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TW202235094A - 經回春的ｔ細胞之製造方法、包含彼之組成物、及彼之使用方法 - Google Patents

經回春的ｔ細胞之製造方法、包含彼之組成物、及彼之使用方法 Download PDF

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TW202235094A
TW202235094A TW110143832A TW110143832A TW202235094A TW 202235094 A TW202235094 A TW 202235094A TW 110143832 A TW110143832 A TW 110143832A TW 110143832 A TW110143832 A TW 110143832A TW 202235094 A TW202235094 A TW 202235094A
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黃寅
前田卓也
尼可拉斯 瑞斯提佛
玉置也剛
勞爾 維茲卡度沙克達
山崎康博
理查 克勞斯納
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美商萊爾免疫藥物公司
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Abstract

本揭示大致上關於製造經回春的T細胞之方法，其包含使T細胞與該至少一種重編程因子接觸並再活化該等經接觸之細胞；和組成物及彼之使用方法。本揭示亦描述根據本文描述之方法製備的細胞群。本揭示亦提供使用藉由本文描述之方法製備的細胞群來治療患者之方法。

Description

經回春的Ｔ細胞之製造方法、包含彼之組成物、及彼之使用方法
本揭示大致上關於製造經回春的T細胞之方法，其包含使T細胞與該至少一種重編程因子接觸並再活化該等經接觸之細胞；和組成物及彼之使用方法。 相關申請之交叉引用本非臨時專利申請案主張2020年11月24日提交之美國臨時專利申請案63/117,787號、2021年2月25日提交之美國臨時專利申請案63/153,881號和2021年3月23日提交之美國臨時專利申請案63/165,093號的優先權，各篇內容之全文併入本文。
腫瘤浸潤淋巴細胞(“TIL”)為在腫瘤內發現之可以識別和殺死癌細胞的免疫細胞(例如T細胞)。自體TIL之過繼性轉移已被廣泛研究，但基於TIL之療法的一種缺點為這些細胞通常表現出廣泛分化之細胞標記及伴隨功能喪失的老化。參見，例如Gurusamy, et al., 2020, Cancer Cell 37, 818-833；Jiang, et al., 2015, Cell Death Dis 6, e17922。通常，TIL主要由TEM或TEMRA細胞所組成，且具有衰竭之特徵。Sakuishi et al., 2010, J Exp Med 207, 2187-2194。此外，臨床前證據強烈表明腫瘤部位之T細胞功能受損會導致T細胞產品的臨床療效不佳。
T細胞(亦稱為T淋巴細胞)為具有獨特性能之血球類型，其係從骨髓中發現之幹細胞發育而來；T細胞可防止感染並對抗癌症。T細胞在結構和功能上與其他細胞類型(諸如纖維母細胞)不同，並經歷需要在胸腺中進行正向和負向選擇及涉及T細胞受體基因位點之體細胞基因重排的複雜發育過程(參見，例如Kurd and Robey, Immunol Rev. 2016 May; 271(1):114-126)。雖然纖維母細胞亦參與身體之免疫反應，但纖維母細胞為合成細胞外基質和膠原蛋白，從而產生動物組織之結構框架的細胞。纖維母細胞主要參與傷口癒合的過程。
腫瘤反應性T細胞除了表現耗竭和分化增加之特徵外，亦受到細胞衰老途徑的誘導。衰老為由老化和重複之細胞分裂循環所導致之效力和功能逐漸喪失的過程。數種與細胞衰老相關之特徵(包括表觀遺傳變化(Vodnala et al., 2019, Cancer Cell 37, 818-833 e819)、端粒長度減少(Rosenberg et al., 2011, Clin Cancer Res17, 4550-4557)和喪失功能性、增殖潛力和細胞活力(Im et al., 2016, Nature 537, 417-421))與T細胞功能不良有關。雖然基於TIL之細胞療法可介導某些患者體內之反應，但臨床證據表明具有提升之CCR7表現和增加之端粒長度的TIL產品與改善之治療結果相關。Rosenberg et al., 2011, Clin Cancer Res17, 4550-4557。因此，許多團體已經尋求細胞去分化或重編程的方法作為逆轉T細胞耗竭、分化和衰老的方法。
過去已藉由利用iPS細胞技術將體細胞回復為多潛能幹細胞，然後重新分化為所需之細胞譜來實現細胞去分化(重編程)。Takahashi et al., 2007, Cell 131, 861-872。iPS細胞技術已被證明能夠將腫瘤抗原特異性腫瘤浸潤淋巴細胞重新編程為iPS細胞，其具有在生物體外產生T譜系細胞的能力。Vizcardo et al., 2013, Cell Stem Cell 12, 31-36。將細胞驅動成iPS細胞具有完全重置細胞之生物和表觀遺傳時鐘的優點。
然而，源自T細胞之iPS細胞通常具有異常的生物學特性—例如不成熟的表型、非MHC依賴性滅殺、不正確之CD8αβ二聚體化、基因表現失調以及無法產生發育上同質的T細胞群。(參見，例如Vizcardo et al., 2018, Cell Rep 22, 3175-3190；Takada, K., Kondo, K., and Takahama, Y. 2017 J. Immunol.198, 2215-2222.；Yamagata, T., et al.,(2004). Nat. Immunol. 5, 597-605；Fink, P.J.(2013). Annu. Rev. Immunol. 31, 31-50；Kuderer, N.M., et al., 2006 Cancer 106, 2258-2266)。雖然這些限制可藉由在3D胸腺類器官培養物上分化iPS細胞來克服(參見，例如Vizcardo et al., 2018, Cell Rep 22, 3175-3190)，但這些方法既耗費時間又耗費資源。用於逆轉T細胞耗竭、分化和衰老之更具可擴展性的方法對於實現使用T細胞之商業上可行的過繼性細胞療法是所欲的。
鑑於T細胞抗腫瘤功能之改善將有利於細胞免疫療法的所有方式，本揭示關於用於改善治療性T細胞產品品質和抗腫瘤潛力之方法、包含該等改善之T細胞的組成物和治療方法，以及該經改良之T細胞組成物的其他用途。因此，該系統可應用於許多其他用於癌症之治療過程，諸如經TCR和CAR轉導之T細胞，以及使用抗衰竭或促功能基因進行遺傳工程修飾，以改善T細胞在腫瘤微環境中之功能的細胞。
該系統亦將適用於T細胞在培養基中未來迭代擴增和藉由人工新蛋白設計之創新的新方法。總之，本揭示之經回春的T細胞可藉由產生具有增強之擴增能力、改善之代謝品質和擴大之持續和消除已確立之實體瘤之能力的T細胞來增進所有細胞免疫療法模式的效率。
於各種實施態樣中，本揭示關於製造經回春的T細胞之方法，該方法包含使T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子；和視需要地，SV40接觸至少一段期間，該期間足夠形成源自T細胞之附著型細胞(adherent cell)，且其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能(totipotent)細胞；及使該等源自T細胞之附著型細胞與至少一種T細胞活化劑接觸。
於各種實施態樣中，本揭示提供製造經回春的T細胞之方法，其包含使T細胞與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地SV40接觸一段期間，該期間足夠形成源自T細胞之附著型細胞，且其中該T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及使該源自T細胞之附著型細胞與至少一種T細胞活化劑接觸。
於各種實施態樣中，本揭示關於製造T細胞之方法，其包含使在培養容器中之第一培養基中的T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子；和視需要地SV40接觸一段期間，該期間足以使該等T細胞形成至少一個附著於該培養容器表面之群落(colony)，且其中該等T細胞未轉形為iPS細胞；及使至少一個附著型群落與至少一種T細胞活化劑接觸。
於各種實施態樣中，本揭示關於製造T細胞之方法，其包含使第一培養基中之經分離的T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子；以及SV40接觸至少約5天至約10天之期間，且其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；使該等經接觸之T細胞與至少一種T細胞活化劑接觸。
於各種實施態樣中，本揭示關於製造至少一個T細胞之方法，其包含使經分離之T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子；以及SV40接觸至少一段期間，該期間足以使該等T細胞表現至少一種選自由下列所組成之群組的標記：SSEA4、CD9和CD90，且其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及使該等經接觸之T細胞與至少一種T細胞活化劑接觸。
於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與該至少一種重編程因子接觸至少一段期間，該期間足以使至少一部分該等T細胞表現CD3及至少一種選自由SSEA4、CD9和CD90所組成之群組的標記。於各種實施態樣中，使該等T細胞與該至少一種重編程因子短暫接觸至少一段期間，該期間足以使至少一部分該等經接觸之T細胞表現SSEA4和CD3。於各種實施態樣中，使該等T細胞與該至少一種重編程因子短暫接觸至少一段期間，該期間足以使至少一部分該等經接觸之T細胞表現CD3、CD9和CD90。於各種實施態樣中，使該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸至少一段期間，該期間足以使至少一部分該等經接觸之T細胞表現CD3、SSEA4、CD9和CD90。
於各種實施態樣中，在使該等經分離之T細胞與該至少一種重編程因子接觸之前，使該等經短暫接觸之T細胞與IL-2和至少一種能夠活化該等經分離之T細胞的化合物接觸。於各種實施態樣中，該T細胞為TCRαβT細胞；TCRgd T細胞；CD4+CD8αβ+雙陽性細胞、CD4+單陽性細胞(諸如Th1、Th2、Th17、Treg)、初始T細胞(naïve T cell)、中央記憶T細胞、或效應記憶T細胞。於各種實施態樣中，該T細胞為TIL。於各種實施態樣中，該等經分離之T細胞係從哺乳動物分離出。
於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC短暫接觸。於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC短暫接觸至少約4至10天。
於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸至少約4至7天。於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸約5天。
於各種實施態樣中，使KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC在T細胞中短暫表現。於各種實施態樣中，使用非整合病毒載體短暫表現KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC。在這方面，可使用一或多種編碼該重編程因子之病毒載體來轉導T細胞。於各種實施態樣中，使用仙台(Sendai)病毒短暫表現KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC。於各種實施態樣中，KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC係組成上表現，其中稍後藉由添加抑制KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC之表現的化合物來抑制表現。於各種實施態樣中，該化合物為特異抑制下列一或多者之表現的小分子抑制劑：KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC表現。於各種實施態樣中，該化合物為特異地抑制下列一或多者之表現的siRNA或shRNA分子：KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC。於各種實施態樣中，KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC係在以奈米顆粒遞送後短暫表現。
於各種實施態樣中，本揭示提供進一步使該等經接觸之T細胞(即，經部分重編程之T細胞)與至少一種T細胞活化化合物，和視需要地，至少一種選自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-12所組成之群組的細胞介素接觸。於各種實施態樣中，該經部分重編程之細胞為源自T細胞之附著型細胞。於各種實施態樣中，該至少一種T細胞活化化合物包含與CD3結合之抗體或與CD28結合之抗體或該兩者；或其中該至少一種T細胞活化化合物為腫瘤抗原。於各種實施態樣中，本揭示提供將該T細胞進一步工程處理以表現細胞表面受體，其中該T細胞係在與該至少一種重編程因子接觸之前經工程處理。於各種實施態樣中，本揭示提供將該T細胞進一步工程處理以表現細胞表面受體，其中該T細胞係在與該至少一種重編程因子短暫接觸之後工程處理。
於各種實施態樣中，該細胞表面受體為嵌合抗原受體、或經工程處理之T細胞受體、或其雜合受體。於各種實施態樣中，該細胞表面受體識別在標靶細胞表面上之特定抗原部分。於各種實施態樣中，該抗原部分為第I類MHC依賴性。於各種實施態樣中，該抗原為非第I類MHC依賴性。
於各種實施態樣中，所產生之T細胞包含T細胞受體基因之V、D和J節段的不完整組。於各種實施態樣中，本揭示提供進一步測量所產生之T細胞的表觀遺傳年齡。於各種實施態樣中，所產生之T細胞的表觀遺傳年齡較重編程前之T細胞群年輕至少5%。於各種實施態樣中，該等經部分重編程之T細胞能夠較該最初分離出之細胞擴增多出至少25倍。於各種實施態樣中，本揭示提供使該等經分離之T細胞與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的因子；和SV40進一步接觸以導致CD3和CD8表現減少。
於各種實施態樣中，本揭示提供製造T細胞之方法，其包含從來源獲得多個經分離之T細胞；將該等經分離之T細胞培養在包含IL-2之第一培養基中並使用至少一種T細胞活化化合物或活化劑，及共刺激劑(諸如特異於CD3和/或CD28之抗體)來活化該等經分離之T細胞；將該等經活化之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC在不包含IL-2或特異於CD3或CD28之抗體的第二培養基中短暫接觸約5天至約10天之期間；其中該等經分離之T細胞未被完全重編程為iPS；以包含IL-2和至少一種特異於CD3和/或CD28之抗體的第三培養基替代該第二培養基；其中該等經短暫接觸之T細胞係在該第三培養基中培養至少約5天。
於各種實施態樣中，本揭示提供進一步擴增該經部分重編程、再活化之T細胞。於各種實施態樣中，該T細胞為TCRαβ細胞；TCRgd細胞；CD4+CD8αβ+雙陽性細胞、CD4+單陽性細胞(Th1、Th2、Th17、Treg)、初始T細胞、中央記憶T細胞、或效應記憶T細胞。於各種實施態樣中，該T細胞為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。
於各種實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其實際年齡(chronological age)年輕至少5%之T細胞群。於各種實施態樣中，本揭示提供T細胞群，其中該表觀遺傳年齡較其實際年齡年輕至少25%。於各種實施態樣中，本揭示提供源自T細胞之附著型細胞群，其中至少70%之該等細胞表現CD3和SSEA4兩者。於各種實施態樣中，本揭示提供源自T細胞之附著型細胞群，其中至少30%之該等細胞表現CD9、或CD90、或CD9和CD90兩者。
於各種實施態樣中，本發明提供腫瘤浸潤淋巴細胞群，其中至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之該等腫瘤浸潤淋巴細胞表現CCR7和CD62L兩者。於各種實施態樣中，本發明提供腫瘤浸潤淋巴細胞群，其中至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%之該等腫瘤浸潤淋巴細胞表現CCR7和TCF7兩者。
於各種實施態樣中，本揭示提供藉由包含下列者之方法而製造的T細胞群：使T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子；及視需要地，SV40短暫接觸一段期間，該期間足以形成源自T細胞之附著型細胞且其中該等經分離之T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及使該等源自T細胞之附著型細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於各種實施態樣中，本揭示提供藉由包含下列者之方法而製造的T細胞群：使在培養容器中之第一培養基中的經分離之T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子；及視需要地，SV40短暫接觸一段期間，該期間足以使該等經分離之T細胞形成至少一個附著於該培養容器表面之群落，且其中該等經分離之T細胞未轉形為iPS；及使該至少一個附著之群落與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於各種實施態樣中，本揭示提供藉由包含下列者之方法而製造的T細胞群：使在第一培養基中之經分離的T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子；及SV40短暫接觸至少約5天且不超過約10天之期間，且其中該等T細胞未轉形為iPS細胞；使該等經短暫接觸之T細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於各種實施態樣中，本揭示提供藉由包含下列者之方法而製造的T細胞群：使經分離之T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子；及SV40短暫接觸一段期間，該期間足以使該等經分離之T細胞表現至少一種選自由SSEA4、CD9和CD90所組成之群組的標記且其中該等經分離之T細胞未轉形為iPS細胞；及使該等經短暫接觸之T細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與該至少一種重編程因子短暫接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等經分離之T細胞表現CD3及至少一種選自由SSEA4、CD9和CD90所組成之群組的標記。於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與該至少一種重編程因子短暫接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等經短暫接觸之T細胞表現SSEA4和CD3。於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與該至少一種重編程因子短暫接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等經短暫接觸之T細胞表現CD3、CD9和CD90。於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與該至少一種重編程因子短暫接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等經短暫接觸之T細胞表現CD3、SSEA4、CD9和CD90。
