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TW202405167A - 具有改良熱穩定性之經工程化之聚合酶 - Google Patents

具有改良熱穩定性之經工程化之聚合酶 Download PDF

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TW202405167A
TW202405167A TW112121711A TW112121711A TW202405167A TW 202405167 A TW202405167 A TW 202405167A TW 112121711 A TW112121711 A TW 112121711A TW 112121711 A TW112121711 A TW 112121711A TW 202405167 A TW202405167 A TW 202405167A
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polymerase
group
amino acid
nucleotide
nucleic acid
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TW112121711A
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詹德里克 漢歇爾
麥可 克蘭
馬克 安布羅索
泰勒 羅培茲
馬修 凱林格
維吉妮亞 薩迪
蘭姆克利斯納 艾德海卡力
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美商元素生物科學股份有限公司
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Abstract

本文提供古菌聚合酶之經工程化變異體，其相對於野生型聚合酶展現出核酸外切酶負活性、熱穩定性增強、經3'修飾之核苷酸併入增強、尿嘧啶耐受性改良及/或降低聚合酶催化之核苷酸結合及延伸反應的序列特異性誤差。本發明亦提供該等經工程化聚合酶用於形成複合聚合酶及形成結合複合物之用途，以及用於進行核酸定序反應之用途。

Description

具有改良熱穩定性之經工程化之聚合酶
本發明提供經工程化以用於改良之熱穩定性、展現經改良核苷酸試劑結合及/或經改良核苷酸試劑結合及併入、改良之尿嘧啶耐受性及/或經降低序列特異性定序誤差的突變聚合酶。例示性核苷酸試劑包括可偵測標記之核苷酸、未經標記之核苷酸、包含3'鏈終止部分之核苷酸、磷酸酯鏈標記之核苷酸及多價分子。在一些實施例中，經工程化聚合酶展現出自核苷酸聚合構形至核酸外切酶構形之減少的轉變。與野生型聚合酶相比，突變聚合酶展現出增加之併入比率。
次代定序(NGS)技術已成為用於獲取分子生物學技術、分類學、農業科學、醫學診斷及新療法開發中使用之定序資料的一個強大工具。本發明提供可用於進行任何核酸定序方法的經工程化聚合酶，其採用經標記或未標記之鏈終止核苷酸，其中該等鏈終止核苷酸在糖3'位置處包括3'-O-疊氮基(或3'-O-甲基疊氮基)或任何其他類型之大體積封端基團。舉例而言，可使用經工程化聚合酶，使用經標記之多價分子及未標記之鏈終止核苷酸進行親合力定序(sequencing-by-avidity，SBA)方法。另外，經工程化聚合酶亦可用於進行採用經標記之鏈終止核苷酸的合成定序(sequencing-by-synthesis，SBS)方法，以及採用未標記之鏈終止核苷酸的結合定序(sequencing-by-binding，SBB)方法。
僅在一股DNA中添加單一核苷酸無法產生容易偵測之足夠訊號。當前可用的SBS技術藉由增加核苷酸添加之訊號雜訊比結合具有足夠靈敏度以進行準確鹼基判讀之偵測方法克服了此問題。大部分商業上成功之平台採用在空間受限之基質中進行之單株模板DNA擴增以產生含有查詢序列之多個複本的分散之DNA島。此擴增得到DNA複本之「群落」，由此使得在所有複本上添加單一DNA鹼基以足以克服訊號雜訊比問題之方式集中偵測模式。關於DNA之多個空間受限之一致複本的定序進一步增加對控制性步進機制的依賴性以確保可添加一個且僅一個核苷酸鹼基，從而確保DNA群落內之所有複本皆相對於彼此保持在相同位置(N、N+1、N+2、N+3等)。
執行SBS所需的分子引擎係DNA聚合酶。在活體內，此類酶負責DNA複製及維持基因體完整性。在原生條件下，DNA依賴性DNA聚合酶(dDdP)催化沿5'至3'方向將去氧核苷酸三磷酸酯(dNTP)添加至DNA中，在引子DNA末端之3'羥基與進入的核苷酸之5'α磷酸酯之間產生磷酸二酯鍵。歸因於正確進入的dNTP與模板鹼基之間的氫鍵結，此化學反應以高保真度發生而得到正確的華特生-克里克鹼基對(Watson-Crick base pair)。此「正確」的鹼基配對誘導酶之構形變化，由此對準催化性胺基酸以高效執行磷酸二酯鍵形成。新添加的dNTP亦具有3'OH，其被用於下一輪催化以進一步延伸DNA股。
為確保在每個SBS循環中，僅單一dNTP添加至生長之DNA股，採用可逆地終止之dNTP。此等鹼基含有阻斷後續數輪併入的針對dNTP之3'羥基的修飾。商業上最成功的可逆終止劑係3'甲基疊氮基，但亦已使用其他終止劑，包括3'胺基烯丙基及3'氧胺。此等可逆終止之dNTP各自以相同方式起作用；一旦併入，大體積的3'嵌段會因無3'羥基存在而抑制下一個核苷酸之添加。當暴露於催化劑時，3'嵌段反應而再生能夠在接下來的循環期間形成新磷酸二酯鍵的3'羥基。儘管有效，但此等大體積的3'修飾為聚合酶提供一個難題。
對於高保真度基因體複製及穩定性之進化需求使得聚合酶在每10 4-10 7個併入事件中僅併入一個非華特生-克里克鹼基對。聚合酶通常亦需要判別細胞環境中大量過量的核苷酸。核苷酸之間的判別通常經由空間閘(steric gate)進行，在此情況下，2'羥基之存在在空間上與核苷酸結合位點處之胺基酸側鏈衝突，以針對核苷酸結合及催化進行選擇。另外，由於含有非活性3'羥基之鹼基可充當抑制DNA合成之鏈終止劑，故對核苷酸3'羥基之破壞或修飾亦被該酶感測到。此等不想要之鹼基的判別係經由動力學路徑發生，其中不正確的核苷酸受質以較弱的總體親和力結合且磷酸二酯鍵以變慢10 2-10 4個數量級之速率形成。此係由於缺少將適當地對準催化性胺基酸以形成鍵的誘導擬合而發生。因此，自然進化之聚合酶不良地併入可逆鏈終止劑核苷酸。
在通篇本申請案中，引用多個公開案、專利及/或專利申請案。該等公開案、專利及/或專利申請案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中，以便更充分地描述本發明所涉及之技術現狀。 相關申請之交叉引用
本申請案主張於2022年6月10日申請之美國臨時申請案第63/351,294號；2023年11月4日申請之63/422,855；及2023年3月21日申請之63/491,374的優先權及權益；其全部揭示內容特此以全文引用之方式併入。 序列表
本申請案含有已以XML格式以電子方式提交且特此以全文引用之方式併入之序列表。該XML複本，在2023年6月7日創建，命名為55744WO_CRF_sequencelisting且大小為5,651千位元組。
定義：
本文提供之標題並非限制本發明之各種態樣，該等態樣可藉由參考整體說明書來理解。
除非另外定義，除非另外定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有一般技術者通常所瞭解之含義。一般而言，本文所描述的關於分子生物學、核酸化學、蛋白質化學、遺傳學、微生物學、轉殖基因細胞製造及雜交之技術的術語係此項技術中熟知且常用的術語。本文所描述之技術及程序一般係根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及論述之各種一般性及更具體的參考文獻中所描述執行。舉例而言，參見Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第三版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2000)。亦參見Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)。結合本文所描述之實驗程序及技術使用的命名法以及該等實驗程序及技術係此項技術中熟知且常用者。
除非本文上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。除非清楚地且明確地限於一個提及物，否則單數形式「一(a/an)」及「該」以及單數形式使用之任何詞語均包括複數個提及物。
應理解，使用替代術語(例如「或」)應意謂替代方案中的一者或兩者或其任何組合。
本文所用之術語「及/或」應意謂特定地揭示所指定特徵或組分中之每一者(在存在或不存在其他特徵或組分之情況下)。舉例而言，如本文在片語諸如「A及/或B」中所使用，術語「及/或」意欲包括：「A及B」；「A或B」；「A」(單獨A)；及「B」(單獨B)。以類似方式，如在片語諸如「A、B及/或C」中所使用，術語「及/或」意圖涵蓋以下態樣中之各者：「A、B及C」；「A、B或C」；「A或C」；「A或B」；「B或C」；「A及B」；「B及C」；「A及C」；「A」(單獨A)；「B」(單獨B)；及「C」(單獨C)。
如本文及所附申請專利範圍中所使用，本文所使用的術語「包含」、「包括」、「具有」及「含有」及其文法變型意欲為非限制性的，因此清單中的一個項目或多個項目不排除可經取代或添加至所列項目中的其他項目。應理解，每當本文中用語言「包含」描述態樣時，則亦另外提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」所描述之類似態樣。
如本文所使用，術語「約」及「大約」係指經一般熟習此項技術者測定，在特定值或組成的可接受之誤差範圍內的值或組成，此該部分取決於如何量測或測定該值或組成，亦即，量測系統之限制。舉例而言，「約」或「大致」可意謂根據此項技術中之實踐在一個或超過一個標準差內。或者，取決於量測系統之限制，「約」或「大約」可意謂至多10% (亦即，±10%)或更高百分比的範圍。舉例而言，約5 mg可包括4.5 mg與5.5 mg之間之任何數值。此外，尤其在生物系統或方法方面，該等術語可意謂值之至多一個數量級或至多5倍。當本發明提供特定值或組成時，除非另外說明，否則「約」或「大致」之含義應假定在該特定值或組成之可接受誤差範圍內。另外，在提供值之範圍及/或子範圍時，該等範圍及/或子範圍可包括該等範圍及/或子範圍之端點。
本文所用之術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」及其他相關術語可互換使用且係指胺基酸聚合物且不限於任何特定長度。多肽可包含天然及非天然胺基酸。多肽包括重組或以化學方式合成的形式。多肽亦包括尚未經歷轉譯後修飾之前驅體分子，該轉譯後修飾為諸如蛋白水解裂解、由核糖體跳躍引起之裂解、羥基化、甲基化、脂質化、乙醯化、類小泛素化、泛素化、糖基化、磷酸化及/或二硫鍵形成。此等術語涵蓋天然及人造蛋白質、蛋白質序列之蛋白質片段及多肽類似物(諸如突變蛋白、變異體、嵌合蛋白及融合蛋白)以及轉譯後或共價或非共價修飾之蛋白質。
如本文所使用，術語「聚合酶」及其變異體包含可催化核苷酸(包括其類似物)聚合形成核酸股之任何酶。通常但非必需地，該等核苷酸聚合可以模板依賴性方式進行。通常，聚合酶包含一或多個活性位點，在該一或多個活性位點處可發生核苷酸結合及/或核苷酸聚合之催化。在一些實施例中，聚合酶包括其他酶活性，諸如3'至5'外切核酸酶活性或5'至3'外切核酸酶活性。在一些實施例中，聚合酶具有股置換活性。聚合酶可包括但不限於天然存在之聚合酶以及其任何次單元及截斷形式、突變聚合酶、變異型聚合酶、重組聚合酶、融合聚合酶或以其他方式經工程化聚合酶、化學修飾之聚合酶、合成分子或組裝體，及其保持催化核苷酸聚合之能力的任何類似物、衍生物或片段(例如催化活性片段)。在一些實施例中，聚合酶可自細胞分離，或使用重組DNA技術或化學合成方法產生。在一些實施例中，聚合酶可在原核生物、真核生物、病毒或噬菌體生物體中表現。在一些實施例中，聚合酶可為轉譯後修飾的蛋白質或其片段。聚合酶可來源於原核生物、真核生物、病毒或噬菌體。聚合酶包含DNA指導之DNA聚合酶及RNA指導之DNA聚合酶。
如本文所使用，術語「保真度」係指模板依賴性DNA聚合酶進行之DNA聚合的準確度。DNA聚合酶之保真度通常係由錯誤率(併入不準確核苷酸，亦即不與模板核苷酸互補之核苷酸的頻率)量測。DNA聚合之準確度或保真度係藉由DNA聚合酶之聚合酶活性及3'-5'外切核酸酶活性維持。
如本文所使用，術語「結合複合物」係指藉由將核酸雙螺旋體、聚合酶及多價分子之游離核苷酸或核苷酸單元結合在一起形成的複合物，其中該核酸雙螺旋體包含與核酸引子雜交之核酸模板分子。在結合複合物中，游離核苷酸或核苷酸單元可結合至或可不結合至核酸引子3'端與核酸模板分子中之互補核苷酸相對的位置處。「三元複合物」係藉由將核酸雙螺旋體、聚合酶及多價分子之游離核苷酸或核苷酸單元結合在一起形成的結合複合物之一個實例，其中該游離核苷酸或核苷酸單元結合至核酸引子(作為核酸雙螺旋體之一部分) 3'端與核酸模板分子中之互補核苷酸相對的位置處。
術語「存留時間」及相關術語係指結合複合物保持穩定而任何組分不解離的時間長度，其中結合複合物之組分包括核酸模板及核酸引子、聚合酶、多價分子之核苷酸單元或游離(例如非結合)核苷酸。核苷酸單元或游離核苷酸可與模板分子中之核苷酸殘基互補或不互補。核苷酸單元或游離核苷酸可結合至核酸引子3'端與核酸模板分子中之互補核苷酸殘基相對的位置處。存留時間指示結合複合物之穩定性及結合相互作用之強度。存留時間可藉由觀察結合複合物之發生及/或持續時間量測，諸如藉由觀察來自結合複合物之經標記組分的訊號量測。舉例而言，經標記核苷酸或包含一或多個核苷酸之經標記試劑可存在於結合複合物中，因此允許在結合複合物之存留時間期間偵測來自標記之訊號。一個例示性標記係螢光標記。結合複合物(例如三元複合物)保持穩定，直至經歷引起聚合酶、模板分子、引子中的任一者及/或核苷酸單元或核苷酸之間之相互作用解離的條件。舉例而言，解離條件包含使結合複合物與洗滌劑、EDTA及/或水中之任一者或任何組合接觸。
本文所用之術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」以及其他相關術語可互換使用且係指核苷酸之聚合物且不限於任何特定長度。核酸包括重組形式及化學合成形式。核酸包括DNA分子(例如cDNA或基因體DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸類似物(例如肽核酸及非天然存在的核苷酸類似物)所產生的DNA或RNA類似物，以及含有DNA及RNA之嵌合形式。核酸可為單股或雙股的。核酸包含核苷酸之聚合物，其中核苷酸包括天然或非天然鹼基及/或糖。核酸包含天然存在之核苷間鍵聯，例如磷酸二酯鍵。核酸包含非天然核苷間鍵聯，包括硫代磷酸酯、硫代磷酸酯或肽核酸(PNA)鍵聯。在一些實施例中，核酸包含一種類型的聚核苷酸或兩種或更多種不同類型之聚核苷酸之混合物。
本文所使用之術語「引子」及相關術語係指能夠與DNA及/或RNA聚核苷酸模板雜交形成雙螺旋體分子的天然或合成寡核苷酸。引子可具有任何長度，但通常在4-50個核苷酸範圍內。典型引子包含5'端及3'端。引子之3'端可包括3'OH部分，該部分充當聚合酶介導之引子延伸反應中的核苷酸聚合起始位點。或者，引子之3'端可沒有3'OH部分，或可包括末端3'封端基團，該基團抑制聚合酶介導之反應中之核苷酸聚合。沿引子長度之任一個核苷酸或超過一個核苷酸可用可偵測之報導體部分標記。引子可呈溶液形式(例如可溶性引子)或可固定至支撐物上(例如捕捉引子)。
術語「模板核酸」、「模板聚核苷酸」、「目標核酸」、「目標聚核苷酸」、「模板股」及其他變化形式係指充當產生互補核酸股之基礎核酸分子的核酸股。模板核酸之序列可與互補股之序列部分或完全互補。模板核酸可自天然存在之來源獲得，可為重組形式或可經化學合成以包括任何類型的核酸類似物。模板核酸可為線性、環狀或其他形式。模板核酸可以任何形式分離，包括染色體、基因體、細胞器(例如粒線體、葉綠體或核糖體)、重組分子、經選殖、經擴增、cDNA、RNA (諸如前驅mRNA或mRNA)、寡核苷酸、全基因體DNA、獲自新鮮冷凍的石蠟包埋之組織、針刺生檢、無細胞循環DNA或任何類型的核酸庫。模板核酸分子可自任何來源分離，包括自以下分離：生物體諸如原核生物、真核生物(例如人類、植物及動物)、真菌及病毒；細胞；組織；正常或病變細胞或組織、體液，包括血液、尿液、血清、淋巴液、腫瘤、唾液、肛門及陰道分泌物、羊膜樣品、汗液及精液；環境樣品；培養物樣品；或使用重組分子生物學化學合成方法製備的合成核酸分子。模板核酸可經歷核酸分析，包括定序及組成分析。
當用於核酸分子時，術語「雜交(hybridize/hybridizing/hybridization)」或其他相關術語係指兩個不同核酸之間進行氫鍵結形成雙螺旋體核酸。雜交亦包括單個核酸分子之兩個不同區域之間進行氫鍵結形成具有雙螺旋體區之自雜交分子。雜交可包含華特生-克里克或胡格斯坦(Hoogstein)結合形成雙螺旋體雙股核酸，或核酸分子內之雙股區。雙股核酸或單一核酸之兩個不同區可為完全互補或部分互補的。互補核酸股無需在其整個長度上彼此雜交。互補鹼基配對可為標準的A-T或C-G鹼基配對，或可為其他形式之鹼基配對相互作用。雙螺旋體核酸可包括錯配的鹼基配對核苷酸。
術語「核苷酸」及相關術語係指包含芳族鹼基、五碳糖(例如核糖或去氧核糖)及至少一個磷酸酯基之分子。標準或非標準核苷酸均符合該術語之使用。在一些實施例中，磷酸酯包含單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯，或相應磷酸酯類似物。在一些實施例中，核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個磷酸酯基。術語「核苷」係指包含芳族鹼基及糖之分子。
核苷酸(及核苷)通常包含包括通常見於核酸中的經取代或未經取代之含氮母雜芳族環的雜環鹼基，包括天然存在之核苷酸(及核苷)、經取代之核苷酸(及核苷)、經修飾之核苷酸(及核苷)或經工程化變異體或其類似物。核苷酸(或核苷)之鹼基能夠與適當互補鹼基形成華特生-克里克及/或胡格斯坦氫鍵。例示性鹼基包括但不限於嘌呤及嘧啶，諸如：2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、腺嘌呤(A)、乙烯基腺嘌呤、N 6-Δ 2-異戊烯基腺嘌呤(6iA)、N 6-Δ 2-異戊烯基-2-甲基硫代腺嘌呤(2ms6iA)、N 6-甲基腺嘌呤、鳥嘌呤(G)、異鳥嘌呤、N 2-二甲基鳥嘌呤(dmG)、7-甲基鳥嘌呤(7mG)、2-硫代嘧啶、6-硫代鳥嘌呤(6sG)、次黃嘌呤及O 6-甲基鳥嘌呤；7-去氮嘌呤，諸如7-去氮腺嘌呤(7-deaza-A)及7-去氮鳥嘌呤(7-deaza-G)；嘧啶，諸如胞嘧啶(C)、5-丙炔基胞嘧啶、異胞嘧啶、胸腺嘧啶(T)、4-硫代胸腺嘧啶(4sT)、5,6-二氫胸腺嘧啶、O 4-甲基胸腺嘧啶、尿嘧啶(U)、4-硫代尿嘧啶(4sU)及5,6-二氫尿嘧啶(二氫尿嘧啶；D)；吲哚，諸如硝基吲哚及4-甲基吲哚；吡咯，諸如硝基吡咯；水粉蕈素(nebularine)；肌苷；羥甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；鹼基(Y)；以及甲基化、糖基化及醯化鹼基部分；及類似物。額外例示性鹼基可見於以下中：Fasman, 1989, 於「Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology」中, 第385-394頁, CRC Press, Boca Raton, Fla。
核苷酸(及核苷)通常包含糖部分，諸如碳環部分(Ferraro and Gotor 2000 Chem. Rev. 100: 4319-48)、非環狀部分(Martinez等人, 1999 Nucleic Acids Research 27: 1271-1274; Martinez等人, 1997 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 第7卷: 3013-3016)及其他糖部分(Joeng等人, 1993 J. Med. Chem. 36: 2627-2638; Kim等人, 1993 J. Med. Chem. 36: 30-7; Eschenmosser 1999 Science 284:2118-2124；及美國專利第5,558,991號)。糖部分包含：核糖基；2'-去氧核糖基；3'-去氧核糖基；2',3'-二去氧核糖基；2',3'-二脫氫二去氧核糖基；2'-烷氧基核糖基；2'-疊氮基核糖基；2'-胺基核糖基；2'-氟核糖基；2'-巰基核糖基；2'-烷基硫代核糖基；3'-烷氧基核糖基；3'-疊氮基核糖基；3'-胺基核糖基；3'-氟核糖基；3'-巰基核糖基；3'-烷基硫代核糖基；碳環、非環狀或其他經修飾之糖。
在一些實施例中，核苷酸包含具有一個、兩個或三個磷原子之鏈，其中該鏈通常經由酯或磷醯胺鍵聯連結至糖部分之5'碳。在一些實施例中，核苷酸係具有磷鏈之類似物，在該磷鏈中，磷原子與插入之O、S、NH、亞甲基或伸乙基連接在一起。在一些實施例中，鏈中之磷原子包括經取代之側基，包括O、S或BH 3。在一些實施例中，該鏈包括經包括胺基磷酸酯基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基及O-甲基胺基磷酸酯基在內之類似物取代的磷酸酯基。
當用於核酸時，術語「延伸(extend/extending/extension/)」及其他變化形式係指將一或多個核苷酸併入核酸分子中。核苷酸併入包含一或多個核苷酸聚合至核酸股之末端3'OH端，引起核酸股之延伸。核苷酸併入可用天然核苷酸及/或核苷酸類似物進行。通常但非必需的，核苷酸併入係以模板依賴性方式發生。使核酸分子延伸之任何適合方法均可使用，包括由DNA聚合酶或RNA聚合酶催化之引子延伸。
術語「報導體部分(reporter moiety/reporter moieties)」或相關術語係指產生或使得產生可偵測訊號之化合物。報導體部分有時稱為「標記」。任何適合的報導體部分均可使用，包括發光部分、光致發光部分、電致發光部分、生物發光部分、化學發光部分、螢光部分、磷光部分、發色團、放射性同位素、電化學部分、質譜、拉曼(Raman)、半抗原、親和標籤、原子或酶。報導體部分由於化學或物理變化(例如熱、光、電、pH、鹽濃度、酶活性或鄰近事件)而產生可偵測訊號。鄰近事件包括彼此接近或彼此締合或彼此結合的兩個報導體部分。熟習此項技術者熟知選擇報導體部分以使得各自在可與其他報導體部分相區分之波長下激發放射線及/或發射螢光，由此允許監測在相同反應中或不同反應中不同報導體部分之存在。選擇的兩個或更多個不同報導體部分可具有在光譜上不同之發射譜，或具有重疊最少之頻譜發射譜。報導體部分可連接(例如可操作地連接)至核苷酸、核苷、核酸、酶(例如聚合酶或反轉錄酶)或支撐物(例如表面)。
報導體部分(或標記)包含螢光標記或螢光團。可充當螢光標記或螢光團之例示性螢光部分包括(但不限於)：螢光素及螢光素衍生物，諸如羧基螢光素、四氯螢光素、六氯螢光素、羧基萘螢光素、異硫氰酸螢光素、NHS-螢光素、碘乙醯胺螢光素、螢光素順丁烯二醯亞胺、SAMSA-螢光素、螢光素胺基硫脲、卡肼甲硫乙醯基-胺基螢光素，若丹明及若丹明衍生物，諸如TRITC、TMR、麗絲胺若丹明、德克薩斯紅、若丹明B、若丹明6G、若丹明10、NHS-若丹明、TMR-碘乙醯胺、麗絲胺碘乙醯胺B磺醯基氯化物、麗絲胺若丹明B磺醯基肼、德克薩斯紅磺醯基氯化物、德克薩斯紅醯肼，香豆素及香豆素衍生物，諸如AMCA、AMCA-NHS、AMCA-磺酸基-NHS、AMCA-HPDP、DCIA、AMCE-醯肼、BODIPY及衍生物，諸如BODIPY FL C3-SE、BODIPY 530/550 C3、BODIPY 530/550 C3-SE、BODIPY 530/550 C3醯肼、BODIPY 493/503 C3醯肼、BODIPY FL C3醯肼、BODIPY FL IA、BODIPY 530/551 IA、Br-BODIPY 493/503，Cascade Blue及衍生物，諸如Cascade Blue乙醯基疊氮化合物、Cascade Blue屍胺、Cascade Blue乙二胺、Cascade Blue醯肼，螢光黃及衍生物，諸如螢光黃碘乙醯胺、螢光黃CH，花青及衍生物，諸如基於吲哚之花青染料、基於苯并吲哚之花青染料、基於吡啶鎓之花青染料、基於噻唑鎓之花青染料、基於喹啉之花青染料、基於咪唑鎓之花青染料、Cy 3、Cy5，鑭系螯合物及衍生物，諸如BCPDA、TBP、TMT、BHHCT、BCOT、銪螯合物、鋱螯合物、Alexa螢光染料、DyLight染料、Atto染料、LightCycler Red染料、CAL Flour染料、JOE及衍生物，Oregon Green染料、WellRED染料、IRD染料、藻紅素及藻膽素染料、孔雀綠、芪、DEG染料、NR染料、近紅外線染料及其他此項技術中已知的，諸如以下中所描述之染料：Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, Oreg.) 第6版; Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed., Plenum Press New York (1999), or Hermanson, Bioconjugate Techniques, 第2版或其衍生物或其任何組合。花青染料可以磺化或非磺化形式存在，且由藉由兩個氮原子之間之聚甲川橋分隔開的兩個假吲哚(indolenin)、苯并吲哚鎓、吡啶鎓、噻唑鎓及/或喹啉鎓基團組成。可商購的花青螢光團包括例如Cy3 (其可包含1-[6-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)-6-側氧基己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)-6-側氧基己基]-3,3-二甲基-1,3-二氫-2H-吲哚-2-亞基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚或1-[6-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)-6-側氧基己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基氧基)-6-側氧基己基]-3,3-二甲基-5-磺酸基-1,3-二氫-2H-吲哚-2-亞基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-5-磺酸酯)、Cy5 (其可包含1-(6-((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基)-6-側氧基己基)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基)-6-側氧基己基)-3,3-二甲基-5-吲哚啉-2-亞基)五-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓或1-(6-((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基)-6-側氧基己基)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基)-6-側氧基己基)-3,3-二甲基-5-磺基吲哚-2-亞基)五-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓-5-磺酸酯)及Cy7 (其可包含1-(5-羧基戊基)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-乙基-1,3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3H-吲哚或1-(5-羧基戊基)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-乙基-5-磺酸基-1,3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)庚-1,3,5-三烯-1-基]-3H-吲哚-5-磺酸酯)，其中「Cy」代表「花青」，且第一數位鑑別兩個吲哚啉基之間的碳原子數目。為㗁唑衍生物而非吲哚啉的Cy2及苯并衍生之Cy3.5、Cy5.5及Cy7.5為此規則例外。
在一些實施例中，報導體部分可為FRET對，由此可在單個激發及成像步驟下執行多次分類。如本文所使用，FRET可包含激發交換(Forster)轉移或電子交換(Dexter)轉移。
許多pH緩衝劑為熟習此項技術者已知。pH緩衝劑之全稱列於本文中。術語「Tris」係指pH緩衝劑Tris(羥基甲基)-胺基甲烷。術語「Tris-HCl」係指pH緩衝劑Tris(羥基甲基)-胺基甲烷鹽酸鹽。術語「Tris-乙酸酯」係指pH緩衝劑，其包含參(羥基甲基)-胺基甲烷之乙酸鹽。術語「麥黃酮」係指pH緩衝劑N-[參(羥基甲基)甲基]甘胺酸。術語「二甘胺酸」係指pH緩衝劑N,N-雙(2-羥基乙基)甘胺酸。術語「Bis-Tris丙烷」係指pH緩衝劑1,3雙[參(羥基甲基)甲胺基]丙烷。術語「HEPES」係指pH緩衝劑4-(2-羥基乙基)-1-哌𠯤乙磺酸。術語「MES」係指pH緩衝劑2-(N-𠰌啉基)乙磺酸)。術語「MOPS」係指pH緩衝劑3-(N-𠰌啉基)丙磺酸。術語「MOPSO」係指pH緩衝劑3-(N-𠰌啉基)-2-羥基丙磺酸。術語「BES」係指pH緩衝劑N,N-雙(2-羥基乙基)-2-胺基乙烷磺酸。術語「TES」係指pH緩衝劑2-[(2-羥基-1,1雙(羥基甲基)乙基)胺基]乙磺酸 )。術語「CAPS」係指pH緩衝劑3-(環己胺基)-1-丙磺酸。術語「TAPS」係指pH緩衝劑N-[參(羥基甲基)甲基]-3-胺基丙烷磺酸。術語「TAPSO」係指pH緩衝劑N-[參(羥基甲基)甲基]-3-胺基-2-羥丙基磺酸。術語「ACES」係指pH緩衝劑N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙烷磺酸。術語「PIPES」係指pH緩衝劑哌𠯤-1,4-雙(2-乙磺酸。術語「乙醇胺」係指pH緩衝劑，其亦稱為2-胺基乙醇。
術語「連接」、「接合」、「連結」及其變化形式包含化合物或分子之任何組合之間的任何類型之融合、鍵結、黏附或締合，其具有足夠穩定性以經受住在特定程序中之使用。該程序可包括但不限於：核苷酸短暫結合；核苷酸併入；解封端；洗滌；移除；流動；偵測；成像及/或鑑別。該鍵聯可包含例如共價、離子、氫、偶極-偶極、親水性、疏水性或親和力鍵結、涉及凡得瓦爾力之鍵或締合、機械鍵結及類似鍵聯。在一些實施例中，此類鍵聯係在分子內發生，例如將單股或雙股線性核酸分子之兩端連接在一起形成環狀分子。在一些實施例中，此類鍵聯可在不同分子之組合之間、或分子與非分子之間發生，包括但不限於：核酸分子與固體表面之間的鍵聯；蛋白質與可偵測報導體部分之間的鍵聯；核苷酸與可偵測報導體部分之間的鍵聯；及類似鍵聯。鍵聯之一些實例可見於例如以下中：Hermanson, G., 「Bioconjugate Techniques」, 第二版(2008); Aslam, M., Dent, A., 「Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」, London: Macmillan (1998); Aslam, M., Dent, A., 「Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」, London: Macmillan (1998)。
如本文所使用，術語「可操作地連接」及「可操作地接合」或相關術語係指組分之併接。併接之組分可共價連接在一起。舉例而言，兩個核酸組分可在酶作用下連接在一起，其中將兩個組分接合在一起之鍵聯包含磷酸二酯鍵聯。第一核酸組分與第二核酸組分可連接在一起，其中第一核酸組分可賦予第二核酸組分功能。舉例而言，引子結合序列與所關注序列之間鍵聯形成具有結合至引子之部分的核酸庫分子。在另一實例中，轉殖基因(例如編碼多肽之核酸或所關注核酸序列)可連接至支撐物，其中鍵聯允許該支撐物中所包含之轉殖基因序列之表現或功能。在一些實施例中，轉殖基因可操作地連接至影響轉殖基因之表現的宿主細胞調控序列(例如啟動子序列)。在一些實施例中，支撐物包含至少一個宿主細胞調控序列，包括啟動子序列、強化子、轉錄及/或轉譯起始序列、轉錄及/或轉譯終止序列、多肽分泌訊號序列及類似序列。在一些實施例中，宿主細胞調控序列控制轉殖基因之表現量、時序及/或定位。
在一些實施例中，支撐物係固體、半固體或兩者的組合。在一些實施例中，支撐物係多孔、半多孔、無孔或孔隙率之任何組合在一些實施例中，支撐物可為實質上平面的、凹形的、凸形的或其任何組合。在一些實施例中，支撐物可為圓柱形的，例如包含毛細管或毛細管之內表面。
在一些實施例中，支撐物之表面可為實質上光滑的。在一些實施例中，支撐物可為規則地或不規則地紋理化的，包括凸塊、蝕刻、孔、三維支架或其任何組合。
在一些實施例中，支撐物包含具有任何形狀之珠粒，該形狀包括球形、半球形、圓柱形、筒形、環狀、圓盤形、棒狀、圓錐形、三角形、立方形、多邊形、管狀或線狀。
支撐物可以由任何材料製造，包括但不限於玻璃、熔融二氧化矽、矽、聚合物(例如聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、環狀烯烴聚合物(COP)、環狀烯烴共聚物(COC)、聚對苯二甲酸伸乙酯(PET))或其任何組合。涵蓋玻璃及塑膠基板兩者之各種組合物。
在一些實施例中，支撐物之表面塗有一或多種化合物以在支撐物上產生鈍化層。在一些實施例中，支撐物包含使得支撐物上之核酸雜交及擴增效能能夠改善之低非特異性結合表面。一般而言，支撐物可包含一或多層共價或至共價連結之低結合、化學改質層，例如矽烷層、聚合物膜，以及一或多個共價或非共價連結之寡核苷酸，其可用於將複數個核酸模板分子固定至該支撐物。
在一些實施例中，表面塗層之親水度(或用水溶液之「濕潤性」)可例如經由量測水接觸角評估，其中將一小滴水置放於表面上且使用例如光學表面張力計量測其與表面接觸之角度。在一些實施例中，可以測定靜態接觸角。在一些實施例中，可以測定前進或後退接觸角。在一些實施例中，本文所揭示之親水性低結合支撐物表面的水接觸角可以在約0度至約30度之範圍內。在一些實施例中，本文所揭示之親水性低結合支撐物表面之水接觸角可以不超過50度、40度、30度、25度、20度、18度、16度、14度、12度、10度、8度、6度、4度、2度或1度。在許多情況下，接觸角不超過40度。熟習此項技術者將認識到，本發明之給定親水性低結合支撐物表面可展現之水接觸角具有在此範圍內之任何處的值。
本發明提供固定至支撐物之複數個(例如兩個或更多個)核酸模板。在一些實施例中，經固定之複數個核酸模板具有相同序列或具有不同序列。在一些實施例中，複數個核酸模板中之個別核酸模板分子固定至支撐物上之不同位點。在一些實施例中，複數個核酸模板中之兩個或更多個的個別核酸模板分子係固定至支撐物上之位點。在一些實施例中，支撐物包含佈置成陣列的複數個位點。術語「陣列」係指包含定位於支撐物上之預定之定位處形成位點陣列之複數個位點的支撐物。該等位點可為分散的且藉由空隙區分隔開。在一些實施例中，支撐物上之預定位點可在一個維度中佈置成一列或一行，或在二個維度中佈置成數列及數行。在一些實施例中，複數個預定位點以經組織方式佈置於支撐物上。在一些實施例中，複數個預定位點係以任何經組織圖案佈置包括長方體、六邊形圖案、柵格圖案、具有反射對稱性之圖案、具有旋轉對稱性之圖案或類似圖案。不同位點對之間的間距可相同或可不同。在一些實施例中，支撐物可具有在複數個位點處以每平方毫米約10 2-10 15個位點或更多位點之表面密度固定的核酸模板分子，以形成核酸模板陣列。在一些實施例中，支撐物包含至少個10 2個位點、至少10 3個位點、至少10 4個位點、至少10 5個位點、至少10 6個位點、至少10 7個位點、至少10 8個位點、至少10 9個位點、至少10 10個位點、至少10 11個位點、至少10 12個位點、至少10 13個位點、至少10 14個位點、至少10 15個位點或更多個位點，其中該等位點係定位於支撐物上預定之定位處。在一些實施例中，支撐物上的複數個預定位點(例如10 2-10 15個位點或更多)固定有核酸模板以形成核酸模板陣列。在一些實施例中，在複數個預定位點處藉由雜交固定至經固定之表面捕捉引子的核酸模板、或核酸模板係共價連結至表面捕捉引子。在一些實施例中，在複數個預定位點處固定，例如在10 2-10 15個位點或更多位點處固定的核酸模板。在一些實施例中，在支撐物上之複數個位點處固定的核酸模板包含線性或環狀核酸模板分子或線性與環狀分子之混合物。在一些實施例中，經固定之核酸模板經殖株擴增以在複數個預定位點處產生經固定之核酸聚合酶群落。在一些實施例中，個別經固定之核酸模板分子包含所關注目標序列之一個複本，或包含具有所關注目標序列之兩個或更多個串聯複本的多聯體。
在一些實施例中，包含定位於支撐物上之隨機定位處的複數個位點之支撐物在本文中稱為上面具有隨機定位之位點的支撐物。支撐物上隨機定位之位點的定位並非預定的。複數個隨機定位之位點係以無序及/或不可預測之方式佈置於支撐物上。在一些實施例中，支撐物包含至少10 2個位點、至少10 3個位點、至少10 4個位點、至少10 5個位點、至少10 6個位點、至少10 7個位點、至少10 8個位點、至少10 9個位點、至少10 10個位點、至少10 11個位點、至少10 12個位點、至少10 13個位點、至少10 14個位點、至少10 15個位點或更多位點，其中該等位點隨機定位於支撐物上。在一些實施例中，支撐物上之複數個隨機定位之位點(例如10 2-10 15個位點或更多位點)固定有核酸模板以形成固定有核酸模板之支撐物。在一些實施例中，在複數個隨機定位之位點處藉由雜交固定至經固定之表面捕捉引子的核酸模板、或核酸模板係共價連結至表面捕捉引子。在一些實施例中，在複數個隨機定位之位點處固定，例如在10 2-10 15個位點或更多位點處固定的核酸模板。在一些實施例中，在支撐物上之複數個位點處固定的核酸模板包含線性或環狀核酸模板分子或線性與環狀分子之混合物。在一些實施例中，固定核酸模板經殖株擴增以在複數個隨機定位之位點產生固定核酸聚合酶群落。在一些實施例中，個別經固定之核酸模板分子包含所關注目標序列之一個複本，或包含具有所關注目標序列之兩個或更多個串聯複本的多聯體。
在一些實施例中，就固定至支撐物上之預定位點或隨機位點的核酸模板分子而言，在支撐物上的複數個經固定之核酸模板分子彼此流體連通以允許試劑(例如包括聚合酶在內之酶、多價分子、核苷酸、二價陽離子及/或緩衝液，及類似物)之溶液流動至支撐物上，由此使支撐物上的複數個經固定之核酸模板分子可以大規模平行方式與該等試劑反應。在一些實施例中，複數個經固定之核酸模板分子的流體連通可用於進行核苷酸結合分析及/或在複數個經固定之核酸模板分子上進行核苷酸聚合(例如引子延伸或定序)，以及進行偵測及成像以供大規模平行定序。在一些實施例中，術語「固定」及相關術語係指核酸分子或酶(例如聚合酶)連結至支撐物之預定定位或隨機定位處，其中該等核酸分子或酶經由共價鍵或非共價相互作用直接連結至支撐物，或該等核酸分子或酶連結至支撐物上之塗層。
如本文所用，術語「以殖株方式擴增」及其變異體係指已在溶液中或在支撐物上經歷一或多種擴增反應之核酸模板分子。在溶液擴增模板分子之情況下，所得擴增子分佈於支撐物上。在擴增之前，模板分子包含所關注序列及至少一個通用銜接子序列。在一些實施例中，殖株擴增包含使用聚合酶鏈反應(PCR)、多重置換擴增(MDA)、轉錄介導之擴增(TMA)、基於核酸序列之擴增(NASBA)、股置換擴增(SDA)、即時SDA、橋式擴增、等溫橋式擴增、滾環擴增(RCA)、環至環擴增、解螺旋酶依賴性擴增、重組酶依賴性擴增、單股結合(SSB)蛋白質依賴性擴增或其任何組合。
如本文所使用，術語「定序」及其變化形式包含自核酸股獲得序列資訊，通常藉由確定核酸模板分子內至少一些核苷酸(包括其核鹼基組分)之身分進行。在一些實施例中，對核酸分子給定區域「定序」包括鑑別定序區域內之每一個核苷酸，而在一些實施例中，「定序」包含確定該區域中僅部分核苷酸之身分，但一些核苷酸之身分不確定或不正確地確定的方法。任何適合的定序方法均可使用。在一個例示性實施例中，定序可包括無標記或基於離子之定序方法。在一些實施例中，定序可包括經標記或含染料之核苷酸或基於螢光之核苷酸定序方法。在一些實施例中，定序可包括基於聚合酶群落之定序或橋接定序方法。在一些實施例中，定序包括大規模平行定序平台，其採用合成定序、雜交定序或結合定序程序。大規模平行合成定序程序之實例包括聚合酶群落定序、焦磷酸定序(例如來自454 Life Sciences；美國專利第7,211,390號、第7,244,559號及第7,264,929號)、鏈終止劑定序(例如來自Illumina；美國專利第7,566,537號；Bentley 2006 Current Opinion Genetics and Development 16:545-552；及Bentley等人, 2008 Nature 456:53-59)、離子敏感性定序(例如來自Ion Torrent)、探針-錨連接定序(例如Complete Genomics)、DNA奈米球定序、奈米孔DNA定序。單分子定序之實例包括Heliscope單分子定序及單分子即時(SMRT)定序。雜交定序之實例包括SOLiD定序(例如來自Life Technologies；WO 2006/084132)。結合定序之實例包括Omniome定序(例如美國專利第10,246,744號)。 展現出增加之熱穩定性的經工程化聚合酶
本發明提供包含具有胺基酸取代及/或截斷之胺基酸序列之突變聚合酶的組合物、編碼該等突變聚合酶之核酸以及包含突變聚合酶之系統及套組。本文進一步提供使用突變聚合酶之方法，包括用於結合核酸雙螺旋、結合互補核苷酸或結合具有互補核苷酸單元之多價分子、併入互補核苷酸、延伸引子及核酸定序之方法，其中該等方法採用本文所描述之突變聚合酶中的任一者。突變聚合酶經工程化以展現出所需特徵，包括核酸外切酶負活性及穩定性增加、尿嘧啶耐受性改良及/或序列特異性誤差降低。另外，突變聚合酶可經工程化以表現較高分數之可溶性表現酶。
本發明提供經工程化以降低轉譯後修飾以改良蛋白質活性及穩定性之突變聚合酶。重組蛋白之轉譯後修飾可降低蛋白質活性，引起錯誤摺疊，增加不均勻性，降低熱穩定性且增加蛋白質聚集。此等修改對達成恆定可製造性且保持長儲存壽命造成挑戰。許多重組蛋白質進行轉譯後修飾，包括磷酸化、乙醯化、泛素化、丁二醯化、甲基化、糖基化(例如，N-連接、O-連接及C-連接)、羥基化、氧化、去醯胺化、亞硝基化、硫酸化、SUMO化、二硫鍵結合、蛋白分解及/或脂質化(例如，軟脂醯化)。
轉譯後修飾之非所需影響的實例包括含硫之胺基酸(諸如半胱胺酸及甲硫胺酸)之氧化性損傷。組胺酸、色胺酸、離胺酸及絲胺酸亦已知容易發生氧化性損傷。天冬醯胺與麩醯胺酸之去醯胺化可引起蛋白質降解，其減少儲存壽命。乙醯化可涉及N端甲硫胺酸裂解及用乙醯基置換。在一些蛋白質中，N端甲硫胺酸在酶活性中起重要作用，且移除此甲硫胺酸殘基可改變酶活性。乙醯化亦可涉及絲胺酸及離胺酸。甲基化可引起疏水性及側鏈電荷變化。泛素化可引起蛋白降解。
諸如質譜分析及串聯質譜分析之分析技術可用於偵測轉譯後修飾，尤其經氧化之甲硫胺酸及離胺酸殘基，其能夠合理突變誘發以改良蛋白質產生及穩定性。
本發明提供經工程化以展現降低之編輯模式構形的突變聚合酶。許多DNA聚合酶具有5'至3'核苷酸聚合活性及3'至5'核酸外切酶校正活性。一般而言，聚合酶中之聚合位點位於與校正位點不同之位點。在聚合模式期間，模板及引子股之生長端位於聚合位點中。在許多B及C家族聚合酶中，手指、拇指及掌型域中之胺基酸殘基形成聚合位點之至少一部分。在校正模式中，引子之生長端以物理方式自聚合位點轉移至核酸外切酶位點，且生長引子股末端之錯誤併入的核苷酸經聚合酶之3'至5'個校正活性切除。引子末端自聚合位點轉移至核酸外切酶位點可涉及引子/模板接合點處若干鹼基對之局部錯配，其阻止股進一步伸長(例如聚合)，直至引子末端轉移回聚合位點且恢復引子/模板配對。在引子末端轉移中起作用之胺基酸殘基與涉及核酸外切酶活性之胺基酸殘基無關。聚合及核酸外切酶位點位於兩種不同域中。聚合酶有時在併入正確核苷酸，從而停止引子延長時不必要地進行此聚合至核酸外切酶構形轉換。在大腸桿菌DNA聚合酶III中，先前已確定引子末端轉移及引子/模板非配對之時間標度為約十毫秒，其為比核苷酸併入長之一個數量級(Dodd等人, 2020 Nature Communication 11:5379, 「Polymerization and editing modes of a high-fidelity DNA polymerase are linked by a well-defined path」)。因此，需要對在併入正確核苷酸時或在來自多價分子之正確核苷酸單元在聚合位點處鍵結時展現出降低之編輯模式構形的定序聚合酶進行工程化。假設編輯模式突變聚合酶將保留3'至5'核酸外切酶活性。
蛋白質模型化及質譜法可沿將引子末端自聚合位點轉移至核酸外切酶位點而不影響核酸外切酶活性之路徑鑑別關鍵胺基酸殘基。此等關鍵胺基酸殘基中之至少一些的突變可減少不必要的聚合至核酸外切酶構形轉換。舉例而言，在將引子末端導引至核酸外切酶位點中起作用的胺基酸殘基之突變或使核酸外切酶位點處之轉移引子末端穩定的胺基酸殘基之突變可降低向編輯模式構形之轉變。在另一實例中，在聚合期間與模板分子相互作用且使模板分子穩定之胺基酸殘基突變可將模板分子保留在聚合位點。
本發明提供可用於進行雙階段核酸定序方法之突變聚合酶。在一些實施例中，第一階段一般包含在適合於抑制核苷酸單元併入之條件下使可偵測標記之多價分子結合至複合聚合酶以形成多價複合聚合酶，且偵測多價複合聚合酶。第一階段可使用截留聚合酶進行。在一些實施例中，第二階段一般包含使用步進聚合酶之聚合酶催化之核苷酸併入。
本發明提供可用於進行核酸定序之截留或步進事件的突變聚合酶。一些突變聚合酶可用於截留及步進事件兩者。
本發明提供可用於截留多價分子之突變聚合酶，該多價分子包含結合至具有互補核苷酸單元之多價分子的複合突變聚合酶(例如，例示性多價分子展示於圖2至圖5中)。在一些實施例中，多價分子包含連接至多個聚合物臂之中心核心，各臂末端具有核苷酸單元。多價分子可經可偵測報導體部分標記。複合突變聚合酶包括結合至模板/引子雙螺旋之突變聚合酶。突變聚合酶經工程化以展現在引子股及/或模板股中之某些模體序列之後出現的降低之序列特異性誤差。捕獲聚合酶之序列特異性誤差可藉由在特定定序循環處引起鹼基錯誤呼叫(例如，鹼基取代)或不呼叫之訊號強度的實質性損失表徵。訊號常常在下一循環中恢復。產生錯誤呼叫之模體序列對指定聚合酶具有特異性，且可在前向或反向定序方向上出現於任一模板股上。
本發明提供可用於結合互補核苷酸(例如非結合核苷酸)且將核苷酸併入至引子之3'端中(稱為步進事件)之突變聚合酶。突變聚合酶經工程化以展現出降低之序列特異性誤差，其特徵在於在引子股及/或模板股中之某些模體序列之後出現的核苷酸併入之實質性損失。步進酶之序列特異性誤差可藉由序列模體之後的大規模定相表徵。導致定相之模體序列對給定聚合酶具有特異性且可在前向或反向定序方向上出現於任一模板股上。
不希望受理論所束縛，假定在自核苷酸併入構形至編輯構形之定序轉換期間在某些序列模體處展現出截留或步進序列特異性誤差的突變聚合酶。在截留事件期間，編輯構形阻止互補核苷酸單元與多價分子之結合，其導致訊號強度降低。在步進事件期間，編輯構形阻止互補核苷酸或核苷酸類似物之結合及併入，導致訊號強度降低。設計攜帶一或多個突變位點之捕獲及步進聚合酶，降低自核苷酸聚合至編輯的構形轉換，可降低捕獲序列特異性錯誤。
在一些實施例中，突變聚合酶包含由新近鑑別之新穎B家族及A家族聚合酶定向進化得到的多肽或其片段，其中該等突變聚合酶展現其特異性之改良，同時維持對於正確華特生-克里克鹼基配對之高判別性。
本發明提供已經工程化以包括取代突變之聚合酶，包括具有以下之胺基酸序列主鏈的聚合酶：RLF 89458.1 (例如，來自超嗜熱太古菌，分離株B13_G1) (SEQ ID NO:1)、RLF 78286.1 (例如，來自超嗜熱太古菌，分離株B89_G9) (SEQ ID NO:2)、NOZ 58130.1 (例如，來自廣古菌門太古菌，分離株M_BaxBin.100) (SEQ ID NO:1714)、RMF 90817.1 (例如，來自廣古菌門太古菌，分離株J060) (SEQ ID NO:2789)、MBC 7218772.1 (例如，來自哈德太古菌，分離株MAG-18) (SEQ ID NO:2790)、WP 175059460.1 (例如，來自超嗜熱太古菌2319x1) (SEQ ID NO:2791)、KUO 42443.1 (例如，來自哈達恰姆候選種黃色嗜血桿菌(Candidatus Hadarchaem, yellowstonense)，分離株YNP_45) (SEQ ID NO:2792)及NOZ 77387.1 (例如，來自廣古菌門太古菌(Euryarchaeota archaeon)，分離株M_MaxBin.027) (SEQ ID NO:2793)。
本文所描述之多肽包括但不限於具有酶活性，諸如具有聚合酶活性多肽，且通常以家族描述。通常，聚合酶係DNA聚合酶、RNA聚合酶、模板非依賴性聚合酶、反轉錄酶或能夠進行核苷酸結合及核苷酸併入(例如引子延伸)之其他酶。許多DNA聚合酶係此項技術中已知的，且在一些情況下，該等酶突變產生本文所描述之組合物。DNA聚合酶家族之成員通常以聚合酶活性、活性位點結構、域同源性/功能或與其他已知DNA聚合酶家族成員之序列同源性定義。舉例而言，DNA聚合酶包括但不限於大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶II或DNA聚合酶家族之其他成員。已知的熱穩定性DNA聚合酶包括Taq聚合酶、Pfu聚合酶及9°N聚合酶或DNA聚合酶家族之其他成員。野生型DNA聚合酶係或可獲自多種來源，諸如真核、原核或病毒來源，且在一些實施例中，出於本發明之目的，來自古菌來源。在一些實施例中，包含SEQ ID NOS: 1、2、1714、2789-2793及2803中之任一者之胺基酸序列的聚合酶係DNA聚合酶家族之成員。
本文所描述之聚合酶可包括增加聚合酶之熱穩定性的一或多個胺基酸取代及/或截斷。在一些實施例中，聚合酶之熱穩定性可藉由量測聚合酶展開及/或聚集之溫度來確定。舉例而言，使用差示掃描螢光測定法之熱偏移分析可用於確定聚合酶之熱穩定性。差示掃描螢光測定法可用於確定蛋白質去摺疊轉變(T(m))，在該轉變下，大致50%之蛋白質呈其天然構形且大致50%之蛋白質呈變性。蛋白質去摺疊轉變(T(m))可獲自熔融峰，其中沿著x軸繪製增加之溫度且沿著y軸繪製螢光相對於溫度變化之第一導數曲線(例如dF/dT或dRFU/dT)。一些蛋白質展現出兩種蛋白質轉變，T(m1)及T(m2)。舉例而言，T(m1)溫度為蛋白質之至少50%自摺疊轉變至未摺疊的溫度。在另一實例中，T(m2)溫度為相較於T(m1)溫度更高之溫度，其中在T(m2)溫度下，更多的蛋白質自摺疊轉變為未摺疊。全變性蛋白質及蛋白質聚集(T(agg))可獲自熔融曲線，其中沿著x軸繪製增加之溫度且沿著y軸繪製螢光(例如RFU)。舉例而言，表1至2 (例如，圖31-32)列出經工程化聚合酶之Tm1及Tm2。
在一些實施例中，與野生型聚合酶相比，或與具有未賦予增加之熱穩定性之突變的經工程化聚合酶相比，經工程化聚合酶在高溫(例如，熱穩定性)下展現出蛋白質去摺疊轉變。在一些實施例中，經工程化聚合酶在約72至75℃，或約75至80℃，或約80至85℃，或約85至90℃，或更高溫度之升高溫度下展現出增加之熱穩定性。許多本文所描述之經工程化聚合酶展現出在約25℃至50℃、或約45℃至75℃、或約65℃至80℃、或約80℃至90℃之溫度範圍內的核苷酸結合及併入活性。因此，此等經工程化聚合酶在中等高溫範圍(例如，中間熱聚合酶)下熱穩定。本文所描述之經工程化聚合酶適用於在約25℃至50℃，或約45℃至75℃，或約65℃至80℃，或約80℃至90℃，或更高溫度之溫度範圍下進行核苷酸結合、核苷酸單元結合、核苷酸併入及/或核酸定序反應。在一些實施例中，突變聚合酶展現出約2℃至4℃，或約4℃至6℃，或約6℃至8℃，或約8℃至10℃之熱穩定性增加。
相比之下，展現出超過95℃之顯著較高的熱穩定性之DNA聚合酶包括9°N、THERMINATOR、VENT、DEEP VENT、Pfu及激烈火球菌( Pyrococcus abyssi)。諸如9°N、VENT、DEEP VENT、Pfu及激烈火球菌聚合酶之熱穩定性聚合酶適用於PCR反應，其中典型循環步驟在超過90℃至95℃或更高溫度之溫度下進行，且可不適用於在低溫範圍下進行之核苷酸結合、核苷酸併入及/或核酸定序反應。來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶)之DNA聚合酶通常穩定高達65℃。
聚合酶不同地包含DNA聚合酶、RNA聚合酶、模板非依賴性聚合酶、反轉錄酶或能夠催化核苷酸併入之其他酶。古菌聚合酶通常來源於嗜熱生物體，且因此可表示熱穩定性或耐熱性酶種類。因此，來源於古菌聚合酶之多肽主鏈提供所需蛋白質工程化目標以進一步增強應用之可逆終止子核苷酸併入，其可藉由施加具有增強之熱穩定性或以其他方式增強之對降解之抗性的酶，諸如藉由重複暴露於高溫、變化之緩衝條件及其類似方面來改良。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，相比於野生型聚合酶或相比於具有不賦予改良之儲存壽命之突變的經工程化聚合酶，該等突變聚合酶展現出改良之儲存壽命。舉例而言，突變聚合酶可在給定溫度下儲存數月或數年之後保留酶活性。在一些實施例中，突變聚合酶可在約0-正27℃之溫度、或約負20℃-負45℃之溫度、或約負45℃-負80℃之溫度儲存2-12個月保留約90-100%活性。在一些實施例中，突變聚合酶可在約0-正27℃之溫度、或約負20℃-負45℃之溫度下、或約負45℃-負80℃之溫度下儲存2-12個月保留約80-90%活性。在一些實施例中，突變聚合酶可在約0-正27℃之溫度、或約負20℃-負45℃之溫度、或約負45℃-負80℃之溫度儲存2-12個月保留約70 - 80 %活性。在一些實施例中，突變聚合酶可在約0-正27℃之溫度、或約負20℃-負45℃之溫度、或約負45℃-負80℃之溫度儲存約12-36個月保留約70-100%活性。
在一些實施例中，野生型或經工程化聚合酶可儲存於包含溶劑、至少一種pH緩衝劑、至少一種鹽、至少一種螯合劑、至少一種黏度劑及至少一種清潔劑之儲存緩衝液中。在一些實施例中，溶劑包含水。
在一些實施例中，緩衝劑包含MES、HEPES、ACES、Tris及/或Tris-HCl或熟習此項技術者已知的任何其他pH緩衝劑。在一些實施例中，pH緩衝劑之pH為約6至6.5，或pH緩衝劑之pH為約6.5至7，或pH緩衝劑之pH為約7至7.5，或pH緩衝劑之pH為約7.5至8，或pH緩衝劑之pH為約8至8.5。在一些實施例中，儲存緩衝液包括濃度為約10至20 mM，或約20至30 mM，或約30至40 mM，或約40至50 mM之至少一種pH緩衝劑。
在一些實施例中，鹽包含含有NaCl、KCl、NH 2SO 4及/或麩胺酸鉀之單價鹽。在一些實施例中，儲存緩衝液包括濃度為約50至100 mM、或約100至200 mM、或約200至300 mM、或約300至400 mM、或約400至500 mM、或約500至600 mM或約600至800 mM之至少一種單價鹽。
在一些實施例中，螯合劑包含EDTA (乙二胺四乙酸)、EGTA (乙二醇四乙酸)、HEDTA (羥乙基伸乙基二胺三乙酸)、DPTA (二伸乙基三胺五乙酸)、NTA (N,N-雙(羧基甲基)甘胺酸)、無水檸檬酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸二銨、檸檬酸、檸檬酸鉀及/或檸檬酸鎂。在一些實施例中，儲存緩衝液包括濃度為約0.0125至0.025 mM、或約0.025至0.05 mM、或約0.05至0.1 mM、或約0.1至0.2 mM之至少一種螯合。
在一些實施例中，黏性劑包含醣，諸如海藻糖、蔗糖、纖維素、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇及/或肌醇。在一些實施例中，黏性劑包含丙三醇或二醇化合物，諸如乙二醇及/或丙二醇。在一些實施例中，儲存緩衝劑包括至少一種呈約20%至30%、或約30%至40%、或約40%至50%、或約50%至60%、或約60%至70%、或約70%至80%的黏性劑。
在一些實施例中，清潔劑包括離子清潔劑，諸如SDS (十二烷基硫酸鈉)。在一些實施例中，清潔劑包含非離子型清潔劑，諸如Triton X-100、Tween 20、Tween 80或Nonidet P-40。在一些實施例中，清潔劑包含兩性離子清潔劑，諸如CHAPS (3-[(3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽)或 N-十二烷基- N , N-二甲基-3-胺基-1-丙烷磺酸鹽(DetX)。在一些實施例中，清潔劑包含LDS(十二烷基硫酸鋰)、牛去氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘胺膽酸鈉、去氧膽酸鈉或膽酸鈉。在一些實施例中，儲存緩衝劑包括至少一種約0.025至0.5%、或約0.5至0.1%、或約0.1至0.2%、或約0.2至0.4%、或約0.4至0.8%、或約0.8至1.6%的清潔劑。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，相較於野生型聚合酶或相較於具有不賦予經改良的與多價分子之互補核苷酸單元結合之突變的經工程化聚合酶，該等突變聚合酶展現出經改良之結合多價分子之互補核苷酸單元的能力。多價分子通常包含連接至複數個臂之中心部分(例如核心)，其中各臂連接至核苷酸單元。多價分子包含星形、梳形、交聯、瓶刷或樹枝狀組態(例如參見圖2)。
吾人出人意料地發現，相比於野生型聚合酶，或相比於具有不賦予增強之核苷酸類似物併入比率之突變的經工程化聚合酶，本文所描述之許多經工程化聚合酶展現出增強之核苷酸類似物併入比率。相較於野生型聚合酶，一些經工程化聚合酶亦展現出一或多種所需特徵，包括增加之與具有3'鏈封端基團之核苷酸類似物的結合親和力；改良之併入與含尿嘧啶模板分子相對之dATP核苷酸的能力(例如，尿嘧啶耐受性突變聚合酶)；改良之結合多價分子之互補核苷酸單元的能力；直至約90℃的增加之熱穩定性；增加之儲存壽命；及降低之序列特異性誤差。
