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TW202239968A - Merfish成像系統的標準化 - Google Patents

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TW202239968A
TW202239968A TW110144773A TW110144773A TW202239968A TW 202239968 A TW202239968 A TW 202239968A TW 110144773 A TW110144773 A TW 110144773A TW 110144773 A TW110144773 A TW 110144773A TW 202239968 A TW202239968 A TW 202239968A
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fluorescent
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probes
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TW110144773A
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梅塔卡爾佩許 巴德雷許庫瑪爾
Original Assignee
美商應用材料股份有限公司
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Abstract

標準化MERFISH成像系統提供了一種標準化用於MERFISH分析的螢光顯微鏡的方法，該螢光顯微鏡包括激發聚焦透鏡組件和光源。該方法包括確定螢光顯微鏡的滾降值；以及藉由控制激發聚焦透鏡組件與光源之間的距離來將螢光顯微鏡的滾降值調節至65%或更低。

Description

MERFISH成像系統的標準化
本揭露案大體而言係關於用於多重誤差穩健螢光原位雜交(multiplex error robust fluorescence in-situ hybridization, MERFISH)的裝置和方法。特定言之，本揭露案的實施例係關於用於標準化MERFISH成像系統的方法和裝置。
螢光顯微術已經成為生命科學研究中的重要工具。隨著該領域中的進步，螢光顯微術的精度和可用性已經提高。隨著此進步，儀器和分析過程已經變得更加複雜，並且更易出錯。
基於應用，螢光顯微術可大體分為兩個主要群組：1)用於鑑定、結構闡明和空間分佈的定性顯微術；和2)用於評估螢光物質的存在量的定量顯微術。對於定性和定量分析，有許多參數可用於限定成像系統的效能。
多重誤差穩健螢光原位雜交，亦稱為MERFISH，是最近發展起來的技術。MERFISH允許定量和確定細胞內RNA的空間分佈。目前的MERFISH成像系統缺乏品質控制參數。該等參數用於限定系統的穩定操作範圍。在沒有該等參數的情況下，很難定性成像系統（亦即，評估成像系統的健康），確定系統穩定性和/或比較不同成像系統的效能。
因此，在本領域中需要裝置和方法來限定成像系統的穩定操作範圍。
本揭露案的一個態樣涉及螢光圖像擷取方法。確定包括光源和激發聚焦透鏡組件的螢光顯微鏡的滾降值(roll-off value)。將螢光顯微鏡的滾降值調節到31%至65%的範圍內。為第一螢光團探針選擇第一激發波長和第一發射波長。使樣品與第一螢光團探針雜交。使用配置有第一焦平面的螢光顯微鏡擷取樣品的圖像，該圖像包括來自樣品的螢光發射光。
本揭露案的額外實施例係關於螢光圖像擷取方法，該等方法包括：確定螢光顯微鏡的滾降值，該螢光顯微鏡包括光源和激發聚焦透鏡組件；將螢光顯微鏡的滾降值調節到在31%至65%的範圍內，該滾降值係藉由控制光源與激發聚焦透鏡組件之間的距離來調節；以及使用複數個螢光團探針定量分析樣品以產生每個螢光團探針的空間分佈。
本揭露案的進一步實施例係關於螢光顯微鏡，該等螢光顯微鏡包括：樣品臺，該樣品臺被配置為保持樣品；可變波長激發光源，該可變波長激發光源指向樣品臺；激發聚焦透鏡組件，該激發聚焦透鏡組件被配置為將來自光源的光聚焦在樣品上；偵測器，該偵測器被配置為偵測從樣品發射的光；以及控制器，該控制器被配置為將顯微鏡的滾降值調節到31%至65%的範圍內。