於各種實施態樣中，該等經分離之T細胞與該至少一種重編程因子接觸之前，使該等經短暫接觸之T細胞與IL-2和至少一種能夠活化該等經分離之T細胞的化合物接觸。
於各種實施態樣中，該T細胞為TCRαβ細胞；TCRγδ細胞；CD4+CD8αβ+雙陽性細胞、CD4+單陽性細胞(諸如Th1、Th2、Th17、Treg)、初始T細胞、中央記憶T細胞、或效應記憶T細胞。於各種實施態樣中，該T細胞為TIL。於各種實施態樣中，該等經分離之T細胞係從哺乳動物分離出。於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC短暫接觸。
於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC短暫接觸至少約4至10天。於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC短暫接觸至少約4至7天。
於各種實施態樣中，使該等經分離之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC短暫接觸約5天。於各種實施態樣中，KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC短暫表現在T細胞。於各種實施態樣中，使用非整合病毒載體短暫表現KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC。於各種實施態樣中，使用仙台病毒短暫表現KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC。於各種實施態樣中，KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC係組成性表現，其中隨後藉由添加抑制KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC表現之化合物來抑制表現。於各種實施態樣中，該化合物為特異抑制KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC表現中一或多者之表現的小分子抑制劑。於各種實施態樣中，該化合物為特異抑制KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC中一或多者之表現的siRNA或shRNA分子。於各種實施態樣中，使用奈米顆粒短暫表現KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC。
於各種實施態樣中，本揭示提供使該等經短暫接觸之T細胞(例如該等經部分重編程之T細胞)與至少一種選自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-12組成之群組的細胞介素；和/或與至少一種T細胞活化劑和/或至少一種T細胞共刺激劑(例如抗CD3和/或抗CD28抗體)進一步接觸。於各種實施態樣中，該至少一種T細胞活化化合物包含與CD3結合之抗體或與CD28結合之抗體或此兩者；或其中該至少一種T細胞活化化合物為腫瘤抗原。
於各種實施態樣中，本揭示提供將該T細胞進一步工程處理以表現細胞表面受體，其中在該T細胞與該至少一種重編程因子短暫接觸之前將該T細胞工程處理。於各種實施態樣中，本揭示提供將該T細胞進一步工程處理以表現細胞表面受體，其中在該T細胞與該至少一種重編程因子短暫接觸之後將該T細胞工程處理。
於各種實施態樣中，該細胞表面受體為嵌合型抗原受體、或T細胞受體、或其雜合受體。於各種實施態樣中，該細胞表面受體識別在標靶細胞表面上之特定抗原部分。於各種實施態樣中，該抗原部分為第I類MHC依賴性的。於各種實施態樣中，該抗原部分與第I類MHC無關。於各種實施態樣中，所產生之T細胞包含T細胞受體基因之V、D和J節段的不完整組。於各種實施態樣中，本揭示提供進一步測量所產生之T細胞的表觀遺傳年齡。於各種實施態樣中，所產生之T細胞的表觀遺傳年齡較該重編程前之T細胞群年輕至少5%。於各種實施態樣中，該經部分重編程之T細胞能夠較初次分離出之細胞擴增多出至少25倍。於各種實施態樣中，本揭示提供使該等經分離之T細胞與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的因子；和SV40進一步接觸以導致CD3和CD8表現減少。
於各種實施態樣中，本揭示關於藉由包含下列者之方法而製造的T細胞群：從來源獲得多個經分離之T細胞；在包含IL-2之第一培養基中培養該等經分離之T細胞並使用至少一種特異於CD3和/或CD28之抗體活化該等經分離之T細胞；將該等經活化之T細胞在不包含IL-2或特異於CD3和/或CD28之抗體的第二培養基中與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC短暫接觸約5天至約10天之期間；其中該等經分離之T細胞未完全重編程成iPS細胞；以包含IL-2和至少一種特異於CD3和/或CD28之抗體的第三培養基替代該第二培養基；其中將該等經短暫接觸之T細胞在該第三培養基中培養至少5天。
於各種實施態樣中，本揭示關於進一步擴增該等經短暫接觸之T細胞。於各種實施態樣中，該T細胞為TCRαβ細胞；TCRγδ細胞；CD4+CD8αβ+雙陽性細胞、CD4+單陽性細胞(Th1、Th2、Th17、Treg)、初始T細胞、中央記憶T細胞、或效應記憶T細胞。於各種實施態樣中，該T細胞為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。
於各種實施態樣中，本揭示關於使用藉由本文揭示之方法製造之T細胞群或藉由本文揭示之T細胞群治療有其需要之患者的方法。於各種實施態樣中，該治療方法為用於治療癌症、病毒病況或自體免疫病症之方法。
於各種實施態樣中，該癌症為急性淋巴細胞癌、急性髓性白血病、肺泡橫紋肌肉瘤(alveolar rhabdomyosarcoma)、骨癌、腦癌、乳癌、肛門癌、肛管癌、或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌、或胸膜癌、頭頸癌(例如鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌)、外陰癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓性細胞癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸道類癌、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、腎臟癌(kidney cancer)、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、腹膜癌、大網膜癌、和腸繫膜癌、咽喉癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌(renal cancer)(例如腎細胞癌(RCC))、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、輸尿管癌或膀胱癌。
於各種實施態樣中，本發明關於至少一種經回春的T細胞之製造方法，其包含：a.從腫瘤中分離出T細胞，其中該T細胞為腫瘤浸潤淋巴細胞；其中該腫瘤浸潤淋巴細胞表現CD137；b.該腫瘤浸潤淋巴細胞係 以至少一種T細胞活化化合物活化，其中該T細胞活化化合物為腫瘤抗原；c.使該等經分離之T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子；和視需要地，SV40短暫接觸一段足以形成源自T細胞之附著型細胞的期間，且其中該等經分離之T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及d.使該等源自T細胞之附著型細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於各種實施態樣中，本發明關於至少一種經回春的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之製造方法，該方法包含(a)從腫瘤中分離出TIL，其中該TIL表現CD137，(b)使用至少一種第一腫瘤抗原活化該TIL，和(c)使該等經分離之TIL群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子；和(ii)視需要地，SV40短暫接觸一段足以形成源自TIL之附著型細胞的期間，且其中該經分離之TIL未轉形為iPS或全潛能細胞。
於各種實施態樣中，本發明關於經回春的T細胞之製造方法，該方法包含使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地，SV40接觸至少一段足以使至少20%之該等經接觸的T細胞表現α6β1整合素的期間，且其中該等經接觸之T細胞未轉形為iPS細胞；使用與α6β1整合素特異結合之結合分子將至少20%之該等經接觸的T細胞分離出；將(b)之經分離的細胞與T細胞活化劑和/或T細胞共刺激劑接觸；從而製造經回春的T細胞。
於各種實施態樣中，本發明關於至少一種經回春的T細胞之製造方法，該方法包含使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地，SV40短暫接觸至少一段足以以形成源自T細胞之附著型細胞；其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；將表現a6(CD49f)或b1(CD29)整合素或兩者的源自T細胞之附著型細胞亞群分離出；使該經分離出之亞群與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於各種實施態樣中，本發明關於藉由包含使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)SV40接觸一段足以以形成源自T細胞之附著型細胞；其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；將表現a6整合素、b1整合素或兩者的源自T細胞之附著型細胞分離出；使該經分離之源自T細胞的附著型細胞亞群與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於各種實施態樣中，本發明關於源自T細胞之附著型細胞群，其中至少70%之該等細胞表現整合素α6或整合素β1。
於各種實施態樣中，本發明關於源自T細胞之附著型細胞群，其中至少50%之該等細胞表現整合素α6或整合素β1兩者。
於各種實施態樣中，本發明關於源自T細胞之附著型細胞群，其中至少70%之該等細胞表現整合素α6和整合素β1兩者。
本技藝之一般技術人士鑑於下列揭示及所附之申請專利權利範圍和附圖將可理解本發明之其他特性和態樣。
下列實施例並不意圖限制，而是為了對本發明提供進一步信息和支持。下列實施例證明使T細胞短暫暴露於細胞重編程條件(在本案例中係使用攜帶四個山中因子之仙台病毒)導致經部分重編程之T細胞具有降低的表觀遺傳年齡，而具有高增殖能力並保留抗原特異性。該經處理之T細胞開始去分化，表現更常見於幹細胞中的標記(例如SSEA4)並附著在培養容器表面形成上皮型群落。同時，該經處理之細胞開始失去T細胞特性(喪失CD3和CD8表現)。隨後之活化可引導這些“源自T細胞之附著型細胞”回復其T細胞特性，並表現出驚人之擴增潛力(6天內250倍)。 實施例 1 ： T 細胞之經部分重編程條件
本實驗中探索用於使T細胞回春及改善生物學特性之重編程條件。使用在含有60 IU/ml IL2之T細胞培養基(TCM)(TCM：OpTmizer 基礎培養基(1000 mL瓶)；OpTmizer細胞補充劑(補充劑 #02)；免疫細胞血清替代品(CTS SR)；L-麩胺醯胺 200mM(100x)；GlutaMAX 200mM (100x)；IL-2(1ug=2.1x10e4 IU)**RS 50ug在105ul中；(1ug=4.5x10e5 IU)**RS 25ug在1125ul)中之可溶性CD3(目錄編號317325；BioLegend)和CD28刺激CD8陽性T細胞3天，該CD8陽性T細胞係使用MACS磁珠(Miltenyi Biotec)自21歲男性(供體11360；購自加州Alameda，Allcells之細胞)之PBMC中分離出。本實驗中描述之所有T細胞培養基均含有60 IU/ml之IL2。進行此活化過程以提高該仙台病毒之轉導效率。仙台病毒(Cytotune iPS 2.0 Sendai重編程套組，ThermoFisher)係由三個載體組成：1)編碼KLF4-OCT3/4-SOX2(KOS)，2)編碼KLF4；3)編碼C-MYC。這些統稱為“山中因子”，在圖中表示為“4因子”或“4F”。此外，使用編碼SV40之仙台病毒載體來提高重編程效率。
將經活化之CD8 T細胞分為四組。#1組為對照組，其中T細胞在整個過程中均培養在T細胞培養基中。#2組亦未使用仙台病毒轉導且從第1天起培養在不含IL2之幹細胞培養基(SCM)(StemFit Basic02和bFGF，味之素)中。以每孔50,000個細胞將#1組和#2組之細胞接種在96孔盤中，一式三份。使用感染複數(MOI)為23之EmGFP 仙台病毒(Cytotune EmGFP仙台螢光報告基因，Thermo)和5 MOI之SV40仙台病毒轉導#3組。根據製造商之方案，將#3組細胞以每孔50,000個之密度平皿接種在24孔盤中，一式三份，該24孔盤係使用重組人層連結蛋白511-E8片段(iMatrix-511，目錄編號T304，Takara)塗層。使用10 MOI之KOS仙台載體、10 MOI之KLF4載體、3 MOI之cMyc載體和5 MOI之SV40載體轉導#4組。從第1天起將細胞培養在不含IL2之SCM中，並以每孔80,000個細胞之密度接種在24孔盤中，一式四份，該24孔盤係使用iMatrix-511塗層。完整之實驗設計參見圖1和表2。
Figure 02_image003
#4組中之T細胞從第3天或第4天開始形成群落。參見圖2。正常之T細胞培養中未見到細胞附著在經塗層之盤底部形成群落。其他條件下之T細胞未顯示出形成任何群落，且未附著在該培養盤之底部。圖3比較來自#4組之附著細胞(其表現四種山中因子)與來自#3組之T細胞(其不表現山中因子；而是表現GFP)之外觀。該附著之細胞顯示出形成群落且較#3組中之T細胞大。此表明源自T細胞之附著型細胞正在失去T細胞特性。該來自#4組之源自T細胞的附著型細胞亦較標準之經活化的T細胞大(圖3D)。圖3A至3F細胞群顯示在如下述之各種條件下培養的T細胞：3A、3C、3E：來自#4組之經附著的群落；3B：來自#3組之細胞；3D：在標準T細胞活化條件下培養之T細胞；3F：標準iPS細胞群落。從圖3可明顯看出，該經部分重編程之細胞顯示出不同的形態。此外，流式細胞術分析顯示#2、#3和#4組細胞中之CD3標記表現減少，所有這些細胞從第1天起都在不含IL2之幹細胞培養基中。參見，例如圖4。CD3為淋巴細胞中T細胞特性的重要標記。#4組之源自T細胞的附著型細胞顯著減少。此亦表明#4組中之附著的細胞正失去T細胞特性。值得注意的是，此與其他組之工作有所不同，其他組之工作顯示山中因子之短暫表現不會干擾細胞命運，但仍然可以逆轉老化並增進某些細胞類型之功效。參見，例如Sarkar et al., 2020, Nat Commun 11, 1545。基於肌源性標記MyoD表現在短暫重編程後不會改變的結果，Sarkar及其同事證明“短暫重編程不會干擾肌源性命運，但可增強肌源性潛力”。此處，T細胞特性被至少部分轉形。此外，如FSC/SSC FACS分析所示，#4組之附著的細胞稍大，結構更複雜(參見圖5和圖6)。 實施例 2 ：經部分重編程之 T 細胞的再活化
接著，於第5天使用在T細胞培養基中1比100稀釋之T細胞TRANSACTTM(Miltenyi Biotec)將96孔盤中之經部分重編程的T細胞再活化2天。第5天將在#4組條件下之細胞分入二個孔中--將漂浮之細胞轉移入一個孔中，將該在暴露於重編程條件後附著之細胞從容器表面脫附，洗滌之並將其轉移入另一個孔中。大量來自#3組的細胞死亡，可能是由於仙台病毒的毒性。假設#4組中表現之山中因子能夠從仙台病毒毒性中拯救細胞。活化後，將所有細胞在T細胞培養基中再培養5天。如圖5所示，在重編程第5天，失去CD3和CD8表現的細胞在第12天重新獲得這些基因之表現。參見，例如圖7。
除了於第12天恢復CD3表現外，再活化之T細胞顯示CCR7和CD62L，T細胞歸巢標記(其表明為初始T細胞群)之表現。參見，例如圖8。
為了評估T細胞擴增，於第0、5和12天藉由使用流式細胞術計算珠粒(123count eBeads Counting beads，Thermo)來計算細胞數量。雖然#4組中之附著的細胞於第5天顯示出異常外觀及降低之CD3表現，但在活化後，它們顯示出強勁之細胞擴增。如圖9中所示，第12天之細胞數量相對於第5天的倍數變化證明與#1組相比較，來自#4組之細胞擴增增加。此表明本文描述之經部分重編程方法增加T細胞擴增潛力，尤其是在附著之細胞中。
於類似之實驗中，依上述使用TRANSACT刺激源自PBMC之CD8 T細胞1天。第二天，亦依上述，藉由仙台病毒轉導將重編程因子(山中因子+SV40)引入T細胞中。在第1天將經感染之T細胞轉移至經iMatrix塗層之培養皿上，並在(a)T細胞培養基+60 IU/ml IL2或(b)具有60 IU/ml IL2iPS細胞培養基中培養3天，然後從第4天開始改為不含IL2之iPS細胞培養基。第8天，收獲漂浮和附著之細胞以用於流式細胞術分析。特別是，為了更精確地監測T細胞重編程，分析SSEA4和CD3表現。SSEA4為碳水化合物表位，其被視為從經部分重編程之體細胞到多潛能幹細胞均表現的廣範圍幹細胞標記。值得注意的是，在條件(a)下未檢測到附著之群落，此表明培養條件可對T細胞重編程產生影響。如圖10所示，在第8天，FACS分析顯示出71.9%之附著的細胞為CD3和SSEA4陽性，此表明該附著之細胞表現T細胞譜系標記以及幹細胞標記兩者。細胞群被觀察到SSEA4高且CD3陰性。與附著之細胞相比較，條件(b)中很少漂浮細胞表現SSEA4，且未觀察到SSEA4高之CD3群。如所預期者，在培養條件(a)(標準T細胞培養條件)之後未發現SSEA4+細胞。該數據強烈表明形成附著之群落的經部分重編程T細胞(源自T細胞之附著型細胞)為去分化的(即，部分去分化)並表現SSEA4。我們的觀察結果與之前使用纖維母細胞重編程成iPS細胞的報告一致(參見，例如Biol Open. 2017 Jan 15;6(1):100-108)。 實施例 3 ：測量表觀遺傳年齡
Horvath及其同事已證明細胞之“表觀遺傳年齡”(eAge)可使用分析細胞基因組中各種不同DNA CpG位點的甲基化狀態的方法來估計。(Horvath et al., Aging, 10(7):1758-1775)。在本實例中，使用Horvath及其同事描述之技術來計算T細胞在經部分重編程之前和之後的eAge。在經部分重編程之前，如實施例1和2中所描述和表1中概述之所有實驗組的eAge估計為21.5歲，此與該供體之實際(實際)年齡相符。在重編程和隨後之T細胞活化後，#1組細胞之計算的eAge為20.8歲，而來自#4組之附著的細胞之計算的eAge為10.0歲(注意在部分重編程過程期間，附著在容器表面之細胞在活化時或活化後不久從表面脫離。該等細胞被稱為“脫附的”細胞，以將它們與漂浮細胞區別。此表明該部分重編程過程導致來自測量之eAge為21.5歲的細胞回春至eAge為約10歲。#4組中之漂浮細胞的計算eAge為14.5歲，#2組中之T細胞的計算eAge亦為14.6歲，儘管未使用該四種山中因子進行轉導。此表明幹細胞培養基本身(StemFit，味之素)含有可提供某些使細胞回春之潛力的成分，儘管其成分不為公眾所知。結果總結於下列表3中。