本發明提供包含與聚合酶相關之突變多肽的組合物及方法，該突變多肽展現出相較於野生型聚合酶增加之結合及鑑別核苷酸類似物之能力，及改善的核苷酸類似物併入。核苷酸類似物包括例如包含連結至糖2'或3'位置之鏈終止基團的核苷酸。鏈終止基團包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基、或另一類型之鏈終止基團。經工程化DNA聚合酶與具有以下中之任一者之胺基酸序列主鏈的相應野生型聚合酶相比展現出增加之核苷酸類似物併入比率：RLF 89458.1 (SEQ ID NO:1)、RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)、NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)、RMF 90817.1 (SEQ ID NO:2789)、MBC 7218772.1 (SEQ ID NO:2790)、WP 175059460.1 (SEQ ID NO:2791)、KUO 42443.1 (SEQ ID NO:2792)及NOZ 77387.1 (SEQ ID NO:2793)。
表1及表2中展示之資料提供許多例示性突變聚合酶，相比於其對應的野生型聚合酶或相比於具有相同主鏈序列及不賦予增加之熱穩定性之突變的經工程化聚合酶，該等突變聚合酶展現出增加之熱穩定性。許多此等突變聚合酶包括LYP模體及/或其他位置處之突變。在一些實施例中，突變聚合酶展現出核苷酸類似物相對於此項技術中當前已知之對應野生型酶或酶變異體約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、500%或1000%的併入比率增加。展現增加之熱穩定性的例示性突變聚合酶列於表1及2中。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有在LYP模體之前或之後插入的至少一個胺基酸殘基。在一些實施例中，在LYP基元之前或之後插入之至少一個胺基酸殘基可將LYP模體作為經摺疊多肽中之單元移動，其可增加或降低突變酶中之LYP模體的活性。在一些實施例中，相較於經設計以改變LYP模體中及周圍之胺基酸側鏈的習知胺基酸取代，在LYP模體之前或之後插入至少一個胺基酸殘基可在調節LYP模體之活性方面更有效。在一些實施例中，相較於缺乏至少一個插入胺基酸殘基之突變聚合酶，在LYP基元之前或之後插入之至少一個胺基酸殘基可調節(例如增加或減少)核苷酸類似物之併入比率。
在一些實施例中，在適合於抑制聚合酶催化之核苷酸併入反應的條件下結合核苷酸(或核苷酸類似物)或多價分子之聚合酶包含在LYP模體之前或之後插入的至少一個胺基酸殘基。在一些實施例中，在適合於促進聚合酶催化之核苷酸併入反應之條件下結合核苷酸(或核苷酸類似物)或多價分子之聚合酶包含在LYP模體之前或之後插入的至少一個胺基酸殘基。
在一些實施例中，在LYP模體之前或之後插入的至少一個胺基酸殘基包含20個胺基酸中之任一者(例如，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)。在一些實施例中，在LYP模體之前或之後插入之至少一個胺基酸殘基包含脯胺酸或甘胺酸。例示性突變聚合酶包含SEQ ID NOS:1076、1094、1197或1351中之任一者的胺基酸序列。
在一些實施例中，具有在LYP模體之前或之後插入的至少一個胺基酸殘基之突變多肽包含以下中之任一者的主鏈序列：RLF 89458.1 (SEQ ID NO:1)、RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)、NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)、RMF 90817.1 (SEQ ID NO:2789)、MBC 7218772.1 (SEQ ID NO:2790)、WP 175059460.1 (SEQ ID NO:2791)、KUO 42443.1 (SEQ ID NO:2792)、及NOZ 77387.1 (SEQ ID NO:2793)。
在一些實施例中，至少一個胺基酸殘基可插入於LYP模體之前或之後，其中RLF 89458.1 (SEQ ID NO:1)及RLF 78286 (SEQ ID NO:2)中之LYP模體位於位置L409、Y410及P411處。
在一些實施例中，至少一個胺基酸殘基可插入於LYP模體之前或之後，其中NOZ 58130 (SEQ ID NO:1714)中之LYP模體位於位置L440、Y441及P442處。
在一些實施例中，至少一個胺基酸殘基可在LYP模體之前或之後插入，其中RMF 90817 (SEQ ID NO:2789)中之LYP模體位於位置L421、Y422及P423處。
在一些實施例中，至少一個胺基酸殘基可插入於LYP模體之前或之後，其中MBC 7218772 (SEQ ID NO:2790)中之LYP模體位於位置L451、Y452及P453處。
在一些實施例中，至少一個胺基酸殘基可在LYP模體之前或之後插入，其中WP 175059460 (SEQ ID NO:2791)中之LYP模體位於位置L411、Y412及P413處。
在一些實施例中，至少一個胺基酸殘基可在LYP模體之前或之後插入，其中KUO 42443 (SEQ ID NO:2792)中之LYP模體位於位置L448、Y449及P450處。
在一些實施例中，至少一個胺基酸殘基可插入於LYP模體之前或之後，其中NOZ 77387 (SEQ ID NO:2793)中之LYP模體位於位置L432、Y433及P434處。
在一些實施例中，具有在LYP模體之前或之後插入的至少一個胺基酸殘基之突變多肽包含與SEQ ID NOs: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%序列一致性的序列。
賦予多肽某些活性之位點可為保守的且可藉由比對各種聚合酶之胺基酸序列而定位。舉例而言，可發現與聚合酶活性(例如，核苷酸併入)相關之某些殘基：具有RLF 89458.1 (SEQ ID NO:1)之主鏈序列之聚合酶的殘基D405、D539及/或D541；或在具有RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列的聚合酶之殘基D405、D539及/或D541處；或在具有NOZ 58130 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列的聚合酶之殘基D436、D570及/或D572處；或在具有RMF 90817 (SEQ ID NO:2789)之主鏈序列的聚合酶之殘基D417、D551及/或D553處；或在具有MBC 7218772 (SEQ ID NO:2790)之主鏈序列的聚合酶之殘基D447、D585及/或D587處；或在具有WP 175059460 (SEQ ID NO:2791)之主鏈序列的聚合酶之殘基D407、D543及/或D545處；或在具有KUO 42443 (SEQ ID NO:2792)之主鏈序列的聚合酶之殘基D444、D582及/或D584處；或在具有NOZ 77387 (SEQ ID NO:2793)之主鏈序列的聚合酶之殘基D428、D562及/或D564處。
熟習此項技術者可藉由審閱圖33中所示之序列比對來定位其他聚合酶中之此等位點及其他功能等效位點。此類位點通常發現於其他區域及域中之類似位置處，且包含此類域之多肽與本文所描述之方法及組合物一致。
本文所描述之聚合酶中的突變不同地包含多肽中存在之胺基酸殘基的一或多個變化。添加、取代、缺失及/或截斷為用於產生突變多肽之突變的所有實例。在一些實施例中，取代包含一個胺基酸交換為替代性胺基酸，且該等替代胺基酸在大小、形狀、構形及/或化學結構方面皆不同於原始胺基酸。在一些實施例中，突變係保守性或非保守性的。保守性突變包含一個胺基酸經具有類似化學特性之胺基酸取代。添加通常包含在多肽之N端、C端或內部位置插入一或多個胺基酸。在一些情況下，添加包含融合多肽，其中一或多個額外多肽聯接至該多肽。在一些實施例中，該等額外多肽包含具有額外活性之域、或具有額外功能(例如改善表現、幫助純化、改善溶解度、連結至固體支撐物或其他功能)之序列。通常，本文所描述之多肽包含一或多個非胺基酸基團。融合多肽視情況包含聯接一或多種蛋白質之胺基酸或其他化學連接子。可將任何數目之突變引入本文所描述之多肽或多肽之部分中，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50個或超過50個突變。
在一些實施例中，完整域(具有確定之功能的多肽之部分)經添加、缺失或經來自其他多肽之域取代。例示性域包括DNA/RNA結合域、核苷酸結合域、核酸酶域、次細胞定位域(諸如細胞核定位域)或其他域。在一些實施例中，本發明之方法及組合物包含連結充當間隔子或標記之域，及/或提供連接子，諸如SNAP標籤、抗生物素蛋白部分、鏈黴抗生物素蛋白部分、抗原決定基標籤、螢光蛋白、親和標籤、金屬結合(亦即，His6(SEQ ID NO:2850)或聚組胺酸標籤)或類似物之連結。在一些實施例中，一或多個突變存在於任何位置，例如核酸外切酶域、核酸結合域、核苷酸結合域及/或催化位點中。多肽包含至少一個突變且可基於SEQ ID NOS: 1、2、1714、2789、2790、2791、2792、2793或2803中之任一者的野生型主鏈序列。
如本文所使用，術語胺基酸殘基或序列位置「周圍」具有其在此項技術中之普通含義，包括且併入在距指定殘基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個或更多個殘基遠(亦即，在指定殘基N端或C端)之殘基處的修飾，諸如取代、缺失、插入或轉譯後修飾。在一些情況下，一般熟習此項技術者應理解，基於序列或結構(亦即，3維)背景，在指定殘基N或C端超過個12殘基或序列位置的殘基可被視為在指定殘基「周圍」。
應理解，本文所描述之殘基的取代或修飾亦可併入或可包括此項技術中已知的非標準胺基酸，包括但不限於羥脯胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、硒代甲硫胺酸、硒代半胱胺酸、磷酸酪胺酸、磷酸組胺酸及類似胺基酸。本文所描述之突變、修飾、截斷、取代及類似處理可藉由此項技術中已知之任何方法，特別是分子生物學及/或蛋白質工程技術中已知之任何方法進行。該等方法可包括使用突變誘發及/或部分簡併引子進行之定點突變誘發、活體外基因組裝、基因編輯(諸如藉由CRISPR或相關方法)及類似方法。本文所描述之突變型蛋白質或經工程化蛋白質可另外藉由如此項技術中已知之任何手段表現、分離及/或純化。相關方法描述於以下中：Green, M. and Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第四版) ，該文獻以全文引用的方式併入本文中且尤其是其有關修飾、轉移及表現重組、經修飾及經工程化基因序列以及萃取、分離及/或純化經工程化蛋白質之方法的揭示內容。
本文所揭示之多肽已顯示充當核苷酸聚合酶，其展現出與其對應野生型酶相比，3'-O-疊氮基甲基衍生之核苷的較高熱穩定性及較高併入比率、增加之尿嘧啶耐受性及/或改良之與多價分子之互補核苷酸單元的結合。本文揭示之多肽可用於在複製或合成期間伸長核酸，或可藉由例如使用非合併或阻斷核苷酸在添加核苷酸位點處捕捉/結合核苷酸，或可在不存在所需鹽或輔因子之條件下使用。本文所揭示之多肽可用於例如聚核苷酸定序應用，諸如合成定序及結合定序應用。本文中揭示突變聚合酶，其包含與SEQ ID NOS: 1、2、1714、2789、2790、2791、2792、2793或2803中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%序列一致性。
本發明提供包含B家族或A家族聚合酶之胺基酸序列主鏈的經工程化DNA聚合酶，其通常包括展現出較高保真性之複製性聚合酶。B家族型聚合酶之實例包括B家族太古菌DNA聚合酶及Phi29聚合酶。在一些實施例中，經工程化DNA聚合酶包含B家族古菌DNA聚合酶，其可選自熱球菌屬(Thermococcus)、嗜酸熱菌(Thermoplasmata)、火球菌屬(Pyrococcus)、甲烷球菌屬(Methanococcus)、哈德古菌(Hadesarchaea)、廣古菌門(Euryarchaeota)或候選種(Candidatus)。在一些實施例中，作為B家族聚合酶之經工程化DNA聚合酶包含來自9°N聚合酶(包括THERMINATOR聚合酶)、VENT聚合酶、DEEP VENT聚合酶、Pfu聚合酶或激烈火球菌聚合酶的胺基酸序列主鏈。在一些實施例中，作為A家族聚合酶之經工程化DNA聚合酶包含嗜熱脂肪地芽孢桿菌之胺基酸序列主鏈(例如Bst DNA聚合酶)。
經工程化DNA聚合酶可藉由將一或多個突變引入至所關注DNA聚合酶的胺基酸序列中而設計及製備，且可確定經工程化聚合酶的所得表型。兩個或更多個突變位點中之任一者或任何組合可自一種類型之聚合酶轉移至第二類型之聚合酶中之位置上等效的位點(或功能上等效之位點)。舉例而言，來自包含SEQ ID NOS: 1、2、1714、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者或SEQ ID NOS:3-1713或1715-2787中之任一者之DNA聚合酶的兩個或更多個突變位點中之任一者或任何組合可被引入至嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS:2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)、RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)或Phi29聚合酶(SEQ ID NO:2803)中之位置上等效的位點(或功能上等效之位點)。
例示性序列比對提供於圖33至40中。該等突變包括任一個胺基酸取代、插入、缺失及/或截斷，或兩個或更多個胺基酸取代、插入、缺失及/或截斷之任何組合。
殘基之功能等效物包含佔據酶(例如DNA聚合酶)之序列(例如序列比對)及/或三維結構中類似位置的一或多個胺基酸殘基，且執行與已知酶中之已知胺基酸殘基實質上相同的功能。功能等效之胺基酸取代包括在另一多肽中具有相同功能作用的基礎多肽中之特定位置處的一或多個胺基酸殘基。功能等效之胺基酸取代包括保守性及/或非保守性胺基酸取代中之任一者或任何組合。序列比對提供於圖33-40中，其列出了在具有SEQ ID NOS: 1、2、1714、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者之主鏈序列的DNA聚合酶中之位點處 及在嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N DNA聚合酶(相對於SEQ ID NO:2795或2796)、THERMINATOR聚合酶(相對於SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(相對於SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(相對於SEQ ID NO:2799)、Pfu DNA聚合酶(相對於SEQ ID NO:2800)、激烈火球菌DNA聚合酶(相對於SEQ ID NO:2801)、RB69聚合酶(相對於SEQ ID NO:2802)或Phi29聚合酶(相對於SEQ ID NO:2803)中之功能上等效之胺基酸位點的胺基酸殘基之實例。
野生型多肽序列通常為蛋白質或酶工程化以產生突變多肽之起點。在一些實施例中，突變多肽與野生型多肽有至少一個胺基酸殘基不同。通常，突變多肽與最接近之野生型多肽有至少一個胺基酸殘基不同。在一些實施例中，突變多肽與野生型多肽有至少兩個胺基酸殘基不同。在一些實施例中，突變型多肽與野生型多肽相差至少三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸殘基。通常，野生型序列係藉由在野生型序列內對準包含至少一個突變之多肽所鑑別的最接近之野生型序列。在一些實施例中，野生型多肽序列包括天然存在之多肽的序列。
胺基酸取代係指將多肽中所選位置處之胺基酸殘基置換為具有類似或不同生物化學特性，諸如具有類似大小、形狀、構形、化學結構、電荷及/或疏水性的不同胺基酸。胺基酸取代可為保守性或非保守性胺基酸置換。在一些實施例中，在多肽中所選位置處之胺基酸殘基可經具有極性側鏈之胺基酸置換。具有極性側鏈之胺基酸的實例包括精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸、離胺酸、絲胺酸及蘇胺酸。在一些實施例中，在多肽中所選位置處之胺基酸殘基可經具有非極性側鏈之胺基酸置換。具有非極性側鏈之胺基酸的實例包括丙胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。在一些實施例中，在多肽中所選位置處之胺基酸殘基可經具有疏水性側鏈之胺基酸置換。具有疏水性側鏈之胺基酸的實例包括甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸及色胺酸。在一些實施例中，在多肽中所選位置處之胺基酸殘基可經具有不帶電側鏈之胺基酸置換。具有不帶電側鏈之胺基酸的實例包括甘胺酸、絲胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、酪胺酸及蘇胺酸。在一些實施例中，在多肽中所選位置處之胺基酸殘基可經具有帶正電側鏈之胺基酸置換。具有帶正電側鏈之胺基酸的實例包括精胺酸、組胺酸及離胺酸。在一些實施例中，在多肽中所選位置處之胺基酸殘基可經具有帶負電側鏈之胺基酸置換。具有帶負電側鏈之胺基酸的實例包括天冬胺酸及麩胺酸。
本文所描述之例示性多肽突變體列於表1至2中(圖31至32)。
在一些實施例中，多肽包含RLF 89458.1之主鏈序列且具有與SEQ ID NOS: 1或2中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%序列一致性之序列且該多肽包含表1、圖31(例如，SEQ ID NOS:3-1713)中所列之突變中之至少一者。
在一些實施例中，多肽包含NOZ 58130.1之主鏈序列且具有與SEQ ID NOS:1714中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%序列一致性之序列且該多肽包含表2、圖32(例如，SEQ ID NOS:1715-2787)中所列之突變中之至少一者。
在一些實施例中，多肽包含RMF 90817之主鏈序列且具有與SEQ ID NO:2787具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%序列一致性之序列且該多肽包含至少一個位置上等效於表1及/或2中所列之突變(分別為圖31及32)(例如SEQ ID NOS:3-1713)(例如SEQ ID NOS:1715-2787)的突變。在一些實施例中，位置上等效之胺基酸位置展示於圖33及36中。
在一些實施例中，多肽包含MBC 7218772.1之主鏈序列且具有與SEQ ID NO:2790具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%序列一致性之序列，且多肽包含突變中之至少一個，且該多肽包含至少一個位置上等效於表1及/或2中所列之突變(分別為圖31及32)(例如SEQ ID NOS:3-1713)(例如SEQ ID NOS:1715-2787)的突變。在一些實施例中，位置上等效之胺基酸位置展示於圖33及37中。
在一些實施例中，多肽包含WP 175059460.1之主鏈序列且具有與SEQ ID NO:2791具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%序列一致性之序列且該多肽包含至少一個位置上等效於表1及/或2中所列之突變(分別為圖31及32)(例如SEQ ID NOS:3-1713)(例如SEQ ID NOS:1715-2787)的突變。在一些實施例中，位置上等效之胺基酸位置展示於圖33及38中。
在一些實施例中，多肽包含KUO 42443.1之主鏈序列且具有與SEQ ID NO:2792具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%序列一致性之序列且該多肽包含至少一個位置上等效於表1及/或2中所列之突變(分別為圖31及32)(例如SEQ ID NOS:3-1713)(例如SEQ ID NOS:1715-2787)的突變。在一些實施例中，位置上等效之胺基酸位置展示於圖33及39中。
在一些實施例中，多肽包含NOZ 77387.1之主鏈序列且具有與SEQ ID NO:2793具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%序列一致性之序列且該多肽包含至少一個位置上等效於表1及/或2中所列之突變(分別為圖31及32)(例如SEQ ID NOS:3-1713)(例如SEQ ID NOS:1715-2787)的突變。在一些實施例中，位置上等效之胺基酸位置展示於圖33及39中。
在一些實施例中，多肽包含Phi29之主鏈序列且具有與SEQ ID NO:2803具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%序列一致性之序列且該多肽包含至少一個位置上等效於表1及/或2中所列之突變(分別為圖31及32)(例如SEQ ID NOS:3-1713)(例如SEQ ID NOS:1715-2787)的突變。
本文進一步描述較大多肽之區段或部分。視情況，區段具有催化活性，諸如核苷酸併入及核酸延伸活性，特別是在如本文所描述之核苷酸聚合或核酸外切酶域之情形中。本文描述多肽，其包含來源於SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的任何全長或片段，及位於N端或C端之至少一個額外殘基(例如，+1個殘基)。在一些實施例中，N及C端具有至少一個額外殘基、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個或超過100個額外殘基。
舉例而言，本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之一個的中之任一者，諸如相鄰N端天冬胺酸、相鄰C端精胺酸或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之任一者，諸如相鄰N端麩醯胺酸、相鄰C端組胺酸或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之任一者，諸如相鄰N端纈胺酸、相鄰C端半胱胺酸或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之任一者，諸如相鄰N端蘇胺酸、相鄰C端半胱胺酸或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之任一者，諸如相鄰N端蘇胺酸、相鄰C端半胱胺酸或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之任一者，諸如相鄰N端天冬胺酸、相鄰C端白胺酸或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之任一者，諸如相鄰N端天冬胺酸、相鄰C端精胺酸或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之任一者，諸如相鄰N端蘇胺酸、相鄰C端蘇胺酸或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之任一者，諸如相鄰N端蘇胺酸、相鄰C端天冬醯胺或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之任一者，諸如相鄰N端蘇胺酸、相鄰C端天冬醯胺或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。本文描述多肽，其包含SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803 (+1個殘基)中之任一者，諸如相鄰N端蘇胺酸、相鄰C端絲胺酸或其組合，或額外殘基，諸如經由SEQ ID NOS: 1-1713、1714-2787、2789、2790、2791、2792、2793及2803中之任一者的比對鑑別之殘基。 包含 RLF 89458 . 1 或 RLF 78286 . 1 主鏈序列 之經 工程化聚合酶
本發明提供一或多個突變聚合酶，其包含RLF 89458.1或RLF 78286.1之主鏈序列，且與SEQ ID NOS: 1-1713中之任一者具有100%、至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%或至少50%序列一致性(表1及圖11-12)。RLF 89458.1及RLF 78286.1之胺基酸序列相差在位置235處之胺基酸取代，其中RLF 78286.1包括D235E。
在一些實施例中，具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列的突變聚合酶包含各種域。
在一些實施例中，N端域包含胺基酸殘基1-134 (SEQ ID NO:2804) (例如，圖29)。
在一些實施例中，核酸外切酶域(例如，3'至5'核酸外切酶域)包含胺基酸殘基135-356 (SEQ ID NO:2805) (例如，圖29)。
在一些實施例中，第一掌型域包含胺基酸殘基357-454 (SEQ ID NO:2806) (例如，圖29)。
在一些實施例中，指型域包含胺基酸殘基455-504 (SEQ ID NO:2807) (例如，圖29)。
在一些實施例中，第二掌型域包含胺基酸殘基505-615 (SEQ ID NO:2808) (例如，圖29)。
在一些實施例中，拇指域包含胺基酸殘基616-765 (SEQ ID NO:2809) (例如，圖29)。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且包含至少一個與缺乏核酸外切酶負活性突變的聚合酶相比3'至5'外切核酸酶活性降低之胺基酸取代突變。舉例而言，突變聚合酶包含在位置D141及/或E143處之至少一個胺基酸取代。在一些實施例中，突變聚合酶包含突變D141A、D141V、D141L、D141I、D141F、D141Y、D141N、D141T、D141S、D141R、D141K、D141Q、D141W、D141E、D141M、D141P、D141G、D141H或D141C。在一些實施例中，突變聚合酶包含突變E143A、E143V、E143L、E143I、E143F、E143Y、E143N、E143T、E143S、E143W、E143M、E143P、E143F、E143G、E143H、E143R、E143K、E143D、E143C或E143Q。在一些實施例中，位置E143未突變。在一些實施例中，突變聚合酶包含在D141及E143位點處之突變的任何組合。
在一些實施例中，突變聚合酶包含未突變E143E及突變D141A、D141V、D141L、D141I、D141F、D141Y、D141N、D141T、D141S、D141R、D141K、D141Q、D141W、D141E、D141M、D141P、D141G、D141H或D141C。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶可用於對含尿嘧啶之核酸模板分子定序。突變聚合酶可展現出具有增加的將dATP併入核酸引子3'端與核酸模板分子中之尿嘧啶鹼基相對之位置處之能力的尿嘧啶耐受性。突變聚合酶亦能夠在與核酸模板分子中之尿嘧啶鹼基相對之位置處結合多價分子的帶有腺嘌呤之核苷酸單元。突變聚合酶可與野生型聚合酶相比或與具有未賦予尿嘧啶耐受性之突變的經工程化聚合酶相比展現出增加之尿嘧啶耐受性。具有尿嘧啶耐受性之具有RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列的突變聚合酶可包含在位置Y7、T9、H89、Q91、V93及/或R97處之突變。在一些實施例中，突變聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有在位置Y7處之胺基酸取代，其中該等突變包含Y7A、Y7F、Y7N、Y7D、Y7R、Y7W、Y7H或Y7Q中之任一者。在一些實施例中，突變聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有在位置T9處之胺基酸取代，其中該等突變包含T9N、T9E、T9S、T9L、T9I、T9D、T9A或T9R中之任一者。在一些實施例中，突變聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有在位置H89處之胺基酸取代，其中該等突變包含H89D、H89A、H89Y、H89R、H89N、H89Q、H89K、H89F、H89L或H89V中之任一者。在一些實施例中，突變聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有在位置Q91處之胺基酸取代，其中該等突變包含Q91L、Q91H、Q91R、Q91W、Q91A、Q91K、Q91N、Q91P、Q91V或Q91Y中之任一者。在一些實施例中，突變聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有在位置V93處之胺基酸取代，其中該等突變包含V93A、V93M、V93E、V93F、V93Y、V93G、V93S、V93K、V93T或V93I中之任一者。在一些實施例中，突變聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有在位置R97處之胺基酸取代，其中該等突變包含R97C、R97H、R97S、R97P、R97L、R97A、R97N、R97Q、R97E、R97I、R97K、R97M或R97T中之任一者。
具有NOZ 58130 (SEQ ID NO:1714)、RMF 90817 (SEQ ID NO:2789)、MBC 7218772 (SEQ ID NO:2790)、WP 175059460 (SEQ ID NO:2791)、KUO 42443 (SEQ ID NO:2792)或NOZ 77387 (SEQ ID NO:2793)之主鏈序列的其他尿嘧啶耐受性突變聚合酶可包括位置上等效於RLF 89458 (SEQ ID NO:1)中之Y7、T9、H89、Q91、V93及/或R97的突變。圖33展示此等各種聚合酶及其位置上等效之胺基酸殘基的序列比對。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且包含例如在位置L409、Y410及P411處之LYP模體的至少一個胺基酸取代突變。在一些實施例中，LYP模體中之至少一個突變可增加核苷酸類似物之併入比率。在一些實施例中，LYP模體之第一、第二及/或第三位置中之任一者或任何組合可經突變。舉例而言，LYP模體之突變包括AAG、AAP、AAV、AAI、AGA、AGG、AGI、AGP、AGV、FAA、FAG、FAI、FAP、FAV、FGA、FGG、FGP、FGV、LAG、LAI、LAP、LGG、LGI、LGV、SAA、SAG、SAI、SAV、SGA、SGG、SGI、YAA、YAG、YAI、YAP、YGA、YGG、YGI、YGP、LAA、LAV、LGP、LGA、FGI、SGV、YAV、YGV、SYP、SAP、AAA、SGP、LFP、IFP、VFP、LMP、VMP、IMP、LLP、VLP、ILP、LDP、VDP、IDP、LTP、VTP、ITP、LIP、TIP、NNP、NDP、NAP、SYG、SSG、SSS、CAG、ASG、SSG、MFG及FTA。
在一些實施例中，包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有在位置L409處之取代突變的聚合酶包含非極性胺基酸或極性不帶電胺基酸。在一些實施例中，在位置L409處之胺基酸取代突變包含纈胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、絲胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或甲硫胺酸。SEQ ID NOS: 1-1713包含在位置L409處之例示性胺基酸取代突變。
在一些實施例中，包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有在位置Y410處之取代突變的聚合酶包含非極性胺基酸或極性不帶電胺基酸。在一些實施例中，在位置Y410處之胺基酸取代突變包含蘇胺酸、絲胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸或酪胺酸。SEQ ID NOS: 1-1713包含在位置Y410處之例示性胺基酸取代突變。
在一些實施例中，包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有在位置P411處之取代突變的聚合酶包含極性不帶電胺基酸、非極性胺基酸或帶正電胺基酸。在一些實施例中，在位置P411處之胺基酸取代突變包含絲胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、半胱胺酸、離胺酸、異白胺酸、蘇胺酸或脯胺酸。SEQ ID NOS: 1-1713包含在P411處之例示性胺基酸取代突變位置。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有用以降低轉譯後修飾之至少一個突變。在一些實施例中，聚合酶包含至少一個甲硫胺酸、離胺酸、組胺酸、色胺酸及/或半胱胺酸殘基之突變或該等突變之任何組合。在一些實施例中，聚合酶包含在位置M1、M129、M159、M313、M329、M467及/或M759處的胺基酸取代。在一些實施例中，在位置M1處之突變包含M1F、M1I、M1L、M1S、M1N、M1A、M1V、M1Y、M1Q、M1K、M1V或M1A。在一些實施例中，在位置M129處之突變包含M129I、M129V、M129K、M129L、M129E、M129F、M129N、M129S、M129R或M129Y。在一些實施例中，在位置M159處之突變包含M159W、M159F或M159Y。在一些實施例中，在位置M313處之突變包含M313I、M313K、M313L、M313V、M313D、M313R、M313E、M313A、M313L或M313N。在一些實施例中，在位置M329處之突變包含M329L、M329S、M329W、M329A、M329R、M329I、M329Q、M329N或M329E。在一些實施例中，在位置M467處之突變包含M467V、M467K、M467D、M467T、M467R、M467E、M467Q或M467L。在一些實施例中，在位置M759處之突變包含M759T、M759S、M759N、M759R、M759E、M759D或M759A。
在一些實施例中，聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有用以降低轉譯後修飾之胺基酸取代，包括在位置K240、K306、K371、K429、K468、K476及/或K592處之突變。在一些實施例中，在位置K240處之突變包含K240S、K240E、K240R、K240D、K240N、K240Q或K240A。在一些實施例中，在位置K306處之突變包含K306R、K306N、K306Q、K306A、K306V、K306I或K306F。在一些實施例中，在位置K371處之突變包含K371R、K371D、K371N、K371Q、K371Y、K371T、K371V或K371L。在一些實施例中，在位置K429處之突變包含K429R、K429S、K429M、K429A、K429N、K429D、K429Q、K429H、K429Y、K429V、K429L或K429E。在一些實施例中，在位置K468處之突變包含K468R、K468E、K468Y、K468T或K468L。在一些實施例中，在位置K476處之突變包含K476R、K476D、K476A、K476F或K476R。在一些實施例中，在位置K592處之突變包含K592Q、K592R、K592W、K592Y、K592A、K592F、K592I、K592T、K592N或K592S。
在一些實施例中，聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有用以降低轉譯後修飾之胺基酸取代，包括在位置W299及/或W767處之突變。在一些實施例中，在位置W299處之突變包含W299F、W299E、W299N、W299Q、W299Y、W299A或W299F。在一些實施例中，在位置W767處之突變包含W767H、W767Y、W767F、W767S、W767R、W767D、W767A或W767N。
在一些實施例中，聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有用以降低轉譯後修飾之胺基酸取代，包括在位置H601處之突變。在一些實施例中，在位置H601處之突變包含H601R、H601I、H601A、H601T、H601V、H601L、H601N或H601K。
在一些實施例中，聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有用以降低轉譯後修飾之胺基酸取代，包括在位置C428處之突變。在一些實施例中，在位置C428處之突變包含C428Y。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有用以移除不配對半胱胺酸，從而降低對聚合酶之氧化損傷的至少一個突變。在一些實施例中，移除至少一個不配對半胱胺酸增加突變聚合酶之熱穩定性及/或降低蛋白質聚集。在一些實施例中，移除至少一個不配對半胱胺酸增加溶胞物製備物中之蛋白質的量。在一些實施例中，聚合酶包含在位置223及/或509處之半胱胺酸之至少一個突變或該等突變的任何組合。在一些實施例中，在位置C223處之突變包含胺基酸取代C223L、C223M、C223A、C223S、C223P、C223K、C223N、C223D或C223V。在一些實施例中，在位置C509處之突變包含胺基酸取代C509V、C509Y、C509S、C509M、C509A、C509N、C509D、C509H或C509Q。
在一些實施例中，聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有用以移除未配對半胱胺酸之胺基酸取代，包括在位置C509及V419處之胺基酸取代。在一些實施例中，在C509處之突變包含C509V、C509Y、C509S、C509M、C509A、C509N、C509D、C509H或C509Q中之任一者。在一些實施例中，在V419處之突變包含V419I、V419L或V419R中之任一者。
在一些實施例中，聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有用以移除未配對半胱胺酸之胺基酸取代，包括在位置C509及Q497處之胺基酸取代。在一些實施例中，在C509處之突變包含C509V、C509Y、C509S、C509M、C509A、C509N、C509D、C509H或C509Q中之任一者。在一些實施例中，在Q497處之突變包含Q497H、Q497G、Q497M、Q497N、Q497F、Q497L、Q497R、Q497K、Q497T、Q497E、Q497D或Q497Y。
在一些實施例中，聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有用以移除未配對半胱胺酸之胺基酸取代，包括在位置C509及S512處之胺基酸取代。在一些實施例中，在C509處之突變包含C509V、C509Y、C509S、C509M、C509A、C509N、C509D、C509H或C509Q中之任一者。在一些實施例中，在S512處之突變包含S512R、S512D、S512E、S512H、S512F、S512K、S512W或S512D。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有與野生型聚合酶相比或與具有不賦予增加之熱穩定性之突變的經工程化聚合酶相比增加聚合酶之熱穩定性的至少一個突變。在一些實施例中，聚合酶在約72至75℃，或約75至80℃，或約80至85℃，或約85至90℃，或更高溫度之升高溫度下展現出熱穩定性。在一些實施例中，使用差示掃描螢光測定法之熱偏移分析可用於確定聚合酶之熱穩定性。
在一些實施例中，聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有增加熱穩定性之胺基酸取代包含亦賦予核酸外切酶負活性之在一或多個位置處的胺基酸取代(包括D141及/或E143)。在一些實施例中，經工程化以展現出增加之熱穩定性的聚合酶包含在單獨位置M329或與D141及/或E143組合處之胺基酸取代。在一些實施例中，經工程化以展現出增加之熱穩定性的聚合酶包含在單獨位置D315或與D141及/或E143組合處之胺基酸取代。在一些實施例中，經工程化以在溶解物製備物中展現出增加量之蛋白質(例如，聚合酶)的聚合酶包含單獨或與未突變E143組合之胺基酸取代D141N或E143之任何胺基酸取代。在溶解物製備物中增加量之蛋白質可增加製備過程中活性聚合酶之產率。
在一些實施例中，在D141處之突變包含D141A、D141V、D141L、D141I、D141F、D141Y、D141N、D141T、D141S、D141R、D141K、D141Q、D141W、D141E、D141M、D141P、D141G、D141H或D141C。
在一些實施例中，在E143處之突變包含E143A、E143V、E143L、E143I、E143F、E143Y、E143N、E143T、E143S、E143W、E143M、E143P、E143G、E143H、E143R、E143K、E143D、E143C或E143Q。
在一些實施例中，在M329處之突變包含M329L、M329S、M329W、M329A、M329R、M329I、M329Q、M329N或M329E。
在一些實施例中，在D315處之突變包含D315A、D315E、D315R、D315W、D315L、D315W、D315F。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有與具有相同野生型或經工程化主鏈序列的未截斷聚合酶相比增加聚合酶之熱穩定性的C端截斷。聚合酶之C端區可為無序的且可促進蛋白質聚集。因此，C端區之截斷可降低蛋白質聚集且改良穩定性。在一些實施例中，聚合酶在約72至75℃，或約75至80℃，或約80至85℃，或約85至90℃，或更高溫度之升高溫度下展現出熱穩定性。在一些實施例中，使用差示掃描螢光測定法之熱偏移分析可用於確定聚合酶之熱穩定性。
在一些實施例中，聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且經工程化以展現出增加之熱穩定性，其中該等聚合酶包含在胺基酸位置處之截斷，包括K464(截斷)、R465(截斷)、E475(截斷)、Y481(截斷)、E616(截斷)、E620(截斷)、E755(截斷)、Y756(截斷)、Q757(截斷)、R758(截斷)、M759(截斷)、T762(截斷)、W767(截斷)或M770(截斷)。在表1及表2中，截斷指定為「^」。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有與具有相同野生型或經工程化主鏈序列的未截斷聚合酶相比增加聚合酶之熱穩定性的N端截斷。在一些實施例中，經工程化聚合酶包含在位置1處之缺失的甲硫胺酸。表1列出在位置1處具有缺失之甲硫胺酸的各種經工程化聚合酶，其命名為「M1X」；及其Tm1及Tm2資料。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有與野生型聚合酶相比或與具有不降低構形轉換之突變的經工程化聚合酶相比降低聚合酶之熱穩定性的至少一個突變。在一些實施例中，蛋白質模型化可鑑別與引子或引子末端相互作用之關鍵胺基酸殘基，其中此等胺基酸殘基可在與引子相互作用中起作用，或將引子末端自聚合位點轉移至核酸外切酶位點。在一些實施例中，聚合酶包含位置V610、D613、Q664、E668、P677及/或D671中之任一者或任何組合處之胺基酸取代。
在一些實施例中，在V610處之突變包含V610D、V610A、V610K、V610S、V610T、V610N、V610R或V610Q。
在一些實施例中，在D613處之突變包含D613S、D613E、D613R、D613K、D613N、D613Q、D613A、D613V、D613Y或D613F。
在一些實施例中，在Q664處之突變包含Q664A、Q664L、Q664V、Q664F、Q664I、Q664R、Q664K、Q664T、Q664N或Q664M。
在一些實施例中，在E668處之突變包含E668G、E668K、E668M、E668A、E668P、E668S、E668R、E688N、E688D、E668Y或E668Q。
在一些實施例中，在P677處之突變包含P677L、P677R、P677K或P677A。
在一些實施例中，在D671處之突變包含D671G、D671R、D671Y、D671S、D671A、D671K或D671N。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有與野生型聚合酶相比或與具有不賦予降低之聚集之突變的經工程化聚合酶相比藉由降低分子間相互作用來降低蛋白質聚集的至少一個突變。在一些實施例中，突變聚合酶與野生型聚合酶相比或與具有不賦予降低之聚集之突變的經工程化聚合酶相比在約72至75℃，或約75至80℃，或約80至85℃，或約85至90℃，或更高溫度之升高溫度下聚集。在一些實施例中，使用差示掃描螢光測定法之熱偏移分析可用於確定蛋白質聚集之溫度。
在一些實施例中，聚合酶包含RLF 89458或RLF 78286 (例如，分別為SEQ ID NOS:1或2)之主鏈序列且具有降低聚集之胺基酸取代包含在一或多個位置N11、K507、K511及/或K637處之胺基酸取代。
在一些實施例中，在位置N11處之突變包含N11S、N11A、N11R、N11Q、N11E、N11K、N11T或N11D。
在一些實施例中，在位置K507處之突變包含K507L、K507E、K507S、K507A、K507N、K507Q、K507E、K507T或K507D。
在一些實施例中，在位置K511處之突變包含E511K、E511S、E511A、E511R、E511N、E511T、E511Q、E511L、E511D或E511A。
在一些實施例中，在位置K637處之突變包含K637M、K637A、K637N、K637Q、K637E、K637S或K637T。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列，且在包括以下之位置的任何一個或任何組合處包含胺基酸取代突變：M1、L3、D4、D6、Y7、I8、T9、E10、N11、G12、K13、P14、V15、I16、R17、I18、F19、K20、K21、E22、K23、G24、E25、F26、K27、I28、E29、Y30、D31,R32、N33、F34、E35、P36、Y37、I38、Y39、A40、L41、L42、E43、D44、D45、E46、S47、I48、E49、D50、I51、K52、K53、I54、T55、R58、G56、E57、R58、H59、G60、K61、K62、V63、I65、I66、R67、V68、E69、K70、V71、K72、K73、K74、F75、L76、G77、E78、P79、I80、E81、V82、W83、K84、L85、V86、F87、E88、H89、P90、Q91、D92、V93、P94、A95、I96、R97、D98、A99、I100、R101、S102、H103、P104、A105、V106、R107、E108、I109、F110、E111、Y112、D113、I114、P115、F116、A117、K118、R119、Y120、L121、I122、D123、K124、L126、V127、P128、M129、E130、G131、G132、E133、L135、K136、L137、L138、A139、F140、D141、I142、E143、T144、F145、Y146、H147、E148、D150、E151、E156、M159、S166、W173、K174、I176、Y180、A190、I191、K192、L195、L198、R199、Q196、P203、V205、L207、Y209、G211、N213、F214、D215、F216、A217、Y218、I219、K220、C223、E224、K225、G227、L228、K229、F230、T231、I232、G233、R234、S237、E238、P239、K240、I241、Q242、R243、M244、G245、D246、R247、A249、E251、L258、Y261、P262、V264、R265、H266、T267、I268、R269、L270、P271、T272、Y273、T274、L275、E276、A277、V278、V282、F283、K285、K286、K287、E288、K289、V290、Y291、A292、I295、E297、A298、W299、K300、S301、E302、L305、K306、R307、V308、A309、Q310、Y311、M313、D315、R317、A318、Y320、E321、P328、V331、M329、E332、L333、A334、I337、G338、Q339、V341、D343、S345、S347、S348、T349、G350、N351、L352、V353、W355、Y356、L357、R359、V360、Y362、N365、E366、L367、K371、P372、G373、G374、E375、E376、Y377、Q378、M381、S383、S384、Y385、I386、G388、Y389、E394、K395、G396、E399、S400、A402、Y403、L404、F406、R407、S408、L409、Y410、P411、S412、I413、V415、H417、V419、P421、D422、T423、L424、E425、E427、C428、K429、N430、Y431、V433、A434、I436、Y439、R440、K443、K446、G447、F448、I449、P450、S451、I452、L453、E454、D455、I457、T459、K462、V463、K464、R465、M467、K468、T470、I471、D472、I474、E475、K476、M478、Y481、R484、A485、L486、K487、I488、N491、S492、Y493、Y494、G495、Q497、G498、Y499、P500、K501、S506、K507、E508、C509、E511、S512、V513、T514、G517、R518、H519、I521、T523、A528、E529、K534、V535、Y537、A538、D539、T540、D541、G542、F543、F544、I547、N549、E550、K551、P552、I555、S557、K558、A559、K560、K561、L563、K564、H565、E568、K569、G572、M573、E575、E577、L583、G585、F586、V588、T589、K592、Y593、L595、I596、D599、H601、T604、R605、G606、L607、V609、V610、R611、R612、D613、E616、I617、K619、E620、T621、Q622、A623、K624、V625、L626、E627、V628、I629、L630、R631、E632、G633、S634、I635、E636、K637、A638、A639、G640、I641、V642、K644、V645、V646、E647、D648、L649、A650、N651、Y652、R653、V654、V656、E657、K658、I660、H662、E663、Q664、I665、T666、R667、E668、K670、D671、Y672、K673、A674、T675、G676、P677、H678、V679、A680、I681、A682、K683、R684、L685、Q686、A687、R688、G689、I690、K691、V692、K693、P694、T696、I698、S699、Y700、V701、V702、L703、K704、G705、S706、K707、K708、I709、D711、R712、V713、I714、L715、F716、D717、E718、Y719、D720、S721、S722、R723、K725、Y726、P728、Y730、Y731、I732、H733、N734、Q735、V736、P738、A739、V740、L741、R742、I743、L744、E745、A746、F747、G748、Y749、K750、E751、K752、D753、L754、E755、Y756、Q757、R758、M759、K760、Q761、T762、G763、L764、G765、A766、W767、L768及/或M770。