在描述本揭露案的幾個示例性實施例之前，應當理解的是，本揭露案不限於以下描述中闡述的構造或處理步驟的細節。本揭露案能夠具有其他實施例，並且能夠以各種方式實踐或進行。
本揭露案的一或多個實施例有利地提供了一或多個品質控制參數來建立MERFISH成像系統的穩定基線。一些實施例有利地提供了量測品質控制參數以建立MERFISH成像系統的穩定基線的方法。
當前螢光成像系統的品質控制(quality control, QC)參數不可擴展到MERFISH分析。在一些實施例中，藉由組合系統量測值和來自生物樣品分析的資訊來估計MERFISH QC參數。例如，照射功率密度是可用於標準化的參數之一。在高分辨率系統，包括MERFISH成像系統中，難以直接量測照射功率密度（功率/像素）。因此，本揭露案的一或多個實施例提供了藉由估計功率密度來限定MERFISH成像系統的穩定操作範圍的方法。
在一些實施例中，來自對生物樣品進行的MERFISH分析的資訊和在同一系統上量測的成像系統參數被組合以限定系統的穩定操作範圍。在本揭露案的一或多個實施例中，所定義的參數允許系統鑑定和/或確定特定系統是在穩定範圍內操作還是需要維護。在一或多個實施例中，該等參數允許比較不同MERFISH成像系統的效能。
如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，術語「標準化」係指使一或多個系統功能在預定的穩定操作範圍內的一般過程。
如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，「螢光探針」係指包含螢光分子的組合物，該螢光分子在被具有預定激發波長的光激發時能夠產生螢光。在一些實施例中，螢光探針包含與螢光分子綴合的多核苷酸。
通常，螢光顯微鏡包括：激發光源，該激發光源被配置為以激發波長照射靶樣品；發射濾光器，該發射濾光器被配置為使預定波長的螢光穿過；以及偵測器，該偵測器被配置為捕獲被照射的靶樣品的圖像。第1圖圖示了多重誤差穩健螢光原位雜交(MERFISH)成像系統100的示意圖。MERFISH成像系統100包括流動池組件110、光源120、偵測器組件160和控制器170。
在一些實施例中，激發光源包括氙弧燈或汞蒸氣燈。在一些實施例中，激發光源進一步包括激發濾光器。
在一些實施例中，激發光源包括雷射器。在一些實施例中，雷射器的波長範圍為400 nm至850 nm、400 nm至800 nm、400 nm至750 nm、400 nm至700 nm、400 nm至650 nm、400 nm至600 nm、400 nm至550 nm、400 nm至500 nm、400 nm至450 nm、500 nm至850 nm、500 nm至800 nm、500 nm至750 nm、500 nm至700 nm、500 nm至650 nm、500 nm至600 nm、500 nm至550 nm、600 nm至850 nm、600 nm至800 nm、600 nm至750 nm、600 nm至700 nm、或600 nm至650 nm。
在一些實施例中，螢光顯微鏡包括照射光學元件。在一些實施例中，螢光顯微鏡包括光學濾光器。
光源120，亦稱為激發源，可以是本領域技藝人士已知的任何合適的照射系統。在所示實施例中，光源120包括複數個單獨的雷射源121、122、123、124、125、126，其中每個雷射源121、122、123、124、125、126發射不同波長（或頻率）的光。來自雷射源121、122、123、124、125、126的發射光穿過帶通濾波器141、142、143、144、145、146，並從反射器131、132、133、134、135、136反射，以作為激發光束151離開光源120。在所示的實施例中，有六個單獨的雷射源121、122、123、124、125、126以及相關聯的帶通濾波器和反射器。然而，本領域技藝人士將認識到，可以有多於或少於六個雷射源。此外，本領域技藝人士將認識到帶通濾波器和/或反射器是可選的。在一些實施例中，存在範圍為2至10個的雷射源，或範圍為3至9個的雷射源，或範圍為4至8個的雷射源，或範圍為5至7個的雷射源，或6個雷射源。
雖然第1圖所示的光源120圖示了複數個單獨的光源、濾光器和反射器，但是本領域技藝人士將認識到，被配置為提供激發能量的其他源亦在本揭露案的範疇內。例如，一些實施例的光源120包括具有可變濾光輪的連續光源。在一或多個實施例中，激發光源包括氙弧燈、汞蒸氣燈、雷射器和發光二極體(light emitting diode, LED)。