Figure 02_image005
實施例 4 ：部分重編程第 10 天後導致非常規 T 細胞產生
於本實施例中，研究第二次刺激(再活化)之時間點範圍。該實驗概述於下列表4中。依下述轉導仙台病毒：KOS 10MOI、KLF4 10MOI、cMyc 3MOI、SV40 5MOI並在含有60 IU/ml IL2之TCM中進行。該重編程培養條件為在含有60 IU/ml IL2之50/50 TCM/iPS培養基(Stemfit)中3天，然後在不含IL2之Stemfit中培養直到第二次活化。在指定之期間重編程後，收集漂浮之細胞和附著之細胞。然後使用在TCM+60 IU/ml IL2中1:100稀釋之TRANSACT活化細胞。在第二次刺激後7天再藉由流式細胞術分析細胞之下列標記的表現：CD3、CD4、CD8α、CD8 β。圖11為總結源自PBMC之CD8 T細胞之過程的示意圖(亦參見表4)。
Figure 02_image007
一般而言，常規細胞毒性T細胞表現CD8⍺-CD8 β異二聚體。非常規T細胞，例如上皮內淋巴細胞(IEL)和γdeltT細胞表現CD8⍺⍺同二聚體。因此，本實驗中，使用FACS來測定使用部分回春過程產生之T細胞是否能夠表現典型的CD8 T細胞標記。刺激後缺乏CD8⍺ β表現可能表明經部分回春的T細胞不是常規的細胞毒性T細胞。
如圖12A和圖12B所示，於第6至10天使用TCM再活化之源自T細胞的附著型細胞群落表現CD8⍺和CD8 β，表明恢復成正常的CD8 T細胞表型。延遲到目前之重編程方法的第10天後再活化以將經去分化的T細胞回復成T細胞表型可導致CD4-CD8-群增加(參見圖12A，第10天之上圖和下圖，其中CD8⍺表現向左側偏移(較低之MFI)。如上文所指出，CD8α陰性細胞不是成熟的T細胞。第10天之後，當對CD8⍺陽性群圈選時，觀察到更多的CD8 β陰性細胞(CD8⍺⍺+非常規之T細胞)(參見圖12B，第13天FACS圖)。 實施例 5 ：經回春之經 NY-ESO-1 TCR 轉導的 T 細胞之細胞介素製造分析和去顆粒化分析證明 T 細胞功能性。
為了測試經部分重編程之T細胞是否保留抗原特異性，將經遺傳修飾以表現NY-ESO-1特異性TCR之CD8+ T細胞進行部分重編程，使用T細胞活化分子刺激，並測量對使用NY-ESO-1肽脈衝之標靶細胞的反應。
自Allcells(加州Alameda)購買來自42歲男性之源自外周血的CD8+ T細胞。依實施例4中之描述，將細胞解凍並使用在含有IL-2(60 IU/ml)之TCM中的TRANSACT(1/100)刺激之。第二天，依下述使用NY-ESO-1 TCR，藉由慢病毒載體來轉導T細胞：
在慢病毒轉導方面，使用1：100稀釋之T細胞TRANSACT(Miltenyi)刺激T細胞30小時。然後將病毒加入T細胞中24小時。然後藉由添加7體積之不含TRANSACT的新鮮培養基來終止刺激和病毒感染，並將細胞在Grex-24盤(Wilson Wolf)中再培養7天，再以3x107個細胞/ml在CryoStor CS10(STEMCELL Technologies)中進行冷凍保存(亦參見Robbins 2008 J Immunol, 180(9) 6116-6131)。對照T細胞未經類似方式轉導和刺激。
在部分重編程和再活化方面，將NY-ESO-1特異性T細胞解凍並使用在含有IL-2(60 IU/ml)之TCM中稀釋的TRANSACT(1/100)刺激之。第2天，使用含有四種山中因子(KOSM MOI=10)和SV40大T抗原(MOI=3)之仙台病毒感染T細胞。然後在第9天使用TRANSACT刺激細胞以獲得如上述經回春的NY-ESO-1特異性T細胞(第二次刺激)。在功能分析方面，在第16天(第三次刺激)再次使用TRANSACT再次刺激該經回春的NY-ESO-1特異性T細胞以擴增它們(參見圖13)。
在第26天依下述進行細胞介素產製和去顆粒化分析。將對照之未經轉導的T細胞和經NY-ESO-1特異性TCR轉導的T細胞解凍並使用在含有IL-2(60 IU/ml)之TCM中的TRANSACT(1/500)刺激一週以擴增之。將非經轉導之T細胞、經NY-ESO-1特異性TCR轉導之T細胞和回春的NY-ESO-1特異性TCR T細胞與效應細胞進行比較。將標靶細胞T2培養在T2培養基(RPMI、20% FCS和P/SM)中。將T2細胞在有或沒有NY-ESO-1肽(SLLMWITQC)(10nM)下預培養1小時、洗滌並計數。一個孔含有5x104個效應細胞和1x105個標靶細胞(E：T比為2：1)。根據製造商之說明添加PMA/離子黴素(由Biolegend製造之Cell Activation Cocktail)以作為陽性對照組。根據製造商之說明添加GolgiPlug和GolgiStop(BD Biosciences)。此外，在培養基中添加抗-CD107a Ab-BV421(1ul/孔)。將細胞在不含細胞介素之TCM中培養6小時。然後對共同培養之細胞進行表面抗原染色(PE-NY-ESO-1四聚體、BUV395-CD8、BUV496-CD4和BUV805-CD3)。亦添加Live/dead eFluor 780以排除死細胞。20分鐘後洗滌細胞。根據製造商之說明，藉由BD cytofix/cytoperm套組將細胞固定和可滲透化。然後將細胞染色以表現細胞內細胞介素(FITC-IFNg、APC-IL-2和BV785-TNFa)。培育30分鐘後，將細胞洗滌二次並使用ZE5儀器，藉由流式細胞術進行分析。藉由FlowJo軟體分析FACS結果。使用單細胞＞活細胞＞CD3+＞CD8+CD4-＞NY-ESO-1四聚體+細胞對NY-ESO-1 Tg T細胞圈選，並使用單細胞＞活細胞＞CD3+＞CD8+CD4-＞NY-ESO-1四聚體-細胞對模擬對照T細胞圈選。依圖14所示，計算IFNg+、TNFa+、IL-2+和CD107a+之頻率。結果表明該經回春之經NY-ESO-1+轉導的T細胞保留功能且為抗原特異性的。 實施例 6 ： T 細胞、 iPS 和經部分重編程之 T 細胞的表面蛋白質剖析
於本實施例中，剖析活化之T細胞、未受刺激之T細胞、iPS細胞和第5天附著之經部分重編程的T細胞(源自T細胞之附著型細胞)的細胞表面蛋白質。篩選之目的為鑑別表現在經部分重編程之細胞中的標記，該等標記可用於鑑別中間細胞及表徵部分重編程過程和使用該方法製造的細胞。
依前述製備T細胞培養基(TCM)。在初步篩選方面，將CD4+和CD8+ T細胞(來自Allcells之細胞ID 3046087I&K)解凍。使用100ng/ml抗CD3和2 ug/ml抗CD28(來自加州聖地牙哥BioLegend之抗人CD3 OKT3和CD28 CD28.2抗體)，加60IU IL-2刺激T細胞三天。將源自臍帶血之iPS細胞株NL5GFP和源自腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之iPS細胞株hi4095#8培養在Stemfit中並收穫之。使用BioLegend LEGENDScreen(加州聖地牙哥BioLegend)加抗CD8、CD4、CD3、SSEA4、Live/Dead對T細胞和iPS細胞進行染色，並使用流式細胞術測定371個標記之表現水準。
初步篩選之結果鑑定出如下文中所列之39個候選標記，根據其在T細胞和iPS細胞中之表現水準進行選擇。選擇在受刺激或未受刺激的T細胞中顯示出相對於iPS細胞而言明顯較高水準的標記，或顯示出在iPS細胞和T-iPS細胞之間具有不同表現模式的標記。這些標記及其在受刺激或未受刺激之T細胞中相對於iPS細胞的相對表現水準的排序總結於下列表5中。該數據亦以瀑布圖之圖式方式顯示於圖15(受刺激之T細胞相對於NL5iPS細胞)和圖16(未受刺激之T細胞相對於T-iPS細胞)中。
Figure 02_image009
Figure 02_image011
於第二次篩選中，將CD4+和CD8+ T細胞(來自Allcells，細胞ID 3046087I&K)解凍並使用100 ng/ml抗CD3和2 ug/ml抗CD28，加60IU IL-2刺激之。三天後，依先前實施例中之描述，使用10 MOI KOS 仙台載體、10 MOI之KLF4載體、3 MOI之cMyc載體和5 MOI之SV40載體轉導T細胞。5天後，依上述用於表面表現於第一次篩選中鑑定之標記的描述來收穫並篩選附著之細胞。使用未受刺激之T細胞、受刺激之T細胞、NL5 iPS細胞和hi4095 iPS細胞作為對照組。
與受刺激和未受刺激之T細胞相比較，經部分重編程之附著型細胞中之CD164、CD9、CD63、CD90、CD71、CD326、TRA-1-81的表現和TRA-1-60-R表現在第5天發現增加，而CD352和CD31則下調。如圖17所示，此第二次篩選將CD9和CD90鑑定為部分重編程期間早期轉變的可能指標，而在第5天，已知之iPS細胞標記SSEA3和SSEA4之表現水準沒有顯著變化。CD9亦稱為四跨膜蛋白-29且具有四個跨膜結構域。其參與細胞黏附、信號轉導和細胞分化。CD90亦稱為THY-1。其為免疫球蛋白超家族表面糖蛋白且為與間質幹細胞相關的標記。其亦參與細胞黏附和通訊。因此，這二個標記之表現可解釋在去分化之T細胞中獲得之附著性能。這二個標記之表現亦表明經部分重編程之T細胞正在去分化為未知類型的細胞，據本發明者所知，該細胞尚未被鑑別為對應於T細胞譜系的分化細胞階段。 實施例 7 ：刺激信號傳導對於回春的 T 細胞之生存和增殖至關重要
為了測定刺激信號傳導對增強之存活和增殖是否至關重要，以不同濃度之TRANSACTTM(Miltenyi Biotec)活化T細胞附著型細胞。
首先，使用實施例1中描述之方法使T細胞經部分重編程。簡單地說，使用在具有60 IU/ml IL2之T細胞培養基中的可溶性CD3和CD28 TRANSACTTM(Miltenyi Biotec)刺激CD8陽性T細胞3天。3天後，使用10 MOI KOS仙台載體、10 MOI之KLF4載體、3 MOI cMyc載體和5 MOI之SV40載體轉導T細胞。從第1天開始將細胞培養在不含IL2之SCM中，並以每孔80,000個細胞之密度平皿接種在經iMatrix-511塗層的24孔盤中，一式四份。
第7天，將附著型細胞從容器表面剝離，洗滌並轉移至另一個孔中。然後使用以1：500或1:1000稀釋之T細胞TRANSACTTM(Miltenyi Biotec)濃度將源自T細胞之附著型細胞再活化，或者在沒有在任何刺激培養基中培育。活化後，將所有細胞在T細胞培養基(TCM加60 IU/ml之IL2)中再培養9天。如圖18A所示，源自T細胞之附著型細胞已大量喪失CD3和CD8a之表現。然而，到第22天，使用任一濃度之TRANSACT活化的細胞中有93%至94%已重新獲得常規T細胞標記CD3和CD8a之表現，而培養在無TRANSACT之僅TCM中的細胞中只有8.4%表現CD3和CD8a。此外，如圖18C和18D所示，當與在不含TRANSACTTM之T細胞培養基中培養的經部分重編程之T細胞相比較時，該等經活化之T細胞顯示出明顯較強之存活和增殖能力。 實施例 8 ：在 IL-2 之存在下，經回春的 T 細胞在長期擴增後顯示出效應表型
本實例中，檢查來自不同供體之經回春的T細胞隨著時間推移之存活和增殖能力。自加州Alameda之Allcells購買來自三名供體(一名42歲男性、一名37歲女性和一名52歲男性)的外周血來源之CD8+ T細胞。將細胞解凍並使用在含有IL-2(60 IU/ml)之TCM中之濃度為1：500的TRANSACTTM(Miltenyi Biotec)刺激之。
第2天，使用含有四種山中因子(KOSM MOI=10)和SV40大T抗原(MOI=3)的仙台病毒感染T細胞。然後在第9天使用TRANSACTTM(1：500)刺激該細胞。第9天(“對照組1”)，將來自每名供體之額外CD8+ T細胞等分解凍並使用在含有IL-2(60 IU/ml)之TCM中的TRANSACTTM (1：500)刺激之，或在第0天，將細胞解凍並使用在含有IL-2(60 IU/ml)之TCM中的TRANSACTTM(1：500)刺激之，並培養在含有IL-2(60 IU/mL)之TCM中(“對照組2”)。第9天，使用TRANSACTTM(1：500)刺激對照組2細胞。令經回春的T細胞在生物體外增殖42天。在生物體外擴增約3週後，未經回春的T細胞之擴增趨於穩定。參見圖19A。培養中之經回春的T細胞持續顯示出顯著擴增長達42天。參見圖19B。此種擴增為細胞介素依賴性，而經回春的T細胞在停用IL-2的6天內開始死亡。參見圖20B和20C。
第36天依下述製造細胞介素和進行去顆粒化分析。將細胞培養在不含細胞介素，有或無PMA/離子黴素的TCM(Biolegend之細胞活化混合物)中。亦根據製造商之說明添加GolgiPlug和GolgiStop(BD Biosciences)。然後對共同培養之細胞進行表面抗原染色(BUV395-CD8、BUV496-CD4和BUV805-CD3)。亦添加Live/dead eFluor 780以排除死細胞。20分鐘後洗滌細胞。根據製造商之說明，藉由BD cytofix/cytoperm套組固定細胞並使細胞可滲透化。然後對細胞進行細胞內細胞介素表現(FITC-IFNg和APC-IL-2)染色。培育30分鐘後，將細胞洗滌二次並使用ZE5儀器，藉由流式細胞術進行分析。藉由FlowJo軟體分析FACS結果。使用單細胞＞活細胞＞CD3+＞CD8+CD4-細胞對所有細胞圈選。依圖21所示計算IFNg+和IL-2+之頻率。結果表明經回春的T細胞保留功能性。通常，效應T細胞表現IFNg但不表現大量IL2。因此，這些結果表明回春的細胞在培養36天後仍未達到完全效應表型。
在第7天和第26天藉由流式細胞術測量CD3、CD8b、CD45RA、CCR7和CD62L之細胞表面表現。參見圖22和23。經歷重編程之脫附的T細胞顯示CD3+CD8b+表現減少，但CD45RA和CCR7+CD62L+表現水準升高。到第26天，經回春的T細胞顯示出正常之CD3+CD8b+表現水準，及降低之CD45RA+細胞和CCR7+CD62L+細胞水準。參見圖22和23。
綜合來說，這些數據表明(圖19至23)在生物體外長期培養後，該經回春的細胞具有高增殖能力且為多功能的。該經回春的細胞持續表現IL2，此為幹性(stemness，幹細胞特性)指示，但具有由細胞表面標記所顯示之效應細胞表型。因此，儘管經過長期培養和擴增，該經回春的細胞似乎仍具有幹性性能。 實施例9：經回春的經NY-ESO-1 TCR轉導之T細胞識別表現NY-ESO-1的腫瘤細胞
為了測試經回春的T細胞是否保留對腫瘤細胞之抗原特異性，將經遺傳工程修飾以表現NY-ESO-1特異性TCR之CD8+ T細胞部分重編程，使用T細胞活化分子刺激之，並測量對使用NY-ESO-1肽脈衝之標靶細胞的反應。
自Allcells(加州Alameda)購買源自外周血之CD8+ T細胞的二種不同供體(#3 42歲男性和#4 37歲女性)。依實施例4之描述，將2x106個細胞解凍並使用在含有IL-2 (60 IU/mL)之TCM中的TRANSACTTM(1:100)刺激各供體在24孔盤中的1個孔。第二天，依下述，使用NY-ESO-1 TCR轉導，藉由慢病毒載體轉導T細胞：首先，使用以1：100稀釋之T細胞TRANSACT(Miltenyi)刺激T細胞30小時。然後，將病毒(MOI: 5)和LentiBOOSTTM A & B(Sirion Biotech)加入T細胞24小時。然後，藉由添加7 ml含有IL-2 (60 IU/L)之TCM來終止刺激和病毒感染。第2天，使用含有四種山中因子(KOS 10MOI、KLF 10MOI、cMyc 3MOI、SV40 5MOI)和SV40大T抗原(MOI=3)的仙台病毒感染T細胞。將對照細胞保持培養在含有IL-2(60 IU/mL)之TCM中。
16小時後，清洗該經感染之T細胞並在第1天轉移至經iMatrix塗層的培養皿上，將培養基更換為Stemfit w/o IL-2(2 mL/孔)。樣本#3密度為2.6x105個細胞/孔且#4密度為1.76x105個細胞/孔，一式三份。第3天，添加Stemfit(2 mL/孔，總共4 mL)。
第5天，根據下列方案去除漂浮的細胞並收穫附著的細胞。吸出培養基並使用每孔2 mL PBS洗滌二次。加入1 mL EDTA，並將混合物在37℃下培育5分鐘。藉由P1000移液收集細胞，#3的3個孔中之最終密度為6.1x105，而#4的1個孔中之最終密度為1.9x106。這導致96孔U形底微孔盤中為約2x105個細胞/孔。然後，使用在含有IL-2(60 IU/mL)之TCM中之1：500的TRANSACT活化細胞。以相同方式重新刺激對照之非經仙台病毒感染的NY-ESO-1 Tg細胞。
第6天，細胞密度太高，因此將它們在96孔微孔盤中的二個孔中。添加含有IL-2(60 IU/mL)的TCM。第8天，將96孔微孔盤的二個孔中之細胞合併入48孔盤的一個孔中，並加入含有IL-2(60 IU/mL)的TCM。第12天，將細胞轉移到24孔盤中，使細胞密度為2x106個細胞/孔。將含有IL-2 (60 IU/mL)的TCM加入每個孔中。每三到四天，計算細胞並計算倍數變化。參見圖24。將細胞數調整為~2x106個細胞/孔並加入含有IL-2(60 IU/mL)之TCM，使體積為2 mL/孔。
第19天(第二次刺激後第14天)，將標靶細胞，T2和表現內源性NYESO1的Mel624 HLA-A*02:01陽性腫瘤細胞培養在T2培養基(RPMI、20% FCS和P/SM)中。將T2細胞與或不與NY-ESO-1肽(SLLMWITOC)(10 nM)預培養1小時，洗滌並計數。一個孔含有5x104個效應細胞和1x105個標靶細胞(E:T比為1:2)。根據製造商之說明添加PMA/離子黴素(Biolegend的Cell Activation Cocktail)來作為陽性對照組。根據製造商之說明添加GolgiPlug和GolgiStop(BD Biosciences)。此外，在培養基中添加抗CD107a Ab-BV421(1 µL/孔)。將細胞在不含細胞介素之TCM中培養6小時。然後對共同培養之細胞進行表面抗原染色(PE-NY-ESO-1四聚體、BUV395-CD8、BUV496-CD4和BUV805-CD3)。亦添加Live/dead eFluor 780以排除死細胞。20分鐘後，洗滌細胞。根據製造商之說明，藉由BD cytofix/cytoperm套組固定細胞和使細胞可滲透化。然後對細胞進行細胞內細胞介素表現(FITC-IFNg、APC-IL-2和BV785-TNFa)染色。培育30分鐘後，將細胞洗滌二次並使用ZE5儀器，藉由流式細胞術分析CD45RA、CD45RO、CCR7和CD62L的細胞表面標記表現。藉由FlowJo軟體分析FACS結果。使用單細胞＞活細胞＞CD3+＞CD8+CD4-＞NY-ESO-1四聚體+細胞對NY-ESO-1 Tg T細胞圈選，並使用單細胞＞活細胞＞CD3+＞CD8+CD4-＞NY-ESO-1四聚體-細胞對模擬對照T細胞圈選，圖25。依圖26A至26D所示，計算IFNg+、TNFa+、IL-2+和CD107a+之頻率。該實驗證實經回春的NYESO1 T細胞為抗原特異性且識別NYESO1陽性T2和Mel624標靶細胞(圖24至26)(亦參見圖14)。這些數據亦證實該經回春的細胞持續表現IL2(此為幹性之指示)，但具有如細胞表面標記所顯示之效應細胞表型。 實施例 10 ：使用抗原特異性刺激使經 NY-ESO-1 TCR 轉導之 T 細胞回春
為了測試抗原特異性T細胞是否能夠使用抗原特異性刺激回春，從一或多個經遺傳工程修飾以表現NY-ESO-1特異性TCR的供體中分離出CD8+ T細胞。將供體細胞解凍並使用在含有IL-2(60 IU/mL)之TCM中的TRANSACTTM刺激各供體在24孔盤中的1個孔。一天後，使用表現NY-ESO-1 T細胞受體之慢病毒轉導T細胞。然後，將NY-ESO-1特異性T細胞與T2細胞共同培養，該T2細胞已使用NY-ESO-1肽脈衝(T2+NY-ESO-1細胞)。接下來，對細胞進行NY-ESO-1特異性T細胞富集(第1組)，或保持為NY-ESO-1特異性T細胞和未經轉導之T細胞的異質混合物(第2組)。在重編程期間，將細胞再次與T2+NY-ESO-1細胞共同培養。接著，使用含有四種山中因子(KOS 10MOI、KLF 10MOI、cMyc 3MOI、SV40 5MOI)和SV40大T抗原(MOI=3)的仙台病毒感染T細胞。將對照細胞與T2+NY-ESO-1細胞共同培養在含有IL-2(60 IU/mL)之TCM中。
