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TW202330929A - 包含肝向性殼體蛋白質和α－半乳糖苷酶的ＡＡＶ顆粒及其治療法布立症的用途 - Google Patents

包含肝向性殼體蛋白質和α－半乳糖苷酶的ＡＡＶ顆粒及其治療法布立症的用途 Download PDF

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TW202330929A
TW202330929A TW111132078A TW111132078A TW202330929A TW 202330929 A TW202330929 A TW 202330929A TW 111132078 A TW111132078 A TW 111132078A TW 111132078 A TW111132078 A TW 111132078A TW 202330929 A TW202330929 A TW 202330929A
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TW
Taiwan
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nucleotide sequence
sequence
seq
encoding
protein
Prior art date
Application number
TW111132078A
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Inventor
雲翔 鄒
彼得 佩尚
阿南尼亞 邦加
維洛斯拉達 蘇珊娜 戈多
Original Assignee
美商北海康成製藥有限公司
美商邏輯生物療法公司
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Publication date
Application filed by 美商北海康成製藥有限公司, 美商邏輯生物療法公司 filed Critical 美商北海康成製藥有限公司
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Abstract

本揭示案提供包含經分離之(例如重組)腺相關病毒(AAV)顆粒之組合物，該等顆粒包含用於遞送GAL蛋白質之肝臟向性衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質。本揭示案亦提供包含第一核酸及第二核酸之組合物，該第一核酸編碼肝臟向性衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質，且該第二核酸包含編碼GAL蛋白質之轉基因。本揭示案亦提供用於製備經分離之(例如重組)AAV顆粒之方法，及用於向個體遞送外源性GAL蛋白質之方法及/或用於治療患有GAL相關疾病或病症，例如溶酶體貯積病，例如法布立症(Fabry disease)之個體之方法。

Description

包含肝向性殼體蛋白質和α-半乳糖苷酶的AAV顆粒及其治療法布立症的用途
本發明係關於GAL相關疾病或病症之治療，具體係治療GAL相關疾病或病症之基於AAV的組成物及方法。
相關申請案
本申請案主張2021年8月25日提交之美國臨時申請案第63/237,122號之優先權，其全部內容以引用之方式併入本文中。
溶酶體貯積病係由細胞醣神經鞘脂質、肝醣或黏多醣之積聚引起的一組體染色體隱性疾病，該積聚係由水解酶缺陷導致。法布立症(Fabry disease)係由酶α-半乳糖苷酶(α-GAL)不足引起的若干種溶酶體貯積病中之一種。此酶係身體內的醣神經鞘脂質(諸如球形三醯神經醯胺，亦稱為GL-3或GB-3，及相關醣神經鞘脂質)之日常代謝所必需的。當未發生此脂質及其他類似脂質之適當代謝時，GL-3在整個身體中之大部分細胞中積聚。所導致的進行性脂質積聚引起 細胞損傷。細胞損傷引起廣泛範圍之中度至重度症狀，包括可能危及生命之後果，諸如腎衰竭、心臟衰竭及中風(通常在相對較年輕時)。
通常存在兩種類型之在症狀首次出現時反映個人年齡之法布立症。對於經典類型，症狀在兒童期或青少年期出現。一種標誌性疾病症狀，即手部及腳部之疼痛灼熱感，可早在兩歲時便很明顯。症狀隨時間推移而逐漸惡化。對於遲發性/非典型類型，人們直至30歲或更大的年齡才出現症狀。問題之第一跡象可為腎衰竭或心臟病。
主要藉由使用重組GAL，例如以Fabrazyme®(Genzyme,Inc.)及Replagal®(TKT,Inc.)市售之產品的酶替代療法(ERT)治療法布立症。ERT通常涉及相應野生型蛋白質之純化形式之靜脈內、皮下或肌肉內輸注，或植入生物可侵蝕之固體形式之蛋白質以用於延續釋放。由於所輸注之蛋白質之快速降解，ERT之一個主要問題係達到及維持蛋白質之治療有效量。因此，ERT需要大量的高劑量輸注且因此係昂貴及耗時的。此外，ERT療法具有若干其他注意事項，諸如難以大規模產生、純化及儲存經適當摺疊之蛋白質；獲得經適當醣基化之原生蛋白質；在一些患者中產生抗蛋白質免疫反應；及無法使足以影響具有顯著中樞神經系統受累之疾病的量之蛋白質穿過血腦障壁。
因此，仍長期需要研發用於治療法布立症及改善罹患GAL相關病症之患者中之GAL缺陷之新穎療法。
本揭示案提供用於治療患者中之GAL相關疾病的基於AAV之組合物及方法。特定言之，藉由利用包含肝臟向性衣殼蛋白質(例如，sL65衣殼蛋 白質或LK03衣殼蛋白質)之重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，實現目標蛋白質，例如GAL之優良及高特異性肝臟轉導及表現，由此使本揭示案之rAAV顆粒成為有前景的用於治療GAL相關疾病，諸如法布立症之基因療法候選物。
因此，在一個態樣中，本揭示案提供經分離之重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其包含AAV衣殼蛋白質及核酸，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列且該核酸包含編碼α-半乳糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因。
在一些實施例中，編碼衣殼蛋白質之核酸包含SEQ ID NO：46之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，經編碼之GAL蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因係經密碼子最佳化的。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：3-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因進一步編碼信號序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
在一些實施例中，經編碼之信號序列係由經密碼子最佳化之核酸編碼。
在一些實施例中，經密碼子最佳化之核酸包含SEQ ID NO：8-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
在一些實施例中，經編碼之信號序列係由經密碼子最佳化之核酸編碼。
在一些實施例中，經密碼子最佳化之核酸包含SEQ ID NO：13-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：
(i)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；或
(ii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序 列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：
(i)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(ii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(iii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(iv)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(v)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；或
(viii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因編碼：
(i)信號序列，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列；或
(ii)信號序列，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，經分離之rAAV顆粒進一步包含可操作地連接至核酸之啟動子，該核酸包含編碼GAL蛋白質之轉基因。
在一些實施例中，啟動子包含組織特異性啟動子或泛素啟動子。
在一些實施例中，啟動子包含：
(i)A1AT啟動子、EF-1a啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子及/或其衍生物CAG、CMV立即早期強化子及/或啟動子、β葡糖苷酸酶(GUSB)啟動子、泛素C(UBC)啟動子、神經元特異性烯醇酶(NSE)、血小板衍生之生長因子(PDGF)啟動子、血小板衍生之生長因子B鏈(PDGF-β)啟動子、細胞間黏著分子2(ICAM- 2)啟動子、突觸蛋白(Syn)啟動子、甲基-CpG結合蛋白質2(MeCP2)啟動子、Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白質激酶II(CaMKII)啟動子、代謝型麩胺酸受體2(mGluR2)啟動子、神經纖毛輕鏈(NFL)或神經纖毛重鏈(NFH)啟動子、β-血球蛋白袖珍基因nβ2啟動子、前腦啡肽原(PPE)啟動子、腦啡肽(Enk)及興奮性胺基酸轉運體2(EAAT2)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)啟動子、心血管啟動子、肝臟啟動子、骨骼肌啟動子或其片段(例如，截短形式)或功能性變異體；及/或
(ii)SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，經分離之rAAV顆粒進一步包含反向末端重複(ITR)序列。
在一些實施例中，ITR序列相對於包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸位於5'。
在一些實施例中，ITR序列相對於包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸位於3'。
在一些實施例中，經分離之rAAV顆粒包含相對於包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸位於5'之ITR序列，及相對於包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸位於3'之ITR序列。
在一些實施例中，ITR序列包含SEQ ID NO：17及/或18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，經分離之rAAV顆粒進一步包含強化子。
在一些實施例中，強化子包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，經分離之rAAV顆粒進一步包含內含子區域。
在一些實施例中，內含子區域包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，經分離之rAAV顆粒進一步包含Kozak序列。
在一些實施例中，Kozak序列包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，經分離之rAAV顆粒進一步包含多腺苷酸化(polyA)信號區域。
在一些實施例中，polyA信號區域包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，polyA信號區域包含SEQ ID NO：24之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，經分離之rAAV顆粒進一步包含土拔鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element；WPRE)序列。
在一些實施例中，WPRE序列包含SEQ ID NO：25之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，WPRE序列包含SEQ ID NO：26之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含5' ITR序列、強化子、啟動子序列、Kozak序列、編碼信號序列之核苷酸序列、編碼GAL蛋白質之核苷酸序列、polyA信號區域及3' ITR序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含5' ITR序列、強化子、啟動子序列、Kozak序列、編碼信號序列之核苷酸序列、編碼GAL蛋白質之核苷酸序列、WPRE序列、polyA信號區域及3' ITR序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(ix)3'ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO：25之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(x)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO：25之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：24之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(x)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，經分離之rAAV顆粒包含：
(i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO：26之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
(ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：24之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
(x)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一個態樣中，本發明提供包含第一核酸及第二核酸之組合物，其中該第一核酸編碼AAV衣殼蛋白質，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列，且該第二核酸包含編碼α-葡萄糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因。
在一些實施例中，編碼衣殼蛋白質之第一核酸包含SEQ ID NO：46之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，經編碼之GAL蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因係經密碼子最佳化的。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：3-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因進一步編碼信號序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
在一些實施例中，經編碼之信號序列係由經密碼子最佳化之核酸編碼。
在一些實施例中，經密碼子最佳化之核酸包含SEQ ID NO：8-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
在一些實施例中，經編碼之信號序列係由經密碼子最佳化之核酸編碼。
在一些實施例中，經密碼子最佳化之核酸包含SEQ ID NO：13-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：
(i)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；或
(ii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：
(i)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(ii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(iii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(iv)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(v)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列；
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
(vii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；或
(vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因編碼：
(i)信號序列，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、與其至少70%一致之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ IDNO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列；或
(ii)信號序列，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列、與其至少70%一致之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供經分離之核酸，其包含編碼α-葡萄糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因，其中編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：3-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，轉基因進一步編碼信號序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：8-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之核酸之組合物。
在一個態樣中，本發明提供一種細胞，其包含本發明之經分離之rAAV顆粒或本發明之組合物或本發明之核酸。
在一些實施例中，細胞係哺乳動物細胞、昆蟲細胞或細菌細胞。
在一個態樣中，本發明提供用於製備經分離之重組腺相關病毒(rAAV)顆粒之方法，該方法包含(i)提供包含核酸之宿主細胞，該核酸包含編碼α-葡萄糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因；及(ii)在適合於將轉基因封裝於AAV衣殼蛋白質中之條件下培育宿主細胞，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列；藉此製備經分離之rAAV顆粒。
在另一態樣中，本發明提供用於製備經分離之重組腺相關病毒(rAAV)顆粒之方法，該方法包含(i)提供包含第一核酸之宿主細胞，該第一核酸包含編碼α-葡萄糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因；(ii)將編碼AAV衣殼蛋白質之第二核酸引入宿主細胞中，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列；及(iii)在適合於將轉基因封裝於AAV衣殼蛋白質中之條件下培育宿主細胞；藉此製備經分離之rAAV顆粒。
在一些實施例中，宿主細胞包含哺乳動物細胞、昆蟲細胞或細菌細胞。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之rAAV顆粒及醫藥學上可接受之賦形劑。
在一個態樣中，本發明提供用於向個體遞送外源性GAL蛋白質之方法，其包含投與有效量之本發明之醫藥組合物或本發明之經分離之rAAV顆粒，藉此向個體遞送外源性GAL。
在一些實施例中，個體患有、已診斷患有GAL相關疾病或具有罹患其之風險。
在一些實施例中，GAL相關疾病為溶酶體貯積病。
在另一態樣中，本發明提供用於治療患有或經診斷患有GAL相關疾病之個體之方法，其包含投與有效量之本發明之醫藥組合物或本發明之經分離之rAAV顆粒，藉此治療個體中之GAL相關疾病。
在一個態樣中，本發明提供用於治療患有或經診斷患有溶酶體貯積病之個體之方法，其包含投與有效量之本發明之醫藥組合物或本發明之經分離之rAAV顆粒，藉此治療個體中之溶酶體貯積病。
在一些實施例中，GAL相關疾病或溶酶體貯積病為法布立症。
在一個態樣中，本發明提供經分離之重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其包含AAV病毒基因體及衣殼蛋白質，其中該AAV病毒基因體包含SEQ ID NO：31-41及51-61中之任一者之核酸序列或由其組成且該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供經分離之重組病毒基因體，其包含SEQ ID NO：31-41及51-61中之任一者之核酸序列或由其組成。
本揭示案之各種態樣或實施例之細節闡述於下文中。本揭示案之其他特徵、目標及優點將由說明書及申請專利範圍顯而易見。除非上下文清楚地另外指示，否則在說明書中，單數形式亦包括複數。除非另外定義，否則本文中所用的所有技術及科學術語皆具有與如本揭示案之領域中的一般熟習此項技術者通常所理解相同的含義。在存在衝突的情況下，以本說明書為準。
圖1提供編碼人類α半乳糖苷酶(GAL)蛋白質及信號肽之例示性構築體之示意圖。
圖2描繪AAV-GLA構築體組合之示意圖。展示AAV基因體，其具有由ApoE-A1AT肝特異性啟動子及bGH多腺苷酸化序列控制的原生及經密碼子最佳化之信號肽與人類α半乳糖苷酶(GAL)之成熟肽之各種組合。1-8=第1-8號構築體；ITR=AAV2反向末端重複序列；ApoE=Apo E/C-I HCR-1強化子；A1AT=A1AT啟動子；bgi=β-血球蛋白內含子；bGH A+=牛生長激素多腺苷酸化序列；sp=信號肽；hGLA=原生人類GAL；coA-GLA=sp及GAL之經密碼子最佳化之版本A；coB-GLA=sp及GAL之經密碼子最佳化之版本B；coB-CpG-GLA=CpG減少之sp及GAL之經密碼子最佳化之版本B；sp-IgG1=人類IgG1信號肽之反轉譯序列；coC-IgG1=IgG1信號肽之經密碼子最佳化之版本C；sp-coC-CpG-IgG1=CpG減少之IgG1信號肽之經密碼子最佳化之版本C。
圖3描繪在轉染後72小時，自經轉染之具有質體之HepG2細胞收集的含GAL成熟肽之上清液以及含前驅體及成熟肽之溶解物之西方墨點法 (Western blot)觀測結果。表現原生GLA及經密碼子最佳化之GLA之第1-8號構築體(特定言之，構築體1A-8A)。
圖4描繪在轉染後72小時，自經轉染之具有質體之HepG2細胞收集的上清液及溶解物中藉由ELISA進行之GAL成熟肽之定量。表現原生GLA及經密碼子最佳化之GLA之第1-8號構築體(特定言之，構築體1A-8A)。
圖5描繪在轉染後72小時，自經轉染之具有質體之HepG2細胞收集的上清液中之GAL蛋白質活性之評估。表現原生GLA及經密碼子最佳化之GLA之第1-8號構築體(特定言之，構築體1A-8A)。
圖6描繪來自法布立症小鼠之血漿中的GAL蛋白質活性之評估。在基礎時間點(第0天)及注射後(第7天)收集之樣本中評估活性。
圖7描繪例示性AAV-GLA構築體組合。展示AAV基因體，其具有原生及經密碼子最佳化之信號肽與人類α半乳糖苷酶(GAL)之成熟肽之各種組合。1-11=第1-11號構築體；ITR=AAV2反向末端重複序列；bGH polyA=牛生長激素多腺苷酸化序列；sp=信號肽；hGLA=原生人類GAL；coA-GLA=sp及GAL之經密碼子最佳化之版本A；coB-GLA=sp及GAL之經密碼子最佳化之版本；coB-CpG-GLA=CpG減少之sp及GAL之經密碼子最佳化之版本B；sp-IgG1=人類IgG1信號肽之反轉譯序列；sp-IgG1co=IgG1信號肽之經密碼子最佳化之版本C；sp-IgG1coCpG=CpG減少之IgG1信號肽之經密碼子最佳化之版本C；WPRE=土拔鼠肝炎病毒轉錄後調節元件；W3SL=內部截短之WPRE序列；SV40=SV40 polyA序列。
圖8描繪在轉染後72小時，自經轉染之具有質體之HepG2細胞收集的含GAL成熟肽之上清液以及含前驅體及成熟肽之溶解物之西方墨點法觀 測結果。表現原生GLA及經密碼子最佳化之GLA之第1-11號構築體(特定言之，構築體1B-11B)。
圖9描繪在轉染後72小時，自經轉染之具有質體之HepG2細胞收集的上清液中之GAL蛋白質活性之評估。表現原生GLA及經密碼子最佳化之GLA之第1-11號構築體(特定言之，構築體1B-11B)。
圖10描繪自HepG2細胞收集之上清液中的GAL成熟肽之西方墨點法觀測結果，該等細胞以三種不同MOI(亦即，5E4、1D5及2E5)經封裝至AAV/DJ中之所選擇的構築體轉導。
圖11描繪自HepG2細胞收集之上清液中的GAL蛋白質活性之評估，該等細胞以三種不同MOI(亦即，5E4、1D5及2E5)經封裝至AAV/DJ中之所選擇的構築體轉導。
圖12描繪來自法布立症小鼠之血漿樣本中的GAL蛋白質活性(左側)及溶血-GB3清除率(右側)之評估。以5E11 vg/kg之劑量向法布立症小鼠(n=5隻/組)投與含經密碼子最佳化之構築體(構築體2、4、6、7、8及9)之AAV-DJ。在第6週收集之樣本中評估GAL活性及溶血-GB3水準。
圖13描繪血漿GAL活性與血漿溶血-GB3水準之間的相關性。
圖14描繪來自法布立症小鼠之血漿樣本中的GAL蛋白質活性之評估。以1E13 vg/kg之劑量向法布立症小鼠(n=4隻/組)投與含經密碼子最佳化之構築體(構築體6及9)之AAV-DJ。在給藥前以及第1週、第4週及第6週收集之樣本中評估GAL活性水準。
圖15描繪來自PXB小鼠之血漿樣本中的GAL蛋白質活性(左側)及白蛋白(右側)水準之評估。以3E13 vg/kg之劑量向PXB小鼠(n=4隻/組)投與 含經密碼子最佳化之構築體(構築體6及9)之AAV-SL65。在給藥前以及第2週及第4週收集之樣本中評估GAL活性及白蛋白水準。
圖16描繪藉由白蛋白對照物標準化之血漿GAL蛋白質活性。
相關申請案
本申請案主張2021年8月25日提交之美國臨時申請案第63/237,122號之優先權，其全部內容以引用之方式併入本文中。
本揭示案提供一種組合物，其包含經分離之(例如重組)病毒顆粒，例如腺相關病毒(AAV)顆粒，該等顆粒包含用於遞送目標蛋白質，例如GAL蛋白質之肝臟向性衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質或LK03衣殼蛋白質，及用於向個體遞送外源性GAL蛋白質之方法，及/或用於使用本揭示案之AAV顆粒治療患有GAL相關疾病或病症，例如溶酶體貯積病，例如法布立症之個體之方法。
本揭示案亦提供包含第一核酸及第二核酸之組合物，其中該第一核酸編碼AAV衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列，且該第二核酸包含編碼GAL蛋白質之轉基因。
腺相關病毒為細小病毒科(Parvoviridae family)之小型無包膜二十面體衣殼病毒，其特徵在於單股DNA病毒基因體。細小病毒科病毒由兩種亞科組成：感染脊椎動物之細小病毒亞科(Parvovirinae)，及感染無脊椎動物之濃核病毒亞科(Densovirinae)。AAV能夠在脊椎動物宿主中複製，該等宿主包括(但不限 於)人類、靈長類動物、牛、犬科動物、馬及綿羊物種。細小病毒及細小病毒科之其他成員通常描述於Kenneth I.Berns,「Parvoviridae：The Viruses and Their Replication」，第69章，Fields Virology(第3d版，1996)中，其內容以全文引用之方式併入本文中。
已證實AAV由於其相對簡單的結構、其在不整合至宿主基因體中及不複製之情況下感染廣泛細胞(包括靜止及分裂細胞)之能力及其相對良性的免疫原性概況而適用作生物學工具。病毒之基因體可經修飾以含有用於組裝功能性重組病毒或病毒顆粒之最小組分，該功能性重組病毒或病毒顆粒負載有或經工程改造以表現或遞送可遞送至目標細胞、組織或生物體之所需核酸構築體或有效負載，例如轉基因、編碼多肽之多核苷酸，例如GLA蛋白質。在一些實施例中，目標細胞為肝臟細胞。在一些實施例中，目標組織為肝臟組織。
基因療法呈現用於法布立症之替代性方法。AAV由於多種有利特徵而通常用於基因療法方法中。不希望受理論約束，咸信在一些實施例中，本文中所描述之AAV顆粒可用於投與及/或遞送GAL蛋白質(例如，GAL及相關蛋白質)，以達成持續及高濃度，從而與非AAV療法相比實現更長的持續性功效、更少的劑量治療、廣泛生物分佈及/或更穩定的GAL蛋白質水準。
本文中所描述之組合物及方法與先前酶替代方法相比提供經改良之特徵，包括(i)增加細胞、組織(例如，肝細胞或組織)中之GAL活性；(ii)使整個肝臟中之生物分佈增加及均勻，及/或(iii)提高肝臟中之有效負載表現，例如GLA mRNA表現。本文中所描述之組合物及方法可用於治療與缺乏GAL蛋白質及/或GAL活性相關之病症，諸如溶酶體貯積病，例如法布立症。