離開光源120的激發光束151行進一段距離並穿過激發聚焦透鏡組件155，該激發聚焦透鏡組件將激發光束151準直或聚焦到二向色立方體150（亦稱為二向色鏡）上。在一些實施例中，激發聚焦透鏡組件包括一或多個準直透鏡。激發光束151被引導離開二向色立方體150以到達物鏡115，該物鏡被配置為將光聚焦到樣品流動池109上。一些實施例的物鏡115包括物鏡和孔隙。在一些實施例中，臺111包括孔隙。所示的光學元件—激發聚焦透鏡組件155、二向色立方體150和物鏡115—圖示在光源120和流動池組件110的外部。然而，本領域技藝人士將會認識到，此僅僅是出於描述的目的，並且不應該被視為限制本揭露案的範疇。所示的任何或所有光學部件，包括下文描述為偵測器組件160的一部分的光學元件，可以在光源120、偵測器組件160、流動池組件110內，或者在該等部件的外部。
流動池組件110包括具有入口107和出口108的樣品流動池109，該入口和出口提供與樣品流動池109的流體連通，使得流經入口107的流體傳遞進入樣品流動池109，並經由出口108流出樣品流動池109。
一或多個貯存器102經由管線103與泵105流體連通。一或多個貯存器102容納有一或多種螢光團探針溶液102a、102b……102z。在一些實施例中，每個螢光團探針溶液102a、102b……102z包括不同的螢光團探針溶液。以此種方式使用時，不同的螢光團探針溶液具有不同的螢光團探針種類。在一些實施例中，存在大於或等於2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種不同的螢光團探針溶液。在一些實施例中，存在範圍為1至30種不同的螢光團探針溶液、或範圍為1至24種不同的螢光團探針溶液、或範圍為1至20種不同的螢光團探針溶液、或範圍為1至16種不同的螢光團探針溶液、或範圍為6至30種不同的螢光團探針溶液、或範圍為8至28種不同的螢光團探針溶液、或範圍為10至26種不同的螢光團探針溶液、或範圍為12至24種不同的螢光團探針溶液、或範圍為14至22種不同的螢光團探針溶液、或範圍為16至20種不同的螢光團探針溶液。
一些實施例的泵105從貯存器102a-102z中的一或多個貯存器選擇一或多種螢光團探針溶液以流過樣品流動池109。在一些實施例中，泵105被配置為一次使螢光團探針溶液從一個貯存器中流出。
一些實施例的泵105被配置為在不同螢光團探針溶液的流之間用來自洗滌緩衝液貯存器104的洗滌緩衝液沖洗樣品流動池109。洗滌緩衝液貯存器104可容納任何合適的緩衝液，取決於例如被分析的樣品。
激發光束151經由物鏡115被引導到樣品流動池109上。激發光束151激發樣品流動池109中的螢光團探針。從樣品流動池109發射的螢光152穿過二向色立方體150進入偵測器組件160。在所示實施例中，偵測器組件160包括發射濾光器156、發射聚焦透鏡157和偵測器165上的鏡子158。如上所述，發射濾光器156、發射聚焦透鏡157和/或鏡子158可以是偵測器組件160的一部分，或者是與偵測器組件160分離的部件。
偵測器165可以是本領域技藝人士已知的任何合適的偵測器。在一些實施例中，偵測器165包括電荷耦合元件(charge-coupled device, CCD)。在一些實施例中，偵測器165包括互補金氧半導體(complementary metal-oxide semiconductor, CMOS)元件。
第1圖所示實施例中的光學元件的佈置僅代表一種可能的配置，並且不應被視為限制本揭露案的範疇。包括鏡子、透鏡、濾光器和二向色立方體的各種光學元件可以是本領域技藝人士已知的以任何合適的配置佈置的任何合適的光學元件。
第2圖圖示了用於多重誤差穩健螢光原位雜交(MERFISH)過程的方法200。方法200圖示了用於標準化螢光顯微鏡以獲得可靠且可再現的MERFISH分析的示例性過程。
MERFISH圖像的分析使用來自被照射的樣品的可偵測螢光信號。螢光信號與照射功率密度成正比。然而，在習知落射照射(epi-illumination)模式中，樣品上照射功率的均勻性與功率密度之間存在折衷。照射功率密度可能受到光源（例如，雷射器）、照射光學元件、光學濾光器和/或通訊系統中的一或多者的影響。此外，系統自發螢光（亦即，源自系統部件或從系統部件反射的自然存在的光）亦有助於增加雜訊位凖。照射光學元件或光學濾光器可有助於系統自發螢光。
本揭露案的一或多個實施例提供了標準化用於MERFISH分析的螢光顯微鏡的方法。特定言之，本揭露案提供了螢光顯微鏡的滾降值作為調節照射功率密度的方式，從而限定了MERFISH成像系統的穩定操作範圍。
