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TW202242139A - 鑒定t細胞調節基因的方法 - Google Patents

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TW202242139A
TW202242139A TW110149441A TW110149441A TW202242139A TW 202242139 A TW202242139 A TW 202242139A TW 110149441 A TW110149441 A TW 110149441A TW 110149441 A TW110149441 A TW 110149441A TW 202242139 A TW202242139 A TW 202242139A
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cells
sequence
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TW110149441A
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袁鵬飛
金鳴
張永建
楊曉梅
楊玲
蘇美華
宗會明
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大陸商北京輯因醫療科技有限公司
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Abstract

本申請提供了鑒定調節T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))對NK細胞殺傷的敏感性或抗性的基因的方法。還提供了對NK細胞殺傷具有抗性的經修飾的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))，以及產生它們的方法和試劑盒。

Description

鑒定T細胞調節基因的方法
[相關申請的交叉引用]
本申請要求於2020年12月29日提交的國際專利申請PCT/CN2020/140860的優先權，其內容通過引用整體並入本文。 [發明領域]
本申請涉及鑒定調節T細胞(例如，同種異體T細胞或表達嵌合抗原受體的T細胞(CAR-T細胞)如同種異體CAR-T細胞)對NK細胞殺傷的敏感性或抗性的基因的方法。還提供了對NK細胞殺傷具有抗性的經修飾的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))，以及產生它們的方法和試劑盒。
免疫治療方法，包括過繼性T細胞療法(例如CAR-T)，在癌症、病毒感染和其他病理生理自身免疫病的治療中發揮著越來越重要的作用。與通常需要漫長且昂貴的定制制備過程且並不適合所有患者的自體T細胞療法相比，同種異體T細胞療法已成為一種更具吸引力的方法，其中T細胞來自健康供者並可提供適用於許多患者而不僅僅是一個人的現貨產品。同種異體方法的主要挑戰之一是宿主排斥，其中患者的免疫系統(例如宿主T細胞、NK細胞)會將注入的非HLA匹配的T細胞識別為外來物並排斥它們。為了克服這個問題，研究人員使用成簇的規則間隔短回文重複序列(CRISPR)/Cas9 (CRISPR相關蛋白9)(CRISPR/Cas9)系統，敲除了CAR-T細胞中人白細胞抗原(HLA)i類表達所需的β-2微球蛋白(B2M)，以防止宿主TCRαβ細胞通過HLA I類將供者 CAR-T細胞識別為外來物(Ren et al., Clin. Cancer Res.2017; 23:2255–2266)。然而，具有降低的HLA I類表達的細胞也成為NK細胞的目標，這代表了防止同種異體T細胞排斥的障礙(Liu et al. Curr. Res. Transl. Med.2018; 66:39–42)。
NK細胞的活性受各種細胞表面抑制和激活受體的複雜相互作用的調節。抑制性受體包括殺傷性免疫球蛋白樣受體(KIR)和CD94/NKG2A，識別主要組織相容性複合體(MHC)或HLA I類分子，使NK細胞識別自體細胞並防止它們攻擊宿主組織。當不存在匹配的MHC I類分子時，NK細胞毒性的抑制作用被釋放，該平衡通過激活受體接合轉向NK細胞激活。在病毒感染或惡性轉化過程中，轉化細胞會降低細胞表面MHC I類抗原的表達，以避免被T細胞識別。NK細胞可以將此類轉化細胞識別為“改變的自我”，其MHC I類表達的異常水平導致KIR的參與減少，並增加刺激性受體表達以提供效應反應和轉化細胞的細胞毒性殺傷(Nayyar et al. Front Oncol.2019; 9:51)。
CRISPR/Cas9系統能夠以高效和特異性的方式在靶基因組基因座進行編輯。其廣泛的應用之一是通過高通量匯集篩選結合下一代測序(“NGS”)分析來鑒定編碼基因、非編碼RNA和調控元件的功能。通過將合並的單鏈引導RNA (“sgRNA”)或配對的引導RNA (“pgRNA”)文庫引入表達Cas9或與效應域融合的無催化活性Cas9 (dCas9)的細胞中，研究人員可以通過產生不同的突變、大基因組缺失、轉錄激活或轉錄抑制來進行多種基因篩選。
為了為任何給定的匯集CRISPR篩選生成高質量的gRNA細胞文庫，必須在細胞文庫構建過程中使用低感染複數(“MOI”)，以確保每個細胞平均含有少於一個sgRNA或pgRNA，以最大限度地減少該篩選的假發現率(FDR)。為了進一步降低FDR並提高數據可重複性，通常需要對gRNA進行深入覆蓋和多次生物複制，以獲得具有高統計意義的命中基因，從而導致工作量增加。當進行大量全基因組篩選時，當用於構建文庫的細胞材料有限時，或者進行更具挑戰性的篩選(即體內篩選)而難以獲得實驗複本或控制MOI時，可能會出現其他困難。申請人先前開發的“內部條形碼(“iBAR”)方法(參見WO2020125762，其內容通過引用整體並入本文)為在真核細胞中進行大規模靶標鑒定提供了可靠且高效的篩選策略，其中假陽性和假陰性率要低得多，並且允許使用高MOI生成細胞文庫。例如，與具有0.3的低MOI的傳統CRISPR/Cas篩選相比，iBAR方法可以將起始細胞數量減少20倍以上(例如，MOI為3)至70倍以上(例如，MOI為10)，同時保持高效率和准確性。iBAR系統特別適用於細胞數量有限的基於細胞的篩選，或用於在低MOI下難以控制病毒感染特定細胞或組織的體內篩選。
在此引用的所有出版物、專利、專利申請和公開的專利申請的公開內容通過引用整體並入本文。
本發明一方面提供了鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供包含多個T細胞的T細胞文庫，其中多個T細胞中每一個細胞在基因組中的命中基因處具有突變(例如，失活突變)(“命中基因突變”)，其中在所述多個T細胞的至少兩個的命中基因彼此不同；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞；以及d)鑒定步驟c)得到的T細胞中的命中基因，從而鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因。在一些實施方案中，所述T細胞文庫是通過對初始T細胞群進行全基因組基因編輯而產生的。在一些實施方案中，所述初始T細胞群中的T細胞表達CAR。
在根據上述任一方法的一些實施方案中，所述T細胞文庫是通過使初始T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))群與以下物質接觸而產生的：i)包含多個sgRNA構建體的單鏈引導RNA (“sgRNA”)文庫，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與基因組中命中基因的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列；以及任選地，ii)在允許將sgRNA構建體和任選的Cas組分引入至初始T細胞群中的條件下，包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的核酸的Cas組分。在一些實施方案中，Cas蛋白是Cas9。在一些實施方案中，每種sgRNA包含與第二序列融合的引導序列，其中第二序列包含與Cas9相互作用的重複-反-重複莖環。在一些實施方案中，每種sgRNA的第二序列還包含莖環1、莖環2和/或莖環3。在一些實施方案中，每種sgRNA還包含內部條形碼(iBAR)序列(“sgRNA iBAR”)，其中每種sgRNA iBAR可與Cas蛋白(例如，Cas9)一起操作以修飾命中基因(例如切割命中基因，或調節命中基因表達)。在一些實施方案中，所述Cas蛋白是Cas9，並且每種sgRNA iBAR的iBAR序列被插入到重複-反-重複莖環的環區中。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR的iBAR序列被插入到重複-反-重複莖環的環區中。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR在5’至3’方向上包含第一莖序列和第二莖序列，其中第一莖序列與第二莖序列雜交以形成與Cas蛋白相互作用的雙鏈RNA (dsRNA)區，並且iBAR序列位於第一莖序列的3’端和第二莖序列的5’端之間。在一些實施方案中，每個引導序列包含約17至約23個核苷酸。在一些實施方案中，每個iBAR序列包含約1至約50個核苷酸(例如，約6個核苷酸)。在一些實施方案中，包含多個sgRNA iBAR構建體的sgRNA文庫(“sgRNA iBAR文庫”)包含多組sgRNA iBAR構建體，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三個或更多個(例如，3、4、5、6或更多) sgRNA iBAR構建體，其各自包含或編碼sgRNA iBAR，其中三個或更多個(例如，3、4、5、6個或更多個) sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中三個或更多個(例如，3、4、5、6個或更多個) sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，並且其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中的不同靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)。在一些實施方案中，每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，並且4種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少約100組(例如，至少約1,000、10,000、50,000或更多中任一個) sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，不同組的sgRNA iBAR構建體中至少兩個sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的(例如，第一組和第二組sgRNA iBAR構建體的兩組sgRNA iBAR構建體之間具有至少1、2、3、4或更多個共享的iBAR序列)。在一些實施方案中，至少兩組sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的。在一些實施方案中，包含多個sgRNA構建體的sgRNA文庫包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列的sgRNA。在一些實施方案中，包含多種sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列的sgRNA iBAR。在一些實施方案中，將sgRNA文庫(或sgRNA iBAR文庫)中至少約95%(例如，至少約96%、97%、98%、99%或100%中的任一個)的sgRNA構建體(或sgRNA iBAR構建體)引入至初始T細胞群中。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於每種sgRNA iBAR具有平均至少約100倍(例如，至少約200-、500-、1,000-、5,000-倍或更多倍中的任一個)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對每種sgRNA具有平均至少約400倍(例如，至少約600-、800-、1,000-、2,000-、8,000-、12,000-倍或更多倍中的任一個)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫(或sgRNA iBAR文庫)包含至少約400個(例如，至少約600、1000、5000、10,000、50,000、100,000、300,000、600,000、600,000或更多中任一個) sgRNA構建體(或sgRNA iBAR構建體)。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫(或sgRNA iBAR文庫)包含至少約150,000個(例如，至少約300,000、600,000或更多中任一個) sgRNA構建體(或sgRNA iBAR構建體)。在一些實施方案中，所述初始T細胞群表達Cas(例如，Cas9)蛋白。在一些實施方案中，所述方法還包括使初始T細胞群或T細胞文庫與以下物質接觸：i)包含或編碼sgRNA的sgRNA構建體，所述sgRNA包含與B2M基因(“B2M sgRNA”)中靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列；以及任選地，ii)在允許將B2M sgRNA構建體和任選的Cas組分引入初始T細胞群或T細胞文庫的條件下，包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的核酸的Cas組分。在一些實施方案中，初始T細胞群中的T細胞包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體(或sgRNA iBAR文庫中的每種sgRNA iBAR構建體)和/或所述B2M sgRNA構建體是RNA。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體(或sgRNA iBAR文庫中的每種sgRNA iBAR構建體)和/或所述B2M sgRNA構建體是質粒。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體(或sgRNA iBAR文庫中的每種sgRNA iBAR構建體)和/或所述B2M sgRNA構建體是病毒載體，如慢病毒載體。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體(或sgRNA iBAR文庫中的每種sgRNA iBAR構建體)和/或所述B2M sgRNA構建體是病毒，如慢病毒。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫(或sgRNA iBAR文庫)和/或B2M sgRNA構建體以至少約2(諸如3)的感染複數(MOI)與初始T細胞群接觸。
在根據上述任一方法的一些實施方案中，用NK細胞處理包括：i)初始處理步驟，包括使T細胞文庫與NK細胞接觸；ii)任選的第一富集步驟，包括分選經處理細胞的混合物以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第一T細胞亞群；iii)任選的第一恢複步驟，包括培養第一T細胞亞群；以及iv)任選的第二處理步驟，包括使第一T細胞亞群與NK細胞接觸。在一些實施方案中，初始處理步驟包括使T細胞文庫與NK細胞接觸至少約48小時，如約48小時、72小時、5天或10天中的任一個。在一些實施方案中，所述方法包括第一富集步驟。在一些實施方案中，第一富集步驟包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群(“第一活的富集”)。在一些實施方案中，第一富集步驟包括分選B2M陰性(或缺陷)和死亡的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第一T細胞亞群(“第一死的富集”)。在一些實施方案中，所述方法還包括在分選之前用抗-B2M抗體對經處理細胞的混合物進行染色。在一些實施方案中，所述方法還包括在分選之前用碘化丙啶(PI)對經處理細胞的混合物進行染色，其中PI染色指示細胞死亡。在一些實施方案中，所述方法包括第一恢複步驟。在一些實施方案中，第一恢複步驟包括培養第一T細胞亞群至少約24小時，例如約48小時。在一些實施方案中，所述方法包括第二處理步驟。在一些實施方案中，第二處理步驟包括使第一T細胞亞群與NK細胞接觸至少約48小時，例如96小時。在一些實施方案中，在初始處理步驟中T細胞文庫中NK細胞與T細胞的比例為約0.1:1至約20:1 (例如，約0.3:1至約1:1，或約0.5:1至約20:1)，如約0.5:1或約1:1。在一些實施方案中，在第二處理步驟中第一T細胞亞群中NK細胞與T細胞的比例為約0.1:1至約20:1 (例如，約0.3:1至約1:1，或約1:1到約10:1)，如約0.3:1。
在根據上述任一方法的一些實施方案中，從所述T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞包括：i)分選步驟，包括分選從步驟b)獲得的細胞以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第二T細胞亞群；以及ii)任選的第二恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養第二T細胞亞群。在一些實施方案中，分選步驟包括分選從步驟b)獲得的B2M陰性(或缺陷)且存活的細胞，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群(“收獲活的分選”)。在一些實施方案中，分選步驟包括分選從步驟b)獲得的B2M陰性(或缺陷)且死亡的細胞，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第二T細胞亞群(“收獲死的分選”)。在一些實施方案中，所述方法還包括在分選之前用抗-B2M抗體對從步驟b)獲得的細胞進行染色。在一些實施方案中，所述方法還包括在分選之前用PI對從步驟b)獲得的細胞進行染色，其中PI染色指示細胞死亡。在一些實施方案中，所述方法包括第二恢複步驟。在一些實施方案中，第二恢複步驟包括培養第二T細胞亞群至少約24小時，例如約48小時。
在根據上述任一方法的一些實施方案中，步驟b)和c)包括：i)初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約72小時；ii)富集步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；iv)第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與NK細胞接觸約96小時；以及v)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。
在根據上述任一方法的一些實施方案中，步驟b)和c)包括：i)處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約10天；以及ii)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群。
在根據上述任一方法的一些實施方案中，步驟b)和c)包括：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及iii)恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時。
在根據上述任一方法的一些實施方案中，步驟b)和c)包括：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)富集步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及iv)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。
在根據上述任何一種方法的一些實施方案中，鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括：i)鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列；以及ii)鑒定與包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列對應的命中基因。在一些實施方案中，鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括：i)鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的sgRNA序列；以及ii)鑒定與sgRNA的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，通過DNA測序或RNA測序鑒定命中基因突變(例如，失活突變)或sgRNA序列。在一些實施方案中，通過下一代測序(NGS)鑒定命中基因突變(例如，失活突變)或sgRNA序列。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：i)在從步驟c)獲得的最終T細胞亞群中獲得包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列；ii)基於序列計數對包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列進行排序；以及iii)鑒定與包含排序高於預定閾值水平的命中基因突變(例如，失活突變)的序列對應的命中基因。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：i)在從步驟c)獲得的最終T細胞亞群中獲得sgRNA序列；ii)基於序列計數對sgRNA序列的相應引導序列進行排序；以及iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，所述sgRNA是sgRNA iBAR，並且鑒定靶基因包括：i)在從步驟c)獲得的最終T細胞亞群中獲得sgRNA iBAR序列；ii)基於序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中所述排序包括基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每個引導序列的排序；以及iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，所述方法是陽性篩選。在一些實施方案中，所述方法是陰性篩選。在一些實施方案中，對所述序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫是sgRNA iBAR文庫，且基於與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，調整每個引導序列的方差。在一些實施方案中，將從步驟c)獲得的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較以提供倍數變化(例如，實際倍數變化，或倍數變化的導出數，如log2或log10倍數變化)。在一些實施方案中，對照T細胞亞群是從在相同條件下培養且沒有經曆NK細胞處理的相同T細胞文庫中獲得的，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲取方法。在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化方向，確定在與每個引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上(例如，增加對減少、增加對不變、或減少對不變)，則所述引導序列的方差增加。在一些實施方案中，所述方法還包括在相同條件下培養相同的T細胞文庫而不經曆NK細胞處理，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲取方法以獲得對照T細胞的亞群，其中鑒定與來自對照T細胞亞群的包含命中基因突變(例如，失活突變)或sgRNA的引導序列的序列對應的命中基因存在，而在來自用NK細胞處理的T細胞文庫的從步驟c)獲得的T細胞中不存在，則將該命中基因鑒定為靶基因。
在根據上述任一方法的一些實施方案中，所述方法包括在步驟d)之前使來自步驟a)的T細胞文庫經曆4個單獨試驗中至少兩個：(I)試驗I：i)初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約72小時；ii)富集步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；iv)第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與NK細胞接觸約96小時；以及v)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群；(II)試驗II：i)處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約10天；以及ii)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；(III)試驗III：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；和iii)恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時；以及(IV)試驗IV：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)富集步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及iv)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括鑒定來自4個單獨試驗中至少兩個的命中基因，其中：i)在FDR≤0.01的至少一個試驗中，或在FDR≤0.05的至少兩個試驗中被鑒定為從最終T細胞亞群(存活的)中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(如失活)使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；和/或ii)在FDR≤0.05的至少一個試驗中，或在FDR≤0.15的至少兩個試驗中被鑒定為從最終T細胞亞群中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因。
在根據上述任一方法的一些實施方案中，所述方法包括在步驟b)中對來自步驟a)的T細胞文庫用NK細胞進行至少兩次單獨的不同處理，並從步驟c)的每次處理中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括鑒定從用NK細胞進行至少兩次單獨的不同處理獲得的T細胞中的命中基因，其中：i)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷具有抗性的最終T細胞亞群中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；ii)在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷具有抗性的最終T細胞亞群中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；iii)在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷敏感的最終T細胞亞群中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；和/或iv) 在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷敏感的最終T細胞亞群中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因。
在根據上述任一方法的一些實施方案中，所述方法還包括通過以下方式驗證靶基因：a)通過在T細胞的靶基因中產生突變(例如，失活突變)來修飾T細胞；以及b)確定修飾的T細胞對NK細胞殺傷的敏感性或抗性。在一些實施方案中，所述方法還包括在T細胞的B2M中產生突變(例如，失活突變)。
在另一方面，還提供了一種產生修飾的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))的方法，包括通過上述任何方法在宿主T細胞中鑒定的靶基因失活。在一些實施方案中，所述宿主T細胞還包含B2M中的突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，所述宿主T細胞表達CAR。在一些實施方案中，所述方法還包括將編碼CAR的核酸引入所述宿主T細胞或經修飾的T細胞。在一些實施方案中，所述宿主T細胞是同種異體的。
還提供了在靶基因中包含突變(例如，失活突變)的經修飾的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))，其中所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。在一些實施方案中，經修飾的T細胞還包含B2M中的突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，靶基因是PSCS2。在一些實施方案中，所述經修飾的T細胞還表達CAR。在一些實施方案中，所述經修飾的T細胞是同種異體的。
還提供了包含一個或多個sgRNA(或sgRNA iBAR)構建體的sgRNA(或sgRNA iBAR)文庫，其中每種sgRNA(或sgRNA iBAR)構建體包含或編碼sgRNA(或sgRNA iBAR)，並且其中每種sgRNA(或sgRNA iBAR)包含與靶基因中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列，所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。在一些實施方案中，所述sgRNA(或sgRNA iBAR)文庫還包含sgRNA構建體，所述sgRNA構建體包含或編碼其引導序列與B2M中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的sgRNA。
還提供了可用於本文所述方法的試劑盒和制品，例如用於產生對NK細胞殺傷具有抗性的修飾T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))的試劑盒。
具體地，本申請涉及以下各項技術方案：
1. 一種鑒定在T細胞中調節所述T細胞活性的靶基因的方法，包括： a) 提供包含多個T細胞的T細胞文庫，其中多個T細胞中每一個在基因組的命中基因處具有突變(“命中基因突變”)，其中在所述多個T細胞的至少兩個的命中基因彼此不同； b) 用NK細胞處理所述T細胞文庫； c) 從所述T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞；以及 d) 鑒定步驟c)得到的T細胞中的命中基因，從而鑒定在T細胞中調節所述T細胞活性的靶基因。
2. 如項1所述的方法，其中所述T細胞文庫是通過對初始T細胞群進行全基因組基因編輯而產生的。
3. 如項1或2所述的方法，其中所述T細胞文庫是通過使初始T細胞群與以下物質接觸而產生的：i)包含多種sgRNA構建體的單鏈引導RNA (“sgRNA”)文庫，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與基因組中命中基因的靶位點互補的引導序列；以及任選地，ii)在允許將sgRNA構建體和任選的Cas組分引入至初始T細胞群的條件下，包含Cas蛋白或編碼所述Cas蛋白的核酸的Cas組分。
4. 如項3所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9。
5. 如項4所述的方法，其中每種sgRNA包含與第二序列融合的引導序列，其中第二序列包含與Cas9相互作用的重複-反-重複莖環。
6. 如項5所述的方法，其中每種sgRNA的第二序列還包含莖環1、莖環2和/或莖環3。
7. 如項3-6中任一項所述的方法，其中每種sgRNA還包含內部條形碼(iBAR)序列(“sgRNA iBAR”)，其中每種sgRNA iBAR可與所述Cas蛋白一起操作以修飾所述命中基因。
8. 如項7所述的方法，其中每種sgRNA iBAR的iBAR序列被插入到所述重複-反-重複莖環的環區中。
9. 如項7所述的方法，其中每種sgRNA iBAR在5’至3’的方向上包含第一莖序列和第二莖序列，其中第一莖序列與第二莖序列雜交以形成與Cas蛋白相互作用的雙鏈RNA (dsRNA)區，並且其中所述iBAR序列位於第一莖序列的3’端和第二莖序列的5’端之間。
10. 如項3-9中任一項所述的方法，其中每種引導序列包含約17至約23個核苷酸。
11. 如項7-10中任一項所述的方法，其中每個iBAR序列包含約1至約50個核苷酸。
12. 如項7-11中任一項所述的方法，其中包含多種sgRNA iBAR構建體的sgRNA文庫(“sgRNA iBAR文庫”)包含多組sgRNA iBAR構建體，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三種或更多種sgRNA iBAR構建體，其各自包含或編碼sgRNA iBAR，其中三種或更多種sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中三種或更多種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，並且其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中的不同靶位點互補。
13. 如項12所述的方法，其中每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，並且其中4種sgRNA iBAR構建體中每一種的iBAR序列彼此不同。
14. 如項12或13所述的方法，其中所述sgRNA iBAR文庫包含至少約100組sgRNA iBAR構建體。
15. 如項12-14中任一項所述的方法，其中至少兩組sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的。
16. 如項3-15中任一項所述的方法，其中包含多種sgRNA構建體的sgRNA文庫包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補的引導序列的sgRNA。
17. 如項3-16中任一項所述的方法，其中將所述sgRNA文庫中至少約95%的sgRNA構建體引入所述初始T細胞群中。
18. 如項12-17中任一項所述的方法，其中所述T細胞文庫對於每種sgRNA iBAR具有至少約100倍的覆蓋率。
19. 如項3-18中任一項所述的方法，其中所述T細胞文庫對於每種sgRNA具有至少約400倍的覆蓋率。
20. 如項3-16中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫包含至少約150000種sgRNA構建體。
21. 如項2-20中任一項所述的方法，其中所述初始T細胞群表達Cas蛋白。
22. 如項3-21中任一項所述的方法，還包括使所述初始T細胞群或所述T細胞文庫與以下物質接觸：i)包含或編碼sgRNA的sgRNA構建體，所述sgRNA包含與B2M基因(“B2M sgRNA”)中靶位點互補的引導序列；以及任選地，ii)在允許將B2M sgRNA構建體和任選的Cas組分引入所述初始T細胞群或所述T細胞文庫的條件下，包含Cas蛋白或編碼所述Cas蛋白的核酸的Cas組分。
23. 如項2-21中任一項所述的方法，其中所述初始T細胞群中的T細胞包含B2M突變。
24. 如項3-23中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體和/或所述B2M sgRNA構建體是RNA。
25. 如項3-23中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體和/或所述B2M sgRNA構建體是質粒。
26. 如項3-23中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體和/或所述B2M sgRNA構建體是病毒載體。
27. 如項26所述的方法，其中所述病毒載體是慢病毒載體。
28. 如項3-23中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體和/或所述B2M sgRNA構建體是病毒。
29. 如項28所述的方法，其中所述病毒是慢病毒。
30. 如項26-29中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫和/或所述B2M sgRNA構建體以至少約2的感染複數(MOI)與所述初始T細胞群接觸。
31. 如項1-30中任一項所述的方法，其中用NK細胞處理包括： i) 初始處理步驟，包括使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸； ii) 任選的第一富集步驟，包括分選經處理細胞的混合物以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第一T細胞亞群； iii) 任選的第一恢複步驟，包括培養第一T細胞亞群；以及 iv) 任選的第二處理步驟，包括使第一T細胞亞群與所述NK細胞接觸。
32. 如項31所述的方法，其中所述初始處理步驟包括使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸至少約48小時。
33. 如項31或32所述的方法，其中所述初始處理步驟包括使T細胞文庫與NK細胞接觸至少約5天。
34. 如項31-33中任一項所述的方法，其中所述方法包括第一富集步驟。
35. 如項34所述的方法，其中所述第一富集步驟包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群(“第一活的富集”)。
36. 如項34所述的方法，其中所述第一富集步驟包括分選B2M陰性或缺陷且死亡的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第一T細胞亞群(“第一死的富集”)。
37. 如項35或36所述的方法，還包括在分選之前用抗-B2M抗體對經處理細胞的混合物進行染色。
38. 如項35-37中任一項所述的方法，還包括在分選之前用碘化丙啶(PI)對經處理細胞的混合物進行染色，其中PI染色指示細胞死亡。
39. 如項31-35、37和38中任一項所述的方法，其中所述方法包括第一恢複步驟。
40. 如項39所述的方法，其中所述第一恢複步驟包括培養第一T細胞亞群至少約24小時。
41. 如項31-35和37-40中任一項所述的方法，其中所述方法包括第二處理步驟。
42. 如項41所述的方法，其中所述第二處理步驟包括使第一T細胞亞群與所述NK細胞接觸至少約48小時。
43. 如項1-42中任一項所述的方法，其中在所述初始處理步驟中，所述T細胞文庫中NK細胞與T細胞的比例為約0.1:1至約20:1。
44. 如項1-43中任一項所述的方法，其中在所述初始處理步驟中，所述T細胞文庫中NK細胞與T細胞的比例為約0.5:1。
45. 如項1-43中任一項所述的方法，其中在所述初始處理步驟中，所述T細胞文庫中NK細胞與T細胞的比例為約1:1。
46. 如項1-35和37-45中任一項所述的方法，其中在第二處理步驟中，第一T細胞亞群中NK細胞與T細胞的比例為約0.1:1至約20:1。
47. 如項1-35和37-46中任一項所述的方法，其中在第二處理步驟中，第一T細胞亞群中NK細胞與T細胞的比例為約0.3:1。
48. 如項1-47中任一項所述的方法，其中從所述T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞包括： i) 分選步驟，包括分選從步驟b)獲得的細胞以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第二T細胞亞群；以及 ii) 任選的第二恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養第二T細胞亞群。
49. 如項48所述的方法，其中所述分選步驟包括分選從步驟b)獲得的B2M陰性或缺陷且存活的細胞，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群(“收獲活的分選”)。
50. 如項48所述的方法，其中所述分選步驟包括分選從步驟b)獲得的B2M陰性或缺陷且死亡的細胞，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第二T細胞亞群(“收獲死的分選”)。
51. 如項49或50所述的方法，還包括在分選之前用抗-B2M抗體對從步驟b)獲得的細胞進行染色。
52. 如項49-51中任一項所述的方法，還包括在分選之前用PI對從步驟b)獲得的細胞進行染色，其中PI染色指示細胞死亡。
53. 如項48-49和51-52中任一項所述的方法，其中所述方法包括第二恢複步驟。
54. 如項53所述的方法，其中所述第二恢複步驟包括培養所述第二T細胞亞群至少約24小時。
55. 如項1-32中任一項所述的方法，其中步驟b)和c)包括： i) 初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約72小時； ii) 富集步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群； iii) 恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時； iv) 第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與所述NK細胞接觸約96小時；以及 v) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。
56. 如項1-32中任一項所述的方法，其中步驟b)和c)包括： i) 處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約10天；以及 ii) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群。
57. 如項1-32中任一項所述的方法，其中步驟b)和c)包括： i) 處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約48小時； ii) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及 iii) 恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時。
58. 如項1-32中任一項所述的方法，其中步驟b)和c)包括： i) 處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約48小時； ii) 富集步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群； iii) 恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及 iv) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。
59. 如項1-58中任一項所述的方法，其中鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括： i) 鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的包含命中基因突變的序列；以及 ii) 鑒定與包含所述命中基因突變的序列對應的命中基因。
60. 項3-58中任一項所述的方法，其中鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括： i) 鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的sgRNA序列；以及 ii) 鑒定與所述sgRNA的引導序列對應的命中基因。
61. 如項59或60所述的方法，其中通過DNA測序或RNA測序鑒定所述命中基因突變或所述sgRNA序列。
62. 如項59-61中任一項所述的方法，其中通過下一代測序(NGS)鑒定所述命中基因突變或所述sgRNA序列。
63. 如項59和61-62中任一項所述的方法，其中鑒定所述靶基因包括： i) 在從步驟c)獲得的最終T細胞亞群中獲得包含命中基因突變的序列； ii) 基於序列計數對包含所述命中基因突變的序列進行排序；以及 iii) 鑒定與包含排序高於預定閾值水平的命中基因突變的序列對應的命中基因。
64. 如項60-62中任一項所述的方法，其中鑒定所述靶基因包括： i) 在從步驟c)獲得的最終T細胞亞群中獲得sgRNA序列； ii) 基於序列計數對所述sgRNA序列的相應引導序列進行排序；以及 iii) 鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。
65. 如項60-62和64中任一項所述的方法，其中所述sgRNA是sgRNA iBAR，並且其中鑒定所述靶基因包括： i) 在從步驟c)獲得的最終T細胞亞群中獲得sgRNA iBAR序列； ii)基於序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中所述排序包括基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每種引導序列的排序；以及 iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。
66. 如項63-65中任一項所述的方法，其為陽性篩選。
67. 如項63-65中任一項所述的方法，其為陰性篩選。
68. 如項63-67中任一項所述的方法，其中使所述序列計數經曆中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。
69. 如項68所述的方法，其中基於在與所述引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性來調整每種引導序列的方差。
70. 如項63-69中任一項所述的方法，其中將從步驟c)獲得的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較以提供倍數變化。
71. 如項70所述的方法，其中所述對照T細胞亞群是從在相同條件下培養且沒有經曆NK細胞處理的相同T細胞文庫中獲得的，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲得方法。
72. 如項70或71所述的方法，其中基於每個iBAR序列的倍數變化方向確定在與每種引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上，則所述引導序列的方差增加。
73. 如項59-62中任一項所述的方法，還包括在相同條件下培養相同的T細胞文庫而不經曆NK細胞處理，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲取方法以獲得對照T細胞亞群，其中鑒定與來自對照T細胞亞群的包含命中基因突變或sgRNA的引導序列的序列對應的命中基因存在，而在來自用NK細胞處理的T細胞文庫的從步驟c)獲得的T細胞中不存在，則將所述命中基因鑒定為靶基因。
74. 如項1-32和61-72中任一項所述的方法，其中所述方法包括在步驟d)之前，使來自步驟a)的T細胞文庫經曆4個單獨試驗中至少兩個： (I) 試驗I： i) 初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約72小時； ii) 富集步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群； iii) 恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時； iv) 第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與所述NK細胞接觸約96小時；以及 v) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群； (II) 試驗II： i) 處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約10天；以及 ii) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群； (III) 試驗III： i) 處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約48小時； ii) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及 iii) 恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時；以及 (IV) 試驗IV： i) 處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約48小時； ii) 富集步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群； iii) 恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及 iv) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。
75. 如項74所述的方法，其中鑒定所述靶基因包括鑒定來自所述4個單獨試驗中至少兩個的命中基因，其中： i) 在FDR≤0.01的至少一個試驗中，在FDR≤0.05的至少兩個試驗中被鑒定為從最終T細胞亞群中耗盡的命中基因被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；和/或 ii) 在FDR≤0.05的至少一個試驗或FDR≤0.15的至少兩個試驗中被鑒定為從最終T細胞亞群中富集的命中基因被鑒定為其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因。
76. 如項1-32和61-72中任一項所述的方法，其中所述方法包括在步驟b)中對來自步驟a)的T細胞文庫用NK細胞進行至少兩次單獨的不同處理，並從步驟c)的每次處理中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞。
77. 如項76所述的方法，其中鑒定所述靶基因包括鑒定從用NK細胞進行至少兩個單獨的不同處理獲得的T細胞中的命中基因，其中： i) 在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷具有抗性的最終T細胞亞群中耗盡的命中基因被鑒定為其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因； ii) 在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷具有抗性的最終T細胞亞群中富集的命中基因被鑒定為其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因； iii) 在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷敏感的最終T細胞亞群中耗盡的命中基因，被鑒定為其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；和/或 iv) 在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷敏感的最終T細胞亞群中富集的命中基因被鑒定為其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因。
78. 如項1-77中任一項所述的方法，還包括通過以下方式驗證所述靶基因： a) 通過在所述T細胞的靶基因中產生突變來修飾T細胞；以及 b) 確定經修飾的T細胞對NK細胞殺傷的敏感性或抗性。
79. 如項78所述的方法，還包括在所述T細胞的B2M中產生突變。
80. 如項2-79中任一項所述的方法，其中所述初始T細胞群中的T細胞表達嵌合抗原受體(CAR)。
81. 產生經修飾的T細胞的方法，包括使宿主T細胞中通過項1-80中任一項所述的方法鑒定的靶基因失活。
82. 如項81所述的方法，其中所述宿主T細胞還包含B2M中的突變。
83. 如項81或82所述的方法，其中所述宿主T細胞表達CAR。
84. 如項81或82所述的方法，還包括將編碼CAR的核酸引入所述宿主T細胞。
85. 如項81-84中任一項所述的方法，其中所述宿主T細胞是同種異體的T細胞。
86. 包含靶基因突變的經修飾的T細胞，其中所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。
87. 如項86所述的經修飾的T細胞，其中所述經修飾的T細胞還包含B2M中的突變。
88. 如項86或87所述的經修飾的T細胞，其中所述靶基因是PSCS2。
89. 如項86-88中任一項所述的經修飾的T細胞，其中所述經修飾的T細胞還表達CAR。
90. 如項86-88中任一項所述的經修飾的T細胞，其中所述經修飾的T細胞是同種異體的。
91. 包含一個或多種sgRNA構建體的sgRNA文庫，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與靶基因中的靶位點互補的引導序列，所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。
92. 如項91所述的sgRNA文庫，其中所述sgRNA文庫還包含如下所述的sgRNA構建體，該sgRNA構建體包含或編碼其引導序列與B2M中的靶位點互補的sgRNA。
93. 用於產生對NK細胞殺傷具有抗性的經修飾的T細胞的試劑盒，其包含項91或92所述的sgRNA文庫。
94. 如項93所述的試劑盒，還包含Cas蛋白或編碼所述Cas蛋白的核酸。
95. 如項93或94所述的試劑盒，還包含編碼CAR的經分離的核酸。
另外，本申請還涉及以下各項技術方案：