I.定義
如本文中所使用，以下術語中之各者在此章節中具有與其相關之含義。
本文中使用冠詞「一(a及an)」指代該冠詞之一個或超過一個(亦即，至少一個)文法賓語。作為實例，「元件」意謂一個元件或超過一個元件，例如複數個元件。
術語「包括」在本文中用於意謂片語「包括(但不限於)」且可與其互換使用。
除非上下文以其他方式明確指示，否則術語「或」在本文中用於意謂術語「及/或」且可與其互換使用。
α-半乳糖苷酶(GAL)：如本文中所使用，術語「α-半乳糖苷酶(GAL)」，亦稱為α-GAL、GALA、半乳糖基半乳糖基葡糖基神經醯胺酶、吉立酶(gelibiase)、α-D-半乳糖苷酶A、α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶1、阿加糖酶α(agalsidase alfa)、α-gal A及阿加糖酶，係指使末端α-半乳糖苷部分自醣脂及醣蛋白水解之溶酶體酶。如本文中所使用，術語「GAL」、「GAL蛋白質」、「GAL酶」、「α-GAL」、「alpha-GAL」及其類似術語係指包括GLA基因(Ensemble基因ID：ENSG00000102393)之肽之蛋白質產物或蛋白質產物部分，其同源物或變異體，以及其異種同源物，包括非人類蛋白質及其同源物。GAL蛋白質包括GLA基因產物之片段、衍生物及修飾。人類GLA之例示性胺基酸及核苷酸序列展示於表1中。
腺相關病毒(AAV)：如本文中所使用，術語「腺相關病毒」或「AAV」係指依賴病毒屬(dependovirus genus)之成員或其變異體，例如功能性變異體。在一些實施例中，AAV係野生型或天然存在的。在一些實施例中，AAV係重組的。
AAV顆粒：如本文中所使用，「AAV顆粒」係指包含AAV衣殼(例如，AAV衣殼變異體)及多核苷酸(例如，病毒基因體)之顆粒或病毒粒子。在一些實施例中，AAV顆粒之病毒基因體包含至少一個有效負載區域及至少一個ITR。在一些實施例中，AAV顆粒能夠將編碼有效負載之核酸(例如，有效負載區域)遞送至細胞，該等細胞通常為哺乳動物(例如，人類)細胞。在一些實施例中，本揭示案之AAV顆粒可以重組方式製備。在一些實施例中，AAV顆粒可衍生自本文中所描述或此項技術中已知之任何血清型，包括血清型之組合(例如「假模式化」AAV)，或衍生自各種基因體(例如，單股的或自互補的)。在一些實施例中，AAV顆粒可為複製缺陷型及/或靶向型。在一些實施例中，AAV顆粒可包含存在於(例如，插入)衣殼中以增強針對所需目標組織之向性的肽，例如靶向肽。應理解，對本揭示案之AAV顆粒之提及亦包括其醫藥組合物，即使未明確地敍述。
AAV載體：如本文中所使用，術語「AAV載體」或「AAV構築體」係指衍生自腺相關病毒血清型之載體。「AAV載體」係指包括AAV核苷酸序列以及異源核苷酸序列之載體。AAV載體僅需要145個順式鹼基末端重複序列即可產生病毒。所有其他病毒序列係非必需的且可以反式提供(Muzyczka(1992)Curr.Topics Microbiol.Immunol.158：97-129)。通常，rAAV載體基因體將僅保留反向末端重複(ITR)序列，以便最大化可由載體有效封裝之轉基因之尺寸。ITR無需為野生型核苷酸序列且可變化，例如藉由核苷酸之插入、缺失或取代，只要序列實現功能性救援、複製及封裝即可。
投與：如本文中所使用，術語「投與」個體包括藉由任何適用於將組合物遞送至個體中之所需部位之途徑將本發明之組合物分配、遞送或施用 至個體。替代地或組合地，藉由局部、腸胃外或經口途徑、腦內注射、肌肉內注射、皮下/皮內注射、靜脈內注射、經頰投與、經皮遞送以及藉由直腸、結腸、陰道、鼻內或呼吸道途徑進行之投與來進行遞送。
衣殼：如本文中所使用，術語「衣殼」係指病毒顆粒(例如，AAV顆粒)之外部，例如蛋白質殼，其實質上(例如，>50%、>60%、>70%、>80%、>90%、>95%、>99%或100%)為蛋白質。在一些實施例中，衣殼為AAV衣殼，其包含本文中所描述之AAV衣殼蛋白質，例如VP1、VP2及/或VP3多肽。AAV衣殼蛋白質可為野生型AAV衣殼蛋白質或變異體，例如來自野生型或參考衣殼蛋白質之結構性及/或功能性變異體，在本文中稱為「AAV衣殼變異體」。在一些實施例中，本文中所描述之AAV衣殼變異體具有封裝(例如囊封)病毒基因體之能力及/或能夠進入細胞，例如哺乳動物細胞。在一些實施例中，衣殼蛋白質為sL65衣殼蛋白質，如本文中所描述。
密碼子最佳化：如本文中所使用，術語「密碼子最佳化」係指按以下方式改變既定基因之密碼子的方法：由該基因編碼之多肽序列保持相同，而經改變之密碼子改良多肽序列之表現過程。舉例而言，若多肽具有人類蛋白質序列且表現於大腸桿菌(E.coli)中，則表現通常將在對DNA序列進行密碼子最佳化以將人類密碼子變成對於大腸桿菌中之表現而言更有效之密碼子時得到改良。
接觸：如本文中所使用，術語「接觸」(亦即，使細胞與試劑接觸)意欲包括在活體外共同培育試劑及細胞(例如，將試劑添加至含細胞之培養物中)或向個體投與試劑，使得試劑與個體之細胞在活體內接觸。術語「接觸」不意欲 包括使細胞暴露於可能天然存在於個體中之試劑(亦即，可能作為天然生理學過程之結果發生之暴露)。
GAL相關病症：術語「GAL相關病症」、「GAL相關疾病」及其類似術語係指具有GLA基因缺陷之疾病或病症，該缺陷諸如GLA中之遺傳性(例如，X性聯)突變，其引起患者細胞中之GAL蛋白質表現之不足或缺陷。GAL相關病症包括(但不限於)溶酶體貯積病，例如法布立症。
法布立症：如本文中所使用，術語「法布立症」，亦稱為α-半乳糖苷酶A不足、安德森-法布立症(Anderson-Fabry disease)、彌漫性軀幹血管角化瘤、彌漫性血管角化瘤及GAL不足，係指罕見的遺傳性鞘醣脂代謝病症，其係由溶酶體酶，即α-半乳糖苷酶A(GAL)之活性缺失或明顯不足引起。此酶係身體內的醣神經鞘脂質(諸如球形三醯神經醯胺，亦稱為GL-3或GB-3，及相關醣神經鞘脂質)之日常代謝所必需的。當未發生此脂質及其他類似脂質之適當代謝時，GL-3在整個身體中之大部分細胞中積聚。所導致的進行性脂質積聚引起細胞損傷。細胞損傷引起廣泛範圍之中度至重度症狀，包括可能危及生命之後果，諸如腎衰竭、心臟衰竭及中風(通常在相對較年輕時)。通常存在兩種類型之在症狀首次出現時反映個人年齡之法布立症。對於經典類型，症狀在兒童期或青少年期出現。一種標誌性疾病症狀，即手部及腳部之疼痛灼熱感，可早在兩歲時便很明顯。症狀隨時間推移而逐漸惡化。對於遲發性/非典型類型，人們直至30歲或更大的年齡才出現症狀。問題之第一跡象可為腎衰竭或心臟病。
輔助功能：如本文中所使用，如本文中所使用之術語「輔助功能」係指編碼多肽之基因，AAV依賴於該等多肽發揮之功能來進行複製(亦即，「輔助功能」)。輔助功能包括AAV複製所需之功能，包括(但不限於)涉及AAV基 因轉錄之活化、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、帽表現產物之合成及AAV衣殼組裝之部分。基於病毒之輔助功能可衍生自任何已知輔助病毒，諸如腺病毒、疱疹病毒、桿狀病毒及痘瘡病毒。輔助功能包括(但不限於)腺病毒E1、E2a、VA及E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52及UL29，以及疱疹病毒聚合酶。在一個實施例中，輔助功能不包括腺病毒E1。
經分離：如本文中所使用，術語「經分離」係指自天然狀態改變或移除，例如自在天然狀態下與其相關之至少一些組分改變或移除之物質或實體。舉例而言，天然存在於活的動物中之核酸或肽係未「經分離」的，但自天然狀態下之共存材料部分或完全分離的相同核酸或肽係「經分離」的。經分離之核酸或蛋白質可以實質上經純化之形式存在，或可存在於非原生環境(諸如宿主細胞)中。此類多核苷酸可為載體之一部分及/或此類多核苷酸或多肽可為組合物之一部分，且仍為經分離的，因為此類載體或組合物不為在自然界中發現其之環境之一部分。在一些實施例中，經分離之核酸係重組的，例如併入載體中。
溶酶體貯積病：如本文中所使用，術語「溶酶體貯積病」或「溶酶體貯積病」係指遺傳性代謝疾病，其特徵在於由酶缺陷引起之身體細胞中的各種有毒物質之異常積聚。溶酶體貯積病影響身體之不同部分，包括骨骼、腦部、皮膚、心臟及中樞神經系統。例示性溶酶體貯積病包括(但不限於)法布立症、龐貝氏病(Pompe disease)、高歇氏病(Gaucher disease)、泰薩克斯病(Tay Sachs disease)、胱胺酸症、巴登氏病(Batten disease)、天冬胺醯葡萄糖胺尿症、桑德霍夫氏病(Sandhoff disease)、異染性腦白質營養不良、黏脂貯積症、辛德勒氏病(Schindler disease)及尼曼-匹克氏病(Niemann-Pick disease)。在各種情況下，溶酶 體貯積病係由引起酶缺失或不足之先天性代謝異常導致，引起身體之各種細胞中的不當物質貯積。大部分溶酶體貯積病係以體染色體隱性方式遺傳。
突變：如本文中所使用，術語「突變」係指改變及/或變化。在一些實施例中，突變可為對蛋白質(包括肽及多肽)及/或核酸(包括多核酸)進行之改變及/或變化。在一些實施例中，突變包含對蛋白質及/或核酸序列進行的改變及/或變化。此類改變及/或變化可包含一或多個胺基酸(在蛋白質及/或肽的情況下)及/或核苷酸(在核酸及多核酸的情況下)之添加、取代及/或缺失。在其中突變包含胺基酸及/或核苷酸之添加及/或取代的實施例中，此類添加及/或取代可包含1個或更多個胺基酸及/或核苷酸殘基，且可包括經修飾之胺基酸及/或核苷酸。一或多種突變可產生例如核酸序列或多肽或蛋白質序列之「突變體」、「衍生物」或「變異體」。
天然存在：如本文中所使用，「天然存在」或「野生型」意謂在不存在人工輔助或不涉及人工處理之情況下存在於自然界中。「天然存在」或「野生型」可指代生物分子、序列或實體之原生形式。
核酸：如本文中所使用，術語「核酸」、「多核苷酸」及「寡核苷酸」係指由多去氧核糖核苷酸(含有2-去氧-D-核糖)或多核糖核苷酸(含有D-核糖)構成的任何核酸聚合物，或任何其他類型的多核苷酸，亦即嘌呤或嘧啶鹼基之N醣苷或經修飾之嘌呤或嘧啶鹼基。在術語「核酸」、「多核苷酸」及「寡核苷酸」之間不存在有意的長度區別，且此等術語可互換地使用。此等術語僅指分子之一級結構。因此，此等術語包括雙股及單股DNA，以及雙股及單股RNA。
可操作地連接：如本文中所使用，片語「可操作地連接」係指在兩個或更多個分子、構築體、轉錄物、實體、部分或其類似物之間的功能性連接。
顆粒：如本文中所使用，「顆粒」為包含至少兩種組分，即蛋白質衣殼及封裝於該衣殼內之多核苷酸序列的病毒。
患者：如本文中所使用，「患者」係指可能尋求或需要治療、要求治療、正在接受治療、即將接受治療之個體，或受到經過訓練(例如，得到許可)的專業人員針對特定疾病或病狀之照護之個體。
有效負載：如本文中所使用，「有效負載」或「有效負載區域」或「轉基因」係指一或多個由病毒基因體編碼或在病毒基因體內編碼之多核苷酸或多核苷酸區域，或此類多核苷酸或多核苷酸區域之表現產物，例如轉基因、編碼多肽之多核苷酸。
有效負載構築體：如本文中所使用，「有效負載構築體」為編碼或包含在一側或兩側上藉由反向末端重複(ITR)序列側接之有效負載的一或多個多核苷酸區域。有效負載構築體係在病毒產生細胞中複製以產生病毒基因體之模板。
有效負載構築體載體：如本文中所使用，「有效負載構築體載體」係編碼或包含有效負載構築體及用於在細菌細胞中之複製及表現之調節區之載體。有效負載構築體載體亦可包含用於病毒複製細胞中之病毒表現的組分。
肽：如本文中所使用，術語「肽」係指長度小於或等於約50個胺基酸，例如長度為約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸之胺基酸鏈。
醫藥學上可接受：片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在合理的醫學判斷範疇內，適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過 敏反應或其他問題或併發症，與合理益處/風險比相匹配的化合物、材料、組合物及/或劑型。
醫藥學上可接受之賦形劑：如本文中所使用，如本文中所使用之術語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指除活性劑(例如本文中所描述)以外之任何存在於醫藥組合物中且具有在個體中實質上無毒性及無發炎性之特性的成分。在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑為能夠使活性劑懸浮及/或溶解之媒劑。賦形劑可包括例如：抗黏劑、抗氧化劑、結合劑、塗料、壓縮助劑、崩解劑、染料(顏料)、潤膚劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或塗料、調味劑、芳香劑、助流劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷油墨、吸附劑、懸浮劑或分散劑、甜味劑或水合水。賦形劑包括(但不限於)：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣(磷酸氫二鈣)、硬脂酸鈣、交聯羧甲纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯普維酮(crospovidone)、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、普維酮(povidone)、預膠凝化澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、棕櫚酸視黃酯、蟲膠、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥基乙酸澱粉鈉、山梨醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維生素A、維生素E、維生素C及/或木糖醇。
醫藥組合物；如本文中所使用，術語「醫藥組合物」或「醫藥學上可接受之組合物」包含AAV多核苷酸、AAV基因體、或AAV顆粒以及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、溶劑、佐劑及/或其類似物。
多肽：如本文中所使用，術語「多肽」係指由在一條鏈中結合在一起的大量胺基酸殘基組成之有機聚合物。單體蛋白質分子為多肽。
預防：如本文中所使用，術語「預防」係指部分或完全地延遲感染、疾病、病症及/或病狀之發作；部分或完全地延遲特定感染、疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特徵或臨床表現的發作；部分或完全地延遲特定感染、疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特徵或表現的發作；部分或完全地延遲感染、特定疾病、病症及/或病狀之進程；及/或降低產生與感染、疾病、病症及/或病狀相關之病變的風險。
啟動子：如本文中所使用，術語「啟動子」係指聚合酶將結合以起始轉錄(DNA至RNA)或反轉錄(RNA至DNA)的核酸位點。
調節序列：如本文中所使用，術語「調節序列」意欲包括啟動子、強化子及其他表現控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。此類調節序列描述於例如Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中。調節序列引導核苷酸序列在多種類型之宿主細胞中之組成性表現、具有組成性活性、誘導型以及引導核苷酸序列僅在某些宿主細胞中之表現(例如組織特異性調節序列)之調節序列。可將本揭示案之表現載體引入宿主細胞，藉此產生由如本文中所描述之核酸編碼之蛋白質或其部分，包括融合蛋白質或其部分。
血清型：如本文中所使用，術語「血清型」係指基於表面抗原的AAV之衣殼中的不同變化形式，其允許在亞種層面上對AAV進行流行病學分類。
信號序列：如本文中所使用，片語「信號序列」係指在蛋白質合成期間可引導蛋白質向內質網之轉運或定位之序列。
類似性：如本文中所使用，術語「類似性」係指聚合分子之間，例如多核苷酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。聚合分子彼此之類似性百分比的計算可以與一致性百分比之計算相同的方式進行，不同之處在於計算類似性百分比時考慮保守性取代，如此項技術中所理解。
個體：如本文中所使用，術語「個體」或「患者」係指可例如出於實驗、診斷、預防及/或治療目的向其投與根據本揭示案之組合物的任何生物體。類似地，「個體」或「患者」係指可能尋求、可能需要、正在接受或即將接受治療，或受到針對特定疾病或病狀經過訓練的專業人員之照護的生物體。典型個體包括動物(例如，哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類及人類)。在某些實施例中，個體或患者可能易患或疑似患有GAL相關病症，例如溶酶體貯積病，例如法布立症。在某些實施例中，個體或患者可經診斷患有法布立症。
實質上：如本文中所使用，術語「實質上」係指呈現總或大致總範圍或程度之相關特徵或特性之定性條件。一般熟習生物學技術者應理解，生物及化學現象很少(若曾經)進行完全及/或繼續進行至完全或獲得或避免絕對結果。因此，本文中使用術語「實質上」以獲得許多生物及化學現象中所固有的完整性之潛在缺乏。
治療劑：術語「治療劑」係指當向個體投與時，具有治療、診斷及/或預防作用及/或引起所需生物學及/或藥理學作用之任何藥劑。
治療有效量：如本文中所使用，術語「治療有效量」意謂當向罹患或易患感染、疾病、病症及/或病狀之個體投與時，足以治療該感染、疾病、病症及/或病狀，改良其症狀、對其進行診斷、預防及/或延遲其發作的所遞送之 藥劑(例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、預防劑等)之量。在一些實施例中，治療有效量係以單次劑量形式提供。在一些實施例中，治療有效量係以包含複數個劑量之給藥方案投與。熟習此項技術者將瞭解，在一些實施例中，若單位劑型所包含之量在作為此類給藥方案之一部分投與時有效，則可認為該單位劑型包含治療有效量之特定藥劑或實體。
治療：如本文中所使用，術語「治療」係指部分或完全減輕、減緩、改良、緩解、逆轉、延遲特定感染、疾病、病症及/或病狀之發作、抑制其進展、降低其嚴重度及/或降低其一或多個症狀或特徵之發生率。出於降低產生與疾病、病症及/或病狀相關之病變的風險的目的，可向未呈現該疾病、病症及/或病狀之病徵的個體及/或向僅呈現該疾病、病症及/或病狀之早期病徵的個體投與治療。
載體：如本文中所使用，「載體」為轉運、轉導或以其他方式充當異源分子之載體之任何分子或部分。本揭示案之載體可以重組方式產生且可基於及/或可包含腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。此類親本或參考AAV序列可充當用於對載體進行工程改造之原始、第二、第三或後續序列。在非限制性實例中，此類親本或參考AAV序列可包含以下序列中之任何一或多者：編碼多肽或多重多肽之多核苷酸序列，其可具有野生型或自野生型修飾之序列且該序列可編碼蛋白質、蛋白質域或GAL蛋白質及其變異體之一或多個子單元之全長或部分序列；編碼GAL蛋白質及其變異體之多核苷酸，其可具有野生型或自野生型修飾之序列；及編碼GAL蛋白質及其變異體之轉基因，其可為或可不為自野生型序列修飾。
病毒構築體載體：如本文中所使用，「病毒構築體載體」係包含一或多個編碼或包含Rep及/或Cap蛋白質之多核苷酸區域之載體。病毒構築體載體亦可包含一或多個編碼或包含用於病毒複製細胞中之病毒表現的組分之多核苷酸區域。
病毒基因體：如本文中所使用，「病毒基因體」或「載體基因體」係包含至少一個反向末端重複序列(ITR)及至少一個經編碼之有效負載的多核苷酸。病毒基因體編碼有效負載之至少一個複本。
野生型：如本文中所使用，「野生型」係生物分子、序列或實體之原生形式。
本揭示案之方法之各種其他態樣進一步詳細描述於以下子章節中。
II.本揭示案之組合物
本揭示案提供包含經分離之，例如重組病毒顆粒(例如，腺相關病毒(AAV)顆粒)之組合物，該等病毒顆粒包含用於遞送蛋白質，例如GAL蛋白質之肝臟向性衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質或LK03衣殼蛋白質，及該等組合物用於治療患有GAL相關疾病或病症，例如溶酶體貯積病，例如法布立症之個體之用途。
本揭示案亦提供包含第一核酸及第二核酸之組合物，其中該第一核酸編碼AAV衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列，且該第二核酸包含編碼GAL蛋白質之轉基因。
屬於細小病毒科之依賴病毒屬及如本文中所使用之AAV病毒包括已知的AAV病毒之超過100種血清型中之任何血清型。通常，AAV病毒之血清型具有在胺基酸及核酸層面上具有顯著同源性之基因體序列、提供一系列相同的遺傳功能、產生在生理及功能方面基本等效之病毒粒子，以及經由幾乎相同的機制複製及組裝。
AAV基因體之長度係約4.7千鹼基，且由正義或反義單股去氧核糖核酸(ssDNA)構成。基因體包含兩個開放閱讀框架(ORF)，其編碼負責複製之蛋白質(Rep)及衣殼之結構性蛋白質(Cap)。開放閱讀框架由充當病毒基因體之複製起點的兩個反向末端重複序列(ITR)側接。rep框架係由編碼Rep蛋白質之四個重疊基因(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40)製成。帽框架含有三個衣殼蛋白質之重疊核苷酸序列：VP1、VP2及VP3。Rep蛋白質對於複製及封裝而言係重要的，而衣殼蛋白質經組裝以產生AAV之蛋白質外殼，或AAV衣殼。參見Carter B,Adeno-associated virus and adeno-associated virus vectors for gene delivery,Lassie D等人編，「Gene Therapy：Therapeutic Mechanisms and Strategies」(Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,US,2000)及Gao G等人，J.Virol.2004；78(12)：6381-6388。
AAV載體通常需要共同輔助物以經歷細胞中之生產性感染。在不存在此類輔助功能之情況下，AAV病毒顆粒基本上進入宿主細胞但未整合至細胞之基因體中。
由於若干獨特的特徵，已研究將AAV載體用於遞送基因治療劑。該等特徵之非限制性實例包括：(i)感染分裂及非分裂細胞之能力；(ii)廣泛的感染性宿主範圍，包括人類細胞；(iii)野生型AAV尚未與任何疾病相關及尚未證實在經感染之細胞中複製；(iv)缺乏針對載體的細胞介導之免疫反應，及(v)宿主 染色體中的非整合性質，由此降低長期基因變化之可能性。此外，AAV載體感染對於改變細胞基因表現模式之影響最小(Stilwell及Samulski等人，Biotechniques,2003,34,148，其內容以全文引用之方式併入本文中)。
通常，用於GAL蛋白質遞送之AAV載體可為重組病毒載體，其由於在病毒基因體內缺乏編碼功能性Rep及Cap蛋白之序列而具有複製缺陷性。在一些情況下，缺陷性AAV載體可缺乏大部分或所有編碼序列且基本上僅含有一個或兩個AAV ITR序列及有效負載序列。
在某些實施例中，經分離之，例如重組AAV顆粒包含衣殼蛋白質，例如肝臟向性衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質，及包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸。在一些實施例中，轉基因進一步編碼信號序列。
在一些實施例中，可將本揭示案之AAV顆粒引入哺乳動物細胞、昆蟲細胞或細菌細胞中。
AAV載體可經修飾以增強遞送效率。本揭示案之此類經修飾之AAV載體可有效封裝且用於在高頻率及最小毒性下成功地感染目標細胞。
在一些實施例中，本揭示案之AAV顆粒可用於向特定器官或組織，例如肝臟遞送GAL蛋白質(參見例如國際專利申請案第PCT/AU2021/050158/號；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
如本文中所使用，術語「AAV載體」或「AAV顆粒」包含衣殼及病毒基因體，該病毒基因體包含有效負載。如本文中所使用，「有效負載」或「有效負載區域」係指一或多個由病毒基因體編碼或在病毒基因體內編碼之多核苷酸或多核苷酸區域或此類多核苷酸或多核苷酸區域之表現產物，例如轉基因、編碼多肽或多重多肽(例如，GAL蛋白質)之多核苷酸。
應理解，本文中所描述之組合物可具有對其功能無實質性影響的其他保守性或非必需胺基酸取代。
AAV血清型
如本文中所使用，「AAV血清型」主要由AAV衣殼定義。本揭示案之AAV顆粒可包含或衍生自任何天然或重組AAV血清型。特定言之，AAV顆粒可利用或基於血清型或包括肝臟向性AAV衣殼，例如sL65衣殼蛋白質，及其變異體之胺基酸序列。
證明包含sL65衣殼蛋白質之AAV顆粒具有靶向肝臟之衣殼的若干必需屬性。特定言之，包含sL65衣殼蛋白質之AAV顆粒在非人類靈長類動物中具有優良的肝臟轉導及轉基因表現。此外，證實包含sL65衣殼蛋白質之AAV顆粒具有高肝臟特異性轉導，其降低由非目標組織中之轉基因表現引起之安全性問題風險。此外，包含sL65衣殼蛋白質之AAV顆粒引起整個肝臟中之廣泛及均勻分佈，使其可理想地用於細胞內及基於分泌型蛋白質之基因療法。最終，包含sL65衣殼蛋白質之AAV顆粒可實現可縮放式生物反應器中之高產率製備，由此使得能夠製造具有成本效益的產物。
在一個態樣中，本揭示案提供經分離之，例如重組AAV顆粒，其包含衣殼蛋白質及核酸，該核酸包含編碼本文中所描述之GAL蛋白質之轉基因。在一些實施例中，衣殼蛋白質包含AAV衣殼蛋白質。在一些實施例中，衣殼蛋白質包含sL65 VP1衣殼蛋白質或其功能性變異體。
在一些實施例中，AAV衣殼可包含如國際專利申請案第PCT/AU2021/050158號中所描述之序列、其片段或變異體，該案之內容以全文引用之方式併入本文中，諸如PCT/AU2021/050158之AAV-C11.11(亦稱為SEQ ID NO：12)。編碼衣殼蛋白質之核酸包含核苷酸序列，如國際專利申請案第PCT/AU2021/050158號中所描述，諸如AAV-C11.11(亦稱為SEQ ID NO：31)。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白質可包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列、其片段或變異體。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白質可由SEQ ID NO：46之核酸序列、其片段或變異體編碼。
在一些實施例中，AAV顆粒(例如，用於本文中所描述之GAL蛋白質之載體化遞送之AAV顆粒)之AAV血清型係sL65或其變異體。在一些實施例中，本文中所描述之AAV顆粒，例如重組AAV顆粒包含sL65衣殼蛋白質。
在一些實施例中，衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、或99%序列一致性)之胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白質包含由SEQ ID NO：46之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%序列一致性)之核苷酸序列編碼之胺基酸序列。在一些實施例中，編碼衣殼蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：46之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%序列一致性)之序列。
在一些實施例中，衣殼蛋白質包含LK03衣殼蛋白質或其功能性變異體。在一些實施例中，AAV衣殼可包含序列、其片段或變異體，如國際專利申請公開案第WO2013029030A1號中所描述，該案之內容以全文引用之方式併入本文中，諸如WO2013029030A1之SEQ ID NO：31。編碼衣殼蛋白質之核酸 包含核苷酸序列，如國際專利申請案第WO2013029030A1號中所描述，諸如SEQ ID NO：4。
AAV病毒基因體
在一些態樣中，本揭示案之重組AAV顆粒充當表現載體，其包含編碼GAL蛋白質之病毒基因體。在一些實施例中，病毒基因體可編碼GAL蛋白質及信號肽。
在一些實施例中，重組AAV顆粒，例如用於本文中所描述之GAL蛋白質之載體化遞送之重組AAV顆粒，包含AAV病毒基因體，或包含病毒基因體之AAV載體。在一些實施例中，病毒基因體進一步包含以下中之一或多者：反向末端重複序列(ITR)區域；強化子(例如，ApoE/C1強化子)；啟動子(例如，hA1At啟動子)；內含子區域(例如，人類β-血球蛋白截短之內含子)；Kozak序列；編碼轉基因之核酸，該轉基因編碼有效負載(例如，本文中所描述之GAL蛋白質)；土拔鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)序列；poly A信號區域；或其組合。
病毒基因體組分：反向末端重複序列(ITR)
在一些實施例中，病毒基因體可包含至少一個反向末端重複序列(ITR)區域。本揭示案之AAV顆粒包含具有至少一個ITR區域及有效負載區域(亦即，編碼蛋白質，例如GAL蛋白質之轉基因)之病毒基因體。ITR序列相對於有效負載區域位於5'或3'。在一些實施例中，病毒基因體具有兩個ITR。此兩個ITR在5'及3'端處側接有效負載區域。在一些實施例中，ITR發揮包含用於複製之識別位點的複製起點之功能。在一些實施例中，ITR包含可互補及以對稱方式配置之序列 區域。在一些實施例中，併入本文中所描述之病毒基因體中之ITR可包含天然存在之多核苷酸序列或以重組方式衍生之多核苷酸序列。
ITR可衍生自與衣殼相同的血清型或其衍生物。ITR可具有與衣殼不同的血清型。在一些實施例中，AAV顆粒具有超過一個ITR。在非限制性實例中，AAV顆粒具有包含兩個ITR之病毒基因體。在一些實施例中，ITR具有彼此相同之血清型。在另一實施例中，ITR具有不同血清型。非限制性實例包括零個、一個或兩個具有與衣殼相同之血清型的ITR。在一些實施例中，AAV顆粒之病毒基因體之兩個ITR皆為AAV2 ITR。