本揭露案的一個態樣描述了一種螢光圖像擷取方法。該方法包括確定螢光顯微鏡的滾降值；將螢光顯微鏡的滾降值調節至65%或更小；選擇第一螢光團探針的第一激發波長和第一發射波長；將樣品與第一螢光團探針雜交；以及使用配置有第一焦平面的螢光顯微鏡擷取樣品的圖像，該圖像包括來自樣品的螢光發射光。
在一或多個實施例中，螢光顯微鏡是寬視場螢光顯微鏡。寬視場螢光顯微鏡通常用於圖像的定量分析。以這種方式使用時，術語「寬視場」意指系統擷取的2D圖像的圖像大小為約200 nm*200 nm或更高，取決於系統中所使用的相機和放大倍數。
用寬視場螢光顯微鏡照射的樣品受到偏離光源高斯分佈的不均勻照射。此種不均勻的照射被稱為「滾降」。滾降值可以用等式(I)的形式表示
Figure 02_image001
其中I max=在均質螢光樣品的圖像的中心處偵測到的最大強度，並且I min=在均質螢光樣品的圖像的對角處偵測到的最小強度。
一些實施例的方法200包括確定螢光顯微鏡的滾降值的過程210。在一些實施例中，將螢光顯微鏡的滾降值調節到65%至60%、65%至55%、65%至50%、65%至45%、65%至40%、65%至35%、65%至30%、65%至25%、65%至20%、60%至55%、60%至50%、60%至45%、60%至40%、60%至35%、60%至30%、60%至25%、60%至20%、55%至50%、55%至45%、55%至40%、55%至35%、55%至30%、55%至25%、55%至20%、50%至45%、50%至40%、50%至35%、50%至30%、50%至25%、50%至20%、45%至40%、45%至35%、45%至30%、45%至25%、45%至20%、40%至35%、40%至30%、40%至25%、40%至20%、35%至30%、35%至25%、35%至20%、30%至25%、30%至20%、或25%至20%的範圍。在一些實施例中，螢光顯微鏡的滾降值小於或等於70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%。
在一或多個實施例中，使用校準載玻片來確定滾降值。在一些實施例中，校準載玻片包括複數個封裝的螢光團。在一或多個實施例中，滾降值由螢光染料、TetraSpeckTM珠粒（例如，來自Thermo Fisher Scientific）、基準標記物或Argolight校準或標準化載玻片中的一或多者來確定。在一或多個實施例中，滾降值藉由使用Argolight校準載玻片來確定。在一些實施例中，Argolight校準載玻片選自由以下項組成的群組的至少一者：ArgoPOWERHM載玻片、Argo-HM載玻片、Argo-SIM載玻片、Argo-LM載玻片、Argo-WP載玻片和Argo-CHECK載玻片。
在一些實施例中，過程210包括調節螢光顯微鏡的滾降值。在一或多個實施例中，藉由控制光源120與激發聚焦透鏡組件155之間的距離來調節滾降值。
可以藉由對含有螢光團探針的標準測試對象成像來校準系統，從而估計照射功率密度。標準測試對象具有穩定的回應，並且在焦深內。焦深在100 nm至1000 nm、100 nm至900 nm、100 nm至800 nm、100 nm至700 nm、100 nm至600 nm、100 nm至500 nm、100 nm至400 nm、100 nm至300 nm、100 nm至200 nm, 200 nm至1000 nm、200 nm至900 nm、200 nm至800 nm、200 nm至700 nm、200 nm至600 nm、200 nm至500 nm、200 nm至400 nm、200 nm至300 nm、300 nm至1000 nm、300 nm至900 nm、300 nm至800 nm、300 nm至700 nm、300 nm至600 nm、300 nm至500 nm、300 nm至400 nm、400 nm至1000 nm、400 nm至900 nm、400 nm至800 nm、400 nm至700 nm、400 nm至600 nm、400 nm至500 nm、500 nm至1000 nm、500 nm至900 nm、500 nm至800 nm、500 nm至700 nm、或500 nm至600 nm的範圍中。
