濁度
pH值 USP ＜791＞ / Ph. Eur 2.2.3 pH值
滲透壓度 USP ＜785＞ / Ph. Eur 2.2.35 mOsmol/kg
治療性細胞轉導及擴增 藉由自患者進行白血球分離術製備之細胞經由在液氮中以控制速率冷凍儲存，直至使用。在過程第0天，解凍冷凍保存之血球分離物且首先使用免疫磁性珠粒正向選擇表現CD8之T細胞；隨後對流過物正向選擇表現CD4之T細胞。所選擇之CD8+及CD4+ T細胞以固定CD4:CD8比率組合，用CD3/CD28特異性抗體活化，且在補充有血清置換及細胞介素之無血清培養基中培養。接著將活化細胞在37℃及5% CO2下培育隔夜。第二天，T細胞經LVV轉導，與化學轉導增強劑組合，且再次在37℃及5% CO 2下培育。擴增、調配及冷凍保存細胞。
流動式細胞量測術 使用對A11G12V TCR具特異性之CD3、CD4、CD8、Dextramer (包含附接至螢光結合之可撓性聚葡萄糖主鏈之單鏈單體)染色，使用流動式細胞量測術評估治療性細胞調配物之A11G12V TCR表現頻率、轉導頻率及T細胞純度。
用於效力及劑量計算之 TCR 表現頻率 藉由Dextramer®試劑染色(與KRAS G12V肽複合且經由生物素-鏈黴抗生物素蛋白相互作用多聚化的氟結合之A11 MHC)進行TCR偵測，以偵測TCR在細胞表面上之表現及結構功能性。分析對照包括未經轉導之健康供體細胞(陰性參考對照)，其提供基線量測且證實特異性。TCR+細胞百分比(小瓶dextramer染色)用於劑量計算(劑量=總活細胞計數×CD3+細胞中之Dextramer+ %)。
細胞介素分泌 作為效力之另一量測，可評估細胞介素分泌以證實工程化T細胞之功能性。觀測到由T細胞活化引起之特定細胞介素之產生；干擾素γ (IFNγ)為活化T細胞之廣泛接受之生物標記物。DP細胞與HLA匹配之抗原呈遞細胞(APC)共培養且負載有KRAS G12V肽。包括未經轉導之細胞作為陰性對照。DP細胞與負載肽之APC細胞之共培養提供相關組織培養平台以評估T細胞活化信號傳導。共培養之後，收集上清液且使用免疫方法量測IFNɣ濃度。
藉由 PCR 確定身分 為確保藥品身分，自整合LVV後DP細胞提取基因體DNA。將DNA分離、正規化，且隨後使用對所編碼轉殖基因具特異性之引子/探針組來評估。另外，陽性及陰性對照均同時評估以確保分析效能。
載體複本數 使用液滴式數位PCR (ddPCR)定量每個宿主細胞基因體之前病毒整合DNA複本之數目來測定載體複本數(VCN)。藉由ddPCR使用針對藥品中之WPRE (LVV主鏈)及RPPH1 (核糖核酸酶P；基因體參考)卡匣的多重引子/探針組來確定VCN。所得VCN相對於轉導頻率正規化。
複製勝任型慢病毒 複製勝任型慢病毒(RCL)之存在或不存在係使用液滴式數位聚合酶鏈式反應(ddPCR)分析測定。此ddPCR分析用於偵測慢病毒載體之水泡性口炎病毒G (VSV-G)包膜蛋白之基因序列作為測試樣品中之RCL之指示物。結果報導為偵測或未偵測到測試樣品中目標基因(VSV-G)之存在。 表2：治療性細胞調配物之建議I期說明
測試 方法 可報導
效力
轉殖基因表現頻率 流動式細胞量測術 (CD3+中) Dextramer+%
細胞介素分泌 共培養及免疫分析 IFNɣ (pg/mL)
身分
藉由PCR確定身分 ddPCR 密碼子最佳化之TCRα
安全性
快速無菌性 BacT/Alert 菌落生長
內毒素 USP ＜85＞ / Ph. Eur. 2.6.14 EU/mL
快速黴漿菌 6 反轉錄-多重PCR 序列存在
快速RCL ddPCR VSV-G序列存在
純度
T細胞純度 流動式細胞量測術 CD3+ %
活力 自動細胞計數器 活%
品質
外觀檢查 目視檢查 顏色及濁度
強度
劑量 流動式細胞量測術 總活細胞計數×(CD3+細胞中)之Dextramer+ %)
用於細胞療法之劑量發現 / 遞增研究 ( 預示性 ) 藉由貝氏最優區間I/II (Bayesian optimal interval phase I/II，BOIN12)試驗設計(Lin等人, (2020) JCO Precision Oncology, 4, PO.20.00257；doi.org/10.1200/PO.20.00257)指導經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白轉導之細胞的劑量發現/遞增，以發現最佳生物劑量(OBD)。BOIN12設計使用效用根據「毒性-功效權衡」來定量劑量合意性，且為個體適應性地分配具有最高所估計合意性之劑量。將選擇OBD作為可容許且基於Lin等人中所描述之等張估計方法具有最高所估計效用的劑量。多達20名個體之總樣品大小招入劑量發現/遞增中。在各新劑量之個體1與個體2之間需要至少28天之交錯。先前隊列之各個體完成28天的完整劑量限制毒性(DLT)觀察期，然後新的先前未評估之劑量隊列可進入治療及主動護理期，該時期定義為淋巴球耗盡性化學療法(LDC)之第一天開始與細胞研究藥品投與之後第28天(亦即DLT觀察期)結束之間的時段。為防止個體分配至有毒及/或無效劑量，BOIN12使用兩個劑量可接受性標準來決定哪些劑量可用於治療個體。
為確保研究個體之安全性，必須在開始治療及主動護理期，亦即自淋巴球耗盡性化學療法開始至DLT觀察期結束之前滿足以下準則。 ● 0-1之美國東岸癌症臨床研究合作組織(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體能狀態 ● 適當器官及骨髓功能 ● 育齡女性個體在LDC之前14天內具有陰性血清妊娠測試 來自先前治療方案或臨床研究之任何細胞毒性化學療法、研究藥劑或任何抗腫瘤藥物在開始治療及主動護理期之前5個半衰期或14天(以先到者為準)中止。若在方案中允許，則相同規則適用於橋式療法之投與。
經過訓練之醫學工作人員密切監測研究個體之不良事件。基於個體之臨床表現，以規則時間間隔且特定地收集血液樣品以監測細胞介素含量。按照機構準則向個體投與抗微生物預防。
不良事件之分級根據NCI CTCAE版本5.0進行。對於免疫效應細胞相關神經毒性症候群(ICANS)及細胞介素釋放症候群(CRS)，使用ASTCT共識分級(Lee等人, (2019) Biology of Blood and Marrow Transplantation: Journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation, 25(4), 論文4；doi.org/10.1016/j.bbmt.2018.12.758)。若適用，則DLT評估期擴展至追蹤進行中之AE，直至事件消退或確認事件為DLT。
