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TW202305118A - 腫瘤浸潤淋巴球之ｃｉｓｈ基因編輯及其在免疫療法中之用途 - Google Patents

腫瘤浸潤淋巴球之ｃｉｓｈ基因編輯及其在免疫療法中之用途 Download PDF

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TW202305118A
TW202305118A TW111110643A TW111110643A TW202305118A TW 202305118 A TW202305118 A TW 202305118A TW 111110643 A TW111110643 A TW 111110643A TW 111110643 A TW111110643 A TW 111110643A TW 202305118 A TW202305118 A TW 202305118A
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TW111110643A
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克里 理堤皮海
亞歷山卓 茱勒拉特
艾力克斯 博因
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美商艾歐凡斯生物治療公司
法商賽勒克提斯公司
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Abstract

本發明提供用於製備TIL以便製備具有如本文所描述之降低的CISH及視情況選用之PD-1表現的治療性經基因修飾之TIL群體的經改良及/或縮短的製程及方法。

Description

腫瘤浸潤淋巴球之ＣＩＳＨ基因編輯及其在免疫療法中之用途
本申請案主張2021年3月23日申請之美國臨時專利申請案第63/165,066號的優先權，該申請案出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。 本發明提供用於製備TIL以便製備具有如本文所描述之降低的CISH及視情況選用之PD-1表現的治療性經基因修飾之TIL群體的經改良及/或縮短的製程及方法。
含細胞介素誘導型SH2之蛋白質為人體內由CISH基因編碼之蛋白質。參見Uchida等人(1997)《細胞遺傳學及基因體研究( Cytogenet Genome Res.)》, 78:209-212。已在具有定序基因體之大多數哺乳動物中鑑別出CISH異種同源物。CISH控制T細胞受體(TCR)傳訊，且具有某些SNP的CISH之變異係與菌血症、結核病及瘧疾之易感性相關。參見Khor等人(2010)《新英格蘭醫學雜誌( N Engl J Med)》, 362 (22): 2092-101。由此基因編碼之蛋白質含有SH2域及SOCS盒域。蛋白質因此屬於細胞介素誘導之STAT抑制劑(CIS)，亦稱為細胞介素傳訊抑制因子(SOCS)或STAT誘導之STAT抑制劑(SSI)，蛋白質家族。已知CIS家族成員為細胞介素傳訊之細胞介素誘導型負調節子。
CISH表現可由適當細胞類型中之介白素-2(IL-2)、IL-3及顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)誘導。免疫沈澱分析顯示CISH蛋白穩定結合於IL-3R β鏈及EPOR(促紅細胞生成素受體)，但僅在配位體結合之後，表明需要受體之酪胺酸磷酸化。CISH蛋白之過表現抑制細胞生長，從而指示CISH對訊號轉導具有負面影響。隨後，顯示CISH表現視STAT5活化而定，且在CISH啟動子區中發現若干STAT5結合位點。參見Matsumoto等人(1997)《血液( Blood)》89(9):3148-54。此外，CISH抑制STAT5之EPO依賴性活化且抑制其他STAT5依賴性受體之活性，從而指示CISH為STAT5之反饋調節子。
廣泛多種STAT5依賴性受體誘導CISH表現，包含(但不限於)生長激素(GH)、促乳素(PRL)、血小板生成素(TPO)、瘦素、IL-2、IL-5及IL-9。參見Bhattacharya等人(2001)《美國呼吸系統細胞及分子生物學雜誌( Am J Respir Cell Mol Biol)》, 24(3):312-6。已顯示CISH結合且抑制來自GH受體(GHR)、PRL受體及IL-2受體β-鏈之傳訊且促進GHR之內化及去活化。參見Ram等人(1999)《生物化學( Biol Chem)》, 274(50):35553-61：Endo等人(2003)《生物化學雜誌( J Biochem)》133(1):109-13；Aman等人(1999)《生物化學雜誌( J Biol Chem) 》274(42):30266-72；Landsman等人(2005)《生物化學雜誌》280(45): 37471-80。在許多組織(肝臟、腎臟、心臟、胃、肺、卵巢及骨胳肌)中發現CISH mRNA之表現。參見Palmer等人(2009) 30(12):592-602；Anderson等人(2009) 138(3):537-44；Clasen等人(2013)《脂質研究雜誌(JLipidRes)》54(7):1988-97。儘管其明顯參與大量重要細胞介素及生長因子之傳訊設備，CISH基因剔除小鼠具有最少的缺陷(免疫反應中之細微變化除外)。參見Palmer等人(2009)《免疫學趨勢( Trends Immunol)》30(12):592-602；Trengove等人(2013)《臨床及實驗免疫學雜誌( Am J Clin Exp Immunol)》2(1): 1-29。此可歸因於其他SOCS家族蛋白質之補償性活性。在組成性表現由β-肌動蛋白啟動子驅動之CISH的轉基因小鼠中觀測到CISH對假定目標基因之生物學的影響。彼等小鼠體重減輕、乳腺發育缺陷以及γ/δ T細胞、自然殺手(NK)細胞及NKT細胞數目減少，類似於StatSa及/或StatSb缺陷型小鼠之表型。參見Matsumoto等人(1999)《分子細胞生物學( Mol Cell Biol)》19(9):6396-407。
CISH潛在地影響藉由許多細胞介素及生長因子進行之傳訊，且已發現CISH活性及變體與傳染病及癌症相關。若干研究已顯示在攜帶某些CISH多態性之個體中對各種傳染劑之易感性增加，包含瘧疾、鉤端螺旋體病、B型肝炎病毒及結核病。參見Khor等人(2010)《新英格蘭醫學雜誌》, 362(22):2092-101；Esteves等人(2014)《科學公共圖書館綜合卷( PLoS One)》, 9(9):e108534；Hu等人(2014)《科學公共圖書館綜合卷》, 9(6):e100826；Tong等人(2012)《免疫遺傳學( Immunogenetics)》, 64(4): 261-5；Ji等人(2014)《感染遺傳學及進化( Infect Genet Evol)》, 28:240-4；Sun等人(2014)《科學公共圖書館( PLoS)》, 9(3):e92020。與替代對偶基因相比，所有研究共有的一個風險對偶基因(rs414171，-292自轉錄開始)在周邊血液單核細胞中顯示出較低的CISH表現量。參見Khor及Sun，見上文。與正常組織相比，CISH之表現量在乳房癌瘤及癌細胞株中升高，從而使得推測CISH可能藉由其活化胞外訊號調節之激酶(ERK)的能力促進腫瘤發生。Raccurt等人(2003)《英國癌症雜誌( Br. J. Cancer)》, 89(3):524-32。CISH變體亦與乳牛的乳汁產生性狀相關。參見Arun等人(2015)《遺傳學前沿( Front Genet)》, 6:342。
包含TALEN之經工程改造之核酸酶經設計以特異性結合於目標DNA位點，其具有調節內源基因之基因表現的能力且可適用於基因體工程改造、基因療法以及諸如癌症及炎症的病症之治療。參見例如美國專利第9,877,988號；第9,394,545號；第9,150,847號；第9,206,404號；第9,045,763號；第9,005,973號；第8,956,828號；第8,936,936號；第8,945,868號；第8,871,905號；第8,586,526號；第8,563,314號；第8,329,986號；第8,399,218號；第6,534,261號；第6,599,692號；第6,503,717號；第6,689,558號；第7,067,317號；第7,262,054號；第7,888,121號；第7,972,854號；第7,914,796號；第7,951,925號；第8,110,379號；第8,409,861號；美國專利公開案第2003/0232410號；第2005/0208489號；第2005/0026157號；第2005/0064474號；第2006/0063231號；第2008/0159996號；第2010/0218264號；第2012/0017290號；第2011/0265198號；第2013/0137104號；第2013/0122591號；第2013/0177983號；第2013/0177960號；及第2015/0056705號，其之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入。此外，基於阿爾古系統(Argonaute system)(例如，來自嗜熱菌( T. thermophilus)，稱為『TtAgo』，參見Swarts等人(2014)《自然( Nature)》507(7491): 258-261)研發靶向核酸酶，該阿爾古系統亦可具有用於基因體編輯及基因療法中之潛能。
TALE介導之基因療法可用於對細胞進行基因工程改造以具有一或多個非活化基因及/或以使該細胞表現先前在該細胞中未產生之產物(例如，經由轉基因插入及/或經由校正內源序列)。使用此等核酸酶之臨床試驗已顯示此等分子能夠治療各種病狀，包含癌症、HIV及/或血液病症(諸如血紅素病及/或血友病)。參見例如Yu等人(2006)《美國實驗生物學學會聯合會雜誌( FASEB J.)》20:479-481；Tebas等人(2014)《新英格蘭醫學雜誌》370(10):901。因此，此等方法可用於治療疾病。然而，仍需要用於CISH TALEN介導之基因滅活/缺失的額外方法及組合物以用於治療及/或預防癌症、發炎性病症及其中需要CISH調節之其他疾病。
使用過繼性轉移腫瘤浸潤淋巴球(TIL)治療大型(bulky)、難治性癌症表示對於不良預後患者的一種強大的治療方案。Gattinoni等人，《自然免疫學評論( Nat. Rev. Immunol.)》2006, 6,383-393。迫切需要提供適合於商業規模製造且經法規批准用於多個臨床中心之人類患者的基於此類製程的經基因修飾之TIL之製造製程及療法。特定言之，此項技術中仍需要與基於TIL之療法組合的用於CISH及/或PD-1基因滅活/缺失之額外方法及組合物以用於治療及/或預防癌症、發炎性病症及其中需要CISH及/或PD-1調節之其他疾病且本發明滿足該需求。
本發明提供一種製備包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)的方法，該方法包括： (a)將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入TIL中，其中一或多種第一TALE核酸酶包括針對SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況引入一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶；及 (b)擴增TIL。
在一些實施例中，該方法包括將編碼一或多種第一TALE核酸酶之核酸引入TIL中包括電穿孔步驟。
在一些實施例中，編碼一或多種第一TALE核酸酶之核酸為RNA且RNA係藉由電穿孔引入TIL中。
在一些實施例中，該方法進一步包括在引入步驟之前，藉由在存在OKT-3之情況下將TIL在細胞培養基中培養約1至3天來活化TIL的步驟。
在一些實施例中，該方法進一步包括在引入步驟之後且在擴增步驟之前，使TIL在包括IL-2之細胞培養基中靜置約1天的步驟。
在一些實施例中，該方法進一步包括在引入步驟之前，冷凍保存TIL，隨後將TIL解凍且在包括IL-2之細胞培養基中培養約1至3天的步驟。
在一些實施例中，靜置步驟中IL-2之濃度為約3000 IU/ml。
在一些實施例中，一或多種第一TALE核酸酶各自由第一半TALE核酸酶及第二半TALE核酸酶構成。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶為由與第一核酸酶催化域融合之第一TALE核酸結合域構成的第一融合蛋白，且第二半TALE核酸酶為由與第二核酸酶催化域融合之第二TALE核酸結合域構成的第二融合蛋白。
在一些實施例中，第一TALE核酸結合域具有第一胺基酸序列且第二TALE核酸結合域具有第二胺基酸序列，且其中第一胺基酸序列不同於第二胺基酸序列。
在一些實施例中，第一核酸酶催化域具有第一胺基酸序列且第二核酸酶催化域具有第二胺基酸序列，且其中第一胺基酸序列與第二胺基酸序列相同。
在一些實施例中，第一核酸酶催化域及第二核酸酶催化域均具有Fok-I之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶及第二半TALE核酸酶能夠形成異二聚體DNA裂解複合物以實現編碼CISH之基因中的目標位點處之DNA裂解，且其中編碼CISH之基因中的目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶識別位於編碼CISH之基因中的目標位點中之第一位置處的第一半目標，且第二半TALE核酸酶識別位於不與第一位置重疊的編碼CISH之基因中的目標位點中之第二位置處的第二半目標。
在一些實施例中，TALE核酸酶包括與選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，TALE核酸酶包括選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 165具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且第二半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 167具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 165之胺基酸序列且第二半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 167之胺基酸序列。
在一些實施例中，經擴增TIL包括足夠的TIL以供向有需要之個體投與治療有效劑量之TIL。
在一些實施例中，治療有效劑量之經擴增TIL包括約1×10 9至約9×10 10個TIL。
本發明亦提供一種經擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現，該經擴增TIL群體可藉由如技術方案1至20中任一項之方法獲得。
本發明亦提供一種識別且實現編碼CISH之基因中的目標位點處之DNA裂解的類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)，其中TALE核酸酶包括與選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，TALE核酸酶包括選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之序列。
在一些實施例中，TALE核酸酶由第一半TALE核酸酶及第二半TALE核酸酶構成，且其中第一半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 165具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且第二半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 167具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 165之胺基酸序列且第二半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 167之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶為由與第一核酸酶催化域融合之第一TALE核酸結合域構成的第一融合蛋白，且第二半TALE核酸酶為由與第二核酸酶催化域融合之第二TALE核酸結合域構成的第二融合蛋白。
在一些實施例中，第一TALE核酸結合域具有第一胺基酸序列且第二TALE核酸結合域具有第二胺基酸序列，且其中第一胺基酸序列不同於第二胺基酸序列。
在一些實施例中，第一核酸酶催化域具有第一胺基酸序列且第二核酸酶催化域具有第二胺基酸序列，且其中第一胺基酸序列與第二胺基酸序列相同。
在一些實施例中，第一核酸酶催化域及第二核酸酶催化域均具有Fok-I之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶及第二半TALE核酸酶能夠形成異二聚體DNA裂解複合物以實現編碼CISH之基因中的目標位點處之DNA裂解，且其中目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶識別位於編碼CISH之基因中的目標位點中之第一位置處的第一半目標，且第二半TALE核酸酶識別位於不與第一位置重疊的編碼CISH之基因中的目標位點中之第二位置處的第二半目標。
本發明提供一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增至包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之治療性TIL群體中的方法，該方法包括： (a)  藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段來獲得及/或接受來源於自個體切除之腫瘤的第一TIL群體； (b)  將第一TIL群體添加至密閉系統中； (c)  藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中第一次擴增進行約3至14天以獲得第二TIL群體，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (d)  將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸引入TIL中，其中一或多種第一TALE核酸酶包括針對編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，其中目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列，且視情況將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶之核酸引入TIL中； (e)  藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養自步驟(d)獲得的TIL來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中第二次擴增進行約7至14天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行；及 (f)   收穫自步驟(e)獲得之治療性TIL群體，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (g)  將收穫的TIL群體自步驟(f)轉移至輸注袋，其中自步驟(f)至(g)之轉移係在不開放系統之情況下發生。
本發明提供一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增至包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之治療性TIL群體中的方法，該方法包括： (a)  藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段來獲得來源於自個體切除之腫瘤的第一TIL群體； (b)  將腫瘤片段添加至密閉系統中； (c)  藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中第一次擴增進行約3至11天以獲得第二TIL群體，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (d)  將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸引入TIL中，其中一或多種第一TALE核酸酶包括針對編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，其中目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列，且視情況將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶之核酸引入TIL中； (e)  藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養自步驟(d)獲得的TIL來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中第二次擴增進行約7至11天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (f)   收穫自步驟(e)獲得之治療性TIL群體，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不開放系統之情況下發生；及 (g)  將收穫的治療性TIL群體自步驟(f)轉移至輸注袋，其中自步驟(f)至(g)之轉移係在不開放系統之情況下發生。
本發明提供一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增至包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之治療性TIL群體中的方法，該方法包括： (a)  由手術切除、穿刺生檢、芯針生檢、小型生檢或其他用於獲得含有來自個體之黑色素瘤的腫瘤及TIL細胞之混合物之樣本的手段獲得及/或接受第一TIL群體， (b)  將第一TIL群體添加至密閉系統中； (c)  藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中第一次擴增進行約3至14天以獲得第二TIL群體，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (d)  將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸引入TIL中，其中一或多種第一TALE核酸酶包括針對編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，其中目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列，且視情況引入一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶； (e)  藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養自步驟(d)獲得的TIL來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中第二次擴增進行約7至14天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (f)   收穫自步驟(e)獲得之治療性TIL群體，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不開放系統之情況下發生；及 (g)  將收穫的治療性TIL群體自步驟(f)轉移至輸注袋，其中自步驟(f)至(g)之轉移係在不開放系統之情況下發生。
本發明提供一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增至包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之治療性TIL群體中的方法，該方法包括： (a)  自個體切除腫瘤，該腫瘤包括第一TIL群體，視情況由手術切除、穿刺生檢、芯針生檢、小型生檢或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物之樣本的手段進行； (b)  將腫瘤片段添加至密閉系統中； (c)  藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中第一次擴增進行約3至11天以獲得第二TIL群體，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (d)  將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸引入TIL中，其中一或多種第一TALE核酸酶包括針對編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，其中目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列，且視情況引入一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶； (e)  藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養自步驟(d)獲得的TIL來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中第二次擴增進行約7至11天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (f)   收穫自步驟(e)獲得之第三TIL群體，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不開放系統之情況下發生；及 (g)  將收穫的第三TIL群體自步驟(f)轉移至輸注袋，其中自步驟(f)至(g)之轉移係在不開放系統之情況下發生。
本發明提供一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增至包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之治療性TIL群體中的方法，該方法包括： (a)  藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段來獲得來源於自個體切除之腫瘤的第一TIL群體； (b)  將腫瘤片段添加至密閉系統中； (c)  藉由在包括IL-2及視情況選用之OKT-3之細胞培養基中培養第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中第一次擴增進行約3至14天以獲得第二TIL群體，其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (d)將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸引入TIL中，其中一或多種第一TALE核酸酶包括針對編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，其中目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列，且視情況引入一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶； (d)  藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養自步驟(d)獲得的TIL來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中第二次擴增進行約4至6天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (e)  將第三TIL群體分成第一複數個2至5個TIL亞群，其中至少1.0×10 9個TIL存在於各亞群中，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (f)   藉由用額外的IL-2、視情況選用之OKT-3補充各TIL亞群之細胞培養基來進行第一複數個TIL亞群之第三次擴增，以產生第二複數個TIL亞群，其中第三次擴增進行約5至7天，其中各亞群之第三次擴增係在提供第三透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不開放系統之情況下發生；及 (g)  收穫自步驟(f)獲得之第二複數個TIL亞群；及 (h)  將收穫的TIL亞群自步驟(g)轉移至一或多個輸注袋，其中自步驟(g)至(h)之轉變。
在一些實施例中，該方法進一步包括使用冷凍保存製程冷凍保存收穫的TIL的步驟。
在一些實施例中，編碼一或多種第一TALE核酸酶之核酸為RNA。
在方法之一些實施例中，引入編碼一或多種第一TALE核酸酶之核酸係藉由電穿孔引入TIL中。
在一些實施例中，該方法進一步包括在引入步驟之前，藉由在存在OKT-3之情況下將TIL在細胞培養基中培養約1至3天來活化TIL的步驟。
在一些實施例中，OKT-3之濃度為約300 ng/ml。
在一些實施例中，該方法進一步包括在引入步驟之後且在第二次擴增步驟之前，使TIL在包括IL-2之細胞培養基中靜置約1天的步驟。
在一些實施例中，靜置步驟之濃度為約3000 IU/ml。
在一些實施例中，該方法進一步包括冷凍保存TIL，隨後將TIL解凍且在包括IL-2之細胞培養基中培養約1至3天。
在一些實施例中，步驟(a)至(g)在約13天至約29天，視情況約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天或約25天內進行。
在一些實施例中，編碼一或多種第一TALE核酸酶之核酸為RNA，且RNA係藉由電穿孔引入TIL中。
在一些實施例中，一或多種第一TALE核酸酶各自由第一半TALE核酸酶及第二半TALE核酸酶構成。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶為由與第一核酸酶催化域融合之第一TALE核酸結合域構成的第一融合蛋白，且第二半TALE核酸酶為由與第二核酸酶催化域融合之第二TALE核酸結合域構成的第二融合蛋白。
在一些實施例中，第一TALE核酸結合域具有第一胺基酸序列且第二TALE核酸結合域具有第二胺基酸序列，且其中第一胺基酸序列不同於第二胺基酸序列。
在一些實施例中，第一核酸酶催化域具有第一胺基酸序列且第二核酸酶催化域具有第二胺基酸序列，且其中第一胺基酸序列與第二胺基酸序列相同。
在一些實施例中，第一核酸酶催化域及第二核酸酶催化域均具有Fok-I之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶及第二半TALE核酸酶能夠形成異二聚體DNA裂解複合物以實現目標位點處之DNA裂解。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶識別位於目標位點中之第一位置處的第一半目標，且第二半TALE核酸酶識別位於不與第一位置重疊的目標位點中之第二位置處的第二半目標。
在一些實施例中，TALE核酸酶包括與選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，TALE核酸酶包括選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 165具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且第二半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 167具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，第一半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 165之胺基酸序列且第二半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 167之胺基酸序列。
在一些實施例中，收穫的TIL包括足夠的TIL以供向有需要之個體投與治療有效劑量之TIL。
在一些實施例中，治療有效劑量之TIL包括約1×10 9至約9×10 10個TIL。
在一些實施例中，APC包括周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，PBMC以約1:25 TIL:PBMC之比率補充。
在一些實施例中，治療性TIL群體在向個體投與時提供增加的功效、增加的干擾素-γ(IFN-γ)產生、增加的多株性、增加的平均IP-10及/或增加的平均MCP-1。
在一些實施例中，IL-2在第一次擴增中在細胞培養基中以1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在。
在一些實施例中，第二次擴增步驟，IL-2以1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在且OKT-3抗體以約30 ng/mL之初始濃度存在。
在一些實施例中，在第二次及/或第三次擴增步驟中，IL-2以1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在，且視情況，OKT-3抗體以約30 ng/mL之初始濃度存在。
在一些實施例中，第一次擴增係使用透氣容器進行。
在一些實施例中，第二次擴增係使用透氣容器進行。
在一些實施例中，第二次及/或第三次擴增係使用透氣容器進行。
在一些實施例中，第一細胞培養基進一步包括選自由以下組成之群組的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。
在一些實施例中，第二細胞培養基進一步包括選自由以下組成之群組的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。
在一些實施例中，步驟中(d)及/或(f)中之細胞培養基進一步包括選自由以下組成之群組的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。
在一些實施例中，第二次擴增之細胞培養基進一步包括選自由以下組成之群組的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。
在一些實施例中，步驟(c)中之第一次擴增及/或步驟(e)中之第二次擴增係在11天之時段內單獨地進行。
本發明提供一種包括降低的CISH及/或PD-1表現的經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體或包括其之組合物，該TIL群體或包括其之組合物可藉由如技術方案1至20及32至73中任一項之方法獲得。
本發明提供一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包括向個體投與包括降低的CISH及/或CISH及PD-1表現之經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)的治療性群體，其中治療性經基因修飾之TIL群體可藉由如技術方案1至20及32至73中任一項之方法獲得。
在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群組：黑色素瘤(包含轉移性黑色素瘤)、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。
I. 前言
當前的擴增方案對將輸注至患者中的TIL之健康狀況提供極少瞭解。T細胞在其自初始T細胞至效應T細胞的成熟過程中經歷了深刻的代謝轉變(參見Chang等人，《自然免疫學( Nat.Immunol.)》 2016, 17, 364，特此明確地以全文併入，且尤其對於厭氧及好氧代謝之論述及標記物而言)。舉例而言，初始T細胞依賴於粒線體呼吸產生ATP，而成熟、健康的效應T細胞(諸如TIL)則具有高度糖酵解，依賴於好氧性糖酵解來提供其增殖、遷移、活化及抗腫瘤功效所需的生物能量受質。
先前的論文報導，在轉移之前限制TIL中之糖酵解及促進粒線體代謝為合乎需要的，因為，因為大量依賴於糖酵解之細胞將在過繼轉移時遭受營養剝奪，此引起大部分經轉移細胞死亡。因此，本領域教示促進粒線體代謝可促進活體內壽命且事實上表明在誘導免疫反應之前使用糖酵解之抑制劑。參見Chang等人,《自然免疫學》 2016,17(364)。
在一些實施例中，本發明進一步關於使用基因編輯技術增強TIL之治療效果。雖然腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之過繼轉移提供了一種有前景及有效的療法，但迫切需要可增加患者之反應率及反應穩健性的更有效的TIL療法。如本文所描述，本發明之實施例提供了將TIL擴增至治療性群體中的方法，該治療性群體經基因編輯以提供增強的治療效果。 II. 定義
除非另有定義，否則本文所用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解之含義相同的含義。本文所提及之所有專利及公開案均以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用，術語「共同投與(co-administration /co-administering)」、「與…組合投與(administered in combination with/administering in combination with)」、「同時(simultaneous)」及「併發(concurrent)」涵蓋向個體投與兩種或更多種活性醫藥成分(在本發明之一較佳實施例中，例如複數個TIL)，使得活性醫藥成分及/或其代謝物兩者同時存在於個體中。共同投與包含以單獨的組合物同時投與、以單獨的組合物在不同時間投與或以其中存在兩種或更多種活性醫藥成分之組合物之形式投與。以單獨的組合物同時投與及以其中存在兩種試劑之組合物之形式投與為較佳的。
術語「活體內」係指發生於個體體內之事件。
術語「活體外」係指發生於個體體外之事件。活體外分析涵蓋採用活細胞或死細胞的基於細胞之分析，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞之分析。
術語「離體」係指涉及對已自個體身體移除的細胞、組織及/或器官進行治療或執行程序的事件。適當地，細胞、組織及/或器官可利用手術或治療方法返回至個體體內。
本文中「腫瘤浸潤淋巴球」或「TIL」意謂最初作為已離開個體血流且遷移至腫瘤中的白血球獲得之細胞群體。TIL包含(但不限於)CD8 +細胞毒性T細胞(淋巴球)、Th1及Th17 CD4 +T細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞及M1巨噬細胞。TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標記物)或功能性(根據其浸潤腫瘤及實現治療之能力)定義。TIL通常可藉由表現以下生物標記物中之一或多者分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可藉由其重新引入患者中後浸潤實體腫瘤之能力來進行功能性定義。TIL包含初代TIL及繼代TIL兩者。「初代TIL」為自如本文所概述之患者組織樣本中獲得的彼等(有時稱為「新鮮收穫的」)，且「繼代TIL」為如本文所論述已經擴增或增殖的任何TIL細胞群體，包含但不限於主體TIL及經擴增TIL(「REP TIL」或「REP後TIL」)，且經基因修飾以包括一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)，其中一或多種TALE核酸酶包括針對編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，該目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列且TIL細胞群體可包含此等經基因修飾之TIL。
如本文中所使用，本文中之「細胞群體」(包含TIL)意謂共用共同性狀之若干細胞。一般而言，群體數目一般範圍介於1×10 6至1×10 10個，其中不同的TIL群體包括不同數目。例如，初代TIL在IL-2之存在下的初始生長產生大約1×10 8個細胞之主體TIL群體。一般進行REP擴增以提供1.5×10 9至1.5×10 10個細胞群體用於輸注。群體中至少複數個TIL經一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)基因修飾，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶。
在本文中，「冷凍保存之TIL」意謂初代、主體或經擴增TIL，其包含經一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)基因修飾的經基因修飾之TIL，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列且經處理並儲存於約-150℃至-60℃之範圍中的TALE核酸酶。用於冷凍保存之通用方法亦描述於本文別處，包含在實例中描述。為了清楚起見，「冷凍保存之TIL」可與可用作初代TIL來源之冷凍組織樣本區分。
本文中「解凍之冷凍保存之TIL」意謂先前經冷凍保存且接著處理以恢復至室溫或更高溫度(包含但不限於細胞培養溫度或可向患者投與TIL之溫度)的TIL群體。
術語「冷凍保存培養基(cryopreservation media/cryopreservation medium)」係指可用於冷凍保存細胞之任何培養基。此類培養基可包含包括7%至10% DMSO之培養基。例示性培養基包含CryoStor CS10、HypoThermosol以及其組合。術語「CS10」係指獲自幹細胞科技公司(Stemcell Technologies)或Biolife Solutions之冷凍保存培養基。CS10培養基可以商品名「CryoStor® CS10」來指代。CS10培養基為包括DMSO之無血清、無動物組分的培養基。
術語「中央記憶T細胞」係指在人類中為CD45R0+且組成性表現CCR7(CCR7 hi)及CD62L(CD62 hi)之T細胞子集。中央記憶T細胞之表面表型亦包含TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包含BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR引發之後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞主要存在於血液的CD4隔室中，且在人類中按比例富集於淋巴結及扁桃體中。
術語「效應記憶T細胞」係指人類或哺乳動物T細胞之子集，如中央記憶T細胞，為CD45R0+，但已經失去對CCR7的組成性表現(CCR7 lo)且對於CD62L表現而言為異質的或低的(CD62L lo)。中央記憶T細胞之表面表型亦包含TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞之轉錄因子包含BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激之後快速分泌高含量發炎性細胞介素，包含干擾素-γ、IL4-及IL-5。效應記憶T細胞主要存在於血液中之CD8隔室中，且在人類中按比例富集於肺、肝臟及腸道中。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量的穿孔素。
如本文所用，術語「碎斷(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「碎斷的(fragmented)」描述將腫瘤破壞之過程，包含機械碎斷方法，諸如壓碎、切片、分割及粉碎腫瘤組織，以及任何其他用於破壞腫瘤組織之物理結構的方法。
術語「周邊血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核之周邊血液細胞，包含淋巴球(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。當用作抗原呈現細胞(PBMC為一種類型之抗原呈現細胞)時，周邊血液單核細胞較佳為經照射之同種異體周邊血液單核細胞。
術語「周邊血液淋巴球」及「PBL」係指自周邊血液擴增的T細胞。在一些實施例中，PBL係與來自供體之全血或血球分離術產物分離。在一些實施例中，PBL係藉由正向或負向選擇T細胞表型(諸如CD3+ CD45+之T細胞表型)而與來自供體之全血或血球分離術產物分離。
術語「抗CD3抗體」係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體的抗體或其變體，例如單株抗體，且包含人類、人源化、嵌合、鼠類或哺乳動物抗體。抗CD3抗體包含OKT-3，亦稱為莫羅單抗。抗CD3抗體亦包含UHCT1純系，亦稱為T3及CD3ε。其他抗CD3抗體包含例如奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizuma)及維西珠單抗(visilizumab)。
術語「OKT-3」(在本文中亦被稱作「OKT3」)係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體的單株抗體或其生物類似物或變體，包含人類、人源化、嵌合或鼠類抗體，且包含市售形式，諸如OKT-3(30 ng/mL，MACS GMP CD3純，美國加利福尼亞州聖地亞哥美天旎生物技術公司(Miltenyi Biotech,Inc , San Diego, CA, USA))及莫羅單抗或其變體、保守胺基酸取代、糖化形式或生物類似物。表1中給出了莫羅單抗之重鏈及輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2)。能夠產生OKT-3之融合瘤寄存於美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)且所指派之ATCC寄存號為CRL 8001。能夠產生OKT-3之融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養物保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures；ECACC)且所指派之目錄號為86022706。
Figure 02_image001
術語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2之T細胞生長因子，且包含所有形式之IL-2，包含人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變體。IL-2係描述於例如Nelson,《免疫學雜誌( J . Immunol.)》 2004, 172,3983-88及Malek,《免疫學年度評論( Annu. Rev. Immunol.)》 2008, 26,453-79中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之重組人類IL-2之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO: 3)。舉例而言，術語IL-2涵蓋人類重組形式之IL-2，諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每單次使用小瓶含22百萬IU)以及由美國新罕布什爾州次茅斯(Portsmouth, NH, USA)的CellGenix, Inc.(CELLGRO GMP)或美國新澤西州東不倫瑞克(East Brunswick, NJ, USA)的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-209-b)供應的重組IL-2形式及來自其他供應商的其他商業等效物。阿地介白素(去丙胺醯基-1，絲胺酸-125人類IL-2)為分子量為大約15 kDa之非糖基化人類重組形式之IL-2。適用於本發明之阿地介白素之胺基酸序列於表2中給出(SEQ ID NO: 4)。術語IL-2亦涵蓋如本文所描述之IL-2之聚乙二醇化形式，包含可購自美國加利福尼亞州南舊金山( South San Francisco, CA, USA)的Nektar Therapeutics之聚乙二醇化IL2前驅藥NKTR-214。適用於本發明之NKTR-214及聚乙二醇化IL-2描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案第WO 2012/065086 A1號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之替代形式的結合IL-2描述於美國專利第4,766,106號、第5,206,344號、第5,089,261號及第4902,502號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。適用於本發明之IL-2調配物描述於美國專利第6,706,289號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
Figure 02_image003
術語「IL-4」(在本文中亦稱「IL4」)係指被稱為介白素4之細胞介素，其由Th2 T細胞及嗜酸性球、嗜鹼性球及肥大細胞產生。IL-4調節初始輔助T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke及Borish，《呼吸研究( Respir. Res.)》 2001, 2,66-70。在由IL-4活化後，Th2 T細胞隨後以正回饋迴路產生額外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增殖及II類MHC表現，且誘導來自B細胞之類別轉換至IgE及IgG 1表現。適用於本發明之重組人類IL-4可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-211)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆(Waltham, MA, USA)的賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific，Inc.)(人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人類IL-4之胺基酸序列提供於表2中(SEQ ID NO: 5)。
術語「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的糖基化的組織衍生之細胞介素，其可獲自基質及上皮細胞以及樹突狀細胞。Fry及Mackall ，《血液》 2002 , 99,3892-904。IL-7可以刺激T細胞之發育。IL-7與IL-7受體(一種由IL-7受體α及共同γ鏈受體組成之異二聚體)結合，其屬於對於T細胞在胸腺內之發育及在周邊內之存活而言重要之一系列訊號。適用於本發明之重組人類IL-7可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-254)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司(人類IL-15重組蛋白，目錄號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人類IL-7之胺基酸序列提供於表2中(SEQ ID NO: 6)。
術語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15之T細胞生長因子，且包含所有形式之IL-2，包含人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變體。IL-15描述於例如Fehniger及Caligiuri,《血液》 2001, 97, 14-32中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-15與IL-2共用β及γ傳訊受體次單位。重組人類IL-15為分子質量為12.8 kDa的含有114個胺基酸(及N端甲硫胺酸)的單一非糖基化多肽鏈。重組人類IL-15可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-230-b)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司(人類IL-15重組蛋白，目錄號34-8159-82)。適用於本發明之重組人類IL-15之胺基酸序列提供於表2中(SEQ ID NO: 7)。
術語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21之多效性細胞介素蛋白，且包含所有形式之IL-21，包含人類及哺乳動物形式、保守胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及其變體。IL-21描述於例如Spolski及Leonard，《自然綜述：藥物發現( Nat. Rev. Drug.Disc.)》 2014, 13,379-95，其揭示內容以引用之方式併入本文中。IL-21主要藉由自然殺手T細胞及經活化之人類CD4 +T細胞產生。重組人類IL-21為分子質量為15.4 kDa之含有132個胺基酸的單一非糖基化多肽鏈。重組人類IL-21可購自多個供應商，包含美國新澤西州東不倫瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目錄號CYT-408-b)及美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司(人類IL-21重組蛋白，目錄號14-8219-80)。適用於本發明之重組人類IL-21之胺基酸序列提供於表2中(SEQ ID NO: 8)。
當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，本發明組合物待投與的精確量可由醫師考慮患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及病狀之個別差異來確定。通常可說明本文所描述之包括腫瘤浸潤淋巴球(例如，繼代TIL或基因修飾之細胞毒性淋巴球)的醫藥組合物可以10 4至10 11個細胞/公斤體重(例如，10 5至10 6、10 5至10 10、10 5至10 11、10 6至10 10、10 6至10 11、10 7至10 11、10 7至10 10、10 8至10 11、10 8至10 10、10 9至10 11或10 9至10 10個細胞/公斤體重)的劑量投與，包含在彼等範圍內之所有整數值。腫瘤浸潤淋巴球(在所有情況下，包含至少複數個藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸(諸如mRNA)引入細胞毒性淋巴球中而經基因修飾的細胞毒性淋巴球，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶)組合物亦可以此等劑量投與多次。腫瘤浸潤淋巴球(在所有情況下，包含至少複數個藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸(諸如mRNA)引入細胞毒性淋巴球中而經基因修飾的細胞毒性淋巴球，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶)可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參見例如Rosenberg等人,《新英格蘭醫學雜誌》, 319: 1676, 1988)。特定患者之最佳劑量及治療方案可容易由所屬醫藥領域的技術人員藉由監測患者之疾病病徵且相應地調整治療來確定。
如本文所用，術語「微環境」可指作為整體之實體或血液腫瘤微環境或可指在微環境內之個別細胞子集。如本文所用，腫瘤微環境係指以下之複雜混合物：「促進贅生性轉化、支援腫瘤生長及侵襲、保護腫瘤不受宿主免疫力影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移茁壯成長之生態棲位(niche)之細胞、可溶因子、傳訊分子、胞外基質及機械訊號」，如Swartz等人，《癌症研究( Cancer Res.)》, 2012, 72, 2473中所描述。儘管腫瘤表現應由T細胞識別之抗原，但由於微環境之免疫抑制，免疫系統清除腫瘤的情況係罕見的。
在一些實施例中，本發明包含用TIL群體(至少複數個TIL，其中群體藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸(諸如mRNA)引入TIL中而經基因修飾，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶)治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本發明之此類TIL之前用非清髓性化學療法預治療。在一些實施例中，可提供TIL群體，其中患者在輸注根據本發明之TIL之前用非清髓性化學療法預治療。在一些實施例中，非清髓性化學療法為環磷醯胺(cyclophosphamide)60毫克/公斤/天持續2天(在輸注此類TIL之前第27天及第26天)及氟達拉濱(fludarabine)25毫克/平方公尺/天持續5天(在輸注此類TIL之前第27至23天)。在一些實施例中，在根據本發明之非清髓性化學療法及TIL輸注之後(第0天)，患者每8小時以720,000 IU/kg靜脈內接受IL-2之靜脈內輸注以達至生理耐受。
術語「有效量」或「治療有效量」係指如本文所描述之化合物或化合物組合之量，其足以實現所預期應用，包含但不限於疾病治療。治療有效量可視預期應用(活體外或活體內)或所治療之個體及疾病病狀(例如，個體之體重、年齡及性別)、疾病病狀之嚴重程度或投與方式而變化。該術語亦適用於將誘導目標細胞中之特定反應(例如，血小板黏附及/或細胞遷移減少)之劑量。特定劑量將視以下而變化：所選特定化合物、所依循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投與、投與時序、其所投與之組織及其中攜帶化合物之物理遞送系統。
術語「治療(treatment/treating/treat)」及其類似術語係指獲得所需的藥理學及/或生理學效應。該效應就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，及/或就部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。如本文所用，「治療」涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病之任何治療，且包含：(a)預防可能易患疾病但尚未診斷出患有該疾病之個體中出現該疾病；(b)抑制疾病，亦即遏制其發展或進展；及(c)緩解疾病，亦即促使疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦意欲涵蓋遞送試劑以便提供藥理學效應，即使在不存在疾病或病狀之情況下亦如此。舉例而言，「治療」涵蓋可在不存在疾病病狀之情況下(例如，在疫苗之情況下)引發免疫反應或賦予免疫性的組合物之遞送。
當參考核酸或蛋白質之部分使用時，術語「異源」指示核酸或蛋白質包括兩個或更多個在自然界中發現彼此之間沒有相同關係的子序列。舉例而言，通常以重組方式產生核酸，其具有兩個或更多個來自無關基因的經佈置以製造新的功能性核酸序列的序列，例如來自一個來源之啟動子及來自另一來源之編碼區或來自不同來源之編碼區。類似地，異源蛋白指示蛋白質包括兩個或更多個在自然界中未發現彼此呈相同關係之子序列(例如，融合蛋白)。
在兩個或更多個核酸或多肽之上下文中，術語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義詞，例如「99%一致」)係指兩個或更多個序列或子序列在進行比較及比對(需要時引入間隔)以達至最大對應性且不將任何保守胺基酸取代視為序列一致性之部分時，該兩個或更多個序列或子序列係相同的或具有相同的特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可使用序列比較軟體或演算法或藉由目視檢查來量測。所屬領域中已知可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之比對的各種演算法及軟體。用以測定序列一致性百分比之適合程式包含例如可購自美國政府的國家生物技術資訊中心(U.S. Government's National Center for Biotechnology Information)BLAST網站之BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP演算法進行。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(美國加利福尼亞州南舊金山的基因泰克(Genentech))或MegAlign(可購自DNASTAR)為額外的可用於比對序列的可供大眾使用的軟體程式。本領域技術人員可藉由特定的比對軟體來測定用於最大比對的適當參數。在某些實施例中，使用比對軟體之預設參數。
如本文所用，術語「變體」涵蓋但不限於包括與參考抗體之胺基酸序列不同之胺基酸序列的抗體或融合蛋白，不同之處在於在參考抗體之胺基酸序列之內或相鄰的某些位置有一或多個取代、缺失及/或添加。與參考抗體之胺基酸序列相比，變體可以在其胺基酸序列中包括一或多個保守取代。保守取代可涉及例如類似帶電或不帶電胺基酸之取代。變體保留與參考抗體之抗原特異性結合的能力。術語變體亦包含聚乙二醇化抗體或蛋白質。TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標記物)或功能性(根據其浸潤腫瘤及實現治療之能力)定義。TIL通常可藉由表現以下生物標記物中之一或多者分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。另外及替代地，TIL可藉由其重新引入患者中後浸潤實體腫瘤之能力來進行功能性定義。TIL可進一步藉由效力表徵，例如，若例如干擾素(IFN)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TIL可視為強效的。
術語「去氧核糖核苷酸」涵蓋天然的及合成的、未經修飾的及經修飾的去氧核糖核苷酸。修飾包含改變糖部分、鹼基部分及/或寡核苷酸中各去氧核糖核苷酸之間的連接。
術語「RNA」定義包括至少一個核糖核苷酸殘基之分子。「核糖核苷酸」定義在b-D-呋喃核糖部分之2'位置具有羥基的核苷酸。術語RNA包含雙股RNA、單股RNA、分離之RNA(諸如部分純化之RNA、基本上純RNA、合成RNA、以重組方式產生之RNA)以及藉由添加、缺失、取代及/或改變一或多種核苷酸而不同於天然存在之RNA的經改變之RNA。本文中所描述之RNA分子中之核苷酸亦可包括非標準核苷酸，諸如非天然存在之核苷酸或化學合成之核苷酸或去氧核苷酸。此等經改變之RNA可稱為類似物或天然存在之RNA之類似物。
術語「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」意欲包含任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑，以及惰性成分。此類醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑用於活性醫藥成分之用途為本領域中所熟知的。除非任何習知醫藥學上可接受之載劑或醫藥學上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，否則涵蓋其在本發明之治療性組合物中之用途。諸如其他藥物之額外活性醫藥成分亦可併入所描述之組合物及方法中。
術語「約」或「大約」意指在值之統計學上有意義的範圍內。此範圍可在既定值或範圍之一數量級內，較佳地50%內，更佳地20%內，再更佳地10%內，且甚至更佳地5%內。由術語「約」或「大約」涵蓋之允許差異視研究中之特定系統而定，且可由所屬領域中具有通常知識者容易地理解。此外，如本文所用，術語「約」及「大約」意指尺寸、大小、調配物、參數、形狀及其他數量(quantity)及特徵並不精確且不需要精確，而是可以視需要為近似值及/或較大或較小的，反映出公差、轉換因子、四捨五入、量測誤差等，以及本領域的技術人員已知的其他因素。一般而言，無論是否如此明確說明，尺寸、大小、調配物、參數、形狀或其他數量或特徵皆為「約」或「大約」的。應注意，大小、形狀及尺寸非常不同之實施例可採用所描述之佈置。