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列，且在包括以下之位置的任何一個或任何組合處包含胺基酸取代突變：M1F、M1I、M1L、M1S、M1N、M1A、M1V、M1Y、M1Q、M1K、M1V、M1A、L3I、D4R、D4A、D6S、D6R、Y7A、Y7F、Y7N、Y7D、Y7R、Y7W、Y7H、Y7Q、I8S、T9N、T9E、T9S、T9L、T9I、T9D、T9A、T9R、E10V、E10D、E10K、E10R、E10A、E10N、N11S、N11A、N11R、N11Q、N11E、N11K、N11T、N11D、G12S、G12D、G12E、K13E、P14Q、P14N、P14S、V15I、I16T、I16N、I16F、R17H、R17C、I18V、I18L、F19Y、F19S、F19I、K20M、K20E、K21E、E22G、E22V、E22K、K23E、K23M、K23R、K23A、K23N、G24S、E25K、F26L、K27M、I28F、I28N、I28T、I28V、I28F、E29V、E29D、Y30F、Y30N、Y30D、Y30K、D31V、R32C、R32S、N33S、F34S、F34I、E35K、E35G、E35D、P36L、P36A、P36G、P36V、P36M、P36T、P36K、Y37N、Y37F、I38T、I38N、Y39F、A40G、A40V、A40T、L41P、L41F、L41Y、L41D、L41E、L42P、L42Q、E43V、E43K、E43D、D44N、D44G、D45V、E46V、E46S、S47N、S47G、S47R、S47A、I48V、E49G、E49K、D50V、D50G、D50N、D50E、I51K、I51F、I51V、K52I、K52R、K53E、I54T、I54N、I54F、I54K、I54V、T55I、T55S、T55A、G56D、G56S、G56V、G56A、E57G、E57K、R58C、R58L、R58H、H59L、H59Y、G60S、G60D、K61M、K61T、K62N、K62E、K62R、K62T、K62V、V63A、V63I、V63D、I65T、I65V、I65F、I65N、I66V、I66T、I66N、I66K、R67C、V68M、V68A、E69K、K70I、V71I、K72H、K72R、K72V、K72Q、K73E、K74E、K74R、K74N、K74Q、F75C、L76Q、G77D、G77S、E78K、E78G、E78N、E78S、E78R、P79S、I80F、I80N、I80K、I80S、I80R、E81D、E81V、V82A、W83R、K84R、L85V、L85Q、L85A、V86D、V86I、V86A、V86Y、F87I、F87L、F87C、E88K、E88D、E88N、E88T、H89D、H89A、H89Y、H89R、H89N、H89Q、H89K、H89F、H89L、H89V、P90L、P90S、P90D、P90R、P90A、P90G、P90V、P90M、P90T、P90K、Q91L、Q91H、Q91R、Q91W、Q91A、Q91K、Q91N、Q91P、Q91V、Q91Y、D92N、D92V、D92E、D92R、V93A、V93M、V93E、V93F、V93Y、V93G、V93S、V93K、V93T、V93I、V93L、P94L、P94W、P94Y、P94Q、P94F、P94S、A95V、I96T、I96K、I96S、R97C、R97H、R97S、R97P、R97L、R97A、R97N、R97Q、R97E、R97I、R97K、R97M、R97T、D98E、D98N、D98V、A99T、A99K、I100T、R101C、R101H、S102N、S102G、S102E、H103R、H103L、H103Q、H103Y、P104T、P104L、A105S、V106A、V106T、R107C、R107S、R107V、E108V、I109K、I109N、I109F、F110L、F110S、F110Y、E111V、E111G、Y112C、D113G、D113Y、I114T、I114A、I114G、I114V、I114M、I114T、I114K、P115C、P115L、P115S、P115R、P115F、F116L、F116S、F116A、A117T、A117V、A117K、K118M、K118R、K118A、K118Q、K118Y、K118N、R119H、R119S、R119C、R119A、R119G、R119V、R119M、R119T、R119K、R119Y、Y120C、Y120N、L121M、I122V、I122F、I122N、I122D、D123G、D123E、D123N、D123V、K124N、K124E、K124R、L126F、L126P、L126Q、V127M、V127I、P128L、P128M、M129I、M129V、M129K、M129L、M129E、M129F、M129N、M129S、M129R、M129Y、E130D、E130G、E130V、E130K、E130T、G131S、G132S、G132D、E133K、L135M、L135P、L135Q、K136E、K136R、K136L、L137F、L137M、L138P、A139E、F140Y、F140L、F140S、D141A、D141V、D141L、D141I、D141F、D141Y、D141N、D141T、D141S、D141R、D141K、D141Q、D141W、D141E、D141M、D141P、D141G、D141H、D141C、I142V、I142F、I142A、E143A、E143V、E143L、E143I、E143F、E143Y、E143N、E143T、E143S、E143W、E143M、E143P、E143G、E143H、E143R、E143K、E143D、E143C、E143Q、T144F、F145L、Y146C、Y146A、Y146E、Y146S、Y146E、Y146K、Y146T、Y146R、H147E、H147R、H147E、H147D、H147N、H147Q、H147K、H147A、E148S、E148D、E148R、E148A、D150R、D150E、E151R、E156P、M159W、M159F、M159Y、S166E、W173R、W173A、W173Q、W173N、W173H、W173F、K174N、K174D、K174E、K174Q、I176V、Y180F、A190V、A190M、I191L、K192L、L195A、R199H、Q196R、L198I、L198V、P203S、V205A、L207I、L207V、Y209A、Y209E、Y209W、G211S、N213E、N213W、N213Y、F214A、F214E、F214W、F214V、D215A、D215N、D215Q、D215E、D215R、D215K、D215P、F216L、A217N、A217T、A217Q、A217S、Y218H、I219V、I219L、K220R、K220N、K220Q、K220H、K220I、K220L、K220M、K220Y、C223V、C223E、C223S、C223L、C223M、C223A、C223P、C223K、C223N、C223D、E224V、E224R、E224K、K225E、G227S、L228P、L228I、L228V、K229R、K229N、K229Q、K229H、F230L、T231I、T231P、I232F、G233D、R234C、S237G、S237C、E238S、E238R、P239S、K240S、K240E、K240R、K240D、K240N、K240Q、K240A、I241T、I241Q、I241E、I241N、I241A、I241S、I241D、I241P、Q242N、Q242S、Q242R、Q242D、Q242E、Q242V、R243E、M244T、M244K、G245D、G245S、G245R、G245A、G245N、G245K、D246R、D246L、D246E、D246V、D246Q、R247E、R247D、R247S、R247H、A249G、A249V、E251S、E251R、E251A、L258I、L258Q、L258F、Y261A、Y261P、Y261T、P262S、P262R、P262L、P262D、P262E、P262Q、V264I、V264A、R265D、R265I、H266F、H266W、H266Y、H266R、H266I、H266L、H266A、H266K、T267A、T267F、T267M、T267V、T267W、T267Y、T267I、T267S、I268A、I268F、I268M、I268V、I268W、I268Y、R269L、R269K、R269S、R269T、R269V、R269N、R269H、R269Y、L270R、P271S、P271F、P271E、P271L、P271Q、P271N、T272A、T272Y、T272V、T272S、T272L、T272E、T272C、T272R、T272W、T272N、T272F、T272H、T272K、Y273A、Y273W、T274E、T274W、T274S、T274D、T274V、T274A、T274R、T274N、L275P、L275M、E276K、A277V、V278M、V282L、V282T、V282G、V282I、F283L、K285I、K285Q、K286E、K286P、K287R、E288G、E288K、K289E、K289Q、K289N、K289I、K289R、V290E、Y291F、Y291N、Y291D、Y291K、Y291R、Y291Q、Y291A、A292N、A292T、A292I、I295N、E297G、A298G、W299F、W299E、W299N、W299Q、W299Y、W299A、W299F、K300S、K300E、S301N、S301T、E302G、L305P、K306R、K306N、K306Q、K306A、K306V、K306I、K306F、R307C、V308I、V308A、A309S、Q310R、Y311A、Y311E、Y311W、Y311F、M313I、M313K、M313L、M313V、M313D、M313R、M313E、M313A、M313L、M313N、D315A、D315E、D315R、D315W、D315L、D315W、D315F、R317C、R317K、A318V、Y320F、E321L、P328A、M329L、M329S、M329W、M329A、M329R、M329I、M329Q、M329N、M329E、V331A、E332K、E332G、E332Q、L333A、L333V、L333I、L333F、A334S、I337V、G338D、Q339N、V341L、D343E、D343N、D343R、D343A、S345C、S345R、S347N、S347T、S347R、S347A、S348C、T349A、T349E、T349F、T349I、T349L、T349N、T349S、T349Y、G350S、N351S、N351Q、N351R、N351I、N351Y、N351K、N351A、N351E、L352M、V353Q、V353E、W355R、W355F、Y356N、Y356C、Y356L、Y356F、L357P、R359H、V360A、V360D、V360I、V360K、Y362I、Y362E、Y362F、Y362N、Y362D、Y362K、Y362R、Y362T、N365S、E366A、E366D、E366N、E366Q、E366R、L367P、K371R、K371D、K371N、K371Q、K371Y、K371T、K371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在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且在包括M1(缺失)、R58(缺失)、V93(缺失)及/或E755(缺失)之位置的任何一個或任何組合處包含胺基酸缺失。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置M1處之取代突變。在一些實施例中，在位置M1處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置Y7處之取代突變。在一些實施例中，在位置Y7處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置K74處之取代突變。在一些實施例中，在位置K74處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置E88處之取代突變。在一些實施例中，在位置E88處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置V93處之取代突變。在一些實施例中，在位置V93處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置A217處之取代突變。在一些實施例中，在位置A217處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置Y261處之取代突變。在一些實施例中，在位置Y261處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置T267處之取代突變。在一些實施例中，在位置T267處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置I268處之取代突變。在一些實施例中，在位置I268處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置E366處之取代突變。在一些實施例中，在位置E366處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置I436處之取代突變。在一些實施例中，在位置I436處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置A485處之取代突變。在一些實施例中，在位置A485處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、V、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置T514處之取代突變。在一些實施例中，在位置T514處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NO:1)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列且具有在位置D671處之取代突變。在一些實施例中，在位置D671處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。 包含 NOZ 58130 . 1 主鏈序列之經工程化聚合酶
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有NOZ 58130.1之主鏈序列，且與SEQ ID NOS: 1714-2787中之任一者具有100%、至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%或至少50%序列一致性(在圖32及圖13處之表2)。
在一些實施例中，具有NOZ 58130.1 (例如，SEQ ID NO:1714)之主鏈序列的突變聚合酶包含各種域。
在一些實施例中，N端域包含胺基酸殘基1-162 (SEQ ID NO:2810)(例如，圖30)。
在一些實施例中，核酸外切酶域(例如，3'至5'核酸外切酶域)包含胺基酸殘基163-405 (SEQ ID NO:2811) (例如，圖30)。
在一些實施例中，掌型域包含胺基酸殘基406-640 (SEQ ID NO:2812) (例如，圖30)。
在一些實施例中，掌型域內之指型子域包含胺基酸殘基480-527 (SEQ ID NO:2813) (例如，圖30)。
在一些實施例中，拇指域包含胺基酸殘基641-792 (SEQ ID NO:2814) (例如，圖30)。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列，且包含與缺乏核酸外切酶負活性突變之聚合酶相比降低3'至5'外切核酸酶活性的至少一個胺基酸取代突變。舉例而言，突變聚合酶包含在位置D168及/或E170處之至少一個胺基酸取代。在一些實施例中，突變聚合酶包含突變D168A、D168V、D168L、D168I、D168F、D168Y、D168N、D168K、D168T、D168S、D168W、D168M、D168P、D168G、D168H、D168R、D168E、D168C或D168Q。在一些實施例中，突變聚合酶包含突變E170A、E170V、E170L、E170I、E170F、E170Y、E170N、E170K、E170T、E170S、E170W、E170M、E170P、E170G、E170H、E170R、E170D、E170C或E170Q。在一些實施例中，突變聚合酶包含在D168及E170位點處之突變的任何組合。SEQ ID NOS:1714-2787包含在位置D168及E170處之例示性胺基酸取代突變。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且包含例如在位置L440、Y441及P442處之LYP模體的至少一個胺基酸取代突變。在一些實施例中，LYP模體中之至少一個突變可增加核苷酸類似物之併入比率。在一些實施例中，LYP模體之第一、第二及/或第三位置中之任一者或任何組合可經突變。舉例而言，LYP模體之突變包括YAG、FAG、YGP、YAP、FGP、SAP、AAA、YGA、YAA、FGA、FTA、AAG、AAP、AAV、AAI、AGA、AGG、AGI、AGP、AGV、FAA、FAI、FAP、FAV、FGG、FGV、LAG、LAI、LAP、LGG、LGI、LGV、SAA、SAG、SAI、SAV、SGA、SGG、SGI、YAI、YGG、YGI、LAA、LAV、LGP、LGA、FGI、SGV、YAV、YGV、SYP、SGP、LFP、IFP、VFP、LMP、VMP、IMP、LLP、VLP、ILP、LDP、VDP、IDP、LTP、VTP、ITP、LIP、TIP、NNP、NDP、NAP、MFG及SYG。
在一些實施例中，包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置L440處之取代突變的聚合酶包含非極性胺基酸或極性不帶電胺基酸。在一些實施例中，在位置L440處之胺基酸取代突變包含纈胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、絲胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或甲硫胺酸。SEQ ID NOS: 1714-2787包含在位置L440處之例示性胺基酸取代突變。
在一些實施例中，包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置Y441處之取代突變的聚合酶包含非極性胺基酸或極性不帶電胺基酸。在一些實施例中，在位置Y441處之胺基酸取代突變包含蘇胺酸、絲胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸或酪胺酸。SEQ ID NOS: 1715-2787包含在Y441處之例示性胺基酸取代突變。
在一些實施例中，包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置P442處之取代突變的聚合酶包含極性不帶電胺基酸、非極性胺基酸或帶正電胺基酸。在一些實施例中，在位置P442處之胺基酸取代突變包含絲胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、半胱胺酸、離胺酸、異白胺酸、蘇胺酸或脯胺酸。SEQ ID NOS: 1715-2787包含在位置P442處之例示性胺基酸取代突變。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有與野生型聚合酶相比或與缺乏用以降低轉譯後修飾之突變的經工程化聚合酶相比降低轉譯後修飾的至少一個突變。在一些實施例中，聚合酶包含至少一個甲硫胺酸、離胺酸、色胺酸及/或絲胺酸殘基之突變或該等突變之任何組合。在一些實施例中，該等聚合酶經工程化以包括在W135、M187、W329、K335、M389、S473、M527、K552、M629、W641、K650、K711、M723及/或W791處之胺基酸取代突變的任一者或任何組合。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置W135處之突變，其包含W135S、W135L、W135R、W135Y、W135F、W135D、W135A、W135V或W135G。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置M187處之突變，其包含M187S、M187L、M187R、M187Y、M187I、M187T、M187A或M187V。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置W329處之突變，其包含W329Y、W329F、W329L、W329D、W329A或W329V。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置K335處之突變，其包含K335R、K335L、K335S或K335A。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置M389處之突變，其包含M389D、M389E、M389L、M389Y、M389S、M389A或M389V。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置S473處之突變，其包含S473K、S473R、S473T、S473Q或S473A。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置M527處之突變，其包含M527H、M527G、M527Q、M527L、M527D、M527A或M527V。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置M549處之突變，其包含M549N、M549Y、M549H、M549T、M549D、M549R、M549A或M549V。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置K552處之突變，其包含K552R、K552T、K552N、K552Q或K552A。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置M629處之突變，其包含M629L、M629A、M629D、M629R或M629V。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置W641處之突變，其包含W641R、W641A、W641L、W641F、W641Y或W641V。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置K650處之突變，其包含K650T、K650C、K650A、K650R或K650S。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置K711處之突變，其包含K711R、K711L、K711T或K711D。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置M723處之突變，其包含M723S、M723I、M723T、M723N、M723R、M723L、M723A或M723C。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置W791處之突變，其包含W791R、W791Y、W791D、W791S、W791L、W791A或W791V。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有用以移除不配對半胱胺酸，從而降低對聚合酶之氧化損傷的至少一個突變。在一些實施例中，移除至少一個不配對半胱胺酸增加突變聚合酶之熱穩定性及/或降低蛋白質聚集。在一些實施例中，移除至少一個不配對半胱胺酸增加溶胞物製備物中之蛋白質的量。在一些實施例中，聚合酶包含在位置362及/或539處之半胱胺酸之至少一個突變或該等突變的任何組合。在一些實施例中，在位置C362處之突變包含胺基酸取代C362A、C362L、C362I、C362S、C362F、C362Y、C362V、C362P、C362K、C362N或C362D。在一些實施例中，在位置C539處之突變包含胺基酸取代C539A、C539V、C539L、C539S、C539Y、C539D、C539K、C539N或C539P。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有未突變或突變C362，及胺基酸取代R536C。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有未突變或突變C539，及胺基酸取代R536C。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有未突變或突變C362，及胺基酸取代D451C。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列具有相同野生型或經工程化主鏈序列的未截斷聚合酶相比增加聚合酶之熱穩定性的C端截斷。聚合酶之C端區可為無序的且可促進蛋白質聚集。因此，C端區之截斷可降低蛋白質聚集且改良穩定性。在一些實施例中，聚合酶在約72至75℃，或約75至80℃，或約80至85℃，或約85至90℃，或更高溫度之升高溫度下展現出熱穩定性。在一些實施例中，使用差示掃描螢光測定法之熱偏移分析可用於確定聚合酶之熱穩定性。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有用以增加之熱穩定性的C端截斷，包括M723(截斷)、G773(截斷)、D777(截斷)、E781(截斷)、T784(截斷)、Q785(截斷)、R790(截斷)、W791(截斷)或F792(截斷)。在表2中，截斷指定為「^」。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有與野生型聚合酶相比或與具有不降低構形轉換之突變的經工程化聚合酶相比降低聚合酶之熱穩定性的至少一個突變。在一些實施例中，蛋白質模型化可鑑別與引子或引子末端相互作用之關鍵胺基酸殘基，其中此等胺基酸殘基可在與引子相互作用中起作用，或將引子末端自聚合位點轉移至核酸外切酶位點。在一些實施例中，聚合酶包含在位置Q95、I186、V304 L313及/或E318處之胺基酸取代。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置Q95處之突變，其包含Q95L、Q95H、Q95R、Q95W、Q95A、Q95K、Q95N或Q95P。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置I186處之突變，其包含I186R或I186N。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置V304處之突變，其包含V304D。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置L313處之突變，其包含L313M、L313D、L313F、L313K、L313R、L313A或L313E。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置E318處之突變，其包含E318V。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有NOZ 58130 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有與野生型聚合酶相比或與具有不賦予降低之聚集之突變的經工程化聚合酶相比藉由降低分子間相互作用來降低蛋白質聚集的至少一個突變。在一些實施例中，突變聚合酶與野生型聚合酶相比或與具有不賦予降低之聚集之突變的經工程化聚合酶相比在約72至75℃，或約75至80℃，或約80至85℃，或約85至90℃，或更高溫度之升高溫度下聚集。在一些實施例中，使用差示掃描螢光測定法之熱偏移分析可用於確定蛋白質聚集之溫度。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOs: 1714-2787中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%序列一致性的序列且包括藉由降低分子間相互作用來降低蛋白質聚集的至少一個突變。
在一些實施例中，聚合酶包含NOZ 58130 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有降低聚集之胺基酸取代包含在一或多個位置E76、K254、R537、E541及/或K664處之胺基酸取代。
在一些實施例中，在位置E76處之突變包含E76N、E76A、E76R、E76K、E76T、E76V、E76S、E76Q、E76D或E76I。
在一些實施例中，在位置K254處之突變包含K254E、K254D、K254A、K254N、K254T、K254V、K254S、K254Q、K254G、K254I或K254R。
在一些實施例中，在位置R537處之突變包含R537S、R537T、R537N、R537Q、R537A、R537V、R537D、R537I、R537E、R537G、R537K或R537L。
在一些實施例中，在位置E541處之突變包含E541A、E541R、E541N、E541K、E541T、E541V、E541S、E541Q、E541D或E541I。
在一些實施例中，在位置K664處之突變包含K664R、K664A、K664N、K664Q、K664E、K664S、K664T、K664D、K664G、K664V或K664I。
在一些實施例中，突變聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列及包括N端域(SEQ ID NO:2810)、核酸外切酶域(SEQ ID NO:2811)、第一掌型域(SEQ ID NO:2812)、指型域(SEQ ID NO:2813)、拇指域(SEQ ID NO:2814)之域中之任一者的缺失部分。
在一些實施例中，突變缺失聚合酶包含與SEQ ID NOs: 1714-2787中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%序列一致性的序列且包括域中之任一者的缺失部分。
在一些實施例中，突變缺失聚合酶包含NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且缺失部分包含I130 - P160或其中之任何子區域。在一些實施例中，缺失之部分包含I130、T134、L136、L138、R143、G151或E156中之任一者的N端。在一些實施例中，缺失之部分包含以下中之任一者的C端：P160、E156、V152、A147、G145或L136。
在一些實施例中，缺失之部分包含以下中之任一者：I130-P160、L136-P160、L138-P160、R143-P160、I130-V152、L136-V152、L138-V152、R143-V152、I130-A147、L136-A147、L138-A147、R143-A147、I130-G145、L136-G145、L138-G145、R143-G145、I130-L136、G151-P160、G151-V152、E156-P160或T134-E156。
在一些實施例中，突變聚合酶中缺失之部分(例如，具有NOZ 58130.1之主鏈序列，SEQ ID NO:1714)為包括RLF 89458 (SEQ ID NO:1)、RLF 78286 (SEQ ID NO:2)、WP 175059460 (SEQ ID NO:2791)、9°N (SEQ ID NOS:2795及2796)、THERMINATOR (SEQ ID NO:2797)、VENT (SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT (SEQ ID NO:2799)、Pfu (SEQ ID NO:2800)及火球菌(P. abyssi) (SEQ ID NO:2801)之其他古菌B家族聚合酶中缺乏的序列或區域。舉例而言，參見圖33及35中之序列比對，其顯示存在於NOZ 58130中但不存在於其他古菌家族B聚合酶中之區域。在一些實施例中，突變聚合酶中缺失之部分包含胺基酸序列TWLRLEVEERDGRALLRGVEQLE (SEQ ID NO:2788)，其長度為23個胺基酸。在一些實施例中，缺失之部分大於或小於SEQ ID NO:2788。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (例如，SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且包含在包括以下之位置中之任何一個或任何組合處的胺基酸取代突變：Y14、E15、V17、E18、R20、F26、L25、L27、G29、F34、V35、V36、F41、S42、P43、F45、L48、P49、G50、R55、E58、L61、A62、S63、A65、E67、A68、I69、K71、V72、I74、E76、K77、L79、F80、T82、P83、R84、V85、A86、L87、T90、V91、S92、H93、P94、Q95、D96、V97、P98、R99、I100、R101、E102、R103、R105、E108、D111、L112、I113、N114、E115、H116、D117、I118、V121、R122、R123、Y124、I126、R128、I130、K131、P132、L133、T134、W135、L136、E139、G145、R150、E153、E156、E157、E158、R163、V164、A165、V167、D168、I169、E170、V171、Y172、N173T、P174、E184、I186、M187、V190、T192、S193、E197、L200、V205、G207、E209、Q210、Q215、D216、M220、L222、E226、K229、G231、Y233、I236、V237、G238、N240、T241、S243、F244、Y248、R252、L253、K254、L260、L265、D266、L269、S272、G275、A276、L277、I282、A286、V288、L290、Y291、P292、I293、V294、R295、H297、V298、K299、N301、S302、Y303、V304、S307、V309、L312、L313、G314、E318、K319、L320、D321、G322、R324、L325、F326、T327、W329、D330、E331、K335、R336、L338、L339、A343、Y342、L344、D346、A352、A354、K356、L360、C362、I367、A376、M378、T379、V384、L387、M389、R390、T393、L398、I399、P400、E407、Y408、A409、R413、Y416、R422、V429、V434、F435、D436、F437、S439、L440、Y441、P442、S443、I444、I445、V446、T454、A465、S473、F479、I480、R496、D504、F511、A515、S522、F523、Y524、Y526、M527、R536、R537、E538、C539、E541、V543、A544、F546、A547、M549、I551、K552、M555、A558、E559、F562、L564、E565、V566、D570、D572、V576、V577、I578、P580、L585、A586、Q587、K588、K592、V593、E595、M597、I601、F608、L613、V615、T616、R619、L622、L623、K628、M629、V631、F636、V637、R638、R639、D640、W641、A642、K650、I655、L656、A660、K664、A665、L668、I673、E674、R675、R677、S682、D685、T687、Y689、T690、Q691、R695、S698、S701、E703、V707、A708、K711、E718、V719、M723、I724、I729、T730、K734、G735、S737、Q738、T741、D752、D758、N759、I761、I765、R767、I772、Y774、L779、K780、E781、G782、I783、T784、Q785、T786、S787、L788、S789、R790、W791及/或F792。
本發明提供包含突變聚合酶之組合物及方法，該等突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (例如，SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且在包括以下之位置的任何一個或任何組合處包含胺基酸取代突變：Y14F、Y14D、Y14I、Y14N、E15I、V17E、E18S、E18N、E18D、R20K、L25F、F26Y、F26S、F26I、L27Q、L27K、G29E、G29K、F34K、V35M、V35K、V36F、V36N、V36T、V36I、V36E、F41S、F41I、F41Y、S42K、S42G、S42D、S42E、P43L、P43A、P43G、P43V、P43M、P43T、P43K、F45T、F45N、F45I、L48D、P49V、P49K、P49D、P49E、P49L、G50K、R55G、R55K、R55E、R55I、E58V、L61I、L61S、L61A、L61T、A62D、A62S、A62V、A62G、S63G、S63K、S63E、A65L、A65Y、A65H、E67M、E67K、E67V、A68R、I69A、I69D、I69V、K71T、K71V、K71F、K71N、K71I、V72T、V72N、V72I、I74K、E76Q、E76N、E76A、E76R、E76K、E76T、E76V、E76S、E76D、E76I、K77E、L79F、F80L、T82K、T82G、T82N、T82S、T82E、P83R、R84N、R84K、R84S、V85R、V85E、A86V、L87W、T90D、T90I、T90A、T90V、V91I、V91L、V91C、V91F、H93D、H93A、H93Y、P94L、P94S、P94D、P94R、P94A、P94G、P94V、P94M、P94T、P94K、Q95L、Q95H、Q95R、Q95W、Q95A、Q95K、Q95N、Q95P、D96N、D96V、V97S、V97A、V97F、V97Y、V97Q、P98L、P98W、P98Y、P98Q、P98F、P98S、R99V、R99A、I100T、I100K、I100S、R101C、R101H、R101S、R101P、R101L、E102N、E102V、E102D、R103T、R103A、R105C、R105H、E108N、D111C、D111S、D111R、L112N、L112Q、L112T、I113K、I113N、I113F、I113A、I113D、I113N、I113T、L114N、L114T、E115V、E115G、H116C、H116Y、H116L、D117G、D117Y、I118T、I118A、I118G、I118V、I118M、I118T、I118K、V121T、V121K、V121A、R122S、R122M、R122K、R123H、R123S、R123C、R123A、R123G、R123V、R123M、R123T、R123K、R123Y、Y124R、Y124C、I126V、I126F、I126N、I126D、R128K、I130L、K131I、P132L、P132M、L133I、L133V、L133K、L133L、L133E、L133M、T134E、W135S、W135L、W135R、W135Y、W135F、W135D、W135A、W135V、W135G、L136D、E139V、G145S、R150A、R150V、R150L、R150K、R150F、E153A、E153V、E153L、E153K、E153R、E153F、E156N、E156R、E157A、E157V、E157L、E157K、E157R、E157F、E157D、E157G、E157T、E158S、E158G、R163E、R163L、R163K、R163H、V164F、V164L、V164M、V164I、A165P、A165L、V167I、V167F、D168A、D168V、D168L、D168I、D168F、D168Y、D168N、D168T、D168S、D168W、D168M、D168P、D168G、D168H、D168R、D168E、D168C、D168K、D168Q、I169V、I169F、I169A、I169R、I169W、E170A、E170V、E170L、E170I、E170F、E170Y、E170N、E170T、E170S、V171F、V171T、V171R、Y172R、Y172T、N173T、P174R、E184N、I186R、I186L、I186N、M187S、M187L、M187R、M187Y、M187I、M187T、M187A、M187V、V190Y、T192D、S193E、E197A、L200I、V205I、G207D、E209P、Q210Y、Q215S、D216T、M220I、L222K、E226R、K229E、G231K、Y233P、I236L、V237I、G238T、N240G、N240T、N240S、T241G、S243N、F244S、Y248D、Y248R、R252A、R252S、L253V、L253E、L253C、K254E、K254R、K254A、K254N、K254Q、K254S、K254T、K254D、K254G、K254V、K254I、L260F、L265D、D266G、L269P、S272Q、G275N、G275K、G275S、G275R、A276M、A276N、A276Q、A276D、L277R、L277M、L277D、I282V、A286I、V288F、L290I、Y291A、Y291P、Y291G、Y291D、Y291N、P292R、I293V、V294M、V294I、R295A、H297F、H297Y、V298I、K299N、N301R、N301P、S302N、S302T、Y303G、Y303D、Y303A、V304D、V304A、V304E、V304H、V304I、V304L、V304M、V304P、V304R、V304T、V304W、V304Y、V304F、V304G、V304K、V304N、V304Q、V304S、S307A、V309Y、L312V、L312I、L313M、L313D、L313F、L313K、L313R、L313A、L313E、G314S、G314D、G314K、G314R、G314E、E318V、K319V、K319R、L320V、D321F、G322D、G322S、R324E、L325R、F326N、F326T、F326A、T327Q、W329Y、W329F、W329L、W329D、W329A、W329V、D330N、D330E、E331N、E331R、K335R、K335L、K335S、K335A、R336L、L338E、L339V、Y342N、Y342A、Y342R、A343S、L344M、D346G、D346A、D346R、A352L、A352E、A352D、A352Q、A354G、K356R、K356D、K356E、L360I、L360Q、L360V、L360M、C362A、C362L、C362I、C362S、C362F、C362Y、C362V、C362P、C362K、C362N、C362D、I367L、A376C、A376R、A376S、M378R、M378T、M378A、T379D、T379K、T379N、T379S、V384Q、V384E、L387N、L387C、L387Y、L387F、M389D、M389E、M389L、M389Y、M389S、M389A、M389V、R390M、L398D、I399A、I399N、I399R、I399F、P400H、P400N、P400S、E407R、Y408R、A409R、A409Q、R413Q、R413T、Y416H、R422V、R422T、R422D、V429W、V434H、V434L、V434Y、F435L、D436T、F437Y、F437R、F437I、S439A、S439G、S439R、L440、L440Y、L440F、L440S、L440A、Y441、Y441A、Y441G、Y441T、P442、P442G、P442A、S443R、S443N、S443A、S443G、I444F、I445L、I445F、V446M、V446K、V446R、V446N、V446T、D451C、T454I、T454L、T454R、A465V、A465D、A465P、S473K、S473R、S473T、S473Q、S473A、F479I、F479L、I480F、I480Y、R496T、R496A、R496G、R496C、D504E、F511Y、F511L、F511V、A515L、A515S、A515T、A515V、A515G、A515R、S522D、S522K、S522T、S522N、S522E、S522G、S522Y、F523A、F523S、F523T、F523V、F523I、F523Y、Y524A、Y524N、Y524G、Y524F、Y524L、Y526C、M527H、M527G、M527Q、M527L、M527D、M527A、M527V、R536C、R537K、R537E、R537G、R537S、R537L、R537A、R537N、R537Q、R537T、R537D、R537V、R537I、E538A、E538C、C539A、C539V、C539L、C539S、C539Y、C539D、C539K、C539N、C539P、E541K、E541S、E541A、E541R、E541N、E541T、E541V、E541Q、E541D、E541I、V543T、V543I、V543A、V543S、V543G、A544G、A544S、A544T、F546W、A547G、M549N、M549Y、M549H、M549T、M549D、M549R、M549A、M549V、I551N、I551T、I551E、I551H、I551L、I551V、I551A、K552R、K552T、K552N、K552Q、K552A、M555Y、M555I、A558I、E559N、E559K、E559D、F562E、F562N、F562Q、F562R、L564F、E565N、E565K、E565S、E565R、V566N、V566K、V566S、V566R、D570A、D570G、D570E、D570V、D570L、D570S、D572A、D572G、D572E、V576A、V577T、I578F、I578T、I578P、I578R、I578T、I578E、I578N、P580G、L585K、L585S、L585E、L585Q、L585R、L585T、L585V、A586K、K588N、K588Q、K588R、K588S、K592A、K592G、K592R、K592T、K592N、K592S、V593I、V593A、E595K、M597L、I601L、F608Y、L613F、V615E、V615T、T616K、R619E、L622V、L623I、K628R、K628I、K628H、M629L、M629A、M629D、M629R、M629V、M629I、V631T、F636I、V637D、V637N、V637R、R638D、R639D、R639N、D640R、D640K、W641R、W641A、W641L、W641F、W641Y、W641V、A642S、K650T、K650C、K650A、K650R、K650S、I655L、I655V、I655A、L656I、A660G、A665E、A665V、A665T、K664R、K664A、K664N、K664Q、K664E、K664S、K664T、K664D、K664G、K664V、K664I、L668I、I673T、E674G、E674D、E674K、R675V、R675C、R675L、R675D、R677E、R677V、R677T、R677N、R677A、S682P、D685R、D685E、D685I、D685L、D685K、T687V、Y689D、Y689N、T690K、T690R、T690S、T690M、T690Q、T690V、T690E、T690N、Q691S、Q691T、R695K、S698D、S698K、S698R、S698G、S698Y、S698D、S701T、S701V、S701A、S701R、S701E、E703R、E703S、E703K、V707I、V707D、V707A、A708V、K711R、K711L、K711T、K711D、E718R、E718V、E718K、V719I、M723S、M723I、M723T、M723N、M723R、M723L、M723A、M723C、I724D、I724V、I729V、T730L、K734I、K734G、K734N、G735M、G735R、G735K、G735S、G735P、G735T、G735E、S737R、S737E、Q738D、Q738S、Q738E、Q738、Q738R、T741I、D752Q、D752T、D758N、N759P、N759D、N759K、N759T、N759Y、N759R、I761V、I765V、R767E、I772L、I772Y、I772F、Y774F、Y774E、L779G、L779Q、L779D、L779K、L779Y、L779E、K780C、K780F、K780I、K780R、K780Q、K780Y、E781L、E781H、E781S、E781M、E781Q、G782H、G782A、G782K、G782R、Q785L、T786N、S789G、W791R、W791Y、W791D、W791S、W791L、W791A、W791V及/或F792R。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置Y14處之取代突變。在一些實施例中，在位置Y14處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置L48處之取代突變。在一些實施例中，在位置L48處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置E76處之取代突變。在一些實施例中，在位置E76處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置V97處之取代突變。在一些實施例中，在位置V97處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置R122處之取代突變。在一些實施例中，在位置R122處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置Y124處之取代突變。在一些實施例中，在位置Y124處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置R150處之取代突變。在一些實施例中，在位置R150處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置K254處之取代突變。在一些實施例中，在位置K254處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置V304處之取代突變。在一些實施例中，在位置V304處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置C362處之取代突變。在一些實施例中，在位置C362處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、E、N、Y、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置R496處之取代突變。在一些實施例中，在位置R496處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置A515處之取代突變。在一些實施例中，在位置A515處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、V、L、H、R、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置R537處之取代突變。在一些實施例中，在位置R537處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、K、D、E、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置E559處之取代突變。在一些實施例中，在位置E559處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且具有在位置K664處之取代突變。在一些實施例中，在位置K664處之胺基酸取代包含熟習此項技術者已知之20種天然胺基酸(亦即，W、I、M、P、F、G、A、V、L、H、R、K、D、N、Y、C、S、T或Q)中之任一者或非天然胺基酸。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且包含在包括D117之任何位置處的胺基酸缺失(缺失的)。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且包含在胺基酸位置處之截斷包括Q587(截斷)、M723(截斷)、G773(截斷)、Y774(截斷)、D777(截斷)、E781(截斷)、G782(截斷)、T784(截斷)、Q785(截斷)、R790(截斷)、W791(截斷)或F792(截斷)。截斷聚合酶與具有相同主鏈序列之非截斷聚合酶相比可展現出增加之熱穩定性。在表2中，截斷指定為符號「^」。
在一些實施例中，突變聚合酶具有NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列且包含在C端處之截斷部分。在一些實施例中，經截斷突變聚合酶包含與SEQ ID NOs: 1714-2787中之任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%序列一致性之序列及在C端處之經截斷部分。在一些實施例中，截斷部分之長度可為2-5、5-10、10-15或15-20個胺基酸。在一些實施例中，截斷部分包含G782 - F792且長度為11個胺基酸。截斷聚合酶與具有相同主鏈序列之非截斷聚合酶相比可展現出增加之熱穩定性。在表2中，經截斷部分以字母「X」指示。 包含經工程化聚合酶的組合物
本發明提供在兩個或更多個位置處突變以增加酶之熱穩定性的聚合酶，展現出與包含SEQ ID NOS: 1、2、1714、2789-2793及2803中之任一者之胺基酸序列的野生型聚合酶相比，核苷酸試劑之結合改良及/或核苷酸試劑之結合及併入改良、核苷酸類似物之併入比率改良、尿嘧啶耐受性改良及/或序列特異性降低。舉例而言，突變聚合酶在約25℃至50℃、或約45℃至75℃、或約65℃至90℃之溫度範圍下展現出增加之熱穩定性。在另一實例中，突變聚合酶展現增加的在糖2'位置處及/或在3'糖位置處包含鏈終止部分(例如封端部分)之核苷酸類似物的併入比率。突變聚合酶可展現出增加之尿嘧啶耐受性。突變聚合酶可展現出與多價分子之互補核苷酸單元的結合改良。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1、2、1714、2789-2793及2803中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，突變聚合酶包含RLF 89458.1或RLF 78286.1之主鏈序列且包含SEQ ID NOS: 1-1713中之任一者的胺基酸序列，且包括可賦予核酸外切酶負活性之包括D141A、D141V、D141L、D141I、D141F、D141Y、D141N、D141T、D141S、D141R、D141K、D141Q、D141W、D141E、D141M、D141P、D141G、D141H或D141C中之任一者的胺基酸取代。在一些實施例中，突變聚合酶包含RLF 89458.1或RLF 78286.1之主鏈序列且包含SEQ ID NOS: 1-1713中之任一者的胺基酸序列，且包括可賦予核酸外切酶負活性之包括未突變E143或突變E143A、E143V、E143L、E143I、E143F、E143Y、E143N、E143T、E143S、E143W、E143M、E143P、E143F、E143G、E143H、E143R、E143K、E143D、E143C或E143Q的胺基酸取代。
在一些實施例中，突變聚合酶包含NOZ 58130.1之主鏈序列且包含SEQ ID NOS: 1714-2787及2249-2479中之任一者的胺基酸序列，且包括可賦予核酸外切酶負活性之包括D168A、D168V、D168L、D168I、D168F、D168Y、D168N、D168K、D168T、D168S、D168W、D168M、D168P、D168G、D168H、D168R、D168E、D168C或D168Q中之任一者的胺基酸取代。在一些實施例中，突變聚合酶包含NOZ 58130之主鏈序列且包含SEQ ID NOS: 1714-2787中之任一者的胺基酸序列，且包括可賦予核酸外切酶負活性之包括E170A、E170V、E170L、E170I、E170F、E170Y、E170N、E170K、E170T、E170S、E170W、E170M、E170P、E170G、E170H、E170R、E170D、E170C或E170Q中之任一者的胺基酸取代。
本發明提供經工程化古菌B家族DNA或A家族聚合酶，包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)，其在一或多個與在具有RLF 89458.1 (例如，SEQ ID NOS:1或3-1713中之任一者)或RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列之聚合酶的位置中之任何一者或任何組合處之胺基酸取代位置上等效(或功能上等效)之位置中突變，包括M1、L3、D4、D6、Y7、I8、T9、E10、N11、G12、K13、P14、V15、I16、R17、I18、F19、K20、K21、E22、K23、G24、E25、F26、K27、I28、E29、Y30、D31、R32、N33、F34、E35、P36、Y37、I38、Y39、A40、L41、L42、E43、D44、D45、E46、S47、I48、E49、D50、I51、K52、K53、I54、T55、R58、G56、E57、R58、H59、G60、K61、K62、V63、I65、I66、R67、V68、E69、K70、V71、K72、K73、K74、F75、L76、G77、E78、P79、I80、E81、V82、W83、K84、L85、V86、F87、E88、H89、P90、Q91、D92、V93、P94、A95、I96、R97、D98、A99、I100、R101、S102、H103、P104、A105、V106、R107、E108、I109、F110、E111、Y112、D113、I114、P115、F116、A117、K118、R119、Y120、L121、I122、D123、K124、L126、V127、P128、M129、E130、G131、G132、E133、L135、K136、L137、L138、A139、F140、D141、I142、E143、T144、F145、Y146、H147、D150、E151、M159、W173、K174、I176、Y180、A190、I191、K192、L195、L198、R199、Q196、P203、V205、L207、Y209、G211、N213、F214、F216、A217、Y218、I219、C223、E224、G227、L228、F230、T231、I232、G233、R234、S237、E238、P239、K240、I241、Q242、R243、M244、G245、D246、R247、A249、E251、L258、Y261、P262、V264、R265、H266、T267、I268、R269、L270、P271、T272、Y273、T274、L275、E276、A277、V278、V282、F283、K285、K286、K287、E288、K289、V290、Y291、A292、I295、E297、A298、W299、K300、S301、L305、K306、R307、V308、A309、Y311、M313、D315、R317、A318、Y320、E321、P328、M329、V331、E332、L333、A334、I337、G338、Q339、V341、D343、S345、S347、S348、T349、G350、N351、L352、V353、W355、Y356、L357、R359、V360、Y362、N365、E366、L367、K371、P372、G373、E376、Q378、M381、S384、Y385、I386、G388、Y389、E394、G396、A402、Y403、L404、F406、R407、S408、L409、Y410、P411、S412、I413、V415、H417、V419、P421、D422、T423、L424、E427、C428、K429、A434、I436、R440、K443、G447、F448、I449、P450、S451、I452、L453、E454、D455、I457、V463、K464、R465、M467、K468、D472、I474、E475、K476、Y481、R484、A485、L486、K487、I488、N491、S492、Y493、Y494、G495、Q497、G498、Y499、P500、K501、S506、K507、E508、C509、E511、S512、V513、T514、G517、R518、H519、I521、T523、A528、E529、K534、V535、A538、E539、D541、G542、I547、I555、P552、S557、K558、A559、K560、K561、L563、K564、H565、E568、K569、G572、M573、E575、E577、L583、G585、F586、V588、T589、K592、L595、I596、H601、T604、G606、V609、V610、R611、R612、D613、E616、I617、K619、E620、T621、Q622、A623、K624、V625、L626、E627、V628、I629、L630、R631、E632、G633、S634、I635、E636、K637、A638、A639、G640、I641、V642、V645、V646、E647、D648、L649、A650、N651、Y652、R653、V654、V656、E657、K658、I660、H662、E663、Q664、I665、T666、R667、E668、K670、D671、Y672、K673、A674、T675、G676、P677、H678、V679、A680、I681、A682、K683、R684、L685、Q686、A687、R688、G689、I690、K691、V692、K693、P694、T696、I698、S699、Y700、V701、V702、L703、K704、G705、S706、K707、K708、I709、D711、R712、V713、I714、L715、F716、D717、E718、D720、S721、S722、R723、K725、Y726、P728、Y730、Y731、I732、H733、N734、Q735、V736、P738、A739、V740、L741、R742、I743、L744、E745、A746、F747、G748、Y749、K750、E751、K752、D753、L754、E755、Y756、Q757、R758、M759、K760、Q761、T762、G763、L764、G765、A766、W767、L768及/或M770。根據圖34中所示之序列比對，熟習此項技術者可確定在嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)中之位置上等效的位置(功能上等效之位點)。