獨立地，各ITR之長度可為約100至約150個核苷酸。在一些實施例中，ITR之長度係100-180個核苷酸，例如長度係約100-115、約100-120、約100-130、約100-140、約100-150、約100-160、約100-170、約100-180、約110-120、約110-130、約110-140、約110-150、約110-160、約110-170、約110-180、約120-130、約120-140、約120-150、約120-160、約120-170、約120-180、約130-140、約130-150、約130-160、約130-170、約130-180、約140-150、約140-160、約140-170、約140-180、約150-160、約150-170、約150-180、約160-170、約160-180或約170-180個核苷酸。ITR長度之非限制性實例係長度為120、130、140、141、142、145個核苷酸。
在一些實施例中，ITR包含SEQ ID NO：17-18中之任一者之核苷酸序列或與前述序列中之任一者實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。
病毒基因體組分：啟動子及表現強化子
在一些實施例中，病毒基因體包含至少一種用於增強轉基因目標特異性及表現之元件。用於增強轉基因目標特異性及表現之元件之非限制性實例包括啟動子、內源性miRNA、轉錄後調節元件(PRE)、多腺苷酸化(PolyA)信號序列、上游強化子(USE)、CMV強化子及內含子。參見例如Powell等人，Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,2015；其內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可藉由特異性啟動子來驅動目標細胞中之多肽之表現，該啟動子包括(但不限於)物種特異性、誘導型、組織特異性或細胞循環特異性啟動子(Parr等人，Nat.Med.3：1145-9(1997)；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，病毒基因體包含足以實現由轉基因編碼之有效負載(例如，GAL蛋白質)之表現(例如，在目標細胞中)之啟動子。在一些實施例中，當啟動子驅動在AAV顆粒之病毒基因體之有效負載區域中經編碼之多肽之表現時，認為其係有效的。
在一些實施例中，當啟動子驅動目標細胞或組織中之表現時，認為其係有效的啟動子。
在一些實施例中，啟動子驅動GAL蛋白質在目標組織中持續一段時間之表現。由啟動子驅動之表現可持續1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2週、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3週、22 天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超過10年之時段。表現可持續1至5小時、1至12小時、1至2天、1至5天、1至2週、1至3週、1至4週、1至2個月、1至4個月、1至6個月、2至6個月、3至6個月、3至9個月、4至8個月、6至12個月、1至2年、1至5年、2至5年、3至6年、3至8年、4至8年或5至10年。
在一些實施例中，啟動子驅動多肽(例如，GAL多肽)之表現持續至少1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年或超過65年。
啟動子可為天然存在的或非天然存在的。啟動子之非限制性實例包括病毒啟動子、植物啟動子及哺乳動物啟動子。在一些實施例中，啟動子可為人類啟動子。在一些實施例中，啟動子可為截短的。
在一些實施例中，病毒基因體包含引起一或多種(例如，多種)細胞及/或組織中之表現之啟動子，例如泛素啟動子。在一些實施例中，驅動或促進大部分哺乳動物組織中之表現之啟動子包括(但不限於)人類延長因子1α-子單元 (EF1α)、巨細胞病毒(CMV)立即早期強化子及/或啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖苷酸酶(GUSB)及泛素C(UBC)。組織特異性表現元件可用於將表現限於某些細胞類型，該等細胞類型諸如(但不限於)肝特異性啟動子、CNS特異性啟動子、B細胞啟動子、單核球啟動子、白血球啟動子、巨噬細胞啟動子、胰臟腺泡細胞啟動子、內及/細胞啟動子、肺組織啟動子、星狀細胞啟動子，或各種可用於將表現限於例如神經元、星狀細胞或寡樹突細胞之特異性神經系統細胞或組織型啟動子。例示性啟動子包括(但不限於)EF-1a啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子及/或其衍生物CAG、CMV立即早期強化子及/或啟動子、β葡糖苷酸酶(GUSB)啟動子、泛素C(UBC)啟動子、神經元特異性烯醇酶(NSE)、血小板衍生之生長因子(PDGF)啟動子、血小板衍生之生長因子B鏈(PDGF-β)啟動子、細胞間黏著分子2(ICAM-2)啟動子、突觸蛋白(Syn)啟動子、甲基-CpG結合蛋白質2(MeCP2)啟動子、Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白質激酶II(CaMKII)啟動子、代謝型麩胺酸受體2(mGluR2)啟動子、神經纖毛輕鏈(NFL)或重鏈(NFH)啟動子、β-血球蛋白袖珍基因nβ2啟動子、前腦啡肽原(PPE)啟動子、腦啡肽(Enk)及興奮性胺基酸轉運體2(EAAT2)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)啟動子、心血管啟動子(例如，αMHC、cTnT及CMV-MLC2k)、肝臟啟動子(例如，hA1AT、TBG)、骨骼肌啟動子(例如，肌間線蛋白、MCK、C512)或其片段(例如，截短物)或功能性變異體。
在一些實施例中，啟動子為泛素啟動子，如Yu等人，(Molecular Pain 2011,7：63)、Soderblom等人，(E.Neuro 2015)、Gill等人，(Gene Therapy 2001,第8卷，1539-1546)及Husain等人，(Gene Therapy 2009)中所描述，其各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，病毒基因體包含肝臟特異性啟動子，例如引起有效負載在肝臟細胞及/或組織中之表現之啟動子。在一些實施例中，肝臟特異性啟動子為人類α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與前述序列實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。
在一些實施例中，啟動子可小於1kb。啟動子之長度可為200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800個或超過800個核苷酸。啟動子之長度可在200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800個核苷酸之間。
在一些實施例中，啟動子可為相同或不同起始或親本啟動子(諸如(但不限於)CMV及CBA)之兩個或更多個組分之組合。各組分之長度可為200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800個或超過800個核苷酸。各組分之長度可在200-300、200-400、200-500、200-600、200- 700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800個核苷酸之間。
在一些實施例中，病毒基因體包含兩個啟動子。作為非限制性實例，啟動子係A1AT啟動子及CMV啟動子。
在一些實施例中，病毒基因體包含強化子元件。強化子元件，在本文中亦稱為「強化子」，可為(但不限於)組織特異性強化子，例如肝臟特異性強化子，例如人類脂蛋白元E/C-I(ApoE/C-I)基因座(或肝臟控制區)。在一些實施例中，強化子包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與前述序列實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。在一些實施例中，強化子為CMV強化子。
在一些實施例中，病毒基因體包含強化子及/或啟動子。在一些實施例中，強化子為ApoE/C-I強化子。在一些實施例中，啟動子為A1AT啟動子。在一些實施例中，病毒基因體包含ApoE/C-I強化子及人類A1AT啟動子。
在一些實施例中，病毒基因體包含經工程改造之啟動子。在另一實施例中，病毒基因體包含來自天然表現之蛋白質之啟動子。
病毒基因體組分：內含子
在一些實施例中，病毒基因體包含至少一種內含子或其片段或衍生物。在一些實施例中，該至少一種內含子可增強如本文中所描述之GAL蛋白質之表現。內含子之非限制性實例包括人類β-血球蛋白內含子(例如，長度為476bp之內部截短之人類β-血球蛋白內含子2)、MVM(67-97bp)、F.IX截短之內含子1(300bp)、β-血球蛋白SD/免疫球蛋白重鏈剪接受體(250bp)、腺病毒剪接供體/免疫球 蛋白剪接受體(500bp)、SV40晚期剪接供體/剪接受體(19S/16S)(180bp)及雜交腺病毒剪接供體/IgG剪接受體(230bp)。
在一些實施例中，內含子之長度可為100-500個核苷酸。內含子之長度可為80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500個核苷酸。內含子之長度可在80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500個核苷酸之間。
在一些實施例中，病毒基因體可包含人類β-血球蛋白內含子或其片段或變異體。在一些實施例中，內含子包含一或多個人類β-血球蛋白序列(例如，包括其片段/變異體)。在一些實施例中，啟動子可為人類A1AT啟動子。
在一些實施例中，內含子包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與前述序列中之任一者實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。
在一些實施例中，經編碼之蛋白質可位於表現載體中之內含子(諸如(但不限於)SV40內含子或β血球蛋白內含子或此項技術中已知的其他內含子)之下游。此外，經編碼之GAL蛋白質亦可位於表現載體中之多腺苷酸化序列之上游。在一些實施例中，經編碼之蛋白質可位於自包含內含子之啟動子之下游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或超過30、40、50、60或70個核 苷酸以內(例如，相對於包含內含子之啟動子之3')及/或表現載體中之多腺苷酸化序列之上游(例如，相對於多腺苷酸化序列之5')。在一些實施例中，經編碼之GAL蛋白質可位於自內含子之下游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30、25-30、30-35、35-40、45-50、50-55、55-60、60-65或65-70個核苷酸以內(例如，相對於內含子之3')及/或表現載體中之多腺苷酸化序列之上游(例如，相對於多腺苷酸化序列之5')。在一些實施例中，經編碼之蛋白質可位於自內含子之下游的前1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%或超過25%的核苷酸以內(例如，相對於內含子之3')及/或表現載體中之多腺苷酸化序列之上游(例如，相對於多腺苷酸化序列之5')。在一些實施例中，經編碼之蛋白質可位於自內含子之下游的前1-5%、1-10%、1-15%、1-20%、1-25%、5-10%、5-15%、5-20%、5-25%、10-15%、10-20%、10-25%、15-20%、15-25%或20-25%之序列以內(例如，相對於內含子之3')及/或表現載體中之多腺苷酸化序列之上游(例如，相對於多腺苷酸化序列之5')。
在某些實施例中，內含子序列不為強化子序列。在一些實施例中，內含子序列不為啟動子序列之子組分。在一些實施例中，內含子序列係啟動子序列之子組分。
病毒基因體組分：非轉譯區(UTR)
在一些實施例中，基因之野生型非轉譯區(UTR)經轉錄但未經轉譯。通常，5' UTR起始於轉錄起始位點且結束於起始密碼子，且3' UTR緊隨終止密碼子之後起始且持續直至轉錄終止信號為止。
可將通常發現於特定目標器官之充分表現之基因中的特性工程改造至UTR中以增強穩定性及蛋白質產生。作為非限制性實例，來自通常表現於肝臟中之mRNA(例如，白蛋白、血清類澱粉蛋白A、脂蛋白元A/B/E、運鐵蛋白、α胎蛋白、紅血球生成素或因子VIII)的5' UTR可用於本揭示案之AAV顆粒之病毒基因體中，以增強肝臟細胞株或肝臟中之表現。
在一些實施例中，編碼本文中所描述之轉基因(例如，編碼GAL蛋白質之轉基因)之病毒基因體包含Kozak序列。
雖然不希望受理論約束，但野生型5'非轉譯區(UTR)包括在轉譯起始中起作用之特徵。Kozak序列通常包括於5' UTR中，通常已知Kozak序列與核糖體用於起始多種基因之轉譯之過程相關。Kozak序列具有共同CCR(A/G)CCAUGG，其中R係起始密碼子(ATG)上游之嘌呤(腺嘌呤或鳥嘌呤)三鹼基，繼之為另一個『G』。在一些實施例中，有利於脊椎動物mRNA中的轉譯之起始之環境係GCCACCatgG(SEQ ID NO：42)(M.Kozak,1996,Mammalian Genome 7：563)。在一些實施例中，Kozak序列包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與前述序列實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。
儘管不希望受理論約束，但已知野生型3' UTR中嵌有腺苷及尿苷之延伸部分。此等富含AU之標記在具有高轉化率之基因中尤其普遍。富含AU之元件(ARE)基於其序列特徵及功能特性可分成三種類別(Chen等人，1995，其內容以全文引用之方式併入本文中)：I類ARE，諸如(但不限於)c-Myc及MyoD，在富含U之區域內含有若干個分散之AUUUA模體之複本。II類ARE，諸如(但不限於)GM-CSF及TNF-a，具有兩個或更多個重疊的UUAUUUA(U/A)(U/A)九 聚體。III類ARE，諸如(但不限於)c-Jun及成肌素，定義不太明確。此等富含U之區域不含AUUUA模體。已知大部分結合於ARE之蛋白質使信使去穩定化，而已證實ELAV家族成員(最顯著地，HuR)可提高mRNA之穩定性。HuR與所有三種類別之ARE結合。將HuR特異性結合位點工程改造至核酸分子之3' UTR中將引起HuR結合，且因此引起活體內訊息之穩定。
3' UTR富含AU之元件(ARE)之引入、移除或修飾可用於調節多核苷酸之穩定性。在工程改造特異性多核苷酸(例如，病毒基因體之有效負載區域)時，可引入ARE之一或多個複本以降低多核苷酸之穩定性，且藉此減少所得蛋白質之轉譯且降低其產量。類似地，可鑑別ARE且將其移除或使其突變以增加細胞內穩定性，且因此增加所得蛋白質之轉譯及產生。
在一些實施例中，病毒基因體之3' UTR可包括用於模板化添加poly-A尾區之寡(dT)序列。
在一些實施例中，病毒基因體之3' UTR可包括土拔鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。在一些實施例中，WPRE包含SEQ ID NO：25之核苷酸序列或與前述序列實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。在一些實施例中，WPRE包含SEQ ID NO：26之內部截短之核苷酸序列W3SL，或與前述序列實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。
來自此項技術中已知之任何基因的任何UTR可併入AAV顆粒之病毒基因體中。此等UTR或其部分可以與基因中相同之定向置放，其中該等UTR係選自該基因，或其定向或位置可變化。在一些實施例中，用於AAV顆粒之病毒基因體中之UTR可經倒轉、縮短、延長或製成具有此項技術中已知的一或多 個其他5' UTR或3' UTR。如本文中所使用，在與UTR相關時，術語「變化」意謂UTR相對於參考序列已以某種方式改變。舉例而言，3'或5' UTR可如上文所教示藉由定向或位置的變化而相對於野生型或原生UTR發生改變，或可藉由包含其他核苷酸、核苷酸之缺失、核苷酸之交換或轉位而發生改變。
在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個人工UTR，其不為野生型UTR之變異體。
在一些實施例中，病毒基因體包含UTR，該等UTR係選自其中蛋白質共有共同功能、結構、特徵或特性之轉錄物之家族。
病毒基因體組分：多腺苷酸化序列
在一些實施例中，本揭示案之病毒基因體包含至少一個多腺苷酸化(polyA)序列。本揭示案之病毒基因體可包含位於有效負載編碼序列之3'端與3' ITR之5'端之間的多腺苷酸化序列。在一些實施例中，polyA信號區域相對於包含編碼有效負載(例如，本文中所描述之GAL蛋白質)之轉基因之核酸位於3'。
在一些實施例中，polyA信號區域之長度係約100-600個核苷酸，例如約100-500個核苷酸、約100-400個核苷酸、約100-300個核苷酸、約100-200個核苷酸、約200-600個核苷酸、約200-500個核苷酸、約200-400個核苷酸、約200-300個核苷酸、約300-600個核苷酸、約300-500個核苷酸、約300-400個核苷酸、約400-600個核苷酸、約400-500個核苷酸或約500-600個核苷酸。在一些實施例中，polyA信號區域之長度係約100至150個核苷酸，例如約127個核苷酸。在一些實施例中，polyA信號區域之長度係約450至500個核苷酸，例如約477個核苷酸。在一些實施例中，polyA信號區域之長度係約520至 約560個核苷酸，例如約552個核苷酸。在一些實施例中，polyA信號區域之長度係約127個核苷酸。
在一些實施例中，病毒基因體包含牛生長激素(bGH)polyA序列。在一些實施例中，polyA序列包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與前述序列實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。
在一些實施例中，病毒基因體包含SV40 polyA序列。在一些實施例中，polyA序列包含SEQ ID NO：24之核苷酸序列或與前述序列實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。
病毒基因體組分：填充序列
在一些實施例中，病毒基因體包含一或多個填充序列。填充序列可為野生型序列或經工程改造之序列。填充序列可為野生型序列之變異體。在一些實施例中，填充序列為人類白蛋白之衍生物。
在一些實施例中，病毒基因體包含一或多個填充序列，以使得病毒基因體之長度係用於封裝之最佳尺寸。在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個填充序列，以使得病毒基因體之長度係約2.3kb。在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個填充序列，以使得病毒基因體之長度係約4.6kb。
在一些實施例中，病毒基因體包含單股(ss)病毒基因體且包含一或多個填充序列，該一或多個填充序列獨立地或共同具有大致在0.1kb-3.8kb之間的長度，諸如(但不限於)0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、 2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb或3.8kb。在一些實施例中，載體基因體中之全長填充序列係3.1kb。在一些實施例中，載體基因體中之全長填充序列係2.7kb。在一些實施例中，載體基因體中之全長填充序列係0.8kb。在一些實施例中，載體基因體中之全長填充序列係0.4kb。在一些實施例中，載體基因體中之各填充序列之長度係0.8kb。在一些實施例中，載體基因體中之各填充序列之長度係0.4kb。
在一些實施例中，病毒基因體包含自互補(sc)病毒基因體且包含一或多個填充序列，該一或多個填充序列獨立地或共同具有大致在0.1kb-1.5kb之間的長度，諸如(但不限於)0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb或1.5kb。在一些實施例中，載體基因體中之全長填充序列係0.8kb。在一些實施例中，載體基因體中之全長填充序列係0.4kb。在一些實施例中，載體基因體中之各填充序列之長度係0.8kb。在一些實施例中，載體基因體中之各填充序列之長度係0.4kb。
在一些實施例中，病毒基因體包含填充序列之任何部分。病毒基因體可包含1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%之填充序列。
在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個填充序列，且填充序列相對於5' ITR序列位於3'。在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個填充序列，且填充序列相對於啟動子序列位於5'。在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個填充序列，且填充序列相對於多腺苷酸化信號序列位於3'。在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個填充序列，且填充序列相對於3' ITR序列位於5'。 在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個填充序列，且填充序列位於兩個內含子序列之間。在一些實施例中，病毒基因體包含至少一個填充序列，且填充序列位於內含子序列內。在一些實施例中，病毒基因體包含兩個填充序列，且第一填充序列相對於5' ITR序列位於3'且第二填充序列相對於多腺苷酸化信號序列位於3'。在一些實施例中，病毒基因體包含兩個填充序列，且第一填充序列相對於啟動子序列位於5'且第二填充序列相對於多腺苷酸化信號序列位於3'。在一些實施例中，病毒基因體包含兩個填充序列，且第一填充序列相對於5' ITR序列位於3'且第二填充序列相對於5' ITR序列位於5'。
在一些實施例中，病毒基因體可包含病毒基因體之更多個區域中之一者之間的一或多個填充序列。在一些實施例中，填充區域可位於諸如(但不限於)有效負載區域、反向末端重複序列(ITR)、啟動子區域、內含子區域、強化子區域、多腺苷酸化信號序列區域及/或外顯子區域的區域之前。在一些實施例中，填充區域可位於諸如(但不限於)有效負載區域、反向末端重複序列(ITR)、啟動子區域、內含子區域、強化子區域、多腺苷酸化信號序列區域及/或外顯子區域的區域之後。在一些實施例中，填充區域可位於諸如(但不限於)有效負載區域、反向末端重複序列(ITR)、啟動子區域、內含子區域、強化子區域、多腺苷酸化信號序列區域及/或外顯子區域的區域之前及之後。
在一些實施例中，病毒基因體包含5' ITR之後的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含啟動子區域之後的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含有效負載區域之後的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含內含子區域之後的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含強化子區域之後 的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含多腺苷酸化信號序列區域之後的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含外顯子區域之後的填充序列。
在一些實施例中，病毒基因體包含啟動子區域之前的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含有效負載區域之前的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含內含子區域之前的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含強化子區域之前的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含多腺苷酸化信號序列區域之前的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含外顯子區域之前的填充序列。在一些實施例中，病毒基因體包含3' ITR之前的填充序列。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如(但不限於)5' ITR與啟動子區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如(但不限於)5' ITR與有效負載區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如(但不限於)5' ITR與內含子區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如(但不限於)5' ITR與強化子區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域之間，諸如(但不限於)5' ITR與多腺苷酸化信號序列區域之間。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域，諸如(但不限於)啟動子區域與有效負載區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域，諸如(但不限於)啟動子區域與內含子區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域，諸如(但不限於)啟動子區域與強化子區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域，諸如(但不限於)啟動子區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域，諸如(但不限於)啟動子區域與 外顯子區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域，諸如(但不限於)啟動子區域與3' ITR之間。
在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域，諸如(但不限於)有效負載區域與內含子區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域，諸如(但不限於)有效負載區域與強化子區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域，諸如(但不限於)有效負載區域與多腺苷酸化信號序列區域之間。在一些實施例中，填充序列可位於兩個區域，諸如(但不限於)有效負載區域與外顯子區域之間。
病毒基因體組分：有效負載
在一些實施例中，重組AAV顆粒，例如用於GAL蛋白質之載體化遞送之AAV顆粒包含編碼有效負載之病毒基因體。在一些實施例中，病毒基因體包含可操作地連接至包含編碼有效負載之轉基因之核酸之啟動子。在一些實施例中，有效負載包含GAL蛋白質。
在一些實施例中，本文中之揭示內容提供構築體，其實現經改良之由基因療法載體遞送之GAL蛋白質之表現及/或活性。
在一些實施例中，本揭示案提供實現經改良之由基因療法載體遞送之GAL蛋白質之生物分佈之構築體。
在一些實施例中，本揭示案提供實現經改良之由基因療法載體遞送之GAL蛋白質之亞細胞分配或運輸之構築體。
在一些實施例中，本揭示案提供實現經改良之由基因療法載體遞送之GAL蛋白質向溶酶體膜之運輸之構築體。
在一些態樣中，本發明係關於包含經分離之重組AAV顆粒之組合物，該顆粒包含肝臟向性衣殼蛋白質(例如，sL65衣殼蛋白質)及核酸序列，該核酸序列包含編碼GAL蛋白質或其功能性片段或變異體之轉基因，及在個體，例如疾病(例如GAL相關疾病，例如溶酶體貯積病，例如法布立症)之人類及/或動物模型一個活體外或活體內投與或遞送組合物之方法。
本揭示案之AAV顆粒可包含編碼至少一個「有效負載」之核酸序列。如本文中所使用，「有效負載」或「有效負載區域」係指由病毒基因體編碼或在病毒基因體內編碼之一或多個多核苷酸或多核苷酸區域或此類多核苷酸或多核苷酸區域之表現產物，例如轉基因、編碼多肽或多重多肽(例如GAL蛋白質或其片段或變異體)之多核苷酸。有效負載可包含此項技術中已知的任何適用於GAL蛋白質在目標細胞中之表現(藉由補充蛋白質產物或使用調節性核酸進行基因置換)之核酸，該目標細胞係經攜帶有效負載之AAV顆粒轉導或與其接觸。
用於如本文中所描述之AAV基因體中的編碼GAL之轉基因之特定特徵包括使用野生型GAL編碼序列及經密碼子最佳化之GAL編碼構築體。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因係野生型GAL編碼序列且編碼野生型GAL蛋白質或其功能性變異體。在一些實施例中，功能性變異體係保留其野生型對應物之一些或全部活性以便達成所需治療作用的變異體。舉例而言，在一些實施例中，功能性變異體可有效地用於基因療法中以治療病症或病狀，例如GLA基因產物不足或GAL相關病症，例如溶酶體貯積病，例如法布立症。除非另外指明，否則如本文中所描述之GAL蛋白質之變異體(例如，在本揭示案之構築體、載體、基因體、方法、套組、組合物等之情形下)係功能性變異體。在一些實施例中，GAL蛋白質包含野生型GAL蛋白質(例如， GAL蛋白質NP_000160.1)之胺基酸1-429。在一些實施例中，GAL蛋白質包含野生型GAL蛋白質之胺基酸32-429。在一些實施例中，經編碼之GAL蛋白質可衍生自任何物種，諸如(但不限於)人類、非人類靈長類動物或嚙齒動物。