1. 一種鑒定在T細胞中調節所述T細胞活性的靶基因的方法，包括： a) 提供包含多個T細胞的T細胞文庫，其中多個T細胞中每一個在基因組的命中基因處具有突變(“命中基因突變”)，其中在所述多個T細胞的至少兩個的命中基因彼此不同； b) 用NK細胞處理所述T細胞文庫； c) 從所述T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞；以及 d) 鑒定步驟c)得到的T細胞中的命中基因，從而鑒定在T細胞中調節所述T細胞活性的靶基因。
2. 如項1所述的方法，其中所述T細胞文庫是通過對初始T細胞群進行全基因組基因編輯而產生的。
3. 如項1或2所述的方法，其中所述T細胞文庫是通過使初始T細胞群與以下物質接觸而產生的：i)包含多種sgRNA構建體的單鏈引導RNA (“sgRNA”)文庫，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與基因組中命中基因的靶位點互補的引導序列；以及任選地，ii)在允許將sgRNA構建體和任選的Cas組分引入至初始T細胞群的條件下，包含Cas蛋白或編碼所述Cas蛋白的核酸的Cas組分。
4. 如項3所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9。
5. 如項4所述的方法，其中每種sgRNA包含與第二序列融合的引導序列，其中第二序列包含與Cas9相互作用的重複-反-重複莖環。
6. 如項5所述的方法，其中每種sgRNA的第二序列還包含莖環1、莖環2和/或莖環3。
7. 如項3-6中任一項所述的方法，其中每種sgRNA還包含內部條形碼(iBAR)序列(“sgRNA iBAR”)，其中每種sgRNA iBAR可與所述Cas蛋白一起操作以修飾所述命中基因。
8. 如項7所述的方法，其中每種sgRNA iBAR的iBAR序列被插入到所述重複-反-重複莖環的環區中。
9. 如項7所述的方法，其中每種sgRNA iBAR在5’至3’的方向上包含第一莖序列和第二莖序列，其中第一莖序列與第二莖序列雜交以形成與Cas蛋白相互作用的雙鏈RNA (dsRNA)區，並且其中所述iBAR序列位於第一莖序列的3’端和第二莖序列的5’端之間。
10. 如項3-9中任一項所述的方法，其中每種引導序列包含約17至約23個核苷酸。
11. 如項7-10中任一項所述的方法，其中每個iBAR序列包含約1至約50個核苷酸。
12. 如項7-11中任一項所述的方法，其中包含多種sgRNA iBAR構建體的sgRNA文庫(“sgRNA iBAR文庫”)包含多組sgRNA iBAR構建體，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三種或更多種sgRNA iBAR構建體，其各自包含或編碼sgRNA iBAR，其中三種或更多種sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中三種或更多種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，並且其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中的不同靶位點互補。
13. 如項12所述的方法，其中每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，並且其中4種sgRNA iBAR構建體中每一種的iBAR序列彼此不同。
14. 如項12或13所述的方法，其中所述sgRNA iBAR文庫包含至少約100組sgRNA iBAR構建體。
15. 如項12-14中任一項所述的方法，其中至少兩組sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的。
16. 如項3-15中任一項所述的方法，其中包含多種sgRNA構建體的sgRNA文庫包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補的引導序列的sgRNA。
17. 如項3-16中任一項所述的方法，其中將所述sgRNA文庫中至少約95%的sgRNA構建體引入所述初始T細胞群中。
18. 如項12-17中任一項所述的方法，其中所述T細胞文庫對於每種sgRNA iBAR具有至少約100倍的覆蓋率。
19. 如項3-18中任一項所述的方法，其中所述T細胞文庫對於每種sgRNA具有至少約400倍的覆蓋率。
20. 如項3-16中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫包含至少約150000種sgRNA構建體。
21. 如項2-20中任一項所述的方法，其中所述初始T細胞群表達Cas蛋白。
22. 如項3-21中任一項所述的方法，還包括使所述初始T細胞群或所述T細胞文庫與以下物質接觸：i)包含或編碼sgRNA的sgRNA構建體，所述sgRNA包含與B2M基因(“B2M sgRNA”)中靶位點互補的引導序列；以及任選地，ii)在允許將B2M sgRNA構建體和任選的Cas組分引入所述初始T細胞群或所述T細胞文庫的條件下，包含Cas蛋白或編碼所述Cas蛋白的核酸的Cas組分。
23. 如項2-21中任一項所述的方法，其中所述初始T細胞群中的T細胞包含B2M突變。
24. 如項3-23中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體和/或所述B2M sgRNA構建體是RNA。
25. 如項3-23中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體和/或所述B2M sgRNA構建體是質粒。
26. 如項3-23中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體和/或所述B2M sgRNA構建體是病毒載體。
27. 如項26所述的方法，其中所述病毒載體是慢病毒載體。
28. 如項3-23中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫中的每種sgRNA構建體和/或所述B2M sgRNA構建體是病毒。
29. 如項28所述的方法，其中所述病毒是慢病毒。
30. 如項26-29中任一項所述的方法，其中所述sgRNA文庫和/或所述B2M sgRNA構建體以至少約2的感染複數(MOI)與所述初始T細胞群接觸。
31. 如項1-30中任一項所述的方法，其中用NK細胞處理包括： i) 初始處理步驟，包括使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸； ii) 任選的第一富集步驟，包括分選經處理細胞的混合物以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第一T細胞亞群； iii) 任選的第一恢複步驟，包括培養第一T細胞亞群；以及 iv) 任選的第二處理步驟，包括使第一T細胞亞群與所述NK細胞接觸。
32. 如項31所述的方法，其中所述初始處理步驟包括使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸至少約48小時。
33. 如項31或32所述的方法，其中所述初始處理步驟包括使T細胞文庫與NK細胞接觸至少約5天。
34. 如項31-33中任一項所述的方法，其中所述方法包括第一富集步驟。
35. 如項34所述的方法，其中所述第一富集步驟包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群(“第一活的富集”)。
36. 如項34所述的方法，其中所述第一富集步驟包括分選B2M陰性或缺陷且死亡的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第一T細胞亞群(“第一死的富集”)。
37. 如項35或36所述的方法，還包括在分選之前用抗-B2M抗體對經處理細胞的混合物進行染色。
38. 如項35-37中任一項所述的方法，還包括在分選之前用碘化丙啶(PI)對經處理細胞的混合物進行染色，其中PI染色指示細胞死亡。
39. 如項31-35、37和38中任一項所述的方法，其中所述方法包括第一恢複步驟。
40. 如項39所述的方法，其中所述第一恢複步驟包括培養第一T細胞亞群至少約24小時。
41. 如項31-35和37-40中任一項所述的方法，其中所述方法包括第二處理步驟。
42. 如項41所述的方法，其中所述第二處理步驟包括使第一T細胞亞群與所述NK細胞接觸至少約48小時。
43. 如項1-42中任一項所述的方法，其中在所述初始處理步驟中，所述T細胞文庫中NK細胞與T細胞的比例為約0.1:1至約20:1。
44. 如項1-43中任一項所述的方法，其中在所述初始處理步驟中，所述T細胞文庫中NK細胞與T細胞的比例為約0.5:1。
45. 如項1-43中任一項所述的方法，其中在所述初始處理步驟中，所述T細胞文庫中NK細胞與T細胞的比例為約1:1。
46. 如項1-35和37-45中任一項所述的方法，其中在第二處理步驟中，第一T細胞亞群中NK細胞與T細胞的比例為約0.1:1至約20:1。
47. 如項1-35和37-46中任一項所述的方法，其中在第二處理步驟中，第一T細胞亞群中NK細胞與T細胞的比例為約0.3:1。
48. 如項1-47中任一項所述的方法，其中從所述T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞包括： i) 分選步驟，包括分選從步驟b)獲得的細胞以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第二T細胞亞群；以及 ii) 任選的第二恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養第二T細胞亞群。
49. 如項48所述的方法，其中所述分選步驟包括分選從步驟b)獲得的B2M陰性或缺陷且存活的細胞，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群(“收獲活的分選”)。
50. 如項48所述的方法，其中所述分選步驟包括分選從步驟b)獲得的B2M陰性或缺陷且死亡的細胞，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第二T細胞亞群(“收獲死的分選”)。
51. 如項49或50所述的方法，還包括在分選之前用抗-B2M抗體對從步驟b)獲得的細胞進行染色。
52. 如項49-51中任一項所述的方法，還包括在分選之前用PI對從步驟b)獲得的細胞進行染色，其中PI染色指示細胞死亡。
53. 如項48-49和51-52中任一項所述的方法，其中所述方法包括第二恢複步驟。
54. 如項53所述的方法，其中所述第二恢複步驟包括培養所述第二T細胞亞群至少約24小時。
55. 如項1-32中任一項所述的方法，其中步驟b)和c)包括： i) 初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約72小時； ii) 富集步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群； iii) 恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時； iv) 第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與所述NK細胞接觸約96小時；以及 v) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。
56. 如項1-32中任一項所述的方法，其中步驟b)和c)包括： i) 處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約10天；以及 ii) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群。
57. 如項1-32中任一項所述的方法，其中步驟b)和c)包括： i) 處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約48小時； ii) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及 iii) 恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時。
58. 如項1-32中任一項所述的方法，其中步驟b)和c)包括： i) 處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約48小時； ii) 富集步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群； iii) 恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及 iv) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。
59. 如項1-58中任一項所述的方法，其中鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括： i) 鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的包含命中基因突變的序列；以及 ii) 鑒定與包含所述命中基因突變的序列對應的命中基因。
60. 項3-58中任一項所述的方法，其中鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括： i) 鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的sgRNA序列；以及 ii) 鑒定與所述sgRNA的引導序列對應的命中基因。
61. 如項59或60所述的方法，其中通過DNA測序或RNA測序鑒定所述命中基因突變或所述sgRNA序列。
62. 如項59-61中任一項所述的方法，其中通過下一代測序(NGS)鑒定所述命中基因突變或所述sgRNA序列。
63. 如項59和61-62中任一項所述的方法，其中鑒定所述靶基因包括： i) 在從步驟c)獲得的最終T細胞亞群中獲得包含命中基因突變的序列； ii) 基於序列計數對包含所述命中基因突變的序列進行排序；以及 iii) 鑒定與包含排序高於預定閾值水平的命中基因突變的序列對應的命中基因。
64. 如項60-62中任一項所述的方法，其中鑒定所述靶基因包括： i) 在從步驟c)獲得的最終T細胞亞群中獲得sgRNA序列； ii) 基於序列計數對所述sgRNA序列的相應引導序列進行排序；以及 iii) 鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。
65. 如項60-62和64中任一項所述的方法，其中所述sgRNA是sgRNA iBAR，並且其中鑒定所述靶基因包括： i) 在從步驟c)獲得的最終T細胞亞群中獲得sgRNA iBAR序列； ii)基於序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中所述排序包括基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每種引導序列的排序；以及 iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。
66. 如項63-65中任一項所述的方法，其為陽性篩選。
67. 如項63-65中任一項所述的方法，其為陰性篩選。
68. 如項63-67中任一項所述的方法，其中使所述序列計數經曆中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。
69. 如項68所述的方法，其中基於在與所述引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性來調整每種引導序列的方差。
70. 如項63-69中任一項所述的方法，其中將從步驟c)獲得的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較以提供倍數變化。
71. 如項70所述的方法，其中所述對照T細胞亞群是從在相同條件下培養且沒有經曆NK細胞處理的相同T細胞文庫中獲得的，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲得方法。
72. 如項70或71所述的方法，其中基於每個iBAR序列的倍數變化方向確定在與每種引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上，則所述引導序列的方差增加。
73. 如項59-62中任一項所述的方法，還包括在相同條件下培養相同的T細胞文庫而不經曆NK細胞處理，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲取方法以獲得對照T細胞亞群，其中鑒定與來自對照T細胞亞群的包含命中基因突變或sgRNA的引導序列的序列對應的命中基因存在，而在來自用NK細胞處理的T細胞文庫的從步驟c)獲得的T細胞中不存在，則將所述命中基因鑒定為靶基因。
74. 如項1-32和61-72中任一項所述的方法，其中所述方法包括在步驟d)之前，使來自步驟a)的T細胞文庫經曆4個單獨試驗中至少兩個： (I) 試驗I： i) 初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約72小時； ii) 富集步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群； iii) 恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時； iv) 第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與所述NK細胞接觸約96小時；以及 v) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群； (II) 試驗II： i) 處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約10天；以及 ii) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群； (III) 試驗III： i) 處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約48小時； ii) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及 iii) 恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時；以及 (IV) 試驗IV： i) 處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使所述T細胞文庫與所述NK細胞接觸約48小時； ii) 富集步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群； iii) 恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及 iv) 分選步驟，包括分選B2M陰性或缺陷且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。
75. 如項74所述的方法，其中鑒定所述靶基因包括鑒定來自所述4個單獨試驗中至少兩個的命中基因，其中： i) 在FDR≤0.01的至少一個試驗中，在FDR≤0.05的至少兩個試驗中被鑒定為從最終T細胞亞群中耗盡的命中基因被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；和/或 ii) 在FDR≤0.05的至少一個試驗或FDR≤0.15的至少兩個試驗中被鑒定為從最終T細胞亞群中富集的命中基因被鑒定為其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因。
76. 如項1-32和61-72中任一項所述的方法，其中所述方法包括在步驟b)中對來自步驟a)的T細胞文庫用NK細胞進行至少兩次單獨的不同處理，並從步驟c)的每次處理中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞。
77. 如項76所述的方法，其中鑒定所述靶基因包括鑒定從用NK細胞進行至少兩個單獨的不同處理獲得的T細胞中的命中基因，其中： i) 在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷具有抗性的最終T細胞亞群中耗盡的命中基因被鑒定為其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因； ii) 在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷具有抗性的最終T細胞亞群中富集的命中基因被鑒定為其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因； iii) 在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷敏感的最終T細胞亞群中耗盡的命中基因，被鑒定為其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；和/或 iv) 在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷敏感的最終T細胞亞群中富集的命中基因被鑒定為其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因。
78. 如項1-77中任一項所述的方法，還包括通過以下方式驗證所述靶基因： a) 通過在所述T細胞的靶基因中產生突變來修飾T細胞；以及 b) 確定經修飾的T細胞對NK細胞殺傷的敏感性或抗性。
79. 如項78所述的方法，還包括在所述T細胞的B2M中產生突變。
80. 如項2-79中任一項所述的方法，其中所述初始T細胞群中的T細胞表達嵌合抗原受體(CAR)。
81. 產生經修飾的T細胞的方法，包括使宿主T細胞中通過項1-80中任一項所述的方法鑒定的靶基因失活。
82. 如項81所述的方法，其中所述宿主T細胞還包含B2M中的突變。
83. 如項81或82所述的方法，其中所述宿主T細胞表達CAR。
84. 如項81或82所述的方法，還包括將編碼CAR的核酸引入所述宿主T細胞。
85. 如項81-84中任一項所述的方法，其中所述宿主T細胞是同種異體的T細胞。
86. 包含靶基因突變的經修飾的T細胞，其中所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。
87. 項86的修飾的T細胞，其中所述靶基因編碼蛋白被突變失活。
88. 如項86所述的經修飾的T細胞，其中所述修飾的T細胞還包含B2M中的突變。
89. 如權利要88所述的經修飾的T細胞，其中所述B2M編碼蛋白被突變失活。
90. 如項86-89任一項所述的經修飾的T細胞，其中所述靶基因是PSCS2。
91. 如項90所述的經修飾的T細胞，其中所述靶基因PSCS2編碼蛋白被突變失活。
92. 如項86-91中任一項所述的經修飾的T細胞，其中所述經修飾的T細胞還表達CAR。
93. 如項86-92中任一項所述的經修飾的T細胞，其中所述經修飾的T細胞是同種異體的。
94. 包含一個或多種sgRNA構建體的sgRNA文庫，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與靶基因中的靶位點互補的引導序列，所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。
95. 如項94所述的sgRNA文庫，其中所述sgRNA文庫還包含如下所述sgRNA構建體，該sgRNA構建體包含或編碼其引導序列與B2M中的靶位點互補的sgRNA。
96. 用於產生對NK細胞殺傷具有抗性的經修飾的T細胞的組合物或試劑盒，其包含項94或95所述的sgRNA文庫。
97. 如項96所述的組合物或試劑盒，還包含Cas蛋白或編碼所述Cas蛋白的核酸。
98. 如項96或97所述的組合物或試劑盒，還包含編碼CAR的經分離的核酸。
99. 對NK細胞殺傷具有抗性的經修飾的T細胞，其中選自如下所述一種或多種靶基因編碼的蛋白經突變或修飾失活：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。
100. 項99的經修飾的T細胞，其為表達CAR的細胞。
本申請提供了鑒定調節T細胞活性(如響應NK細胞處理)的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中的靶基因的方法。所述方法包括：a)提供包含多個T細胞的T細胞文庫，其中多個T細胞中每一個在基因組中的命中基因處具有突變(例如，失活突變)(“命中基因突變”)，其中在所述多個T細胞的至少兩個的命中基因彼此不同；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞；以及d)鑒定T細胞中的命中基因，從而鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因。在一些實施方案中，一個或多個命中基因處的一個或多個突變(例如，失活突變)是由CRISPR/Cas引導RNA (例如單鏈引導RNA)或編碼CRISPR/Cas引導RNA的構建體(例如，載體如病毒載體，或病毒如慢病毒)，如包含本文所述的iBAR序列(sgRNA iBAR)的sgRNA產生的。使用本文所述的sgRNA iBAR分子、構建體、組或文庫的篩選測定，為真核細胞(例如T細胞)中的大規模靶標鑒定提供了可靠且高效的篩選策略，假陽性和假陰性率要低得多，並允許使用高MOI生成細胞文庫。本文鑒定的靶基因，尤其是那些其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷具有更高抗性的基因，在過繼性T細胞療法(例如CAR-T)中特別有用。例如，可以修飾同種異體T細胞(例如同種異體CAR-T細胞)以使本文鑒定的一種或多種靶基因失活，從而避免來自宿主NK細胞的排斥反應。
因此，本發明一方面提供了一種鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供包含靶向基因組(例如，人類全基因組)中的一個或多個命中基因的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫的T細胞文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞；以及d)鑒定T細胞中的命中基因，從而鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫包含一個或多個sgRNA構建體，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與基因組中命中基因的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含多組sgRNA iBAR構建體，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列和iBAR序列，其中三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體的引導序列是相同的並且與基因組中的相同靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)，其中三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中的不同靶位點(例如，不同基因或相同基因內的不同位點)互補，並且其中每種sgRNA iBAR可與Cas蛋白(例如，Cas9)一起操作以修飾(例如，切割或調節表達)所述靶位點。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫是全基因組文庫，即靶向基因組中的每個注釋基因。在一些實施方案中，為每個命中基因設計多於一個(例如，2、3、4或更多，如2個)引導序列。
還提供了用於進行本文所述的篩選方法的sgRNA或sgRNA iBAR分子、構建體、組或文庫。還提供了包含sgRNA或sgRNA iBAR分子、構建體、組或文庫的經修飾的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))，及其產生方法。還提供了靶基因，其突變(例如，失活，如敲除)使T細胞對NK細胞殺傷具有更高的敏感性或更高的抗性。還提供了針對其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷具有更高的抗性的靶基因的sgRNA分子、構建體或文庫，包含其的經修飾的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))、其藥物組合物和試劑盒。
I. 定義
將結合特定實施方案並參考某些附圖描述本發明，但本發明不限於此。申請專利範圍中的任何附圖標記不應被解釋為限制其範圍。在附圖中，為了說明的目的，一些元件的尺寸可能被誇大並且未按比例繪制。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語與本領域普通技術人員通常理解的含義相同。如有沖突，以本文件(包括定義)為准。優選的方法和材料在下面描述，盡管與本文描述的那些相似或等效的方法和材料可用於本發明的實踐或測試中。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻均通過引用整體並入。本文公開的材料、方法和實施例僅是說明性的，並不旨在進行限制。
如本文所用，“內部條形碼”或“iBAR”是指插入或附連到分子的索引，其可用於追蹤分子的身份和性能。例如，iBAR可以是插入或附連到CRISPR/Cas系統的引導RNA的短核苷酸序列，如本發明所例舉的。多個iBAR可用於在一個實驗中跟蹤單鏈引導RNA序列的性能，從而為統計分析提供重複數據，而無需重複實驗。
“CRISPR系統”或“CRISPR/Cas系統”統稱為參與CRISPR相關(“Cas”)基因表達和/或指導其活性的轉錄物和其他元件。例如，CRISPR/Cas系統可以包括編碼Cas基因的序列、tracr (反式激活CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-mate序列(例如，包括“同向重複序列”和內源性CRISPR系統中經tracrRNA處理的部分同向重複序列)、引導序列(在內源性CRISPR系統中也稱為“間隔區”)，以及源自CRISPR基因座的其他序列和轉錄物。
在CRISPR複合物形成的上下文中，“靶序列”是指引導序列被設計成與之具有互補性的序列，其中靶序列和引導序列之間的雜交促進了CRISPR複合物的形成。不一定需要完全互補，只要有足夠的互補性來引起雜交並促進CRISPR複合物的形成。靶序列可包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。CRISPR複合物可包含與靶序列雜交並與一種或多種Cas蛋白複合的引導序列。
術語“引導序列”是指引導RNA中核苷酸的連續序列，其與靶多核苷酸中的靶序列具有部分或完全互補性，並且可以通過Cas蛋白促進的堿基配對與靶序列雜交。在CRISPR/Cas9系統中，靶序列與PAM位點相鄰。PAM序列及其另一條鏈上的互補序列共同構成PAM位點。
術語“單鏈引導RNA”、“合成引導RNA”和”sgRNA”可互換使用，是指這樣的多核苷酸序列，其包含引導序列和sgRNA功能和/或sgRNA與一個或多個Cas蛋白相互作用以形成CRISPR複合物所需的任何其他序列。在一些實施方案中，所述sgRNA包含與含有源自tracrRNA的tracr序列和源自crRNA的tracr配對序列的第二序列融合的引導序列。tracr序列可以含有來自天然存在的CRISPR/Cas系統的tracrRNA的全部或部分序列。術語“引導序列”是指在引導RNA內指定靶位點的核苷酸序列，並且可以與術語“引導”或“間隔區”互換使用。術語“tracr配對序列”也可以與術語“同向重複序列”互換使用。如本文所用，“sgRNA iBAR”是指具有iBAR序列的單鏈引導RNA。
術語“可與Cas蛋白一起操作”是指引導RNA可以與Cas蛋白相互作用以形成CRISPR複合物。
如本文所用，術語“野生型”是技術人員理解的本領域術語，並且意指生物體、菌株、基因或特征的典型形式，如其在自然界中出現的，有別於突變體或變異體形式。
如本文所用，術語“變體”應理解為具有偏離自然發生模式的特性的展示。
“互補性”是指核酸通過傳統的沃森-克裏克堿基配對或其他非傳統類型與另一核酸序列形成氫鍵的能力。百分比互補性表示可以與第二核酸序列形成氫鍵(例如沃森-克裏克堿基配對)的核酸分子中殘基的百分比(例如，10個中的5、6、7、8、9、10個，即為50%、60%、70%、80%、90%和100%的互補)。“完全互補”是指一個核酸序列的所有連續殘基將與第二個核酸序列中相同數量的連續殘基形成氫鍵。如本文所用，“基本互補”是指在整個8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50個或更多個核苷酸的區域，有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、或100%的互補程度，或指在嚴格條件下雜交的兩個核酸。
如本文所用，用於雜交的“嚴格條件”是指在該條件下與靶序列具有互補性的核酸顯著地與靶序列雜交，並且基本上不與非靶序列雜交。嚴格條件通常取決於序列，並根據眾多因素而變化。通常，序列越長，該序列與其靶序列特異性雜交的溫度就越高。嚴格條件的非限制性實例詳細描述於Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1, Second Chapter “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”, Elsevier, N.Y.。
“雜交”是指一種反應，其中一種或多種多核苷酸反應形成複合物，該複合物通過核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵而穩定。氫鍵可以通過沃森-克裏克堿基配對、Hoogstein結合或任何其他序列特異性方式發生。複合物可包含形成雙鏈體結構的兩條鏈、形成多鏈複合物的三條或更多條鏈、單條自雜交鏈、或上述這些的任何組合。雜交反應可以構成更廣泛過程中的一個步驟，如PCR的起始，或酶對多核苷酸的切割。能夠與給定序列雜交的序列被稱為給定序列的“互補物”。
如本文所用，“構建體”是指核酸分子(例如，DNA或RNA)，或能夠遞送此類核酸分子的載體。例如，當在sgRNA的上下文中使用時，構建體是指sgRNA分子、編碼sgRNA的核酸分子(例如分離的DNA或病毒載體)，或能夠遞送編碼sgRNA的核酸分子的載體，如攜帶編碼sgRNA的核酸分子的慢病毒。當在蛋白質的上下文中使用時，構建體是指包含可以轉錄為RNA或表達為蛋白質的核苷酸序列的核酸分子。構建體可包含必要的調控元件，其可操作地連接至核苷酸序列，當構建體存在於宿主細胞中時該調控元件允許該核苷酸序列的轉錄或表達。
如本文所用，“可操作地連接”是指基因的表達處於與其空間連接的調控元件(例如，啟動子)的控制之下。調節元件可以位於其控制下的基因的5’(上遊)或3’(下遊)。調控元件(例如，啟動子)與基因之間的距離，可以與該調控元件(例如，啟動子)與其天然控制且該調控元件所源自的基因之間的距離大致相同。如本領域已知的，可以在不喪失調節元件(例如啟動子)功能情況下包含距離的變化。
術語“載體”用於描述可被工程化以包含可在宿主細胞中增殖的一個或多個克隆的多核苷酸的核酸分子。載體包括但不限於單鏈、雙鏈或部分雙鏈的核酸分子；包含一個或多個遊離末端、無遊離末端(例如環狀)的核酸分子；包含DNA、RNA或兩者的核酸分子；以及本領域已知的其他種類的多核苷酸。一種類型的載體是“質粒”，它指的是環狀雙鏈DNA環，其中可以插入額外的DNA片段，如通過標准分子克隆技術。某些載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自主複制(例如，具有細菌複制起點的細菌載體和遊離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非遊離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞後被整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複制。此外，某些載體能夠指導與它們有效連接的基因的表達。此類載體在本文中稱為“表達載體”。重組表達載體可以包含適於在宿主細胞中表達核酸的形式的本發明核酸，這意味著重組表達載體包括一種或多種調控元件，其可以基於宿主細胞進行選擇以用於表達，即與待表達的核酸序列可操作地連接。
“宿主細胞”是指可能是或曾經是載體或分離的多核苷酸的受體的細胞。宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。在一些實施方案中，所述宿主細胞是真核細胞，其可在體外培養並使用本文所述的方法進行修飾。術語“細胞”包括原代受試者細胞及其後代。
“感染複數”或“MOI”在本文中可互換使用，是指病原體(例如，噬菌體、病毒或細菌)與其感染靶標(例如，細胞或生物體)的比例。例如，當提到一組用病毒顆粒接種的細胞時，感染複數或MOI是病毒顆粒(例如，包含sgRNA文庫的病毒顆粒)數量與在病毒轉導過程中混合物中存在的靶細胞數量之間的比例。
如本文所用，細胞的“表型”是指細胞的可觀察特征或性狀，如其形態、發育(例如，生長、增殖、分化或死亡)、生化或生理特性、物候學或行為。表型可能來自細胞中基因的表達、環境因素的影響或兩者之間的相互作用。在一些實施方案中，表型是對殺傷(例如，通過NK細胞)的抗性或敏感性。在一些實施方案中，表型是生長或增殖的抑制。在一些實施方案中，表型是死亡。
本文所述的“分離的”核酸分子，是從至少一種汙染核酸分子中鑒定並分離的核酸分子，在其產生的環境中該核酸分子通常與之相關聯。優選地，分離的核酸不與與生產環境相關的所有成分結合。編碼本文中的多肽和抗體的分離的核酸分子，其形式不同於其在自然界中發現的形式或環境。因此，分離的核酸分子不同於編碼天然存在於細胞中的本文的多肽和抗體的核酸。
除非另有說明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此的簡並形式並編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短語編碼蛋白質或RNA的核苷酸序列也可以包括內含子，其程度是編碼蛋白質的核苷酸序列在某些版本中可以包含一個或多個內含子。
如本文所用，術語“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”，是指將外源核酸轉移或引入宿主細胞(例如，T細胞)的過程。“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”細胞是用外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。該細胞包括原代受試者細胞及其後代。
如本文所用，“處理/治療(treatment/treating)”是用於獲得包括臨床結果在內的有益或期望結果的方法。出於本發明的目的，有益的或期望的臨床結果包括但不限於以下一種或多種：減輕由疾病引起的一種或多種症狀、減輕疾病的程度、穩定疾病(例如，預防或延緩疾病的惡化)、預防或延緩疾病的傳播(例如轉移)、預防或延緩疾病的複發、延緩或減緩疾病的進展、改善疾病狀態、提供緩解(部分或全部)、減少治療疾病所需的一種或多種其他藥物的劑量、延緩疾病的進展、提高生活質量和/或延長生存期。“治療”還包括減少癌症的病理後果。
如本文所用，“個體”或“受試者”是指哺乳動物，包括但不限於：人、牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物或靈長類動物。在一些實施方案中，個體是人。
如本文所用，術語“自體的”是指源自同一個體的任何材料，隨後將其重新引入該個體。
“同種異體”是指源自同一物種的不同個體的移植物。“同種異體T細胞”是指來自捐贈者的T細胞，其具有與受者匹配的組織HLA類型。通常，匹配是基於HLA基因的三個或更多基因座的變異性進行的，並且優選在這些基因座上完美匹配。在某些情況下，同種異體移植供者可能是相關的(通常是HLA匹配密切的兄弟姐妹)、同基因的(患者的單卵“同卵”雙胞胎)或無關(沒有血緣關系並發現HLA匹配程度非常接近的供者)。HLA基因分為兩類(I型和II型)。一般來說，I型基因(即HLA-A、HLA-B或HLA-C)的錯配會增加移植排斥的風險。HLA II型基因(即HLA-DR或HLA-DQB1)的錯配會增加GvHD的風險。
如本文所用，“患者”包括患有疾病(例如，癌症或病毒感染)的任何人。術語“受試者”、“個體”和“患者”在本文中可互換使用。術語“供者受試者”或“供者”在本文中是指其細胞被獲得以用於進一步體外工程的受試者。供者受試者可以是要用通過本文描述的方法產生的細胞群來治療的患者(即自體供者)，或者可以是捐贈血液樣品(例如淋巴細胞樣品)的個體，通過本文描述的方法產生了細胞群後，將用於治療不同的個體或患者(即，同種異體供者)。接受通過本方法制備的細胞的那些受試者，可稱為“受體”或“受體受試者”。
如本文所用，術語“刺激”是指通過連接細胞表面部分(例如配體、受體或結合細胞表面部分的分子)來誘導的初級響應。例如，在受體的情況下，這種刺激需要受體的連接(例如，配體或分子與受體的結合)，以及隨後的信號轉導事件。關於T細胞的刺激，這種刺激是指T細胞表面部分的連接，在一個實施方案中其隨後誘導信號轉導事件，如結合TCR/CD3複合物。此外，刺激事件可以激活細胞並上調或下調分子的表達或分泌，如下調TGF-β。因此，即使在沒有直接信號轉導事件的情況下，細胞表面部分的連接也可能導致細胞骨架結構的重組，或細胞表面部分的聚結，其中每一個都可以用於增強、修飾或改變後續的細胞響應。
如本文所用，術語“活化”是指細胞在充分連接細胞表面部分以誘導顯著的生化或形態變化後的狀態。在T細胞的背景下，這種激活是指T細胞已被充分刺激以誘導細胞增殖的狀態。T細胞的活化還可誘導細胞因子的產生和調節性能或細胞溶解效應子功能。在其他細胞的上下文中，該術語推斷特定物理化學過程的上調或下調。術語“活化的T細胞”表示T細胞當前正在經曆細胞分裂、細胞因子產生、調節性能或細胞溶解效應功能，和/或最近經曆了“活化”過程。
在本說明書和申請專利範圍中使用術語“包含/包括”時，不排除其他元件或步驟。
應當理解，本文描述的本申請的實施方案包括“由……組成”和/或“基本上由……組成”的實施方案。
此處提及“約”值或參數包括(並描述)針對該值或參數本身的變化。例如，提及“關於X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，提及“非”值或參數通常意味著並描述“排除”該值或參數。例如，該方法不用於治療X型癌症意味著該方法用於治療除X型以外的癌症。
本文使用的術語“約X-Y”與“約X至約Y”具有相同的含義。
對於本文中核苷酸的數字範圍的敘述，明確考慮了其間的每個中間數字。例如，對於19-21nt的範圍，除了19nt和21nt之外還考慮了數字20nt，並且對於MOI的範圍，明確考慮了其間的每個中間數字，無論是整數還是小數。
如本文和所附申請專利範圍中所用，除非上下文另有明確規定，否則單數形式“一個/一種(a/an)”和“所述/該(the)”包括複數的所指對象。
II. 鑒定調節 T 細胞對 NK 細胞殺傷的敏感性或抗性的靶基因的方法
本申請提供了鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，如響應NK細胞處理。在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供包含多個T細胞的T細胞文庫，其中多個T細胞中每一個細胞在基因組中的命中基因處具有突變(例如，失活突變)，其中所述多個T細胞中的至少兩個的命中基因彼此不同；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞；以及d)鑒定T細胞中的命中基因，從而鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因。在一些實施方案中，所述T細胞文庫是通過對初始T細胞群進行全基因組基因編輯而產生的。在一些實施方案中，所述T細胞文庫是通過使初始T細胞群(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))與以下物質接觸而產生的：i)包含多個sgRNA構建體的sgRNA文庫，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與基因組中命中基因的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列；以及任選地，ii)在允許將sgRNA構建體和任選的Cas組分引入至初始T細胞群中的條件下，包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的核酸的Cas組分。在一些實施方案中，Cas蛋白是Cas9。在一些實施方案中，每種sgRNA包含與第二序列融合的引導序列，其中第二序列包含與Cas9相互作用的重複-反-重複莖環。在一些實施方案中，每種sgRNA的第二序列還包含莖環1、莖環2和/或莖環3。在一些實施方案中，每種sgRNA還包括iBAR序列(“sgRNA iBAR”)，其中每種sgRNA iBAR可與Cas蛋白一起操作以修飾(例如，切割或調節表達)命中基因。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR的iBAR序列被插入到重複-反-重複莖環的環區中。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR在5’至3’方向上包含第一莖序列和第二莖序列，其中第一莖序列與第二莖序列雜交以形成與Cas蛋白相互作用的雙鏈RNA (dsRNA)區，並且其中iBAR序列位於第一莖序列的3’端和第二莖序列的5’端之間。在一些實施方案中，每個引導序列包含約17至約23個核苷酸。
在一些實施方案中，通過將初始T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))群與i)包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫接觸而產生T細胞文庫，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體，其各自包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列和iBAR序列，其中三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體的引導序列是相同的並且與基因組中的相同靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)，其中三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中不同的靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同位點)互補，並且其中每種sgRNA iBAR可與Cas9蛋白一起操作以修飾靶位點；以及任選地，ii)在允許將sgRNA iBAR構建體和任選的Cas組分引入至初始T細胞群中的條件下，包含Cas9蛋白或編碼該Cas9蛋白的核酸的Cas9組分。在一些實施方案中，通過將初始T細胞群與i)包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫接觸而產生T細胞文庫，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體，其各自包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列、第二序列和iBAR序列，其中三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體的引導序列是相同的並且與基因組中的相同靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)，其中三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，其中引導序列與第二序列融合，其中第二序列包含與Cas9蛋白相互作用的重複-反-重複莖環，其中iBAR序列被插入到重複-反-重複莖環的環區中，其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中的不同靶位點互補，並且其中每種sgRNA iBAR可與Cas9蛋白一起操作以修飾靶位點；以及任選地，ii)在允許將sgRNA iBAR構建體和任選的Cas9組分引入至初始T細胞群中的條件下，包含Cas9蛋白或編碼該Cas9蛋白的核酸的Cas9組分。在一些實施方案中，每個iBAR序列包含約1至約50個核苷酸。在一些實施方案中，每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，並且其中4種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少約100組sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，不同組sgRNA iBAR構建體中至少兩個sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的(例如，第一組和第二組sgRNA iBAR構建體在這兩組sgRNA iBAR構建體之間具有至少1、2、3、4或更多個共享的iBAR序列)。在一些實施方案中，至少兩組sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫以大於約2 (例如，至少約3、5或10)的MOI與初始T細胞群接觸。在一些實施方案中，包含多個sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補的引導序列的sgRNA iBAR。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫中至少約95%(例如，至少約96%、97%、98%、99%或更多中任一個)，如至少約99%的sgRNA iBAR構建體被引入至初始T細胞群中。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於每種sgRNA iBAR具有平均至少約100倍(例如，至少約200-、400-、500-、1,000-倍或更多倍中的任一個)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於每組sgRNA iBAR具有平均至少約400倍(例如，至少約800-、1,000-、2,000-、4,000-倍或更多倍中的任一個)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對sgRNA iBAR文庫具有平均至少約100倍(例如，至少約200-、400-、500-、1,000-倍或更多倍中的任一個)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對每個基因具有平均至少約800倍(例如，至少約1,200-、1,600-、2,000-、3,000-、4,000-、10,000-倍或更多倍中的任一個)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫還包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過將T細胞文庫或用於產生T細胞文庫的初始T細胞群與包含或編碼B2M sgRNA的B2M sgRNA構建體(例如，病毒載體或病毒)接觸而產生的，所述構建體包含與B2M基因中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列。在一些實施方案中，將B2M sgRNA構建體以大於約2 (例如，至少約3、5或10)的MOI與T細胞文庫或用於產生該T細胞文庫的初始T細胞群接觸。
在一些實施方案中，使用本文描述的sgRNA iBAR文庫的篩選方法，可以通過統計分析提高靶鑒別和數據再現性並降低假發現率(FDR)。在使用匯集sgRNA文庫的基於CRISPR/Cas的傳統篩選方法中，在細胞文庫構建過程中使用低MOI生成表達gRNA的高質量細胞文庫，以確保每個細胞平均具有少於一個sgRNA或成對的引導RNA (“pgRNA”)。由於文庫中的sgRNA分子隨機整合到轉染細胞中，因此足夠低的MOI可確保每個細胞表達單個sgRNA，從而最大限度地減少篩選的FDR。為了進一步降低FDR並提高數據可重複性，通常需要深入覆蓋gRNA和多個生物複制，以獲得具有高統計顯著性的命中基因。當需要大量全基因組篩選時，當用於構建文庫的細胞材料有限時，或者當進行更具挑戰性的篩選(即體內篩選)而難以安排實驗複本或控制MOI時，傳統篩選方法面臨困難。使用本文所述的sgRNA iBAR文庫的篩選方法，通過在每種sgRNA中包含iBAR序列來克服困難，這使得能夠在每個具有相同引導序列但不同iBAR序列的sgRNA組內收集內部複本。這種iBAR方法可以降低實驗噪聲。例如，如WO2020125762所示，每種sgRNA具有4個核苷酸的iBAR可以提供足夠的內部複本，以評估針對相同基因組基因座的不同sgRNA iBAR構建體之間的數據一致性。WO2020125762中兩個獨立實驗之間的高度一致性表明，一個實驗複本足以使用iBAR方法進行CRISPR/Cas篩選。因為在宿主細胞的病毒轉導過程中，文庫覆蓋率隨著高MOI顯著增加，初始細胞群中的細胞數量可以減少20倍以上以達到相同的文庫覆蓋率，如在WO2020125762中構建的全基因組人類文庫所示。同樣地，使用sgRNA iBAR的每個全基因組篩選的工作量可以按比例減少。使用具有不同iBAR序列的sgRNA，可以通過對引導序列和相應的iBAR核苷酸序列進行計數，在同一實驗中多次追蹤每個引導序列的性能，從而大大降低FDR，並提高效率和可能性。可以進一步提高轉導效率和文庫覆蓋率，在病毒轉導步驟期間使用高病毒滴度，例如，MOI＞1 (例如，MOI＞1.5、MOI＞2，MOI＞2.5、MOI＞3、MOI＞3.5、MOI＞4、MOI＞4.5、MOI＞5、MOI＞5.5、MOI＞6、MOI＞6.5、MOI＞7、MOI＞7.5、MOI＞8、MOI＞8.5、MOI＞9、MOI＞9.5或MOI＞10；如MOI是約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10中的任何一個)。