當以原始及修改形式用於所附申請專利範圍中時，過渡術語「包括(comprising)」、「基本上由…組成(consisting essentially of)」及「由…組成(consisting of)」相對於哪些未敍述之額外技術方案要素或步驟(若存在)被排除在申請專利範圍之範疇之外來定義申請專利範圍範疇。術語「包括」意欲為包括性的或開放性的，且不排除任何額外的、未敍述之要素、方法、步驟或材料。術語「由…組成」不包括除申請專利範圍中指定之要素、步驟或材料以外的任何要素、步驟或材料，且在後一情況中排除與指定材料一般相關之雜質。術語「基本上由…組成」將申請專利範圍之範疇限於所指定要素、步驟或材料及實質上不影響所主張發明之基礎及新穎特徵的要素、步驟或材料。在替代實施例中，本文所描述之體現本發明之所有組合物、方法及套組可由任何過渡術語「包括」、「基本上由…組成」及「由…組成」更具體地定義。
術語「抗體(antibody)」及其複數形式「抗體(antibodies)」係指完整的免疫球蛋白及任何抗原結合片段(「抗原結合部分」)或其單鏈。「抗體」進一步係指包括藉由二硫鍵連接之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈之糖蛋白，或其抗原結合部分。各重鏈由重鏈可變區(在本文中縮寫為V H)及重鏈恆定區構成。重鏈恆定區由三個域構成：CH1、CH2及CH3。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為V L)及輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個域構成：C L。抗體之V H及V L區可進一步細分成高變區，其稱為互補決定區(CDR)或高變區(HVR)，且其可穿插有更保守的區，稱為構架區(FR)。各V H及V L由自胺基端至羧基端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與一或多個抗原抗原決定基相互作用之結合域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白結合於宿主組織或因子，包含免疫系統之多種細胞(例如，效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。
術語「抗原」係指誘導免疫反應之物質。在一些實施例中，若藉由主要組織相容複合體(MHC)分子呈現，則抗原為能夠與抗體或TCR結合之分子。如本文所使用，術語「抗原」亦涵蓋T細胞抗原決定基。抗原另外能夠由免疫系統識別。在一些實施例中，抗原能夠誘導使得B淋巴球及/或T淋巴球活化的體液免疫反應或細胞免疫反應。在一些情況下，此可能需要抗原含有或連接至Th細胞抗原決定基。抗原亦可具有一或多個抗原決定基(例如，B抗原決定基及T抗原決定基)。在一些實施例中，抗原較佳將通常以高度特異性且選擇性方式與其對應抗體或TCR反應，且不與可由其他抗原誘導之多種其他抗體或TCR反應。
術語「單株抗體」、「mAb」、「單株抗體組合物」或其複數形式係指單分子組合物之抗體分子之製劑。單株抗體組合物顯示針對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。對某些受體具有特異性之單株抗體可使用以下技術中之知識及技術製得，即向測試個體注射適合抗原，且接著分離表現具有所需序列或功能特徵之抗體的融合瘤。編碼單株抗體之DNA易於使用習知程序分離且定序(例如，藉由使用能夠特異性結合於編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)。融合瘤細胞充當此類DNA之較佳來源。DNA一經分離，則可置放於表現載體中，接著轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中達成單株抗體之合成。抗體之重組產生將在下文更詳細地描述。
如本文所使用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」(或簡言之「抗體部分」或「片段」)係指保持特異性結合於抗原之能力的抗體之一或多個片段。已顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。術語抗體之「抗原結合部分」範圍內所涵蓋的結合片段之實例包含(i)Fab片段，即由V L、V H、C L及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，即一種二價片段，其包括在鉸鏈區藉由二硫橋鍵連接的兩個Fab片段；(iii)由V H及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之V L及V H域組成的Fv片段；(v)域抗體(dAb)片段(Ward等人,《自然》, 1989, 341, 544-546),其可由一個V H或一個V L域組成；及(vi)分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個域V L及V H係由獨立基因編碼，但其可使用重組方法，藉由合成連接子接合，該合成連接子能夠將其製造成V L與V H區配對形成單價分子之單一蛋白質鏈，稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人,《科學( Science)》 1988, 242, 423-426；及Huston等人,《美國國家科學院院刊( Proc. Natl. Acad. Sci. USA)》 1988, 85, 5879-5883)。此類scFv抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」內。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式來篩選供使用的片段。
如本文中所使用，術語「人類抗體」意欲包含具有其中構架區及CDR區皆來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區的抗體。另外，若抗體含有恆定區，則恆定區亦來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包含不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。如本文所使用，術語「人類抗體」並不意欲包含來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植於人類構架序列上的抗體。
術語「人類單株抗體」係指展示單一結合特異性且具有可變區之抗體，其中構架區與CDR區均來源於人類生殖系免疫球蛋白序列。在一些實施例中，人類單株抗體係由融合瘤產生，該融合瘤包含與永生化細胞融合的自轉殖基因非人類動物(例如，轉殖基因小鼠)獲得的B細胞，其具有包括人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因體。
如本文所使用，術語「重組人類抗體」包含藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，該等人類抗體諸如(a)自對於人類免疫球蛋白基因而言為轉殖基因或轉染色體之動物(諸如小鼠)或由其製備之融合瘤(在下文進一步描述)分離的抗體；(b)自經轉型以表現人類抗體之宿主細胞，例如自轉染瘤分離的抗體；(c)自重組、組合人類抗體庫分離的抗體；及(d)藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組人類抗體具有其中構架區及CDR區來源於人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區。然而，在某些實施例中，此類重組人類抗體可經歷活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時為活體內體細胞突變誘發)，且因此，重組抗體之V H及V L區之胺基酸序列係這樣一類序列，該等序列雖然來源於人類生殖系V H及V L序列且與其相關，但可能並非在活體內天然存在於人類抗體生殖系譜系內之序列。
如本文所用，「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如，IgM或IgG1)。
片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合於抗原之抗體」互換使用。
術語「人類抗體衍生物」係指人類抗體之任何經修飾形式，包含抗體與另一種活性醫藥成分或抗體之結合物。術語「結合物」、「抗體-藥物結合物」、「ADC」或「免疫結合物」係指與另一治療部分結合之抗體或其片段，該治療部分可使用此項技術中可用之方法與本文所描述之抗體結合。
術語「人源化抗體(humanized antibody/humanized antibodies)」及「人源化」意欲指來源於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已移植於人類構架序列上的抗體。在人類構架序列中可進行額外的構架區修飾。非人類(例如鼠類)抗體之人源化形式為含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之高變區的殘基經來自諸如具有所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種(供體抗體)之15個高變區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基係由對應非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包括在受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步優化抗體效能。一般而言，人源化抗體將包括實質上所有至少一個且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等區域且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白序列之彼等區域。人源化抗體視情況亦將包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常，人類免疫球蛋白之恆定區之至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人,《自然》 1986, 321, 522-525；Riechmann等人,《自然》 1988, 332, 323-329；及Presta,《結構生物學新見(Curr. Op.Struct.Biol)》 . 1992, 2,593-596。本文所描述之抗體亦可經修飾以採用已知賦予效應物功能及/或FcR結合改良(例如降低)的任何Fc變體。Fc變體可包含例如以下所揭示之胺基酸取代中之任一者：國際專利申請公開案第WO 1988/07089 A1號、第WO 1996/14339 A1、第WO 1998/05787 A1、第WO 1998/23289 A1、第WO 1999/51642 A1、第WO 99/58572 A1、第WO 2000/09560 A2、第WO 2000/32767 A1、第WO 2000/42072 A2、第WO 2002/44215 A2、第WO 2002/060919 A2、第WO 2003/074569 A2、第WO 2004/016750 A2、第WO 2004/029207 A2、第WO 2004/035752 A2、第WO 2004/063351 A2、第WO 2004/ 074455 A2、第WO 2004/099249 A2、第WO 2005/040217 A2、第WO 2005/070963 A1、第WO 2005/077981 A2、第WO 2005/092925 A2、第WO 2005/123780 A2、第WO 2006/019447 A1、第WO 2006/047350 A2及第WO 2006/ 085967 A2；及美國專利第5,648,260號；第5,739,277號；第5,834,250號；第5,869,046號；第6,096,871號；第6,121,022號；第6,194,551號；第6,242,195號；第6,277,375號；第6,528,624號；第6,538,124號；第6,737,056號；第6,821,505號；第6,998,253號；及第7,083,784號；其揭示內容以引用之方式併入本文中。
術語「嵌合抗體」意指可變區序列來源於一個物種且恆定區序列來源於另一物種的抗體，諸如可變區序列來源於小鼠抗體且恆定區序列來源於人類抗體的抗體。
「雙功能抗體」為具有兩個抗原結合位點之小抗體片段。片段包括連接至同一多肽鏈(V H-V L或V L-V H)中之輕鏈可變域(V L)的重鏈可變域(V H)。藉由使用過短以使得同一鏈上之兩個可變域之間不能配對的連接子，迫使可變域與另一條鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更完整地描述於例如歐洲專利第EP 404,097號；國際專利公開案第WO 93/11161號；及Bolliger等人,《美國國家科學院院刊》 1993, 90, 6444-6448中。
術語「糖基化」係指抗體之經修飾之衍生物。非糖基化抗體缺乏糖基化。糖基化可經改變以例如增加抗體對抗原之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來實現。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，使得排除一或多個可變區構架糖基化位點，以藉此消除該位點處之糖基化。改變之糖基化可增加抗體對抗原之親和力，如美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中所描述。另外或替代地，可產生糖基化類型改變之抗體，諸如海藻糖基殘基量減少之低海藻糖基化抗體或二分GlcNac結構增加之抗體。此類經改變之糖基化模式已證實會增加抗體之能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在具有改變之糖基化機制之宿主細胞中表現抗體來實現。糖基化機制改變之細胞已描述於此項技術中且可用作表現本發明之重組抗體以藉此產生糖基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而言，細胞株Ms704、Ms705及Ms709缺乏海藻糖基轉移酶基因、FUT8(α(1,6)海藻糖基轉移酶)，使得Ms704、Ms705及Ms709細胞株中表現之抗體在其碳水化合物上缺乏海藻糖。Ms704、Ms705及Ms709 FUT8−/−細胞株係藉由使用兩種置換載體靶向破壞CHO/DG44細胞中之FUT8基因而產生(參見例如美國專利公開案第2004/0110704號或Yamane-Ohnuki等人,《生物技術與生物工程( Biotechnol. Bioeng.)》, 2004, 87, 614-622)。作為另一實例，歐洲專利第EP 1,176,195描述一種具有功能性破壞之FUT8基因之細胞株，該FUT8基因編碼海藻糖基轉移酶，使得此類細胞株中表現之抗體藉由減少或消除α1,6鍵相關酶而展現出低海藻糖基化，且亦描述如下細胞株，該等細胞株具有用於將海藻糖添加至結合至抗體Fc區之N-乙醯基葡糖胺的低酶活性或不具有酶活性，例如細胞株為大鼠骨髓瘤細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)。國際專利公開案WO 03/035835描述變體CHO細胞株，即Lec 13細胞，其具有將海藻糖連接至Asn(297)-連接之碳水化合物的降低能力，亦導致表現於彼宿主細胞中之抗體之低海藻糖基化(亦參見Shields等人,《生物化學雜誌( J. Biol. Chem.)》 2002, 277, 26733-26740。國際專利公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現糖蛋白修飾型糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺轉移酶III(GnTIII))之細胞株，使得經工程改造之細胞株內所表現之抗體展現增加之二分GlcNac結構，使得增加抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人,《自然生物技術( Nat. Biotech.)》 1999, 17, 176-180)。替代地，抗體之海藻糖殘基可使用海藻糖苷酶裂解開。例如，海藻糖苷酶α-L-海藻糖苷酶自抗體中移除海藻糖基殘基，如Tarentino等人,《生物化學》 1975, 14,5516-5523中所描述。
「聚乙二醇化」係指經修飾之抗體或其片段，其通常在一或多個PEG基團連接至抗體或抗體片段之條件下與聚乙二醇(PEG)，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物反應。聚乙二醇化可例如增加抗體之生物(例如，血清)半衰期。較佳地，聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所使用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋用於衍生其他蛋白質之任何PEG形式，諸如單(C 1-C 10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。待聚乙二醇化之抗體可為去糖基化抗體。聚乙二醇化方法係此項技術中已知的且可應用於本發明之抗體，如歐洲專利第EP 0154316號及歐洲專利第EP 0401384號及美國專利第5,824,778號中所描述，其各自之揭示內容以引用之方式併入本文中。
術語「生物類似物」意謂這樣一種生物產物，包含單株抗體或蛋白質，儘管其在臨床非活性組分中存在少量差異，但其與美國核准之參考生物產物高度類似，且生物產物與參考產物之間在產物之安全性、純度及效力方面不存在臨床意義的差異。此外，類似生物或「生物類似物」為一種與已被歐洲藥物管理局授權使用之另一生物藥物相似的生物藥物。術語「生物類似物」亦被其他國家及地區監管機構以同義使用。生物產物或生物藥物為由生物來源(諸如細菌或酵母)製成或衍生的藥物。其可由相對較小分子(諸如人類胰島素或紅血球生成素)或複合分子(諸如單株抗體)組成。舉例而言，若參考IL-2蛋白為阿地介白素(PROLEUKIN)，則由藥物監管機構批准之參考阿地介白素的蛋白質為阿地介白素之「生物類似物」或為阿地介白素之「其生物類似物」。在歐洲，類似生物或「生物類似物」藥物為一種與已被歐洲藥物管理局(European Medicines Agency；EMA)授權使用之另一生物藥物相似的生物藥物。歐洲類似生物應用之相關法律依據為法規(EC)第726/2004號第6條及指令2001/83/EC第10(4)條，經修訂且因此在歐洲，生物類似物可根據法規(EC)第726/2004號第6條及指令2001/83/EC第10(4)條進行授權、批准的授權或授權申請的對象。經授權之原始生物醫藥產物在歐洲可被稱為「參考醫藥產物」。關於類似生物醫藥產物之CHMP指南中概述了產物被視為生物類似物的一些要求。此外，產物特定指南(包含與單株抗體生物類似物相關的指南)係由EMA逐項產物提供且發佈在其網站上。如本文所描述之生物類似物可藉助於品質特徵、生物活性、作用機制、安全概況及/或功效與參考醫藥產物類似。另外，生物類似物可用於或意欲用於治療與參考醫藥產物相同之病狀。因此，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考醫藥產物類似或高度類似之品質特徵。替代地或另外，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考醫藥產物類似或高度類似之生物活性。替代地或另外，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考醫藥產物類似或高度類似之安全概況。替代地或另外，可認為如本文所描述之生物類似物具有與參考醫藥產物類似或高度類似之功效。如本文所描述，歐洲生物類似物與已由EMA授權之參考醫藥產物進行比較。然而，在一些情況下，生物類似物在某些研究中可與在歐洲經濟區以外許可之生物醫藥產物(非EEA許可之「比較物」)進行比較。此類研究包含例如某些臨床及活體內非臨床研究。如本文所使用，術語「生物類似物」亦關於已與或可與非EEA許可之比較物比較的生物醫藥產物。某些生物類似物為蛋白質，諸如抗體、抗體片段(例如，抗原結合部分)及融合蛋白。蛋白質生物類似物可具有胺基酸序列，該胺基酸序列在胺基酸結構中具有少量修飾(包含例如胺基酸之缺失、添加及/或取代)，其不顯著影響多肽之功能。生物類似物可包含與其參考醫藥產物之胺基酸序列具有97%或更高序列一致性之胺基酸序列，例如97%、98%、99%或100%。生物類似物可包含一或多個轉譯後修飾，例如但不限於糖基化、氧化、去醯胺及/或截斷，其不同於參考醫藥產物之轉譯後修飾，其限制條件為差異不會引起醫藥產物之安全性及/或功效變化。生物類似物可具有與參考醫藥產物相同或不同的糖基化模式。特定言之，雖然不排他性地，但若差異解決或意欲解決與參考醫藥產物相關之安全問題，則生物類似物可具有不同糖基化模式。另外，生物類似物可在例如其強度、醫藥形式、調配物、賦形劑及/或呈現方式等方面不同於參考醫藥產物，只要該醫藥產物之安全性及功效不受影響。相比於參考醫藥產物，生物類似物可包含例如藥物動力學(PK)及/或藥效動力學(PD)概況之差異，但仍視為與參考醫藥產物充分類似，從而待授權或視為適合於授權。在某些情況下，生物類似物展現出與參考醫藥產物不同之結合特徵，其中該等不同結合特徵被監管機構(諸如EMA)認為並非類似生物產物獲得許可的障礙。術語「生物類似物」亦被其他國家及地區監管機構以同義使用。 III. TALEN 基因編輯及擴增過程 A.概述：TIL擴增+TALEN基因編輯
本發明之實施例係關於用於擴增TIL群體之方法，該方法包括藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸(諸如mRNA)引入TIL中而對至少一部分TIL進行TALEN基因編輯之一或多個步驟，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列，以便增強其治療效果。如本文中所使用，「TALEN基因編輯」、「基因編輯」及「基因體編輯」係指一種類型之基因修飾，其中在細胞之基因體中永久性修飾DNA，例如在細胞之基因體內插入、缺失、修飾或置換DNA。在一些實施例中，TALEN基因編輯引起DNA序列之表現沉默(有時稱為基因剔除)或抑制/降低(有時稱為基因減弱)。在其他實施例中，TALEN基因編輯引起DNA序列之表現增強(例如，藉由引起過表現)。根據本發明之實施例，使用TALEN基因編輯技術以增強治療性TIL群體之有效性。
本發明之經基因修飾之TIL包括TIL群體，其之至少一部分藉由將編碼一或多種針對藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TLS中而經基因修飾，其中一或多種TALE核酸酶包括針對包括SEQ ID NO: 175之核酸序列之核酸序列的TALE核酸酶，該TIL群體可根據如本文圖7中所描述或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/ 012633中所描述之方法之任何實施例擴增成治療性群體。 B. 在 TIL 擴增期間 TALEN 基因編輯之時序
根據一些實施例，本發明提供一種用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法包括： (a)藉由將自患者獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段來獲得來源於自該患者切除之腫瘤的第一TIL群體； (b)將腫瘤片段添加至密閉系統中； (c)藉由在包括IL-2及視情況選用之OKT-3(例如，OKT-3可在擴增過程之開始日開始存在於培養基中)之細胞培養基中培養第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行第一次擴增，其中第一次擴增進行約3至14天以獲得第二TIL群體，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (d)藉由用額外的IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)補充第二TIL群體之細胞培養基來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中第二次擴增進行約7至14天以獲得第三TIL群體，其中第三TIL群體為治療性TIL群體，其中在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行第二次擴增，且其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (e)收穫自步驟(d)獲得之治療性TIL群體，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (f)將收穫的TIL群體自步驟(e)轉移至輸注袋，其中自步驟(e)至(f)之轉移係在不開放系統之情況下發生；及 (g)在步驟(f)中之轉移至輸注袋之前的方法期間的任何時間處，藉由將編碼一或多種針對藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(視情況，mRNA)引入TIL細胞中而使至少一部分TIL細胞經受基因編輯，其中一或多種TALE核酸酶包括針對包括SEQ ID NO: 175之核酸序列之核酸序列的TALE核酸酶。
如上文所描述之實施例之步驟(g)中所陳述，可在步驟(f)中之轉移至輸液袋之前的TIL擴增方法期間的任何時間處進行基因編輯過程，其意謂可在擴增方法中之任何步驟之前、期間或之後對TIL進行基因編輯；例如，在以上方法中所概述之步驟(a)至(f)中之任一者期間或在以上方法中所概述之步驟(a)至(e)中之任一者之前或之後。根據某些實施例，在擴增方法期間收集TIL(例如，對至少一部分TIL「暫停」擴增方法)且使所收集之TIL經受基因編輯過程，且在一些情況下，隨後再引入回擴增方法中(例如，引入回培養基中)以繼續擴增過程，使得至少一部分最終轉移至輸液袋之治療性TIL群體經永久性基因編輯。在一些實施例中，可藉由活化TIL、對經活化之TIL進行基因編輯步驟及根據本文中所描述之方法擴增經基因編輯之TIL而在擴增之前進行基因編輯過程。
應注意，擴增過程之替代性實施例可與以上展示之方法不同；例如，替代性實施例可能不具有相同步驟(a)至(g)，或可能具有不同數目之步驟。與特定實施例無關，可在TIL擴增方法期間的任何時間處進行基因編輯過程。舉例而言，替代性實施例可包含超過兩次擴增，且有可能在第三次或第四次擴增等期間對TIL進行基因編輯。
根據一個實施例，對來自第一群體、第二群體及第三群體中之一或多者的TIL進行基因編輯過程。舉例而言，可對第一TIL群體或對自第一群體收集之一部分TIL進行基因編輯，且在基因編輯過程後，可隨後將彼等TIL置放回擴增過程中(例如，置放回培養基中)。替代地，可對來自第二或第三群體之TIL或對分別自第二或第三群體收集之一部分TIL進行基因編輯，且在基因編輯過程後，可隨後將彼等TIL置放回擴增過程中(例如，置放回培養基中)。根據其他實施例，在TIL仍位於培養基中時及在擴增正在進行時進行基因編輯，亦即，無需自擴增「移除」TIL即可進行基因編輯。
根據其他實施例，對來自第一次擴增之TIL或來自第二次擴增之TIL或其兩者進行基因編輯過程。舉例而言，在第一次擴增或第二次擴增期間，可對自培養基收集之TIL進行基因編輯，且在基因編輯過程後，可隨後將彼等TIL置放回擴增方法中，例如藉由將其再引入回培養基中。
根據其他實施例，在第一次擴增之後且在第二次擴增之前對至少一部分TIL進行基因編輯過程。舉例而言，在第一次擴增之後，可對自培養基收集之TIL進行基因編輯，且在基因編輯過程後，可隨後將彼等TIL置放回擴增方法中(例如，藉由將其再引入回培養基中)以進行第二次擴增。
根據替代性實施例，在步驟(c)之前(例如，在步驟(a)至(b)中之任一者之前、期間或之後)、在步驟(d)之前(例如，在步驟(a)至(c)中之任一者之前、期間或之後)、在步驟(e)之前(例如，在步驟(a)至(d)之前、期間或之後)或在步驟(f)之前(例如，在步驟(a)至(e)中之任一者之前、期間或之後)進行基因編輯過程。
應注意，關於OKT-3，根據某些實施例，細胞培養基可在第一次擴增之開始日(第0天)或第1天開始包括OKT-3，使得在第0天及/或第1天，在TIL已暴露於細胞培養基中之OKT-3之後對其進行基因編輯。根據其他實施例，細胞培養基在第一次擴增期間及/或在第二次擴增期間包括OKT-3，且在將OKT-3引入細胞培養基中之前進行基因編輯。替代地，細胞培養基可在第一次擴增期間及/或在第二次擴增期間包括OKT-3，且在將OKT-3引入細胞培養基中之後進行基因編輯。
亦應注意，關於4-1BB促效劑，根據某些實施例，細胞培養基可在第一次擴增之開始日(第0天)或第1天開始包括4-1BB促效劑，使得在第0天及/或第1天，在TIL已暴露於細胞培養基中之4-1BB促效劑之後對其進行基因編輯。根據其他實施例，細胞培養基在第一次擴增期間及/或在第二次擴增期間包括4-1BB促效劑，且在將4-1BB促效劑引入細胞培養基中之前進行基因編輯。替代地，細胞培養基可在第一次擴增期間及/或在第二次擴增期間包括4-1BB，且在將4-1BB引入細胞培養基中之後進行基因編輯。
應注意，關於IL-2，根據某些實施例，細胞培養基可在第一次擴增之開始日(第0天)或第1天開始包括IL-2，使得在第0天及/或第1天，在TIL已暴露於細胞培養基中之IL-2之後對其進行基因編輯。根據其他實施例，細胞培養基在第一次擴增期間及/或在第二次擴增期間包括IL-2，且在將IL-2引入細胞培養基中之前進行基因編輯。替代地，細胞培養基可在第一次擴增期間及/或在第二次擴增期間包括IL-2，且在將IL-2引入細胞培養基中之後進行基因編輯。
如上文所論述，OKT-3、4-1BB促效劑及IL-2中之一或多者可在第一次擴增之第0天或第1天開始包含於細胞培養基中。根據一個實施例，OKT-3在第一次擴增之第0天或第1天開始包含於細胞培養基中，及/或4-1BB促效劑在第一次擴增之第0天或第1天開始包含於細胞培養基中，及/或IL-2在第一次擴增之第0天或第1天開始包含於細胞培養基中。根據一實例，細胞培養基在第一次擴增之第0天或第1天開始包括OKT-3及4-1BB促效劑。根據另一實例，細胞培養基在第一次擴增之第0天或第1天開始包括OKT-3、4-1BB促效劑及IL-2。當然，可在擴增過程期間之一或多個額外的時間點處將OKT-3、4-1BB促效劑及IL-2中之一或多者添加至細胞培養基中，如本文中所描述之各種實施例中所闡述。
根據一些實施例，用於將腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法包括： (a)藉由將自患者獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段來獲得來源於自該患者切除之腫瘤的第一TIL群體； (b)將腫瘤片段添加至密閉系統中； (c)藉由將第一TIL群體在包括IL-2且視情況包括OKT-3及/或4-1BB促效劑抗體之細胞培養基中培養約3至11天來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行第一次擴增； (d)藉由添加OKT-3且培養約1至3天來刺激第二TIL群體，其中自步驟(c)至步驟(d)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (e)對第二TIL群體進行無菌電穿孔以實現將編碼一或多種針對藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之一或多種核酸(視情況，mRNA)轉移至第二TIL群體之一部分細胞中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對包括SEQ ID NO: 175之核酸序列之核酸序列的TALE核酸酶； (f)將第二TIL群體靜置約1天； (g)藉由用額外的IL-2、視情況選用之OKT-3抗體、視情況選用之OX40抗體及抗原呈現細胞(APC)補充第二TIL群體之細胞培養基來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中第二次擴增進行約7至11天以獲得第三TIL群體，其中在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行第二次擴增，且其中自步驟(f)至步驟(g)之轉變係在不開放系統之情況下發生； (h)收穫自步驟(g)獲得之治療性TIL群體以得到收穫的TIL群體，其中自步驟(g)至步驟(h)之轉變係在不開放系統之情況下發生，其中收穫的TIL群體為治療性TIL群體；及 (i)將收穫的TIL群體轉移至輸液袋，其中自步驟(h)至(i)之轉移係在不開放系統之情況下發生， 其中將一或多種核酸無菌電穿孔至第二TIL群體之部分細胞中修飾複數個細胞以降低CISH在細胞中之表現。
在一些實施例中，核酸為DNA。在一些實施例中，核酸為RNA。在一些實施例中，核酸為mRNA。
根據一些實施例，前述方法進一步包括使用冷凍保存培養基來冷凍保存收穫的TIL群體。在一些實施例中，冷凍保存培養基為基於二甲亞碸之冷凍保存培養基。在其他實施例中，冷凍保存培養基為CS10。 1.   CISH
CISH(細胞介素傳訊抑制因子(SOCS)家族之成員)係由CD8+ T細胞中之TCR刺激誘導且抑制其針對腫瘤之功能親合力。CD8+ T細胞中之CISH之基因缺失可增強其擴增、功能親合力及細胞介素多功能性，引起現有腫瘤之明顯及持久消退。參見例如Palmer等人,《實驗醫學雜誌( Journal of Experimental Medicine)》, 212 (12): 2095 (2015)。
根據特定實施例，根據本發明之組合物及方法，使用如圖7中所示描述為Gen 2或Gen 3之方法，CISH在TIL中之表現沉默或降低，且其中經基因修飾之TIL係藉由將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(視情況，mRNA)引入TIL中來產生，其中一或多種TALE核酸酶包括針對包括SEQ ID NO: 175之核酸序列之核酸序列的TALE核酸酶，其中該方法包含藉由沉默或抑制CISH之表現對至少一部分TIL進行TALEN基因編輯。 2.   PD-1
針對誘導檢查點阻斷而研究最多的目標之一為計劃性死亡受體(PD1或PD-1，亦稱為PDCD1)，其為T細胞調節子之CD28超家族之成員。其配位體PD-L1及PD-L2表現於各種腫瘤細胞(包含黑色素瘤)上。PD-1與PD-L1之相互作用可抑制T細胞效應物功能，引起慢性刺激環境下之T細胞耗竭且誘導腫瘤微環境中之T細胞凋亡。PD1亦可在腫瘤特異性逃避免疫監視中起作用。
根據特定實施例，本發明提供一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增成治療性TIL群體之方法，該擴增可根據如圖7中所示描述為Gen 2之方法進行，其中經基因修飾之TIL係藉由將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(視情況，mRNA)引入TIL中來產生，其中一或多種TALE核酸酶包括針對包括SEQ ID NO: 175之核酸序列的CISH之基因目標序列中之一者的TALE核酸酶，且其中該方法視情況進一步包括藉由沉默或抑制PD1之表現對至少一部分TIL進行TALEN基因編輯。舉例而言，此TALE方法可用於沉默或降低PD1在TIL中之表現，除CISH以外。在一些實施例中，靶向PD-1基因之TALEN為描述於WO 2013/176915 A1、WO 2014/184744 A1、WO 2014/184741 A1、WO 2018/007263 A1及WO 2018/073391 A1中之彼等，包含描述於WO 2013/176915 A1之第62-63頁上之表10中的PD-1 TALEN中之任一者、描述於WO 2014/184744 A1之第78頁上之表11中的PD-1 TALEN中之任一者、描述於WO 2014/184741 A1之第75頁上之表11中的PD-1 TALEN中之任一者、描述於WO 2018/007263 A1之第48-52頁上之表3中的PD-1 TALEN中之任一者及描述於WO 2018/073391 A1之第62-68頁上之表4及/或第73-99頁上之表5中的PD-1 TALEN中之任一者。 C.TALE基因編輯方法
已研發出使得能夠進行位點特異性基因體編輯的主要種類之核酸酶包含類轉錄活化子核酸酶(TALEN)，其經由蛋白質-DNA相互作用實現特異性DNA結合。參見例如Cox等人,《自然醫學( Nature Medicine)》, 2015, 第21卷, 第2期。TALE方法(其實施例更詳細地描述於下文中)可用作本發明之基因編輯方法。
如上文所論述，本發明之實施例提供經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾的腫瘤浸潤淋巴球(TIL)：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，以增強其治療效果。本發明之實施例涵蓋將此類基因編輯之TIL擴增成TIL群體的方法。本發明之實施例亦提供用於將此類基因編輯之TIL擴增成治療性群體的方法。
在一些實施例中，本發明提供一種藉由用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL來基因修飾TIL群體的方法，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶。電穿孔方法為本領域中已知的，且描述於例如以下中：Tsong,《生物物理雜誌( Biophys. J.)》 1991, 60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。可使用本領域中已知之其他電穿孔方法，諸如以下中描述之彼等電穿孔方法：美國專利第5,019,034號、第5,128,257號、第5,137,817號、第5,173,158號、第5,232,856號、第5,273,525號、第5,304,120號、第5,318,514號、第6,010,613號及第6,078,490號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，電穿孔方法為無菌電穿孔方法。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該一系列至少三個DC電脈衝具有一個、兩個或三個以下特徵：(1)至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同；(2)至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同；及(3)第一組至少三個脈衝中之兩者的第一脈衝間隔與第二組至少三個脈衝中之兩者的第二脈衝間隔不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中第一組至少三個脈衝中之兩者的第一脈衝間隔與第二組至少三個脈衝中之兩者的第二脈衝間隔不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以誘導TIL中之孔形成之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該一系列至少三個DC電脈衝具有一個、兩個或三個以下特徵：(1)至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同；(2)至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同；及(3)第一組至少三個脈衝中之兩者的第一脈衝間隔與第二組至少三個脈衝中之兩者的第二脈衝間隔不同，使得所誘導的孔持續相對長的時段，且使得維持TIL之成活力。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包含磷酸鈣轉染之步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沈澱、細胞表面包覆及胞吞作用)為本領域中已知的且描述於以下中：Graham及van der Eb,《病毒學( Virology)》 1973, 52, 456-467；Wigler等人,《美國國家科學院院刊》 1979, 76, 1373-1376；及Chen及Okayarea,《分子細胞生物學》 1987, 7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包含脂質體轉染之步驟。脂質體轉染方法，諸如採用陽離子脂質 N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]- n, n, n-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)於過濾水中之1:1(w/w)脂質體調配物之方法為本領域中已知的且描述於以下中：Rose等人,《生物技術( Biotechniques)》 1991, 10, 520-525及Felgner等人,《美國國家科學院院刊》, 1987, 84, 7413-7417以及美國專利第5,279,833號、第5,908,635號、第6,056,938號、第6,110,490號、第6,534,484號及第7,687,070號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包含使用以下中描述之方法進行轉染之步驟：美國專利第5,766,902號、第6,025,337號、第6,410,517號、第6,475,994號及第7,189,705號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在本發明之一些實施例中，電穿孔用於遞送所需編碼TALEN之核酸，包含編碼TALEN之RNA及/或DNA。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為流式電穿孔系統。適用於本發明之一些實施例之適合流式電穿孔系統之實例為市售MaxCyte STX系統。有若干種可能適用於本發明之替代性市售電穿孔儀器，諸如可獲自BTX-Harvard Apparatus之AgilePulse系統或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(龍沙(Lonza)/Amaxa)、GenePulser MXcell(伯樂(BIORAD))、iPorator-96(Primax (致伸))或siPORTer96(Ambion)。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統與TIL擴增方法之其餘部分一起形成密閉無菌系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為如本文中所描述之脈衝電穿孔系統，且與TIL擴增方法之其餘部分一起形成密閉無菌系統。
任何適合方法可用於擴增經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾的TIL：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在本發明之一些方法中，將此類基因編輯之TIL擴增成治療性群體可根據如本文圖7中所描述或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/ 012605或PCT/US2018/012633中所描述的方法之任何實施例進行。
TALE代表「類轉錄活化子效應」蛋白，其包含TALEN(「類轉錄活化子效應物核酸酶」)。使用TALE系統進行基因編輯之方法在本文中亦稱為TALE方法。TALE為來自植物病原細菌黃單孢菌屬( Xanthomonas)之天然存在蛋白質，且含有由一系列各自識別單鹼基對之33-35個胺基酸之重複域構成的DNA結合域。TALE特異性係藉由被稱為重複可變二殘基(repeat-variable di-residue；RVD)之兩個高變胺基酸來確定。模組化TALE重複序列連接在一起以識別連續DNA序列。DNA結合域中之特異性RVD識別目標基因座中之鹼基，從而提供結構特徵以組裝可預測的DNA結合域。將TALE之DNA結合域與IIS型FokI核酸內切酶之催化域融合，以製備可靶向的TALE核酸酶(TALEN)。TALE核酸酶為極其特異性的試劑，因為其需要在必然異二聚體形式下成對結合DNA以獲得裂解域Fok-1之二聚。左雜二聚體及右雜二聚體成員各自識別約14至20 bp之不同核酸序列，一起跨越30至50 bp總體特異性之目標序列。為了誘導位點特異性突變，由14-20個鹼基對間隔區域分開之兩個個別TALEN臂將FokI單體拉近以二聚合且產生靶向的雙股斷裂。
若干個利用各種組裝方法之大的系統性研究指示，可併入TALE重複序列以識別幾乎任何使用者定義之序列。能夠實現定製TALE陣列之快速組裝的策略包含Golden Gate分子選殖、高通量固相組裝及非連接依賴性選殖技術。定製設計的TALE陣列亦由Cellectis Bioresearch (法國巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals (美國肯塔基州列克星敦(Lexington, KY, USA))及生命技術公司(Life Technologies)(美國紐約州格蘭德島(Grand Island, NY, USA))市售。另外，可使用基於網路之工具，諸如TAL效應子-核苷酸目標2.0(TAL Effector-Nucleotide Target 2.0)，其能夠設計用於所需目標之定製TAL效應子重複序列陣列及提供所預測的TAL效應子結合位點。參見Doyle等人,《核酸研究( Nucleic Acids Research)》, 2012, 第40卷, W117-W122。適用於本發明之TALE及TALEN方法之實例描述於美國專利申請公開案第US 2011/0201118 A1號、第US 2013/0117869 A1號、第US 2013/0315884 A1號、第US 2015/0203871 A1號及第US 2016/0120906 A1號中，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
根據本發明之一些實施例，TALE方法包含藉由抑制或阻止目標基因之轉錄來沉默或降低一或多個基因之表現。舉例而言，TALE方法可包含利用KRAB-TALE，其中該方法包括將轉錄Kruppel相關匣(KRAB)域與靶向基因之轉錄起始位點之DNA結合域融合，使得抑制或阻止基因之轉錄。
根據其他實施例，TALE方法包含藉由在靶向基因中引入突變來沉默或降低一或多個基因之表現。舉例而言，TALE方法可包含使核酸酶效應子域(諸如Fokl)與TALE DNA結合域融合，產生TALEN。Fokl在作為二聚體時具有活性；因此，該方法包括構築TALEN對以將FOKL核酸酶域定位至相鄰基因體目標位點，該等域在該等目標位點處引入DNA雙股斷裂。可在Fokl之正確定位及二聚化之後完成雙股斷裂。在引入雙股斷裂之後，可經由兩種不同機制實現DNA修復：高保真同源重組對(HRR)(亦稱為同源定向修復或HDR)或易錯非同源末端接合(NHEJ)。經由NHEJ進行之雙股斷裂之修復較佳引起DNA目標位點缺失、插入或取代，亦即，NHEJ通常引起在斷裂位點處引入小型插入及缺失，通常誘導剔除基因功能之讀框轉移。根據特定實施例，使TALEN對靶向基因之大部分5'外顯子，促進早期讀框轉移突變或早熟終止密碼子。由TALEN引入之基因突變較佳為永久性的。因此，根據一些實施例，該方法包括藉由利用二聚化TALEN誘導經由易錯NHEJ修復之位點特異性雙股斷裂來沉默或降低目標基因之表現，從而引起目標基因中之一或多個突變。
根據其他實施例，可根據本發明之實施例使用TALEN，該TALEN為衍生自FokI及AvrXa7之雜交蛋白質，如美國專利公開案第2011/0201118號中所揭示。此TALEN保留對AvrXa7之目標核苷酸之識別特異性及FokI之雙股DNA裂解活性。可使用相同方法製備具有不同識別特異性之其他TALEN。舉例而言，可藉由工程改造具有不同RVD集合之核心TALE骨架以改變DNA結合特異性及靶向特異性單一dsDNA目標序列來產生緊密的TALEN。參見美國專利公開案第2013/0117869號。可將所選擇之催化域連接至骨架以實現DNA處理，其可經工程改造以確保當與核心TALE骨架融合時，催化域能夠處理單一dsDNA目標序列附近之DNA。肽連接子亦可經工程改造以使催化域與骨架融合，從而產生由單一多肽鏈製成之緊密的TALEN，其無需二聚以靶向特異性單一dsDNA序列。核心TALE骨架亦可藉由使催化域(其可為TAL單體)與其N端融合，實現此催化域可與另一個與另一TAL單體融合之催化域相互作用的可能性，藉此產生可能處理目標序列附近的DNA之催化實體而經修飾。參見美國專利公開案第2015/0203871號。此架構僅允許靶向一個DNA股，其並非經典TALEN架構之選擇方案。
根據本發明之一些實施例，可使用習知RVD以產生能夠顯著降低基因表現之TALEN。在一些實施例中，使用四種RVD，即NI、HD、NN及NG，以分別靶向腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶。此等習知RVD可用於例如產生靶向PD-1基因之TALEN。使用習知RVD之TALEN之實例包含Gautron等人,《分子療法：核酸( Molecular Therapy: Nucleic Acids)》, 2017年12月, 第9卷:312-321 (Gautron)中所揭示之T3v1及T1 TALEN，其以引用之方式併入本文中。T3v1及T1 TALEN靶向PD-L1結合位點所位於之PDCD1基因座之第二外顯子且能夠顯著減少PD-1產生。在一些實施例中，T1 TALEN藉由使用目標SEQ ID NO: 127如此進行及T3v1 TALEN藉由使用目標SEQ ID NO: 128以及實例1中描述之彼等序列如此進行。在一些實施例中，靶向PD-1基因之TALEN為描述於WO 2013/176915 A1、WO 2014/184744 A1、WO 2014/184741 A1、WO 2018/007263 A1及WO 2018/073391 A1中之彼等，包含描述於WO 2013/176915 A1之第62-63頁上之表10中的PD-1 TALEN中之任一者、描述於WO 2014/184744 A1之第78頁上之表11中的PD-1 TALEN中之任一者、描述於WO 2014/184741 A1之第75頁上之表11中的PD-1 TALEN中之任一者、描述於WO 2018/007263 A1之第48-52頁上之表3中的PD-1 TALEN中之任一者及描述於WO 2018/073391 A1之第62-68頁上之表4及/或第73-99頁上之表5中的PD-1 TALEN中之任一者。
根據其他實施例，使用非習知RVD修飾TALEN以改良其針對目標基因之活性及特異性，諸如Gautron中所揭示。天然存在之RVD僅涵蓋高變胺基酸位置之潛在多樣性譜系之一小部分。非習知RVD提供天然RVD之替代物且具有新穎的固有靶向特異性特徵，其可用於排除TALEN靶向位點外目標(基因體內之相對於目標序列含有少數錯配之序列)。可藉由產生及篩檢在陣列之既定位置處之兩個高變胺基酸位置處含有替代性胺基酸組合之TALEN之集合來鑑別非習知RVD，如Juillerat等人,《科學報導( Scientific Reports)》5, 章節編號8150 (2015)中所揭示，其以引用之方式併入本文中。接著，可選擇能夠區分錯配位置處存在之核苷酸之非習知RVD，其可防止位點外序列處之TALEN活性，同時仍允許目標位置之適當處理。接著可使用所選擇的非習知RVD置換TALEN中之習知RVD。其中習知RVD已由非習知RVD置換的TALEN之實例包含由Gautron產生之T3v2及T3v3 PD-1 TALEN。此等TALEN與使用習知RVD之TALEN相比具有增加之特異性。
根據其他實施例，TALEN可經特定設計，從而允許能夠靶向基因之特定選擇的目標細胞內之DSB事件之較高發生率。參見美國專利公開案第2013/0315884號。使用此類罕見的切割核酸內切酶可增加實現經轉染細胞中的目標基因之雙重不活化之幾率，從而允許產生經工程改造之細胞，諸如T細胞。另外，可將其他催化域與TALEN一起引入以增加突變誘發且增強目標基因不活化。成功地使用美國專利公開案第2013/0315884號中所描述之TALEN來工程改造T細胞以使其適用於免疫療法。TALEN亦可用於不活化T細胞中之各種免疫檢查點基因，包含不活化單一T細胞中之至少兩個基因。參見美國專利公開案第2016/0120906號。另外，TALEN可用於不活化編碼免疫抑制劑及T細胞受體之目標的基因，如美國專利公開案第2018/0021379號中所揭示，其以引用之方式併入本文中。此外TALEN可用於抑制β2-微球蛋白(B2M)及/或II類主要組織相容複合物反式活化子(CIITA)之表現，如美國專利公開案第2019/0010514號中所揭示，其以引用之方式併入本文中。
靶向PD-1基因的TALE核酸酶之實例提供於下表以及實例1中之表5及WO 2018/007263 A1中。在此等實例中，目標基因體序列含有由15-bp間隔子(以小寫字母展示)分隔之兩個17-鹼基對(bp)長序列(稱為半目標，以大寫字母展示)。每對右半及左半目標係由表中所列之對應對右半及左半TALE核酸酶之重複序列識別。因此，根據特定實施例，根據本發明之TALE核酸酶識別選自由以下組成之群組的目標序列且使其裂解：SEQ ID NO: 127及SEQ ID NO: 128。TALEN序列及基因編輯方法亦描述於上文所論述之Gautron中。
Figure 02_image005
另外，靶向PD-1基因的TALE核酸酶之實例提供於WO 2013/176915 A1、WO 2014/184744 A1、WO 2014/184741 A1、WO 2018/007263 A1及WO 2018/073391 A1中，包含描述於WO 2013/176915 A1之第62-63頁上之表10中的PD-1 TALEN中之任一者、描述於WO 2014/184744 A1之第78頁上之表11中的PD-1 TALEN中之任一者、描述於WO 2014/184741 A1之第75頁上之表11中的PD-1 TALEN中之任一者、描述於WO 2018/007263 A1之第48-52頁上之表3中的PD-1 TALEN中之任一者及描述於WO 2018/073391 A1之第62-68頁上之表4及/或第73-99頁上之表5中的PD-1 TALEN中之任一者。
藉由TALE方法來改變目標基因序列之表現且可根據本發明之實施例使用之系統、方法及組合物之實例描述於美國專利第8,586,526號中，其以引用之方式併入本文中。此等所揭示之實例包含使用具有兩個或更多個TALE重複單元的非天然存在之DNA結合多肽，該TALE重複單元含有重複RVD、由TALE蛋白質之殘基製成之N帽多肽及由TALE蛋白質之全長C端區域之片段製成之C帽多肽。
可用於有效進行TALEN介導之基因整合及不活化以及可根據本發明之實施例使用之TALEN設計及設計策略、活性評定、篩檢策略及方法之實例描述於Valton等人,《方法( Methods)》, 2014, 69, 151-170中，其以引用之方式併入本文中。 IV.       TIL 製造過程 -2A(Gen2)
用於產生且擴增本發明之經基因修飾之TIL的例示性過程描繪於圖7中，其中經擴增TIL係經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。如本文所論述，本發明可包含與再刺激冷凍保存之TIL以增加其代謝活性且因此在移植至患者中之前相對健康相關的步驟，及測試該代謝健康之方法。如本文大體上概述，TIL一般係獲自患者樣本且在移植至患者體內之前進行操作以擴增其數目。在一些實施例中，可冷凍保存此等經基因修飾之TIL。解凍後，其亦可經再刺激以在輸注至患者中之前增加其代謝。
在一些實施例中，如下文以及實例及圖7中詳細論述，將製備此等經基因修飾之TIL的第一次擴增(包含被稱為預REP之過程以及作為步驟B1展示於圖7中之過程)縮短至3至14天且將第二次擴增(包含被稱為REP之過程以及作為步驟C展示於圖7中之過程)縮短至7至14天，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，將製備經基因修飾之TIL的第一次擴增(例如，作為步驟B1描述於圖7中之擴增)縮短至11天且將第二次擴增(例如，如圖7中之步驟C中所描述之擴增)縮短至11天，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，如下文及實例及圖7中詳細論述，將第一次擴增及第二次擴增之組合(例如，作為步驟B1及步驟C描述於圖7中之擴增)縮短至22天，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。
以下「步驟」名稱A、B、C等參照圖7且參照本文所描述之某些實施例。以下步驟及圖7中之步驟次序為例示性的，且本申請案及本文中所揭示之方法涵蓋步驟之任何組合或次序，以及額外的步驟、步驟重複及/或步驟省略。 A. 步驟 A ：獲得患者腫瘤樣本
一般而言，TIL最初獲自患者腫瘤樣本(「初代TIL」)且接著擴增成較大群體以進行如本文中所描述之進一步操縱，視情況冷凍保存、如本文所概述之再刺激及視情況針對作為TIL健康之指示的表型及代謝參數進行評估，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。
患者腫瘤樣本可使用此項技術中已知之方法，一般經由手術切除、穿刺生檢、芯針生檢、小型生檢或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物之樣本的手段獲得。在一些實施例中，使用多病灶取樣。在一些實施例中，手術切除、穿刺生檢、芯針生檢、小型生檢或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物之樣本的手段包含多病灶取樣(亦即，自患者之一或多個腫瘤部位及/或位置以及在同一位置或緊密相鄰的一或多個腫瘤處獲得樣本)。一般而言，腫瘤樣本可來自任何實體腫瘤，包含原發性腫瘤、侵襲性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病之腫瘤。實體腫瘤可為皮膚組織。在一些實施例中，有用的TIL獲自黑色素瘤。
一旦獲得，腫瘤樣本通常使用銳器分割碎斷成1至約8 mm 3的片，其中約2-3 mm 3為尤其適用的。在一些實施例中，使用酶素性腫瘤碎解物自此等片段培養TIL。此類腫瘤碎解物可藉由在酶素性培養基(例如羅斯威爾公園癌症研究所(Roswell Park Memorial Institute；RPMI)1640緩衝液、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL慶大黴素(gentamicine)、30單位/毫升DNA酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，隨後進行機械解離(例如使用組織解離器)來產生。腫瘤碎解物可藉由以下產生：將腫瘤置放於酶素性培養基中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO 2中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環，直至僅存在小組織片。在此過程結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可進行使用FICOLL分支鏈親水性多醣之密度梯度分離以移除此等細胞。可使用本領域中已知之替代方法，諸如美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中所描述之方法，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。任何前述方法可用於本文所描述之任何實施例中擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
如上文所指示，在一些實施例中，TIL係衍生自實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤未經碎斷。在一些實施例中，實體腫瘤未經碎斷且以全腫瘤經受酶素性碎解。在一些實施例中，腫瘤係在包括膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中碎解。在一些實施例中，腫瘤係在包括膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中碎解1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO 2下在包括膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中碎解1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO 2 、旋轉下在包括膠原蛋白酶、DNA酶及中性蛋白酶之酶混合物中碎解1-2小時。在一些實施例中，腫瘤係在恆定旋轉下碎解隔夜。在一些實施例中，腫瘤係在37℃、5% CO 2、恆定旋轉下碎解隔夜。在一些實施例中，整個腫瘤與酶組合以形成腫瘤碎解反應混合物。
在一些實施例中，在無菌緩衝液中用凍乾酶重構腫瘤。在一些實施例中，緩衝液為無菌HBSS。
在一些實施例中，酶混合物包括膠原蛋白酶。在一些實施例中，膠原蛋白酶為膠原蛋白酶IV。在一些實施例中，膠原蛋白酶之工作儲備液為100 mg/ml 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括DNA酶。在一些實施例中，DNA酶之工作儲備液為10,000 IU/ml 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括玻尿酸酶。在一些實施例中，玻尿酸酶之工作儲備液為10 mg/ml 10×工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括10 mg/ml膠原蛋白酶、1000 IU/ml DNA酶及1 mg/ml玻尿酸酶。
在一些實施例中，酶混合物包括10 mg/ml膠原蛋白酶、500 IU/ml DNA酶及1 mg/ml玻尿酸酶。
在一些實施例中，酶混合物包括中性蛋白酶。在一些實施例中，以175 DMC U/mL之濃度重構中性蛋白酶之工作儲備液。
在一些實施例中，酶混合物包括中性蛋白酶、DNA酶及膠原蛋白酶。
在一些實施例中，酶混合物包括10 mg/ml膠原蛋白酶、1000 IU/mlDNA酶及0.31 DMC U/ml中性蛋白酶。在一些實施例中，酶混合物包括10 mg/ml膠原蛋白酶、500 IU/mlDNA酶及0.31 DMC U/ml中性蛋白酶。
一般而言，所收穫細胞懸浮液被稱為「初代細胞群體」或「新鮮收穫的」細胞群體。
在一些實施例中，碎斷包含物理碎斷，包含例如分割以及碎解。在一些實施例中，碎斷為物理碎斷。在一些實施例中，碎斷為分割。在一些實施例中，碎斷係藉由碎解進行。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者之酶素性腫瘤碎解物及腫瘤片段培養。在一些實施例中，TIL最初可在經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾之前自獲自患者之酶素性腫瘤碎解物及腫瘤片段培養：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。
