TW202305011A

TW202305011A - 靶向ｐｄ－１和／或ｏｘ４０的特異性結合蛋白

Info

Publication number: TW202305011A
Application number: TW111122111A
Authority: TW
Inventors: 杰森盧恩; 木勝包; 戎一平; 尹躍翔; 羅海山; 黄冰
Original assignee: 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司
Priority date: 2021-06-17
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2023-02-01
Also published as: TWI835166B; CN117460746A; WO2022262749A1

Abstract

本發明涉及靶向PD-1的抗體或其抗原結合片段，以及靶向PD-1和OX40的雙特異性抗體或其片段。本發明還涉及編碼所述抗體或其抗原結合片段的核酸分子。本發明還涉及所述靶向PD-1的抗體或其抗原結合片段，所述靶向PD-1和OX40的雙特異性抗體或其片段，及其編碼核酸分子在治療、預防和/或診斷疾病中的用途，所述疾病例如為免疫性疾病，急性和慢性炎性疾病，以及腫瘤疾病。

Description

靶向PD-1和/或OX40的特異性結合蛋白

本發明關於生物醫藥領域，更具體地關於抗體治療領域。

哺乳動物的免疫系統是一個精細平衡的系統，但有時會被諸如癌症的疾病破壞。免疫檢查點受體通過發揮共刺激或共抑制作用，在免疫系統對疾病的反應中發揮重要作用，而二者的微妙平衡決定了免疫應答的功效。共抑制劑抑制T細胞增殖並誘導抗炎細胞因子釋放。它們可以減輕炎症，避免過度免疫反應造成器官/組織損害。另一方面，共刺激劑通過促進T細胞株系擴增(clonal expansion)，效應子分化和存活，以促進保護性免疫應答的發展。

一種行之有效的癌症免疫治療方法可以通過阻斷共抑制受體功能或誘導共刺激受體活性的抗體靶向這些檢查點受體，來觸發免疫系統識別並殺死腫瘤細胞(Pardoll, 2012)。阻斷共抑制受體活性的抗體已顯示出良好的臨床活性，目前已被批准用於治療癌症(Larkin等, 2015)。誘導共刺激受體活性的抗體已在臨床前模型系統中顯示出巨大潛力(Moran等, 2013；Schaer等, 2014)，目前有幾種藥物正在臨床試驗中(Mayes等, 2018；Melero等, 2013)。這些抗體旨在模擬這些共刺激受體的配體，因此也被稱為促效劑抗體。

OX40（又稱CD134，ACT45，TNFRSF4）屬於腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族的一員，主要在活化的T細胞上表達，包括CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、1型和2型T輔助細胞(Th1和Th2)和調節性T(Treg)細胞，並在活化的自然殺傷細胞(NK)上表達。在抗原呈遞細胞(APC)上表達的OX40及其配體OX40配體(OX40L)的相互作用，增加了T細胞的株系擴增、分化和存活，並增強了記憶性T細胞的生成(Croft等, 2009)。OX40刺激可對T細胞產生直接影響，促進其增殖和存活，或者通過增強炎症細胞因子(例如IL2和IFNγ)的產生而產生間接影響。OX40訊號傳導也可調節Treg細胞的功能，儘管在Treg細胞上OX40訊號傳導可以消除Treg細胞的抑制活性(Takeda等, 2004)。已經發現OX40在患有頭頸部癌、黑色素瘤和結腸直腸癌患者的腫瘤浸潤T細胞中表達，但是，高水平的OX40陽性淋巴細胞與患者更高的存活率相關(Petty等, 2002；Vetto等, 1997)。OX40的促效劑抗體目前正在癌症的臨床試驗中，大多數顯示出良好的安全性和有限的臨床活性。以靶向OX40作為單一療法的效果卻並不理想，始終未能達到預期的結果。

PD-1(programmed death-1)是由活化的T和B細胞表達的關鍵免疫檢查點受體，並介導免疫抑制。PD-1是受體CD28家族的成員，該家族包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。已鑒定出PD-1的兩種細胞表面糖蛋白配體，為程式性死亡配體-1(Programmed cell death 1 ligand 1；PD-L1)和程式性死亡配體-2(PD-L2)，它們表達在抗原呈遞細胞以及許多種類的人癌症細胞上，已顯示它們通過結合PD-1下調T細胞活化和細胞因子分泌。PD-1和PD-L1之間的相互作用導致腫瘤浸潤性淋巴細胞減少，T細胞受體介導的增殖降低，和癌細胞的免疫逃避。

雖然利用促效劑刺激共刺激受體或者檢查點受體抑制劑的抗癌原理是明確的：CTLA4、PD1/PDL1等檢查點受體抑制劑是增強T細胞的抗癌作用，而共刺激受體促效劑CD28，4-1BB、OX40、GITR、CD27和ICOS則是促進T細胞的抗腫瘤免疫力。但在臨床上將共刺激受體促效劑和檢查點受體抑制劑共同使用並未取得良好的效果。理論上，在高度免疫抑制的腫瘤微環境中，利用促效劑刺激這些共刺激受體應該能夠增強抗腫瘤免疫力。大量的小鼠資料也證實了這類藥物的治療潛力。例如，基因泰克將OX40促效劑抗體和PD-L1抗體聯合起來，在一種小鼠模型中，90%的結直腸癌腫瘤獲得了完全緩解。然而，雖然動物研究資料喜人，但臨床試驗的資料並不理想。在基因泰克關於OX40促效劑MOXR0916聯合PD-L1抗體atezolizumab的Ib期試驗中，僅4%（2 of 51）的患者獲得了部分緩解，因此，基因泰克關閉了其OX40項目。大多數情況下，化療藥的聯合用藥可能都會起到協同作用，從而使得腫瘤治療效果更好，但是免疫療法的聯合用藥並不是簡單的1+1＞2，它可能會與預期的結果相差甚遠，亦或是完全相反。在2017年發表的兩組小鼠模型資料顯示，當同時給予OX40促效劑和PD-1抑制劑時，由於T細胞衰竭或程式性細胞死亡，這兩種抗體的作用相互抵消。但是，序貫給藥則增強了這些藥物的抗腫瘤活性。一種假設是，共刺激必須首先促進腫瘤特異性T細胞達到檢查點抑制免疫反應的程度，然後檢查點抑制劑才能有效。

目前尚未有能夠將靶向PD1和OX40的抗體共同使用實現有效抗癌的方法，因此發掘能夠使兩者功能同時發揮的方法，如製備成雙特異性抗體，具有重要的臨床意義。

本發明提供了特異性結合蛋白，所述特異性結合蛋白能夠以高親和力和高特異性與一種或多種抗原結合，所述抗原為PD-1或其片段，和/或OX40或其片段。本發明還提供了編碼所述特異性結合蛋白的核酸分子，用於產生所述特異性結合蛋白的表達載體，宿主細胞以及用於製備所述特異性結合蛋白的方法。本發明還涉及所述特異性結合蛋白在治療、預防和/或診斷疾病中的用途，所述疾病例如為免疫性疾病，急性和慢性炎性疾病，以及腫瘤疾病。

第一方面，本發明提供了一種特異性抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段結合PD-1或其片段，包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH，其中，所述VL包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 39、46和54所示，所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 8、18和28所示，或者分別如SEQ ID NO: 81、86和91所示。在一些實施方案中，這些CDR中可以包含1至3個胺基酸取代。

在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段的VL包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 39、46和54所示，且所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 8、18和28所示。在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段的VL包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 39、46和54所示，且VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 81、86和91所示。在一些實施方案中，這些CDR中可以包含胺基酸突變，並能維持所述抗體的特異性結合PD-1的功能。較佳地，所述胺基酸突變為胺基酸替換，所述胺基酸替換的數目可以為1-3個。

在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段的VL包含如SEQ ID NO: 67所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在具體的實施方案中，上述特異性結合蛋白的VL包含如SEQ ID NO: 67所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段的VH包含SEQ ID NO: 62所示的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在具體的實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段的VH包含SEQ ID NO: 62所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段的VH包含SEQ ID NO: 102所示的胺基酸序列，或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段的VH包含SEQ ID NO: 102所示的胺基酸序列。

在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段選自IgG、Fab、Fab’、F(ab’) ₂、Fv或scFv。在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段為IgG。在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段包括重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。在一些實施方案中，上述重鏈恆定區可以來源於人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。在一些實施方案中，所述輕鏈恆定區可以選自κ鏈或者λ鏈。在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段可以為制得的多株抗體或單株抗體。

在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段的Fc在第234位和/或第235位發生胺基酸替換。在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段包含L234A和/或L235A突變。在一些實施方案中，上述特異性結合蛋白包含L234A和L235A兩個突變。

在一些實施方案中，上述特異性抗體的Fc為人IgG1的Fc。在一些實施方案中，上述特異性抗體的Fc為人IgG4的Fc。在一些實施方案中，所述Fc包含L234A和L235A突變。

在一些實施方案中，上述特異性抗體或其抗原結合片段包括重鏈和輕鏈。在一些實施方案中，所述輕鏈包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；所述重鏈包括如SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述輕鏈包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；所述重鏈包括如SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。

第二方面，本發明提供了特異性結合蛋白，所述特異性結合蛋白包含至少兩個結構域，能夠結合PD-1或其片段，和/或OX40或其片段。

在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白為雙特異性抗體或其抗原結合抗體，其包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域結合PD-1或其片段，並且所述第二結構域結合OX40或其片段。在一些實施方案中，所述第二結構域為僅含重鏈的VH，不含輕鏈。

在一些實施方案中，所述第一結構域為PD-1抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方案中，所述第二結構域為OX40抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方案中，所述第一結構域和/或所述第二結構域的結構選自IgG、Fab、Fab’、F(ab’) ₂、Fv、scFv、VH、或HCAb的一種，較佳地，所述Fab、Fab’、F(ab’) ₂、Fv、scFv、VH的數量為一個或多個。

在一些實施方案中，所述第一結構域為IgG的形式。較佳地，所述IgG的重鏈恆定區為人重鏈恆定區，更佳為人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4重鏈恆定區；較佳地，所述第一結構域中IgG的Fc為人IgG1或IgG4的Fc。

在一些實施方案中，人IgG較佳包含L234A、L235A和P329G中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含L234A和L235A兩個突變或包含L234A、L235A和P329G三個突變；

較佳地，所述第一結構域中IgG的Fc為人IgG1的Fc，更佳地，所述Fc包含L234A、L235A和P329G突變；

較佳地，所述第一結構域中IgG的Fc為人IgG4的Fc，更佳地，所述Fc包含L234A和L235A和P329G突變。

在一些實施方案中，人IgG較佳包含L234A、L235A和G237A中的一個、兩個或三個突變，更佳地包含L234A和L235A兩個突變或包含L234A、L235A和G237A三個突變；

較佳地，所述第一結構域中IgG的Fc為人IgG1的Fc，更佳地，所述Fc包含L234A、L235A和G237A突變；

較佳地，所述第一結構域中IgG的Fc為人IgG4的Fc，更佳地，所述Fc包含L234A和L235A和G237A突變。

較佳地，所述第一結構域為四價結構。

較佳地，所述第二結構域為VH結構，VH的數量較佳為 1、2、3或4個；更佳地，VH的數量為2個。

在一些實施方案中，所述第一結構域與所述第二結構域直接連接或經連接肽L連接形成雙特異性結合蛋白。

在一些實施方案中，特異性結合蛋白為IgG_HC-VH 四價對稱結構的雙特異性抗體，其包含兩條多肽鏈：多肽鏈2，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VL ₁-CL ₁-C’；多肽鏈1，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VH ₁-CH ₁-h-CH2-CH3-L-VH ₂-C’；其中，所述VL ₁和VH ₁分別為第一結構域的VL和VH，所述VH ₂為第二結構域的VH，所述h為IgG抗體的鉸鏈區，所述CL ₁是第一結構域的CL，所述CH ₁是第一結構域的CH1，所述L為連接肽，多肽鏈1的CH3經由L連接到VH ₂。

在一些實施方案中，特異性結合蛋白為VH-IgG_HC四價對稱結構的雙特異性抗體，其包含兩條多肽鏈：多肽鏈2，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VL ₁-CL ₁-C’；多肽鏈1，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VH ₂-L-VH ₁-CH ₁-h-CH2-CH3-C’；其中，所述VL ₁和VH ₁分別為第一結構域的VL和VH，所述VH ₂為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述CL ₁是第一結構域的CL，所述CH1是第一結構域的CH ₁，所述L為連接肽，多肽鏈1的VH ₂經由連接肽L連接到VH ₁。

在一些實施方案中，特異性結合蛋白為Fab(CL)-VH-Fc四價對稱結構的雙特異性抗體，其包含兩條多肽鏈，多肽鏈2，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VH’-CH1’-C’；多肽鏈1，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VL’-CL’-L-VH ₂-h-CH ₂-CH ₃-C’。其中，所述VL’和VH’分別為第一結構域的VL和VH，所述VH ₂為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述的L為連接肽，所述CL’是第一結構域的CL，所述CH1’是第一結構域的CH1，多肽鏈1的CL’與VH ₂直接融合連接，即L的長度為0。

在一些實施方案中，特異性結合蛋白為IgG_HC-VH-VH六價對稱結構的雙特異性抗體，其包含兩條多肽鏈：多肽鏈2，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VL ₁-CL ₁-C’；多肽鏈1，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VH ₁-CH ₁-h-CH ₂-CH ₃-L ₁-VH ₂-L2-VH ₂-C’。其中，所述VL ₁和VH ₁分別為第一結構域的VL和VH，所述VH ₂為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述的L1和L2為連接肽，所述CL ₁是第一結構域的CL，所述CH ₁是第一結構域的CH1，多肽鏈1的CH3經由L1連接到VH ₂，兩個VH ₂之間通過L2連接。

在一些實施方案中，特異性結合蛋白為IgG_HC-VH-VH-VH八價對稱結構的雙特異性抗體，其包含兩條多肽鏈：多肽鏈2，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VL1-CL1-C’；多肽鏈1，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VH1-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH2-L2-VH2-L3-VH2-C’。其中，所述VL1和VH1分別為第一結構域的VL和VH，所述VH2為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述的L1、L2和L3為連接肽，所述CL1是第一結構域的CL，所述CH1是第一結構域的CH1，多肽鏈1中的CH3經由連接肽L1連接到自多肽鏈1的N端至C端的第一個VH2，第一個VH2與第二個VH2通過連接肽L2連接，第二個VH2與第三個VH2通過連接肽L3連接。

其中，所述的鉸鏈區h為免疫球蛋白領域常見的鉸鏈區，通常含大量脯胺酸，具有撓性，形成2-5個二硫鍵。

較佳地，所述L為長度為0-30個胺基酸長度的肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO：116-140任一所示所示，見表1。