在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞；以及d)鑒定T細胞中的命中基因，從而鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因。在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞；以及d)鑒定T細胞中的命中基因，從而鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因；其中用NK細胞處理包括：i)初始處理步驟，包括使T細胞文庫與NK細胞接觸；ii)任選的第一富集步驟，包括分選經處理細胞的混合物以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第一T細胞亞群；iii)任選的第一恢複步驟，包括培養第一T細胞亞群；以及iv)任選的第二處理步驟，包括使第一T細胞亞群與NK細胞接觸；和/或其中從對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞文庫中獲得T細胞，包括：i)分選步驟，包括分選從步驟b)獲得的細胞以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第二T細胞亞群；以及ii)任選的第二恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養第二T細胞亞群。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫靶向基因組中的每個注釋基因(即，sgRNA iBAR文庫是全基因組sgRNA iBAR文庫)。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於全基因組sgRNA iBAR文庫具有平均至少約100倍(例如，至少約400倍)的覆蓋率。在一些實施方案中，鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括：i)鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的sgRNA iBAR序列；以及ii)鑒定與sgRNA iBAR的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：i)在從步驟c)獲得的最終T細胞亞群中獲得sgRNA iBAR序列；ii)基於序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中該排序包括基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每個引導序列的排序；以及iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，所述方法是陽性篩選。在一些實施方案中，所述方法是陰性篩選。在一些實施方案中，將從步驟c)獲得的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較以提供倍數變化(例如，實際倍數變化，或倍數變化的導出數，如log2或log10倍數變化)。在一些實施方案中，對照T細胞亞群是從在相同條件下培養而沒有經曆NK細胞處理的相同T細胞文庫中獲得的，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲取方法。在一些實施方案中，所述T細胞文庫還包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過使T細胞文庫或用於產生T細胞文庫的初始T細胞群與本文所述的B2M sgRNA構建體(例如，病毒載體或病毒)接觸而產生的。在一些實施方案中，在步驟b)中用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。
在一些實施方案中，提供了鑒定在T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節所述T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供包含多個T細胞的T細胞文庫，其中多個T細胞中每一個細胞在基因組中的命中基因處具有突變(例如，失活突變)，其中所述多個T細胞中的至少兩個的命中基因彼此不同；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞(處理後的T細胞群)；以及d)基於從步驟c)獲得的T細胞(或處理後的T細胞群)和對照T細胞(或對照T細胞群)中命中基因突變特征之間的差異來鑒定靶基因。在一些實施方案中，對照T細胞(或對照T細胞群)獲自在相同條件下培養而未用NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地進行步驟c)中相同的獲取方法。在一些實施方案中，用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。在一些實施方案中，從步驟c)獲得的T細胞(或處理後的T細胞群)和對照T細胞(或對照T細胞群)中命中基因突變的特征通過下一代測序來鑒定。在一些實施方案中，在步驟b)和c)中對T細胞文庫進行兩次或更多次(例如，2、3、4或更多次)單獨的不同NK細胞處理和/或獲得方法，並且基於每個處理的特征之間的差異來鑒定靶基因。在一些實施方案中，使包含命中基因突變的序列計數經曆中值比歸一化，然後是均值-方差建模。在一些實施方案中，所述方法包括：將包含從獲自步驟c)的T細胞(或處理後的T細胞群)獲得的命中基因突變的序列計數與包含從對照T細胞(或對照T細胞群)獲得的命中基因突變的序列計數進行比較，其中i)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；ii)在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；iii)在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷敏感的T細胞(或處理後的T細胞群)中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；和/或iv)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷敏感的T細胞(或處理後的T細胞群)中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因。
在一些實施方案中，提供了鑒定在T細胞中(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))調節所述T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供包含多個T細胞的T細胞文庫，其中多個T細胞中的每一個在基因組中的命中基因處具有突變(例如失活突變)，其中在多個T細胞中的至少兩個的命中基因彼此不同，其中T細胞文庫是通過使初始T細胞群與以下物質接觸而產生的：i)包含多個sgRNA構建體的sgRNA文庫，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與相應命中基因的靶位點互補的引導序列；以及ii)在允許將sgRNA構建體和Cas組分引入至初始T細胞群中並在命中基因處產生突變的條件下，包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的核酸的Cas組分；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)；以及d)基於從步驟c)中獲得的T細胞(或處理後的T細胞群)和對照T細胞(或對照T細胞群)中sgRNA或命中基因突變特征之間的差異來鑒別靶基因。在一些實施方案中，將sgRNA文庫和Cas組分依次引入初始T細胞群中。在一些實施方案中，對照T細胞(或對照T細胞群)獲自在相同條件下培養而未進行NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地進行步驟c)中相同的獲取方法。在一些實施方案中，用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。在一些實施方案中，從步驟c)獲得的T細胞(或處理後的T細胞群)和對照T細胞(或對照T細胞群)中的sgRNA或命中基因突變的特征通過下一代測序來鑒定。在一些實施方案中，在步驟b)和c)中對T細胞文庫進行兩次或更多次(例如，2、3、4或更多次)單獨的不同NK細胞處理和/或獲得方法，並且基於每個處理的特征之間的差異來鑒別靶基因。在一些實施方案中，使包含sgRNA或命中基因突變的序列計數經曆中值比歸一化，然後是均值-方差建模。在一些實施方案中，所述方法包括：將包含從獲自步驟c)的T細胞(或處理後的T細胞群)獲得的sgRNA或命中基因突變的序列計數與包含從對照T細胞(或對照T細胞群)獲得的sgRNA或命中基因突變的序列計數進行比較，其中i)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應sgRNA引導序列或突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；ii)在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應sgRNA引導序列或突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；iii)在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應sgRNA引導序列或突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷敏感的T細胞(或處理後的T細胞群)中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；和/或iv)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應sgRNA引導序列或突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷敏感的T細胞(或處理後的T細胞群)中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因。
在一些實施方案中，提供了鑒定在T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節所述T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供包含多個T細胞的T細胞文庫，其中多個T細胞中的每一個在基因組中的命中基因處具有突變(例如失活突變)，其中在多個T細胞中的至少兩個的命中基因彼此不同，其中T細胞文庫是通過使初始T細胞群與以下物質接觸而產生的：i)包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含與相應命中基因中的靶位點互補的引導序列，其中三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體的引導序列是相同的，其中三種或更多種(例如，4種) sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，並且其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與命中基因中的不同靶序列互補；以及ii)在允許將sgRNA iBAR構建體和Cas組分引入初始T細胞群並產生突變的條件下，包含Cas蛋白(例如，Cas9)或編碼該Cas蛋白的核酸的Cas組分；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群的T細胞群)；以及d)基於從步驟c)中獲得的T細胞(或處理後的T細胞群)和對照T細胞(或對照T細胞群)中sgRNA或命中基因突變特征之間的差異來鑒別靶基因。在一些實施方案中，將sgRNA iBAR文庫和Cas組分依次引入初始T細胞群。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR的iBAR序列被插入到重複-反-重複莖環的環區中。在一些實施方案中，對照T細胞(或對照T細胞群)獲自在相同條件下培養而未進行NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地進行步驟c)中相同的獲取方法。在一些實施方案中，用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。在一些實施方案中，從步驟c)獲得的T細胞(或處理後的T細胞群)和對照T細胞(或對照T細胞群)中的sgRNA iBAR或命中基因突變的特征通過下一代測序來鑒定。在一些實施方案中，在步驟b)和c)中對T細胞文庫進行兩次或更多次(例如，2、3、4或更多次)單獨的不同NK細胞處理和/或獲得方法，並且基於每個處理的特征之間的差異來鑒定靶基因。在一些實施方案中，對包含sgRNA siBAR或命中基因突變的序列計數進行中值比歸一化，然後是均值-方差建模。在一些實施例中，基於與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中的iBAR序列之間的數據一致性來調整每個引導序列的方差。在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化方向，確定在與每個引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上，則所述引導序列的方差增加。在一些實施方案中，所述方法包括：將包含從獲自步驟c)的T細胞(或處理後的T細胞群)獲得的sgRNA iBAR或命中基因突變的序列計數與包含從對照T細胞(或對照T細胞群)獲得的sgRNA iBAR或命中基因突變的序列計數進行比較，其中i)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應sgRNA iBAR引導序列或突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；ii)在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應sgRNA iBAR引導序列或突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；iii)在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應sgRNA iBAR引導序列或突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷敏感的T細胞(或處理後的T細胞群)中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；和/或iv)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應sgRNA iBAR引導序列或突變被鑒定為在從步驟c)獲得的對NK細胞殺傷敏感的T細胞(或處理後的T細胞群)中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因。在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞；以及d)鑒定步驟c)得到的T細胞中的命中基因，從而鑒定出T細胞中調節T細胞活性的靶基因；其中步驟b)和c)包括：i)初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約72小時；ii)富集步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；iv)第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與NK細胞接觸約96小時；以及v)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK殺傷具有抗性的第二T細胞亞群細胞。在一些實施方案中，鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括：i)鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的sgRNA iBAR序列；以及ii)鑒定與sgRNA iBAR的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞；其中步驟b)和c)包括：i)初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約72小時；ii)富集步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；iv)第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與NK細胞接觸約96小時；以及v)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK殺傷具有抗性的第二T細胞亞群細胞；以及d)鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因，其中鑒定靶基因包括：i)獲得從步驟c)得到的最終T細胞亞群中的sgRNA iBAR序列；ii)基於序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中該排序包括基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每個引導序列的排序；以及iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫靶向基因組中的每個注釋基因。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於全基因組sgRNA iBAR文庫具有平均至少約100倍(例如，至少約400倍)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述方法是陽性篩選。在一些實施方案中，所述方法是陰性篩選。在一些實施方案中，對序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，調整每個引導序列的方差。在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化的方向，確定在與每個引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上(例如，增加對減少、增加對不變、或減少對不變)，則所述引導序列的方差增加。在一些實施方案中，將從步驟c)獲得的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較以提供倍數變化(例如，實際倍數變化，或倍數變化的導出數，如log2或log10倍數變化)。在一些實施方案中，對照T細胞亞群獲自在相同條件下培養且沒有經曆NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲取方法。在一些實施方案中，所述T細胞文庫還包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過將T細胞文庫或用於產生T細胞文庫的初始T細胞群與本文所述的B2M sgRNA構建體(例如，病毒載體或病毒)接觸而產生的。在一些實施方案中，在步驟b)中用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。
在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞；以及d)鑒定步驟c)得到的T細胞中的命中基因，從而鑒定出T細胞中調節T細胞活性的靶基因；其中步驟b)和c)包括：i)處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約10天；以及ii)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群。在一些實施方案中，鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括：i)鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的sgRNA iBAR序列；以及ii)鑒定與sgRNA iBAR的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞；其中步驟b)和c)包括：i)處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約10天；以及ii)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及d)鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因，其中鑒定靶基因包括：i)獲得從步驟c)得到的最終T細胞亞群中的sgRNA iBAR序列；ii)基於序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中該排序包括基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每個引導序列的排序；以及iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫靶向基因組中的每個注釋基因。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於全基因組sgRNA iBAR文庫具有平均至少約100倍(例如，至少約400倍)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述方法是陽性篩選。在一些實施方案中，所述方法是陰性篩選。在一些實施方案中，對序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，調整每個引導序列的方差。在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化的方向，確定在與每個引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上(例如，增加對減少、增加對不變、或減少對不變)，則所述引導序列的方差增加。在一些實施方案中，將從步驟c)獲得的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較以提供倍數變化(例如，實際倍數變化，或倍數變化的導出數，如log2或log10倍數變化)。在一些實施方案中，對照T細胞亞群獲自在相同條件下培養且沒有經曆NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲取方法。在一些實施方案中，所述T細胞文庫還包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過將T細胞文庫或用於產生T細胞文庫的初始T細胞群與本文所述的B2M sgRNA構建體(例如，病毒載體或病毒)接觸而產生的。在一些實施方案中，在步驟b)中用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。
在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞；以及d)鑒定步驟c)得到的T細胞中的命中基因，從而鑒定出T細胞中調節T細胞活性的靶基因；其中步驟b)和c)包括：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及iii)恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時。在一些實施方案中，鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括：i)鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的sgRNA iBAR序列；以及ii)鑒定與sgRNA iBAR的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞；其中步驟b)和c)包括：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及iii)恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時；以及d)鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因，其中鑒定靶基因包括：i)獲得從步驟c)得到的最終T細胞亞群中的sgRNA iBAR序列；ii)基於序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中該排序包括基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每個引導序列的排序；以及iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫靶向基因組中的每個注釋基因。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於全基因組sgRNA iBAR文庫具有平均至少約100倍(例如，至少約400倍)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述方法是陽性篩選。在一些實施方案中，所述方法是陰性篩選。在一些實施方案中，對序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，調整每個引導序列的方差。在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化的方向，確定在與每個引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上(例如，增加對減少、增加對不變、或減少對不變)，則所述引導序列的方差增加。在一些實施方案中，將從步驟c)獲得的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較以提供倍數變化(例如，實際倍數變化，或倍數變化的導出數，如log2或log10倍數變化)。在一些實施方案中，對照T細胞亞群獲自在相同條件下培養且沒有經曆NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲取方法。在一些實施方案中，所述T細胞文庫還包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過將T細胞文庫或用於產生T細胞文庫的初始T細胞群與本文所述的B2M sgRNA構建體(例如，病毒載體或病毒)接觸而產生的。在一些實施方案中，在步驟b)中用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。
在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞；以及鑒定步驟c)得到的T細胞中的命中基因，從而鑒定出T細胞中調節T細胞活性的靶基因；其中步驟b)和c)包括：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)富集步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群NK細胞。在一些實施方案中，鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括：i)鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的sgRNA iBAR序列；以及ii)鑒定與sgRNA iBAR的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用NK細胞處理T細胞文庫；c)從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞；其中步驟b)和c)包括：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)富集步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及iv)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群NK細胞；以及d)鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因，其中鑒定靶基因包括：i)獲得從步驟c)得到的最終T細胞亞群中的sgRNA iBAR序列；ii)基於序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中該排序包括基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每個引導序列的排序；以及iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫靶向基因組中的每個注釋基因。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於全基因組sgRNA iBAR文庫具有平均至少約100倍(至少約400倍)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述方法是陽性篩選。在一些實施方案中，所述方法是陰性篩選。在一些實施方案中，對序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，調整每個引導序列的方差。在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化的方向，確定在與每個引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上(例如，增加對減少、增加對不變、或減少對不變)，則所述引導序列的方差增加。在一些實施方案中，將從步驟c)獲得的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較以提供倍數變化(例如，實際倍數變化，或倍數變化的導出數，如log2或log10倍數變化)。在一些實施方案中，對照T細胞亞群獲自在相同條件下培養且沒有經曆NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地經曆步驟c)中相同的獲取方法。在一些實施方案中，所述T細胞文庫還包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過將T細胞文庫或用於產生T細胞文庫的初始T細胞群與本文所述的B2M sgRNA構建體(例如，病毒載體或病毒)接觸而產生的。在一些實施方案中，在步驟b)中用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。
在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b)用本文所述的NK細胞對T細胞文庫進行至少兩種不同的處理；c)從T細胞文庫中獲得對步驟b)的每次處理的NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞(或T細胞亞群)；以及d)鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因；其中鑒定靶基因包括：i)針對每個NK細胞處理獲得步驟c)中獲得的T細胞(或T細胞亞群)中的sgRNA iBAR序列；ii)基於每個NK細胞處理的序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中所述排序包括基於與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每個引導序列的排序；以及iii)鑒定針對每個NK細胞處理與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因；其中(1)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩種各自不同的NK細胞處理中被鑒定為從最終T細胞亞群(來自步驟c)中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；(2)在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中或在FDR≤0.15的至少兩次單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷具有抗性的最終T細胞亞群(來自步驟c)中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；(3)在FDR≤0.05的至少一個NK細胞處理中或在FDR≤0.15的至少兩次單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞殺傷敏感的最終T細胞亞群(來自步驟c)中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；和/或(4)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05的至少兩種各自不同的NK細胞處理中被鑒定為對NK細胞殺傷敏感的從最終T細胞亞群(來自步驟c)中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫靶向基因組中的每個注釋基因。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於全基因組sgRNA iBAR文庫具有平均至少約100倍(至少約400倍)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述方法是陽性篩選。在一些實施方案中，所述方法是陰性篩選。在一些實施方案中，對序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，調整每個引導序列的方差。在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化的方向，確定在與每個引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上(例如，增加對減少、增加對不變、或減少對不變)，則所述引導序列的方差增加。在一些實施方案中，將從針對每個NK細胞處理的步驟c)獲得的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較以提供倍數變化(例如，實際倍數變化，或倍數變化的導出數，例如log2或log10倍數變化)。在一些實施方案中，對照T細胞亞群獲自在相同條件下培養並且沒有在步驟b)中進行相應的NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地經曆與步驟c)中相同的相應獲取方法。在一些實施方案中，所述T細胞文庫還包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過將T細胞文庫或用於產生T細胞文庫的初始T細胞群與本文所述的B2M sgRNA構建體(例如，病毒載體或病毒)接觸而產生的。在一些實施方案中，在步驟b)中用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。
在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b-c)使T細胞文庫經曆4個單獨的NK細胞處理試驗中的至少兩個試驗(例如，殺傷)，從而從T細胞文庫中獲得對來自每個試驗的NK細胞殺傷具有抗性的T細胞；以及d)鑒定從步驟b-c)的每個試驗獲得的T細胞中的命中基因，從而鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因；其中所述4個試驗是：(I)試驗I：i)初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約72小時；ii)富集步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；iv)第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與NK細胞接觸約96小時；以及v)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群；(II)試驗II：i)處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約10天；以及ii)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；(III)試驗III：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及iii)恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時；以及(IV)試驗IV：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)富集步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及iv)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。在一些實施方案中，鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的命中基因包括：i)鑒定從步驟c)獲得的T細胞中的sgRNA iBAR序列；以及ii)鑒定與sgRNA iBAR的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括鑒定來自4個單獨試驗中至少兩個的命中基因，其中：i)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05(例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001或更少中的任何一個)的至少兩個試驗中鑒定為從最終T細胞亞群中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；和/或ii)在FDR≤0.05的至少一個試驗或FDR≤0.15的至少兩個試驗(例如，FDR≤0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更少中的任何一個)中鑒定為從最終T細胞亞群中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使得T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫靶向基因組中的每個注釋基因。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於全基因組sgRNA iBAR文庫具有平均至少約100倍(例如，至少約400倍)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述方法是陽性篩選。在一些實施方案中，所述方法是陰性篩選。在一些實施方案中，對序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，調整每個引導序列的方差。在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化的方向，確定在與每個引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上(例如，增加對減少、增加對不變、或減少對不變)，則所述引導序列的方差增加。在一些實施方案中，將從步驟b-c)的每個試驗得到的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較，以提供倍數變化(例如，實際倍數變化，或倍數變化，如log2或log10倍數變化)。在一些實施方案中，對照T細胞亞群獲自在相同條件下培養而未在步驟b-c)的相應試驗中進行NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地在相應的試驗中進行相同的獲取方法步驟b-c)。在一些實施方案中，所述T細胞文庫還包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過將T細胞文庫或用於產生T細胞文庫的初始T細胞群與本文所述的B2M sgRNA構建體(例如，病毒載體或病毒)接觸而產生的。在一些實施方案中，在步驟b-c)中用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。
在一些實施方案中，提供了鑒定T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中調節T細胞活性的靶基因的方法，包括：a)提供T細胞文庫，其包含本文所述的靶向基因組中一個或多個命中基因的sgRNA iBAR文庫；b-c)使T細胞文庫經曆4個單獨的NK細胞處理試驗中的至少兩個試驗(例如，殺傷)，從而從T細胞文庫中獲得對每個試驗的NK細胞殺傷具有抗性的T細胞；其中4個試驗是：(I)試驗I：i)初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約72小時；ii)富集步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；iv)第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與NK細胞接觸約96小時；以及v)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群；(II)試驗II：i)處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約10天；以及ii)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；(III)試驗III：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及iii)恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時；以及(IV)試驗IV：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)富集步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及iv)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性(或缺陷)，或CD3 +)且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對殺傷具有抗性的第二T細胞亞群NK細胞；以及d)鑒定T細胞中調節T細胞活性的靶基因，其中鑒定靶基因包括：i)獲得從步驟b-c)的每個試驗獲得的最終T細胞亞群中的sgRNA iBAR序列；ii)基於每個試驗的序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中所述排序包括基於與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每個引導序列的排序；以及iii)鑒定與每個試驗的排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因；其中(1)在FDR≤0.01的至少一個NK細胞處理中，在FDR≤0.05(例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001或更少中的任一個)的至少兩個試驗中被鑒定為從最終T細胞亞群中耗盡(和/或具有至少約2倍的耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多耗盡中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；和/或(2)在FDR≤0.05的至少一個試驗或FDR≤0.15的至少兩個試驗(例如，FDR≤0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更少中的任一個)中被鑒定為從最終T細胞亞群中富集(和/或具有至少約2倍的富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多富集中的任一種)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使得T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫靶向基因組中的每個注釋基因。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於全基因組sgRNA iBAR文庫具有平均至少約100倍(例如，至少約400倍)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述方法是陽性篩選。在一些實施方案中，所述方法是陰性篩選。在一些實施方案中，對序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，調整每個引導序列的方差。在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化的方向，確定在與每個引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上(例如，增加對減少、增加對不變、或減少對不變)，則所述引導序列的方差增加。在一些實施方案中，將從步驟b-c)的每個試驗得到的最終T細胞亞群獲得的序列計數與從對照T細胞亞群獲得的相應序列計數進行比較，以提供倍數變化(例如，實際倍數變化，或倍數變化，例如log2或log10倍數變化)。在一些實施方案中，對照T細胞亞群獲自在相同條件下培養而未在步驟b-c)的相應試驗中進行NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地經曆在步驟b-c)的相應試驗中的相同獲取方法。在一些實施方案中，所述T細胞文庫還包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過將T細胞文庫或用於產生T細胞文庫的初始T細胞群與本文所述的B2M sgRNA構建體(例如，病毒載體或病毒)接觸而產生的。在一些實施方案中，在步驟b-c)中用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。
在一些實施方案中，本文所述的任何鑒定方法還包括通過以下方式驗證靶基因：a)通過在T細胞的靶基因中產生突變(例如，失活突變)來修飾T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))；b)確定修飾的T細胞對NK細胞殺傷的敏感性或抗性。在一些實施方案中，所述方法還包括在T細胞的B2M中產生突變(例如，失活突變)。
還提供了通過使由本文所述的任何方法鑒定的一種或多種靶基因失活而獲得的經修飾的T細胞(例如，經修飾的同種異體T細胞，或經修飾的CAR-T細胞(如經修飾的同種異體CAR-T細胞))。
單鏈引導 RNA (sgRNA) 文庫和 sgRNA iBAR 文庫
在一些實施方案中，本發明使用CRISPR/Cas引導RNA (例如，單鏈引導RNA)和編碼CRISPR/Cas引導RNA的構建體，以在基因組的一個或多個命中基因中產生突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，通過切割命中基因(例如，用CRISPR/Cas9)產生突變。在一些實施方案中，通過調節(例如，阻抑或降低)命中基因的表達(例如，用與阻遏物結構域融合的CRISPR/dCas)來產生突變。
在一些實施方案中，提供了包含一種或多種(例如，1、2、3、4、5、10、100、1,000、10,000、20,000或更多) sgRNA構建體的sgRNA文庫，其中每種sgRNA構建體(例如，編碼sgRNA的慢病毒或慢病毒載體)包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與相應命中基因中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫包含多個(例如，2、3、4、5、10、100、1,000、10,000、20,000或更多) sgRNA構建體，其中與引導序列互補的至少兩個命中基因是彼此不同。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體包含sgRNA(或由其組成)。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體編碼sgRNA。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體是編碼sgRNA的質粒。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體是編碼sgRNA的病毒載體(例如，慢病毒載體)。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體是編碼sgRNA的病毒(例如，慢病毒)。在一些實施方案中，每種sgRNA包含與第二序列融合的引導序列，其中第二序列包含與Cas蛋白(例如，Cas9)相互作用的重複-反-重複莖環。在一些實施方案中，每種sgRNA的第二序列還包含莖環1、莖環2和/或莖環3。在一些實施方案中，每個引導序列包含約17至約23個核苷酸。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫包含至少約100個sgRNA構建體，如至少約200、300、400、1,000、1,600、4,000、10,000、15,000、16,000、19,000、20,000、38,000、50,000、100,000、150,000、155,000、200,000或更多sgRNA構建體。在一些實施方案中，包含多個sgRNA構建體的sgRNA文庫，包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補的引導序列的sgRNA (下文中也稱為“全基因組sgRNA文庫”)。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫包含至少兩個sgRNA構建體，所述構建體包含或編碼具有與相同命中基因的至少兩個不同靶位點互補的引導序列的sgRNA，即sgRNA文庫對該命中基因具有平均至少兩倍的覆蓋率。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫包含至少兩個(例如，2、3、4、5個或更多) sgRNA構建體，所述構建體包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的相同命中基因內的至少兩個不同靶位點互補的引導序列的sgRNA，即sgRNA文庫對全基因組具有平均至少兩倍的覆蓋率。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫還包含一個或多個(例如，1、2、3、4、5、10、100、1,000、2,000、10,000或更多)“陰性對照sgRNA構建體”，其中每個陰性對照sgRNA構建體(例如，編碼陰性對照sgRNA的慢病毒或慢病毒載體)包含或編碼陰性對照sgRNA，並且其中每個陰性對照sgRNA包含與不在基因組中的無關序列互補的引導序列，與對照基因互補(例如，已知在基因失活後測試組和對照組之間響應相同或相似)，或與基因組中任何注釋基因無關的序列互補的引導序列。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫還包含占sgRNA文庫中命中基因sgRNA構建體數量的約3%至約30%的量的陰性對照sgRNA構建體。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫還包含約1,000個陰性對照sgRNA構建體。