在無任何進一步刺激之情況下，NY-ESO-1特異性T細胞能夠在T2+NY-ESO-1細胞之存在下形成源自T細胞之附著型細胞。根據實施例9中描述之方案收穫附著之細胞，然後藉由與T2+NY-ESO-1細胞共同培養再次活化之。 實施例 11 ：腫瘤浸潤淋巴細胞中之回春增強的 T 細胞幹性性能
在本實施例中，從66歲之供體中分離出腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，並依下述回春。藉由將腫瘤片段培養在T細胞培養基中2週來富集TIL。透過與源自該腫瘤之自體抗原呈遞細胞共同培養隔夜來活化T細胞。然後將T細胞進行FACS分選並將CD137(4-1BB)陽性細胞分離出。一天後(第0天)，或是不干擾細胞，或是依前述使用表現KOS(KLF4、OCT3/4、SOX2)、KLF4、cMyc和SV40的四種仙台病毒來轉導細胞。然後將細胞轉移至幹細胞培養基(StemFit)中並培養7天。在第7天，收穫源自T細胞之附著型細胞，並使用在T細胞培養基中之TransAct(1：500)再另外活化二天。從第9天起，將細胞培養在正常T細胞培養基中。第21天，使用流式細胞術未評估經回春的細胞或對照細胞(其經歷相同的程序，除了未使用四種仙台病毒轉導之細胞外)之CD62L、CCR7和TCF7表現。相對於未經回春的對照細胞，經回春的TIL表現出增強之增殖(圖27A)和增強之幹性表型標記的表現(圖27B)。本實驗中，73.0%之經回春的TIL共同表現CCR7和CD62L，而64.5%之經回春的TIL共同表現CCR7和TCF7，明顯高於未經回春的TIL群，該未經回春的TIL群顯示出僅2.94%共同表現CCR和CD62L，及3.07%共同表現CCR7和TCF7。這些數據表明TIL(其通常以低增殖能力和表型標誌衰竭來表徵)可被成功回春，以允許增強之增殖和幹性。 實施例 12 ： T 細胞回春過程期間之表觀遺傳時鐘的動態分析
本實施例中，使用在含有60 IU/mL之IL-2的T細胞培養基(TCM)中的人類T細胞TransAct®(Miltenyi Biotec)(1：500稀釋)刺激在48孔盤中之來自53歲男性、55歲男性和50歲男性的CD8+ T細胞，細胞密度為100萬個細胞/ml。下文中描述之所有TCM均含有60 IU/ml IL-2。活化26.5h後，將細胞分成二組。一組接受回春方案；另一組作為對照組，不進行任何病毒操作且在全部過程中培養在TCM中。
以10 MOI之KLF4-OCT3/4-SOX2、10 MOI之KLF4、3 MOI之cMyc和5 MOI之SV40將含有山中因子和SV40之仙台病毒(SeV)轉導入該回春樣本(第0天)，然後培養在37℃下。16.5小時後，使用幹細胞培養基洗滌細胞並懸浮之。以50,000個細胞/孔(對應於第0天之50,000的計數)將細胞平皿接種在經iMatrix-511塗層之24孔盤上，並在37℃下培養(第1天)。在第3天和第5天添加500 ul之SCM。
第7天，將1 ml TrypLE Express(Thermo目錄編號12604013)加入細胞中並將細胞在37℃下培育10分鐘以使該附著型細胞脫附。然後藉由移液收穫該脫附的細胞。亦保留上清液中之漂浮細胞並與該脫附的細胞混合。保存一部分細胞用於DNA以測定eAge。使用在500 ul之TCM中之1：500稀釋的人T細胞TransAct來活化48孔盤中之各為50萬個細胞的對照和經回春樣本，密度為100萬個細胞/ml。第9天，將細胞轉移到12孔盤中，並在每個孔中加入1 ml TCM。第11天，將細胞轉移入6孔盤中。然後將細胞培養在6孔盤中。
在預活化步驟之前收集細胞樣本以用於SeV轉導，及在第7、13和18天收集細胞樣本以用於表觀遺傳時鐘分析。將來自各時間點之細胞沉澱成小丸並保持在攝氏-20度，直到萃取DNA。使用PureLink Genomic DNA迷你套組(Invitrogen，K182002)從冷凍細胞沉澱小丸中萃取DNA。將各萃取之DNA分裝入3個試管中以用於甲基化體(methylome)分析之技術性重複。由於缺乏足夠之DNA，供體1在第18天和供體3在第7天和第18天的對照條件下僅包含2個技術性重複。製備樣本以藉由Illumina Infinium陣列進行表觀遺傳分析。依(Horvath et al., 2018, Aging 10, 1758-1775；Horvath and Raj, 2018, Nature Reviews Genetics, 19:371-375)中之描述，使用霍瓦斯方法分析CpG甲基化狀態數據以獲得皮膚和血液時鐘值。
使用螢光結合之抗體和活力染料對細胞染色，藉由在Cytek Aurora中進行流式細胞術獲得細胞表型。
根據圖28中描述之回春方案，使用山中因子和SV40將來自三位男性供體(年齡53、55和50歲)的CD8陽性T細胞進行轉導，並與在每個時間點均處於非轉導狀態的對照組相比較。經回春的細胞在第7天顯示出CD3和CD8b表現降低。將它們分離和刺激之後，該經回春的細胞中之T細胞常規標記表現在第13天和18天完全恢復(圖29A和29B)。因此，經部分重編程之細胞在再活化後僅6天就重新獲得常規T細胞標記的表現。
在3名男性供體的DNA樣本中執行皮膚和血液表觀遺傳時鐘(一種高度準確之年齡估計器)並分析之以在回春方案之4個時間點檢查表觀遺傳年齡(eAGE)(圖30A至30C)。
在Sev轉導活化前，供體1(其實際年齡為53歲)之eAge顯示為45.1歲。雖然在TransAct活化後該未經回春之對照細胞中的eAge未顯示出變化，[範圍從43.3至45.7歲(差異2.4歲)]，經仙台病毒轉導之細胞(回春的細胞)的eAge在第7天顯示出最年輕的年齡，30.9歲，其逐漸增加並在第18天達到46.2歲。第7天時對照和經回春的eAGE之間的差異為12.9歲。藉由霍瓦斯時鐘分析測量時年齡減少約24.3%。
供體2(其實際年齡為55歲)之對照細胞的eAge係在43.8至50.0歲之範圍內(差異6.2歲)。同樣地，最年輕的年齡34.4歲係在回春第7天獲得(較第7天之對照eAGE年輕12.9歲)。與供體1的結果一致，eAge逐漸增加。
供體3之實際年齡為50歲。未經回春的對照細胞中之eAge在46.0至51.4歲之間變化(差異5.4歲)，而經回春的細胞在第7天的最年輕之年齡為31.5歲，較第7天之對照eAge年輕19.9歲。總之，在所有三名供體中，該經回春的細胞於第7天顯示出最年輕的eAge，然後eAge逐漸增加。供體1經回春的細胞之eAge在第18天達到對照水準，而在其他二名供體的情況中，經回春的細胞持續較對照組年輕。
由上述結果證明，當在脫附日(即，第7天)測量時，該經部分重編程的T細胞失去常見的T細胞標記(例如CD3和CD8b)。然而，在第7天重新刺激並在T細胞培養基中培養後，該T細胞附著型細胞在第13天前或在第13天完全重新獲得T細胞標記。該表觀遺傳時鐘顯示測試之三名供體在第7天的表觀遺傳年齡最年輕(分別為50、53和55歲)。本實施例之結果表明：雖然在第7天後觀察到eAge逐漸增加，但在第13天當該經回春的細胞顯示完整之T細胞表型時，該經回春的細胞仍然較對照組年輕。 實施例 13 ：經 NY-ESO-1 轉導之 T 細胞的回春
本實施例證明T細胞可經遺傳工程修飾以表現特異於合需標靶(例如NYESO1)之TCR並使用本文之方法回春。
健康供體CD4/CD8 T細胞活化：在第1天，將來自二名男性供體(24歲和35歲)的健康人類供體CD4和CD8 T細胞解凍、洗滌一次並重新懸浮在預先溫熱之完全TCM+IL-2(60 IU/ml)中(第-3天)。將細胞稀釋成2e6個細胞/ml。添加10 ul/ml(1/100稀釋)之Transact以刺激CD4和CD8 T細胞(參見圖31)。第2天，計算受刺激之CD8+和CD4+T細胞並將7.5e+5個細胞懸浮在0.75 ml之TCM+IL-2中。使用標準方案製造編碼NYESO1特異性TCR之慢病毒載體。添加編碼NYESO1之慢病毒的上清液(7.5 ul，MOI；10)和LentiBoost A&B(各7.5 ul)。第二天，加入5.25ml之新的TCM+IL-2(共6 ml)。
將NY-ESO-1轉基因(Tg)T細胞重編程並收集之：第0天，收集4e+5個細胞，重新懸浮於48孔盤中之TCM+IL-2中。使用Cytotune®仙台重編程套組來進行重編程(KOS：MOI=10，KLF4：MOI=10，C-MYC：MOI=3及SV40：MOI=5)。隔天(即，第1天)，收集細胞，重新懸浮在幹細胞培養基中並接種在經iMatrix塗層的6孔盤中(每種條件二個孔)。第3天，添加新的幹細胞培養基並在第5天使用新的幹細胞培養基更新一半的培養基。將對照細胞培養在TCM+IL-2中。第7天，收集漂浮的細胞，使用PBS洗滌孔，加入TrypLE，使附著之細胞脫附。計算所有收集之細胞(即，漂浮細胞+脫附的細胞)的細胞數。使用在500 ul TCM+IL2中之Transact(1/500稀釋)重新刺激脫附之細胞(在48孔盤中)。在第11天收集細胞，重新懸浮於1 ml之新的TCM+IL-2中並轉移至6孔盤中。每3至4天進行一次細胞計數和培養基更換。第13天，使用CD3、CD62L、CD45RO、HLA-A02:01 NYESO1 MHC 四聚體、Cd197、CD4、CD8a、CD45RA之抗體對1/20之細胞進行表面表現染色，並按照製造商之方案的描述使用Foxp3染色套組對TCF1進行細胞內染色、固定及可滲透化，使用Tcf7抗體染色並藉由FACS分析。參見，例如圖32A和32B。按照說明使用PureLink Genomic DNA迷你套組從每個條件下之1e+6個細胞中萃取基因組DNA。如前述，使用RNAse處理DNA並評估表觀遺傳年齡分析。
將T2細胞之原液瓶解凍並洗滌一次，然後在完整RP10培養基中培養一週。將5e+6個細胞在5%CO2培養箱中重新懸浮在含有或不含有10nM NY-ESO1肽的完整RP10中2小時。2小時後，洗滌細胞並重新懸浮於TCM中。
第19天，分析對照組和經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞在與標靶細胞共同培養時產生細胞介素的能力。將5e+4個T細胞與1e+5個帶有或不帶有NY-ESO-1肽的T2細胞共同培養。加入不含標靶細胞之孔和具有PMA/離子黴素(細胞活化混合物)之孔分別作為陰性和陽性對照組。在培養基中加入CD107a抗體。6小時後，使用表面Ab混合物對共同培養之細胞進行染色，依製造商之方案中的描述藉由BD套組進行固定和可滲透化，使用細胞內Ab混合物染色並藉由FACS(Cytek Aurora)進行分析。使用Flowjo軟體分析數據。門控策略如下：淋巴細胞＞單細胞＞Live/Dead-＞CD3+NY-ESO-1四聚體+。
第19天，使用順序刺激分析對照組和經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞殺死標靶細胞的能力。具體地說，計算對照組和經回春的T細胞。將50,000個NY-ESO-1四聚體+T細胞與20,0000個NY-ESO-1+HLA A02:01+標靶細胞(A375-Nuclight Red(NLR)或H1703-NLR)在24孔盤中，1:4 E:T共同培養。每3至4天，將25%之培養物轉移入新的盤中，其中具有以初始接種密度接種的新鮮標靶細胞。使用Incucyte量化目標清除率。
結果表明經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞具有分化程度較低之表型。特別是，在第13天，經回春的NY-ESO-1 TCR轉導之T細胞(藉由與NY-ESO-1四聚體結合來檢測)含有較高百分比之CCR7+CD62L+群和Tcf1+群，表明分化程度較低之表型。參見，例如圖32A和32B。將對照組和經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞保持培養在TCM+IL-2中一段延長的時間。每3至4天更換一次培養基並將細胞濃度保持在1-2e+6/ml。經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞需要較長的時間才能開始增殖，這可能是由於從重編程過程中恢復。然而，隨著時間推移，它們的增殖較對照組未經回春的細胞多出100倍。參見，例如圖33。依圖34中之描述分析對照組和經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞之表觀遺傳年齡。與對照T細胞相比較，經回春的細胞在第19天顯出年輕約8至18歲的表型。更具體地，在第一供體方面(圖34A)，與對照細胞之eAge相比較，該經回春的CD4 T細胞(源自T細胞之附著型細胞)在第7天的表觀遺傳年齡顯示出年齡減少68%(在第19天之eAge)。第19天，與對照細胞相比較，該經回春的CD4+T細胞顯示出年齡減少33%。第7天，與對照細胞相比較，該經回春的CD8 T細胞顯示出表觀遺傳年齡於減少70%。第19天，與對照細胞相比較，該經回春的CD8 T細胞顯示出年齡減少45%。在第二供體中(圖34B)，與對照細胞相比較，該經回春的CD4 T細胞(源自T細胞之附著型細胞)在第7天顯示出表觀遺傳年齡年齡減少62%。第19天，與對照細胞相比較，該經回春的CD4+ T細胞顯示出年齡減少27%。第7天，與對照細胞相比較，該經回春的CD8 T細胞(源自T細胞之附著型細胞)顯示出表觀遺傳年齡於減少68%。第19天，與對照細胞相比較，該經回春的CD8 T細胞顯示出年齡減少67%。
此外，觀察到經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞在與帶有NY-ESO-1肽之標靶細胞共同培養時製造較多的細胞介素(IL-2、IFNg和TNFa)(圖35)。依上述，藉由將對照細胞和經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞與帶有或不帶有NY-ESO-1肽的T2細胞(HLA A02:01+)共同培養來分析對照細胞和經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞產生細胞介素(IL-2、TNFa、IFNg)的情況。當將對照細胞和經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞與不帶有肽的T2細胞共同培養時兩者均不產生細胞介素。當與帶有NY-ESO-1肽之T2細胞共同培養時，經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞確實製造較高百分比之IL-2、IFNg和TNFα。參見，例如圖35。
一般而言，參見圖31至37。圖31為NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞之回春實驗的示意圖。藉由Transact刺激CD4或CD8 T細胞並在重編程前使用NY-ESO-1 TCR轉導。從第1天到第7天，將細胞培養在iPS細胞培養條件下。在第7天收集、計算細胞數，以Transact再刺激細胞並保持培養在TCM+IL-2中。第19天，分析對照細胞和經回春之細胞的細胞介素產製和細胞毒性活性。在連續滅殺分析的條件下，將經回春之CD4和CD8 T細胞混合以檢查其協同作用。
圖32A和32B說明經回春的NY-ESO-1 Tg CD4(圖32A)和CD8 T細胞(圖32B)顯示出分化程度較低之表型。第13天，藉由FACS分析對照組和經回春的NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞之表面標記和Tcf1細胞內表現。以淋巴細胞＞單細胞＞Live/Dead-＞NY-ESO-1四聚體+對細胞圈選，並繪製為CD4xCD8a、CCR7xCD62L和CCR7xTcf1。
圖33說明回春NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞較對照NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞增殖更多。依描述使NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞回春並培養之，每3至4天計算一次細胞數。圖表描繪重編程因子與其對應之對照細胞在轉導後第7天隨時間之倍數變化的比較。四名不同供體的代表性數據。
圖34說明藉由表觀遺傳年齡分析，經回春的NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞顯示出較對照NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞和供體之實際年齡年輕的表型。圖表顯示從某些CpG位點之甲基化狀態分析之年齡值的平均值和S.D.。
圖35說明當與帶有NY-ESO-1肽之T2細胞共同培養時，回春NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞製造較多之細胞介素(IFNg、IL-2和TNFa)。第19天，在高基氏體轉運蛋白抑制劑之存在下，將對照組或經回春的NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞單獨培養，或與PMA/離子黴素、帶有或不帶有NY-ESO-1肽的T2細胞一起培養。將表面抗原染色後，固定細胞、使細胞可滲透化並藉由細胞內抗體染色。描繪各細胞介素陽性NY-ESO-1四聚體+細胞的頻率。
圖36說明與其對照細胞相比較，在與表現NY-ESO-1的標靶細胞(A375-NLR)重複共同培養後，經回春的NY-ESO-1 Tg CD8 T細胞持續及保持其細胞毒性活性更為長久。將對照細胞或經回春的NY-ESO-1 Tg CD8 T細胞與A375-NLR細胞株共同培養。每3至4天，將25%之先前培養物轉移入具有新鮮標靶細胞之新盤中。使用Incucyte®活細胞分析系統監測標靶細胞之生長，並使用基礎軟體分析模塊(Base Software Analysis Module)進行分析。圖表顯示每個條件下之A375-NLR/圖像的數量。二名不同供體的代表性數據。NLR：Nuclight Red
圖37描述由添加經回春的NY-ESO-1 Tg CD4 T細胞而導致經回春的NY-ESO-1 Tg CD8 T細胞之細胞毒性增強。將經回春的NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞與A375-NLR細胞株以E：T=1：4共同培養。在一種情況下，添加外源性IL-2(10IU/ml)。在另一種情況下，將經回春的CD4和CD8 T細胞以1:1之比例混合，並與A375-NLR細胞株以E：T=1：2共同培養。每3至4天，將25%之先前培養物轉移到具有新鮮標靶細胞之新盤中。使用Incucyte®活細胞分析系統監測標靶細胞之生長，並使用基礎軟體分析模塊進行分析。圖表顯示每個條件下之A375-NLR/圖像的數量。代表性數據係來自二名不同供體。
從本實施例可歸結出與對照NY-ESO-1 TCR Tg T細胞相比較，經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞顯示出分化程度較低之表型和較多之增殖。此外，經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞之表觀遺傳年齡低於對照NY-ESO-1 TCR Tg T細胞的表觀遺傳年齡。當與使用相關NYESO1肽脈衝之標靶細胞共同培養時，經回春的NY-ESO-1 TCR Tg T細胞亦產生較多之細胞介素(IL-2、IFNg和TNFa)。此外，與未經回春的對照細胞相比較，經回春的NYESO1 TCR+細胞在重複暴露於靶抗原細胞後，保持細胞毒活性的期間較長。此外，經回春的NY-ESO-1 TCR Tg CD8 T細胞活性藉由添加IL-2或經回春的NY-ESO-1 TCR Tg CD4 T細胞而增強。 實施例 14 ：細胞介素鑑定