本發明提供經工程化古菌B家族DNA或A家族聚合酶，包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)，其在一或多個與在具有NOZ 58130.1 (例如，SEQ ID NOS:1714-2787)中之任一者)之主鏈序列之聚合酶的位置中之任何一者或任何組合處之胺基酸取代位置上等效(或功能上等效)之位置中突變，包括Y14、E18、F26、L27、G29、F34、V35、V36、F41、S42、P43、F45、L48、P49、R55、L61、A62、S63、A65、E67、I69、K71、V72、E76、K77、T82、P83、R84、V85、T90、V91、S92、H93、P94、Q95、D96、V97、P98、R99、I100、R101、E102、R103、R105、E108、D111、L112、I113、N114、E115、H116、D117、I118、V121、R122、R123、Y124、I126、I130、P132、L133、W135、G145、R150、E153、E156、E157、E158、R163、V164、A165、V167、D168、I169、E170、V171、Y172、N173T、P174、E184、I186、M187、V190、L200、V205、M220、K229、Y233、I236、V237、G238、N240、F244、Y248、R252、L253、K254、L260、L269、G275、A276、L277、I282、A286、V288、L290、Y291、P292、I293、V294、R295、H297、V298、N301、S302、Y303、V304、S307、V309、L312、L313、G314、E318、K319、L320、D321、G322、L325、F326、T327、W329、D330、E331、K335、L338、L339、A343、Y342、L344、D346、A352、A354、K356、L360、C362、I367、A376、M378、T379、V384、L387、M389、R390、T393、L398、I399、P400、E407、Y408、A409、R413、Y416、R422、V429、V434、F435、D436、F437、S439、L440、Y441、P442、S443、I444、I445、V446、T454、A465、S473、F479、I480、R496、D504、F511、A515、S522、F523、Y524、Y526、M527、R536、R537、E538、C539、E541、V543、A544、F546、A547、M549、I551、K552、M555、A558、E559、F562、L564、E565、V566、D570、D572、V576、V577、I578、P580、L585、A586、Q587、K588、K592、V593、E595、M597、I601、F608、L613、V615、T616、R619、L622、L623、K628、M629、V631、F636、V637、R638、R639、D640、W641、A642、K650、I655、L656、A660、K664、A665、L668、I673、E674、R675、R677、S682、D685、T687、Y689、T690、Q691、R695、S698、S701、E703、V707、A708、K711、E718、V719、M723、I724、I729、T730、K734、G735、S737、Q738、T741、D752、D758、N759、I761、I765、R767、I772、Y774、L779、K780、E781、G782、I783、T784、Q785、T786、S787、L788、S789、R790、W791及/或F792。根據圖35中所示之序列比對，熟習此項技術者可確定在嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)中之位置上等效的位置(功能上等效之位點)。
本發明提供經工程化古菌B家族DNA或A家族聚合酶，包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)，其在一或多個與在具有RMF 90817.1 (SEQ ID NO:2789)之主鏈序列之聚合酶的位置中之任何一者或任何組合處之胺基酸取代位置上等效(或功能上等效)之位置中突變，包括Y11、D15、F23、K25、I28、L29、F34、Q35、P36、F38、H43、E49、G55、A56、V57、R62、R67、I75、L76、S77、H78、P79、S80、E81、V82、P83、K84、I85、R86、E87、E88、R90、E96、I98、E100、H101、D102、I103、A106、R108、I111、P117、L118、E138、G139、R144、V145、M146、D149、I150、E151、T152、A234、Y272、C307、R312、E333、A357、V365、L368、F374、L390、V415、D417、F418、S420、L421、Y422、P423、I425、V427、T435、P445、F459、A496、S503、F504、Y505、M508、K518、E519、C520、S523、V524、T525、M530、T532、D551、D553、V559、R566、A567、M568、R576、I596、T597、N609、Q631、V636、A646、N655、R656、K658、D666、T671、R679、N682、K688、E699、M704、G715、L716、N740、L753、Y755、K761、E762、E763、M764、V765、Q766、G767、S768、L769、Q770、R771、W772及/或F773。根據圖36中所示之序列比對，熟習此項技術者可確定在嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)中之位置上等效的位置(功能上等效之位點)。
本發明提供經工程化古菌B家族DNA或A家族聚合酶，包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)，其在一或多個與在具有MBC 7218772.1 (SEQ ID NO:2790)之主鏈序列之聚合酶的位置中之任何一者或任何組合處之胺基酸取代位置上等效(或功能上等效)之位置中突變，包括I10、C468及/或T560。根據圖37中所示之序列比對，熟習此項技術者可確定在嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)中之位置上等效的位置(功能上等效之位點)。
本發明提供經工程化古菌B家族DNA或A家族聚合酶，包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)，其在一或多個與在具有WP 175059460.1 (SEQ ID NO:2791)之主鏈序列之聚合酶的位置中之任何一者或任何組合處之胺基酸取代位置上等效(或功能上等效)之位置中突變，包括Y7、D11、I51、K61、V93、A117、M129、D141、I142、E143、T144、A223、E302、E323、D407、F408、S410、L411、Y412、P413、R487、A488、S495、Y496、K510、T517、I524、K562、A563、R564、S572、T593、R605、K652、D675、K695、T700、R712、R759、Y760、Q761、S762、S763、K764、Q765及/或T766。根據圖38中所示之序列比對，熟習此項技術者可確定在嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)中之位置上等效的位置(功能上等效之位點)。
本發明提供經工程化古菌B家族DNA或A家族聚合酶，包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)，其在一或多個與在具有KUO 42443.1 (SEQ ID NO:2792)之主鏈序列之聚合酶的位置中之任何一者或任何組合處之胺基酸取代位置上等效(或功能上等效)之位置中突變，包括Y7、D170、E172、T557及/或S558。根據圖39中所示之序列比對，熟習此項技術者可確定在嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)中之位置上等效的位置(功能上等效之位點)。
本發明提供經工程化古菌B家族DNA或A家族聚合酶，包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)，其在一或多個與在具有NOZ 77387.1 (SEQ ID NO:2793)之主鏈序列之聚合酶的位置中之任何一者或任何組合處之胺基酸取代位置上等效(或功能上等效)之位置中突變，包括Y10、C41、C531及/或T536。根據圖40中所示之序列比對，熟習此項技術者可確定在嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)及RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)中之位置上等效的位置(功能上等效之位點)。
本發明提供可操作地連接至可偵測之報導體部分的聚合酶。本文所描述之聚合酶中之任一者可經可偵測報導體部分標記，包括具有包括以下本文所描述之任何聚合酶之突變胺基酸序列主鏈的聚合酶：SEQ ID NOS:1-2787、2789-2793中之任一者，嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)、RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)及Phi29 (SEQ ID NO:2803)。
在一些實施例中，可偵測之報導體部分由於化學或物理變化(例如熱、光、電、pH、鹽濃度、酶活性或鄰近事件諸如FRET)而產生可偵測之訊號。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含發光部分、螢光部分或猝滅劑。在一些實施例中，可偵測部分包含行為如同FRET供體或受體之螢光部分。可偵測之報導體部分可連結至聚合酶之N端、C端或任何內部位置。可偵測之報導體部分係以不干擾聚合酶結合核酸模板分子、核酸引子或核苷酸之能力的方式連結至聚合酶。可偵測之報導體部分係以不干擾聚合酶之催化活性(包括核苷酸併入)的方式連結至聚合酶。
本發明提供重組融合多肽，其包括可操作地連接至用於親和純化、裂解及/或溶解之外源胺基酸序列中之任一者或者兩個或更多個外源胺基酸序列之任何組合的本文所描述之DNA聚合酶中的任一者。在一些實施例中，重組融合多肽包含具有可操作地連接至親和純化標籤、裂解標籤及/或溶解標籤之本文所描述之任何聚合酶之突變型胺基酸序列主鏈的聚合酶，包括SEQ ID NOS: 1-2787、2789-2793中之任一者，嗜熱脂肪地芽孢桿菌(例如，Bst DNA聚合酶) (SEQ ID NO:2794)、9°N聚合酶(SEQ ID NOS: 2795或2796) (包括THERMINATOR聚合酶；SEQ ID NO:2797)、VENT聚合酶(SEQ ID NO:2798)、DEEP VENT聚合酶(SEQ ID NO:2799)、Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及/或激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)、RB69聚合酶(SEQ ID NO:2802)及Phi29 (SEQ ID NO:2803)。
在一些實施例中，重組融合多肽包含在其N端及/或C端處可操作地連接至至少一個親和純化標籤序列的野生型及突變聚合酶中之任一者，其中該等親和純化標籤序列包括組胺酸標籤(例如，His標籤)、FLAG標籤、T7標籤、Strep II標籤、S標籤(例如，來自胰臟核糖核酸酶A)、HA標籤(例如，來自人類流感血球凝集素蛋白質)及/或c-Myc標籤。在一些實施例中，親和純化標籤序列包含複數個組胺酸殘基，例如(3-10個組胺酸殘基SEQ ID NO: 2851)。在一些實施例中，親和純化標籤序列包含複數個連續組胺酸殘基，例如3至10個連續組胺酸殘基(SEQ ID NO: 2851)。
在一些實施例中，野生型及經工程化聚合酶為重組蛋白質，其可由含有選殖之表現支撐物的宿主細胞表現。先前已證明，攜有親和純化His標籤之重組蛋白質可藉由大腸桿菌表現宿主細胞進行轉譯後。轉譯後修飾之實例包括N-磷醯基葡萄糖酸基化，其中葡萄糖酸衍生物連接至重組蛋白質之N端處的His標籤。N-磷醯基葡萄糖酸基化藉由大腸桿菌6-磷酸葡萄糖酸-1,5-內酯路徑催化(Geoghegan 1999 Analytical Biochemistry 267:169-184; Aon 2008 Applied and Environmental Microbiology 74(4):950-958)。轉譯後修飾之另一實例包括N-葡萄糖酸基化，其中N-磷酸葡萄糖酸基化重組蛋白質進一步修飾為大腸桿菌宿主細胞磷酸酶。重組蛋白質之N-葡萄糖酸基化由非酶促醯化修飾引起且已知降低蛋白質活性、提高對氧化之敏感性且降低蛋白質結晶作用。因此，N-磷酸葡萄糖酸基化及/或N-葡萄糖酸基化為非所需轉譯後修飾，其可不利地影響包括經工程化聚合酶的重組蛋白質之產生及儲藏壽命。
先前已經其他表明，N-葡萄糖酸基化可藉由宿主細胞培養條件之變化、經修飾之純化方法之調適或重組蛋白質中之N端附近的胺基酸殘基之定點突變誘發而降低。舉例而言，攜帶N端His標籤之重組蛋白質，其中His標籤之胺基酸序列經修飾，展現降低之N-葡萄糖酸基化(Martos-Maldonado等人, 2018 Nature Communications 9:3307 (doi:10.1038/s41467-018-05695-3))。
在一些實施例中，包含SEQ ID NOS: 1-2787中之任一者的經工程化聚合酶中之任一者可在N端或C端處連接至習知His標籤。在一些實施例中，習知His標籤包含序列MGSSHHHHHH (SEQ ID NO:2815)、MGSSHHHHHHGS (SEQ ID NO:2816)或MGSSHHHHHHSSG (SEQ ID NO:2817)。
在一些實施例中，經工程化聚合酶可在N端或C端處連接至經修飾之His標籤，產生經標記聚合酶，其展現出當由攜帶選殖表現支撐物之表現宿主細胞表現時降低之N-磷酸葡萄糖酸基化及/或N-葡萄糖酸基化，其中該經修飾之His標籤包含序列MGSDKIHHHHHH (SEQ ID NO:2818)、MAHHHHHH (SEQ ID NO:2819)、MHHHHHH (SEQ ID NO:2820)、MRGSPHHHHHH (SEQ ID NO:2821)、MRGSHHHHHH (SEQ ID NO:2822)、MHHHHHHSSG (SEQ ID NO:2823)或GGHHHHHH (SEQ ID NO:2824)。
在一些實施例中，經工程化聚合酶可在N端或C端連接於His標籤，該His標籤藉由置換對N-磷酸葡萄糖酸基化及/或N-葡萄糖酸基化敏感之一或多個胺基酸殘基而經修飾。在一些實施例中，經工程化聚合酶可在N端或C端處連接至經修飾之N端His標籤，產生經標記聚合酶，其展現出當由攜帶選殖表現支撐物之表現宿主細胞表現時降低之N-磷酸葡萄糖酸基化及/或N-葡萄糖酸基化，其中該經修飾之His標籤包含在位置2處之甘胺酸，其經苯丙胺酸(F)或脯胺酸(P)置換。在一些實施例中，經修飾之His標籤包含序列MFGSDKIHHHHHH (SEQ ID NO:2825)、MPGSDKIHHHHHH (SEQ ID NO:2826)、MFGSSHHHHHHGS (SEQ ID NO:2827)、MPGSSHHHHHHGS (SEQ ID NO:2828)、MFRGSPHHHHHH (SEQ ID NO:2829)、MPRGSPHHHHHH (SEQ ID NO:2830)、MFRGSHHHHHH (SEQ ID NO:2831)、MPRGSHHHHHH (SEQ ID NO:2832)、MFGSSHHHHHHSSGLVPRGSH (SEQ ID NO:2846)、MPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH (SEQ ID NO:2847)、MPSSHHHHHHSSGLVPRGS (SEQ ID NO:2848)或MPGSSHHHHHHSSGLVPRGS (SEQ ID NO:2849)。
在一些實施例中，展現出降低之N-磷酸葡萄糖酸基化及/或N-葡萄糖酸基化的經標記聚合酶亦展現出與攜帶未經修飾之His標籤的經標記聚合酶相比增加之酶活性及/或降低之氧化。在一些實施例中，展現出降低之N-磷酸葡萄糖酸基化及/或N-葡萄糖酸基化的經標記聚合酶亦展現出與攜帶未經修飾之His標籤的經標記聚合酶相比所製備批料(例如，製造批料)中增加之活性聚合酶溶離份及/或增加之儲存期限。
在一些實施例中，經工程化聚合酶包含在其N端及/或C端處可操作地連接至至少一個多肽裂解序列的SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者，或多肽裂解序列可安置於親和標籤序列與聚合酶序列之N端或C端之間。在一些實施例中，多肽裂解序列可用蛋白酶或還原條件識別及裂解。在一些實施例中，多肽裂解序列包含凝血酶裂解序列、TEV裂解序列(例如來自菸草蝕紋病毒(tobacco etch virus)，包括AcTEV及ProTEV)、因子Xa裂解序列、腸激酶裂解序列及SUMO裂解序列(例如小泛素樣修飾蛋白，包括Ulp1、Senp2及SUMOstar)。
在一些實施例中，經工程化聚合酶可在N端或C端連接至包含凝血酶裂解序列之標籤。舉例而言，習知凝血酶裂解序列包含序列LVPRGS (SEQ ID NO:2833)，其中裂解發生在精胺酸(R)之後。
在一些實施例中，經工程化聚合酶可在N端或C端處連接至包含經修飾之凝血酶裂解序列的標籤，以產生經標記聚合酶，其展現出當由攜帶選殖表現支撐物之表現宿主細胞表現時降低之N-磷酸葡萄糖酸基化及/或N-葡萄糖酸基化，其中該經修飾之凝血酶裂解序列包含在位置4處之精胺酸之後插入的額外胺基酸殘基。在一些實施例中，經修飾之凝血酶裂解序列包含序列LVPRAGSH (SEQ ID NO:2834)、LVPRGGSH (SEQ ID NO:2835)或LVPRSGSH (SEQ ID NO:2836)。
在一些實施例中，經工程化聚合酶可在N端或C端連接至包含凝血酶裂解序列之His標籤。在一些實施例中，包含習知凝血酶裂解序列之His標籤包含序列MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH (SEQ ID NO:2837)或MGSSHHHHHHSSGLVPRGS (SEQ ID NO:2838)。在一些實施例中，包含凝血酶裂解序列的His標籤包含序列MGSSHHHHHHSSGLHHRSGLVPRGSH (SEQ ID NO:2839)、MGSSHHHHHHSSGLVPRQS (SEQ ID NO:2840)或MGSSHHHHHHSSGLVPGGSH (SEQ ID NO:2841)。
在一些實施例中，經工程化聚合酶可在N端或C端處連接至包含經修飾之凝血酶裂解序列的His標籤，以產生經標記聚合酶，其展現出當由攜帶選殖表現支撐物之表現宿主細胞表現時降低之N-磷酸葡萄糖酸基化及/或N-葡萄糖酸基化，其中包含經修飾之凝血酶裂解序列的His標籤包含序列MGSSHHHHHHSSGLVPRAGSH (SEQ ID NO:2842)、MGSSHHHHHHSSGLVPRGGSH (SEQ ID NO:2843)或MGSSHHHHHHSSGLVPRSGSH (SEQ ID NO:2844)。
在一些實施例中，重組融合多肽包含在N及/或C端處可操作地連接至至少一個用於改善溶解之外源胺基酸序列的本文所描述之野生型及突變聚合酶中的任一者，該外源胺基酸序列包括麥芽糖結合蛋白(MBP)、小泛素樣修飾蛋白(SUMO)及麩胱甘肽S-轉移酶(GST)。
本發明提供一種組合物，其包含：一或多個突變聚合酶及至少一個核酸模板分子及至少一個核酸引子。在一些實施例中，該一或多種突變聚合酶可結合至或可不結合至該至少一個核酸模板分子及至少一個核酸引子。在一些實施例中，引子提供核苷酸聚合之起始位點。在一些實施例中，引子包含聚合酶催化之核苷酸併入反應的3'可延伸端，或引子包含3'不可延伸端。在一些實施例中，核酸模板分子包括至少一個尿苷核苷酸或沒有尿苷核苷酸。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，突變聚合酶包括賦予核酸外切酶負活性之胺基酸取代。在一些實施例中，聚合酶包含與其相應野生型聚合酶相比增加酶之熱穩定性、改良核苷酸試劑結合及/或改良核苷酸試劑之結合及併入、改良核苷酸類似物併入比率、改良尿嘧啶耐受性及/或改良序列特異性錯誤的至少一個突變。
本發明提供一種組合物，其包含：一或多個突變聚合酶及具有自引發3'端之至少一個核酸模板分子。在一些實施例中，該一或多種突變聚合酶可結合至或可不結合至該至少一個具有自引發3'端之核酸模板分子。在一些實施例中，模板分子之自引發3'端提供核苷酸聚合之起始位點。在一些實施例中，核酸模板分子包括至少一個尿苷核苷酸或沒有尿苷核苷酸。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，突變聚合酶包括賦予核酸外切酶負活性之胺基酸取代。在一些實施例中，聚合酶包含與其相應野生型聚合酶相比增加酶之熱穩定性、改良核苷酸類似物併入比率及/或改良尿嘧啶耐受性至少一個突變。
在一些實施例中，組合物包含：該一或多種突變聚合酶結合至核酸雙螺旋體，該等核酸雙螺旋體包含與核酸引子雜交之核酸模板分子，由此形成複合聚合酶。在一些實施例中，引子提供核苷酸聚合之起始位點。在一些實施例中，突變聚合酶結合至具有自引發3'端之核酸模板分子以形成沒有獨立引子分子之複合聚合酶。在一些實施例中，核酸模板分子包括至少一個尿苷核苷酸或沒有尿苷核苷酸。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，突變聚合酶係重組聚合酶。
在一些實施例中，組合物包含一或多個突變聚合酶、至少一個核酸模板分子及用於核苷酸聚合之起始位點，其中該突變聚合酶呈溶液形式，核酸模板分子呈溶液形式，且起始位點(例如引子)呈溶液形式。在一些實施例中，組合物包含一或多個突變聚合酶、至少一個核酸模板分子及用於核苷酸聚合之起始位點，其中組合物包含呈溶液形式之突變聚合酶、呈溶液形式或固定至支撐物之核酸模板分子及呈溶液形式或固定至支撐物之起始位點(例如引子)的任何組合。在一些實施例中，該組合物包含一或多種突變聚合酶、至少一個核酸模板分子及核苷酸聚合之起始位點，其中該組合物包含呈溶液形式或固定至支撐物之突變聚合酶、呈溶液形式或固定至支撐物之核酸模板分子及呈溶液形式或固定至支撐物之起始位點(例如引子)的任何組合。
在一些實施例中，突變聚合酶與野生型聚合酶相比或與具有包括具有SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者的胺基酸序列之聚合酶之相同主鏈序列的經工程化聚合酶相比展現出增加之熱穩定性。舉例而言，突變聚合酶在約25℃至50℃、或約45℃至90℃之溫度範圍內展現出增加之熱穩定性。
在一些實施例中，突變聚合酶展現出與野生型聚合酶相比或與具有包括具有SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者之胺基酸序列的聚合酶之相同主鏈序列的經工程化聚合酶相比增加之核苷酸類似物併入比率，其中核苷酸類似物包含在糖2'位置處及/或在3'糖位置處的鏈終止部分(例如，阻斷部分)。
在一些實施例中，突變聚合酶展現出與野生型聚合酶相比與野生型聚合酶相比或與包括具有SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者之胺基酸序列的聚合酶具有相同主鏈序列的經工程化聚合酶相比增加之尿嘧啶耐受性。
在一些實施例中，突變聚合酶展現出與野生型聚合酶相比或與包括具有SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者之胺基酸序列的聚合酶具有相同主鏈序列的經工程化聚合酶相比增加之與多價分子之互補核苷酸單元結合的能力。
在一些實施例中，突變聚合酶展現出與野生型聚合酶相比或與包括具有SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者之胺基酸序列的聚合酶具有相同主鏈序列的經工程化聚合酶相比降低之自聚合構形向核酸外切酶構形的轉換(例如，向編輯模態之降低之轉換)。
在一些實施例中，該組合物包含：一或多種突變聚合酶，及複數個核酸雙螺旋體，該複數個核酸雙螺旋體各自包含與核酸引子雜交之核酸模板。在一些實施例中，一或多個聚合酶及核酸雙螺旋進一步包含核苷酸試劑。該一或多種突變聚合酶可結合至或可不結合至核酸雙螺旋體。一或多個突變聚合酶可能或可能不結合至核苷酸試劑。在一些實施例中，一或突變聚合酶結合至核酸雙螺旋，該核酸雙螺旋包含與核酸引子雜交之核酸模板，藉此形成複合聚合酶。在一些實施例中，複合聚合酶進一步包含核苷酸試劑。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，突變聚合酶係重組聚合酶。
在一些實施例中，核苷酸試劑包含核苷酸及/或多價分子中之任一者或任何組合。在一些實施例中，核苷酸包含典型核苷酸。在一些實施例中，核苷酸包含未經標記之核苷酸。在一些實施例中，核苷酸包含可偵測地標記之核苷酸，其各自包含接合至核苷鹼基或磷酸酯鏈之磷酸酯部分中之一者的可偵測報導部分。在一些實施例中，核苷酸包含攜帶可移除或非可移除鏈封端部分之核苷酸。在一些實施例中，可逆鏈封端核苷酸可經可偵測地標記或未經標記。在一些實施例中，個別多價分子包含附接至多個聚合物臂的中心核心，各臂末端具有核苷酸單元。
在一些實施例中，複合聚合酶進一步包含含有核苷酸之核苷酸試劑。在一些實施例中，核苷酸可在不併入之情況下結合至複合聚合酶。在一些實施例中，互補核苷酸可在不經歷聚合酶催化之併入情況下結合複合聚合酶以形成三元複合物，其中該互補核苷酸結合引子3'端與模板股中之互補核苷酸相對的位置處。
在一些實施例中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含鹼基、糖及至少一個磷酸酯基。在一些實施例中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含芳族鹼基、五碳糖(例如，核糖或去氧核糖)及一或多個磷酸酯基(例如，1至10個磷酸酯基)。複數個核苷酸可包含選自由以下組成之群的至少一種類型之核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。複數個核苷酸可在兩種或更多種類型之核苷酸的任何組合之混合物處包含選自由以下組成之群的核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
在一些實施例中，在該系統中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含含一個、兩個或三個磷原子之鏈，其中該鏈通常經由酯或磷醯胺鍵聯連結至糖部分之5'碳。在一些實施例中，複數個中之至少一個核苷酸係具有磷鏈之類似物，在該磷鏈中，磷原子與插入之O、S、NH、亞甲基或伸乙基連接在一起。在一些實施例中，鏈中之磷原子包括經取代之側基，包括O、S或BH 3。在一些實施例中，該鏈包括經包括胺基磷酸酯基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基及O-甲基胺基磷酸酯基在內之類似物取代的磷酸酯基。
在一些實施例中，在該系統中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分可在引子延伸反應期間抑制聚合酶催化的新生股中後續核苷酸單元或游離核苷酸之併入。在一些實施例中，鏈終止部分連結至3'糖羥基位置，其中該糖包含核糖或去氧核糖糖部分。在一些實施例中，鏈終止部分可自3'糖羥基位置移除/裂解以產生具有3'OH糖基團的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸併入反應中以後續核苷酸延伸。在一些實施例中，鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基、矽基或縮醛基。在一些實施例中，鏈終止部分係可例如藉由使鏈終止部分化學試劑反應、pH變化、光或熱而自核苷酸裂解/移除的。在一些實施例中，鏈終止部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，鏈終止部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，鏈終止部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，鏈終止部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，鏈終止部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。在一些實施例中，鏈終止部分可用亞硝酸裂解/移除。在一些實施例中，鏈終止部分可使用包含亞硝酸鹽，諸如包含亞硝酸鹽與酸(諸如乙酸、硫酸或硝酸)之組合的溶液裂解/移除。在一些其他實施例中，該溶液可包含有機酸。
在一些實施例中，在該系統中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-O-疊氮基或3'-O-疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。在一些實施例中，包含3'-O-胺基、3'-O-胺基甲基、3'-O-甲基胺基或其衍生物中之一或多者的鏈終止部分可用亞硝酸，經由利用亞硝酸或使用包含亞硝酸之溶液的機制裂解。在一些實施例中，包含3'-O-胺基、3'-O-胺基甲基、3'-O-甲基胺基或其衍生物中之一或多者的鏈終止部分可使用包含亞硝酸鹽之溶液裂解。在一些實施例中，例如，亞硝酸鹽可與酸組合或與酸接觸，該酸諸如為乙酸、硫酸或硝酸。在一些其他實施例中，例如，亞硝酸鹽可與有機酸組合或與有機酸接觸，該有機酸諸如為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸或類似物。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-縮醛部分，其可經鈀脫除阻隔基試劑(例如，Pd(0))裂解。
在一些實施例中，在該系統中，核苷酸類似物包含鏈終止部分，該鏈終止部分係選自由以下組成之群：3'-去氧核苷酸、2',3'-雙去氧核苷酸、3'-甲基、3'-疊氮基、3'-疊氮基甲基、3'-O-疊氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-胺基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺醯基、3'-丙二醯基、3'-胺基、3'-O-胺基、3'-硫氫基、3'-胺基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-三級丁基、3'-茀基甲氧基羰基、3'三級丁氧基羰基、3'-O-烷基羥胺基、3'-硫代磷酸酯及3-O-苯甲基，或其衍生物。
在一些實施例中，複數個核苷酸包含缺乏可偵測報導部分之複數個核苷酸，例如螢光團。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含複數個用可偵測之報導體部分標記之核苷酸。可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，螢光團連結至核苷酸鹼基。在一些實施例中，螢光團用連接子連結至核苷酸鹼基，該連接子可自鹼基裂解/移除。
在一些實施例中，鹼基上之可裂解連接子包含可裂解部分，其包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基。在一些實施例中，鹼基上之可裂解連接子可藉由可裂解部分與化學試劑反應、pH變化、光或熱而自鹼基裂解/移除。在一些實施例中，可裂解部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，可裂解部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，可裂解部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，可裂解部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，可裂解部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。
在一些實施例中，鹼基上之可裂解連接子包含包括疊氮化合物、疊氮基或疊氮基甲基之可裂解部分。在一些實施例中，可裂解部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。
在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及在鹼基上之可裂解連接子具有相同或不同的可裂解部分。在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及連接至鹼基的可偵測之報導體部分可用相同化學試劑化學裂解/移除。在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及連接至鹼基的可偵測之報導體部分可用不同化學試劑化學裂解/移除。
在一些實施例中，該組合物包含：一或多種突變聚合酶，及核酸雙螺旋體，該複數個核酸雙螺旋體各自包含與核酸引子雜交之核酸模板。在一些實施例中，一或多個聚合酶及核酸雙螺旋進一步包含複數種核苷酸試劑。在一些實施例中，該一或多種聚合酶及該核酸雙螺旋體進一步包含複數個多價分子。該一或多種突變聚合酶可結合至或可不結合至核酸雙螺旋體。該一或多種突變聚合酶可結合至或可不結合至一或多個多價分子。在一些實施例中，一或突變聚合酶結合至核酸雙螺旋，該核酸雙螺旋包含與核酸引子雜交之核酸模板，藉此形成複合聚合酶。在一些實施例中，複合聚合酶進一步包含至少一種核苷酸試劑(例如，複數個多價分子)。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，突變聚合酶係重組聚合酶。
在一些實施例中，核苷酸試劑包含核苷酸及/或多價分子中之任一者或任何組合。在一些實施例中，核苷酸包含典型核苷酸。在一些實施例中，核苷酸包含未經標記之核苷酸。在一些實施例中，核苷酸包含核苷酸類似物，其包含可偵測地標記之核苷酸及/或攜帶可移除或不可移除之鏈終止部分的核苷酸。在一些實施例中，個別多價分子包含附接至多個聚合物臂的中心核心，各臂末端具有核苷酸單元。
在一些實施例中，多價分子通常包含連接至複數個臂之中心部分(例如，核心)，其中各臂連接至核苷酸單元。多價分子包含星形、梳狀、交聯、瓶刷或樹狀組態。在一些實施例中，多價分子可包含2至4個、4至10個、10至20個或多達64個臂。在一些實施例中，該等臂可自中央部分發散。
在一些實施例中，該複數個多價分子中之至少一個多價分子包含： ( a )核心；及 ( b )複數個核苷酸臂，該等臂包含(i)核心連接部分、(ii)間隔子(例如，包含PEG部分)、(iii)連接子及(iv)核苷酸單元，其中該核心連接至該複數個核苷酸臂，其中該間隔子連接至該連接子，其中該連接子連接至該核苷酸單元。在一些實施例中，核苷酸單元包含鹼基、糖及至少一個磷酸酯基，且連接子經由鹼基連結至核苷酸單元。在一些實施例中，該連接子包含脂族鏈或寡聚乙二醇鏈，其中兩個連接子鏈均具有2-6個次單元。在一些實施例中，連接子亦包括芳族部分。例示性多價分子展示於圖2-5中。例示性核苷酸臂展示於圖6中。例示性間隔子展示於圖7 (頂部)中。各種例示性連接子展示於圖7 (底部)及圖8中。接合/連接至核苷酸單元之各種連接子的實例顯示於圖9A-D中，其中嘧啶鹼基之5位或嘌呤鹼基之7位經由炔丙基胺連接而連接至連接子(亦參見圖10)。
在一些實施例中，核苷酸臂設計成使得核苷酸臂之核苷酸單元能夠以類似於自由核苷酸之方式與聚合酶相互作用。核苷酸臂之核苷酸單元可結合聚合酶，該聚合酶與核酸模板及核酸引子形成複合物(例如核苷酸締合)。核苷酸單元亦可自複合聚合酶解離且再結合同一複合聚合酶或結合接近多價分子之不同複合聚合酶。由於多價分子包含多個核苷酸臂，故單一多價分子之核苷酸單元可同時結合多個複合聚合酶。多價分子有效地增加核苷酸之局部濃度，由此可增強核苷酸結合反應中之訊號。
在一些實施例中，多價分子之核苷酸單元可在不併入之情況下結合至複合聚合酶。在一些實施例中，多價分子之互補核苷酸單元可在不經歷聚合酶催化之併入情況下結合複合聚合酶，其中該互補核苷酸單元結合引子3'端與模板股中之互補核苷酸相對的位置處。
在一些實施例中，多價分子之核苷酸單元可結合至複合聚合酶，且藉由併入可延伸引子之3'端(例如與聚合酶形成複合物)中引起引子延伸而經歷引子延伸。當核苷酸單元包括糖3'OH時，則後續核苷酸可併入新生的延伸引子中。當核苷酸單元包括經封端基團取代之糖3'OH時，則後續核苷酸經封端而不會併入新生的延伸引子股中。核苷酸單元(多價分子之核苷酸單元)可結合引子3'端與模板股中之互補核苷酸相對的位置處。核苷酸單元可在聚合酶催化之反應中經歷核苷酸併入，由此使引子延伸一個核苷酸。
在一些實施例中，多價分子之核心、連接子及/或核苷酸單元可以允許在攜帶不同類型之核苷酸單元的不同多價分子之間加以區分的方式用可偵測報導體部分(例如螢光團)標記。舉例而言，第一多價分子之核心單元係用第一螢光團標記，其中第一多價分子包含具有dGTP核苷酸單元之多個核苷酸臂。第二多價分子之核心單元係用第二螢光團(其不同於第一螢光團)標記，其中第二多價分子包含具有dATP核苷酸單元之多個核苷酸臂。核苷酸單元之結合及併入事件可經偵測，且核苷酸單元(作為多價分子之一部分)的特定鹼基可基於偵測及鑑別核心上的可偵測之報導體部分來鑑別。在另一實例中，第一多價分子之連接子及/或核苷酸單元係用第一螢光團標記，其中第一多價分子包含具有dGTP核苷酸單元之多個核苷酸臂。第二多價分子之連接子及/或核苷酸單元係用第二螢光團(其不同於第一螢光團)標記，其中第二多價分子包含具有dATP核苷酸單元之多個核苷酸臂。核苷酸單元之結合及併入事件可經偵測，且核苷酸單元(作為多價分子之一部分)的特定鹼基可基於偵測及鑑別核心上的可偵測之報導體部分來鑑別。在一些實施例中，核心、連接子及核苷酸單元未經可偵測報導體部分標記。
在一些實施例中，連結至多價分子之核苷酸臂的至少一個核苷酸單元可用可偵測之報導體部分(例如螢光團)以允許判別攜帶不同類型核苷酸單元之不同多價分子的方式標記。舉例而言，第一多價分子之核苷酸單元係用第一螢光團標記，其中第一多價分子包含具有dGTP核苷酸單元之多個核苷酸臂。第二多價分子之核苷酸單元係用第二螢光團(其不同於第一螢光團)標記，其中第二多價分子包含具有dATP核苷酸單元之多個核苷酸臂。核苷酸單元之結合及併入事件可經偵測，且核苷酸單元(作為多價分子之一部分)的特定鹼基可基於偵測及鑑別核苷酸單元上的可偵測之報導體部分鑑別。
在一些實施例中，在該系統中，複數個多價分子中之個別多價分子包含連結至多個核苷酸臂之核心，且其中該多個核苷酸臂具有相同類型之核苷酸單元，其係選自由以下組成之群：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。
在一些實施例中，至少一個多價分子的核苷酸單元包括芳族鹼基、五碳糖(例如，核糖或去氧核糖)以及一或多個磷酸酯基(例如，1至10個磷酸酯基)。複數個多價分子可包含一種類型之多價分子，其具有一種類型之選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。複數個核苷酸可包含兩種或更多種類型之多價分子的任何組合之混合物，其中混合物中之個別多價分子包含選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
在一些實施例中，複數個複合突變DNA聚合酶進一步包含第一結合複合物及第二結合複合物以及形成親合力複合物之多價分子，其中(i)該第一結合複合物包含第一核酸引子、第一DNA聚合酶及第一多價分子，其結合至多聯體模板分子之第一部分，由此形成第一結合複合物(例如，圖44-46)，其中多價分子之第一核苷酸單元結合至第一DNA聚合酶；且(ii)第二結合複合物包含第二核酸引子、第二DNA聚合酶及第一多價分子，其結合至同一多聯體模板分子之第二部分，由此形成第二結合複合物(例如，44-46)，其中多價分子之第二核苷酸單元結合至第二DNA聚合酶，其中包括相同多價分子之第一結合複合物及第二結合複合物形成親合力複合物(例如，圖47)。在一些實施例中，第一聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。在一些實施例中，第二聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。多聯體模板分子包含所關注序列之串聯重複序列及至少一個通用定序引子結合位點。第一核酸引子及第二核酸引子可沿多聯體模板分子結合至定序引子結合位點。
在一些實施例中，在該系統中，複數個複合DNA聚合酶進一步包含第一結合複合物及第二結合複合物以及多價分子，其形成親合力複合物，其中(i)該第一結合複合物包含第一核酸引子、第一DNA聚合酶及第一多價分子，其結合至第一模板分子，由此形成第一結合複合物，其中多價分子之第一核苷酸單元結合至第一DNA聚合酶；且(ii)第二結合複合物包含第二核酸引子、第二DNA聚合酶及第一多價分子，其結合至第二模板分子，由此形成第二結合複合物，其中多價分子之第二核苷酸單元結合至第二DNA聚合酶，其中包括相同多價分子之第一結合複合物及第二結合複合物形成親合力複合物。在一些實施例中，第一聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。在一些實施例中，第二聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。在一些實施例中，第一模板分子及第二模板分子係經殖株擴增之模板分子。在一些實施例中，第一模板分子及第二模板分子彼此緊密靠近地定位。舉例而言，經殖株擴增之第一模板分子及第二模板分子包含線性模板分子，其係經由橋式擴增產生且固定至支撐物上之相同定位或特徵。第一模板分子及第二模板分子包含所關注序列及至少一個通用定序引子結合位點。第一核酸引子第二核酸引子可分別結合至第一模板分子及第二模板分子上之定序引子結合位點。
在一些實施例中，在該系統中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含具有含一個、兩個或三個磷原子之鏈的核苷酸單元，其中該鏈通常經由酯或磷醯胺鍵聯連結至糖部分之5'碳。在一些實施例中，至少一個核苷酸單元係具有磷鏈之核苷酸類似物，在該磷鏈中，磷原子與插入之O、S、NH、亞甲基或伸乙基連接在一起。在一些實施例中，鏈中之磷原子包括經取代之側基，包括O、S或BH 3。在一些實施例中，該鏈包括經包括胺基磷酸酯基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基及O-甲基胺基磷酸酯基在內之類似物取代的磷酸酯基(例如1-10個磷酸酯基)。
在一些實施例中，在該系統中，複數個多價分子中之個別多價分子包含連結至多個核苷酸臂之核心，且其中個別核苷酸臂包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之核苷酸單元。
在一些實施例中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含核苷酸單元，該核苷酸單元包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)的核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分可在引子延伸反應期間抑制聚合酶催化的新生股中後續核苷酸單元或游離核苷酸之併入。在一些實施例中，鏈終止部分連結至3'糖羥基位置，其中該糖包含核糖或去氧核糖糖部分。在一些實施例中，鏈終止部分可自3'糖羥基位置移除/裂解以產生具有3'OH糖基團的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸併入反應中以後續核苷酸延伸。在一些實施例中，鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基。在一些實施例中，鏈終止部分係可例如藉由使鏈終止部分化學試劑反應、pH變化、光或熱而自核苷酸裂解/移除的。在一些實施例中，鏈終止部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，鏈終止部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，鏈終止部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，鏈終止部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，鏈終止部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。
在一些實施例中，在該系統中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含核苷酸單元，該核苷酸單元包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-O-疊氮基或3'-O-疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。
在一些實施例中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含含有鏈終止部分之核苷酸單元，該鏈終止部分係選自由以下組成之群：3'-去氧核苷酸、2',3'-雙去氧核苷酸、3'-甲基、3'-疊氮基、3'-疊氮基甲基、3'-O-疊氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-胺基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺醯基、3'-丙二醯基、3'-胺基、3'-O-胺基、3'-硫氫基、3'-胺基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-三級丁基、3'-茀基甲氧基羰基、3'三級丁氧基羰基、3'-O-烷基羥胺基、3'-硫代磷酸酯及3-O-苯甲基，或其衍生物。
在一些實施例中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含連結至多個核苷酸臂之核心，其中該核心用可偵測之報導體部分標記。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。
在一些實施例中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含連結至多個核苷酸臂的核苷酸單元，其中核苷酸單元用可偵測之報導體部分標記。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。
在一些實施例中，複數個多價分子中之至少一種多價分子包含至少一個為核苷酸臂之一部分的連接子，其中該連接子經可偵測報導體部分標記。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。
在一些實施例中，核心包含鏈黴抗生物素蛋白型或抗生物素蛋白型部分且核心連結部分包含生物素。在一些實施例中，核心包含鏈黴抗生物素蛋白型或抗生物素蛋白型部分，其包括抗生物素蛋白，以及可結合到至少一個生物素部分的抗生物素蛋白之任何衍生物、類似物及其他非天然形式。抗生物素蛋白部分之其他形式包括天然及重組抗生物素蛋白及鏈黴抗生物素蛋白，以及衍生化之分子，例如未糖基化之抗生物素蛋白及截斷之鏈黴抗生物素蛋白。舉例而言，抗生物素蛋白部分包括抗生物素蛋白之去糖基化形式、由鏈黴菌(Streptomyces)(例如抗生蛋白鏈黴菌(Streptomyces avidinii))產生之細菌鏈黴抗生物素蛋白以及衍生化形式，例如N-醯基抗生物素蛋白，例如N-乙醯基抗生物素蛋白、N-苯二甲醯基抗生物素蛋白及N-琥珀醯基抗生物素蛋白，及可商購的產品ExtrAvidin™、Captavidin™、Neutravidin TM及Neutralite Avidin™。例示性多價分子展示於圖2-3及5中，其中通用核心與複數個核苷酸臂結合。例示性多價分子示於圖4中，其中通用樹狀體核心結合至複數個核苷酸臂。多價分子之例示性設計示於圖5中其顯示與複數個核苷酸臂連結/結合之核心(例如鏈黴抗生物素蛋白核心)，其中核苷酸臂包含核心連結部分(例如生物素)、間隔子、連接子及核苷酸單元。包含生物素、間隔子、連接子及核苷酸單元之例示性生物素化核苷酸臂示於圖6中。
在一些實施例中，組合物包含：一或多個突變聚合酶，其結合至各自包含與核酸引子雜交之核酸模板的核酸雙螺旋，由此形成複合聚合酶，且組合物進一步包含至少一種陽離子。在一些實施例中，該至少一個陽離子係選自由以下組成之群：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。在一些實施例中，陽離子包含促進聚合酶催化之核苷酸併入的催化性二價陽離子，其中該等催化性二價陽離子包含鎂或錳。在一些實施例中，陽離子包含抑制聚合酶催化之核苷酸併入的非催化性二價陽離子，其中該等該催化性二價陽離子包含鍶、鋇及/或鈣。
在一些實施例中，組合物包含：一或多個突變聚合酶，其結合至各自包含雜交至核酸引子之核酸模板分子的核酸雙螺旋體，由此形成複合聚合酶。在一些實施例中，核酸模板分子包含線性核酸分子、或環狀核酸分子、或線性核酸分子與環狀核酸分子之混合物。在一些實施例中，複數個核酸模板分子中之核酸模板分子包含相同的所關注目標序列或不同的所關注目標序列。在一些實施例中，核酸模板分子包含擴增之核酸分子。在一些實施例中，核酸模板分子包含經殖株擴增之模板分子或單一核酸模板分子。在一些實施例中，核酸模板分子包含所關注目標序列之一個複本。在一些實施例中，核酸模板分子包含所關注目標序列之兩個或更多個串聯複本(例如多聯體)。在一些實施例中，核酸模板分子包括至少一個尿苷核苷酸或沒有尿苷核苷酸。在一些實施例中，引子提供核苷酸聚合之起始位點。在一些實施例中，核酸引子包含可延伸之3'末端或不可延伸之3'末端。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，複合聚合酶固定於支撐物，其中核酸模板、核酸引子及/或聚合酶中之任一者固定於支撐物。在一些實施例中，組合物包含固定於支撐物之複數個複合聚合酶。在一些實施例中，約10 2-10 15個複合聚合酶在支撐物上之不同位點處固定至支撐物。在一些實施例中，複數個複合聚合酶固定至支撐物上之預定位點(例如定位)。在一些實施例中，複數個複合聚合酶固定至支撐物上之隨機位點(例如定位)。在一些實施例中，複數個經固定之複合突變型DNA聚合酶彼此流體連通以允許試劑(例如包括聚合酶在內之酶、多價分子、核苷酸及/或二價陽離子及類似物)之溶液流動至支撐物上以使得在該支撐物上的複數個經固定之複合聚合酶可與試劑之溶液以大規模平行方式反應。
在一些實施例中，支撐物包含平面或非平面支撐物。支撐物可為固體或半固體。在一些實施例中，支撐物可為多孔、半多孔或無孔的。在一些實施例中，支撐物之表面可塗有一或多種化合物以在支撐物上產生鈍化層。在一些實施例中，鈍化層形成多孔或半多孔層。在一些實施例中，核酸引子或模板、或聚合酶可連結至鈍化層以將引子、模板及/或聚合酶固定至支撐物。在一些實施例中，支撐物包含使得支撐物上之核酸雜交及擴增效能能夠改善之低非特異性結合表面。一般而言，支撐物可包含一或多層共價或非共價連結之低結合、化學改質層，例如矽烷層、聚合物膜及一或多個共價或非共價連結之寡核苷酸，其可用於將複數個核酸模板分子固定至支撐物。在一些實施例中，支撐物可包含經由支撐物上之化學基團至少共價結合至支撐物之一部分的官能化聚合物塗層、移植至官能化聚合物塗層上之引子以及在該引子及該官能化聚合物塗層上之水溶性保護塗層。在一些實施例中，官能化聚合物塗層包含聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺(PAZAM)。在一些實施例中，支撐物包含具有至少一個親水性聚合物塗層之表面塗層及至少一層複數個寡核苷酸。親水性聚合物塗層可包含聚乙二醇(PEG)。親水性聚合物塗層可包含具有至少4個分支之分支PEG。在一些實施例中，低非特異性結合塗層具有可作為水接觸角量測之親水性程度，其中水接觸角不超過45度。
在一些實施例中，該組合物包含複數個複合聚合酶，其具有至少第一複合聚合酶及第二複合聚合酶，其中：(a)該第一複合聚合酶包含結合至第一核酸雙螺旋體之第一突變聚合酶，該第一核酸雙螺旋體包含與第一核酸引子雜交之第一核酸模板分子；(b)該第二複合聚合酶包含結合至第二核酸雙螺旋體之第二突變聚合酶，該第二核酸雙螺旋體包含與第二核酸引子雜交之第二核酸模板分子。在一些實施例中，第一核酸模板分子及第二核酸模板分子包含相同或不同序列。在一些實施例中，第一核酸模板分子及第二核酸模板分子經殖株擴增。在一些實施例中，第一核酸模板分子及/或第二核酸模板分子包括至少一個尿苷核苷酸或沒有尿苷核苷酸。在一些實施例中，第一引子及第二引子包含可延伸之3'端或不可延伸之3'端。在一些實施例中，第一及第二突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，第一及第二突變聚合酶係重組聚合酶。
在一些實施例中，複數個複合聚合酶(包括第一及第二複合聚合酶)固定至支撐物。在一些實施例中，複數個複合聚合酶之密度包含每平方毫米約10 2-10 15個固定至支撐物之複合聚合酶。在一些實施例中，第一及第二核酸模板分子固定至支撐物上之不同位點。在一些實施例中，支撐物包含佈置成陣列的複數個位點。在一些實施例中，支撐物上之位點在一個維度中佈置成一列或一行，或在二個維度中佈置成數列及數行。在一些實施例中，複數個位點以隨機或經組織方式或兩者之組合佈置於支撐物上。在一些實施例中，複數個位點佈置成任何圖案，包括長方體或六邊形圖案。在一些實施例中，支撐物包含每平方毫米約10 2-10 15個或更多個位點，其固定有核酸模板以形成核酸模板陣列。在一些實施例中，核酸模板在複數個位點處固定，例如核酸模板分子以每平方毫米約10 2-10 15個或更多個位點固定，其中固定之核酸模板經殖株擴增以產生在複數個位點處固定之核酸聚合酶群落。在一些實施例中，固定在支撐物上之複數個核酸模板分子彼此流體連通以允許試劑(例如複數個酶(例如聚合酶)、複數個核苷酸及/或複數個多價分子)之溶液流動至支撐物上以使得固定至支撐物上之複數個核酸模板分子可與複數種試劑以大規模平行方式反應。在一些實施例中，固定至支撐物上的複數個核酸聚合酶群落之流體連通可用於在複數個核酸聚合酶群落上基本上同時進行核苷酸結合分析及/或進行核苷酸併入分析(例如引子延伸或定序)。在一些實施例中，固定至支撐物上的複數個核酸聚合酶群落之流體連通可用於進行大規模平行定序之偵測及成像。在一些實施例中，術語「固定」及相關術語係指經由共價鍵或非共價相互作用直接連結至支撐物或連結至支撐物上之塗層的核酸分子或酶。在一些實施例中，低非特異性結合塗層具有可作為水接觸角量測之親水性程度，其中水接觸角不超過45度。