在一些實施方案中，所述sgRNA還包含內部條形碼(iBAR)序列(此類sgRNA在下文中稱為”sgRNA iBAR”)。在一些實施方案中，iBAR位於sgRNA中，使得所得的sgRNA iBAR可與Cas蛋白(例如，Cas9)一起操作以修飾(例如，切割或調節表達)與sgRNA iBAR的引導序列互補的命中基因。因此在一些實施方案中，本文所述的sgRNA文庫是sgRNA iBAR文庫。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含一種或多種(例如，1、2、3、4、5、10、100、1,000、2,000、10,000或更多) sgRNA iBAR構建體，其中每種sgRNA iBAR構建體包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列和iBAR序列，並且其中每個引導序列與基因組的相應命中基因中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含多個(例如，2、3、4、5、10、100、1,000、10,000或更多) sgRNA iBAR構建體，其中與引導序列互補的至少兩個命中基因是彼此不同。在一些實施方案中，每種sgRNA (或sgRNA iBAR)包含與第二序列融合的引導序列，其中第二序列包含與Cas蛋白(例如，Cas9)相互作用的重複-反-重複莖環。在一些實施方案中，每種sgRNA (或sgRNA iBAR)的第二序列還包含莖環1、莖環2和/或莖環3。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR的iBAR序列被插入到重複-反-重複莖環的環區中。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR在5’至3’方向上包含第一莖序列和第二莖序列，其中第一莖序列與第二莖序列雜交以形成與Cas蛋白相互作用的雙鏈RNA (dsRNA)區，並且其中iBAR序列位於第一莖序列的3’端和第二莖序列的5’端之間。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR在5’至3’方向上包含：引導序列、在環區域插入iBAR序列的重複-反-重複莖環、莖環1、莖環2和莖環3。在一些實施方案中，提供了包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三個或更多個(例如，3、4、5個或更多個，如4個) sgRNA iBAR構建體(例如，編碼sgRNA iBAR的慢病毒或慢病毒載體)，其各自包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列和iBAR序列，其中三個或更多個sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中三個或更多個sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，並且其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中相應命中基因的不同靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同位點)互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)。在一些實施方案中，每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，並且其中4種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同。因此，在一些實施方案中，提供了包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，其中每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列和iBAR序列，其中4種sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中4種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，並且其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中相應命中基因的不同靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同位點)互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少約100 (例如，至少約200、400、1,000、1,200、1,600、4,000、10,000、15,000、19,000、20,000、38,000、50,000、100,000、150,000、155,000、200,000或更多)組的sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，不同組sgRNA iBAR構建體中至少兩個sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的(例如，第一組和第二組sgRNA iBAR構建體的兩組sgRNA iBAR構建體之間具有至少1、2、3、4或更多個共享的iBAR序列)。在一些實施方案中，至少兩組sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的。在一些實施方案中，包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補的引導序列的sgRNA iBAR(下文中也稱為“全基因組sgRNA iBAR文庫”)。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少兩組(例如，至少2、3、4、5或更多組)sgRNA iBAR構建體，所述構建體包含或編碼具有與相同命中基因的至少兩個(例如，至少2、3、4、5或更多，如2個)不同靶位點互補的引導序列的sgRNA iBAR，即sgRNA iBAR文庫對該命中基因具有平均至少兩倍的覆蓋率。在一些實施方案中，對於每個命中基因，sgRNA iBAR文庫包含2組sgRNA iBAR構建體，所述構建體包含或編碼具有與相同命中基因的2個不同靶位點互補的引導序列的sgRNA siBAR。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少兩組(例如，至少2、3、4、5或更多組)sgRNA iBAR構建體，其包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的相同命中基因內的至少兩個(例如，至少2、3、4、5或更多，如2個)不同靶位點互補的引導序列的sgRNA iBAR，即sgRNA iBAR文庫對全基因組具有平均至少兩倍的覆蓋率。在一些實施方案中，每個引導序列包含約17至約23個核苷酸。在一些實施方案中，每個iBAR序列包含約1至約50個(例如，約6個)核苷酸。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR構建體包含sgRNA iBAR(或由其組成)。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR構建體編碼sgRNA iBAR。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR構建體是編碼sgRNA iBAR的質粒。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR構建體是編碼sgRNA iBAR的病毒載體(例如，慢病毒載體)。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR構建體是編碼sgRNA iBAR的病毒(例如，慢病毒)。具有不同iBAR序列的一組不同sgRNA iBAR構建體可用於單個基因編輯和篩選實驗，以提供重複數據。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫還包含一組或多組“陰性對照sgRNA iBAR構建體”，其中每組陰性對照sgRNA iBAR構建體包含三個或更多個(例如，3、4、5個或更多個，如4個))陰性對照sgRNA iBAR構建體(例如，編碼陰性對照sgRNA iBAR的慢病毒或慢病毒載體)，其各自包含或編碼陰性對照sgRNA iBAR，其中每個陰性對照sgRNA iBAR包含引導序列和iBAR序列，其中三個或更多個陰性對照sgRNA iBAR的引導序列構建體是相同的，其中三個或更多個陰性對照sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，並且其中每組陰性對照sgRNA iBAR構建體的引導序列與和基因組中的任何注釋基因無關的靶位點互補，與對照基因互補(例如，已知在基因失活後測試組和對照組之間響應相同或相似)，或者與不在基因組中的無關序列互補。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫還包含占sgRNA iBAR文庫中命中基因sgRNA iBAR構建體數量的約3%至約30%的量的陰性對照sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫還包含約1,000個陰性對照sgRNA iBAR構建體。
在一些實施方案中，提供了包含一個或多個sgRNA構建體(例如，sgRNA iBAR構建體)的sgRNA文庫(例如，sgRNA iBAR文庫)，其中每種sgRNA構建體(例如，編碼所述sgRNA的慢病毒或慢病毒載體)包含或編碼sgRNA (例如，sgRNA iBAR)，並且其中每種sgRNA (例如，sgRNA iBAR)包含與靶基因中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列，所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫還包含sgRNA構建體(例如，編碼所述sgRNA的慢病毒或慢病毒載體)，所述sgRNA構建體包含或編碼其引導序列與B2M中的靶位點互補的sgRNA。
在一些實施方案中，提供了包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三個或更多個(例如，3、4、5個或更多個，如4個) sgRNA iBAR構建體(例如，編碼所述sgRNA iBAR的慢病毒或的慢病毒載體)，其各自包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列和iBAR序列，其中三個或更多個sgRNA iBAR構建體的引導序列是相同的，其中三個或更多個sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中相應命中基因中的不同靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同位點)互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)，並且其中每種sgRNA iBAR可與Cas9蛋白一起操作以修飾靶位點。在一些實施方案中，提供了包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，其中每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列和iBAR序列，其中4種sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中4種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中相應命中基因中的不同靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同位點)互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)，並且其中每種sgRNA iBAR可操作Cas9蛋白修飾靶位點。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR序列包含與第二序列融合的引導序列，其中第二序列包含與Cas9相互作用的重複-反-重複莖環。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR序列的第二序列還包含莖環1、莖環2和/或莖環3。在一些實施方案中，iBAR序列被插入到重複-反-重複莖環的環區中，和/或莖環1、莖環2或莖環3的環區中。在一些實施方案中，每個iBAR序列包含約1-50 (例如，約6)個核苷酸。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR構建體是RNA、質粒、病毒載體(例如，慢病毒載體)或病毒(例如，慢病毒)。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少約100 (例如，至少約200、400、1,000、1,200、1,600、4,000、10,000、15,000、19,000、20,000、38,000、50,000、100,000、150,000、155,000、200,000或更多)組的sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，不同組sgRNA iBAR構建體中至少兩個sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的(例如，第一組和第二組sgRNA iBAR構建體的兩組sgRNA iBAR構建體之間具有至少1、2、3、4或更多個共享的iBAR序列)。在一些實施方案中，至少兩組sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的。在一些實施方案中，包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補的引導序列的sgRNA iBAR。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少兩組(例如，2、3、4、5或更多組) sgRNA iBAR構建體，所述構建體包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的相同命中基因內的至少兩個(例如，2、3、4、5或更多個，如2個)不同靶位點互補的引導序列的sgRNA iBAR。在一些實施方案中，每個引導序列包含約17至約23個核苷酸。
在一些實施方案中，提供了包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三個或更多個(例如，3、4、5個或更多個，如4個) sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列、第二序列和iBAR序列，其中三個或更多個sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中三個或更多個sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，其中引導序列與所述第二序列融合，其中第二序列包含與Cas9蛋白相互作用的重複-反-重複莖環，其中iBAR序列被插入在重複-反-重複莖環的環區中，其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中相應命中基因的不同靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同位點)互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)，並且其中每種sgRNA iBAR可與Cas9蛋白一起操作以修飾靶位點。在一些實施方案中，提供了包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，其中每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列、第二序列和iBAR序列，其中4種sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中4種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，其中引導序列與所述第二序列融合，其中第二序列包含與Cas9蛋白相互作用的重複-反-重複莖環，其中iBAR序列被插入到重複-反-重複莖環的環區中，其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中相應命中基因的不同靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同位點)互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)，並且其中每種sgRNA iBAR可與Cas9蛋白一起操作以修飾靶位點。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR序列的第二序列還包含莖環1、莖環2和/或莖環3，例如，融合至重複-反-重複莖環序列的3'端。在一些實施方案中，每個iBAR序列包含約1-50 (例如，6)個核苷酸。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR構建體是RNA、質粒、病毒載體(例如，慢病毒載體)或病毒(例如，慢病毒)。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少約100 (例如，至少約200、400、1,000、1,200、1,600、4,000、10,000、15,000、19,000、20,000、38,000、50,000、100,000、150,000、155,000、200,000或更多)組sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，不同組sgRNA iBAR構建體中至少兩個sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的(例如，第一組和第二組sgRNA iBAR構建體的兩組sgRNA iBAR構建體之間具有至少1、2、3、4或更多個共享的iBAR序列)。在一些實施方案中，至少兩組sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的。在一些實施方案中，包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補的引導序列的sgRNA iBAR。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少兩組(例如，2、3、4、5或更多組)sgRNA iBAR構建體，所述構建體包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的相同命中基因內的至少兩個(例如，2、3、4、5或更多個，如2個)不同靶位點互補的引導序列的sgRNA iBAR。在一些實施方案中，每個引導序列包含約17至約23個核苷酸。
在一些實施方案中，提供了一種sgRNA iBAR構建體，其包含靶向基因組的相應命中基因中的靶位點(例如，與其具有至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中任一個的互補性)的引導序列和編碼重複:反-重複雙鏈體和四環的序列的引導發夾，其中iBAR被嵌入在四環作為內部複本。在一些實施方案中，iBAR包含1個核苷酸(“nt”)-50nt (例如，1nt-40nt、1nt-30nt、1nt-25nt、2nt-20nt、3nt-18nt、3nt-16nt、3nt-14nt、3nt-12nt、3nt-10nt、3nt-9nt、4nt-8nt、5nt-7nt；優選地，3nt、4nt、5nt、6nt、7nt)由A、T、C和G核苷酸組成的序列。在一些實施方案中，引導序列的長度約為17-23、18-22或19-21個核苷酸中的任何一個，並且在發夾序列轉錄後就可與Cas核酸酶(例如，Cas9)結合。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR構建體還包含編碼莖環1、莖環2和/或莖環3的序列。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR構建體是RNA、質粒、病毒載體(例如，慢病毒載體)或病毒(例如，慢病毒)。
還提供了由本文所述的任一種sgRNA構建體或文庫編碼的sgRNA分子。還提供了由本文所述的任一種sgRNA iBAR構建體、組或文庫編碼的sgRNA iBAR分子。還提供了包含任一種所述sgRNA或sgRNA iBAR構建體、分子、組或文庫的組合物和試劑盒。
在一些實施方案中，提供了包含本文所述的任一種sgRNA或sgRNA iBAR構建體、分子、組或文庫的的分離的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))。在一些實施方案中，提供了一種T細胞文庫，其中每個T細胞包含來自本文所述的sgRNA文庫的一種或多種sgRNA構建體，或來自本文所述的sgRNA iBAR文庫的一種或多種sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，所述T細胞文庫包含本文描述的靶向基因組中每個注釋基因的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫。在一些實施方案中，所述宿主細胞包含或表達CRISPR/Cas系統的一種或多種組分，如可與sgRNA或sgRNA iBAR構建體一起操作的Cas蛋白。在一些實施方案中，Cas蛋白是Cas9核酸酶。
iBAR 序列
一組sgRNA iBAR構建體包含三個或更多個sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含不同的iBAR序列。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體包含三個sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含不同的iBAR序列。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含不同的iBAR序列。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體包含5個sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含不同的iBAR序列。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體包含6個或更多個sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含不同的iBAR序列。
iBAR序列可以具有任何合適的長度。在一些實施方案中，每個iBAR序列的長度為約1-50個核苷酸(“nt”)，如約1nt-40nt、1nt-30nt、1nt-20nt、2nt-20nt、3nt-18nt、3nt-16nt、3nt-14nt、3nt-12nt、3nt-10nt、3nt-9nt、3nt-8nt、4nt-8nt或5nt-7nt中的任一個。在一些實施方案中，每個iBAR序列的長度為約2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt或8nt中的任一個。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR構建體中的iBAR序列具有相同的長度。在一些實施方案中，不同sgRNA iBAR構建體的iBAR序列具有不同長度。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體中的iBAR序列具有相同的長度。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體中的iBAR序列具有不同的長度。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體中的iBAR序列與另一組sgRNA iBAR構建體中的iBAR序列具有不同的長度。在一些實施方案中，iBAR序列為約6nt，以下稱為“iBAR 6”。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫內的每個iBAR序列為約6nt。
iBAR序列可以具有任何合適的序列。在一些實施方案中，iBAR序列是由A、T、C和/或G核苷酸中的任一個構成的DNA序列。在一些實施方案中，iBAR序列是由A、U、C和/或G核苷酸中的任一個構成的RNA序列。在一些實施方案中，iBAR序列具有除A、T/U、C和G之外的非常規或經修飾的核苷酸。在一些實施方案中，每個iBAR序列長6個核苷酸，由A、T、C和G核苷酸組成。在一些實施方案中，編碼的sgRNA iBAR中的iBAR序列長6個核苷酸，由A、U、C和G核苷酸組成。
在一些實施方案中，與sgRNA iBAR文庫中的每組sgRNA iBAR構建體相關的一組iBAR序列彼此不同。在一些實施方案中，不同組sgRNA iBAR構建體中至少兩個sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的(例如，第一組和第二組sgRNA iBAR構建體的兩組sgRNA iBAR構建體之間具有至少1、2、3、4或更多個共享的iBAR序列，但同一組sgRNA iBAR構建體中每種sgRNA iBAR構建體的iBAR序列彼此不同)。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫中至少兩組(例如，至少約2、3、4、5、10、50、100、1000或更多個)組sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的。在一些實施方案中，一個或多個相同的iBAR序列用於sgRNA iBAR文庫中每組sgRNA iBAR構建體的一個或多個sgRNA iBAR構建體(但同一組sgRNA iBAR構建體中每種sgRNA iBAR構建體的iBAR序列彼此不同)。在一些實施方案中，同一組iBAR序列用於sgRNA iBAR文庫中的每組sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，沒有必要為不同組的sgRNA iBAR構建體設計不同的iBAR組。在一些實施方案中，固定的iBAR組用於sgRNA iBAR文庫中的所有sgRNA iBAR構建體組。在一些實施方案中，多個iBAR序列被隨機分配給sgRNA iBAR文庫中不同組的sgRNA iBAR構建體。本文描述的具有最新分析工具的iBAR策略(MAGeCK iBAR; Zhu et al., Genome Biol.2019; 20:200)，可以促進大規模CRISPR/Cas篩選以在各種環境中進行生物醫學發現。
可以將iBAR序列插入(包括附加)到引導RNA (例如sgRNA)中不影響gRNA將Cas核酸酶(例如，Cas9)引導至其靶位點的效率的任何合適區域。在一些實施方案中，iBAR序列位於sgRNA的3’端。在一些實施方案中，iBAR序列位於sgRNA的5’端。在一些實施方案中，iBAR序列位於sgRNA的內部位置。例如，sgRNA可以包含與CRISPR複合物中的Cas核酸酶相互作用的各種莖環，並且iBAR序列可以嵌入至任何一個莖環的環區中。在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR序列在5’至3’方向上包含第一莖序列和第二莖序列，其中第一莖序列與第二莖序列雜交形成與Cas蛋白(例如，Cas9)相互作用的雙鏈RNA (dsRNA)區，並且其中iBAR序列位於第一莖序列的3’端和第二莖序列的5’端之間。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR還包含莖環1、莖環2和/或莖環3，其中iBAR序列被插入到莖環1、莖環2和/或莖環的環區中。
例如，CRISPR/Cas9系統的引導RNA可以包含靶向基因組基因座(例如命中基因中的靶位點)的引導序列，以及編碼重複:反-重複雙鏈體和四環的引導發夾序列。在一些實施方案中，iBAR被插入到四環中作為內部複本。在內源性CRISPR/Cas9系統的背景下，crRNA與反式激活的crRNA (tracrRNA)雜交以形成crRNA:tracrRNA雙鏈體，將其加載到Cas9上以指導切割帶有適當的前間隔區序列臨近基序的同源DNA序列(PAM)。內源性crRNA序列可分為引導區(20nt)和重複區(12nt)，而內源性tracrRNA序列可分為反-重複區(14nt)和三個tracrRNA莖環。在一些實施方案中，所述sgRNA結合靶DNA以形成T形結構，其包含引導:靶異源雙鏈體、重複:反-重複雙鏈體和莖環1-3。在一些實施方案中，重複和反-重複部分通過四環連接，並且重複和反-重複形成重複:反-重複雙鏈體，通過單個核苷酸(A51)與莖環1連接，而莖環1和2通過5nt單鏈接頭(核苷酸63-67)連接。在一些實施方案中，引導序列(核苷酸1-20)和靶DNA (核苷酸10-200)通過20個沃森-克裏克堿基對形成引導:靶異源雙鏈體，以及重複(核苷酸21-32)和反-重複(核苷酸37-50)通過9個沃森-克裏克堿基對(U22:A49-A26:U45和G29:C40-A32:U37)形成重複:反-重複雙鏈體。在一些實施方案中，tracrRNA尾部(核苷酸68-81和82-96)分別通過4個和6個沃森-克裏克堿基對(A69:U80-U72:A77和G82:C96-G87:C91)形成莖環2和3。Nishimasu等人描述了示例性CRISPR/Cas9系統的晶體結構(Nishimasu et al.“Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA.” Cell. 2014; 156:935–949)，其通過引用整體並入本文。
在一些實施方案中，iBAR序列被插入到sgRNA的四環或重複:反-重複莖環的環區中。在一些實施方案中，文庫內每種sgRNA iBAR的iBAR序列被插入到重複-反-重複莖環的環區中。Cas9sgRNA骨架的四環位於Cas9-sgRNA核糖核蛋白複合物之外，該複合物因各種目的發生改變而不影響其上遊引導序列的活性(Gilbert et al. Cell 159, 647-661 (2014); Zhu et al. Methods Mol Biol 1656, 175-181 (2017))。申請人先前已在WO2020125762中證明，6nt長的iBAR (iBAR 6)可以嵌入至典型Cas9sgRNA骨架的四環中，而不會影響sgRNA的基因編輯效率或增加脫靶效應，並且在iBAR 6中沒有序列偏好。示例性iBAR 6產生4,096個條形碼組合，這為高通量篩選提供了足夠的變化(參見WO2020125762的圖1A)。
引導序列
引導序列與靶序列(例如，命中基因中的靶位點)雜交並指導CRISPR複合物與靶序列的序列特異性結合。在一些實施方案中，當使用合適的比對算法進行最佳比對時，引導序列與其對應的靶序列之間的互補程度為約或大於約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多(例如，100%互補)中的任一個。與靶位點或命中基因“互補”的引導序列，可以是與靶位點或命中基因完全或部分互補的(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)。可以使用用於比對序列的任何合適的算法來確定最佳比對，其非限制性示例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wimsch算法、基於Burrows-Wheeler變換的算法。在某些實施方案中，引導序列的長度為約或多於約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個核苷酸。在一些實施方案中，引導序列包含約17至約23個核苷酸。引導序列指導CRISPR複合物與靶序列進行序列特異性結合的能力，可以通過任何合適的測定來評估。例如，可將足以形成CRISPR複合體的CRISPR系統組件，包括待測試的引導序列，提供給具有相應靶序列的宿主細胞，如通過用編碼CRISPR序列組件的載體轉染，然後評估靶序列內的優先切割。類似地，靶多核苷酸序列的切割可以通過如下方式在測試管中評估：提供靶序列、CRISPR複合物的組分，包括待測試的引導序列和不同於測試引導序列的對照引導序列，並比較在測試和對照引導序列反應之間靶序列處的結合或切割率。
在一些實施方案中，引導序列可短至約10個核苷酸，且長至約30個核苷酸。在一些實施方案中，引導序列的長度為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸中的任何一個。合成引導序列可以是約20個核苷酸長，但可以更長或更短。舉例來說，CRISPR/Cas9系統的引導序列，可以由與靶序列(例如，命中基因中的靶位點)互補的20個核苷酸組成，即除了DNA和RNA之間的A/U差異之外，引導序列可以與PAM序列上遊的20個核苷酸相同。在一些實施方案中，引導序列包含約17至約23個核苷酸。在一些實施方案中，文庫內每種sgRNA或sgRNA iBAR的引導序列具有相同的長度。在一些實施方案中，文庫內至少兩個sgRNA或sgRNA iBAR的引導序列具有不同的長度。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體內的引導序列具有相同的長度。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體內的引導序列具有不同的長度。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體中的引導序列與另一組sgRNA iBAR構建體中的引導序列具有不同的長度。
在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體中的引導序列是相同的。在一些實施方案中，一組sgRNA iBAR構建體中的引導序列是相同的，而每組sgRNA iBAR構建體中的引導序列與基因組中的不同靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同靶位點)互補。在一些實施方案中，至少兩組sgRNA iBAR構建體的引導序列與相同命中基因的兩個不同靶位點互補。在一些實施方案中，在至少兩個(例如，2、3、4個或更多，如2個)不同靶位點中，基因組中的每個命中基因被至少兩組(例如，2、3、4或更多，如2)組sgRNA iBAR構建體的至少兩個(例如，2、3、4個或更多，如2個)引導序列靶向。在一些實施方案中，每組sgRNA iBAR構建體內的引導序列與基因組中的不同命中基因互補。
sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體中的引導序列，可根據本領域任何已知方法設計。引導序列可以靶向編碼區，如外顯子或剪接位點、靶基因的5’非翻譯區(UTR)或3’非翻譯區(UTR)。例如，基因的閱讀框可能會被引導RNA靶位點處的雙鏈斷裂(DSB)介導的插入缺失破壞。或者，可以使用靶向編碼序列5’端的引導RNA來高效地產生基因敲除。引導序列可以根據某些序列特征進行設計和優化，以實現高的在靶基因編輯活性和低的脫靶效應。例如，引導序列的GC含量可以在約20%至約70%的範圍，並且可以避免包含均聚物片段(例如，TTTT、GGGG)的序列。
引導序列可以設計為靶向任何靶基因組基因座(例如，任何命中基因的任何靶位點)。在一些實施方案中，引導序列靶向蛋白質編碼基因。在一些實施方案中，引導序列靶向編碼RNA的基因，如小RNA (例如，microRNA、piRNA、siRNA、snoRNA、tRNA、rRNA和snRNA)、核糖體RNA或長鏈非編碼RNA (lincRNA)。在一些實施方案中，引導序列靶向基因組的非編碼區。在一些實施方案中，引導序列靶向染色體基因座。在一些實施方案中，引導序列靶向染色體外基因座。在一些實施方案中，引導序列靶向線粒體基因。在一些實施方案中，引導序列與基因組(例如，人類基因組)中任何注釋基因的靶位點互補。在一些實施方案中，引導序列靶向基因組中沒有任何基因注釋的區域(“非基因區域”)。包含或編碼與非基因區域互補的此類引導序列的sgRNA或sgRNA iBAR構建體可用作陰性對照。
在一些實施方案中，引導序列被設計為抑制或失活任何命中基因或目標靶基因的表達。命中基因或靶基因可以是內源基因或轉基因。在一些實施方案中，已知命中基因或靶基因與特定表型相關。在一些實施方案中，命中基因或靶基因是未涉及特定表型的基因，如未知與特定表型相關的已知基因，或尚未表征的未知基因。在一些實施方案中，引導序列靶向的區域作為命中基因或靶基因位於不同的染色體上。
其他 sgRNA 或 sgRNA iBAR 組件
在一些實施方案中，所述sgRNA或sgRNA iBAR包含促進與Cas蛋白形成CRISPR複合物的附加序列元件。在一些實施方案中，所述sgRNA或sgRNA iBAR包含含有重複-反-重複莖環的第二序列。重複-反-重複莖環包含與tracr序列融合的tracr配對序列，所述tracr序列通過環區與tracr配對序列互補。
通常，在內源性CRISPR/Cas9系統的背景下，CRISPR複合物(包含與靶序列雜交並與一種或多種Cas蛋白複合的引導序列)的形成，導致靶序列內或附近(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多個堿基對內)一條或兩條鏈的切割。tracr序列，其可包含野生型tracr序列的全部或部分或由其組成(例如，野生型tracr序列的約或多於約20、26、32、45、48、54、63、67、85個或更多核苷酸中的任一個)，也可以形成CRISPR複合物的一部分，如通過沿著至少部分tracr序列與可操作地連接到引導序列的全部或部分tracr配對序列雜交。在一些實施方案中，tracr序列與tracr配對序列具有足夠的互補性，以雜交並參與CRISPR複合物的形成。與靶序列一樣，據認為不需要完全互補，只要有足夠的功能即可。在一些實施方案中，當最佳比對時，tracr序列沿tracr配對序列的長度具有至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的序列互補性中的任何一個。確定最佳排列在本領域技術人員的能力範圍內。例如，存在公開和商業可用的比對算法和程序，如但不限於：ClustalW、Matlab中的Smith-Waterman、Bowtie、Geneious、Biopython和SeqMan。在一些實施方案中，tracr序列的長度為約或多於約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多個核苷酸中的任一個。可以使用任何一種已知的tracr配對序列和源自天然存在的CRISPR系統的tracr序列，如來自化膿性鏈球菌( S. pyogenes) CRISPR/Cas9系統的tracr配對序列和tracr序列，如US8697359和本文所述的那些。
在一些實施方案中，tracr序列和tracr配對序列包含在單個轉錄物內，使得兩者之間的雜交產生具有二級結構的轉錄物，如莖環(也稱為發夾)，稱為“重複-反-重複莖環”。
在一些實施方案中，沒有iBAR序列的sgRNA構建體中莖環的環區長度為4個核苷酸，並且此類環區也稱為“四環”。在一些實施方案中，環區具有GAAA序列。然而，可以使用更長或更短的環序列，或者可以使用替代序列，如包括核苷酸三聯體(例如，AAA)和附加核苷酸(例如C或G)的序列。在一些實施方案中，環區的序列是CAAA或AAAG。在一些實施方案中，iBAR被插入環區，如四環。例如，iBAR序列可以插入在四環中的第一個核苷酸之前、第一個核苷酸或第二個核苷酸之間、第二個核苷酸和第三個核苷酸之間、第三個核苷酸和第4個核苷酸之間或第4個核苷酸之後。在一些實施方案中，iBAR序列替換環區中的一個或多個核苷酸。
在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR包含至少兩個或更多個莖環。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR具有兩個、三個、4個或5個莖環。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR具有至多5個發夾。在一些實施方案中，所述sgRNA或sgRNA iBAR構建體還包含轉錄終止序列，如polyT序列，例如6個T核苷酸。
在一些實施方案中，其中Cas蛋白是Cas9，每種sgRNA或sgRNA iBAR包含與包含與第二序列融合的引導序列，所述第二序列包含與Cas9相互作用的重複-反-重複莖環。在一些實施方案中，iBAR序列被插入至重複-反-重複莖環的環區中。在一些實施方案中，iBAR序列替換重複-反-重複莖環的環區中的一個或多個核苷酸。在一些實施方案中，每種sgRNA或sgRNA iBAR的第二序列還包含莖環1、莖環2和/或莖環3。在一些實施方案中，iBAR序列被插入至莖環1的環區中。在一些實施方案中，iBAR序列取代莖環1的環區中的一個或多個核苷酸。在一些實施方案中，iBAR序列被插入至莖環2的環區中。在一些實施方案中，iBAR序列取代了莖環2的環區中的一個或多個核苷酸。在一些實施方案中，iBAR序列被插入至莖環3的環區。在一些實施方案中，iBAR序列替換莖環3的環區中的一個或多個核苷酸。
在一些實施方案中，每種sgRNA iBAR在5’至3’方向上包含第一莖序列和第二莖序列，其中第一莖序列與第二莖序列雜交以形成與Cas蛋白相互作用的雙鏈RNA (dsRNA)區，並且其中iBAR序列位於第一莖序列的3’端和第二莖序列的5’端之間。
在CRISPR/Cas9系統中，引導RNA可用於指導Cas9核酸酶切割基因組DNA。例如，引導RNA可以由以序列特異性方式將CRISPR/Cas系統核酸酶靶向基因組位置的可變序列(引導序列)的核苷酸間隔區和在不同引導RNA之間恒定的不變發夾序列組成，並允許引導RNA與Cas核酸酶結合。在一些實施方案中，CRISPR/Cas引導RNA包含與宿主細胞中的靶基因組序列(例如，命中基因的靶位點)同源或互補的CRISPR/Cas可變引導序列和轉錄時能夠結合Cas核酸酶(例如Cas9)的不變發夾序列，其中所述發夾序列編碼重複:反-重複雙鏈體和四環，並且iBAR被嵌入至該四環區。
CRISPR/Cas9引導RNA的引導序列的長度可以是約17-23、18-22或19-21個核苷酸中的任何一個。引導序列可以序列特異性方式將Cas核酸酶靶向基因組基因座，並且可以按照本領域已知的一般原則設計。可以根據本領域的常識提供不變的引導RNA發夾序列，例如，如Nishimasu等人所公開的 (Nishimasu H, et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 2014; 156:935–949)。可以使用任何不變的發夾序列，只要它們在轉錄後能夠與Cas核酸酶結合。
先前的研究表明，盡管具有48-nt tracrRNA尾的sgRNA (稱為sgRNA (+48))是最小區域，但對於Cas9催化的體外DNA切割(Jinek et al., 2012)，具有擴展的tracrRNA尾的sgRNA，sgRNA (+67)和sgRNA (+85)，可以提高體內Cas9切割活性(Hsu et al., 2013)。在一些實施方案中，所述sgRNA或sgRNA iBAR包含莖環1、莖環2和/或莖環3。莖環1、莖環2和/或莖環3區可以提高CRISPR/Cas9系統中的編輯效率。在一些實施方案中，所述sgRNA在5’至3’方向上包含：引導序列、重複-反-重複莖環、莖環1、莖環2和莖環3。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR在5’至3’方向上包含：引導序列、在環區域插入iBAR序列的重複-反-重複莖環、莖環1、莖環2和莖環3。
載體和載具
在一些實施方案中，所述sgRNA構建體包含一個或多個可操作地連接至引導RNA序列的調控元件。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR構建體包含一個或多個可操作地連接至引導RNA序列和iBAR序列的調控元件。示例性調控元件包括但不限於：啟動子、增強子、內部核糖體進入位點(IRES)和其他表達控制元件(例如轉錄終止信號，如多聚腺苷酸化信號和多聚U序列)。例如，這類調控元件描述於：Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。調控元件包括在許多類型的宿主細胞中指導核苷酸序列的組成型表達的那些，以及僅在某些宿主細胞中指導核苷酸序列表達的那些(例如，組織特異性調控序列)。
sgRNA或sgRNA iBAR構建體可以存在於載體中。在一些實施方案中，載體適用於在真核細胞如哺乳動物細胞(例如，T細胞)中複制和整合。在一些實施方案中，所述sgRNA或sgRNA iBAR構建體是表達載體，如病毒載體或質粒。病毒載體的實例包括但不限於：腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物。病毒載體技術是本領域公知的，並且例如描述於：Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001, New York)，以及其他病毒學和分子生物學手冊。本領域技術人員將理解，表達載體的設計可取決於諸如待轉化宿主細胞的選擇、所需表達水平等的因素。在一些實施方案中，所述sgRNA或sgRNA iBAR構建體是一種慢病毒載體。在一些實施方案中，所述sgRNA或sgRNA iBAR構建體是病毒。在一些實施方案中，所述sgRNA或sgRNA iBAR構建體是腺病毒或腺相關病毒。在一些實施方案中，所述sgRNA或sgRNA iBAR構建體是慢病毒。在一些實施方案中，載體還包含選擇標記物。在一些實施方案中，載體還包含編碼CRISPR/Cas系統的一個或多個元件的一個或多個核苷酸序列，如編碼Cas核酸酶(例如，Cas9)的核苷酸序列。在一些實施方案中，提供了一種載體系統，其包含一種或多種編碼核苷酸序列的載體，所述核苷酸序列編碼CRISPR/Cas系統的一種或多種元件，以及包含本文所述的sgRNA或sgRNA iBAR構建體中的任一個的載體。載體可以包括一種或多種以下元件：複制起點、一種或多種調節目標多肽表達的調控序列(例如啟動子和/或增強子)，和/或一種或多種選擇標記基因(例如，抗生素抗性基因，或熒光蛋白編碼基因)。
許多基於病毒的系統已被開發用於將基因轉移到哺乳動物細胞中。例如，逆轉錄病毒為基因傳遞系統提供了一個方便的平臺。可以使用本領域已知的技術將異源核酸插入載體並包裝在逆轉錄病毒顆粒中。然後可以分離重組病毒並在體外或離體將其遞送至工程改造的哺乳動物細胞。許多逆轉錄病毒系統是本領域已知的。在一些實施方案中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體是本領域已知的。在一些實施方案中，使用慢病毒載體。在一些實施方案中，使用自我失活的慢病毒載體。可以使用本領域已知的方案將自失活慢病毒載體包裝到慢病毒中。使用本領域已知的方法，所得慢病毒可用於轉導哺乳動物細胞(例如原代人T細胞)。源自慢病毒等逆轉錄病毒的載體是實現長期基因轉移的合適工具，因為它們允許轉基因長期穩定地整合並在後代細胞中繁殖。慢病毒載體還具有低免疫原性，並且可以轉導非增殖細胞。
在一些實施方案中，載體是非病毒載體。在一些實施方案中，載體是轉座子，如睡美人轉座子系統或PiggyBac轉座子系統。在一些實施方案中，載體是基於聚合物的非病毒載體，包括例如聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)和聚乳酸(PLA)、聚(乙烯亞胺)(PEI)和樹枝狀聚合物。在一些實施方案中，載體是基於陽離子脂質的非病毒載體，如陽離子脂質體、脂質納米乳液和固體脂質納米顆粒(SLN)。在一些實施方案中，載體是基於肽的基因非病毒載體，如聚-L-賴氨酸。適用於基因編輯的任何已知非病毒載體，均可用於將sgRNA或sgRNA iBAR編碼核酸引入至免疫效應細胞(例如T細胞)。參見，例如，Yin H. et al. Nature Rev. Genetics(2014) 15:521-555; Aronovich EL et al.“The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.” Hum. Mol. Genet.(2011) R1: R14-20; and Zhao S. et al.“PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene editing.” Transl. Lung Cancer Res.(2016) 5(1): 120-125，其通過引用並入本文。在一些實施方案中，通過物理方法將編碼本文所述的sgRNA或sgRNA iBAR的任何一種或多種核酸引入T細胞，所述物理方法包括但不限於：電穿孔、聲穿孔、光穿孔、磁轉染、水穿孔。
在一些實施方案中，編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸和編碼CRISPR/Cas系統的一個或多個元件(例如Cas核酸酶，如Cas9)的一種或多種核酸位於不同的載體(例如病毒載體，如慢病毒載體)。在一些實施方案中，編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸和編碼CRISPR/Cas系統的一種或多種元件的一種或多種核酸在同一載體上。在一些實施方案中，編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸和編碼CRISPR/Cas系統的一種或多種元件的一種或多種核酸由單獨的啟動子可操作地控制。在一些實施方案中，編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸和編碼CRISPR/Cas系統的一種或多種元件的一種或多種核酸由相同的啟動子可操作地控制。在一些實施方案中，編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸和編碼CRISPR/Cas系統的一種或多種元件的一種或多種核酸通過一種或多種連接序列如IRES連接。
可以使用本領域任何已知的分子克隆方法將核酸克隆到載體中，包括例如使用限制性內切核酸酶位點和一種或多種選擇標記物。在一些實施方案中，核酸與啟動子可操作地連接。已經探索了多種啟動子用於哺乳動物細胞中的基因表達，並且本領域已知的任何啟動子都可以用於本發明。啟動子可以粗略地分類為組成型啟動子或調節型啟動子，如誘導型啟動子。
在一些實施方案中，編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸和/或編碼CRISPR/Cas系統(例如，Cas9)的一種或多種元件的一種或多種核酸可操作地連接至組成型啟動子。組成型啟動子允許異源基因(也稱為轉基因)在宿主細胞中組成型表達。本文考慮的示例性啟動子包括但不限於：巨細胞病毒極早期啟動子(CMV IE)、人類延伸因子-1α (hEF1α)、泛素C啟動子(UbiC)、磷酸甘油激酶啟動子(PGK)、猿猴病毒40早期啟動子(SV40)、雞β-肌動蛋白啟動子與CMV早期增強子(CAGG)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、多瘤增強子/單純皰疹胸苷激酶(MC1)啟動子、β肌動蛋白(β-ACT)啟動子、“骨髓增殖性肉瘤病毒增強子、陰性對照區缺失的、d1587rev引物結合位點取代的(MND)”啟動子。這種組成型啟動子在促進轉基因表達方面的效率，已在大量研究中得到廣泛比較。
在一些實施方案中，編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸和/或編碼CRISPR/Cas系統(例如，Cas9)的一種或多種元件的一種或多種核酸可操作地連接至誘導型啟動子。誘導型啟動子屬於受調控的啟動子類別。誘導型啟動子可以由一種或多種條件誘導，如工程化T細胞的物理條件、微環境或工程化T細胞的生理狀態、誘導劑(即誘導劑)或其組合。在一些實施方案中，誘導條件不誘導工程化T細胞中和/或接受T細胞療法的受試者中內源基因的表達。在一些實施方案中，誘導條件選自：誘導劑、輻射(如電離輻射、光)、溫度(如熱)、氧化還原狀態、腫瘤環境和工程化T細胞的活化狀態。在一些實施方案中，誘導型啟動子可以是NFAT啟動子、TETON ®啟動子或NFκB啟動子。
文庫
本文所述的sgRNA文庫包含一個或多個sgRNA構建體，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與基因組中相應命中基因的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列。根據基因篩選的需要，本文所述的sgRNA文庫可以設計為靶向一個或多個基因組基因座(例如，基因組中一個或多個命中基因中的多個靶位點)。在一些實施方案中，設計單個sgRNA構建體以靶向每個命中基因。在一些實施方案中，可以設計多個(例如，至少約2、3、4、5、10、20、100或更多)具有靶向單個命中基因的不同引導序列的sgRNA構建體。例如，這樣的多個sgRNA構建體可以包含或編碼靶向單個命中基因的不同靶位點的引導序列，如單個命中基因的2個(或約3至約12個)不同的靶位點。
包含一個或多個sgRNA iBAR構建體的sgRNA文庫，在本文中也稱為sgRNA iBAR文庫，其中每種sgRNA構建體包含或編碼iBAR序列。本文所述的sgRNA iBAR文庫包含一個或多個sgRNA iBAR構建體，其中每種sgRNA iBAR構建體包含或編碼sgRNA iBAR，並且其中每種sgRNA iBAR包含與基因組中相應命中基因的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列。根據基因篩選的需要，本文所述的sgRNA iBAR文庫可設計為靶向一個或多個基因組基因座(例如，基因組中一個或多個命中基因中的多個靶位點)。在一些實施方案中，設計單個sgRNA iBAR構建體以靶向每個命中基因。在一些實施方案中，可以設計多個(例如，至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或更多)具有靶向單個命中基因的不同引導序列的sgRNA iBAR構建體。例如，這樣的多個sgRNA iBAR構建體可以包含或編碼靶向單個命中基因的不同靶位點(如單個命中基因的2個不同靶位點)的引導序列。
在一些實施方案中，本文所述的sgRNA iBAR文庫包含一組或多組sgRNA iBAR構建體，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三個或更多個(例如，3、4、5個或更多個，如4個) sgRNA iBAR構建體，每個構建體包含或編碼sgRNA iBAR，其中每種sgRNA iBAR包含引導序列和iBAR序列，其中三個或更多個sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中三個或更多個sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，並且其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中相應命中基因的不同靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同位點)互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%互補中的任一個)。在一些實施方案中，每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，並且其中4種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同。在一些實施方案中，設計單組sgRNA iBAR構建體以靶向每個命中基因。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含多組(例如，至少約2、3、4、5、10、20或更多)組sgRNA iBAR構建體，其具有針對單個命中基因的不同引導序列。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少2 (如2)組sgRNA iBAR構建體，其設計為靶向每個命中基因的至少2 (如2)個不同靶位點，其中每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少約100組sgRNA iBAR構建體，如至少約200、300、400、800、1,000、2,000、3,000、5,000、10,000、15,000、19,000、20,000、40,000、50,000、100,000、150,000、200,000或更多組sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少約100，如約18,000至約20,000組sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含約36,000至約40,000組sgRNA iBAR構建體。