進行本實施例以評估經回春的T細胞之細胞介素產製。
PBMC的回春。第-2天，將1x106個供體細胞解凍並培育在24孔盤之每孔中的1 mL TCM+IL-2(60 IU/ml)中24小時。第二天(即，第-1天)計算細胞數量，並使用T Cell TransAct.Human(Miltenyi) REA107 1：500活化T細胞，隨後培育24小時。第0天，進行仙台載體轉導(MOI：KOS 10、KLF4 10、c-MYC 3、SV40 5)，並藉由稀釋iMatrix 511(57.6 ul iMatrix+9ml PBS)製備經基質塗層(iMatrix 511)的盤。在24孔盤的每一個孔中加入500 ul之稀釋的iMatrix，並保持在37℃下＞1小時。第1天，將細胞沉澱成小丸並分配到經iMatrix塗層之盤中，該盤中每一個孔中具有500 uL幹細胞培養基+bFGF。第3天，將500 ul新鮮幹細胞培養基和bFGF加入24孔盤的每個孔中。於第7天，收穫所有漂浮細胞，不包含懸浮液，並添加1 mLTrypLE Express以使細胞脫附。將細胞在37℃下培育10分鐘，然後在每一個孔中加入500 ul PBS以進行稀釋。收穫細胞，在其中加入1 ml PBS。將該細胞懸浮並收穫之，將漂浮的細胞與脫附之細胞結合。計算細胞數量、沉澱成小丸並使用TCM+IL-2(60 IU/ml)重新懸浮之，然後使用T Cell TransAct.Human(Miltenyi)(1：500)再活化。收集上清液並冷凍之。第11、14和18天，將細胞沉澱成小丸、收穫並使用新鮮的TCM+IL-2(60 IU/ml)重新懸浮之。
適應性免疫相關細胞介素之定量分析。第7、11、14和18天藉由Isoplexis Codeplex 適應性免疫分泌組晶片分析來自對照細胞和經回春的細胞之上清液。結果描繪於圖38A和38B中。在二名供體中，D7源自T細胞之附著型細胞顯示出相對較低之GM-CSF、IFN-g、IL-5、IL-13、MIP-1a和MIP-1b的表現水準。第18天時這些細胞介素之表現逐漸增加到與對照細胞相當的水準。源自T細胞之附著型細胞(D7細胞)中的IL-6、IL-8和TNF-b之表現模式與對照細胞不同。這些結果表明源自T細胞之附著型細胞與對照細胞為不同細胞類型。
先天免疫相關之細胞介素的定量分析。第7、11、14和18天藉由Isoplexis Codeplex先天免疫分泌組晶片分析來自對照細胞和經回春的細胞之上清液。結果描繪於圖39A和39B中。在二名供體中，該等源自T細胞之附著型細胞(D7細胞)顯示出相對較低之IFN-g、MIP-1a表現水準。 實施例 15 ：抗原特異性 T 細胞之選擇性經回春
進行本實施例以研究特定T細胞之抗原刺激是否會導致這些細胞的選擇性回春。
建立自體LCL。將健康人類供體之耗盡CD4和CD8的PBMC解凍、洗滌一次並重新懸浮在預熱之完整RP10培養基中。將1e+6個細胞培養在24孔盤中之1ml完整RP10培養基中。將人類γ皰疹病毒4(HHV-4)(ATCC)之上清液解凍並在該培養物中加入250 ul。4天後，吸出500 ul之舊培養基並加入新的完整RP10(500 ul)。每三或四天更換一次培養基，直到細胞開始增殖。三週後，細胞開始增殖並被轉移入培養瓶中。將每瓶2e+6個LCL冷凍。
步驟A：健康供體CD8 T細胞活化。將健康之人類供體CD8 T細胞解凍、洗滌一次並重新懸浮於預熱之完整TCM+IL-2(60 IU/ml)中。將細胞稀釋或2e6個細胞/ml。加入10 ul/ml之Transact(1/100稀釋)以刺激CD8 T細胞。
步驟B：NY-ESO-1 TCR之轉導。第二天，計算受刺激之CD8 T細胞的數量，並將1e+6個細胞懸浮在1 ml TCM+IL-2中。將來自編碼NYESO1-TCR之慢病毒載體的上清液(10 ul，MOI；9.7)和LentiBoost A&B(各12.5ul)加入懸浮之細胞中。第二天，藉由FACS測定轉導效率。特別是，加入7 ml之TCM+IL-2以稀釋該病毒。第7天，使用下列表6中描述之抗體混合物將細胞染色，並分析細胞之NY-ESO-1 TCR表現。參見圖40。
Figure 02_image013
步驟C：重編程。
自體LCL之絲裂黴素C(MMC)處理及使用NY-ESO-1肽脈衝。將自體LCL解凍、洗滌一次並培養在完整RP10培養基中一週。將1e+7個細胞重新懸浮在2 ml預熱之添加MMC(最終濃度50 ug/ml)的完全RP10培養基中，並在5% CO2培養箱中培養1小時。一小時後，將細胞收集在錐形管中，在其中加入10 ml PBS。將細胞離心沈澱下並吸出上清液。然後將細胞懸浮在完整RP10中。將細胞在具有或不具有10 nM NY-ESO1肽之完整RP10中，在5% CO2培養箱中培養2小時。2小時後，洗滌細胞並重新懸浮於TCM+IL-2中。
藉由Transact或自體LCL(使用或不使用NY-ESO-1肽脈衝)活化經NY-ESO-1 TCR轉導的T細胞。第2天，計算來自步驟B(NY-ESO-1 TCR之轉導)中的NY-ESO-1 TCR Tg CD8 T細胞數量，重新懸浮在TCM+IL-2中並將5e+5個細胞/孔接種在24孔盤中。測試四種不同條件；無刺激、Transact(1/500稀釋)、無NY-ESO-1肽之自體LCL(1e+6個細胞(T細胞：LCL=1：2))和使用NY-ESO-1肽脈衝之自體LCL(1e+6個細胞(T細胞：LCL=1：2))。第二天(第-1天)，收集以Transact活化之T細胞，使用10 ml PBS洗滌之，重新懸浮於1 ml之TCM+IL-2中，並保持培養。收集與自體LCL共同培養之T細胞，並藉由EasySep™人T細胞分離套組(EasySep™ Human T Cell Isolation Kit)富集T細胞，重新懸浮於TCM+IL-2中並保持培養。參見圖41。
使用Cytotune重編程套組進行NY-ESO-1 TCR Tg T細胞重編程。第0天，從每個條件收集2.4e+5個細胞，重新懸浮在96 U形底盤中的TCM+IL-2中。使用Cytotune仙台重編程套組進行重編程(KOS：MOI=10，KLF4：MOI=10，c-myc：MOI=3，SV40：MOI=5)。隔天(第1天)，收集細胞，重新懸浮在幹細胞培養基中並接種在經iMatrix塗層之6孔盤(每種條件2孔)中。第3天，添加新的幹細胞培養基，並在第5天將一半培養基更換為新的幹細胞培養基(圖3A)。
步驟D：部分重編程之NY-ESO-1 TCR Tg T細胞之脫附和再刺激。
收集經部分重編程之細胞。第7天，收集漂浮細胞，使用PBS洗滌孔，添加TrypLE，並使附著之細胞脫附。計算所有收集之細胞(漂浮細胞+脫附的細胞)的細胞數。然後將所有細胞用於再活化。
重新刺激經部分重編程之細胞。使用Transact或具有NY-ESO-1肽之自體LCL來重新刺激先前使用Transact或具有NY-ESO-1肽之自體LCL刺激的細胞。依前述，使用MMC處理自體LCL並使用NY_ESO-1肽脈衝之。藉由無刺激/在200ul之TCM+IL2(96 U形底盤)中之Transact(1/500)/LCL P-/LCL P+(E:T=1:1)來重新刺激1e+5個細胞/孔。第10天，使用新的TCM+IL-2將一半培養基更新。第14天，收集細胞，重新懸浮於1ml之新TCM+IL-2中並轉移至24孔盤。在第18天和第21天進行細胞計數和更換培養基。
經回春的T細胞之表面表型分析。第14天，使用表6中描述之抗體將1/20之細胞染色，然後藉由FACS分析NY-ESO-1 TCR四聚體陽性(TE+)細胞之頻率。
結果表明，在重編程前藉由自體LCL+NY-ESO-1肽進行之TCR刺激導致第7天有較多之經部分重編程的細胞。藉由Transact或如上述之具有或不具有NY-ESO-1肽之自體LCL來刺激經NY-ESO-1 TCR轉導之CD8 T細胞(其含有約60%之NY-ESO-1 TCR陽性細胞)(如圖40所示)。第7天，收集細胞(漂浮和附著之細胞兩者)並計數(參見圖41和42)。與第0天(仙台病毒感染當天)之細胞數量相比較，使用Transact或具有NY-ESO-1肽之自體LCL刺激的條件顯示出細胞數量分別增加5.5倍和8.7倍，而在沒有刺激及不具有肽之自體LCL的條件下，觀察到之倍數變化分別為0.62和1.6。自體LCL表現EB病毒抗原，因此，當與不具有肽之自體LCL共同培養時，EB病毒特異性T細胞可會接受TCR刺激。
再次刺激經部分重編程之NY-ESO-1 Tg T細胞會導致NY-ESO-1 TCR+細胞優先經回春。第7天，收集經部分重編程的細胞，包括附著和漂浮的細胞，並使用Transact®或如上述之具有或不具有NY-ESO-1肽的自體LCL重新刺激。第14天，收穫1/20之細胞並依上述使用NY-ESO-1四聚體分析NY-ESO-1 TCR之表現。
與在預活化和再活化的二個步驟(即，第-2天和第7天)中以TRANSACT非特異性地刺激之細胞相比較，在任一步驟中以抗原(LCL+NYESO1肽)刺激之T細胞具有較高頻率的NY-ESO-1四聚體+細胞(參見圖43和圖44，78.6%相對於97%或97.1%)，無論該初次刺激為非特異性(使用TRANSACT)還是抗原特異性(使用LCL+肽)(參見圖43)。
經回春的NY-ESO-1 Tg T細胞增殖。依描述培養該使用Transact或具有肽之自體LCL重新刺激的經部分重編程之T細胞(第一次係使用Transact刺激)，直到第21天。增殖曲線顯示於圖45中。使用具有NY-ESO-1肽之自體LCL重新刺激之經回春的T細胞及那些使用Transact重新刺激者同樣增殖。 實施例 16 ： CD19-CAR T 細胞的回春
製造本實施例CD19 CAR-T細胞並使其進行部分重編程過程，然後評估增殖和細胞毒性。與對照組相比較，經回春的CD19 CAR T細胞顯示出較高之增殖，如同先前NY-ESO-1 Tg CD8 T細胞所顯示者。藉由與表現CD19之標靶細胞(Nalm6)重複共同培養來測試經回春的CD19 CAR T細胞之細胞毒性。經過重複共同培養，經回春的CAR T細胞顯示出較高之持久性和細胞毒性。
材料和方法
步驟A：健康供體CD8 T細胞活化。將健康的人類供體CD8 T細胞解凍、洗滌一次並重新懸浮在預熱之完全TCM+IL-2(60 IU/ml)中(第-3天)。將細胞稀釋或2e6個細胞/ml。加入10 ul/ml Transact(1/100 稀釋)以刺激CD8 T細胞。
步驟B：轉導CD19-CAR：使用TRANSACT刺激後的第二天(第-2天)計算受刺激之CD8 T細胞的數量，並將3e+5個細胞懸浮在1 ml TCM+IL-2中。使用常規方法製造編碼CD19 CAR和截短之EGFR的慢病毒載體。將病毒上清液(6 ul，MOI；)和LentiBoost A&B(各10 ul)加入該經活化的細胞中。隔天，除去0.7 ml含病毒之培養基和1.8 ml之新TCM+IL-2。在CAR轉導後第5天，使用下列表7中之抗體混合物對細胞進行染色，並藉由獨特型抗體和EGFR抗體分析CAR之表現。(圖46)
Figure 02_image015
使用Cytotune重編程套組將CD19 CAR Tg T細胞重編程。第0天，收集3e+5個細胞(供體#1)或4e+5個細胞(供體#2)，重新懸浮在48孔盤中之TCM+IL-2中。使用Cytotune仙台重編程套組來重編程(KOS：MOI=10，KLF4：MOI=10，c-myc：MOI=3和SV40：MOI=5)。第二天收集細胞，重新懸浮在幹細胞培養基(StemFit)中並接種在經iMatrix塗層的6孔盤(2孔/條件)上。第3天，加入新鮮的幹細胞培養基，並於第5天更新一半的培養基。將對照細胞保持培養在TCM+IL-2中。
步驟D：重新刺激經部分重編程之CD19 CAR Tg T細胞。第7天，收集漂浮細胞，以PBS洗滌孔，加入TrypLE酶，並將附著之細胞脫附。計算收集到之細胞(漂浮細胞+脫附之細胞)的數量。參見圖47。將5e+5細胞保存於-80℃以用於檢查DNA年齡。使用在TCM+IL-2中之Transact(1/500稀釋)重新刺激收穫的細胞(供體#1和#2分別為1.7e+6和2.3e+6)。以相同方式刺激1e+6個對照細胞。第10天，使用新的TCM+IL-2更新一半的培養基。第13天及之後，每三或四天進行一次細胞計數並更換培養基。以每毫升1-2e+6個細胞的濃度培養細胞。
經回春的T細胞之FACS分析。第13天，使用表面抗體(TCF7-PB(C63D9)，可從Cell Signaling Technology購得)將1/20之細胞染色並使用Foxp3染色套組依製造商之方案中的描述進行固定和可滲透化，使用Tcf7抗體染色並藉由FACS進行分析。
經回春的CD19 CAR Tg T細胞的細胞內細胞介素製造分析。第20天，分析對照組和經回春的CD19 CAR Tg T細胞在與CD19抗原特異性標靶細胞共同培養時產生細胞介素的能力。將5e+4個T細胞與1e+5個Colo205(CD19-)或Nalm6(CD19+)細胞以1：2 E：T比率共同培養(參見圖49)。加入不含標靶細胞之孔和具有PMA/離子黴素(細胞活化混合物)之孔以分別作為陰性和陽性對照組。5小時後，使用表面抗體將共同培養之細胞染色，依照製造商之方案中的描述使用BD套組固定該細胞和使細胞可滲透化，使用細胞內抗體混合物染色(表7)並藉由FACS(Cytek Aurora)進行分析。使用Flowjo軟體分析數據。使用之門控策略如下：淋巴細胞＞單細胞＞Live/Dead-＞CD3+EGFR+。
步驟F：分析CAR-T細胞使用連續刺激重複清除標靶細胞的能力。
經回春的CD19 CAR Tg T細胞的連續滅殺分析。第20天，使用連續刺激分析對照組和經回春的CD19 CAR Tg T細胞之滅殺標靶細胞的能力。計算對照組和經回春的T細胞之數量。將50,000個EGFR+CAR T細胞與20,0000個CD19+標靶細胞(Nalm6-NLR)以1：4 E：T在經Poly-D-Lysin塗層的24孔盤中共同培養。每3至4天，將25%之先前培養物(第4次和第5次之共同培養物為10%)轉移入新的盤中，並以初始接種密度接種該新鮮標靶細胞。使用Incucyte®活細胞分析系統量化目標清除率，並使用Base Software模塊進行分析。
結果
經回春的CD19 CAR T細胞顯示出分化程度較少之表型。依上述，將健康供體之CD8+ T細胞活化並依上述使用CD19 CAR轉導，重新編程7天，脫附並藉由Transact重新刺激。第13天，經回春的經CD19 CAR轉導之T細胞(其藉由EGFRt之表現區分)具有較高百分比之CCR7+CD62L+群和Tcf1+群，表明該經回春的CAR-T細胞具有分化程度較低之更多幹細胞樣表型。(見圖47)
經回春的CD19 CAR T細胞較對照CD19 CAR T細胞增殖更多。將對照組和經回春的CD19 CAR Tg T細胞培養在TCM+IL-2中，並隨時間監測細胞計數。每3至4天更換培養基並將細胞濃度調整為保持在1-2e+6/ml。儘管經回春的CD19 CAR Tg T細胞最初表現出延遲之增殖率，但第25天標記出一個拐點，之後到第55天，經回春的細胞表現出較對照組擴增超過100倍。(參見圖48)
經回春的CD19 CAR T細胞在與表現CD19之標靶細胞共同培養時製造相當水準之細胞介素。依上述，藉由將對照細胞和經回春的CD19 CAR T細胞與表現CD19(Nalm6)或不表現CD19(Colo205)的標靶細胞共同培養來分析其細胞介素(IL-2、TNFa、IFNg)產製。在將對照細胞或經回春的CD19 CAR Tg T細胞與對照Colo205細胞共同培養時，其均不產生細胞介素。然而，除了IFNg外，當與Nalm6共同培養時，二組產生之細胞介素水準相當。(參見圖49)。值得注意的是，與對照細胞相比較，經回春的細胞中之IFNg的產量較高。
在使用表現CD19之標靶細胞重複刺激(共同培養)時，與對照細胞相比較，經回春的CD19 CAR T細胞持續並保持其殺死標靶細胞的能力較久。二名供體，經回春的和對照CAR T細胞均有效地殺死並清除標靶細胞，直到共同培養之第4輪或第5輪。然而，在第6輪和第7輪再刺激時，經回春的細胞保持優越之細胞毒性和持久性，而對照細胞則不。(參見圖50A和50B)。總括而言，這些研究表明與對照細胞相比較，利用部分重編程之回春過程導致具有更多幹樣表型、較高之增殖能力、較高之持久性和細胞毒性的CD19 CAR T細胞。 實施例 17 ： mSev 相對於 Sev
本實施例中，使用經修飾以表現來自單一多順反子(multicistronic)(即“mSev”)載體之四種山中因子的仙台病毒載體來使T細胞回春，並與先前實施例中描述之使用Cytotune套組進行回春相比較。
如前述，Cytotune-iPS 2.0仙台重編程套組(即，“Sev”)包含3個單獨的病毒載體：編碼Klf4、OCT4和SOX2之KOS；cMyc；用於重編程之Klf4。通常，亦使用另外之表現SV40的仙台病毒(Sev)來抑制細胞凋亡和增加重編程效率。使用cytotune套組，必須將四個單獨的載體轉導入T細胞中。如下文中之進一步詳細討論，發現使用四種單獨之病毒轉導會導致不均勻的共轉導、重編程效率低下且可能導致後期產物之顯著變化。
因此，使用(a)表現該四種山中因子(但不表現SV40)的多順反子仙台載體或(b)Cytotune Sev(+SV40)對T細胞進行本文所描述之回春過程。
二個實驗組在脫附後顯示出具有相似之增殖曲線達23天。多順反子仙台組顯示出略高之幹性T細胞表型(TCF1+CCR7+)。這些數據表明即使沒有增加重編程效率之SV40，多順反子仙台載體可用於T細胞之部分重編程和回春。
步驟A：T細胞回春。使用在含有60 IU/ml IL-2之T細胞培養基中以1：500稀釋之人類T細胞TransAct (Miltenyi Biotec，目錄編號130-111-160)刺激在48孔盤中之來自53歲男性(供體1)和55歲男性(供體2)，細胞密度為100萬個細胞/mL的CD8+ T細胞。在該實施例中，本發明者發現使用多順反子仙台病毒載體(mSev)活化24小時可導致最有效之轉導。使用TransAct刺激26小時後，將細胞分成二組(即，在第0天)。一組細胞使用來自CytoTune套組(Sev或“比較實施例17”)的仙台病毒載體進行回春過程，而另一組使用多順反子仙台病毒載體(mSev)進行經回春。使用10 MOI之Klf4-Oct3/4-Sox2、10 MOI之Klf4、3 MOI之cMyc(Cytotune iPS 2.0仙台重編程套組，Thermo)和5 MOI之SV40來轉導經Sev回春組，而MSev組係使用5 MOI之表現全部四種山中因子，但無SV40的mSev轉導。然後將細胞在37℃下培養。16.5小時後，洗滌細胞並以幹細胞培養基(SCM；具有bFGF之Stemfit Basic 04)懸浮之。將細胞以50,000個細胞/孔(對應於第0天之計數)接種在經iMatrix-511 (PEPROTEC 目錄編號RL511S)塗層之24孔盤上，並在37℃下培養(即，第1天)。第3、5、7、9天，添加500 ul之SCM。第7天吸出1 ml之SCM。在再刺激方面，在第7、9和11天，使用1 ml之TrypLE Express(Thermo目錄編號12604013)將二組細胞脫附並在37℃下培育10分鐘。藉由移液收穫脫附之細胞。使用在200 uL之T細胞培養基中之1：500稀釋的人類T細胞TransAct活化在96孔圓底板中之1x105細胞，細胞密度為5x105個細胞/ml。脫附後二天，將細胞轉移至12孔盤中，並在每一個孔中加入1 ml之T細胞培養基。脫附後四天，將細胞轉移至6孔盤中。之後，使用含有IL2 60 IU/ml之T細胞培養基將細胞培養在六孔盤中。
步驟B：流式細胞術分析。使用與螢光結合之抗體和活力染料(見下列表8)將細胞染色。在Cytek Aurora中藉由流式細胞術獲得細胞表型。
Figure 02_image017
步驟C：DNA萃取和表觀遺傳分析
使用PureLink Genomic DNA迷你套組(Invitrogen, K182002)從冷凍細胞沉澱小丸中萃取DNA。將各萃取出之DNA分成3個試管，以用於甲基化體分析之技術重複。將樣本送至AKESOgen公司以藉由Illumina Infinium陣列進行表觀遺傳分析。依(AGING 2018, Vol.10, No. 7,1758-1774)中之用於皮膚和血液時鐘值之描述，使用霍瓦斯法分析CpG甲基化狀態數據。