在一些實施例中，病毒基因體包含編碼人類(智人)GAL蛋白質或其變異體之有效負載區域(或轉基因)。
Figure 111132078-A0202-12-0064-66
在一些實施例中，病毒基因體包含編碼多肽之核酸序列，該多肽與如表1中所提供之人類GAL蛋白質序列或其片段具有至少85%，例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。
在一些實施例中，GAL蛋白質係衍生自非人類靈長類動物(諸如食蟹獼猴(cynomolgus monkey)、長尾獼猴(Macaca fascicularis))之GAL蛋白質編碼序列。某些實施例提供呈長尾獼猴序列之人類化版本形式之GAL蛋白質。
在一些實施例中，病毒基因體包含編碼食蟹獼猴或食蟹(長尾)獼猴(長尾獼猴)GAL蛋白質或其變異體之有效負載區域。
在一些實施例中，病毒基因體包含編碼恆河猴(rhesus macaque)(恆河獼猴(Macaca mulatta))GAL蛋白質或其變異體之有效負載區域。
在一些實施例中，由轉基因編碼之GAL蛋白質可包含與上文所描述及表1中所提供之胺基酸序列中之任一者具有50%、51%、52%、53%、54%、 55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，GAL蛋白質可由與上文所描述及表1中所提供之核酸序列中之任一者具有50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之核酸序列編碼。
如本文中所描述之GAL蛋白質有效負載可編碼任何GAL蛋白質或GAL蛋白質之任何部分或衍生物，且不限於表1中所提供之GAL蛋白質或蛋白質編碼序列。
在一些實施例中，GAL蛋白質或其功能性變異體包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之胺基酸。
在一些實施例中，編碼GAL之轉基因包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與SEQ ID NO：2實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。
在一些實施例中，亦可使用編碼相同或實質上相同的GAL蛋白質胺基酸序列(例如，具有至少約90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列)之經密碼子最佳化及其他的變異體。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因針對哺乳動物細胞(包括人類細胞)中之表現經密碼子最佳化，諸如SEQ ID NO：3-5中所闡述之序列或與任何前述序列實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核苷酸序列。
有效負載構築體可包含編碼及非編碼核酸序列之組合。
病毒基因體之任何區段、片段或整個病毒基因體及其中之有效負載區域可經密碼子最佳化。
在一些實施例中，病毒基因體編碼一或多種有效負載。作為非限制性實例，可將編碼一或多種有效負載之病毒基因體複製及封裝至病毒顆粒中。經包含一或多種有效負載之病毒顆粒轉導之目標細胞可表現單一細胞中之各有效負載。
在一些實施例中，病毒基因體可對編碼或非編碼RNA進行編碼。在某些實施例中，腺相關病毒載體顆粒進一步包含至少一個選自由以下組成之群之順式元件：Kozak序列、主鏈序列及內含子序列。
在一些實施例中，有效負載係多肽，其可為肽或蛋白質。由有效負載構築體編碼之蛋白質可包含分泌型蛋白質、細胞內蛋白質、細胞外蛋白質及/或膜蛋白質。經編碼之蛋白質可為結構性或功能性的。由病毒基因體編碼之蛋白質包括(但不限於)哺乳動物蛋白質。在某些實施例中，AAV顆粒含有編碼GAL蛋白質或其片段或變異體之病毒基因體。本文中所描述之AAV顆粒可適用於人類疾病、獸醫學應用以及各種活體內及活體外情形之領域。
在一些實施例中，有效負載可包含充當用於評估細胞轉型及表現之標記蛋白質的多肽、融合蛋白質、具有所需生物學活性之多肽、可補充遺傳缺 陷之基因產物、RNA分子、轉錄因子及在調節及/或表現方面感興趣的其他基因產物。在一些實施例中，有效負載可包含提供所需作用或調節功能之核苷酸序列(例如，轉位子、轉錄因子)。
經編碼之有效負載可包含基因療法產物。基因療法產物可包括(但不限於)多肽、RNA分子或在表現於目標細胞中時提供所需治療作用的其他基因產物。在一些實施例中，基因療法產物可包含非功能性基因或不存在、以不足量表現或突變之基因的替代物。在一些實施例中，基因療法產物可包含非功能性蛋白質或多肽或不存在、以不足量表現、摺疊異常、降解過於迅速或突變之蛋白質或多肽的替代物。舉例而言，基因療法產物可包含GAL蛋白質或編碼GAL蛋白質之多核苷酸以治療GAL不足或GAL相關病症。
在一些實施例中，有效負載編碼信使RNA(mRNA)。如本文中所使用，術語「信使RNA」(mRNA)係指感興趣的多肽且能夠轉譯以在活體外、活體內、原位或離體產生經編碼的感興趣的多肽的任何多核苷酸。某些實施例提供編碼GAL或其變異體之mRNA。
mRNA之組分包括(但不限於)編碼區、5'-UTR(非轉譯區)、3'-UTR、5'-帽及poly-A尾區。在一些實施例中，經編碼之mRNA或AAV基因體之任何部分可經密碼子最佳化。
在一些實施例中，由編碼GAL或其變異體之有效負載構築體編碼的蛋白質或多肽之長度在約50與約4500個胺基酸殘基之間(在下文中，在此情形下，「長度為X個胺基酸」係指X個胺基酸殘基)。在一些實施例中，經編碼之蛋白質或多肽之長度在50-2000個胺基酸之間。在一些實施例中，經編碼之蛋白質或多肽之長度在50-1000個胺基酸之間。在一些實施例中，經編碼之蛋白質 或多肽之長度在50-1500個胺基酸之間。在一些實施例中，經編碼之蛋白質或多肽之長度在50-1000個胺基酸之間。在一些實施例中，經編碼之蛋白質或多肽之長度在50-800個胺基酸之間。在一些實施例中，經編碼之蛋白質或多肽之長度在50-600個胺基酸之間。在一些實施例中，經編碼之蛋白質或多肽之長度在50-400個胺基酸之間。在一些實施例中，經編碼之蛋白質或多肽之長度在50-200個胺基酸之間。在一些實施例中，經編碼之蛋白質或多肽之長度在50-100個胺基酸之間。
編碼有效負載之有效負載構築體可包含或編碼可選標記物。可選標記物可包含基因序列或由表現於宿主細胞中之基因序列編碼之蛋白質或多肽，其允許自可或可不表現可選標記物之細胞群體鑑別、選擇及/或純化宿主細胞。在一些實施例中，可選標記物提供抗性以經受選擇過程(諸如用抗生素處理),該選擇過程原本將殺死宿主細胞。在一些實施例中，抗生素可選標記物可包含一或多種抗生素抗性因子，包括(但不限於)新黴素(neomycin)抗性(例如neo)、潮黴素(hygromycin)抗性、卡那黴素(kanamycin)抗性及/或嘌呤黴素(puromycin)抗性。
在一些實施例中，編碼有效負載之有效負載構築體可包含可選標記物，包括(但不限於)β-內醯胺酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶或任何其他報導基因，如同該術語在此項技術中所理解，包括細胞表面標記物，諸如CD4或經截短之神經生長因子(NGFR)(關於GFP，參見WO 96/23810；Heim等人，Current Biology 2：178-182(1996)；Heim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)；或Heim等人，Science373：663-664(1995)；關於β-內醯胺酶，參見WO 96/30540)；該等文獻中之各者之內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，編碼可選標記物之有效負載構築體可包含螢光蛋白。如本文中所描述之螢光蛋白可包含任何螢光標記物，包括(但不限於)綠色、黃色及/或紅色螢光蛋白(GFP、YFP及/或RFP)。在一些實施例中，編碼可選標記物之有效負載構築體可包含人類流感血球凝集素(HA)標籤。
在某些實施例中，用於在目標細胞中表現有效負載之核酸將併入病毒基因體中且位於兩個ITR序列之間。
有效負載組分：信號序列
在一些實施例中，包含編碼有效負載(例如，GAL蛋白質)之轉基因之核酸序列包含編碼信號序列(例如，本文中之信號序列區域)之核酸序列。在一些實施例中，包含編碼有效負載之轉基因之核酸序列包含兩個信號序列區域。在一些實施例中，包含編碼有效負載之轉基因之核酸序列包含三個或更多個信號序列區域。
在一些實施例中，編碼信號序列之核苷酸序列相對於編碼GAL蛋白質之核苷酸序列位於5'。在一些實施例中，經編碼之GAL蛋白質包含N端處之信號序列，其中信號序列視情況在GAL蛋白質之細胞處理及/或定位期間裂解。
在一些實施例中，信號序列為GAL蛋白質(例如，人類GAL蛋白質)之原生信號序列。
在一些實施例中，人類GAL信號序列可包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與SEQ ID NO：6實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之胺基酸序列。在一些實施例中，信號序列可包含相對於SEQ ID NO：6具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列。
在一些實施例中，人類GAL信號序列可由SEQ ID NO：7之核酸序列或與SEQ ID NO：7實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列編碼。
在一些實施例中，編碼人類GAL信號序列之核酸係經密碼子最佳化的。在一些實施例中，信號序列可由SEQ ID NO：8-10中之任一者之核酸序列或與SEQ ID NO：8-10中之任一者實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列編碼。
在一些實施例中，信號序列係異源信號序列。
在一些實施例中，異源信號序列係人類或小鼠IgG1信號序列。
在一些實施例中，小鼠及人類IgG1信號序列可包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與SEQ ID NO：11實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之胺基酸序列。在一些實施例中，信號序列可包含相對於SEQ ID NO：11具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列。
在一些實施例中，人類IgG1信號序列可由SEQ ID NO：12之核酸序列或與SEQ ID NO：12實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列編碼。
在一些實施例中，小鼠IgG1信號序列可由SEQ ID NO：12之核酸序列或與SEQ ID NO：12實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列編碼。
在一些實施例中，編碼IgG1信號序列(例如，小鼠及/或人類序列)之核酸係經密碼子最佳化的。在一些實施例中，信號序列可由SEQ ID NO：13或 14之核酸序列或與SEQ ID NO：13或14實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列編碼。
在一些實施例中，異源信號序列係合成IgG1信號序列。
在一些實施例中，合成IgG1信號序列可包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列或與SEQ ID NO：15實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之胺基酸序列。在一些實施例中，信號序列可包含相對於SEQ ID NO：15具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列。
在一些實施例中，合成IgG1信號序列可包含SEQ ID NO：16之核酸序列或與SEQ ID NO：16實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列，例如人類GAL信號肽包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與SEQ ID NO：6實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之胺基酸序列；且經編碼之GAL蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列相對於經編碼之GAL蛋白質位於N端。在一些實施例中，具有人類GAL信號肽序列之經編碼之GAL蛋白質包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列或與SEQ ID NO：27實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之胺基酸序列。
在一些實施例中，編碼人類GAL信號序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO：7-10中之任一者之核苷酸序列或與SEQ ID NO：7-10中之任一者實質上一 致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列，且編碼GAL蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與SEQ ID NO：2-5中之任一者實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
在一些實施例中，編碼信號序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與SEQ ID NO：7實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列，且編碼GAL蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與SEQ ID NO：2實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
在一些實施例中，編碼信號序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列或與SEQ ID NO：8實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列，且編碼GAL蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與SEQ ID NO：3實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
在一些實施例中，編碼信號序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列或與SEQ ID NO：9實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列，且編碼GAL蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與SEQ ID NO：4實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
在一些實施例中，編碼信號序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與SEQ ID NO：10實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列，且編碼GAL蛋白質之核苷酸 序列包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與SEQ ID NO：5實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
在一些實施例中，經編碼之信號序列，例如人類或小鼠IgG1信號肽包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與SEQ ID NO：11實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之胺基酸序列；且經編碼之GAL蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列相對於經編碼之GAL蛋白質位於N端。在一些實施例中，具有人類或小鼠IgG1信號肽序列之經編碼之GAL蛋白質包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列或與SEQ ID NO：28實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之胺基酸序列。
在一些實施例中，編碼人類或小鼠IgG1信號序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與SEQ ID NO：12-14中之任一者實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列，且編碼GAL蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與SEQ ID NO：2-5中之任一者實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
在一些實施例中，編碼信號序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與SEQ ID NO：12實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列，且編碼GAL蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與SEQ ID NO：2實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
在一些實施例中，編碼信號序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與SEQ ID NO：13實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列，且編碼GAL蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與SEQ ID NO：3實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
在一些實施例中，編碼信號序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與SEQ ID NO：13實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列，且編碼GAL蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與SEQ ID NO：4實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
在一些實施例中，編碼信號序列之核苷酸序列包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與SEQ ID NO：14實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列，且編碼GAL蛋白質之核苷酸序列包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與SEQ ID NO：5實質上一致(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%一致)之核酸序列。
例示性有效負載：GAL
在一些實施例中，本揭示案之經分離之重組AAV顆粒包含肝臟向性衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質，及包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因編碼：信號序列，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性或相對於SEQ ID NO：6具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列；及GAL蛋白質， 其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7-10中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列； 及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因編碼：信號序列，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性或相對於SEQ ID NO：11具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列； 及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
例示性AAV病毒基因體及顆粒
本揭示案之AAV顆粒包含衣殼蛋白質，例如肝臟向性衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質，及如本文中所描述之AAV病毒基因體或載體。
在一些實施例中，衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或100%序列一致性)之胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白質由SEQ ID NO：46之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%)之核苷酸序列編碼。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV顆粒之病毒基因體包含可操作地連接至編碼GAL蛋白質之轉基因之啟動子。在一些實施例中，病毒基因體進一步包含反向末端重複序列區域、強化子、啟動子、內含子、Kozak序列、WPRE序列、polyA區域或其組合。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV顆粒之病毒基因體包含核苷酸序列，例如自5' ITR至3' ITR、具有SEQ ID NO：31-41及51-61中之任一者之核苷酸序列(例如表2中所描述)之核苷酸序列，或與前述序列中之任一者實質上一致(例如，具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%序列一致性)之核苷酸序列。
Figure 111132078-A0202-12-0079-67
Figure 111132078-A0202-12-0080-68
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：31或51之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：31或51之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與SEQ ID NO：2之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：31或51之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：32或52之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：32或52之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與SEQ ID NO：3之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：32或52之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：33或53之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：33或53之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與SEQ ID NO：4之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3'ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：33或53之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：34或54之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：34或54之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5'ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與SEQ ID NO：5之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3'ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：34或54之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：35或55之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：35或55之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與SEQ ID NO：2之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：35或55之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：36或56之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：36或56之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與SEQ ID NO：3之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：36或56之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：37或57之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：37或57之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與SEQ ID NO：4之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：37或57之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：38或58之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：38或58之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5'ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與SEQ ID NO：5之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：38或58之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：39或59之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：39或59之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與SEQ ID NO：5之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；WPRE序列，其包含SEQ ID NO：25之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23 之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：39或59之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：40或60之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：40或60之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與SEQ ID NO：5之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；WPRE序列，其包含SEQ ID NO：25之核苷酸序 列或與其至少95%一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：24之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：40或60之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV顆粒包含病毒基因體，其包含SEQ ID NO：41或61之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，以5'至3'順序，包含SEQ ID NO：41或61之核苷酸序列或與其實質上一致之核苷酸序列之病毒基因體包含：5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之核苷酸序列；編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與SEQ ID NO：5之核苷酸序列至少85%(例如，至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、 98%或99%)一致之核苷酸序列；WPRE截短之序列W3SL，其包含SEQ ID NO：26之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：24之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，包含SEQ ID NO：41或61之核苷酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之核苷酸序列之病毒基因體編碼GAL蛋白質，該GAL蛋白質包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性)之胺基酸序列。