DLT如下定義： 1.  任何治療引發之4級或5級CRS 2.  在7天內未消退至2級的任何治療引發之3級CRS 3.  在72小時內未消退至2級的3級或更高級別神經毒性 4.  3級或更高級別的與細胞輸注相關之過敏反應 5.  ≥3級任何治療引發之自體免疫毒性 6.  3級或更高級別之器官毒性(心臟、皮膚病、胃腸道、肝、肺、腎/泌尿生殖道)，先前不存在或並非由細胞輸注30天內發生之潛在惡性病引起。 7.  任何3級或更高級別之非血液毒性應在7天內消退至2級或更低 8.  3級血小板減少症，伴隨出血或7天內未能恢復至2級的更大級別血液毒性 9.  不符合研究者認為表示DLT之以上準則的與細胞療法相關之任何其他臨床上顯著毒性。
以下條件不視為DLT： ●   3級疲勞 ●   有或無全身性皮質類固醇及/或激素替代療法進行管理的3級內分泌病症(甲狀腺、垂體及/或腎上腺功能不全)，伴隨症狀消退 ●   可藉由醫學療法控制之3級高血壓 ●   無症狀且臨床上不顯著的3級實驗室值異常 ●   任何AE級別之白斑病或禿頭症 接受經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白轉導之細胞且在成像時確認具有部分反應(PR)的個體可根據研究者之判斷來接受第二次細胞輸注。亦可根據研究者之判斷，考慮在此研究之短期隨訪(STFU)期內實現短暫完全反應(CR)且稍後進展之個體進行再次治療。另外，個體需要耐受住經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白轉導之細胞之初始輸注，不發生任何DLT。以與細胞之第一次輸注相同的劑量投與再次治療。在用於再次治療之細胞產物可用性有限的情況下，在與醫學監測者討論之後考慮較低劑量。若個體在第一劑量之後2個月內接受第二劑量的經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白轉導之細胞，則不投與LDC。若在第一次輸注細胞之後超過2個月進行再次治療，則投與LDC之決定留給研究者。然而，在第二次輸注經TCR工程化之細胞之前LDC之再投與遵循草案大綱中所描述之LDC納入標準。收集用細胞再次治療後發生之AE，且報導，但在DLT分析中不使用。
可組合上述各種實施例以提供其他實施例。本說明書中所提及及/或本申請案資料表單中所列出之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利出版物均以全文引用之方式併入本文中。必要時，可修改該等實施例之態樣以採用各種專利、申請案及公開案之概念來提供其他實施例。
可鑒於以上實施方式對實施例進行此等及其他改變。一般而言，在以下申請專利範圍中，所用術語不應解釋為將申請專利範圍限制於本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例，而應解釋為包括所有可能之實施例以及該申請專利範圍有權要求的等效物之全部範疇。因此，申請專利範圍不受本發明限制。
本發明之新穎特徵詳細闡明於隨附申請專利範圍中。將參考闡述利用本發明原理之說明性實施例及其隨附圖式的以下詳細描述來獲得對本發明之特徵及優勢的較佳理解：
圖 ( 圖 ) 1A 、 1B 、 1C 、 1D及 1E係關於鑑別來自健康人類供者之T細胞譜系的KRAS G12V特異性T細胞受體(TCR)。(圖1A)(左圖)示意性顯示自供者樣品中鑑別出侷限於HLA-A11之突變型KRAS (mKRAS)特異性T細胞株的方法及(右圖)表現mKRAS特異性TCR之CD8+ T細胞在不存在(左)或存在(右) mKRAS G12V肽之情況下的TNFα產生。( 圖 1B)(上圖)用於分選mKRAS反應性CD8+ T細胞及定序以及(下圖)對CD8+ T細胞進行工程化以異源性表現mKRAS特異性TCR之方法的示意圖。分離出五十六種mKRAS特異性TCR (G12V特異性或G12D特異性)，且執行敏感性及細胞毒性分析。( 圖 1C) T細胞殖株在活體外在存在及不存在KRAS G12V突變肽之情況下的富集倍數。( 圖 1D)經TCR轉導之T細胞在活體外在 Nur77基因座控制下在不同濃度之KRAS G12V突變肽存在下的活化，根據表現GFP之T細胞的百分比所評估。T細胞經轉導以表現TCR，如圖例所示。( 圖 1E) Log EC50 KRAS G12V 9聚體肽值(表示經TCR轉導之T細胞產生其 Nur77表現之半數最大反應所需的KRAS G12V肽濃度)。
圖 ( 圖 ) 2A、 2B及 2C展示TCR 11NA4 (參見表1)與TCR 220_21 (SEQ ID NO:61 (Vα)及62 (Vβ)中所示之胺基酸序列)及TCR 「BNT」 (SEQ ID NO:60中所示之Vα域胺基酸序列(具有信號肽)；SEQ ID NO:59中所示之Vβ域胺基酸序列(具有信號肽))相比之功能性親合力。( 圖 2A)在指定濃度之KRAS G12V肽下表現CD137的經TCR轉導之原代CD8+ T細胞之百分比；( 圖 2B) TCR針對KRAS G12V肽的log EC50；( 圖 2C) T細胞活化，藉由在指定濃度之KRAS G12V肽下表現CD137的經TCR轉導之原代CD8+ T細胞之百分比量測。( 圖 2D)暴露於9聚體及10聚體肽，TCR針對KRAS G12V之log EC50；( 圖 2E) T細胞活化，藉由在暴露於指定KRAS G12肽後，表現CD137的經TCR轉導之原代CD8+ T細胞之百分比量測。( 圖 2F)在指定濃度之KRAS G12V肽下，表現IFN-γ的經TCR轉導之原代CD8+ T細胞之百分比。
圖 ( 圖 ) 3A及 3B顯示與表現HLA-A11+ KRAS G12V之腫瘤細胞株共培養的經TCR轉導之T細胞的活化(根據表現CD137的經TCR轉導之T細胞之百分比評估)。( 圖 3A)顯示在多個細胞株中且在包含G12V突變之KRAS肽存在下表現四種不同TCR中之一者的T細胞之活化。「UT」=未轉導之陰性對照。( 圖 3B)顯示表現TCR 11N4A之T細胞相對於其他TCR之優良活化。「UNTR」-未轉導之陰性對照。
圖 ( 圖 ) 4A及 4B係關於表現KRAS G12V特異性TCR的CD8+ T細胞在Incuyte殺滅分析中特異性殺滅表現HLA-A11+ KRAS G12V之腫瘤細胞株。在此分析中，紅色目標面積指示存在腫瘤細胞。( 圖 4A) IncuCyte®殺滅分析中的mKRAS+/HLA-A11+腫瘤細胞生長曲線。測試條件為單獨的腫瘤細胞、腫瘤細胞 + 經轉導以表現TCR 11N4A之T細胞及經轉導以表現比較TCR 220_21的腫瘤細胞。y軸上之紅色目標面積顯示腫瘤細胞生長。第72小時添加額外的腫瘤細胞。( 圖 4B)來自另一殺滅分析實驗之資料，其中T細胞及SW480腫瘤細胞株以指定效應細胞:目標細胞比率共培養。