在一些實施例中，在腫瘤為實體腫瘤時，腫瘤在例如步驟A(如圖7中所提供)中獲得腫瘤樣本之後經歷物理碎斷。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，碎斷在獲得腫瘤之後並且在不進行任何冷凍保存的情況下發生。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個或更多個片段或片置於各容器中以進行第一次擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將30或40個片段或片置於各容器中以進行第一次擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷且將40個片段或片置於各容器中以進行第一次擴增。在一些實施例中，多個片段包括約4個至約50個片段，其中各片段之體積為約27 mm 3。在一些實施例中，多個片段包括約30個至約60個片段，其總體積為約1300 mm 3至約1500 mm 3。在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總體積為約1350 mm 3。在一些實施例中，多個片段包括約50個片段，其總質量為約1公克至約1.5公克。在一些實施例中，多個片段包括約4個片段。在一些實施例中，多個片段包括約至約100個片段。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm 3與10 mm 3之間。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm 3與8 mm 3之間。在一些實施例中，腫瘤片段為約1 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約2 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約3 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約4 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約5 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約6 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約7 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約8 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約9 mm 3。在一些實施例中，腫瘤片段為約10 mm 3。在一些實施例中，腫瘤為1-4 mm × 1-4 mm × 1-4 mm。在一些實施例中，腫瘤為1 mm × 1 mm × 1 mm。在一些實施例中，腫瘤為2 mm × 2 mm × 2 mm。在一些實施例中，腫瘤為3 mm × 3 mm× 3 mm。在一些實施例中，腫瘤為4 mm × 4 mm × 4 mm。
在一些實施例中，腫瘤經切除以使各片上出血性、壞死及/或脂肪組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經切除以使各片上出血性組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經切除以使各片上壞死組織之量減至最小。在一些實施例中，腫瘤經切除以使各片上脂肪組織之量減至最小。
在一些實施例中，進行腫瘤碎斷以便維持腫瘤內部結構。在一些實施例中，在不使用解剖刀進行鋸切動作的情況下進行腫瘤碎斷。在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤碎解物。在一些實施例中，藉由在酶培養基(例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL慶大黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原蛋白酶)中培育，隨後進行機械解離(加利福尼亞州奧本美天旎生物技術的GentleMACS)來產生腫瘤碎解物。在將腫瘤置於酶培養基中之後，可以機械方式將腫瘤解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO 2中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO 2中再培育30分鐘之後，可將腫瘤第三次機械破壞大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後若大片組織仍存在，則施加1或2次額外的機械解離至樣本，不論是否在37℃下在5% CO 2中培育額外30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可進行使用Ficoll之密度梯度分離以移除此等細胞。
在一些實施例中，將第一次擴增步驟之前收穫的細胞懸浮液稱為「初代細胞群體」或「新鮮收穫的」細胞群體。
在一些實施例中，細胞可視情況在樣本收穫之後冷凍且在進入步驟B中所描述之擴增之前冷凍儲存，該步驟在下文進一步詳細描述以及在圖7中例示。 B. 步驟 B1 ：第一次擴增
在一些實施例中，本發明方法提供獲得年輕TIL，其能夠在投與個體/患者時提供增加之複製循環且因此可提供優於較老TIL(亦即，在投與個體/患者之前進一步經歷更多輪複製之TIL)之額外治療益處。年輕TIL之特徵已在文獻中描述，例如Donia等人,《斯堪的納維亞免疫學雜誌( Scandinavian Journal of Immunology)》, 75:157-167 (2012)；Dudley等人,《臨床癌症研究( Clin Cancer Res)》, 16:6122-6131 (2010)；Huang等人,《免疫療法雜誌( J Immunother)》, 28(3):258-267 (2005)；Besser等人,《臨床癌症研究》, 19(17):OF1-OF9 (2013)；Besser等人,《免疫療法雜誌》32:415-423 (2009)；Robbins等人,《免疫學雜誌( J Immunol)》2004; 173:7125-7130；Shen等人,《免疫療法雜誌》, 30:123-129 (2007)；Zhou等人,《免疫療法雜誌》, 28:53-62 (2005)；及Tran等人,《免疫療法雜誌》, 31:742-751 (2008)，其皆以全文引用之方式併入本文中。
T及B淋巴球之多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段之體細胞重組產生。此等基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(接合區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)之結合特異性及下游應用。本發明提供一種用於產生展現且增加T細胞組庫多樣性之經擴增之TIL的方法，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，藉由本發明方法獲得的經擴增之TIL展現T細胞組庫多樣性之增加，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，與新鮮收穫的TIL及/或使用除本文提供之彼等方法以外之其他方法(包含例如除實施於圖7中之彼等方法以外之方法)製備的TIL相比，藉由本發明方法獲得的經擴增之TIL(其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中)展現T細胞組庫多樣性之增加。在一些實施例中，第一次擴增中獲得之TIL展現T細胞組庫多樣性之增加，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，多樣性之增加為免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性之增加。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於免疫球蛋白中，存在於免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在於T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在於選自由α、β、γ及δ受體組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α之表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β之表現增加。在一些實施例中，TCRab(即，TCRα/β)之表現增加。
在例如圖7之步驟A中所描述的腫瘤片段之分割或碎解之後，所得細胞在含有IL-2之血清中在促進TIL生長超過腫瘤及其他細胞之條件下培養。在一些實施例中，在2 mL孔中在包含具有6000 IU/mL IL-2之非活化人類AB血清之培養基中培育腫瘤碎解物。將此初代細胞群體培養數天之時段，一般3至14天，產生一般約1×10 8個主體TIL細胞之主體TIL群體，其中經擴增之TIL已經或將經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養7至14天之時段，產生一般約1×10 8個主體TIL細胞之主體TIL群體，其中經擴增之TIL已經或將經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養10至14天之時段，產生一般約1×10 8個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，將此初代細胞群體培養約11天之時段，產生一般約1×10 8個主體TIL細胞之主體TIL群體，其中經擴增之TIL已經或將經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。
在一些實施例中，TIL之擴增可使用如下文及本文所描述之初始主體TIL擴增步驟(例如，諸如描述於圖7之步驟B1中之彼等，其可包含被稱為預REP之過程)來進行，其中經擴增之TIL已經或將經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。獲自此過程之TIL可視情況針對如本文所描述之表型特徵及代謝參數進行表徵。
在例如使用平底Costar 24孔細胞培養簇(紐約康寧(Corning,NY)的Corning Incorporated)在24孔盤中開始TIL培養的實施例中，各孔可在2 mL具有IL-2(6000 IU/mL；加利福尼亞州愛莫利維爾(Emeryville,CA)的Chiron Corp.)之完全培養基(CM)中接種有1×10 6個腫瘤碎解物細胞或一個腫瘤片段，其中經擴增之TIL已經或將經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，腫瘤片段在約1 mm 3與10 mm 3之間。
在一些實施例中，第一次擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，步驟B之CM由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL慶大黴素的含GlutaMAX之RPMI 1640組成。在具有40 mL容量及10 cm 2透氣矽底的透氣性燒瓶(例如，G-Rex10；明尼蘇達州新布萊頓市(New Brighton, MN)之Wilson Wolf Manufacturing)中開始培養之實施例中，各燒瓶可裝載有在10-40 mL具有IL-2之CM中的10-40×10 6個活腫瘤碎解物細胞或5-30個腫瘤片段。G-Rex10及24孔盤兩者可在含濕氣培育箱中在37℃在5% CO 2中培育且在培養開始後5天，可移除一半培養基且置換為新鮮的CM及IL-2，且在第5天之後，每2-3天可更換一半培養基。
在製備腫瘤片段之後，在含有IL-2之血清中在促進TIL生長超過腫瘤及其他細胞之條件下培養所得細胞(亦即，片段)，其中其生長係有利的之TIL已經或將經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，將腫瘤碎解物在2 mL孔中，在包括非活化人類AB血清(或在一些情況下，如本文所概述，在存在APC細胞群體之情況下)及6000 IU/mL IL-2的培養基中培育。將此初代細胞群體培養數天之時段，一般為10至14天，產生一般約1×10 8個主體TIL細胞之主體TIL群體。在一些實施例中，生長培養基在第一次擴增期間包括IL-2或其變體。在一些實施例中，IL為重組人類IL-2(rhIL-2)。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20-30×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有20×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有25×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，1 mg小瓶之IL-2儲備液具有30×10 6IU/mg之比活性。在一些實施例中，IL-2儲備液具有4-8×10 6IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有5-7×10 6IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備液具有6×10 6IU/mg IL-2之最終濃度。在一些實施例中，如實例5中所描述製備IL-2儲備溶液。在一些實施例中，第一次擴增培養基包括約10,000 IU/mL IL-2、約9,000 IU/mL IL-2、約8,000 IU/mL IL-2、約7,000 IU/mL IL-2、約6000 IU/mL IL-2或約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約9,000 IU/mL IL-2至約5,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約8,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約7,000 IU/mL IL-2至約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，第一次擴增培養基包含約6,000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含1000與2000 IU/mL之間、2000與3000 IU/mL之間、3000與4000 IU/mL之間、4000與5000 IU/mL之間、5000與6000 IU/mL之間、6000與7000 IU/mL之間、7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，細胞培養基包括OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL或約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、1 ng/mL與5 ng/mL之間、5 ng/mL與10 ng/mL之間、10 ng/mL與20 ng/mL之間、20 ng/mL與30 ng/mL之間、30 ng/mL與40 ng/mL之間、40 ng/mL與50 ng/mL之間及50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包括OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗(參見表1)。
在一些實施例中，細胞培養基在細胞培養基中包括一或多種TNFRSF促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且該4-1BB促效劑係選自由以下組成之群組：烏瑞魯單抗(urelumab)、烏圖木單抗(utomilumab)、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變體、生物類似物及組合。在一些實施例中，以足以在細胞培養基中實現0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度添加TNFRSF促效劑。在一些實施例中，以足以在細胞培養基中實現20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度添加TNFRSF促效劑。
在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包括初始濃度約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一或多種TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。
在一些實施例中，第一次擴增培養基稱為「CM」(培養基之縮寫)。在一些實施例中，其稱為CM1 (培養基1)。在一些實施例中，CM由補充有10%人類AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL慶大黴素的具有GlutaMAX之RPMI 1640組成。在具有40 mL容量及10 cm 2透氣矽底的透氣性燒瓶(例如，G-Rex10；明尼蘇達州新布萊頓市之Wilson Wolf Manufacturing)中開始培養之實施例中(圖1)，各燒瓶可裝載有在10-40 mL具有IL-2之CM中的10-40×10 6個活腫瘤碎解物細胞或5-30個腫瘤片段。G-Rex10及24孔盤兩者可在含濕氣培育箱中在37℃在5% CO 2中培育且在培養開始後5天，可移除一半培養基且置換為新鮮的CM及IL-2，且在第5天之後，每2-3天可更換一半培養基。在一些實施例中，CM為實例中所描述之CM1，參見實例1。在一些實施例中，第一次擴增發生於初始細胞培養基或第一細胞培養基中。在一些實施例中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包括IL-2。
在一些實施例中，第一次擴增(包含諸如描述於圖7之步驟B1中之彼等的過程，其可包含有時稱為預REP之彼等)縮短至3-14天，如實例及圖式中所論述。在一些實施例中，將第一次擴增(包含諸如描述於圖7之步驟B1中之彼等的過程，其可包含有時稱為預REP之彼等)縮短至7至14天，如實例中所論述且展示於圖7之步驟B1中描述之擴增中。在一些實施例中，將步驟B1之第一次擴增縮短至10-14天。在一些實施例中，將第一次擴增縮短至11天，如例如圖7之步驟B1中所描述之擴增中所論述。
在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天，其中經擴增之TIL已經或將經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行3天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行4天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行5天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行6天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行7天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行8天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行9天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行10天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行11天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行12天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行13天至14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行14天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行1天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行7天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行8天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行9天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行10天至11天。在一些實施例中，第一次TIL擴增可進行11天。
在一些實施例中，在密閉系統生物反應器中進行第一次擴增，例如根據圖7之步驟B1。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。 C. 步驟 B2 ：活化
在一些實施例中，在預REP步驟(圖7中之步驟B2)之後，TIL係藉由將OKT-3添加至培養基中且培養約1至3天而經活化，其中TIL已經或將經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，使活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)進行約2天。
在一些實施例中，藉由在300 ng/ml OKT-3存在下將TIL培養約1至3天來進行活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)。
在一些實施例中，活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)中之細胞培養基包括約300 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)中之細胞培養基包括約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約300 ng/ml、約400 ng/ml、約500 ng/mL、約600 ng/ml、約700 ng/ml、約800 ng/ml、約900 ng/ml或約1 µg /mL OKT-3抗體。在一些實施例中，活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)中之細胞培養基包括0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、1 ng/mL與5 ng/mL之間、5 ng/mL與10 ng/mL之間、10 ng/mL與20 ng/mL之間、20 ng/mL與30 ng/mL之間、30 ng/mL與40 ng/mL之間、40 ng/mL與50 ng/mL之間、50 ng/mL與100 ng/mL之間、100 ng/ml與500 ng/ml之間、200 ng/ml與400 ng/ml之間、250 ng/ml與350 ng/ml之間或275 ng/ml與325 ng/ml之間的OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗(參見表1)。
在一些實施例中，藉由在不開放系統之情況下將OKT-3添加至培養物中之TIL來進行活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)。 D. 步驟 B3 ： TALEN 基因修飾步驟
在一些實施例中，活化步驟(例如，圖7中之步驟B3)之後為藉由以下基因修飾TIL之步驟：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中(例如，圖8中之步驟B3)。
在一些實施例中，TALEN基因修飾步驟(例如，圖7中之步驟B3)係藉由基因修飾獲自活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)之TIL藉由以下來進行：用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL。
在一些實施例中，TALEN基因修飾步驟(例如，圖7中之步驟B3)係藉由基因修飾獲自活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)之TIL藉由以下來進行：用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL，其中一或多種TALE核酸酶包括具有包括SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的TALE核酸酶及具有包括SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL。
在一些實施例中，TALEN基因修飾步驟(例如，圖7中之步驟B3)係藉由基因修飾獲自活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)之TIL藉由以下來進行：用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL，其中一或多種TALE核酸酶包括具有包括SEQ ID NO: 165之胺基酸序列的TALE核酸酶及具有包括SEQ ID NO: 167之胺基酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL。
在一些實施例中，TALEN基因修飾步驟(例如，圖7中之步驟B3)係藉由基因修飾獲自活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)之TIL藉由以下來進行：用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL，其中一或多種TALE核酸酶包括具有包括SEQ ID NO: 164之胺基酸序列的TALE核酸酶及具有包括SEQ ID NO: 167之胺基酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL。
在一些實施例中，TALEN基因修飾步驟(例如，圖7中之步驟B3)係藉由基因修飾獲自活化步驟(例如，圖7中之步驟B2)之TIL藉由以下來進行：用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL，其中所需TALE核酸酶包括具有包括SEQ ID NO: 165之胺基酸序列的TALE核酸酶及具有包括SEQ ID NO: 166之胺基酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由用編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)電穿孔TIL。
在一些實施例中，如上適用之前述段落中之任一者中描述的TALEN基因修飾步驟經修改以使得用於TIL之電穿孔的核酸(諸如mRNA)包含編碼藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶的核酸(諸如mRNA)。
在一些實施例中，如上適用之前述段落中之任一者中描述的TALEN基因修飾步驟經修改以使得用於TIL之電穿孔的核酸(諸如mRNA)包含編碼具有包括SEQ ID NO: 170之胺基酸序列之TALE核酸酶的核酸(諸如mRNA)，且進一步包含編碼具有包括SEQ ID NO: 172之胺基酸序列之TALE核酸酶的核酸(諸如mRNA)。
在一些實施例中，如上適用之前述段落中之任一者中描述的TALEN基因修飾步驟經修改以使得編碼一或多種選擇性地不活化CISH基因之TALE核酸酶的核酸(諸如mRNA)、編碼一或多種選擇性地不活化PD-1基因之TALE核酸酶的核酸(諸如mRNA)及電穿孔緩衝液摻合在一起，且使TIL在摻合物存在下經受單一電穿孔步驟。
電穿孔方法為本領域中已知的，且描述於例如以下中：Tsong,《生物物理雜誌》 1991, 60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。可使用本領域中已知之其他電穿孔方法，諸如以下中描述之彼等電穿孔方法：美國專利第5,019,034號、第5,128,257號、第5,137,817號、第5,173,158號、第5,232,856號、第5,273,525號、第5,304,120號、第5,318,514號、第6,010,613號及第6,078,490號，其揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，電穿孔方法為無菌電穿孔方法。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該一系列至少三個DC電脈衝具有一個、兩個或三個以下特徵：(1)至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同；(2)至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同；及(3)第一組至少三個脈衝中之兩者的第一脈衝間隔與第二組至少三個脈衝中之兩者的第二脈衝間隔不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以改變、操縱或引起TIL中之限定及受控制的永久性或暫時性變化之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個單一、操作者控制之獨立程式化的DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中第一組至少三個脈衝中之兩者的第一脈衝間隔與第二組至少三個脈衝中之兩者的第二脈衝間隔不同。在一些實施例中，電穿孔方法為脈衝電穿孔方法，其包括用脈衝電場處理TIL以誘導TIL中之孔形成之步驟，包括向TIL施加一系列至少三個DC電脈衝之步驟，場強度等於或大於100 V/cm，其中該一系列至少三個DC電脈衝具有一個、兩個或三個以下特徵：(1)至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝振幅上彼此不同；(2)至少三個脈衝中之至少兩者在脈衝寬度上彼此不同；及(3)第一組至少三個脈衝中之兩者的第一脈衝間隔與第二組至少三個脈衝中之兩者的第二脈衝間隔不同，使得所誘導的孔持續相對長的時段，且使得維持TIL之成活力。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包含磷酸鈣轉染之步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沈澱、細胞表面包覆及胞吞作用)為本領域中已知的且描述於以下中：Graham及van der Eb,《病毒學》 1973, 52, 456-467；Wigler等人,《美國國家科學院院刊》 1979, 76, 1373-1376；及Chen及Okayarea,《分子細胞生物學》 1987, 7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包含脂質體轉染之步驟。脂質體轉染方法，諸如採用陽離子脂質 N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]- n, n, n-三甲基氯化銨(DOTMA)及二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)於過濾水中之1:1(w/w)脂質體調配物之方法為本領域中已知的且描述於以下中：Rose等人,《生物技術》 1991, 10, 520-525及Felgner等人,《美國國家科學院院刊》, 1987, 84, 7413-7417以及美國專利第5,279,833號、第5,908,635號、第6,056,938號、第6,110,490號、第6,534,484號及第7,687,070號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，基因修飾TIL群體之方法包含使用以下中描述之方法進行轉染之步驟：美國專利第5,766,902號、第6,025,337號、第6,410,517號、第6,475,994號及第7,189,705號，其中之每一者之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在本發明之一些實施例中，電穿孔用於遞送所需編碼TALEN之核酸，包含編碼TALEN之RNA及/或DNA。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為流式電穿孔系統。適用於本發明之一些實施例之適合流式電穿孔系統之實例為市售MaxCyte STX系統。有若干種可能適用於本發明之替代性市售電穿孔儀器，諸如可獲自BTX-Harvard Apparatus之AgilePulse系統或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(龍沙/Amaxa)、GenePulser MXcell(伯樂)、iPorator-96(致伸)或siPORTer96 (Ambion)。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統與TIL擴增方法之其餘部分一起形成密閉無菌系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統為如本文中所描述之脈衝電穿孔系統，且與TIL擴增方法之其餘部分一起形成密閉無菌系統。 E. 步驟 B4 ：靜置步驟
在一些實施例中，基因修飾步驟(例如，圖7中之步驟B3)之後為使TIL靜置之步驟(例如，圖8中之步驟B4)，其中靜置TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，使TIL靜置約1天。在一些實施例中，緊接著在基因修飾步驟(例如，圖7中之步驟B3)中之電穿孔之後，使TIL靜置約16小時。在一些實施例中，緊接著在基因修飾步驟(例如，圖7中之步驟B3)中之電穿孔之後，使TIL再懸浮於CM1培養基中且在37℃下培育一小時，隨後在30℃下培育15小時。 F. 步驟 C ：第一次擴增至第二次擴增之轉變
在一些情況下，獲自第一次擴增的經基因修飾之TIL群體(包含例如獲自例如如圖7中所指示之步驟B1的TIL群體)可使用以下本文中論述之方案立即冷凍保存，其中基因修飾包括藉由以下進行TALEN基因編輯：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。替代地，獲自第一次擴增之TIL群體(被稱為第二TIL群體)可如上文所描述在不進行臨時冷凍保存之情況下經受基因修飾，隨後為第二次擴增(其可包含有時稱為REP之擴增)且接著如下文所論述冷凍保存，其中基因修飾包括藉由以下進行TALEN基因編輯：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。 G. 步驟 D ：第二次擴增
在一些實施例中，TIL細胞群體在初始批量處理、預REP擴增及基因修飾後數目擴增，例如，在步驟A及步驟B之後，以及稱為步驟C之轉變，如圖7中所指示，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。此進一步擴增在本文中稱為第二次擴增，其可包含在此項技術中一般稱為快速擴增過程(REP；以及如圖7之步驟D中所指示之過程)之擴增過程。第二次擴增一般使用包括多種組分(包含飼養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)之培養基在透氣容器中實現。
在一些實施例中，TIL之第二次擴增或第二次TIL擴增(其可包含有時稱為REP之擴增；以及如圖7之步驟D中所指示的過程)可使用本領域之技術人員已知的任何TIL燒瓶或容器進行，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約7天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約8天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約9天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約10天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約11天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約12天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約13天至約14天。在一些實施例中，第二次TIL擴增可進行約14天。
在一些實施例中，第二次擴增可在透氣容器中使用本揭示案之方法(包含例如被稱為REP之擴增；以及如圖7之步驟D中所指示之過程)進行。舉例而言，TIL可在介白素-2(IL-2)或介白素-15(IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激而快速擴增。非特異性T細胞受體刺激物可包含例如抗CD3抗體，諸如約30 ng/ml OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自新澤西州拉里坦市(Raritan, NJ)的Ortho-McNeil或加利福尼亞州奧本市(Auburn, CA)的美天旎生物技術公司)或UHCT-1(可購自美國加利福尼亞州聖地亞哥市的BioLegend)。TIL可藉由在第二次擴增期間包含一或多種癌症之抗原(包含其抗原部分，諸如抗原決定基)來擴增以誘導進一步TIL活體外刺激，該等抗原可視情況在T細胞生長因子(諸如300 IU/mL IL-2或IL-15)存在下視情況自載體表現，該載體諸如人類白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如0.3 μM MART-1 :26-35(27 L)或gpl 00:209-217(210M)。其他適合抗原可包含例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或其抗原部分。TIL亦可藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈現細胞上的相同癌症抗原再刺激而快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如實例經照射之自體淋巴球或用經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激作為第二次擴增之部分發生。在一些實施例中，第二次擴增在經照射之自體淋巴球或經照射之HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2存在下發生。
在一些實施例中，細胞培養基進一步包括IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約3000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包括1000與2000 IU/mL之間、2000與3000 IU/mL之間、3000與4000 IU/mL之間、4000與5000 IU/mL之間、5000與6000 IU/mL之間、6000與7000 IU/mL之間、7000與8000 IU/mL之間或8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，細胞培養基包括OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約30 ng/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL或約1 µg/mL OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包括0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、1 ng/mL與5 ng/mL之間、5 ng/mL與10 ng/mL之間、10 ng/mL與20 ng/mL之間、20 ng/mL與30 ng/mL之間、30 ng/mL與40 ng/mL之間、40 ng/mL與50 ng/mL之間及50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基不包括OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體為莫羅單抗。
在一些實施例中，細胞培養基在細胞培養基中包括一或多種TNFRSF促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑為4-1BB促效劑，且該4-1BB促效劑係選自由以下組成之群組：烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白及其片段、衍生物、變體、生物類似物及組合。在一些實施例中，以足以在細胞培養基中實現0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度添加TNFRSF促效劑。在一些實施例中，以足以在細胞培養基中實現20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度添加TNFRSF促效劑。
在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包括初始濃度約3000 IU/mL之IL-2及初始濃度約30 ng/mL之OKT-3抗體，且其中該一或多種TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑。
在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞(APC)為PBMC。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC及/或抗原呈現細胞之比率為約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC之比率在1比50與1比300之間。在一些實施例中，在快速擴增及/或第二次擴增中TIL與PBMC之比率在1比100與1比200之間。
在一些實施例中，REP及/或第二次擴增在燒瓶中進行，其中主體TIL在150 ml培養基中與100倍或200倍過量之非活化飼養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2混合。進行培養基置換(一般用新鮮培養基經由抽吸置換2/3培養基)，直至細胞轉移至替代生長室中。替代生長室包含G-REX燒瓶及透氣容器，如下文更充分論述。
在一些實施例中，如實例及圖中所論述，將第二次擴增(其可包含被稱為REP過程之過程)縮短至7-14天，其中藉由此第二次擴增擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，wherein the一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，將第二次擴增縮短至11天。
在一些實施例中，REP及/或第二次擴增可以使用先前描述的T-175燒瓶及透氣袋(Tran等人，《免疫療法雜誌》 2008, 31, 742-51；Dudley等人,《免疫療法雜誌》 2003, 26, 332-42)或透氣培養皿(G-Rex燒瓶)進行，其中藉由此第二次擴增擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，第二次擴增(包含稱為快速擴增之擴增)係在T-175燒瓶中執行，且可將懸浮於150 mL培養基中的約1×10 6個TIL添加至各T-175燒瓶中。TIL可在補充有3000 IU/mL IL-2及30 ng/ml抗CD3的CM與AIM-V培養基之1:1混合物中培養。T-175燒瓶可在37℃下在5% CO 2中培育，其中藉由此第二次擴增擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。可在第5天使用具有3000 IU/mL IL-2的50/50培養基更換一半培養基。在一些實施例中，在第7天，可以將來自兩個T-175燒瓶之細胞組合在3 L袋中，且將300 mL AIM V與5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2添加至300 ml TIL懸浮液中。每天或每兩天對每個袋中之細胞數目計數，並添加新鮮培養基以使細胞計數保持在0.5與2.0×10 6個細胞/毫升之間。
在一些實施例中，第二次擴增(其可包含被稱為REP之擴增，以及圖7之步驟D中提及之彼等)可在具有100 cm透氣矽底之500 mL容量透氣燒瓶(G-Rex 100，可購自美國明尼蘇達州新布萊頓市之Wilson Wolf Manufacturing Corporation)中進行，5 × 10 6或10 × 10 6個TIL可在400 mL補充有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2及30 ng/ml抗CD3(OKT3)之50/50培養基中與PBMC一起培養，其中藉由此第二次擴增擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將引入編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)TIL中。G-Rex 100燒瓶可在37℃下在5% CO 2中培育。在第5天，可將250 mL上清液移除並放入離心瓶中且以1500 rpm(491 × g)離心10分鐘。TIL糰粒可用150 mL具有5%人類AB血清、3000 IU/mL IL-2之新鮮培養基再懸浮，且添加回原始G-Rex 100燒瓶中。當在G-Rex 100燒瓶中連續擴增TIL時，在第7天，可使各G-Rex 100中之TIL懸浮於各燒瓶中存在之300 mL培養基中，且細胞懸浮液可分成3份100 mL等分試樣，該等分試樣可用於接種3個G-Rex 100燒瓶。接著可將150 mL具有5%人類AB血清及3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各燒瓶中。可將G-Rex 100燒瓶在37℃下於5% CO 2中培育且在4天之後，可將150 mL具有3000 IU/mL IL-2之AIM-V添加至各G-Rex 100燒瓶中。可在培養之第14天收穫細胞。
在一些實施例中，第二次擴增(包含被稱為REP之擴增)在燒瓶中進行，其中將主體TIL在150 ml培養基中與100倍或200倍過量之非活化飼養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2混合。在一些實施例中，進行培養基置換，直至細胞轉移至替代生長室中，其中藉由此第二次擴增擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，藉由抽吸消耗培養基，隨後輸注新鮮培養基來置換2/3培養基。在一些實施例中，替代生長室包含G-REX燒瓶及透氣容器，如下文更充分論述。
在一些實施例中，第二次擴增培養基(例如，有時被稱為CM2或第二細胞培養基)包括IL-2、OKT-3以及抗原呈現飼養細胞(APC)，如下文更詳細論述。
在一些實施例中，在密閉系統生物反應器中進行第二次擴增，例如根據圖7之步驟D。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。 1. 飼養細胞及抗原呈現細胞
在一些實施例中，本文描述之第二次擴增程序(例如包含諸如描述於圖7之步驟D中之彼等以及被稱為REP之彼等的擴增)在REP TIL擴增期間及/或在第二次擴增期間需要過量飼養細胞，其中藉由此第二次擴增程序擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在許多實施例中，飼養細胞為獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC係使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理為非活化的，且如實例中所描述用於REP程序，其提供用於評估經照射同種異體PBMC之複製非勝任之例示性方案。
在一些實施例中，若第14天活細胞總數小於在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目，則認為PBMC為複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC為複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，若第7天及第14天在OKT3及IL-2存在下培養的活細胞總數與在REP第0天及/或第二次擴增第0天(亦即第二次擴增之起始日)放入培養物中的初始活細胞數目相比並未增加，則認為PBMC為複製非勝任的且可接受其用於本文所描述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5-60 ng/ml OKT3抗體及1000-6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在10-50 ng/ml OKT3抗體及2000-5000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在20-40 ng/ml OKT3抗體及2000-4000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在25-35 ng/ml OKT3抗體及2500-3500 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為PBMC。在一些實施例中，抗原呈現飼養細胞為人工抗原呈現飼養細胞。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率為約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率在1比50與1比300之間。在一些實施例中，在第二次擴增中TIL與抗原呈現飼養細胞之比率在1比100與1比200之間。
在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約2.5×10 9個飼養細胞:約100×10 6個TIL之比率。在其他實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約2.5×10 9個飼養細胞:約50×10 6個TIL之比率。在又其他實施例中，本文所描述之第二次擴增程序需要約2.5×10 9個飼養細胞:約25×10 6個TIL之比率。
在一些實施例中，本文所描述之第二次擴增程序在第二次擴增期間需要過量飼養細胞。在許多實施例中，飼養細胞為獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC係使用標準方法，諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，使用人工抗原呈現細胞(aAPC)代替PBMC。
一般而言，同種異體PBMC經由照射或熱處理為非活化的，且用於本文所描述之TIL擴增程序，包含圖及實例中所描述之例示性程序。
在一些實施例中，在第二次擴增中使用人工抗原呈現細胞來代替PBMC或與PBMC組合使用。 H. 步驟 E ：收穫 TIL
在第二次擴增步驟之後，可收穫細胞。在一些實施例中，在例如圖7中所提供之一、二、三、四個或更多個擴增步驟之後收穫TIL。在一些實施例中，在例如如圖7中所提供之兩個擴增步驟之後收穫TIL，其中藉由此擴增步驟擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。
TIL可以任何適當且無菌之方式收穫，包含例如離心。用於收穫TIL之方法為此項技術中熟知的且任何此類已知方法均可與本發明製程一起使用。在一些實施例中，使用自動化系統收穫TIL。
細胞收穫機及/或細胞處理系統可購自各種來源，包含例如費森尤斯卡比(Fresenius Kabi)、Tomtec Life Science、珀金埃爾默(Perkin Elmer)及Inotech Biosystems International, Inc.。本發明方法可採用任何基於細胞之收穫機。在一些實施例中，細胞收穫機及/或細胞處理系統為基於膜之細胞收穫機。在一些實施例中，細胞收穫係經由細胞處理系統，諸如LOVO系統(由費森尤斯卡比製造)進行。術語「LOVO細胞處理系統」亦係指由任何供應商製造之任何可在無菌及/或密閉系統環境中將包括細胞之溶液泵送通過膜或過濾器(諸如旋轉膜或旋轉過濾器)的儀器或裝置，從而允許連續流動及細胞處理以移除上清液或細胞培養基而不發生團塊化。在一些實施例中，細胞收穫機及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中進行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施例中，收穫(例如根據圖7之步驟E)係在密閉系統生物反應器中進行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所描述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器為例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器為單一生物反應器。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器進入以維持系統之無菌性及密閉性質。 I. 步驟 F ：最終調配 / 轉移至輸注袋
在如以圖7中之例示性順序提供及如上文及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將經基因修飾之TIL轉移至用於向患者投與之容器中，其中經基因修飾之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，一旦使用上文所描述之擴增方法獲得治療充足數目的經基因修飾之TIL，將其轉移至用於向患者投與之容器中，其中經基因修飾之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。
在一些實施例中，使用本揭示案之APC擴增之TIL係以醫藥組合物形式投與至患者，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，醫藥組合物為經基因修飾之TIL於無菌緩衝液中的懸浮液。使用本揭示案之方法擴增的TIL可藉由此項技術中已知之任何適合途徑投與，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。在一些實施例中，TIL係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投與，此較佳持續大約30至60分鐘，其中經擴增之TIL已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中。其他合適的投與途徑包含腹膜內、鞘內及淋巴內。 IV. 醫藥組合物、劑量及給藥方案
在一些實施例中，TIL以醫藥組合物形式投與至患者，該等TIL經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，且使用揭示案之方法擴增(在本文中被稱作「CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL」)。在一些實施例中，醫藥組合物為CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL於無菌緩衝液中的懸浮液。在一些實施例中，使用本揭示案之PBMC擴增的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL可藉由此項技術中已知之任何適合途徑投與。在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投與，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合投與途徑包含腹膜內、鞘內及淋巴管內投與。
可投與任何適合劑量之CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約2.3×10 10至約13.7×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL，平均約7.8×10 10個CISH lo/ PD-1 loTIL，尤其在癌症為黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，投與約1.2×10 10至約4.3×10 10個CISH lo或CISH lo/ PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約3×10 10至約12×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約4× 10 10至約10×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約5×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約6×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約7×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約2.3×10 10至約13.7×10 10個。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×10 10個CISH lo或CISH lo/ PD-1 loTIL，尤其在癌症為黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，治療有效劑量為約1.2×10 10至約4.3×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約3×10 10至約12×10 10個CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約4×10 10至約10×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約5×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約6×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約7×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之數目為約1×10 6、2×10 6、3×10 6、4×10 6、5×10 6、6×10 6、7×10 6、8×10 6、9×10 6、1×10 7、2×10 7、3×10 7、4×10 7、5×10 7、6×10 7、7×10 7、8×10 7、9×10 7、1×10 8、2×10 8、3×10 8、4×10 8、5×10 8、6×10 8、7×10 8、8×10 8、9×10 8、1×10 9、2×10 9、3×10 9、4×10 9、5×10 9、6×10 9、7×10 9、8×10 9、9×10 9、1×10 10、2×10 10、3×10 10、4×10 10、5×10 10、6×10 10、7×10 10、8×10 10、9×10 10、1×10 11、2×10 11、3×10 11、4×10 11、5×10 11、6×10 11、7×10 11、8×10 11、9×10 11、1×10 12、2×10 12、3×10 12、4×10 12、5×10 12、6×10 12、7×10 12、8×10 12、9×10 12、1×10 13、2×10 13、3×10 13、4×10 13、5×10 13、6×10 13、7×10 13、8×10 13及9×10 13個。在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之數目在1×10 6至5×10 6、5×10 6至1×10 7、1×10 7至5×10 7、5×10 7至1×10 8、1×10 8至5×10 8、5×10 8至1×10 9、1×10 9至5×10 9、5×10 9至1×10 10、1×10 10至5×10 10、5×10 10至1×10 11、5×10 11至1×10 12、1×10 12至5×10 12及5×10 12至1×10 13之範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之濃度小於例如醫藥組合物之100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之濃度大於醫藥組合物之90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之濃度在醫藥組合物之約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v之範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之濃度在醫藥組合物之約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v之範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之量等於或少於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之量超過0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL在廣泛劑量範圍內有效。準確劑量將視投與途徑、化合物投與形式、待治療個體之性別及年齡、待治療個體之體重及主治醫師之偏好及經驗而定。適當時亦可使用CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之臨床確定劑量。使用本文之方法投與的醫藥組合物之量，諸如CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之劑量將視所治療之人類或哺乳動物、病症或病狀之嚴重程度、投與速率、活性醫藥成分之配置及開處方醫師之判斷而定。
在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL可以單一劑量投與。此類投與可藉由例如靜脈內注射之注射進行。在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL可以多次劑量投與。給藥可為每年一次、兩次、三次、四次、五次、六次或超過六次。給藥可為每月一次、每兩週一次、一週一次或每隔一天一次。只要需要，可繼續TIL之投與。
在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之有效劑量為約1×10 6、2×10 6、3×10 6、4×10 6、5×10 6、6×10 6、7×10 6、8×10 6、9×10 6、1×10 7、2×10 7、3×10 7、4×10 7、5×10 7、6×10 7、7×10 7、8×10 7、9×10 7、1×10 8、2×10 8、3×10 8、4×10 8、5×10 8、6×10 8、7×10 8、8×10 8、9×10 8、1×10 9、2×10 9、3×10 9、4×10 9、5×10 9、6×10 9、7×10 9、8×10 9、9×10 9、1×10 10、2×10 10、3×10 10、4×10 10、5×10 10、6×10 10、7×10 10、8×10 10、9×10 10、1×10 11、2×10 11、3×10 11、4×10 11、5×10 11、6×10 11、7×10 11、8×10 11、9×10 11、1×10 12、2×10 12、3×10 12、4×10 12、5×10 12、6×10 12、7×10 12、8×10 12、9×10 12、1×10 13、2×10 13、3×10 13、4×10 13、5×10 13、6×10 13、7×10 13、8×10 13及9×10 13個。在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之有效劑量在1×10 6至5×10 6、5×10 6至1×10 7、1×10 7至5×10 7、5×10 7至1×10 8、1×10 8至5×10 8、5×10 8至1×10 9、1×10 9至5×10 9、5×10 9至1×10 10、1×10 10至5×10 10、5×10 10至1×10 11、5×10 11至1×10 12、1×10 12至5×10 12及5×10 12至1×10 13之範圍內。
在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之有效劑量在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg之範圍內。