在方法200的一些實施例中，樣品是與許多不同螢光團探針雜交的多重誤差穩健螢光原位雜交樣品。在一些實施例中，存在多於或等於兩個螢光團探針。在一些實施例中，螢光團探針的數量在2至30個、2至25個、2至20個、2至16個、4至20個、4至16個、6至20個、6至16個、8至20個、8至16個、10至20個、或10至16個的範圍內。在一些實施例中，樣品由細胞系製備。在一些實施例中，細胞系包含上皮肺細胞。在一些實施例中，細胞系包含A549細胞。本領域技藝人士將認識到，其他細胞系可使用並且在本揭露案的範疇內。
在一些實施例中，每個選擇的螢光團探針具有唯一的激發波長。螢光顯微鏡的所有部件保持不變。參考第1圖，在一或多個實施例中，螢光顯微鏡包括被配置為支撐樣品流動池109的臺111。一些實施例的臺111連接至焦平面致動器112，該焦平面致動器被配置為垂直於焦平面移動臺111。在一些實施例中，焦平面致動器112亦被配置為平行於焦平面移動臺111。在一些實施例中，焦平面致動器112連接至焦平面控制器或焦平面處理器。一些實施例的焦平面控制器或焦平面處理器被配置為跟蹤樣品中的螢光對象。
在過程220處，為選擇的螢光團探針選擇激發波長和發射波長。在過程230處，使樣品與同在過程220中選擇的激發波長和發射波長相關聯的第一螢光團探針雜交。本領域技藝人士將認識到，過程220或過程230可以被首先執行或者可以同時執行。
在一或多個實施例中，該臺進一步包括流動池組件。流動池包括被配置為保持樣品的流動池保持器、連接至一或多個貯存器的入口，和連接至廢棄容器的出口。該貯存器包括一或多個洗滌緩衝液貯存器或螢光團探針貯存器。在一或多個實施例中，流動池組件連接至流動池組件控制器或流動池組件處理器，該流動池組件控制器或流動池組件處理器被配置為使螢光團探針或洗滌緩衝液分別以預定量從螢光團探針貯存器或洗滌緩衝液貯存器流至樣品，將樣品與螢光團探針一起孵育預定時間，用洗滌緩衝液洗滌掉未結合的螢光團探針，並將未結合的螢光團探針棄置到棄置容器中。預定量在1 μl至50 ml、1 ml至50 ml、5 ml至50 ml、10 ml至50 ml、1 ml至20 ml、5 ml至20 ml、或10 ml至20 ml的範圍內。預定時間在1 s至6小時、1 min至6小時、5 min至6小時、20 min至6小時、30 min至6小時、1小時至6小時、2小時至6小時、4小時至6小時、1 min至60 min、5 min至60 min、10 min至60 min、20 min至60 min、20 min至60 min、或30 min至60 min的範圍內。
在過程230中雜交樣品之後，在過程240中擷取樣品的圖像。在一或多個實施例中，方法200進一步包括過程250，在該過程中定量分析樣品圖像以確定圖像中發螢光的第一螢光團探針的數量和空間分佈。
在分析之後，或者在執行資料分析的同時，考慮決策點260。若已經捕獲了足夠數量的螢光團探針的圖像資料，則方法200進行到過程270，在該過程中組合圖像的定量分析。若沒有捕獲到預定量的螢光團探針的圖像資料，則方法200移動到過程280，在該過程中將樣品進行光漂白以使雜交的螢光團探針失活。在一或多個實施例中，螢光圖像擷取方法200進一步包括對樣品進行光漂白以使螢光團探針失活。
在過程280中的光漂白之後，方法200使用第二螢光團探針重複過程220-250。在一些實施例中，方法200進一步包括在過程220的重複中為第二螢光團探針選擇第二激發波長和第二發射波長。在一些實施例中，螢光顯微鏡被調節到不同於第一焦平面的第二焦平面，該第二焦平面基於第二激發波長。在過程230中，使樣品與第二螢光團探針雜交，並且在過程240中擷取來自與第二螢光團探針雜交的樣品的螢光發射光的第二圖像。第二激發波長不同於第一激發波長。在一些實施例中，該方法進一步包括在過程250處定量分析第二圖像，以確定第二圖像中發螢光的第二螢光團探針的第二數量和第二空間分佈。
在一或多個實施例中，該方法進一步包括過程270，其中將發螢光的第一螢光團探針和發螢光的第二螢光團探針的定量分析進行組合以確定樣品中RNA的複本數和空間分佈。
在一些實施例中，該方法進一步包括對一或多種另外的螢光團探針重複過程280、220、230、240和250。在一些實施例中，方法200進一步包括為一或多個額外螢光團探針選擇一或多個額外激發波長和一或多個額外發射波長；基於該一或多個額外激發波長將螢光顯微鏡調節到某一焦平面；將樣品與該一或多個額外螢光團探針中的一個額外螢光團探針雜交；擷取來自與該一或多個額外螢光團探針雜交的樣品的螢光發射光的一或多個額外圖像；定量分析該一或多個額外圖像以確定一或多個額外螢光團探針的額外數量和額外空間分佈；以及將螢光團探針的定量分析進行組合以確定樣品中RNA的複本數量和空間分佈。