在實施例中，AAV顆粒包含AAV病毒基因體，其包含本文中所描述(例如，表2中所描述)之任何病毒基因體之核苷酸序列，或與前述序列中之任一者實質上一致(例如，具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或99%序列一致性)之核苷酸序列。在一些實施例中，AAV顆粒進一步包含衣殼蛋白質，例如結構性蛋白質。在一些實施例中，衣殼蛋白質包含VP1多肽、VP2多肽及/或VP3多肽。在一些實施例中，VP1多肽、VP2多肽及/或VP3多肽係由至少一種Cap基因編碼。在一些實施例中，衣殼蛋白質係sL65衣殼蛋白質。在一些實施例中，AAV顆粒進一步包含Rep蛋白質，例如非結構性蛋白質。在一些實施例中，Rep蛋白質包含Rep78蛋白質、Rep68、Rep52蛋白質及/或Rep40蛋白質。在一些實施例中，Rep78蛋白質、Rep68蛋白質、Rep52蛋白質及/或Rep40蛋白質係由至少一種Rep基因編碼。
在一些實施例中，本揭示案提供包含以上所鑑別之任何病毒基因體之載體、細胞及/或AAV顆粒。
在一些實施例中，AAV載體係單股載體(ssAAV)。
在一些實施例中，AAV載體係自互補AAV載體(scAAV)。參見例如美國專利案第7,465,583號。scAAV載體含有兩個DNA股，其黏接在一起以形成雙股DNA。藉由跳過第二股合成，scAAV在細胞中實現快速表現。
用於產生及/或修飾AAV載體之方法揭示於此項技術中，諸如假模式化AAV載體(國際專利公開案第WO200028004號、第WO200123001號、第WO2004112727號、第WO 2005005610號及第WO 2005072364號，其中之各者之內容以全文引用之方式併入本文中)。
編碼病毒衣殼及病毒基因體之核酸
本揭示案亦提供一種組合物，其包含編碼AAV衣殼蛋白質之核酸及包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸，例如其中該兩種核酸可位於不同載體上。在一些實施例中，組合物包含第一核酸及第二核酸，其中該第一核酸編碼AAV衣殼蛋白質，例如sL65衣殼蛋白質，其中衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列，且該第二核酸包含編碼GAL蛋白質之轉基因。
在一些實施例中，編碼衣殼蛋白質之第一核酸包含SEQ ID NO：46之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。在一些實施例中，經編碼之GAL蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因係經密碼子最佳化的。在一些實施例中，包含編碼GAL蛋白質之轉基因之第二核酸包含SEQ ID NO：3-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因進一步編碼信號序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含人類GAL信號肽。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含相對於SEQ ID NO：6具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：7-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
在一些實施例中，經編碼之信號序列包含IgG1信號肽(例如，小鼠及/或人類肽)。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO：11具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因編碼：信號序列，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、 80%、85%、90%、95%或99%序列一致性或相對於SEQ ID NO：6具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7-10中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列或與其具 有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因編碼：信號序列，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列，或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性或相對於SEQ ID NO：11具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其具 有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一個實施例中，以5'至3'順序，編碼GAL蛋白質之轉基因包含：編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%序列一致性之核苷酸序列。
在一些實施例中，第一核酸及/或第二核酸可進一步包含以下中之一或多者：反向末端重複序列(ITR)區域、啟動子、強化子、內含子區域、Kozak序列、WPRE序列、polyA信號區域或其組合。
在一些實施例中，包含轉基因之第二核酸進一步包含至少一個ITR序列。ITR序列相對於轉基因位於5'或3'。在一些實施例中，包含轉基因之第二核酸包含兩個ITR。此兩個ITR在5'及3端與轉基因側接。
在一些實施例中，包含轉基因之第二核酸進一步包含啟動子序列及/或強化子。在一些實施例中，啟動子為引起一或多種(例如，多種)細胞及/或組織中之表現之泛素啟動子。在一些實施例中，啟動子為組織特異性啟動子，例如將表現限於某些細胞類型之啟動子，例如肝臟特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子及/或強化子相對於如本文中所描述之轉基因位於5'。在一些實施例中，啟動子及/或強化子相對於如本文中所描述之轉基因位於5'，且至少一個ITR序列相對於啟動子及/或強化子位於5'。
在一些實施例中，包含轉基因之第二核酸進一步包含至少一個內含子或其片段或衍生物。在一些實施例中，該至少一個內含子可增強轉基因之表現。在一些實施例中，內含子包含β-血球蛋白內含子或其片段或變異體。
在一些實施例中，包含轉基因之第二核酸進一步包含Kozak序列及/或WPRE序列。在一些實施例中，Kozak序列相對於如本文中所描述之轉基因位於5'。在一些實施例中，WPRE序列相對於如本文中所描述之轉基因位於3'。
在一些實施例中，包含轉基因之第二核酸進一步包含至少一個多腺苷酸化(polyA)序列。在一些實施例中，polyA序列相對於如本文中所描述之轉基因位於3'。在一些實施例中，polyA序列相對於如本文中所描述之轉基因位於3'，且至少一個ITR序列相對於polyA序列位於3'。
在一些實施例中，自5'至3'，第二核酸包含：ITR序列、強化子、啟動子序列、內含子、Kozak序列、如本文中所描述之任何轉基因、polyA序列及第二ITR序列。
在一些實施例中，自5'至3'，第二核酸包含：ITR序列、強化子、啟動子序列、內含子、Kozak序列、如本文中所描述之任何轉基因、WPRE序列、polyA序列及第二ITR序列。
在一些實施例中，第一核酸及第二核酸共同包含於單一載體中，該載體係包含於組合物中。在一些實施例中，第一核酸及第二核酸共同包含於不同載體中，其中該等載體皆包含於組合物中。
在一些實施例中，本揭示案提供一或多種包含如本文中所描述之經分離之rAAV顆粒之細胞(例如，複數種細胞)。在一些實施例中，本揭示案提供一或多種包含如本文中所描述之核酸組合物之細胞(例如，複數種細胞)。
本揭示案亦提供包含編碼α-葡萄糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因之核酸，例如經分離之核酸，其中編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：3-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之核苷酸序列。本揭示案亦提供組合物，其包含有包含編碼α-葡萄糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因之核酸(例如，經分離之核酸)，其中編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：3-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之核苷酸序列。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之轉基因進一步編碼信號序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含人類GAL信號肽。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與其至少70%、75%、 80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含相對於SEQ ID NO：6具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：7-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
在一些實施例中，經編碼之信號序列包含人類IgG1信號肽。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含相對於SEQ ID NO：11具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
本揭示案亦提供組合物，其包含有包含編碼信號序列之轉基因之核酸。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含人類GAL信號肽。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列，或相對於SEQ ID NO：6具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：8-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
本揭示案亦提供組合物，其包含有包含編碼信號序列之轉基因之核酸。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含人類IgG1信號肽。在一些實施 例中，經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列包含相對於SEQ ID NO：11具有至少一個、兩個或三個，但不超過四個修飾(例如，取代)之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
在一些實施例中，本揭示案亦提供經分離之，例如重組病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)，其包含SEQ ID NO：31-41及51-61中之任一者之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：31之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：32之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：33之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：34之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：35之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：36之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：37之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：38之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：39之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：40之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：41之核酸序列 或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：51之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：52之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：53之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：54之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：55之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：56之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：57之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：58之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：59之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：60之核酸序列或由其組成。在一些實施例中，病毒基因體(例如，AAV病毒基因體)包含SEQ ID NO：61之核酸序列或由其組成。本揭示案亦提供包含任何前述病毒基因體之組合物。本揭示案亦提供包含任何前述病毒基因體之細胞，例如細菌、哺乳動物或昆蟲細胞。
III.病毒產生
一般病毒產生方法
在一些實施例中，用於產生AAV(例如，rAAV)顆粒之細胞可包含哺乳動物細胞(諸如HEK293細胞)及/或昆蟲細胞(諸如Sf9細胞)。
在各種實施例中，AAV產生包括用於產生AAV顆粒及可與目標細胞接觸以遞送包括編碼有效負載分子之核苷酸的有效負載(例如，重組病毒構 築體)之載體的過程及方法。在某些實施例中，病毒載體係腺相關病毒(AAV)載體，諸如重組腺相關病毒(rAAV)載體。在某些實施例中，AAV顆粒係腺相關病毒(AAV)顆粒，諸如重組腺相關病毒(rAAV)顆粒。
在一些實施例中，本文中揭示包含本揭示案之病毒基因體之載體。在一些實施例中，本文中揭示包含本揭示案之病毒基因體之細胞。在一些實施例中，細胞為細菌細胞、哺乳動物細胞(例如，HEK293細胞)或昆蟲細胞(例如，Sf9細胞)。
在一些實施例中，本文中揭示用於製備本揭示案之重組AAV顆粒之方法，該方法包含(i)提供包含本文中所描述之病毒基因體(例如，包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸)之宿主細胞，及在適合於將病毒基因體封裝於衣殼蛋白質，例如本文中所描述之衣殼蛋白質(例如，sL65衣殼蛋白質或其功能性變異體)中之條件下培育宿主細胞，藉此製備重組AAV顆粒。在一些實施例中，該方法包含在步驟(i)之前，將包含病毒基因體之第一核酸引入細胞中。在一些實施例中，宿主細胞包含編碼衣殼蛋白質之第二核酸。在一些實施例中，在第一核酸分子之前、與其同時或在其之後將第二核酸引入宿主細胞中。在一些實施例中，宿主細胞係細菌細胞、哺乳動物細胞(例如，HEK293細胞)或昆蟲細胞(例如，Sf9細胞)。
在各種實施例中，本文中提供藉由以下步驟產生AAV顆粒或載體之方法：(a)使病毒產生細胞與一或多種編碼至少一種AAV衣殼蛋白質之病毒表現構築體及一或多種編碼有效負載分子之有效負載構築體接觸，該有效負載分子可選自：轉基因、編碼蛋白質之多核苷酸及調節核酸；(b)在使得產生至少一 種AAV顆粒或載體之條件下培養病毒產生細胞，及(c)自產生物料流分離AAV顆粒或載體。
在此等方法中，病毒表現構築體可編碼至少一種結構性蛋白質及/或至少一種非結構性蛋白質。結構性蛋白質可包括原生或野生型衣殼蛋白質VP1、VP2及/或VP3或其嵌合蛋白質中之任一者。在一些實施例中，VP1衣殼蛋白質可為sL65 VP1衣殼蛋白質。非結構性蛋白質可包括原生或野生型Rep78、Rep68、Rep52及/或Rep40蛋白質或其嵌合蛋白質中之任一者。
在某些實施例中，接觸係經由短暫轉染、病毒轉導及/或電穿孔發生。
在某些實施例中，病毒產生細胞係選自哺乳動物細胞及昆蟲細胞。在某些實施例中，昆蟲細胞包括草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)昆蟲細胞。在某些實施例中，昆蟲細胞包括Sf9昆蟲細胞。在某些實施例中，昆蟲細胞包括Sf21昆蟲細胞。
在各種實施例中，本揭示案之有效負載構築體載體可包括至少一個反向末端重複序列(ITR)且可包括哺乳動物DNA。
亦提供根據本文中所描述之方法產生之AAV顆粒及病毒載體。
在各種實施例中，本揭示案之AAV顆粒可與一或多種可接受之賦形劑一起調配為醫藥組合物。
在某些實施例中，AAV顆粒或病毒載體可藉由本文中所描述之方法產生。
在某些實施例中，AAV顆粒可藉由使病毒產生細胞(例如，昆蟲細胞或哺乳動物細胞)與至少一種編碼至少一種衣殼蛋白質之病毒表現構築體及至 少一種有效負載構築體載體接觸而產生。可藉由短暫轉染、病毒轉導及/或電穿孔來接觸病毒產生細胞。有效負載構築體載體可包括編碼有效負載分子之有效負載構築體，有效負載分子諸如(但不限於)轉基因、編碼蛋白質之多核苷酸及調節核酸。可在使得產生、分離(例如，使用溫度誘導之溶解、機械溶解及/或化學溶解)及/或純化(例如，使用過濾、層析及/或免疫親和力純化)至少一種AAV顆粒或載體之條件下培養病毒產生細胞。作為非限制性實例，有效負載構築體載體可包括哺乳動物DNA。
在某些實施例中，使用本文中所描述之方法在昆蟲細胞(例如，草地黏蟲(Sf9)細胞)中產生AAV顆粒。作為非限制性實例，使用可包括桿狀病毒轉導之病毒轉導來接觸昆蟲細胞。
在某些實施例中，使用本文中所描述之方法在哺乳動物細胞(例如，HEK293細胞)中產生AAV顆粒。作為非限制性實例，使用可包括多質體短暫轉染(諸如三重質體短暫轉染)之病毒轉導來接觸哺乳動物細胞。
在某些實施例中，本文中所描述之AAV顆粒產生方法在病毒產生細胞中產生大於101、大於102、大於103、大於104或大於105個AAV顆粒。
在某些實施例中，本揭示案之方法包括使用病毒產生系統在病毒產生細胞中產生病毒顆粒，該病毒產生系統包括至少一種病毒表現構築體及至少一種有效負載構築體。可將該至少一種病毒表現構築體及該至少一種有效負載構築體共轉染(例如，雙重轉染、三重轉染)至病毒產生細胞中。使用熟習此項技術者已知且常規進行之標準分子生物學技術來完成轉染。病毒產生細胞提供產生AAV顆粒所需之蛋白質及其他生物材料(包括複製有效負載構築體之Rep 蛋白質及組裝以形成包圍所複製之有效負載構築體之衣殼的Cap蛋白質)之表現所需之細胞機制。自病毒產生細胞提取所得AAV顆粒且處理成用於投與之醫藥製劑。
在各種實施例中，不受理論約束，在投與後，本文中所揭示之AAV顆粒可接觸目標細胞且進入細胞，例如內體中。接著，AAV顆粒，例如自內體釋放之AAV顆粒，可接觸目標細胞之細胞核以遞送有效負載構築體。可將有效負載構築體，例如重組病毒構築體遞送至目標細胞之細胞核，其中可表現由有效負載構築體編碼之有效負載分子。
在某些實施例中，用於產生病毒顆粒之方法利用病毒產生細胞之種菌培養物，其包括一或多種桿狀病毒(例如，已經病毒表現構築體及有效負載構築體載體轉染之桿狀病毒表現載體(BEV)或經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC))。在某些實施例中，收穫種菌培養物，將其分成等分試樣且冷凍，且可在稍後時間點使用於起始原生產生細胞群體之感染。
在一些實施例中，AAV顆粒之大規模產生利用生物反應器。不受理論約束，使用生物反應器可允許精確量測及/或控制支援病毒產生細胞之生長及活性的變數，諸如質量、溫度、混合條件(葉輪RPM或波振盪)、CO2濃度、O2濃度、氣體噴射速率及體積、氣體覆蓋速率及體積、pH值、活細胞密度(VCD)、細胞活力、細胞直徑及/或光密度(OD)。在某些實施例中，使用生物反應器進行分批生產，其中在以實驗方式測定之時間點收集整個培養物且將AAV顆粒純化。在一些實施例中，使用生物反應器進行連續生產，其中在以實驗方式測定之時間點收集一部分培養物以用於AAV顆粒之純化，且將生物反應器中之剩餘培養物用額外的生長培養基組分再新。
在各種實施例中，可在包括細胞溶解、澄清、滅菌及純化之過程中自病毒產生細胞提取AAV病毒顆粒。細胞溶解包括破壞病毒產生細胞之結構，由此釋放AAV顆粒之任何過程。在某些實施例中，細胞溶解可包括熱衝擊、化學或機械溶解方法。澄清可包括溶解之細胞、培養基組分及AAV顆粒之混合物之粗純化。在某些實施例中，澄清包括離心及/或過濾，包括(但不限於)深度末端、切向流及/或中空纖維過濾。
在各種實施例中，病毒產生之最終結果係包括以下兩種組分之經純化之AAV顆粒之集合：(1)有效負載構築體(例如，重組AAV載體基因體構築體)，及(2)病毒衣殼。
在某些實施例中，本揭示案之病毒產生系統或方法包括使用病毒產生細胞(VPC)及質體構築體產生經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的步驟。將來自細胞庫(CB)之病毒產生細胞(VPC)解凍及擴增，以獲得目標工作體積及VPC濃度。將所得VPC池分成Rep/Cap VPC池及有效負載VPC池。將一或多個Rep/Cap質體構築體(病毒表現構築體)處理成Rep/Cap穿梭載體多核苷酸且轉染至Rep/Cap VPC池中。將一或多種有效負載質體構築體(有效負載構築體)處理成有效負載穿梭載體多核苷酸且轉染至有效負載VPC池中。培育兩個VPC池，以生產P1 Rep/Cap桿狀病毒表現載體(BEV)及P1有效負載BEV。將兩個BEV池擴增成斑塊集合，其中選擇單一斑塊用於純系斑塊(CP)純化(亦稱為單一斑塊擴增)。該方法可包括單一CP純化步驟或可包括連續或由其他處理步驟分隔之多個CP純化步驟。該一或多個CP純化步驟提供CP Rep/Cap BEV池及CP有效負載BEV池。隨後可將此兩個BEV池儲存且用於未來的產生步驟，或其隨後可轉染至VPC中，以產生Rep/Cap BIIC池及有效負載BIIC池。
在某些實施例中，本揭示案之病毒產生系統或方法包括使用病毒產生細胞(VPC)及經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)產生AAV顆粒的步驟。將來自細胞庫(CB)之病毒產生細胞(VPC)解凍及擴增，以獲得目標工作體積及VPC濃度。將工作體積之病毒產生細胞接種至生產用生物反應器中，且可進一步擴增為具有用於BIIC感染之目標VPC濃度的200-2000L工作體積。生產用生物反應器中之工作體積的VPC隨後以目標VPC：BIIC比及目標BIIC：BIIC比經Rep/Cap BIIC及有效負載BIIC共同感染。VCD感染亦可利用BEV。將經共同感染之VPC在生產用生物反應器中培育及擴增，以產生AAV顆粒及VPC之塊狀收集物。
病毒表現構築體
在各種實施例中，本揭示案之病毒產生系統包括一或多種病毒表現構築體，其可轉染/轉導至病毒產生細胞中。在某些實施例中，本揭示案之病毒表現構築體或有效負載構築體可為穿梭載體，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因體。在某些實施例中，病毒表現包括蛋白質編碼核苷酸序列及至少一個用於病毒產生細胞中之表現之表現控制序列。在某些實施例中，病毒表現包括蛋白質編碼核苷酸序列，其可操作地連接至至少一個用於病毒產生細胞中之表現之表現控制序列。在某些實施例中，病毒表現構築體含有受一或多種啟動子控制之細小病毒基因。細小病毒基因可包括編碼非結構性AAV複製蛋白質之核苷酸序列，諸如編碼Rep52、Rep40、Rep68或Rep78蛋白質之Rep基因。細小病毒基因可包括編碼結構性AAV蛋白質之核苷酸序列，諸如編碼VP1、VP2及VP3蛋白質之Cap基因。在一些實施例中，VP1蛋白質係sL65 VP1蛋白質。
本揭示案之病毒表現構築體可包括任何促進使用核酸轉型、轉染或轉導細胞之生物或化學化合物或調配物。例示性生物病毒表現構築體包括質體、線性核酸分子及重組病毒，包括桿狀病毒。例示性化學載體包括脂質複合物。使用病毒表現構築體將核酸序列併入根據本揭示案之病毒複製細胞中。(O'Reilly,David R.,Lois K.Miller及Verne A.Luckow.Baculovirus expression vectors：a laboratory manual.Oxford University Press,1994.)；Maniatis等人編，Molecular Cloning.CSH Laboratory,NY,N.Y.(1982)；以及Philiport及Scluber編，Liposomes as tools in Basic Research and Industry.CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)，其各自之與病毒表現構築體及其用途相關之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，病毒表現構築體係AAV表現構築體，其包括一或多個編碼非結構性AAV複製蛋白質、結構性AAV衣殼蛋白質或其組合之核苷酸序列。
在某些實施例中，本揭示案之病毒表現構築體可為質體載體。在某些實施例中，本揭示案之病毒表現構築體可為桿狀病毒構築體。
本揭示案不受用於產生AAV顆粒或病毒載體之病毒表現構築體的數目之限制。在某些實施例中，可使用一種、兩種、三種、四種、五種、六種或更多種病毒表現構築體在根據本揭示案之病毒產生細胞中產生AAV顆粒。在本揭示案之某些實施例中，病毒表現構築體可用於在昆蟲細胞中產生AAV顆粒。在某些實施例中，可對衣殼及/或rep基因之野生型AAV序列進行修飾，例如以改良病毒顆粒之屬性，諸如增加感染性或特異性，或提高產率。
在某些實施例中，病毒表現構築體可含有包括起始密碼子區域之核苷酸序列，諸如編碼包括一或多個起始密碼子區域之AAV衣殼蛋白質的序列。在某些實施例中，起始密碼子區域可在表現控制序列內。起始密碼子可為ATG或非ATG密碼子(亦即，次最佳起始密碼子，其中AAV VP1衣殼蛋白質之起始密碼子係非ATG)。
在某些實施例中，用於AAV產生之病毒表現構築體可含有編碼AAV衣殼蛋白質之核苷酸序列，其中AAV VP1衣殼蛋白質之起始密碼子係非ATG，亦即，次最佳起始密碼子，其允許在產生系統中表現經修改之比率之病毒衣殼蛋白質，以提供經改良之宿主細胞感染性。在非限制性實例中，病毒構築體載體可含有核酸構築體，其包含編碼AAV VP1、VP2及VP3衣殼蛋白質之核苷酸序列，其中用於AAV VP1衣殼蛋白質之轉譯之起始密碼子係CTG、TTG或GTG，如美國專利案第US 8,163,543號中所描述，其與AAV衣殼蛋白質及其製備相關之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，本揭示案之病毒表現構築體可為質體載體或桿狀病毒構築體，其編碼用於昆蟲細胞中之表現之細小病毒rep蛋白質。在某些實施例中，將單一編碼序列用於Rep78及Rep52蛋白質，其中用於Rep78蛋白質之轉譯之起始密碼子係選自由ACG、TTG、CTG及GTG組成之群之次最佳起始密碼子，其在表現於昆蟲細胞中時實現部分外顯子跳躍，如美國專利案第8,512,981號中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中，例如以促進與Rep52相比，Rep78之不太充足的表現，其可有助於高載體產率。
在某些實施例中，VP-編碼區編碼特定AAV血清型之一或多種AAV衣殼蛋白質。VP-編碼區之AAV血清型可為相同或不同的。在某些實施例 中，VP-編碼區可經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP-編碼區或核苷酸序列可針對哺乳動物細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP-編碼區或核苷酸序列可針對昆蟲細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP-編碼區或核苷酸序列可針對草地黏蟲細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP-編碼區或核苷酸序列可針對Sf9或Sf21細胞株經密碼子最佳化。