步驟D：分析
第7、9和11天，使用Sev和mSev將來自53歲和55歲男性的2名供體之CD8+ T細胞進行轉導、脫附及再刺激(參見圖51)。脫附和再刺激後，在脫附和再活化後6天，經回春的二個組之細胞中的常規T細胞標記CD3和CD8b完全恢復(參見圖52A和52B)。
將細胞在脫附後培養23天。
於第7天(圖53A)和第9天(圖53B)脫附之細胞方面，Sev和mSev轉導組顯示出相似之增殖曲線。在第11天脫附之細胞(圖53C)方面，mSev組顯示出較高之增殖。據觀察，Sev重編程導致脫附時較大之群落，並導致較mSev組中所測量之產量高3至4倍的細胞產量。mSev組具有較多之群落，但該群落較小。不受單一理論的束縛，咸信Sev組和mSev組之間細胞計數的差異可能是由來自mSev載體之重編程因子的表現水準較低和缺乏SV40(其增加重編程效率)所引起。總體而言，Sev和mSev組之增殖曲線相似，表明經mSev重編程之細胞獲得類似之經回春的增殖能力。
Sev和mSev似乎具有不同之重編程速度。特別是，在第11天脫附時(參見圖52A和52B)，Sev組中之細胞較mSev組中之細胞失去較多之CD3和CD8b細胞表面表現(參見圖52A)。這表明與mSev組相比較，Sev組中有較多之細胞被重編程至無法返回的點，導致Sev組中對TranAct有反應和增殖的細胞較少。這些數據亦表明使用mSev載體進行重編程較使用Sev進行重編程要慢，且mSev重編程需要較多時間來形成足夠之源自T細胞的附著型細胞及使經部分重編程的細胞回春。不欲受單一理論的束縛，觀察到之差異可能如上述由多順反子載體中之重編程因子的表現水準和/或缺少SV40引起。修改該載體以增加該重編程因子之表現和/或添加SV40可能減少達到理想之重編程所需的天數。
就細胞表型而言，mSev在CD3+CD8b+群中顯示出較高之TCF1+CCR7+和較高之CCR7+CD62L+群，這表明mSev組中有較多之幹樣群(參見圖54A和54B)。
在脫附第7天、脫附第9天和脫附第11天藉由霍瓦斯鐘分析進行之表觀遺傳年齡測定表明與對照細胞相比較，經mSev短暫地重編程的T細胞具有降低之表觀遺傳年齡(參見圖55)。如圖55中所繪製之各組的eAge減少情形總結於下列表9中：
Figure 02_image019
如表9中所示，mSev組中eAge之減少程度低於Sev組中所觀察到之減少程度。考慮到mSev載體需要較長之時間進行重編程，這樣的結果並不令人驚訝。如上文所討論者，修飾該載體以增加重編程因子之表現可導致經短暫重編程之T細胞的eAge進一步降低。
因此，本實施例和隨附之數據表明多順反子仙台載體可用於T細胞之回春。 實施例 18 ：經回春的 CD8+ T 細胞之轉錄 (transcriptome) 表徵
本實施例中使用單細胞和傳統大量細胞RNAseq(bulk RNAseq)之高維轉錄分析來表徵經回春的T細胞以與對照T細胞相比較。總言之，對成簇之單細胞RNA-seq數據的分析顯示在重新編程7天後，該經回春的T細胞與對照T細胞的整體表型非常不同。大多數經部分重編程的細胞在第7天表現該四種山中因子，但到第13天，該經轉導之山中因子之表現係處於背景水準。第13天觀察到該山中因子之一-C-MYC-的表現，但其被證實為內源性的(即，未經轉導的)C-MYC。到第13天，該經回春的細胞恢復為表現典型T細胞標記，但不表現在源自iPSC之T細胞中典型見到之淋巴細胞/骨髓譜系標記的T細胞(Maeda et al. 2016)。藉由傳統大量細胞RNA-seq分析證實單細胞RNA-seq結果。第7天和第13天均可在經回春的細胞中見到數種代謝基因集富集。總言之，轉錄分析強調在山中因子轉導後第7天，該T細胞附著型細胞與對應之對照T細胞非常不同。第13天後，在再活化之後，該經回春的細胞表現T細胞標記且代謝基因集中之基因富集，同時失去山中因子表現。
T細胞回春
本實施例中，使用四名供體進行二個獨立實驗。
在第一個實驗中，依下述將來自54歲男性供體(供體編號18698)之CD8陽性T細胞進行回春過程。將細胞分成二組，一組依下述進行回春，另一組作為對照組。
在第二個實驗中，將來自53歲男性供體、55歲男性供體和50歲男性供體(供體編號分別為11347、12254和26221)之CD8陽性T細胞進行相同方案。
在這二個實驗方面，使用在含有60 IU/ml IL-2之T細胞培養基中，以1：500稀釋的人類T細胞TransAct(Miltenyi Biotec)刺激在48孔盤中之來自各供體的CD8陽性T細胞，細胞密度為100萬個細胞/mL。使用TransAct活化24小時後，將來自各供體的細胞分成2組，一組依本文之描述進行回春過程，另一組作為對照組(無仙台載體轉導)並培養在T細胞培養基中。在預活化步驟中使用TRANSACT活化對照組，培養在含有IL2之TCM中，然後使用TRANSACT再活化，同時將該經部分重編程的細胞再活化(在第7天脫附後)。
在該經回春之組中，以10 MOI之Klf4-Oct3/4-Sox2、10 MOI之Klf4、3 MOI之cMyc (Cytotune iPS 2.0仙台重編程套組，Thermo)和5 MOI之SV40(ID Pharma，日本筑波)轉導含有該四種山中因子和SV40之仙台病毒(SeV)(即，在第0天)，然後在37℃下培養。16小時後，使用幹細胞培養基(具有bFGF之Stemfit Basic 02，味之素公司，日本東京)洗滌並懸浮細胞。將細胞以50,000個細胞/孔(對應於第0天之50,000個計數)平皿接種在經iMatrix-511(PEPROTEC)塗層之24孔盤上，並在37℃下培養(第1天)。在第3天和第5天，將500 ul之SCM加入培養物中。在第7天，將源自T細胞之附著型細胞與0.5 ml之TrypLE Express(Thermo)在37℃下培育10分鐘，以使該細胞從培養皿脫附。然後，藉由移液收穫該脫附之細胞。亦收獲上清液中之漂浮細胞並與該脫附之細胞混合。由於細胞數量不足，丟棄第一個實驗中之漂浮細胞。
在第二個實驗中，使用在500 ul之T細胞培養基中，以1：500稀釋的人類T細胞TransAct活化在48孔盤中之對照和經回春樣本兩者的50萬個細胞，細胞密度為100萬個細胞/mL，而由於細胞數量少，第一個實驗中之48孔盤中的細胞數量為364,050/孔。對照細胞和經回春的細胞係以相同的密度接種。將細胞培養到第13天(從第7天脫附開始)，在2個時間點(第7天和第13天)採集樣本，並依下述移除死細胞以進行總轉錄本分析。在第一個實驗中將細胞繼續培養至第17天，而在第二個實驗中將細胞繼續培養至第29天。在第7天和第13天對第一和第二個實驗之細胞進行計數。亦在第18、21和29天對第二個實驗之細胞進行計數。
根據製造商之說明，使用EasySep死細胞移除(Annexin V)套組(STEMCELL技術公司)移除死細胞。使用EasySep處理樣本二次以提高活細胞純度。
藉由傳統大量細胞RNA-seq對T細胞進行轉錄剖析。
在第7天和第13天亦收集來自四名男性供體之經回春和對照樣本的細胞以用於傳統大量細胞RNA-seq。
在每個收集時間點，將細胞進行死細胞移除(如上述)，將來自各樣本之約50,000個細胞收集在根據MagMAX mirVana Total RNA分離套組方案(Thermo Fisher Scientific)製備之溶胞結合混合物中，並儲存在-80℃下直至加工處理。
在Kingfisher Flex系統上使用MagMAX mirVana RNA套組從細胞萃取總RNA，並儲存在-80℃。在2100 BioAnalyzer上使用Agilent RNA 6000 Pico套組(安捷倫)評估RNA之品質和數量。使用SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA套組(美國Takara Bio)，利用在Biomek i7工作站上之自動化製造商方案，使用5 ng總RNA製備用於mRNA測序之集合庫以生成cDNA。使用高敏感性DNA套組(安捷倫)在2100 BioAnalyzer上進行cDNA評估並使用150 pg之全長cDNA製備用於定序之條碼集合庫，該定序係使用Nextera XT DNA Library Prep套組(Illumina)，利用在Biomek i7 工作站上之自動化製造商方案進行。利用具有4200 TapeStation系統之DNA1000 ScreenTape分析(Agilent)進行品質評估。然後將樣本間之條碼集合庫在等莫耳池中多重處理、純化及使用NovaSeq 6000系統進行測序。
單細胞CITE-Seq分析
以Genome Reference Consortium Human Build 38(GRCh38)作為參考基因組和默認參數，使用10X Cell Ranger軟體版本5.0.1(10X Genomics)處理單細胞CITE-Seq數據。以來自仙台病毒骨架之經轉導的山中因子序列和控制序列補充參考基因組。使用R語言之Seurat包(參見Hao et al. 2021)進一步處理細胞基因矩陣。藉由目視選擇粒線體百分比、nCount_RNA、nFeature_RNA、nCount_ADT和標籤雙聯體之閾值來進行細胞水準品質控制和異常值的去除。將從四名男性供體收集之經回春的樣本和對照樣本之細胞合併以用於第7天和第13天之單細胞總轉錄本分析。將過濾之細胞基因矩陣使用“NormalizeData”函數進行全局縮放，比例因子(scale.factor)參數設為default 10000。在每個供體樣本方面，藉由使用Seurat包中之“CellCycleScoring”函數計算細胞週期階段評分(G2M.評分、S.評分)，然後回歸函數中之細胞週期階段評分和粒線體reads百分比來校正細胞週期異質性的影響。將與二個細胞週期階段評分中任一者相關(Pearson相關係數大於0.25)的基因從選定之特性排除，以進一步將細胞週期異質性之影響最小化。亦將與基因相關之粒線體、核醣體、TCR和IG複合物從選定之特性排除。
為了校正可能之批次效果及考慮供體異質性，使用前30個典型相關分析維度將來自各供體第7天和第13天之數據集與“FindIntegrationAnchors”和“IntegrateData”函數調用組合。然後，對該集成數據進行縮放，並使用使用過濾之特性，藉由“RunPCA”函數計算前30 PC。之後，使用藉由Seurat包中之“RunUMAP”函數運算的均勻流形逼近和投影(UMAP)(uniform manifold approximation and projection)來將細胞映射到二維空間以使代表細胞的每個點可視化。使用Seurat包中之“FindClusters”函數對細胞進行叢聚分析(cluster analysis)。CITE-Seq分析在報告中亦稱為單細胞RNA-Seq分析，因為該分析(UMAP，叢聚)係使用RNA表現完成，而沒有在CD8+ T細胞中表現蛋白質。
單細胞表型評估
在單細胞叢聚分析後，使用“FeaturePlots”函數將編碼山中因子之標記基因的表現水準可視化。使用在pHeatmap包(pheatmap CRAN)中執行之熱圖可視化來評估在人類經誘導之分化多能幹細胞衍生的細胞(Themeli et al. 2013, Maeda et al 2016)上觀察到的常規和非常規T或B細胞標記之表現。使用Seurat中之“FindMarkers”鑑定經回春之細胞的偽大量(Pseudo-bulk)基因標記。使用Seurat中之“AddModuleScore”函數將顯著基因集呈陽性之細胞可視化。
使用Integrative Genomics Browser(參見，例如Thorvaldsdóttir et al. 2013)將單細胞reads比對可視化。
傳統大量RNA-Seq分析
使用標準處理流程從測序數據產生基因表現。使用Trim_galore(Krueger-Github)來修剪轉接子序列並使用STAR(參見，例如Dobin et al. 2013)來與符合GRCh38序列之參考基因組比對，該GRCh38序列係經補充來自仙台病毒骨架之過度表現的山中因子序列和控制序列。基因表現量化係使用默認參數，藉由RSEM執行(參見，例如Li and Dewey. 2011)。使用DESeq2(Love et al 2014)包進行差異分析，從中計算出統計數據，諸如表現之log2倍數變化(log2FC)和經調整之p值(padj)。代謝基因集之富集(MSigDB 版本7，Subramanian et al 2005)係藉由在clusterProfiler包中執行之“enricher”函數進行(參見，例如Yu et al. 2012)。
經回春的細胞之表型評估。
根據回春方案，使用山中因子和SV40轉導來自四名男性供體之CD8陽性T細胞(即，經回春的細胞)並在各時間點與處於非轉導條件的對應對照組相比較。在實驗1和2中，允許細胞分別生長至第17天和第29天。如圖56所示，與前述實施例一致，與對照細胞相比較，經回春的細胞顯示出增殖增加。
在第7天和第13天使用來自所有四名供體(供體編號18698、11347、12254和26221)的細胞對來自對照細胞和經回春的細胞之CD8+ T細胞進行單細胞RNA-seq分析。在與上述第二個實驗中使用的相同樣本(即，第二個實驗的53歲、55歲和50歲男性)中進行傳統大量細胞RNA-seq。
在7天部分重編程結束時細胞顯示出與對應之對照T細胞不同的表型。單細胞RNA-seq UMAP圖分別顯示該經回春的細胞簇和對照細胞(參見圖57A)。於第7天有二個經回春的細胞簇，其中一個細胞簇之大多數細胞表現山中因子(OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC)，另一個細胞簇在這些因子方面呈陰性(參見圖57A)。第7天後在單細胞(參見圖57B)和傳統大量細胞(參見圖57C)RNA-seq數據中都觀察到外源性重編程因子下調。值得注意的是，有些單細胞在重新定向到T細胞狀態後在第13天表現cMYC(參見圖57B，標記Myc的小組)。我們已經確認重編程後之C-MYC表現主要為內源性的，而非來自經轉導之C-MYC(圖57D)。從第7天開始，單細胞RNA-seq reads比對的主要波峰為外顯子1(數據範圍，0-66547)，而第13天比對的波峰係來自C-MYC的5’ UTR(數據範圍0-2596)。經轉導之C-MYC從外顯子1開始，而內源性cMYC預計將從5’ UTR開始，確認在第7天看到之C-MYC為經轉導的，而在第13天的為內源性。這些數據表明經回春的T細胞仍表現四種山中因子直到脫附、重新懸浮和活化之日(第7天)。第13天未檢測到這些因子之外源性表現。雖然經回春的T細胞仍表現C-MYC，但表現起源為內源性的。
然後同時在單細胞和傳統大量細胞RNA-seq數據中評估經回春的和對照T細胞中之譜系特異性淋巴樣/骨髓樣標記基因的表現(Themeli et al. 2013, Maeda et al 2016)。第7天，脫附之經回春的細胞(例如T細胞附著型細胞)顯示出降低之CD3和CD8b的表現。在脫附並刺激它們後，經回春的細胞在第13天完全恢復T細胞譜系標記。經回春的T細胞中並未見到非常規的NK、T或B細胞標記(例如NCAM1、NCR2、FCGR3A、KIR2DL4、KIR2DS4)的異常表現，像那些在源自人iPSC之T細胞產物上觀察到者(Themeli et al. 2013, Maeda et al 2016)。因此，使用本文所描述之部分重編程方法製造之經回春的T細胞沒有異常表現非常規標記NCAM1、NCR2、FCGR3A、KIR2DL4、KIR2DS4。
將人類iPSC分化成常規之成熟T細胞一直具有挑戰性，涉及使用3D類器官培養物以提供T細胞分化所需之有序工作和分化的合適環境(Montel-Hagen et al., 2019)。此外，來自iPSC之T細胞的分化導致表現異常NK、T或B細胞標記之T細胞(Themeli et al. 2013, Maeda et al 2016)。數據證實部分T細胞重編程過程不僅避免耗時之iPSC重編程和使用複雜之T細胞再分化系統，但令人驚訝的是，在T細胞活化後，該過程導致不表現異常標記，與對照和起始T細胞相比較，表觀遺傳年齡降低且增殖能力增加之T細胞。
然後，評估經回春的細胞以確定它們在第7天和第13天是否與對應之對照T細胞代謝上相異。在第7天和第13天之經回春的細胞中顯著富集對應於氧化磷酸化、脂肪酸代謝、糖解和缺氧之代謝基因集(參見圖58A)。這些代謝基因集投射在單細胞RNA-seq數據上表明該經回春的細胞在第7天富集用於糖解和氧化磷酸化。令人驚訝地，雖然該經回春的細胞到第13天轉變為或是高氧化磷酸化，或是高糖解(參見圖58B)，但與對照細胞相比較，這些細胞在這二種基因集方面仍是全面顯著地富集。
此外，在第13天評估經回春的細胞和對應之對照T細胞中之初始基因集(Gattinoni et al., 2011 Nature Medicine 17(10):1290-1297)。第13天，經回春的細胞中富集對應於初始T細胞表型之基因集(參見圖59A和59B)。此外，藉由辛普森單株性估計相關T細胞受體組庫的多樣性(Wong et al. J. Immunology V:197. Pp 1642-1649)。使用辛普森單株性指數估計T細胞組庫的多樣性(diversity)，其範圍從0到1，其中0代表完全均勻之樣本，而1代表單株樣本。與對照T細胞相比較，第7天和第13天在經回春的樣本中觀察到較低之辛普森單株性，表明TCR組庫多樣性增加。(參見圖75)。
因此，與對照細胞相比較時，本實施例之經回春的T細胞增強表現與較高之代謝活性相關的基因。本實施例中之數據亦表明與對照組相比較，經回春的T細胞更適合使用能量及合成增殖所需之核苷酸，並進一步解釋在經回春的細胞中觀察到顯著增加之增殖能力。氧化磷酸化和糖解基因集之富集與體細胞重編程為iPSC之期間的代謝轉變有關(參見，例如Nishimura 2019 Int. J. Mol. Sci. 20:2254; doi:10.3390/ijms20092254)，並表明該經回春的細胞可能已獲得一些與幹細胞相關之特性，而不需重編程至完全分化多能iPSC階段。再者，經回春的T細胞富集對應於初始T細胞表型之基因集，且具有增加之多株性。綜合上述，該數據表明本文描述之經回春過程導致具有改善和有利之特性的T細胞以用於過繼細胞療法治療。 實施例 19 ：腫瘤浸潤淋巴細胞中之回春增強的 T 細胞幹性性能
本實施例中，使用如實施例11中描述之過程，將來自多種不同之腫瘤類型(肺腺癌、結腸直腸癌、肝臟、黑色素瘤、結腸直腸癌轉移到肝臟)的TIL回春，其差異標註於下文表10中。
自人體組織合作網絡(Cooperative Human Tissue Network)(CHTN)購買腫瘤樣本。將TIL新鮮分離出且或是1)藉由磁珠分離來富集CD45+免疫細胞(例如T細胞)並直接使用；或是2)藉由磁珠分離來富集CD45+免疫細胞(例如T細胞)，然後使用TransAct(1：500)活化1或2天；或3)分離並在含有6000 IU/ml IL-2之培養基中擴增5至17天。由於腫瘤樣本小，因此需要進行富集和/或擴增以產生足夠用於回春過程之細胞。在預活化步驟方面，藉由如下表10中概述之方法其中一者活化TIL：
1)TransAct(除非另有說明，否則為1：500稀釋；在某些實驗中，使用1：2000稀釋。二種稀釋之間沒有發現顯著差異)；
2)與基本上依下述製備之自體腫瘤類器官共同培養：將腫瘤片段在冰上切碎，使用PBS洗滌並在冰上使用Matrigel包埋，在6孔盤中形成圓頂，每個圓頂約20 ul。在37℃下固化20分鐘後，使用2 mL IntestiCult™類器官生長培養基(人類)(Stemcell Technologies)覆蓋圓頂。在其中無法切碎腫瘤碎片的情況下，使用膠原蛋白酶IV(200 IU/mL；(Worthington Biochemical Corporation)在37℃下分解組織30分鐘，再洗滌和包埋。或使用自體腫瘤細胞株，隨後藉由FACS分選4-1BB+細胞。