本揭露案中描述的另一態樣包括一種螢光圖像擷取方法。在一或多個實施例中，該方法包括確定螢光顯微鏡的滾降值；將螢光顯微鏡的滾降值調節到31%至65%的範圍內，該滾降值係藉由控制光源與激發聚焦透鏡組件之間的距離來調節；以及使用複數個螢光團探針定量分析樣品以產生每個螢光團探針的空間分佈。
在一或多個實施例中，定量分析樣品的方法包括選擇包含核苷酸序列和螢光團的螢光團探針；選擇該螢光團探針的激發波長和發射波長；將樣品與該螢光團探針雜交；以及使用螢光顯微鏡擷取來自雜交樣品的螢光發射光的圖像。在一些實施例中，該方法進一步包括在將樣品與不同的螢光團探針雜交之前擷取來自雜交樣品的螢光發射光的圖像之後，對樣品進行光漂白。
本揭露案的另一態樣提供了一種螢光顯微鏡，該螢光顯微鏡具有：樣品臺，該樣品臺被配置為保持樣品；可變波長激發，該可變波長激發指向樣品臺；偵測器，該偵測器被配置為偵測從樣品發出的光；以及控制器，該控制器被配置為將顯微鏡的滾降值調節到31%至65%範圍內的。
本文所述的過程通常可以作為軟體常式儲存在記憶體中，該軟體常式當由控制器或處理器執行時標準化螢光顯微鏡的一或多個參數，如在本揭露案中所述。軟體常式亦可以由第二控制器或處理器（未圖示）儲存和/或執行，該第二控制器或處理器遠離由控制器或處理器所控制的硬體定位。本揭露案的方法中的一些或所有方法亦可以在硬體中執行。如此，過程可以在軟體中實施並使用電腦系統在硬體中執行為例如特殊應用積體電路或其他類型的硬體實施，或者作為軟體和硬體的組合。當由處理器或控制器執行時，軟體常式將通用電腦轉換成控制螢光顯微鏡操作的專用電腦（控制器），使得製程被執行。該等過程可以儲存在包括指令的非暫時性電腦可讀取媒體上，該等指令當由螢光顯微鏡的控制器執行時使得螢光顯微鏡執行本文所述的方法中的一或多種方法。
返回參考第1圖，在一些實施例中，至少一個控制器170耦接至流動池組件110、光源120或偵測器組件160中的一或多者。在一些實施例中，有多於一個控制器170連接至流動池組件110、光源120或偵測器組件160。在一些實施例中，至少一個控制器170連接至光學元件（例如，透鏡、濾光器、反射器）、焦平面致動器112或其他部件。
控制器170可以是任何形式的通用電腦處理器、微控制器、微處理器等中的一者，該控制器可以在工業環境中用於控制各種腔室和子處理器。至少一個控制器170可以具有處理器172、耦接至處理器172的記憶體174、耦接至處理器172的輸入/輸出設備176、以及用於在不同的電子部件之間通訊的支援電路178。記憶體174可以包括暫時性記憶體（例如，隨機存取記憶體）和非暫時性記憶體（例如，儲存裝置）中的一或多者。
處理器的記憶體174或電腦可讀取媒體可以是易得記憶體，例如隨機存取記憶體(random access memory; RAM)、唯讀記憶體(read-only memory; ROM)、軟碟、硬碟或任何其他形式的本地或遠端數位儲存裝置中的一或多者。記憶體174可以保存指令集，該指令集可由處理器172操作以控制系統100的參數和部件。支援電路178耦接至處理器172以用於以習知方式支持處理器。電路可以包括例如快取、電源、時鐘電路、輸入/輸出電路系統、子系統等。
過程通常可以作為軟體常式儲存在記憶體中，該軟體常式當由處理器執行時使得處理腔室執行本揭露案的過程。軟體常式亦可以由遠離被控制的硬體的第二處理器（未圖示）儲存及/或執行。本揭露案的方法中的一些或所有方法亦可以在硬體中執行。如此，製程可以在軟體中實施並使用電腦系統在硬體中執行為例如特殊應用積體電路或其他類型的硬體實施，或者作為軟體和硬體的組合。當由處理器執行時，軟體常式將通用電腦轉換成控制腔室操作的專用電腦（控制器），使得製程被執行。
在一些實施例中，控制器170具有一或多個配置來執行單獨的製程或子製程以執行該方法。控制器170可以連接至中間部件並被配置成操作該等中間部件來執行方法的功能。例如，控制器170可以連接至泵、氣閥、致動器、馬達、流量控制器、鏡子、濾光器、透鏡、帶通濾波器孔、光源或電源中的一或多者並被配置為控制其。