在一些實施方案中，所述第二多肽鏈的CH3與VH ₂直接連接，即L的長度為0。

表1.連接肽序列

SEQ ID NO:	連接肽名稱	長度	序列
SEQ ID NO:116	H1	15	EPKSSDKTHTPPPPP
SEQ ID NO:117	(G2S)2	6	GGSGGS
SEQ ID NO:118	(G4S)3	15	GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:119	(G4S)2	10	GGGGSGGGGS
SEQ ID NO:120	GS_2	2	GS
SEQ ID NO:121	GS_4	4	GSGS
SEQ ID NO:122	GS_5	5	GGGGS
SEQ ID NO:123	GS_7	7	GGGGSGS
SEQ ID NO:124	GS_20	20	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:125	GS_25	25	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:126	LH1	10	DKTHTCPPCP
SEQ ID NO:127	G5-LH	15	GGGGGDKTHTCPPCP
SEQ ID NO:128	H1_15-RT	17	EPKSSDKTHTPPPPPRT
SEQ ID NO:129	L-GS_15-RT	18	LGGGGSGGGGSGGGGSRT
SEQ ID NO:130	L-H1_15-RT	18	LEPKSSDKTHTPPPPPRT
SEQ ID NO:131	KL-H1_15-RT	19	KLEPKSSDKTHTPPPPPRT
SEQ ID NO:132	KL-H1_15-AS	19	KLEPKSSDKTHTPPPPPAS
SEQ ID NO:133	RT-GS_5-KL	9	RTGGGGSKL
SEQ ID NO:134	RT-GS_15-KL	19	RTGGGGSGGGGSGGGGSKL
SEQ ID NO:135	RT-GS_25-KL	29	RTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKL
SEQ ID NO:136	人IgG1鉸鏈	15	EPKSCDKTHTCPPCP
SEQ ID NO:137	人IgG1鉸鏈 (C220S)	15	EPKSSDKTHTCPPCP
SEQ ID NO:138	人IgG2鉸鏈	12	ERKCCVECPPCP
SEQ ID NO:139	人IgG4鉸鏈	12	ESKYGPPCPSCP
SEQ ID NO:140	人IgG4鉸鏈 (S228P)	12	ESKYGPPCPPCP

在一些實施方案中，所述第一結構域包含輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH），所述VL包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 39、46和54所示，所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 8、18和28所示或者分別如SEQ ID NO: 81、86和91所示。

在一些實施方案中，所述第一結構域包含VL和VH。在一些實施方案中，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 67所示或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性。在具體的實施方案中，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 67所示。在一些實施方案中，所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 62或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性。在具體的實施方案中，所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 62。在一些實施方案中，所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 102所示，或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性。在具體的實施方案中，所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 102所示。

在一些實施方案中，所述第一結構域包含與SEQ ID NO: 77所示的胺基酸具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈，和與SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 106所示的胺基酸具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈。

在一些實施方案中，所述第一結構域包含與SEQ ID NO: 77所示的胺基酸具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈，和與SEQ ID NO: 71所示的胺基酸具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈。在具體的實施方案中，所述第一結構域包含如SEQ ID NO: 77所示的輕鏈，和如SEQ ID NO: 71所示的重鏈。

在一些實施方案中，所述第一結構域包含與SEQ ID NO: 77所示的胺基酸具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈，和與SEQ ID NO: 72所示的胺基酸具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈。在具體的實施方案中，所述第一結構域包含如SEQ ID NO: 77所示的輕鏈和如SEQ ID NO: 72所示的重鏈。

在一些實施方案中，所述第一結構域包含與SEQ ID NO: 77所示的胺基酸具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈，和與SEQ ID NO: 106所示的胺基酸具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈。在具體的實施方案中，所述第一結構域包含如SEQ ID NO: 77所示的輕鏈和如SEQ ID NO: 106所示的重鏈。

在一些實施方案中，所述第二結構域包含重鏈可變區（VH），所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 9、19和29所示。在一些實施方案中，所述第二結構域包含重鏈可變區（VH），所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 9、85和90所示。

在一些實施方案中，所述第二結構域包含VH，所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 63所示，或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性。在具體的實施方案中，所述第二結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 63所示。在一些實施方案中，所述第二結構域包含VH，所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 101所示，或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性。在具體的實施方案中，所述第二結構域的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 101所示。

在一些實施方案中，所述第二結構域包含與SEQ ID NO: 73所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈。在具體的實施方案中，所述第二結構域包含如SEQ ID NO: 73所示的重鏈。在一些實施方案中，所述第二結構域包含與SEQ ID NO: 105所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈。在具體的實施方案中，所述第二結構域包含如SEQ ID NO: 105所示的重鏈。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域包含輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH），所述VL包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 39、46和54所示，所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 8、18和28所示；並且，所述第二結構域包含重鏈可變區（VH），所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 9、19和29所示。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域包含VL和VH，所述VL包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 39、46和54所示，所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 81、86和91所示；並且，所述第二結構域包含VH，所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 9、19和29所示。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域包含VL和VH，所述VL包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 39、46和54所示，所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 81、86和91所示；並且，所述第二結構域包含VH，所述VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 9、85和90所示。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域包含輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH），所述VL和VH的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 67和SEQ ID NO: 62所示；並且，所述第二結構域包含VH，所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 63所示。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域包含輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH），所述VL和VH的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 67和SEQ ID NO: 102所示；並且，所述第二結構域包含VH，所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 63所示。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含第一結構域和第二結構域，所述第一結構域包含輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH），所述VL和VH的胺基酸序列分別如SEQ ID NO: 67和SEQ ID NO: 102所示；並且，所述第二結構域包含VH，所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 101所示。

在一些實施方案中，所述雙特異性結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1為長鏈，所述多肽鏈2為短鏈。

在一些實施方案中，所述多肽鏈1具有SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115中任一項所示的胺基酸序列，或與具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；所述多肽鏈2具有SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:113中任一所示的胺基酸序列，或與具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含兩條多肽鏈：其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含兩條多肽鏈：其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含兩條多肽鏈：其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含兩條多肽鏈：其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含兩條多肽鏈：其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：112所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含兩條多肽鏈：其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列。

在具體的實施方案中，所述雙特異性抗體包含兩條多肽鏈：其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。

第三方面，本發明提供了分離的核酸分子，其編碼本發明第一方面的抗體或其抗原結合片段、第二方面所述的特異性結合蛋白或其片段。

在一些實施方案中，所述核酸分子是mRNA分子。

第四方面，本發明提供了表達載體，其包含本發明第三方面所述的分離的核酸分子。

所述表達載體可以是真核細胞表達載體和/或原核細胞表達載體，例如為逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、噬菌體載體、腺病毒載體、腺相關載體或單純皰疹載體。

在一些實施方案中，所述表達載體存在於奈米顆粒、脂質體、外來體、微泡或基因槍中。

第五方面，本發明提供了宿主細胞，所述宿主細胞包含第三方面的分離的核酸分子，或第四方面的表達載體。

所述宿主細胞為本領域常規的宿主細胞，只要能使第四方面的表達載體穩定地將所攜帶的核酸分子表達為第一方面的抗體或其抗原結合片段或第二方面所述的雙特異性抗體。較佳地，所述宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞，所述原核細胞較佳 E. coli細胞如TG1、BL21（表達單鏈抗體或Fab抗體），所述真核細胞較佳HEK293細胞或CHO細胞（表達全長IgG抗體）。將第四方面的表達載體轉化至宿主細胞中，即可得本發明的宿主細胞。其中所述轉化方法為本領域的常規轉化方法，較佳地為化學轉化法，熱激法或電轉法。

第六方面，本發明提供了第一方面的抗體或其抗原結合片段或第二方面的雙特異性抗體的製備方法。

在一些實施方案中，利用雜交瘤技術或者本領域的其他常規技術製備，例如人源化技術等製備第一方面的抗體或其抗原結合片段或第二方面的雙特異性抗體。

在一些實施方案中，所述製備方法包括培養第四方面的宿主細胞的步驟。

在一些實施方案中，利用Harbour HCAb轉基因小鼠（以下簡稱HCAb轉基因小鼠）製備第二方面的雙特異性抗體的第二結構域。

所述HCAb轉基因小鼠是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。

較佳地，所述利用HCAb轉基因小鼠製備第二方面的雙特異性抗體的第二結構域的方法包括如下步驟： (a) 利用人OX40免疫HCAb轉基因小鼠，更佳地，所述人OX40抗原為重組人OX40-ECD-Fc，具體地，所述抗原為OX40的胞外區連接Fc構成的重組融合蛋白； (b) 利用免疫後的HCAb轉基因小鼠脾B細胞的RNA反轉錄後的cDNA，以及特異性引物擴增人VH基因； (c) 將擴增的VH基因構建到編碼人IgG抗體重鏈Fc結構域序列的哺乳動物細胞表達載體中；和 (d) 純化步驟(c)獲得的全人源OX40單抗。較佳地，所述IgG抗體為IgG1抗體或IgG4抗體。

在一些實施方案中，利用Harbour H2L2轉基因小鼠（以下簡稱H2L2轉基因小鼠）製備第一方面的特異性抗體或其抗原結合片段或者第二方面的雙特異性抗體的第一結構域。

所述H2L2轉基因小鼠是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，其產生的抗體具有完整的人的抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。

較佳地，所述利用H2L2轉基因小鼠製備第一方面的特異性抗體或其抗原結合片段或者第二方面的雙特異性抗體的的第一結構域的方法包括如下步驟： (a) 利用人PD-1免疫H2L2轉基因小鼠，更較佳地，所述人PD-1抗原為可溶性的重組人PD-1-hFc，具體地，所述抗原為PD-1連接Fc構成的重組融合蛋白； (b) 免疫後的H2L2轉基因小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞系融合得到雜交瘤細胞，分離的雜交瘤表達具有完整的人可變結構域和大鼠恆定結構域的重鏈和輕鏈的抗體分子； (c) 將步驟(b)獲得的抗體輕鏈可變結構域序列（VL）通過基因合成並選殖到編碼人抗體κ輕鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表達載體中，以編碼產生抗體的全長輕鏈； (d) 將步驟(b)獲得的抗體重鏈可變結構域序列（VH）通過基因合成並選殖到編碼人IgG抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表達載體中，以編碼產生IgG抗體的全長重鏈； (e) 將步驟(c)和(d)的表達載體同時轉染哺乳動物宿主細胞，利用常規的重組蛋白表達和純化技術，可以得到輕重鏈正確配對組裝的重組抗體。

較佳地，將步驟(b)獲得的抗體重鏈可變結構域序列（VH）通過基因合成並選殖到編碼人IgG4抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表達載體中，以編碼產生IgG4抗體的全長重鏈。

可選地，將步驟(b)獲得的抗體重鏈可變結構域序列（VH）通過基因合成並選殖到編碼人IgG1抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表達載體中，以編碼產生IgG1抗體的全長重鏈。

在一些實施方案中，將所製備的第二結構域和所製備的第一結構域組合成特異性結合蛋白。所述特異性結合蛋白可以同時結合兩個靶點，其中第一結構域可以識別腫瘤細胞表面特異表達的PD-1，而第二結構域可以結合T細胞上的OX40分子，所述特異性結合蛋白結合到腫瘤細胞表面後，可以招募並啟動腫瘤細胞附近的T細胞，從而殺死腫瘤細胞。

在一些實施方案中，將所製備的第二結構域和所製備的第一結構域構建成雙特異性結合蛋白。所述雙特異性結合蛋白可以同時結合兩個靶點，其中第一結構域可以識別腫瘤細胞表面特異表達的PD-1，而第二結構域可以結合T細胞上的OX40分子，所述特異性結合蛋白結合到腫瘤細胞表面後，可以招募並啟動腫瘤細胞附近的T細胞，從而殺死腫瘤細胞。

較佳地，所述雙特異性結合蛋白為二價結構或為四價對稱結構。更佳地，所述雙特異性結合蛋白為四價對稱結構。

較佳地，所述雙特異性結合蛋白具有第二方面中所述的結構和序列。

第七方面，本發明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含第一方面所述的抗體或其抗原結合片段或第二方面所述的雙特異性抗體，以及藥學上可接受的載體。

在一些實施方案中，所述藥物組合物還包括其他的成分作為活性成分，例如其他的小分子藥物或者抗體或多肽作為活性成分。

所述的藥學上可接受的載體可為本領域常規的載體，所述的載體可以為任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物輔料。所述的藥物輔料為本領域常規的藥物輔料，較佳地包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。更佳地，所述的藥物組合物包括0.01~99.99%的所述特異性結合蛋白和/或其他的小分子藥物或者抗體或多肽，以及0.01~99.99%的藥用載體，所述百分比為占所述藥物組合物的品質百分比。

所述的藥物組合物的給藥途徑可以是經腸胃外、注射或口服給藥。所述藥物組合物可以製備成適於給藥的形式，例如固體、半固體或液體的形式，可以為水溶液、非水溶液或混懸液，粉末、片劑、膠囊、顆粒、注射劑或輸注劑的形式。可以經血管內、皮下、腹膜內、肌內、吸入、鼻內、氣道滴注或胸腔內滴注施用。所述藥物組合物還可以氣霧劑或噴霧劑的形式施用，例如經鼻施用；或者，鞘內、髓內或心室內施用，還可以經透皮、經皮、局部、腸內、陰道內、舌下或經直腸施用。所述的藥物組合物可根據需要製成各種劑型，並可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。

在一些實施方案中，所述藥物組合物中的特異性結合蛋白與其他的活性成分可以同時給藥或者按順序給藥。

在一些實施方案中，所述特異性結合蛋白是雙特異性結合蛋白。

第八方面，本發明提供了第一方面所述的抗體或其抗原結合片段、第二方面所述的雙特異性抗體、第三方面所述的分離的核酸分子、第七方面的藥物組合物在製備用於預防、治療和/或診斷免疫性疾病，急性和慢性炎性疾病，以及腫瘤疾病的藥物中的應用。

所述腫瘤可以為乳腺癌、腎細胞癌、黑色素瘤、結腸癌，以及B細胞淋巴瘤，黑色素瘤，頭頸癌，膀胱癌，胃癌，卵巢癌，惡性肉瘤，尿路上皮癌，肝癌，食道癌，胃食道交界癌，鼻咽癌，小細胞肺癌，子宮頸癌，子宮內膜癌，胰腺癌，前列腺癌，膠質瘤，非小細胞肺癌，急性粒細胞白血病，霍奇金淋巴瘤，皮膚鱗狀細胞癌，局部晚期或轉移性惡性腫瘤等。

所述炎性疾病可以為特應性皮炎、潰瘍性結腸炎等。

所述免疫性疾病可以為移植物抗宿主病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、哮喘等。

第九方面，本發明提供了用於檢測樣品中的OX40和PD-1的方法，所述方法包括用第一方面所述的抗體或抗原結合片段或第二方面的雙特異性抗體檢測樣品中的OX40和PD-1的步驟。

所述樣品可以是生物學樣品，例如，全血，紅血細胞濃縮物，血小板濃縮物，白細胞濃縮物，組織，骨髓吸出物，血漿，血清，腦脊液，糞便，尿液，培養的細胞，唾液，口腔分泌物，和鼻腔分泌物等生物學樣品。

在一些實施方案中，所述檢測樣品中的OX40和PD-1的方法出於非診斷的目的。

第十方面，本發明還提供了一種套裝藥盒，該套裝藥盒包括一個或多個藥盒，包含如本發明第一方面所述的抗體或其抗原結合片段或第二方面所述的雙特異性抗體或如本發明第七方面所述的藥物組合物。

在一些實施方案中，所述套裝藥盒包括第一藥盒，所述第一藥盒包括第一方面的抗體或其抗原結合片段，或者第二方面所述的第一結構域和第二結構域組成的雙特異性抗體。

在一些實施方案中，所述套裝藥盒可以進一步包括第二藥盒，所述第二藥盒包括其他治療劑，所述其他治療劑包括，但不限於化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物。