在某些實施例中，編碼一或多種VP衣殼蛋白質之核苷酸序列可經密碼子最佳化以與參考核苷酸序列具有小於100%之核苷酸同源性。在某些實施例中，經密碼子最佳化之VP核苷酸序列與參考VP核苷酸序列之間的核苷酸同源性係小於100%、小於99%、小於98%、小於97%、小於96%、小於95%、小於94%、小於93%、小於92%、小於91%、小於90%、小於89%、小於88%、小於87%、小於86%、小於85%、小於84%、小於83%、小於82%、小於81%、小於80%、小於78%、小於76%、小於74%、小於72%、小於70%、小於68%、小於66%、小於64%、小於62%、小於60%、小於55%、小於50%及小於40%。
在某些實施例中，本揭示案之病毒表現構築體或有效負載構築體可為穿梭載體，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因體。在某些實施例中，本揭示案之病毒表現構築體或有效負載構築體(例如，穿梭載體)可包括多核苷酸，該多核苷酸係藉由熟習此項技術者已知及進行之標準分子生物學技術由同源重組(轉位子供體/受體系統)併入穿梭載體中。
在某些實施例中，併入穿梭載體中之多核苷酸(亦即，多核苷酸插入物)可包括可操作地連接至蛋白質編碼核苷酸序列之表現控制序列。在某些實施例中，併入穿梭載體中之多核苷酸可包括表現控制序列，其包括啟動子，諸如p10或polH，且其可操作地連接至編碼結構性AAV衣殼蛋白質(例如，VP1、VP2 VP3或其組合)之核苷酸序列。在一些實施例中，VP1蛋白質係sL65 VP1衣殼蛋白質。在某些實施例中，併入穿梭載體中之多核苷酸可包括表現控制序列，其包括啟動子，諸如p10或polh，且其可操作地連接至編碼非結構性AAV衣殼蛋白質(例如，Rep78、Rep52或其組合)之核苷酸序列。
本揭示案之方法不受使用特定表現控制序列之限制。然而，當達成VP產物之某一化學計量(分別對於VP1、VP2及VP3，近似於1：1：10)時，以及當Rep52或Rep40(亦稱為p19 Rep)之水準顯著高於Rep78或Rep68(亦稱為p5 Rep)時，可獲得產生細胞(諸如昆蟲細胞)中之經改良之AAV產量。在某些實施例中，p5/p19比率低於0.6以上、低於0.4或低於0.3，但始終至少為0.03。此等比率可按蛋白質之水準進行量測或可與特定mRNA之相對水準相關。
在某些實施例中，AAV顆粒係在病毒產生細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中全部三種VP蛋白質係以近似於、約為或為以下之化學計量表現：1：1：10(VP1：VP2：VP3)、2：2：10(VP1：VP2：VP3)、2：0：10(VP1：VP2：VP3)、1-2：0-2：10(VP1：VP2：VP3)、1-2：1-2：10(VP1：VP2：VP3)、2-3：0-3：10(VP1：VP2：VP3)、2-3：2-3：10(VP1：VP2：VP3)、3：3：10(VP1：VP2：VP3)、3-5：0-5：10(VP1：VP2：VP3)或3-5：3-5：10(VP1：VP2：VP3)。
在某些實施例中，表現控制區經工程改造以產生選自由以下組成之群之VP1：VP2：VP3比率：約或精確的1：0：10；約或精確的1：1：10；約或精確的2：1：10；約或精確的2：1：10；約或精確的2：2：10；約或精確的3：0：10；約或精確的3：1：10；約或精確的3：2：10；約或精確的3：3：10；約或精確的4：0：10；約或精確的4：1：10；約或精確的4：2：10；約或精確的4：3：10；約或精確的4：4：10；約或精確的5：5：10；約或精確的1-2：0-2：10；約或精確的1-2：1-2：10；約或精確的1-3：0-3：10； 約或精確的1-3：1-3：10；約或精確的1-4：0-4：10；約或精確的1-4：1-4：10；約或精確的1-5：1-5：10；約或精確的2-3：0-3：10；約或精確的2-3：2-3：10；約或精確的2-4：2-4：10；約或精確的2-5：2-5：10；約或精確的3-4：3-4：10；約或精確的3-5：3-5：10；及約或精確的4-5：4-5：10。
在本揭示案之某些實施例中，Rep52或Rep78係自桿狀病毒衍生之多面體啟動子(polh)轉錄。Rep52或Rep78亦可自較弱啟動子，例如ie-1啟動子之缺失突變體△ie-1啟動子(其轉錄活性為ie-1啟動子之約20%)轉錄。可使用與△ie-1啟動子實質上同源之啟動子。關於啟動子，將至少50%、60%、70%、80%、90%或更高的同源性視為實質上同源之啟動子。
哺乳動物細胞
本文中揭示之本揭示案之病毒產生描述用於產生AAV顆粒或病毒載體之過程及方法，該等AAV顆粒或病毒載體與目標細胞接觸以遞送有效負載構築體，例如重組AAV顆粒或病毒構築體，其包括編碼有效負載分子之核苷酸。病毒產生細胞可選自任何生物體，包括原核(例如，細菌)細胞，及真核細胞，包括昆蟲細胞、酵母細胞及哺乳動物細胞。
在某些實施例中，本揭示案之AAV顆粒可在包括哺乳動物細胞之病毒產生細胞中產生。病毒產生細胞可包含哺乳動物細胞，諸如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293、HEK293T(293T)、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、Huh7、HepG2、C127、3T3、CHO、HeLa細胞、KB細胞、BHK以及衍生自哺乳動物之初生纖維母細胞、肝細胞及肌纖維母細胞。病毒產生細胞可包括衍生自任何哺乳 動物物種(包括(但不限於)人類、猴、小鼠、大鼠、兔及倉鼠)或細胞類型(包括(但不限於)纖維母細胞、肝細胞、腫瘤細胞、細胞株轉型細胞等)之細胞。
通常用於產生重組AAV顆粒之AAV病毒產生細胞包括(但不限於)如美國專利案第6,156,303號、第5,387,484號、第5,741,683號、第5,691,176號、第6,428,988號及第5,688,676號；美國專利申請案2002/0081721以及國際專利公開案第WO 00/47757號、第WO 00/24916號及第WO 96/17947號中所描述之其他哺乳動物細胞株，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其與本揭示案不存在衝突即可。在某些實施例中，AAV病毒產生細胞係反式互補封裝細胞株，其提供複製缺陷型輔助病毒缺失之功能，例如HEK293細胞或其他Ea反式互補細胞。
在某些實施例中，封裝細胞株293-10-3(ATCC寄存編號PTA-2361)可用於產生AAV顆粒，如美國專利案第US 6,281,010號中所描述，其與293-10-3封裝細胞株及其用途相關之內容以全文引用之方式併入本文中。
在本揭示案之某些實施例中，用於反式互補E1缺失之腺病毒載體的細胞株，諸如HeLa細胞株可用於AAV顆粒產生，該等腺病毒載體在磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子之控制下編碼腺病毒E1a及腺病毒E1b，如美國專利案第6365394號中所描述，其與HeLa細胞株及其用途相關之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，使用多質體短暫轉染法(諸如三重質體短暫轉染)在哺乳動物細胞中產生AAV顆粒。在某些實施例中，多質體短暫轉染法包括以下三種不同構築體之轉染：(i)有效負載構築體，(ii)Rep/Cap構築體(細小病毒Rep及細小病毒Cap)，及(iii)輔助構築體。在某些實施例中，AAV顆粒產生之三 種組分之三重轉染法可用於產生小批量病毒以用於包括轉導效率、目標組織(向性)評估及穩定性之分析法。在某些實施例中，AAV顆粒產生之三種組分之三重轉染法可用於產生大批量材料以用於臨床或商業應用。
待調配之AAV顆粒可藉由三重轉染或桿狀病毒介導之病毒產生或此項技術中已知的任何其他方法產生。可使用此項技術中已知的任何適合之容許或封裝細胞來產生載體。在某些實施例中，使用反式互補封裝細胞株，其提供複製缺陷型輔助病毒缺失之功能，例如293細胞或其他E1a反式互補細胞。
基因卡匣可含有細小病毒(例如，AAV)cap及rep基因中之一些或全部。在某些實施例中，藉由將編碼衣殼及/或Rep蛋白質之封裝載體引入細胞中來以反式形式提供cap及rep功能中之一些或全部。在某些實施例中，基因卡匣不編碼衣殼或Rep蛋白質。或者，使用經穩定轉型以表現cap及/或rep基因之封裝細胞株。
在某些實施例中，根據如US2016/0032254中所描述之程序自培養物上清液製備及純化重組AAV病毒顆粒，其與重組AAV病毒顆粒之製備及處理相關之內容以全文引用之方式併入本文中。製備亦可涉及此項技術中已知之方法，包括使用293T細胞、三重轉染之方法或任何適合的製備方法。
在某些實施例中，哺乳動物病毒產生細胞(例如，293T細胞)可呈黏著/黏附狀態(例如，使用磷酸鈣)或懸浮狀態(例如，使用聚乙二亞胺(PEI))。哺乳動物病毒產生細胞經產生AAV所需之質體(亦即，AAV rep/cap構築體、腺病毒輔助構築體及/或ITR側接之有效負載構築體)轉染。在某些實施例中，轉染過程可包括視情況進行之培養基更換(例如，針對呈黏著形式之細胞更換培養基、針對呈懸浮形式之細胞不更換培養基、視需要針對呈懸浮形式之細胞更換培養 基)。在某些實施例中，轉染過程可包括諸如DMEM或F17之轉染培養基。在某些實施例中，轉染培養基可包括血清或可不含血清(例如，與磷酸鈣呈黏著狀態且具有血清之細胞，與PEI呈懸浮狀態且不含血清之細胞)。
細胞可隨後藉由刮擦(黏附形式)及/或粒化(懸浮形式及經刮擦之黏附形式)收集且轉移至容器中。可視需要重複收集步驟以完全收集所產生之細胞。接著，可藉由連續凍融循環(-80℃至37℃)、化學溶解(諸如添加清潔劑曲拉通(triton))、機械溶解或藉由使細胞培養物在達到約0%活力之後降解來達成細胞溶解。藉由離心及/或深層過濾來移除細胞碎片。藉由DNA qPCR或ddPCR，由抗DNA酶抗性基因體滴定針對AAV顆粒對樣本進行定量。
根據基因體複本數目(每毫升之基因體顆粒)量測AAV顆粒效價。如先前報導，基因體顆粒濃度係基於載體DNA之DNA qPCR(Clark等人，(1999)Hum.Gene Ther.,10：1031-1039；Veldwijk等人，(2002)Mol.Ther.,6：272-278，其關於顆粒濃度之量測之內容各自以全文引用的方式併入本文中)。
昆蟲細胞
本揭示案之病毒產生包括用於產生AAV顆粒或病毒載體之過程及方法，該等AAV顆粒或病毒載體與目標細胞接觸以遞送有效負載構築體，例如重組病毒構築體，其包括編碼有效負載分子之核苷酸。在某些實施例中，本揭示案之AAV顆粒或病毒載體可在包括昆蟲細胞之病毒產生細胞中產生。
培養物中之昆蟲細胞之生長條件，及在培養物中之昆蟲細胞中產生異源產物係此項技術中熟知的，參見美國專利案第6,204,059號，其與在病毒產生中生長及使用昆蟲細胞相關之內容以全文引用之方式併入本文中。
可根據本揭示案使用允許細小病毒之複製且可維持於培養物中之任何昆蟲細胞。通常用於產生重組AAV顆粒之AAV病毒產生細胞包括(但不限於)草地黏蟲，包括(但不限於)Sf9或Sf21細胞株；果蠅(Drosophila)細胞株；或蚊蟲(mosquito)細胞株，諸如白紋伊蚊(Aedes albopictus)衍生之細胞株。昆蟲細胞用於表現異源蛋白質之用途已經充分證明，將核酸，諸如載體(例如，昆蟲-細胞相容載體)引入此類細胞中之方法及將此類細胞維持於培養物中之方法亦已經充分證明。參見例如Methods in Molecular Biology,Richard編，Humana Press,NJ(1995)；O'Reilly等人，Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等人，J.Vir.63：3822-8(1989)；Kajigaya等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88：4646-50(1991)；Ruffing等人，J.Vir.66：6922-30(1992)；Kimbauer等人，Vir.219：37-44(1996)；Zhao等人，Vir.272：382-93(2000)；及Samulski等人，美國專利案第6,204,059號，其與昆蟲細胞在病毒產生中之用途相關之內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，使用WO2015/191508中所描述之方法製備AAV顆粒，其內容在不與本發明衝突之程度下以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，可使用昆蟲宿主細胞系統與桿狀病毒系統之組合(例如Luckow等人，Bio/Technology 6：47(1988)所描述)。在某些實施例中，用於製備嵌合肽之表現系統係粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)，Tn 5B1-4昆蟲細胞/桿狀病毒系統，其可用於高蛋白質水準，如美國專利案第6660521號中所描述，其與病毒顆粒之產生相關之內容以全文引用之方式併入本文中。
昆蟲細胞之擴增、培養、轉染、感染及儲存可在此項技術中已知之任何細胞培養基、細胞轉染培養基或儲存培養基中進行，包括HycloneTM SFX- InsectTM細胞培養基、Expression System ESF AFTM昆蟲細胞培養基、ThermoFisher Sf-900IITM培養基、ThermoFisher Sf-900IIITM培養基或ThermoFisher Grace昆蟲培養基。本揭示案之昆蟲細胞混合物亦可包括本揭示案中所描述之任何調配物添加劑或成分，包括(但不限於)鹽、酸、鹼、緩衝劑、界面活性劑(諸如Poloxamer 188/Pluronic F-68)及其他已知培養基成分。調配物添加劑可逐漸或以「尖峰」(在短時間內併入大量體積)形式併入。
桿狀病毒產生系統
在某些實施例中，本揭示案之方法可包括使用病毒表現構築體及有效負載構築體載體在桿狀病毒系統中產生AAV顆粒或病毒載體。在某些實施例中，桿狀病毒系統包括桿狀病毒表現載體(BEV)及/或經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)。在某些實施例中，本揭示案之病毒表現構築體或有效負載構築體可為穿梭載體，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因體。在某些實施例中，本揭示案之病毒表現構築體或有效負載構築體可為多核苷酸，該多核苷酸係藉由熟習此項技術者已知及進行之標準分子生物學技術由同源重組(轉位子供體/受體系統)併入穿梭載體中。獨立病毒複製細胞群體之轉染產生兩組或更多組(例如，兩組、三組)桿狀病毒(BEV)，其中一或多組可包括病毒表現構築體(表現BEV)，且其中一或多組可包括有效負載構築體(有效負載BEV)。桿狀病毒可用於感染病毒產生細胞以產生AAV顆粒或病毒載體。
在某些實施例中，方法包括轉染單一病毒複製細胞群體以產生單一桿狀病毒(BEV)組，其包括病毒表現構築體及有效負載構築體兩者。此等桿狀病毒可用於感染病毒產生細胞以產生AAV顆粒或病毒載體。
在某些實施例中，使用穿梭載體轉染劑，諸如Promega FuGENE® HD、WFI水或ThermoFisher Cellfectin® II試劑來產生BEV。在某些實施例中，在諸如昆蟲細胞之病毒產生細胞中產生及擴增BEV。
在某些實施例中，方法利用包括一或多種BEV，包括經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的病毒產生細胞之種菌培養物。種菌BIIC已經包括病毒表現構築體之表現BEV及包括有效負載構築體之有效負載BEV轉染/轉導/感染。在某些實施例中，收集種菌培養物，將其分成等分試樣且冷凍，且可在稍後的時間使用以起始原生產生細胞群體之轉染/轉導/感染。在某些實施例中，將一組種菌BIIC儲存於-80℃下或LN2蒸汽中。
桿狀病毒由若干必需蛋白質製成，該等必需蛋白質對於桿狀病毒之功能及複製係必需的，諸如複製蛋白質、包膜蛋白質及衣殼蛋白質。因此，桿狀病毒基因體包括若干編碼必需蛋白質之必需基因核苷酸序列。作為非限制性實例，基因體可包括必需基因區，其包括編碼用於桿狀病毒構築體之必需蛋白質的必需基因核苷酸序列。必需蛋白質可包括：GP64桿狀病毒包膜蛋白質、VP39桿狀病毒衣殼蛋白質或用於桿狀病毒構築體之其他類似的必需蛋白質。
用於在包括(但不限於)草地黏蟲(Sf9)細胞之昆蟲細胞中產生AAV顆粒之桿狀病毒表現載體(BEV)提供高效價之病毒載體產物。編碼病毒表現構築體及有效負載構築體之重組桿狀病毒起始病毒載體複製細胞之生產性感染。自原發性感染釋放之感染性桿狀病毒顆粒繼發性感染培養物中之其他細胞，在作為初始感染倍率之函數的感染循環數中以指數方式感染整個細胞培養物群體，參見Urabe,M.等人，J Virol.2006年2月；80(4)：1874-85，其與產生及使用BEV及病毒顆粒相關之內容以全文引用之方式併入本文中。
在昆蟲細胞系統中產生具有桿狀病毒之AAV顆粒可解決已知的桿狀病毒基因及物理不穩定性。
在某些實施例中，藉由利用無效價感染細胞保存及按比例擴大系統，本揭示案之產生系統在多個繼代內解決桿狀病毒不穩定性。病毒產生細胞之小規模種菌培養物經編碼AAV顆粒之結構性及/或非結構性組分的病毒表現構築體轉染。以可在液氮中冷凍保存的等分試樣形式收集經桿狀病毒感染之病毒產生細胞；等分試樣保留用於感染大規模病毒產生細胞培養物之活力及感染性。Wasilko DJ等人，Protein Expr Purif.2009年6月；65(2)：122-32，其與BEV及病毒顆粒之產生及用途相關之內容以全文引用之方式併入本文中。
遺傳穩定之桿狀病毒可用於產生用以在無脊椎細胞中產生AAV顆粒之組分中的一或多者之來源。在某些實施例中，缺陷型桿狀病毒表現載體可以游離方式維持於昆蟲細胞中。在此類實施例中，相應的穿梭載體經複製控制元件工程改造，該等元件包括(但不限於)啟動子、強化子及/或細胞週期調節之複製元件。
在某些實施例中，容許桿狀病毒感染的穩定病毒產生細胞經AAV複製及載體產生所需之元件中之任一者的至少一個穩定整合複本工程改造，該至少一個複本包括(但不限於)完整AAV基因體、Rep及Cap基因、Rep基因、Cap基因、呈單獨轉錄卡匣形式之各Rep蛋白質、呈單獨轉錄卡匣形式之各VP蛋白質、AAP(組裝活化蛋白質)或至少一種具有原生或非原生啟動子之桿狀病毒輔助基因。
在一些實施例中，本揭示案之AAV顆粒可在昆蟲細胞(例如，Sf9細胞)中產生。
在一些實施例中，本揭示案之AAV顆粒可使用三重轉染產生。
在一些實施例中，本揭示案之AAV顆粒可在哺乳動物細胞中產生。
在一些實施例中，本揭示案之AAV顆粒可藉由三重轉染在哺乳動物細胞中產生。
在一些實施例中，本揭示案之AAV顆粒可藉由三重轉染在HEK293細胞中產生。
如本文中所描述之包含肝臟向性衣殼蛋白質(例如，sL65衣殼蛋白質)且編碼GAL蛋白質之AAV顆粒可適用於人類疾病、獸醫學應用及各種活體內及活體外情形之領域。本揭示案之AAV顆粒可適用於用以治療、防治、緩解或改善GAL相關疾病及/或病症，例如溶酶體貯積病，例如法布立症之醫學領域。在一些實施例中，使用本揭示案之AAV顆粒預防及/或治療GAL相關病症，例如溶酶體貯積病，例如法布立症。
IV.醫藥組合物
本揭示案亦提供用於治療哺乳動物個體，包括人類個體中之GAL相關病症及與GAL蛋白質之功能或表現之缺陷相關的病症之方法，其包含向個體投與病毒顆粒或其醫藥組合物，該病毒顆粒包含肝臟向性衣殼蛋白質(例如，sL65衣殼蛋白質)及包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸。
如本文中所使用，術語「組合物」包含AAV顆粒及至少一種賦形劑。如本文中所使用，術語「醫藥組合物」包含AAV顆粒及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
儘管本文中所提供之對醫藥組合物(例如，包含待遞送之編碼GAL蛋白質之有效負載的AAV)的描述大體上係關於適合於向人類投與之醫藥組合物，但熟習此項技術者應理解，此類組合物通常適合於向任何其他動物(例如，非人類動物，例如非人類哺乳動物)投與。可良好理解為了使組合物適用於向各種動物投與而對適用於向人類投與之醫藥組合物進行之修飾，且一般熟練的獸醫藥理學家僅用普通實驗(若存在)即可設計及/或進行此類修飾。預期投與醫藥組合物之個體包括(但不限於)人類及/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、羊、貓、犬、小鼠及/或大鼠；及/或鳥類，包括商業相關之鳥類，諸如家禽、雞、鴨、鵝及/或火雞。
在一些實施例中，向人類、人類患者或個體投與組合物。
在一些實施例中，本文中所描述之AAV顆粒調配物可含有編碼至少一種有效負載之核酸。在一些實施例中，調配物可含有編碼1、2、3、4或5種有效負載之核酸。在一些實施例中，調配物可含有編碼有效負載構築體之核酸，該有效負載構築體編碼選自諸如(但不限於)以下類別之蛋白質：人類蛋白質、獸醫學蛋白質、細菌蛋白質、生物蛋白質、抗體、免疫原性蛋白質、治療性肽及蛋白質、分泌型蛋白質、質膜蛋白質、細胞質蛋白質、細胞骨架蛋白質、細胞內膜結合蛋白質、核蛋白質、與人類疾病相關之蛋白質及/或與非人類疾病相關之蛋白質。在一些實施例中，調配物含有至少三種編碼蛋白質之有效負載構築體。某些實施例規定：至少一種有效負載係GAL蛋白質或其變異體。
根據本揭示案之醫藥組合物可以散裝、以單一單位劑量形式及/或以複數個單一單位劑量形式製備、封裝及/或出售。如本文中所使用，「單位劑量」係指包含預定量之活性成分之醫藥組合物之離散量。活性成分之量通常等於 將向個體投與之活性成分之劑量及/或此類劑量之適宜分數，諸如此類劑量之二分之一或三分之一。
在本揭示案之一個態樣中，本揭示案之AAV顆粒將呈含有醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物形式。如本文中所使用，「醫藥學上可接受之載劑」係指習知地可用於投與藥品之任何實質上無毒性載體，本揭示案之經分離之多肽將在其中保持穩定及生物可用。醫藥學上可接受之載劑必須具有充分高的純度且具有足夠低的毒性以使其適用於向所治療之哺乳動物投與。其亦應維持活性劑之穩定性及生物可用性。醫藥學上可接受之載劑可為液體或固體，且經選擇(考慮所計劃之投與方式)以在與活性劑及既定組合物之其他組分組合時提供所需體積、稠度等。適合的醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，以及其類似物。醫藥學上可接受之載劑亦包括無菌水性溶液或分散液以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。此類介質及試劑用於醫藥學活性物質之用途係此項技術中熟知的。除非任何習知介質或試劑與基因療法載體不相容，否則涵蓋將其用於本揭示案之醫藥組合物中。亦可將補充活性化合物併入組合物中。
本揭示案之醫藥組合物可經調配以向用於獸醫學目的之動物(例如，家畜(牛、豬、犬、小鼠、大鼠))及其他非人類哺乳動物個體以及人類個體遞送。
在一個實施例中，本揭示案之醫藥組合物呈可注射組合物形式。組合物可製備為呈液體溶液或懸浮液形式之可注射劑。製劑亦可乳化。適合的賦形劑係例如水、生理鹽水、右旋糖、甘油、乙醇、磷酸鹽緩衝生理鹽水或其類似 物以及其組合。此外，視需要，製劑可含有少量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH值緩衝劑、佐劑、界面活性劑或免疫增強劑。
無菌可注射溶液可藉由將所需量之本揭示案之組合物併入具有一種以上列舉之成分或其組合的適當溶劑中，接著過濾滅菌來製備。通常，藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有鹼性分散介質及所需的來自以上列舉之成分的其他成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑之情況下，較佳製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加來自其先前無菌過濾溶液之任何其他所需成分的散劑。
可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥學程序來測定本文中所描述之核酸分子之毒性及治療功效，例如用於測定ED50(在50%的群體中在治療學上有效之劑量)。自細胞培養物分析法及/或動物研究獲得之資料可用於調配用於人類的劑量範圍。劑量通常將位於包括ED50且具有極少或不具有毒性之濃度範圍內。劑量可視所使用之劑型及所用投藥途徑而在此範圍內變化。對於本揭示案之方法中所使用之任何化合物，可最初由細胞培養物分析法評估治療有效劑量。
V.調配物
本文中所描述之AAV醫藥組合物之調配物可藉由藥理學技術中已知或此後研發之任何方法來製備。通常，此類製備方法包括以下步驟：使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他附屬成分締合，且隨後在必要及/或需要時，將產物分割、成型及/或封裝成所需單劑量或多劑量單元。
根據本揭示案之醫藥組合物中的活性成分、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何其他成分之相對量將視所治療之個體之身分、體型及/或狀況且進一步視組合物之投與途徑而變化。
舉例而言，組合物可包含0.1%與99%(w/w)之間的活性成分。作為實例，組合物可包含0.1%與100%之間，例如0.5%與50%之間、1-30%之間、5-80%之間，或至少80%(w/w)的活性成分。
本揭示案之AAV顆粒可使用一或多種賦形劑來調配以：(1)增加穩定性；(2)增加細胞轉染或轉導；(3)允許持續或延遲釋放；(4)改變生物分佈(例如，使病毒顆粒靶向特定組織或細胞類型)；(5)活體內增加經編碼之蛋白質之轉譯；(6)活體內改變經編碼之蛋白質之釋放曲線；及/或(7)實現有效負載之可調節表現。
本揭示案之調配物可包括(但不限於)生理鹽水、類脂質、脂質體、脂質奈米顆粒、聚合物、脂複合體、核-殼奈米顆粒、肽、蛋白質、經病毒載體轉染之細胞(例如，用於移植至個體中)、奈米顆粒模擬物以及其組合。此外，本揭示案之病毒載體可使用自組裝核酸奈米顆粒調配。
在一些實施例中，編碼GAL蛋白質之病毒載體可經調配以最佳化比重及/或滲透壓。在一些實施例中，可最佳化比重及/或滲透壓以確保肝臟中之最佳藥物分佈。
本揭示案之調配物可包括一或多種賦形劑，該一或多種賦形劑之中各者之量共同增加AAV顆粒之穩定性、增加由病毒顆粒進行之細胞轉染或轉導、增加病毒顆粒編碼之蛋白質之表現及/或改變AAV顆粒編碼之蛋白質之釋放曲線的量。在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑可為至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%純的。在一些實施例中，賦形劑被批准用於人類及獸醫學用途。在一些實施例中，賦形劑可由美國食品及藥物管理局(United States Food and Drug Administration)批准。在一些實施例中，賦形劑可為醫藥級。在一些實施例中，賦形劑可符合美國藥典(United States Pharmacopoeia；USP)、歐洲藥典(European Pharmacopoeia；EP)、英國藥典(British Pharmacopoeia)及/或國際藥典(International Pharmacopoeia)之標準。
如本文中所使用之賦形劑包括(但不限於)適用於所需特定劑型之任何及全部溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、界面活性劑、等張劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑及其類似物。用於調配醫藥組合物之各種賦形劑及用於製備組合物之技術為此項技術中已知的(參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro,Lippincott,Williams & Wilkins,Baltimore,MD,2006；其內容以全文引用之方式併入本文中)。除非任何習知賦形劑介質可能與物質或其衍生物不相容，諸如產生任何不合需要的生物作用或以其他方式與醫藥組合物之任何其他組分以有害的方式相互作用，否則在本揭示案之範疇內可涵蓋使用習知賦形劑介質。
在一些實施例中，AAV調配物可包含至少一種賦形劑，該至少一種賦形劑係非活性成分。如本文中所使用，術語「非活性成分」係指一或多種對調配物中所包括之醫藥組合物之活性無貢獻之藥劑。在一些實施例中，可用於本揭示案之調配物中之非活性成分可全部、皆未或其中一些經美國食品及藥物管理局(FDA)批准。
本文中所揭示之AAV顆粒之調配物可包括陽離子或陰離子。在一些實施例中，調配物包括金屬陽離子，諸如(但不限於)Zn2+、Ca2+、Cu2+、 Mg+或其組合。在一些實施例中，調配物可包括與金屬陽離子錯合之聚合物或多核苷酸(參見例如美國專利案第6,265,389號及第6,555,525號，其內容各自以全文引用之方式併入本文中)。
VI.本揭示案之方法
本揭示案亦提供使用本揭示案之組合物之方法，其通常包括投與AAV顆粒或包含本揭示案之AAV顆粒之醫藥組合物。
在一個態樣中，本揭示案提供用於向個體遞送外源性GAL蛋白質之方法。該等方法通常包括投與有效量之AAV病毒顆粒或包含本揭示案之AAV顆粒之醫藥組合物，藉此向個體遞送外源性GAL。
本揭示案亦提供用於治療患有或經診斷患有溶酶體貯積病(例如，法布立症)之個體之方法。該等方法包含投與有效量之AAV病毒顆粒或包含本揭示案之AAV顆粒之醫藥組合物，藉此治療個體中之溶酶體貯積病。
本揭示案亦提供用於治療患有或經診斷患有GAL相關疾病(例如，法布立症)之個體之方法。該等方法包含投與有效量之AAV病毒顆粒或包含本揭示案之AAV顆粒之醫藥組合物，藉此治療個體中之GAL相關疾病。
本揭示案亦提供用於治療患有或經診斷患有法布立症之個體。該等方法包含投與有效量之AAV病毒顆粒或包含本揭示案之AAV顆粒之醫藥組合物，藉此治療個體中之法布立症。
在一些實施例中，經由遞送功能性有效負載，本揭示案之AAV顆粒可調節有需要之個體中之基因產物之水準或功能，其中該功能性有效負載係包含GAL蛋白質或其變異體之治療產品。功能性有效負載可緩解或減少有需要 之個體中之由基因產物之異常水準及/或功能(例如，蛋白質之缺失或缺陷)引起之症狀。