一些實施例的控制器170具有選自以下的一或多種配置：用於使螢光團探針從貯存器流入樣品流動池的配置；用於使洗滌緩衝液從洗滌緩衝液貯存器流到樣品流動池的配置；用於使用偵測器擷取樣品流動池的圖像的配置；用於分析樣品流動池的圖像以確定樣品流動池中螢光團探針的空間分佈的配置；用於分析樣品流動池的圖像以量化樣品流動池中螢光團探針的數量的配置；用於調節顯微鏡光學元件的焦平面的配置；用於調節支撐樣品流動池的臺的位置的配置；用於光漂白樣品流動池的配置；用於打開物鏡(object lens)的孔隙和/或物鏡(objective lens)的孔隙的配置；用於控制雷射器的功率以光漂白樣品流動池的配置；用於調節螢光顯微鏡的滾降值的配置；和/或用於調節螢光顯微鏡的功率密度的配置。
在整個說明書中對「一個實施例」、「某些實施例」、「各種實施例」、「一或多個實施例」或「一實施例」的提及意謂結合該實施例描述的特定特徵、結構、材料或特性包括在本揭露案的至少一個實施例中。因此，諸如「在一或多個實施例中」、「在某些實施例中」、「在各種實施例中」、「在一個實施例中」或「在一實施例中」的用語在本說明書各處的出現不一定指本揭露案的同一實施例。此外，在一或多個實施例中，特定特徵、結構、材料或特性可以以任何合適的方式組合。
雖然本文的揭示內容提供了參考特定實施例的描述，但是應當理解，該等實施例僅僅是揭示內容的原理和應用的說明。對於熟習此項技術者來說顯而易見的是，在不脫離本揭露案的精神和範疇的情況下，可以對本揭露案進行各種修改和變化。因此，本揭露案意欲包括在所附申請專利範圍及其等同物的範疇內的修改和變化。
100:多重誤差穩健螢光原位雜交(MERFISH)成像系統 102:貯存器 102a:螢光團探針溶液 102b:螢光團探針溶液 102z:螢光團探針溶液 103:管線 104:洗滌緩衝液貯存器 105:泵 107:入口 108:出口 109:樣品流動池 110:流動池組件 111:臺 112:焦平面致動器 115:物鏡 120:光源 121:雷射源 122:雷射源 123:雷射源 124:雷射源 125:雷射源 126:雷射源 131:反射器 132:反射器 133:反射器 134:反射器 135:反射器 136:反射器 141:帶通濾波器 142:帶通濾波器 143:帶通濾波器 144:帶通濾波器 145:帶通濾波器 146:帶通濾波器 150:二向色立方體 151:激發光束 152:螢光 155:激發聚焦透鏡組件 156:發射濾光器 157:發射聚焦透鏡 158:鏡子 160:偵測器組件 165:偵測器 170:控制器 172:處理器 174:的記憶體 176:輸入/輸出設備 178:支援電路 200:方法 210:過程 220:過程 230:過程 240:過程 250:過程 260:過程 270:過程 280:過程
為了能夠詳細理解本揭露案的上述特徵，可以參考實施例對以上簡要概述的本揭露案進行更特別的描述，實施例中的一些實施例在附圖中圖示。然而，應當注意的是，附圖僅圖示了本揭露案的典型實施例，因此不應被認為是對其範疇的限制，因為本揭露案可以允許其他同等有效的實施例。
第1圖圖示了根據本揭露案的一或多個實施例的MERFISH成像系統的示意圖；並且
第2圖圖示了根據本揭露案的一或多個實施例的過程的流程圖。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無
100:多重誤差穩健螢光原位雜交(MERFISH)成像系統
102:貯存器
102a:螢光團探針溶液
102b:螢光團探針溶液
102z:螢光團探針溶液
103:管線
104:洗滌緩衝液貯存器
105:泵
107:入口
108:出口
109:樣品流動池
110:流動池組件
111:臺
112:焦平面致動器
115:物鏡
120:光源
121:雷射源
122:雷射源
123:雷射源
124:雷射源
125:雷射源
126:雷射源
131:反射器
132:反射器
133:反射器
134:反射器
135:反射器
136:反射器
141:帶通濾波器
142:帶通濾波器
143:帶通濾波器
144:帶通濾波器
145:帶通濾波器
146:帶通濾波器
150:二向色立方體
151:激發光束
152:螢光
155:激發聚焦透鏡組件
156:發射濾光器
157:發射聚焦透鏡
158:鏡子
160:偵測器組件
165:偵測器
170:控制器
172:處理器
174:的記憶體
176:輸入/輸出設備
178:支援電路

Claims (20)