在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫包含至少約1、2、3、4、5、10、20、50、100、200、400、500、1,000、2,000、4,000、5,000、10,000、15,000、19,000、20,000、38,000、39,000、40,000、50,000、100,000、150,000、155,000、200,000或更多sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體中的任一個。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫包含至少約150,000個sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫包含約15,000至約200,000個sgRNA構建體，如約18,000至約20,000、約38,000至約40,000、約18,000至約50,000、約50,000至約100,000、約10,000至約200,000、約140,000至約180,000，或約150,000至約160,000個sgRNA構建體。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含約15,000至約200,000個sgRNA iBAR構建體，如約18,000至約50,000、約18,000至約20,000、約38,000至約約40,000、約50,000至約100,000、約10,000至約200,000、約140,000至約180,000，或約150,000至約160,000個sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含至少約1、2、3、4、5、10、20、50、100、200、400、500、1,000、2,000、5,000、10,000、19,000、20,000、38,000、50,000、100,000、150,000、200,000或更多組sgRNA iBAR構建體中任一個。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫靶向細胞或生物體中至少約1、2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,00 0、10,000、15,000、19,000、20,000、38,000、50,000或更多基因中的任一個。在一些實施方案中，生物體是人。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫是蛋白質編碼基因和/或非編碼RNA的全基因組文庫。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫是每個注釋基因的全基因組文庫。因此，在一些實施方案中，包含多個sgRNA構建體的sgRNA文庫，包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補的引導序列的sgRNA，如人類基因組中19,114個注釋基因的靶位點。在一些實施方案中，包含多個sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，包含或編碼具有與基因組中每個注釋基因的靶位點互補的引導序列的sgRNA iBAR，如人類基因組中19,114個注釋基因的靶位點。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫靶向細胞或生物體中至少約0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的基因中的任一個。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫是靶向文庫，其靶向信號通路中或與細胞過程相關的選定基因，如對免疫效應細胞(例如，NK細胞)介導的殺傷、細胞增殖、細胞周期、轉錄調控、泛素化、細胞凋亡、免疫響應如自身免疫、腫瘤轉移、腫瘤惡性轉化等具有敏感性或抗性。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫用於與特定調節表型相關的全基因組篩選，如免疫效應細胞(例如，NK細胞)介導的殺傷具有敏感性或抗性。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫用於全基因組篩選，以鑒定與特定調節的表型相關的至少一種靶基因，如T細胞中響應NK細胞處理而調節T細胞活性的靶基因。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫被設計成靶向真核基因組，如哺乳動物基因組。示例性目標基因組包括齧齒動物(小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠)、馴養動物(例如，牛、羊、貓、狗、馬或兔)、非人類靈長類動物(例如，猴子)、魚(例如斑馬魚)、非脊椎動物(例如黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)和秀麗隱杆線蟲( Caenorhabditis elegans))和人類的基因組。
sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫的引導序列可以使用任何已知算法設計，這些算法在人類基因組中具有高度靶向特異性的用戶定義列表中識別CRISPR/Cas靶位點，如基因組靶標掃描(GT-Scan)(參見O’Brien et al., Bioinformatics (2014) 30:2673-2675)、DeepCRISPR、CasFinder、CHOPCHOP、CRISPRscan等。在一些實施方案中，至少約100、400、500、1,000、5,000、10,000、15,000、19,000、20,000、50,000、100,000、150,000、155,000、200,000或更多個sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可以在單個陣列上產生。在一些實施方案中，至少約19,000、20,000、38,000、50,000、100,000、150,000、155,000、200,000或更多個sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體中的任一個可以在單個陣列上產生，提供足夠的覆蓋率以全面篩選人類基因組的所有基因。這種方法還可以通過並行合成多個sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫來擴展，以實現全基因組篩選。sgRNA文庫中sgRNA構建體的確切數量，或sgRNA iBAR文庫中sgRNA iBAR構建體(或sgRNA iBAR構建體組)的確切數量，可以取決於該篩選是：1)靶向基因還是調控元件，2)靶向整個基因組還是基因組基因的亞組。
在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫被設計成靶向與基因組中基因重疊的每個PAM序列，其中PAM序列對應於Cas蛋白。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫被設計成靶向基因組中發現的PAM序列的子集，其中PAM序列對應於Cas蛋白。
在一些實施方案中，所述sgRNA文庫包含一種或多種不靶向基因組中的任何基因組基因座的對照sgRNA構建體。在一些實施方案中，不靶向推定基因組基因的sgRNA構建體可以作為陰性對照包括在sgRNA文庫中。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫包含一種或多種不靶向基因組中任何基因組基因座的對照sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，不靶向推定基因組基因的sgRNA iBAR構建體可以作為陰性對照包括在sgRNA iBAR文庫中。
可以使用本領域任何已知的核酸合成和/或分子克隆方法來制備本文所述的sgRNA構建體和文庫。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫通過陣列上的電化學方法(例如，CustomArray、Twist、Gen9)、DNA印刷(例如，Agilent)或單個寡核苷酸的固相合成(例如，通過IDT)來合成。sgRNA構建體可以通過PCR擴增，並克隆到表達載體(例如，慢病毒載體)中。在一些實施方案中，慢病毒載體進一步編碼基於CRISPR/Cas的遺傳編輯系統的一種或多種組分，如Cas蛋白，例如Cas9。
本發明在一些實施方案中提供編碼本文所述的任何sgRNA構建體、sgRNA iBAR構建體、sgRNA iBAR構建體組、sgRNA文庫、sgRNA iBAR文庫或B2M sgRNA構建體的分離的核酸。還提供了包含編碼本文所述的任何sgRNA構建體、sgRNA iBAR構建體、sgRNA iBAR構建體組、sgRNA文庫、sgRNA iBAR文庫和/或B2M sgRNA構建體的任何核酸的載體(例如，非病毒載體，或病毒載體，如慢病毒載體)和病毒(例如，慢病毒)。
Cas 蛋白
本文所述的sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可以設計為與本領域已知的任何一種天然存在的或工程化的CRISPR/Cas系統一起操作。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與I型CRISPR/Cas系統一起操作。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與II型CRISPR/Cas系統一起操作。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與III型CRISPR/Cas系統一起操作。示例性的CRISPR/Cas系統可參見WO2013176772、WO2014065596、WO2014018423、WO2016011080、US8697359、US8932814、US10113167B2，其全部內容通過引用並入本文。
在某些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與源自CRISPR/Cas I型、II型或III型系統的Cas蛋白一起操作，所述系統具有RNA引導的多核苷酸結合和/或核酸酶活性。此類Cas蛋白的實例描述於，例如WO2014144761、WO2014144592、WO2013176772、US20140273226和US20140273233，其通過引用整體並入本文。
在某些實施方案中，Cas蛋白源自II型CRISPR-Cas系統。在某些實施方案中，Cas蛋白是或源自Cas9蛋白。在某些實施方案中，Cas蛋白是或源自細菌Cas9蛋白，包括在WO2014144761中鑒定的那些。
在一些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與Cas9 (也稱為Csn1和Csx12)、其同源物或其修飾形式一起操作。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與兩種或更多種(例如，2、3、4、5或更多種) Cas蛋白一起操作。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與來自化膿性鏈球菌( S. pyogenes)或肺炎鏈球菌( S. pneumoniae)的Cas9蛋白一起操作。Cas酶是本領域已知的；例如，化膿性鏈球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可參見SwissProt數據庫，登錄號為Q99ZW2。
Cas蛋白(在本文中也稱為“Cas核酸酶”)提供所需的活性，如靶標結合、靶標切口或切割活性。在某些實施方案中，所需活性是靶結合。在某些實施方案中，所需活性是靶標切口或靶標切割。在某些實施方案中，所需活性還包括由共價融合至Cas蛋白或核酸酶缺陷型Cas蛋白的多肽提供的功能。這種所需活性的實例包括轉錄調節活性(激活或抑制)、表觀遺傳修飾活性或靶標可視化/鑒別活性。
在一些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與切割靶序列的Cas核酸酶一起操作，包括雙鏈切割和單鏈切割。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與無催化活性的Cas (“dCas”)一起操作。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與CRISPR激活(“CRISPRa”)系統的dCas一起操作，其中dCas與轉錄激活因子融合。在一些實施方案中，所述sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體可與CRISPR幹擾(CRISPRi)系統的dCas一起操作。在一些實施方案中，dCas與阻遏結構域(如KRAB結構域)融合。此類CRISPR/Cas系統可用於調節(例如，誘導、抑制、增加或減少)基因表達。
在某些實施方案中，Cas蛋白是野生型Cas蛋白(如Cas9)或其片段的突變體。Cas9蛋白通常具有至少兩個核酸酶(例如，DNA酶)結構域。例如，Cas9蛋白可以具有RuvC樣核酸酶結構域和HNH樣核酸酶結構域。RuvC和HNH結構域共同作用以在靶位點切割兩條鏈，從而在靶多核苷酸中形成雙鏈斷裂。(Jinek et al., Science 337: 816-21)。在某些實施方案中，突變的Cas9蛋白被修飾為僅包含一個功能性核酸酶結構域(RuvC樣或HNH樣核酸酶結構域)。例如，在某些實施方案中，突變Cas9蛋白被修飾，使得核酸酶結構域之一被缺失或突變，從而使其不再具有功能性(即，核酸酶活性不存在)。在核酸酶結構域之一無活性的一些實施方案中，突變體能夠將切口引入雙鏈多核苷酸(這種蛋白質稱為“切口酶”)但不能切割雙鏈多核苷酸。在某些實施方案中，Cas蛋白被修飾以增加核酸結合親和力和/或特異性、改變酶活性和/或改變蛋白的另一特性。在某些實施方案中，Cas蛋白被截短或修飾以優化效應結構域的活性。在某些實施方案中，RuvC樣核酸酶結構域和HNH樣核酸酶結構域都被修飾或消除，使得突變Cas9蛋白不能切口或切割靶多核苷酸。在某些實施方案中，相對於野生型對應物缺乏一些或全部核酸酶活性的Cas9蛋白，或多或少地保持靶標鑒定活性。
在某些實施方案中，Cas蛋白是融合蛋白，其包含與另一多肽或效應結構域融合的天然存在的Cas或其變體。另一個多肽或效應子結構域可以是例如切割結構域、轉錄激活結構域、轉錄抑制結構域或表觀遺傳修飾結構域。在某些實施方案中，融合蛋白包含修飾或突變的Cas蛋白，其中所有核酸酶結構域都已失活或缺失。在某些實施方案中，Cas蛋白的RuvC和/或HNH結構域被修飾或突變，使得它們不再具有核酸酶活性。
在某些實施方案中，融合蛋白的效應結構域是從具有所需特性的任何核酸內切酶或核酸外切酶獲得的切割結構域。
在某些實施方案中，融合蛋白的效應結構域是轉錄激活結構域。一般而言，轉錄激活結構域與轉錄控制元件和/或轉錄調節蛋白(即轉錄因子、RNA聚合酶等)相互作用以增加和/或激活基因的轉錄。在某些實施方案中，轉錄激活結構域是單純皰疹病毒VP16激活結構域、VP64(其為VP16的四聚體衍生物)、NFκBp65激活結構域、p53激活結構域1和2、CREB (cAMP反應元件結合蛋白)激活結構域、E2A激活結構域或NFAT(激活的T細胞的核因子)激活結構域。在某些實施方案中，轉錄激活結構域是Gal4、Gcn4、MLL、Rtg3、Gln3、Oaf1、Pip2、Pdr1、Pdr3、Pho4或Leu3。轉錄激活結構域可以是野生型，或者原始轉錄激活結構域的修飾或截短版本。
在某些實施方案中，融合蛋白的效應結構域是轉錄抑制結構域，如誘導型cAMP早期抑制(ICER)結構域、Kruppel相關框A (KRAB-A)抑制結構域、YY1富含甘氨酸的抑制結構域、Sp1樣阻遏物、E(spI)阻遏物、I.κ.B阻遏物或MeCP2。
在某些實施方案中，融合蛋白的效應結構域是通過修飾組蛋白結構和/或染色體結構來改變基因表達的表觀遺傳修飾結構域，如組蛋白乙醯轉移酶結構域、組蛋白脫乙醯酶結構域、組蛋白甲基轉移酶結構域、組蛋白脫甲基酶結構域、DNA甲基轉移酶結構域或DNA脫甲基酶結構域。
在某些實施方案中，Cas蛋白還包含至少一個附加結構域，如核定位信號(NLS)、細胞穿透或易位結構域和標記物結構域(例如，熒光蛋白標記物)。
Cas蛋白可以作為(i)Cas蛋白，或(ii)編碼Cas蛋白的mRNA，或(iii)編碼該蛋白的線性或環狀DNA而引入T細胞。Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的構建體可以在組合物中純化或未純化。將蛋白質或核酸構建體引入宿主細胞的方法是本領域公知的，並且適用於本文所述的需要將Cas蛋白或其構建體引入T細胞的所有方法。在某些實施方案中，Cas蛋白作為蛋白質被遞送到T細胞中。在某些實施方案中，Cas蛋白由宿主T細胞中的mRNA或DNA組成型表達。在某些實施方案中，來自mRNA或DNA的Cas蛋白的表達在宿主T細胞中可誘導或誘導。在某些實施方案中，可以使用本領域已知的重組技術將Cas蛋白以Cas蛋白:sgRNA複合物的形式引入宿主T細胞。引入Cas蛋白或其構建體的示例性方法描述於，例如WO2014144761WO2014144592和WO2013176772，其通過引用整體並入本文。
在一些實施方案中，所述方法使用CRISPR/Cas9系統。Cas9是來自微生物II型CRISPR(成簇的規則間隔短回文重複序列)系統的核酸酶，已顯示與單鏈引導RNA (sgRNA)配對時可切割DNA。sgRNA將Cas9引導到靶基因組基因中的互補區域，這可能導致位點特異性雙鏈斷裂(DSB)，可以通過細胞非同源末端連接(NHEJ)機制以容易出錯的方式修複。野生型Cas9主要切割基因組基因座，gRNA序列後跟PAM序列(-NGG)。NHEJ介導的Cas9誘導的DSB的修複，誘導了在切割位點啟動的廣泛突變，這些突變通常是小(＜10bp)插入/缺失(indel)，但可以包括更大(＞100bp)的插入/缺失。
T 細胞文庫
本文所述的T細胞文庫包含多個(例如，至少約2、3、4、5、10、100、1×10 3、1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7、2×10 7、3.5×10 7、1×10 8或更多中任一個) T細胞(例如，細胞毒性T淋巴細胞或“CTL”)，其中多個T細胞中每一個在基因組(例如，人類基因組)中的命中基因處具有突變(例如，失活突變))，並且其中多個T細胞中至少兩個的命中基因彼此不同。在一些實施方案中，所述T細胞文庫還包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。
在一些實施方案中，所述T細胞文庫包含在細胞或生物體中具有至少約2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1,0002,000、5,000、10,000、20,000、50,000個或更多中任一個的命中基因的多個T細胞。在一些實施方案中，生物體是人。在一些實施方案中，所述T細胞文庫包含在約15,000至約50,000個命中基因，如約18,000至約20,000個命中基因，具有突變(例如，失活突變)的多個T細胞。在一些實施方案中，所述T細胞文庫包含至少約2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、1×10 4、2×10 4、5×10 4、1×10 5、2×10 5、1×10 6、5×10 6、1×10 7、1.5×10 7、2×10 7、3.5×10 7、1×10 8、1×10 9、1×10 10個或更多T細胞中的任一個。在一些實施方案中，所述T細胞文庫內的至少兩個T細胞在不同的靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同位點)具有突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，所述T細胞文庫內的每個T細胞在不同的命中基因處具有突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，所述T細胞文庫內的每個T細胞在不同的靶位點(例如，可以在相同的命中基因內，或在不同的命中基因內)具有突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，所述T細胞文庫不包含在相同命中基因處具有突變(例如，失活突變)的T細胞，如在相同命中基因的相同靶位點的失活突變，或在相同的命中基因的不同靶位點的失活突變。在一些實施方案中，所述T細胞文庫不包含在相同靶位點具有突變(例如，失活突變)的T細胞。在一些實施方案中，所述T細胞文庫內的多個(例如，至少約2、3、4、5、10、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、2×10 7或更多)T細胞在相同命中基因處具有突變(例如，失活突變)，如在相同命中基因的相同靶位點的失活突變，或在相同命中基因的不同靶位點的失活突變。在一些實施方案中，所述T細胞文庫包含在基因組的至少約0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%、95%或更多命中基因中含有突變(例如，失活突變)的多個T細胞。在一些實施方案中，所述T細胞文庫包含在基因組中的所有基因處包含突變(例如，失活突變)的多個T細胞(本文也稱為“全基因組T細胞文庫”)，如所有注釋基因人類基因組。在一些實施方案中，對於基因組中的每個注釋基因，或對於每個命中基因，T細胞文庫中存在至少兩個(例如，2、3、4、5或更多，如2個) T細胞，每個T細胞在相同命中基因的不同靶位點中包含突變(例如，失活突變)，例如T細胞A在基因X的靶位點A'中含有突變(例如，失活突變)，並且T細胞B在基因X的靶位點B'中含有突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，所述T細胞文庫是靶向文庫，其包含在信號轉導通路中選定的基因處或與細胞過程相關的突變(例如，失活突變)，如對免疫效應細胞(例如，NK細胞)介導的殺傷的敏感性或抗性、細胞增殖、細胞周期、轉錄的調節、泛素化、細胞凋亡、免疫響應如自身免疫、腫瘤轉移、腫瘤惡性轉化等。在一些實施方案中，所述T細胞文庫用於與特定調節表型相關的全基因組篩選，如對免疫效應細胞(例如，NK細胞)介導的殺傷的敏感性或抗性。在一些實施方案中，所述T細胞文庫用於全基因組篩選以鑒定與特定調節表型相關的至少一種靶基因，如調節T細胞的活性以響應於NK細胞處理的T細胞中的靶基因。在一些實施方案中，所述T細胞文庫是真核T細胞文庫，如哺乳動物T細胞文庫。T細胞文庫涵蓋的示例性靶基因組包括：齧齒動物(小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠)、馴養動物(例如牛、羊、貓、狗、馬或兔)、非人類的基因組靈長類動物(例如猴子)、魚(例如斑馬魚)、非脊椎動物(例如黑腹果蠅和秀麗隱杆線蟲)和人類的基因組。在一些實施方案中，所述T細胞文庫是人T細胞文庫，如人全基因組T細胞文庫。
在一些實施方案中，全基因組T細胞文庫中的多個(例如，約2、3、4、5、10、100、500、1000、2000、5000、10000或更多)T細胞在相同的命中基因上具有突變(例如，失活突變)，這樣的全基因組T細胞文庫也被稱為“對基因組具有X倍覆蓋率”或“對每個基因具有X倍覆蓋率”，其中“X”是在相同命中基因上具有突變(例如，失活突變)的T細胞的數量。例如，包含約19,114個T細胞(每個細胞在不同的命中基因處具有突變，如失活突變)的全基因組T細胞文庫，對人類基因組(約19,114個注釋基因)具有平均約1倍的覆蓋率。包含約1.9×10 7個T細胞的全基因組T細胞文庫，對人類基因組具有平均約1000倍的覆蓋率，即約1000個T細胞在相同命中基因上具有突變(例如，失活突變)。包含約3.56×10 7個T細胞的全基因組T細胞文庫，其中約2000個T細胞在相同的命中基因處具有突變(例如，失活突變)(例如，約1000個T細胞在相同命中基因的第一靶位點具有諸如失活突變的突變，約1000個T細胞在相同命中基因的第二個靶位點具有諸如失活突變的突變；或約2000個T細胞在相同命中基因的相同靶位點具有諸如失活突變的突變)，對人類基因組具有平均約1000倍的覆蓋率。在一些實施方案中，本文所述的T細胞文庫具有平均至少約2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍的基因組(例如人類基因組)的覆蓋率。在一些實施方案中，本文所述的T細胞文庫具有平均至少約1,000倍的人類基因組的覆蓋率。在一些實施方案中，本文所述的全基因組T細胞文庫具有至少約100倍的人類基因組的覆蓋率。在一些實施方案中，Cas9 +sgRNA T細胞文庫對於每種sgRNA具有平均約100倍至約1000倍的覆蓋率。在一些實施方案中，本文所述的Cas9 +sgRNA (或誘變劑誘導的突變) T細胞文庫對每個命中基因具有平均約300倍至約3000倍的覆蓋率。在一些實施方案中，Cas9 +sgRNA iBART細胞文庫對每種sgRNA iBAR具有平均約25倍至約250倍，如約100倍的覆蓋率。在一些實施方案中，Cas9 +sgRNA iBART細胞文庫對於每組sgRNA iBAR具有平均約100倍至約1000倍，如約400倍的覆蓋率。在一些實施方案中，本文所述的Cas9 +sgRNA iBART細胞文庫對於每個命中基因具有平均約300倍至約3000倍(例如，約300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1500、1800、2000、2400或3000倍中任一個），如約300倍的覆蓋率。
命中基因的突變
在一些實施方案中，所述基因組(例如，人類基因組)中的所有注釋基因被選為命中基因。在一些實施方案中，基於被編碼的mRNA或蛋白在T細胞內表達，或被編碼的蛋白在健康T細胞或疾病狀態的T細胞中的T細胞表面表達來進一步選擇命中基因。
在一些實施方案中，命中基因的突變是致病突變或失活突變。本文所述的失活突變可以是導致基因表達(轉錄和/或翻譯)和/或功能完全廢止或消除的任何突變，如插入、缺失(indel)、替換、移碼、染色體重排或其組合。在一些實施方案中，失活突變可以完全消除基因的轉錄、翻譯、翻譯後修飾、與其他分子(例如，蛋白質複合物中的其他分子)的關聯和/或功能(例如，信號轉導或受體激活)。在一些實施方案中，命中基因處的突變是降低(例如，降低至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多中任一個)或影響(例如，破壞)以下中的一項或多項：命中基因轉錄、命中基因翻譯、命中基因mRNA加工、命中基因mRNA穩定性、命中基因mRNA功能，命中基因蛋白質功能、與其他分子(例如，蛋白質複合物中的其他分子)的關聯，以及命中基因翻譯後修飾。命中基因的突變(例如，失活突變)可以在一個或多個調控區內，如命中基因的增強子、啟動子、5’非翻譯區(UTR)、3’UTR、或編碼區(如外顯子或剪接位點)。本文所述的命中基因可以是任何基因組序列，例如蛋白編碼基因、編碼RNA的基因如小RNA (例如，microRNA、piRNA、siRNA、snoRNA、tRNA、rRNA和snRNA)、核糖體RNA、長鏈非編碼RNA (lincRNA)或線粒體基因。已知命中基因與特定表型相關；或未涉及特定表型，如未知與特定表型相關的已知基因，或尚未表征的未知基因。在一些實施方案中，命中基因是不編碼任何東西或尚不知道編碼任何東西的基因組序列。
某些基因的致病性失活突變(功能喪失)可以通過核查已發表的科學文獻中的實驗證據和核查可能被破壞的關鍵區域來確定，包括但不限於：移碼、錯義突變、截短突變、缺失、拷貝數變異、無義突變以及基因的丟失或缺失。致病性或失活突變包括但不限於：純合缺失、雙等位基因(雙命中)突變、剪接位點突變(例如，第二個或額外的剪接位點突變)、移碼突變和編碼區的無義突變、確認了影響的錯義突變。
在一些實施方案中，所述T細胞文庫通過使初始T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))群經曆(例如，接觸)誘變劑而產生。所述誘變劑可分為三類：物理(如伽馬射線、紫外線輻射)、化學(如甲磺酸乙酯或EMS)和轉座元件(如轉座子、逆轉錄轉座子、T-DNA、逆轉錄病毒)。
在一些實施方案中，所述T細胞文庫是通過對初始T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))群進行基因編輯(例如，全基因組基因編輯)來產生的。任何已知的基因編輯方法均可用於生成本文所述的T細胞文庫，如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活因子樣效應核酸酶(TALEN)和基於CRISPR/Cas的基因編輯或基因組工程化方法。參見，例如，Gaj et al., Trends Biotechnol. 2013; 31(7): 397–405。在一些實施方案中，所述T細胞文庫是通過基於CRISPR/Cas的方法對初始T細胞群進行全基因組基因編輯而產生的。
在一些實施方案中，所述T細胞文庫是通過將初始T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))群與以下物質接觸而產生的：i)本文所述的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫；以及任選地，ii)在允許將sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體和任選的Cas組分引入至初始T細胞群中的條件下，包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的核酸(例如Cas9)的Cas組分。因此，在一些實施方案中，所述T細胞文庫是通過將初始T細胞群與以下物質接觸而產生的：i)包含多個sgRNA構建體的sgRNA文庫，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與基因組的相應命中基因中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中任一個)的引導序列；以及任選地，ii)在允許將sgRNA構建體和任選的Cas組分引入至初始T細胞群中的條件下，包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的核酸的Cas組分。在一些實施方案中，所述T細胞文庫是通過將初始T細胞群與以下物質接觸而產生的：i)包含多組sgRNA iBAR構建體的sgRNA iBAR文庫，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三個或更多個(例如，3、4、5個或更多，例如4個) sgRNA iBAR構建體，其各自包含或編碼sgRNA iBAR，其中三個或更多個sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中三個或更多個sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，並且其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組的相應命中基因中的不同靶位點(例如，不同的命中基因，或相同命中基因內的不同位點)互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)；以及任選地，ii)在允許將sgRNA構建體和任選的Cas組分引入至初始T細胞群中的條件下，包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的核酸的Cas組分。在一些實施方案中，所述條件進一步允許在命中基因處產生突變。在一些實施方案中，每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，並且其中4種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同。在一些實施方案中，將所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫和Cas組分同時引入初始T細胞群中。在一些實施方案中，將所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫和Cas組分依次引入初始T細胞群中。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫和Cas組件通過單獨的載體(例如，慢病毒載體)或單獨的病毒被引入至初始T細胞群中。在一些實施方案中，通過相同載體或相同病毒將sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫和Cas組分引入至初始T細胞群中。在一些實施方案中，通過慢病毒載體或慢病毒將sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫引入至初始T細胞群中，並且將Cas組分作為編碼Cas組分(例如，Cas9)的mRNA引入至初始T細胞群中。在一些實施方案中，初始T細胞群已各自攜帶Cas組分(例如，作為mRNA引入的轉基因Cas9或Cas9；下文也稱為“Cas9 +T細胞”)，然後sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫被引入到每個細胞中，如通過載體(例如，慢病毒載體)或病毒(例如，慢病毒)。
在一些實施方案中，所述T細胞文庫僅包含本文所述的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫，且不包含Cas組件(例如，Cas9)，即，直到進一步引入Cas組件(例如，Cas9)(例如，當引入針對B2M的sgRNA)時在T細胞文庫中sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫靶向的命中基因才失活。包含本文所述的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫的T細胞文庫，在下文中稱為“sgRNA T細胞文庫”或“sgRNA iBART細胞文庫”。在一些實施方案中，所述T細胞文庫包含sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫和Cas組件(例如，Cas9)，即T細胞文庫包含失活的命中基因。在一些實施方案中，T細胞的初始群表達Cas蛋白。在一些實施方案中，所述T細胞文庫通過將表達Cas蛋白的初始T細胞群與本文所述的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫接觸而產生，這將導致T細胞文庫包含失活的命中基因。包含本文所述的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫和Cas9組分(例如，Cas9蛋白或其編碼核酸)的T細胞文庫，在下文中稱為“Cas9 +sgRNA T細胞文庫”或“Cas9 +sgRNA iBART細胞文庫”。在一些實施方案中，初始T細胞群中的T細胞包含B2M突變(例如，通過引入針對B2M的sgRNA和Cas9)，如失活的B2M突變，此類T細胞在本文中也稱為“B2M -T細胞”，由此產生的T細胞文庫被稱為“B2M -T細胞文庫”。在一些實施方案中，初始T細胞群中的T細胞包含針對B2M的sgRNA構建體(例如，針對B2M的sgRNA或其編碼載體)。包含本文所述的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫以及針對B2M的sgRNA的T細胞文庫，在下文中稱為“B2M-sgRNA sgRNA T細胞文庫”或“B2M-sgRNA sgRNA iBART細胞文庫”。包含本文所述的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫、針對B2M的sgRNA和Cas9組分(例如，Cas9蛋白或其編碼核酸)的T細胞文庫，在下文中稱為“Cas9 +B2M -sgRNA T細胞文庫”，或“Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞文庫”，其中B2M和相應的命中基因都已失活。
在一些實施方案中，將至少約50% (如至少約60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多中任一個)的sgRNA文庫中的sgRNA構建體、或sgRNA iBAR文庫中的sgRNA iBAR構建體、或sgRNA iBAR文庫中的sgRNA iBAR構建體組，引入至本文所述的初始T細胞群、或B2M -T細胞文庫、或Cas9 +B2M -T細胞文庫中。在一些實施方案中，至少約95%(例如，至少約96%、97%、98%、99%或更多中任一個)的sgRNA文庫中的sgRNA構建體，或sgRNA iBAR文庫中的sgRNA iBAR構建體，或sgRNA iBAR文庫中的多組sgRNA iBAR構建體，被引入本文所述的初始T細胞群、或B2M -T細胞文庫、或Cas9 +B2M -T細胞文庫。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫的命中基因失活效率為至少約80%，如至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87 %、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多中的任一個。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫的命中基因失活效率為至少約90%。
在一些實施方案中，所述T細胞文庫包含一個或多個(例如，約2、3、4、5、8、10、100、250、400、500、1,000、2,000、5,000、10,000或更多)包含相同sgRNA構建體或相同sgRNA iBAR構建體的T細胞，其靶向相同的命中基因。此類T細胞文庫也稱為“對sgRNA/sgRNA iBAR具有X倍覆蓋率”或“對每種sgRNA/sgRNA iBAR具有X倍覆蓋率”，其中“X”是表達相同sgRNA或sgRNA iBAR的T細胞的數量。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對每種sgRNA或sgRNA iBAR或每組sgRNA iBAR具有平均約1至約10,000倍的覆蓋率，如對每種sgRNA或sgRNA iBAR或每組sgRNA iBAR具有約1至約5,000、約100至約10,000、約1,000至約5,000、約10至約100、約50至約500、約80至約200、約100至約400、約100至約800、約100至約1,000、約1至約1,000、約10至約1,000、或約300至約600倍的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對每種sgRNA或sgRNA iBAR或每組sgRNA iBAR具有平均至少約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、400倍、500倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對每種sgRNA或突變(例如，誘變劑誘導的突變)具有至少約100倍(例如，約400倍)的覆蓋率。在一些實施方案中，每個命中基因被約2至約12個不同sgRNA靶向，或在至少2個(例如，約2至約12個)不同靶位點具有突變。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於每組sgRNA iBAR具有至少約400倍(例如，約800倍)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於每種sgRNA iBAR具有至少約100倍(例如，約200倍)的覆蓋率。
在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於每種sgRNA iBAR具有平均至少約100倍(例如，至少約200-、400-、500-、1,000-、4,000-倍或更多倍中的任一個)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對於每組sgRNA iBAR具有平均至少約400倍(例如，至少約800-、1000-、2000-、4000-、16,000-倍或更多倍中的任一個)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對sgRNA iBAR文庫具有平均至少約100倍(例如，至少約200-、400-、500-、1,000-、4,000-倍或更多倍中的任一個)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對每個命中基因具有平均至少約800倍(例如，至少約1,000-、1,600-、2,000-、2,400、3,200-、4,000-、10,000、16,000-倍或更多倍中的任一個)的覆蓋率。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR文庫靶向基因組中的每個注釋基因(即，sgRNA iBAR文庫是全基因組sgRNA iBAR文庫)。在一些實施方案中，所述T細胞文庫對全基因組sgRNA iBAR文庫具有至少約100倍(例如，至少約400倍、800-或1,200-倍中任一個)的覆蓋率。
B2M 突變
β-2微球蛋白(B2M)是在所有有核細胞上表達的MHC I類分子(α1、α2、α3)的組分。宿主TCRαβ細胞識別MHC I類分子，並區分“自身”和“外來”細胞。NK細胞的活性受各種細胞表面抑制和激活受體的複雜相互作用的調節。抑制性受體包括殺傷性免疫球蛋白樣受體(KIR)和CD94/NKG2A，其識別MHC或HLA I類分子，使NK細胞識別自體細胞，並阻止它們攻擊宿主組織。具有降低或缺失HLA I類表達的細胞(例如，T細胞，如同種異體T細胞)被NK細胞作為“外來物”靶向，導致排斥反應(Liu et al. Curr. Res. Transl. Med.2018; 66: 39–42)。
在一些實施方案中，本文所述的T細胞文庫還包含B2M突變(“B2M -T細胞文庫”)。在一些實施方案中，B2M突變是失活的B2M突變。本文所述的失活B2M突變可以是導致B2M表達(轉錄和/或翻譯)和/或功能完全廢止或消除的任何突變，如插入、缺失(indel)、替換、移碼、染色體重排或其組合。在一些實施方案中，失活B2M突變可以完全消除B2M的轉錄、翻譯、翻譯後修飾、與其他分子(例如MHC I類分子中的其他分子)的結合和/或功能(例如，受體識別或抗原呈遞)。在一些實施方案中，B2M突變是減少(例如減少至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多)或影響(例如，破壞)以下中的一項或多項：B2M轉錄、B2M翻譯、B2M mRNA加工、B2M mRNA穩定性、B2M mRNA功能、B2M蛋白功能、B2M細胞表面表達和B2M翻譯後修飾。在一些實施方案中，B2M突變是減少(例如減少至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多)或影響(例如，破壞)以下中的一項或多項：MHC I類分子細胞表面表達、組裝、功能和/或被NK細胞識別的能力。在一些實施方案中，B2M突變是在B2M的一個或多個調控區，如增強子、啟動子、5’非翻譯區(UTR)、3’UTR或編碼區(如外顯子或剪接位點)中的突變。在一些實施方案中，B2M突變是不在B2M基因或相應調節組分內但影響B2M表達和/或功能的突變，如在影響B2M mRNA剪接、B2M翻譯後修飾等的另一分子(例如，核酸或蛋白質)中的突變。已減少(例如減少至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多中任一個)或消除了B2M表達和/或功能的細胞(例如，T細胞)，在本文中也稱為B2M陰性或缺陷的細胞。在一些實施方案中，所述T細胞文庫包含B2M基因中的一個或多個突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，初始T細胞群中的T細胞包含B2M突變(“B2M -T細胞”)，如失活的B2M突變。此類B2M -T細胞進一步用於構建本文所述的T細胞文庫。在一些實施方案中，在獲得本文所述的T細胞文庫如Cas9 +sgRNA/sgRNA iBART細胞文庫，或sgRNA/sgRNA iBART細胞文庫之後，引入B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)由誘變劑產生，例如物理誘變劑(例如，γ射線、紫外線輻射)、化學誘變劑(例如，甲磺酸乙酯或EMS)，或轉座元件(如轉座子、反轉錄轉座子、T-DNA、逆轉錄病毒)。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過B2M基因編輯產生的。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過影響B2M表達和/或功能的非B2M基因的基因編輯產生的。任何已知的基因編輯方法均可用於生成本文所述的B2M -T細胞文庫，如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活因子樣效應核酸酶(TALEN)和基於CRISPR/Cas的方法。在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過對初始T細胞群或本文所述的T細胞文庫進行基於CRISPR/Cas的基因編輯而產生的。因此，在一些實施方案中，B2M突變(例如，失活的B2M突變)是通過使初始T細胞群或本文所述的T細胞文庫(例如，Cas9 +sgRNA/sgRNA iBART細胞文庫，或sgRNA/sgRNA iBART細胞文庫)與以下物質接觸來產生的：i)一個或多個B2M sgRNA構建體，其中每個B2M sgRNA構建體包含或編碼包含與B2M基因中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列的B2M sgRNA (本文中也稱為“針對B2M的sgRNA”，或“靶向B2M的sgRNA”)；以及任選地，ii)在允許將一種或多種B2M sgRNA構建體和任選的Cas組分引入初始T細胞群或T細胞文庫的條件下，包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的核酸(例如Cas9)的Cas組分。在一些實施方案中，所述T細胞文庫中的B2M突變(例如，失活的B2M突變)是用一個B2M sgRNA構建體產生的。在一些實施方案中，所述T細胞文庫中的B2M突變(例如，失活的B2M突變)是用兩個B2M sgRNA構建體產生的，每個構建體包含或編碼含有與B2M基因中的不同靶位點互補的引導序列的B2M sgRNA。在一些實施方案中，B2M sgRNA構建體包含B2M sgRNA。在一些實施方案中，B2M sgRNA構建體編碼B2M sgRNA。在一些實施方案中，B2M sgRNA構建體是編碼B2M sgRNA的質粒。在一些實施方案中，B2M sgRNA構建體是編碼B2M sgRNA的病毒載體(例如，慢病毒載體)。在一些實施方案中，B2M sgRNA構建體是編碼B2M sgRNA的病毒(例如，慢病毒)。
在一些實施方案中，本文所述的T細胞文庫通過如下產生的：i)在允許將sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建引入到初始T細胞群(“sgRNA T細胞文庫”或“sgRNA iBART細胞文庫”)的條件下使初始T細胞群與本文所述的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫(例如通過慢病毒)接觸；ii)在允許將B2M sgRNA構建體和Cas組分引入包含sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫的T細胞的條件下(例如，通過電轉化)使包含sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫的T細胞與本文所述的B2M sgRNA構建體(例如，B2M sgRNA)和包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的核酸(例如，Cas9 mRNA)的Cas組分接觸，從而產生Cas9 +B2M -sgRNA T細胞文庫或Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞文庫，其中B2M和相應的命中基因都已被失活。
B2M sgRNA構建體中的引導序列可根據本領域任何已知方法設計。引導序列可以靶向編碼區，如外顯子或剪接位點、B2M的5’UTR或3’UTR。例如，B2M的閱讀框可能會由DSB在B2M引導RNA的靶位點介導的插入缺失破壞。或者，可以使用靶向B2M編碼序列5’端的引導RNA來高效地產生B2M敲除。引導序列可以根據某些序列特征進行設計和優化，以實現高的在靶基因編輯活性和低的脫靶效應。例如，引導序列的GC含量可以在約20%至約70%的範圍，並且可以避免包含均聚物片段(例如，TTTT、GGGG)的序列。
在一些實施方案中，將至少約50%(如至少約60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多中任一個)的B2M sgRNA構建體(例如，針對B2M的sgRNA)和/或Cas組分(例如，Cas9 mRNA)引入至初始T細胞群，或本文所述的Cas9 +sgRNA/sgRNA iBART細胞文庫，或本文所述的sgRNA/sgRNA iBART細胞文庫。在一些實施方案中，至少約90% (如至少約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多中任一個)的B2M sgRNA構建體(例如，針對B2M的sgRNA)和/或Cas組分(例如，Cas9 mRNA)被引入本文所述的sgRNA/sgRNA iBART細胞文庫。在一些實施方案中，B2M失活效率(例如，通過B2M基因編輯，如通過具有B2M sgRNA和Cas組分如Cas9的CRISPR/Cas)為至少約80%，如至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多中的任一個。在一些實施方案中，B2M失活效率為至少約90%。
T 細胞及制備方法
在一些實施方案中，提供了包含T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))的組合物，所述T細胞包含本文所述的sgRNA或sgRNA iBAR構建體、分子、組或文庫中的任一個。在一些實施方案中，T細胞還包含本文所述的B2M構建體，或一個或多個B2M突變(例如，失活的B2M突變)。
在一些實施方案中，提供了一種在T細胞中編輯基因組基因座的方法，包括向宿主T細胞(例如，原代T細胞，或包含B2M突變如失活B2M突變的T細胞)中引入包含靶向基因組基因座(例如，命中基因的靶位點)的引導序列和編碼重複:反-重複雙鏈體和四環的引導發夾序列的引導RNA構建體，其中iBAR被嵌入四環中作為內部複制，表達靶向宿主T細胞中基因組基因座的引導RNA，從而在Cas核酸酶(例如，Cas9)存在下編輯靶向的基因組基因座(例如，命中基因)。在一些實施方案中，所述方法還包括將B2M sgRNA構建體引入宿主T細胞或包含引導RNA構建體的T細胞。在一些實施方案中，所述方法還包括將包含Cas蛋白或編碼該Cas蛋白的核酸(例如，作為Cas9 mRNA)的Cas組分引入T細胞。
在一些實施方案中，提供了通過將本文所述的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫中的任一個轉染至多個宿主T細胞(例如，具有或不具有B2M突變如失活的B2M突變的初始T細胞群)制備的T細胞文庫，其中sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體存在於病毒載體(例如，慢病毒載體)或病毒(例如，慢病毒)中。在一些實施方案中，通過將本文所述的B2M sgRNA構建體(例如，mRNA、病毒載體或病毒)進一步轉染至初始T細胞群，或轉染至包含sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫的T細胞文庫而制備T細胞文庫。在一些實施方案中，轉染期間病毒載體或病毒與宿主T細胞(例如，初始T細胞群或T細胞文庫)之間的感染複數(MOI)為至少約1。在一些實施方案中，MOI是至少約1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10或更高中的任一個。在一些實施方案中，MOI為約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5或約10。在一些實施方案中，MOI為約1-10、1-3、3-5、5-10、2-9、3-8、4-6或2-5中的任一個。在一些實施方案中，轉染期間病毒載體或病毒與宿主T細胞(例如，初始T細胞群或T細胞文庫)之間的MOI小於1，如小於約0.8、0.5、0.3或更低中的任一個。在一些實施方案中，MOI為約0.3至約1。在一些實施方案中，病毒sgRNA文庫或病毒sgRNA iBAR文庫以至少約2，如至少約3的MOI與初始T細胞群接觸。在一些實施方案中，B2M sgRNA病毒構建體以至少約2，如至少約3的MOI與初始T細胞群或T細胞文庫接觸。
在一些實施方案中，將促使CRISPR/Cas系統的一種或多種元件表達的一種或多種載體引入宿主T細胞(例如，初始T細胞群或T細胞文庫)，使得CRISPR系統的元件的表達指導在一個或多個命中基因的一個或多個靶位點處與本文所述的sgRNA分子或sgRNA iBAR分子形成CRISPR複合物。在一些實施方案中，所述宿主T細胞(例如，初始T細胞群)已被引入Cas核酸酶(例如，Cas9 mRNA)，或被工程化改造以穩定表達CRISPR/Cas核酸酶。
在一些實施方案中，所述宿主T細胞(例如，初始T細胞群)是T細胞系，如預先建立的T細胞系。宿主T細胞和T細胞系可以是人T細胞或T細胞系​​，或者它們可以是非人、哺乳動物T細胞或T細胞系​​。在一些實施方案中，所述宿主T細胞難以在低MOI(例如，低於1、0.5或0.3)下使用病毒載體如慢病毒載體進行轉染。在一些實施方案中，所述宿主T細胞難以在低MOI(例如，低於1、0.5或0.3)下使用CRISPR/Cas系統進行編輯。在一些實施方案中，獲得有限數量的宿主T細胞。在一些實施方案中，所述宿主T細胞獲自個體的血樣。
T細胞的分離培養