圖 ( 圖 ) 5A 、 5B及 5C係關於使用KRAS G12 9聚體及10聚體肽進行的誘變掃描實驗，以表徵TCR 11N4A之肽結合模體。( 圖 5A)在G12V肽或指定位置之胺基酸經丙胺酸、甘胺酸或蘇胺酸置換之G12V肽變異體存在下，表現 Nur77 - GFP之經TCR轉導之T細胞的百分比，如所指示。左圖：KRAS G12 9聚體肽之突變掃描結果。右圖：KRAS G12 10聚體肽之突變掃描結果。( 圖 5B)在指示的9聚體肽存在下，表現活化標記物 Nur77(連接至報導基因)之經TCR 11N4A轉導之CD8+ T細胞的百分比。( 圖 5C)使用ScanProsite (prosite.expasy.org/scanprosite/)使用以下搜尋字串搜尋人類蛋白質體之結果：x-V-G-A-x-G-x-x-K (SEQ ID NO:4)。對來自人類蛋白質體之肽進行評分，以預測對HLA-A11之結合。
圖 ( 圖 ) 6A 、 6B 、 6C 、 6D 、 6E 、 6F 、 6G及 6H顯示TCR 11N4A在人類中具有低自體反應風險。XScan分析預測可在基因體中具有潛在脫靶反應性之單肽RAB7B。然而，RAB7B肽在生理濃度下無法刺激經轉導之CD4/CD8 T細胞，表明缺乏自體反應性。( 圖 6A 、圖 6B)經TCR 11N4A轉導之T細胞對一組潛在交叉反應肽的反應性(參見圖5B)。( 圖 6C)經轉導以表現TCR 11N4A且暴露於KRAS G12V或RAB7B肽之細胞的肽劑量-反應曲線及( 圖 6D)相對於同源KRAS G12V肽，經TCR 11NA4轉導之T細胞針對RAB7B肽的計算負對數EC50。( 圖 6E)響應於與含有同源KRAS G12V肽(172肽)之各位置處每一可能胺基酸之取代的一組全面位置掃描肽培養隔夜，表現CD137之經TCR 11N4A轉導之CD8+ T細胞的百分比。在此分析中，引發大於15%之反應的肽視為陽性。( 圖 6F)根據由 圖 6E之資料鑑別的潛在交叉反應模體，經由搜尋ScanProsite鑑別出的潛在交叉反應肽。( 圖 6G) 經轉導以表現TCR 11N4A或TCR 11N4A + CD8αβ且與100 ng/ml潛在交叉反應肽培養隔夜的分選純化之初代CD8+ T細胞的CD137表現(藉由流動式細胞量測術測定)。( 圖 6H)類似於 圖 6C中所示之結果，在滴定之RAB7B肽培育後不刺激經A11 G12V TCR、CD8α/CD8β及FAS-41BB融合蛋白進行慢病毒轉導之CD8+ T細胞(底部線)且在滴定之KRAS突變G12V肽培育後刺激(頂部線)。
圖 ( 圖 ) 7A及 7B係關於評估TCR 11N4A之潛在同種異體反應性。( 圖 7A)表現不同HLA對偶基因之B淋巴母細胞樣細胞株(B-LCL)與經TCR 11N4A轉導之CD8+ T細胞一起培育且藉由IFN-γ或CD137之表現所測定，評估T細胞之反應性。( 圖 7B)同種異體反應性篩選結果：在CD8αβ存在(上圖)或不存在(下圖)下，針對表現共同HLA對偶基因之B-LCL的經TCR 11N4A轉導之CD137+ T細胞之百分比。
圖 ( 圖 ) 8顯示經工程化以表現TCR 11N4A及CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)之CD8+及CD4+ T細胞針對mKRAS:HLA-A11+腫瘤細胞之殺滅活性。
圖 ( 圖 ) 9A 、圖 9B 、圖 9C 、圖 9D 、圖 9E 、圖 9F 、圖 9G及 圖 9H展示與TCR 11N4A相關之核苷酸( 圖 9A - 圖 9E)及胺基酸( 圖 9F - 圖 9H)序列及編碼或包含其之表現構築體。
圖 ( 圖 ) 10A 、圖 10B 、圖 10C 、圖 10D 、圖 10E及 圖 10F展示與TCR 11N6相關之核苷酸( 圖 10A - 圖 10C)及胺基酸( 圖 10D - 圖 10F)序列及編碼或包含其之表現構築體。
應理解，圖9A-10F中所示的序列並非皆含有圖例中指示的每個序列特徵。在圖例中，CDR3序列根據IMGT接面定義展示。
圖 ( 圖 ) 11證明經攜有TCR 11N4A、CD8αβ輔受體及FAS/41BB融合物之單一慢病毒構築體轉導的細胞成功表現所有三種標記物。展示未經轉導(左)或經工程化以表現A11 G12V TCR + CD8αb + FAS-41BB (右)之初代人類CD4/CD8 T細胞中工程化TCR表現(G12V四聚體，頂部)、FAS-41BB融合蛋白(FAS，中間)及外源性CD8 (CD8經由CD4+閘控，底部)之代表性流動式細胞量測圖。細胞內2A染色(x軸)經由區分慢病毒構築體內之個別參數的2A元件鑑別經轉導細胞。CD8分析僅包括CD4+ T細胞，因此排除內源性CD8+ T細胞。T細胞經抗CD3/CD28珠粒活化2天，進行慢病毒轉導，且在擴增3天之後藉由流動式細胞量測術分析。
圖 ( 圖 ) 12A 及 12B證實經TCR 11N4A、CD8α/CD8β輔受體及FAS-41BB融合蛋白轉導之細胞對由I類MHC呈現之內源性KRAS突變肽具有反應性。 ( 圖 12A )展示與A11 KRAS G12V突變細胞株共培養之經轉導CD4 T細胞上之CD137表現的條形圖。 ( 圖 12B )展示與A11 KRAS G12V突變細胞株共培養之經轉導CD8 T細胞上之CD137表現的條形圖。細胞株包括表現HLA-A*11:01及內源性KRAS突變G12V之細胞株SW527、SW620、CFPAC1、COR-L23、DAN-G及NCI-H441。所誘導之CD137表現證明對由I類MHC呈現之內源性KRAS突變肽的反應性。
圖 ( 圖 ) 13證實FAS-41BB融合蛋白改善經再刺激之T細胞對經KRAS工程化之T細胞的敏感性。在此實驗中，用遞增之G12V肽濃度處理包含針對KRAS之TCR 11N4A、CD8α及CD8β輔受體及根據SEQ ID NO: 80之FAS/41BB融合蛋白(與所指示之對照一起)的T細胞以刺激TCR且評定經刺激以表現CD137受體之細胞的百分比。包括FAS-41BB融合蛋白有效增加G12V肽之刺激反應的程度。
圖 ( 圖 ) 14A - 14E證實FAS-41BB融合蛋白在活體外(例如在表現Fas配位體之細胞株中)改善經KRAS工程化之T細胞的腫瘤殺死。 圖 14A展示在以5:1或2:1效應細胞:目標細胞比率與未經轉導之T細胞、經TCRKRASG12V (11N4A)+CD8α/β輔受體轉導或經TCRKRASG12V、CD8α/β及FAS-41BB轉導之初代CD4及CD8 T細胞共培養之後SW527的匯合。 圖 14B為一幅總結實驗結果之圖，其中未經轉導之T細胞(UTD)、來自供體1之經TCRKRASG12V+CD8α/β輔受體轉導之T細胞或經TCRKRASG12V、CD8α/β及FAS-41BB轉導之T細胞與1×10 4個過度表現FASLG及NucLight紅色螢光蛋白之HLA-A*11:01 SW620腫瘤細胞以5:1效應細胞:目標細胞比率共培養長達8天。將培養物大致每72小時用相等數目之腫瘤細胞再刺激以模擬慢性抗原刺激(▲)。 圖 14C展示使用來自不同供體之T細胞之相同實驗的結果。 圖 14D展示使用來自供體1之T細胞及將此等細胞與COR-L23腫瘤細胞共培養之相同實驗的結果。 圖 14E展示使用來自不同供體之T細胞的 圖 14D中之相同實驗之結果。在同一研究內測試兩種不同供體。藉由總NucLight紅色目標面積量測之腫瘤匯合報導為整個研究中之腫瘤細胞生長/活力之量度。