在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之有效劑量在1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg，或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg之範圍內。
有效量之CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL可藉由投與具有類似效用之藥劑的任一種公認模式，包含鼻內及經皮途徑、藉由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、非經腸、肌肉內、皮下、局部、藉由移植或藉由吸入，以單次或多次劑量投與。
在其他實施例中，本發明提供了一種輸液袋，其包括上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體。
在其他實施例中，本發明提供一種腫瘤浸潤淋巴球(TIL)組合物，其包括上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體及醫藥學上可接受之載劑。
在其他實施例中，本發明提供了一種輸液袋，其包括上文前述段落中之任一者中描述的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物。
在其他實施例中，本發明提供了一種上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體之冷凍保存製劑。
在其他實施例中，本發明提供一種腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)組合物，其包括上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體及冷凍保存培養基。
在其他實施例中，本發明提供了上文前述段落中之任一者中描述的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得冷凍保存培養基含有DMSO。
在其他實施例中，本發明提供了上文前述段落中之任一者中描述的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得冷凍保存培養基含有7-10% DMSO。
在其他實施例中，本發明提供了一種上文前述段落中之任一者中描述的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物之冷凍保存製劑。
在一些實施例中，使用本揭示案之方法擴增之CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL係以醫藥組合物形式投與至患者。在一些實施例中，醫藥組合物為CISH lo或CISH lo/ PD-1 loTIL於無菌緩衝液中的懸浮液。使用本揭示案之PBMC擴增的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL可藉由此項技術中已知之任何適合途徑投與。在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL係以單一動脈內或靜脈內輸注之形式投與，其較佳持續大約30至60分鐘。其他適合投與途徑包含腹膜內、鞘內及淋巴管內投與。
可投與任何適合劑量之CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約2.3×10 10至約13.7×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL，平均約7.8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL，尤其在癌症為黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，投與約1.2×10 10至約4.3×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約3×10 10至約12×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約4×10 10至約10×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約5×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約6×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，投與約7×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約2.3×10 10至約13.7×10 10個。在一些實施例中，治療有效劑量為約7.8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL，尤其在癌症為黑色素瘤之情況下。在一些實施例中，治療有效劑量為約1.2×10 10至約4.3×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約3×10 10至約12×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約4×10 10至約10×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約5×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約6×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。在一些實施例中，治療有效劑量為約7×10 10至約8×10 10個CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之數目為約1×10 6、2×10 6、3×10 6、4×10 6、5×10 6、6×10 6、7×10 6、8×10 6、9×10 6、1×10 7、2×10 7、3×10 7、4×10 7、5×10 7、6×10 7、7×10 7、8×10 7、9×10 7、1×10 8、2×10 8、3×10 8、4×10 8、5×10 8、6×10 8、7×10 8、8×10 8、9×10 8、1×10 9、2×10 9、3×10 9、4×10 9、5×10 9、6×10 9、7×10 9、8×10 9、9×10 9、1×10 10、2×10 10、3×10 10、4×10 10、5×10 10、6×10 10、7×10 10、8×10 10、9×10 10、1×10 11、2×10 11、3×10 11、4×10 11、5×10 11、6×10 11、7×10 11、8×10 11、9×10 11、1×10 12、2×10 12、3×10 12、4×10 12、5×10 12、6×10 12、7×10 12、8×10 12、9×10 12、1×10 13、2×10 13、3×10 13、4×10 13、5×10 13、6×10 13、7×10 13、8×10 13及9×10 13個。在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之數目在1×10 6至5×10 6、5×10 6至1×10 7、1×10 7至5×10 7、5×10 7至1×10 8、1×10 8至5×10 8、5×10 8至1×10 9、1×10 9至5×10 9、5×10 9至1×10 10、1×10 10至5×10 10、5×10 10至1×10 11、5×10 11至1×10 12、1×10 12至5×10 12及5×10 12至1×10 13之範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之濃度小於例如醫藥組合物之100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之濃度大於醫藥組合物之90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之濃度在醫藥組合物之約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v之範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之濃度在醫藥組合物之約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v之範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之量等於或少於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之量超過0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組合物中的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL在廣泛劑量範圍內有效。準確劑量將視投與途徑、化合物投與形式、待治療個體之性別及年齡、待治療個體之體重及主治醫師之偏好及經驗而定。適當時亦可使用CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之臨床確定劑量。使用本文之方法投與的醫藥組合物之量，諸如CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之劑量將視所治療之人類或哺乳動物、病症或病狀之嚴重程度、投與速率、活性醫藥成分之配置及開處方醫師之判斷而定。
在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL可以單一劑量投與。此類投與可藉由例如靜脈內注射之注射進行。在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL可以多次劑量投與。給藥可為每年一次、兩次、三次、四次、五次、六次或超過六次。給藥可為每月一次、每兩週一次、一週一次或每隔一天一次。只要需要，可繼續CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之投與。
在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之有效劑量為約1×10 6、2×10 6、3×10 6、4×10 6、5×10 6、6×10 6、7×10 6、8×10 6、9×10 6、1×10 7、2×10 7、3×10 7、4×10 7、5×10 7、6×10 7、7×10 7、8×10 7、9×10 7、1×10 8、2×10 8、3×10 8、4×10 8、5×10 8、6×10 8、7×10 8、8×10 8、9×10 8、1×10 9、2×10 9、3×10 9、4×10 9、5×10 9、6×10 9、7×10 9、8×10 9、9×10 9、1×10 10、2×10 10、3×10 10、4×10 10、5×10 10、6×10 10、7×10 10、8×10 10、9×10 10、1×10 11、2×10 11、3×10 11、4×10 11、5×10 11、6×10 11、7×10 11、8×10 11、9×10 11、1×10 12、2×10 12、3×10 12、4×10 12、5×10 12、6×10 12、7×10 12、8×10 12、9×10 12、1×10 13、2×10 13、3×10 13、4×10 13、5×10 13、6×10 13、7×10 13、8×10 13及9×10 13個。在一些實施例中，TIL之有效劑量在1×10 6至5×10 6、5×10 6至1×10 7、1×10 7至5×10 7、5×10 7至1×10 8、1×10 8至5×10 8、5×10 8至1×10 9、1×10 9至5×10 9、5×10 9至1×10 10、1×10 10至5×10 10、5×10 10至1×10 11、5×10 11至1×10 12、1×10 12至5×10 12及5×10 12至1×10 13之範圍內。
在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之有效劑量在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg之範圍內。
在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之有效劑量在1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg，或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg之範圍內。
有效量之CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL可藉由投與具有類似效用之藥劑的任一種公認模式，包含鼻內及經皮途徑、藉由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、非經腸、肌肉內、皮下、局部、藉由移植或藉由吸入，以單次或多次劑量投與。 V. 治療患者之方法
治療方法始於原始TIL收集及TIL培養。此類方法均已描述於例如以全文引用之方式併入本文中的Jin等人,《免疫療法雜誌》, 2012, 35(3):283-292之領域中。下文貫穿各個部分，包含實例，描述了治療方法之實施例。
本發明之經擴增之CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL可根據如本文圖7中所描述或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述的方法之任何實施例擴增，可用於治療患有癌症之患者(例如，如Goff等人,《臨床腫瘤學雜誌( J. Clinical Oncology)》, 2016,34(20):2389-239以及補充內容中所描述，其以引用之方式全部併入本文中)。在一些實施例中，如先前描述自經切除轉移性黑色素瘤保藏物生長TIL(參見以全文引用之方式併入本文中的Dudley等人,《免疫療法雜誌》, 2003, 26:332-342)。
可藉由針對表面標記物CD3、CD4、CD8、CCR7及CD45RA之流式細胞測量術(例如FlowJo)(BD BioSciences)以及藉由本文所描述之任一種方法分析輸液袋CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之冷凍保存樣本之細胞表型。藉由使用標準酶聯免疫吸附分析技術量測血清細胞介素。血清IFN-γ之上升可定義為˃100 pg/mL。
功效之量度可包含疾病控制率(DCR)以及總反應率(ORR)，如本領域已知以及本文所描述。 A. 治療癌症及其他疾病之方法
本文所描述之組合物及方法可用於治療疾病之方法中。在一些實施例中，其用於治療過度增生病症。其亦可用於治療如本文及以下段落中所描述之其他病症。
在一些實施例中，過度增生病症為癌症。在一些實施例中，過度增生病症為實體腫瘤癌症。在一些實施例中，實體腫瘤癌症係選自由以下組成之群組：神經膠母細胞瘤(GBM)、胃腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、大腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，過度增生病症為血液惡性病。在一些實施例中，實體腫瘤癌症係選自由以下組成之群組：慢性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及套細胞淋巴瘤。
在一些實施例中，癌症為高突變癌症表型。高突變癌症廣泛描述於Campbell等人(《細胞》, 171: 1042-1056(2017)；出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)中。在一些實施例中，高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)9至10個突變。在一些實施例中，小兒高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)9.91個突變。在一些實施例中，成人高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)9個突變。在一些實施例中，增強的高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)10至100個突變。在一些實施例中，增強的小兒高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)10至100個突變。在一些實施例中，增強的成人高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)10至100個突變。在一些實施例中，超高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)大於100個突變。在一些實施例中，小兒超高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)大於100個突變。在一些實施例中，成人超高突變腫瘤包括每兆鹼基(Mb)大於100個突變。
在一些實施例中，高突變腫瘤具有複製修復路徑之突變。在一些實施例中，高突變腫瘤具有複製修復相關DNA聚合酶之突變。在一些實施例中，高突變腫瘤具有微衛星不穩定性。在一些實施例中，超高突變腫瘤具有複製修復相關DNA聚合酶之突變且具有微衛星不穩定性。在一些實施例中，腫瘤之高突變與對免疫檢查點抑制劑之反應相關。在一些實施例中，高突變腫瘤對免疫檢查點抑制劑治療具有抗性。在一些實施例中，高突變腫瘤可使用本發明之TIL治療。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由環境因素(外在暴露)引起。舉例而言，UV光可為惡性黑色素瘤中大量突變之主要原因(參見例如Pfeifer, G.P.、You, Y.H.及Besaratinia, A.(2005).《突變研究(Mutat. Res.)》571, 19-31.；Sage, E.(1993).《光化學與光生物學(Photochem. Photobiol.)》57, 163-174.)。在一些實施例中，腫瘤之高突變可歸因於直接突變原暴露而由菸草煙霧中大於60種之肺及喉腫瘤以及其他腫瘤致癌物引起(參見例如Pleasance, E.D., Stephens, P.J., O'Meara, S., McBride, D.J., Meynert, A., Jones, D., Lin, M.L., Beare, D., Lau, K.W., Greenman, C等人(2010).《自然》463, 184-190)。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由已顯示在廣泛範圍之癌症中引起C至T轉變量增加的催化性多肽樣脂蛋白元B mRNA編輯酶(APOBEC)家族成員的失調引起(參見例如Roberts, S.A., Lawrence, M.S., Klimczak, L.J., Grimm, S.A., Fargo, D., Stojanov, P., Kiezun, A., Kryukov, G.V., Carter, S.L., Saksena, G等人(2013).《自然遺傳學(Nat. Genet.)》45, 970-976)。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由缺陷性DNA複製修復引起，該缺陷性DNA複製修復係由損害主要複製酶Pol3及Pold1所進行之校讀的突變造成。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由與結腸直腸癌、子宮內膜癌及其他癌症之高突變相關的DNA錯配修復缺陷引起(參見例如Kandoth, C., Schultz, N., Cherniack, A.D., Akbani, R., Liu, Y., Shen, H., Robertson, A.G., Pashtan, I., Shen, R., Benz, C.C等人(2013).《自然》497, 67-73.；Muzny, D.M., Bainbridge, M.N., Chang, K., Dinh, H.H., Drummond, J.A., Fowler, G., Kovar, C.L., Lewis, L.R., Morgan, M.B., Newsham, I.F.等人 (2012).《自然》487, 330-337)。在一些實施例中，DNA複製修復突變亦發現於癌症易感症候群，諸如組成性或雙對偶錯配修復缺陷(constitutional or biallelic mismatch repair deficiency；CMMRD)、林奇症候群(Lynch syndrome)及聚合酶校讀相關息肉病(PPAP)中。
在一些實施例中，本發明包含一種用CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體治療癌症之方法，其中癌症為高突變癌症。在一些實施例中，本發明包含一種用CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體治療癌症之方法，其中癌症為增強的高突變癌症。在一些實施例中，本發明包含一種用CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體治療癌症之方法，其中癌症為超高突變癌症。
在一些實施例中，本發明包含用CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體治療癌症之方法，其中患者在輸注根據本揭示案之CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之前用非清髓性化學療法預治療。在一些實施例中，非清髓性化學療法為環磷醯胺60毫克/公斤/天持續2天(在CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注前第27天及第26天)及氟達拉濱25毫克/平方公尺/天持續5天(在CISH lo/PD-1 loTIL輸注前第27天至第23天)。在一些實施例中，非清髓性化學療法為環磷醯胺60毫克/公斤/天持續2天(在CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注前第27天及第26天)及氟達拉濱25毫克/平方公尺/天持續3天(在CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注前第27天至第25天)。在一些實施例中，非清髓性化學療法為環磷醯胺60毫克/公斤/天持續2天(在CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注前第27天及第26天)，隨後為氟達拉濱25毫克/平方公尺/天持續3天(在CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注前第25天至第23天)。在一些實施例中，在根據本揭示案之非清髓性化學療法及CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注之後(第0天)，患者每8小時以720,000 IU/kg靜脈內接受IL-2之靜脈內輸注以達至生理耐受。 1. 患者之視情況存在之淋巴球耗盡預調節
在一些實施例中，本發明包含一種用經基因修飾之TIL群體治療癌症的方法，該經基因修飾之TIL群體已經由TALEN基因編輯藉由以下進行基因修飾：將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中一或多種TALE核酸酶包括針對作為CISH基因目標序列的SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況藉由將編碼一或多種藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的TALE核酸酶之核酸(諸如mRNA)引入TIL中，其中患者在輸注根據本揭示案之此類TIL之前用非清髓性化學療法預治療。在一些實施例中，本發明包含用於治療已用非清髓性化學療法預治療之患者之癌症的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體。在一些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體係藉由輸注投與。在一些實施例中，非清髓性化學療法為環磷醯胺60毫克/公斤/天持續2天(在TIL輸注前第27天及第26天)及氟達拉濱25毫克/平方公尺/天持續5天(在TIL輸注前第27天至第23天)。在一些實施例中，非清髓性化學療法為環磷醯胺60毫克/公斤/天持續2天(在CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注前第27天及第26天)及氟達拉濱25毫克/平方公尺/天持續3天(在CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注前第27天至第25天)。在一些實施例中，非清髓性化學療法為環磷醯胺60毫克/公斤/天持續2天(在CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注前第27天及第26天)，隨後為氟達拉濱25毫克/平方公尺/天持續3天(在CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注前第25天至第23天)。在一些實施例中，在根據本揭示案之非清髓性化學療法及CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL輸注之後(第0天)，患者每8小時以720,000 IU/kg靜脈內接受IL-2(阿地介白素，可以PROLEUKIN商購)之靜脈內輸注以達至生理耐受。在某些實施例中，CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體係用於與IL-2組合治療癌症，其中IL-2係在此類TIL群體之後投與。
實驗發現表明，在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴球之前，淋巴球耗盡藉由消除調節性T細胞且競爭免疫系統之元件(『細胞介素庫(cytokine sink)』)在增強治療功效方面發揮關鍵作用。因此，本發明之一些實施例在引入本發明之TIL之前在患者身上採用淋巴球耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調節」)。
一般而言，使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱作馬磷醯胺(mafosfamide))及其組合之投與實現淋巴球耗盡。此類方法描述於Gassner等人,《癌症免疫學及免疫治療( Cancer Immunol. Immunother.)》 2011, 60, 75-85，Muranski等人,《自然臨床實踐腫瘤學( Nat. Clin. Pract. Oncol.)》 , 2006,3, 668-681，Dudley等人,《臨床腫瘤學( J. Clin. Oncol.)》, 2008, 26,5233-5239，及Dudley等人,《臨床腫瘤學》, 2005, 23,2346-2357中，所有文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，氟達拉濱係以0.5 μg/mL至10 μg/mL氟達拉濱之濃度投與。在一些實施例中，氟達拉濱係以1 μg/mL氟達拉濱之濃度投與。在一些實施例中，將氟達拉濱治療投與1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，氟達拉濱係以10毫克/公斤/天、15毫克/公斤/天、20毫克/公斤/天、25毫克/公斤/天、30毫克/公斤/天、35毫克/公斤/天、40毫克/公斤/天或45毫克/公斤/天之劑量投與。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35毫克/公斤/天投與2-7天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35毫克/公斤/天投與4-5天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以25毫克/公斤/天投與4-5天。
在一些實施例中，藉由投與環磷醯胺獲得濃度為0.5 μg/mL至10 μg/mL的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施例中，藉由投與環磷醯胺獲得濃度為1 μg/mL的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施例中，將環磷醯胺治療投與1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，環磷醯胺係以100毫克/平方公尺/天、150毫克/平方公尺/天、175毫克/平方公尺/天、200毫克/平方公尺/天、225毫克/平方公尺/天、250毫克/平方公尺/天、275毫克/平方公尺/天或300毫克/平方公尺/天之劑量投與。在一些實施例中，環磷醯胺係靜脈內(亦即i.v.)投與。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以35毫克/公斤/天投與2-7天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250毫克/平方公尺/天靜脈內投與4-5天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250毫克/平方公尺/天靜脈內投與4天。
在一些實施例中，藉由將氟達拉濱及環磷醯胺一起投與至患者進行淋巴球耗盡。在一些實施例中，歷經4天以25毫克/平方公尺/天靜脈內投與氟達拉濱且以250毫克/平方公尺/天靜脈內投與環磷醯胺。
在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續五天來進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天來進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱三天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱，且其中在總計三天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以約25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天來進行淋巴球耗盡，其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱三天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱，且其中在總計三天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約20毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以約20毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天來進行淋巴球耗盡，其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約50毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約20毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱三天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱，且其中在總計三天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約20毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以約20毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天來進行淋巴球耗盡，其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約20毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱三天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱，且其中在總計三天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約15毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱五天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱，且其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以約15毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天來進行淋巴球耗盡，其中在總計五天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以約40毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺兩天及以約15毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱三天來進行淋巴球耗盡，其中在前兩天投與環磷醯胺及氟達拉濱，且其中在總計三天中進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天來進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，藉由以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天來進行淋巴球耗盡。
在一些實施例中，環磷醯胺係與美司鈉(mesna)一起投與。在一些實施例中，美司鈉係以15 mg/kg投與。在輸注美司鈉之一些實施例中，且若連續輸注，則歷經24小時，伴隨各自環磷醯胺劑量開始，美司鈉可經大約2小時與環磷醯胺一起輸注(第-5天及/或第-4天)，接著在剩餘22小時以3毫克/公斤/小時之速率輸注。
在一些實施例中，本發明之方法進一步包括在向患者投與CISH lo/PD-1 loTIL之後當天開始用IL-2方案治療患者的步驟。
在一些實施例中，本發明之方法進一步包括在與向患者投與CISH lo/PD-1 loTIL之同一天開始用IL-2方案治療患者的步驟。
在一些實施例中，淋巴球耗盡包括5天之預調節治療。在一些實施例中，天數指示為第-5天至-1天，或第0天至第4天。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的環磷醯胺。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的靜脈內環磷醯胺。在一些實施例中，該方案包括第-5天及第-4天(亦即第0天及第1天)的60 mg/kg靜脈內環磷醯胺。在一些實施例中，環磷醯胺係與美司鈉一起投與。在一些實施例中，該方案進一步包括氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括25 mg/m 2靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括第-5天至第-1天(亦即第0天至第4天)的25 mg/m 2靜脈內氟達拉濱。在一些實施例中，該方案進一步包括第-5天至第-1天(亦即第0天至第4天)的25 mg/m 2靜脈內氟達拉濱。
在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續五天的步驟。
在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天的步驟。
在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續五天的步驟。
在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天的步驟。
在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天的步驟。
在一些實施例中，非清髓性淋巴球耗盡方案係根據下表投與：
Figure 02_image007
2. IL-2 方案
在一些實施例中，IL-2方案包括高劑量IL-2方案，其中高劑量IL-2方案包括阿地介白素或其生物類似物或變體，其在投與治療性CISH lo/PD-1 loTIL群體之治療有效部分之後當天開始靜脈內投與，其中阿地介白素或其生物類似物或變體係每八小時使用15分鐘彈丸注射靜脈內輸注以0.037 mg/kg或0.044 mg/kg IU/kg(患者體重)之劑量投與直至耐受，最大為14次劑量。在休止9天後，可重複此時程再投與14次劑量，最多總計28次劑量。在一些實施例中，IL-2係以1、2、3、4、5或6次劑量投與。在一些實施例中，IL-2係以至多6次劑量之最大劑量投與。
在一些實施例中，IL-2方案包括遞減IL-2方案。遞減IL-2方案已描述於O'Day等人,《臨床腫瘤學》, 1999, 17, 2752-61及Eton等人,《癌症》, 2000, 88,1703-9，其之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，遞減IL-2方案包括歷經6小時靜脈內投與18×10 6IU/m 2，然後歷經12小時靜脈內投與18×10 6IU/m 2，然後歷經24小時靜脈內投與18×10 6IU/m 2，然後歷經72小時靜脈內投與4.5×10 6IU/m 2。此治療週期可每28天重複，持續最多四個週期。在一些實施例中，遞減IL-2方案包括第1天18,000,000 IU/m 2、第2天9,000,000 IU/m 2以及第3天及第4天4,500,000 IU/m 2。
在一些實施例中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天之劑量投與聚乙二醇化IL-2。
在一些實施例中，IL-2方案包括投與移植至抗體主鏈上之IL-2片段。在一些實施例中，IL-2方案包括投與結合IL-2低親和力受體之抗體細胞介素移植蛋白。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈可變區(VH)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(VL)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL之CDR中，其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈可變區(VH)，其包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(VL)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL之CDR中，其中IL-2分子為突變蛋白，並且其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞。在一些實施例中，IL-2方案包括投與美國專利申請公開案第US 2020/0270334 A1號中所描述之抗體，該公開案之揭示內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈可變區(VH)，包括互補決定區HCDR1、HCDR2、HCDR3；輕鏈可變區(VL)，包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；及IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL之CDR中，其中IL-2分子為突變蛋白，其中該抗體細胞介素移植蛋白優先於調節性T細胞擴增T效應細胞，並且其中抗體進一步選自由以下組成之群組的包括IgG類重鏈及IgG類輕鏈：包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號中之SEQ ID NO: 69的IgG類輕鏈及包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號中之SEQ ID NO: 53的IgG類重鏈；包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號中之SEQ ID NO: 37的IgG類輕鏈及包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號中之SEQ ID NO: 21的IgG類重鏈；包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號中之SEQ ID NO: 69的IgG類輕鏈及包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號中之SEQ ID NO: 21的IgG類重鏈；及包括美國專利申請案公開第2020/0270334 A1號中之SEQ ID NO: 37的IgG類輕鏈及包括美國專利申請案公開第2020/0270334 A1號中之SEQ ID NO: 53的IgG類重鏈。
在一些實施例中，將IL-2分子或其片段移植至VH之HCDR1中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，將IL-2分子或其片段移植至VH之HCDR2中，其中IL2分子為突變蛋白。在一些實施例中，將IL-2分子或其片段移植至VH之HCDR3中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，將IL-2分子或其片段移植至VL之LCDR1中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，將IL-2分子或其片段移植至VL之LCDR2中，其中IL-2分子為突變蛋白。在一些實施例中，將IL-2分子或其片段移植至VL之LCDR3中，其中IL-2分子為突變蛋白。
IL-2分子之插入可在CDR之N端區處或附近，在CDR之中間區中，或在CDR之C端區處或附近。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括併入CDR中之IL-2分子，其中IL2序列不會將CDR序列框移。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括併入CDR中之IL-2分子，其中IL-2序列置換CDR序列之全部或一部分。IL-2分子置換可在CDR之N端區處，在CDR之中間區中，或在CDR之C端區處或附近。IL-2分子置換可少至CDR序列或整個CDR序列之一或兩個胺基酸。
在一些實施例中，IL-2分子直接移植至無肽連接子之CDR中，其中在CDR序列與IL-2序列之間沒有額外的胺基酸。在一些實施例中，IL-2分子間接移植至具有肽連接子之CDR中，其中CDR序列與IL-2序列之間存在一或多個額外的胺基酸。
在一些實施例中，本文所描述之IL-2分子為IL-2突變蛋白。在一些情況下，IL-2突變蛋白包括R67A取代。在一些實施例中，IL-2突變蛋白包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號中之胺基酸序列SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，IL-2突變蛋白包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號中之表1中的胺基酸序列。
在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括選自由以下組成之群組的HCDR1：美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括選自由美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 16組成之群組的HCDR1及選自由美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 17組成之群組的HCDR2。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括選自由美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 16組成之群組的HCDR1、選自由美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14及SEQ ID NO: 17組成之群組的HCDR2及選自由美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 18以下組成之群組的HCDR3。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括VH區，其包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括重鏈，其包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體細胞介素移植蛋白包括美國專利申請公開案第2020/0270334 A1號之IgG.IL2R67A.H1。在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白之抗體組分包括帕利珠單抗(palivizumab)之免疫球蛋白序列、構架序列或CDR序列。
在一些實施例中，本文所描述之抗體細胞介素移植蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(諸如但不限於阿地介白素(Proleukin®)或可比分子)長。
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
3. 額外的治療方法
在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法，其包括向個體投與上文前述段落中之任一者中描述的治療有效劑量之治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體。
在其他實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法，其包括向個體投與上文前述段落中之任一者中描述的治療有效劑量之CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其經修改以使得在分別投與上文前述段落中之任一者中描述的治療有效劑量之治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體及CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物之前，已向個體投與非清髓性淋巴球耗盡方案。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其經修改以使得非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續五天的步驟。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其經修改以使得非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天的步驟。
在一些實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其經修改以使得非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天的步驟。
在一些實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其經修改以使得非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天的步驟。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其經修改以進一步包括在向個體投與TIL細胞後當天開始用高劑量IL-2方案治療個體的步驟。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其經修改以使得高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘彈丸注射靜脈內輸注形式投與600,000或720,000 IU/kg直至耐受。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其經修改以使得癌症為實體腫瘤。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其經修改以使得癌症為黑色素瘤。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的用於治療患有癌症之個體的方法，其經修改以使得癌症為小兒高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL之治療性TIL群體，其用於治療患有癌症之個體的方法中，該方法包括向個體投與治療有效劑量之治療性CISH lo或CISH lo/ PD-1 loTIL群體。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者描述的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其用於治療患有癌症之個體的方法中，該方法包括向個體投與治療有效劑量之TIL組合物。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或上文前述段落中之任一者中描述的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得在向個體投與上文前述段落中之任一者中描述的治療有效劑量之治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或上文前述段落中之任一者中描述的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物之前，已向個體投與非清髓性淋巴球耗盡方案。
在其他實施例中，本發明提供上文任何前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續五天的步驟。
在一些實施例中，本發明提供上文任何前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天的步驟。
在一些實施例中，本發明提供上文任何前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺及以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續一天的步驟。
在一些實施例中，本發明提供上文任何前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得非清髓性淋巴球耗盡方案包括以60毫克/平方公尺/天之劑量投與環磷醯胺持續兩天，隨後以25毫克/平方公尺/天之劑量投與氟達拉濱持續三天的步驟。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以進一步包括在向患者投與TIL細胞之後當天開始用高劑量IL-2方案治療患者的步驟。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得高劑量IL-2方案包括每八小時以15分鐘彈丸注射靜脈內輸注形式投與600,000或720,000 IU/kg直至耐受。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得癌症為實體腫瘤。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得癌症為黑色素瘤。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得癌症為高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物，其經修改以使得癌症為小兒高突變癌症。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體在治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向個體投與治療有效劑量之治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物在治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向個體投與治療有效劑量之CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物。
在其他實施例中，本發明提供上文前述段落中之任一者中描述的治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或上文前述段落中之任一者中描述的CISH lo或CISH lo/ PD-1 loTIL組合物在治療個體之癌症之方法中的用途，該方法包括向個體投與非清髓性淋巴球耗盡方案，且接著向個體投與上文前述段落中之任一者中描述的治療有效劑量之治療性CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL群體或上文前述段落中之任一者中描述的治療有效劑量之CISH lo或CISH lo/PD-1 loTIL組合物。 實例
現參考以下實例描述本文中涵蓋之實施例。此等實例僅出於說明之目的提供且本揭示案決不應理解為限於此等實例，而應理解為涵蓋由於本文提供之教示而變得顯而易見的任何及所有變化形式。 實例 1 ：藉由 CISH 基因剔除製備 TIL
此實例描述藉由CISH基因剔除製備腫瘤浸潤淋巴球(CISH KO TIL)之程序。此培養基可用於製備本申請案及實例中所描述之TIL中之任一者。 用於 CISH KO TIL 擴增之方案
預擴增設置：在具有IL-2之CM1中自每個G-REX 10燒瓶6至8個腫瘤片段開始預REP培養，持續11天。將預REP TIL以35e6個細胞/小瓶冷凍保存在CS10冷凍培養基中且保存在-80℃下直至使用。
預擴增TIL解凍：在TIL經冷凍保存之例示性情況中，將冷凍保存之TIL解凍且在24孔盤中以2e6個細胞/孔在含有IL-2(3000 IU/mL)之CM1中靜置兩天。
T細胞活化：將細胞用盤結合之抗CD3以300 ng/ml之濃度活化另外兩天。
電穿孔：TIL用編碼CISH TALEN之mRNA、編碼PD-1 TALEN之mRNA、編碼CISH TALEN之mRNA + 編碼PD-1 TALEN之mRNA電穿孔，或非電穿孔。對於每次電穿孔，將一百萬個活化的TIL用細胞穿孔緩衝液T4洗滌兩次。將細胞再懸浮於每組含有4 μg TALEN mRNA的50 μl細胞穿孔T4緩衝液中。將細胞轉移至1 mm Gap電穿孔光析槽中且使用BTX AgilePulse電穿孔。緊接著在電穿孔之後，將細胞再懸浮於1 ml CM1培養基中且塗覆於24孔盤孔中。將細胞在37℃下培育一小時，隨後在30℃下培育15小時。
擴增：非電穿孔及CISH KO TALEN mRNA電穿孔之TIL(1e5個細胞)藉由在OKT3(30 ng/ml，Miltenyi Biotec)、IL-2(6000 IU/ml，CellGenix)中培養使用快速擴增方案(REP)擴增且照射PBMC(30e6個細胞)持續11天。
擴增後TIL收穫：收穫細胞且如下處理。
在藉由西方墨點分析評定CISH蛋白及/或藉由流式細胞測量術評定PD-1表現之前，用抗CD3再刺激擴增後TIL隔夜。NE = 非電穿孔；過表現CISH蛋白之293T細胞用作陽性對照；來自西方墨點分析之密度測定法資料用於計算相對倍數變化；NE用於基線計算。
Figure 02_image015
實驗中所用之編碼CISH KO TALEN之序列及其在CISH基因中之對應裂解位點的描述提供於下表7中。
Figure 02_image017
Figure 02_image019
Figure 02_image021
實驗中所用之PD-1 KO TALEN及其在PD-1基因中之對應裂解位點的描述提供於下表8中。
Figure 02_image023
Figure 02_image025
Figure 02_image027
實驗結果
單一及雙重CISH KO之效率分別為75%及40%(圖2)。在藉由西方墨點分析評定CISH蛋白之前，用抗CD3再刺激擴增後TIL隔夜。NE = 非電穿孔；+Ctrl = 過表現CISH蛋白之293T細胞；來自西方墨點分析之密度測定法資料用於計算相對倍數變化；NE用於基線計算。
PD-1 KO效率在雙重CISH/PD-1 KO TIL中範圍介於50%至75%(圖3)。在藉由流式細胞測量術評定PD-1表現之前，用抗CD3再刺激擴增後TIL隔夜。KO效率之負值指示PD-1表現增加。
CISH KO TIL之倍數擴增相對於對照降低(圖4)。對擴增後TIL進行計數且評定細胞成活力。藉由擴增後TIL之總細胞計數除以擴增第0天接種之細胞數目來計算倍數擴增。
就T細胞譜系及記憶子集而言，CISH KO TIL之表型與非電穿孔對照類似(圖5)。針對CD3、CD4、CD8、CD45RA及CCR7對擴增後TIL進行染色。在BD FACSCanto™上獲取細胞且藉由FlowJo分析。
就分化及活化/耗竭而言，CISH KO TIL之表型與非電穿孔對照類似(圖6)。針對CD3、CD28、CD56、DNAM、TIGIT及TIM-3對擴增後TIL進行染色。在BD FACSCanto™上獲取細胞且藉由FlowJo分析。 實例2：CISH基因剔除效率 實驗設計
用正向及反向引子(CISH-F1及CISH-RI)使用PCR擴增自九對CISH基因剔除及非電穿孔TIL中分離之基因體DNA。
藉由NGS定序分析PCR產物。
使用CRISPresso 2進行資料分析。 引子、裂解位點及 CISH 序列
CISH正向引子- CTGCACTGCTGATACCCGAA (SEQ ID NO: 173)
CISH反向引子- GGGGTACTGTCGGAGGTAGT (SEQ ID NO: 174)
裂解位點： TGCGCCTAGTGACCCAGCACTGCCTGCTCCTCCACCAGCCACTGCTGTA (SEQ ID NO: 168)
CISH目標位點序列： CTGCACTGCTGATACCCGAAGCGACAGCCCCGATCC TGCTCCCACCCCGGCCCTGCCTATGCCTAAGGAGGATGCGCCTAGTGACCCAGCACTGCCTGCTCCTCCACCAGCCACTGCTGTACACCTAAAACTGGTGCAGCCCTTTGTACGCAGAAGCAGTGCCCGCAGCCTGCAACACCTGTGCCGCCTTGTCATCAACCGTCTGGTGGCCGACGTGGACTGCCTGCCACTGCCCCGGCGCATGGCCG ACTACCTCCGACAGTACCC(SEQ ID NO: 175)。三個加底線區域對應於CISH序列上之特定位置。
Figure 02_image029
提供上述實例以為一般熟習此項技術者提供如何製得並使用本發明之組合物、系統及方法之實施例的完整揭示及描述，且並不意欲限制本發明人定義其發明之範疇。熟習此項技術者顯而易見的進行本發明之上述模式修改意欲在以下申請專利範圍之範疇內。本說明書中提及之所有專利及公開案指示熟習本發明所關於之技術者之技能水準。
所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應視為以任何方式具限制性。舉例而言，熟習此項技術者應瞭解根據本文所描述之本發明之精神及範疇按需要組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。
本文中引用之所有參考文獻以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其引用程度如同各個別公開案或專利或專利申請案經特定且個別地指示出於所有目的以全文引用之方式併入本文中一般。 如本領域中熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本申請案之精神及範疇的情況下對其進行多種修改及改變。本文所描述之特定實施例及實例僅作為實例提供，且本申請案僅受隨附申請專利範圍之各項以及申請專利範圍授權之等效物的全部範疇限制。
[ 圖 1] ：TIL中雙KO之評定。
[ 圖 2] ：單及雙CISH KO之效率。
[ 圖 3] ：雙CISH/PD-1 KO TIL中之PD-1 KO效率。
[ 圖 4] ：相對於對照減少的CISH KO TIL之倍數擴增。
[ 圖 5] ：CISH KO TIL中之T細胞譜系及記憶子集。
[ 圖 6] ：CISH：CISH KO TIL中之分化及活化/耗竭。
[ 圖 7] ：顯示藉由將編碼一或多種針對CISH基因中之目標序列的TALE核酸酶的核酸引入TIL中來擴增經基因修飾之TIL的例示性製程，該目標序列包括SEQ ID NO: 175之核酸序列。 序列表的簡要說明
SEQ ID NO: 1為莫羅單抗(muromonab)之重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 2為莫羅單抗之輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 3為重組人類IL-2蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 4為阿地介白素(aldesleukin)之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 5為重組人類IL-4蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 6為重組人類IL-7蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 7為重組人類IL-15蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 8為重組人類IL-21蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 9-126目前未指定。
SEQ ID NO: 127為目標PD-1序列。
SEQ ID NO: 128為目標PD-1序列。
SEQ ID NO: 129為重複的PD-1左重複序列。
SEQ ID NO: 130為重複的PD-1右重複序列。
SEQ ID NO: 131為重複的PD-1左重複序列。
SEQ ID NO: 132為重複的PD-1右重複序列。
SEQ ID NO: 133為PD-1左TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO: 134為PD-1右TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO:135為PD-1左TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO: 136為PD-1右TALEN核酸酶序列。
SEQ ID NO: 137為IL-2序列。
SEQ ID NO: 138為IL-2突變蛋白序列。
SEQ ID NO: 139為IL-2突變蛋白序列。
SEQ ID NO: 140為IgG.IL2R67A.H1之 HCDR1_IL-2。
SEQ ID NO: 141為IgG.IL2R67A.H1之HCDR2。
SEQ ID NO: 142為IgG.IL2R67A.H1之HCDR3。
SEQ ID NO: 143為IgG.IL2R67A.H1之 HCDR1_IL-2 kabat。