在一些實施例中，結合複合物包含突變聚合酶、與引子形成雙螺旋之核酸模板分子及核苷酸試劑。在一些實施例中，結合複合物包含(i)突變聚合酶、與引子形成雙螺旋之核酸模板分子及核苷酸，或結合複合物包含(ii)突變聚合酶、與引子形成雙螺旋之核酸模板分子及多價分子之核苷酸單元。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，結合複合物之存留時間大於約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1秒。在一些實施例中，結合複合物之存留時間為1-30秒。該結合複合物之存留時間大於約0.1-0.25秒、或約0.25-0.5秒、或約0.5-0.75秒、或約0.75-1秒、或約1-2秒、或約2-3秒、或約3-4秒、或約4-5秒、或約5-10秒、或約10-30秒，及/或其中該方法係在或可在等於或高於15℃、等於或高於20℃、等於或高於25℃、等於或高於35℃、等於或高於37℃、等於或高於42℃、等於或高於55℃、等於或高於60℃、或等於或高於72℃、或等於或高於80℃或在任何前述所界定之範圍內的溫度下進行。在一些實施例中，結合複合物之存留時間可為大於1s、大於2s、大於3s、大於5s、大於10s、大於15s、大於20s、大於30s、大於60s、大於120s、大於360s、大於3600s或更久，或持續處於由此等值中之任何兩者或更多者定義之範圍內的時間。結合複合物(例如三元複合物)保持穩定，直至經歷引起聚合酶、模板分子、引子中的任一者及/或核苷酸單元或核苷酸之間之相互作用解離的條件。舉例而言，解離條件包含使結合複合物與洗滌劑、EDTA及/或水中之任一者或任何組合接觸。在一些實施例中，本發明提供該方法，其中該結合複合物係沈積於表面上、連結至表面或與表面雜交，該表面在偵測步驟中顯示出大於20之造影劑與雜訊比。在一些實施例中，本發明提供該方法，其中該接觸係在該核苷酸或核苷酸單元與該模板核酸之下一個鹼基互補時使該結合複合物穩定且在該核苷酸或核苷酸單元與該模板核酸之該下一個鹼基不互補時使該結合複合物不穩定的條件下執行。
本發明提供一種包含反應混合物之組合物，其包含： ( a )一或多種突變聚合酶； ( b )核酸模板分子； ( c )具有3'可延伸端或3'不可延伸端之核酸引子；及 ( d )複數個核苷酸或複數個多價分子。在一些實施例中，該一或多種突變聚合酶不結合至核酸模板分子。在一些實施例中，該一或多種突變聚合酶不結合至核酸引子。在一些實施例中，該一或多種突變聚合酶結合至核酸雙螺旋體，該等核酸雙螺旋體包含與核酸引子雜交之核酸模板分子，由此形成複合聚合酶。在一些實施例中，核酸模板分子包括至少一個尿苷核苷酸或沒有尿苷核苷酸。在一些實施例中，複數個核苷酸包括至少一個尿苷核苷酸或沒有尿苷核苷酸。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，反應混合物進一步包含 (e1)至少一個非催化性二價陽離子，其允許至少一個核苷酸結合至複合聚合酶或允許至少一個多價分子結合至複合聚合酶，但非催化性二價陽離子抑制聚合酶催化之併入。在一些實施例中，非催化性二價陽離子包含鍶、鋇及/或鈣。
在一些實施例中，該反應混合物進一步包含 (e2)至少一個催化性二價陽離子，其允許至少一個核苷酸結合至複合聚合酶或允許至少一個多價分子結合至複合聚合酶，且催化性二價陽離子促進聚合酶催化之併入。在一些實施例中，催化性二價陽離子包含鎂及/或錳。在一些實施例中，核酸模板及核酸引子係呈溶液形式。在一些實施例中，核酸模板及/或核酸引子固定至支撐物或固定至支撐物上之塗層。
在一些實施例中，反應混合物適用於進行核苷酸結合反應(或多價分子結合反應)。在一些實施例中，反應混合物適用於進行核苷酸併入反應(或多價分子之核苷酸單元的併入反應)。在一些實施例中，反應混合物適用於進行引子延伸反應，在該反應中，核苷酸併入可延伸引子之3'端中(或多價分子之核苷酸單元併入可延伸引子之3'端中)。 套組
本發明提供一種套組，其包含至少一個突變聚合酶，該突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，該套組進一步包含至少一個陽離子。在一些實施例中，該至少一個陽離子係選自由以下組成之群：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。
在一些實施例中，該套組進一步包含複數個具有可延伸之3'末端或不可延伸之3'末端的核酸引子。在一些實施例中，該等引子中之至少一者可固定至支撐物。在一些實施例中，經固定之引子(例如捕捉引子)可用於與核酸模板雜交。在一些實施例中，該等引子中之至少一者包含定序引子，其可與附接至模板分子之接頭序列(例如通用接頭序列)雜交。
在一些實施例中，套組進一步包含複數個核苷酸。在一些實施例中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含鹼基、糖及至少一個磷酸酯基。在一些實施例中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含芳族鹼基、五碳糖(例如，核糖或去氧核糖)及一或多個磷酸酯基(例如，1至10個磷酸酯基)。複數個核苷酸可包含選自由以下組成之群的至少一種類型之核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。複數個核苷酸可在兩種或更多種類型之核苷酸的任何組合之混合物處包含選自由以下組成之群的核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
在一些實施例中，在該套組中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含含一個、兩個或三個磷原子之鏈，其中該鏈通常經由酯或磷醯胺鍵聯連結至糖部分之5'碳。在一些實施例中，複數個中之至少一個核苷酸係具有磷鏈之類似物，在該磷鏈中，磷原子與插入之O、S、NH、亞甲基或伸乙基連接在一起。在一些實施例中，鏈中之磷原子包括經取代之側基，包括O、S或BH 3。在一些實施例中，該鏈包括經包括胺基磷酸酯基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基及O-甲基胺基磷酸酯基在內之類似物取代的磷酸酯基。
在一些實施例中，在該套組中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分可在引子延伸反應期間抑制聚合酶催化的新生股中後續核苷酸單元或游離核苷酸之併入。在一些實施例中，鏈終止部分連結至3'糖羥基位置，其中該糖包含核糖或去氧核糖糖部分。在一些實施例中，鏈終止部分可自3'糖羥基位置移除/裂解以產生具有3'OH糖基團的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸併入反應中以後續核苷酸延伸。在一些實施例中，鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基。在一些實施例中，套組亦可包括裂解鏈終止部分之化學劑。舉例而言，該套組包含肆(三苯基膦)鈀(0) (Pd(PPh 3) 4)與哌啶，或與2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯并-醌(DDQ)、H2 Pd/C或膦或與包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)之硫醇基中之任一者或任何組合。在一些實施例中，套組包括含碳酸鉀(K 2CO 3)之MeOH、含三乙胺之吡啶或含Zn之乙酸(AcOH)的化學劑。在一些實施例中，套組包括包含氟化四丁基銨、吡啶-HF、氟化銨或三乙胺三氫氟酸鹽之化學劑。在一些實施例中，套組包括包含亞硝酸之化學劑。在一些實施例中，套組包括包含亞硝酸鹽之溶液，諸如亞硝酸鹽與諸如乙酸、硫酸或硝酸之酸的組合。在一些其他實施例中，該溶液可包含有機酸，諸如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸或其類似物。
在一些實施例中，在該套組中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-O-疊氮基或3'-O-疊氮基甲基。在一些實施例中，套組可包括裂解鏈終止部分之化學劑。舉例而言，套組包含膦化合物之任一者或任何組合，該膦化合物包含衍生之三烷基膦部分或衍生之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。
在一些實施例中，在該套組中，核苷酸類似物包含鏈終止部分，該鏈終止部分係選自由以下組成之群：3'-去氧核苷酸、2',3'-雙去氧核苷酸、3'-甲基、3'-疊氮基、3'-疊氮基甲基、3'-O-疊氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-胺基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺醯基、3'-丙二醯基、3'-胺基、3'-O-胺基、3'-硫氫基、3'-胺基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-三級丁基、3'-茀基甲氧基羰基、3'三級丁氧基羰基、3'-O-烷基羥胺基、3'-硫代磷酸酯及3-O-苯甲基，或其衍生物。
在一些實施例中，在該套組中，複數個核苷酸包含複數個用可偵測之報導體部分標記之核苷酸。可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，螢光團連結至核苷酸鹼基。在一些實施例中，螢光團用連接子連結至核苷酸鹼基，該連接子可自鹼基裂解/移除。
在一些實施例中，在該系統中，鹼基上之可裂解連接子包含可裂解部分，其包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基。在一些實施例中，套組亦可包括裂解鹼基上之可裂解連接子的化學劑。舉例而言，該套組包含肆(三苯基膦)鈀(0) (Pd(PPh 3) 4)與哌啶，或與2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯并-醌(DDQ)、H2 Pd/C或膦或與包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)之硫醇基中之任一者或任何組合。在一些實施例中，套組包括含碳酸鉀(K 2CO 3)之MeOH、含三乙胺之吡啶或含Zn之乙酸(AcOH)的化學劑。在一些實施例中，套組包括包含氟化四丁基銨、吡啶-HF、氟化銨或三乙胺三氫氟酸鹽之化學劑。
在一些實施例中，在套組中，鹼基上之可裂解連接子包含包括疊氮化合物、疊氮基或疊氮基甲基之可裂解部分。在一些實施例中，套組可包括裂解鹼基上之可裂解連接子的化學劑。舉例而言，套組包含膦化合物之任一者或任何組合，該膦化合物包含衍生之三烷基膦部分或衍生之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。
在一些實施例中，在該套組中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及在鹼基上之可裂解連接子具有相同或不同的可裂解部分。在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及連接至鹼基的可偵測之報導體部分可用相同化學試劑化學裂解/移除。在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及連接至鹼基的可偵測之報導體部分可用不同化學試劑化學裂解/移除。
本發明提供一種套組，其包含至少一種突變聚合酶，該突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列，且該套組進一步包含複數個多價分子。在一些實施例中，該複數個多價分子中之至少一個多價分子包含：(a)核心；及(b)複數個核苷酸臂，該等臂包含(i)核心連接部分、(ii)間隔子(例如，包含PEG部分)、(iii)連接子及(iv)核苷酸單元，其中該核心連接至該複數個核苷酸臂，其中該間隔子連接至該連接子，其中該連接子連接至該核苷酸單元。例示性多價分子展示於圖2-5中。例示性核苷酸臂展示於圖6中。例示性間隔子展示於圖7 (頂部)中。各種例示性連接子展示於圖7 (底部)及圖8中。接合/連接至核苷酸單元之各種連接子的實例顯示於圖9A-D中，其中嘧啶鹼基之5位或嘌呤鹼基之7位經由炔丙基胺連接而連接至連接子(亦參見圖10)。在一些實施例中，核苷酸單元包含鹼基、糖及至少一個磷酸酯基，且連接子經由鹼基連結至核苷酸單元。在一些實施例中，該連接子包含脂族鏈或寡聚乙二醇鏈，其中兩個連接子鏈均具有2-6個次單元。在一些實施例中，連接子進一步包括芳族部分。
在一些實施例中，在該套組中，複數個多價分子中之個別多價分子包含連結至多個核苷酸臂之核心，且其中該多個核苷酸臂具有相同類型之核苷酸單元，其係選自由以下組成之群：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。
在套組中之一些實施例中，至少一種多價分子之核苷酸單元包含芳族鹼基、五碳糖(例如，核糖或去氧核糖)及一或多個磷酸酯基(例如，1至10個磷酸酯基)。複數個多價分子可包含一種類型之多價分子，其具有一種類型之選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。複數個核苷酸可包含兩種或更多種類型之多價分子的任何組合之混合物，其中混合物中之個別多價分子包含選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
在一些實施例中，在該套組中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含含一個、兩個或三個磷原子之核苷酸單元，其中該鏈通常經由酯或磷醯胺鍵聯連結至糖部分之5'碳。在一些實施例中，至少一個核苷酸單元係具有磷鏈之核苷酸類似物，在該磷鏈中，磷原子與插入之O、S、NH、亞甲基或伸乙基連接在一起。在一些實施例中，鏈中之磷原子包括經取代之側基，包括O、S或BH 3。在一些實施例中，該鏈包括經包括胺基磷酸酯基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基及O-甲基胺基磷酸酯基在內之類似物取代的磷酸酯基。
在一些實施例中，在該套組中，複數個多價分子中之個別多價分子包含連結至多個核苷酸臂之核心，且其中個別核苷酸臂包含在糖2'位置處、該糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)的核苷酸單元。
在一些實施例中，在該套組中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含核苷酸單元，其包含具有在糖2'位置處、該糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分可在引子延伸反應期間抑制聚合酶催化的新生股中後續核苷酸單元或游離核苷酸之併入。在一些實施例中，鏈終止部分連結至3'糖羥基位置，其中該糖包含核糖或去氧核糖糖部分。在一些實施例中，鏈終止部分可自3'糖羥基位置移除/裂解以產生具有3'OH糖基團的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸併入反應中以後續核苷酸延伸。在一些實施例中，鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基。在一些實施例中，套組亦可包括使多價分子之核苷酸單元之鏈終止部分裂解的化學劑。舉例而言，該套組包含肆(三苯基膦)鈀(0) (Pd(PPh 3) 4)與哌啶，或與2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯并-醌(DDQ)、H2 Pd/C或膦或與包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)之硫醇基中之任一者或任何組合。在一些實施例中，套組包括含碳酸鉀(K 2CO 3)之MeOH、含三乙胺之吡啶或含Zn之乙酸(AcOH)的化學劑。在一些實施例中，套組包括包含氟化四丁基銨、吡啶-HF、氟化銨或三乙胺三氫氟酸鹽之化學劑。
在一些實施例中，在該套組中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含核苷酸單元，其包含具有在糖2'位置處、該糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-O-疊氮基或3'-O-疊氮基甲基。在一些實施例中，套組可包括使多價分子之核苷酸單元之鏈終止部分裂解的化學劑。舉例而言，套組包含膦化合物之任一者或任何組合，該膦化合物包含衍生之三烷基膦部分或衍生之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。
在一些實施例中，在套組中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含含有選自由以下組成之群的鏈終止部分之核苷酸單元：3'-脫氧核苷酸、2',3'-雙脫氧核苷酸、3'-甲基、3'-疊氮基、3'-疊氮基甲基、3'-O-疊氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-胺基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺醯基、3'-丙二醯基、3'-胺基、3'-O-胺基、3'-巰基、3'-胺基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-三級丁基、3'-茀基甲氧基羰基、3'三級丁氧基羰基、3'-O-烷基羥胺基、3'-硫代磷酸酯及3-O-苯甲基或其衍生物。
在一些實施例中，在套組中，複數個多價分子中之至少一個多價分子包含連接至多個核苷酸臂的核心。在一些實施例中，核心、至少一個連接子及/或至少一個核苷酸單元經可偵測報導基因部分標記。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。
在一些實施例中，在該套組中，個別多價分子包含具有抗生素蛋白樣部分之核心，且該核心連接部分包含生物素。在一些實施例中，核心包含鏈黴抗生物素蛋白型或抗生物素蛋白型部分，其包括抗生物素蛋白，以及可結合到至少一個生物素部分的抗生物素蛋白之任何衍生物、類似物及其他非天然形式。抗生物素蛋白部分之其他形式包括天然及重組抗生物素蛋白及鏈黴抗生物素蛋白，以及衍生化之分子，例如未糖基化之抗生物素蛋白及截斷之鏈黴抗生物素蛋白。舉例而言，抗生物素蛋白部分包括抗生物素蛋白之去糖基化形式、由鏈黴菌(Streptomyces)(例如抗生蛋白鏈黴菌(Streptomyces avidinii))產生之細菌鏈黴抗生物素蛋白以及衍生化形式，例如N-醯基抗生物素蛋白，例如N-乙醯基抗生物素蛋白、N-苯二甲醯基抗生物素蛋白及N-琥珀醯基抗生物素蛋白，及可商購的產品ExtrAvidin™、Captavidin™、Neutravidin TM及Neutralite Avidin™。
在一些實施例中，套組包含一或多個容器，其含有至少一個突變聚合酶、陽離子、引子、複數個核苷酸及/或複數個多價分子。突變聚合酶、陽離子、引子及/或複數個核苷酸可以任何組合形式組合且可包含在單一容器中、或可包含在獨立容器中，或其任何組合。突變聚合酶、陽離子、引子及/或複數個多價分子可以任何組合形式組合且可包含在單一容器中、或可包含在獨立容器中，或其任何組合。
該套組可包括關於使用複數個核苷酸進行核苷酸結合反應、核苷酸併入反應及/或核酸定序反應的該套組之使用說明書。該套組可包括關於使用複數個多價分子進行多價分子結合反應、多價分子併入反應及/或核酸定序反應的該套組之使用說明書。 編碼經工程化聚合酶的核酸、支撐物及宿主細胞
本發明提供編碼本文所描述之突變聚合酶中之任一者的核酸，其包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。
本發明提供一種可操作地連接至至少一個編碼本文所描述之突變聚合酶中之任一者之核酸(例如，轉殖基因)的支撐物，該支撐物包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，支撐物包含至少一個宿主細胞調控序列，包括啟動子序列、強化子、轉錄及/或轉譯起始序列、轉錄及/或轉譯終止序列、多肽分泌訊號序列及類似序列。啟動子序列可為組成型或誘導型啟動子序列。在一些實施例中，支撐物中之啟動子序列可可操作地連接至該至少一個編碼突變聚合酶之核酸以控制宿主細胞對該突變聚合酶之表現。在一些實施例中，該支撐物包含表現支撐物。
本發明提供一種宿主細胞，其攜帶可操作地連接至至少一個編碼本文所描述之突變聚合酶中之任一者之核酸(例如，轉殖基因)的支撐物(例如，表現支撐物)，該等突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，支撐物包含可操作地連接至該至少一個編碼突變聚合酶之核酸的啟動子序列，其中該啟動子序列控制宿主細胞對該突變聚合酶之表現。
本發明提供複數個宿主細胞，其中複數個宿主細胞中之個別宿主細胞具有可操作地連接至至少一個編碼本文所描述之突變聚合酶中之任一者之核酸(例如，轉殖基因)的支撐物(例如，表現支撐物)，該等突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，支撐物包含可操作地連接至該至少一個編碼突變聚合酶之核酸的啟動子序列，其中該啟動子序列控制宿主細胞對該突變聚合酶之表現。 方法
本發明提供製備複數個突變聚合酶之方法，其包含：培養複數個宿主細胞，其中複數個宿主細胞中之個別宿主細胞具有可操作地連接至至少一個編碼本文所描述之突變聚合酶中之任一者之核酸(例如，轉殖基因)的支撐物(例如，表現支撐物)，該等突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，宿主細胞中之支撐物包含可操作地連接至該至少一個編碼突變聚合酶之核酸的啟動子序列，其中該啟動子序列控制宿主細胞對該突變聚合酶之表現。在一些實施例中，將複數個宿主細胞在適於複數個宿主細胞表現複數種突變聚合酶之條件下培養。在一些實施例中，該方法進一步包含自複數個宿主細胞回收(例如分離/富集)該複數種突變聚合酶。
在一些實施例中，複數個宿主細胞具有可操作地連接至編碼本文所描述之突變聚合酶中之任一者之至少一個核酸(例如，轉殖基因)的支撐物(例如表現支撐物)，該等突變聚合酶包含胺基酸序列，其與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性，且其中編碼突變聚合酶中之任一者的轉殖基因可操作地連接至His標籤中之任一者(例如，SEQ ID NOS:2815-2832)或具有凝血酶裂解序列之His標籤中之任一者(例如，SEQ ID NOS:2833-2849)。
本發明提供結合核苷酸類似物之方法、併入核苷酸類似物之方法及結合多價分子之核苷酸單元的方法。本文所描述之方法可用於進行引子延伸反應及核酸定序反應。聚合酶不同地包含DNA聚合酶、RNA聚合酶、模板非依賴性聚合酶、反轉錄酶或能夠進行核苷酸延伸之其他酶。野生型DNA聚合酶一般並不容許某些類型之核苷酸修飾，諸如對糖3'位置之修飾。此特性需要野生型DNA聚合酶經顯著修飾以便促進可逆不可逆終止劑(防止核酸延伸的可移除之化學基團)併入以進行諸如定序之類應用。本文進一步提供採用併入經修飾之核苷酸的突變聚合酶進行之定序方法。另外，使用經工程化DNA聚合酶允許開發能夠在不犧牲酶之熱穩定性或酶在較高溫度下起作用之能力的情況下，將經修飾之核苷酸併入伸長之核酸鏈中的酶。當基於古菌聚合酶主鏈且更尤其是來源於嗜熱性或耐熱性古菌之DNA聚合酶序列的主鏈對DNA聚合酶進行工程化時，此特性尤其得到增強。
展現改良之熱穩定性及/或改良之併入核苷酸類似物之能力的工程化DNA聚合酶可適用於等溫定序或伸長技術。等溫技術包括SDA、LAMP、SMAP、ICAN、SMART等，且可進一步包括如本文所揭示之額外技術。在此等技術中，伸長反應在恆定溫度下，例如使用股置換反應，或在一些額外例示性實施例中自經引發之單股模板、尤其包括經引發之多價模板伸長來進行。在一些實施例中，經工程化DNA聚合酶具有股置換能力。在擴增依賴性方法中，等溫擴增可藉由一恆定溫度下培育樣品、引子、具有股置換活性之DNA聚合酶及受質的混合物，以單步驟完成。此減少所需步驟之數目，消除熱斜變步驟並減少各定序或伸長循環之總循環時間，同時縮短各循環所需之反應時間。在不擴增之方法中，等溫方法允許在定序循環期間進行新生核酸股之結合、偵測及伸長，而不會因溫度斜變或者關鍵組分或試劑上之額外熱應力而造成時間損失。 使用經工程化聚合酶的定序方法
本發明提供可用於進行任何核酸定序方法的經工程化聚合酶，其採用經標記或未標記之鏈終止核苷酸，其中該等鏈終止核苷酸在糖3'位置處包括3'-O-疊氮基(或3'-O-甲基疊氮基)或任何其他類型之大體積封端基團。舉例而言，可使用經工程化聚合酶，使用經標記之多價分子及未標記之鏈終止核苷酸進行親合力定序(sequencing-by-avidity，SBA)方法。另外，經工程化聚合酶亦可用於進行採用經標記之鏈終止核苷酸的合成定序(sequencing-by-synthesis，SBS)方法，以及採用未標記之鏈終止核苷酸的結合定序(sequencing-by-binding，SBB)方法。經工程化聚合酶可用於傳導經磷酸酯鏈標記之核苷酸。
DNA之親合力定序(SBA)在理想情況下需要(a)偵測n+1個鹼基且需要目標核酸序列之2個或更多個複本、與該等目標核酸序列之一或多個區互補的兩個或更多個引子核酸分子以及使該組合物與多價分子(例如聚合物-核苷酸結合物)在足以允許該聚合物-核苷酸結合物與該組合物中該目標核酸序列之該兩個或更多個複本之間形成多價結合複合物的條件下接觸的兩種以上聚合酶，其中聚合物-核苷酸結合物包含兩個或更多個核苷酸部分；隨後將偵測受質洗掉，並且(b)確保僅單個併入發生，需要未標記核苷酸之結構改變(『封端基團』)以確保單核苷酸併入，而且接著阻止任何其他核苷酸併入聚核苷酸鏈中。接著，須在不干擾定序之DNA之完整性的反應條件下移除封端基團。定序循環接著可藉由N+1次偵測接下來的多價聚合酶-結合物-DNA複合物等繼續。為了實際使用，親合力步驟需要(a)保持足夠長時間以成像＞30秒之的穩定受質及(b)步進步驟，由此整個方法應由高產率、高度特異性化學及酶步驟組成以便於進行多個循環之定序。 合成定序
DNA之合成定序(SBS)在理想情況下需要控制併入與定序寡核苷酸相對的正確互補核苷酸(亦即，一次一個)。此允許透過多次循環添加核苷酸來進行準確地定序，因為一次一個地對各核苷酸殘基定序時，因此防止發生失控的連續併入。該經併入核苷酸係使用與之連結的適當標記進行讀取，隨後移除標記部分並隨後進行下一輪定序。為確保僅發生單一併入，需要對正在定序之核苷酸進行結構改變(『封端基團』)以確保單核苷酸併入，而且接著阻止任何其他核苷酸併入聚核苷酸鏈中。接著，須在不干擾定序之DNA之完整性的反應條件下移除封端基團。接著，併入下一個經封端、經標記核苷酸繼續定序循環。為了實際應用，整個方法應由高產率、高度特異性的化學及酶步驟組成以便於進行多個定序循環。 結合定序
結合定序(SBB)需要包括以下步驟之核酸定序方法：(a)使經引發之模板核酸依序與至少兩種獨立混合物在三元複合物穩定性條件下接觸，其中該至少兩種獨立混合物各自包括聚合酶及核苷酸，藉此該依序接觸使得經引發之模板核酸在三元複合物穩定性條件下與模板中第一、第二及第三鹼基類型之核苷酸同源物接觸；(b)檢查至少兩種獨立混合物以確定是否形成三元複合物；及(c)鑑別用於該經引發之模板核酸分子的下一個正確核苷酸，其中若在步驟(b)中偵測到三元複合物，則該下一個正確核苷酸係鑑別為該第一、第二或第三鹼基類型之同源物，而其中基於步驟(b)中不存在三元複合物，則該下一個正確核苷酸係被推算為與第四鹼基類型同源之核苷酸；(d)在步驟(b)之後，將下一個正確核苷酸添加至經引發之模板核酸的引子中，由此產生延伸之引子；及(e)對包含經延伸引子的經引發之模板核酸重複步驟(a)至(d)至少一次。例示性結合定序方法描述於美國專利第10,246,744及10,731,141號中(其中兩個專利之內容以全文引用之方式併入本文中)。 使用磷酸酯鏈標記之核苷酸的定序方法
本發明提供使用結合非固定模板分子的固定定序聚合酶定序的方法，其中定序反應係使用經磷酸酯鏈標記之核苷酸進行。在一些實施例中，定序方法包含 步驟 ( a )：提供支撐物上固定有複數個定序聚合酶之支撐物。在一些實施例中，定序聚合酶包含持續性DNA聚合酶。在一些實施例中，定序聚合酶包含野生型或突變DNA聚合酶，包括(例如) Phi29 DNA聚合酶。在一些實施例中，支撐物包含複數個分隔隔室且定序聚合酶固定化於隔室之底部。在一些實施例中，分隔隔室包含光可穿透之二氧化矽底部。在一些實施例中，分隔隔室包含二氧化矽底部，其經組態有奈米光子限制結構，奈米光子限制結構包含金屬包覆膜(例如，鋁包覆膜)中之孔。在一些實施例中，金屬包層中之孔具有小孔徑，例如大約70 nm。在一些實施例中，奈米光子限制結構之高度為大約100 nm。在一些實施例中，奈米光子限制結構包含零模式波導(ZMW)。在一些實施例中，奈米光子限制結構含有液體。
在一些實施例中，定序方法進一步包含 步驟 ( b )：使該複數個固定之定序聚合酶與複數個單股環狀核酸模板分子及複數個寡核苷酸定序引子接觸，在適用於個別固定之定序聚合酶以結合單股環狀模板分子，及適用於個別定序引子以雜交至個別單股環狀模板分子之條件下，從而產生複數個聚合酶/模板/引子複合物。在一些實施例中，個別定序引子與單股環狀模板分子上之通用定序引子結合位點雜交。
在一些實施例中，定序方法進一步包含 步驟 ( c )：使該複數個聚合酶/模板/引子複合物與各自包含芳族鹼基、五碳糖(例如，核糖或去氧核糖)之複數個經磷酸酯鏈標記之核苷酸及包含3至20個磷酸酯基之磷酸酯鏈接觸，其中末端磷酸酯基連接至可偵測報導部分(例如，螢光團)。第一、第二及第三磷酸酯基可稱為α、β及γ磷酸酯基。在一些實施例中，連接至末端磷酸酯基之特定可偵測報導體部分對應於核苷酸鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許核苷鹼基之偵測及鑑別。在一些實施例中，在適合於聚合酶催化之核苷酸併入的條件下，使複數個聚合酶/模板/引子複合物與複數個磷酸酯鏈標記之核苷酸接觸。在一些實施例中，定序聚合酶能夠結合互補的磷酸酯鏈標記之核苷酸且併入與模板分子中之核苷酸相對的互補核苷酸。在一些實施例中，經聚合酶催化之核苷酸併入反應在α與β磷酸酯基之間裂解，由此釋放連接至螢光團之多磷酸酯鏈。
在一些實施例中，定序方法進一步包含 步驟 ( d )：偵測由磷酸酯鏈標記之核苷酸發射的螢光訊號，該核苷酸與定序聚合酶結合且併入定序引子之末端中。在一些實施例中，步驟(d)進一步包含鑑別經磷酸酯鏈標記之核苷酸，其藉由定序聚合酶結合且併入至定序引子之末端中。
在一些實施例中，定序方法進一步包含步驟(d)：重複步驟(c)-(d)至少一次。在一些實施例中，採用經磷酸酯鏈標記之核苷酸的定序方法可根據美國專利第7,170,050號；第7,302,146號；及/或第7,405,281號中所描述之方法進行。
可根據本發明之方法及組合物使用之DNA聚合酶包括病毒、細菌、古菌及真核聚合酶、以及其同系物及直系同源物。在一些實施例中，DNA聚合酶包括(但不限於)古菌DNA聚合酶，諸如熱球菌屬(Thermococcus)、嗜酸熱菌(Thermoplasmata)、火球菌屬(Pyrococcus)、甲烷球菌屬(Methanococcus)、哈德古菌(Hadesarchaea)、廣古菌門(Euryarchaeota)或候選種(Candidatus)聚合酶及其同源物及直系同源物以及其經工程化、突變及/或截斷之變體。其他DNA聚合酶及同源或直系同源聚合酶係此項技術中已知的且明確地涵蓋在本發明內。
本文提供採用具有增強熱穩定性之突變多肽的方法。在一些實施例中，此類突變多肽具有聚合酶活性(例如突變型核酸聚合酶)。在一些實施例中，熱穩定性包括相對於最接近之野生型酶(諸如包含最接近之野生型酶序列的野生型酶)增加之Tm、對降解之抗性及/或在高溫下維持功能活性(例如併入核苷酸)之能力。在一些實施例中，突變聚合酶包含相對於最接近之野生型酶增加約1、2、5、10、15、20、25或約30℃之Tm。在一些實施例中，突變多肽包含相對於最接近之野生型酶增加至少1、2、5、10、15、20、25或至少30℃的Tm。突變聚合酶通常包含相對於最接近之野生型酶增加至少1-10、5-15、4-20、2-10、4 -15、20-30、10-60或25-35℃之Tm值。在一些實施例中，聚合酶活性包含k cat、k cat/K m或在給定時段內併入之核苷酸的產率。在一些實施例中，聚合酶活性在一些實施例中包含k cat、k cat/K m或在給定時段內併入之經修飾核苷酸(諸如3'-O-疊氮基或3'-O-疊氮基甲基修飾之核苷酸)的產率。在一些實施例中，在高溫下起作用之突變聚合酶維持在低溫下起作用的利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。舉例而言，在約37℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在約42℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在約55℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在約60℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在至少50℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在至少60℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在約37-95℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在37-95、37-60、37-55、37-42、40-60、50-80、42-55、55-60、55-95、60-95或40-90℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在約42-95℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在約40-90℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在約37-55℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在約50-95℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在約60-95℃下起作用之突變聚合酶維持利用未經修飾之核苷酸的最接近之野生型酶之最佳活性的至少99%、98%、95%、90%、85%或至少80%。在一些實施例中，在至少37℃之溫度下起作用之突變聚合酶具有相對於最接近之相關野生型序列增加之k cat。在一些實施例中，在至少42℃之溫度下起作用之突變聚合酶具有相對於最接近之相關野生型序列增加之k cat。在一些實施例中，在至少55℃之溫度下起作用之突變聚合酶具有相對於最接近之相關野生型序列增加之k cat。在一些實施例中，在至少60℃之溫度下起作用之突變聚合酶具有相對於最接近之相關野生型序列增加之k cat。在一些實施例中，在至少80℃之溫度下起作用之突變聚合酶具有相對於最接近之相關野生型序列增加之k cat。在一些實施例中，在至少90℃之溫度下起作用之突變聚合酶具有相對於最接近之相關野生型序列增加之k cat。在一些實施例中，在37-95、37-60、37-55、37-42、40-60、50-80、42-55、55-60、55-95、60-95或40-80℃之溫度下起作用之突變聚合酶具有相對於最接近之相關野生型序列增加之k cat。在一些實施例中，在37-55℃之溫度下起作用之突變聚合酶具有相對於最接近之相關野生型序列增加之k cat。在一些實施例中，在35-90℃之溫度下起作用之突變聚合酶具有相對於最接近之相關野生型序列增加之k cat。 用於形成複合聚合酶之方法
本發明提供用於形成複數個複合聚合酶之方法，其包含步驟 (a)：使複數個突變聚合酶與(i)複數個核酸模板分子及(ii)複數個核酸引子在適於該複數個突變聚合酶與該複數個核酸模板分子及該複數個核酸引子結合之條件下接觸，由此形成複數個複合聚合酶，其各自包含結合至核酸雙螺旋體之突變聚合酶，其中該核酸雙螺旋體包含與核酸引子雜交之核酸模板分子。在一些實施例中，該複數個突變聚合酶包含DNA聚合酶。在一些實施例中，複數個突變聚合酶包含複數個重組突變聚合酶。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，突變聚合酶包括賦予核酸外切酶負活性之胺基酸取代。在一些實施例中，突變聚合酶相比於具有野生型胺基酸主鏈序列之聚合酶展現出所需特徵。舉例而言，突變聚合酶展現增加之熱穩定性(Tm)。在另一實例中，突變聚合酶展現增加的在糖2'位置處及/或在3'糖位置處包含鏈終止部分(例如封端部分)之核苷酸類似物的併入比率。在另一實例中，突變聚合酶展現增加之尿嘧啶耐受性。在一些實施例中，突變DNA聚合酶展現出與核苷酸試劑之結合改良。在一些實施例中，突變DNA聚合酶展現出核苷酸試劑之結合及併入改良。在一些實施例中，突變DNA聚合酶展現出序列特異性定序誤差降低。在一些實施例中，突變DNA聚合酶在約25℃至50℃或約45℃至75℃之溫度範圍內展現出與包含SEQ ID NO: 1-2787及2789-2793之對應野生型聚合酶相比增加的熱穩定性。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，核苷酸試劑包含核苷酸及/或多價分子中之任一者或任何組合。在一些實施例中，核苷酸包含典型核苷酸。在一些實施例中，核苷酸包含未經標記之核苷酸。在一些實施例中，核苷酸包含核苷酸類似物，其包含可偵測地標記之核苷酸及/或攜帶可移除或不可移除之鏈終止部分的核苷酸。在一些實施例中，個別多價分子包含附接至多個聚合物臂的中心核心，各臂末端具有核苷酸單元。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，引子包含3'可延伸端或3'不可延伸端。在一些實施例中，複數個核酸模板分子包含線性核酸分子或環狀核酸分子。在一些實施例中，複數個核酸模板分子包含經擴增模板分子(例如，殖株擴增之模板分子)。在一些實施例中，複數個核酸模板分子包含所關注目標序列的一個複本。在一些實施例中，複數個核酸分子包含所關注目標序列的兩個或更多個串聯複本(例如，多聯體)。在一些實施例中，複數個核酸模板分子中之核酸模板分子包含相同的所關注目標序列或不同的所關注目標序列。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，該複數個核酸模板分子及/或該複數個核酸引子係呈溶液形式或固定至支撐物。在一些實施例中，當該複數個核酸模板分子及/或該複數個核酸引子固定至支撐物時，與重組突變聚合酶之結合產生複數個經固定之複合聚合酶。在一些實施例中，該複數個核酸模板分子及/或核酸引子係固定至支撐物上之10 2-10 15個不同位點。在一些實施例中，該複數個模板分子及核酸引子與該複數個重組突變聚合酶結合產生固定至支撐物上之10 2-10 15個不同位點的複數個複合聚合酶。在一些實施例中，在支撐物上之複數個經固定之複合聚合酶係固定至支撐物上之預定位點或隨機位點。在一些實施例中，複數個經固定之複合聚合酶彼此流體連通以允許試劑(例如包括聚合酶在內之酶、多價分子、核苷酸及/或二價陽離子及類似物)之溶液流動至支撐物上以使得在該支撐物上的複數個經固定之複合聚合酶可與試劑之溶液以大規模平行方式反應。 與多價分子形成複合聚合酶
在一些實施例中，用於形成複數個複合聚合酶之方法大體上包含： ( a )使複數個突變聚合酶與(i)複數個核酸模板分子及(ii)複數個核酸引子接觸以形成複數個複合聚合酶； ( b1 )使該複數個複合聚合酶與複數個多價分子接觸以形成複數個多價-複合聚合酶。在一些實施例中，該方法進一步包含步驟 (c1)：偵測結合至該等複合聚合酶之多價分子。在一些實施例中，該方法進一步包含步驟 (d1)：鑑別結合至該等複合聚合酶的多價分子之互補核苷酸單元。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，用於形成複數個複合聚合酶之方法進一步包含步驟 (b1)：使該複數個複合聚合酶與複數個多價分子接觸，其中該複數個中之個別多價分子包含連結至多個核苷酸臂之核心且各核苷酸臂連結至核苷酸(例如核苷酸單元)。在一些實施例中，多價分子之互補核苷酸單元與複合聚合酶結合形成複數個多價-複合聚合酶。在一些實施例中，步驟(b1)中之接觸係在適於該等多價分子中之至少一者的互補核苷酸單元與該等複合聚合酶中之至少一者結合的條件下進行。在一些實施例中，該條件適於抑制互補核苷酸單元併入複數個多價-複合聚合酶之引子中。在一些實施例中，步驟(b1)中之接觸係在適於該等多價分子中之至少一者的核苷酸與該等複合聚合酶中之至少一者結合，但經結合之核苷酸不併入核酸引子之3'端的條件下進行。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，複數個多價分子中之個別多價分子包含：(a)核心；及(b)複數個核苷酸臂，其包含(i)核心連接部分、(ii)間隔子(例如，包含PEG部分)、(iii)連接子及(iv)核苷酸，其中該核心經由其核心連接部分連接至該複數個核苷酸臂，其中該間隔子連接至該連接子，且其中該連接子連接至該核苷酸。在一些實施例中，該連接子包含具有2-6個次單元之脂族鏈或具有2-6個次單元之寡聚乙二醇鏈。例示性多價分子展示於圖2-5中。例示性核苷酸臂展示於圖6中。例示性間隔子展示於圖7 (頂部)中。各種例示性連接子展示於圖7 (底部)及圖8中。接合/連接至核苷酸單元之各種連接子的實例顯示於圖9A-D中，其中嘧啶鹼基之5位或嘌呤鹼基之7位經由炔丙基胺連接而連接至連接子(亦參見圖10)。在一些實施例中，連接至給定核心之複數個核苷酸臂具有相同類型之核苷酸，且其中核苷酸類型包含dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP。在一些實施例中，該複數個多價分子包含一種類型的多價分子，其中該複數個中的各多價分子具有選自由以下組成之群的相同類型之核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。在一些實施例中，該複數個多價分子包含兩種或更多種類型之多價分子之任何組合的混合物，各類型具有選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，複數個複合聚合酶與複數個多價分子之結合形成至少一個親合力複合物，該方法包含以下步驟： ( a )使第一核酸引子、第一DNA聚合酶及第一多價分子結合至多聯體模板分子之第一部分，藉此形成第一結合複合物(例如圖44至46)，其中該第一多價分子之第一核苷酸單元結合至該第一DNA聚合酶；及 ( b )使第二核酸引子、第二DNA聚合酶及第一多價分子結合至同一多聯體模板分子之第二部分，藉此形成第二結合複合物(例如圖44至46)，其中第一多價分子之第二核苷酸單元結合至第二DNA聚合酶，其中包括相同多價分子之第一結合複合物及第二結合複合物形成親合力複合物(例如，圖47)。在一些實施例中，第一聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。在一些實施例中，第二聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。多聯體模板分子包含所關注序列之串聯重複序列及至少一個通用定序引子結合位點。第一核酸引子及第二核酸引子可沿多聯體模板分子結合至定序引子結合位點。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，該複數個複合DNA聚合酶與該複數個多價分子結合形成至少一種親合力複合物，該方法包含以下步驟： ( a )使第一核酸引子、第一DNA聚合酶及第一多價分子與第一模板分子結合，由此形成第一結合複合物，其中第一多價分子之第一核苷酸單元結合至第一DNA聚合酶；且 ( b )使第二核酸引子、第二DNA聚合酶及第一多價分子與第二模板分子結合，由此形成第二結合複合物，其中該第一多價分子之第二核苷酸單元結合至第二DNA聚合酶，其中包括相同多價分子之第一結合複合物及第二結合複合物形成親合力複合物。在一些實施例中，第一聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。在一些實施例中，第二聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。在一些實施例中，第一模板分子及第二模板分子係經殖株擴增之模板分子。在一些實施例中，第一模板分子及第二模板分子彼此緊密靠近地定位。舉例而言，經殖株擴增之第一模板分子及第二模板分子包含線性模板分子，其係經由橋式擴增產生且固定至支撐物上之相同定位或特徵。第一模板分子及第二模板分子包含所關注序列及至少一個通用定序引子結合位點。第一核酸引子第二核酸引子可分別結合至第一模板分子及第二模板分子上之定序引子結合位點。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，該複數個多價分子中之至少一個多價分子係用可偵測之報導體部分標記。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，多價分子之核心係用螢光團標記，且其中連結至該多價分子之給定核心的螢光團對應於核苷酸臂之核苷酸鹼基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)。在一些實施例中，多價分子之至少一個核苷酸臂包含連結至螢光團之連接子及/或核苷酸鹼基，且其中連結至給定連接子或核苷酸鹼基之螢光團對應於該核苷酸臂之核苷酸鹼基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，該複數個多價分子包含至少一個具有多個核苷酸臂之多價分子，該多個核苷酸臂各自與核苷酸類似物(例如核苷酸類似物單元)連結，其中該核苷酸類似物在糖2'及/或3'位置處包括鏈終止部分。在一些實施例中，該複數個多價分子包含至少一個包含多個核苷酸臂之多價分子，該多個核苷酸臂各自與沒有鏈終止部分之核苷酸單元連結。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之接觸係在至少一個選自由以下組成之群的陽離子存在下進行：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。在一些實施例中，步驟(b1)之接觸係在鍶、鋇及/或鈣存在下進行。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(a)之接觸係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度下進行。在一些實施例中，步驟(b1)之接觸係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度下進行。在一些實施例中，步驟(a)及(b1)之接觸係在選自約25-90℃溫度範圍之恆定溫度(例如，等溫溫度)下進行。
在一些實施例中，用於形成複數個複合聚合酶之方法進一步包含步驟 (c1)：偵測結合至複合聚合酶之多價分子。在一些實施例中，該偵測包括偵測結合至複合聚合酶之多價分子，其中該等多價分子之互補核苷酸單元結合至引子，但互補核苷酸單元之併入受到抑制。在一些實施例中，該等多價分子用可偵測之報導體部分標記以允許偵測。在一些實施例中，經標記之多價分子包含連結至多價分子之核心、連接子及/或核苷酸單元之鹼基的螢光團。
在一些實施例中，用於形成複數個複合聚合酶之方法進一步包含步驟 (d1)：鑑別結合至複合聚合酶的多價分子之互補核苷酸單元。在一些實施例中，鑑別多價分子之互補核苷酸單元可用於確定核酸模板之序列。在一些實施例中，該等多價分子用可偵測之報導體部分標記，該可偵測之報導體部分對應於連結至核苷酸臂之特定核苷酸單元以允許鑑別結合至複數個複合聚合酶之互補核苷酸單元(例如核苷酸鹼基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)。在一些實施例中，步驟(c1)之偵測及步驟(d1)之鑑別可用於確定核酸模板分子之序列。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之複數個多價分子中之至少一個多價分子包含：(a)核心；及(b)複數個核苷酸臂，其包含(i)核心連接部分、(ii)間隔子(例如，包含PEG部分)、(iii)連接子及(iv)核苷酸單元，其中該核心連接至該複數個核苷酸臂，其中該間隔子連接至該連接子，其中該連接子連接至該核苷酸單元。例示性多價分子展示於圖2-5中。例示性核苷酸臂展示於圖6中。例示性間隔子展示於圖7 (頂部)中。各種例示性連接子展示於圖7 (底部)及圖8中。接合/連接至核苷酸單元之各種連接子的實例顯示於圖9A-D中，其中嘧啶鹼基之5位或嘌呤鹼基之7位經由炔丙基胺連接而連接至連接子(亦參見圖10)。在一些實施例中，核苷酸單元包含鹼基、糖及至少一個磷酸酯基，且連接子經由鹼基連結至核苷酸單元。在一些實施例中，該連接子包含脂族鏈或寡聚乙二醇鏈，其中兩個連接子鏈均具有2-6個次單元。在一些實施例中，連接子亦包括芳族部分。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之複數個多價分子中之個別多價分子包含連接至多個核苷酸臂之核心，且其中多個核苷酸臂具有選自由以下組成之群的相同類型之核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之至少一個多價分子的核苷酸單元包含芳族鹼基、五碳糖(例如，核糖或去氧核糖)及一或多個磷酸酯基(例如，1至10個磷酸酯基)。複數個多價分子可包含一種類型之多價分子，其具有一種類型之選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。複數個多價分子可包含兩種或更多種類型之多價分子的任何組合之混合物，其中混合物中之個別多價分子包含選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之複數個多價分子中的至少一個多價分子包含具有含一個、兩個或三個磷原子之鏈的核苷酸單元，其中該鏈通常經由酯或磷醯胺鍵聯連結至糖部分之5'碳。在一些實施例中，至少一個核苷酸單元係具有磷鏈之核苷酸類似物，在該磷鏈中，磷原子與插入之O、S、NH、亞甲基或伸乙基連接在一起。在一些實施例中，鏈中之磷原子包括經取代之側基，包括O、S或BH 3。在一些實施例中，該鏈包括經包括胺基磷酸酯基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基及O-甲基胺基磷酸酯基在內之類似物取代的磷酸酯基。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之複數個多價分子中的個別多價分子包含連結至聚核苷酸臂之核心且其中個別核苷酸臂包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之核苷酸單元。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之複數個多價分子中的至少一個多價分子包括含終止劑核苷酸類似物之核苷酸單元，該核苷酸類似物在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)。在一些實施例中，鏈終止部分可在引子延伸反應期間抑制聚合酶催化的新生股中後續核苷酸單元或游離核苷酸之併入。在一些實施例中，鏈終止部分連結至3'糖羥基位置，其中該糖包含核糖或去氧核糖糖部分。在一些實施例中，鏈終止部分可自3'糖羥基位置移除/裂解以產生具有3'OH糖基團的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸併入反應中以後續核苷酸延伸。在一些實施例中，鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基。在一些實施例中，鏈終止部分可自核苷酸單元可裂解/移除，例如藉由使鏈終止部分與化學劑、pH改變、光或熱反應。在一些實施例中，鏈終止部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，鏈終止部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，鏈終止部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，鏈終止部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，鏈終止部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之複數個多價分子中的至少一個多價分子包括含終止劑核苷酸類似物之核苷酸單元，該核苷酸類似物在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)。在一些實施例中，鏈終止部分包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-O-疊氮基或3'-O-疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之複數個多價分子中之至少一個多價分子包含核苷酸單元，該核苷酸單元包含選自由以下組成之群的鏈終止部分：3'-脫氧核苷酸、2',3'-雙脫氧核苷酸、3'-甲基、3'-疊氮基、3'-疊氮基甲基、3'-O-疊氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-胺基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺醯基、3'-丙二醯基、3'-胺基、3'-O-胺基、3'-巰基、3'-胺基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-三級丁基、3'-茀基甲氧基羰基、3'三級丁氧基羰基、3'-O-烷基羥胺基、3'-硫代磷酸酯及3-O-苯甲基或其衍生物。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之複數個多價分子中之至少一個多價分子包含連接至多個核苷酸臂之核心，其中該核心、連接子及/或核苷酸單元經可偵測報導體部分標記。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，連結至多價分子之特定可偵測之報導體部分(例如螢光團)可對應於核苷酸單元之鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許偵測及鑑別核苷酸鹼基。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之複數個多價分子中之多價分子的至少一個核苷酸臂具有連結至可偵測之報導體部分的核苷酸單元。在一些實施例中，可偵測之報導體部分連結至核苷酸鹼基。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，連結至多價分子之特定可偵測之報導體部分(例如螢光團)可對應於核苷酸單元之鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許偵測及鑑別核苷酸鹼基。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b1)之多價分子的核心包含抗生物素蛋白樣部分且核心連結部分包含生物素。在一些實施例中，核心包含鏈黴抗生物素蛋白型或抗生物素蛋白型部分，其包括抗生物素蛋白，以及可結合到至少一個生物素部分的抗生物素蛋白之任何衍生物、類似物及其他非天然形式。抗生物素蛋白部分之其他形式包括天然及重組抗生物素蛋白及鏈黴抗生物素蛋白，以及衍生化之分子，例如未糖基化之抗生物素蛋白及截斷之鏈黴抗生物素蛋白。舉例而言，抗生物素蛋白部分包括抗生物素蛋白之去糖基化形式、由鏈黴菌(Streptomyces)(例如抗生蛋白鏈黴菌(Streptomyces avidinii))產生之細菌鏈黴抗生物素蛋白以及衍生化形式，例如N-醯基抗生物素蛋白，例如N-乙醯基抗生物素蛋白、N-苯二甲醯基抗生物素蛋白及N-琥珀醯基抗生物素蛋白，及可商購的產品ExtrAvidin™、Captavidin™、Neutravidin TM及Neutralite Avidin™。 與核苷酸形成複合聚合酶