圖 ( 圖 ) 15A證實FAS-41BB融合蛋白在活體外再攻擊分析中改善攜有KRAS TCR之細胞的擴增。該圖之左圖中展示如下流程，其中包含針對KRAS之TCR 11N4A、CD8αβ輔受體及根據SEQ ID NO: 80之FAS/41BB融合蛋白(與所指示之對照一起)的T細胞與SW527細胞共培養3-4天，隨後計數且轉移至SW527細胞之新鮮細胞培養盤；按照所指示，重複轉移至SW527細胞之新鮮培養盤。右圖展示所轉移T細胞隨時間推移之擴增的圖。如右圖中可見，包括FAS-41BB融合蛋白與KRAS TCR可改善攜有KRAS TCR之細胞的複製。
圖 ( 圖 ) 15B證實在活體外再攻擊分析中攜有KRAS TCR、CD8α/CD8β及FAS-41BB融合蛋白之細胞的擴增在細胞包含CD4 +及CD8 +細胞兩者時得以改善。展示與表現HLA-A*11:01及內源性KRAS突變G12V之SW527細胞株共培養的CD4+ (三角形；中部線)、CD8+ (正方形；自底部線起第2線)、CD4+/CD8+混合物(圓圈；頂部線)或相應未經轉導之對照(底部線)初代T細胞之累積擴增倍數的圖。
圖 ( 圖 ) 15C展示來自兩種不同健康供體(D1、D2)之經TCR工程化之細胞或未經轉導之供體T細胞(UTD)，該等細胞與1×10 4個各種HLA-A*11:01+ KRASG12V+腫瘤細胞以5:1效應細胞:目標細胞比率共培養7天，在此期間，兩次添加新鮮腫瘤細胞至共培養物中以再刺激T細胞。第7天，藉由CD4+及CD8+ T細胞之流動式細胞量測術碘化丙錠(PI)染色量測T細胞增殖。PI陰性T細胞計數以活淋巴球計數/微升繪圖。
圖 ( 圖 ) 16A證實FAS-41BB融合蛋白在具有SW527細胞之活體內異種移植腫瘤模型中改善攜有KRAS TCR之細胞的功效。在此實驗中，包含針對KRAS之TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及根據SEQ ID NO: 80之FAS/41BB融合蛋白(與所指示之對照一起)的T細胞以10×10 6個T細胞之劑量靜脈內投與至負載皮下SW527腫瘤之免疫缺陷小鼠且隨著時間推移量測腫瘤體積。如圖可見，包括Fas/41BB融合蛋白與KRAS TCR提高活體內SW527腫瘤之殺死，超過缺乏Fas/41BB融合蛋白之細胞。
圖 ( 圖 ) 16B證實，投與經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白轉導之細胞的負載腫瘤小鼠對比經TCR 11N4A及CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)轉導且無FAS/41BB融合之細胞具有優良活體內存活率。
圖 ( 圖 ) 16C證實，已在SW527腫瘤細胞皮下接種之某些小鼠中實現完全反應，相比於未經轉導之T細胞(頂部線)，該等小鼠接受約1×10 7個經A11 G12V TCR、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS-41BB (底部線)進行慢病毒轉導之初代CD4/CD8 T細胞的單次靜脈內投與。
圖 ( 圖 ) 16D證實，投與經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白轉導之細胞的負載腫瘤小鼠相對於投與未經轉導之細胞之小鼠展示增強的存活率。展示在投與工程化CD4/CD8 T細胞後負載腫瘤小鼠之卡普蘭-邁耶存活曲線(Kaplan-Meier survival curve)。展示負載表現HLA-A*11:01及內源性KRAS突變G12V之SW527異種移植物之小鼠的存活機率。線描繪接受未經轉導(灰色)或經A11 G12V TCR、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS-41BB (頂部平坦線)進行慢病毒轉導之初代CD4/CD8 T細胞的負載腫瘤小鼠。細胞在轉導之後用抗CD3/CD28珠粒擴增7天。為起始實驗，當腫瘤達到約100 mm 3時，在SW527細胞皮下接種之後10天靜脈內投與10×10 6個經轉導之T細胞。冷凍保存T細胞且解凍，隨後投與。
圖 ( 圖 ) 17A - 17D證實，攜有KRAS TCR、CD8α/CD8β及FAS-41BB融合蛋白之細胞在其包含CD4 +及CD8 +細胞兩者時展示改善之抗腫瘤活性。 圖 17A為表現紅色螢光蛋白、HLA-A*11:01及內源性KRAS突變G12V之SW527腫瘤細胞株的匯合之圖，在活腫瘤目測分析法中監測，定量隨時間推移之紅色螢光信號。培養物包含SW527單培養物(灰色)或與未經轉導之CD4+/CD8+混合T細胞(黑色)或經A11 G12V TCR + CD8αb + FAS-41BB進行慢病毒轉導之CD4+ (紅色)、CD8+ (藍色)或CD4+/CD8+混合(綠色)T細胞共培養。初代T細胞用抗CD3/CD28珠粒活化，轉導後擴展5天，以0.5:1之初始比率與SW527細胞共培養，且每3天(由箭頭指示)添加額外的新鮮SW527細胞至培養物中。 圖 17B為總結如 圖 17A中進行但在SW620細胞中進行之相同實驗之結果的圖。 圖 17C為總結如 圖 17A中進行但在CFPAC1細胞中進行之相同實驗之結果的圖。 圖 17D為總結如 圖 17A中進行但在COR-L23細胞中進行之相同實驗之結果的圖。
圖 ( 圖 ) 18證實，經TCR 11N4A、CD8αβ輔受體(例如外源性CD8αβ輔受體)及FAS/41BB融合蛋白轉導之細胞在不存在外源性細胞介素支持下無法增殖，從而增強其安全概況。展示藉由在外源性細胞介素不存在之情況下每2-4天定量細胞來監測之CD4+/CD8+ T細胞之持久性(藉由細胞計數量測)的圖。展示未經轉導(灰線；頂部線)或經A11 G12V TCR + CD8αb + FAS-41BB轉導(底部線)之初代T細胞，其已在含有IL2/IL7/IL15之培養基中用抗CD3/CD28珠粒擴增7-10天且轉移至無細胞介素之培養基中。每2-4天補充一半培養基(無細胞介素)。
圖 ( 圖 ) 19說明若干慢病毒載體設計，其包含抗KRAS TCR、FAS-41BB融合蛋白及CD8α/CD8β。大部分設計考慮在單一轉譯RNA上在單一啟動子(「MSCV」或鼠類幹細胞病毒啟動子)下表現抗KRAS TCR (「TCRb」或「TCRa」)、CD8α/CD8β (「CD8a」或「CD8b」)及FAS-41BB (「FasBB」)，其中使用編碼自裂解肽(「P2A」、「T2A」、「F-P2A」)之同框序列分隔編碼獨立多肽之區域。一些(22992-8、22992 -9)涉及在獨立啟動子(「PGK」或磷酸甘油酸激酶啟動子)下表現Fas-41BB。