在一些實施方案中，上述第一藥盒和第二藥盒可以同時使用，也可以先使用上述第一藥盒再使用上述第二藥盒，還可以先使用上述第二藥盒再使用上述第一藥盒，可以根據具體應用時的實際需求而定。

第十方面，本發明提供了預防、治療和/或診斷免疫性疾病、急性和慢性炎性疾病以及腫瘤疾病的方法，其包括向受試者施用治療有效量的本發明第一方面抗體或其抗原結合片段或第二方面所述的雙特異性抗體或第七方面所述的藥物組合物。

本發明的特異性結合蛋白具有如下技術效果： 1，本發明的PD-1的特異性抗體能夠特異性結合表達人PD-1的細胞和表達食蟹猴PD-1的細胞； 2，本發明的PD1xOX40雙特異性抗體的第一結構域能夠特異性結合表達人PD-1的細胞和表達食蟹猴PD-1的細胞；第二結構域能夠結合人OX40蛋白和食蟹猴OX40蛋白；第二結構域在CHO-K1/CD32b交聯條件下顯示出濃度依賴的增強NF-κb訊號通路的作用； 3，本發明的PD1xOX40雙特異性抗體是PD-1交聯依賴型；在CHO-K1/PD-1細胞交聯輔助作用下，特異性的引起濃度依賴的增強NF-κb訊號通路的作用。能夠特異地引起PD-1交聯依賴的OX40介導的NF-κb訊號通路的促進作用，而且其引起的訊號強度與其濃度成正相關關係遞增； 4，本發明的PD-1xOX40雙特異性抗體對PD-1訊號通路有抑制作用；能夠增強TNFα和IFNγ的分泌；對Treg細胞分泌IL-10有抑制作用；能夠促進T細胞中細胞因子Granzyme B的分泌。 5，本發明的PD-1xOX40雙特異性抗體不僅能夠增強效應T細胞的功能和存活，而且還能抑制Treg的抑制性功能；相對於單獨的PD-1單抗和OX40單抗，以及PD-1單抗和OX40單抗的組合顯示出明顯的協同活性。

定義

除非另有定義，否則本發明使用的所有技術術語和科技術語都具有如在本發明所屬領域中通常使用的相同含義。出於解釋本說明書的目的，將應用以下定義，並且在適當時，以單數形式使用的術語也將包括複數形式，反之亦然。

“約”和“大約”通常意指鑒於測量的性質或精度，所測量值的可接受誤差範圍。通常誤差範圍在所給出的值或值範圍的20%範圍內，一般在10%的範圍內，甚至更一般在5%的範圍內。

術語“抗原結合分子”或“特異性結合蛋白”泛指特異性結合抗原決定簇的分子。抗原結合分子包括例如抗體、抗體片段和骨架抗原結合蛋白。

本發明的術語“抗體”涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性和多特異性抗體(例如，雙特異性抗體或三特異性抗體)，單鏈分子以及抗體片段，只要表現出所需的抗原結合活性即可。

本發明的術語“單株抗體”是指從基本上同質的抗體群獲得的抗體，即，除了可能微量存在的變異抗體(例如含有天然存在的突變或在單株抗體製劑的生產過程中產生的，通常以少量存在)之外，所述抗體群所包含的各個抗體是相同的和/或結合相同的表位。與通常包括針對不同抗原決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製劑不同，單株抗體製劑中的每種單株抗體針對抗原上的單個決定簇。

本發明的術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙特異性抗體（diabodies）、和三抗體（triabodies）、共價或非共價連接在一起的抗體片段等。

本發明的術語“雙特異性結合蛋白”或“雙特異性抗體”是指能夠特異性結合至少兩種不同的抗原決定簇，例如各自由一對抗體重鏈可變結構域(VH)和抗體輕鏈可變結構域(VL)形成的兩個結合位點與不同抗原或同一抗原上的不同表位結合。雙特異性抗體可以是1+1形式，2+1形式(包含第一抗原或表位的兩個結合位點和第二抗原或表位的一個結合位點)或2+2形式(包含第一抗原或表位的兩個結合位點和第二抗原或表位的兩個結合位點)。通常，雙特異性抗體包含兩個抗原結合位點，每個抗原結合位點特異性針對不同的抗原決定簇。

本發明的術語“價”表示抗原結合分子存在指定數目的結合結構域。因此，術語“二價”“四價”和“六價”分別表示抗原結合分子中存在兩個結合結構域、四個結合結構域和六個結合結構域。所述雙特異性抗體至少是“二價的”，並且可以是“三價的”“四價的”或“更多價的”)。在一些情況下，所述抗體具有兩個或更多個結合位點並且是雙特異性的。也就是說，即使在存在多於兩個結合位點(即抗體是三價的或多價的)的情況下，抗體也可以是雙特異性的。

本發明的術語“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指代與天然抗體結構基本上相似的抗體。“天然抗體”是指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG類抗體是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由二硫鍵鍵合的兩條輕鏈和兩條重鏈組成。從N末端到C末端，每條重鏈具有可變區(VH)(也稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)和三個恆定結構域(CH1、CH2和CH3)(也稱為重鏈恆定區)。從N末端到C末端，每條輕鏈具有可變區(VL)(也稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)和輕鏈恆定結構域(CL)(也稱為輕鏈恆定區)。抗體的重鏈可以是五種類型中的一種，所述五種類型為α(IgA)、δ(IgD)、ɛ(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，還可以進一步分為亞型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗體的輕鏈基於其恆定結構域的胺基酸序列，可以是兩種類型中的一種，所述兩種類型為κ輕鏈和λ輕鏈。

在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區通過大約12或更多個胺基酸的“J”區連接，重鏈還包含大約3個或更多個胺基酸的“D”區。各重鏈由重鏈可變區 (VH) 和重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域(CH1、CH2和CH3) 組成。各輕鏈由輕鏈可變區 (VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞（例如，效應細胞）和經典補體系統的第一組分(C1q)的結合。

“抗體片段”包含完整抗體的一部分。抗體片段的示例包括但不限於Fab、Fab’、F(ab’) ₂和Fv；雙體抗體、三體抗體、四體抗體、交叉Fab片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；由抗體片段和單結構域抗體形成的多特異性抗體。

本發明的術語“抗原結合結構域”或“抗原結合位點”是指抗原結合分子中特異性結合抗原決定簇的部分。更具體地，術語“抗原結合結構域”是指抗體的一部分，所述部分包含與抗原的一部分或全部特異性結合並互補的區域。在抗原分子很大的情況下，抗原結合分子可以僅結合抗原的特定部分，該部分稱為表位。抗原結合結構域可以由例如一個或多個可變結構域(也稱為可變區)提供。較佳地，抗原結合結構域包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)。在一個方面，抗原結合結構域能夠結合其抗原並阻斷或部分阻斷所述抗原的功能。

本發明的術語“抗原決定簇”與“抗原”和“表位”同義，並且是指多肽大分子上的位點(例如一段連續的胺基酸或由非連續胺基酸的不同區域組成的構象構型)，抗原結合部分與所述位點結合，從而形成抗原結合部分-抗原複合物。抗原決定簇可以存在於例如腫瘤細胞的表面、微生物感染細胞的表面、其他患病細胞的表面、免疫細胞的表面、血清中游離物和/或細胞外基質(ECM)中。除非另有說明，本發明中用作抗原的蛋白可以是任何脊椎動物來源的任何天然形式的蛋白質，所述脊椎動物來源包括諸如靈長類動物(例如人類)和齧齒類動物(例如小鼠和大鼠)等哺乳動物。抗原也可以是人蛋白質，或者抗原為“全長”、未加工的蛋白質，以及由細胞內加工而產生的任何形式的蛋白質，或者為天然存在的蛋白質變體，例如剪接變體或等位基因變體。

“特異性結合”是指對於抗原具有結合選擇性，並且可以與不需要的或非特異性的結合區分開來。抗原結合分子與特定抗原結合的能力可以通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)或本領域技術人員熟悉的其他技術(例如表面電漿共振(SPR)技術以及傳統的結合測定進行測量。在一個實施例中，例如通過SPR所測得的，抗原結合分子與不相關蛋白的結合程度小於所述抗原結合分子與抗原的結合程度的約10%。在某些實施例中，與抗原結合的分子的解離常數(Kd)為≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10 ^-7M或更低，例如10 ^-7M至10 ^-13M，例如10- ⁹M至10 ^-13M)。

“親和力”或“結合親和力”是指分子(例如抗體)的單個結合位點與其結合配體(例如抗原)之間的非共價相互作用的強度。結合親和力通常可以用解離常數(Kd)表示，解離常數(Kd)是解離速率常數與締合速率常數(分別為k _off和k _on)的比率。因此，等效親和力可以包括不同的速率常數，只要速率常數的比率保持相同即可。親和力可以通過本領域已知的常規方法測量，例如表面電漿共振(SPR)。

本發明的術語“高親和力”是指抗體對靶抗原的Kd為10 ^-9M或更低，甚至10 ^-10M或更低。本發明的術語“低親和力”是指抗體的Kd為10 ^-8M或更高。

“親和力成熟的”的抗體是指在一個或多個高變區(HVR)中具有一個或多個修飾的抗體，與不具有此類修飾的親本抗體相比，此類修飾導致了抗體對抗原親和力的改善。

本發明的術語“單域抗體”和“奈米抗體”具有相同的含義，指僅具有抗體重鏈的可變區，構建僅由一個重鏈可變區組成的單域抗體，它是具有完整功能的最小的抗原結合片段。

本發明的術語“重鏈抗體”也稱為HCAb抗體，是指相對雙鏈抗體（免疫球蛋白）來說，缺失抗體輕鏈，只包含重鏈的抗體，具體來說包含重鏈可變結構域和Fc恆定結構域。

術語“包含特異性結合PD1的第一抗原結合結構域和特異性結合OX40的第二抗原結合結構域的雙特異性抗體”“特異性結合PD1和OX40的雙特異性抗體”“特異於PD1和OX40的雙特異性抗原結合分子”或“抗PD1/抗OX40抗體”或“PD-1xOX40雙特異性抗體”在本文中可互換使用，並且是指能夠以足夠的親和力結合PD1和OX40，使得該抗體可用作靶向PD1和OX40的診斷和/或治療劑的雙特異性抗體。

本發明的術語“T效應細胞”指具有細胞溶解活性的T細胞(例如，CD4+及CD8+T細胞)以及T輔助(Th)細胞，T效應細胞分泌細胞因子、且啟動並引導其他免疫細胞，但不包括調控性T細胞(Treg細胞)。本發明的所述抗OX40抗體可啟動T效應細胞，例如CD4+及CD8+T效應細胞。

本發明的術語“調節性T細胞”或“Treg細胞”是指特殊類型的CD4+T細胞，能阻斷其它T細胞的應答。Treg細胞特徵在於表達CD4，IL-2受體的α亞基(CD25)和轉錄因子FOXP3，並且在誘導和維持外周自體耐受中發揮至關重要的作用，所述耐受針對腫瘤表達的抗原。

本發明的術語“PD1”，也稱為程式性細胞死亡蛋白1，是一種由288個胺基酸組成的I型膜蛋白，是免疫球蛋白超家族，最早公開於1992年(Ishida等人, EMBO J., 11(1992), 3887-3895)。PD-1是擴展的CD28/CTLA-4家族T細胞調節因子的成員，並具有至少兩個配體PD-L1(B7-H1、CD274)和PD-L2(B7-DC、CD273)。蛋白質結構包括細胞外IgV結構域，然後是跨膜區和細胞內尾部。細胞內尾部含有位於免疫受體酪胺酸基的抑制基序和免疫受體酪胺酸基的開關基序中的兩個磷酸化位點，表明PD-1負調節T細胞受體TCR訊號。這與配體結合後SHP-1磷酸酶和SHP-2磷酸酶與PD-1的細胞質尾部的結合一致。雖然PD-1不在原初T細胞上表達，但在T細胞受體(TCR)介導的啟動後上調，並且在啟動的和耗竭的T細胞上都被觀察到(Agata等人，Int. Immunology 8(1996),765-772)。這些耗竭的T細胞具有功能障礙的表型並且不能適當地作出反應。儘管PD-1具有相對較寬的表達譜，但其最重要的作用可能是作為T細胞上的共抑制受體(Chinai等人，Trends in Pharmacological Sciences 36(2015),587-595)。因此，目前的治療方法主要是阻斷PD-1與其配體的相互作用以增強T細胞應答。術語“程式性死亡1”“程式性細胞死亡1”“蛋白質PD-1”“PD-1”“PD1”“PDCD1”“hPD-1”和“hPD-I”可互換使用，並且包括人PD-1的變體、同種型、物種同源物，以及與PD-1具有至少一個共同表位的類似物。人PD1的胺基酸序列顯示於UniProt(www.uniprot.org)登錄號Q15116中。

本發明的術語“PD1抗體”能夠結合PD1，尤其是在細胞表面上表達的PD1多肽，並具有足夠的親和力以使得所述抗體可用作靶向PD1的診斷和/或治療劑。通常情況下，經放射免疫測定(RIA)或流式細胞術(FACS)或使用生物感測器系統通過表面電漿共振測定，PD1抗體與不相關的非PD1蛋白的結合能力小於所述抗體與PD-1的結合能力的約10%。在某些實施方案中，結合人PD1的抗原結合蛋白的KD值≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10 ^-8M或更低，例如10 ^-13M至10 ^-8M，例如10 ^-13M至10 ^-9M)。在一些實施方案中，在表面電漿共振測定中，使用人PD1(PD1-ECD)測定結合親和力的相應KD值，以獲得PD-1結合親和力。PD-1/PD-L1抗體的治療策略是幾種轉移性腫瘤中的標準治療策略，並已顯示出它們在早期疾病階段和輔助治療中的作用，尤其是黑色素瘤和非小細胞肺癌。

本發明的術語“OX40”又稱CD134，表達於啟動後1-3天的活化CD4+T細胞，以及CD8+T細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞和Treg細胞等。OX40的配體OX40L表達於樹突狀細胞、B細胞等抗原呈遞細胞（APC）的表面。OX40/OX40L的相互作用能夠在OX40的胞內區域內招募TRAF分子，也可啟動經典的NF-κB1途徑或非經典的NF-κB2途徑、PI3k/PKB和NFAT途徑，進而調控T細胞分裂和存活的基因，以及促進細胞因子基因的轉錄以及細胞因子受體的表達，還能促進B細胞分化成漿細胞，促進抗體產生等，換句話說，可增強效應T細胞、NK、NK-T細胞活性，解除Treg的免疫抑制作用，既可增強特異性免疫反應，也可增強固有免疫反應，從而增強抗腫瘤免疫。

本發明的術語“OX40抗體”能夠結合OX40，並具有足夠的親和力以使得所述抗體可用作靶向OX40的診斷和/或治療劑。通常情況下，經放射免疫測定(RIA)或流式細胞術(FACS)或使用生物感測器系統通過表面電漿共振測定，OX40抗體與不相關的OX40蛋白的結合能力小於所述抗體與OX40的結合能力的約10%。在某些實施方案中，結合OX40的抗體具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10 ^-8M或更低，例如10 ^-13M到10 ^-8M，例如10 ^-13M到10 ^-9M)的解離常數(KD)。

本發明中的術語“H2L2轉基因小鼠”或“Harbour H2L2小鼠”是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，所述小鼠產生具有完全人可變區的由兩條重鏈和兩條輕鏈(H2L2)組成的傳統四聚體抗體，具有完整的人抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。由所述轉基因小鼠所產生的抗體親和力成熟，可變區完全人源化，並且具有優異的溶解性。