SEQ ID NO: 144為IgG.IL2R67A.H1之HCDR2 kabat。
SEQ ID NO: 145為IgG.IL2R67A.H1之HCDR3 kabat。
SEQ ID NO: 146為IgG.IL2R67A.H1之 HCDR1_IL-2 clothia。
SEQ ID NO: 147為IgG.IL2R67A.H1之HCDR2 clothia。
SEQ ID NO: 148為IgG.IL2R67A.H1之HCDR3 clothia。
SEQ ID NO: 149為IgG.IL2R67A.H1之 HCDR1_IL-2 IMGT。
SEQ ID NO: 150為IgG.IL2R67A.H1之HCDR2 IMGT。
SEQ ID NO: 151為IgG.IL2R67A.H1之HCDR3 IMGT。
SEQ ID NO: 152為IgG.IL2R67A.H1之VH鏈。
SEQ ID NO: 153為IgG.IL2R67A.H1之重鏈。
SEQ ID NO: 154為IgG.IL2R67A.H1之LCDR1 kabat。
SEQ ID NO: 155為IgG.IL2R67A.H1之LCDR2 kabat。
SEQ ID NO: 156為IgG.IL2R67A.H1之LCDR3 kabat。
SEQ ID NO: 157為IgG.IL2R67A.H1之LCDR1 chothia。
SEQ ID NO: 158為IgG.IL2R67A.H1之LCDR2 chothia。
SEQ ID NO: 159為IgG.IL2R67A.H1之LCDR3 chothia。
SEQ ID NO: 160為VL鏈。
SEQ ID NO: 161為輕鏈。
SEQ ID NO: 162為輕鏈。
SEQ ID NO: 163為輕鏈。
SEQ ID NO: 164為左CISH KO TALE核酸酶之核苷酸序列。
SEQ ID NO: 165為左CISH KO TALE核酸酶之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 166為右CISH KO TALE核酸酶之核苷酸序列。
SEQ ID NO: 167為右CISH KO TALE核酸酶之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 168為人類CISH基因中CISH TALEN KO之裂解位點的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 169為左PD-1 KO TALE核酸酶之mRNA序列。
SEQ ID NO: 170為左PD-1 KO TALE核酸酶之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 171為右PD-1 KO TALE核酸酶之mRNA序列。
SEQ ID NO: 172為右PD-1 KO TALE核酸酶之胺基酸序列。
SEQ ID NO: 173為CISH正向引子之核苷酸序列。
SEQ ID NO: 174 CISH反向引子之核苷酸序列。
SEQ ID NO: 175為人類CISH基因中CISH TALEN KO之目標位點的核苷酸序列。
 

          <![CDATA[<110>  美商艾歐凡斯生物治療公司（Iovance Biotherapeutics, Inc.）]]>
                 法商賽勒克提斯公司（Cellectis SA）
          <![CDATA[<120>  腫瘤浸潤淋巴球之CISH基因編輯及其在免疫療法中之用途]]>
          <![CDATA[<130>  116983-5082-TW]]>
          <![CDATA[<140>  TW111110643]]>
          <![CDATA[<141>  2022-03-22]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/165,066]]>
          <![CDATA[<151>  2021-03-23]]>
          <![CDATA[<160>  175   ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn第3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  450]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  莫羅單抗重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 
                  115                 120                 125             
          Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 
              130                 135                 140                 
          Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          Gly Lys 
              450 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  莫羅單抗輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 
              130                 135                 140                 
          Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 
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          Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Asn Glu Cys 
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          <![CDATA[<400>  3]]>
          Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 
          1               5                   10                  15      
          His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 
                      100                 105                 110         
          Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser 
                  115                 120                 125             
          Ile Ile Ser Thr Leu Thr 
              130                 
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  阿地介白素]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 
                      20                  25                  30          
          Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 
              50                  55                  60                  
          Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 
                          85                  90                  95      
          Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 
                      100                 105                 110         
          Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile 
                  115                 120                 125             
          Ser Thr Leu Thr 
              130         
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  130]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成重組人類IL-4]]>
          （rhIL-4）
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp 
                      20                  25                  30          
          Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr 
              50                  55                  60                  
          Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 
                          85                  90                  95      
          Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn 
                      100                 105                 110         
          Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys 
                  115                 120                 125             
          Ser Ser 
              130 
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  153]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成重組人類IL-7]]>
          （rhIL-7）
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys 
                  35                  40                  45              
          Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu 
              50                  55                  60                  
          Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln 
                          85                  90                  95      
          Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys 
                      100                 105                 110         
          Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp 
                  115                 120                 125             
          Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn 
              130                 135                 140                 
          Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 
          145                 150             
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成重組人類IL-15]]>
          （rhIL-15）
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 
                      20                  25                  30          
          His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 
                          85                  90                  95      
          Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 
                      100                 105                 110         
          Asn Thr Ser 
                  115 
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  132]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成重組人類IL-21]]>
          （rhIL-21）
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val 
          1               5                   10                  15      
          Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro 
                      20                  25                  30          
          Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys 
                  35                  40                  45              
          Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg 
              50                  55                  60                  
          Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp 
                          85                  90                  95      
          Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser 
                      100                 105                 110         
          Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser Glu Asp Ser 
              130         
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
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          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
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          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
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          <![CDATA[<400>  12]]>
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          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
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          <![CDATA[<400>  18]]>
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          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
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          <![CDATA[<400>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  21]]>
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          <![CDATA[<400>  29]]>
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          <![CDATA[<400>  30]]>
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          <![CDATA[<400>  35]]>
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          <![CDATA[<400>  38]]>
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          <![CDATA[<400>  39]]>
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          <![CDATA[<400>  89]]>
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          <![CDATA[<400>  90]]>
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          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
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          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
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          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
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          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
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          <![CDATA[<400>  95]]>
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          <![CDATA[<400>  97]]>
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          <![CDATA[<400>  98]]>
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          <![CDATA[<400>  99]]>
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          <![CDATA[<400>  100]]>
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          <![CDATA[<400>  102]]>
          000
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
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          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          000
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          000
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          000
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
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          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
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          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
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          <![CDATA[<400>  110]]>
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          <![CDATA[<210>  111]]>
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          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<400>  114]]>
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          <![CDATA[<400>  115]]>
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          <![CDATA[<210>  116]]>
          <![CDATA[<400>  116]]>
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          <![CDATA[<210>  117]]>
          <![CDATA[<400>  117]]>
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          <![CDATA[<400>  119]]>
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          <![CDATA[<400>  122]]>
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          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<400>  123]]>
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          <![CDATA[<400>  124]]>
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          <![CDATA[<210>  125]]>
          <![CDATA[<400>  125]]>
          000
          <![CDATA[<210>  126]]>
          <![CDATA[<400>  126]]>
          000
          <![CDATA[<210>  127]]>
          <![CDATA[<211>  49]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  目標PD-1序列]]>
          <![CDATA[<400>  127]]>
          ttctccccag ccctgctcgt ggtgaccgaa ggggacaacg ccaccttca                   49
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  49]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  目標PD-1序列]]>
          <![CDATA[<400>  128]]>
          tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagaga                   49
          <![CDATA[<210>  129]]>
          <![CDATA[<211>  530]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  530]]>
                 PRT
          人工序列
          合成構築體重複PD-1-左
          <![CDATA[<400>  129]]>
          Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 
                      20                  25                  30          
          His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 
              50                  55                  60                  
          Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 
                          85                  90                  95      
          Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 
                      100                 105                 110         
          Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 
                          165                 170                 175     
          Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 
                  195                 200                 205             
          Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala 
                          245                 250                 255     
          Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 
                      260                 265                 270         
          Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys 
                  275                 280                 285             
          Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 
              290                 295                 300                 
          His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 
                          325                 330                 335     
          Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His 
                      340                 345                 350         
          Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 
                  355                 360                 365             
          Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 
              370                 375                 380                 
          Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 
                          405                 410                 415     
          Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 
                      420                 425                 430         
          Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 
                  435                 440                 445             
          Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 
              450                 455                 460                 
          Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 
                          485                 490                 495     
          Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 
                      500                 505                 510         
          Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala 
                  515                 520                 525             
          Leu Glu 
              530 
          <![CDATA[<210>  130]]>
          <![CDATA[<211>  529]]>
          <![CDATA[<212>  PR]]>T
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  529]]>
                 PRT
          人工序列
          合成構築體重複PD-1右
          <![CDATA[<400>  130]]>
          Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 
                      20                  25                  30          
          His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys 
              50                  55                  60                  
          Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val 
                          85                  90                  95      
          Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 
                      100                 105                 110         
          Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 
                          165                 170                 175     
          Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 
                  195                 200                 205             
          Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala 
                          245                 250                 255     
          Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 
                      260                 265                 270         
          Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gln 
                  275                 280                 285             
          Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His 
              290                 295                 300                 
          Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 
                          325                 330                 335     
          Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 
                      340                 345                 350         
          Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 
                  355                 360                 365             
          Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile 
                          405                 410                 415     
          Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
                      420                 425                 430         
          Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val 
                  435                 440                 445             
          Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 
              450                 455                 460                 
          Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 
                          485                 490                 495     
          Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 
                      500                 505                 510         
          Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala Leu 
                  515                 520                 525             
          Glu 
          <![CDATA[<210>  131]]>
          <![CDATA[<211>  530]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  530]]>
                 PRT
          人工序列
          合成構築體重複PD-1-左
          <![CDATA[<400>  131]]>
          Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 
                      20                  25                  30          
          His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 
              50                  55                  60                  
          Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 
                          85                  90                  95      
          Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 
                      100                 105                 110         
          Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 
                          165                 170                 175     
          Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 
                  195                 200                 205             
          Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala 
                          245                 250                 255     
          Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 
                      260                 265                 270         
          Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys 
                  275                 280                 285             
          Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 
              290                 295                 300                 
          His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 
                          325                 330                 335     
          Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 
                      340                 345                 350         
          Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 
                  355                 360                 365             
          Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 
              370                 375                 380                 
          Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 
                          405                 410                 415     
          Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 
                      420                 425                 430         
          Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val 
                  435                 440                 445             
          Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 
              450                 455                 460                 
          Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 
                          485                 490                 495     
          Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 
                      500                 505                 510         
          Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala 
                  515                 520                 525             
          Leu Glu 
              530 
          <![CDATA[<210>  132]]>
          <![CDATA[<211>  529]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  529]]>
                 PRT
          人工序列
          合成構築體重複PD-1-右
          <![CDATA[<400>  132]]>
          Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 
                      20                  25                  30          
          His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 
              50                  55                  60                  
          Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 
                          85                  90                  95      
          Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 
                      100                 105                 110         
          Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 
                  115                 120                 125             
          Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val 
                          165                 170                 175     
          Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln 
                  195                 200                 205             
          Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala 
                          245                 250                 255     
          Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 
                      260                 265                 270         
          Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 
                  275                 280                 285             
          Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 
              290                 295                 300                 
          His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys 
                          325                 330                 335     
          Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 
                      340                 345                 350         
          Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 
                  355                 360                 365             
          Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala 
              370                 375                 380                 
          Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala 
                          405                 410                 415     
          Ile Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
                      420                 425                 430         
          Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val 
                  435                 440                 445             
          Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 
              450                 455                 460                 
          Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 
                          485                 490                 495     
          Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 
                      500                 505                 510         
          Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Arg Pro Ala Leu 
                  515                 520                 525             
          Glu 
          <![CDATA[<210>  133]]>
          <![CDATA[<211>  2814]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  2814]]>
                 DNA
          人工序列
          合成構築體PD-1-左TALEN 133
          <![CDATA[<400>  133]]>
          atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac       60
          gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc      120
          aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt      180
          acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc      240
          aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc      300
          ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg      360
          agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc      420
          gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac      480
          ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag      540
          acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg      600
          gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg      660
          ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat      720
          ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc      780
          cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg      840
          ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag      900
          caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg      960
          ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc     1020
          agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc     1080
          caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag     1140
          caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc     1200
          ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat attggtggca agcaggcgct ggagacggtg     1260
          caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc     1320
          atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg     1380
          ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc     1440
          ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc     1500
          ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag     1560
          acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg     1620
          gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg     1680
          ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat     1740
          ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc     1800
          cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg     1860
          ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag     1920
          caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg     1980
          ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc     2040
          agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat     2100
          ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt     2160
          cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg     2220
          aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac     2280
          gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg     2340
          aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc     2400
          aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg     2460
          gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag     2520
          aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag     2580
          gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc     2640
          aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg     2700
          tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag     2760
          gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa           2814
          <![CDATA[<210>  134]]>
          <![CDATA[<211>  2829]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  2829]]>
                 DNA
                 人工序列
          合成構築體PD-1-右TALEN 134
          <![CDATA[<400>  134]]>
          atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc       60
          gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag      120
          cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca      180
          ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg      240
          ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac      300
          gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc      360
          acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag      420
          attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg      480
          acgggtgccc cgctcaactt gaccccccag caagtcgtcg caatcgccag caataacgga      540
          gggaagcaag ccctcgaaac cgtgcagcgg ttgcttcctg tgctctgcca ggcccacggc      600
          cttacccctg agcaggtggt ggccatcgca agtaacattg gaggaaagca agccttggag      660
          acagtgcagg ccctgttgcc cgtgctgtgc caggcacacg gcctcacacc agagcaggtc      720
          gtggccattg cctccaacat cggggggaaa caggctctgg agaccgtcca ggccctgctg      780
          cccgtcctct gtcaagctca cggcctgact ccccaacaag tggtcgccat cgcctctaat      840
          aacggcggga agcaggcact ggaaacagtg cagagactgc tccctgtgct ttgccaagct      900
          catgggttga ccccccaaca ggtcgtcgct attgcctcaa acaacggggg caagcaggcc      960
          cttgagactg tgcagaggct gttgccagtg ctgtgtcagg ctcacgggct cactccacaa     1020
          caggtggtcg caattgccag caacggcggc ggaaagcaag ctcttgaaac cgtgcaacgc     1080
          ctcctgcccg tgctctgtca ggctcatggc ctgacaccac aacaagtcgt ggccatcgcc     1140
          agtaataatg gcgggaaaca ggctcttgag accgtccaga ggctgctccc agtgctctgc     1200
          caggcacacg ggctgacccc ccagcaggtg gtggctatcg ccagcaataa tgggggcaag     1260
          caggccctgg aaacagtcca gcgcctgctg ccagtgcttt gccaggctca cgggctcact     1320
          cccgaacagg tcgtggcaat cgcctccaac ggagggaagc aggctctgga gaccgtgcag     1380
          agactgctgc ccgtcttgtg ccaggcccac ggactcacac ctcagcaggt cgtcgccatt     1440
          gcctctaaca acgggggcaa acaagccctg gagacagtgc agcggctgtt gcctgtgttg     1500
          tgccaagccc acggcttgac tcctcaacaa gtggtcgcca tcgcctcaaa tggcggcgga     1560
          aaacaagctc tggagacagt gcagaggttg ctgcccgtcc tctgccaagc ccacggcctg     1620
          actccccaac aggtcgtcgc cattgccagc aacggcggag gaaagcaggc tctcgaaact     1680
          gtgcagcggc tgcttcctgt gctgtgtcag gctcatgggc tgacccccca gcaagtggtg     1740
          gctattgcct ctaacaatgg aggcaagcaa gcccttgaga cagtccagag gctgttgcca     1800
          gtgctgtgcc aggcccacgg gctcacaccc cagcaggtgg tcgccatcgc cagtaacggc     1860
          gggggcaaac aggcattgga aaccgtccag cgcctgcttc cagtgctctg ccaggcacac     1920
          ggactgacac ccgaacaggt ggtggccatt gcatcccatg atgggggcaa gcaggccctg     1980
          gagaccgtgc agagactcct gccagtgttg tgccaagctc acggcctcac ccctcagcaa     2040
          gtcgtggcca tcgcctcaaa cggggggggc cggcctgcac tggagagcat tgttgcccag     2100
          ttatctcgcc ctgatccggc gttggccgcg ttgaccaacg accacctcgt cgccttggcc     2160
          tgcctcggcg ggcgtcctgc gctggatgca gtgaaaaagg gattggggga tcctatcagc     2220
          cgttcccagc tggtgaagtc cgagctggag gagaagaaat ccgagttgag gcacaagctg     2280
          aagtacgtgc cccacgagta catcgagctg atcgagatcg cccggaacag cacccaggac     2340
          cgtatcctgg agatgaaggt gatggagttc ttcatgaagg tgtacggcta caggggcaag     2400
          cacctgggcg gctccaggaa gcccgacggc gccatctaca ccgtgggctc ccccatcgac     2460
          tacggcgtga tcgtggacac caaggcctac tccggcggct acaacctgcc catcggccag     2520
          gccgacgaaa tgcagaggta cgtggaggag aaccagacca ggaacaagca catcaacccc     2580
          aacgagtggt ggaaggtgta cccctccagc gtgaccgagt tcaagttcct gttcgtgtcc     2640
          ggccacttca agggcaacta caaggcccag ctgaccaggc tgaaccacat caccaactgc     2700
          aacggcgccg tgctgtccgt ggaggagctc ctgatcggcg gcgagatgat caaggccggc     2760
          accctgaccc tggaggaggt gaggaggaag ttcaacaacg gcgagatcaa cttcgcggcc     2820
          gactgataa                                                             2829
          <![CDATA[<210>  135]]>
          <![CDATA[<211>  2814]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  2814]]>
                 DNA
          人工序列
          合成構築體PD-1-左TALEN 135
          <![CDATA[<400>  135]]>
          atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac       60
          gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc      120
          aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt      180
          acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc      240
          aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc      300
          ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg      360
          agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc      420
          gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac      480
          ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag      540
          acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg      600
          gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg      660
          ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac      720
          gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc      780
          cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg      840
          ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag      900
          caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg      960
          ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc     1020
          agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc     1080
          caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag     1140
          caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc     1200
          ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc     1260
          cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc     1320
          atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg     1380
          ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caataatggt     1440
          ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc     1500
          ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag     1560
          acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg     1620
          gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg     1680
          ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac     1740
          gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc     1800
          cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg     1860
          ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag     1920
          caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg     1980
          ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc     2040
          agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat     2100
          ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt     2160
          cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg     2220
          aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac     2280
          gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg     2340
          aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc     2400
          aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg     2460
          gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag     2520
          aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag     2580
          gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc     2640
          aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg     2700
          tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag     2760
          gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa           2814
          <![CDATA[<210>  136]]>
          <![CDATA[<211>  2829]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  2829]]>
                 DNA
                 人工序列
          合成構築體PD-1-右TALEN 136
          <![CDATA[<400>  136]]>
          atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc       60
          gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag      120
          cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca      180
          ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg      240
          ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac      300
          gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc      360
          acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag      420
          attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcagtg gaggcagtgc atgcatggcg caatgcactg      480
          acgggtgccc cgctcaactt gacccccgag caagtcgtcg caatcgccag ccatgatgga      540
          gggaagcaag ccctcgaaac cgtgcagcgg ttgcttcctg tgctctgcca ggcccacggc      600
          cttacccctc agcaggtggt ggccatcgca agtaacggag gaggaaagca agccttggag      660
          acagtgcagc gcctgttgcc cgtgctgtgc caggcacacg gcctcacacc agagcaggtc      720
          gtggccattg cctcccatga cggggggaaa caggctctgg agaccgtcca gaggctgctg      780
          cccgtcctct gtcaagctca cggcctgact ccccaacaag tggtcgccat cgcctctaat      840
          ggcggcggga agcaggcact ggaaacagtg cagagactgc tccctgtgct ttgccaagct      900
          catgggttga ccccccaaca ggtcgtcgct attgcctcaa acgggggggg caagcaggcc      960
          cttgagactg tgcagaggct gttgccagtg ctgtgtcagg ctcacgggct cactccacaa     1020
          caggtggtcg caattgccag caacggcggc ggaaagcaag ctcttgaaac cgtgcaacgc     1080
          ctcctgcccg tgctctgtca ggctcatggc ctgacaccac aacaagtcgt ggccatcgcc     1140
          agtaataatg gcgggaaaca ggctcttgag accgtccaga ggctgctccc agtgctctgc     1200
          caggcacacg ggctgacccc cgagcaggtg gtggctatcg ccagcaatat tgggggcaag     1260
          caggccctgg aaacagtcca ggccctgctg ccagtgcttt gccaggctca cgggctcact     1320
          ccccagcagg tcgtggcaat cgcctccaac ggcggaggga agcaggctct ggagaccgtg     1380
          cagagactgc tgcccgtctt gtgccaggcc cacggactca cacctgaaca ggtcgtcgcc     1440
          attgcctctc acgatggggg caaacaagcc ctggagacag tgcagcggct gttgcctgtg     1500
          ttgtgccaag cccacggctt gactcctcaa caagtggtcg ccatcgcctc aaatggcggc     1560
          ggaaaacaag ctctggagac agtgcagagg ttgctgcccg tcctctgcca agcccacggc     1620
          ctgactcccc aacaggtcgt cgccattgcc agcaacaacg gaggaaagca ggctctcgaa     1680
          actgtgcagc ggctgcttcc tgtgctgtgt caggctcatg ggctgacccc cgagcaagtg     1740
          gtggctattg cctctaatgg aggcaagcaa gcccttgaga cagtccagag gctgttgcca     1800
          gtgctgtgcc aggcccacgg gctcacaccc cagcaggtgg tcgccatcgc cagtaacaac     1860
          gggggcaaac aggcattgga aaccgtccag cgcctgcttc cagtgctctg ccaggcacac     1920
          ggactgacac ccgaacaggt ggtggccatt gcatcccatg atgggggcaa gcaggccctg     1980
          gagaccgtgc agagactcct gccagtgttg tgccaagctc acggcctcac ccctcagcaa     2040
          gtcgtggcca tcgcctcaaa cggggggggc cggcctgcac tggagagcat tgttgcccag     2100
          ttatctcgcc ctgatccggc gttggccgcg ttgaccaacg accacctcgt cgccttggcc     2160
          tgcctcggcg ggcgtcctgc gctggatgca gtgaaaaagg gattggggga tcctatcagc     2220
          cgttcccagc tggtgaagtc cgagctggag gagaagaaat ccgagttgag gcacaagctg     2280
          aagtacgtgc cccacgagta catcgagctg atcgagatcg cccggaacag cacccaggac     2340
          cgtatcctgg agatgaaggt gatggagttc ttcatgaagg tgtacggcta caggggcaag     2400
          cacctgggcg gctccaggaa gcccgacggc gccatctaca ccgtgggctc ccccatcgac     2460
          tacggcgtga tcgtggacac caaggcctac tccggcggct acaacctgcc catcggccag     2520
          gccgacgaaa tgcagaggta cgtggaggag aaccagacca ggaacaagca catcaacccc     2580
          aacgagtggt ggaaggtgta cccctccagc gtgaccgagt tcaagttcct gttcgtgtcc     2640
          ggccacttca agggcaacta caaggcccag ctgaccaggc tgaaccacat caccaactgc     2700
          aacggcgccg tgctgtccgt ggaggagctc ctgatcggcg gcgagatgat caaggccggc     2760
          accctgaccc tggaggaggt gaggaggaag ttcaacaacg gcgagatcaa cttcgcggcc     2820
          gactgataa                                                             2829
          <![CDATA[<210>  137]]>
          <![CDATA[<211>  153]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL-2]]>
          <![CDATA[<400>  137]]>
          Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 
                      20                  25                  30          
          Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 
                  35                  40                  45              
          Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 
                          85                  90                  95      
          Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 
                      100                 105                 110         
          Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 
                  115                 120                 125             
          Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 
              130                 135                 140                 
          Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 
          145                 150             
          <![CDATA[<210>  138]]>
          <![CDATA[<211>  133]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL-2突變蛋白]]>
          <![CDATA[<400>  138]]>
          Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 
                      20                  25                  30          
          Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 
                          85                  90                  95      
          Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 
                      100                 105                 110         
          Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 
                  115                 120                 125             
          Ile Ser Thr Leu Thr 
              130             
          <![CDATA[<210>  139]]>
          <![CDATA[<211>  133]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IL-2突變蛋白]]>
          <![CDATA[<400>  139]]>
          Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 
                      20                  25                  30          
          Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 
                          85                  90                  95      
          Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 
                      100                 105                 110         
          Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 
                  115                 120                 125             
          Ile Ser Thr Leu Thr 
              130             
          <![CDATA[<210>  140]]>
          <![CDATA[<211>  145]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR1_IL-2]]>
          <![CDATA[<400>  140]]>
          Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe 
                  35                  40                  45              
          Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 
                  115                 120                 125             
          Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val 
              130                 135                 140                 
          Gly 
          145 
          <![CDATA[<210>  141]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR2]]>
          <![CDATA[<400>  141]]>
          Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  142]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR3]]>
          <![CDATA[<400>  142]]>
          Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  143]]>
          <![CDATA[<211>  91]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR1_IL-2 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  143]]>
          Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu 
          1               5                   10                  15      
          Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 
                      20                  25                  30          
          Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly 
                  35                  40                  45              
          Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile 
              50                  55                  60                  
          Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly 
                          85                  90      
          <![CDATA[<210>  144]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR2 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  144]]>
          Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  145]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR3 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  145]]>
          Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  146]]>
          <![CDATA[<211>  142]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR1_IL-2 clothia]]>
          <![CDATA[<400>  146]]>
          Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe 
                  35                  40                  45              
          Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 
                  115                 120                 125             
          Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met 
              130                 135                 140         
          <![CDATA[<210>  147]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR2 clothia]]>
          <![CDATA[<400>  147]]>
          Trp Trp Asp Asp Lys 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  148]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR3 clothia]]>
          <![CDATA[<400>  148]]>
          Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  149]]>
          <![CDATA[<211>  143]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR1_IL-2 IMGT]]>
          <![CDATA[<400>  149]]>
          Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe 
                  35                  40                  45              
          Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 
              50                  55                  60                  
          Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 
                          85                  90                  95      
          Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 
                      100                 105                 110         
          Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 
                  115                 120                 125             
          Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser 
              130                 135                 140             
          <![CDATA[<210>  150]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR2 IMGT]]>
          <![CDATA[<400>  150]]>
          Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  151]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HCDR3 IMGT]]>
          <![CDATA[<400>  151]]>
          Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  152]]>
          <![CDATA[<211>  253]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  VH]]>
          <![CDATA[<400>  152]]>
          Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr 
                      20                  25                  30          
          Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val 
              130                 135                 140                 
          Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr 
                  195                 200                 205             
          Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp 
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                          245                 250             
          <![CDATA[<210>  153]]>
          <![CDATA[<211>  533]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  153]]>
          Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu 
                      20                  25                  30          
          Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val 
                  35                  40                  45              
          Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu 
              50                  55                  60                  
          Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe 
                          85                  90                  95      
          Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 
                  115                 120                 125             
          Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr 
              130                 135                 140                 
          Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala 
                          165                 170                 175     
          Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val 
                      180                 185                 190         
          Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 
                          245                 250                 255     
          Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 
                      260                 265                 270         
          Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 
              290                 295                 300                 
          Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                          325                 330                 335     
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val 
                      340                 345                 350         
          Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
                  355                 360                 365             
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 
              370                 375                 380                 
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala 
                          405                 410                 415     
          Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                      420                 425                 430         
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
                  435                 440                 445             
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
              450                 455                 460                 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
                          485                 490                 495     
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                      500                 505                 510         
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
                  515                 520                 525             
          Leu Ser Pro Gly Lys 
              530             
          <![CDATA[<210>  154]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  LCDR1 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  154]]>
          Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  155]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  LCDR2 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  155]]>
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  156]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  LCDR3 kabat]]>
          <![CDATA[<400>  156]]>
          Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  157]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  LCDR1 chot]]>hia
          <![CDATA[<400>  157]]>
          Gln Leu Ser Val Gly Tyr 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  158]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  LCDR2 chothia]]>
          <![CDATA[<400>  158]]>
          Asp Thr Ser 
          1           
          <![CDATA[<210>  159]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  LCDR3 chothia]]>
          <![CDATA[<400>  159]]>
          Gly Ser Gly Tyr Pro Phe 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  160]]>
          <![CDATA[<211>  106]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  VL]]>
          <![CDATA[<400>  160]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210>  161]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  161]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Gly Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  162]]>
          <![CDATA[<211>  583]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  162]]>
          Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ala Pro Thr 
                      20                  25                  30          
          Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys 
              50                  55                  60                  
          Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val 
              130                 135                 140                 
          Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys 
                      180                 185                 190         
          Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr 
                  195                 200                 205             
          Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp 
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 
                          245                 250                 255     
          Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 
                      260                 265                 270         
          Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 
                  275                 280                 285             
          Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 
              290                 295                 300                 
          Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 
                          325                 330                 335     
          Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 
                      340                 345                 350         
          Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                  355                 360                 365             
          Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
              370                 375                 380                 
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 
                      420                 425                 430         
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                  435                 440                 445             
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 
              450                 455                 460                 
          Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
          465                 470                 475                 480 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 
                          485                 490                 495     
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                      500                 505                 510         
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                  515                 520                 525             
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
              530                 535                 540                 
          Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 
          545                 550                 555                 560 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
                          565                 570                 575     
          Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                      580             
          <![CDATA[<210>  163]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈]]>