圖 ( 圖 ) 20證實，藉由涉及包含抗KRAS TCR、FAS-41BB融合蛋白及CD8α/CD8β之單一載體的製造策略產生之T細胞相對於藉由涉及獨立載體上之抗KRAS TCR及FAS-41BB融合蛋白的策略產生之細胞顯示優良的TCR表現及表面活性。 圖 20A展示慢病毒載體之替代性設計。 圖 20B展示如先前所述經產生之慢病毒載體轉導之T細胞的FACS分析。 圖 20C展示表現包含抗KRAS TCR之順反子之細胞的百分比(「2A+%」)、表現功能性TCR及包含抗KRAS TCR之順反子之細胞的百分比(「Tet+2A+%」)、總功能性TCR表現(「Tet MFI」)、FAS-41BB融合蛋白表現(「Fas MFI」)及CD4+細胞之CD8α/CD8β輔受體表現(「CD4+下CD8 MFI」)。FACS分析表明，就TCR及CD8表現而言，單一慢病毒策略(「22992-4」)優於雙重慢病毒策略(「2慢病毒」)。
圖 ( 圖 ) 21A展示藉由涉及單一載體之製造策略產生之T細胞的活化，該單一載體包含抗KRAS TCR、FAS-41BB融合蛋白及CD8α/CD8β或雙重載體系統。
圖 ( 圖 ) 21B展示此等細胞當以新鮮TCR-T細胞形式投與時或在各種腫瘤細胞株中解凍後的細胞殺死活性。
圖 ( 圖 ) 22A展示藉由涉及單一載體之製造策略產生之T細胞的長期重複刺激及腫瘤細胞殺死，該單一載體包含抗KRAS G12V TCR、FAS-41BB融合蛋白及CD8α/CD8β或雙重載體系統。
圖 ( 圖 ) 22B展示在活體內異種移植模型中投與此等細胞之後腫瘤細胞體積之變化。
圖 ( 圖 ) 22C展示在活體內異種移植模型中投與包含抗KRAS G12D TCR、FAS-41BB融合蛋白及CD8α/CD8β之細胞之後的腫瘤細胞體積變化。

Claims (111)

  1. 一種聚核苷酸，其包含編碼以下之核酸序列： (a)結合蛋白，其中該結合蛋白包含： (i)T細胞受體(TCR)或其功能衍生物；或 (ii)嵌合抗原受體(CAR)或其功能衍生物；及 (b)融合蛋白，其中該融合蛋白包含： (i)包含CD95配位體(FasL)結合域之細胞外組分，該CD95配位體結合域包含CD95 (Fas)胞外域或其功能片段；及 (ii)包含CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域之細胞內組分，其中編碼該結合蛋白之該核酸序列位於編碼該融合多肽之該核酸序列的上游。
  2. 如請求項1之聚核苷酸，其進一步包含編碼以下之核酸序列： (c) CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體，其中編碼該結合蛋白之該序列位於編碼CD8輔受體α或β鏈或其該部分或變異體之細胞外部分的該序列的上游。
  3. 如請求項1之聚核苷酸，其進一步包含編碼以下之核酸序列： (c) CD8輔受體α及β鏈或其部分或變異體，其中編碼該結合蛋白之該序列位於編碼該CD8輔受體α及β鏈或其該等部分或變異體之細胞外部分的該序列的上游。
  4. 如請求項1至3中任一項之聚核苷酸，其中編碼該融合蛋白之該核酸序列進一步編碼： (d)介於該融合蛋白之該細胞外組分與該細胞內組分之間的疏水性組分。
  5. 如請求項1至4中任一項之聚核苷酸，其中該結合蛋白包含結合於肽:HLA複合物之結合域，其中該複合物包含新抗原肽及HLA蛋白。
  6. 如請求項1至5中任一項之聚核苷酸，其中該結合蛋白包含單鏈TCR (scTCR)或單鏈T細胞受體可變片段(scTv)。
  7. 如請求項1至5中任一項之聚核苷酸，其中該結合蛋白包含TCR α鏈可變(Vα)域或TCR β鏈可變(Vβ)域。
  8. 如請求項1至6中任一項之聚核苷酸，其中該結合蛋白包含TCR α鏈可變(Vα)域及TCR β鏈可變(Vβ)域。
  9. 如請求項1至8中任一項之聚核苷酸，其中該CD95 (Fas)配位體結合域為Fas胞外域或其功能片段。
  10. 如請求項1至9中任一項之聚核苷酸，其中該細胞內組分為CD137 (4-1BB)跨膜域或其功能片段。
  11. 如請求項1至10中任一項之聚核苷酸，其中該CD95 (Fas)胞外域或其功能片段包含與SEQ ID NO: 81具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列，或該CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO:82具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。
  12. 如請求項1至10中任一項之聚核苷酸，其中該融合蛋白包含與SEQ ID NO: 80具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。
  13. 如請求項1至10中任一項之聚核苷酸，其中編碼該融合蛋白之該核酸序列包含與SEQ ID NO: 83具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之聚核苷酸，其中該CD95 (Fas)胞外域或其功能片段包含SEQ ID NO: 81之殘基R68、F97、K100、R102、R103、L106、F133、H142中的至少一者。
  15. 如請求項1至14中任一項之聚核苷酸，其中該CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域或其一部分或變異體包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。
  16. 如請求項2或3之聚核苷酸，其中該CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列或SEQ ID NO: 66之胺基酸序列。
  17. 如請求項5至16中任一項之聚核苷酸，其中該新抗原肽為KRAS、HRAS、NRAS、p53或PIK3CA突變肽。
  18. 如請求項17之聚核苷酸，其中該KRAS突變肽包含x-V-G-A-x-G-x-x-K，其中x表示任何胺基酸。
  19. 如請求項17或18之聚核苷酸，其中該KRAS突變肽為KRAS G12V突變肽。
  20. 如請求項19之聚核苷酸，其中該KRAS G12V突變肽包含胺基酸序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO:2)或VVGAVGVGK (SEQ ID NO:3)。
  21. 如請求項5至20中任一項之聚核苷酸，其中該HLA蛋白由HLA-A*11或HLA-A*11:01對偶基因編碼。