本發明中的術語“HarbourHCAb小鼠”（WO2002/085945A2）是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc的恆定結構域。由於不含輕鏈這一特點，該僅“重鏈”抗體幾乎解決了輕鏈錯配和異源二聚化的問題，使得這一技術平臺能夠開發出傳統抗體平臺難以實現的產品。

本發明的術語“可變區”或“可變結構域”是指參與抗原結合分子與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域(分別為VH和VL)通常具有相似的結構，其中每個結構域包含四個保守框架區(FR)和三個高變區(HVR)。單個VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。

本發明的術語“可變”是指可變域的某些區段在抗體之間在序列上普遍不同。V結構域介導抗原結合並限定特定抗體對於其特定抗原的特異性。然而，可變性在整個可變域並非均勻分佈的。相反，集中於輕鏈與重鏈可變域內三個稱為高變區(HVR)的區段中。可變域的更高度保守部分被稱作框架區(FR)。天然重鏈與輕鏈的可變域各自包含四個FR區，大部分採用β-折疊構型，由三個HVR連接，其形成環連接，並且在一些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的HVR通過FR區緊密保持在一起，並且與其它鏈的HVR一起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat等, Sequences of Immunological Interest, 第5版, National Institute of Health, Bethesda, MD(1991))。恆定域不直接參與抗體與抗原的結合，具有其他效應功能，例如參與抗體的抗體依賴性細胞毒性。

本發明的術語“高變區”或“HVR”是指在抗體可變結構域區域中序列上高變和/或形成結構上限定的環(“高變環”)的區域。通常，天然四鏈抗體包含六個HVR：三個存在於VH中(H1、H2、H3)，三個存在於VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自高變環和/或來自“互補決定區(CDR)”的胺基酸殘基，來自“互補決定區(CDR)”的胺基酸殘基具有最高的序列可變性和/或參與抗原識別。示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)發生在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)處(Chothia等人, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)。示例性CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)發生在胺基酸殘基24-34(L1)、胺基酸殘基50-56(L2)、胺基酸殘基89-97(L3)、胺基酸殘基31-35(H1)、胺基酸殘基50-65(H2)，以及胺基酸殘基95-102(H3)處(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)。作為比較，在表2中列出了包含上文引用的參考文獻中所定義的CDR的相應胺基酸殘基。在本發明中，上述所列CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的（本發明的請求項中也是按照Chothia定義規則所示出的序列）。但是，本領域人員公知，在本領域中可以通過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則和基於結構環區域位置的Chothia定義規則（參見J Mol Biol 273:927-48, 1997）。在本發明中，還可以使用包含Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區（例如可變區）的“CDR”及“互補決定區”應理解為涵蓋如通過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。

表2. 各CDR區的胺基酸編號系統（可參見http://bioinf.org.uk/abs/）

CDR\編號體系	Kabat	Chothia	Combined
LCDR1	24-34	26-32	24-34
LCDR2	50-56	50-52	50-56
LCDR3	89-97	91-96	89-97
HCDR1	31-35	26-32	26-35
HCDR2	50-65	52-58	50-65
HCR3	95-102	95-102	95-102

“框架”或“FR”是指除高變區(HVR)殘基之外的可變結構域殘基。可變結構域的FR通常由以下四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

抗體的“類別”是指抗體的重鏈所具有的恆定結構域或恆定區的類型。存在五類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些類別中的若干可以進一步分為亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ɛ、γ和μ。

“人源化抗體”包含來自非人HVR的胺基酸殘基和來自人FR的胺基酸殘基。在某些實施例中，人源化抗體包含至少一個，通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)對應於非人抗體的HVR，並且所有或基本上所有的FR對應於人抗體的FR。人源化抗體任選地可以包含來源於人抗體的抗體恆定區的至少一部分。“人源化形式”的抗體，例如非人抗體，是指已經進行了人源化的抗體。

“人抗體”具有的胺基酸序列與由人或人細胞產生的或來源於利用人抗體庫或其他人抗體編碼序列的非人來源的抗體的胺基酸序列相對應。人抗體的該定義特別地排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。

本發明的術語“Fc結構域”或“Fc區”用於定義含有恆定區的至少一部分的抗體重鏈C末端區域。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。IgG Fc區包含IgG CH2結構域和IgG CH3結構域。本文的CH2結構域可以是天然序列CH2結構域或變體CH2結構域。本文的CH3結構域可以是天然序列CH3結構域或變體CH3結構域。CH2結構域可包含一種或多種減少或消除CH2結構域結合一種或多種Fcγ受體(例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII)和/或補體的突變。推測減少或消除與Fc受體γ的結合將減少或消除抗體分子介導的ADCC。類似地，減少或消除與補體的結合預期將減少或消除抗體分子介導的CDC。減少或消除CH2結構域與一種或多種Fcγ受體和/或補體結合的突變是本領域已知的(Wang等，2018)。這些突變包括所謂的LALA突變”，所述突變涉及將CH2域的IMGT位置的1.3和1.2處的白胺酸殘基替換為丙胺酸(L1.3A和L1.2A)。或者，通過將CH2結構域中IMGT位置的84.4位的天冬醯胺(N)突變為丙胺酸、甘胺酸或麩醯胺酸(N84.4A、N84.4G或N84.4Q)，從而將保守的N-鏈糖基化位點突變產生a-糖基抗體，以降低IgG1效應子功能也是已知的(Wang等，2018)。作為另一選擇，已知補體啟動(C1q結合)和ADCC可通過將CH2結構域的IMGT位置第114位的脯胺酸突變為丙胺酸或甘胺酸(P114A或P114G)而降低(Idusogie等，2000；Klein等，2016)。這些突變可以被組合，以產生具有進一步降低或沒有ADCC或CDC活性的抗體分子。

抗體的“抗原結合部分”或“抗原結合片段”是指保留與給定抗原（例如PD-1或OX4）特異性結合的能力的完整抗體的一或多個片段。抗體的抗原結合功能可由完整抗體的片段執行。術語抗體的抗原結合部分或抗原結合片段的實例包括，但不限於，Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1結構域組成的單價片段；F(ab) ₂片段，一種包含兩個Fab片段的二價片段，該兩個Fab片段經位於鉸鏈區的二硫橋鍵連接；Fd片段，其由VH及CH1結構域組成；Fv片段，其由抗體的單臂的VL及VH結構域組成；單域抗體（dAb）片段，其由VH結構域或VL結構域組成；及分離的互補決定區（CDR）。

“與免疫球蛋白的Fc區等同的區域”包括免疫球蛋白Fc區的天然存在等位基因的變體，以及具有取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介導的效應子功能(諸如抗體依賴性細胞毒性)的能力的修飾變體。例如，可以使一個或多個胺基酸從免疫球蛋白的Fc區的N末端或C末端缺失，而基本上不喪失生物學功能。可以根據本領域中已知的一般規則來選擇此類變體，以便對活性具有最小的影響(參見例如Bowie, J.U.等人，Science 247:1306-10(1990))。

本發明的術語“效應子功能”可歸因於抗體的Fc區，是隨著抗體同種型的變化而變化的生物活性。抗體效應子功能的示例包括：C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫複合物介導的抗原呈遞細胞的抗原攝取、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)，以及B細胞啟動等。

本發明的術語“肽接頭”或者“連接肽”是指包含一個或多個胺基酸，通常為約2至20個胺基酸的肽。連接肽是本領域中已知的連接肽或在本文中描述的連接肽。

本發明的術語“融合至”“融合連接”或“連接至”是指區段(例如抗原結合結構域和FC結構域)或者直接地或經由一個或多個連接肽而通過肽鍵連接。

本發明還涉及本發明的雙特異性抗體的胺基酸序列變體。雙特異性抗體的胺基酸序列變體可以通過向編碼分子的核苷酸序列中引入適當的修飾或通過肽合成來製備。這類修飾包括例如抗體胺基酸序列中殘基的缺失、插入和/或取代。可以進行缺失、插入和取代的任何組合獲得最終的構建體，最終構建體具有所需的特性，例如抗原結合活性。用於取代的位點通常包括HVR和框架(FR)。參見表3中胺基酸的可能取代。

表3. 保守胺基酸取代

胺基酸殘基	保守取代	優選保守取代
Ala(A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg(R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn(N)	Gln; His; Asp; Lys; Arg	Gln
Asp(D)	Glu; Asn	Glu
Cys(C)	Ser; Ala	Ser
Gln(Q)	Asn; Glu	Asn
Glu(E)	Asp; Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
His(H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile(I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Nle	Leu
Leu(L)	Nle; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys(K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met(M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe(F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Val; Ser	Ser
Trp(W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val(V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Nle	Leu

本發明的術語“多核苷酸”或“核酸”或“核苷酸序列”或“核酸分子”指分離的核酸分子或構建物，例如信使RNA(mRNA)，病毒衍生的RNA或質粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常規的磷酸二酯鍵或非常規鍵(例如醯胺鍵,諸如在肽核酸(PNA)中找到的)。術語“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一個或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。

本發明的術語“分離的”核酸分子或多核苷酸是指已經與其天然環境分隔開的核酸分子，DNA或RNA。在本發明中，載體中包含的編碼多肽的重組多核苷酸也是分離的。分離的多核苷酸的其他實例包括在異源宿主細胞中的重組多核苷酸或溶液中純化的多核苷酸。分離的多核苷酸包括通常是含有該多核苷酸分子的細胞中所含有的多核苷酸分子，但是該多核苷酸分子存在於染色體外或與其天然染色體位置不同的染色體位置。分離的RNA分子包括本發明的體內或體外RNA轉錄物，為正和負鏈形式，以及雙鏈形式。本發明的分離的多核苷酸或核酸進一步包括合成生成的此類分子。另外，多核苷酸或核酸可以為或可以包括調節元件，諸如啟動子，核糖體結合位點,或轉錄終止子。

本發明的術語“表達盒”指重組或合成生成的多核苷酸，具有允許特定核酸在靶細胞中轉錄的一系列核酸元件。重組表達盒可導入質粒，染色體，線粒體DNA，質體DNA，病毒或核酸片段。典型地，在其它序列以外，表達載體的重組表達盒部分包括要轉錄的核酸序列和啟動子。在某些實施方案中，本發明的表達盒包含編碼本發明的雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列。

本發明的術語“載體”或“表達載體”與“表達構建物”可以互換使用，將與其可操作連接的特定基因導入靶細胞並指導表達的DNA分子。所述載體包括作為自身複製性核酸結構的載體以及併入其已經導入的宿主細胞的基因組的載體。本發明的表達載體包含表達盒。表達載體可以進行大量穩定mRNA的轉錄。一旦表達載體在靶細胞內，則由細胞轉錄和/或轉譯機制生成由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施方案中，本發明的表達載體包括含有編碼本發明的雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列的表達盒。

術語“宿主細胞”“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可互換使用，是指其中已經導入外源核酸的細胞，還包括這類細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體/轉化子”和“轉化細胞”，包括原代轉化細胞以及由其衍生的後代。後代的核酸與親本細胞可以不完全一致，可含有突變。宿主細胞是可用於生成本發明的雙特異性抗原結合分子的任何類型的細胞。宿主細胞包括培養的細胞，例如培養的哺乳動物細胞，諸如CHO細胞，HEK293細胞，BHK細胞，NS0細胞，SP2/0細胞，YO骨髓瘤細胞，P3X63小鼠骨髓瘤細胞，PER細胞，PER.C6細胞或雜交瘤細胞，酵母細胞，昆蟲細胞和植物細胞，還包括轉基因動物，轉基因植物或培養的植物或動物組織內所包含的細胞。

藥物的“有效量”指在接受其施用的細胞或組織中導致生理變化所必需的量。“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用的嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

依照本發明的雙特異性抗體具有協同效應。“協同效應”是指兩種藥物的組合效果大於它們單獨的效果之和且在統計學上不同於對照和單一藥物。本發明的疊加效應是指兩種藥物的組合效果是它們單獨的效果之和且在統計學上不同於對照和/或單一藥物。

藥物(例如藥用組合物)的“治療有效量”指在劑量和給藥間隔和時間上有效實現想要的治療或預防效果必需的量。例如，治療有效量的藥物消除、減輕/減少、延遲、最小化或預防疾病的不利影響。

“個體”或“受試者”是指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物(例如牛，綿羊，貓，犬和馬)，靈長類動物(例如人和非人靈長類，諸如猴)，家兔和齧齒類動物(例如小鼠和大鼠)。具體地，個體或受試者是人。

“藥物組合物”表示含有一種或多種本公開的抗體或其抗原結合片段與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體或賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

“藥學可接受的載體”指藥用組合物中除了活性組分以外，對受試者無毒的組分。藥學可接受賦形劑包括但不限於緩衝劑，稀釋劑，穩定劑和/或防腐劑。

術語“癌症”是指描述哺乳動物中以細胞生長不受調節為特徵的疾病。癌症的例子包括但不限於腫瘤，淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。癌症更具體的實例包括但不限於鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)、骨癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮頸癌、唾液腺癌、腎癌或輸尿管癌、前列腺癌、陰道癌、外陰癌、甲狀腺癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、膽管癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、脊椎軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、成髓細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤和尤文氏肉瘤、淺表擴散性黑素瘤、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端黑素瘤、結節性黑素瘤、多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病和移植後淋巴增殖性疾病(PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關的異常血管增殖、腦瘤和腦癌、以及頭或頸癌和相關的轉移癌。

“治療”是指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開的任一種特異性結合蛋白，雙特異性抗體，抗體或其抗原結合片段的組合物或編碼特異性結合蛋白，雙特異性抗體，抗體或其抗原結合片段的核酸分子，所述患者具有一種或多種疾病或症狀，所述治療劑對這些疾病或症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病或症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。

術語“預防癌症”是指在哺乳動物中延遲、抑制或防止癌症發作，所述哺乳動物中癌發生或腫瘤發生的起始尚未得到證實，但是通過例如遺傳篩查或其它方法確定，已鑒定其具有癌症易感性。該術語還包括治療具有癌變前病症的哺乳動物以終止所述癌變前病症向惡性腫瘤的進展或導致其消退。

術語“脂質體”是指包括通過產生封閉的脂質雙層或聚集體形成的多種單層和多層脂質載體。脂質體可表徵為具有磷脂雙層膜和內部水性介質的囊泡結構。多層脂質體具有由水性介質分開的多個脂質層。它們在磷脂懸浮於過量的水溶液中時自發形成。

術語“施用”是指向有需要的受試者提供本發明的特異性結合蛋白、分離的核酸分子、表達載體、宿主細胞或藥物組合物，例如通過口服、注射、局部給藥的方式向受試者施用。

本發明的抗體的輕鏈、重鏈及可變區的序列編號（SEQ ID NO:）見表4。

表4.本發明的抗體的輕鏈、重鏈及可變區的序列編號（SEQ ID NO:）

抗體編號	輕鏈	重鏈	VL	VH	LCDR1	LCDR2	LCDR3	HCDR1	HCDR2	HCDR3
PR000674	77	71	67	62	39	46	54	8	18	28
PR001985	77	72	67	62	39	46	54	8	18	28
PR006429	77	106	67	102	39	46	54	81	86	91
PR002063		105		101				9	85	90
PR000150	75	69	65	60	37	44	52	6	16	26
PR000324	76	70	66	61	38	45	53	7	17	27
PR002067		73		63				9	19	29
PR003475	78	74	68	64	40	47	55	10	20	30
PR200526	108	107	104	103	95	97	99	82	87	92