在一些實施例中，遞送AAV顆粒可停止或減緩GAL相關病症，例如溶酶體貯積病，例如法布立症之進程，如藉由個體中之GAL水準所量測。可使用此項技術中已知之任何方法量測GAL水準，例如藉由量測血液中之GAL水準。通常可經由酶分析法測試來診斷患有法布立症之男性。患有經典型法布立症之男性基本上不具有GAL酶(小於正常值之1%)。具有非經典型法布立症基因突變之男性將具有一些酶，但其仍極少。相比之下，女性可具有大致正常的酶水準，因此酶分析法不足以進行診斷，因此，必須進行DNA序列分析。
在某些實施例中，遞送AAV顆粒可改良GAL相關病症(例如，法布立症)之一或多種症狀，包括例如麻木、麻刺感、灼熱感或其他異常感覺，尤其在手部及腳部中(肢端感覺異常)；疼痛發作/危象；發熱；身體痛或不適；無法耐受費力的身體活動；頻繁及/或慢性疲勞；無法耐受炎熱及寒冷的溫度；出汗減少或不出汗；小腿、踝部及腳部腫脹(水腫)；角膜或晶狀體渾濁，即角膜上且有時眼睛之晶狀體上之斑紋狀或輪狀不透明/混濁圖案(輪狀角膜及法布立氏白內障(Fabry cataracts))；小型，有時叢集性，略微凸起之紅色或淡紫紅色皮膚病變(血管角化瘤)；胃腸道問題，頻繁的中度至重度腹瀉及/或便秘、胃腸積氣、胃或腸道疼痛及痙攣、早飽、食物不耐症及難以增加體重；阻塞性或縮窄性肺病，通常由哮喘、慢性咳嗽、呼吸短促或憋氣(呼吸困難)證明；復發性支氣管炎及疲勞(通常診斷為阻塞性肺病)；耳朵中之鳴響(耳鳴)；以及進行性或突發性聽力喪失、虛弱、畏光、頭暈、眩暈(旋轉型頭暈)及由神經損傷引起之頭痛；及其他腦血管疾病影響；引起或加重許多其他法布立症症狀之周邊神經病變(對周邊神經系統 之損傷)；短暫性缺血性發作(TIA)；中風；腎功能衰弱及腎衰竭(通常不存在糖尿病)；蛋白尿及微量白蛋白尿；腎臟透析及移植；心臟併發症，諸如心律不齊(心率或節律異常，包括心房震顫)；左心室肥大(LVH)；以及心臟瓣膜功能障礙、心臟病發作及心臟衰竭。可根據此項技術中已知的標準方法及技術容易地評估此等症狀中之任一者之改良。亦可監測上文未列舉之其他症狀以測定治療法布立症之有效性。
在某些實施例中，需要治療之個體係患有經典型法布立症之個體。在其他實施例中，需要治療之個體係患有遲發性或非典型類型法布立症之個體。在某些實施例中，本揭示案提供用於減少任何前述有需要之個體中(諸如骨骼肌、心肌及/或肝臟中)之醣神經鞘脂質積聚之方法，其係藉由投與AAV顆粒或包含本揭示案之AAV顆粒之醫藥組合物。
通常，此項技術中已知用於感興趣的細胞之病毒感染之方法。可使病毒與感興趣的細胞接觸或可注射至罹患GAL相關病症，例如溶酶體貯積病，例如法布立症之個體中。
將本揭示案之組合物引入個體中以用於治療目的之指導係此項技術中已知的且可在美國專利案第5,631,236號、第5,688,773號、第5,691,177號、第5,670,488號、第5,529,774號、第5,601,818號及PCT公開案第WO 95/06486號中獲得，其全部內容以引用之方式併入本文中。
本揭示案之AAV顆粒可藉由任何產生治療學上有效結果之途徑來投與。此等途徑包括(但不限於)經腸(進入腸道)、胃腸道、硬腦膜上(進入硬腦膜)、口服(通過口腔)、經皮、硬膜外、腦內(進入大腦)、腦室內(進入腦室)、顱內(進入顱骨)、經由皮膚(施用於皮膚上)、皮內(進入皮膚自身)、皮下(在皮膚下)、 經鼻投與(經由鼻子)、靜脈內(進入靜脈)、靜脈內推注、靜脈內滴注、動脈內(進入動脈)、肌肉內(進入肌肉)、心內(進入心臟)、骨內輸注(進入骨髓)、實質內(進入實質)、鞘內(進入脊椎管)、腹膜內(輸注或注射至腹膜中)、囊泡內輸注、玻璃體內(經由眼睛)、海綿竇內注射(進入病理腔)、腔內(進入陰莖底部)、陰道內投與、子宮內、羊膜外投與、經皮(經由完整皮膚擴散以用於全身分佈)、經黏膜(經由黏膜擴散)、經陰道、吹入(嗅吸)、舌下、唇下、灌腸、滴眼劑(在結膜上)、耳內滴劑、經耳(在耳中或通過耳部)、經頰(向頰部引導)、結膜、皮膚、牙齒(對一或多個牙齒)、電滲透、子宮頸內、竇道內、氣管內、體外、血液透析、浸潤、間質、腹部內、羊膜內、關節內、椎管內、支氣管內、囊內、軟骨內(在軟骨內)、尾部內(在馬尾神經內)、腦池內(在小腦延髓池內)、角膜內(在角膜內)、牙冠內、冠狀動脈內(在冠狀動脈內)、陰莖海綿體內(在陰莖之海棉體之可膨脹空間內)、椎間盤內(在椎間盤內)、管內(在腺體之管道內)、十二指腸內(在十二指腸內)、硬膜內(在硬腦膜內或下方)、表皮內(到達表皮)、食管內(到達食道)、胃內(在胃內)、齒齦內(在齒齦內)、回腸內(在小腸之遠端部分內)、病灶內(在局部病灶內或直接引導至局部病灶)、腔內(體管之內腔內)、淋巴管內(在淋巴內)、髓內(在骨骼之骨髓腔內)、腦脊膜內(在腦膜內)、眼內(在眼睛內)、卵巢內(在卵巢內)、心包內(在心包內)、胸膜內(在胸膜內)、前列腺內(在前列腺腺體內)、肺內(在肺或其支氣管內)、竇內(在鼻竇或眶周竇內)、脊椎內(在脊柱內)、滑膜內(在關節之滑液腔內)、肌腱內(在肌腱內)、睾丸內(在睾丸內)、鞘內(在腦脊髓軸之任何平面處之腦脊髓液內)、胸內(在胸腔內)、小管內(在器官之小管內)、瘤內(在腫瘤內)、鼓室內(在鼓室內)、血管內(在一或多個血管內)、室內(在腦室內)、離子導入療法(藉助於電流，其中可溶性鹽之離子遷移至身體之組織中)、灌注(沖刷或沖洗開放性傷口或 體腔)、喉部(直接在喉上)、鼻胃管(經由鼻且進入胃部)、封閉敷裹技術(局部途徑投藥，接著由遮擋該區域之敷料覆蓋)、眼用(到達外眼)、口咽(直接到達口腔及咽部)、腸胃外、透皮、關節周、硬膜外、神經周、牙周、經直腸、呼吸道(在呼吸道內，藉由經口或經鼻吸入以實現局部或全身作用)、眼球後(在腦橋後或在眼球後)、軟組織、蛛膜下、結膜下、黏膜下、軟膜下、局部、經胎盤(經由或穿過胎盤)、經氣管(經由氣管壁)、經鼓膜(穿過或經由鼓腔)、輸尿管(到達尿管)、尿道(到達尿道)、經陰道、骶管阻滯、診斷性、神經阻滯、膽灌注、心臟灌注、光除去法或脊椎。
在一些實施例中，可藉由全身遞送來遞送AAV顆粒。在一些實施例中，全身遞送可藉由血管內投與來進行。在一些實施例中，全身遞送可藉由靜脈內(IV)投與來進行。
應用本揭示案之方法以治療及/或預防病症可引起治癒病症、減少與病症相關之至少一種症狀(長期或短期)或僅短暫的對個體有利之作用。
因此，如本文中所使用，術語「治療(treat/treatment/treating)」包括向罹患GAL相關疾病(例如，溶酶體貯積病(例如法布立症))或易患此類病狀之個體施用或投與如本文中所描述之組合物，以達成治癒、治療、緩解、減輕、改變、補救、改善、改良或影響此類病狀或此類病狀之至少一種症狀之目的。如本文中所使用，若減少、減緩、延緩或預防病狀之復發，則亦「治療」病狀。
術語「預防性」或「治療性」治療係指向個體投與一或多種本發明之組合物。若在非吾人所樂見的病狀(例如，宿主動物之疾病或其他非吾人所樂見的病況)之臨床表現之前投與，則治療為預防性，亦即，其保護宿主避免發 展非吾人所樂見的病狀，然而若在非吾人所樂見的病狀之表現之後投與，則治療為治療性(亦即，意欲減少、改善或維持現有的非吾人所樂見的病狀或其副作用)。
如本文中所使用，「治療有效量」意欲包括當投與患者以用於治療GAL相關疾病，例如溶酶體貯積病(例如法布立症)時，足以實現疾病之治療(例如，藉由減少、改善或維持現有疾病或疾病之一或多種症狀)之本揭示案之組合物之量。「治療有效量」可視組合物、投與組合物之方式、疾病及其嚴重性以及病史、年齡、體重、家族病史、基因構成、由疾病表現介導之病理學過程之階段、先前或伴隨治療之類型以及(若存在)所治療之患者之其他個別特徵而變化。
如本文中所使用，「預防有效量」意欲包括當向尚未經歷或顯示例如GAL相關疾病，例如溶酶體貯積病(例如，法布立症)之症狀，但可能傾向於罹患該疾病之個體投與時，足以預防或改善疾病或疾病之一或多種症狀之組合物之量。改善疾病包括減緩疾病之病程或降低後期發展之疾病之嚴重性。「預防有效量」可視組合物、投與組合物之方式、疾病之風險程度、病史、年齡、體重、家族病史、基因構成、先前或伴隨治療之類型以及(若存在)所治療之患者之其他個別特徵而變化。
「治療有效量」或「預防有效量」亦包括在合理的利益/風險比下產生適用於任何治療之某種所需局部或全身作用之組合物的量。本揭示案之方法中所使用之組合物可以足以產生適用於此類治療之合理的利益/風險比的量投與。
可視需要投與如本文中所描述之組合物以實現所需作用且取決於多種因素，包括(但不限於)病狀之嚴重性、個體之年齡及病史以及組合物之性質，例如基因之身分或受影響的生化途徑。
本揭示案之醫藥組合物可以單次劑量投與或在本揭示案之特定實施例中，可使用多次劑量(例如，兩次、三次、四次或更多次投藥)以實現治療作用。當使用多次投藥時，可使用分次給藥方案，諸如本文中所描述之方案。如本文中所使用，「分次劑量」係將「單一單位劑量」或每日總劑量分成兩個或更多個劑量，例如單一單位劑量之兩次或更多次投藥。如本文中所使用，「單一單位劑量」為在一個劑量/一次性/單一途徑/單一接觸點中(亦即，單次投藥事件)投與的任何治療組合物之劑量。在一些實施例中，單一單位劑量係以離散劑型(例如，錠劑、膠囊、貼片、已裝載之注射器、小瓶等)提供。如本文中所使用，「每日總劑量」係在24小時時段中提供或指定之量。其可以單一單位劑量形式投與。病毒顆粒可僅調配於緩衝液中或調配於本文中所描述之調配物中。
治療性或預防性方案可涵蓋至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24週之時段或長期向個體投與。
通常，本揭示案之核酸分子及/或載體係以治療有效量提供，以引發所需作用，例如增加GAL表現及/或活性。根據治療之數目及量，待投與之病毒顆粒之數量亦將取決於諸如臨床狀況、年齡、先前治療、個體之一般健康狀況及/或年齡、所存在之其他疾病以及病症之嚴重性之因素。需要投與之活性成分之精確量取決於基因治療師之判斷且將對各個患者而言係特定的。此外，用治療有效量之本揭示案之核酸分子及/或載體治療個體可包括單一治療或較佳可包括一系列治療。亦應瞭解，用於治療之有效劑量可在特定治療之過程中增加或減少。劑量之變化可由如本文中所描述之診斷性分析法之結果引起。醫藥組合物可與投藥說明書一起包括於容器、封裝或分配器中。
在一些實施例中，本揭示案之病毒顆粒(或本揭示案之醫藥組合物)之治療有效量或預防有效量之效價範圍係約1×105、約1.5×105、約2×105、約2.5×105、約3×105、約3.5×105、約4×105、約4.5×105、約5×105、約5.5×105、約6×105、約6.5×105、約7×105、約7.5×105、約8×105、約8.5×105、約9×105、約9.5×105、約1×106、約1.5×106、約2×106、約2.5×106、約3×106、約3.5×106、約4×106、約4.5×106、約5×106、約5.5×106、約6×106、約6.5×106、約7×106、約7.5×106、約8×106、約8.5×10、約9×106、約9.5×106、約1×107、約1.5×107、約2×107、約2.5×107、約3×107、約3.5×107、約4×107、約4.5×107、約5×107、約5.5×107、約6×107、約6.5×107、約7×107、約7.5×107、約8×107、約8.5×107、約9×107、約9.5×107、約1×108、約1.5×108、約2×108、約2.5×108、約3×108、約3.5×108、約4×108、約4.5×108、約5×108、約5.5×108、約6×108、約6.5×108、約7×108、約7.5×108、約8×108、約8.5×108、約9×108、約9.5×108、約1×109、約1.5×109、約2×109、約2.5×1098、約3×109、約3.5×109、約4×109、約4.5×109、約5×109、約5.5×109、約6×109、約6.5×109、約7×109、約7.5×109、約8×109、約8.5×109、約9×109、約9.5×109、約1×1010、約1.5×1010、約2×1010、約2.5×1010、約3×1010、約3.5×1010、約4×1010、約4.5×1010、約5×1010、約5.5×1010、約6×1010、約6.5×1010、約7×1010、約7.5×1010、約8×1010、約8.5×1010、約9×1010、約9.5×1010、約1×1011、約1.5×1011、約2×1011、約2.5×1011、約3×1011、約3.5×1011、約4×1011、約4.5×1011、約5×1011、約5.5×1011、約6×1011、約6.5×1011、約7×1011、約7.5×1011、約8×1011、約8.5×1011、約9×1011、約9.5×1011、約1×1012、約1.5×1012、約2×1012、約2.5×1012、約3×1012、約3.5×1012、約4×1012、約4.5×1012、約5×1012、約 5.5×1012、約6×1012、約6.5×1012、約7×1012、約7.5×1012、約8×1012、約8.5×1012、約9×1012、約9.5×1012、約1×1013、約1.5×1013、約2×1034、約2.5×1013、約3×1013、約3.5×1013、約4×1013、約4.5×1013、約5×1013、約5.5×1013、約6×1013、約6.5×1013、約7×1013、約7.5×1013、約8×1013、約8.5×1013、約9×1013、約9.5×1013、約1×1014、約1.5×1014、約2×1014、約2.5×1014、約3×1014、約3.5×1014、約4×1014、約4.5×1014、約5×1014、約5.5×1014、約6×1014、約6.5×1014、約7×1014、約7.5×1014、約8×1014、約8.5×1014、約9×1014、約9.5×1014、約1×1015個病毒顆粒(vp)。
在一些實施例中，本揭示案之病毒顆粒(或本揭示案之醫藥組合物)之治療有效量或預防有效量係以基因體複本(「GC」)，亦稱為「病毒基因體」(「vg」)表示，其範圍係：約1×105、約1.5×105、約2×105、約2.5×105、約3×105、約3.5×105、約4×105、約4.5×105、約5×105、約5.5×105、約6×105、約6.5×105、約7×105、約7.5×105、約8×105、約8.5×105、約9×105、約9.5×105、約1×106、約1.5×106、約2×106、約2.5×106、約3×106、約3.5×106、約4×106、約4.5×106、約5×106、約5.5×106、約6×106、約6.5×106、約7×106、約7.5×106、約8×106、約8.5×10、約9×106、約9.5×106、約1×107、約1.5×107、約2×107、約2.5×107、約3×107、約3.5×107、約4×107、約4.5×107、約5×107、約5.5×107、約6×107、約6.5×107、約7×107、約7.5×107、約8×107、約8.5×107、約9×107、約9.5×107、約1×108、約1.5×108、約2×108、約2.5×108、約3×108、約3.5×108、約4×108、約4.5×108、約5×108、約5.5×108、約6×108、約6.5×108、約7×108、約7.5×108、約8×108、約8.5×108、約9×108、約9.5×108、約1×109、約1.5×109、約2×109、約2.5×1098、約3×109、約3.5×109、約4×109、約4.5×109、約5×109、約5.5×109、 約6×109、約6.5×109、約7×109、約7.5×109、約8×109、約8.5×109、約9×109、約9.5×109、約1×1010、約1.5×1010、約2×1010、約2.5×1010、約3×1010、約3.5×1010、約4×1010、約4.5×1010、約5×1010、約5.5×1010、約6×1010、約6.5×1010、約7×1010、約7.5×1010、約8×1010、約8.5×1010、約9×1010、約9.5×1010、約1×1011、約1.5×1011、約2×1011、約2.5×1011、約3×1011、約3.5×1011、約4×1011、約4.5×1011、約5×1011、約5.5×1011、約6×1011、約6.5×1011、約7×1011、約7.5×1011、約8×1011、約8.5×1011、約9×1011、約9.5×1011、約1×1012、約1.5×1012、約2×1012、約2.5×1012、約3×1012、約3.5×1012、約4×1012、約4.5×1012、約5×1012、約5.5×1012、約6×1012、約6.5×1012、約7×1012、約7.5×1012、約8×1012、約8.5×1012、約9×1012、約9.5×1012、約1×1013、約1.5×1013、約2×1034、約2.5×1013、約3×1013、約3.5×1013、約4×1013、約4.5×1013、約5×1013、約5.5×1013、約6×1013、約6.5×1013、約7×1013、約7.5×1013、約8×1013、約8.5×1013、約9×1013、約9.5×1013、約1×1014、約1.5×1014、約2×1014、約2.5×1014、約3×1014、約3.5×1014、約4×1014、約4.5×1014、約5×1014、約5.5×1014、約6×1014、約6.5×1014、約7×1014、約7.5×1014、約8×1014、約8.5×1014、約9×1014、約9.5×1014、約1×1015、約1.5×1015、約2×1015、約2.5×1015、約3×1015、約3.5×1015、約4×1015、約4.5×1015、約5×1015、約5.5×1015、約6×1015、約6.5×1015、約7×1015、約7.5×1015、約8×1015、約8.5×1015、約9×1015、約9.5×1015或約1×1016個vg。
可使用此項技術中已知之任何方法測定本揭示案之病毒組合物之基因體複本(GC)數目。一種用於進行AAV GC數目滴定之方法如下：首先用DNA 酶處理經純化之AAV病毒顆粒樣本以消除未經衣殼化之AAV基因體DNA或來自產生過程之受污染之質體DNA。接著，對DNA酶抗性顆粒進行熱處理以自衣殼釋放基因體。接著，使用靶向病毒基因體之特定區域之引子/探針集合，藉由即時PCR或ddPCR定量所釋放之基因體。
在本揭示案之某些實施例中，本揭示案之組合物係與其他治療劑或治療組合投與。組合物及其他治療劑可在同一組合物中組合投與，或其他治療劑可作為單獨的組合物之一部分或藉由本文中所描述之另一種方法投與。
治療劑可由美國食品及藥物管理局批准且可處於臨床試驗中或處於臨床前研究階段。治療劑可利用此項技術中已知的任何治療模式，作為非限制性實例，包括基因靜默或干擾(亦即，miRNA、siRNA、RNAi、shRNA)、基因編輯(亦即，TALEN、CRISPR/Cas9系統、鋅指核酸酶)以及基因、蛋白質或酶置換。
適用於本揭示案之方法中的其他治療劑或治療之實例包括已知用於治療GAL相關疾病，例如法布立症之藥劑或治療。在一個實施例中，其他治療劑或治療係酶替代療法。其涉及靜脈內投與重組人類GAL，例如藉由以Fabrazyme®(Genzyme,Inc.)及Replagal®(TKT,Inc.)市售之產品。在其他實施例中，適用於本揭示案之方法之其他治療劑或治療包括口服伴隨蛋白療法，例如Galafold®(或米加司他(migalastat))。
VI.套組
本揭示案亦提供各種用於便利地及/或有效地進行本揭示案之方法之套組。通常，套組將包含足以允許使用者對個體進行多次治療及/或進行多次實驗的量及/或數目之組分。
本揭示案之載體、構築體或GAL蛋白質中之任一者可包含於套組中。在一些實施例中，套組可進一步包括用於產生及/或合成本揭示案之化合物及/或組合物之試劑及/或說明書。在一些實施例中，套組亦可包括一或多種緩衝液。在一些實施例中，本揭示案之套組可包括用於製備蛋白質或核酸陣列或庫之組分，且因此可包括例如固體支撐物。
在一些實施例中，套組組分可封裝於水性介質中或以凍乾形式封裝。套組之容器構件通常將包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器構件，可將組分置放且較佳適當等分於該等容器構件中。在存在超過一種套組組分(標記試劑及標記可封裝在一起)的情況下，套組通常亦可含有第二、第三或其他額外容器，額外組分可單獨置放於該等額外容器中。在一些實施例中，套組亦可包含用於容納無菌、醫藥學上可接受之緩衝液及/或其他稀釋劑之第二容器構件。在一些實施例中，組分之各種組合可包含於一或多個小瓶中。本揭示案之套組亦可通常包括密封存放以用於商業銷售的用於容納本揭示案之化合物及/或組合物(例如，蛋白質、核酸)的構件及任何其他試劑容器。此類容器可包括固持所需小瓶的注射模製或吹塑模製之塑膠容器。
在一些實施例中，套組組分係以一種及/或多種液體溶液形式提供。在一些實施例中，液體溶液係水性溶液，尤其使用無菌水性溶液。在一些實施例中，套組組分可以乾燥粉末形式提供。當試劑及/或組分以乾粉形式提供時，此類粉末可藉由添加適合的體積之溶劑來復原。在一些實施例中，設想亦可在另一容器構件中提供溶劑。在一些實施例中，標記染料係以乾燥粉末形式提供。在一些實施例中，經考慮，在本揭示案之套組中提供10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、 400、500、600、700、800、900、1000微克或至少或至多此等量之乾燥染料。在此類實施例中，染料可隨後再懸浮於任何適合的溶劑，諸如DMSO中。
在一些實施例中，套組可包括使用套組組分以及使用未包括於套組中之任何其他試劑的說明書。說明書可包括可實施之變化形式。
藉由以下非限制性實例進一步說明本揭示案。
實例
實例1.載體設計及合成
產生各種編碼人類GAL蛋白質之AAV病毒基因體。經編碼之GAL蛋白質具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其對應於人類GAL蛋白質(SEQ ID NO：47)之胺基酸32-429，且係由SEQ ID NO：2之核苷酸序列編碼。編碼GAL蛋白質之核酸序列亦經密碼子最佳化(SEQ ID NO：3-5)。
編碼GAL蛋白質之病毒基因體經設計以進一步編碼信號肽。一些病毒基因體經設計以包括具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列之原生GAL信號肽，其對應於人類GAL蛋白質(SEQ ID NO：47)之胺基酸1-31。原生GAL信號肽係由SEQ ID NO：7之核苷酸序列編碼。編碼GAL信號肽之核酸序列亦經密碼子最佳化(SEQ ID NO：8-10)。
或者，將具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列之人類IgG1信號序列併入病毒基因體中。人類IgG1信號肽係由SEQ ID NO：12之核苷酸序列編碼。編碼IgG1信號肽之核酸序列亦經密碼子最佳化(SEQ ID NO：13及14)。
圖1提供編碼具有信號肽之GAL蛋白質之例示性構築體之示意圖。
實例2.活體外表現構築體之評估
針對α-GAL成熟肽之產生來活體外評估各種AAV-GLA構築體組合。
用包含構築體1-8之質體轉染HepG2細胞(圖2)。實例2及3(及其中參考之圖式)中之構築體1-8分別指如本文中所描述之構築體1A-8A或SEQ ID NO：31-38(參見表6)。在轉染後72小時收集細胞且處理，以量測溶解物及上清液中之α-GAL水準。α-GAL肽水準之西方墨點法觀測及ELISA定量表明，某些構築體在溶解物及上清液中顯示較高的α-GAL表現，其中構築體2及構築體8在上清液中產生至少750ng/ml，如藉由ELISA偵測(參見圖3、圖4及表3)。亦包括β-肌動蛋白標準作為內參考物。評估各構築體之α-GAL蛋白質之活性，其中構築體2及構築體8在上清液中展示至少15nmol/hr×ml(參見圖5及表4)。
Figure 111132078-A0202-12-0139-4
Figure 111132078-A0202-12-0139-5
本實例尤其表明，本揭示案之構築體可活體外產生成熟、功能性GAL。在一些實施例中，GAL之水準及/或活性相對於參考構築體可得到改良。
實例3.活體內表現構築體之評估
針對α-GAL成熟肽之產生及活性來活體內評估各種AAV-GLA構築體組合。
將構築體1(圖2)封裝於AAV-DJ中且經由靜脈內(IV)投與來遞送至14週齡法布立氏小鼠(Fabry mice)(n=3)。實例3中之構築體1係指如本文中所描述之構築體1A或SEQ ID NO：31(參見表6)。以5E13vg/kg之劑量將組合物投與至眶靜脈中。在第0天及注射後第7天收集血漿樣本且評估GAL活性(圖6)。
本實例尤其表明，本揭示案之構築體活體內產生成熟、功能性GAL。在一些實施例中，GAL之水準及/或活性相對於參考構築體可得到改良。
將如圖2中所示之構築體封裝於受啟動子控制之AAV ITR內且針對表現進行測試。亦針對細胞中之GLA酶活性來測試構築體。
產生包含病毒基因體之AAV顆粒。此等重組AAV顆粒包含具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列之肝臟向性衣殼蛋白質sL65。衣殼蛋白質係由具有SEQ ID NO：46之核苷酸序列之核酸編碼。
實例4.活體外表現構築體之評估
針對α-GAL成熟肽之產生來活體外評估AAV-GLA構築體組合。用包含構築體1-11之質體轉染HepG2細胞(圖7)。實例4及5以及其中參考之圖式中之構築體1-11分別指構築體1B-11B或SEQ ID NO：51-61(參見表6)。構築體1B-11B與構築體1A-11A的不同之處在於，構築體1B-11B含有靠近3' ITR之5'的 填充序列中之2個鹼基對添加(「gt」)，以及5' ITR之外部及靠近5' ITR之3'的填充序列中之6個鹼基對缺失。
簡言之，在12孔盤中，將細胞接種於細胞培養基(DMEM及10% FBS，2毫升/孔)中。根據製造商說明製備質體及脂質複合物。以92μl之總體積混合2μg DNA及Opti-MEM，且添加6μl Fugene HD轉染劑(Promega)且立即渦旋5秒。將DNA/脂質複合物在室溫下培育15分鐘，且接著添加至細胞中以用於在37℃下培育48-72小時。
α-GAL肽水準之西方墨點法觀測表明，某些構築體在溶解物及上清液中顯示較高的α-GAL表現(圖8)。亦包括β-肌動蛋白標準作為內參考物。亦評估各構築體之α-GAL蛋白質之活性，其中構築體2、4、5、6、7、8、9、10及11在上清液中展示至少70nmol/hr×ml(圖9及表5)。
Figure 111132078-A0202-12-0141-6
亦用與Ref2K一起封裝至AAV/DJ中之所選擇的構築體(亦即，構築體2、4、6、7、8及9)轉導HepG2細胞。簡言之，在第0天將細胞(500,000個 細胞)塗佈於12孔盤中，且在第1天用封裝至AAV/DJ中之構築體以三種不同感染倍率(MOI)，亦即，5E4、1E5及2E5進行轉導。在轉導後72小時收集細胞且收集上清液樣本。α-GAL肽水準之西方墨點法觀測表明，在1E5之MOI下之轉導引起GAL之更好的表現，且某些構築體在上清液中顯示較高的α-GAL表現，諸如構築體6、8及9(圖10)。亦針對α-GAL蛋白質之活性來評估各構築體。與西方墨點法結果一致，在1E5之MOI下之轉導引起更高的GAL活性水準，特定言之，對於構築體6、8及9(圖11)。
實例5.活體內AAV-DJ中之表現構築體之評估
針對α-GAL成熟肽之產生及活性來活體內評估AAV-GLA構築體組合。實例5及其中參考之圖式中之構築體1-11分別指構築體1B-11B或SEQ ID NO：51-61(參見表6)。
簡言之，向法布立氏小鼠(B6；129-Glatm1Kul/J；JAX 003535)(n=5隻/組)投與含經密碼子最佳化之構築體之AAV-DJ且監測6週。組合物係在調配緩衝液(10mM磷酸鈉、150mM NaCl及0.001% Pluronic F68)中以5E11vg/kg之劑量投與。在第6週之後將動物處死。量測血漿中之α-GAL活性，且亦評估溶血-GB3積聚之清除率(圖12)。如圖12中所示，接受構築體6、8及9之小鼠中之α-GAL活性顯著增加且溶血-GB3水準顯著降低。α-GAL與溶血-GB3水準之間的相關性係如圖13所示。
如上文所描述，在法布立氏小鼠(n=4隻/組)中以1E13vg/kg之較高劑量進一步測試AAV-DJ中之構築體6及9。在給藥前且在第1週、第4週及第6週收集血漿樣本且量測α-GAL活性。如圖14中所示，接受構築體9之小鼠具有最高的α-GAL活性水準。
本實例尤其表明，本揭示案之構築體活體內產生成熟、功能性GAL，且接受本揭示案之構築體之小鼠中的GAL之水準及/或活性得到顯著改良。
實例6.封裝於含有SL65衣殼之AAV顆粒中的表現構築體之活體內評估
選擇選定的表現構築體以用於在包含肝臟向性衣殼蛋白質SL65之AAV顆粒中進行評估。肝臟向性衣殼蛋白質sL65包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列。衣殼蛋白質係由具有SEQ ID NO：46之核苷酸序列之核酸編碼。活體內評估α-GAL成熟肽之產生及活性。
簡言之，將構築體6及9封裝於包含肝臟向性衣殼蛋白質SL65之AAV顆粒中，且經由IV投與來遞送至PXB小鼠(n=4隻/組)。實例6及其中參考之圖式中之構築體6及9分別指構築體6B-9B或SEQ ID NO：56及59(參見表6)。以3E13vg/kg之劑量投與組合物。在給藥前且在第2週及第4週收集血漿樣本。在第4週之後將動物處死。量測血漿中之α-GAL活性且評估人類白蛋白(ALB)之水準作為對照(圖15)。如圖15中所示，與給藥前相比，接受構築體6或9之小鼠中之α-GAL活性水準顯著增加，同時未觀測到ALB水準之顯著變化。圖16展示藉由ALB水準標準化之經校正之α-GAL活性水準。特定言之，在投與封裝於具有SL65衣殼之AAV顆粒中的構築體9之後兩週，在小鼠中觀測到α-GAL活性水準增加17倍。
本實例尤其表明，本揭示案之構築體活體內產生成熟、功能性GAL，且接受本揭示案之構築體之小鼠中的GAL之水準及/或活性得到顯著改良。
等效物及範疇
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文中所描述之特定實施例及方法之許多等效物。此類等效物意欲涵蓋於以下申請專利範圍之範疇內。
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Figure 111132078-A0202-12-0146-8