在一些實施例中，用於形成複數個複合聚合酶之方法大體上包含：(a)使複數個突變聚合酶與(i)複數個核酸模板分子及(ii)複數個核酸引子接觸以形成複數個複合聚合酶； ( b2 )使該複數個複合聚合酶與複數個核苷酸接觸以形成複數個核苷酸-複合聚合酶。在一些實施例中，該方法進一步包含步驟 (c2)：偵測併入核苷酸-複合聚合酶之引子中的互補核苷酸。在一些實施例中，該方法進一步包含步驟 (d2)：鑑別併入核苷酸-複合聚合酶之引子中的互補核苷酸之鹼基。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，用於形成複數個複合聚合酶之方法進一步包含步驟 (b2)：使步驟(a)之複數個複合聚合酶與複數個核苷酸在適於來自該複數個核苷酸之互補核苷酸與來自該複數個複合聚合酶之複合聚合酶結合的條件下接觸，由此形成核苷酸-複合聚合酶。在一些實施例中，步驟(b2)之接觸係在適於促進經結合之互補核苷酸併入核苷酸-複合聚合酶之引子中，由此形成複數個核苷酸-複合聚合酶的條件下進行。在一些實施例中，步驟(b2)中將核苷酸併入引子之3'端中包含引子延伸反應。在一些實施例中，步驟(b2)之接觸係在至少一個選自由以下組成之群的陽離子存在下進行：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。在一些實施例中，步驟(b2)之接觸係在鎂及/或錳存在下進行。在一些實施例中，複數個中之個別核苷酸包含芳族鹼基、五碳糖及1至10個磷酸酯基。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含一種類型之選自由dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP組成之群的核苷酸，或包含兩種或更多種類型之選自由dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP組成之群的核苷酸之任何組合的混合物。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含天然核苷酸(例如非類似物核苷酸)或核苷酸類似物。在一些實施例中，該複數個核苷酸中之個別核苷酸包含連結至2'及/或3'糖位置之鏈終止部分。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含可移除或不可移除之2'及/或3'鏈終止部分。在一些實施例中，鏈終止部分包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，該疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基可用膦化合物自核苷酸移除。熟習此項技術者應認識到，其他可移除之鏈終止部分亦為可能的。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含複數個用可偵測之報導體部分標記之核苷酸。可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，螢光團連結至核苷酸鹼基。在一些實施例中，螢光團用連接子連結至核苷酸鹼基，該連接子可自鹼基裂解/移除或不可自鹼基移除。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸未用可偵測之報導體部分標記。在一些實施例中，連結至核苷酸之特定可偵測之報導體部分(例如螢光團)可對應於核苷酸鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許偵測及鑑別核苷酸鹼基。在一些實施例中，步驟(b2)中之複數個核苷酸包含未經標記之核苷酸。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(a)之接觸係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度下進行。在一些實施例中，步驟(b2)之接觸係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度下進行。在一些實施例中，步驟(a)及(b2)之接觸係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度(例如，等溫溫度)下進行。
在一些實施例中，用於形成複數個複合聚合酶之方法進一步包含步驟 (c2)：偵測併入核苷酸-複合聚合酶之引子中的互補核苷酸。在一些實施例中，該複數個核苷酸用可偵測之報導體部分標記以允許偵測。
在一些實施例中，用於形成複數個複合聚合酶之方法進一步包含步驟 (d2)：鑑別併入核苷酸-複合聚合酶之引子的3'端中的互補核苷酸之鹼基。在一些實施例中，步驟(c2)之偵測及步驟(d2)之鑑別可用於確定核酸模板分子之序列。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b2)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含鹼基、糖及至少一個磷酸酯基。在一些實施例中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含芳族鹼基、五碳糖(例如，核糖或去氧核糖)及一或多個磷酸酯基(例如，1至10個磷酸酯基)。複數個核苷酸可包含選自由以下組成之群的至少一種類型之核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。複數個核苷酸可在兩種或更多種類型之核苷酸的任何組合之混合物處包含選自由以下組成之群的核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸不為核苷酸類似物。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸包含核苷酸類似物。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b2)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含具有含一個、兩個或三個磷原子之鏈的核苷酸單元，其中該鏈通常經由酯或磷醯胺鍵聯連結至糖部分之5'碳。在一些實施例中，複數個中之至少一個核苷酸係具有磷鏈之類似物，在該磷鏈中，磷原子與插入之O、S、NH、亞甲基或伸乙基連接在一起。在一些實施例中，鏈中之磷原子包括經取代之側基，包括O、S或BH 3。在一些實施例中，該鏈包括經包括胺基磷酸酯基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基及O-甲基胺基磷酸酯基在內之類似物取代的磷酸酯基。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b2)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含具有鏈終止部分(例如，阻斷部分)的終止子核苷酸類似物，該核苷酸類似物在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分。在一些實施例中，鏈終止部分可在引子延伸反應期間抑制聚合酶催化的新生股中後續核苷酸單元或游離核苷酸之併入。在一些實施例中，鏈終止部分連結至3'糖羥基位置，其中該糖包含核糖或去氧核糖糖部分。在一些實施例中，鏈終止部分可自3'糖羥基位置移除/裂解以產生具有3'OH糖基團的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸併入反應中以後續核苷酸延伸。在一些實施例中，鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基、矽基或縮醛基。在一些實施例中，鏈終止部分係可例如藉由使鏈終止部分化學試劑反應、pH變化、光或熱而自核苷酸裂解/移除的。在一些實施例中，鏈終止部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，鏈終止部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，鏈終止部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，鏈終止部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，鏈終止部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。在一些實施例中，鏈終止部分可用亞硝酸裂解/移除。在一些實施例中，鏈終止部分可使用包含亞硝酸鹽，諸如包含亞硝酸鹽與酸(諸如乙酸、硫酸或硝酸)之組合的溶液裂解/移除。在一些其他實施例中，該溶液可包含有機酸。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b2)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含具有鏈終止部分(例如，阻斷部分)的終止子核苷酸類似物，該核苷酸類似物在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分。在一些實施例中，鏈終止部分包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-O-疊氮基或3'-O-疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。在一些實施例中，包含3'-O-胺基、3'-O-胺基甲基、3'-O-甲基胺基或其衍生物中之一或多者的鏈終止部分可用亞硝酸，經由利用亞硝酸或使用包含亞硝酸之溶液的機制裂解。在一些實施例中，包含3'-O-胺基、3'-O-胺基甲基、3'-O-甲基胺基或其衍生物中之一或多者的鏈終止部分可使用包含亞硝酸鹽之溶液裂解。在一些實施例中，例如，亞硝酸鹽可與酸組合或與酸接觸，該酸諸如為乙酸、硫酸或硝酸。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-縮醛部分，其可經鈀脫除阻隔基試劑(例如，Pd(0))裂解。在一些其他實施例中，例如，亞硝酸鹽可與有機酸組合或與有機酸接觸，該有機酸諸如為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸或類似物。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b2)之複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含鏈終止部分，該鏈終止部分選自由以下組成之群的鏈終止部分：3'-脫氧核苷酸、2',3'-雙脫氧核苷酸、3'-甲基、3'-疊氮基、3'-疊氮基甲基、3'-O-疊氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-胺基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺醯基、3'-丙二醯基、3'-胺基、3'-O-胺基、3'-巰基、3'-胺基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-三級丁基、3'-茀基甲氧基羰基、3'三級丁氧基羰基、3'-O-烷基羥胺基、3'-硫代磷酸酯、3'-O-苯甲基及3'-縮醛部分或其衍生物。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b2)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含可偵測之報導體部分。在一些實施例中，步驟(b2)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含經標記之核苷酸。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，螢光團連結至核苷酸鹼基。在一些實施例中，螢光團用連接子連結至核苷酸鹼基，該連接子可自鹼基裂解/移除。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸未用可偵測之報導體部分標記。在一些實施例中，連結至核苷酸之特定可偵測之報導體部分(例如螢光團)可對應於核苷酸鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許偵測及鑑別核苷酸鹼基。在一些實施例中，步驟(b2)之複數個核苷酸包含未經標記之核苷酸。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b2)之複數個核苷酸中之至少一個核苷酸在鹼基上包含可裂解連接子，其包含可裂解(例如，可移除)部分，該部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫鍵基、碳酸酯基、脲基、矽基或縮醛基。在一些實施例中，鹼基上之可裂解連接子可藉由可裂解部分與化學試劑反應、pH變化、光或熱而自鹼基裂解/移除。在一些實施例中，可裂解部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，可裂解部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，可裂解部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，可裂解部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，可裂解部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b2)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含在鹼基上之可裂解連接子，其包含可裂解部分，包括疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，可裂解部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，步驟(b2)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含該糖2'及/或糖3'位置處之鏈終止部分及在鹼基上之可裂解連接子，其中在糖上之鏈終止部分及在鹼基上之可裂解連接子具有相同或不同的可裂解部分。在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及連接至鹼基的可偵測之報導體部分可用相同化學試劑化學裂解/移除。在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及連接至鹼基的可偵測之報導體部分可用不同化學試劑化學裂解/移除。
本發明提供用於使突變聚合酶結合至核苷酸的方法，其包含： (a)使突變聚合酶與(i)核酸模板分子及(ii)核酸引子接觸，其中該接觸係在適於該突變聚合酶結合至與核酸引子雜交之核酸模板分子的條件下進行，其中與核酸引子雜交之核酸模板分子形成核酸雙螺旋體。在一些實施例中，突變聚合酶包含重組突變聚合酶。在一些實施例中，引子包含3'可延伸端或3'不可延伸端。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，突變聚合酶包括賦予核酸外切酶負活性之胺基酸取代。在一些實施例中，突變聚合酶展現出與對應野生型聚合酶相比增加之核苷酸類似物併入比率，其中核苷酸類似物在糖2'位置及/或3'糖位置包含鏈終止部分(例如阻斷部分)。
在一些實施例中，該用於使突變聚合酶結合至核苷酸之方法進一步包含 (b)使該突變聚合酶與複數個核苷酸在適於至少一個核苷酸結合至與核酸雙螺旋體結合之突變聚合酶的條件下接觸。在一些實施例中，突變聚合酶係在至少一個陽離子存在下與複數個核苷酸接觸，該至少一個陽離子選自由以下組成之群：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。在一些實施例中，步驟(b)之接觸係在鍶、鋇及/或鈣存在下進行。在一些實施例中，至少一個核苷酸結合突變聚合酶不併入可延伸或不可延伸引子之3'端中。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含至少一個在糖2'或3'位置處具有鏈終止部分之核苷酸類似物。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含至少一個沒有鏈終止部分之核苷酸。在一些實施例中，該方法進一步包含 (c)偵測結合至聚合酶但未併入引子之3'端中的該至少一個核苷酸。在一些實施例中，該方法進一步包含 (d)鑑別結合至聚合酶但未併入引子之3'端中的該至少一個核苷酸。
或者，用於將聚合酶結合至核苷酸之方法包含形成複合聚合酶： (a1)使突變聚合酶與(i)核酸模板分子及(ii)核酸引子接觸，其中該接觸係在適於該突變聚合酶結合至與核酸引子雜交之核酸模板分子的條件下進行，其中與核酸引子雜交之核酸模板分子形成核酸雙螺旋體。在一些實施例中，突變聚合酶包含重組突變聚合酶。在一些實施例中，引子包含3'可延伸端或3'不可延伸端。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，突變聚合酶包括賦予核酸外切酶負活性之胺基酸取代。在一些實施例中，突變聚合酶展現出與對應野生型聚合酶相比增加之核苷酸類似物併入比率，其中核苷酸類似物在糖2'位置及/或3'糖位置包含鏈終止部分(例如阻斷部分)。
替代方法進一步包含步驟 (b1)：在適合於將來自複數個核苷酸之互補核苷酸結合至來自複數個複合聚合酶之複合聚合酶的條件下使步驟(a1)之複數個複合聚合酶與複數個核苷酸接觸，藉此形成核苷酸複合聚合酶。在一些實施例中，步驟(b1)之接觸係在適於促進核苷酸結合但抑制經結合之互補核苷酸併入核苷酸-複合聚合酶之引子的3'端中的條件下進行。在一些實施例中，步驟(b1)之接觸在至少一種選自由以下組成之群的陽離子存在下進行：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。該複數個複合聚合酶可依序與至少兩種獨立混合物接觸，其中各混合物包含經工程化聚合酶及核苷酸。該接觸係在適於與模板中第一、第二及第三鹼基類型之同源物形成穩定三元複合物的條件下進行。該方法進一步包含步驟(c1)檢查該至少兩種獨立混合物，以確定是否形成三元複合物。該方法進一步包含步驟 ( d1 )鑑別經引發之模板核酸分子的下一個正確核苷酸，其中若在步驟(c1)中偵測到三元複合物，則將該下一個正確核苷酸鑑別為第一、第二或第三鹼基類型之同源物，且其中基於步驟(c1)中不存在三元複合物，則插入該下一個正確核苷酸作為第四鹼基類型之核苷酸同源物。該方法進一步包含步驟(e1)在步驟(c3)之後，將下一個正確核苷酸添加至經引發之模板核酸之引子中，由此產生延伸引子；及步驟(f1)對包含該延伸引子的經引發之模板核酸重複步驟(a)至(e1)。
本發明提供用於併入核苷酸之方法，其包含： ( a )使突變聚合酶與(i)核酸模板分子及(ii)核酸引子接觸，其中該接觸在適合於將突變聚合酶結合至與核酸引子雜交之核酸模板分子的條件下進行，其中與核酸引子雜交之核酸模板分子形成核酸雙螺旋。在一些實施例中，突變聚合酶包含重組突變聚合酶。在一些實施例中，引子包含3'可延伸端。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，突變聚合酶包括賦予核酸外切酶負活性之胺基酸取代。在一些實施例中，突變聚合酶展現出與對應野生型聚合酶相比增加之核苷酸類似物併入比率，其中核苷酸類似物在糖2'位置及/或3'糖位置包含鏈終止部分(例如阻斷部分)。
在一些實施例中，該用於併入核苷酸之方法進一步包含 (b)使該突變聚合酶與複數個核苷酸在適於至少一個核苷酸結合至與核酸雙螺旋體結合之突變聚合酶的條件下接觸。在一些實施例中，突變聚合酶係在至少一個陽離子存在下與複數個核苷酸接觸，該至少一個陽離子選自由以下組成之群：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。在一些實施例中，步驟(b)之接觸係在鍶、鋇及/或鈣存在下進行。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含至少一個在糖2'或3'位置處具有鏈終止部分之核苷酸類似物。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含至少一個沒有鏈終止部分之核苷酸。在一些實施例中，複數個核苷酸包含經標記之核苷酸。在一些實施例中，複數個核苷酸包含未經標記之核苷酸。在一些實施例中，該方法進一步包含 (c)在適於併入至少一個核苷酸之條件下將該至少一個核苷酸併入可延伸引子之3'端中。在一些實施例中，用於核苷酸結合突變聚合酶與用於併入核苷酸的適合條件可相同或不同。在一些實施例中，適於併入核苷酸之條件包含包括至少一個選自由以下組成之群的陽離子：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。在一些實施例中，該至少一個核苷酸結合突變聚合酶且併入可延伸引子之3'端中。在一些實施例中，步驟 (c)中將核苷酸併入引子之3'端中包含引子延伸反應。在一些實施例中，該方法進一步包含 (d)重複步驟(c)之將至少一個核苷酸併入可延伸引子之3'端中至少一次。在一些實施例中，該方法進一步包含偵測至少一個在步驟(c)及/或(d)併入之核苷酸。在一些實施例中，該方法進一步包含鑑別至少一個在步驟(c)及/或(d)併入之核苷酸。在一些實施例中，核酸模板分子之序列可藉由偵測及鑑別結合突變聚合酶之核苷酸來確定。在一些實施例中，核酸模板分子之序列可藉由偵測及鑑別併入引子3'端中之核苷酸來確定。
本發明提供用於確定核酸模板分子之序列的方法，其包含： (a)使突變聚合酶與(i)核酸模板分子及(ii)核酸引子接觸，其中該接觸係在適於該突變聚合酶結合至與核酸引子雜交之核酸模板分子的條件下進行，其中與核酸引子雜交之核酸模板分子形成核酸雙螺旋體。在一些實施例中，突變聚合酶包含重組突變聚合酶。在一些實施例中，引子包含3'可延伸端。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，突變聚合酶包括賦予核酸外切酶負活性之胺基酸取代。在一些實施例中，突變聚合酶展現出與對應野生型聚合酶相比增加之核苷酸類似物併入比率，其中核苷酸類似物在糖2'位置及/或3'糖位置包含鏈終止部分(例如阻斷部分)。
在一些實施例中，該用於確定核酸模板分子之序列的方法進一步包含接觸，即 (b)使該突變聚合酶與複數個核苷酸在適於至少一個核苷酸結合至與核酸雙螺旋體結合之突變聚合酶的條件下接觸。在一些實施例中，突變聚合酶係在至少一個陽離子存在下與複數個核苷酸接觸，該至少一個陽離子選自由以下組成之群：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。在一些實施例中，步驟(b)之接觸係在鍶、鋇及/或鈣存在下進行。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含至少一個在糖2'或3'位置處具有鏈終止部分之核苷酸類似物。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含至少一個沒有鏈終止部分之核苷酸。在一些實施例中，複數個核苷酸包含經標記之核苷酸。在一些實施例中，複數個核苷酸包含未經標記之核苷酸。在一些實施例中，該方法進一步包含 (c)在適於併入至少一個核苷酸之條件下將該至少一個核苷酸併入可延伸引子之3'端中。在一些實施例中，用於核苷酸結合突變聚合酶與用於併入核苷酸的適合條件可相同或不同。在一些實施例中，適於併入核苷酸之條件包含包括至少一個選自由以下組成之群的陽離子：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。在一些實施例中，該至少一個核苷酸結合突變聚合酶且併入可延伸引子之3'端中。在一些實施例中，步驟(c)中將核苷酸併入引子之3'端中包含引子延伸反應。在一些實施例中，該方法進一步包含 (d)重複步驟(c)之將至少一個核苷酸併入可延伸引子之3'端中至少一次。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含複數個用可偵測之報導體部分標記之核苷酸。可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，螢光團連結至核苷酸鹼基。在一些實施例中，螢光團用連接子連結至核苷酸鹼基，該連接子可自鹼基裂解/移除。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸未用可偵測之報導體部分標記。在一些實施例中，連結至核苷酸之特定可偵測之報導體部分(例如螢光團)可對應於核苷酸鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許偵測及鑑別核苷酸鹼基。在一些實施例中，該方法進一步包含偵測至少一個在步驟(c)及/或(d)併入之核苷酸。在一些實施例中，該方法進一步包含鑑別至少一個在步驟(c)及/或(d)併入之核苷酸。在一些實施例中，核酸模板分子之序列可藉由偵測及鑑別結合突變聚合酶之核苷酸，由此確定核酸模板之序列來確定。在一些實施例中，核酸模板分子之序列可藉由偵測及鑑別併入引子3'端中之核苷酸，由此確定核酸模板之序列來確定。
在一些實施例中，在用於確定核酸模板之序列的方法中，結合至核酸雙螺旋體的複數個聚合酶包含複數個複合聚合酶，其具有至少第一複合聚合酶及第二複合聚合酶，其中(a)第一複合聚合酶包含結合至第一核酸雙螺旋體之第一聚合酶，該第一核酸雙螺旋體包含與第一核酸引子雜交之第一核酸模板；(b)第二複合聚合酶包含結合至第二核酸雙螺旋體之第二聚合酶，該第二核酸雙螺旋體包含與第二核酸引子雜交之第二核酸模板；(c)第一核酸模板與第二核酸模板包含不同序列；(d)第一核酸模板及第二核酸模板經殖株擴增；(e)第一引子及第二引子包含可延伸3'端或不可延伸3'端；及(f)該複數個複合聚合酶係固定至支撐物。在一些實施例中，複數個複合聚合酶之密度係每平方毫米約10 2-10 15個固定至支撐物之複合聚合酶。
在一些實施例中，在用於結合核苷酸之方法中及用於併入核苷酸之方法中以及使用核苷酸對核酸模板定序之方法中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含鹼基、糖及至少一個磷酸酯基。在一些實施例中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含芳族鹼基、五碳糖(例如，核糖或去氧核糖)及一或多個磷酸酯基(例如，1至10個磷酸酯基)。複數個核苷酸可包含選自由以下組成之群的至少一種類型之核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。複數個核苷酸可在兩種或更多種類型之核苷酸的任何組合之混合物處包含選自由以下組成之群的核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸不為核苷酸類似物。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸包含核苷酸類似物。
在一些實施例中，在用於結合核苷酸之方法中及用於併入核苷酸之方法中以及用於對核酸模板定序之方法中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含具有一個、兩個或三個磷原子之鏈其中該鏈通常經由酯或磷醯胺鍵聯連結至糖部分之5'碳。在一些實施例中，複數個中之至少一個核苷酸係具有磷鏈之類似物，在該磷鏈中，磷原子與插入之O、S、NH、亞甲基或伸乙基連接在一起。在一些實施例中，鏈中之磷原子包括經取代之側基，包括O、S或BH 3。在一些實施例中，該鏈包括經包括胺基磷酸酯基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基及O-甲基胺基磷酸酯基在內之類似物取代的磷酸酯基。
在一些實施例中，在用於結合核苷酸之方法中及用於併入核苷酸之方法中以及用於對核酸模板定序之方法中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)的終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分可在引子延伸反應期間抑制聚合酶催化的新生股中後續核苷酸單元或游離核苷酸之併入。在一些實施例中，鏈終止部分連結至3'糖羥基位置，其中該糖包含核糖或去氧核糖糖部分。在一些實施例中，鏈終止部分可自3'糖羥基位置移除/裂解以產生具有3'OH糖基團的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸併入反應中以後續核苷酸延伸。在一些實施例中，鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基。在一些實施例中，鏈終止部分係可例如藉由使鏈終止部分化學試劑反應、pH變化、光或熱而自核苷酸裂解/移除的。在一些實施例中，鏈終止部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，鏈終止部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，鏈終止部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，鏈終止部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，鏈終止部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。在一些實施例中，鏈終止部分可用亞硝酸裂解/移除。在一些實施例中，鏈終止部分可使用包含亞硝酸鹽，諸如包含亞硝酸鹽與酸(諸如乙酸、硫酸或硝酸)之組合的溶液裂解/移除。在一些其他實施例中，該溶液可包含有機酸。
在一些實施例中，在用於結合核苷酸之方法中及用於併入核苷酸之方法中以及用於對核酸模板定序之方法中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)的終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-O-疊氮基或3'-O-疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。在一些實施例中，包含3'-O-胺基、3'-O-胺基甲基、3'-O-甲基胺基或其衍生物中之一或多者的鏈終止部分可用亞硝酸，經由利用亞硝酸或使用包含亞硝酸之溶液的機制裂解。在一些實施例中，包含3'-O-胺基、3'-O-胺基甲基、3'-O-甲基胺基或其衍生物中之一或多者的鏈終止部分可使用包含亞硝酸鹽之溶液裂解。在一些實施例中，例如，亞硝酸鹽可與酸組合或與酸接觸，該酸諸如為乙酸、硫酸或硝酸。在一些其他實施例中，例如，亞硝酸鹽可與有機酸組合或與有機酸接觸，該有機酸諸如為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸或類似物。
在一些實施例中，在結合核苷酸之方法及併入核苷酸之方法及用於定序核酸模板之方法中，該核苷酸包含鏈終止部分，該鏈終止部分選自由以下組成之群的鏈終止部分：3'-脫氧核苷酸、2',3'-雙脫氧核苷酸、3'-甲基、3'-疊氮基、3'-疊氮基甲基、3'-O-疊氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-胺基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺醯基、3'-丙二醯基、3'-胺基、3'-O-胺基、3'-巰基、3'-胺基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-三級丁基、3'-茀基甲氧基羰基、3'三級丁氧基羰基、3'-O-烷基羥胺基、3'-硫代磷酸酯、3'-O-苯甲基及3'-縮醛部分或其衍生物。
在一些實施例中，在用於結合核苷酸之方法中及用於併入核苷酸之方法中以及用於對核酸模板定序之方法中，複數個核苷酸包含複數個用可偵測之報導體部分標記的核苷酸。可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，螢光團連結至核苷酸鹼基。在一些實施例中，螢光團用連接子連結至核苷酸鹼基，該連接子可自鹼基裂解/移除。在一些實施例中，在併入核苷酸之方法及在使用包含連接至核苷酸鹼基之螢光團的核苷酸定序核酸模板之方法中，裂解連接子以移除螢光團產生經延伸之股，該經延伸股具有產生瘢痕之連接子的至少一部分。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸未用可偵測之報導體部分標記。在一些實施例中，連結至核苷酸之特定可偵測之報導體部分(例如螢光團)可對應於核苷酸鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許偵測及鑑別核苷酸鹼基。在一些實施例中，複數個核苷酸包含未經標記之核苷酸。
在一些實施例中，在結合核苷酸之方法及併入核苷酸之方法及用於定序核酸模板之方法中，鹼基上之可裂解連接子包含可裂解部分，其包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基。在一些實施例中，鹼基上之可裂解連接子可藉由可裂解部分與化學試劑反應、pH變化、光或熱而自鹼基裂解/移除。在一些實施例中，可裂解部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，可裂解部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，可裂解部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，可裂解部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，可裂解部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-縮醛部分，其可經鈀脫除阻隔基試劑(例如，Pd(0))裂解。
在一些實施例中，在用於結合核苷酸之方法中及用於併入核苷酸之方法中以及用於對核酸模板定序之方法中，鹼基上之可裂解連接子包含可裂解部分，其包括疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，可裂解部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。
在一些實施例中，在用於結合核苷酸之方法中及用於併入核苷酸之方法中以及用於對核酸模板定序之方法中，鏈終止部分(例如糖2'及/或糖3'位置處)與鹼基上之可裂解連接子具有相同或不同的可裂解部分。在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及連接至鹼基的可偵測之報導體部分可用相同化學試劑化學裂解/移除。在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及連接至鹼基的可偵測之報導體部分可用不同化學試劑化學裂解/移除。
在一些實施例中，在用於定序之方法中，結合複合物包含突變聚合酶、與引子形成雙螺旋之核酸模板分子及核苷酸反應劑。在一些實施例中，在形成結合複合物之方法中，該結合複合物包含(i)突變聚合酶、與引子形成雙螺旋之核酸模板分子及核苷酸，或結合複合物包含(ii)突變聚合酶、與引子形成雙螺旋之核酸模板分子及多價分子之核苷酸單元。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，結合複合物之存留時間大於約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1秒。該結合複合物之存留時間大於約0.1-0.25秒、或約0.25-0.5秒、或約0.5-0.75秒、或約0.75-1秒、或約1-2秒、或約2-3秒、或約3-4秒、或約4-5秒、或約5-10秒，及/或其中該方法係在或可在等於或高於15℃、等於或高於20℃、等於或高於25℃、等於或高於35℃、等於或高於37℃、等於或高於42℃、等於或高於55℃、等於或高於60℃、或等於或高於72℃、或等於或高於80℃或在任何前述所界定之範圍內的溫度下進行。結合複合物(例如三元複合物)保持穩定，直至經歷引起聚合酶、模板分子、引子中的任一者及/或核苷酸單元或核苷酸之間之相互作用解離的條件。舉例而言，解離條件包含使結合複合物與洗滌劑、EDTA及/或水中之任一者或任何組合接觸。在一些實施例中，本發明提供該方法，其中該結合複合物係沈積於表面上、連結至表面或與表面雜交，該表面在偵測步驟中顯示出大於20之造影劑與雜訊比。在一些實施例中，本發明提供該方法，其中該接觸係在該核苷酸或核苷酸單元與該模板核酸之下一個鹼基互補時使該結合複合物穩定且在該核苷酸或核苷酸單元與該模板核酸之該下一個鹼基不互補時使該結合複合物不穩定的條件下執行。
在一些實施例中，在用於形成複數個複合聚合酶之方法中，包括使用多價分子及/或核苷酸之方法，支撐物包含平面或非平面支撐物。支撐物可為固體或半固體。在一些實施例中，支撐物可為多孔、半多孔或無孔的。在一些實施例中，支撐物之表面可塗有一或多種化合物以在支撐物上產生鈍化層。在一些實施例中，鈍化層形成多孔或半多孔層。在一些實施例中，核酸引子、模板及/或聚合酶可連結至鈍化層以將引子、模板及/或聚合酶固定至支撐物。在一些實施例中，支撐物包含使得支撐物上之核酸雜交及擴增效能能夠改善之低非特異性結合表面。一般而言，支撐物可包含一或多層共價或非共價連接之較低結合的化學修飾層(例如，矽烷層)、聚合物膜及一或多個可用於將複數個核酸模板分子固定至支撐物的共價或非共價連接之寡核苷酸(例如，圖1)。在一些實施例中，支撐物可包含經由支撐物上之化學基團至少共價結合至支撐物之一部分的官能化聚合物塗層、移植至官能化聚合物塗層上之引子以及在該引子及該官能化聚合物塗層上之水溶性保護塗層。在一些實施例中，官能化聚合物塗層包含聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺(PAZAM)。在一些實施例中，支撐物包含具有至少一個親水性聚合物塗層之表面塗層及至少一層複數個寡核苷酸。親水性聚合物塗層可包含聚乙二醇(PEG)。親水性聚合物塗層可包含具有至少4個分支之分支PEG。在一些實施例中，低非特異性結合塗層具有可作為水接觸角量測之親水性程度，其中水接觸角不超過45度。在一些實施例中，固定至支撐物或固定至支撐物上之塗層的複數個複合聚合酶之密度係每平方毫米約10 2-10 6個、或每平方毫米約10 6-10 9個、或每平方毫米約10 9-10 12個、或每平方毫米約10 12-10 15個。在一些實施例中，複數個複合聚合酶固定至支撐物或在該支撐物(或在支撐物上之塗層)上之預定位點處固定至支撐物上之塗層，或在該支撐物(或在該支撐物上之塗層)之隨機位點處固定至支撐物上之塗層。 核酸定序之方法
本發明提供用於確定一或多個核酸模板分子序列的方法，其包含： (a)使複數個第一突變聚合酶與複數個核酸模板分子及(ii)複數個核酸引子接觸，其中接觸係在適於該複數個第一突變型DNA聚合酶與該複數個核酸模板分子及該複數個核酸引子結合，由此形成複數個第一複合聚合酶的條件下進行，該複數個第一複合聚合酶各自包含結合至核酸雙螺旋體之第一突變型DNA聚合酶，其中該核酸雙螺旋體包含與核酸引子雜交之核酸模板分子。在一些實施例中，該複數個第一突變聚合酶包含重組突變聚合酶。在一些實施例中，該複數個第一突變聚合酶包含DNA聚合酶。在一些實施例中，第一突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，第一突變聚合酶係重組聚合酶。在一些實施例中，第一突變聚合酶包括賦予核酸外切酶負活性之胺基酸取代。在一些實施例中，第一突變聚合酶相比於具有對應野生型胺基酸主鏈序列之聚合酶(例如，SEQ ID NOS: 1、2、1714或2789-2793中之任一者)展現出所需特徵。舉例而言，第一突變聚合酶展現出增加之熱穩定性(Tm)。在另一實例中，第一突變聚合酶展現出增加的在糖2'位置處及/或在3'糖位置處包含鏈終止部分(例如封端部分)之核苷酸類似物的併入比率。在另一實例中，第一突變聚合酶展現增加之尿嘧啶耐受性。在一些實施例中，突變DNA聚合酶展現出與核苷酸試劑之結合改良。在一些實施例中，突變DNA聚合酶展現出核苷酸試劑之結合及併入改良。在一些實施例中，突變DNA聚合酶展現出序列特異性定序誤差降低。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，核苷酸試劑包含核苷酸及/或多價分子中之任一者或任何組合。在一些實施例中，核苷酸包含典型核苷酸。在一些實施例中，核苷酸包含未經標記之核苷酸。在一些實施例中，核苷酸包含核苷酸類似物，其包含可偵測地標記之核苷酸及/或攜帶可移除或不可移除之鏈終止部分的核苷酸。在一些實施例中，個別多價分子包含附接至多個聚合物臂的中心核心，各臂末端具有核苷酸單元。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，引子包含3'可延伸端或3'不可延伸端。在一些實施例中，複數個核酸模板分子包含經擴增模板分子(例如，殖株擴增之模板分子)。在一些實施例中，複數個核酸模板分子包含所關注目標序列的一個複本。在一些實施例中，複數個核酸分子包含所關注目標序列的兩個或更多個串聯複本(例如，多聯體)。在一些實施例中，複數個核酸模板分子中之核酸模板分子包含相同的所關注目標序列或不同的所關注目標序列。在一些實施例中，該複數個核酸模板分子及/或該複數個核酸引子係呈溶液形式或固定至支撐物。在一些實施例中，當該複數個核酸模板分子及/或該複數個核酸引子固定至支撐物時，與第一重組突變聚合酶之結合產生複數個經固定之第一複合聚合酶。在一些實施例中，該複數個核酸模板分子及/或核酸引子係固定至支撐物上之10 2-10 15個不同位點。在一些實施例中，該複數個模板分子及核酸引子與複數個第一重組突變聚合酶結合產生固定至支撐物上之10 2-10 15個不同位點的複數個第一複合聚合酶。在一些實施例中，在支撐物上之複數個經固定之第一複合聚合酶係固定至支撐物上之預定位點或隨機位點。在一些實施例中，該複數個經固定之第一複合聚合酶彼此流體連通以允許試劑(例如包括聚合酶在內之酶、多價分子、核苷酸及/或二價陽離子)之溶液流動至支撐物上以使得該支撐物上之複數個經固定之複合聚合酶與試劑之溶液以大規模平行之方式反應。
在一些實施例中，該用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法進一步包含步驟(b)：使該複數個第一複合聚合酶與複數個多價分子接觸以形成複數個多價-複合聚合酶。在一些實施例中，複數個多價分子中之個別多價分子包含連結至多個核苷酸臂之核心且各核苷酸臂連結至核苷酸(例如核苷酸單元)。在一些實施例中，步驟(b)之接觸係在適於多價分子之互補核苷酸單元與複數個第一複合聚合酶中之至少兩者結合，由此形成複數個多價-複合聚合酶的條件下進行。在一些實施例中，該條件適於抑制互補核苷酸單元併入複數個多價-複合聚合酶之引子中。在一些實施例中，該複數個多價分子包含至少一個具有多個核苷酸臂之多價分子，該多個核苷酸臂各自與核苷酸類似物(例如核苷酸類似物單元)連結，其中核苷酸類似物在糖2'及/或3'位置處包括鏈終止部分。在一些實施例中，該複數個多價分子包含至少一個包含多個核苷酸臂之多價分子，該多個核苷酸臂各自與沒有鏈終止部分之核苷酸單元連結。在一些實施例中，該複數個多價分子中之至少一個多價分子未用可偵測之報導體部分標記。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，步驟(b)之接觸係在至少一個選自由以下組成之群的陽離子存在下進行：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。在一些實施例中，步驟(b)之接觸係在鍶、鋇及/或鈣存在下進行。
在一些實施例中，用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法進一步包含步驟 ( c )：偵測複數個多價複合聚合酶。在一些實施例中，該偵測包括偵測結合至複合聚合酶之多價分子，其中該等多價分子之互補核苷酸單元結合至引子，但互補核苷酸單元之併入受到抑制。在一些實施例中，該等多價分子用可偵測之報導體部分標記以允許偵測。在一些實施例中，經標記之多價分子包含連接至多價分子之核心、連接子及/或核苷酸單元的螢光團。
在一些實施例中，用於確定一或多個核酸模板分子之序列之方法進一步包含步驟 ( d )：鑑別結合至複數個第一複合聚合酶之互補核苷酸單元之鹼基，藉此確定核酸模板之序列。在一些實施例中，該等多價分子用可偵測之報導體部分標記，該可偵測之報導體部分對應於連結至核苷酸臂之特定核苷酸單元以允許鑑別結合該複數個第一複合聚合酶之互補核苷酸單元(例如核苷酸鹼基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，複數個第一複合聚合酶與複數個多價分子之結合形成至少一個親合力複合物，該方法包含以下步驟： ( a )使第一核酸引子、第一DNA聚合酶及第一多價分子結合至多聯體模板分子之第一部分，藉此形成第一結合複合物(例如圖44至46)，其中該第一多價分子之第一核苷酸單元結合至該第一DNA聚合酶；及 ( b )使第二核酸引子、第二DNA聚合酶及第一多價分子結合至同一多聯體模板分子之第二部分，藉此形成第二結合複合物(例如圖44至46)，其中第一多價分子之第二核苷酸單元結合至第二DNA聚合酶，其中包括相同多價分子之第一及第二結合複合物形成親合力複合物(例如圖47)。在一些實施例中，第一聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。在一些實施例中，第二聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。多聯體模板分子包含所關注序列之串聯重複序列及至少一個通用定序引子結合位點。第一核酸引子及第二核酸引子可沿多聯體模板分子結合至定序引子結合位點。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，該方法包括複數個第一複合聚合酶與複數個多價分子結合以形成至少一個親合力複合物，該方法包含以下步驟：在適合於將來自該複數個之單個多價分子結合至該第一複合聚合酶及該第二複合聚合酶之條件下， ( a )使該複數個DNA聚合酶及該複數個核酸引子與多聯體核酸模板分子之不同部分接觸，以在該同一多聯體模板分子上形成至少第一及第二複合聚合酶(例如，圖44-45)； ( b )使複數個多價分子與同一多聯體模板分子上之至少第一及第二複合聚合酶接觸，其中該單一多價分子之至少第一核苷酸單元結合至該第一複合聚合酶，該第一複合聚合酶包括與該多聯體模板分子之第一部分雜交的第一引子，由此形成第一結合複合物(例如，第一三元複合物)(例如，圖44-46)，且其中單一多價分子之至少第二核苷酸單元結合至包括雜交至多聯體模板分子之第二部分之第二引子的第二複合聚合酶，藉此形成第二結合複合物(例如，第二三元複合物) (例如圖44至46)，其中該接觸在適合於抑制該第一及第二結合複合物中該結合之第一及第二核苷酸單元的經聚合酶催化之併入的條件下進行，且其中結合至同一多價分子之第一及第二結合複合物形成親合力複合物(例如，圖47)；及(c)偵測同一多聯體模板分子上之第一及第二結合複合物，及(d)鑑別第一結合複合物中之第一核苷酸單元，由此確定多聯體模板分子之第一部分的序列，及鑑別該第二結合複合物中之該第二核苷酸單元，從而確定該多聯體模板分子之該第二部分的序列。在一些實施例中，複數個DNA聚合酶包含本文所描述之任何突變聚合酶。多聯體模板分子包含所關注序列之串聯重複序列及至少一個通用定序引子結合位點。複數個核酸引子可沿著多聯體模板分子結合至定序引子結合位點。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，複數個第一複合聚合酶與複數個多價分子之結合形成至少一個親合力複合物，該方法包含以下步驟：(a)使第一核酸引子、第一DNA聚合酶及第一多價分子結合至第一模板分子，藉此形成第一結合複合物，其中該第一多價分子之第一核苷酸單元結合至該第一DNA聚合酶；以及(b)使第二核酸引子、第二DNA聚合酶及第一多價分子結合至第二模板分子，藉此形成第二結合複合物，其中該第一多價分子之第二核苷酸單元結合至該第二DNA聚合酶，其中包括相同多價分子之該第一及第二結合複合物形成親合力複合物。在一些實施例中，第一聚合酶包含本文所描述之任何野生型或突變聚合酶。在一些實施例中，第二聚合酶包含本文所描述之任何野生型或突變聚合酶。在一些實施例中，第一模板分子及第二模板分子係經殖株擴增之模板分子。在一些實施例中，第一模板分子及第二模板分子彼此緊密靠近地定位。舉例而言，經殖株擴增之第一模板分子及第二模板分子包含線性模板分子，其係經由橋式擴增產生且固定至支撐物上之相同定位或特徵。第一模板分子及第二模板分子包含所關注序列及至少一個通用定序引子結合位點。第一核酸引子第二核酸引子可分別結合至第一模板分子及第二模板分子上之定序引子結合位點。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，該方法包括複數個第一複合聚合酶與複數個多價分子結合以形成至少一個親合力複合物，該方法包含以下步驟：在適合於將來自該複數個之單個多價分子結合至該第一複合聚合酶及該第二複合聚合酶之條件下， ( a )使複數個DNA聚合酶及複數個核酸引子(其包括第一及第二引子)與第一及第二模板分子接觸，以分別在第一及第二模板分子上形成至少第一及第二複合聚合酶； ( b )使複數個多價分子與該至少第一及第二複合聚合酶接觸，其中該單個多價分子之至少第一核苷酸單元結合至包括與該第一模板分子雜交之第一引子的該第一複合聚合酶，由此形成第一結合複合物(例如，第一三元複合物)，且其中該單個多價分子之至少第二核苷酸單元結合至包括雜交至第二模板分子之第二引子的第二複合聚合酶，由此形成第二結合複合物(例如，第二三元複合物)，其中該接觸係在適合於抑制第一及第二結合複合物中之結合之第一及第二核苷酸單元的聚合酶催化之併入的條件下進行，且其中結合至相同多價分子之第一及第二結合複合物形成親合力複合物；及 ( c )分別偵測第一及第二模板分子上之第一及第二結合複合物，及 ( d )鑑別第一結合複合物中之第一核苷酸單元，藉此確定第一模板分子之序列，且鑑別第二結合複合物中之第二核苷酸單元，藉此測定第二模板分子之序列。在一些實施例中，複數個DNA聚合酶包含本文所描述之任何野生型或突變聚合酶。第一模板分子及第二模板分子係經殖株擴增之模板分子。在一些實施例中，第一模板分子及第二模板分子彼此緊密靠近地定位。舉例而言，經殖株擴增之第一模板分子及第二模板分子包含線性模板分子，其係經由橋式擴增產生且固定至支撐物上之相同定位或特徵。第一模板分子及第二模板分子包含所關注序列及至少一個通用定序引子結合位點。第一核酸引子第二核酸引子可分別結合至第一模板分子及第二模板分子上之定序引子結合位點。
在一些實施例中，用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法進一步包含步驟(e)：解離複數個多價-複合聚合酶並移除複數個第一突變型DNA聚合酶及其結合之多價分子，且保留複數個核酸雙螺旋體。
在一些實施例中，用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法進一步包含步驟 (f)：使步驟(e)的複數個保留之核酸雙螺旋體與複數個第二重組突變型DNA聚合酶接觸，其中該接觸係在適於該複數個第二突變型DNA聚合酶與該複數個保留之核酸雙螺旋體結合，由此形成複數個第二複合聚合酶的條件下進行，該複數個第二複合聚合酶各自包含結合核酸雙螺旋體之第二突變型DNA聚合酶。在一些實施例中，第二突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，第二突變聚合酶係重組聚合酶。在一些實施例中，第二突變聚合酶包括賦予核酸外切酶負活性之胺基酸取代。在一些實施例中，第二突變聚合酶相比於具有對應野生型胺基酸主鏈序列之聚合酶(例如，SEQ ID NOS:1、2、1714或2789-2793中之任一者)展現出所需特徵。舉例而言，第二突變聚合酶展現出增加之熱穩定性(Tm)。在另一實例中，第二突變聚合酶展現增加的在糖2'位置處及/或在3'糖位置處包含鏈終止部分(例如封端部分)之核苷酸類似物的併入比率。在另一實例中，第二突變聚合酶展現增加之尿嘧啶耐受性。
在一些實施例中，步驟(a)之複數個第一突變聚合酶具有與步驟(f)之複數個第二突變聚合酶之胺基酸序列100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，步驟(a)之複數個第一突變聚合酶具有與步驟(f)之複數個第二突變聚合酶的胺基酸序列不同之胺基酸序列。
在一些實施例中，用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法進一步包含步驟 (g)：使複數個第二複合聚合酶與複數個核苷酸接觸，其中該接觸係在適於來自該複數個核苷酸之互補核苷酸與該等第二複合聚合酶中之至少兩者結合之條件下進行，由此形成複數個核苷酸-複合聚合酶。在一些實施例中，步驟(g)之接觸係在適於促進經結合之互補核苷酸併入核苷酸-複合聚合酶之引子中，由此形成複數個核苷酸-複合聚合酶的條件下進行。在一些實施例中，步驟(g)中將核苷酸併入引子之3'端中包含引子延伸反應。在一些實施例中，步驟(g)之接觸係在至少一個選自由以下組成之群的陽離子存在下進行：鍶、鋇、鈉、鎂、鉀、錳、鈣、鋰、鎳及鈷。在一些實施例中，步驟(g)之接觸係在鎂及/或錳存在下進行。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含天然核苷酸(例如非類似物核苷酸)或核苷酸類似物。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含可移除或不可移除之2'及/或3'鏈終止部分。在一些實施例中，該複數個核苷酸包含複數個用可偵測之報導體部分標記之核苷酸。可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，螢光團連結至核苷酸鹼基。在一些實施例中，螢光團用連接子連結至核苷酸鹼基，該連接子可自鹼基裂解/移除或不可自鹼基移除。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸未用可偵測之報導體部分標記。在一些實施例中，複數個核苷酸未經標記。在一些實施例中，連結至核苷酸之特定可偵測之報導體部分(例如螢光團)可對應於核苷酸鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許偵測及鑑別核苷酸鹼基。在一些實施例中，個別經標記之核苷酸包含連接至磷酸酯鏈中之離去磷酸酯基中之一者的螢光團，或螢光團可藉由可自鹼基裂解/移除之連接子連接至核苷酸鹼基。在一些實施例中，當螢光團附接至核苷酸鹼基時，在併入經標記之核苷酸之後，分裂連接子以移除螢光團產生經延伸股，其具有產生瘢痕之其餘的至少一部分連接子。在一些實施例中，當複數個核苷酸包含未經標記之核苷酸時，併入未經標記之核苷酸產生缺少瘢痕之經延伸股。
在一些實施例中，用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法進一步包含步驟 (h)：偵測併入核苷酸至複合聚合酶之引子中的互補核苷酸。在一些實施例中，該複數個核苷酸用可偵測之報導體部分標記以允許偵測。在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，偵測步驟被省略。
在一些實施例中，用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法進一步包含步驟 (i)：鑑別併入核苷酸-複合聚合酶之引子中的互補核苷酸之鹼基。在一些實施例中，步驟(i)中併入之互補核苷酸的鑑別可用於確認在步驟(d)中結合至複數個第一複合聚合酶的多價分子之互補核苷酸的身分。在一些實施例中，步驟(i)之鑑別可用於確定核酸模板分子之序列。在一些實施例中，在確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，鑑別步驟被省略。
在一些實施例中，用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法進一步包含步驟 (j)：當步驟(g)係藉由使複數個第二複合聚合酶與包含至少一個具有2'及/或3'鏈終止部分之核苷酸的複數個核苷酸接觸來進行時，自併入之核苷酸移除該鏈終止部分。