本發明的抗體的框架區的序列編號（SEQ ID NO:）見表5。

表5.本發明的抗體的框架區的序列編號（SEQ ID NO:）

抗體編號	VH FWR1	VH FWR2	VH FWR3	VH FWR4	VLFWR1	VLFWR2	VLFWR3	VLFWR4
PR000674	3	13	23	33	34	41	50	58
PR001985	3	13	23	33	34	41	50	58
PR000150	1	11	21	31	34	41	48	56
PR000324	2	12	22	32	35	42	49	57
PR002067	4	14	24	33
PR003475	5	15	25	33	36	43	51	59
PR006429	3	13	23	33	34	41	50	58
PR002063	4	83	88	93
PR200526	80	84	89	33	94	96	98	100

下面顯示的實施例意在說明本發明的具體實施方案，並且不意在以任何方式限制本說明書或申請專利範圍的範圍。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法．這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E．F．和Maniais，T．（1989）Molecular Cloning： A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。實施例1抗OX40全人源HCAb抗體的獲得

Harbour HCAb小鼠（Harbour Antibodies BV，WO 2002/085945 A3）是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，能夠產生全新的僅“重鏈”抗體，該抗體的大小只有傳統IgG抗體的一半。其產生的抗體僅具有人的抗體“重鏈”可變結構域和小鼠Fc恆定結構域。由於不含輕鏈的這一特點，該抗體幾乎解決了輕鏈錯配和異源二聚化的問題，使得這一技術平臺能夠開發出傳統抗體平臺難以實現的產品。

1.1 免疫HCAb小鼠

6～8周齡的上述Harbour HCAb人源抗體轉基因小鼠利用2組免疫方案對Harbour HCAb小鼠進行多輪免疫。具體為：免疫方案1，用重組的人OX40-ECD-Fc（ChemPartner, #21127-022）抗原蛋白進行免疫。每隻小鼠每次免疫時通過皮下經腹股溝注射或通過腹腔注射接受的總注射劑量是100μL。在首輪免疫中，每隻小鼠用50μg抗原蛋白與完全弗氏佐劑（Sigma,#F5881）以體積比1:1混合配製的免疫原試劑進行免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每隻小鼠接受用25μg抗原蛋白與Ribi佐劑（Sigma Adjuvant System, Sigma,#S6322）混合配製的免疫原試劑的免疫。免疫方案2，用過表達人OX40的HEK293/OX40（ChemPartner, Shanghai）穩定細胞系進行免疫。每隻小鼠每次免疫時腹腔注射2×10 ⁶細胞懸液。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩周，通常不超過五輪增強免疫。免疫時間為第0天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天；並且在第49天、第77天，檢測小鼠血清抗體滴度。在進行HCAb小鼠脾B細胞分離前5天，以每隻小鼠25μgOX40-ECD-Fc（ChemPartner, #21127-022）抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。

採集小鼠血液，對血液進行10倍稀釋，取5個濃度（1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000），在包被有人OX40-ECD-Fc的ELISA板進行ELISA檢測來確定小鼠血液中抗人OX40的滴度，並經流式細胞術檢測2個濃度的小鼠血液（1:100、1:1000）對OX40高表達的CHO-K1/hOX40細胞（Chempartner, Shanghai）和CHO-K1母細胞的特異反應性。空白對照組（PB）為免疫前小鼠的血清。

1.2 獲得抗OX40的HCAb抗體序列

當檢測上述小鼠的血清中OX40特異的抗體滴度達到一定的水平後，從小鼠的脾細胞取出分離B細胞，用BD 流式分選儀（BD Biosciences，FACS AriaII Cell Sorter）分選CD138陽性的漿細胞和人OX40抗原陽性的B細胞群。提取B細胞的RNA，反轉錄cDNA (SuperScript IV First-Strand synthesis system, Invitrogen, #18091200) ，然後用特異性的引物PCR擴增人VH基因。PCR正向引物5’-GGTGTCCAGTGTSAGGTGCAGCTG-3’（SEQ ID NO: 141），PCR反向引物5’- AATCCCTGGGCACTGAAGAGACGGTGACC-3’（SEQ ID NO:142）。將擴增的VH基因片段構建到編碼人IgG1抗體重鏈Fc結構域序列的哺乳動物細胞表達質粒pCAG載體中。

構建好的質粒轉染哺乳動物宿主細胞（如人胚腎細胞HEK293）進行表達獲得HCAb的抗體。檢測表達HCAb的上清與過表達人OX40的穩定細胞系CHO-K1/OX40（CHO-K1/hu OX40，Genscript，#M00561）的結合，同時用陽性抗體(泊加珠單抗)作為陽性對照，進行mirrorball®螢光細胞儀（SPT Labtech Ltd.）篩選。具體步驟是：用無血清的F12K培養基（Thermo，#21127022）洗滌CHO-K1/OX40細胞，將其用無血清的培養基重懸至1×10 ⁶/mL。加入Draq5螢光探針（Cell Signaling Technology，#4048L）(1μL Draq5 至1mL CHO-K1/OX40細胞中，1:1000稀釋)，在避光處培養30分鐘。離心細胞後用培養基洗滌細胞，調整細胞密度至1×10 ⁵細胞/mL。再加入1:1000稀釋後的Alexa Fluor® 488, AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific二抗（Jackson ImmunoResearchLaboratories Inc.，#109-545-098），取每孔30μL的該混合物加入384孔板（Greiner Bio One，#781091）。再在384孔板中加入10μL陽性對照或者表達HCAB的上清，培養2小時。在mirrorball螢光流式儀器上讀取螢光值。陽性純系抗體(clone antibody)進一步與人OX40蛋白（Acrobiosystem，#OX0-H5224）和食蟹猴OX40蛋白（Novoprotein，#CB17）進行ELISA檢測來驗證交叉結合活性。同時進一步通過FACS檢測與CHO-K1/hu OX40#細胞的結合活性。利用常規的測序手段獲得純系抗體的編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列以及對應的胺基酸序列。去除重複序列後將餘下的測序後的純系抗體質粒轉染至HEK293細胞進行表達，獲得的上清再次進行NF-kb功能試驗，這樣得到64個同時結合CHO-K1/hu OX40和食蟹猴OX40蛋白的功能性的具有獨特序列的全人源OX40單株抗體。根據人猴結合能力及NF-Kb功能試驗結果，選擇綜合排名靠前的抗體進行重組表達。

1.3製備抗OX40全人重組抗體

將上述所得的編碼HCAb抗體的質粒轉染哺乳動物宿主細胞（如人胚腎細胞HEK293），利用常規的重組蛋白表達和純化技術，得到純化的抗OX40重組重鏈抗體。具體說來，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基（Thermo, #A1383504）擴培。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6×10 ⁵細胞/mL，於37℃ 8% CO ₂搖床中培養24小時，細胞濃度在1.2×10 ⁶細胞/mL。準備30 mL培養的細胞，將上述編碼HCAb重鏈的30 µg質粒溶解於1.5 mL Opti-MEM無血清培養基（Thermo,#31985088），再取1.5 mL Opti-MEM溶入1 mg/mL PEI（Polysciences, Inc, # 23966-2）120 µL，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質粒中，室溫培養10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質粒PEI混合溶液，於37℃ 8% CO ₂搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300G轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS（pH7.4）平衡含有MabSelect ™（GE Healthcare Life Science,#71-5020-91 AE）的重力柱（Bio-Rad,#7311550），2-5倍柱體積沖洗。將上清樣品過柱。用5-10倍柱體積的PBS沖洗柱子。再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗脫目的蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管（Millipore, #UFC901024）濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗人OX40的HCAb單抗溶液。抗體濃度用NanoDrop檢測280nm吸光度測定，抗體的純度用SEC-HPLC和SDS-PAGE測定。

獲得OX40抗體PR002067和PR002063，其對應的重鏈胺基酸序列參見SEQ ID NO: 73和SEQ ID NO:105。同時本發明生產製備了抗OX40的陽性對照抗體Pogalizumab(泊加珠單抗)類似物（PR003475），其胺基酸序列來源於IMGT數據，抗體重鏈胺基酸序列參見SEQ ID NO: 74，抗體輕鏈胺基酸序列參見SEQ ID NO:78。

1.4 利用HPLC-SEC分析蛋白純度和多聚體

使用分析型分子尺寸排阻層析色譜法（SEC）來分析上述所得抗體蛋白樣品的純度和聚體形式。將分析型色譜柱TSKgel G3000SWxl（Tosoh Bioscience, 08541, 5 µm, 7.8 mm × 30 cm）連接到高壓液相色譜儀（HPLC）（型號Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II），用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品（至少10µg，樣品濃度調整到1 mg/mL）用0.22 µm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用pH 7.4 PBS緩衝液將樣品以1.0 mL/min的流速流過色譜柱，最長時間為20分鐘；檢測波長 280 nm。採集後用ChemStation軟體對色譜圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。

1.5 利用HPLC-HIC分析蛋白純度和疏水性

使用分析型疏水相互作用層析色譜法（HIC）來分析上述所得抗體蛋白樣品的純度和疏水性。將分析型色譜柱TSKge1 Buty1-NPR（Tosoh Bioscience, 14947, 4.6 mm × 3.5 cm）連接到高壓液相色譜儀（HPLC）（型號：Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II），用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。設定方法由16分鐘內從100%流動相A（20 mM 組胺酸，1.8 M 硫酸銨，pH 6.0）至100%流動相B（20 mM 組胺酸，pH 6.0）的線性梯度，流速設定為0.7 mL/min, 蛋白樣品濃度1 mg/mL，進樣體積 20 µL，檢測波長 280 nm。採集後用ChemStation軟體對色譜圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。

1.6 利用DSF測定蛋白分子的熱穩定性

差示掃描螢光法（Differential Scanning Fluorimetry, DSF）是一種常用的高通量的用來測定蛋白質熱穩定性的方法。其使用即時螢光定量PCR儀通過監測與去折疊的蛋白分子結合的染料的螢光強度的變化，來反映蛋白質的變性過程，從而反映出蛋白分子的熱穩定性。本實施例利用DSF方法來測定蛋白分子的熱變性溫度（Tm）。10µg蛋白加入96-孔PCR板（Thermo, #AB-0700/W），接著加入2 µL 100×稀釋的染料SYPROTM（Invitrogen, #2008138），然後加入緩衝液使得終體積為40 µL每孔。將PCR板密封，放置於即時螢光定量PCR儀（Bio-Rad，型號 CFX96 PCR System），先於25℃培養5分鐘，然後以0.2℃/0.2分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃，在測試結束時將溫度降至25℃。使用FRET掃描模式並使用Bio-Rad CFX Maestro軟體進行資料分析並計算出樣品的Tm。

對OX40抗體PR002067和PR002063的理化性質的檢測結果如表6所示。

表6. OX40抗體的理化性質

重組抗體	表達體系和體積	第一步純化後產量 (mg/L)	HPLC-SEC 純度 (%)	濃度 (mg/mL)	內毒素水平 (EU/mg)	總量 (mg)	HPLC-HIC 滯留時間 (min)	DSF TM1 (℃)
PR002067	HEK293 (40mL)	87.5	99.29	3.5	＜1	3.5	17.469	45.4
PR002063	HEK293 (40ml)	137.5	99.3	5.5	＜1	5.5	18.109	51.8

1.7 ELISA檢測OX40的HCAb單抗蛋白水平的結合能力

本實施例是為了研究制得的抗OX40的HCAb單抗體外結合人和食蟹猴OX40蛋白的活性。採用人OX40蛋白（Acro biosystem,#OX0-H5224）和食蟹猴OX40蛋白（Novoprotein,#CB17）進行蛋白水平上的抗體結合實驗。簡言之，在384孔板（PerkinElmer,#6007509）每孔包被20 μL的1ug/mL溶於PBS的人OX40蛋白和食蟹猴OX40蛋白，4℃過夜。第二天用含0.05%吐溫的PBS（MEDICAGO，#09-9410-100）洗滌384孔板三次，用含2%牛奶（Bio-Rad,#170-6404）的PBS在37℃封閉1小時。待測的OX40抗體和陽性抗體（Pogalizumab）起始濃度為10nM，做4倍梯度稀釋。封閉後的384孔板用PBST洗滌三次，在板內加入10 μL PBS或10 μL 4倍梯度稀釋的抗體和陽性對照（Pogalizumab），室溫培養1小時。洗滌三次，每孔加入20 μL羊抗人Fc 辣根過氧化物酶(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., #109-035-098)，37℃培養40分鐘。洗滌三次，每孔加入20 μL TMB（Sera Care，#5120-0077），室溫培養5-15分鐘。每孔加入20 μL終止液（BBI life sciences，#E661006-0200），使用讀板機（Molecular Devices，型號SpectraMax Plus）讀取OD _450-650值。用Graphad 8.0分析該值並做圖。

本實施例的OX40 PR002067抗體和PR002063抗體能結合人OX40和食蟹猴（cyno）OX40蛋白，且檢測到的抗體結合能力與抗體濃度成正相關關係遞增。與參照抗體Tab（Pogalizumab（泊加珠單抗，羅氏）相比，PR002067、PR002063與人OX40蛋白和食蟹猴OX40蛋白結合的EC50與Tab（Pogalizumab）相當，說明該抗體能以較低的濃度更靈敏地結合人OX40。

OX40抗體與人OX40蛋白的結合活性見表7。

表7. OX40抗體與人OX40蛋白的結合活性

抗體	EC50 (pM)	OD 最大值
PR002067	80.6	2.378
PR002063	100.9	2.281
Pogalizumab	82.59	2.134

OX40抗體與食蟹猴OX40蛋白的結合活性見表8。

表8. OX40抗體與食蟹猴OX40蛋白的結合活性

抗體	EC50 (pM)	OD 最大值
PR002067	232	2.163
PR002063	275.8	2.318
Pogalizumab	194.3	2.226

實施例2 抗PD-1 H2L2抗體的製備

為製備針對PD-1特異性結合的抗體分子，通常可以利用PD-1抗原對實驗動物進行免疫，該實驗動物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、駱駝等。通常，其得到的抗體分子是非人源的。在獲得非人源抗體後，需要對這些分子利用抗體工程技術進行人源化改造，以降低免疫原性並提高成藥性。然而，抗體的人源化過程有其技術複雜性，經過人源化改造的分子往往會降低對抗原的親和力。另一方面，轉基因技術的進步使得可以培育出基因工程化小鼠，其攜帶人免疫球蛋白免疫庫並使其內源的鼠的免疫庫缺失。這種轉基因小鼠產生的抗體具有全人源的序列，因而無需再進一步做人源化改造，大大提高了治療性抗體開發的效率。

Harbour H2L2小鼠（Harbour Antibodies BV）是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的轉基因小鼠，其產生的抗體具有完整的人抗體可變結構域和大鼠恆定結構域。