  22. 如請求項7至21中任一項之聚核苷酸，其進一步包含編碼自裂解肽之核酸序列，該核酸序列介於編碼TCR受體可變α (Vα)區之核酸序列與編碼TCR受體可變β (Vβ)區之核酸序列之間。
  23. 如請求項2或3之聚核苷酸，其進一步包含編碼自裂解肽之核酸序列，該自裂解肽安置於(a)與(b)之間或在存在(c)下安置於(b)與(c)之間。
  24. 如請求項2或3之聚核苷酸，其進一步包含編碼自裂解肽之核酸序列，該核酸序列介於編碼該CD8輔受體α鏈之該序列與編碼該CD8輔受體β鏈之該序列之間。
  25. 如請求項2至24中任一項之聚核苷酸，其進一步包含編碼自裂解肽之核酸序列，該核酸序列安置於編碼結合蛋白之該核酸序列與編碼包含CD8輔受體α鏈之細胞外部分之多肽的該核酸序列之間；及/或安置於編碼結合蛋白之該核酸序列與編碼包含CD8輔受體β鏈之細胞外部分之多肽的該核酸序列之間。
  26. 如請求項23至25中任一項之聚核苷酸，其進一步包含同框可操作地連接的以下各者： (iii)  (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)-(pnFP)；或 (iv)   (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)-(pnFP)； (iii)  (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnFP)-(pnSCP 1)-(pnCD8α)-(pnSCP 2)-(pnCD8β)；或 (iv)   (pnBP)-(pnSCP 1)-(pnFP)-(pnSCP 1)-(pnCD8β)-(pnSCP 2)-(pnCD8α)； 其中pnCD8α為編碼包含CD8輔受體α鏈之細胞外部分之多肽的該核酸序列， 其中pnCD8β為編碼包含CD8輔受體β鏈之細胞外部分之多肽的該核酸序列， 其中pnBP為編碼結合蛋白之該核酸序列， 其中pnFP為編碼融合蛋白之該核酸序列，且 其中pnSCP 1及pnSCP 2各自獨立地為編碼自裂解肽之聚核苷酸，其中該等聚核苷酸及/或所編碼的該等自裂解肽視情況相同或不同。
  27. 如請求項22至26中任一項之聚核苷酸，其中該自裂解肽為P2A、T2A、E2A或弗林蛋白酶肽。
  28. 如請求項27之聚核苷酸，其中該P2A、T2A或E2A肽分別包含SEQ ID NO:74、75或76之胺基酸序列。
  29. 如請求項27之聚核苷酸，其中該弗林蛋白酶肽包含胺基酸序列RAKR。
  30. 如請求項22至29中任一項之聚核苷酸，其中該結合蛋白及該融合蛋白在單一構築體或連續基因體區段中進行編碼。
  31. 如請求項2至30中任一項之聚核苷酸，其中該結合蛋白、該融合蛋白及該CD8α或CD8β或兩者在單一構築體或連續基因體區段中進行編碼。
  32. 如請求項1至31中任一項之聚核苷酸，其中該結合蛋白及該融合蛋白在單一開放閱讀框架中進行編碼。
  33. 如請求項1至32中任一項之聚核苷酸，其中結合蛋白及融合蛋白可操作地連接於單一啟動子。
  34. 如請求項1至32中任一項之聚核苷酸，其中結合蛋白及融合蛋白可操作地連接於不同啟動子。
  35. 一種載體，其包含如請求項1至34中任一項之聚核苷酸。
  36. 如請求項35之載體，其中該載體為病毒載體。
  37. 如請求項36之載體，其中該病毒載體為慢病毒載體或γ-反轉錄病毒載體。
  38. 一種宿主細胞，其包含如請求項1至34中任一項之聚核苷酸或如請求項35至37中任一項之載體。
  39. 如請求項38之宿主細胞，其中該宿主細胞在外源性細胞介素不存在之情況下不複製超過5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、24、36或48小時。
  40. 如請求項38或39之宿主細胞，其中該宿主細胞為造血先驅細胞或人類免疫細胞。
  41. 如請求項40之宿主細胞，其中該宿主細胞為人類免疫細胞，其中該人類免疫細胞包含T細胞、NK細胞、NK-T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球或其任何組合。
  42. 如請求項41之宿主細胞，其中該人類免疫細胞包含T細胞，其中該T細胞包含CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、γδ T細胞、初始T細胞、中樞記憶T細胞、幹細胞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。
  43. 一種用於治療個體之與KRAS G12V突變或NRAS G12V突變或HRAS G12V突變相關之疾病或病症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項38至42中任一項之宿主細胞。
  44. 如請求項43之方法，其中該疾病或病症包含癌症。
  45. 如請求項44之方法，其中該癌症為實體癌症或血液惡性病。
  46. 如請求項44或45之方法，其中該癌症為胰臟癌或癌瘤，視情況為胰管腺癌(PDAC)；結腸直腸癌或癌瘤；肺癌，視情況為非小細胞肺癌；膽癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，視情況為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(視情況為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良之甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突狀細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星形細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；被套細胞淋巴瘤；不可分類之骨髓發育不良/骨髓增生性贅瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；母細胞過量之難治性貧血-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關之AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。
  47. 如請求項43至46中任一項之方法，其中非經腸或靜脈內向該個體投與該有效量之該宿主細胞。
  48. 如請求項43至47中任一項之方法，其中該有效量包含約10 4個細胞/kg至約10 11個細胞/kg。
  49. 如請求項43至48中任一項之方法，其中該有效量包含CD4 +T細胞及CD8 +T細胞。