在一些實施例中，用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法進一步包含步驟 (k)：重複步驟(a)-(j)至少一次。在一些實施例中，核酸模板分子之序列可藉由在步驟(c)及(d)偵測及鑑別結合突變聚合酶但未併入引子3'端中的多價分子來確定在一些實施例中，核酸模板分子之序列可藉由在步驟(h)及(i)偵測及鑑別併入引子3'端中之核苷酸來確定(或確認)。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟 ( b )之複數個多價分子中之至少一個多價分子包含：(1)核心；及(2)複數個核苷酸臂，其包含(i)核心連接部分、(ii)間隔子(例如，包含PEG部分)、(iii)連接子及(iv)核苷酸單元，其中該核心連接至該複數個核苷酸臂，其中該間隔子連接至該連接子，其中該連接子連接至該核苷酸單元。在一些實施例中，核苷酸單元包含鹼基、糖及至少一個磷酸酯基，且連接子經由鹼基連結至核苷酸單元。在一些實施例中，該連接子包含脂族鏈或寡聚乙二醇鏈，其中兩個連接子鏈均具有2-6個次單元。在一些實施例中，連接子亦包括芳族部分。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(b)之複數個多價分子中之個別多價分子包含連接至多個核苷酸臂之核心，且其中多個核苷酸臂具有選自由以下組成之群的相同類型之核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(b)之至少一個多價分子的核苷酸單元包含芳族鹼基、五碳糖(例如，核糖或去氧核糖)及一或多個磷酸酯基(例如，1至10個磷酸酯基)。複數個多價分子可包含一種類型之多價分子，其具有一種類型之選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。複數個多價分子可包含兩種或更多種類型之多價分子的任何組合之混合物，其中混合物中之個別多價分子包含選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(b)之複數個多價分子中的至少一個多價分子包含具有含一個、兩個或三個磷原子之鏈的核苷酸單元其中該鏈通常經由酯磷醯胺鍵聯連結至糖部分之5'碳。在一些實施例中，至少一個核苷酸單元係具有磷鏈之核苷酸類似物，在該磷鏈中，磷原子與插入之O、S、NH、亞甲基或伸乙基連接在一起。在一些實施例中，鏈中之磷原子包括經取代之側基，包括O、S或BH 3。在一些實施例中，該鏈包括經包括胺基磷酸酯基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基及O-甲基胺基磷酸酯基在內之類似物取代的磷酸酯基。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(b)之複數個多價分子中的個別多價分子包含連結至多個核苷酸臂之核心，且其中個別核苷酸臂包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之核苷酸單元。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(b)之複數個多價分子中的至少一個多價分子包含核苷酸單元，其包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分可在引子延伸反應期間抑制聚合酶催化的新生股中後續核苷酸單元或游離核苷酸之併入。在一些實施例中，鏈終止部分連結至3'糖羥基位置，其中該糖包含核糖或去氧核糖糖部分。在一些實施例中，鏈終止部分可自3'糖羥基位置移除/裂解以產生具有3'OH糖基團的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸併入反應中以後續核苷酸延伸。在一些實施例中，鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基。在一些實施例中，鏈終止部分可自核苷酸單元可裂解/移除，例如藉由使鏈終止部分與化學劑、pH改變、光或熱反應。在一些實施例中，鏈終止部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，鏈終止部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，鏈終止部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，鏈終止部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，鏈終止部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。在一些實施例中，鏈終止部分可用亞硝酸裂解/移除。在一些實施例中，鏈終止部分可使用包含亞硝酸鹽，諸如包含亞硝酸鹽與酸(諸如乙酸、硫酸或硝酸)之組合的溶液裂解/移除。在一些其他實施例中，該溶液可包含有機酸。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(b)之複數個多價分子中的至少一個多價分子包含核苷酸單元，其包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-O-疊氮基或3'-O-疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。在一些實施例中，包含3'-O-胺基、3'-O-胺基甲基、3'-O-甲基胺基或其衍生物中之一或多者的鏈終止部分可用亞硝酸，經由利用亞硝酸或使用包含亞硝酸之溶液的機制裂解。在一些實施例中，包含3'-O-胺基、3'-O-胺基甲基、3'-O-甲基胺基或其衍生物中之一或多者的鏈終止部分可使用包含亞硝酸鹽之溶液裂解。在一些實施例中，例如，亞硝酸鹽可與酸組合或與酸接觸，該酸諸如為乙酸、硫酸或硝酸。在一些其他實施例中，例如，亞硝酸鹽可與有機酸組合或與有機酸接觸，該有機酸諸如為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸或類似物。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-縮醛部分，其可經鈀脫除阻隔基試劑(例如，Pd(0))裂解。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(b)之複數個多價分子的至少一個多價分子包含具有鏈終止部分之核苷酸單元，該鏈終止部分係選自由以下組成之群：3'-脫氧核苷酸、2',3'-雙脫氧核苷酸、3'-甲基、3'-疊氮基、3'-疊氮基甲基、3'-O-疊氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-胺基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺醯基、3'-丙二醯基、3'-胺基、3'-O-胺基、3'-巰基、3'-胺基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-三級丁基、3'-茀基甲氧基羰基、3'三級丁氧基羰基、3'-O-烷基羥胺基、3'-硫代磷酸酯、3'-O-苯甲基及3'-縮醛部分或其衍生物。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟 ( b )之複數個多價分子中的至少一個多價分子包含連接至多個核苷酸臂之核心，其中該等核苷酸臂包含間隔子、連接子及核苷酸單元，且其中該核心、連接子及/或核苷酸單元用可偵測報導體部分標記。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，連結至多價分子之特定可偵測之報導體部分(例如螢光團)可對應於核苷酸單元之鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許偵測及鑑別核苷酸鹼基。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟 (b)之複數個多價分子中之多價分子的至少一個核苷酸臂具有連結至可偵測之報導體部分的核苷酸單元。在一些實施例中，可偵測之報導體部分連結至核苷酸鹼基。在一些實施例中，可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，連結至多價分子之特定可偵測之報導體部分(例如螢光團)可對應於核苷酸單元之鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許偵測及鑑別核苷酸鹼基。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟 (b)之多價分子的核心包含抗生物素蛋白樣部分且核心連結部分包含生物素。在一些實施例中，核心包含鏈黴抗生物素蛋白型或抗生物素蛋白型部分，其包括抗生物素蛋白，以及可結合到至少一個生物素部分的抗生物素蛋白之任何衍生物、類似物及其他非天然形式。抗生物素蛋白部分之其他形式包括天然及重組抗生物素蛋白及鏈黴抗生物素蛋白，以及衍生化之分子，例如未糖基化之抗生物素蛋白及截斷之鏈黴抗生物素蛋白。舉例而言，抗生物素蛋白部分包括抗生物素蛋白之去糖基化形式、由鏈黴菌(Streptomyces)(例如抗生蛋白鏈黴菌(Streptomyces avidinii))產生之細菌鏈黴抗生物素蛋白以及衍生化形式，例如N-醯基抗生物素蛋白，例如N-乙醯基抗生物素蛋白、N-苯二甲醯基抗生物素蛋白及N-琥珀醯基抗生物素蛋白，及可商購的產品ExtrAvidin™、Captavidin™、Neutravidin TM及Neutralite Avidin™。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(a)至(j)中之各者在選自約25℃至90℃之溫度範圍的溫度下進行。在一些實施例中，步驟(a)及(b)之接觸係在選自約25-90℃溫度範圍之恆定溫度(例如，等溫溫度)下進行。在一些實施例中，步驟(c)及(d)之偵測及鑑別係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度(例如等溫溫度)下進行。在一些實施例中，步驟(e)之解離係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度(例如等溫溫度)下進行。在一些實施例中，步驟(f)及(g)之接觸係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度(例如等溫溫度)下進行。在一些實施例中，步驟(h)及(i)之偵測及鑑別係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度(例如等溫溫度)下進行。在一些實施例中，步驟(j)之移除係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度(例如等溫溫度)下進行。在一些實施例中，步驟(a)-(j)係在選自約25-90℃之溫度範圍的恆定溫度(例如等溫溫度)下進行。
在一些實施例中，定序反應或結合分析可藉由將複數個螢光標記之多價分子結合至突變聚合酶來進行，且所得結合複合物與用對應野生型聚合酶或參考聚合酶進行相同定序反應或分析相比可展現出降低之錯誤率、降低之定相及/或改良之訊號強度。
在一些實施例中，用於進行定序反應或分析之突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-1713 (例如，RLF 89458.1或RLF 78286.1主鏈序列)中之任一者具有至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，用於進行定序反應或分析之突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1714-2787 (例如，NOZ 58130主鏈序列)中之任一者具有至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，用於進行定序反應或分析之突變聚合酶包含與SEQ ID NO: 2789 (例如，RMF 90817主鏈序列)中之任一者具有至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，用於進行定序反應或分析之突變聚合酶包含與SEQ ID NO: 2790 (例如，MBC 7218772主鏈序列)中之任一者具有至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，用於進行定序反應或分析之突變聚合酶包含與SEQ ID NO: 2791 (例如，WP 175059460主鏈序列)中之任一者具有至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，用於進行定序反應或分析之突變聚合酶包含與SEQ ID NO: 2792 (例如，KUO 42443主鏈序列)具有至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，用於進行定序反應或分析之突變聚合酶包含與SEQ ID NO: 2793 (例如，NOZ 77387主鏈序列)具有至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟 (g)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含鹼基、糖及至少一個磷酸酯基。在一些實施例中，複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含芳族鹼基、五碳糖(例如，核糖或去氧核糖)及一或多個磷酸酯基(例如，1至10個磷酸酯基)。複數個核苷酸可包含選自由以下組成之群的至少一種類型之核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。複數個核苷酸可在兩種或更多種類型之核苷酸的任何組合之混合物處包含選自由以下組成之群的核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸不為核苷酸類似物。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸包含核苷酸類似物。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(g)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含具有一個、兩個或三個磷原子之鏈，其中該鏈通常經由酯或磷醯胺鍵聯連結至糖部分之5'碳。在一些實施例中，複數個中之至少一個核苷酸係具有磷鏈之類似物，在該磷鏈中，磷原子與插入之O、S、NH、亞甲基或伸乙基連接在一起。在一些實施例中，鏈中之磷原子包括經取代之側基，包括O、S或BH 3。在一些實施例中，該鏈包括經包括胺基磷酸酯基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基及O-甲基胺基磷酸酯基在內之類似物取代的磷酸酯基。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(g)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分可在引子延伸反應期間抑制聚合酶催化的新生股中後續核苷酸單元或游離核苷酸之併入。在一些實施例中，鏈終止部分連結至3'糖羥基位置，其中該糖包含核糖或去氧核糖糖部分。在一些實施例中，鏈終止部分可自3'糖羥基位置移除/裂解以產生具有3'OH糖基團的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸併入反應中以後續核苷酸延伸。在一些實施例中，鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基、矽基或縮醛基。在一些實施例中，鏈終止部分係可例如藉由使鏈終止部分化學試劑反應、pH變化、光或熱而自核苷酸裂解/移除的。在一些實施例中，鏈終止部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，鏈終止部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，鏈終止部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，鏈終止部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，鏈終止部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。在一些實施例中，鏈終止部分可用亞硝酸裂解/移除。在一些實施例中，鏈終止部分可使用包含亞硝酸鹽，諸如包含亞硝酸鹽與酸(諸如乙酸、硫酸或硝酸)之組合的溶液裂解/移除。在一些其他實施例中，該溶液可包含有機酸。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(g)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含在糖2'位置處、在糖3'位置處或在糖2'及3'位置處具有鏈終止部分(例如封端部分)之終止劑核苷酸類似物。在一些實施例中，鏈終止部分包含疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-O-疊氮基或3'-O-疊氮基甲基。在一些實施例中，鏈終止部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。在一些實施例中，包含3'-O-胺基、3'-O-胺基甲基、3'-O-甲基胺基或其衍生物中之一或多者的鏈終止部分可用亞硝酸，經由利用亞硝酸或使用包含亞硝酸之溶液的機制裂解。在一些實施例中，包含3'-O-胺基、3'-O-胺基甲基、3'-O-甲基胺基或其衍生物中之一或多者的鏈終止部分可使用包含亞硝酸鹽之溶液裂解。在一些實施例中，例如，亞硝酸鹽可與酸組合或與酸接觸，該酸諸如為乙酸、硫酸或硝酸。在一些實施例中，鏈終止部分包含3'-縮醛部分，其可經鈀脫除阻隔基試劑(例如，Pd(0))裂解。在一些其他實施例中，例如，亞硝酸鹽可與有機酸組合或與有機酸接觸，該有機酸諸如為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸或類似物。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟 ( g )之複數個核苷酸的至少一個核苷酸包含鏈終止部分，其係選自由以下組成之群：3'-脫氧核苷酸、2',3'-雙脫氧核苷酸、3'-甲基、3'-疊氮基、3'-疊氮基甲基、3'-O-疊氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-胺基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺醯基、3'-丙二醯基、3'-胺基、3'-O-胺基、3'-巰基、3'-胺基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-三級丁基、3'-茀基甲氧基羰基、3'三級丁氧基羰基、3'-O-烷基羥胺基、3'-硫代磷酸酯、3'-O-苯甲基及3'-縮醛部分或其衍生物。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(g)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含可偵測之報導體部分(例如至少一個經標記之核苷酸)。可偵測之報導體部分包含螢光團。在一些實施例中，螢光團連結至核苷酸鹼基。在一些實施例中，螢光團用連接子連結至核苷酸鹼基，該連接子可自鹼基裂解/移除。在一些實施例中，該複數個中之至少一個核苷酸未用可偵測之報導體部分標記。在一些實施例中，連結至核苷酸之特定可偵測之報導體部分(例如螢光團)可對應於核苷酸鹼基(例如dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允許偵測及鑑別核苷酸鹼基。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟(g)之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含鹼基上之可裂解連接子，其包含具有以下之可裂解(例如，可移除)部分：烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基。在一些實施例中，鹼基上之可裂解連接子可藉由可裂解部分與化學試劑反應、pH變化、光或熱而自鹼基裂解/移除。在一些實施例中，可裂解部分烷基、烯基、炔基及烯丙基可用(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh 3) 4)、用哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些實施例中，可裂解部分芳基及苯甲基可用H2 Pd/C裂解。在一些實施例中，可裂解部分胺、醯胺、酮基、異氰酸酯、磷酸酯、硫基、二硫基團可用膦或用包括β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)在內之硫醇基裂解。在一些實施例中，可裂解部分碳酸酯可用在MeOH中之碳酸鉀(K 2CO 3)、用在吡啶中之三乙胺或用在乙酸(AcOH)中之Zn裂解。在一些實施例中，可裂解部分脲及矽基可用氟化四丁銨、吡啶-HF、用氟化銨或用三氫氟化三乙胺裂解。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟 ( g )之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含鹼基上之可裂解連接子，其包含包括疊氮化物、疊氮基或疊氮基甲基之可裂解部分。在一些實施例中，可裂解部分疊氮化物、疊氮基及疊氮基甲基可用膦化合物裂解/移除。在一些實施例中，膦化合物包含衍生化之三烷基膦部分或衍生化之三芳基膦部分。在一些實施例中，膦化合物包含參(2-羧基乙基)膦(TCEP)或雙磺基三苯基膦(BS-TPP)或參(羥基丙基)膦(THPP)。在一些實施例中，裂解劑包含4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中，步驟 ( g )之複數個核苷酸中的至少一個核苷酸包含糖2'及/或糖3'位置上的鏈終止部分。在一些實施例中，糖上之鏈終止部分及鹼基上之可裂解連接子具有相同或不同可裂解部分。在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及連接至鹼基的可偵測之報導體部分可用相同化學試劑化學裂解/移除。在一些實施例中，鏈終止部分(例如在糖2'及/或糖3'位置處)及連接至鹼基的可偵測之報導體部分可用不同化學試劑化學裂解/移除。
在一些實施例中，在用於定序之方法中，結合複合物包含突變聚合酶、與引子形成雙螺旋之核酸模板分子及核苷酸反應劑。在一些實施例中，在包含形成結合複合物之定序方法中，其中該結合複合物包含(i)突變聚合酶、與引子形成雙螺旋之核酸模板分子及核苷酸，或該結合複合物包含(ii)突變聚合酶、與引子形成雙螺旋之核酸模板分子及多價分子之核苷酸單元。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-2787及2789-2793中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，結合複合物之存留時間大於約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1秒。在一些實施例中，結合複合物之持久性時間為1-30秒。該結合複合物之存留時間大於約0.1-0.25秒、或約0.25-0.5秒、或約0.5-0.75秒、或約0.75-1秒、或約1-2秒、或約2-3秒、或約3-4秒、或約4-5秒、或約5-10秒、或約10-30秒，及/或其中該方法係在或可在等於或高於15℃、等於或高於20℃、等於或高於25℃、等於或高於35℃、等於或高於37℃、等於或高於42℃、等於或高於55℃、等於或高於60℃、或等於或高於72℃、或等於或高於80℃或在任何前述所界定之範圍內的溫度下進行。在一些實施例中，結合複合物之存留時間可為大於1s、大於2s、大於3s、大於5s、大於10s、大於15s、大於20s、大於30s、大於60s、大於120s、大於360s、大於3600s或更久，或持續處於由此等值中之任何兩者或更多者定義之範圍內的時間。結合複合物(例如三元複合物)保持穩定，直至經歷引起聚合酶、模板分子、引子中的任一者及/或核苷酸單元或核苷酸之間之相互作用解離的條件。舉例而言，解離條件包含使結合複合物與洗滌劑、EDTA及/或水中之任一者或任何組合接觸。在一些實施例中，本發明提供該方法，其中該結合複合物係沈積於表面上、連結至表面或與表面雜交，該表面在偵測步驟中顯示出大於20之造影劑與雜訊比。在一些實施例中，本發明提供該方法，其中該接觸係在該核苷酸或核苷酸單元與該模板核酸之下一個鹼基互補時使該結合複合物穩定且在該核苷酸或核苷酸單元與該模板核酸之該下一個鹼基不互補時使該結合複合物不穩定的條件下執行。
在一些實施例中，在用於確定一或多個核酸模板分子之序列的方法中之任一者中，支撐物包含平面或非平面支撐物。支撐物可為固體或半固體。在一些實施例中，支撐物可為多孔、半多孔或無孔的。在一些實施例中，支撐物之表面可塗有一或多種化合物以在支撐物上產生鈍化層。在一些實施例中，鈍化層形成多孔或半多孔層。在一些實施例中，核酸引子、模板及/或聚合酶可連結至鈍化層以將引子、模板及/或聚合酶固定至支撐物。在一些實施例中，支撐物包含使得支撐物上之核酸雜交及擴增效能能夠改善之低非特異性結合表面。一般而言，支撐物可包含一或多層共價或非共價連接之較低結合的化學修飾層(例如，矽烷層)、聚合物膜及一或多個可用於將複數個核酸模板分子固定至支撐物的共價或非共價連接之寡核苷酸(例如，圖1)。在一些實施例中，支撐物可包含經由支撐物上之化學基團至少共價結合至支撐物之一部分的官能化聚合物塗層、移植至官能化聚合物塗層上之引子以及在該引子及該官能化聚合物塗層上之水溶性保護塗層。在一些實施例中，官能化聚合物塗層包含聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺(PAZAM)。在一些實施例中，支撐物包含具有至少一個親水性聚合物塗層之表面塗層及至少一層複數個寡核苷酸。親水性聚合物塗層可包含聚乙二醇(PEG)。親水性聚合物塗層可包含具有至少4個分支之分支PEG。在一些實施例中，低非特異性結合塗層具有可作為水接觸角量測之親水性程度，其中水接觸角不超過45度。在一些實施例中，固定至支撐物或固定至支撐物上之塗層的複數個第一複合聚合酶之密度係每平方毫米約10 2-10 6個、或每平方毫米約10 6-10 9個、或每平方毫米約10 9-10 12個。在一些實施例中，複數個第一複合聚合酶固定至支撐物或在該支撐物(或在支撐物上之塗層)上之預定位點處固定至支撐物上之塗層，或在該支撐物(或在該支撐物上之塗層)之隨機位點處固定至支撐物上之塗層。
在一些實施例中，用較低非特異性結合塗層鈍化支撐物。本文所描述之表面塗層展現出極低的與通常用於核酸捕捉、擴增及定序工作流程之試劑的非特異性結合，該等試劑諸如染料、核苷酸、酶及核酸引子。相比於習知表面塗層，表面塗層展現較低背景螢光訊號或較高對比度與噪聲比(CNR)。
較低非特異性結合塗層包含一個層或多個層。在一些實施例中，將複數個表面引子固定至較低非特異性結合塗層。在一些實施例中，至少一個表面引子嵌入於較低非特異性結合塗層內。較低非特異性結合塗層實現改良之核酸雜交及擴增效能。一般而言，支撐物包含基板(或支撐結構)、共價或非共價連接之較低結合化學改質層之一或多個層(例如，矽烷層、聚合物膜)及一或多個共價或非共價連接之表面引子，其可用於將單股核酸庫分子繫栓至支撐物(例如圖1)。在一些實施例中，塗層之調配物，例如一或多個層之化學組成；用於使一或多個層交聯至支撐物及/或彼此之偶合化學反應；及層之總數目可變化，使得蛋白質、核酸分子及其他雜交及擴增反應組分與塗層之非特異性結合相對於可比的單層降至最低或減少。本文所描述之塗層的調配物可變化，使得相對於可比單層，塗層上非特異性雜交降至最低或減小。表面之調配物可以變化，以使得基板表面上之非特異性擴增相對於可比較單層降至最低或減少。可改變塗層之調配物，使得使塗層上之特定擴增速率及/或產率最大化。在本文所揭示之一些情況下，在不超過2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或超過30次擴增循環中實現適用於偵測之擴增程度。
包含一或多個經化學修飾之層(例如低的非特異性結合聚合物層)之支撐結構可以為非依賴性的或整合至另一結構或組裝中。舉例而言，在一些實施例中，支撐結構可包含整合或組裝之微流體流通槽內的一或多個表面。支撐結構可包含微定量盤格式內之一或多個表面，例如微定量盤中之孔的底部表面。在一些實施例中，支撐結構包含毛細管之內表面(諸如，內腔表面)。在一些實施例中，支撐結構包含經蝕刻至平面晶片中之毛細管的內表面(諸如內腔表面)。
用於將第一化學改質之層接枝至支撐物之表面的附接化學方法將一般取決於製造表面之材料及層之化學性質兩者。在一些實施例中，第一層可共價附接至表面。在一些實施例中，第一層可非共價連接，例如經由在支撐物與第一層之分子組分之間的非共價相互作用，諸如靜電相互作用、氫鍵結或凡得瓦爾相互作用，吸附至支撐物。在任一情況下，支撐物可在第一層之附接或沈積之前經處理。熟習此項技術者已知之各種表面製備技術中之任一者可用於清潔或處理基板表面。舉例而言，玻璃或矽表面可以使用Piranha 溶液(硫酸(H 2SO 4)及過氧化氫(H 2O 2)之混合物)進行酸洗滌、在KOH和NaOH中進行鹼處理及/或使用氧電漿處理方法進行清潔。
矽烷化學反應構成用於共價改質玻璃或矽表面上之矽烷醇基團以使更多反應性官能基(例如，胺或羧基)連接之非限制性方法，其可隨後用於偶合鍵聯分子(例如，不同長度之線性烴分子，諸如C6、C12、C18烴或線性聚乙二醇(PEG)分子)或層分子(例如，分支PEG分子或其他聚合物)與表面之偶合。可用於形成所揭示之低結合塗層中之任一者的適合矽烷之實例包括但不限於(3-胺丙基)三甲氧基矽烷(APTMS)、(3-胺丙基)三乙氧基矽烷(APTES)、各種PEG-矽烷(例如，包含1K、2K、5K、10K、20K等之分子量)、胺基-PEG矽烷(亦即，包含游離胺基官能基)、順丁烯二醯亞胺-PEG矽烷、生物素-PEG矽烷中之任一者及其類似物。
熟習此項技術者已知之各種分子中之任一者(包括但不限於胺基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、其他單體或聚合物或其組合)可用於在支撐物上形成一或多個經化學修飾層，其中所用組分之選擇可以變化以改變一或多個層之特性，例如官能基及/或所繫留之寡核苷酸引子之表面密度、層之親水性/疏水性或層之三維性質(亦即，「厚度」)。可用於在任何所揭示之塗層中形成一或多層較低非特異性結合材料的聚合物之實例包括(但不限於)具有各種分子量及分支結構之聚乙二醇(PEG)、鏈黴抗生物素蛋白、聚丙烯醯胺、聚酯、聚葡萄糖、聚離胺酸及聚離胺酸共聚物，或其任何組合。可用於將一或多個材料層(例如，聚合物層)接枝至表面及/或使該等層彼此交聯之結合化學物質之實例包括但不限於生物素-鏈黴抗生物素蛋白相互作用(或其變化形式)、His標籤-Ni/NTA結合化學物質、甲氧基醚結合化學物質、羧酸酯結合化學物質、胺結合化學物質、NHS酯、順丁烯二醯亞胺、硫醇、環氧樹脂、疊氮化物、醯肼、炔烴、異氰酸酯及矽烷。
較低非特異性結合表面塗層可均勻地施加在整個支撐物上。或者，表面塗層可經圖案化，使得化學改性層受限於支撐物之一或多個離散區域。舉例而言，塗層可使用光微影技術圖案化以在支撐物上產生經化學改質之區域的有序陣列或隨機圖案。替代地或組合地，塗層可以使用例如接觸印刷及/或噴墨印刷技術圖案化。在一些實施例中，經化學改質之區域的有序陣列或隨機圖案可至少包含1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000或更多個離散區域。
在一些實施例中，較低非特異性結合塗層包含非特異性吸附或共價接枝於支撐物之親水性聚合物。通常，利用聚(乙二醇) (PEG，亦稱為聚氧化乙烯(PEO)或聚氧化乙烯)或其他具有不同分子量及端基之親水性聚合物進行鈍化，該等親水性聚合物使用例如矽烷化學連接至支撐物。遠離表面之端基可包括但不限於生物素、甲氧基醚、羧酸酯、胺、NHS酯、順丁烯二醯亞胺及雙矽烷。在一些實施例中，親水性聚合物，例如直鏈聚合物、分支鏈聚合物或多分支鏈聚合物之兩層或更多層可沈積在表面上。在一些實施例中，兩個或更多個層可彼此共價耦合或內部交聯以改良所得塗層之穩定性。在一些實施例中，可以各種表面密度將具有不同核苷酸序列及/或鹼基修飾(或其他生物分子，例如酶或抗體)的表面引子繫栓至所得層。在一些實施例中，舉例而言，表面官能基密度及表面引子濃度可變化以獲得所需表面引子密度範圍。另外，可藉由用攜帶相同官能基之其他分子稀釋表面引子來控制表面引子密度。舉例而言，經胺標記之表面引子可以在與經NHS酯塗佈之表面之反應中用經胺標記之聚乙二醇稀釋以降低最終引子密度。亦可應用在雜交區域與表面附接官能基之間具有不同長度之連接子的表面引子以控制表面密度。適合連接子之實例在引子(例如，0至20個鹼基)、PEG連接子(例如，3至20個單體單元)及碳鏈(例如，C6、C12、C18等)之5'端處包括聚-T及聚-A股。為量測引子密度，螢光標記之引子可以繫留至表面，且隨後將螢光讀數與已知濃度之染料溶液之螢光讀數進行比較。
在一些實施例中，較低非特異性結合塗層包含經由支撐物上之化學基團共價鍵結至少部分支撐物之官能化聚合物塗層、接枝於官能化之聚合物塗層的引子，及引子及官能化之聚合物塗層上之水溶性保護性塗層。在一些實施例中，官能化聚合物塗層包含聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺(PAZAM)。
為衡量引子表面密度及將額外維度添加至親水性或兩性塗層，已開發出包含多層PEG及其他親水性聚合物塗層之支撐物。藉由使用親水性及兩性表面成層途徑，其包括但不限於下文所描述之聚合物/共聚物材料，有可能顯著增加支撐物上之引子負載密度。傳統PEG塗佈途徑使用單層引子沈積，其通常已報導用於單分子應用，但不產生核酸擴增應用之高複本數。如本文所描述之「成層」可以使用利用任何相容性聚合物或單體子單元之傳統交聯途徑實現，以使得可以依序建構包含兩個或更多個高度交聯層之表面。適合聚合物之實例包括但不限於鏈黴抗生物素蛋白、聚丙烯醯胺、聚酯、聚葡萄糖、聚離胺酸及聚離胺酸及PEG之共聚物。在一些實施例中，不同層可以藉由各種結合反應中之任一者彼此附接，該等結合反應包括但不限於生物素-鏈黴抗生物素蛋白結合、疊氮化物-炔烴點擊反應、胺-NHS酯反應、硫醇-順丁烯二醯亞胺反應及帶正電聚合物與帶負電聚合物之間之離子相互作用。在一些實施例中，高引子密度材料可以在溶液中構築且在多個步驟中隨後分層至表面上。
支撐結構可以自其製造之材料之實例包括但不限於玻璃、熔融二氧化矽、矽、聚合物(例如，聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、環烯烴聚合物(COP)、環烯烴共聚物(COC)、聚對苯二甲酸伸乙酯(PET))或其任何組合。涵蓋玻璃及塑膠支撐物結構兩者之各種組合物。
支撐結構可以熟習此項技術者已知之各種幾何結構及尺寸中之任一者呈現，且可包含熟習此項技術者已知之各種材料中之任一者。舉例而言，支撐結構可為局部平面(例如，包含顯微鏡載片或顯微鏡載片之表面)。總體地，支撐結構可以為圓柱形的(例如，包含毛細血管或毛細血管內表面)、球形的(例如，包含無孔珠粒外表面)或不規則的(例如，包含不規則形狀、無孔珠粒或粒子之外表面)。在一些實施例中，用於核酸雜交及擴增之支撐結構的表面可為固體無孔表面。在一些實施例中，用於核酸雜交及擴增之支撐結構的表面可為多孔的，使得本文所描述之塗層穿透多孔表面，且在其上進行之核酸雜交及擴增反應可在孔內進行。
包含一或多個經化學修飾之層(例如低的非特異性結合聚合物層)之支撐結構可以為非依賴性的或整合至另一結構或組裝中。舉例而言，支撐結構可包含整合或組裝之微流體流通槽內之一或多個表面。支撐結構可包含微定量盤格式內之一或多個表面，例如微定量盤中之孔的底部表面。在一些實施例中，支撐結構包含毛細管之內表面(諸如，內腔表面)。在一些實施例中，支撐結構包含經蝕刻至平面晶片中之毛細管的內表面(諸如內腔表面)。
如所指出，本發明之低的非特異性結合基板呈現用於固相核酸擴增之雜交及/或擴增調配物之蛋白質、核酸及其他組分之非特異性結合減少。藉由給定基板表面呈現之非特異性結合之程度可以定性或定量地評定。舉例而言，在標準化條件組中使表面曝露於螢光染料(例如，諸如Cy3或Cy5等之氰化物、螢光素、香豆素、若丹明等或本文所揭示之其他染料)、螢光標記之核苷酸、螢光標記之寡核苷酸及/或螢光標記之蛋白質(例如，聚合酶)，接著指定沖洗方案及螢光成像可用作定性比較工具以用於在支撐物上比較包含不同表明調配物之非特異性結合。在一些實施例中，在一組標準化條件下，使表面暴露於螢光染料、螢光標記之核苷酸、螢光標記之寡核苷酸及/或螢光標記之蛋白質(例如聚合酶)，接著指定沖洗方案，且螢光成像可用作用於比較包含不同表面調配物之支撐物上的非特異性結合之定量工具，其限制條件為小心確保螢光成像在螢光訊號與支撐表面上之螢光團數目線性相關(或以可預測方式相關)的條件下(例如，在螢光團之訊號飽和及/或自淬滅不是問題的條件下)執行且使用適合之校準標準。在一些實施例中，熟習此項技術者已知之其他技術，例如放射性同位素標記及計數法可用於定量評定藉由本發明之不同基板表面調配物呈現非特異性結合之程度。
本文所揭示之一些表面呈現諸如Cy3之螢光團之特異性與非特異性結合之比為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大於100，或橫跨本文中之範圍之任何中間值。本文所揭示之一些表面呈現諸如Cy3之螢光團之特異性與非特異性螢光之比為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大於100，或橫跨本文中之範圍之任何中間值。
針對在一組標準化培育及沖洗條件下使表面與經標記蛋白質(例如，牛血清白蛋白(BSA)、鏈黴抗生物素蛋白、DNA聚合酶、逆轉錄酶、解螺旋酶、單股結合蛋白(SSB)等或其任何組合)、經標記核苷酸、經標記寡核苷酸等接觸，繼之以偵測殘留在表面上之標記之量及比較自其所獲得之訊號與適當的校準標準物，由所揭示之低結合基板呈現之非特異性結合程度可以使用標準化方案評定。在一些實施例中，標記可包含螢光標記。在一些實施例中，標記物可包含放射性同位素。在一些實施例中，標記可包含熟習此項技術者已知之任何其他可偵測標記。在一些實施例中，給定支撐表面調配物所展現之非特異性結合程度可因此根據每單位面積非特異性結合之蛋白質分子(或核酸分子或其他分子)的數目加以評估。在一些實施例中，本發明之較低結合支撐物可展現出低於0.001個分子/μm 2、低於0.01個分子/μm 2、低於0.1個分子/μm 2、低於0.25個分子/μm 2、低於0.5個分子/μm 2、低於1個分子/μm 2、低於10個分子/μm 2、低於100個分子/μm 2或低於1,000個分子/μm 2之非特異性蛋白質結合(或其他指定分子之非特異性結合(例如，諸如Cy3或Cy5等之氰化物、螢光素、香豆素、若丹明等或本文所揭示之其他染料))。熟習此項技術者將認識到，本發明之給定支撐表面可以呈現非特異性結合在此範圍之任何位置內，例如低於86個分子/µm 2。舉例而言，在與經Cy3標記之鏈黴抗生物素蛋白(GE Amersham)於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)緩衝液中之1 uM溶液接觸15分鐘，繼之以用去離子水沖洗3次之後，本文所揭示之一些經修飾之表面呈現非特異性蛋白質結合低於0.5個分子/um 2。本文所揭示之一些經修飾之表面呈現Cy3染料分子之非特異性結合低於0.25個分子/µm 2。在非依賴型非特異性結合分析中，將1 μM標記之Cy3 SA (ThermoFisher)、1 μM Cy5 SA染料(ThermoFisher)、10 μM胺基烯丙基-dUTP-ATTO-647N (Jena Biosciences)、10 μM胺基烯丙基-dUTP-ATTO-Rhol 1 (Jena Biosciences)、10 μM胺基烯丙基-dUTP-ATTO-Rhol 1 (Jena Biosciences)、10 μM 7-炔丙基胺基-7-去氮-dGTP-Cy5 (Jena Biosciences)及10 μM 7-炔丙基胺基-7-去氮-dGTP-Cy3 (Jena Biosciences)在低結合塗佈之支撐物上在37℃下在384孔盤格式中培育15分鐘。各孔用50 ul無去離子RNase/DNase自由水沖洗2-3次，且用25 mM ACES緩衝液pH 7.4沖洗2-3次。384孔盤使用Cy3、AF555或Cy5過濾器組(根據進行之染料測試)如製造商在800之PMT增益設置及50-100 μm之解析度下所規定在GE Typhoon儀器上成像。對於更高解析度成像，在具有全內反射螢光(TIRF)物鏡(100×，1.5 NA，Olympus)、CCD相機(例如，Olympus EM-CCD單色相機、Olympus XM-10單色相機或Olympus DP80彩色及單色相機)、照明源(例如，Olympus 100W Hg燈、Olympus 75W Xe燈或Olympus U-HGLGPS螢光光源)且激勵波長為532 nm或635 nm之Olympus IX83顯微鏡(例如，反向螢光顯微鏡)(Olympus Corp., Center Valley, PA)上收集影像。二向色鏡係購自(IDEX Health & Science, LLC, Rochester, New York)，例如405、488、532或633 nm二向色反射器/分束器及帶通濾光片選為與適當激勵波長一致之532 LP或645 LP。本文所揭示之一些經修飾之表面呈現染料分子之非特異性結合低於0.25個分子/µm 2。在一些實施例中，將經塗佈支撐物浸入緩衝液(例如25 mM ACES，pH 7.4)中同時獲取圖像。
在一些實施例中，本文所揭示之表面呈現諸如Cy3之螢光團之特異性與非特異性結合之比為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大於100，或橫跨本文中之範圍之任何中間值。在一些實施例中，本文所揭示之表面呈現諸如Cy3之螢光團之特異性與非特異性螢光訊號的比為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大於100，或橫跨本文中之範圍之任何中間值。
與本文之揭示內容一致之低背景表面可以呈現特異性染料附接(例如，Cy3附接)與非特異性染料吸附(例如，Cy3染料吸收)之比為至少4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1，或每個非特異性吸附之分子超過50個所附接之特異性染料分子。類似地，當經歷激發能量時，例如Cy3之螢光團已與其附接之與本文之揭示內容一致的低背景表面可以呈現特異性螢光訊號(例如，由附接至表面之經Cy3標記之寡核苷酸產生)與非特異性吸附之染料螢光訊號之比為至少4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1或超過50:1。
在一些實施例中，所揭示之支撐表面之親水度(或與水溶液之「可濕性」)可以例如藉由量測水接觸角評定，其中將小的水液滴置放於表面上且使用例如光學張力計來量測其與表面接觸之角度。在一些實施例中，可以測定靜態接觸角。在一些實施例中，可以測定前進或後退接觸角。在一些實施例中，本文所揭示之親水性低結合支撐物表面的水接觸角可以在約0度至約30度之範圍內。在一些實施例中，本文所揭示之親水性低結合支撐物表面之水接觸角可以不超過50度、40度、30度、25度、20度、18度、16度、14度、12度、10度、8度、6度、4度、2度或1度。在許多情況下，接觸角不超過40度。熟習此項技術者將認識到，本發明之給定親水性低結合支撐物表面可展現之水接觸角具有在此範圍內之任何處的值。
在一些實施例中，通常由於生物分子與低結合表面之非特異性結合減少，本文所揭示之親水性表面有助於減少生物分析之洗滌時間。在一些實施例中，足夠的洗滌步驟可以在少於60、50、40、30、20、15、10或少於10秒內進行舉例而言，可在低於30秒內進行充分洗滌步驟。
本發明之一些低結合表面呈現對長時間暴露於溶劑及高溫或溶劑暴露之重複循環或溫度變化之穩定性或耐久性顯著改善。舉例而言，在一些情形下，所揭示之表面之穩定性可以藉由螢光標記表面上之官能基或表面上之所繫留之生物分子(例如，寡核苷酸引子)及在長時間暴露於溶劑及高溫或溶劑暴露或溫度變化之重複循環之前、期間及之後監測螢光訊號進行測試。在一些實施例中，用於評估表面品質之螢光的改變程度可經1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、15小時、20小時、25小時、30小時、35小時、40小時、45小時、50小時或100小時暴露於溶劑及/或高溫之時段(或此等百分比之任何組合，如在此等時段內量測)小於1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%或25%。在一些實施例中，用於評定表面質量之螢光變化程度可以在重複暴露於溶劑變化及/或溫度變化之5次循環、10次循環、20次循環、30次循環、40次循環、50次循環、60次循環、70次循環、80次循環、90次循環、100次循環、200次循環、300次循環、400次循環、500次循環、600次循環、700次循環、800次循環、900次循環或1,000次循環內低於1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%或25%(或如在此循環範圍內量測之此等百分比之任何組合)。
在一些實施例中，本文所揭示之表面可以呈現特異性訊號與非特異性訊號或其他背景之比率較高。舉例而言，當用於核酸擴增時，一些表面可以呈現擴增訊號比表面之相鄰非密集區域之訊號大至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍或超過100倍。類似地，一些表面呈現擴增訊號比表面之相鄰經擴增核酸群體區域之訊號大至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍或超過100倍。
在一些實施例中，所揭示之低背景表面的螢光影像在用於核酸雜交或擴增應用中以產生雜交或殖株擴增之核酸分子的聚合酶群落(例如，其已經用螢光團直接或間接標記)時展現至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、210、220、230、240、250或超過250之對比度與噪聲比(CNR)。
一或多種類型之引子可連接或繫栓至支撐表面。在一些實施例中，一或多種類型之銜接子或引子可包含間隔序列、用於雜交至銜接子接合之目標庫核酸序列的銜接序列、正向擴增引子、反向擴增引子、定序引子及/或分子條形碼序列或其任何組合。在一些實施例中，1個引子或銜接子序列可以繫留至表面之至少一個層。在一些實施例中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10個不同引子或銜接子序列可繫栓至至少一個表面層。
在一些實施例中，經繫栓銜接子及/或引子序列之長度可在約10個核苷酸至約100個核苷酸之範圍內。在一些實施例中，所繫留之轉接子及/或引子序列之長度可以為至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個核苷酸。在一些實施例中，所繫留之轉接子及/或引子序列之長度可以為至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20或至多10個核苷酸。此段落中所描述之下限值及上限值中之任一者可經組合以形成包括於本發明內之範圍，例如在一些實施例中，所繫留之轉接子及/或引子序列之長度可在約20個核苷酸至約80個核苷酸範圍內。熟習此項技術者將認識到所繫留之轉接子及/或引子序列之長度之任何值可在此範圍內，例如約24個核苷酸。
在一些實施例中，本發明之較低結合支撐物表面上引子(例如，捕獲引子)的所得表面密度可在約100個引子分子/μm 2至約100,000個引子分子/μm 2範圍內。在一些實施例中，本發明之較低結合支撐物表面上引子的所得表面密度可在約1,000個引子分子/μm 2至約1,000,000個引子分子/μm 2範圍內。在一些實施例中，引子之表面密度可為每平方微米至少1,000個、至少10,000個、至少100,000個、或至少1,000,000個分子。在一些實施例中，引子之表面密度可為每平方微米至多1,000,000個、至多100,000個、至多10,000個或至多1,000個分子。本段中所描述之下限值及上限值中的任一者可組合形成本發明內所包括的範圍，例如，在一些實施例中，引子之表面密度可在每平方微米約10,000個分子至每平方微米約100,000個分子的範圍內。熟習此項技術者應認識到，引子分子之表面密度可具有在此範圍內之任何值，例如每平方微米約455,000個分子。在一些實施例中，最初與支撐物表面上之轉接子或引子序列雜交的目標庫核酸序列之表面密度可低於或等於對於所繫栓引子之表面密度所指示的表面密度。在一些實施例中，與支撐物表面上之轉接子或引子序列雜交的殖株擴增之目標庫核酸序列的表面密度可跨越與針對繫栓引子之表面密度所指示相同的範圍。
如上文所列之局部密度不排除跨越表面密度之變化，使得表面可包含具有例如500,000/μm 2之寡核苷酸密度的區域，同時亦至少包含具有大體上不同之局部密度的第二區域。
在一些實施例中，使用所揭示之反應調配物及較低結合支撐物之核酸雜交及/或擴增反應的效能可使用螢光成像技術評估，其中影像之對比度與噪聲比(CNR)提供評定擴增特異性及支撐物上非特異性結合之關鍵度量。CNR通常被定義為：CNR= (訊號-背景)/雜訊。背景術語通常視為針對指定相關區域(ROI)中之特定特點(繞射受限點，DLS)周圍之隙間區域量測之訊號。儘管訊號雜訊比(SNR)通常視為總訊號質量之基準，其可以展示改善CNR可提供優於SNR之顯著優勢作為用於需要快速影像捕捉(例如，循環時間必須降至最低之定序應用)之應用中之訊號質量之基準，如以下實例中所示。在高CNR下，即使在CNR中等改善之情況下，達至準確鑑別(及因此在定序應用之情況下準確鹼基識別)所需之成像時間可以顯著減少。成像整合時間上之成像資料中之改進的CNR提供一種更精確地偵測諸如支撐物表面上之殖株擴增核酸群落之特徵的方法。
在大多數基於整體之定序途徑中，背景術語通常量測為與『隙間』區域相關之訊號。除「間隙」背景(B inter)以外，「間隙內」背景(B intra)存在於經擴增之DNA群落佔據的區域內。此等兩種背景訊號之組合指示可實現的CNR，且隨後直接影響光學儀器需要、架構費用、試劑費用、操作時間、費用/基因組，且最終影響基於循環陣列之定序應用之準確度及資料質量。由各種來源產生之B inter背景訊號：幾個實例包括來自可消耗流動細胞之自體螢光、產生可能混淆訊號與ROI之偽螢光訊號之偵測分子之非特異性吸附、非特異性DNA擴增產物(例如，由引子二聚體產生之產物)之存在。在典型次定序(NGS)應用中，隨時間平均化且減去當前視野(FOV)中之此背景訊號。由個別DNA群落產生之訊號(亦即，FOV中(訊號) - B (間質性))產生可分類之可辨別的特點。在一些實施例中，隙內背景(B(隙內))可能貢獻混淆螢光訊號，其對相關目標不具有特異性，但存在於相同ROI中，因此使其極難以平均化及減去。
對本文所描述之較低結合塗佈之支撐物的核酸擴增可藉由降低非特異性結合而降低B (間隙性)背景訊號，可引起特異性核酸擴增改良，且可引起非特異性擴增降低，其可影響由間隙區域及間隙內區域引起之背景訊號。在一些實施例中，相比於使用習知支撐物及雜交、擴增及/或定序方案達成之彼等者，視情況與所揭示之雜交及/或擴增反應調配物組合使用的所揭示之較低結合塗佈之支撐物可引起CNR改良2、5、10、100、250、500或1000倍。儘管本文在使用螢光成像作為讀出或偵測模式之上下文中描述，但相同原理同樣適用於使用所揭示之較低結合塗佈之支撐物及核酸雜交及擴增調配物用於其他偵測模式，包括光學及非光學偵測模式兩者。
本發明提供用於確定核酸模板分子之序列的方法，其中多價分子用螢光團標記且偵測及/或鑑別步驟包含使用螢光成像。在一些實施例中，螢光成像包含雙波長激勵/四個波長發射螢光成像。在一些實施例中，採用四種不同類型之多價分子，各自包含不同核苷酸單元(或核苷酸單元類似物)。舉例而言，第一類型之多價分子包含dATP核苷酸單元，第二類型之多價分子包含dGTP核苷酸單元，第三類型之多價分子包含dCTP核苷酸單元，且第四類型之多價分子包含dTTP核苷酸單元。在一些實施例中，四種不同類型之多價分子用對應於附接至給定多價分子之核苷酸單元的不同螢光團標記，以允許鑑別核苷酸單元。在一些實施例中，偵測步驟包含在足以激發全部四個螢光團及波長下足以偵測各對應螢光團之螢光發射成像之波長下的同時或單一激勵。在一些實施例中，四種經標記之多價分子用於確定核酸模板分子中之末端核苷酸的身分。在一些實施例中，四種類型之多價分子用不同螢光團標記，包括例如發射不同可見顏色(諸如藍色、綠色、黃色、橙色或紅色)之螢光團。在一些實施例中，四種類型之多價分子用不同螢光團標記，包括例如Cy2或在激發或發射特性方面類似之染料或螢光團、Cy3或在激發或發射特性方面類似之染料或螢光團、Cy3.5或在激發或發射特性方面類似之染料或螢光團、Cy5或在激發或發射特性方面類似之染料或螢光團、Cy5.5或在激發或發射特性方面類似之染料或螢光團，及Cy7或在激發或發射特性方面類似之染料或螢光團。在一些實施例中，偵測步驟包含在532 nm、568 nm及633 nm中之任兩者處同時激發，及螢光發射分別在約570 nm、592 nm、670 nm及702 nm處成像。在一些實施例中，螢光成像包含雙波長激勵/雙波長發射螢光成像。在一些實施例中，四種不同類型之多價分子經可識別螢光團(或一組螢光團)標記，且偵測步驟包含波長足以激發一種、兩種、三種或四種螢光團或一組螢光團之同時或單一激發，且波長下之螢光發射之成像足以偵測各相應螢光團。
在一些實施例中，定序方法可用三種不同類型之經標記多價分子及一種類型之未標記多價分子(例如，「暗」多價分子)進行，其中經標記多價分子用對應於附接至給定多價分子之核苷酸單元的不同螢光團標記以允許鑑別核苷酸單元。在一些實施例中，偵測步驟包含在足以激發三種類型之螢光團及波長下之螢光發射成像的波長下同時激發足以偵測各相應螢光團，且參考「暗」或未標記點之位置確定或可確定第四類型之多價分子的偵測。
在一些實施例中，螢光團包含FRET供體及受體對，使得多個偵測及鑑別可在單一激發及成像步驟下進行。在一些實施例中，定序循環包含形成複數個複合聚合酶，使複合聚合酶與複數個不同類型的螢光標記之多價分子接觸，且偵測結合至複合聚合酶之螢光標記之多價分子。在一些實施例中，定序循環可在少於30分鐘、少於20分鐘或少於10分鐘內進行。在一些實施例中，用經標記多價分子進行定序反應產生大於或等於30及/或大於或等於40之定序操作之鹼基判讀準確性的平均Q評分。在一些實施例中，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%鹼基判讀具有大於30及/或大於或等於40之Q評分。在一些實施例中，本發明提供該方法，在本文中至少95%鹼基判讀之Q分數大於30。 實例
以下實例意欲說明且可用於進一步瞭解本發明之實施例且不應解釋為以任何方式限制本教示之範疇。
實例 1 ：突變聚合酶之澄清溶解產物製備
使用定點突變誘發製備突變聚合酶。突變聚合酶之突變位點列出於表1 (圖31)及表2 (圖32)中。
製備含有可操作地連接於編碼野生型聚合酶或突變聚合酶中之一者之核酸的表現支撐物的宿主細胞。在適合於表現野生型或突變聚合酶之條件下培養宿主細胞。使宿主細胞在盤格式中生長並在表現之後進行離心。藉由用在緩衝液(20 mM Tris-HCl(pH 8.8)、10 mM KCl、10 mM(NH 4) 2SO 4))中之溶菌酶處理來將細胞集結粒溶解，且再進行離心。將上清液轉移至PCR盤中並在65℃下使其熱休克，保持60分鐘。接著，用離心機使熱休克之溶解產物變澄清，並將上清液轉移至新盤中用於核苷酸併入分析。
澄清溶解物與4X SDS負載天混合且在4-12% NuPAGE Bis-Tris SDS聚丙烯醯胺凝膠上操作。在操作凝膠之後，將其用考馬斯藍染色緩衝液染色且去染色隔夜以解析目標帶。蛋白質產量及穩定酶之存在或熱休克聚集可藉由目視檢查去染色凝膠來評估。或者，使用自動化微流體晶片確定來自裂解物之蛋白質產量及濃度，該晶片在高產量模式下經組態以染色、去染色及電泳分離蛋白質(例如，LABCHIP GXII TOUCH)。
實例 2 ：核苷酸併入分析
使用Atto染料標記之DNA模板製備DNA模板。將經標記之DNA模板與在反應緩衝液(Tris-HCl(pH 7.5)、NaCl、EDTA)中之引子黏接在一起。將雙螺旋體與澄清之溶解產物(如實例1中所描述)混合且將其平衡至42℃。藉由添加基於模板對應於下一個核苷酸之3'甲基疊氮基核苷酸(例如dCTP-N3或dATP-N3)起始核苷酸併入反應。使反應在不同溫度及時間條件下進行，例如42℃持續150秒，或56℃持續少至2秒，且用EDTA及甲醯胺淬滅。藉由毛細電泳法進行n+1對比n之分析。
表2 (圖32)中所列之併入之活性資料表示突變聚合酶在42℃下在延伸聚核苷酸鏈的N+1位置處併入有3'甲基疊氮基核苷酸方面的相對活性。
許多突變聚合酶係由如實例1中所描述之重組宿主細胞表現。含有突變聚合酶之來自表現宿主細胞的溶解物在65℃下經受熱休克60分鐘。如實例2中所描述，篩選熱休克溶解物中之突變聚合酶的併入有3'甲基疊氮基核苷酸之能力。如實例2中所描述，經由毛細電泳進行併入反應之分析。若突變聚合酶之併入活性展現出零或可忽略併入活性，則其被指定為0級，或若其分別展現出中度或高度併入活性，則其被指定為+或++級別。預測約50%至60%或更多突變聚合酶將展現出併入活性，該活性具有+或更高級別。
實例 3 ：熱熔化分析
將經純化野生型及突變聚合酶在肝素溶離緩衝液中與1X SYPRO Orange Protein Gel Stain混合，且在CFX384熱循環儀上運行。使用CFX Maestro軟體(來自Bio-Rad)分析熱熔融資料。包括(Tm1)及(Tm2)之熱熔融資料列於表1及表2中。熱熔融資料用於產生熔融峰值及熔融曲線。
實例 4 ：熱聚集分析
聚集起始溫度(T(agg))使用含有1 mg/mL聚合酶之石英比色管於緩衝液中量測。將比色管置放於UNCLE儀器(來自Unchained Labs, Pleasanton, California)中，且以0.5℃/秒之速率曝露於25℃至95℃之溫度斜線變化。聚集溫度使用靜態光散射來量測且確定為266 nm訊號增加超過平均基線讀數之10%的溫度。由熱熔融資料確定熱聚集T(agg)溫度且產生熔融曲線。
實例 5 ：尿嘧啶併入分析
使反應緩衝劑中之預致敏DNA模板分子與經純化之突變聚合酶混合且使其平衡至42℃。反應藉由添加對應於模板分子上之下一鹼的3'甲基疊氮基核苷酸開始。使反應在42℃下進行且在遞增時間下用EDTA及甲醯胺淬滅。藉由毛細電泳法進行n+1對n之分析。分析dATP核苷酸類似物於具有胸腺嘧啶作為模板分子中之下一鹼基之模板中的併入比率。分析dATP核苷酸類似物於具有腺嘌呤作為模板分子中之下一鹼基的模板中之併入比率。分析dATP核苷酸類似物於具有尿嘧啶作為模板分子中之下一鹼基之模板中的併入比率。一些突變聚合酶展現將dATP核苷酸類似物併入含尿嘧啶模板分子中之能力增加。
實例 6 ：結合標記之多價分子的分析
製備DNA多聯體且固定至流槽中。螢光標記之多價分子(例如，參見圖5)及經工程化聚合酶的溶液流動至流槽上。各溶液含有攜帶dATP、dGTP、dCTP或dTTP之核苷酸單元的多價分子。多價分子之核心用與dATP、dGTP、dCTP或dTTP之核苷酸單元對應的不同螢光團標記。使多聯體與溶液反應10秒，隨後使用空氣移除。用洗滌緩衝劑移除多價分子及聚合酶。使成像溶液流動至流槽上，且量測結合於多聯體之多價分子的螢光強度。藉由將顯性核苷酸單元(例如，正確核苷酸單元)之螢光強度除以所有四個核苷酸單元之強度總和來計算結合之核苷酸單元的純度。
在獨立分析中，複合經工程化聚合酶與攜載dATP、dGTP、dCTP或dUTP之核苷酸單元的經螢光標記之多價分子在不同溫度及時間條件下反應。舉例而言，所測試溫度包括25至56℃，及在包括1至90秒期間之時間。獲取結合複合聚合酶之多價分子的影像及強度。