在T細胞擴增和遺傳修飾之前，從個體獲得T細胞來源。T細胞可以從多種來源獲得，包括外周血單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在一些實施方案中，可以使用本領域可用的任何數量的T細胞系。在一些實施方案中，T細胞可以使用任何數目的本領域技術人員已知的技術如FICOLL TM分離，從從受試者采集的血液單位獲得。在一些實施方案中，來自個體循環血液的細胞通過單采血技術獲得。單采產品通常包含淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白細胞、紅細胞和血小板。在一些實施方案中，可以洗滌通過單采收集的細胞以去除血漿部分，並將細胞置於合適的緩沖液或培養基中以用於後續處理步驟。在一些實施方案中，細胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌。在一些實施方案中，洗滌溶液缺乏鈣並且可能缺乏鎂或可能缺乏許多(如果不是全部)二價陽離子。在一些實施方案中，在不存在鈣的情況下的初始活化步驟導致放大的活化。如本領域普通技術人員將容易理解的，洗滌步驟可以通過本領域技術人員已知的方法完成，如通過使用半自動“流通”離心機(例如，Cobe 2991細胞處理器，Baxter CytoMate或Haemonetics公司的Cell Saver 5)根據制造商的說明完成。洗滌後，可將細胞重懸於多種生物相容的緩沖液中，如無Ca 2+、無Mg 2+的PBS、PlasmaLyteA或其他含或不含緩沖液的鹽水溶液。或者，可以去除單采樣品中不需要的成分，並將細胞直接重新懸浮在培養基中。
在一些實施方案中，T細胞由臍帶血庫、外周血庫提供，或源自誘導的多能幹細胞(iPSC)、專能(multipotent)和多能幹細胞或人胚胎幹細胞。在一些實施方案中，T細胞源自細胞系。在一些實施方案中，T細胞獲自異種來源，例如來自小鼠、大鼠、非人靈長類動物和豬。在一些實施方案中，T細胞是人類細胞。在一些方面，T細胞是原代細胞，如直接從受試者分離和/或從受試者分離並冷凍的那些。在一些實施方案中，在血液收集之後，將PBMC從供者血液樣品中分離，然後例如使用免疫磁珠法從PBMC中分離T細胞。在一些實施方案中，細胞包括一個或多個T細胞亞群，如完整T細胞群、CD4 +細胞、CD8 +細胞及其亞群，如由以下特性定義的那些：功能、活化狀態、成熟度、分化潛能、擴增、再循環、定位和/或持續能力、抗原特異性、抗原受體類型、特定器官或區室中的存在、標記物或細胞因子分泌特征和/或分化程度。關於待治療的受試者，細胞可以是同種異體的和/或自體的。在某些情況下，T細胞對於一個或多個預期受者是同種異體的。在某些情況下，T細胞適合移植，如不會在受體中誘導GvHD。在一些實施方案中，所述T細胞是同種異體CAR-T細胞。在一些實施方案中，所述T細胞(例如同種異體T細胞)經修飾以表達嵌合受體，如CAR或工程化TCR。在一些實施方案中，對T細胞(例如同種異體T細胞)經修飾以敲除內源性TCR。
在T細胞和/或CD4 +和/或CD8 +T細胞的亞型和亞群中，有初始T (T N)細胞、效應T細胞(T EFF)、記憶T細胞及其亞型，如幹細胞記憶T (TSC M)、中樞記憶T (TC M)、效應記憶T (T EM)或終末分化效應記憶T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞(CTL)、粘膜相關不變性T (MAIT)細胞、天然存在和適應性調節性T (Treg)細胞，輔助性T細胞如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助T細胞、α/β T細胞和δ/γ T細胞。
在一些實施方案中，通過裂解紅細胞並去除單核細胞，例如借助通過PERCOLL TM梯度離心或通過逆流離心淘析，從外周血淋巴細胞中分離T細胞。可以通過陽性或陰性選擇技術進一步分離特定的T細胞亞群，如CD3 +、CD28 +、CD4 +、CD8 +、CD45RA +和CD45RO +T細胞。例如，在一些實施方案中，通過與抗-CD3/抗-CD28(即，3×28)-綴合的珠子，如DYNABEADS®M-450 CD3/CD28T一起溫育足夠的時間來分離T細胞，以陽性選擇所需的T細胞。在一些實施方案中，該時間段是約30分鐘。在進一步的實施方案中，該時間段的範圍是從30分鐘至36小時或更長時間，以及其間的所有值。在另一個實施方案中，該時間段是至少1、2、3、4、5或6小時。在一些實施方案中，該時間段是10-24小時。在一些實施方案中，孵育時間為24小時。為了從白血病患者中分離T細胞，使用更長的孵育時間如24小時，可以增加細胞產量。在與其他細胞類型相比，如從腫瘤組織或免疫受損個體中分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，在T細胞很少的任何情況下，可以用更長的孵育時間來分離T細胞。此外，使用更長的孵育時間可以提高捕獲CD8 +T細胞的效率。因此，通過簡單地縮短或延長允許T細胞與CD3/CD28珠子結合的時間和/或通過增加或減少珠子與T細胞的比率(如本文進一步描述的)，可以對於或針對在培養開始時或該過程中的其他時間點優先選擇T細胞亞群。此外，通過增加或減少珠子或其他表面上抗-CD3和/或抗-CD28抗體的比率，可以對於或針對在培養開始時或在其他所需時間點優先選擇T細胞亞群。技術人員會認識到也可以使用多輪選擇。在一些實施方案中，可能需要執行選擇程序並在激活和擴展過程中使用“未選擇的”細胞。“未選擇”的細胞也可以經曆進一步的多輪選擇。
通過陰性選擇來富集T細胞群，可以使用針對陰性選擇的細胞特有的表面標記物的抗體組合來完成。一種方法是通過負磁性免疫粘附或流式細胞術進行細胞分選和/或選擇，其使用針對存在於陰性選擇的細胞上的細胞表面標記物的單克隆抗體混合物。例如，為了通過陰性選擇富集CD4 +細胞，單克隆抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗體。在某些實施方案中，可能需要富集或陽性選擇通常表達CD4 +、CD25 +、CD62Lhi、GITR +和FoxP3 +的調節性T細胞。或者，在某些實施方案中，T調節細胞被抗-CD25綴合的珠子或其他類似的選擇方法耗盡。
為了通過陽性選擇或陰性選擇分離所需的細胞群，可以改變細胞和表面(例如，諸如珠子的顆粒)的濃度。在某些實施方案中，可能需要顯著減少珠子和細胞混合在一起的體積(即，增加細胞的濃度)，以確保細胞和珠子的最大接觸。例如，在一個實施方案中，使用20億個細胞/mL的濃度。在一個實施方案中，使用10億個細胞/mL的濃度。在進一步的實施方案中，使用大於100百萬個細胞/mL的濃度。在另一個實施方案中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/mL的細胞濃度。在又一個實施方案中，使用75、80、85、90、95或100百萬個細胞/mL的細胞濃度。在進一步的實施方案中，可以使用125或150百萬個細胞/mL的濃度。使用高濃度可提高細胞產量、細胞活化和細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可以更有效地捕獲可能弱表達目標靶抗原的細胞，如CD28陰性T細胞，或來自存在許多腫瘤細胞的樣本(即白血病血液、腫瘤組織等)。這樣的細胞群可能具有治療價值並且需要獲得。例如，使用高濃度細胞可以更有效地選擇通常具有較弱CD28表達的CD8 +T細胞。
在一些實施方案中，可能需要使用較低濃度的細胞。通過顯著稀釋T細胞和表面(諸如珠子的顆粒)的混合物，顆粒和細胞之間的相互作用被最小化。這會選擇表達大量所需抗原的細胞與顆粒結合。例如，CD4 +T細胞表達更高水平的CD28，並且在稀釋濃度下比CD8 +T細胞更有效地被捕獲。在一些實施方案中，所使用的細胞濃度為5×10 6/mL。在一些實施方案中，所使用的濃度可為約1×10 5/mL至1×10 6/mL，以及介於兩者之間的任何值。
在一些實施方案中，細胞可以在旋轉器上以不同的速度在2-10℃、室溫或約37℃下孵育不同的時間長度。
用於刺激的T細胞也可以在洗滌步驟後冷凍。不希望受理論束縛，冷凍和隨後的解凍步驟通過去除細胞群中的粒細胞和一定程度上的單核細胞來提供更均勻的產品。在去除血漿和血小板的洗滌步驟之後，可以將細胞懸浮在冷凍溶液中。雖然許多冷凍溶液和參數是本領域已知的並且在這方面有用，但一種方法涉及使用含有20% DMSO和8%人血清白蛋白的PBS，或含有10%葡聚糖40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5%DMSO的培養基，或含有31.25% Plasmalyte-A、31.25%葡萄糖5%、0.45%NaCl、10%葡聚糖40和5%葡萄糖、20%人血清白蛋白和7.5%DMSO的培養基，或含有例如Hespan和PlasmaLyteA的其他合適的細胞冷凍培養基，然後將細胞以每分鐘1°的速度冷凍至-80 oC，並儲存在液氮儲罐的氣相中。可以使用其他受控冷凍方法，以及立即在-20 oC或液氮中進行非受控冷凍。
在一些實施方案中，冷凍保存的細胞如本文所述被解凍和洗滌，並在活化前在室溫下靜置一小時。
本申請還考慮在可能需要如本文所述的擴增細胞之前的時間段，從受試者收集血液樣品或單采血液產品。因此，可以在任何必要的時間點收集待擴增細胞的來源，分離和冷凍所需細胞如T細胞供以後用於T細胞治療，用於治療任何數量的將受益於T細胞療法的疾病或狀況，例如本文所述的那些。在一個實施方案中，血液樣品或單采血樣取自一般健康的受試者。在某些實施方案中，血液樣品或單采血樣取自處於發展疾病風險但尚未發展疾病的一般健康受試者，並且分離和冷凍目標細胞以備後用。在某些實施方案中，所述T細胞可以被擴增、冷凍並在以後使用。在某些實施方案中，在如本文所述診斷出特定疾病後不久但在任何治療之前，從患者收集樣品。在進一步的實施方案中，在任何數量的相關治療方式之前，從受試者的血液樣品或單采血樣中分離細胞，包括但不限於：采用藥劑治療如那他珠單抗、依法珠單抗、抗病毒劑，化學療法，放射，免疫抑制劑如環孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、黴酚酸酯和FK506，抗體或其他免疫消融劑如CAMPATH、抗-CD3抗體、環磷醯胺、氟達拉濱、環孢菌素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228和輻照。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調神經磷酸酶(環孢菌素和FK506)，或抑制對生長因子誘導的信號轉導很重要的p70S6激酶(雷帕黴素)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。在進一步的實施方案中，為患者分離細胞並冷凍以供以後與下述治療一起(例如，之前、同時或之後)使用：骨髓或幹細胞移植、使用化療劑如氟達拉濱的T細胞消融治療、外部-射束放射治療(XRT)、環磷醯胺或抗體如OKT3或CAMPATH。在另一個實施方案中，在B細胞消融療法如與CD20反應的藥劑如利妥昔單抗之後，細胞在之前被分離並且可以被冷凍以供以後用於治療。
在一些實施方案中，所述T細胞在治療後直接從患者獲得。在這方面，已經觀察到在某些癌症治療後，特別是使用損害免疫系統的藥物進行治療後，在患者通常從治療中恢複期間的治療後不久，獲得的T細胞的質量可能是最佳的或改善了其體外擴增的能力。同樣，在使用本文所述的方法進行離體操作後，這些細胞可能處於增強了植入和體內擴增的優選狀態。因此，在本發明的上下文中考慮在該恢複階段收集血細胞，包括T細胞。此外，在某些實施方案中，動員(例如，用GM-CSF動員)和調理方案可用於在受試者中創造一種條件，其中有利於特定細胞類型的再增殖、再循環、再生和/或擴增，尤其是在治療後的規定時間窗口。
T細胞的激活和擴增
在一些實施方案中，在基因工程之前或與基因工程相關地溫育和/或培養細胞。孵育步驟可以包括培養、培植、刺激、活化和/或繁殖或擴增。在一些實施方案中，組合物或細胞在刺激條件或刺激劑存在下溫育。此類條件包括那些旨在誘導群中細胞增殖、擴增、活化和/或存活以模擬抗原暴露和/或為基因工程准備細胞的條件。條件可以包括一種或多種特定介質、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、試劑例如營養物、氨基酸、抗生素、離子和/或刺激因子如細胞因子、趨化因子、抗原、結合伴侶、融合蛋白、重組可溶性受體和任何其他旨在激活細胞的試劑。
無論是在對T細胞進行遺傳修飾之前還是之後，通常都可以用來激活和擴增T細胞的方法描述於，例如以下專利號的美國專利：6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美國專利申請公開No. 20060121005。
通常，T細胞可以通過如下操作而擴增：與附著有刺激CD3/TCR複合物相關信號的試劑和刺激T細胞表面上的共刺激分子的配體的表面接觸。具體地，可以如本文所述刺激T細胞群，如通過與抗-CD3抗體或其抗原結合片段、或固定在表面上的抗-CD2抗體接觸，或通過與蛋白激酶C接觸活化劑(例如苔蘚抑素)與鈣離子載體結合使用。為了共同刺激T細胞表面的輔助分子，使用結合輔助分子的配體。例如，在適合刺激T細胞增殖的條件下，可以將T細胞群與抗-CD3抗體和抗-CD28抗體接觸。為了刺激CD4 +T細胞或CD8 +T細胞的增殖，需要使用抗-CD3抗體和抗-CD28抗體。可使用的抗-CD28抗體的實例包括9.3、B-T3、XR-CD28 (Diaclone,Besancon,France)，可使用本領域公知的其他方法(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
在一些實施方案中，按如下擴增T細胞：通過將T細胞添加到培養起始組合物飼者細胞，如非分裂外周血單核細胞(PBMC)，(例如，使得所得細胞群包含至少約5、10、20或40個或更多PBMC飼者細胞，用於待擴增的初始群中的每個T淋巴細胞)；並培養該培養物(例如足夠的時間來擴大T細胞的數量)。在一些方面，非分裂飼者細胞可以包括伽馬輻照的PBMC飼者細胞。在一些實施方案中，PBMC用約3000-3600拉德的伽馬射線輻照以防止細胞分裂。在一些方面，飼者細胞在添加T細胞群之前被添加到培養基中。
在一些實施方案中，所述T細胞的主要刺激信號和共刺激信號可以由不同的方案提供。例如，提供每個信號的試劑可以在溶液中或結合到表面。當結合至表面時，藥劑可結合至相同表面(即，以“順式”形式)，或結合至分開的表面(即，以“反式”形式)。或者，一種試劑可以結合到表面上，而另一種試劑在溶液中。在一個實施方案中，提供共刺激信號的藥劑結合到細胞表面，並且提供初級激活信號的藥劑在溶液中或結合到表面。在某些實施方案中，兩種藥劑都可以在溶液中。在另一個實施方案中，試劑可以是可溶形式，然後交聯到表面，如表達Fc受體的細胞或抗體或將與試劑結合的其他結合劑。在這點上，參見例如美國專利申請公開US20040101519和US20060034810的人工抗原呈遞細胞(aAPC)，其被認為用於在本發明中激活和擴增T細胞。
在一些實施方案中，將T細胞與包被藥劑的珠子組合，隨後將珠子和細胞分離，然後培養細胞。在一個替代性實施方案中，在培養之前，包被藥劑的珠子和細胞不分離而是一起培養。在進一步的實施方案中，珠子和細胞首先通過施加力如磁力而濃縮，導致細胞表面標記物的連接增加，從而誘導細胞刺激。
舉例來說，細胞表面蛋白可以通過使抗-CD3和抗-CD28附著於其上的順磁珠(3×28個珠)接觸T細胞來連接。在一個實施方案中，將細胞(例如，10 4至10 9個T細胞)和珠子(例如，DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T順磁珠子)組合在緩沖液中，優選PBS(不含二價陽離子如鈣和鎂)。同樣，本領域普通技術人員可以容易地理解，可以使用任何細胞濃度。例如，靶細胞在樣品中可能非常罕見並且僅占樣品的0.01%，或整個樣品(即100%)可能包括目標靶細胞。因此，任何細胞數量都在本發明的範圍內。在某些實施方案中，可能需要顯著減少顆粒和細胞混合在一起的體積(即，增加細胞的濃度)，以確保細胞和顆粒的最大接觸。例如，在一個實施方案中，使用約20億個細胞/mL的濃度。在另一個實施方案中，使用大於100百萬個細胞/mL。在另一個實施方案中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或500百萬個細胞/mL的細胞濃度。在又一個實施方案中，使用75、80、85、90、95或100百萬個細胞/mL的細胞濃度。在進一步的實施方案中，可以使用125或150百萬個細胞/mL的濃度。使用高濃度可提高細胞產量、細胞活化和細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可以更有效地捕獲可能弱表達目標抗原的細胞，如CD28陰性T細胞。這樣的細胞群可能具有治療價值，並且在某些實施方案中需要獲得。例如，使用高濃度細胞可以更有效地選擇通常具有較弱CD28表達的CD8 +T細胞。在一些實施方案中，將約30百萬個培養的T細胞用於活化和擴增。
在一些實施方案中，可將混合物培養數小時(約3小時)至約14天或兩者之間的任何小時整數值。在另一個實施方案中，混合物可以培養21天。在本發明的一種實施方案中，珠子和T細胞一起培養約8天。在另一個實施方案中，珠子和T細胞一起培養2-3天。也可能需要幾個刺激周期，使得T細胞的培養時間可以是60天或更長時間。適合T細胞培養的條件包括適當的培養基(例如，最低基礎培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15 (Lonza))，其中可能含有增殖和活力所需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清))、白細胞介素-2 (IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或任何其他技術人員已知的用於細胞生長的添加劑。用於細胞生長的其他添加劑包括但不限於：表面活性劑、代用血漿和還原劑如N-乙醯半胱氨酸和2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20，優選添加氨基酸、丙酮酸鈉和維生素，無血清或補充適量的血清(或血漿)或一組確定的激素，和/或足以使T細胞生長和擴增的細胞因子。抗生素，例如青黴素和鏈黴素，僅包含在實驗培養物中，而不包含在要注入受試者的細胞培養物中。靶細胞維持在支持生長所需的條件下，例如適當的溫度(例如37 oC)和大氣(例如空氣+5% CO 2)。暴露於不同刺激時間的T細胞可能表現出不同的特征。例如，典型的血液或單采外周血單核細胞產品的輔助T細胞群(TH、CD4 +)大於細胞毒性或抑制性T細胞群(TC、CD8)。通過刺激CD3和CD28受體對T細胞進行體外擴增，在約第8-9天之前產生主要由TH細胞組成的T細胞群，而在約第8-9天之後，T細胞群包括越來越多的群體TC細胞。因此，根據治療目的，將主要包含TH細胞的T細胞群輸注給受試者可能是有利的。類似地，如果已經分離出抗原特異性TC細胞亞群，則將這個亞群擴大到更大的程度可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8標記物外，其他表型標記也有顯著差異，但在很大程度上，在細胞擴增過程中可重現。因此，這種可重複性使得能夠為特定目的定制活化的T細胞產品。
在一些實施方案中，所述方法包括評估一種或多種標記物在修飾細胞或待工程化改造細胞表面上的表達。在一個實施方案中，所述方法包括評估TCR或CD3ε的表面表達，例如通過基於親和力的檢測方法，如流式細胞術。在一些方面，當該方法揭示抗原或其他標記物的表面表達時，例如使用本文所述的方法破壞編碼抗原或其他標記物的基因或以其他方式抑制表達。
經修飾的T細胞的分離和富集
在一些實施方案中，本文所述的方法還包括分離或富集包含命中基因中的突變(例如，失活突變)和/或B2M突變如失活B2M突變的T細胞。在一些實施方案中，本文所述的方法還包括分離或富集包含本文所述的Cas組分、sgRNA構建體、sgRNA iBAR構建體和/或B2M sgRNA構建體的T細胞。在一些實施方案中，本文所述的方法還包括從修飾的T細胞中分離或富集CD8 +T細胞。
在一些實施方案中，分離方法包括，基於細胞中是否存在一種或多種特定分子如表面標記物例如表面蛋白、細胞內標記物或核酸(例如sgRNA、sgRNA iBAR、B2M sgRNA和/或編碼Cas的核酸)，分離不同的細胞類型。在一些實施方案中，可以使用基於此類標記物的任何已知的分離方法。在一些實施方案中，分離是基於親和或免疫親和的分離。例如，在一些方面，分離包括基於細胞的表達或一種或多種標記物(通常是細胞表面標記物)的表達水平來分離細胞和細胞群，例如，通過與特異性結合此類標記物的抗體或結合伴侶一起孵育，隨後通常是洗滌步驟，以及將結合抗體或結合伴侶的細胞與未結合抗體或結合伴侶的細胞分離。在一些實施方案中，分離包括基於細胞的可選擇標記基因(例如，抗生素抗性基因如嘌呤黴素，或熒光蛋白編碼基因)的表達來分離細胞和細胞群。此類分離步驟可基於陽性選擇，其中已結合試劑、對抗生素具有抗性或表達熒光蛋白的細胞被保留以供進一步使用；和/或陰性選擇，其中未與抗體或結合伴侶結合或者不表達熒光蛋白的細胞被保留。在一些實例中，保留兩個級分以供進一步使用。在一些方面，當沒有抗體可用於特異性識別異質群中的細胞類型時，陰性選擇可能特別有用，從而最好基於除所需群之外的細胞表達的標記物進行分離。
分離不需要導致的100%富集或去除特定細胞群或表達特定標記物的細胞。例如，特定類型細胞(例如表達標記物的細胞)的陽性選擇或富集是指增加此類細胞的數量或百分比，但不需要導致完全不存在不表達標記物的細胞。同樣，特定類型細胞(例如表達標記物的細胞)的陰性選擇、去除或耗盡是指減少此類細胞的數量或百分比，但不需要導致完全去除所有此類細胞。
在一些實例中，進行多輪分離步驟，其中來自一個步驟的陽性選擇或陰性選擇的級分經曆另一分離步驟，如隨後的陽性選擇或陰性選擇。在一些實例中，單個分離步驟可以同時耗盡表達多種標記物的細胞，如通過將細胞與多種抗體或結合伴侶一起孵育，每個抗體或結合伴侶對靶向用於陰性選擇的標記物具有特異性。同樣，通過將細胞與在各種細胞類型上表達的多種抗體或結合伴侶一起孵育，可以同時陽性選擇多種細胞類型。
例如，在一些方面，T細胞的特定亞群，如陽性或高水平表達一種或多種表面標記物如CD28 +、CD62L +、CCR7 +、CD27 +、CD127 +、CD4 +、CD8 +、CD45RA +的細胞，和/或CD45RO +T細胞，通過陽性或陰性選擇技術分離。在一些實施方案中，分離不表達某些標記物如由一種或多種命中基因編碼的標記物和/或B2M的T細胞。
例如，CD3 +、CD28 +T細胞可以使用CD3/CD28綴合的磁珠(例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)進行陽性選擇。
在一些實施方案中，通過陽性選擇富集特定細胞群或通過陰性選擇耗盡特定細胞群來進行分離。在一些實施方案中，陽性或陰性選擇是通過將細胞與一種或多種抗體或其他結合劑一起溫育來完成的，所述抗體或結合劑特異性結合分別在陽性或陰性選擇的細胞上表達(標記物 +)或以相對較高的水平表達(標記物 高)的一種或多種表面標志物。
在一些方面，待分離的細胞的樣品或組合物與小的、可磁化的或磁響應的材料一起溫育，如磁響應顆粒或微粒如順磁珠(例如Dynabeads或MACS珠)。磁響應材料，例如顆粒，通常直接或間接連接到結合伴侶例如抗體，其特異性結合存在於細胞、多個細胞或細胞群上的分子例如表面標志物，所述細胞正是希望分離的，例如希望陰性或陽性地選擇的細胞。
在一些實施方案中，磁性顆粒或珠子包含與特定結合成員如抗體或其他結合伴侶結合的磁響應材料。有許多眾所周知的磁響應材料用於磁分離方法。合適的磁性顆粒包括在Molday的美國專利US4,452,773和歐洲專利說明書EP452342B中描述的那些，其在此通過引用並入本文。膠體大小的顆粒，如Owen的美國專利US4,795,698中描述的那些，以及Liberti等人的美國專利US5,200,084是其他實例。
溫育通常在這樣的條件下進行，即抗體或結合伴侶，或特異性結合此類抗體或結合伴侶的分子如二抗或其他試劑(所述抗體或結合伴侶附著於磁性顆粒或珠子)，特異性結合如果樣品中的細胞上存在的細胞表面分子。
在一些實施方案中，將樣品置於磁場中，並且附著有磁響應或可磁化顆粒的那些細胞將被吸引到磁體並與未標記的細胞分離。對於陽性選擇，被磁鐵吸引的細胞被保留；對於陰性選擇，未吸引的細胞(未標記的細胞)被保留。在一些方面，在同一選擇步驟期間進行陽性和陰性選擇的組合，其中陽性和陰性級分被保留並進一步處理，或經曆進一步的分離步驟。
在某些實施方案中，磁響應顆粒包被在一抗或其他結合伴侶、二抗、凝集素、酶或鏈黴親和素中。在某些實施方案中，磁性顆粒通過包被對一種或多種標記物具有特異性的一抗而附著到細胞上。在某些實施方案中，細胞而不是珠子用一抗或結合伴侶標記，然後加入細胞類型特異性二抗或其他結合伴侶(例如鏈黴親和素)包被的磁性顆粒。在某些實施方案中，鏈黴親和素包被的磁性顆粒與生物素化的一抗或二抗結合使用。
在一些實施方案中，磁響應顆粒附著在隨後將被溫育、培養和/或工程化改造的細胞上；在一些方面，顆粒附著在細胞上用於施用於患者。在一些實施方案中，可磁化或磁響應顆粒從細胞中移除。從細胞中去除可磁化顆粒的方法是已知的，包括例如使用競爭性未標記抗體、可磁化顆粒或與可切割接頭綴合的抗體等。在一些實施方案中，可磁化顆粒是可生物降解的。
在一些實施方案中，基於親和力的選擇是通過磁激活細胞分選(MACS)(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)。磁性激活細胞分選(MACS)系統能夠高純度選擇附著有磁化顆粒的細胞。在某些實施方案中，MACS以在施加外部磁場之後順序洗脫非靶標物質和靶標物質的模式運行。也就是說，附著在磁化顆粒上的細胞被固定在原位，而未附著的物質被洗脫。然後，在該第一洗脫步驟完成後，被困在磁場中並被阻止被洗脫的物質以某種方式被釋放，使得它們可以被洗脫和回收。在某些實施方案中，非靶細胞被標記並從異質細胞群中去除。
在某些實施方案中，使用系統、裝置或器具進行分離(isolation)或分離(separation)，其執行所述方法的分離(isolation)、細胞制備、分離(separation)、加工、溫育、培養和/或配制步驟中的一個或多個。在一些方面，該系統用於在封閉或無菌環境中執行這些步驟中每一個，例如以最小化誤差、用戶接觸和/或汙染。在一個實例中，該系統是描述於國際專利申請、公開號WO2009/072003或US20110003380中的系統。
在一些實施方案中，該系統或裝置在集成或自包含系統中和/或以自動化或可編程方式執行一個或多個，例如所有的分離、加工、工程化和配制步驟。在一些方面，系統或器具包括與系統或器具通信的計算機和/或計算機程序，其允許用戶對加工、分離、工程化和配方步驟的結果進行編程、控制、評估和/或調整它們的各個方面。
在一些方面，分離和/或其他步驟使用CliniMACS系統(MiltenyiBiotec)進行，例如，用於在封閉和無菌系統中在臨床規模水平上自動分離細胞。組件可包括集成的微型計算機、磁分離單元、蠕動泵和各種夾管閥。在某些方面，集成的計算機控制儀器的所有組件，並指導系統以標准化的順序執行重複的程序。在某些方面，磁分離單元包括可移動的永磁體和用於選擇柱的支架。蠕動泵控制整個管道組的流速，並與夾管閥一起確保緩沖液通過系統的受控流動和細胞的連續懸浮。
在某些方面，CliniMACS系統使用在無菌、無熱原溶液中提供的抗體結合的可磁化顆粒。在一些實施方案中，在用磁性顆粒標記細胞之後，洗滌細胞以去除多餘的顆粒。然後將細胞制備袋連接到管組，管組又連接到裝有緩沖液的袋子和細胞收集袋。管組由預組裝的無菌管組成，包括預柱和分離柱，僅供一次性使用。啟動分離程序後，系統會自動將細胞樣品施加到分離柱上。標記的細胞保留在柱內，而未標記的細胞通過一系列洗滌步驟被去除。在一些實施方案中，用於本文所述方法的細胞群未標記且未保留在柱中。在一些實施方案中，用於本文所述方法的細胞群被標記並保留在柱中。在一些實施方案中，用於本文所述方法的細胞群在去除磁場後從柱中洗脫，並被收集在細胞收集袋內。
在某些實施方案中，分離和/或其他步驟使用CliniMACS Prodigy系統(MiltenyiBiotec)進行。在某些方面，CliniMACS Prodigy系統配備了細胞處理裝置，其允許通過離心自動洗滌和分離細胞。CliniMACS Prodigy系統還可以包括機載攝像頭和圖像識別軟件，通過辨別源細胞產品的宏觀層來確定最佳細胞分級終點。例如，外周血自動分為紅細胞、白細胞和血漿層。CliniMACS Prodigy系統還可以包括集成的細胞培養室，其完成細胞培養方案，如細胞分化和擴增、抗原加載和長期細胞培養。輸入端口可以允許無菌去除和補充培養基，而細胞可以使用集成的顯微鏡進行監測。
在一些實施方案中，通過流式細胞術收集和富集(或耗盡)本文所述的細胞群，其中針對多種細胞表面標記物染色的細胞被攜帶在流體流中。在一些實施方案中，通過制備規模(FACS)-分選來收集和富集(或耗盡)本文所述的細胞群。在某些實施方案中，通過使用微機電系統(MEMS)芯片結合基於FACS的檢測系統來收集和富集(或耗盡)本文所述的細胞群(參見，例如WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip10, 1567-1573; 以及Godin et al. (2008) J Biophoton. 1 (5):355-376)。在這兩種情況下，細胞都可以用多種標記物進行標記，從而允許分離明確定義的高純度的T細胞亞群。
在一些實施方案中，抗體或結合伴侶用一種或多種可檢測標記物標記，以促進陽性和/或陰性選擇的分離。例如，分離可以基於與熒光標記的抗體的結合。在一些實例中，基於抗體或其他對一種或多種細胞表面標記物具有特異性的結合伴侶的結合，在流體流中進行細胞分離，例如通過熒光激活細胞分選(FACS)，包括制備規模(FACS)和/或微機電系統(MEMS)芯片，例如與流式細胞術檢測系統結合。此類方法允許同時基於多個標記進行陽性和陰性選擇。
NK 細胞處理和獲得對 NK 細胞殺傷敏感或具有抗性的 T 細胞
本文所述的方法包括使本文所述的T細胞文庫(例如，Cas9 +B2M -sgRNA T細胞文庫、Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞文庫、Cas9 +sgRNA T細胞文庫或Cas9 +sgRNA iBART細胞文庫)經曆自然殺傷劑(NK)細胞的處理，並從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞。在一些實施方案中，用NK細胞處理T細胞文庫，包括在NK細胞存在下培養T細胞文庫。
在一些實施方案中，用NK細胞處理(下文中也稱為“NK細胞處理步驟”、“NK細胞處理步驟b)”或“步驟b)”)包括：i)初始處理步驟，包括使T細胞文庫與NK細胞接觸(“初始處理步驟”)；ii)任選的第一富集步驟，包括分選經處理細胞的混合物以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第一T細胞亞群(“第一富集步驟”)；iii)任選的第一恢複步驟，包括培養第一T細胞亞群(“第一恢複步驟”)；以及iv)任選的第二處理步驟，包括使第一T細胞亞群與NK細胞接觸(“第二處理步驟”)。在一些實施方案中，用NK細胞處理步驟b)包括單個(例如，初始)處理步驟，包括使T細胞文庫與NK細胞接觸。在一些實施方案中，用NK細胞處理步驟b)包括：i)單個(例如初始)處理步驟，包括使T細胞文庫與NK細胞接觸；以及ii)第一恢複步驟，包括培養經處理細胞的混合物。在一些實施方案中，用NK細胞處理步驟b)包括：i)初始處理步驟，包括使T細胞文庫與NK細胞接觸；ii)第一恢複步驟，包括培養經處理細胞的混合物；以及iii)第二處理步驟，包括將恢複的經處理細胞的混合物與NK細胞接觸。在一些實施方案中，用NK細胞處理步驟b)包括：i)單個(例如初始)處理步驟，包括使T細胞文庫與NK細胞接觸；ii)第一富集步驟，包括分選經處理細胞的混合物以獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；以及iii)第一恢複步驟，包括培養第一T細胞亞群。在一些實施方案中，用NK細胞處理步驟b)包括：i)初始處理步驟，包括使T細胞文庫與NK細胞接觸；ii)第一富集步驟，包括分選經處理細胞的混合物以獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)第一恢複步驟，包括培養第一T細胞亞群；以及iv)第二處理步驟，包括使第一T細胞亞群與NK細胞接觸。
在一些實施方案中，從對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞文庫中獲得T細胞(以下也稱為“T細胞獲得步驟”、“T細胞獲得步驟c)”，或“步驟c)”)包括：i)分選步驟，包括分選從“NK細胞處理步驟b)”獲得的細胞以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第二T細胞亞群(“收獲分類步驟”)；以及ii)任選的第二恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養第二T細胞亞群(“第二恢複步驟”)。在一些實施方案中，所述T細胞獲得步驟c)包括：分選步驟，包括分選從“NK細胞處理步驟b)”獲得的細胞以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第二T細胞亞群。在一些實施方案中，所述T細胞獲得步驟c)包括：i)分選步驟，包括分選從“NK細胞處理步驟b)”獲得的細胞以獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群；以及ii)第二恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養第二T細胞亞群。
在一些實施方案中，NK細胞處理步驟b)和T細胞獲得步驟c)包括：i)初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約72小時；ii)富集步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；iv)第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與NK細胞接觸約96小時；以及v)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。
在一些實施方案中，NK細胞處理步驟b)和T細胞獲得步驟c)包括：i)處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約10天；以及ii)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群。
在一些實施方案中，NK細胞處理步驟b)和T細胞獲得步驟c)包括：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及iii)恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時。
在一些實施方案中，NK細胞處理步驟b)和T細胞獲得步驟c)包括：i)處理步驟，包括以1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時約；ii)富集步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及iv)分選步驟，包括分選B2M陰性(或缺陷)且存活的恢複後的第一T細胞亞群，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。
初始處理步驟
在一些實施方案中，初始處理步驟包括使T細胞文庫與NK細胞接觸(例如，在NK細胞存在下培養T細胞文庫)至少約48小時，如至少約50小時、52小時、54小時、56小時、58小時、60小時、62小時、64小時、66小時、68小時、70小時、72小時、74小時、76小時、78小時、80小時、84小時、96小時、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、14天、16天、18天、20天或更長時間中的任一個。在一些實施方案中，初始處理步驟包括使T細胞文庫與NK細胞接觸至少約48小時。在一些實施方案中，初始處理步驟包括使T細胞文庫與NK細胞接觸至少約72小時。在一些實施方案中，初始處理步驟包括使T細胞文庫與NK細胞接觸至少約5天。在一些實施方案中，初始處理步驟包括使T細胞文庫與NK細胞接觸至少約10天。
在一些實施方案中，初始處理步驟中T細胞文庫中NK細胞與T細胞的比例為約0.1:1至約100:1，如約0.1:1至約1:1、約0.3:1至約1:1、約0.1:1至約0.5:1、約0.5:1至約1:1、約1:1至約5:1、約1:1至約10:1、約5:1至約10:1、約1:1至約50:1、約1:1至約20:1、約10:1至約100:1、約0.1:1至約20:1、約0.5:1至約20:1、約0.1:1至約10:1、或約0.2:1至約2:1中的任一個。在一些實施方案中，初始處理步驟中T細胞文庫中NK細胞與T細胞的比例為約0.5:1。在一些實施方案中，初始處理步驟中T細胞文庫中NK細胞與T細胞的比例為約1:1。
NK細胞接觸時間越長，和/或NK細胞與T細胞的比率越高，處理條件就越苛刻。
第一富集步驟
在一些實施方案中，所述方法包括在初始處理步驟之後的第一富集步驟，包括分選經處理細胞(包括NK細胞和經處理的T細胞文庫)的混合物，以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第一T細胞亞群。在一些實施方案中，第一富集步驟包括分選作為T細胞(或非NK細胞)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群(本文中也稱為作為“第一活的富集”)。在一些實施方案中，第一富集步驟包括分選作為T細胞(或非NK細胞)且死亡的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞的殺傷敏感的第一T細胞亞群(在本文中也稱為作為“第一死的富集”)。
在一些實施方案中，第一富集步驟還包括在分選之前用特異性識別T細胞特異性標記物或NK細胞特異性標記物的抗體對經處理細胞的混合物進行染色，以區分T細胞和NK細胞。例如，在一些實施方案中，第一富集步驟包括用抗-CD3抗體和/或抗-CD56抗體對經處理細胞的混合物進行染色，並分選作為CD3 +和/或CD56 -(即T細胞)的經處理細胞的混合物。
在一些實施方案中，第一富集步驟還包括在分選之前用細胞活力標記物(例如染料)對經處理細胞的混合物進行染色。用於評估細胞活力的方法和試劑是本領域眾所周知的，例如基於熒光或基於比色法(酶促)。例如，基於膜滲透性的檢測，如用DAPI、碘化丙啶(PI)、7-AAD或胺反應性染料染色指示死細胞；而吖啶橙更有效地染色活細胞。羧基熒光素二乙酸酯(CFDA)是一種非熒光、細胞滲透性染料，其可通過僅存在於活細胞中的非特異性細胞內酯酶水解形成熒光分子羧基熒光素。CFDA-SE是CFDA的衍生物，其在活細胞中水解後能更好地保留。四甲基羅丹明乙酯(TMRE)和四甲基羅丹明甲酯(TMRM)定位於健康細胞的線粒體和垂死細胞的細胞質。JC-1是一種常用的電位染料。在健康細胞中，JC-1定位於線粒體，在那裏形成紅色熒光聚集體。在線粒體膜電位消除後，JC-1擴散到整個細胞並作為綠色熒光單體存在。BrdU摻入新合成的DNA指示活細胞。
在一些實施方案中，第一富集步驟還包括在分選之前用碘化丙啶(PI)對經處理細胞的混合物進行染色，其中PI染色指示細胞死亡。因此，在一些實施方案中，第一富集步驟包括分選作為T細胞(例如CD3 +和/或CD56 -)和PI陰性(無PI染色)的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群。在一些實施方案中，第一富集步驟包括分選作為T細胞(例如CD3 +和/或CD56 -)和PI陽性(PI染色指示細胞死亡)的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷敏感第一T細胞亞群。
在一些實施方案中，本文所述的T細胞文庫包含B2M突變(例如，包含B2M sgRNA構建體)，如失活的B2M突變。因此，在一些實施方案中，第一富集步驟包括分選B2M陰性或缺陷型(即T細胞)且存活的(例如PI -)經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群(“第一活的富集”)。在一些實施方案中，第一富集步驟包括分選B2M陰性或缺陷(即，T細胞)且死亡的(例如，PI +)經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第一T細胞亞群(“第一死的富集”)。B2M突變(例如，失活B2M突變)的存在或不存在，可以通過以下方式評估：抗-B2M抗體染色、評估B2M sgRNA構建體(例如sgRNA載體骨架或B2M sgRNA)的存在、評估靶向影響B2M表達和/或功能的另一個基因的sgRNA構建體存在，或檢測B2M突變，如通過PCR或測序(例如，B2M基因座的PCR或測序，或影響B2M表達和/或功能的另一個基因的PCR或測序)。在一些實施方案中，第一富集步驟還包括在分選之前用抗-B2M抗體對經處理細胞的混合物進行染色。因此，在一些實施方案中，第一富集步驟包括用抗-B2M抗體和PI對經處理細胞的混合物進行染色，並對染色的經處理細胞的混合物進行分選，它們是：i)B2M -(或較少的B2M表達)和PI -，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；或ii)B2M -(或較少的B2M表達)和PI +，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第一T細胞亞群。
本文可使用任何細胞分選方法，如FACS、MACS、微流控細胞分選、浮力激活細胞分選(BACS)等。可以在一個分選步驟或單獨的分選步驟中，按細胞類型和活力對經處理細胞的混合物進行分選。例如，可以從經處理細胞的混合物中分選出T細胞(活的和死的)，然後從T細胞的混合物中分選出活的T細胞(或死的T細胞)；或者，可以先從經處理細胞的混合物中分選出活的(或死的)細胞(T細胞和NK細胞的混合物)，然後從T細胞和NK細胞的混合物中分選出活的(或死的) T細胞。
第一恢複步驟
在一些實施方案中，所述方法包括：第一恢複步驟，包括在使T細胞文庫與NK細胞接觸的初始處理步驟之後，培養經處理細胞(NK細胞和經處理T細胞文庫)的混合物。在一些實施方案中，所述方法包括：第一恢複步驟，包括在包含分選經處理細胞的混合物以獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群(即，活的T細胞)的第一富集步驟之後，培養第一T細胞亞群。在一些實施方案中，第一恢複步驟包括培養經處理細胞(NK細胞和處理過的T細胞文庫)的混合物或第一T細胞亞群至少約24小時，如至少約26小時、28小時、30小時、32小時、34小時、36小時、38小時、40小時、48小時、52小時、56小時、60小時、64小時、68小時、72小時、78小時、84小時、96小時、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、14天、16天、18天、20天或更長時間中的任一個。在一些實施方案中，第一恢複步驟包括將經處理細胞(NK細胞和經處理的T細胞文庫)的混合物或第一T細胞亞群培養約48小時。
培養條件適合T細胞生長和/或增殖。在一些實施方案中，培養條件不會在擴增期間將T細胞誘導為特定表型。這種培養條件是本領域公知的。例如，在37°C、5% CO 2培養箱中。還參見Master et al.(“T Cell Media: A Comprehensive Guide to Key Components,” 2018)。在一些實施方案中，培養基是T細胞完全培養基。在一些實施方案中，培養條件與NK細胞處理之前的T細胞文庫的培養條件相同。在一些實施方案中，培養條件適用於過繼性T細胞療法，如CAR-T細胞(例如，同種異體CAR-T細胞)。成功培養的培養基類型可因T細胞的亞組而異。對於T細胞，白介素-2 (IL-2)是一種有效的細胞因子，其可調節增殖和分化為效應和記憶T細胞。可以進一步改進培養條件，以在擴增過程中將T細胞極化為特定的表型。例如，據報道，IL-4、IL-7和IL-15分別對記憶T細胞的誘導、存活或更新至關重要。研究實驗室中最廣泛使用的培養T細胞的培養基是補充有FBS的RPMI1640，而對於過繼細胞治療的T細胞的生物制造，“完整”配方如補充人血清的X-VIVO 15 (Lonza, Inc)和CTS OpTimizer (Thermofisher, Inc)更為常見。在一些實施方案中，培養基進一步補充有用於可選擇標記物的試劑，例如以選擇在增殖期間不丟失轉基因或突變的T細胞。
第二處理步驟
在一些實施方案中，所述方法包括：第二處理步驟，包括在包含使T細胞文庫與NK細胞接觸的初始處理步驟之後(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)，使經處理細胞(NK細胞和經處理的T細胞文庫)的混合物與NK細胞接觸。在一些實施方案中，所述方法包括：第二處理步驟，包括在第一富集步驟之後(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)，將第一T細胞亞群與NK細胞接觸，其中在初始處理步驟中第一T細胞亞群對NK細胞殺傷具有抗性。在一些實施方案中，用NK細胞接觸T細胞，包括在NK細胞存在下培養T細胞。
在一些實施方案中，第二處理步驟包括，在初始處理步驟期間(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)，使經處理細胞(NK細胞和經處理的T細胞文庫)的混合物或對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群與NK細胞接觸至少約48小時，如至少約50小時、52小時、54小時、56小時、58小時、60小時、62小時、64小時、66小時、68小時、70小時、72小時、74小時、76小時、78小時、80小時、84小時、96小時、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、14天、16天、18天、20天或更長時間中的任一個。在一些實施方案中，第二處理步驟包括與初始處理步驟相比，與NK細胞接觸相同或相似(例如，最多約30分鐘左右)量的時間。在一些實施方案中，第二處理步驟包括與初始處理步驟相比，與NK細胞接觸更短的時間，如與初始處理步驟相比約35分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時、5天、6天、7天、8天、9天或10天或更少中的任一個。在一些實施方案中，第二處理步驟包括與初始處理步驟相比，與NK細胞接觸更多的時間，如與初始處理步驟相比約35分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時、5天、6天、7天、8天、9天或10天或更長中時間的任一個。在一些實施方案中，第二處理步驟包括，在初始處理步驟期間(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)，使經處理細胞(NK細胞和經處理的T細胞文庫)的混合物或對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群與NK細胞接觸約96小時。
在一些實施方案中，在第二個NK細胞處理步驟中，NK細胞與在初始處理步驟期間對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群中的T細胞的比例，或NK細胞與恢複步驟後來自第一T細胞亞群的T細胞的比例，為約0.1:1至約100:1，如約0.1:1至約1:1、約0.3:1至約1:1、約0.1:1至約0.5:1，約0.5:1至約1:1、約1:1至約5:1、約1:1至約10:1、約1:1至約50:1、約1:1至約20:1、約10:1至約100:1、約0.1:1至約20:1、約0.5:1至約20:1、約0.1:1至約10:1、約5:1至約10:1、或約0.2:1至約2:1中任一個。在一些實施方案中，第二處理步驟包括以相同的NK細胞與T細胞的比率，接觸經處理細胞(NK細胞和經處理的T細胞文庫)的混合物、在初始處理步驟期間對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群、或來自恢複步驟後的第一T細胞亞群的T細胞。在一些實施方案中，第二處理步驟包括以更高的NK細胞與T細胞的比率，接觸經處理細胞(NK細胞和經處理的T細胞文庫)的混合物、在初始處理步驟期間對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群、或來自恢複步驟後的第一T細胞亞群的T細胞，如與初始處理步驟相比至少更高約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍的NK細胞與T細胞比率中的任一個。在一些實施方案中，第二處理步驟包括以更低的NK細胞與T細胞的比率，接觸經處理細胞(NK細胞和經處理的T細胞文庫)的混合物、在初始處理步驟期間對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群、或來自恢複步驟後的第一T細胞亞群的T細胞，如與初始處理步驟相比至少更低約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍的NK細胞與T細胞比率中的任一個。在一些實施方案中，在第二個NK細胞處理步驟中，NK細胞與在初始處理步驟期間對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群中的T細胞的比例，或NK細胞與恢複步驟後來自第一T細胞亞群的T細胞的比例為約0.3:1。
NK細胞接觸時間越長，和/或NK細胞與T細胞的比例越高，處理條件就越苛刻。
任選的附加恢複步驟
在一些實施方案中，所述方法還包括：附加恢複步驟，包括在第二處理步驟之後培養經處理細胞(NK細胞和經處理的第一T細胞亞群)的混合物。在一些實施方案中，附加恢複步驟具有與第一恢複步驟中相同的培養條件。在一些實施方案中，附加恢複步驟具有與第一恢複步驟中不同的培養條件。在一些實施方案中，附加恢複步驟比第一恢複步驟長，如比第一步恢複更長至少約10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時、5天、6天、7天、8天、9天或10天中的任一個。在一些實施方案中，附加恢複步驟比第一恢複步驟短，如比第一步恢複更短至少約10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時、5天、6天、7天、8天、9天或10天中的任一個。
收獲分選步驟
在一些實施方案中，從T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞(“T細胞獲得步驟c)”)包括：分選步驟，包括分選獲自“NK細胞處理步驟b)”的細胞以獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第二T細胞亞群(“收獲分選步驟”)。
在一些實施方案中，從“NK細胞處理步驟b)”獲得的細胞是在初始處理步驟之後的經處理細胞(NK細胞和經處理的T細胞文庫)的混合物。在一些實施方案中，從“NK細胞處理步驟b)”獲得的細胞是在初始處理步驟之後，以及在包括培養經處理細胞的混合物的第一恢複步驟之後的經處理細胞(NK細胞和處理的T細胞文庫)的混合物。在一些實施方案中，從“NK細胞處理步驟b)”獲得的細胞是在第二處理步驟之後的經處理細胞(NK細胞和經處理的第一T細胞亞群)的混合物。在一些實施方案中，從“NK細胞處理步驟b)”獲得的細胞是在第二處理步驟之後，以及在包括培養經處理細胞的混合物的附加恢複步驟之後的經處理細胞(NK細胞和處理的T細胞文庫)的混合物。對於此類實施方案，收獲分選步驟與上述的第一富集步驟相同或相似。
例如，在一些實施方案中，收獲分選步驟包括分選從“NK細胞處理步驟b)”獲得的作為T細胞(或非NK細胞)且存活的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群(本文中也稱為“收獲活的分選”)。在一些實施方案中，收獲分選步驟包括分選從“NK細胞處理步驟b)”獲得的作為T細胞(或非NK細胞)且死亡的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第二T細胞亞群(本文中也稱為“收獲死的分選”)。
在一些實施方案中，收獲分選步驟還包括在分選之前用特異性識別T細胞特異性標記物或NK細胞特異性標記物的抗體對從“NK細胞處理步驟b)”獲得的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物進行染色，以區分T細胞和NK細胞。例如，在一些實施方案中，收獲分選步驟包括用抗-CD3抗體和/或抗-CD56抗體對從“NK細胞處理步驟b)”獲得的經處理細胞的混合物進行染色，並分選作為CD3 +和/或CD56 -(即T細胞)的經處理細胞的混合物。
在一些實施方案中，收獲分選步驟還包括在分選之前用細胞活力標記物(例如染料)對從“NK細胞處理步驟b)”獲得的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物進行染色。上文“第一富集步驟”小節中描述的任何試劑和/或方法可用於此處。
在一些實施方案中，收獲分選步驟還包括在分選之前用PI對從“NK細胞處理步驟b)”獲得的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物進行染色，其中PI染色指示細胞死亡。因此，在一些實施方案中，收獲分選步驟包括分選從“NK細胞處理步驟b)”獲得的作為T細胞(例如CD3 +和/或CD56 -)和PI陰性(無PI染色)的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群。在一些實施方案中，收獲分選步驟包括分選從“NK細胞處理步驟b)”獲得的作為T細胞(例如，CD3 +和/或CD56 -)和PI陽性(PI染色指示細胞死亡)的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第二T細胞亞群。
在一些實施方案中，本文所述的T細胞文庫包含B2M突變(例如，包含B2M sgRNA構建體)，如失活的B2M突變。因此，在一些實施方案中，收獲分選步驟包括分選從“NK細胞處理步驟b)”獲得的B2M陰性或缺陷型(即T細胞)且存活的(例如PI -)的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群(“收獲活的分選”)。在一些實施方案中，收獲分選步驟包括分選從“NK細胞處理步驟b)”獲得的B2M陰性或缺陷(即，T細胞)且死亡的(例如，PI +)經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第二T細胞亞群(“收獲死的分選”)。B2M突變(例如，失活B2M突變)的存在或不存在，可以通過以下方式評估：抗-B2M抗體染色、評估B2M sgRNA構建體(例如sgRNA載體骨架或B2M sgRNA)的存在、評估靶向影響B2M表達和/或功能的另一個基因的sgRNA構建體存在，或檢測B2M突變，如通過PCR或測序(例如，B2M基因座的PCR或測序，或影響B2M表達和/或功能的另一個基因的PCR或測序)。在一些實施方案中，收獲分選步驟還包括在分選之前用抗-B2M抗體對從“NK細胞處理步驟b)”獲得的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物進行染色。因此，在一些實施方案中，收獲分選步驟包括用抗-B2M抗體和PI對獲自“NK細胞處理步驟b)”的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物進行染色，並對染色的經處理細胞的混合物進行分選，它們是：i)B2M -(或較少的B2M表達)和PI -，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群；或ii)B2M -(或較少的B2M表達)和PI +，從而獲得對NK細胞殺傷敏感的第二T細胞亞群。