  1. 一種螢光圖像擷取方法，該方法包括以下步驟： 確定一螢光顯微鏡的一滾降值，該螢光顯微鏡包括一光源和一激發聚焦透鏡組件； 將該螢光顯微鏡的該滾降值調節到31%至65%的一範圍內； 為一第一螢光團探針選擇一第一激發波長和一第一發射波長； 將該樣品與該第一螢光團探針雜交；以及 使用配置有一第一焦平面的該螢光顯微鏡擷取該樣品的一圖像，該圖像包括來自該樣品的螢光發射光。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該樣品是與多個不同螢光團探針雜交的一多重誤差穩健螢光原位雜交樣品，該等不同螢光團探針的數量大於或等於2。
  3. 如請求項2所述之方法，其中該等不同螢光團探針的數量在6至20的範圍內。
  4. 如請求項2所述之方法，其中該樣品是從A549細胞系製備的。
  5. 如請求項1所述之方法，其中該螢光顯微鏡是一寬視場螢光顯微鏡。
  6. 如請求項1所述之方法，其中使用包括複數個包封的螢光團的一校準載玻片來確定該滾降值。
  7. 如請求項1所述之方法，其中藉由控制該光源與該激發聚焦透鏡組件之間的一距離來調節該滾降值。
  8. 如請求項2所述之方法，進一步包括以下步驟：定量分析該圖像以確定該圖像中發螢光的第一螢光團探針的一數量和空間分佈。
  9. 如請求項8所述之方法，進一步包括以下步驟：對該樣品進行光漂白以使該等螢光團探針失活。
  10. 如請求項9所述之方法，進一步包括以下步驟： 為一第二螢光團探針選擇一第二激發波長和一第二發射波長； 將該螢光顯微鏡調節到不同於該第一焦平面的一第二焦平面，該第二焦平面基於該第二激發波長； 將該樣品與該第二螢光團探針雜交；以及 擷取來自與該第二螢光團探針雜交的該樣品的螢光發射光的一第二圖像。
  11. 如請求項10所述之方法，進一步包括以下步驟：定量分析該第二圖像以確定該第二圖像中發螢光的第二螢光團探針的一第二數量和第二空間分佈。
  12. 如請求項11所述之方法，進一步包括以下步驟：將該等發螢光的第一螢光團探針和該等發螢光的第二螢光團探針的該定量分析進行組合以確定該樣品中RNA的一複本數和空間分佈。
  13. 如請求項11所述之方法，進一步包括以下步驟： 為一或多種額外螢光團探針選擇一或多個額外激發波長和一或多個額外發射波長； 基於該一或多個額外激發波長將該螢光顯微鏡調節至一焦平面； 將該樣品與該一或多種額外螢光團探針中的一者雜交； 擷取來自與該一或多種額外螢光團探針雜交的該樣品的螢光發射光的一或多個額外圖像； 定量分析該一或多個額外圖像以確定該一或多種額外螢光團探針的一額外數量和額外空間分佈；以及 將該等發螢光的螢光團探針的該定量分析進行組合以確定該樣品中RNA的一複本數和空間分佈。
  14. 一種螢光圖像擷取方法，該方法包括以下步驟： 確定一螢光顯微鏡的一滾降值，該螢光顯微鏡包括一光源和一激發聚焦透鏡組件； 將該螢光顯微鏡的該滾降值調節到31%至65%的一範圍內，該滾降值藉由控制該光源與該激發聚焦透鏡組件之間的一距離來調節；以及 使用複數個螢光團探針來定量分析一樣品，以產生每個螢光團探針的一空間分佈。
  15. 如請求項14所述之方法，其中使用包括複數個包封的螢光團的一校準載玻片來確定該滾降值。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該校準載玻片選自由以下項組成的群組：Argo POWERHM校準載玻片、Argo-HM校準載玻片、Argo-SIM校準載玻片、Argo-LM校準載玻片、Argo-WP校準載玻片和ArgoCheck校準載玻片。
  17. 如請求項15所述之方法，其中定量分析該樣品之步驟包括以下步驟： 選擇包含一核苷酸序列和一螢光團的一螢光團探針； 選擇該螢光團探針的一激發波長和一發射波長； 將該樣品與該螢光團探針雜交；以及 使用該螢光顯微鏡擷取來自該雜交樣品的螢光發射光的一圖像。
  18. 如請求項17所述之方法，其中定量分析該樣品之步驟進一步包括以下步驟：在將樣品與一不同的螢光團探針雜交之前擷取來自該雜交樣品的螢光發射光的一圖像之後，對該樣品進行光漂白。
  19. 一種螢光顯微鏡，包括： 一樣品臺，該樣品臺被配置為保持一樣品； 一可變波長激發光源，該可變波長激發光源指向該樣品臺； 一激發聚焦透鏡組件，該激發聚焦透鏡組件被配置為將來自該光源的一光聚焦在該樣品上； 一偵測器，該偵測器被配置為偵測從該樣品發射的光；以及 一控制器，該控制器被配置為將該顯微鏡的一滾降值調節到31%至65%的範圍內。
  20. 如請求項19所述之螢光顯微鏡，其中該控制器被配置為控制該光源與該激發聚焦透鏡組件之間的一距離。
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