          <![CDATA[<400> ]]> 163
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 
                      20                  25                  30          
          His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Gly Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  164]]>
          <![CDATA[<211>  2781]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  左CISH KO TALEN]]>
          pCLS34485 CISHe3_9-L1
          核苷酸序列
          <![CDATA[<400>  164]]>
          atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgatatcg ccgatctacg cacgctcggc       60
          tacagccagc agcaacagga gaagatcaaa ccgaaggttc gttcgacagt ggcgcagcac      120
          cacgaggcac tggtcggcca cgggtttaca cacgcgcaca tcgttgcgtt aagccaacac      180
          ccggcagcgt tagggaccgt cgctgtcaag tatcaggaca tgatcgcagc gttgccagag      240
          gcgacacacg aagcgatcgt tggcgtcggc aaacagtggt ccggcgcacg cgctctggag      300
          gccttgctca cggtggcggg agagttgaga ggtccaccgt tacagttgga cacaggccaa      360
          cttctcaaga ttgcaaaacg tggcggcgtg accgcagtgg aggcagtgca tgcatggcgc      420
          aatgcactga cgggtgcccc gctcaacttg accccccagc aggtggtggc catcgccagc      480
          aataatggtg gcaagcaggc gctggagacg gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag      540
          gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg gccatcgcca gccacgatgg cggcaagcag      600
          gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc      660
          cagcaggtgg tggccatcgc cagcaataat ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag      720
          cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cggagcaggt ggtggccatc      780
          gccagccacg atggcggcaa gcaggcgctg gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg      840
          tgccaggccc acggcttgac cccggagcag gtggtggcca tcgccagcca cgatggcggc      900
          aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg      960
          accccccagc aggtggtggc catcgccagc aatggcggtg gcaagcaggc gctggagacg     1020
          gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg     1080
          gccatcgcca gcaatattgg tggcaagcag gcgctggaga cggtgcaggc gctgttgccg     1140
          gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc cagcaggtgg tggccatcgc cagcaataat     1200
          ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac     1260
          ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc gccagcaatg gcggtggcaa gcaggcgctg     1320
          gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg tgccaggccc acggcttgac cccccagcag     1380
          gtggtggcca tcgccagcaa taatggtggc aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg     1440
          ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg accccggagc aggtggtggc catcgccagc     1500
          aatattggtg gcaagcaggc gctggagacg gtgcaggcgc tgttgccggt gctgtgccag     1560
          gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg gccatcgcca gccacgatgg cggcaagcag     1620
          gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccg     1680
          gagcaggtgg tggccatcgc cagccacgat ggcggcaagc aggcgctgga gacggtccag     1740
          cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cggagcaggt ggtggccatc     1800
          gccagccacg atggcggcaa gcaggcgctg gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg     1860
          tgccaggccc acggcttgac cccggagcag gtggtggcca tcgccagcaa tattggtggc     1920
          aagcaggcgc tggagacggt gcaggcgctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg     1980
          acccctcagc aggtggtggc catcgccagc aatggcggcg gcaggccggc gctggagagc     2040
          attgttgccc agttatctcg ccctgatccg gcgttggccg cgttgaccaa cgaccacctc     2100
          gtcgccttgg cctgcctcgg cgggcgtcct gcgctggatg cagtgaaaaa gggattgggg     2160
          gatcctatca gccgttccca gctggtgaag tccgagctgg aggagaagaa atccgagttg     2220
          aggcacaagc tgaagtacgt gccccacgag tacatcgagc tgatcgagat cgcccggaac     2280
          agcacccagg accgtatcct ggagatgaag gtgatggagt tcttcatgaa ggtgtacggc     2340
          tacaggggca agcacctggg cggctccagg aagcccgacg gcgccatcta caccgtgggc     2400
          tcccccatcg actacggcgt gatcgtggac accaaggcct actccggcgg ctacaacctg     2460
          cccatcggcc aggccgacga aatgcagagg tacgtggagg agaaccagac caggaacaag     2520
          cacatcaacc ccaacgagtg gtggaaggtg tacccctcca gcgtgaccga gttcaagttc     2580
          ctgttcgtgt ccggccactt caagggcaac tacaaggccc agctgaccag gctgaaccac     2640
          atcaccaact gcaacggcgc cgtgctgtcc gtggaggagc tcctgatcgg cggcgagatg     2700
          atcaaggccg gcaccctgac cctggaggag gtgaggagga agttcaacaa cggcgagatc     2760
          aacttcgcgg ccgactgata a                                               2781
          <![CDATA[<210>  165]]>
          <![CDATA[<211>  925]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  左CISH KO TALEN pCLS34485 CISHe3_9-L1胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  165]]>
          Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly 
                  35                  40                  45              
          Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro 
                      100                 105                 110         
          Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile 
                      180                 185                 190         
          Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
                  195                 200                 205             
          Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val 
              210                 215                 220                 
          Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln 
                          245                 250                 255     
          Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 
                      260                 265                 270         
          Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 
                  275                 280                 285             
          Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu 
              290                 295                 300                 
          Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln 
                          325                 330                 335     
          Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His 
                      340                 345                 350         
          Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly 
                  355                 360                 365             
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 
              370                 375                 380                 
          Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 
                          405                 410                 415     
          Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
                      420                 425                 430         
          Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 
                  435                 440                 445             
          Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile 
              450                 455                 460                 
          Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val 
                          485                 490                 495     
          Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 
                      500                 505                 510         
          Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln 
                  515                 520                 525             
          Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 
              530                 535                 540                 
          Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu 
                          565                 570                 575     
          Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 
                      580                 585                 590         
          Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln 
                  595                 600                 605             
          Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His 
              610                 615                 620                 
          Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 
                          645                 650                 655     
          Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 
                      660                 665                 670         
          Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro 
                  675                 680                 685             
          Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala 
              690                 695                 700                 
          Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly 
          705                 710                 715                 720 
          Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys 
                          725                 730                 735     
          Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile 
                      740                 745                 750         
          Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu 
                  755                 760                 765             
          Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys 
              770                 775                 780                 
          His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly 
          785                 790                 795                 800 
          Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly 
                          805                 810                 815     
          Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val 
                      820                 825                 830         
          Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp 
                  835                 840                 845             
          Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser 
              850                 855                 860                 
          Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile 
                          885                 890                 895     
          Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg 
                      900                 905                 910         
          Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp 
                  915                 920                 925 
          <![CDATA[<210>  166]]>
          <![CDATA[<211>  2781]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  右CISH KO]]>
          TALEN
          pCLS34486
          CISHe3_9-R1核苷酸序列
          <![CDATA[<400>  166]]>
          atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgatatcg ccgatctacg cacgctcggc       60
          tacagccagc agcaacagga gaagatcaaa ccgaaggttc gttcgacagt ggcgcagcac      120
          cacgaggcac tggtcggcca cgggtttaca cacgcgcaca tcgttgcgtt aagccaacac      180
          ccggcagcgt tagggaccgt cgctgtcaag tatcaggaca tgatcgcagc gttgccagag      240
          gcgacacacg aagcgatcgt tggcgtcggc aaacagtggt ccggcgcacg cgctctggag      300
          gccttgctca cggtggcggg agagttgaga ggtccaccgt tacagttgga cacaggccaa      360
          cttctcaaga ttgcaaaacg tggcggcgtg accgcagtgg aggcagtgca tgcatggcgc      420
          aatgcactga cgggtgcccc gctcaacttg accccggagc aggtggtggc catcgccagc      480
          aatattggtg gcaagcaggc gctggagacg gtgcaggcgc tgttgccggt gctgtgccag      540
          gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg gccatcgcca gccacgatgg cggcaagcag      600
          gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccg      660
          gagcaggtgg tggccatcgc cagcaatatt ggtggcaagc aggcgctgga gacggtgcag      720
          gcgctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc      780
          gccagcaata atggtggcaa gcaggcgctg gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg      840
          tgccaggccc acggcttgac cccggagcag gtggtggcca tcgccagcca cgatggcggc      900
          aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg      960
          accccggagc aggtggtggc catcgccagc aatattggtg gcaagcaggc gctggagacg     1020
          gtgcaggcgc tgttgccggt gctgtgccag gcccacggct tgacccccca gcaggtggtg     1080
          gccatcgcca gcaataatgg tggcaagcag gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg     1140
          gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc cagcaggtgg tggccatcgc cagcaatggc     1200
          ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac     1260
          ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc gccagcaata atggtggcaa gcaggcgctg     1320
          gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg tgccaggccc acggcttgac cccccagcag     1380
          gtggtggcca tcgccagcaa taatggtggc aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg     1440
          ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg accccggagc aggtggtggc catcgccagc     1500
          cacgatggcg gcaagcaggc gctggagacg gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag     1560
          gcccacggct tgacccccca gcaggtggtg gccatcgcca gcaatggcgg tggcaagcag     1620
          gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc     1680
          cagcaggtgg tggccatcgc cagcaataat ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag     1740
          cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc     1800
          gccagcaata atggtggcaa gcaggcgctg gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg     1860
          tgccaggccc acggcttgac cccccagcag gtggtggcca tcgccagcaa tggcggtggc     1920
          aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg     1980
          acccctcagc aggtggtggc catcgccagc aatggcggcg gcaggccggc gctggagagc     2040
          attgttgccc agttatctcg ccctgatccg gcgttggccg cgttgaccaa cgaccacctc     2100
          gtcgccttgg cctgcctcgg cgggcgtcct gcgctggatg cagtgaaaaa gggattgggg     2160
          gatcctatca gccgttccca gctggtgaag tccgagctgg aggagaagaa atccgagttg     2220
          aggcacaagc tgaagtacgt gccccacgag tacatcgagc tgatcgagat cgcccggaac     2280
          agcacccagg accgtatcct ggagatgaag gtgatggagt tcttcatgaa ggtgtacggc     2340
          tacaggggca agcacctggg cggctccagg aagcccgacg gcgccatcta caccgtgggc     2400
          tcccccatcg actacggcgt gatcgtggac accaaggcct actccggcgg ctacaacctg     2460
          cccatcggcc aggccgacga aatgcagagg tacgtggagg agaaccagac caggaacaag     2520
          cacatcaacc ccaacgagtg gtggaaggtg tacccctcca gcgtgaccga gttcaagttc     2580
          ctgttcgtgt ccggccactt caagggcaac tacaaggccc agctgaccag gctgaaccac     2640
          atcaccaact gcaacggcgc cgtgctgtcc gtggaggagc tcctgatcgg cggcgagatg     2700
          atcaaggccg gcaccctgac cctggaggag gtgaggagga agttcaacaa cggcgagatc     2760
          aacttcgcgg ccgactgata a                                               2781
          <![CDATA[<210>  167]]>
          <![CDATA[<211>  925]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  右CISH KO TALEN]]>
          pCLS34486
          CISHe3_9-R1
          胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  167]]>
          Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly 
                  35                  40                  45              
          Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro 
                      100                 105                 110         
          Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile 
                      180                 185                 190         
          Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
                  195                 200                 205             
          Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val 
              210                 215                 220                 
          Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln 
                          245                 250                 255     
          Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 
                      260                 265                 270         
          Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 
                  275                 280                 285             
          Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu 
              290                 295                 300                 
          Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys Gln 
                          325                 330                 335     
          Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His 
                      340                 345                 350         
          Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly 
                  355                 360                 365             
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 
              370                 375                 380                 
          Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 
                          405                 410                 415     
          Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
                      420                 425                 430         
          Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 
                  435                 440                 445             
          Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile 
              450                 455                 460                 
          Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val 
                          485                 490                 495     
          Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 
                      500                 505                 510         
          Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln 
                  515                 520                 525             
          Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 
              530                 535                 540                 
          Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu 
                          565                 570                 575     
          Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 
                      580                 585                 590         
          Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln 
                  595                 600                 605             
          Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His 
              610                 615                 620                 
          Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 
                          645                 650                 655     
          Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 
                      660                 665                 670         
          Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro 
                  675                 680                 685             
          Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala 
              690                 695                 700                 
          Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly 
          705                 710                 715                 720 
          Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys 
                          725                 730                 735     
          Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile 
                      740                 745                 750         
          Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu 
                  755                 760                 765             
          Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys 
              770                 775                 780                 
          His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly 
          785                 790                 795                 800 
          Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly 
                          805                 810                 815     
          Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val 
                      820                 825                 830         
          Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp 
                  835                 840                 845             
          Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser 
              850                 855                 860                 
          Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile 
                          885                 890                 895     
          Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg 
                      900                 905                 910         
          Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp 
                  915                 920                 925 
          <![CDATA[<210>  168]]>
          <![CDATA[<211>  49]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CISH KO裂解位點序列]]>
          CISHe3_9.1
          核苷酸序列
          <![CDATA[<400>  168]]>
          tgcgcctagt gacccagcac tgcctgctcc tccaccagcc actgctgta                   49
          <![CDATA[<210>  169]]>
          <![CDATA[<211>  2781]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  左PD-1 KO TALEN]]>
           mRNA序列
          （pCLS29259）
          <![CDATA[<400>  169]]>
          atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgatatcg ccgatctacg cacgctcggc       60
          tacagccagc agcaacagga gaagatcaaa ccgaaggttc gttcgacagt ggcgcagcac      120
          cacgaggcac tggtcggcca cgggtttaca cacgcgcaca tcgttgcgtt aagccaacac      180
          ccggcagcgt tagggaccgt cgctgtcaag tatcaggaca tgatcgcagc gttgccagag      240
          gcgacacacg aagcgatcgt tggcgtcggc aaacagtggt ccggcgcacg cgctctggag      300
          gccttgctca cggtggcggg agagttgaga ggtccaccgt tacagttgga cacaggccaa      360
          cttctcaaga ttgcaaaacg tggcggcgtg accgcagtgg aggcagtgca tgcatggcgc      420
          aatgcactga cgggtgcccc gctcaacttg acccccgagc aagtggtggc tatcgcttcc      480
          aagctggggg gaaagcaggc cctggagacc gtccaggccc ttctcccagt gctttgccag      540
          gctcacggac tgacccctga acaggtggtg gcaattgcct cacacgacgg gggcaagcag      600
          gcactggaga ctgtccagcg gctgctgcct gtcctctgcc aggcccacgg actcactcct      660
          gagcaggtcg tggccattgc cagccacgat gggggcaaac aggctctgga gaccgtgcag      720
          cgcctcctcc cagtgctgtg ccaggctcat gggctgaccc cacagcaggt cgtcgccatt      780
          gccagtaacg gcggggggaa gcaggccctc gaaacagtgc agaggctgct gcccgtcttg      840
          tgccaagcac acggcctgac acccgagcag gtggtggcca tcgcctctca tgacggcggc      900
          aagcaggccc ttgagacagt gcagagactg ttgcccgtgt tgtgtcaggc ccacgggttg      960
          acaccccagc aggtggtcgc catcgccagc aatggcgggg gaaagcaggc ccttgagacc     1020
          gtgcagcggt tgcttccagt gttgtgccag gcacacggac tgacccctca acaggtggtc     1080
          gcaatcgcca gctacaaggg cggaaagcag gctctggaga cagtgcagcg cctcctgccc     1140
          gtgctgtgtc aggctcacgg actgacacca cagcaggtgg tcgccatcgc cagtaacggg     1200
          ggcggcaagc aggctttgga gaccgtccag agactcctcc ccgtcctttg ccaggcccac     1260
          gggttgacac ctcagcaggt cgtcgccatt gcctccaaca acgggggcaa gcaggccctc     1320
          gaaactgtgc agaggctgct gcctgtgctg tgccaggctc atgggctgac accccagcag     1380
          gtggtggcca ttgcctctaa caacggcggc aaacaggcac tggagaccgt gcaaaggctg     1440
          ctgcccgtcc tctgccaagc ccacgggctc actccacagc aggtcgtggc catcgcctca     1500
          aacaatggcg ggaagcaggc cctggagact gtgcaaaggc tgctccctgt gctctgccag     1560
          gcacacggac tgacccctca gcaggtggtg gcaatcgctt ccaacaacgg gggaaagcag     1620
          gccctcgaaa ccgtgcagcg cctcctccca gtgctgtgcc aggcacatgg cctcacaccc     1680
          gagcaagtgg tggctatcgc cagccacgac ggagggaagc aggctctgga gaccgtgcag     1740
          aggctgctgc ctgtcctgtg ccaggcccac gggcttactc cagagcaggt cgtcgccatc     1800
          gccagtcatg atggggggaa gcaggccctt gagacagtcc agcggctgct gccagtcctt     1860
          tgccaggctc acggcttgac tcccgagcag gtcgtggcca ttgcctcaaa cattgggggc     1920
          aaacaggccc tggagacagt gcaggccctg ctgcccgtgt tgtgtcaggc ccacggcttg     1980
          acaccccagc aggtggtcgc cattgcctct aatggcggcg ggagacccgc cttggagagc     2040
          attgttgccc agttatctcg ccctgatccg gcgttggccg cgttgaccaa cgaccacctc     2100
          gtcgccttgg cctgcctcgg cgggcgtcct gcgctggatg cagtgaaaaa gggattgggg     2160
          gatcctatca gccgttccca gctggtgaag tccgagctgg aggagaagaa atccgagttg     2220
          aggcacaagc tgaagtacgt gccccacgag tacatcgagc tgatcgagat cgcccggaac     2280
          agcacccagg accgtatcct ggagatgaag gtgatggagt tcttcatgaa ggtgtacggc     2340
          tacaggggca agcacctggg cggctccagg aagcccgacg gcgccatcta caccgtgggc     2400
          tcccccatcg actacggcgt gatcgtggac accaaggcct actccggcgg ctacaacctg     2460
          cccatcggcc aggccgacga aatgcagagg tacgtggagg agaaccagac caggaacaag     2520
          cacatcaacc ccaacgagtg gtggaaggtg tacccctcca gcgtgaccga gttcaagttc     2580
          ctgttcgtgt ccggccactt caagggcaac tacaaggccc agctgaccag gctgaaccac     2640
          atcaccaact gcaacggcgc cgtgctgtcc gtggaggagc tcctgatcgg cggcgagatg     2700
          atcaaggccg gcaccctgac cctggaggag gtgaggagga agttcaacaa cggcgagatc     2760
          aacttcgcgg ccgactgata a                                               2781
          <![CDATA[<210>  170]]>
          <![CDATA[<211>  925]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  左PD-1 KO TALEN]]>
          胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  170]]>
          Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly 
                  35                  40                  45              
          Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro 
                      100                 105                 110         
          Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Leu Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile 
                      180                 185                 190         
          Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
                  195                 200                 205             
          Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val 
              210                 215                 220                 
          Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln 
                          245                 250                 255     
          Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 
                      260                 265                 270         
          Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 
                  275                 280                 285             
          Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu 
              290                 295                 300                 
          Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln 
                          325                 330                 335     
          Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His 
                      340                 345                 350         
          Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Tyr Lys Gly Gly 
                  355                 360                 365             
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 
              370                 375                 380                 
          Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu 
                          405                 410                 415     
          Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
                      420                 425                 430         
          Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 
                  435                 440                 445             
          Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile 
              450                 455                 460                 
          Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val 