可以在一個分選步驟或單獨的分選步驟中，按細胞類型和活力對從“NK細胞處理步驟b)”獲得的處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物進行分選。例如，可以從“NK細胞處理步驟b)”獲得的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物中分選出T細胞(活的和死的)，然後從T細胞的混合物中分選出活的T細胞(或死的T細胞)；或者，可以先從“NK細胞處理步驟b)”獲得的經處理細胞(有或沒有在恢複步驟中進一步培養)的混合物中分選出活的(或死的)細胞(T細胞和NK細胞的混合物)，然後從T細胞和NK細胞的混合物中分選出活的(或死的) T細胞。
第二恢複步驟
在一些實施方案中，所述方法包括收獲分選步驟之後的第二恢複步驟。因此，在一些實施方案中，“T細胞獲得步驟c)”包括：i)分選步驟，包括對從“NK細胞處理步驟b)”獲得的細胞進行分選以獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群；ii)第二恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養第二T細胞亞群。
在一些實施方案中，第二恢複步驟是本文所述方法中唯一的恢複步驟。在一些實施方案中，第二恢複步驟包括培養對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群至少約24小時，如至少約26小時、28小時、30小時、32小時、34小時、36小時、38小時、40小時、48小時、52小時、56小時、60小時、64小時、68小時、72小時、78小時、84小時、96小時、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、14天、16天、18天、20天或更長時間中的任一個。在一些實施方案中，第二恢複步驟包括培養對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群約48小時。
培養條件適合T細胞生長和/或增殖。本文可以使用上文“第一恢複步驟”小節中描述的任何培養條件和/或方法。
在一些實施方案中，第二恢複步驟具有與第一恢複步驟(和/或任選的附加恢複步驟)中相同的培養條件。在一些實施方案中，第二恢複步驟具有與第一恢複步驟(和/或任選的附加恢複步驟)不同的培養條件。在一些實施方案中，第二恢複步驟比第一恢複步驟(和/或任選的附加恢複步驟)時間更長，如比第一恢複步驟(和/或任選的附加恢複步驟)更長至少約10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時、5天、6天、7天、8天、9天或10天中的任一個。在一些實施方案中，第二恢複步驟比第一恢複步驟(和/或任選的附加恢複步驟)時間更短，如比第一恢複步驟(和/或任選的附加恢複步驟)更短至少約10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時、5天、6天、7天、8天、9天或10天中的任一個。
T 細胞收獲步驟
在一些實施方案中，在從收獲分選步驟獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的第二T細胞亞群之後，或在獲得第二T細胞亞群並在第二恢複步驟中培養之後，收獲所獲得的T細胞(活的或死的)。在一些實施方案中，所述T細胞收獲步驟包括將T細胞收集到容器(例如，Falcon管、EP管或離心管)中用於儲存或用於以後的實驗。在一些實施方案中，所述T細胞收獲步驟包括洗滌獲得的T細胞，使得T細胞處於適合儲存(例如，4°C、-20°C或-80°C儲存)或以後實驗的條件(例如，細胞裂解和PCR或測序)。
NK 細胞及制備方法
NK細胞是參與免疫響應的淋巴細胞。它們具有殺傷活體內腫瘤細胞、正在經曆致癌轉化的細胞和其他異常細胞的功能，是先天免疫監視機制的重要組成部分。NK細胞具有通過多種抑制和激活受體區分“外來”或潛在靶細胞和健康“自身”細胞的機制，這些受體與MHC I類分子、MHC I類樣分子和與MHC無關的分子結合(Caliguiri, Blood 2008, 112:461-69)。具有降低或缺失HLA I類表達的細胞(例如，T細胞，如同種異體T細胞)被NK細胞作為“外來物”靶向，導致排斥反應(Liu et al. Curr. Res. Transl. Med.2018;66:39–42)。
NK細胞表達特征性NK細胞表面受體，並且缺乏TCR重排和T細胞、B細胞、單核細胞和/或巨噬細胞表面標記物。NK細胞通過釋放導致靶細胞因細胞凋亡而死亡的蛋白質的小細胞質顆粒(穿孔素和顆粒酶)表現出細胞毒性。殺傷是在依賴於接觸的非吞噬過程中觸發的，該過程不需要預先對抗原致敏。人類NK細胞的特征是存在細胞表面標記物CD16和CD56，但不存在T細胞受體(CD3)。人骨髓來源的NK細胞還以CD2 +CD16 +CD56 +CD3 -表型為特征，且包含T細胞受體ζ (zeta)鏈[ζ (Q-TCR])，通常以NKp46、NKp30或NKp44為特征。抑制性NK細胞受體包括：HLA-E (CD94/NKG2A)；HLA-C (組1或2)、KIR2DL；KIR3DL (HLA-B Bw4)和HLA-A3或A4+肽。激活NK細胞受體包括HLA-E (CD94/NKG2C)；KIR2DS (HLA-C)和KIR3DS (HLA-Bw4)。其他受體包括NK細胞受體蛋白-1 (在小鼠中稱為NK1.1)和IgG的Fc部分的低親和力受體(FcγRIII；CD16)。
NK細胞的分離、培養、誘導、擴增和富集方法是本領域眾所周知的，例如US9,938,498或Magee等人(“Chapter Nine -- Isolation, culture and propagation of natural killer cells,” Natural Killer Cells, Basic Science and Clinical Application, 2010, P125-135)。另見上文“T細胞和制備方法”部分，其方法可適用於NK細胞的制備。例如，具有針對NK細胞特異性標記物的抗體的FACS可用於NK細胞的分離和/或富集。
本發明的NK細胞可源自包含此類細胞的任何來源。NK細胞存在於許多組織中，例如可以從淋巴結、脾、肝、肺、腸、蛻膜中獲得，也可以從iPS細胞或胚胎幹細胞(ESC)中獲得。通常，臍帶血、外周血、動員的外周血和骨髓含有異質淋巴細胞群，用於提供大量NK細胞用於研究和臨床使用。在一些實施方案中，所述方法包括培養源自臍帶血、外周血或骨髓之一的NK細胞群。在一些實施方案中，從包含NK細胞、CD3 -細胞和CD3 +細胞的異質細胞群培養NK細胞。在一個實施方案中，CD3 +部分大於CD3 -NK細胞部分，這是骨髓、臍帶血或外周血的典型特征。在一些實施方案中，針對NK細胞選擇或富集NK細胞群。在一些實施方案中，NK細胞可以從新鮮細胞群增殖，而其他實施方案從儲存的細胞群(如冷凍保存和解凍的細胞)或先前培養的細胞群增殖NK細胞。在一些實施方案中，NK細胞來自細胞系，如NK-92 ®。在一些實施方案中，NK細胞是同質的NK細胞群(即，表達相同的細胞表面標記物)。在一些實施方案中，NK細胞是異質NK細胞群。在一些實施方案中，包含NK細胞的細胞群用於處理本文所述的T細胞文庫。在一些實施方案中，NK細胞是選定的NK細胞群，例如CD56 +CD3 -NK細胞、CD56 +CD16 +CD3 -NK細胞或CD56 +CD16 -CD3 -NK細胞。根據表型選擇NK細胞的方法是本領域眾所周知的，例如免疫檢測或FACS分析。
富集和分離淋巴細胞的方法是本領域眾所周知的，可以根據所需的群選擇合適的方法。例如，在一種方法中，通過去除紅細胞來富集淋巴細胞的源材料。在最簡單的形式中，紅細胞的去除可能涉及未凝固的全血或骨髓的離心。根據密度將紅細胞與淋巴細胞和其他細胞分開。然後可以選擇性地回收富含淋巴細胞的部分。淋巴細胞及其祖細胞也可以通過使用分離介質如可從各種商業來源獲得的標准淋巴細胞分離培養基(LSM)進行離心來富集。或者，可以使用各種基於親和力的程序來富集淋巴細胞/祖細胞。許多抗體介導的親和制備方法是本領域已知的，如抗體綴合的磁珠。淋巴細胞富集也可以使用商業上可用的制劑進行，以陰性選擇不需要的細胞，如FICOLL-HYPAQUE™和其他密度梯度培養基，用於富集完整的淋巴細胞、T細胞或NK細胞。
命中基因鑒定
本文所述的方法包括鑒定從T細胞文庫(例如Cas9 +B2M -sgRNA T細胞文庫、Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞文庫、Cas9 +sgRNA T細胞文庫或Cas9 +sgRNA iBART細胞文庫)獲得的對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞中的命中基因(“命中基因鑒定步驟”)。在一些實施方案中，從T細胞庫(或處理後的T細胞群)獲得的對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞中鑒別的命中基因，被視為其突變分別使T細胞對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的靶基因。
在一些實施方案中，命中基因鑒定步驟包括：i)鑒定在從“T細胞獲得步驟c)” (或處理後的T細胞群)獲得的T細胞中包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列；以及ii)鑒定與包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列對應的命中基因。在一些實施方案中，包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列通過測序鑒定，例如PCR測序(例如Sanger測序)或基因組測序(或DNA-seq，如下一代測序或“NGS”)。例如，在一些實施方案中，通過測序鑒定從T細胞文庫(或處理後的T細胞群)獲得的對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞的序列(核酸片段、PCR片段或​​全基因組)，通過與野生型基因組序列相比，或通過與初始T細胞群的基因組序列相比，可以鑒定包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列並將其劃分為命中基因。在一些實施方案中，命中基因鑒定步驟還包括從“T細胞獲得步驟c)” (或處理後的T細胞群)獲得的T細胞中分離基因組DNA或RNA。在一些實施方案中，命中基因鑒定步驟還包括包含命中基因突變(例如，失活突變)的核酸序列的PCR擴增。
在一些實施方案中，本文所述的T細胞文庫包含針對本文所述的命中基因的sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體。因此在一些實施方案中，命中基因鑒定步驟包括：i)鑒定從“T細胞獲得步驟c)” (或處理後的T細胞群)獲得的T細胞中的sgRNA序列或sgRNA iBAR序列；以及ii)鑒定與sgRNA或sgRNA iBAR的引導序列相對應(靶向)的命中基因。在一些實施方案中，所述sgRNA序列或sgRNA iBAR序列通過RNA測序(RNA-seq)例如RNA NGS鑒定。在一些實施方案中，命中基因鑒定步驟包括：i)鑒定從“T細胞獲得步驟c)” (或處理後的T細胞群)獲得的T細胞中編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸序列；以及ii)鑒定與由核酸序列編碼的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸序列通過測序鑒定，例如PCR測序(例如Sanger測序)或基因組測序(DNA-seq)，例如NGS。在一些實施方案中，iBAR序列可用於鑒定sgRNA iBAR序列或編碼sgRNA iBAR的核酸序列。在一些實施方案中，命中基因鑒定步驟還包括從“T細胞獲得步驟c)” (或處理後的T細胞群)獲得的T細胞中分離基因組DNA或RNA。在一些實施方案中，命中基因鑒定步驟還包括編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸序列的PCR擴增。
DNA-seq、RNA-seq、PCR-測序(例如，Sanger測序)、DNA/RNA提取、cDNA制備和數據分析的方法是本領域眾所周知的，並且可以在本文中適當地用於鑒定在來自T細胞文庫(或處理後的T細胞群)的對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞中的命中基因。可以使用本領域的任何已知方法分析測序數據並將其與基因組比對。
靶基因鑒定
在一些實施方案中，在來自T細胞文庫(或處理後的T細胞群)的對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞中鑒定的命中基因，被認為是T細胞中調節T細胞活性的靶基因。例如，在一些實施方案中，在來自T細胞文庫的對NK細胞殺傷敏感的T細胞(即死的T細胞亞群)中鑒定的命中基因是靶基因，其突變(例如，失活)使得T細胞對NK細胞殺傷敏感。在一些實施方案中，在來自T細胞文庫的對NK細胞的殺傷具有抗性的T細胞(即，活T細胞亞群)中鑒定的命中基因是靶基因，其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性。
在一些實施方案中，在來自T細胞文庫(或處理後的T細胞群)的對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞中鑒定的命中基因與對照進一步比較，和/或用預定閾值水平進一步排序和/或過濾。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：i)在從“T細胞獲得步驟c)”獲得的最終T細胞亞群中獲得包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列；ii)基於序列計數對包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列進行排序；以及iii)鑒定與包含排序高於預定閾值水平的命中基因突變(例如，失活突變)的序列相對應的命中基因。在一些實施方案中，排序步驟包括基於包含對應於相同命中基因的命中基因突變(例如，失活突變) (或相同命中基因的相同靶位點)的所有序列之間的數據一致性，來調整包含命中基因突變(例如，失活突變)的每個序列的排序。例如，數據不一致(如相對於對照的不同方向的倍數變化)將增加包含對應於相同命中基因的命中基因突變(例如，失活突變)的序列的方差，並降低此類命中基因的排序。在一些實施方案中，命中基因被鑒定為對應於包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列，其排序針對基於RRA或α-RRA算法的零假設下的排列序列始終優於預期。在一些實施方案中，預定閾值水平是值“X”的FDR (例如，0.15或0.05)，並且對應於包含FDR≤“X”的命中基因突變(例如，失活突變)的序列的命中基因被確定為靶基因。在一些實施方案中，預定閾值水平是值“X”倍(例如，約2倍)的富集或耗盡，並且對應於包含具有≥“X”倍富集或耗盡的命中基因突變(例如，失活突變)的序列的命中基因被鑒定為靶基因。在一些實施方案中，包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列通過測序鑒定，例如Sanger測序或基因組測序(或DNA-seq，如NGS)。
在一些實施方案中，本文所述的T細胞文庫包含針對本文所述的命中基因的sgRNA構建體或sgRNA iBAR構建體。因此在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：i)在從“T細胞獲得步驟c)”獲得的最終T細胞亞群中獲得sgRNA序列或sgRNA iBAR序列；ii)基於序列計數對sgRNA序列或sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序；以及iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，排序包括基於對應於相同命中基因(或相同命中基因的相同靶位點)的所有引導序列之間的數據一致性，來調整sgRNA序列或sgRNA iBAR序列的每個引導序列的排序。例如，數據不一致(如相對於對照的倍數變化方向不同)會增加與相同命中基因相應的引導序列的方差，降低該命中基因的排序。在一些實施方案中，命中基因被鑒定為對應於引導序列，其排序對於基於RRA或α-RRA算法的在零假設下的排列序列始終優於預期。在一些實施方案中，預定閾值水平是值“X”的FDR(例如，0.15或0.05)，並且對應於具有FDR≤“X”的引導序列的命中基因被鑒定為靶基因。在一些實施方案中，預定閾值水平是值“X”倍(例如，約2倍)的富集或耗盡，並且對應於具有≥“X”倍富集或耗盡的引導序列的命中基因被鑒定為靶基因。在一些實施方案中，所述sgRNA序列或sgRNA iBAR序列通過RNA-seq，例如RNA NGS鑒定。在一些實施方案中，編碼sgRNA或sgRNA iBAR的核酸序列通過基因組測序(DNA-seq)，例如NGS來鑒定。
在一些實施方案中，本文所述的T細胞文庫包含針對本文所述的命中基因的sgRNA iBAR構建體。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：i)在從“T細胞獲得步驟c)”獲得的最終T細胞亞群中獲得sgRNA iBAR序列；ii)基於序列計數對sgRNA iBAR序列的相應引導序列進行排序，其中該排序包括基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每個引導序列的排序；以及iii)鑒定與排序高於預定閾值水平的引導序列對應的命中基因。在一些實施方案中，命中基因被鑒定為對應於引導序列，其排序對於在基於RRA或α-RRA算法的零假設下的排列序列始終優於預期。在一些實施方案中，預定閾值水平是值“X”的FDR(例如，0.15或0.05)，並且對應於具有FDR＜“X”的引導序列的命中基因被鑒定為靶基因。在一些實施方案中，預定閾值水平是至少約2倍的富集或耗盡。
在一些實施方案中，包含命中基因突變(例如，失活突變)或引導RNA的序列的序列計數，由統計分析確定。在一些實施方案中，引導RNA的序列計數和相應的iBAR序列，由統計分析確定。示例性靶基因鑒定工作流程參見圖5。統計方法可用於確定包含在最終T細胞亞群中富集或耗盡的命中基因突變(例如，失活突變)、sgRNA分子或sgRNA iBAR分子的序列的身份。在一些實施方案中，對經NK細胞處理的T細胞文庫進行多於一個(例如，2、3個或更多)生物學或技術複本。在一些實施方案中，對於對照T細胞文庫或對照T​​細胞亞群進行多於一個(例如，2、3個或更多)生物學或技術複本。在一些實施方案中，組合包含來自NK細胞處理組(或對照組)的兩個或更多個(例如，2、3、4個或更多)重複的命中基因突變(例如，失活突變)或引導RNA的序列，以計算NK細胞處理組(或對照組)的重複之間的平均值和方差。示例性統計方法包括但不限於：線性回歸、廣義線性回歸和分層回歸。在一些實施方案中，對序列計數進行歸一化方法，如總計數歸一化或中值比率歸一化。在一些實施方案中，例如，對於陽性篩選，中值比歸一化是優選的。在一些實施方案中，例如，對於遵循正態分布的序列計數，對序列計數進行中值比歸一化，然後是均值-方差建模。在一些實施方案中，將MAGeCK (Li, W. et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol15, 554 (2014))用於對包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列或引導RNA序列的序列進行排序，和/或識別靶基因。在一些實施方案中，將MAGeCK iBAR(Zhu et al., Genome Biol.2019; 20:20)用於對包含命中基因突變(例如，失活突變)或引導RNA序列的序列進行排序，和/或識別靶基因。
在一些實施方案中，基於從步驟c)獲得的來自T細胞文庫的對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)和對照T細胞(或對照T細胞群)中sgRNA (或sgRNA iBAR)或命中基因突變的特征之間的差異，鑒定其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的靶基因。在一些實施方案中，基於從步驟c)獲得的來自T細胞文庫的對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)和對照T細胞(或對照T細胞群)中命中基因突變的特征之間的差異，鑒定靶基因。在一些實施方案中，基於從步驟c)獲得的來自T細胞文庫的對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)和對照T細胞(或對照T細胞群)中sgRNA (或sgRNA iBAR)的特征之間的差異，鑒定靶基因。在一些實施方案中，對照T細胞群獲自在相同條件下培養而未經NK細胞處理的相同T細胞文庫，並且任選地經過步驟c)中的相同獲得方法。在一些實施方案中，從步驟c)獲得的來自T細胞文庫的對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)和對照T細胞(或對照T細胞群)中sgRNA (或sgRNA iBAR)或命中基因突變的特征，通過下一代測序(NGS)進行鑒定，如DNA-seq或RNA-seq。在一些實施方案中，sgRNA (或sgRNA iBAR)的特征包括sgRNA (或sgRNA iBAR)的序列計數，或sgRNA (或sgRNA iBAR)的相應引導序列的序列計數。在一些實施方案中，sgRNA (或sgRNA iBAR)的特征包括編碼sgRNA (或sgRNA iBAR)的核酸的序列計數，或編碼相應sgRNA (或sgRNA iBAR)的引導序列的核酸的序列計數。在一些實施方案中，命中基因突變的特征包括包含命中基因突變的序列的序列計數。在一些實施方案中，本文所述的方法還包括在相同條件下培養相同的T細胞文庫而不進行NK細胞處理，並且任選地進行步驟c)中相同的獲得方法。
在一些實施方案中，將從“T細胞獲得步驟c)”獲得的最終T細胞亞群(或處理後的T細胞群)獲得的序列計數(sgRNA或sgRNA iBAR或其引導序列的序列計數，編碼sgRNA或sgRNA iBAR或其引導序列的核酸序列的序列計數，或包含命中基因突變的序列的序列計數)與從對照T細胞亞群或對照T細胞文庫獲得的相應序列計數進行比較，例如，以提供倍數變化(例如，實際倍數變化，或倍數變化的導出數，如log2或log10倍數變化)，用於顯著性測試(例如，FDR，p-值)，用於分布統計，和/或通過評分和/或推導提供基因或序列排序。在一些實施方案中，對照T細胞亞群(或對照T細胞群)獲自在相同條件下培養而沒有經曆NK細胞處理的相同T細胞文庫，例如從測試開始到最終樣品收獲，在與測試組相同的培養條件下持續培養相同的時間量(用NK細胞處理) (參見圖2)。在一些實施方案中，對照T細胞亞群為在相同條件下培養的完整T細胞文庫，其未經曆NK細胞處理，也未經曆“T細胞獲取步驟c)”中的任何選擇或獲取方法，以下也稱為“對照T細胞文庫”。在一些實施方案中，對照T細胞亞群是從在相同條件下培養的相同T細胞文庫中獲得，其未經曆NK細胞處理，並采用與“T細胞獲取步驟c)”中相同的獲取方法。
在一些實施方案中，本文所述的方法還包括在相同條件下培養相同的T細胞文庫而不進行NK細胞處理，並且任選地進行步驟c)中相同的獲得方法以獲得對照T細胞群。在一些實施方案中，所述方法還包括從對照T細胞群或對照T細胞文庫鑒定包含命中基因突變(例如，失活突變)或sgRNA或sgRNA iBAR的引導序列的序列。在一些實施方案中，鑒定與來自對照T細胞群或對照T細胞文庫的包含命中基因突變(例如，失活突變)或sgRNA或sgRNA iBAR的引導序列的序列相對應的命中基因不存在，而鑒定在從步驟c)獲得的對NK細胞的殺傷敏感或具有抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)中存在，則將該命中基因鑒定為靶基因。在一些實施方案中，鑒定與來自對照T細胞群或對照T細胞文庫的包含命中基因突變(例如，失活突變)或sgRNA或sgRNA iBAR的引導序列的序列相對應的命中基因存在，而鑒定在從步驟c)獲得的對NK細胞的殺傷敏感或抗性的T細胞(或處理後的T細胞群)中不存在，則將該命中基因鑒定為靶基因。例如，對於在單獨的T細胞中包含突變A、B和C的T細胞文庫，如果從處理後的T細胞群(例如，存活的)中僅鑒定出突變A，而在該處理後的T細胞群(例如，存活的)鑒定出突變B和C不存在，則表明命中基因B和C是靶基因，例如，在突變時賦予對NK細胞殺傷的敏感性。又例如，如果從處理後的T細胞群(例如，死亡的)中僅鑒定出突變A，而在該處理後的T細胞群(例如，死亡的)中鑒定出突變B和C不存在，則表明命中基因B和C是靶基因，例如，在突變時賦予對NK細胞殺傷的抗性。
在一些實施方案中，獲得的處理後的T細胞群是對NK細胞殺傷具有抗性的活的T細胞。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：將從處理後的T細胞群獲得的sgRNA (或sgRNA iBAR或其引導序列，或編碼sgRNA或sgRNA iBAR或其引導序列的核酸)的序列計數與從對照T細胞群獲得的sgRNA (或sgRNA iBAR或引導序列，或編碼sgRNA或sgRNA iBAR或其引導序列的核酸)的序列計數進行比較，其中：i)在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15(例如，FDR≤0.1、0.05、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應的sgRNA (或sgRNA iBAR)引導序列被鑒定為與對照T細胞群相比在處理後的T細胞群(例如，存活的、對NK細胞殺傷具有抗性)中富集(和/或具有至少約2倍富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍富集中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；和/或ii)在FDR≤0.01 (例如，FDR≤0.009、0.007、0.005、0.001、0.0005或更小中的任一個)的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應的sgRNA (或sgRNA iBAR)引導序列被鑒定為與對照T細胞群相比在處理後的T細胞群(例如，存活的、對NK細胞殺傷具有抗性)中耗盡(和/或具有至少約2倍耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍耗盡中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因。在一些實施方案中，將sgRNA (或sgRNA iBAR或其引導序列，或編碼sgRNA或sgRNA iBAR或其引導序列的核酸)的序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：將從處理後的T細胞群獲得的命中基因突變的序列計數與從對照T細胞群獲得的命中基因突變的序列計數進行比較，其中：i)在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15(例如，FDR≤0.1、0.05、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應的命中基因突變序列被鑒定為與對照T細胞群相比在處理後的T細胞群(例如，存活的、對NK細胞殺傷具有抗性)中富集(和/或具有至少約2倍富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍富集中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；和/或ii)在FDR≤0.01 (例如，FDR≤0.009、0.007、0.005、0.001、0.0005或更小中的任一個)的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應的命中基因突變序列被鑒定為與對照T細胞群相比在處理後的T細胞群(例如，存活的、對NK細胞殺傷具有抗性)中耗盡(和/或具有至少約2倍耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍耗盡中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因。在一些實施方案中，將命中基因突變的序列計數進行中值比歸一化，然後是均值-方差建模。
在一些實施方案中，獲得的處理後的T細胞群是對NK細胞殺傷敏感的死的T細胞。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：將從處理後的T細胞群獲得的sgRNA (或sgRNA iBAR或其引導序列，或編碼sgRNA或sgRNA iBAR或其引導序列的核酸)的序列計數與從對照T細胞群獲得的sgRNA (或sgRNA iBAR或引導序列，或編碼sgRNA或sgRNA iBAR或其引導序列的核酸)的序列計數進行比較，其中：i)在FDR≤0.01 (例如，FDR≤0.009、0.007、0.005、0.001、0.0005或更小中的任一個)的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應的sgRNA (或sgRNA iBAR)引導序列被鑒定為與對照T細胞群相比在處理後的T細胞群(例如，死亡的、對NK細胞殺傷敏感)中富集(和/或具有至少約2倍富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍富集中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；和/或ii)在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15(例如，FDR≤0.1、0.05、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應的sgRNA (或sgRNA iBAR)引導序列被鑒定為與對照T細胞群相比在處理後的T細胞群(例如，死亡的、對NK細胞殺傷敏感)中耗盡(和/或具有至少約2倍耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍耗盡中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因。在一些實施方案中，將sgRNA (或sgRNA iBAR或其引導序列，或編碼sgRNA或sgRNA iBAR或其引導序列的核酸)的序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：將從處理後的T細胞群獲得的命中基因突變的序列計數與從對照T細胞群獲得的命中基因突變的序列計數進行比較，其中：i)在FDR≤0.01 (例如，FDR≤0.009、0.007、0.005、0.001、0.0005或更小中的任一個)的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應的命中基因突變序列被鑒定為與對照T細胞群相比在處理後的T細胞群(例如，死亡的、對NK細胞殺傷敏感)中富集(和/或具有至少約2倍富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍富集中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；和/或ii)在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.15 (例如，FDR≤0.1、0.05、0.01、0.001或更小中的任一個)的至少兩個單獨的不同NK細胞處理中，其相應的命中基因突變序列被鑒定為與對照T細胞群相比在處理後的T細胞群(例如，死亡的、對NK細胞殺傷敏感)中耗盡(和/或具有至少約2倍耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍耗盡中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因。在一些實施方案中，將命中基因突變的序列計數進行中值比歸一化，然後進行均值-方差建模。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫是sgRNA iBAR文庫。在一些實施方案中，基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，調整每個引導序列的方差。在一些實施方案中，基於相同基因之間的數據一致性，調整每個引導序列或包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列的方差。如本文所用，“數據一致性”是指篩選實驗中與不同iBAR序列對應的相同引導序列的測序結果(例如序列計數、歸一化序列計數、排序或倍數變化)的一致性；或不同命中基因突變例如失活突變(例如，在相同命中基因的不同靶點)或與相同基因對應的不同sgRNA序列的測序結果的一致性。理論上，篩選的真正命中應該具有生物學相關的性能相似性，如與具有相同引導序列但不同iBAR的sgRNA iBAR構建體對應的相似歸一化序列計數、排序和/或倍數變化；和/或與相同基因但不同命中基因突變序列如失活突變序列(例如，在命中基因的不同靶位點)或不同sgRNA序列對應的相似歸一化序列計數、排序和/或倍數變化。關於如何進行均值-方差建模，以及如何基於在與引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性調整每個引導序列的方差，還參見WO2020125762。
在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化的方向，確定在與每個引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上(例如，增加對減少、增加對不變、或減少對不變，都被認為是不同的方向)，則所述引導序列的方差增加。在一些實施方案中，不同命中基因突變(如失活突變)序列或與相同基因對應的不同sgRNA序列之間的數據一致性，是根據每個命中基因突變(如失活突變)序列或每個sgRNA序列的倍數變化方向確定的，其中如果不同命中基因突變(例如，失活突變)序列或不同sgRNA序列的倍數變化相對於彼此在不同方向上，則命中基因突變(例如，失活突變)序列或引導序列的方差的增加。這種數據不一致導致的方差增加，有助於排除高MOI下陽性篩選中罕見但顯著變化的命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA/sgRNA iBAR序列。例如，對於iBAR系統，由於文庫構建過程中的高MOI，可能會出現假陽性sgRNA的“搭便車”，這些假陽性sgRNA與針對真陽性命中基因的sgRNA相關。本文所述的“搭便車”是指靶向不相關序列(例如，不相關命中基因)的sgRNA，所述不相關序列與靶向真陽性命中基因以進入相同T細胞的sgRNA是錯誤關聯的。在一些實施方案中，所述sgRNA iBAR的方差基於一組sgRNA iBAR構建體中每個引導序列的不同iBAR的富集方向進行修正。如果一組sgRNA iBAR構建體的所有iBAR (即，對應於相同引導序列的所有iBAR)呈現相同的倍數變化方向，即都大於或小於對照組的，則該組sgRNA iBAR構建體的方差(或引導序列的方差)將保持不變。如果一組sgRNA iBAR構建體的iBAR (或對應於同一引導序列的iBAR)顯示相對於對照的倍數變化方向不一致，則相應的引導序列會因增加其方差而被罰分。在一些實施方案中，不一致的sgRNA iBAR的最終調整方差是模型估計的方差(例如，通過均值-方差建模)加上從NK細胞處理的樣品和對照組計算的實驗方差。在一些實施方案中，命中基因包含兩個或更多個(例如，2、3、4、5或更多，如2個)命中基因突變(例如，失活突變)，或命中基因在不同靶位點被兩個或多個(例如，2、3、4、5或更多，如2個)不同的引導序列靶向(例如，兩個或多個不同的sgRNA，或兩組或更多組sgRNA iBAR構建體，每個構建體都包含針對不同靶位點的引導序列)。在一些實施方案中，在與每個引導序列和與相同命中基因對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，都是基於每個iBAR序列的倍數變化方向來確定的，其中如果對應的iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上，則引導序列的方差增加了，如果靶向相同命中基因的兩個或多個(例如，2、3、4、5或更多，如2個)不同的引導序列相對於彼此在不同方向上有倍數變化，則引導序列的方差(或命中基因的方差)進一步增加。例如，對於靶向相同命中基因X的不同靶位點的sgRNA A和sgRNA B，如果sgRNA A和sgRNA B的引導序列與對照相比都富集或耗盡，則每個引導序列或命中基因的方差沒變；如果與對照相比，sgRNA A的引導序列富集，而sgRNAB的引導序列耗盡，則每個引導序列或命中基因的方差增加。在一些實施方案中，基於每個iBAR序列的倍數變化方向來確定對應於相同命中基因的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性，其中如果與相同命中基因對應的iBAR序列的倍數變化相對於彼此在不同的方向上，則靶向相同命中基因的每個引導序列的方差增加了，且靶向相同命中基因的各引導序列的方差(或命中基因的方差)增加。例如，如果2組sgRNA iBAR(每組4種sgRNA iBAR)靶向相同命中基因的2個不同靶位點，如果與對照相比所有8個iBAR序列都被鑒定為富集，則這兩種引導序列的方差保持不變；如果與對照相比某些iBAR序列被鑒定為富集，而另一些被鑒定為未變化或耗盡，則兩種引導序列的方差增加。
在一些實施方案中，其相應靶位點之間的倍數變化顯示在不同方向上的在相同命中基因的不同靶位點處包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列，其相應靶位點之間的倍數變化顯示在不同方向上的靶向相同命中基因的不同靶位點的sgRNA或sgRNA iBAR，或相應iBAR之間的倍數變化顯示在不同方向上的sgRNA，可以通過增加的方差而被罰分，從而導致某些命中基因的得分和排序較低。例如，如果2組sgRNA iBAR(每組4種sgRNA iBAR)靶向相同命中基因的2個不同靶位點，如果與對照相比所有8個iBAR序列都被鑒定為富集，則命中基因具有低方差且因此的排名和/或評分較高(例如，對NK細胞殺傷敏感的基因排名高，具有高的敏感性評分)；如果與對照相比某些iBAR序列被鑒定為富集，而另一些被鑒定為沒有變化或耗盡，則命中基因具有高方差且因此排名和/或評分較低(例如，對NK細胞殺傷具有抗性的基因排名較低，具有低的抗性評分)。
在一組sgRNA iBAR構建體中，可以根據該組中不同iBAR序列的預定閾值數量m的富集方向的一致性來調整引導序列的排序，其中m是1和n之間的整數。例如，如果sgRNA iBAR集的至少m個iBAR序列呈現相同的倍數變化方向，即都大於或小於對照T細胞亞群的倍數變化，則引導序列的排序(或方差)不變。然而，如果超過n-m個不同iBAR序列揭示了不一致的倍數變化方向，那麼sgRNA iBAR集將通過降低其排序(例如，通過增加其方差)而被罰分。在一些實施方案中，可以根據與相同命中基因對應的不同命中基因突變(例如，失活突變)或不同引導序列的預定閾值數m的富集方向的一致性，來調整(或進一步調整)含有命中基因突變(例如，失活突變)的序列或引導序列的排序，其中m是1和n之間的整數。例如，如果與相同命中基因對應的至少m個命中基因突變(例如，失活突變)或m個引導序列呈現相同的倍數變化方向，即都大於或小於對照T細胞亞群的倍數變化，那麼排序(或方差)不變。然而，如果超過n-m個不同的命中基因突變(例如，失活突變)或超過n-m個不同的引導序列顯示倍數變化的方向不一致，那麼包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列或引導序列將通過降低它們的排序(例如，通過增加它們的方差)來罰分。
在一些實施方案中，與對照組進行比較，使用處理組的均值和方差(例如，實驗方差、模型估計方差、或基於數據不一致的修正方差)來計算包含命中基因突變(例如失活突變)的每個序列的P值，或sgRNA或sgRNA iBAR的每個引導序列的P值。
魯棒排序聚合(Robust Rank Aggregation, RRA; Kolde R et al. Bioinformatics. 2012;28:573–580)或改良的RRA (例如，MAGeCK中的α-RRA；Li W et al. Genome Biol.2014;15:554)是本領域可用的統計和排序工具之一，其可以檢測在不相關輸入的零假設下排序始終優於預期的基因，並為每個基因分配顯著性分數，並將排序列表組合成單個排序。它假設所有信息歸一化的排序都來自一個強烈偏向零的分布，並從假設的排序均勻分布中計算出二項式概率來檢測這些分布。並且分配給聚合列表中每個元素的P值用於對基因進行排序並描述它的排序比預期好多少，從而使隨機排序的基因不那麼重要。潛在的概率模型使RRA算法參數自由，並且對異常值、噪聲和誤差具有魯棒性。顯著性分數還提供了一種嚴格的方法來僅將統計相關的基因保留在最終列表中。這些屬性使這種方法在許多設置中都很穩健且引人注目。簡言之，在RRA和α-RRA中，對於對應於命中基因的每個包含命中基因突變(例如，失活突變)的序列、每個sgRNA引導序列、或每個sgRNA iBAR引導序列(以下也稱為“命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列”) (例如，當有兩個sgRNAs靶向同一個命中基因時)，該算法會查看這樣的序列在從T細胞文庫(NK細胞處理的T細胞文庫，或對照T細胞/對照T細胞文庫)中獲得的所有命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列的歸一化排序列表中是如何定位的，並將其與所有命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列隨機打亂(“排列序列”)的基線情況進行比較。因此，為與其命中基因對應的所有命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列分配了P值，顯示它在排序列表中的位置比偶然預期的好多少。該P值用於重新排序與命中基因對應的命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列，並確定它們的顯著性。本領域技術人員可以理解，其他工具也可以用於這種統計和排序。在一些實施方案中，采用RRA或α-RRA來計算每個命中基因的最終得分，以獲得基於每個命中基因的均值和方差(例如，修正方差)的命中基因的排序。
在一些實施方案中，包含命中基因突變(例如，失活突變)、sgRNA引導序列或sgRNA iBAR引導序列(命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列)的序列，基於P值進行排序，所述P值是使用負二項式(NB)分布模型的均值和方差(例如，針對數據不一致調整的修正方差)計算的，用於跨越生物學/實驗複本以及處理組與對照組來估計每個命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列的概率，然後應用RRA或α-RRA算法來鑒定與最高排序(例如，最高α%，如最高5%)的命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR的引導序列對應的陽性選擇或陰性選擇的命中基因。較低的RRA分數對應於更強的命中基因富集。在一些實施方案中，選擇低於閾值(例如，P值＜0.25)的此類排序靠前的命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列的P值，並且相應的命中基因被鑒定為靶基因。在一些實施方案中，選擇低於閾值(例如，FDR≤0.05)的這種排序靠前的命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列的FDR，並將相應的命中基因鑒定為靶基因。在一些實施方案中，當針對相同命中基因設計多個命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列時，排序靠前的命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列中只有一個基因在RRA或α-RRA計算中被考慮。RRA或α-RRA假設如果命中基因針對NK細胞處理對T細胞敏感性/抗性沒有影響，則對應於該命中基因的命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列，在從T細胞文庫中獲得的所有命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列的排序列表中應均勻分布。在一些實施方案中，所有命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列，根據每個組內它們的相對排序和在各組的不同分布，在處理組和對照組之間通過RRA或α-RRA進行排序和比較。通過將命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列的β分布偏斜與一致的零假設模型進行比較，對T細胞文庫覆蓋的所有命中基因的進行排序，並且其相應的命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列排序始終高於預期的命中基因，采用本傑米尼-霍赫伯格(Benjamini-Hochberg)程序通過排列測試和/或可接受的FDR具有統計顯著性(P值)，在RRA或α-RRA中優先處理(較低的RRA分數)。這種RRA或α-RRA分析可以顯著減少或消除由於實驗或采樣中的擾動而導致的假陽性。在一些實施方案中，基於通過中值比歸一化隨後均值-方差建模獲得的相應命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列的排序分數，對命中基因進行排序。在一些實施方案中，考慮到相同命中基因的多個命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列，通過RRA或α-RRA對命中基因進一步排序。
在一些實施方案中，預定的閾值水平是來自從實驗(處理或對照)獲得的所有命中基因突變(例如，失活突變)/sgRNA引導序列/sgRNA iBAR引導序列的排列測試的FDR值。在一些實施方案中，通過考慮特定篩選(例如，涉及響應NK細胞處理的特定途徑)中的最大潛在真實靶基因來確定FDR值。在一些實施方案中，閾值是從T細胞文庫獲得的序列計數(歸一化或未歸一化)的前β%，並且相應的命中基因被鑒定為靶基因。
本領域已知的任何靶鑒別方法均可用於本文。例如，經驗貝葉斯方法(通過似然性鑒別靶標)或基於此的算法，如casTLE (cas9高通量最大似然估計器)，它使用經驗貝葉斯框架來解釋多種可變性來源，包括試劑功效和脫靶對大規模基因組擾動篩選分析的影響，並提供用於排序和閾值截止的casTLE分數(Morgens, D.W. et al. (2016) Nat Biotechnol 34, 634-636)。在一些實施方案中，可以使用來自t檢驗的log2比率差和p值來鑒定靶基因。例如，RIGER (Luo, J. et al. (2009). Cell 137, 835-848)根據shRNA在兩類樣本之間的差異效應對它們進行排序，然後在排序列表的前部鑒別出shRNA靶向的基因，從而確定對類別之間的差異至關重要的基因。LFC和P值可用於排序和閾值截止。在一些實施方案中，二項式分布的概率質量函數(或基於其的算法)可用於靶基因鑒定。例如，STARS (Doench, J.G., et al.(2016) Nat Biotechnol 34, 184-191)，其中STAR分數可用於排序和閾值截止。在一些實施方案中，基於負二項式模型和α-RRA算法可用於靶基因鑒定，如MAGeCK (Li, W. et al. (2014) Genome Biol 15, 554)，並且RRA分數可用於排序和閾值截止。在一些實施方案中，基於β-二項式建模的算法可用於靶基因鑒定，例如CRISPRBetaBinomial (CB 2) (Jeong, H.H. et al. (2019). Genome Res 29, 999-1008)，P值或FDR可以用於排序和閾值截止。在一些實施方案中，如在嚴格陽性篩選期間，sgRNA或sgRNA iBAR原始讀數計數排序、歸一化讀數計數排序和/或處理組和對照組之間的log2倍變化，可用於靶基因鑒定，例如，對應於讀取計數的前X%的命中基因被確定為靶基因。
在一些實施方案中，靶基因鑒定是陽性篩選，即通過鑒定在最終T細胞亞群中富集的命中基因突變(例如，失活突變)序列或引導序列。在一些實施方案中，靶基因鑒定是陰性篩選，即通過鑒定在最終T細胞亞群中耗盡的命中基因突變(例如，失活突變)序列或引導序列。基於序列計數或倍數變化，在最終T細胞亞群中富集的命中基因突變(例如，失活突變)序列或引導序列排序較高；而在基於序列計數或倍數變化，在最終T細胞亞群中耗盡的命中基因突變(例如，失活突變)序列或引導序列排序較低。在一些實施方案中，富集或耗盡與從最終T細胞亞群獲得的總序列計數有關。在一些實施方案中，富集或耗盡與對照T細胞亞群或對照T細胞文庫中的相應序列計數有關，如從未用NK細胞處理的相同T細胞文庫獲得的T細胞亞群。在一些實施方案中，基於RRA或α-RRA算法計算富集或耗盡。
在一些實施方案中，所述方法包括：在步驟b)中用NK細胞對T細胞文庫進行至少兩種(例如，至少3、4、5、6、7、7、8、10或更多種)單獨的不同處理，以及在步驟c)中獲得對每次處理的NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞，用於靶基因鑒定。在一些實施方案中，所述方法包括在從每次處理獲得的來自步驟c)的處理後的T細胞群中鑒定一種或多種命中基因，以及i)獲得從其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的所有處理中鑒定的一種或多種命中基因，從而鑒定在T細胞中其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；或ii)獲得從其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的所有處理中鑒定的一種或多種命中基因，從而鑒定在T細胞中其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因。在一些實施方案中，所述方法包括在從每次處理獲得的步驟c)的處理後的T細胞群中鑒定一種或多種命中基因，以及i)組合從其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的所有處理中鑒定的一種或多種命中基因，從而鑒定在T細胞中其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；或ii)組合從其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的所有處理中鑒定的一種或多種命中基因，從而鑒定在T細胞中其突變使所述T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括：使用NK細胞鑒定從至少兩種(例如，至少3、4、5、6、7、7、8、10或更多種)單獨不同處理獲得的T細胞中的命中基因，其中：i)在FDR≤0.01 (例如，FDR≤0.009、0.007、0.005、0.001、0.0005或更小中的任一個)的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001或更少中任一個)的至少兩次單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞的殺傷具有抗性的最終T細胞亞群中耗盡(和/或具有至少約2倍耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍耗盡中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；ii)在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001或更少中任一個)的至少一次NK細胞處理中，或FDR≤0.15 (例如，FDR≤0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更少中任一個)的至少兩次單獨的不同NK細胞處理中，被鑒定為從對NK細胞的殺傷具有抗性的最終T細胞亞群中富集(和/或具有至少約2倍富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍富集中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；iii)在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001或更少中任一個)的至少一次NK細胞處理中，或FDR≤0.15 (例如，FDR≤0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更少中任一個)的至少兩次單獨的不同NK細胞處理中，被鑒定為從對NK細胞的殺傷敏感的最終T細胞亞群中耗盡(和/或具有至少約2倍耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍耗盡中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因；和/或iv)在FDR≤0.01 (例如，FDR≤0.009、0.007、0.005、0.001、0.0005或更小中的任一個)的至少一個NK細胞處理中，或在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001或更少中任一個)的至少兩次單獨的不同NK細胞處理中被鑒定為從對NK細胞的殺傷敏感的最終T細胞亞群中富集(和/或具有至少約2倍富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍富集中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變(例如，失活)使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因。