2.1 PD-1免疫H2L2小鼠

用可溶的重組人PD-1-hFc融合蛋白（Shanghai ChemPartner）對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。抗原蛋白與免疫佐劑混合成免疫原試劑，然後通過皮下經腹股溝注射或通過腹腔注射。在每一輪免疫中，每隻小鼠接受的總注射劑量是100μL。在首輪免疫中，每隻小鼠接受用50 μg抗原蛋白（人PD-1-hFc）與完全弗氏佐劑（Sigma, #F5881）以體積比1:1混合配製的免疫原試劑的免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每隻小鼠接受用25 μg抗原蛋白與Ribi佐劑（Sigma Adjuvant System, #S6322）混合配製的免疫原試劑的免疫。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩周，通常不超過五輪增強免疫。免疫時間為第0天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天；並且在第49天、第77天，檢測小鼠血清抗體滴度。在進行細胞融合前3天，以每隻小鼠25 μg抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。

採集小鼠血液，對血液進行10倍稀釋，取5個濃度（1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000），在包被有人PD-1-His（Shanghai ChemPartner）的ELISA板進行ELISA檢測來確定小鼠血液中抗人PD-1的滴度，並經流式細胞術檢測2個濃度的小鼠血液（1:100、1:1000）對PD-1高表達的CHO-K1/hPD-1細胞（Shanghai ChemPartner）和CHO-K1母細胞的特異反應性。空白對照組（PB）為免疫前小鼠的血清。

2.2獲得雜交瘤單株和抗體序列

當檢測H2L2小鼠血清中PD-1特異的抗體滴度達到一定的水平後，將小鼠的脾細胞取出並與骨髓瘤細胞系融合得到雜交瘤細胞；對雜交瘤細胞經過多輪篩選和選殖之後，分離出至少8個表達抗-PD-1的單株抗體分子的雜交瘤。分離的雜交瘤細胞及其表達的單株抗體都使用對應的選殖號來表示，例如：4004_10H9A12，4004_12H9C1 等等。分離的雜交瘤表達具有完整的人可變結構域和大鼠恆定結構域的重鏈和輕鏈的抗體分子。對上述單株抗體進行進一步的鑒定，根據其對人PD-1的結合能力、食蟹猴PD-1的結合能力、抑制PD-1與PD-L1結合能力等參數，選出若干個雜交瘤克隆進行測序。利用常規的雜交瘤測序手段獲得編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列以及對應的胺基酸序列。在本實施例中，從免疫的Harbour H2L2小鼠得到的抗PD-1單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列。在本發明中，所述CDR序列通過Chothia定義規則劃分。

抗體的重鏈可變結構域序列來源於染色體上重鏈基因群的胚系基因V、D、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件；輕鏈可變結構域序列來源於輕鏈基因群的胚系基因V、J基因片段的基因重排和體細胞高頻突變等事件。基因重排和體細胞高頻突變是增加抗體多樣性的主要因素。來源於相同胚系V基因片段的抗體也可能產生不同的序列，但總體上相似性較高。利用一些演算法，例如IMGT/DomainGapAlign (http://imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi) 或者NCBI/IgBLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 可以從抗體的可變結構域序列推測出其發生基因重排時可能的胚系基因片段。

上述獲得的抗體的胚系基因分析如表9所示，抗體序列編號如表10所示。

同時，本發明的抗PD-1的陽性對照抗體Pembrolizumab(Keytruda)類似物（PR000150），其相應的胺基酸序列來源於IMGT資料庫，抗體重鏈序列如SEQ ID NO: 69所示，抗體輕鏈序列如SEQ ID NO:75所示。

表9.抗PD-1 H2L2序列胚系基因分析

克隆號	重組抗體	分子結構	IgG 亞型	VH胚系V基因	VL胚系V基因
	4004_12H9C1	PR000674	H2L2	人 IgG4	IGHV3-33	IGKV3-11

表10.抗PD-1 H2L2抗體的序列編號（SEQ ID NO:）

抗體編號	輕鏈	重鏈	VL	VH	LCDR1	LCDR2	LCDR3	HCDR1	HCDR2	HCDR3
Pembrolizumab	75	69	65	60	37	44	52	6	16	26
PR000674	77	71	67	62	39	46	54	8	18	28
PR001985	77	72	67	62	39	46	54	8	18	28
PR006429	77	106	67	102	39	46	54	81	86	91

2.3重組全人源抗體的製備

上述實施例2.1和2.2中得到編碼抗體分子的輕鏈、重鏈可變結構域序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將輕鏈、重鏈可變結構域序列和相應的人的抗體輕鏈、重鏈恆定結構域序列進行融合表達，得到重組抗體分子。

在本實施例中Harbour H2L2小鼠得到的抗體輕鏈可變結構域序列（VL）通過基因合成並選殖到編碼人抗體κ輕鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表達質粒載體中，以編碼產生抗體的全長輕鏈。抗體重鏈可變結構域序列（VH）通過基因合成並選殖到編碼人IgG4抗體重鏈恆定結構域序列(SEQ ID NO:143)的哺乳動物細胞表達質粒載體中，以編碼產生IgG4抗體的全長重鏈。

將編碼Harbour H2L2抗體重鏈的質粒和編碼抗體輕鏈的質粒同時轉染哺乳動物宿主細胞（如人胚腎細胞HEK293），利用常規的重組蛋白表達和純化技術，可以得到具有輕重鏈正確配對組裝的純化的重組抗體。

具體說來，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基（Thermo，#A1383504）擴培。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至(6~8)×10 ⁵細胞/mL，於37°C 8% CO ₂搖床中培養24小時，細胞濃度在1.2×10 ⁶細胞/mL。準備30mL培養的細胞。將上述編碼H2L2抗體的重鏈質粒和輕鏈質粒以2:3的比例混合溶解於1.5 mL Opti-MEM減血清培養基（Thermo，#31985088），並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 mL Opti-MEM 溶入1 mg/mL PEI（Polysciences Inc，#23966-2）120 µL，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質粒中，室溫培養10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質粒PEI混合溶液，於37°C 8% CO ₂搖床中培養5天。5天後觀測細胞活率。收集培養物，以3300 g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS（pH7.4）平衡含有MabSelect™（GE Healthcare Life Science，#71-5020-91 AE）的重力柱（Bio-Rad，#7311550），2-5倍柱體積沖洗。將上清樣品過柱。用5-10倍柱體積的PBS沖洗柱子。再用pH3.5的0.1M甘胺酸洗脫目的蛋白，然後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管（Millipore，#UFC901024）濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的抗體溶液。然後用NanoDrop（Thermo Scientific™ NanoDrop™ One）測定濃度，分裝、存儲備用。

2.4利用HPLC-SEC分析蛋白純度和多聚體形式

使用分析型分子尺寸排阻層析色譜法（SEC）來分析蛋白樣品的純度和聚體形式。將分析型色譜柱TSKgel G3000SWxl（Tosoh Bioscience, #08541, 5 µm, 7.8 mm x 30 cm）連接到高壓液相色譜儀（HPLC）（型號：Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II），用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品（至少10 µg，樣品濃度調整到1 mg/mL）用0.22 µm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS（pH 7.4）緩衝液將樣品以1.0 mL/min的流速流過色譜柱，最長時間為25分鐘；檢測波長280 nm。採集後用ChemStation軟體對色譜圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。PD-1抗體的產量和純度分析結果見表11。

表11.PD-1抗體的產量和純度分析

重組抗體	分子類型	表達體系和體積	第一步純化後產量 (mg/L)	HPLC-SEC 純度 (%)
PR000674	H2L2	HEK293-F (30 mL)	119.0	99.53

2.5改變H2L2抗體Fc序列

對PR000674的Fc進行改造，將抗體類型由IgG4轉換成IgG1並引入LALA (L234A和L235A突變,根據EU索引編號)突變，獲得了PR001985，表10中列出了PR001985抗體的輕、重鏈可變結構域胺基酸序列，輕鏈全長胺基酸序列，重鏈（人IgG1）全長胺基酸序列，和根據Chothia定義規則定義的CDR的胺基酸序列。

2.6 抗體的序列優化

本實施例中對PR001985抗體的潛在PTM位點進行胺基酸突變得到新的抗體分子PR006429(稱為PTM removal 變體)。表10中列出了PR006429抗體的輕、重鏈可變結構域胺基酸序列，輕鏈全長胺基酸序列，重鏈（人IgG1）全長胺基酸序列，和根據Chothia定義規則定義的CDR的胺基酸序列。所有設計出來的PTM-removal變體PR006429按照實施例2.3中描述的方法得到純化的重組抗體，並在後續的功能實驗中進一步驗證。

2.7抗原結合蛋白與過表達人/食蟹猴PD-1的細胞的結合（FACS）

為了研究PD-1抗原結合蛋白體外結合人/食蟹猴PD-1的活性。採用過表達人或食蟹猴PD-1的CHO-K1細胞株（CHO-K1-hPD-1，CHO-K1-cPD-1，來源於GenScript）進行細胞水平的結合實驗。簡言之，消化CHO-K1-hPD-1細胞，並用F-12K完全培養基重懸，將細胞密度調整為1×10 ⁶細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底板（Corning, Cat#3894），隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗原結合蛋白，混合均勻，其中抗原結合蛋白最高終濃度為100 nM或300 nM，共8至11個濃度，hIgG作為對照。將細胞放置於4℃，避光培養1小時。然後，加入100 µL /孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100 µL /孔螢光二抗（山羊抗人IgG (H+L)第二抗體（Alexa Fluor® 488 conjugate，Invitrogen，Cat #A11013, 1:1000）），4℃，避光培養30分鐘。用200 µL /孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200 µL/孔預冷PBS重懸細胞，使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光訊號值。

結果顯示，本發明所述PD-1抗原結合蛋白PR000674能結合過表達人PD-1的CHO-K1細胞以及過表達食蟹猴PD-1的CHO-K1細胞。

PD-1抗原結合蛋白與過表達人PD-1的CHO-K1細胞的結合活性見表12。

表12. PD-1抗原結合蛋白與過表達人PD-1的CHO-K1細胞的結合活性

抗體	EC50 (nM)	MFI最大值
PR000674	1.939	2347018
Pembrolizumab	1.634	2382166

PD-1抗原結合蛋白與過表達食蟹猴PD-1的CHO-K1細胞的結合活性見表13。

表13. PD-1抗原結合蛋白與過表達食蟹猴PD-1的CHO-K1細胞的結合活性

抗體	EC50 (nM)	MFI最大值
PR000674	2.349	41162
Pembrolizumab	0.998	19091

2.8抗原結合蛋白阻斷人PD-L1與過表達人PD-1的CHO-K1細胞的結合

為了研究人PD-1結合蛋白體外阻斷人PD-1與人PD-L1結合的活性，採用過表達人PD-1的CHO-K1細胞株(CHO-K1-hPD-1)進行細胞水平的人PD-1/人PD-L1結合阻斷實驗。簡言之，消化CHO-K1-hPD-1細胞，並用F-12K完全培養基重懸，將細胞密度調整為1×10 ⁶細胞/mL。以100μL細胞/孔接種於96孔V底板(Corning,Cat#3894)，隨後加入100μL/孔，2倍於終濃度的3倍或5倍濃度梯度稀釋的待測抗原結合蛋白，混合均勻，其中抗原結合蛋白最高終濃度為100nM或300nM，共8個濃度，hIgG作為對照。將細胞放置於4℃，避光培養1小時。之後，4℃下離心5分鐘，棄上清，隨後加入50μL/孔，1μg/mL濃度的生物素標記的人PD-L1蛋白(AcroBiosystems,PD1-H82F2), 4℃，避光培養30分鐘。加入100μL/孔預冷PBS漂洗細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。加入100μL/孔螢光二抗(PE Streptavidin,BD,Cat#554061，1:200)，4℃，避光培養30分鐘。用200μL/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500g，4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200μL/孔預冷PBS重懸細胞，使用BD FACS CANTOII讀取螢光發光訊號值，計算IC50。

結果如圖6和表14所示。圖6和表14顯示抗體PR001985、PR006429均能阻斷人PD-L1與細胞表面的人PD-1結合，且抑制能力與陽性對照Keytruda(pembrolizumab)相當。

表14 PD-1抗原結合蛋白阻斷PD-1與PD-L1結合

Abs	Keytruda	PR001985	PR006429
最大值RUL	4831	4785	4944
EC50	2.267	2.04	2.216

實施例3 抗PD-1 H2L2 × OX40雙特異性抗體的製備

將實施例1製備的抗OX40抗體和實施例2製備的抗PD-1抗體組合用於製備雙特異性抗體，可以同時結合兩個靶點，其中一端(第一結構域)可以識別腫瘤細胞表面特異表達的PD-1，而另一端(第二結構域)可以結合T細胞上的OX40分子。當PD-1×OX40雙抗分子結合到腫瘤細胞表面後，可以招募並啟動腫瘤細胞附近的T細胞，從而殺死腫瘤細胞。

本實施例製備的PD-1×OX40雙特異性抗體為IgG1，PR003787具有Fc L234A和L235A和P329G突變（根據EU索引編號），R200538、PR200539、PR200531、PR200536、PR200528以及PR200600具有Fc L234A,L235A和G237A)，分子結構參見圖1-5。

3.1構建IgG_HC-VH 四價對稱結構的雙特異性抗體（結構1）

利用抗PD-1的H2L2抗體和抗OX40的HCAb抗體構建IgG_HC-VH 四價對稱結構的雙特異性抗體PR003787、PR200531、PR200528。IgG_HC-VH 四價對稱結構（參見圖1所示）的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈2，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VL ₁-CL ₁-C’；多肽鏈1，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VH ₁-CH ₁-h-CH ₂-CH ₃-L-VH ₂-C’。其中，所述VL ₁和VH ₁分別為第一結構域的VL和VH，所述VH ₂為第二結構域的VH，所述h為IgG抗體的鉸鏈區，所述CL ₁是第一結構域的CL，所述CH ₁是第一結構域的CH1，所述L為連接肽，多肽鏈1的CH3經由L連接到VH ₂。雙特異性抗體PR003787中的連接肽L為H1，其胺基酸序列如表15中的SEQ ID NO:116所示，雙特異性抗體PR200531和PR200528中的連接肽L為(G2S) ₂，其序列如表15中的SEQ ID NO:117所示。

3.2構建VH-IgG_HC四價對稱結構的雙特異性抗體(結構2)

利用抗PD-1的H2L2抗體PR006429和抗OX40的HCAb抗體PR002607構建VH-IgG_HC四價對稱結構的雙特異性抗體PR200538。VH-IgG_HC四價對稱結構(參見圖2所示)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈2，也稱短鏈，從氨基末端到羧基末端，其包含N’-VL ₁-CL ₁-C’；多肽鏈1，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VH ₂-L-VH ₁-CH ₁-h-CH ₂-CH ₃-C’。。其中，所述VL ₁和VH ₁分別為第一結構域的VL和VH，所述VH ₂為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述CL ₁是第一結構域的CL，所述CH ₁是第一結構域的CH1，多肽鏈1的VH ₂經由連接肽L連接到VH1，所述L為連接肽(G4S) ₃，其序列如表15中的SEQ ID NO:118所示

3.3 構建Fab(CL)-VH-Fc四價對稱結構的雙特異性抗體(結構3)

利用抗PD-1的H2L2抗體PR006429和抗OX40的HCAb抗體PR002607構建Fab(CL)-VH-Fc四價對稱結構的雙特異性抗體PR200539。Fab(CL)-VH-Fc四價對稱結構(參見圖3所示)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈2，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VH’-CH1’-C’；多肽鏈1，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VL’-CL’-L-VH ₂-h-CH2-CH3-C’。其中，所述VL’和VH’分別為第一結構域的VL和VH，所述VH ₂為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述的L為連接肽，所述CL’是第一結構域的CL，所述CH1’是第一結構域的CH1，PR200539中多肽鏈1的CL’與VH2直接融合連接，即L的長度為0。