若突變聚合酶所展現之強度展現出零或可忽略活性，則其被指定為0級，或若其分別展現出中度或高度活性，則其被指定為+或++級別。預測約50%至60%或更多突變聚合酶將展現出強度，該強度具有+或更高級別。具有+或++級別之突變聚合酶適合於在定序中形成。
實例 7 ：結合活性標記之核苷酸臂
製備經標記之核苷酸臂(例如圖6)，其各自攜帶螢光團、核苷酸單元、連接子、間隔子及核心連接部分。含有突變聚合酶之細胞溶解物係由表現不同突變聚合酶之不同宿主細胞製備。製備DNA模板/引子雙螺旋體，其中模板分子經螢光標記。在適合於形成複合聚合酶之條件下且在適合於將核苷酸臂結合於複合聚合酶之條件下，細胞溶解物、模板/引子雙螺旋及經標記之核苷酸臂與非催化性陽離子在多孔盤之孔中混合在一起。將盤置於盤讀數上且以適當激勵波長進行光譜掃描。獲得發射量測結果。突變聚合酶之多價結合活性資料列於表1中(圖31)。
實例 8 ：質譜分析及模型化
製備野生型聚合酶。野生型聚合酶包含RLF 89458.1 (SEQ ID NO:1)或NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:992)之主鏈序列，且在其N端具有His標籤。RLF 89458.1聚合酶上之His標籤包含序列MGSSHHHHHHSSGLVPRGS (SEQ ID NO:2838)且NOZ 58130.1聚合酶上之His標籤包含序列MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH (SEQ ID NO:2837)。
使用30 kDa截止自旋過濾器將His標記之聚合酶溶解於包含Tris (50 mM，pH 7.5)及NaCl (50 mM)之試劑中。如使用Bradford分析所確定，聚合酶溶液濃縮至約0.5 - 1 mg/mL。20-50 uL聚合酶溶液使用0.2% Rapigest (例如，0.2% Rapigest於50 mM碳酸氫銨中)稀釋至100 uL之最終體積。將2.5 uL之DTT (例如，200 mM DTT於50 mM碳酸氫銨中)添加至稀釋之聚合酶中且渦旋。聚合酶溶液在60℃烘箱中培育30分鐘以還原。在還原之後，聚合酶溶液平衡至室溫。將7.5 uL碘乙醯胺(IAA) (例如，200 mM碘乙醯胺於50 mM碳酸氫銨中)添加至經還原聚合酶溶液中。使聚合酶溶液在室溫下在黑暗中渦旋30分鐘。以1:30胰蛋白酶/聚合酶濃度之比率向聚合酶溶液中添加胰蛋白酶(例如，含0.1 ug/uL胰蛋白酶之50 mM碳酸氫銨)。在37℃下使聚合酶消化至少4小時(例如，隔夜)。在消化之後，藉由添加HCl將聚合酶溶液(例如，現肽)調節至約pH 2且保持在37℃下30分鐘。聚合酶溶液經渦旋且置於4℃下至少2小時。聚合酶溶液經離心15分鐘且上清液用於質譜分析。
使用電噴霧電離進行質譜分析(MS/MS)分析。在資料相依掃描模式中，使用離子阱質譜儀(Thermo Scientific Q Exactive Plus質譜儀)，藉由奈米流動LC串聯質譜分析來分析肽。使用Mascot軟體(Matrix Science Limited)針對自已知蛋白質序列之理論消化物的所預測片段離子搜尋MS/MS資料。質譜資料用於產生預測之三維帶狀模型且鑑別包括氧化及乙醯化位點之轉譯後修飾位點(例如圖41及圖42)。乙醯化位點鑑別為經歷N-磷酸葡萄糖酸基化或N-葡萄糖酸基化之位點。圖41中之帶狀模型亦展示His標籤MGSSHHHHHHSSGLVPRGS (SEQ ID NO:2838)之預測結構，其中G-17、S-16、S-15、H-12及H-11為來自His標籤之胺基酸殘基。圖42中之帶狀模型亦展示His標籤MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH (SEQ ID NO:2837)之經預測結構，其中G-17、H-8、H-7、S-4及S-3為來自His標籤之胺基酸殘基。
使用具有標準工作流程輸入之Rosetta軟體進行野生型聚合酶RLF 89458.1及NOZ 58130.1之模型化，包括(1)使用ClustalX產生序列比對，及(2)可獲自RCSB蛋白質結構資料庫Protein Data Bank之模板結構之座標。將比對及模板輸入至Rosetta中且命令將目標序列執行至模板上。片段係針對缺失部分產生。產生大約10,000至15,000個比較模型且選擇最低能量模型。
實例 9 ：經工程化聚合酶的加速老化研究
進行加速老化研究以確定各種純化經工程化聚合酶，包括包含RLF89458 (例如，SEQ ID NOS: 1-1713)或NOZ 58130 (例如，SEQ ID NOS: 1714-2787)主鏈序列之聚合酶的所估計之儲存壽命。經工程化聚合酶在缺乏核苷酸類似物及多價分子之定序儲存緩衝液中老化。加速老化研究在包括-20℃、4℃、25℃或37℃之四種溫度下進行。
使用以下方程式估計理論儲存壽命： 其中Q10為反應速率係數，T AA為烘箱老化溫度，且T RT為環境溫度(例如，室溫)。反應速率係數Q10對應於在溫度升高至10℃時腐敗之速率。典型地，Q10之值設定為2，其中對於溫度每增加10℃，腐敗速率加倍。舉例而言，當應用加速老化時間等式時，在25℃下儲存16天之經工程化聚合酶對應於在-20℃之362天。
當經工程化聚合酶老化所需時間時，其活性程度藉由進行核苷酸併入分析來測試。
以類似於實例2中所描述之併入分析的方式進行核苷酸併入分析。在反應緩衝液中用引子使染料標記之DNA模板退火。將雙螺旋體與純化的經工程化聚合酶混合且使其平衡至50℃。核苷酸併入反應藉由添加對應於模板上之下一鹼基的3'甲基疊氮基核苷酸開始。使反應進行50℃，且在遞增時間用EDTA及甲醯胺淬滅。藉由毛細電泳法進行n+1對比n之分析。
實例 10 ： 使用多價分子及核苷酸定序
在上面固定有複數個多聯體模板分子(例如固定之聚合酶群落)的流槽上進行二階段定序反應。
第一階段定序反應係藉由使複數個可溶性定序引子與固定至流槽之多聯體模板分子雜交形成經固定之引子-多聯體雙螺旋體來進行。使複數個第一定序聚合酶流動至流槽上(例如接觸經固定之引子-多聯體雙螺旋體)並在適於定序聚合酶與雙螺旋體結合形成複合聚合酶的條件下培育。例示性第一定序聚合酶包含SEQ ID NOS:1、2或1714中之任一者的胺基酸主鏈序列。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-1713或1714-2787中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。使經螢光標記之多價分子(例如約20-100 nM之不同濃度)的混合物在包括非催化性陽離子(例如鍶、鋇及/或鈣)之緩衝液存在下流動至流槽上並在適於多價分子之互補核苷酸單元與複合聚合酶結合形成親合力複合物，而不進行聚合酶催化之核苷酸單元併入的條件下培育。測試各種溫度及時間條件，例如25℃至56℃持續5-90秒。經螢光標記之多價分子係在其核心標記。洗滌複合聚合酶。獲得保持結合至複合聚合酶的多價分子之圖像。藉由用包含洗滌劑之緩衝液洗滌將第一定序聚合酶及多價分子移除，同時保留與經固定之多聯體雜交的定序引子(保留雙螺旋體)。
第一階段定序反應適於在多聯體模板分子(例如聚合酶群落)上形成複數個親合力複合物。舉例而言，第一階段定序反應包含： ( a )使第一核酸引子、第一聚合酶及第一多價分子與多聯體模板分子之第一部分結合，由此形成第一結合複合物，其中該第一多價分子之第一核苷酸單元結合至第一聚合酶；且 ( b )使第二核酸引子、第二聚合酶及該第一多價分子與同一多聯體模板分子之第二部分結合，由此形成第二結合複合物，其中該第一多價分子之第二核苷酸單元結合至第二聚合酶，其中包括相同多價分子之該第一結合複合物及第二結合複合物形成第一親合力複合物。
第二階段定序反應係藉由使保留之雙螺旋體與複數個第二定序聚合酶接觸形成複合聚合酶來進行。例示性第二定序聚合酶包含SEQ ID NOS:1、2或1714中之任一者的胺基酸主鏈序列。在一些實施例中，突變聚合酶包含與SEQ ID NOS: 1-1713或1714-2787中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%一致性或更高位準序列一致性的胺基酸序列。在包括催化陽離子(例如，鎂及/或錳)之緩衝液存在下將未經標記之核苷酸類似物(例如，3'O-甲基疊氮基核苷酸)之混合物(例如，在約1-5 uM之不同濃度下)添加至複合聚合酶，且在適合於結合互補核苷酸之條件下培育至複合聚合酶且促進核苷酸之聚合酶催化併入以產生初生延伸之定序引子。測試各種溫度及時間條件，例如25℃至56℃持續5-180秒。洗滌複合聚合酶。未獲得圖像。使併入的未標記之核苷酸類似物與裂解試劑反應以移除3'O-甲基疊氮基並產生可延伸之3'OH基團。
在替代性第二階段定序反應中，在包括催化性陽離子(例如鎂及/或錳)之緩衝液存在下，將經螢光標記之核苷酸類似物(例如3'O-甲基疊氮基核苷酸)(例如約1-5 μM)之混合物添加至複合聚合酶中並在適於互補核苷酸與複合聚合酶結合且促進聚合酶催化之核苷酸併入的條件下培育以產生新生的經延伸之定序引子。洗滌複合聚合酶。獲得作為複合聚合酶之一部分併入的經螢光標記之核苷酸類似物的圖像。使併入的經螢光標記之核苷酸類似物與裂解試劑反應以移除3'O-甲基疊氮基並產生可延伸之3'OH基團。
藉由用包含洗滌劑之緩衝液洗滌將第二定序聚合酶移除，同時保留與多聯體雜交的新生的經延伸之定序引子(保留雙螺旋體)。藉由執行多個循環的第一階段及第二階段定序反應，再進行定序反應以產生經延伸之正向定序引子股。圖43顯示由大腸桿菌DNA製備之核酸庫產生的固定之多聯體的150個循環定序操作。X軸指示定序循環數目且Y軸指示誤差%。
本文所揭示之組合物及方法的新穎優勢及特徵在所附申請專利範圍中細緻地陳述。以下參照闡述例示性實施例及附圖的詳細描述將獲得對本發明組合物及方法之特徵及優勢的更好理解，在附圖中：
圖 1為例示性低結合支撐物之示意圖，該低結合支撐物包含玻璃基板及親水性塗層之交替層，該等親水性塗層之交替層共價或非共價黏附至玻璃，且進一步包含充當寡核苷酸引子(例如，捕捉寡核苷酸)之連接位點的化學反應性官能基。在一替代實施例中，支撐物可由任何材料製成，諸如玻璃、塑膠或聚合物材料。
圖 2為多價分子之各種例示性組態的示意圖。 左側 ( I 類 ) ：具有「星型」或「螺旋」組態之多價分子的示意圖。 中心 ( II 類 )：具有樹形組態之多價分子的示意圖。 右側 ( III 類 ) ：藉由使鏈黴抗生物素蛋白與4臂或8臂PEG-NHS與生物素及dNTP反應而形成之多種多價分子的示意圖。核苷酸單元命名為「N」，生物素命名為「B」，且鏈黴抗生物素蛋白命名為「SA」。
圖 3係包含連結至複數個核苷酸臂之通用核心的例示性多價分子之示意圖。
圖 4係包含連結至複數個核苷酸臂之樹狀體核心的例示性多價分子之示意圖。
圖 5顯示包含連結至複數個核苷酸臂之核心的例示性多價分子之示意圖，其中核苷酸臂包含生物素、間隔子、連接子及核苷酸單元。
圖 6係包含核心連結部分、間隔子、連接子及核苷酸單元之例示性核苷酸臂的示意圖。
圖 7顯示例示性間隔子之化學結構 ( 頂部 )，以及包括11個原子之連接子、16個原子之連接子、23個原子之連接子及N3連接子在內之各種例示性連接子的化學結構 ( 底部 )。
圖 8顯示包括連接子1-9之各種例示性連接子的化學結構。
圖 9A顯示接合/連結至核苷酸單元之各種例示性連接子的化學結構。
圖 9B顯示接合/連結至核苷酸單元之各種例示性連接子的化學結構。
圖 9C顯示接合/連結至核苷酸單元之各種例示性連接子的化學結構。
圖 9D顯示接合/連結至核苷酸單元之各種例示性連接子的化學結構。
圖 10顯示例示性生物素化核苷酸臂之化學結構。在此實例中，核苷酸單元在嘧啶鹼基之5位或嘌呤鹼基之7位經由炔丙基胺連結而聯接至連接子。
圖 11為具有來自RLF 89458.1 (SEQ ID NO:1)之主鏈序列的野生型DNA聚合酶之胺基酸序列。
圖 12為具有來自RLF 78286.1 (SEQ ID NO:2)之主鏈序列之野生型DNA聚合酶的胺基酸序列。
圖 13為具有來自NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之主鏈序列之野生型DNA聚合酶的胺基酸序列。
圖 14為具有來自RMF 90817.1 (SEQ ID NO:2789)之主鏈序列的野生型DNA聚合酶之胺基酸序列。
圖 15為具有來自MBC 7218772.1 (SEQ ID NO:2790)之主鏈序列的野生型DNA聚合酶之胺基酸序列。
圖 16為具有來自WP 175059460.1 (SEQ ID NO:2791)之主鏈序列的野生型DNA聚合酶之胺基酸序列。
圖 17為具有來自KUO 42443.1 (SEQ ID NO:2792)之主鏈序列的野生型DNA聚合酶之胺基酸序列。
圖 18為具有來自NOZ 77387.1 (SEQ ID NO:2793)之主鏈序列之野生型DNA聚合酶的胺基酸序列。
圖 19為具有來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Bst聚合酶) (SEQ ID NO:2794)之主鏈序列的野生型DNA聚合酶之胺基酸序列。
圖 20為9 °N聚合酶之胺基酸序列(SEQ ID NO:2795)。
圖 21為9 °N聚合酶UniProt Q56366之胺基酸序列(SEQ ID NO:2796)。
圖 22為THERMINATOR聚合酶之胺基酸序列(SEQ ID NO:2797)。
圖 23為VENT聚合酶UniProt P30317之胺基酸序列(SEQ ID NO:2798)。
圖 24為DEEP VENT聚合酶UniProt Q51334之胺基酸序列(SEQ ID NO:2799)。
圖 25為Pfu聚合酶UniProt P61875之胺基酸序列(SEQ ID NO:2800)。
圖 26為激烈火球菌聚合酶UniProt P0CL77之胺基酸序列(SEQ ID NO:2801)。
圖 27為RB69聚合酶之胺基酸序列(SEQ ID NO:2802)。
圖 28為Phi29聚合酶之胺基酸序列(SEQ ID NO:2803)。
圖 29展示RLF 89458.1聚合酶之域的胺基酸序列。
圖 30展示NOZ 58130.1聚合酶之域的胺基酸序列。
圖 31 (115 張圖 )為列出具有RLF 89458.1之主鏈序列且攜載突變取代位點之突變變異體(SEQ ID NOS:3-1713)之蛋白質去摺疊轉變溫度Tm1及Tm2 (以℃為單位)及活性的表1。在表1中，截斷用「^」指示。在表1中，缺失之胺基酸用「X」指示。在表1中，插入之胺基酸用「[插入物X在P411之後]」指示，其中X為單字母胺基酸編碼。
圖 32 (68 張圖 )為列出具有NOZ 58130.1之主鏈序列且攜載突變取代位點之突變變異體(SEQ ID NOS:1715-2787)之蛋白質去摺疊轉變溫度Tm1及Tm2 (以℃為單位)及活性的表2。在表2中，截斷用「^」指示。在表2中，缺失之胺基酸用「X」指示。在表2中，缺失之部分用「[缺失之……]」指示，其中缺失之部分用單字母胺基酸編碼指示。
圖 33 (5 張圖 )顯示來自以下之DNA聚合酶的胺基酸序列比對：RLF 89458.1 (SEQ ID NO:1); WP 175059460 (SEQ ID NO:2791)；MBC 7218772 (SEQ ID NO:2790)；KUO 42443 (SEQ ID NO:2792)；NOZ 58130 (SEQ ID NO:1714)；RMF 90817 (SEQ ID NO:2789)；及NOZ 77387 (SEQ ID NO:2793)。
圖 34 (5 張圖 )顯示來自以下之DNA聚合酶的胺基酸序列比對：RLF 89458.1 (SEQ ID NO:1)；嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)(Bst聚合酶) (SEQ ID NO:2794)；9°N (SEQ ID NO:2795)；Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及激烈火球菌聚合酶( Pyrococcus abyssipolymerase)(SEQ ID NO:2801)。
圖 35 (5 張圖 )顯示來自以下之DNA聚合酶的胺基酸序列比對：NOZ 58130 (SEQ ID NO:1714)；嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Bst聚合酶) (SEQ ID NO:2794)；9°N (SEQ ID NO:2795)；Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)。
圖 36 (5 張圖 )顯示來自以下之DNA聚合酶的胺基酸序列比對：RMF 90817 (SEQ ID NO:2789)；嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Bst聚合酶) (SEQ ID NO:2794)；9°N (SEQ ID NO:2795)；Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)。
圖 37 (5 張圖 )顯示來自以下之DNA聚合酶的胺基酸序列比對：MBC 7218772 (SEQ ID NO:2790)；嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Bst聚合酶) (SEQ ID NO:2794)；9°N (SEQ ID NO:2795)；Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)。
圖 38 (5 張圖 )顯示來自以下之DNA聚合酶的胺基酸序列比對：WP 175059460 (SEQ ID NO:2791)；嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Bst聚合酶) (SEQ ID NO:2794)；9°N (SEQ ID NO:2795)；Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)。
圖 39 (5 張圖 )顯示來自以下之DNA聚合酶的胺基酸序列比對：KUO 42443 (SEQ ID NO:2792)；嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Bst聚合酶) (SEQ ID NO:2794)；9°N (SEQ ID NO:2795)；Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)。
圖 40 (5 張圖 )顯示來自以下之DNA聚合酶的胺基酸序列比對：NOZ 77387 (SEQ ID NO:2793)；嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Bst聚合酶) (SEQ ID NO:2794)；9°N (SEQ ID NO:2795)；Pfu聚合酶(SEQ ID NO:2800)及激烈火球菌聚合酶(SEQ ID NO:2801)。
圖 41為展示具有N端His標籤之野生型聚合酶RLF 89458.1 (SEQ ID NO:1)之預測的三維帶狀模型的示意圖。帶狀模型包括在某些胺基酸殘基處轉譯後修飾之預測位置。帶狀模型係基於質譜資料。
圖 42為展示具有N端His標籤之野生型聚合酶NOZ 58130.1 (SEQ ID NO:1714)之預測的三維帶狀模型的示意圖。帶狀模型包括在某些胺基酸殘基處轉譯後修飾之預測位置。帶狀模型係基於質譜資料。
圖 43為展示由大腸桿菌DNA製備之核酸庫之150個週期定序操作的誤差%的圖。
圖 44為與第一及第二核酸引子雜交之例示性固定化核酸模板分子的示意圖。圖44中所示之核酸模板分子包含與複數個核酸引子雜交的多聯體。
圖 45為由虛線圓圈指示之例示性複合聚合酶之示意圖，其中個別複合聚合酶包含結合至核酸雙螺旋之DNA聚合酶，其中各雙螺旋包含雜交至核酸引子之核酸模板。
圖 46為例示性第一結合複合物(例如由虛線圓圈指示)之示意圖，該複合物包含結合至多聯體模板分子之第一部分的第一核酸引子、第一DNA聚合酶及第一多價分子，藉此形成第一結合複合物。圖46亦展示複數個多價分子，該等多價分子不為第一結合複合物之一部分。
圖 47為例示性親合力複合物(例如由虛線圓圈指示)之示意圖，其包含(i)第一結合複合物，其包含第一核酸引子、第一DNA聚合酶及第一多價分子，其結合至多聯體模板分子之第一部分，由此形成第一結合複合物，其中該多價分子之第一核苷酸單元結合至該第一DNA聚合酶，及(ii)該第二結合複合物，其包含第二核酸引子、第二DNA聚合酶及結合至該同一多聯體模板分子之第二部分的同一第一多價分子，由此形成第二結合複合物，其中該多價分子之第二核苷酸單元結合至該第二DNA聚合酶，且其中包括相同多價分子之該第一及第二結合複合物形成親合力複合物。
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Claims (150)

  1. 一種經工程化聚合酶，其包含與SEQ ID NO: 1具有至少85%一致性之胺基酸序列，及 具有選自由以下組成之群的第一胺基酸取代：D141N、D141V、D141A、D141L、D141I、D141F、D141Y、D141T、D141S、D141R、D141K、D141Q、D141W、D141E、D141M、D141P、D141G、D141H及D141C，且 該經工程化聚合酶具有選自由以下組成之群的第二胺基酸取代：E143A、E143V、E143L、E143I、E143F、E143Y、E143N、E143T、E143S、E143W、E143M、E143P、E143F、E143G、E143L、E143H、E143R、E143K、E143D、E143C及E143Q。
  2. 一種經工程化聚合酶，其包含與SEQ ID NO: 1具有至少85%一致性的胺基酸序列且具有非突變位置E143E及選自由以下組成之群的胺基酸取代：D141N、D141V、D141A、D141L、D141I、D141F、D141Y、D141T、D141S、D141R、D141K、D141Q、D141W、D141E、D141M、D141P、D141G、D141H及D141C。
  3. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：V93A、V93M、V93E、V93F、V93Y、V93G、V93S、V93K、V93T及V93I。
  4. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含胺基酸取代L409S、Y410A及P411G。
  5. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M1F、M1I、M1L、M1S、M1N、M1A、M1V、M1Y、M1Q、M1K、M1V及M1A。
  6. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M129I、M129V、M129K、M129L、M129E、M129F、M129N、M129S、M129R及M129Y。
  7. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M159W、M159F及M159Y。
  8. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M313I、M313K、M313L、M313V、M313D、M313R、M313E、M313A、M313L及M313N。
  9. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M329L、M329S、M329W、M329A、M329R、M329I、M329Q、M329N及M329E。
  10. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M467V、M467K、M467D、M467T、M467R、M467E、M467Q及M467L。
  11. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M759T、M759S、M759N、M759R、M759E、M759D及M759A。
  12. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K240R、K240D、K240N、K240Q、K240A。
  13. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K306R、K306N、K306Q、K306A、K306V、K306I及K306F。
  14. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K371R、K371D、K371N、K371Q、K371Y、K371T、K371V及K371L。
  15. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K429R、K429S、K429M、K429A、K429N、K429D、K429Q、K429H、K429Y、K429V及K429L。
  16. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K468R、K468E、K468Y、K468T及K468L。
  17. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K476R、K476D、K476A及K476F。
  18. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K592Q、K592R、K592W、K592Y、K592A、K592F、K592I、K592T、K592N及K592S。
  19. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：W299F、W299E、W299N、W299Q、W299Y、W299A及W299F。
  20. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：H601R、H601I、H601A、H601T、H601V、H601L及H601N。
  21. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：C428Y。
  22. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含位置1處之甲硫胺酸缺失。
  23. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：C223V、C223E、C223S、C223L、C223M、C223A、C223P、C223K、C223N及C223D。
  24. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：C509V、C509Y、C509S、C509M、C509A、C509N、C509D、C509H及C509Q。
  25. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含在位置K464、R465、E475、Y481、E616、E620、E755、Y756、Q757、R758、M759、T762、W767或M770處之截斷。
  26. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：V610D、V610A、V610K、V610S、V610T、V610N、V610R及V610Q。
  27. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：D613S、D613E、D613R、D613K、D613N、D613Q、D613A、D613V、D613Y及D613F。
  28. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q664A、Q664L、Q664V、Q664F、Q664I、Q664R、Q664K、Q664T、Q664N及Q664M。
  29. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：E668G、E668K、E668M、E668A、E668P、E668S、E668R、E688N、E688D、E668Y及E668Q。
  30. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：P677L、P677R、P677K及P677A。
  31. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：D671G、D671R、D671Y、D671S、D671A、D671K及D671N。
  32. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：N11S、N11A、N11R、N11Q、N11E、N11K及N11T。
  33. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K507L、K507E、K507S、K507A、K507N、K507Q、K507E及K507T。
  34. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：E511K、E511S、E511A、E511R、E511N及E511T。
  35. 如請求項1或2之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K637M、K637A、K637N、K637Q、K637E、K637S及K637T。
  36. 一種經工程化聚合酶，其包含與SEQ ID NO: 1714具有至少85%一致性之胺基酸序列，及 具有選自由以下組成之群的第一胺基酸取代：D168A、D168V、D168L、D168I、D168F、D168Y、D168N、D168T、D168S、D168W、D168M、D168P、D168G、D168H、D168R、D168E、D168C、D168K或D168Q，且 該經工程化聚合酶具有選自由以下組成之群的第二胺基酸取代：E143A、E143V、E143L、E143I、E143F、E143Y、E143N、E143T、E143S、E143W、E143M、E143P、E143G、E143H、E143R、E143K、E143D、E143C或E143Q。
  37. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含位置L440、Y441及P442處之LYP模體處的胺基酸取代，其中LYP模體突變包含： L440F、Y441G及P442P；或 L440S、Y441G、P442P。
  38. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：Y14F、Y14D、Y14I及Y14N。
  39. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：W135S、W135L、W135R、W135Y、W135F、W135D、W135A及W135V。
  40. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M187S、M187L、M187R、M187Y、M187I、M187T、M187A及M187V。
  41. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：W329Y、W329F、W329L、W329D、W329A及W329V。
  42. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K335R、K335L、K335S及K335A。
  43. 如請求項37之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M389D、M389E、M389L、M389Y、M389S、M389A及M389V。
  44. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：S473K、S473R、S473T、S473Q及S473A。
  45. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M527H、M527G、M527Q、M527L、M527D、M527A及M527V。
  46. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M549N、M549Y、M549H、M549T、M549D、M549R、M549A及M549V。
  47. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K552R、K552T、K552N、K552Q及K552A。
  48. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M629L、M629A、M629D、M629R及M629V。
  49. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：W641R、W641A、W641L、W641F、W641Y及W641V。
  50. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K650T、K650C、K650A、K650R及K650S。
  51. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：K711R、K711L、K711T及K711D。
  52. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：M723S、M723I、M723T、M723N、M723R、M723L、M723A及M723C。
  53. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：W791R、W791Y、W791D、W791S、W791L、W791A及W791V。
  54. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：C362A、C362L、C362I、C362S、C362F、C362Y、C362V、C362P、C362K、C362N及C362D。
  55. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：C539A、C539V、C539L、C539S、C539Y、C539D、C539K、C539N及C539P。
  56. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含在位置M723、G773、D777、E781、T784、Q785、R790、W791或F792處之截斷。
  57. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q95L、Q95H、Q95R、Q95W、Q95A、Q95K、Q95N及Q95P。
  58. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含胺基酸取代I186R。
  59. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含胺基酸取代V304D。
  60. 如請求項36之經工程化聚合酶，其進一步包含選自由以下組成之群的胺基酸取代：L313M、L313D、L313F、L313K、L313R、L313A及L313E。
  61. 如請求項37之經工程化聚合酶，其進一步包含胺基酸取代E318V。
  62. 如請求項1、2、36或37中任一項之經工程化聚合酶，其進一步包含複數個該經工程化聚合酶、複數個核酸模板分子及複數個具有3'可延伸末端之核苷酸聚合起始位點。
  63. 如請求項1、2、36或37中任一項之經工程化聚合酶，其中該複數個核酸模板分子包含線性核酸分子、環狀核酸分子或線性核酸分子與環狀核酸分子之混合物。
  64. 如請求項1、2、36或37中任一項之經工程化聚合酶，其中該複數個核酸模板分子包含殖株擴增之模板分子。
  65. 如請求項1、2、36或37中任一項之經工程化聚合酶，其中該複數個核酸模板分子中之至少一個核酸模板分子包含所關注目標序列一個複本，或包含具有所關注目標序列之兩個或更多個串聯複本的多聯體。
  66. 如請求項1、2、36或37中任一項之經工程化聚合酶，其中該複數個核苷酸聚合起始位點中之個別核苷酸聚合起始位點包含雜交至該等核酸模板分子中之至少一個之一部分的核酸引子，或其中該複數個核苷酸聚合起始位點中之個別核苷酸聚合起始位點包含該等核酸模板分子中之至少一個的自引發(self-priming)末端部分。
  67. 如請求項62之經工程化聚合酶，其中該複數個聚合酶、該複數個核酸模板分子及該複數個核苷酸聚合起始位點形成複數個複合聚合酶，該等複合聚合酶各自包含結合至核酸雙螺旋之聚合酶，其中該雙螺旋包含雜交至核酸引子之核酸模板分子。
  68. 如請求項67之經工程化聚合酶，其中該複數個核酸模板分子包含相同的所關注目標序列或不同的所關注目標序列。
  69. 如請求項67之經工程化聚合酶，其中該複數個複合聚合酶進一步包含複數個多價分子，其中該複數個多價分子中之個別多價分子包含： ( a )核心；及 ( b )複數個核苷酸臂，該等臂包含(i)核心連接部分、(ii)間隔子、(iii)連接子及(iv)核苷酸單元，其中該核心經由其核心連接部分連接至該複數個核苷酸臂，其中該間隔子連接至該連接子，且其中該連接子連接至該核苷酸單元。
  70. 如請求項69之經工程化聚合酶，其中該連接子包含具有2-6個次單元之脂族鏈或具有2-6個次單元之寡聚乙二醇鏈。
  71. 如請求項69之經工程化聚合酶，其中連接至給定核心之該複數個核苷酸臂具有相同類型之核苷酸單元，且其中該核苷酸單元包含dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP。
  72. 如請求項69之經工程化聚合酶，其中該複數個多價分子包含一種類型的多價分子，其中該複數個多價分子中之各者具有選自由以下組成之群的相同類型之核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。
  73. 如請求項69之經工程化聚合酶，其中該複數個多價分子包含兩種或更多種類型之多價分子之任何組合的混合物，各類型具有選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
  74. 如請求項69之經工程化聚合酶，其中該複數個多價分子中之至少一個多價分子包含經螢光團標記之核心。
  75. 如請求項69之經工程化聚合酶，其中該複數個多價分子中之至少一個多價分子包含經螢光團標記之核苷酸單元。
  76. 如請求項67之經工程化聚合酶，其中該複數個複合聚合酶進一步包含複數個核苷酸，其中該複數個核苷酸中之個別核苷酸包含芳族鹼基、五碳糖及1至10個磷酸酯基。
  77. 如請求項76之經工程化聚合酶，其中該複數個核苷酸包含選自由以下組成之群的一種類型之核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。
  78. 如請求項76之經工程化聚合酶，其中該複數個核苷酸包含選自由以下組成之群的兩種或更多種類型之核苷酸的任何組合之混合物：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
  79. 如請求項76之經工程化聚合酶，其中該複數個核苷酸中之至少一個核苷酸經螢光團標記。
  80. 如請求項76之經工程化聚合酶，其中該複數個核苷酸缺乏螢光團標記。
  81. 如請求項76之經工程化聚合酶，其中該複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含連接至糖基團之3'碳位置的可移除之鏈終止部分，其中該可移除之鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基團、疊氮基、O-疊氮基甲基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基，且其中該可移除之鏈終止部分可用化合物裂解，以在該糖基團上產生可延伸之3'OH部分。
  82. 如請求項67之經工程化聚合酶，其中該複數個複合聚合酶進一步包含抑制聚合酶催化之核苷酸併入的複數個非催化性二價陽離子，其中該等非催化性二價陽離子包含鍶或鋇。
  83. 如請求項67之經工程化聚合酶，其中該複數個複合聚合酶進一步包含促進聚合酶催化之核苷酸併入的複數個催化性二價陽離子，其中該等催化性二價陽離子包含鎂或錳。
  84. 如請求項67之經工程化聚合酶，其中該複數個複合聚合酶固定至支撐物或固定至該支撐物上之塗層。
  85. 如請求項84之經工程化聚合酶，其中固定至該支撐物之該複數個複合聚合酶的密度包含每平方毫米10 2- 10 12個。
  86. 如請求項84之經工程化聚合酶，其中該複數個固定之複合聚合酶係固定至該支撐物上之預定位點或固定至該支撐物上之隨機位點。
  87. 如請求項84之經工程化聚合酶，其中該塗層包含至少一個包含未分支聚乙二醇(PEG)之親水性聚合物塗層，或其中該塗層包含至少一個包含具有至少4個分支之分支聚乙二醇(PEG)之親水性聚合物塗層。
  88. 如請求項87之經工程化聚合酶，其中該親水性聚合物塗層具有不超過45度之水接觸角。
  89. 如請求項84之經工程化聚合酶，其中該複數個固定之複合聚合酶彼此流體連通以允許試劑溶液流動至該支撐物上，以使該支撐物上之複數個固定之複合聚合酶與該試劑溶液以大規模平行方式反應。
  90. 如請求項67之經工程化聚合酶，其中該複數個複合聚合酶進一步包含第一及第二結合複合物，其中 (i)該第一結合複合物包含第一核酸引子、第一聚合酶及第一多價分子，該第一核酸引子、該第一聚合酶及該第一多價分子結合至多聯體模板分子之第一部分，由此形成第一結合複合物，其中該多價分子之第一核苷酸單元結合至該第一聚合酶，且 (ii)該第二結合複合物包含第二核酸引子、第二聚合酶及該第一多價分子，該第二核酸引子、該第二聚合酶及該第一多價分子結合至該同一多聯體模板分子之第二部分，由此形成第二結合複合物，其中該多價分子之第二核苷酸單元結合至該第二聚合酶， 其中包括同一多價分子的該第一結合複合物及該第二結合複合物形成親合力複合物。
  91. 一種用於形成複數個複合聚合酶之方法，其包含：使複數個經工程化聚合酶在適合於形成各自包含結合至核酸雙螺旋之聚合酶的複數個複合聚合酶之條件下與(i)複數個核酸模板分子，及(ii)複數個核酸引子接觸，其中該核酸雙螺旋包含雜交至核酸引子之核酸模板分子，其中該複數個經工程化聚合酶包含如請求項1、2、36或37中任一項之胺基酸序列。
  92. 如請求項91之方法，其中該複數個核酸模板分子包含線性核酸分子、環狀核酸分子或線性核酸分子與環狀核酸分子之混合物。
  93. 如請求項91之方法，其中該複數個核酸模板分子包含殖株擴增之模板分子。
  94. 如請求項91之方法，其中該複數個核酸分子中之個別核酸模板分子包含所關注目標序列的一個複本，或其中該複數個核酸分子中之個別核酸模板分子包含具有所關注目標序列之兩個或更多個串聯複本的多聯體。
  95. 如請求項91之方法，其中該複數個核酸分子包含相同的所關注目標序列或不同的所關注目標序列。
  96. 如請求項91之方法，其進一步包含：使該複數個複合聚合酶與複數個多價分子接觸，其中該複數個多價分子中之個別多價分子包含： ( a )核心；及 ( b )複數個核苷酸臂，該等臂包含(i)核心連接部分、(ii)間隔子、(iii)連接子及(iv)核苷酸單元，其中該核心經由其核心連接部分連接至該複數個核苷酸臂，其中該間隔子連接至該連接子，且其中該連接子連接至該核苷酸單元。
  97. 如請求項96之方法，其中該連接子包含具有2-6個次單元之脂族鏈或具有2-6個次單元之寡聚乙二醇鏈。
  98. 如請求項96之方法，其中連接至給定核心之該複數個核苷酸臂具有相同類型之核苷酸單元，且其中該等類型之核苷酸單元包含dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP。
  99. 如請求項96之方法，其中該複數個多價分子包含一種類型的多價分子，其中該複數個多價分子中之各者具有選自由以下組成之群的相同類型之核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。
  100. 如請求項96之方法，其中該複數個多價分子包含兩種或更多種類型之多價分子之任何組合的混合物，各類型具有選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
  101. 如請求項96之方法，其中該複數個多價分子中之至少一個多價分子經螢光團標記。
  102. 如請求項96之方法，其中該複數個多價分子中之至少一個多價分子包含經螢光團標記之核心。
  103. 如請求項96之方法，其中該複數個多價分子中之至少一個多價分子包含經螢光團標記之一或多個核苷酸單元。
  104. 如請求項96之方法，其中該接觸係在適於該等多價分子中之至少一者的互補核苷酸單元與該等複合聚合酶中之至少一者結合的條件下進行。
  105. 如請求項96之方法，其進一步包含使該複數個複合聚合酶與抑制聚合酶催化之核苷酸併入的複數個非催化性二價陽離子接觸，其中該等非催化性二價陽離子包含鍶或鋇。
  106. 如請求項91之方法，其進一步包含：使該複數個複合聚合酶與複數個核苷酸接觸，其中該複數個核苷酸中之個別核苷酸包含芳族鹼基、五碳糖及1至10個磷酸酯基。
  107. 如請求項106之方法，其中該複數個核苷酸包含選自由以下組成之群的一種類型之核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。
  108. 如請求項106之方法，其中該複數個核苷酸包含選自由以下組成之群的兩種或更多種類型之核苷酸的任何組合之混合物：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
  109. 如請求項106之方法，其中該複數個核苷酸中之至少一個核苷酸經螢光團標記。
  110. 如請求項106之方法，其中該複數個核苷酸缺乏螢光團標記。
  111. 如請求項106之方法，其中該複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含連接至糖基團之3'碳位置的可移除之鏈終止部分，其中該可移除之鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基團、疊氮基、O-疊氮基甲基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基、矽基或縮醛基，且其中該可移除之鏈終止部分可用化合物裂解，以在該糖基團上產生可延伸之3'OH部分。
  112. 如請求項106之方法，其中該接觸係在適合於使來自該複數個核苷酸之至少一個互補核苷酸結合至至少一個複合聚合酶之條件下進行。
  113. 如請求項106之方法，其進一步包含使該複數個複合聚合酶與促進聚合酶催化之核苷酸併入的複數個催化性二價陽離子接觸，其中該等催化性二價陽離子包含鎂或錳。
  114. 如請求項91之方法，其中該複數個複合聚合酶固定至支撐物或固定至該支撐物上之塗層。
  115. 如請求項114之方法，其中固定至該支撐物之該複數個複合聚合酶的密度包含每平方毫米10 2- 10 12個。
  116. 如請求項114之方法，其中該複數個固定之複合聚合酶係固定至該支撐物上之預定位點，或該複數個固定之複合聚合酶係固定至該支撐物上之隨機位點。
  117. 如請求項114之方法，其中該塗層包含至少一個包含未分支聚乙二醇(PEG)之親水性聚合物塗層，或其中該塗層包含至少一個包含具有至少4個分支之分支聚乙二醇(PEG)之親水性聚合物塗層。
  118. 如請求項117之方法，其中該親水性聚合物塗層具有不超過45度之水接觸角。
  119. 如請求項91之方法，其中該複數個固定之複合聚合酶彼此流體連通以允許試劑溶液流動至該支撐物上，以使該支撐物上之複數個固定之複合聚合酶與該試劑溶液以大規模平行方式反應。
  120. 如請求項96之方法，其包含形成複數個結合複合物，其包含以下步驟： a)使第一核酸引子、第一聚合酶及第一多價分子結合至多聯體模板分子之第一部分，藉此形成第一結合複合物，其中該第一多價分子之第一核苷酸單元結合至該第一聚合酶；及 b)使第二核酸引子、第二聚合酶及該第一多價分子結合至該同一多聯體模板分子之第二部分，藉此形成第二結合複合物，其中該第一多價分子之第二核苷酸單元結合至該第二聚合酶， 其中包括該同一多價分子的該第一結合複合物及該第二結合複合物形成親合力複合物。
  121. 一種用於確定核酸模板之序列的方法，其包含： a)使複數個第一聚合酶與(i)各自包含所關注目標序列的複數個核酸模板及(ii)複數個核酸引子接觸，其中該接觸係在適合於將該複數個第一聚合酶結合至該複數個核酸模板分子及該複數個核酸引子之條件下進行，由此形成複數個第一複合聚合酶，其各自包含結合至核酸雙螺旋之第一聚合酶，其中該核酸雙螺旋包含雜交至核酸引子之核酸模板分子，其中該複數個第一聚合酶包含如請求項1、2或37中任一項之胺基酸序列； b)使該複數個第一複合聚合酶與複數個多價分子接觸以形成複數個多價結合複合物，其中該複數個多價分子中之個別多價分子包含連接至多個核苷酸臂之核心且各核苷酸臂連接至核苷酸單元，其中該接觸係在適合於將該等多價分子之互補核苷酸單元結合至該複數個第一複合聚合酶中之至少兩個的條件下進行，由此形成複數個多價結合複合物，且該條件適用於抑制該等互補核苷酸單元併入該複數個多價結合複合物之引子中； c)偵測該複數個多價結合複合物；及 d)鑑別該複數個多價結合複合物中之互補核苷酸單元的鹼基，從而確定該等核酸模板分子之序列。
  122. 如請求項121之方法，其進一步包含： e)藉由移除該複數個第一聚合酶及其結合之多價分子且保留該複數個核酸雙螺旋，使該複數個多價結合複合物解離； f)使步驟(e)之該複數個所保留核酸雙螺旋與複數個第二聚合酶在適合於將該複數個第二聚合酶結合至該複數個所保留核酸雙螺旋之條件下接觸，藉此形成複數個第二複合聚合酶，其各自包含結合至核酸雙螺旋之第二聚合酶，其中該複數個第二聚合酶包含如請求項1、2或37中任一項之胺基酸序列；及 g)使該複數個第二複合聚合酶與複數個核苷酸接觸，其中該接觸係在適合於將來自該等複數個核苷酸之互補核苷酸結合至該等第二複合聚合酶中之至少兩個的條件下進行，由此形成複數個核苷酸結合複合物，且該條件適合於促進該等核苷酸結合複合物之引子中的該等結合之互補核苷酸之核苷酸併入。
  123. 如請求項122之方法，其中步驟(g)中之該複數個核苷酸包含複數個未經標記之核苷酸。
  124. 如請求項122之方法，其中步驟(g)中之該複數個核苷酸包含複數個經標記之核苷酸，且該方法進一步包含： h)偵測併入核苷酸複合聚合酶之引子中的該等互補核苷酸；及 i)鑑別併入該等核苷酸複合聚合酶之引子中的該等互補核苷酸之鹼基。
  125. 如請求項121之方法，其中步驟(b)之該使該複數個第一複合聚合酶與該複數個多價分子接觸係在抑制聚合酶催化之核苷酸併入的非催化性二價陽離子之存在下進行，其中該非催化性二價陽離子包含鍶或鋇。
  126. 如請求項122之方法，其中步驟(g)之該使該複數個第二複合聚合酶與該複數個核苷酸接觸係在促進聚合酶催化之核苷酸併入的催化性二價陽離子之存在下進行，其中該催化性二價陽離子包含鎂或錳。
  127. 如請求項121之方法，其中步驟(a)中之該複數個核酸模板分子包含殖株擴增之模板分子。
  128. 如請求項121之方法，其中步驟(a)之該複數個核酸分子中之個別核酸模板分子包含所關注目標序列的一個複本，或包含具有所關注目標序列之兩個或更多個串聯複本的多聯體。
  129. 如請求項121之方法，其中步驟(a)中之該複數個核酸分子中之核酸模板分子包含相同的所關注目標序列或不同的所關注目標序列。
  130. 如請求項121之方法，其中該複數個多價分子中之個別多價分子包含： ( a )核心；及 ( b )複數個核苷酸臂，該等臂包含(i)核心連接部分、(ii)間隔子、(iii)連接子及(iv)核苷酸單元，其中該核心經由其核心連接部分連接至該複數個核苷酸臂，其中該間隔子連接至該連接子，且其中該連接子連接至該核苷酸單元。
  131. 如請求項130之方法，其中該連接子包含具有2-6個次單元之脂族鏈或具有2-6個次單元之寡聚乙二醇鏈。
  132. 如請求項130之方法，其中連接至給定核心之該複數個核苷酸臂具有相同類型之核苷酸單元，且其中該等類型之核苷酸單元包含dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP。
  133. 如請求項130之方法，其中該複數個多價分子包含一種類型的多價分子，其中該複數個多價分子中之各者具有選自由以下組成之群的相同類型之核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP。
  134. 如請求項130之方法，其中該複數個多價分子包含兩種或更多種類型之多價分子之任何組合的混合物，各類型具有選自由以下組成之群的核苷酸單元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP。
  135. 如請求項130之方法，其中該複數個多價分子中之至少一個多價分子經螢光團標記。
  136. 如請求項130之方法，其中該複數個多價分子中之至少一個多價分子包含經螢光團標記之核心。
  137. 如請求項130之方法，其中該複數個多價分子中之至少一個多價分子包含經螢光團標記之一或多個核苷酸單元。
  138. 如請求項122之方法，其中步驟(g)中之該複數個核苷酸中之個別核苷酸包含芳族鹼基、五碳糖及1至10個磷酸酯基。
  139. 如請求項138之方法，其中步驟(g)之該複數個核苷酸包含一種類型之選自由dATP、dGTP、dCTP、dTTP及dUTP組成之群的核苷酸，或包含兩種或更多種類型之選自由dATP、dGTP、dCTP、dTTP及/或dUTP組成之群的核苷酸之任何組合的混合物。
  140. 如請求項122之方法，其中步驟(g)中之該複數個核苷酸中之至少一個核苷酸經螢光團標記。
  141. 如請求項122之方法，其中步驟(g)中之該複數個核苷酸缺乏螢光團標記。
  142. 如請求項122之方法，其中步驟(g)之該複數個核苷酸中之至少一個核苷酸包含連接至糖基團之3'碳位置的可移除之鏈終止部分，其中該可移除之鏈終止部分包含烷基、烯基、炔基、烯丙基、芳基、苯甲基、疊氮基團、疊氮基、O-疊氮基甲基、胺基、醯胺基、酮基、異氰酸酯基、磷酸酯基、硫基、二硫基團、碳酸酯基、脲基或矽基，且其中該可移除之鏈終止部分可用化合物裂解，以在該糖基團上產生可延伸之3'OH部分。
  143. 如請求項121之方法，其中步驟(a)中之該複數個第一複合聚合酶固定至支撐物或固定至該支撐物上之塗層。
  144. 如請求項143之方法，其中固定至該支撐物之該複數個第一複合聚合酶的密度包含每平方毫米10 2- 10 12個。
  145. 如請求項143之方法，其中該複數個第一複合聚合酶固定至該支撐物上之預定位點，或固定至該支撐物上之隨機位點。
  146. 如請求項143之方法，其中該塗層包含至少一個包含未分支聚乙二醇(PEG)之親水性聚合物塗層，或其中該塗層包含至少一個包含具有至少4個分支之分支聚乙二醇(PEG)之親水性聚合物塗層。
  147. 如請求項146之方法，其中該親水性聚合物塗層具有不超過45度之水接觸角。
  148. 如請求項121之方法，其中該複數個固定之第一複合聚合酶彼此流體連通以允許試劑溶液流動至該支撐物上，以使該支撐物上之複數個固定之第一複合聚合酶與該試劑溶液以大規模平行方式反應。
  149. 如請求項121之方法，其包含形成複數個結合複合物，其包含以下步驟： a)使第一核酸引子、第一聚合酶及第一多價分子結合至多聯體模板分子之第一部分，藉此形成第一結合複合物，其中該第一多價分子之第一核苷酸單元結合至該第一聚合酶；及 b)使第二核酸引子、第二聚合酶及該第一多價分子結合至該同一多聯體模板分子之第二部分，藉此形成第二結合複合物，其中該第一多價分子之第二核苷酸單元結合至該第二聚合酶， 其中包括該同一多價分子的該第一結合複合物及該第二結合複合物形成親合力複合物。
  150. 如請求項121之方法，其進一步包含： a)使該複數個聚合酶及該複數個核酸引子與多聯體核酸模板分子之不同部分接觸，以在該同一多聯體模板分子上形成至少第一及第二複合聚合酶； b)使複數個多價分子在該同一多聯體模板分子上，在適合於將來自該複數個多價分子之單一多價分子結合至該第一複合聚合酶及該第二複合聚合酶之條件下接觸該等至少第一及第二複合聚合酶，其中該單一多價分子之至少第一核苷酸單元結合至該第一複合聚合酶，該第一複合聚合酶包括與該多聯體模板分子之第一部分雜交的第一引子，由此形成第一結合複合物，且其中該單一多價分子之至少第二核苷酸單元結合至該第二複合聚合酶，該第二複合聚合酶包括與該多聯體模板分子之第二部分雜交的第二引子，由此形成第二結合複合物，及 其中該接觸係在適合於抑制該第一結合複合物及該第二結合複合物中之結合的第一核苷酸單元及第二核苷酸單元之聚合酶催化之併入的條件下進行，及 其中該第一結合複合物及該第二結合複合物結合至該同一多價分子，形成親合力複合物； c)偵測該同一多聯體模板分子上之該第一結合複合物及該第二結合複合物；及 d)鑑別該第一結合複合物中之第一核苷酸單元，從而確定該多聯體模板分子之第一部分的序列，及鑑別該第二結合複合物中之第二核苷酸單元，從而確定該多聯體模板分子之第二部分的序列。
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