  50. 如請求項43至49中任一項之方法，其中該方法進一步包含向該個體投與細胞介素。
  51. 如請求項50之方法，其中該細胞介素包含IL-2、IL-15或IL-21。
  52. 如請求項43至51中任一項之方法，其中該個體已接受或正接受免疫檢查點抑制劑及/或免疫檢查點刺激劑之促效劑。
  53. 如請求項43至52中任一項之方法，其中該個體已接受骨髓清除療法。
  54. 如請求項44至52中任一項之方法，其中在投與該有效量之該等宿主細胞後一段時間內，該癌症降低至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
  55. 如請求項54之方法，其中該段時間包含少於或等於120天、少於或等於60天、少於或等於50天、少於或等於40天、少於或等於30天或少於或等於20天。
  56. 如請求項43至56中任一項之方法，其進一步包含投與至少第二劑量。
  57. 一種引發針對表現新抗原之細胞之免疫反應的方法，該方法包含使該細胞與包含如請求項1至35中任一項之聚核苷酸或如請求項35至37中任一項之載體的細胞接觸。
  58. 一種引發針對表現新抗原之細胞之免疫反應的方法，該方法包含使該細胞與如請求項38至42中任一項之宿主細胞接觸。
  59. 如請求項57或58之方法，其中該細胞為癌細胞。
  60. 如請求項58之方法，其中該癌細胞為胰臟癌細胞、肺癌細胞或結腸直腸癌細胞。
  61. 如請求項58之方法，其中該胰臟癌細胞為胰管腺癌細胞。
  62. 如請求項60之方法，其中該肺癌細胞為非小細胞肺癌細胞。
  63. 一種基因工程化免疫細胞之方法，該方法包含使該細胞與聚核苷酸接觸，該聚核苷酸包含編碼T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體、CD8α及/或CD8β輔受體或其功能片段或變異體及包含CD95 (Fas)胞外域或其功能片段及包含CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域之細胞內組分之融合蛋白的核酸序列，及擴增該免疫細胞。
  64. 如請求項63之方法，其中該聚核苷酸為如請求項1至34中任一項之聚核苷酸或如請求項35至37中任一項之載體。
  65. 一種宿主細胞，其包含： (a)融合蛋白，其中該融合蛋白包含： (i)包含CD95配位體(FasL)結合域之細胞外組分，該CD95配位體結合域包含CD95 (Fas)胞外域或其功能片段；及 (ii)包含CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域之細胞內組分，其中編碼該結合蛋白之核酸序列位於編碼該融合多肽之核酸序列的上游；及 (b)外源性CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體。
  66. 如請求項65之宿主細胞，其中該外源性CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體自CD8輔受體α或β鏈之原生基因座以外之基因座表現。
  67. 如請求項65或66之宿主細胞，其中該宿主細胞包含編碼包含非原生3'或5'非轉譯區(UTR)之該外源性CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體之mRNA。
  68. 如請求項67之宿主細胞，其中該非原生3'或5' UTR為病毒UTR、腺病毒UTR或慢病毒UTR。
  69. 如請求項65至68中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞包含原生TCR。
  70. 如請求項65至69中任一項之宿主細胞，其中該融合蛋白進一步編碼介於該融合蛋白之該細胞外組分與該細胞內組分之間的疏水性組分。
  71. 如請求項65至70中任一項之宿主細胞，其中該CD95 (Fas)配位體結合域為Fas胞外域或其功能片段。
  72. 如請求項65至71中任一項之宿主細胞，其中該細胞內組分為CD137 (4-1BB)跨膜域或其功能片段。
  73. 如請求項65至72中任一項之宿主細胞，其中該CD95 (Fas)胞外域或其功能片段包含與SEQ ID NO: 81具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列，或該CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO:82具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。
  74. 如請求項65至73中任一項之宿主細胞，其中該融合蛋白包含與SEQ ID NO: 80具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。
  75. 如請求項65至74中任一項之宿主細胞，其中該CD95 (Fas)胞外域或其功能片段包含SEQ ID NO: 81之殘基R68、F97、K100、R102、R103、L106、F133、H142中的至少一者。
  76. 如請求項65至75中任一項之宿主細胞，其中該CD137 (4-1BB)細胞內信號傳導域或其一部分或變異體包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。
  77. 如請求項65至76中任一項之宿主細胞，其中該CD8輔受體α或β鏈或其一部分或變異體包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列或SEQ ID NO: 66之胺基酸序列。
  78. 如請求項65至77中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞進一步包括包含外源性TCR之結合蛋白。
  79. 如請求項78之宿主細胞，其中該結合蛋白包含結合於肽:HLA複合物之結合域，其中該複合物包含新抗原肽及HLA蛋白。
  80. 如請求項79之宿主細胞，其中該新抗原肽為KRAS、HRAS、NRAS、p53或PIK3CA突變肽。
  81. 如請求項80之宿主細胞，其中該KRAS突變肽包含x-V-G-A-x-G-x-x-K，其中x表示任何胺基酸。
  82. 如請求項80或81之宿主細胞，其中該新抗原肽為KRAS突變肽，其中該KRAS突變肽為KRAS G12V突變肽。
  83. 如請求項82之宿主細胞，其中該KRAS G12V突變肽包含胺基酸序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO:2)或VVGAVGVGK (SEQ ID NO:3)。