3.4構建IgG_HC-VH-VH六價對稱結構的雙特異性抗體(結構4)

利用抗PD-1的H2L2抗體PR006429和抗OX40的HCAb抗體PR002607構建IgG_HC-VH-VH六價對稱結構的雙特異性抗體PR200536。IgG_HC-VH-VH六價對稱結構(參見圖4所示)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈2，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VL ₁-CL ₁-C’；多肽鏈1，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VH1-CH ₁-h-CH2-CH3-L1-VH ₂-L2-VH ₂-C’。其中，所述VL ₁和VH ₁分別為第一結構域的VL和VH，所述VH ₂為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述的L1和L2為連接肽，所述CL1是第一結構域的CL，所述CH ₁是第一結構域的CH1。多肽鏈1的CH3經由L1連接到VH ₂，兩個VH ₂之間通過L2連接，L1和L2序列分別如表15中的SEQ ID NO:117、118所示。

3.5 構建IgG_HC-VH-VH-VH八價對稱結構的雙特異性抗體(結構5)

利用抗PD-1的H2L2抗體PR006429和抗OX40的HCAb抗體PR002603構建IgG_HC-VH-VH-VH八價對稱結構的雙特異性抗體PR200600。IgG_HC-VH-VH-VH八價對稱結構(參見圖5所示)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈2，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VL ₁-CL ₁-C’；多肽鏈1，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含N’-VH1-CH ₁-h-CH ₂-CH3-L1-VH ₂-L ₂-VH ₂-L3-VH ₂-C’。其中，所述VL ₁和VH ₁分別為第一結構域的VL和VH，所述VH ₂為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述的L1、L ₂和L ₃為連接肽，所述CL ₁是第一結構域的CL，所述CH ₁是第一結構域的CH ₁。多肽鏈1中的CH3經由連接肽L1連接到第一個VH ₂(從多肽鏈-1的N端至C端排序)，第一個VH ₂與第二個VH ₂通過連接肽L2連接，第二個VH ₂與第三個VH ₂通過連接肽L3連接，其中L1為(G2S)2，L2為(G4S)3，L3為(G4S) ₂，L1、L2和L3的序列分別如表15中的SEQ117、118、119所示。

表15 .連接肽序列表

連接肽名字	連接肽長度	連接肽序列	序列編號 SEQ ID NO:
H1	15	EPKSSDKTHTPPPPP	116
(G2S) ₂	6	GGSGGS	117
(G4S) ₃	15	GGGGSGGGGSGGGGS	118
(G4S) ₂	10	GGGGSGGGGS	119

本發明所得雙抗分子的多肽鏈的胺基酸序列在序列表中的編號中如表16所示。

表16.本發明所得雙抗分子的序列編號（SEQ ID NO:）

抗體編號	多肽鏈 1	多肽鏈 2
PR003787	79	77
PR200528	109	77
PR200531	110	77
PR200536	111	77
PR200538	112	77
PR200539	114	113
PR200600	115	77

PD-1×OX40雙特異性抗體的抗原結構域的CDR序列編號如表17所示，表17中1#序號為結合PD-1的抗原結構域，2#序號為結合OX40的抗原結構域。

表17.雙抗的抗原結合結構域的CDR序列編號（SEQ ID NO:）

結構編號	抗體編號	抗原結合域序號	LCDR1	LCDR2	LCDR3	HCDR1	HCDR2	HCDR3
1	PR003787	#1	39	46	54	8	18	28
#2	—	—	—	9	19	29
2	PR200531	#1	39	46	54	81	86	91
#2	—	—	—	9	19	29
3	PR200528	#1	39	46	54	81	86	91
#2	—	—	—	9	85	90
4	PR200538	#1	39	46	54	81	86	91
#2	—	—	—	9	19	29
5	PR200539	#1	39	46	54	81	86	91
#2	—	—	—	9	19	29
6	PR200536	#1	39	46	54	81	86	91
#2	—	—	—	9	19	29
7	PR200600	#1	39	46	54	81	86	91
#2	—	—	—	9	85	90

本發明的雙特異性抗體分子結構資訊見表18。

表18.具有 IgG-VH 四價對稱結構的PD-1×OX40雙抗分子

雙抗分子	PD-1 抗體 (IgG)	OX40 抗體 (VH ₂)	VH ₂ 相對 IgG 位置	連接肽（ VH ₂ 和 IgG 之間）	Fc 類型（突變）	連接肽長度（ VH2 和 IgG 之間）
PR003787	PR001985	PR002067	重鏈 C 端	EPKSSDKTHTPPPPP( SEQ ID NO: 116)	人 IgG1 (L234A, L235A, P329G)	15
PR200531	PR006429	PR002067	重鏈 C 端	GGSGGS(SEQ ID NO:117)	人IgG1（L234A,L235A,G237A）	6
PR200528	PR006429	PR002063	重鏈 C 端	GGSGGS9(SEQ ID NO:117)	人IgG1(L234A,L235A,G237A)	6
PR200538	PR006429	PR002067	重鏈 N 端	GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:118)	人IgG1(L234A,L235A,G237A)	15
PR200539	PR006429	PR002067	重鏈第一結構域與IgG之間	—	人IgG1(L234A,L235A,G237A)	0
PR200536	PR006429	PR002067	重鏈 C 端	GGSGGS(SEQ ID NO:117)	人IgG1(L234A,L235A,G237A)	6
PR200600	PR006429	PR002063	重鏈 C 端	GGSGGS(SEQ ID NO:117)	人IgG1(L234A,L235A,G237A)	6

實施例4

FACS檢測PD-1×OX40雙特異性抗體在過表達人PD-1的CHO-K1細胞株上的體外結合

本實施例為了研究PD-1×OX40雙特異性抗體PD-1抗體臂體外結合人PD-1的活性。採用過表達人PD-1的CHO-K1細胞株（CHO-K1-hu PD-1, Shanghai ChemPartner）進行細胞水平上的抗體結合實驗。簡言之，消化CHO-K1-hu PD-1細胞，並用DMEM完全培養基重懸，將細胞密度分別調整為1×10 ⁶細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底板（Corning, Cat#: 3894），隨後加入100 µL /孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培養1小時。之後，加入100 µL /孔預冷PBS 漂洗細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100 µL /孔螢光二抗（Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, Cat#:109-545-06, 1：500稀釋），4℃，避光培養30分鐘。用100 µL /孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200 µL /孔預冷PBS重懸細胞，使用BD Accuri C6 Plus 流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。

圖7示出PD-1×OX40雙特異性抗體在過表達人PD-1的CHO-K1細胞株上的體外結合。

如圖7A和7B所示，本實例中的PD-1×OX40雙特異性抗體PR003787、PR200538、PR200539或其組成的單株抗體PR001985、PR006429均與過表達人PD-1的CHO-K1細胞特異性結合。且PR003787與人PD-1的結合能力與PD-1抗體和人PD-1結合能力一致。本實施中的PD-1×OX40雙特異抗體PR003787中PD-1抗體臂具有和PD-1單株抗體同樣的結合能力。

實施例5

FACS檢測PD-1×OX40雙特異性抗體在過表達OX40的HEK293細胞系上的體外結合

本實施例為了研究PD-1×OX40雙特異性抗體OX40臂結合人OX40的活性，採用高表達OX40的HEK293細胞系（OX40 / NF-κB Reporter – HEK293， BPS BioScience, Cat# 60482）進行細胞與人OX40結合實驗。簡言之，收集高表達OX40的HEK293細胞懸液，將細胞密度分別調整為 2×10 ⁶細胞/mL。以50 µL細胞/孔接種於96孔V底板（Corning, Cat#: 3894），隨後加入50 µL /孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培養2小時。之後，加入100 µL /孔預冷PBS 漂洗細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100 µL /孔螢光二抗（Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson ImmunoResearch, Cat#:109-605-098, 1:1000稀釋），4℃，避光培養1小時。用100 µL /孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200 µL /孔預冷FACS重懸細胞，使用BD Accuri C6 Plus Flowcytometer讀取螢光發光訊號值。

圖8A和8B示出通過流式細胞術測定的在人HEK293/OX40/NF-kb報告細胞中，本發明的PD-1×OX40雙特異抗體PR003787、PR200538、PR200539或組成其結構的單株抗體PR002067均與過表達人OX40的HEK293細胞特異性結合，且隨著濃度增加對細胞表面OX40的結合。而且雙抗PR003787、PR200538的OX40抗體臂具有和OX40單株抗體同樣或更優的結合能力。

實施例6

FACS檢測PD-1×OX40雙特異性抗體在過表達OX40和PD-1的HEK293細胞系上的體外結合

本實施例為了研究PD-1×OX40雙特異性抗體結合OX40和PD-1共表達細胞的活性。採用高表達OX40的HEK293細胞系（OX40 / NF-κB Reporter – HEK293， BPS BioScience, Cat# 60482），進一步用慢病毒構建穩定表達人PD1細胞系（Origene, Cat# PS100092V），經過puromycin 抗性篩選後，得到穩定表達OX40和PD-1的HEK293細胞系，得到的細胞株用來進行細胞結合實驗。簡言之，收集高表達OX40和PD-1的HEK293細胞懸液，將細胞密度分別調整為 2×10 ⁶細胞/mL。以50 µL細胞/孔接種於96孔V底板（Corning, Cat#: 3894），隨後加入50 µL /孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培養2小時。之後，加入100 µL /孔預冷PBS 漂洗細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100 µL /孔螢光二抗（Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson ImmunoResearch, Cat#:109-605-098, 1:1000稀釋），4℃，避光培養1小時。用100 µL /孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200 µL /孔預冷FACS重懸細胞，使用BD Accuri C6 Plus Flowcytometer讀取螢光發光訊號值。

圖9示出通過流式細胞術測定的在人HEK293/OX40/PD1 NF-kb報告細胞中，本發明的PD-1×OX40雙特異抗體PR003787、PR200538、PR200539或組成其結構的單株抗體均與過表達人OX40和PD-1的HEK293細胞特異性結合，且隨著濃度增加對細胞表面OX40和PD-1的結合。和OX40單株抗體相比，雙抗PR003787、PR200538和PR200539顯示更強的結合能力；和PD1單株抗體相比，雙抗PR003787、PR200538和PR200539顯示出類似或稍弱的結合能力。

實施例7

FACS檢測PD-1×OX40雙特異性抗體在啟動T細胞上的體外結合

由於過表達細胞不能真正反映生理條件下靶點的表達情況，本實施例研究PD-1×OX40雙特異性抗體結合啟動的T細胞的活性。購買人濃縮白細胞(Research blood components LLC)，分離人的外周血單核細胞(PBMC)，用包被到細胞培養板上的抗CD3抗體刺激T細胞48小時。收集刺激後的PBMC，將細胞密度分別調整為 4×10 ⁶細胞/mL。以50 µL細胞/孔接種於96孔V底板（Corning, Cat#: 3894），隨後加入50 µL /孔，2倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培養2小時。之後，加入100 µL /孔預冷PBS 漂洗細胞兩次，於500g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再加入100 µL /孔螢光二抗（Goat anti-Human IgG Fc Secondary Antibody, PE, eBioscience™，Cat#: 12-4998-82，1：250稀釋）和APC標記的抗人CD3抗體（BioLegend, Cat#317318），4℃，避光培養1小時。用100 µL /孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。最後，200 µL /孔預冷FACS重懸細胞，使用BD BD LSRFortessa Flowcytometer讀取螢光發光訊號值。

圖10示出通過流式細胞術測定的在啟動的人T細胞中，本發明的PD-1×OX40雙特異抗體PR003787、PR200538、PR200539或組成其結構的單株抗體均與啟動的T細胞結合，且隨著濃度增加對T細胞的結合。與OX40單株抗體和PD1單株抗體相比，雙抗PR003787、PR200538和PR200539顯示更強的結合能力。表明本發明的雙抗能夠特異性的結合PD1和OX40陽性的T細胞。

實施例8 利用報導基因細胞系檢測 PD-1×OX40雙特異性抗體對OX40訊號通路的刺激作用

每孔鋪100μL的培養液，或者1.5×10 ⁴表達CD32b的CHO-K1細胞(CHO-K1/CD32b) （BPS BioScience, #79511）或表達人PD1的CHO 細胞(CHO-K1/PD-1) 到96孔板（Perkin Elmer，#6005225），每孔加入40μL的2倍的待測抗原結合蛋白稀釋液，起始終濃度為200 nM，4倍梯度稀釋，hlgG1為陰性對照組。每孔加入40μL 4.5×10 ⁴的可持續表達OX40和NF-kb反應元件的螢光素酶報導基因的HEK293報告細胞（HEK293/OX40/NF-kb報告細胞，BPS Biosciences, #60482）。37℃在5% CO ₂培養箱內培養6小時。之後加入ONE-Glo ^TM螢光素酶試劑（Promega，#E6110），室溫培養15分鐘，酶標儀檢測發光值。

結果如圖11至圖13所示。圖11至圖13的結果顯示本發明所述PD-1×OX40雙特異性抗體PR003787是PD-1交聯依賴型。圖11結果顯示PD-1×OX40雙特異性抗體PR003787對HEK293/OX40/NF-kb報告細胞沒有直接的啟動作用。圖12結果顯示，OX40親本單株抗體在CHO-K1/CD32b交聯條件下顯示出濃度依賴的增強NF-Kb訊號通路的作用，而PD-1×OX40雙特異性抗體PR003787未顯示出NF-Kb訊號啟動作用。圖13結果顯示PD-1×OX40雙特異性抗體PR003787在CHO-K1/PD-1細胞交聯輔助作用下，特異性地引起濃度依賴的增強NF-Kb訊號通路的作用。

本發明所述PD-1×OX40雙特異性抗體PR003787能夠特異地引起PD-1交聯依賴的OX40介導的NF-Kb訊號通路的促進作用，而且其引起的訊號強度與其濃度成正相關關係遞增。

實施例9 利用報導基因細胞系檢測PD-1×OX40雙特異性抗體（PR003787）對PD-1訊號通路的抑制作用

將過表達PD-L1和OS8（CD3單鏈抗體跨膜蛋白）的HEK293細胞，鋪到96孔板上，細胞量為1.25×10 ⁴/孔，100 μL/孔。加入50μL/孔的待測抗原結合蛋白稀釋液，起始濃度為100 nM，4倍濃度稀釋，hlgG1為對照組。加入5×10 ⁴/孔的可持續表達PD-1和NFAT-螢光素酶報導基因的Jurkat報告細胞（Shanghai ChemPartner構建）50 μL/孔。37℃在5% CO ₂環境下培養6小時。加入ONE-Glo ^TM螢光素酶試劑（Promega, #E6110），室溫培養15分鐘，酶標儀檢測發光值。

結果如圖14所示。顯示本發明所述PD-1×OX40雙特異性抗體（PR003787）及PD-1的親本抗體對PD-1訊號通路均有抑制作用。實施例10 PD-1×OX40雙特異性抗體對T細胞的活化功能檢測

購買人濃縮白細胞（Research blood components LLC），分離人的外周血單核細胞(PBMC)，然後將人PBMC細胞和絲裂黴素處理的CHOK1-huPD-L1細胞共培養，加入2.5ug/mL的PHA-L（eBioscience, #00-4977-03）刺激3天。收集上清，通過MSD（Meso Scale Discovery, U-Plex K15067M-2）檢測腫瘤壞死因子TNFα和IFNγ的分泌。