在一些實施方案中，本文所述的方法包括使T細胞文庫經曆用於靶基因鑒定的4個單獨試驗中至少兩個：(I)試驗I：i)初始處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸持續約72小時；ii)富集步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性或缺陷型，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；iv)第二處理步驟，包括以約0.3:1的NK細胞與T細胞的比例將恢複後的第一T細胞亞群與NK細胞接觸約96小時；以及v)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性或缺陷型，或CD3 +)且存活的經處理細胞的最終混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群；(II)試驗II：i)處理步驟，包括以約0.5:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約10天；以及ii)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性或缺陷型，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；(III)試驗III：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)分選步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性或缺陷型，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的T細胞亞群；以及iii)恢複步驟，包括在收獲細胞之前培養T細胞亞群約48小時；以及(IV)試驗IV：i)處理步驟，包括以約1:1的NK細胞與T細胞的比例使T細胞文庫與NK細胞接觸約48小時；ii)富集步驟，包括分選作為T細胞(例如，B2M陰性或缺陷型，或CD3 +)且存活的經處理細胞的混合物，從而獲得對NK細胞殺傷具有抗性的第一T細胞亞群；iii)恢複步驟，包括將第一T細胞亞群培養約48小時；以及iv)分選步驟，包括分選恢複後作為T細胞(例如，B2M陰性或缺陷型，或CD3 +)且存活的第一T細胞亞群，從而獲得對T細胞殺傷具有抗性的第二T細胞亞群NK細胞。在一些實施方案中，鑒定靶基因包括鑒定來自4個單獨試驗中至少兩個的命中基因，其中：i)在FDR≤0.01的至少一個試驗中，或在FDR≤0.05 (例如，FDR≤0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001或更少中任一個)的至少兩個試驗中被鑒定為從最終T細胞亞群中耗盡(和/或具有至少約2倍耗盡，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍耗盡中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因；和/或ii)在FDR≤0.05的至少一個試驗或FDR≤0.15的至少兩個試驗中(例如，FDR≤0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01或更少中任一個)被鑒定為從最終T細胞亞群中富集(和/或具有至少約2倍富集，如至少約3-、4-、5-、10-、20-、50-、100-倍或更多倍富集中的任一個)的命中基因，被鑒定為其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因。
在一些實施方案中，所述方法還包括對鑒定的靶基因進行排序，其中靶基因排序基於與對照T細胞群相比，處理後的T細胞群(從步驟c)獲得的T細胞)中的sgRNA或sgRNA iBAR引導序列或命中基因突變的富集或耗盡程度(例如，富集倍數、耗盡倍數、富集FDR或耗盡FDR)。在一些實施方案中，基於包含對應於相同靶基因的命中基因突變(例如，失活突變)的所有序列之間的數據一致性，進一步調整靶基因排序。在一些實施方案中，所述sgRNA文庫為sgRNA iBAR文庫，基於與靶基因的引導序列對應的sgRNA iBAR序列中的iBAR序列之間的數據一致性，和/或基於對應於相同靶基因(例如，相同或不同的靶位點)的所有引導序列之間的數據一致性，進一步調整靶基因排序。在一些實施方案中，RRA或α-RRA算法用於對鑒定的靶基因進行排序。在一些實施方案中，所鑒定的靶基因的排序是：i)基於包含對應於相同靶基因的命中基因突變(例如，失活突變)的所有序列之間的數據一致性；或ii)基於與靶基因的引導序列對應的sgRNA iBAR序列中iBAR序列之間的數據一致性；和/或iii)基於對應於相同靶基因(例如，相同或不同靶位點)的sgRNA或sgRNA iBAR的所有引導序列之間的數據一致性；其中基於數據的一致性程度從高到低，將鑒定出的靶基因從高到低排序。在一些實施方案中，處理後的T細胞群(從步驟c)獲得的T細胞)是活的群，即對NK細胞殺傷具有抗性。在一些實施方案中，所述方法還包括對鑒定的靶基因分配敏感性評分或抗性評分，其中基於與對照T細胞群相比，處理後的T細胞群(例如，活的、對NK細胞殺傷具有抗性)中sgRNA或sgRNA iBAR引導序列或命中基因突變的富集倍數(或基於富集FDR—FDR越小，排名越高；或基於數據一致性程度—數據一致性程度越高，排名越高)，將其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因從高到低排序，並且每個靶基因相應地被分配從高到低的抗性評分；和/或其中基於與對照T細胞群相比，處理後的T細胞群(例如，存活的、對NK細胞殺傷具有抗性)中sgRNA或sgRNA iBAR引導序列或命中基因突變的耗盡倍數(或基於耗盡FDR—FDR越小，排名越高；或基於數據一致性程度—數據一致性程度越高，排名越高)，將其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因從高到低排序，並且每個靶基因相應地被分配從高到低的敏感性評分。在一些實施方案中，處理後的T細胞群(從步驟c)獲得的T細胞)是死的群，即對NK細胞殺傷敏感。在一些實施方案中，所述方法還包括對鑒定的靶基因分配敏感性評分或抗性評分，其中基於與對照T細胞群相比，處理後的T細胞群(例如，死的、對NK細胞殺傷敏感)中sgRNA或sgRNA iBAR引導序列或命中基因突變的富集倍數(或基於富集FDR—FDR越小，排名越高；或基於數據一致性程度—數據一致性程度越高，排名越高)，將其突變使T細胞對NK細胞殺傷敏感的靶基因從高到低排序，並且每個靶基因相應地被分配從高到低的敏感性評分；和/或其中基於與對照T細胞群相比，處理後的T細胞群(例如，死的、對NK細胞殺傷敏感)中sgRNA或sgRNA iBAR引導序列或命中基因突變的耗盡倍數(或基於耗盡FDR—FDR越小，排名越高；或基於數據一致性程度—數據一致性程度越高，排名越高)，將其突變使T細胞對NK細胞殺傷具有抗性的靶基因從高到低排序，並且每個靶基因相應地被分配從高到低的抗性評分。在一些實施方案中，所述方法還包括通過以下方式驗證所鑒定的靶基因：a)通過在T細胞的靶基因中產生突變(例如，失活突變)來修飾T細胞；b)確定修飾的T細胞對NK細胞殺傷的敏感性或抗性。在一些實施方案中，所述方法包括使修飾的T細胞經曆本文所述的任何NK細胞處理步驟b)和任選的任何T細胞獲得步驟c)。本領域已知和本文所述的任何細胞活力測定可用於確定修飾的T細胞對NK細胞殺傷的敏感性或抗性。當修飾的T細胞是同質群時(即包含相同的突變，如失活突變)，可以使用更多的細胞活力測定，如基於代謝活性的測定，例如刃天青(氧化-還原(氧化還原反應)指示劑)、四唑鹽MTT和XTT、二氫羅丹明、-鈣黃綠素或-熒光素、發光ATP測定。在一些實施方案中，驗證方法還包括在T細胞或靶基因修飾的T細胞中的B2M中產生突變(例如，失活突變)。在靶基因和B2M中產生突變(例如，失活突變)可以同時或順序進行，使用相同或不同的突變生成方法(例如，都使用CRISPR/Cas介導的基因編輯)。靶基因和/或B2M中的突變(例如，失活突變)可以通過本領域已知和本文描述的任何方法產生，如通過誘變劑，或TALEN-、ZFN-或CRISPR/Cas介導的基因編輯(例如，使用Cas、針對靶基因的sgRNA和/或B2M sgRNA)。在一些實施方案中，在靶基因中產生突變(例如，失活突變)之前的T細胞在B2M中包含突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，所述方法包括：a)通過在T細胞的靶基因中產生突變(例如，失活突變)來修飾T細胞；b)任選的靶基因修飾的T細胞的富集步驟；以及c)通過在B2M中產生突變(例如，失活突變)來修飾靶基因修飾的T細胞。在一些實施方案中，所述方法包括：a)通過在B2M中產生突變(例如，失活突變)來修飾T細胞；b)任選的B2M修飾的T細胞的富集步驟；以及c)通過在靶基因中產生突變(例如，失活突變)來修飾B2M修飾的T細胞。
III. 產生修飾的 T 細胞的方法
本發明的一方面提供了產生修飾的T細胞的方法，如對NK細胞殺傷具有更高抗性的經修飾的T細胞。在一些實施方案中，產生修飾的T細胞的方法包括：在宿主T細胞(例如，同種異體T細胞、前體T細胞、PBMC衍生的T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中失活通過本文所述的任何篩選方法鑒定的一種或多種靶基因。在一些實施方案中，所述宿主T細胞還包含B2M中的突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，所述方法還包括在宿主T細胞或經修飾的T細胞的B2M中產生一個或多個突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，所述宿主T細胞表達CAR。在一些實施方案中，所述方法還包括將編碼CAR的核酸或載體引入所述宿主T細胞或經修飾的T細胞。還提供了通過本文所述的任何方法產生的經修飾的T細胞。
在一些實施方案中，產生修飾的T細胞的方法包括：在通過本文所述的任何篩選方法鑒定的一個或多個靶基因處產生一個或多個突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，所述方法包括：使宿主T細胞(例如，同種異體T細胞、前體T細胞、PBMC衍生的T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))與誘變劑接觸，並選擇在本文鑒定的一個或多個靶基因上包含一個或多個突變(例如，失活突變)的經修飾的T細胞。檢測此類突變的方法是本領域眾所周知的，如通過PCR。在一些實施方案中，所述方法包括：通過基因編輯，如本領域已知的或本文所述的任何基因編輯方法，在宿主T細胞(例如，同種異體T細胞、前體T細胞、PBMC衍生的T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))中本文鑒定的一個或多個靶基因上產生一個或多個突變(例如，失活突變)。例如，非同源末端連接(NHEJ)-或同源重組介導的基因破壞，或ZFN-、TALEN-或CRISPR/Cas介導的基因破壞。在一些實施方案中，產生修飾的T細胞的方法包括：將sgRNA構建體引入宿主T細胞(例如，同種異體T細胞、前體T細胞、PBMC衍生的T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))，其中sgRNA構建體包含或編碼sgRNA (例如，sgRNA，或攜帶編碼sgRNA的核酸的載體(例如，病毒載體，如慢病毒載體))，其中sgRNA包含與本文鑒定的靶基因中的靶位點互補(例如，至少約60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列。在一些實施方案中，提供了一種產生修飾的T細胞的方法，包括將sgRNA文庫引入宿主T細胞(例如，同種異體T細胞、前體T細胞、PBMC衍生的T細胞或CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))，其中sgRNA文庫包含一個或多個sgRNA構建體，其中每個sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每個sgRNA包含與靶基因中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列，所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。在一些實施方案中，所述方法還包括：將攜帶編碼Cas蛋白(例如Cas9)或Cas(例如Cas9)mRNA的核酸的載體(例如病毒載體，如慢病毒載體)，引入宿主T細胞或包含所述sgRNA構建體的宿主T細胞。在一些實施方案中，所述方法還包括：將B2M sgRNA構建體引入宿主T細胞或包含針對靶基因的sgRNA構建體的宿主T細胞，其中B2M sgRNA構建體包含或編碼B2M sgRNA (例如，B2M sgRNA，或攜帶編碼B2M sgRNA的核酸的載體(例如病毒載體，如慢病毒載體)，其中B2M sgRNA包含與B2M中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列。在一些實施方案中，所述宿主T細胞包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，將針對靶基因的sgRNA構建體、B2M sgRNA構建體，和/或包含Cas蛋白或編碼Cas蛋白的核酸(例如，載體或mRNA)的Cas組分，(和/或編碼嵌合受體如CAR或工程化TCR的核酸，例如用於產生CAR-T或TCR-T細胞)同時引入宿主T細胞。在一些實施方案中，編碼靶基因sgRNA的核酸、編碼B2M sgRNA的核酸，和/或編碼Cas蛋白的核酸，(和/或編碼嵌合受體如CAR或工程化TCR的核酸，例如用於產生CAR-T或TCR-T細胞)在同一載體上，在同一啟動子控制下，或在不同啟動子控制下。在一些實施方案中，編碼靶基因sgRNA的核酸、編碼B2M sgRNA的核酸，和/或編碼Cas蛋白的核酸，(和/或編碼嵌合受體如CAR或工程化TCR的核酸，例如用於產生CAR-T或TCR-T細胞)通過一個或多個IRES連接序列連接，並在相同的啟動子控制下。在一些實施方案中，編碼靶基因sgRNA的核酸、編碼B2M sgRNA的核酸，和/或編碼Cas蛋白的核酸，(和/或編碼嵌合受體如CAR或工程化TCR的核酸，例如用於產生CAR-T或TCR-T細胞)在不同的載體上。在一些實施方案中，所述宿主T細胞包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)。在一些實施方案中，將針對靶基因的sgRNA構建體、B2M sgRNA構建體，和/或包含Cas蛋白或編碼Cas蛋白的核酸(例如，載體或mRNA)的Cas組分，(和/或編碼嵌合受體如CAR或工程化TCR的核酸，例如用於產生CAR-T或TCR-T細胞)依次引入宿主T細胞。
在一些實施方案中，當宿主T細胞群(或初始T細胞群)用於產生本文所述的經修飾的T細胞時，該方法還包括一個或多個分離和/或富集步驟，例如，從用本文所述的任何修飾藥劑接觸的T細胞群中，分離和/或富集在靶基因和/或B2M、靶基因sgRNA構建體、B2M sgRNA構建體或Cas組分中包含一個或多個突變(例如，失活突變)的T細胞。在一些實施方案中，所述方法還包括分離和/或富集表達嵌合受體如CAR或工程化TCR的T細胞。這種分離和/或富集步驟可以使用本領域和本文描述的任何已知技術進行，如FACS或磁激活細胞分選(MACS)。另請參閱上述“修飾的T細胞的分離和富集”、“第一富集步驟”和“收獲分選步驟”小節中描述的方法。
在一些實施方案中，所述宿主T細胞源自：血液、骨髓、淋巴或淋巴器官。在一些方面，宿主T細胞是人T細胞。在一些實施方案中，所述宿主T細胞源自T細胞系。在一些實施方案中，所述宿主T細胞獲自異種來源，例如獲自：小鼠、大鼠、非人靈長類動物或豬。在一些實施方案中，所述宿主T細胞是工程化T細胞，如包含突變(例如，B2M突變)的工程化T細胞、CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞)、具有內源性TCR敲除的T細胞、或表達外源性Nef蛋白的T細胞。
在一些實施方案中，通過轉導/轉染核酸(DNA或RNA)或編碼其的載體(例如，非病毒載體，或病毒載體如慢病毒載體)，或包含編碼其的核酸的病毒(例如，慢病毒)。在一些實施方案中，通過將蛋白插入細胞膜的同時使細胞通過微流體系統如CELLSQUEEZE ®(參見例如，美國專利申請公開US20140287509)，將Cas組分(例如Cas9蛋白)引入宿主T細胞。
將載體(例如，病毒載體)或分離的核酸引入哺乳動物細胞的方法是本領域已知的。可以通過物理、化學或生物方法將本文所述的核酸或載體轉移到T細胞中。
將載體(例如，病毒載體)引入T細胞的物理方法，包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、微粒轟擊、顯微注射、電穿孔等。生產包含載體和/或外源核酸的細胞的方法是本領域公知的。參見，例如Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。在一些實施方案中，通過電穿孔將載體(例如，病毒載體)引入T細胞。
將載體引入T細胞的生物學方法，包括使用DNA和RNA載體。病毒載體已成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動物(如人類)細胞的方法。
用於將載體(例如，病毒載體)引入T細胞的化學方法，包括膠體分散系統，如大分子複合物、納米膠囊、微球、珠子和基於脂質的系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質體。用作體外遞送載體的示例性膠體系統是脂質體(例如，人造膜囊泡)。
在一些實施方案中，RNA分子(例如，sgRNA或編碼Cas9的mRNA)可以通過常規方法(例如，體外轉錄)制備，然後通過已知方法如mRNA電穿孔引入T細胞。參見，例如Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035。
在一些實施方案中，將包含編碼本文所述的任何靶基因sgRNA、靶基因sgRNA iBAR、B2M sgRNA和/或Cas蛋白的核酸的病毒載體(慢病毒載體)或病毒(例如，慢病毒)與宿主T細胞(或初始T細胞群)接觸，例如以至少約1，如至少約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9或10中任一個的MOI。在一些實施方案中，包含編碼本文所述的任何靶基因sgRNA、靶基因sgRNA iBAR、B2M sgRNA和/或Cas蛋白的核酸的病毒載體(慢病毒載體)或病毒(例如慢病毒)以約3的MOI與宿主T細胞(或初始T細胞群)接觸。
在一些實施方案中，在引入載體或分離的核酸之後，離體增殖轉導/轉染的T細胞。在一些實施方案中，將轉導/轉染的T細胞培養以增殖至少約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天或14天中的任一個。在一些實施方案中，進一步評估或篩選轉導/轉染的T細胞，以選擇本文所述的所需修飾的T細胞。
報告基因可用於鑒定潛在轉染/轉導的細胞以及評估調控序列的功能。一般而言，報告基因是不存在於受體生物體或組織中或不由其表達並且編碼多肽的基因，該多肽的表達通過一些易於檢測的特性例如酶活性來證明。將DNA/RNA引入受體細胞後，在合適的時間測定報告基因的表達。合適的報告基因可包括：編碼熒光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌性堿性磷酸酶或綠色熒光蛋白(GFP)的基因(例如，Ui-Tei et al. FEBS Letters 479: 79-82 (2000))。合適的表達系統是眾所周知的，並且可以使用已知技術制備或商業獲得。抗生素選擇標記物也可用於鑒定潛在的轉染/轉導細胞。
確認修飾的T細胞的靶基因中存在本文所述的任何核酸(例如，sgRNA構建體)或突變(例如，失活突變)的其他方法，包括例如本領域技術人員熟知的分子生物學測定，如Southern和Northern印跡、RT-PCR、PCR、DNA-seq或RNA-seq；生化分析，如檢測特定肽的存在與否，例如通過免疫學方法(如ELISA和蛋白質印跡)、熒光激活細胞分選(FACS)或磁激活細胞分選(MACS)。
在一些實施方案中，所述方法還包括：用至少一種藥學上可接受的載體配制修飾的T細胞(例如，對NK細胞殺傷具有更強抗性的經修飾的T細胞)。在一些實施方案中，所述方法還包括：向個體(例如人)施用有效量的經修飾的T細胞(例如對NK細胞殺傷具有更強抗性的經修飾的CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞))，或有效量的其藥物制劑。在一些實施方案中，個體患有癌症。在一些實施方案中，個體與經修飾的T細胞所源自的宿主T細胞的供者是組織不相容的。
IV. 包含修飾的 T 細胞的藥物組合物
本申請還提供了藥物組合物，其包含：在本文鑒定的一種或多種靶基因中包含一種或多種突變(例如，失活突變)的經修飾的T細胞(例如對NK細胞殺傷具有更強抗性的經修飾的T細胞)中的任一個，以及任選的藥學上可接受的載體。還提供了使用本文所述的經修飾的T細胞(例如，經修飾的CAR-T細胞，或經修飾的同種異體CAR-T細胞)或其藥物組合物(例如，對NK細胞殺傷具有抗性)治療個體(例如人)的疾病(例如，癌症、免疫疾病如感染等)的方法，包括向個體施用有效量的經修飾的T細胞或其藥物組合物。在一些實施方案中，經修飾的T細胞(例如，對NK細胞殺傷具有抗性)是CAR-T細胞。在一些實施方案中，CAR特異性識別抗原，如癌症/腫瘤抗原、傳染原(例如，病毒、細菌、真菌、寄生蟲等)的抗原。
在一些實施方案中，提供了一種修飾的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T (如同種異體CAR-T細胞))，其在一個或多個靶基因中包含一個或多個突變(例如失活突變，如敲除)，其中所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。在一些實施方案中，提供了一種修飾的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T (如同種異體CAR-T細胞))，其在PSCS2中包含一個或多個突變(例如失活突變，如敲除)。在一些實施方案中，提供了一種藥物組合物，其包含：i)一種或多種修飾的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T (如同種異體CAR-T細胞))，所述T細胞在一個或多個靶基因中包含一個或多個突變(例如失活突變，如敲除)，其中所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2；以及ii)任選的藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，提供了一種藥物組合物，其包含：i)一種或多種修飾的T細胞(例如，同種異體T細胞或CAR-T (如同種異體CAR-T細胞))，所述T細胞在PSCS2中包含一個或多個突變(例如失活突變，如敲除)；以及ii)任選的藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，經修飾的T細胞在所有靶基因中包含突變(例如失活突變，如敲除)。在一些實施方案中，經修飾的T細胞還包含B2M中的突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，與從修飾的T細胞源自的宿主T細胞供者中分離的原代T細胞相比，經修飾的T細胞在組織不相容的個體中對NK細胞殺傷具有更高的抗性。在一些實施方案中，與從修飾的T細胞源自的宿主T細胞供者中分離的原代T細胞相比，經修飾的T細胞在組織不相容的個體中對NK細胞殺傷具有更高至少約1.2倍(例如，至少約1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更多中任一個)的抗性。在一些實施方案中，相比從修飾的T細胞源自的宿主T細胞供者中分離的原代T細胞，在組織不相容個體中被NK細胞殺傷的經修飾的T細胞的量至少更低約10% (如至少更低約15%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、80%、90%或95%中任一個)。在一些實施方案中，在組織不相容個體中至多約70%(如至多約60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%中任一個)的修飾T細胞被NK細胞殺傷。
藥物組合物可以通過將本文所述的經修飾的T細胞群與任選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑以水溶液的形式混合來制備(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。在一些實施方案中，經修飾的T細胞群是同質的(即，包含相同的突變，如失活突變)。在一些實施方案中，經修飾的T細胞群是異質的(即，包含至少一種不同的突變，如失活突變)。在一些實施方案中，經修飾的T細胞群的至少約70%(如至少約75%、80%、85%、90%或95%中的任一個)包含相同的突變，如失活突變。
可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所采用的劑量和濃度下對受者是無毒的，並且包括：緩沖劑、抗氧化劑包括抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E、焦亞硫酸鈉；防腐劑、等滲劑、穩定劑、金屬配合物(例如鋅-蛋白質配合物)；螯合劑如EDTA和/或非離子表面活性劑。
緩沖液用於將pH值控制在優化治療效果的範圍內，尤其是在穩定性取決於pH值的情況下。適用於本發明的緩沖劑包括有機和無機酸及其鹽。例如，檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。此外，緩沖液可包含組氨酸和三甲胺鹽如Tris。
添加防腐劑以阻止微生物生長，通常以0.2%-1.0% (w/v)的範圍存在。適用於本發明的防腐劑包括：十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲銨；苯紮氯銨(例如氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯銨；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚;環己醇、3-戊醇和間甲酚。
其他賦形劑可以包括防止粘附到容器壁的試劑。
也可以存在非離子表面活性劑或去汙劑(也稱為“潤濕劑”)。合適的非離子表面活性劑包括：聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊咯沙姆(184、188等)、PLURONIC®多元醇、TRITON®、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN®-20、TWEEN®-80等)、月桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、單硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。可以使用的陰離子去汙劑包括：十二烷基硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉和二辛基磺酸鈉。陽離子去汙劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。
為了將藥物組合物用於體內給藥，它們必須是無菌的。可以通過無菌過濾膜過濾使藥物組合物無菌。本文的藥物組合物通常置於具有無菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈注射溶液袋或小瓶。
給藥途徑按照已知和接受的方法，如通過單次或多次推注或以合適的方式長時間輸注，例如通過皮下、靜脈內、瘤內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內或關節內途徑注射或輸注，或通過持續釋放或延長釋放方式。緩釋制劑的合適實例包括：含有拮抗劑的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成型制品的形式，例如薄膜或微膠囊。緩釋基質的實例包括：聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美國專利US3,773,919)、L-穀氨酸和L-穀氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRONDEPOT™ (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
活性成分也可以被包裹在通過例如凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊中，例如分別在膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)或粗乳液中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。此類技術公開於 Remington's Pharmaceutical Sciences18th edition。
本文所述的藥物組合物還可以包含多於一種活性化合物或視所治療的具體適應症需要而定的藥劑，優選具有互補活性且不會相互產生不利影響的那些。或者，或另外，組合物可包含細胞毒劑、化療劑、細胞因子、免疫抑制劑或生長抑制劑。此類分子以對於預期目的有效的量適當地組合存在。
V. 試劑盒和制品
本申請還提供了用於鑒定本文所述的T細胞中的靶基因的方法的任何實施方案的試劑盒和制品，如使用本文所述的sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫。還提供了用於產生對NK細胞殺傷具有更高抗性的修飾T細胞的試劑盒和制品。
在一些實施方案中，提供了用於鑒定調節T細胞活性(例如，對NK細胞處理的敏感性或抗性)的T細胞中的靶基因的試劑盒，其包含本文所述的任何sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫中的任一個。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含Cas蛋白或編碼Cas蛋白的核酸。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含sgRNA構建體，所述sgRNA構建體包含或編碼其引導序列與B2M中的靶位點(例如，編碼B2M sgRNA的病毒載體)互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的sgRNA。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含sgRNA iBAR構建體的一個或多個陽性和/或陰性對照組，或sgRNA構建體的一個或多個陽性和/或陰性對照。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含NK細胞和/或初始T細胞群，如同種異體T細胞、PBMC衍生的T細胞、前體T細胞、CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞)或包含B2M突變的(例如，失活B2M突變)的T細胞。在一些實施方案中，所述試劑盒還包括數據分析軟件。在一些實施方案中，試劑盒包括用於執行本文所述的任何一種方法的說明。
在一些實施方案中，提供了用於鑒定T細胞中調節T細胞活性(例如，對NK細胞處理的敏感性或抗性)的靶基因的試劑盒，其包含本文所述的任一個T細胞文庫，如包含基因組中一些或所有命中基因中的突變(例如，失活突變)的T細胞文庫，或包含本文所述的任一個sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫的T細胞文庫。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含Cas蛋白或編碼Cas蛋白的核酸。在一些實施方案中，T細胞文庫還包含B2M中的突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，T細胞文庫還包含sgRNA構建體，所述sgRNA構建體包含或編碼其引導序列與B2M中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的sgRNA。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含NK細胞。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含對照T細胞文庫，如在基因組中的非基因區具有一個或多個突變(例如，失活突變)，或包含sgRNA構建體的一個或多個陽性和/或陰性對照，或sgRNA iBAR構建體的一個或多個陽性和/或陰性對照組。在一些實施方案中，所述試劑盒還包括數據分析軟件。在一些實施方案中，試劑盒包括用於執行本文所述的任何一種方法的說明。
在一些實施方案中，提供了用於產生對NK細胞殺傷具有更高抗性的經修飾的T細胞的試劑盒，其包含含有一個或多個sgRNA構建體的sgRNA文庫(或sgRNA iBAR文庫)，其中每個sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每個sgRNA包含與靶基因中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的引導序列，所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含sgRNA構建體，所述sgRNA構建體包含或編碼其引導序列與B2M中的靶位點互補(例如，至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補中的任一個)的sgRNA。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含Cas蛋白或編碼Cas蛋白的核酸。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含初始T細胞群，如同種異體T細胞、PBMC衍生的T細胞、前體T細胞、CAR-T細胞(如同種異體CAR-T細胞)或包含B2M突變(例如，失活的B2M突變)的T細胞。在一些實施方案中，所述試劑盒包含用於實施修飾的T細胞產生方法的說明。
在一些實施方案中，提供了包含修飾的T細胞或其藥物組合物的試劑盒，其中所述修飾的T細胞包含在一個或多個靶基因中的一個或多個突變(例如失活突變，如敲除)，所述靶基因選自由下述構成的組：TACC2、HES1、STON1、GJD2、LILRB4、PLS1、KLHL24、FANCB、ARNTL、AMY2A、SIX1、USP17L13、PIK3R6、ATP6V1H、TPM3、OR5H14、TFG、SMAD6、PDE4C、SRRM3、LRRC69、KCNJ13、C8orf34和PACS2。在一些實施方案中，提供了包含修飾的T細胞或其藥物組合物的試劑盒，其中修飾的T細胞包含在PSCS2中的一個或多個突變(例如失活突變，如敲除)。在一些實施方案中，經修飾的T細胞還包含在B2M中的突變(例如，失活突變)。在一些實施方案中，經修飾的T細胞對NK細胞殺傷具有更高的抗性。在一些實施方案中，所述試劑盒還包括使用說明。在一些實施方案中，所述試劑盒包含均質的經修飾的T細胞群。在一些實施方案中，試劑盒包含異質的經修飾的T細胞群。在一些實施方案中，經修飾的T細胞還包含CAR。
所述試劑盒可包含附加組件，如容器、試劑、培養基、引物、緩沖液、酶等，以促進本文所述的任一種篩選方法的實施。在一些實施方案中，所述試劑盒包含用於將sgRNA文庫或sgRNA iBAR文庫和Cas蛋白或編碼Cas蛋白的核酸引入T細胞的試劑、緩沖液和載體。在一些實施方案中，所述試劑盒包含用於制備序列的測序文庫的引物、試劑和酶(例如，聚合酶)，所述序列包含從選定的T細胞亞群中提取的命中基因突變(例如，失活突變)、sgRNA序列或sgRNA iBAR序列。
本申請的試劑盒采用合適的包裝。合適的包裝包括但不限於：小瓶、瓶子、廣口瓶、軟包裝(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。試劑盒可以選擇性地提供附加組件，如緩沖液和解釋性信息。本申請因此還提供制品，其包括小瓶(如密封的小瓶)、瓶子、廣口瓶、軟包裝等。
制品可包括容器和在容器上或與容器相關聯的標簽或包裝插頁。合適的容器包括：例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多種材料形成，如玻璃或塑料。通常，容器容納組合物(例如，對NK細胞殺傷具有更高抗性的經修飾的T細胞)，並且可以具有無菌接入口(例如，容器可以是靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺破的塞子的小瓶)。在一些實施方案中，標簽或包裝插頁指示組合物用於治療特定病況或增強個體的免疫響應。標簽或包裝插頁將還包含用於向個體施用組合物的說明。包裝插頁是指通常包含在治療產品商業包裝中的說明，其包含有關適應症、用法、劑量、給藥、禁忌症和/或有關使用此類治療產品的警告的信息。此外，制品還可包括第二容器，其包含藥學上可接受的緩沖液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。從商業和用戶的角度來看，它還可以包括其他所需的材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
試劑盒或制品可以包括多個單位劑量的藥物組合物和使用說明書，其包裝量足以在藥房例如醫院藥房和複合藥房中儲存和使用。
實施例
下面的實施例和示例性實施方案旨在純粹作為本發明的示例，因此不應被視為以任何方式限制本發明。以下實施例和詳細描述是作為說明而非限制來提供的。
實施例 1 ： T 細胞調節基因的鑒定
本實施例提供了用於鑒定T細胞調節基因的示例性方法。簡而言之，為Cas9介導的基因敲除(KO)構建了攜帶靶向每個人類基因的sgRNA iBAR和靶向B2M的sgRNA的T細胞文庫。B2M是MHC I類分子的組分。具有B2M KO的T細胞將被NK細胞殺傷。通過檢測構建的B2M -sgRNA iBART細胞文庫的NK細胞殺傷功效，可以鑒定出KO後賦予對NK細胞殺傷具有抗性表型或敏感表型的基因。圖1顯示了工作流程。
1. T 細胞分離培養
采血後，將PBMC從供者血液樣本中分離出來。使用免疫磁珠法從PBMC中分離T細胞，然後在37°C、5% CO 2的培養箱中培養於含有10% FBS、1% GlutaMAX和0.1%重組人IL-2的X-VIVO TM15培養基(以下稱為“T細胞完全培養基”)。
2. T 細胞活化和擴增
將800µL Dynabeads® 人T-激活劑CD3/CD28被分開到4個1.5mL Eppendorf管中，200µL/管。每管加入1mL PBS，吸移重懸Dynabeads®，將1.5mL管置於磁力架上靜置1分鐘，然後去除上清液。該洗滌步驟重複兩次。然後將1mL T細胞完全培養基添加到每個管中，通過輕輕移液重新懸浮洗滌過的Dynabeads®。
將3.2×10 7個培養的T細胞轉移到T150細胞培養瓶中，然後將4mL重懸的Dynabeads®加入T細胞中，並輕輕混合。將混合物在37°C、5% CO 2培養箱中培養以激活和擴增T細胞。將活化的T細胞擴增到足夠量後構建T細胞文庫。
3. 人類基因組規模 CRISPR sgRNA iBAR 文庫和 T 細胞文庫的構建
人類基因組規模的CRISPR sgRNA iBAR文庫的設計和構建，類似於WO2020125762和Zhu等人所述(Zhu et al.,“Guide RNAs with embedded barcodes boost CRISPR-pooled screens,” Genome Biol.2019; 20:20)，其各自的內容通過引用整體並入本文。簡而言之，從UCSC人類基因組中檢索了19,114個注釋的蛋白編碼基因。使用DeepRank算法(參見Zhu et al.)設計靶向每個基因的sgRNA，並將4個6-bp iBAR (iBAR 6)隨機分配給每個sgRNA (“sgRNA iBAR”)。內部條形碼序列被設計為放置在Cas9-sgRNA核糖核蛋白複合物外部的gRNA支架的四環中，這不影響其上遊引導序列的活性。設計並大量合成了編碼sgRNA iBAR的DNA寡核苷酸，然後進行PCR擴增。PCR產物被克隆到基於pLenti-sgRNA-Lib (addgene #53121)的內部修飾的慢病毒sgRNA iBAR表達骨架中，以獲得sgRNA iBAR文庫質粒，該質粒編碼156,848個sgRNA iBAR，涵蓋19,114個人類基因(2組sgRNA iBAR，每個基因針對2個不同的靶位點；每組sgRNA iBAR包含4種sgRNA iBAR)。然後使用標准方案獲得sgRNA iBAR文庫慢病毒。
添加sgRNA iBAR文庫慢病毒，以在MOI為3時激活T細胞並輕輕混合。將細胞混合物在37°C、5% CO 2培養箱中培養過夜以進行感染。次日棄上清，加入等量補充有嘌呤黴素的T細胞完全培養基，於37°C、5% CO 2培養箱中培養過夜。然後去除未成功感染的T細胞，產生sgRNA iBART細胞文庫，其攜帶靶向19,114個注釋的功能基因中每一個的sgRNA。
4. Cas9+ β-2- 微球蛋白 KO (B2M-) sgRNA iBART 細胞文庫的構建
將sgRNA iBAR文庫慢病毒感染的T細胞轉移至50mL離心管中，置於磁力架上靜置10分鐘。然後將上清液轉移到新的50mL離心管中，置於磁性架上靜置5分鐘，以去除盡可能多的Dynabeads®。將含有T細胞的上清液轉移到幹淨的50mL離心管中，以400g離心5分鐘，用20mL DPBS重懸，洗滌兩次，然後以400g離心5分鐘。棄去上清液，用600µL Opti-MEM®減血清培養基重懸T細胞，並進行細胞計數(6.60×10 7個T細胞)。這些T細胞被分離到三個1.5mL Eppendorf管中並置於冰上。將16µg Cas9 mRNA和16µg 特異性靶向B2M的sgRNA (內部設計和制造)加入每個管中輕輕混合，然後將細胞混合物分別轉移到4mm BTX電穿孔比色皿中進行電轉化。將電轉化後的T細胞轉移至T150細胞培養瓶中，加入T細胞完全培養基將細胞密度調整至1×10 6個細胞/mL，然後於37℃、5% CO 2培養箱中培養。每兩天進行一次細胞傳代。電轉化後96小時，靶基因(sgRNA iBAR靶向的人類基因)和B2M被認為被有效​​敲除(經檢測B2M的KO效率約為91%)，產生Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞文庫，用於進行篩選。
5. 用 NK 細胞處理的 Cas9 +B2M -sgRNA iBART 細胞文庫的篩選
將NK細胞添加到Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞文庫中，以檢查NK細胞殺傷功效。殺傷效力取決於NK細胞與B2M -T細胞文庫的比例和總孵育時間。因此，以不同的處理強度和篩選方案設立4個測試組(試驗3-6；參見圖2)。設置無NK細胞處理的對照組，Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞在T細胞完全培養基中培養，每兩天傳代一次。每組設置兩個生物學複本。為了確保T細胞文庫中sgRNA iBAR的豐度，每個重複使用3.56×10 7個T細胞(每個sgRNA iBAR平均約100倍覆蓋率，或每個命中基因平均約800倍覆蓋率)。
在測試組中，Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞文庫與NK細胞孵育一段時間後，收集所有細胞，用碘化丙啶(PI)染料(指示死細胞)和抗-B2M抗體染色，然後使用FACS分選PI陰性和B2M陰性或缺陷細胞(即活的Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞)。對於CRISPR篩選，多輪NK細胞處理有助於富集靶sgRNA iBART細胞，並提高信噪比。由於活化的T細胞只能在體外培養有限的時間，如果在第一輪NK細胞處理後分選的活Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞處於合適的條件下，則可以進行第二輪NK細胞處理，然後針對PI陰性和B2M陰性或缺陷細胞再次染色和FACS分選(即，富集的活Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞；參見圖2中的試驗3和6)。可以鑒定不同篩選條件下的公共靶。
5.1 NK細胞處理
根據不同的篩選方案(圖2)將適量的NK細胞加入到Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞文庫中，然後在37°C、5% CO 2培養箱中共培養。
5.2 目標Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞的FACS分選
收集測試組細胞，以300g離心10分鐘，棄上清。用500μL PBS緩沖液重懸細胞，加入PE抗-人β2-微球蛋白抗體(每1×107 個細胞5μL抗體)，室溫避光靜置15分鐘。然後將2mL PBS添加到細胞混合物中，以400g離心5分鐘。去除上清液，用1.5mL緩沖液(PBS+1%FBS+10×PS)重懸細胞。將150µL PI染料添加到細胞懸液中並輕輕混合，然後通過FACS將細胞分選為PI陰性和PE陰性細胞(即活的Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞)。
6. 靶基因分析
FACS分選的PI陰性和B2M陰性或缺陷細胞(即活的Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞)用於基因組提取。sgRNA iBAR編碼片段，從提取的基因組中擴增、純化，並准備用於NGS測序。MAGeCK iBAR算法用於測序數據分析(參見Zhu et al., “Guide RNAs with embedded barcodes boost CRISPR-pooled screens,” Genome Biol.2019; 20:20；其內容通過引用整體並入本文)，其中包含三個主要部分：分析准備、統計檢驗和秩聚合。簡而言之，根據測試組和對照組之間每個基因的富集或耗盡程度，對每個sgRNA iBAR靶向的基因進行評分和排序，以確定該基因是否為高置信度的候選基因。參見圖5，用於靶基因鑒定的工作流程。來自每個試驗的排序靠前的候選物(水平虛線上方的深灰色點)如圖3A-3B所示，其中從陰性篩選中鑒定出其缺失導致對NK細胞殺傷敏感表型的候選基因，而從陽性篩選中鑒定出其缺失導致對NK細胞殺傷具有抗性表型的候選基因。繪制了每個試驗中FDR≤0.15的排序靠前的候選物。發現這些排序靠前的候選基因參與自身免疫響應(例如，TAAC2、HES1、LILRB4、KLHL24、ARNTL、LRRC69、PACS2、CSK和MYB等)、腫瘤惡性轉化(例如，CJD2、FANCB、TPM3、TFG、SMAD6、PTPN14或MEF12等)，或腫瘤轉移(例如STON1、PLS1、SIX1、PIK3R6、PDE4C、SRRM3、SSPO、TLN1、PIH1D2或SLC35C2等)。圖4A-4B示出了FDR≤0.15的各種試驗中排序靠前的候選物的維恩圖。
7. 結果
在FDR≤0.05的至少兩個試驗的陰性篩選中出現的候選基因被歸類為T細胞調節基因，其缺失導致對NK細胞殺傷的敏感表型(表1)。在FDR≤0.05的任何試驗的陽性篩選中出現的候選基因，或在FDR≤0.15的至少兩個試驗的陽性篩選中出現的候選基因被歸類為T細胞調節基因，其缺失導致對NK細胞殺傷的抗性表型(表2)。在這些中，磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分選蛋白2 (PACS-2)被鑒定為T細胞調節基因，其在缺失後賦予對NK細胞殺傷的抗性。這與在腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)介導的凋亡中PACS-2的促凋亡效應子作用一致(Werneburg et al., J Biol Chem.2012; 287(29):24427–24437)。另一個實例是PTEN，被鑒定為T細胞調節基因，其在缺失後賦予對NK細胞殺傷的敏感性。這與在細胞增殖、轉錄調控和泛素化中PTEN的作用一致。
此處獲得的結果，特別是發現其缺失賦予T細胞對NK細胞殺傷的抗性的基因，證明了在同種異體T細胞治療中避免宿主排斥的有價值的靶標。
表 1. 缺失後對 NK 細胞殺傷敏感的 T 細胞調節基因
基因名稱 基因 ID 基因全稱
BCL11B 64919 BAF染色質重塑複合體亞基BCL11B
CEP68 23177 中心體蛋白68
CNPY3 10695 Canopy FGF信號轉導調節因子3
CSK 1445 C-末端Src激酶
EFHD1 80303 EF-hand結構域家族成員D1
GFI1B 8328 生長因子非依賴性1B轉錄阻遏子
IQGAP2 10788 含有GTP酶激活蛋白2的IQ基序
LIMS2 55679 含有LIM鋅指結構域的蛋白2
LZTR1 8216 亮氨酸拉鏈樣轉錄調節因子1
MED12 9968 中介複合體亞基12
MED24 9862 中介複合體亞基24
MEF2D 4209 心肌細胞增強因子2D
MYB 4602 MYB原癌基因，轉錄因子
NARF 26502 核纖層蛋白前體A識別因子
PTEN 5728 磷酸酶和張力蛋白同系物
RAB11FIP1 80223 RAB11家族相互作用蛋白1
RASA2 5922 RAS p21蛋白激活劑2
RNF7 9616 環指蛋白7
SLC35A1 10559 溶質載體家族35成員A1
SMARCB1 6598 SWI/SNF相關、基質相關、肌動蛋白依賴的染色質調節因子，亞家族b，成員1
SOCS1 8651 細胞因子信號轉導抑制因子1
SORCS2 57537 含有Sortilin相關VPS10結構域的受體2
SP4 6671 Sp4轉錄因子
STAR 6770 類固醇生成急性調節蛋白
TGFA 7039 轉化生長因子α
ZBED1 9189 含有鋅指BED型的蛋白1
ZNF558 148156 鋅指蛋白558
表 2 ：缺失後對 NK 細胞殺傷具有抗性的 T 細胞調節基因
基因名稱 基因 ID 基因全稱
TACC2 10579 含轉化酸性螺旋線圈的蛋白2
HES1 3280 HES家族bHLH轉錄因子1
STON1 11037 石蛋白1
GJD2 57369 間隙連接蛋白δ2
LILRB4 11006 白細胞免疫球蛋白樣受體B4
PLS1 5357 絲束蛋白1
KLHL24 54800 Kelch樣家族成員24
FANCB 2187 FA互補群B
ARNTL 406 芳香烴受體核轉運體樣蛋白
AMY2A 279 澱粉酶α 2A
SIX1 6495 SIX同源框1
USP17L13 100287238 泛素特異性肽酶17樣家族成員13
PIK3R6 146850 磷脂醯肌醇-3-激酶調節亞基6
ATP6V1H 51606 ATP酶H+轉運V1亞基H
TPM3 7170 原肌球蛋白3
OR5H14 403273 嗅覺受體家族5亞家族H成員14
TFG 10342 從內質網向高爾基轉運的調節因子
SMAD6 4091 SMAD家族成員6
PDE4C 5143 磷酸二酯酶4C
SRRM3 222183 絲氨酸/精氨酸重複基質3
LRRC69 100130742 含有富亮氨酸重複的蛋白69
KCNJ13 3769 內向整流型鉀離子通道亞家族J成員13
C8orf34 116328 染色體8開放閱讀框34
PACS2 23241 磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分選蛋白2
無
圖1顯示了篩選與T細胞的NK細胞殺傷相關的基因的示例性程序。 圖2顯示了Cas9 +B2M -sgRNA iBART細胞文庫的示例性篩選方法。 圖3A-3D顯示了來自試驗3-6的篩選結果和排序靠前的候選物，鑒定了賦予T細胞基因敲除後NK細胞殺傷抗性表型(陽性側)或敏感表型(陰性側)的基因。FDR≤0.15的排序靠前的基因在虛線上方呈深灰色。 圖4顯示了各種篩選試驗中排序靠前的候選物的維恩圖(FDR≤0.15)。 圖5顯示了Cas9 +sgRNA iBART細胞文庫的示例性靶基因鑒定工作流程。

Claims (15)

  1. 一種鑒定在T細胞中調節所述T細胞活性的靶基因的方法，包括： a) 提供包含多個T細胞的T細胞文庫，其中多個T細胞中每一個在基因組的命中基因處具有突變(“命中基因突變”)，其中在所述多個T細胞的至少兩個的命中基因彼此不同； b) 用NK細胞處理所述T細胞文庫； c) 從所述T細胞文庫中獲得對NK細胞殺傷敏感或具有抗性的T細胞；以及 d) 鑒定步驟c)得到的T細胞中的命中基因，從而鑒定在T細胞中調節所述T細胞活性的靶基因。
  2. 如請求項1所述的方法，其中所述T細胞文庫是通過對初始T細胞群進行全基因組基因編輯而產生的。
  3. 如請求項1或2所述的方法，其中所述T細胞文庫是通過使初始T細胞群與以下物質接觸而產生的：i)包含多種sgRNA構建體的單鏈引導RNA (“sgRNA”)文庫，其中每種sgRNA構建體包含或編碼sgRNA，並且其中每種sgRNA包含與基因組中命中基因的靶位點互補的引導序列；以及任選地，ii)在允許將sgRNA構建體和任選的Cas組分引入至初始T細胞群的條件下，包含Cas蛋白或編碼所述Cas蛋白的核酸的Cas組分。
  4. 如請求項3所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9。
  5. 如請求項4所述的方法，其中每種sgRNA包含與第二序列融合的引導序列，其中第二序列包含與Cas9相互作用的重複-反-重複莖環。
  6. 如請求項5所述的方法，其中每種sgRNA的第二序列還包含莖環1、莖環2和/或莖環3。
  7. 如請求項3-6中任一項所述的方法，其中每種sgRNA還包含內部條形碼(iBAR)序列(“sgRNA iBAR”)，其中每種sgRNA iBAR可與所述Cas蛋白一起操作以修飾所述命中基因。
  8. 如請求項7所述的方法，其中每種sgRNA iBAR的iBAR序列被插入到所述重複-反-重複莖環的環區中。
  9. 如請求項7所述的方法，其中每種sgRNA iBAR在5’至3’的方向上包含第一莖序列和第二莖序列，其中第一莖序列與第二莖序列雜交以形成與Cas蛋白相互作用的雙鏈RNA (dsRNA)區，並且其中所述iBAR序列位於第一莖序列的3’端和第二莖序列的5’端之間。
  10. 如請求項3-9中任一項所述的方法，其中每種引導序列包含約17至約23個核苷酸。
  11. 如請求項7-10中任一項所述的方法，其中每個iBAR序列包含約1至約50個核苷酸。
  12. 如請求項7-11中任一項所述的方法，其中包含多種sgRNA iBAR構建體的sgRNA文庫(“sgRNA iBAR文庫”)包含多組sgRNA iBAR構建體，其中每組sgRNA iBAR構建體包含三種或更多種sgRNA iBAR構建體，其各自包含或編碼sgRNA iBAR，其中三種或更多種sgRNA iBAR構建體的引導序列相同，其中三種或更多種sgRNA iBAR構建體中每一個的iBAR序列彼此不同，並且其中每組sgRNA iBAR構建體的引導序列與基因組中的不同靶位點互補。
  13. 如請求項12所述的方法，其中每組sgRNA iBAR構建體包含4種sgRNA iBAR構建體，並且其中4種sgRNA iBAR構建體中每一種的iBAR序列彼此不同。
  14. 如請求項12或13所述的方法，其中所述sgRNA iBAR文庫包含至少約100組sgRNA iBAR構建體。
  15. 如請求項12-14中任一項所述的方法，其中至少兩組sgRNA iBAR構建體的iBAR序列是相同的。
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