                          485                 490                 495     
          Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 
                      500                 505                 510         
          Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln 
                  515                 520                 525             
          Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 
              530                 535                 540                 
          Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu 
                          565                 570                 575     
          Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 
                      580                 585                 590         
          Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln 
                  595                 600                 605             
          Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His 
              610                 615                 620                 
          Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 
                          645                 650                 655     
          Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 
                      660                 665                 670         
          Gly Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro 
                  675                 680                 685             
          Asp Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala 
              690                 695                 700                 
          Cys Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly 
          705                 710                 715                 720 
          Asp Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys 
                          725                 730                 735     
          Lys Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile 
                      740                 745                 750         
          Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu 
                  755                 760                 765             
          Met Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys 
              770                 775                 780                 
          His Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly 
          785                 790                 795                 800 
          Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly 
                          805                 810                 815     
          Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val 
                      820                 825                 830         
          Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp 
                  835                 840                 845             
          Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser 
              850                 855                 860                 
          Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile 
                          885                 890                 895     
          Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg 
                      900                 905                 910         
          Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp 
                  915                 920                 925 
          <![CDATA[<210>  171]]>
          <![CDATA[<211>  2778]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  右PD-1 KO TALEN]]>
          mRNA序列
          （pCLS25171）
          <![CDATA[<400> ]]> 171
          atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgatatcg ccgatctacg cacgctcggc       60
          tacagccagc agcaacagga gaagatcaaa ccgaaggttc gttcgacagt ggcgcagcac      120
          cacgaggcac tggtcggcca cgggtttaca cacgcgcaca tcgttgcgtt aagccaacac      180
          ccggcagcgt tagggaccgt cgctgtcaag tatcaggaca tgatcgcagc gttgccagag      240
          gcgacacacg aagcgatcgt tggcgtcggc aaacagtggt ccggcgcacg cgctctggag      300
          gccttgctca cggtggcggg agagttgaga ggtccaccgt tacagttgga cacaggccaa      360
          cttctcaaga ttgcaaaacg tggcggcgtg accgcagtgg aggcagtgca tgcatggcgc      420
          aatgcactga cgggtgcccc gctcaacttg acccccgagc aagtcgtcgc aatcgccagc      480
          catgatggag ggaagcaagc cctcgaaacc gtgcagcggt tgcttcctgt gctctgccag      540
          gcccacggcc ttacccctca gcaggtggtg gccatcgcaa gtaacggagg aggaaagcaa      600
          gccttggaga cagtgcagcg cctgttgccc gtgctgtgcc aggcacacgg cctcacacca      660
          gagcaggtcg tggccattgc ctcccatgac ggggggaaac aggctctgga gaccgtccag      720
          aggctgctgc ccgtcctctg tcaagctcac ggcctgactc cccaacaagt ggtcgccatc      780
          gcctctaatg gcggcgggaa gcaggcactg gaaacagtgc agagactgct ccctgtgctt      840
          tgccaagctc atgggttgac cccccaacag gtcgtcgcta ttgcctcaaa cggggggggc      900
          aagcaggccc ttgagactgt gcagaggctg ttgccagtgc tgtgtcaggc tcacgggctc      960
          actccacaac aggtggtcgc aattgccagc aacggcggcg gaaagcaagc tcttgaaacc     1020
          gtgcaacgcc tcctgcccgt gctctgtcag gctcatggcc tgacaccaca acaagtcgtg     1080
          gccatcgcca gtaataatgg cgggaaacag gctcttgaga ccgtccagag gctgctccca     1140
          gtgctctgcc aggcacacgg gctgaccccc gagcaggtgg tggctatcgc cagcaatatt     1200
          gggggcaagc aggccctgga aacagtccag gccctgctgc cagtgctttg ccaggctcac     1260
          gggctcactc cccagcaggt cgtggcaatc gcctccaacg gcggagggaa gcaggctctg     1320
          gagaccgtgc agagactgct gcccgtcttg tgccaggccc acggactcac acctgaacag     1380
          gtcgtcgcca ttgcctctca cgatgggggc aaacaagccc tggagacagt gcagcggctg     1440
          ttgcctgtgt tgtgccaagc ccacggcttg actcctcaac aagtggtcgc catcgcctca     1500
          aatggcggcg gaaaacaagc tctggagaca gtgcagaggt tgctgcccgt cctctgccaa     1560
          gcccacggcc tgactcccca acaggtcgtc gccattgcca gcaacaacgg aggaaagcag     1620
          gctctcgaaa ctgtgcagcg gctgcttcct gtgctgtgtc aggctcatgg gctgaccccc     1680
          gagcaagtgg tggctattgc ctctaatgga ggcaagcaag cccttgagac agtccagagg     1740
          ctgttgccag tgctgtgcca ggcccacggg ctcacacccc agcaggtggt cgccatcgcc     1800
          agtaacaacg ggggcaaaca ggcattggaa accgtccagc gcctgcttcc agtgctctgc     1860
          caggcacacg gactgacacc cgaacaggtg gtggccattg catcccatga tgggggcaag     1920
          caggccctgg agaccgtgca gagactcctg ccagtgttgt gccaagctca cggcctcacc     1980
          cctcagcaag tcgtggccat cgcctcaaac ggggggggcc ggcctgcact ggagagcatt     2040
          gttgcccagt tatctcgccc tgatccggcg ttggccgcgt tgaccaacga ccacctcgtc     2100
          gccttggcct gcctcggcgg gcgtcctgcg ctggatgcag tgaaaaaggg attgggggat     2160
          cctatcagcc gttcccagct ggtgaagtcc gagctggagg agaagaaatc cgagttgagg     2220
          cacaagctga agtacgtgcc ccacgagtac atcgagctga tcgagatcgc ccggaacagc     2280
          acccaggacc gtatcctgga gatgaaggtg atggagttct tcatgaaggt gtacggctac     2340
          aggggcaagc acctgggcgg ctccaggaag cccgacggcg ccatctacac cgtgggctcc     2400
          cccatcgact acggcgtgat cgtggacacc aaggcctact ccggcggcta caacctgccc     2460
          atcggccagg ccgacgaaat gcagaggtac gtggaggaga accagaccag gaacaagcac     2520
          atcaacccca acgagtggtg gaaggtgtac ccctccagcg tgaccgagtt caagttcctg     2580
          ttcgtgtccg gccacttcaa gggcaactac aaggcccagc tgaccaggct gaaccacatc     2640
          accaactgca acggcgccgt gctgtccgtg gaggagctcc tgatcggcgg cgagatgatc     2700
          aaggccggca ccctgaccct ggaggaggtg aggaggaagt tcaacaacgg cgagatcaac     2760
          ttcgcggccg actgataa                                                   2778
          <![CDATA[<210>  172]]>
          <![CDATA[<211>  924]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  pCLS34486]]>
          CISHe3_9-
          R1
          胺基酸序列
          <![CDATA[<400>  172]]>
          Met Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ile Asp Ile Ala Asp Leu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile Lys Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val Gly His Gly 
                  35                  40                  45              
          Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro Ala Ala Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Thr Val Ala Val Lys Tyr Gln Asp Met Ile Ala Ala Leu Pro Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Thr His Glu Ala Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp Ser Gly Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Val Ala Gly Glu Leu Arg Gly Pro 
                      100                 105                 110         
          Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Leu Lys Ile Ala Lys Arg Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Val Thr Ala Val Glu Ala Val His Ala Trp Arg Asn Ala Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
          145                 150                 155                 160 
          His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile 
                      180                 185                 190         
          Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
                  195                 200                 205             
          Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val 
              210                 215                 220                 
          Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln 
                          245                 250                 255     
          Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 
                      260                 265                 270         
          Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 
                  275                 280                 285             
          Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu 
              290                 295                 300                 
          Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln 
                          325                 330                 335     
          Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His 
                      340                 345                 350         
          Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly 
                  355                 360                 365             
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln 
              370                 375                 380                 
          Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Ala Leu Leu Pro Val Leu 
                          405                 410                 415     
          Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
                      420                 425                 430         
          Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 
                  435                 440                 445             
          Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile 
              450                 455                 460                 
          Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val 
                          485                 490                 495     
          Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln 
                      500                 505                 510         
          Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Gln Gln 
                  515                 520                 525             
          Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr 
              530                 535                 540                 
          Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu 
                          565                 570                 575     
          Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly Leu Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala 
                  595                 600                 605             
          Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala His Gly 
              610                 615                 620                 
          Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 
          625                 630                 635                 640 
          Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 
                          645                 650                 655     
          His Gly Leu Thr Pro Gln Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly 
                      660                 665                 670         
          Gly Arg Pro Ala Leu Glu Ser Ile Val Ala Gln Leu Ser Arg Pro Asp 
                  675                 680                 685             
          Pro Ala Leu Ala Ala Leu Thr Asn Asp His Leu Val Ala Leu Ala Cys 
              690                 695                 700                 
          Leu Gly Gly Arg Pro Ala Leu Asp Ala Val Lys Lys Gly Leu Gly Asp 
          705                 710                 715                 720 
          Pro Ile Ser Arg Ser Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys 
                          725                 730                 735     
          Ser Glu Leu Arg His Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu 
                      740                 745                 750         
          Leu Ile Glu Ile Ala Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met 
                  755                 760                 765             
          Lys Val Met Glu Phe Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His 
              770                 775                 780                 
          Leu Gly Gly Ser Arg Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Pro Ile Asp Tyr Gly Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly 
                          805                 810                 815     
          Tyr Asn Leu Pro Ile Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu 
                      820                 825                 830         
          Glu Asn Gln Thr Arg Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys 
                  835                 840                 845             
          Val Tyr Pro Ser Ser Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly 
              850                 855                 860                 
          His Phe Lys Gly Asn Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile 
          865                 870                 875                 880 
          Thr Asn Cys Asn Gly Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly 
                          885                 890                 895     
          Gly Glu Met Ile Lys Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg 
                      900                 905                 910         
          Lys Phe Asn Asn Gly Glu Ile Asn Phe Ala Ala Asp 
                  915                 920                 
          <![CDATA[<210>  173]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CISH正向引子]]>
          <![CDATA[<400>  173]]>
          ctgcactgct gatacccgaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  174]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CISH反向引子]]>
          <![CDATA[<400>  174]]>
          ggggtactgt cggaggtagt                                                   20
          <![CDATA[<210>  175]]>
          <![CDATA[<211>  267]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CISH目標位點序列]]>
          <![CDATA[<400>  175]]>
          ctgcactgct gatacccgaa gcgacagccc cgatcctgct cccaccccgg ccctgcctat       60
          gcctaaggag gatgcgccta gtgacccagc actgcctgct cctccaccag ccactgctgt      120
          acacctaaaa ctggtgcagc cctttgtacg cagaagcagt gcccgcagcc tgcaacacct      180
          gtgccgcctt gtcatcaacc gtctggtggc cgacgtggac tgcctgccac tgccccggcg      240
          catggccgac tacctccgac agtaccc                                          267
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Claims (76)

  1. 一種製備包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)的方法，該方法包括： (a)將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)的核酸引入該等TIL中，其中該一或多種第一TALE核酸酶包括針對SEQ ID NO: 175之核酸序列的TALE核酸酶，且視情況引入一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶；及 (b)擴增該等TIL。
  2. 如請求項1之方法，其中將編碼該一或多種第一TALE核酸酶之核酸引入該等TIL中包括電穿孔步驟。
  3. 如請求項1或2之方法，其中編碼該一或多種第一TALE核酸酶之該一或多種核酸為RNA且該等RNA係藉由電穿孔引入該等TIL中。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該方法進一步包括在該引入步驟之前，藉由在存在OKT-3之情況下將該等TIL在細胞培養基中培養約1至3天來活化TIL的步驟。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該方法進一步包括在該引入步驟之後且在該擴增步驟之前，使該等TIL在包括IL-2之細胞培養基中靜置約1天的步驟。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該方法進一步包括在該引入步驟之前，冷凍保存該等TIL，隨後將該等TIL解凍且在包括IL-2之細胞培養基中培養約1至3天的步驟。
  7. 如請求項5或6之方法，其中該靜置步驟中該IL-2之濃度為約3000 IU/ml。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該一或多種第一TALE核酸酶各自由第一半TALE核酸酶及第二半TALE核酸酶構成。
  9. 如請求項8之方法，其中該第一半TALE核酸酶為由與第一核酸酶催化域融合之第一TALE核酸結合域構成的第一融合蛋白，且該第二半TALE核酸酶為由與第二核酸酶催化域融合之第二TALE核酸結合域構成的第二融合蛋白。
  10. 如請求項9之方法，其中該第一TALE核酸結合域具有第一胺基酸序列且該第二TALE核酸結合域具有第二胺基酸序列，且其中該第一胺基酸序列不同於該第二胺基酸序列。
  11. 如請求項9或10之方法，其中該第一核酸酶催化域具有第一胺基酸序列且該第二核酸酶催化域具有第二胺基酸序列，且其中該第一胺基酸序列與該第二胺基酸序列相同。
  12. 如請求項9至11中任一項之方法，其中該第一核酸酶催化域及該第二核酸酶催化域均具有Fok-I之胺基酸序列。
  13. 如請求項8至12中任一項之方法，其中該第一半TALE核酸酶及該第二半TALE核酸酶能夠形成異二聚體DNA裂解複合物以實現該編碼CISH之基因中的目標位點處之DNA裂解，且其中該編碼CISH之基因中的該目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列。
  14. 如請求項8至13中任一項之方法，其中該第一半TALE核酸酶識別位於該編碼CISH之基因中的該目標位點中之第一位置處的第一半目標，且該第二半TALE核酸酶識別位於不與該第一位置重疊的該編碼CISH之基因中的該目標位點中之第二位置處的第二半目標。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中該TALE核酸酶包括與選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  16. 如請求項15之方法，其中該TALE核酸酶包括選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之序列。
  17. 如請求項8至15中任一項之方法，其中該第一半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 165具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且該第二半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 167具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  18. 如請求項17之方法，其中該第一半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 165之胺基酸序列且該第二半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 167之胺基酸序列。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該等經擴增TIL包括足夠的TIL以供向有需要之個體投與治療有效劑量之該等TIL。
  20. 如請求項19之方法，其中該治療有效劑量之該等經擴增TIL包括約1×10 9至約9×10 10個TIL。
  21. 一種經擴增腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體，其包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現，該經擴增TIL群體可藉由如請求項1至20中任一項之方法獲得。
  22. 一種識別且實現編碼CISH之基因中的目標位點處之DNA裂解的類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)，其中該TALE核酸酶包括與選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  23. 如請求項22之TALE核酸酶，其中該TALE核酸酶包括選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之序列。
  24. 如請求項22之TALE核酸酶，其中該TALE核酸酶由第一半TALE核酸酶及第二半TALE核酸酶構成，且其中該第一半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 165具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且該第二半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 167具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  25. 如請求項24之TALE核酸酶，其中該第一半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 165之胺基酸序列且該第二半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 167之胺基酸序列。
  26. 如請求項24或25之TALE核酸酶，其中該第一半TALE核酸酶為由與第一核酸酶催化域融合之第一TALE核酸結合域構成的第一融合蛋白，且該第二半TALE核酸酶為由與第二核酸酶催化域融合之第二TALE核酸結合域構成的第二融合蛋白。
  27. 如請求項26之TALE核酸酶，其中該第一TALE核酸結合域具有第一胺基酸序列且該第二TALE核酸結合域具有第二胺基酸序列，且其中該第一胺基酸序列不同於該第二胺基酸序列。
  28. 如請求項26或27之TALE核酸酶，其中該第一核酸酶催化域具有第一胺基酸序列且該第二核酸酶催化域具有第二胺基酸序列，且其中該第一胺基酸序列與該第二胺基酸序列相同。
  29. 如請求項26至28中任一項之TALE核酸酶，其中該第一核酸酶催化域及該第二核酸酶催化域均具有Fok-I之胺基酸序列。
  30. 如請求項24至29中任一項之TALE核酸酶，其中該第一半TALE核酸酶及該第二半TALE核酸酶能夠形成異二聚體DNA裂解複合物以實現該編碼CISH之基因中的目標位點處之DNA裂解，且其中該目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列。
  31. 如請求項24至30中任一項之TALE核酸酶，其中該第一半TALE核酸酶識別位於該編碼CISH之基因中的該目標位點中之第一位置處的第一半目標，且該第二半TALE核酸酶識別位於不與該第一位置重疊的該編碼CISH之基因中的該目標位點中之第二位置處的第二半目標。
  32. 一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增至包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之治療性TIL群體中的方法，該方法包括： (a)  藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段來獲得及/或接受來源於自該個體切除之腫瘤的第一TIL群體； (b)  將該第一TIL群體添加至密閉系統中； (c)  藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增進行約3至14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放該系統之情況下發生； (d)  將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸引入該等TIL中，其中該一或多種第一TALE核酸酶包括針對該編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，其中該目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列，且視情況將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶之核酸引入該等TIL中； (e)  藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養自步驟(d)獲得的該等TIL來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增進行約7至14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行；及 (f)   收穫自步驟(e)獲得之該治療性TIL群體，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不開放該系統之情況下發生； (g)  將該收穫的TIL群體自步驟(f)轉移至輸注袋，其中自步驟(f)至(g)之該轉移係在不開放該系統之情況下發生。
  33. 一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增至包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之治療性TIL群體中的方法，該方法包括： (a)  藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段來獲得來源於自該個體切除之腫瘤的第一TIL群體； (b)  將該等腫瘤片段添加至密閉系統中； (c)  藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增進行約3至11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放該系統之情況下發生； (d)  將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸引入該等TIL中，其中該一或多種第一TALE核酸酶包括針對該編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，其中該目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列，且視情況將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶之核酸引入該等TIL中； (e)  藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養自步驟(d)獲得的該等TIL來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增進行約7至11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (f)   收穫自步驟(e)獲得之該治療性TIL群體，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不開放該系統之情況下發生；及 (g)  將該收穫的治療性TIL群體自步驟(f)轉移至輸注袋，其中自步驟(f)至(g)之該轉移係在不開放該系統之情況下發生。
  34. 一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增至包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之治療性TIL群體中的方法，該方法包括： (a)  由手術切除、穿刺生檢、芯針生檢、小型生檢或其他用於獲得含有來自個體之黑色素瘤的腫瘤及TIL細胞之混合物之樣本的手段獲得及/或接受第一TIL群體， (b)  將該第一TIL群體添加至密閉系統中； (c)  藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增進行約3至14天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放該系統之情況下發生； (d)  將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸引入該等TIL中，其中該一或多種第一TALE核酸酶包括針對該編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，其中該目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列，且視情況引入一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶； (e)  藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養自步驟(d)獲得的該等TIL來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增進行約7至14天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (f)   收穫自步驟(e)獲得之該治療性TIL群體，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不開放該系統之情況下發生；及 (g)  將該收穫的治療性TIL群體自步驟(f)轉移至輸注袋，其中自步驟(f)至(g)之該轉移係在不開放該系統之情況下發生。
  35. 一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增至包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之治療性TIL群體中的方法，該方法包括： (a)  自個體切除腫瘤，該腫瘤包括第一TIL群體，視情況由手術切除、穿刺生檢、芯針生檢、小型生檢或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物之樣本的手段進行； (b)  將該等腫瘤片段添加至密閉系統中； (c)  藉由在包括IL-2之細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增進行約3至11天以獲得該第二TIL群體，且其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放該系統之情況下發生； (d)  將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸引入該等TIL中，其中該一或多種第一TALE核酸酶包括針對該編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，其中該目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列，且視情況引入一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶； (e)  藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養自步驟(d)獲得的該等TIL來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增進行約7至11天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (f)   收穫自步驟(e)獲得之該第三TIL群體，其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不開放該系統之情況下發生；及 (g)  將該收穫的第三TIL群體自步驟(f)轉移至輸注袋，其中自步驟(f)至(g)之該轉移係在不開放該系統之情況下發生。
  36. 一種用於將經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)擴增至包括降低的CISH及視情況選用之PD-1表現之治療性TIL群體中的方法，該方法包括： (a)  藉由將自個體獲得之腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段來獲得來源於自該個體切除之腫瘤的第一TIL群體； (b)  將該等腫瘤片段添加至密閉系統中； (c)  藉由在包括IL-2及視情況選用之OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL群體來進行第一次擴增，以產生第二TIL群體，其中該第一次擴增係在提供第一透氣表面區域之密閉容器中進行，其中該第一次擴增進行約3至14天以獲得該第二TIL群體，其中自步驟(b)至步驟(c)之轉變係在不開放該系統之情況下發生； (d)  將編碼一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼CISH之基因的第一類轉錄活化子效應物核酸酶(TALE核酸酶)之核酸引入該等TIL中，其中該一或多種第一TALE核酸酶包括針對該編碼CISH之基因中之目標位點的TALE核酸酶，其中該目標位點包括SEQ ID NO: 175之核酸序列，且視情況引入一或多種能夠藉由DNA裂解選擇性地不活化編碼PD-1之基因的第二TALE核酸酶； (d)  藉由在包括IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養自步驟(d)獲得的該等TIL來進行第二次擴增，以產生第三TIL群體，其中該第二次擴增進行約4至6天以獲得該第三TIL群體，其中該第三TIL群體為治療性TIL群體，其中該第二次擴增係在提供第二透氣表面區域之密閉容器中進行； (e)  將該第三TIL群體分成第一複數個2至5個TIL亞群，其中至少1.0×10 9個TIL存在於各亞群中，其中自步驟(d)至步驟(e)之轉變係在不開放該系統之情況下發生； (f)   藉由用額外的IL-2、視情況選用之OKT-3補充各TIL亞群之該細胞培養基來進行該第一複數個TIL亞群之第三次擴增，以產生第二複數個TIL亞群，其中該第三次擴增進行約5至7天，其中各亞群之該第三次擴增係在提供第三透氣表面區域之密閉容器中進行，且其中自步驟(e)至步驟(f)之轉變係在不開放該系統之情況下發生；及 (g)  收穫自步驟(f)獲得之該第二複數個TIL亞群；及 (h)  將該等收穫的TIL亞群自步驟(g)轉移至一或多個輸注袋，其中自步驟(g)至(h)之轉變。
  37. 如請求項32至36中任一項之方法，其中該方法進一步包括使用冷凍保存製程冷凍保存該收穫的TIL的步驟。
  38. 如請求項32至37中任一項之方法，其中編碼該一或多種第一TALE核酸酶之該一或多種核酸為RNA。
  39. 如請求項32至38中任一項之方法，其中引入編碼該一或多種第一TALE核酸酶之該一或多種核酸係藉由電穿孔引入該等TIL中。
  40. 如請求項32至39中任一項之方法，其中該方法進一步包括在該引入步驟之前，藉由在存在OKT-3之情況下將該等TIL在細胞培養基中培養約1至3天來活化TIL的步驟。
  41. 如請求項40之方法，其中OKT-3之濃度為約300 ng/ml。
  42. 如請求項32至41中任一項之方法，其中該方法進一步包括在該引入步驟之後且在該第二次擴增步驟之前，使該等TIL在包括IL-2之細胞培養基中靜置約1天的步驟。
  43. 如請求項42之方法，其中該靜置步驟中該IL-2之濃度為約3000 IU/ml。
  44. 如請求項32至43中任一項之方法，其中該方法進一步包括冷凍保存該等TIL，隨後將該等TIL解凍且在包括IL-2之細胞培養基中培養約1至3天。
  45. 如請求項32至44中任一項之方法，其中步驟(a)至(g)在約13天至約29天，視情況約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天或約25天內進行。
  46. 如請求項32至45中任一項之方法，其中編碼該一或多種第一TALE核酸酶之該一或多種核酸為RNA，且該等RNA係藉由電穿孔引入該等TIL中。
  47. 如請求項32至46中任一項之方法，其中該一或多種第一TALE核酸酶各自由第一半TALE核酸酶及第二半TALE核酸酶構成。
  48. 如請求項47之方法，其中該第一半TALE核酸酶為由與第一核酸酶催化域融合之第一TALE核酸結合域構成的第一融合蛋白，且該第二半TALE核酸酶為由與第二核酸酶催化域融合之第二TALE核酸結合域構成的第二融合蛋白。
  49. 如請求項48之方法，其中該第一TALE核酸結合域具有第一胺基酸序列且該第二TALE核酸結合域具有第二胺基酸序列，且其中該第一胺基酸序列不同於該第二胺基酸序列。
  50. 如請求項48或49之方法，其中該第一核酸酶催化域具有第一胺基酸序列且該第二核酸酶催化域具有第二胺基酸序列，且其中該第一胺基酸序列與該第二胺基酸序列相同。
  51. 如請求項48至50中任一項之方法，其中該第一核酸酶催化域及該第二核酸酶催化域均具有Fok-I之胺基酸序列。
  52. 如請求項47至51中任一項之方法，其中該第一半TALE核酸酶及該第二半TALE核酸酶能夠形成異二聚體DNA裂解複合物以實現該目標位點處之DNA裂解。
  53. 如請求項47至52中任一項之方法，其中該第一半TALE核酸酶識別位於該目標位點中之第一位置處的第一半目標，且該第二半TALE核酸酶識別位於不與該第一位置重疊的該目標位點中之第二位置處的第二半目標。
  54. 如請求項53之方法，其中該TALE核酸酶包括與選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  55. 如請求項53或54之方法，其中該TALE核酸酶包括選自由SEQ ID NO: 165及SEQ ID NO: 167組成之群組之序列。
  56. 如請求項53或54之方法，其中該第一半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 165具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且該第二半TALE核酸酶包括與SEQ ID NO: 167具有至少70%、75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  57. 如請求項56之方法，其中該第一半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 165之胺基酸序列且該第二半TALE核酸酶包括SEQ ID NO: 167之胺基酸序列。
  58. 如請求項32至57中任一項之方法，其中所收穫的該等TIL包括足夠的TIL以供向有需要之個體投與治療有效劑量之該等TIL。
  59. 如請求項58之方法，其中該治療有效劑量之該等TIL包括約1×10 9至約9×10 10個TIL。
  60. 如請求項32至59中任一項之方法，其中該等APC包括周邊血液單核細胞(PBMC)。
  61. 如請求項60之方法，其中該等PBMC係以約1:25 TIL:PBMC之比率補充。
  62. 如請求項32至61中任一項之方法，其中該治療性TIL群體在向該個體投與時提供增加的功效、增加的干擾素-γ(IFN-γ)產生、增加的多株性、增加的平均IP-10及/或增加的平均MCP-1。
  63. 如請求項32至36中任一項之方法，其中該IL-2在該第一次擴增中在該細胞培養基中係以1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在。
  64. 如請求項32至36中任一項之方法，其中在該第二次擴增步驟中，該IL-2係以1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在且該OKT-3抗體係以約30 ng/mL之初始濃度存在。
  65. 如請求項36之方法，其中在該第二次及/或第三次擴增步驟中，該IL-2係以1000 IU/mL與6000 IU/mL之間的初始濃度存在，且視情況，該OKT-3抗體係以約30 ng/mL之初始濃度存在。
  66. 如請求項32至36中任一項之方法，其中該第一次擴增係使用透氣容器進行。
  67. 如請求項32至35中任一項之方法，其中該第二次擴增係使用透氣容器進行。
  68. 如請求項36之方法，其中該第二次及/或第三次擴增係使用透氣容器進行。
  69. 如請求項32至36中任一項之方法，其中第一細胞培養基進一步包括選自由以下組成之群組的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。
  70. 如請求項32至35中任一項之方法，其中第二細胞培養基進一步包括選自由以下組成之群組的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。
  71. 如請求項36之方法，其中步驟中(d)及/或(f)中之該細胞培養基進一步包括選自由以下組成之群組的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。
  72. 如請求項32至35中任一項之方法，其中該第二次擴增之該細胞培養基進一步包括選自由以下組成之群組的細胞介素：IL-4、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。
  73. 如請求項32至35中任一項之方法，其中步驟(c)中之該第一次擴增及/或步驟(e)中之該第二次擴增係在11天之時段內單獨地進行。
  74. 一種包括降低的CISH及/或PD-1表現的經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體或包括其之組合物，該TIL群體或包括其之組合物可藉由如請求項1至20及32至73中任一項之方法獲得。
  75. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包括向該個體投與包括降低的CISH及/或CISH及PD-1表現之經基因修飾之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)的治療性群體，其中經基因修飾之TIL之該治療性群體可藉由如請求項1至20及32至73中任一項之方法獲得。
  76. 如請求項75之治療癌症之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群組：黑色素瘤(包含轉移性黑色素瘤)、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人類乳頭狀瘤病毒引起之癌症、頭頸癌(包含頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。
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