然後依下述使TIL回春：使用10 MOI之Klf4-Oct3/4-Sox2、10 MOI之Klf4、3 MOI之cMyc(Cytotune iPS 2.0仙台重編程套組，Thermo)和5 MOI之SV40轉導來自預活化步驟之TIL。然後在37℃下培養細胞。約16小時後，使用幹細胞培養基(SCM；具有bFGF之Stemfit Basic 02)洗滌並懸浮細胞。以約50,000個細胞/孔(對應於第0天之細胞計數)將細胞接種在經iMatrix-511(PEPROTEC)塗層的24孔盤上，並在37℃下培養(第1天)。第7天，使用酶(1 ml之TryplE Express(Thermo))將TIL脫附，並在37℃下培育10分鐘。藉由移液收穫脫附之細胞。使用在200 ul之輔以60 IU/mL IL2的TCM中之1：500稀釋之人類T細胞TransAct活化在96孔圓底板中之1E5細胞，細胞密度為5x105個細胞/ml。在相關圖形(圖60、62、64和68)中指明之不同時間點進行細胞計數，直到第30天。在圖 61、63和65中所指明之日子藉由流式細胞術測量與幹性相關之表面標記(CD62L、CCR7、TCF7)的表現。注意：在較早的時間點通常沒有足夠之細胞數量來評估表型。
在實驗6方面，依下述進行表觀遺傳年齡測定：使用PureLink基因組DNA迷你套組(Invitrogen, K182002)從冷凍細胞沉澱小丸中萃取DNA。將每個萃取之DNA分成3個試管以用於甲基化體分析之技術性重複。將樣本送至AKESOgen公司以藉由Illumina Infinium陣列進行表觀遺傳分析。依((1) Horvath Genome Biology 2013, 14: R115;(2) doi:10.1371/journal.pone.0014821]中之描述，使用用於皮膚和血液表觀遺傳時鐘值之霍瓦斯法分析CpG甲基化狀態數據。(參見圖66和圖67)
如圖60至68所示，來自該實施例之數據證實先前在實施例11中概述並顯示於圖27中之結果和結論，TIL可使用本文之方法回春，並將數據擴展至數種不同的腫瘤類型，包括肺腺癌、結腸直腸癌、肝癌、黑色素瘤和結腸直腸癌轉移至肝臟。結果表明經回春之TIL表現出增殖能力增強、與幹性相關之表型標記的表現增加和表觀遺傳年齡降低。
當幹性表型標記之增強表現下降且表觀遺傳年齡隨著時間推移擴增而逐漸增加的同時，TIL大致耗盡、終末分化且難以擴增。TIL獲得增強之增殖力、與幹性相關之表型標記的表現增加及回春過程後表觀遺傳年齡降低的能力表明該回春過程可用於提升TIL在過繼細胞療法應用中的治療潛力。
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實施例 20 ：使用 mSev 使腫瘤浸潤淋巴細胞回春
本實施例中，使用如實施例17中描述之編碼該四種山中因子(無SV40)的多順反子仙台載體(mSev)來使TIL回春。
藉由在冰上進行機械分離，再藉由酶分解約30至約90分鐘將來自52和83歲女性供體(供體6和8；見表10)的TIL從腫瘤樣本中分離出並直接使用(即，“原液”)或藉由用於CD45+免疫細胞(例如T細胞)之磁珠分離來進行富集，然後使用TransAct進行擴增。
在供體8(83歲女性)方面，藉由在含有6000 IU/ml IL-2之T細胞培養基中培養1個月來擴增TIL。在轉導前之預活化步驟方面，使用以1：500稀釋之人類T細胞TransAct(Miltenyi Biotec)活化TIL 1天。然後使用5 MOI之表現4種山中因子，但不表現SV40的mSev來轉導該預活化之TIL。然後在37℃下培養細胞。
約16小時後，使用幹細胞培養基(具有bFGF之Stemfit Basic 02)洗滌並懸浮細胞，並以50,000個細胞/孔(對應於第0天之計數)接種在經iMatrix-511(PEPROTEC)塗層之24孔盤上，並在37℃下培養(即，第1天)。
第11天，使用1 mL之TryplE Express (Thermo)在37℃下培育10分鐘來使源自T細胞之附著型細胞脫附。然後藉由移液收穫致脫附之細胞。使用在200 ul T細胞培養基中之1：500稀釋的人類T細胞TransAct將在96孔圓底盤中之1x105個細胞活化，細胞密度為5x105個細胞/mL。脫附後二天，將細胞轉移入12孔盤中，並在每個孔中加入1 mL T細胞培養基。脫附後四天，將細胞轉移至6孔盤中。之後，使用T細胞培養基來培養6孔盤中之細胞。在第14天和第18天，使用與螢光結合之抗體和活力染料對細胞染色，並在Cytek Aurora中藉由流式細胞術獲得細胞表型。
第14和18天，該經mSev回春的細胞顯示出在CD3+群中具有較高之TCF7+CCR7+群，此表明mSev群組中之群較對照組更具幹樣(參見圖69A和69B)。
因此，該實施例表明mSev載體可用於使TIL回春。 實施例 21 ：作為經回春之 T 細胞的標記之整合素α 6 和整合素 β1
本實施例中評估整合素α6β1是否可作為T細胞附著型細胞之標記，其可能促成細胞黏附和分化程度較低之表型。
整合素為參與細胞黏附最重要的蛋白質之一。異二聚體跨膜蛋白將肌動蛋白細胞骨架與細胞外基質結合，從而將細胞與細胞外基質連接起來。它們不僅作為細胞黏附分子，亦作為傳遞調節細胞增殖和存活之細胞內傳信的受體。本文描述之T細胞的部分重編程的重要特性為細胞早期附著於經基質塗層的盤，這表明經部分重編程之T細胞表現細胞黏附分子，即，整合素(參見，例如www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov/books/NBK26867/)。在iPS細胞中，最主要之整合素複合物為整合素α6β1(參見，例如Nishiuchi et al., Matrix Biology 2006, 25(3):189-197)。已知整合素α6β1與層連結蛋白511結合，層連結蛋白511在本實施例中作為細胞外基質並已用於培養人分化多能幹細胞(參見，例如Miyazaki T. et al. Nat Commun (2012) 3, 1236)。
材料和方法
步驟A：T細胞回春
使用在含有60 IU/ml IL2之T細胞培養基(TCM)中的人類T細胞TransAct(Miltenyi Biotec，目錄#130-111-160)刺激在48孔盤中之來自49歲的女性供體之CD8陽性T細胞1天，細胞密度為100萬個細胞/1 ml。本實施例中使用之所有TCM均含有60 IU/ml IL2。活化24小時後，進行轉導。
以10 MOI之Klf4-Oct3/4-Sox2、10 MOI之Klf4、3 MOI之cMyc和5 MOI之SV40 (Cytotune iPS 2.0仙台重編套組，Thermo)轉導仙台病毒17小時，然後洗滌並懸浮於不含IL2之幹細胞培養基(SCM)(具有bFGF之StemFit Basic02，味之素)中。
將細胞以5萬個細胞/孔(對應於第0天之5萬個計數)平皿接種在經iMatrix-511(PEPROTEC 目錄編號 RL511S)塗層之24孔盤上。
步驟B：經部分重編程之T細胞脫附
第10天，將經部分重編程之T細胞分成3組。除去SCM後，加入1 ml TCM並藉由P1000移液管重新懸浮二次，再收穫之，稱為微弱附著細胞。使用1 ml TCM，藉由劇烈移液來收穫之脫附的細胞稱為附著之細胞。強附著之細胞係藉由與重組酶TrypLE Express(Thermo目錄#12604013)在37℃下培育10分鐘來脫附。對細胞進行存活力染色並使用用於檢測CCR7、CD3、CD45RA、CD45RO、CD8b、CD4、CD62L、CD49f、CD29、TCF1/7之螢光結合抗體。分別使用CD49f抗體和CD29抗體來檢測整合素α6和整合素β1。在TCF1之細胞內染色方面，藉由Foxp3染色緩衝液組(Thermo，00-5523-00)來固定和使細胞可滲透化。藉由Cytek Aurora獲得細胞表型。
分析和結果
在經回春的細胞中，整合素α6和整合素β1之表現高於經活化的T細胞(即，對照細胞)中者。第10天，將脫附之細胞與經活化之T細胞相比較，該等經活化之T細胞係在第-1天活化並在TCM中培養10天。源自T細胞之附著型細胞中的整合素α6和整合素b1表現高於經活化之T細胞對照組(圖70)。在脫附之細胞中，強附著之細胞顯示出整合素α6(CD49f)和整合素β1(CD29)雙陽性細胞的比例高於附著之細胞，尤其是高於微弱附著之細胞，這表明整合素複合物的表現水準與附著強度相關。
T細胞在第10天活化後，再在TCM中培養，整合素表現水準朝向經活化之對照細胞中的表現水準降低(圖71)。
T細胞表型和增殖。CD3為T細胞最常見之標記，而CD8為細胞毒性T細胞之標記。微弱附著之細胞、附著之細胞和強力附著之細胞中的CD3+CD8+群在第10天減少，但該群在第17天增加(圖72)。鑑於強附著之細胞在第10天幾乎完全失去CD3+CD8+表現，第17天的結果顯示CD3+CD8+群之重新出現證實CD3-或CD8-群(源自T細胞之附著型細胞群)藉由T細胞活化和在T細胞培養條件下生長重新獲得T細胞標記表現。從該實驗中並不清楚第10天在該強力附著之細胞中觀察到的CD3+CD8-群(見圖72)是否對應於恢復CD8表現之群。該微弱附著之細胞、附著之細胞和強力附著之細胞在第10天T細胞活化後表現出增殖更多(圖73)。強力附著之細胞在脫附後不久增殖減緩，但最終較對照細胞回復和擴增更多。
分化程度較低之表型。TCF1和CCR7為眾所周知之分化程度較低之T細胞的標記。在第10天和第17天，強力附著之細胞顯示出TCF1和CCR7之表現較活化的對照組高，而附著之細胞和微弱附著之細胞在二個時間點均顯示出TCF1之表現與活化之對照組相當，而CCR7之表現較活化之對照組高(圖74)。
摘要：據觀察，與活化之T細胞相比較，第10天脫附之T細胞附著型(即，經部分重編程)細胞顯示出整合素α6和整合素β1之表現較高。在第10天活化，然後在T細胞條件下培養後表現水準降低。需要酶分解以從盤上脫附之強力附著之細胞中的表現水準較高。可不藉由酶，但藉由移液從盤上脫附之微弱附著的細胞中之表現較低。這表明整合素表現水準與細胞黏附強度相關。所有附著之細胞群(微弱附著之細胞、附著之細胞和強力附著之細胞)於第10天活化後表現出高度增殖(參見圖73)。該強力附著之細胞在脫附後不久增殖緩慢，但最終回復並表現出強勁之增殖。該強力附著之細胞在第10天和第17天亦具有高度TCF1和CCR7表現，表明幹樣表型。整合素β1高度表現可藉由透過信號傳導導致β-連環蛋白(catenin)表現上調(參見，例如Yuzuriha et al., Stem Cell Res. 2021 May; 53: 102287)引起，此可能促成經回春的T細胞之分化程度較低的表型實施例實施例(參見，例如Clin Cancer Res, 2010 Oct 1;16(19):4695-701)。 引用之參考文獻
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[圖1]顯示使用仙台病毒轉導進行部分重編程之實驗設計。從外周血單核細胞(PBMC)分離後，使用包含IL2之CD3、CD28活化培養基將T細胞活化三天(第-2天至第0天)。在第0天，使細胞(i)不受干擾(#1組)；(ii)置於不含IL2之幹細胞培養基中(#2組)；(iii)置於不含IL2之幹細胞培養基中，並使用二種仙台病毒轉導--一種表現EmGFP；一種表現SV40(#3組)；或(iv)置於不含IL2之幹細胞培養基中並使用四種仙台病毒轉導--表現KOS(KLF4、OCT3/4、SOX2)、KLF4、cMyc和SV40(#4組)。表現持續五天。
[圖2]顯示使用表現OSKM+SV40之仙台病毒轉導後第4天至第9天#4組中開始形成的群落。
[圖3A至3F]顯示依實施例1中之描述在不同條件下培養之T細胞的形態差異。圖3A顯示來自#4組之附著型細胞群落形成，圖3B顯示#3組中之T細胞，該T細胞未顯示附著和形成群落；圖3C顯示與圖3A相同之細胞群以用於與圖3D進行比較。圖3D顯示在使用抗CD3抗體(100 ng/ml)和抗CD28抗體(2μg/ml)刺激之標準T細胞培養基中3天後的T細胞；圖3E為與圖3A相同之細胞群以用於與圖3F進行比較。圖3F顯示正常之iPS細胞群落。顯示於圖3A、3C和3E中之附著型細胞在本文中稱為源自T細胞之附著型細胞。
[圖4]顯示部分重編程之第3、4和5天的CD3表現。值得注意的是，#4組中之經重編程的細胞顯示出在部分重編程的過程中損失CD3。
[圖5]顯示#4組中之附著細胞的側向散射/前向散射(SSC/FSC)FACS圖，其表明與#1組和#3組中之細胞相比較，附著之細胞較大且具有較複雜之結構。
[圖6]為SSC/FSC FACS等高線圖，其顯示第5天附著之細胞變得更大且具有複雜結構。
[圖7]顯示#4組中之附著的細胞在T細胞活化二天，隨後在T細胞培養基中再培養五天後恢復CD3和CD8表現。在第5天，使用在T細胞培養基中之1比100稀釋(1:100)的T細胞TRANSACT TM(Miltenyi Biotec)將在96孔盤中之T細胞活化2天。第5天，將在#4組條件下之細胞分在2個孔中，藉由移液來收穫漂浮之細胞和附著之細胞。活化後，將所有細胞在T細胞培養基中再培養5天。
[圖8]顯示CD3陽性細胞在第12天之表型。CCR7和CD62L為用於檢測某些T細胞類型(號者如初始、記憶幹細胞和中央記憶T細胞)之標記。該細胞在第12天恢復CD3表現，表明恢復T細胞表型。
[圖9]為描繪在第0天、第5天和第12天之細胞擴增的長條圖。使用流式細胞術，藉由計算珠粒(123count eBeads Counting beads，Thermo)數量來測量細胞擴增。儘管#4組中之附著之細胞在第5天顯示出異常外觀和降低之CD3表現，從第5天開始活化後，它們對活化做出反應並擴增。第12天相對於第5天之倍數變化表明與#1相比較，#4之擴增增加，尤其是在附著之細胞方面。此表明本文所使用之部分回春方法可增加T細胞擴增潛力，尤其是在附著之細胞方面。
[圖10]為經部分重編程之T細胞中之SSEA4和CD3表現的FACS等高線圖分析。第1天，依實施例2中之描述將經仙台病毒感染之T細胞轉移至經iMatrix塗層之培養皿上，並在iPS細胞培養基+60 IU/ml IL2中培養3天，然後從第4天起更換為不含IL2之iPS細胞培養基。在重編程之第8天進行FACS分析。該圖形顯示經部分重編程之T細胞表現hiPS細胞標記SSEA4並失去CD3 T細胞標記之表現。
[圖11]為概述源自PBMC之CD8 T細胞的部分重編程之示意圖(參見實施例4，表4)。
[圖12A至12B]顯示在再活化之前，使用流式細胞術測量已部分重編程達指定天數之細胞中的CD8a、CD8b、CD3之結果。圖12A顯示第7、9和10天時CD8a和CD8b表現的FACS圖，圖12B為第6至10天時CD8a和CD3CD8ab陽性細胞之百分比的繪製圖。參見實施例4。對CD4-CD8a+群圈選(gate)以進一步分析CD8B和CD3。無仙台病毒感染意味CD8 T細胞接受第一次和第二次刺激，但沒有被仙台病毒感染(無重編程因子)。
[圖13]為概述NY-ESO-1+T細胞之部分重編程和再活化的示意圖。為了清楚起見，標記整個過程的不同階段。
[圖14A至14D]之圖形顯示經回春之經NY-ESO-1 TCR轉導的T細胞之細胞介素製造和去顆粒化分析的結果。藉由FlowJo軟體分析FACS結果。使用單細胞＞活細胞＞CD3+＞CD8+CD4-＞NY-ESO-1四聚體+細胞對NY-ESO-1 Tg T細胞圈選，並使用單細胞＞活細胞＞CD3+＞CD8+CD4-＞NY-ESO-1 四聚體-細胞對模擬對照T細胞圈選。依所示計算並繪製IFNg+(A)、TNFa+(B)、IL-2+(C)和CD107a+(D)之頻率。
[圖15]為受刺激之T細胞中之細胞表面標記的表現水準相對於源自T細胞之iPS細胞之比率的瀑布圖(亦參見表5)。
[圖16]為未受刺激之T細胞中細胞表面標記之表現水準的比率相對於源自T細胞之iPS細胞的瀑布圖(亦參見表5)。
[圖17]顯示CD9和CD90為部分重編程之T細胞早期階段的可能細胞表面標記指標。該圖形顯示受刺激之T細胞、未受刺激之T細胞和第5天附著之部分重編程T細胞(源自T細胞之附著型細胞)中之CD9和CD90表現的流式細胞術分析。與CD9和CD90之表現相反，源自T細胞之附著型細胞中之早期iPS細胞表面標記SSEA4的表現在第5天沒有顯著變化。
[圖18A至18D]顯示刺激信號傳導對經部分重編程之T細胞重新獲得常規T細胞標記CD3和CD8a之表現以及存活和增殖至關重要。圖18A為FACS等高線圖，其顯示表現CD3和CD8a之經部分重編程的細胞在第7天(脫離日)之百分比。圖18B為FACS等高線圖，其顯示使用1：500或1：1000稀釋之TRANSACT活化或在僅T細胞培養基(TCM+IL2 60 IU/ml)中培養後第20天表現CD3和CD8a之細胞的百分比。圖18C和18D顯示不同群組的增殖和活力。
[圖19A至19B]顯示經回春之T細胞表現出在生物體外顯著增強和持續之增殖。T細胞係從一名37歲女性、一名42歲男性和一名52歲男性供體獲得。
[圖20A至20C]顯示IL-2對經回春的T細胞之影響。在回春後第45天，將經回春的T細胞共同培養在不含IL-2之TCM中。藉由FlowJo軟體分析FACS結果。使用單細胞＞活細胞＞CD3+細胞對所有細胞組圈選。從圖20B和圖20C可以看出，在無IL-2的情況下共同培養之細胞在六天內死亡。
[圖21]顯示經回春之37yF、42yM和52yM T細胞之細胞介素產製分析的結果。藉由FlowJo軟體分析FACS結果。使用單細胞＞活細胞＞CD3+＞CD8+CD4-細胞對所有細胞組圈選。依所顯示者計算並繪製IL2+和IFNg+之頻率。
[圖22A至22C]顯示經回春的T細胞在長期擴增後顯示出效應細胞表型。第1天，將經仙台病毒感染之T細胞轉移至經iMatrix塗層之培養皿中，並培養在T細胞培養基+60 IU/ml IL2或iPS細胞培養基+60 IU/ml IL2中3天，然後從第4天開始更換為不含IL2之iPS細胞培養基。在重編程後之第7天和第26天進行FACS分析。
[圖23]為用於定義T細胞之分化狀態的細胞標記(CD3、CD45RA、CD45RO、CD62L和CCR7)之FACS等高線圖分析。
[圖24]顯示在使用TRANSACT刺激後，來自二個不同供體(#3和#4)之經NY-ESO-1回春的細胞或對照細胞之倍數擴增。經回春的T細胞增殖之時間較對照組長且較超對照組多出約2至3週之培養。
[圖25]為經部分重編程之NY-ESO-1 T細胞中的NY-ESO-1-CD3、CD4-CD8b、CCR7-CD62L和CD45RO-CD45RA表現之FACS等高線圖分析。
[圖26A至26D]之圖形顯示經回春的經NY-ESO-1 TCR轉導之T細胞的細胞介素產製和去顆粒化分析之結果。藉由FlowJo軟體分析FACS結果。使用單細胞＞活細胞＞CD3+＞CD8+CD4-＞NY-ESO-1四聚體+細胞對NY-ESO-1 Tg T細胞圈選，及使用單細胞＞活細胞＞CD3+＞CD8+CD4-＞NY-ESO-1四聚體-細胞對模擬對照T細胞圈選。如所示，計算並繪製IFNg+(A)、TNFa+(B)、IL-2+(C)和CD107a+(D)之頻率。無標靶(對照組)；T2P-：不含肽之T2標靶細胞(-對照組)；T2P+：使用NYESO1肽脈衝之T2標靶細胞；Mel624：表現內源性NYESO1之HLA-A2+腫瘤細胞；PMA/I：使用PMA/離子黴素活化之細胞(+對照組)。
[圖27A至27B]顯示腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)回春增強增殖並導致更多幹細胞樣產物。圖27A為繪製細胞擴增的圖形並將經回春之TIL與對照細胞之倍數變化進行比較。圖27B顯示CCR7-CD62L和CCR7-TCF7表現之FACS圖並顯示經回春的TIL表現出高度表現幹性相關標記。
[圖28]描繪下文描述之實施例12中所採用之回春方案的示例性、非限制性方案。
[圖29A和29B]顯示結合實施例12之回春方案進行的表型分析。圖29A顯示供體1之代表性FACS圖，其顯示CD3+CD8b+之頻率(對單峰、死亡的染色陰性和淋巴細胞SSC/FSC圈選)。圖29B為依圖29A中圈選之CD3+CD8b+頻率的長條圖；各長條顯示供體1至3的平均值。誤差槓表示+/-1SD
[圖30A至30C]顯示實施例12之供體1至3中Sev轉導前和轉導後第7、13、18天的皮膚和血液時鐘結果。“Sev轉導前”表示仙台病毒轉導活化前之樣品。誤差槓顯示±1SD。
[圖31]說明NY-ESO-1TgCD4和CD8 T細胞回春的結果。藉由Transact刺激CD4或CD8 T細胞並在重編程前使用NY-ESO-1 TCR轉導。