  84. 如請求項79至83中任一項之宿主細胞，其中該HLA蛋白由HLA-A*11或HLA-A*11:01對偶基因編碼。
  85. 如請求項65至77中任一項之宿主細胞，其中該融合蛋白及該CD8α或CD8β或兩者在單一構築體或連續基因體區段中進行編碼。
  86. 如請求項65至78中任一項之宿主細胞，其中該融合蛋白及該CD8α或CD8β或兩者在單一開放閱讀框架中進行編碼。
  87. 如請求項65至86中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞在外源性細胞介素不存在之情況下不複製超過5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、24、36或48小時。
  88. 如請求項65至87中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞為造血先驅細胞或人類免疫細胞。
  89. 如請求項88之宿主細胞，其中該宿主細胞為人類免疫細胞，其中該人類免疫細胞包含T細胞、NK細胞、NK-T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核球或其任何組合。
  90. 如請求項89之宿主細胞，其中該人類免疫細胞為T細胞，其中該T細胞包含CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 -CD8 -雙陰性T細胞、γδ T細胞、初始T細胞、中樞記憶T細胞、幹細胞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。
  91. 一種治療個體之癌症的方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項65至90中任一項之宿主細胞。
  92. 如請求項91之方法，其中該宿主細胞進一步包含針對由該癌症顯示之抗原的TCR。
  93. 如請求項91至92中任一項之方法，其中該癌症為胰臟癌或癌瘤，視情況為胰管腺癌(PDAC)；結腸直腸癌或癌瘤；肺癌，視情況為非小細胞肺癌；膽癌；子宮內膜癌或癌瘤；子宮頸癌；卵巢癌；膀胱癌；肝癌；骨髓性白血病，視情況為諸如急性骨髓性白血病之骨髓性白血病；骨髓發育不良症候群；淋巴瘤，諸如非霍奇金氏淋巴瘤；慢性骨髓單核球白血病；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；泌尿道癌症；小腸癌；乳癌或癌瘤；黑色素瘤(視情況為皮膚黑色素瘤、肛門黑色素瘤或黏膜黑色素瘤)；神經膠質瘤；分化不良之甲狀腺癌；神經母細胞瘤；組織細胞及樹突狀細胞贅瘤；1型神經纖維瘤病；橫紋肌肉瘤；軟組織肉瘤；膀胱癌；肉瘤；神經膠母細胞瘤；鱗狀細胞肺癌；退行性星形細胞瘤；慢性骨髓性白血病；瀰漫性大B細胞淋巴瘤；雙擊淋巴瘤；頭頸癌；頭頸鱗狀細胞癌；肝細胞癌；惡性周邊神經鞘腫瘤；被套細胞淋巴瘤；不可分類之骨髓發育不良/骨髓增生性贅瘤；周邊T細胞淋巴瘤；前列腺癌；母細胞過量之難治性貧血-2；腎細胞癌；橫紋肌瘤；神經鞘瘤；繼發性AML；小細胞肺癌；治療有關之AML；胸腺癌；甲狀腺濾泡癌；惡性甲狀腺贅瘤；甲狀腺癌；甲狀腺腺癌；尿道上皮癌；或甲狀腺乳頭狀癌。
  94. 如請求項91至93中任一項之方法，其中非經腸或靜脈內向該個體投與該有效量之該宿主細胞。
  95. 如請求項91至94中任一項之方法，其中該有效量包含約10 4個細胞/kg至約10 11個細胞/kg。
  96. 如請求項91至95中任一項之方法，其中該有效量包含CD4 +T細胞及CD8 +T細胞。
  97. 如請求項91至96中任一項之方法，其中該方法進一步包含向該個體投與細胞介素。
  98. 如請求項97之方法，其中該細胞介素包含IL-2、IL-15或IL-21。
  99. 如請求項91至98中任一項之方法，其中該個體已接受或正接受免疫檢查點抑制劑及/或免疫檢查點刺激劑之促效劑。
  100. 如請求項91至99中任一項之方法，其中該個體已接受骨髓清除療法。
  101. 如請求項91至100中任一項之方法，其中在投與該有效量之該宿主細胞後一段時間內，該癌症降低至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
  102. 如請求項101之方法，其中該段時間包含少於或等於120天、少於或等於60天、少於或等於50天、少於或等於40天、少於或等於30天或少於或等於20天。
  103. 如請求項91至102中任一項之方法，其進一步包含投與至少第二劑量。
  104. 如請求項91至103中任一項之方法，其中該等宿主細胞已藉由表3中所描述之方法中之任一者驗證。
  105. 一種組合物，其包含複數個宿主細胞，其中該等宿主細胞包含針對突變KRAS肽之T細胞，其中該組合物： (a)包含藉由流動式細胞量測術評定，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更多的用對突變KRAS肽具特異性之dextramer染色之CD3+細胞； (b)包含藉由流動式細胞量測術評定，至少80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或更多的CD3陽性T細胞； (c)包含藉由自動細胞計數評定，至少70%、75%、80%、85%、90%或更多的活細胞。
  106. 如請求項105之組合物，其包含如請求項38至42或65至90中任一項之宿主細胞。
  107. 如請求項105或106之組合物，其中該組合物包含藉由流動式細胞量測術評定，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更多的用對突變KRAS G12V肽具特異性之dextramer染色之CD3+細胞。
  108. 如請求項105至107中任一項之組合物，其中該組合物包含藉由流動式細胞量測術評定，至少80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或更多的CD3陽性T細胞。
  109. 如請求項105至108中任一項之組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
  110. 一種組合物，其包含如請求項38至42或65至90中任一項之宿主細胞及醫藥學上可接受之賦形劑。
  111. 一種組合物，其包含如請求項1至34中任一項之聚核苷酸或如請求項35至37中任一項之載體及醫藥學上可接受之賦形劑。 [1]對經純化塊體進行測試 [2]對塊體收穫物進行測試 [3]對病毒上清液以及生產細胞結束進行RCL測試 [4]對塊體收穫物進行測試 [5]對經純化塊體進行測試
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