如圖15和圖16所示，本發明所述PD-1×OX40雙特異性抗體（PR003787）及PD-1的親本抗體(PR001985)與人IgG1同種型（PR000324）相比均能增強TNFα和IFNγ的分泌。實施例11 PD-1×OX40雙特異性抗體抑制Tregs細胞中IL-10的生產

購買人濃縮白細胞(Research blood components LLC), 分離Treg細胞(StemCell, Cat#18063)，加入CD3/CD28磁珠和重組人源白介素2(IL-2) (R&D, #202-IL-010/CF)，培養期間根據細胞生長狀態每2-4天補充加入新鮮的含有IL-2的培養液，培養12天後，通過流式細胞儀分析Treg的比例，冷凍保存體外擴增的Treg細胞。解凍保存的Treg細胞，用含有重組人源白介素2(IL-2) (R&D, #202-IL-010/CF)的培養液培養2天，然後將Treg細胞和絲裂黴素處理的CHOK1-huPD-L1細胞共培養，加入CD3/CD28磁珠和重組人源白介素2(IL-2)培養5天。收集細胞，用BD Accuri C6 Plus 流式細胞儀檢測FoxP3和白介素IL-10分泌細胞的比例。

如圖17所示，本發明所述PD-1×OX40雙特異性抗體（PR003787）及OX40的親本抗體(PR002067)與人IgG1同種型（PR000324）相比對Treg細胞分泌IL-10均有抑制作用。

實施例12 PD-1×OX40雙特異性抗體（PR003787）與親本單抗、聯合使用的功能差異（IFNγ，Granzyme B，IL-2 secretion）

購買人濃縮白細胞(Research blood components LLC)，分離T細胞（StemCell，#17951），冷凍保存。同時分離Treg細胞(StemCell, Cat#18063)，加入CD3/CD28磁珠和重組人源白介素2(IL-2) (R&D, #202-IL-010/CF)，培養期間根據細胞生長狀態每2-4天補充加入新鮮的含有IL-2的培養液，培養12天後，通過流式細胞儀分析Treg的比例。

購買第二供體人濃縮白細胞(Research blood components LLC)，分離monocytes細胞（StemCell，#19359），加入重組人源白介素4（IL-4）（R&D，#204-GMP）和人源GM-CSF（R&D，#215-GM/CF）誘導6天後，獲得未成熟的人CD14+樹突狀細胞（iDC細胞）。

將第一供體的5×10 ⁴個T細胞、5×10 ⁴個Treg細胞及第二供體的2×10 ⁴個iDC細胞按照2.5:2.5:1的比例接種至96孔板，加入2nM或10nM本發明所述的PD-1×OX40雙特異性抗體（PR003787），親本單抗或PD-1和OX40兩個親本聯合單抗，共培養4-5天。收集100μL培養上清，通過MSD (Meso Scale Discovery, U-Plex K15067M-2) 檢測IL-2，Granzyme B和IFNγ的分泌。

如圖18、圖19和圖20所示，本發明所述PD-1×OX40雙特異性抗體（PR003787）的活性優於PD-1單抗(PR001985)和OX40單抗(PR002067)，並優於PD-1單抗(PR001985)和OX40單抗(PR002067)的組合，顯示了協同活性。

實施例13 PHA檢測PD-1×OX40雙特異性抗體的T細胞啟動作用

購買人濃縮白細胞（Research blood components LLC），分離人的外周血單核細胞(PBMC)，然後將人PBMC細胞中加入2.5ug/mL的PHA-L（eBioscience, #00-4977-03）刺激3天。收集上清，通過MSD（Meso Scale Discovery, U-Plex K15067M-2）檢測腫瘤壞死因子IL-2的分泌。

如圖21A和圖21B所示，與PD1單株抗體相比，本發明所述PD-1×OX40雙特異性抗體PR003787、PR500531、PR200538、PR200539、PR200536、PR200528和PR200600具有更強的啟動T細胞分泌IL-2的能力。且與PR003787相比，PR200538、PR200539、PR200528呈現劑量依賴的T細胞的啟動能力，在高濃度條件下具有更強的T細胞活化能力。

無

圖1示出PD-1xOX40雙特異性抗體IgG_HC-VH結構(結構1)。

圖2示出PD-1xOX40雙特異性抗體VH-IgG_HC結構(結構2)。

圖3示出PD-1xOX40雙特異性抗體Fab(CL)-VH-Fc結構(結構3)。

圖4示出PD-1xOX40雙特異性抗體IgG_HC-VH-VH結構(結構4)。

圖5示出PD-1xOX40雙特異性抗體IgG_HC-VH-VH-VH結構(結構5)。

圖6示出PD-1單株抗體阻斷PD-1與PD-L1結合。

圖7示出通過流式細胞術測定的在表達人PD-1的CHO 細胞中，本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體隨著濃度增加對細胞表面PD-1的結合。

圖8示出通過流式細胞術測定的在人OX40 和NFkB啟動子-luc的HEK 293 細胞中，本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體隨著濃度增加對細胞表面OX40的結合。

圖9 示出通過流式細胞術測定的在人OX40、PD1 和NFkB啟動子-luc的HEK 293 細胞中，本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體隨著濃度增加對細胞表面的結合。

圖10示出通過流式細胞術測定的在啟動的人T細胞中，本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體隨著濃度增加對細胞表面的結合。

圖11示出在表達人OX40 和NFkB啟動子-luc的HEK293 細胞中，加入不同濃度的本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體後對螢光素酶報導基因表達的檢測。

圖12示出表達人CD32b的CHO 細胞和表達人OX40 和NFκB啟動子-luc的HEK 293 細胞共培養，加入不同濃度的本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體後對螢光素酶報導基因表達的檢測。

圖13示出表達人PD-1的CHO 細胞和表達人OX40 和NFκB啟動子-luc的HEK 293 細胞共培養，加入不同濃度的本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體後對螢光素酶報導基因表達的檢測。

圖14示出表達人PD-L1和OS8的HEK 293 細胞和表達人PD-1和NFAT啟動子-luc的Jurkat 細胞共培養，加入不同濃度的本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體後對螢光素酶報導基因表達的檢測。

圖15示出在人外周血單個核細胞（PBMC）與過表達人PD-L1的CHO細胞共培養體系裡，加入PHA-L和不同濃度的本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體後細胞因子TNFα的分泌。

圖16示出在人外周血單個核細胞（PBMC）與過表達人PD-L1的CHO細胞共培養體系裡，加入PHA-L和不同濃度的本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體後細胞因子IFNγ的分泌。

圖17示出在體外培養擴增後的Treg細胞中加入不同濃度的本發明的雙特異抗體後用流式細胞術檢測Treg的IL10分泌。

圖18示出在分離的人T細胞、體外擴增的Treg細胞和體外誘導分離的DC細胞共培養體系中，加入不同濃度的本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體後細胞因子IFNγ的分泌。

圖19示出在分離的人T細胞、體外擴增的Treg細胞和體外誘導分離的DC細胞共培養體系中，加入不同濃度的本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體後細胞因子Granzyme B的分泌。

圖20示出在分離的人T細胞、體外擴增的Treg細胞和體外誘導分離的DC細胞共培養體系中，加入不同濃度的本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體後細胞因子IL2的分泌。

圖21示出在人外周血單個核細胞（PBMC）裡，加入PHA-L和不同濃度的本發明的雙特異抗體或組成其結構的單株抗體後細胞因子IL2的分泌。

Claims

一種靶向PD-1或其片段的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體或其抗原結合片段包括輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH ，所述VL和所述VH分別包括三個CDR，其中：所述VL包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO: 39、46和54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述VH包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO: 8、18和28所示HCDR1、HCDR2和HCDR3；或所述VL包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO: 39、46和54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述VH包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO: 81、86和91所示HCDR1、HCDR2和HCDR3；較佳地，所述CDR包含1至3個胺基酸取代。
如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中，所述VL可變區包括如SEQ ID NO:67所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；所述VH包括如SEQ ID NO:62所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；或所述VL可變區包括如SEQ ID NO:67所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；所述VH包括如SEQ ID NO:102所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。
如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體還包括重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區；較佳地，所述抗體的重鏈恆定區選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4，所述輕鏈恆定區選自κ鏈或者λ鏈；更較佳地，所述抗體的Fc的第234位和/或第235位發生胺基酸替換，較佳所述胺基酸替換為L234A和/或L235A。
如請求項1至3中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體選自全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv。
如請求項1至4所述之抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段進一步包括重鏈和輕鏈，其中，所述輕鏈包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；所述重鏈包括如SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；或所述輕鏈包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；所述重鏈包括如SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。
一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包括：第一結構域，其結合PD-1或其片段，所述第一結構域為如請求項1至5中任一項所述之靶向PD-1的抗體；和第二結構域，其結合OX40或其片段，較佳地，所述第二結構域為VH結構。
如請求項6所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中，所述雙特性抗體或其抗原結合片段包括兩條多肽鏈，其中：多肽鏈2具有N’-VL ₁-CL ₁-C’所示的結構，多肽鏈1具有N’-VH ₁-CH ₁-h-CH ₂-CH ₃-L-VH ₂-C’所示的結構；或多肽鏈2具有N’-VL ₁-CL ₁-C’所示的結構，多肽鏈1具有N’-VH ₂-L-VH ₁-CH ₁-h-CH ₂-CH ₃-C’所示的結構；或多肽鏈2具有N’-VH’-CH ₁’-C’所示的結構，多肽鏈1具有N’-VL’-CL’-L-VH ₂-h-CH ₂-CH ₃-C’所示的結構；或多肽鏈2具有N’-VL ₁-CL ₁-C’所示的結構，多肽鏈1具有N’-VH ₁-CH ₁-h-CH ₂-CH ₃-L ₁-VH ₂-L ₂-VH ₂-C’所示的結構；或多肽鏈2具有N’-VL ₁-CL ₁-C’所示的結構，多肽鏈1具有N’-VH ₁-CH ₁-h-CH ₂-CH ₃-L ₁-VH ₂-L ₂-VH ₂-L ₃-VH ₂-C’所示的結構，其中，所述VL ₁、VH ₁、VL’和VH’分別為第一結構域的VL和VH，所述VH ₂為第二結構域的VH，所述h為鉸鏈區，所述的L、L ₁、L ₂和L ₃為連接肽，所述CL ₁和CL’是第一結構域的CL，所述CH ₁和CH ₁’是第一結構域的CH ₁；較佳地，所述連接肽為長度為0-30個胺基酸的肽，較佳地，其胺基酸序列如SEQ ID NO:116-140任一所示；較佳地，所述多肽鏈1和所述多肽鏈2形成四價對稱結構、六價對稱結構或八價對稱結構。
如請求項6或7所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中，所述第二結構域包含重鏈可變區，其中，所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；或所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:90所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；較佳地，所述第二結構域包含與如SEQ ID NO:63或101所示的胺基酸序列具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈可變區。
如請求項8所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中，Fc為人IgG1結構，較佳地，所述Fc包含L234A、L235A和P329G，或所述Fc包含L234A、L235A和G237A。
如請求項7所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中，所述雙特異性抗體或其抗原結合片段包括：多肽鏈1包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；或多肽鏈1包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；或多肽鏈1包括如SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；或多肽鏈1包括如SEQ ID NO：111所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；或多肽鏈1包括如SEQ ID NO：112所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；或多肽鏈1包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；或多肽鏈1包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或與其具有至少80%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列。
一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項6至10中任一項所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段，較佳地，所述核酸分子是mRNA分子。
一種表達載體，其包含如請求項11所述之分離的核酸分子，所述表達載體為真核細胞表達載體或原核細胞表達載體，較佳為逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、噬菌體載體、腺病毒載體、腺相關載體或單純皰疹載體。
如請求項12所述之表達載體，其中，所述表達載體存在於奈米顆粒、脂質體或基因槍中。
一種宿主細胞，其包含如請求項11所述之分離的核酸分子，或如請求項12或13所述之表達載體，所述宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞，所述原核細胞較佳為 E. coli細胞，所述真核細胞較佳為HEK293細胞或CHO細胞。
一種如請求項1至5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，或如請求項6至9中任一項所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段的製備方法，包括在使得如請求項1至5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，或如請求項6至10中任一項所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段表達的情況下，培養如請求項14所述之宿主細胞。
一種藥物組合物，其包含如請求項1至5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，或如請求項6至10中任一項所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段；以及藥學上可接受的載體；較佳地，所述藥物組合物還包含第二治療劑，所述第二治療劑包括化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑、細胞毒性藥物。
如請求項16所述之藥物組合物，其中，所述藥物組合物為固體、半固體或液體的形式；較佳地，所述藥物組合物為水溶液、非水溶液或混懸液，粉末、片劑、膠囊、顆粒、注射劑或輸注劑的形式。
一種如請求項1至5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，如請求項6至10中任一項所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段，如請求項11所述之分離的核酸分子，如請求項12或13所述之表達載體，如請求項14所述之宿主細胞，或如請求項16或17所述之藥物組合物在製備用於預防、治療和/或診斷腫瘤疾病，急性和慢性炎性疾病和/或免疫性疾病的藥物中的應用。
如請求項18所述之應用，其中，所述腫瘤選自乳腺癌、腎細胞癌、黑色素瘤、結腸癌、B細胞淋巴瘤、黑色素瘤、頭頸癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、惡性肉瘤、尿路上皮癌、肝癌、食道癌、胃食道交界癌、鼻咽癌、小細胞肺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、胰腺癌、前列腺癌、膠質瘤、非小細胞肺癌、急性粒細胞白血病、霍奇金淋巴瘤、皮膚鱗狀細胞癌、局部晚期或轉移性惡性腫瘤中的一種或多種；所述炎性疾病為特應性皮炎或潰瘍性結腸炎，所述免疫性疾病為移植物抗宿主病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡或哮喘。
一種用於檢測樣品中的OX40和/或PD-1的方法，所述方法包括利用如請求項1至5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，或如請求項6至10中任一項所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段，檢測樣品中的OX40和/或PD-1的步驟，所述樣品為全血、紅血細胞濃縮物、血小板濃縮物、白細胞濃縮物、組織、骨髓吸出物、血漿、血清、腦脊液、糞便、尿液、培養的細胞、唾液、口腔分泌物和/或鼻腔分泌物；較佳地，所述檢測方法為非診斷目的。
一種套裝藥盒，其包括一個或多個藥盒，所述一個或多個藥盒包括如請求項1至5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，如請求項6至10中任一項所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段，或如請求項16或17所述之藥物組合物。
如請求項21所述之套裝藥盒，其中，所述套裝藥盒包括第一藥盒，且所述第一藥盒包括如請求項6至10中任一項所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段；可選地，所述套裝藥盒進一步包括第二藥盒，且所述第二藥盒包括選自化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑和細胞毒性藥物中的至少一種治療劑。
一種預防、治療和/或診斷免疫性疾病、急性和慢性炎性疾病以及腫瘤疾病的方法，其包括向受試者施用治療有效量的如請求項1至5中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，如請求項6至10中任一項所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段，如請求項11所述之分離的核酸分子，如請求項12或13所述之表達載體，如請求項14所述之宿主細胞，或如請求項16或17所述之藥物組合物。