Figure 111132078-A0202-12-0147-9
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Claims (88)

  1. 一種經分離之重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其包含AAV衣殼蛋白質及核酸，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列，且該核酸包含編碼α-半乳糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因。
  2. 如請求項1所述之經分離之rAAV顆粒，其中該編碼衣殼蛋白質之核酸包含SEQ ID NO：46之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  3. 如請求項1或2所述之經分離之rAAV顆粒，其中該經編碼之GAL蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其中該編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  5. 如請求項1至3中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其中該編碼GAL蛋白質之轉基因係經密碼子最佳化的。
  6. 如請求項5所述之經分離之rAAV顆粒，其中該編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：3-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其中該編碼GAL蛋白質之轉基因進一步編碼信號序列。
  8. 如請求項7所述之經分離之rAAV顆粒，其中該經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列。
  9. 如請求項7或8所述之經分離之rAAV顆粒，其中該經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
  10. 如請求項7或8所述之經分離之rAAV顆粒，其中該經編碼之信號序列係由經密碼子最佳化之核酸編碼。
  11. 如請求項10所述之經分離之rAAV顆粒，其中該經密碼子最佳化之核酸包含SEQ ID NO：8-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列。
  12. 如請求項7所述之經分離之rAAV顆粒，其中該經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列。
  13. 如請求項7或12所述之經分離之rAAV顆粒，其中該經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
  14. 如請求項7或12所述之經分離之rAAV顆粒，其中該經編碼之信號序列係由經密碼子最佳化之核酸編碼。
  15. 如請求項14所述之經分離之rAAV顆粒，其中該經密碼子最佳化之核酸包含SEQ ID NO：13-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其中以5'至3'順序，該編碼GAL蛋白質之轉基因包含：
    (i)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列， 其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；或
    (ii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其中以5'至3'順序，該編碼GAL蛋白質之轉基因包含：
    (i)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (ii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (iii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (iv)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (v)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；或
    (viii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  18. 如請求項1至17中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其中以5'至3'順序，該編碼GAL蛋白質之轉基因編碼：
    (i)信號序列，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列；或
    (ii)信號序列，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列。
  19. 如請求項1至18中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其進一步包含啟動子，該啟動子可操作地連接至該包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸。
  20. 如請求項19所述之經分離之rAAV顆粒，其中該啟動子包含組織特異性啟動子或泛素啟動子。
  21. 如請求項19或20所述之經分離之rAAV顆粒，其中該啟動子包含：
    (i)A1AT啟動子、EF-1a啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子及/或其衍生物CAG、CMV立即早期強化子及/或啟動子、β葡糖苷酸酶(GUSB)啟動子、泛素C(UBC)啟動子、神經元特異性烯醇酶(NSE)、血小板衍生之生長因子(PDGF)啟動子、血小板衍生之生長因子B鏈(PDGF-β)啟動子、細胞間黏著分子2(ICAM-2)啟動子、突觸蛋白(Syn)啟動子、甲基-CpG結合蛋白質2(MeCP2)啟動子、Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白質激酶II(CaMKII)啟動子、代謝型麩胺酸受體2(mGluR2)啟動子、神經纖毛輕鏈(NFL)或神經纖毛重鏈(NFH)啟動子、β-血球蛋白袖珍基因nβ2啟動子、前腦啡肽原(PPE)啟動子、腦啡肽(Enk)及興奮性胺基酸轉運體2(EAAT2)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子、髓磷脂鹼性蛋白(MBP)啟動子、心血管啟動子、肝臟啟動子、骨骼肌啟動子或其片段，例如截短形式，或功能性變異體；及/或
    (ii)SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  22. 如請求項1至21中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其進一步包含反向末端重複(ITR)序列。
  23. 如請求項22所述之經分離之rAAV顆粒，其中該ITR序列相對於該包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸位於5'。
  24. 如請求項22所述之經分離之rAAV顆粒，其中該ITR序列相對於該包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸位於3'。
  25. 如請求項22所述之經分離之rAAV顆粒，其包含相對於該包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸位於5'之ITR序列及相對於該包含編碼GAL蛋白質之轉基因之核酸位於3'之ITR序列。
  26. 如請求項22至25中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其中該ITR序列包含SEQ ID NO：17及/或18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  27. 如請求項1至26中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其進一步包含強化子。
  28. 如請求項27所述之經分離之rAAV顆粒，其中該強化子包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  29. 如請求項1至18中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其進一步包含內含子區域。
  30. 如請求項29所述之經分離之rAAV顆粒，其中該內含子區域包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  31. 如請求項1至30中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其進一步包含Kozak序列。
  32. 如請求項31所述之經分離之rAAV顆粒，其中該Kozak序列包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  33. 如請求項1至32中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其進一步包含多腺苷酸化(polyA)信號區域。
  34. 如請求項33所述之經分離之rAAV顆粒，其中該polyA信號區域包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  35. 如請求項33所述之經分離之rAAV顆粒，其中該polyA信號區域包含SEQ ID NO：24之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  36. 如請求項1至35中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，其進一步包含土拔鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element；WPRE)序列。
  37. 如請求項36所述之經分離之rAAV顆粒，其中該WPRE序列包含SEQ ID NO：25之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  38. 如請求項36所述之經分離之rAAV顆粒，其中該WPRE序列包含SEQ ID NO：26之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  39. 如請求項1至38中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含5' ITR序列、強化子、啟動子序列、Kozak序列、編碼信號序列之核苷酸序列、編碼GAL蛋白質之核苷酸序列、polyA信號區域及3' ITR序列。
  40. 如請求項1至39中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含5' ITR序列、強化子、啟動子序列、Kozak序列、編碼信號序列之核苷酸序列、編碼GAL蛋白質之核苷酸序列、WPRE序列、polyA信號區域及3' ITR序列。
  41. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  42. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  43. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  44. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  45. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)ApoE/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  46. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  47. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  48. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (ix)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  49. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)ApoE/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO：25之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：23之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (x)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  50. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO：25之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：24之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (x)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  51. 如請求項1至40中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，以5'至3'順序，其包含：
    (i)5' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：17之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ii)Apo E/C-I強化子，其包含SEQ ID NO：19之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iii)A1AT啟動子，其包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (iv)內含子，其包含SEQ ID NO：21之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (v)Kozak序列，其包含SEQ ID NO：22之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (viii)WPRE序列，其包含SEQ ID NO：26之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；
    (ix)多腺苷酸化序列，其包含SEQ ID NO：24之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列；及
    (x)3' ITR序列區域，其包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列或與其至少95%一致之核苷酸序列。
  52. 一種組合物，其包含第一核酸及第二核酸，該第一核酸編碼AAV衣殼蛋白質，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列，且該第二核酸包含編碼α-葡萄糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因。
  53. 如請求項52所述之組合物，其中該編碼衣殼蛋白質之第一核酸包含SEQ ID NO：46之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  54. 如請求項52或53所述之組合物，其中該經編碼之GAL蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列。
  55. 如請求項52至54中任一項所述之組合物，其中該編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  56. 如請求項52至54中任一項所述之組合物，其中該編碼GAL蛋白質之轉基因係經密碼子最佳化的。
  57. 如請求項56所述之組合物，其中該編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：3-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  58. 如請求項52至57中任一項所述之組合物，其中該編碼GAL蛋白質之轉基因進一步編碼信號序列。
  59. 如請求項58所述之組合物，其中該經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列。
  60. 如請求項58或59所述之組合物，其中該經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
  61. 如請求項58或59所述之組合物，其中該經編碼之信號序列係由經密碼子最佳化之核酸編碼。
  62. 如請求項61所述之組合物，其中該經密碼子最佳化之核酸包含SEQ ID NO：8-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列。
  63. 如請求項58所述之組合物，其中該經編碼之信號序列包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列或與其至少70%一致之胺基酸序列。
  64. 如請求項58或63所述之組合物，其中該經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
  65. 如請求項58或63所述之組合物，其中該經編碼之信號序列係由經密碼子最佳化之核酸編碼。
  66. 如請求項65所述之組合物，其中該經密碼子最佳化之核酸包含SEQ ID NO：13-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列。
  67. 如請求項52至66中任一項所述之組合物，其中以5'至3'順序，該編碼GAL蛋白質之轉基因包含：
    (i)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；或
    (ii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  68. 如請求項52至67中任一項所述之組合物，其中以5'至3'順序，該編碼GAL蛋白質之轉基因包含：
    (i)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：7之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (ii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：8之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (iii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (iv)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (v)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：12之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列；
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；
    (vii)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：13之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列；或
    (vi)編碼信號序列之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：14之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列；及編碼GAL蛋白質之核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  69. 如請求項52至68中任一項所述之組合物，其中以5'至3'順序，該編碼GAL蛋白質之轉基因編碼：
    (i)信號序列，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、與其至少70%一致之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列；或
    (ii)信號序列，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列、與其至少70%一致之胺基酸序列；及GAL蛋白質，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列。
  70. 一種經分離之核酸，其包含編碼α-葡萄糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因，其中該編碼GAL蛋白質之轉基因包含SEQ ID NO：3-5中之任一者之核苷酸序列或與其至少85%一致之核苷酸序列。
  71. 如請求項70所述之核酸，其中該轉基因進一步編碼信號序列。
  72. 如請求項71所述之核酸，其中該經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：8-10中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
  73. 如請求項71所述之核酸，其中該經編碼之信號序列係由包含SEQ ID NO：12-14中之任一者之核苷酸序列或與其至少70%一致之核苷酸序列之核酸編碼。
  74. 一種組合物，其包含如請求項70至73中任一項所述之核酸。
  75. 一種細胞，其包含如請求項1至51中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，或如請求項52至69及74中任一項所述之組合物，或如請求項70至73中任一項所述之核酸。
  76. 如請求項75所述之細胞，其中該細胞係哺乳動物細胞、昆蟲細胞或細菌細胞。
  77. 一種用於製備經分離之重組腺相關病毒(rAAV)顆粒之方法，該方法包含
    (i)提供包含核酸之宿主細胞，該核酸包含編碼α-葡萄糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因；及
    (ii)在適合於將該轉基因封裝於AAV衣殼蛋白質中之條件下培育該宿主細胞，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列；藉此製備該經分離之rAAV顆粒。
  78. 一種用於製備經分離之重組腺相關病毒(rAAV)顆粒之方法，該方法包含
    (i)提供包含第一核酸之宿主細胞，該第一核酸包含編碼α-葡萄糖苷酶(GAL)蛋白質之轉基因；
    (ii)將編碼AAV衣殼蛋白質之第二核酸引入該宿主細胞中，其中該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列或與其至少85%一致之胺基酸序列；及
    (iii)在適合於將該轉基因封裝於該AAV衣殼蛋白質中之條件下培育該宿主細胞；藉此製備該經分離之rAAV顆粒。
  79. 如請求項76或77所述之方法，其中該宿主細胞包含哺乳動物細胞、昆蟲細胞或細菌細胞。
  80. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至51中任一項所述之rAAV顆粒及醫藥學上可接受之賦形劑。
  81. 一種用於向個體遞送外源性GAL蛋白質之方法，其包含投與有效量之如請求項79所述之醫藥組合物或如請求項1至51中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，藉此向該個體遞送該外源性GAL。
  82. 如請求項81所述之方法，其中該個體患有、已診斷患有GAL相關疾病或具有罹患GAL相關疾病之風險。
  83. 如實施例81或82所述之方法，其中該GAL相關疾病係溶酶體貯積病。
  84. 一種用於治療患有或經診斷患有GAL相關疾病之個體之方法，其包含投與有效量之如請求項80所述之醫藥組合物或如請求項1至51中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，藉此治療該個體中之GAL相關疾病。
  85. 一種用於治療患有或經診斷患有溶酶體貯積病之個體之方法，其包含投與有效量之如請求項80所述之醫藥組合物或如請求項1至51中任一項所述之經分離之rAAV顆粒，藉此治療該個體中之溶酶體貯積病。
  86. 如請求項82至85中任一項所述之方法，其中該GAL相關疾病或該溶酶體貯積病係法布立症(Fabry disease)。
  87. 一種經分離之重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其包含AAV病毒基因體及衣殼蛋白質，其中該AAV病毒基因體包含SEQ ID NO：31-41及51-61中之任一者之核酸序列或由其組成，且該衣殼蛋白質包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列。
  88. 一種經分離之重組病毒基因體，其包含SEQ ID NO：31-41及51-61中之任一者之核酸序列或由其組成。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT202300004443A1 (it) * 2023-03-09 2024-09-09 Int Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Icgeb Sequenza codificante per alfa galattosidasi a umana per il trattamento della malattia di fabry
US20240360431A1 (en) * 2023-04-30 2024-10-31 Sichuan Real&Best Biotech Co., Ltd. Engineered alpha-galactosidase a (a-gal a) peptides and functional variants thereof and associated methods of treating fabry disease

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6083725A (en) * 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
CN102212558B (zh) * 2003-09-30 2016-08-03 宾夕法尼亚大学托管会 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用
EP3293259A1 (en) * 2016-09-12 2018-03-14 Genethon Acid-alpha glucosidase variants and uses thereof
CN112334489A (zh) * 2018-05-16 2021-02-05 星火治疗有限公司 密码子优化的酸性α-葡萄糖苷酶表达盒及其使用方法
JP7428664B2 (ja) * 2018-06-12 2024-02-06 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル 合成肝臓指向性アデノ随伴ウイルスカプシドおよびその使用
WO2020117898A1 (en) * 2018-12-05 2020-06-11 Abeona Therapeutics Inc. Recombinant adeno-associated viral vector for gene delivery
CN113423419A (zh) * 2019-01-04 2021-09-21 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗法布里病的方法和组合物
WO2021102107A1 (en) * 2019-11-19 2021-05-27 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus comprising liver-specific promoters for treating pompe disease and lysosomal disorders
CA3169063A1 (en) * 2020-02-25 2021-09-02 Leszek Lisowski Adeno-associated virus capsid polypeptides and vectors

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