[圖32A和32B]說明回春之NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞顯示出較少分化之表型的結果。
[圖33]說明回春之NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞較對照NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞增殖更多的結果。
[圖34A和34B]為顯示來自二名供體之eAge值的長條圖：24歲男性(A)和35歲男性(B)。該圖形說明藉由表觀遺傳年齡分析，經回春的NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞顯示出較對照NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞，及該供體之實際年齡更年輕的表型。圖形顯示從某些CpG位點之甲基化狀態分析之年齡數值的平均值和S.D.。
[圖35]描繪之長條圖顯示來自經回春的NY-ESO-1細胞和對照NY-ESO-1細胞之細胞內細胞介素染色。該圖形顯示當與帶有NY-ESO-1肽之T2細胞共同培養時，該經回春的NY-ESO-1 Tg CD4和CD8 T細胞製造較多之細胞介素(IFNg(A)、IL-2(B)和TNFa(C))。t檢驗p值統計顯著性：*＜0.05，**＜0.005，***＜0.0005，****＜0.0001。
[圖36]說明當與表現NY-ESO-1之標靶細胞(A375-NLR)重複共同培養時，回春之NY-ESO-1 Tg CD8 T細胞持續並保持其細胞毒性活性更久的結果。
[圖37]描述由添加經回春的NY-ESO-1 Tg CD4 T細胞而導致經回春的NY-ESO-1 Tg CD8 T細胞之細胞毒性增強。
[圖38A和38B]顯示來自二名不同供體之經回春的細胞和對照細胞在指定之時間點的適應性免疫相關細胞介素的表現水準。y軸表示以pg/mL計之細胞介素濃度。
[圖39A和39B]顯示來自二名不同供體之經回春的細胞和對照細胞在指定時間之先天免疫相關細胞介素的表現水準。y軸表示以pg/mL計之細胞介素濃度。
[圖40]描述使用NY-ESO-1 TCR轉導之T細胞的代表性FACS繪圖描述CD8 T細胞中之NY-ESO-1 TCR轉導效率：(左)CD4 xCD8b，(右)CD3 x NY-ESO-1 TCR TE。參見實施例15。
[圖41]提供實施例15之程序的示意圖。
[圖42]提供長條圖，其顯示與第0天相比較，在第7天從各條件收集之脫附的細胞數之倍數變化。參見實施例15。
[圖43]描述經部分重編程之NY-ESO-1 TCR Tg T細胞的再刺激。圖43提供第14天之代表性FACS圖。提供NY-ESO-1 TCR TE+細胞之頻率。參見實施例15。
[圖44]描述經部分重編程之NY-ESO-1 TCR Tg T細胞之再刺激。圖44提供NY-ESO-1 TCR TE+細胞在第14天之頻率的代表性長條圖。參見實施例15。
[圖45]為增殖曲線，其顯示經回春的NY-ESO-1 Tg T細胞較未經回春之對照組具有較高的增殖能力(參見實施例15)。
[圖46]說明CD8 T細胞中之CD19 CAR轉導效率。參見實施例16。以淋巴細胞＞單細胞＞Live/Dead-對細胞圈選，並繪製為CD3xCD8a(右二)、CAR獨特型xEGFR(最右)。表現tEGFR為成功轉導的標記。
[圖47]說明經回春的CD19 CAR T細胞，其顯示出較少分化之表型。在第13天，藉由FACS分析對照組和經回春的CD19 CAR Tg T細胞的表面標記和Tcf1表現。依淋巴細胞＞單細胞＞Live/Dead-＞CD19 CAR+對細胞圈選並繪製為CD4 x CD8a(左起第二個)、CCR7 x CD62L(右起第二個)和 CCR7 xTcf1(最右)。
[圖48]顯示經回春的CD19 CAR T細胞較對照CD19 CAR T細胞增殖更多。參見實施例16。依第3段之描述使CD19 CAR Tg T細胞回春和培養，並每3至4天計算細胞數。該圖形描繪與重編程因子轉導後第7天相比較之二個健康供體及其對應之對照細胞中的倍數變化。
[圖49]說明當與表現CD19之標靶細胞共同培養時，經回春的CD19 CAR T細胞產生相當之水準的細胞介素。參見實施例16。在第20天，在高爾基體轉運蛋白抑制劑之存在下，單獨培養對照或經回春的CD19 CAR Tg T細胞，或與PMA/離子黴素、Colo205(CD19-)或Nalm6(CD19+)一起培養。將表面抗原染色後，將細胞固定、可滲透化並藉由細胞內抗體染色。描繪各細胞介素陽性CAR+細胞之頻率。
[圖50A和50B]顯示在與表現CD19之標靶細胞重複共同培養後，經回春的CD19 CAR T細胞持續並較長時間地保持其細胞毒性活性。參見實施例16。圖50A和50B顯示對照細胞或經回春之CD19 CAR Tg T細胞與Nalm6-NLR細胞株共同培養之結果。每3至4天，將25%之先前培養物(在第4次和第5次共同培養物方面為10%)轉移到具有新鮮標靶的新培養盤中。使用Incucyte®活細胞分析系統監測標靶之生長，並使用基礎軟體分析模組(Base Software Analysis Module)進行分析。圖表顯示出在每個條件下供體#1(圖50A)和#2(圖50B)的Nalm6-NLR/圖像之數量。
[圖51]為用於說明之實施例17中描述之回春方案的示例性、非限制性實驗設計。
[圖52A和52B]為實施例17中所討論之各Sev和mSev組中在第11天脫附的細胞(圖52A)和相同細胞(即，在第11天脫附)在第17天(圖52B)的表型分析結果。提供之FACS圖顯示CD3+CD8b+之頻率(對單態、死亡染色陰性和淋巴細胞SSC/FSC圈選)。
[圖53A至53C]為增殖曲線，其顯示脫附後不同天數後之倍數變化(參見實施例17)。圖53A顯示在第7天發生脫附後之細胞計數的倍數變化。圖53B顯示在第9天發生脫附後之細胞計數的倍數變化。圖53C顯示在第11天發生脫附後之細胞計數的倍數變化。圖53A至53C表示2名供體之平均值。誤差槓表示±1 SD。
[圖54A]顯示實施例17之經重編程的T細胞脫附後6天表現之幹性表型。長條圖顯示技術副本中之平均TCF1+CCR7+頻率(對單態、死亡染色陰性和淋巴細胞SSC/FSC和CD3+CD8b+圈選)。誤差槓表示±1SD。
[圖54B]顯示實施例17之經重編程的T細胞脫附後6天表現之幹性表型。長條圖顯示技術副本中之平均CCR7+CD62L+頻率(對單態、死亡染色陰性和淋巴細胞SSC/FSC和CD3+CD8b+圈選)。誤差槓表示±1SD。
[圖55]顯示依實施例17中之使用Sev或mSev短暫重編程並在第7、9和11天之T細胞的表觀遺傳年齡。表觀遺傳年齡係使用霍瓦斯(Horvath)皮膚血鐘測量。
[圖56]顯示實施例18之經回春細胞和對照細胞的增殖曲線。
[圖57A至57D]顯示在實施例18之第7天和第13天，來自對照和經回春細胞的健康供體CD8+T細胞的總轉錄本(transcriptome)剖析。圖57A顯示藉由UMAP可視化之來自所有四名供體的對照細胞和經回春細胞的CD8+T細胞之單細胞RNA-seq數據。圖57B顯示編碼CD8+T細胞之單細胞RNA-seq數據中經回春的細胞之山中因子(Yamanaka factor)的轉錄子之表現水準，該CD8+T細胞係來自對照組和經回春的細胞。圖57C顯示編碼CD8+T細胞之大量RNA-seq數據中之山中因子的轉錄子之表現水準，該CD8+T細胞係來自對照組和經回春的細胞。圖57D顯示與健康供體CD8+T細胞中之內源性cMYC基因比對的基因序列的基因組比對可視化，該CD8+T細胞係來自第7天和第13天之對照和經回春的細胞。
[圖58A]描繪在實施例18之傳統大量細胞RNA-seq數據的3名供體(即，供體編號11347、12254和26221)中，經回春的細胞在第7天和第13天與對照細胞相比較下代謝基因組富集。x軸刻度之差異顯示第7天和第13天之調整後的p值。灰色實線顯示顯著性閾值(調整後之P值＜0.05)。
[圖58B]顯示與圖59A中所示者相同之UMAP表示法上的糖解和氧化磷酸化基因組之AddModule評分(參見實施例18)。
[圖59A]為說明與對照細胞相比較，經回春的細胞在第13天富集初始基因組(Gattinoni)的UMAP(參見實施例18)。
[圖59B]為說明與對照細胞相比較，經回春的細胞在第13天富集初始基因組(Gattinoni)的柱狀圖(參見實施例18)。
[圖60A和60B]為顯示回春後供體1和2之增殖曲線的圖形。所有經回春的細胞均顯示出較對照組高得多的擴增倍數。在一名供體中，TransAct刺激組顯示出較CD137+選擇組更高之擴增，而在另一名供體中則較低。這表明腫瘤反應性群對刺激的不同親和力。33天後顯示擴增減少，這可能是由於該培養物之接種細胞密度對於培養盤而言是次優的，導致養分和氧氣供應不足。參見示例19。
[圖61A和61B]之圖形顯示經回春的細胞和對照細胞中之CD62L和CCR7隨時間推移的表現。CD62L+CCR7+保留在回春早期。在指定之日收穫細胞並使用經螢光標記之抗體染色，然後藉由流式細胞術進行分析。結果表明，在第14天和17天，該二名供體中之回春的細胞高度表現CD62L+CCR7+。參見實施例19。
[圖62]之圖形顯示供體3回春後之增殖曲線。TILs富集CD45+，然後使用TransAct刺激之，隨後進行回春。在指定日計算細胞數量。與對照細胞相比較，經回春之CD45+顯示出增殖大為增進，而CD45-組顯示出非常有限之擴增。參見實施例19。
[圖63]顯示在第15天測量與對照組和供體3中之幹性相關的標記表現之FACS等高線圖。經回春的CD45+TIL顯示出高出許多之CD62L+CCR7+和TCF7+CCR7+表現，但CD45-細胞則不。參見實施例19。
[圖64]之圖形顯示對照組和供體4回春後之增殖曲線。使用1：500(HI)或1:2000(LO)之TransAct刺激細胞。經回春的細胞(HI和LO組)在重定向至T細胞後顯示出與對照組相似之擴增率。
[圖65]顯示測量對照細胞和供體4中與幹性相關之標記的表現，和回春後第21天之表現的FACS等高線圖。經回春的細胞(HI和LO組)顯示出較對照細胞高之CD62L+CCR7+和TCF7+CCR7+表現。參見實施例19。
[圖66]之圖形顯示來自供體7之對照或經回春的細胞在指定時間的表觀遺傳年齡(eAge)。對照細胞之表觀遺傳年齡與供體之實際年齡相似，而經回春的細胞在第15天顯示出年齡低得多，該表觀遺傳年齡隨著擴增時間的增加逐漸增加。參見實施例19。
[圖67]之圖形顯示來自供體9之對照或經回春的細胞在指定時間的表觀遺傳年齡(eAge)。對照組之表觀遺傳年齡與供體年齡相似，而經回春的細胞在第15天顯示出低得多的表觀遺傳年齡，該表觀遺傳年齡隨著培養中增殖時間的推移而逐漸回復到對照水準。參見實施例19。
[圖68]之圖形顯示來自供體7和供體9之對照和經回春的細胞之增殖。經回春細胞在重定向至T細胞後顯示出與對照組相似之擴增率。參見實施例19。
[圖69A]顯示來自實施例20之供體6在第11天脫附的細胞在第14天和第18的表型分析。FACS圖顯示CD3+之頻率(在單態、死亡染色陰性和CD3+細胞上圈選)。經回春的細胞在第14和18天顯示出較高之TCF7+CCR7+。參見實施例20和表10。
[圖69B]顯示來自實施例20之供體8在第11天脫附的細胞在第14天和第18的表型分析。FACS圖顯示CD3+之頻率(在單態、死亡染色陰性和CD3+細胞上圈選)。經回春的細胞在第14和18天顯示出較高之TCF7+CCR7+。參見實施例20和表10。
[圖70]顯示出與經活化的T細胞對照組相比較，附著之細胞(微弱附著之細胞、附著之細胞、強力附著之細胞)在第10天顯示出較高之整合素a6和整合素b1表現。強力附著之細胞顯示出較微弱附著之細胞和附著之細胞為高之整合素a6和整合素b1表現。這些圖係在單態和存活門控之後獲得。
[圖71]顯示整合素a6和整合素b1表現在第10天T細胞活化後降低。長條圖顯示圖70之圖的MFI(平均螢光強度)。藉由各時間點之經活化的T細胞對照組之MFI將這些數值標準化。對照值為1。
[圖72]顯示附著之細胞在第10天失去CD3表現，但在第17天獲得CD3表現。
[圖73]顯示微弱附著之細胞、附著之細胞和強力附著之細胞表現出高度增殖。強力附著之細胞顯示細胞擴增較晚開始。
[圖74A和74B]顯示附著之細胞(尤其是強力附著之細胞)在第10天(圖74A)和第17天(圖74B)表現出TCF1和CCR7高度表現。MFI係從單態和存活門控後之數據獲得。
[圖75]顯示第7天和第13天來自對照和經回春的細胞之單細胞TCR序列的辛普森單株性(Simpson clonality)分佈(參見實施例18)。 詳細說明
應理解的是，本文之描述僅為示例性和說明性的，並不限制所主張之揭示內容。本申請案中，除非另外具體說明，否則單數的使用包括複數。
本文所使用之章節標題僅用於組織目的，不應被解釋為限制所描述之主題。
本揭示之全文引用各種專利案、專利申請案和出版物。這些專利案、專利申請案和出版物之全部揭示內容以引用方式併入本揭示，以更全面地描述截至本揭示之日期為止其中之技術熟習人士已知之技藝狀態。當引用之專利案、專利申請案和出版物與本揭示不一致時，以本揭示為主。
為方便起見，此處收集本專利說明書、實施例和申請專利範圍中所使用的某些術語。除非另有定義，本揭示中所使用之所有技術和科學術語之含義與本揭示所屬之技藝中的一般技術人士所通常理解者相同。除非另有說明，根據本揭示所使用之下列術語應被理解為具有下列含義：
本申請案中，除非另有說明，否則所使用之“或”意指“和/或”。此外，所使用之術語“包括(including)”，以及諸如“包括(includes)”和“包括(included)”等其他形式並非限制性的。此外，除非另外具體指明，諸如“元件”或“組分”之術語同時包含含有一個單元之元件和組分，及含有多於一個亞單元之元件和組分。
本揭示部分關於產生經回春的T細胞之方法，該方法藉由部分重編程和再活化之過程來將該經部分重編程之細胞恢復成經回春和有功能之T細胞。於某些實施態樣中，部分重編程包含在T細胞中短暫表現重編程因子。該部分重編程過程導致表現一或多種去分化之細胞的標記，但保留T細胞譜系之表型標記的“源自T細胞之附著型細胞”形成。因此，源自T細胞之附著型細胞為部分去分化之T細胞，當與T細胞活化化合物接觸時，其恢復為有功能之T細胞。如本文中進一步詳細描述者，藉由該過程產生之T細胞顯示出細胞回春之特徵，同時保持譜系穩定性並保持抗原特異性。
如本文所使用者，術語“免疫細胞”表示任何類型之免疫細胞，包括，例如T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞，等。於某些示例性實施態樣中，本文揭示之免疫細胞為T細胞。
術語“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”包括單股和雙股核苷酸聚合物兩者。包含核苷酸之多核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型之核苷酸的修飾形式。該修飾包括鹼基修飾(諸如溴尿苷和肌苷衍生物)、核糖修飾(諸如2’,3’-雙脫氧核糖)和核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、縮苯胺硫代磷酸酯、縮苯胺磷酸酯和胺基磷酸酯。
術語“寡核苷酸”係指包含200個或更少個核苷酸之多核苷酸。寡核苷酸可為單股或雙股的，例如用於構建突變基因。寡核苷酸可為有義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可包括用於檢測分析之標籤，包括放射標籤、螢光標籤、半抗原或抗原標籤。寡核苷酸可作為，例如PCR引物、選殖引物或雜交探針。
術語“控制序列”係指可影響與其連接之編碼序列的表現和加工之多核苷酸序列。該等控制序列之性質可取決於宿主生物。於特定之實施態樣中，用於原核生物之控制序列可包括啟動子、核醣體結合位點和轉錄終止序列。例如，用於真核生物之控制序列可包括包含一或多個用於轉錄因子之識別位點的啟動子、轉錄增強子序列和轉錄終止序列。“控制序列”可以包括前導序列(信號肽)和/或融合伴侶序列。
如本文所使用者，“可操作地連接”係指該術語適用之組分處於允許它們在合適之條件下執行其固有功能的關係中。
術語“載體”係指用於將蛋白質編碼信息轉移入宿主細胞中之任何分子或實體(例如核酸、質粒、噬菌體或病毒)。術語“表現載體”或“表現構建體”係指適合用於宿主細胞轉形之載體且其含有指導和/或控制(與宿主細胞結合)與其可操作地連接之一或多個異源編碼區的表現之核酸序列。表現構建體可包括，但不限於影響或控制轉錄、轉譯，且若存有內含子，影響與其可操作地連接之編碼區的RNA剪接之序列。
術語“宿主細胞”係指已使用核酸序列轉形或能夠使用核酸序列轉形，從而表現所欲基因之細胞。該術語包括親本細胞之後代，無論該後代在形態上或基因組成上與原始親本細胞是否相同，只要存在該所欲基因即可。
術語“轉形”係指細胞遺傳特徵之變化，當細胞已經過修飾而含有新的DNA或RNA時，細胞已被轉形。例如，經由轉染、轉導、使用奈米顆粒(例如脂質奈米顆粒)遞送或其他技術引入新的遺傳物質使細胞從其天然狀態經遺傳修飾而轉形。在轉染或轉導後，該轉形DNA可藉由物理整合入細胞之染色體中而與該細胞之DNA重組，或可以游離基因體元件形式短暫保持而不被複製，或可以質粒形式獨立複製。當轉形DNA隨著細胞分裂而複製時，細胞被認為已被“穩定轉形”。
術語“轉染”係指外來或外源遺傳物質(DNA或RNA)被細胞採取。許多轉染技術已為本技藝所周知且揭示於本文中。參見，例如Graham et al.,1973, Virology, 1973, 52:456；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001，同上；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986, Elsevier；Chu et al., 1981, Gene, 13:197。
術語“轉導”係指經由病毒載體將外源DNA或RNA引入細胞所憑藉之過程。參見，例如Jones et al., Genetics: Principles and Analysis, 1998, Boston: Jones & Bartlett Publ。
術語“多肽”或“蛋白質”係指具有蛋白質之胺基酸序列的大分子，包括從天然序列刪除、添加和/或取代一或多個胺基酸。術語“多肽”和“蛋白質”具體包含已從抗原結合蛋白刪除、添加和/或取代一或多個胺基酸之抗原結合分子、抗體或序列。術語“多肽片段”係指與全長天然蛋白質相比較具有胺基端缺失、羧基端缺失和/或內部缺失之多肽。與天然蛋白質相比較，該等片段亦可含有經修飾之胺基酸。有用之多肽片段包括抗原結合分子之免疫功能片段。
術語“經分離的”係指(i)不含至少某些通常會與其一起發現的其他蛋白質，(ii)基本上不含來自相同來源，例如來自相同物種的其他蛋白質，(iii)與至少約50%之自然界中與其相伴之多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分開，(iv)與在自然界中不與其相聯結之多肽可操作地聯結(藉由共價或非共價交互作用)，或(v)在自然界中不會發生。
多肽(例如抗原結合分子)之“變體”包含相對於另一多肽序列而言，其中有一或多個胺基酸殘基被插入、刪除和/或取代入該胺基酸序列中的胺基酸序列。變體包括融合蛋白。
術語“同一性”係指藉由比對和比較序列來測定之具有二或更多個多肽分子或二或更多個核酸分子的序列之間的關係。“同一性百分比”係指在相比較的分子中之胺基酸或核苷酸之間的相同殘基之百分比，其係基於被比較之最小分子的尺寸計算。在這些計算方面，比對中之間隙(若有的話)較佳為藉由特定數學模型或電腦程式(即“算法”)解決。
為了計算同一性百分比，被比較之序列通常以能在序列之間導致最大匹配的方式進行比對。可用於測定同一性百分比之電腦程式的一種實例為GCG程式包，其包括GAP(Devereux et al., Nucl. Acid Res., 1984, 12, 387；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)。電腦算法GAP係用於比對欲測定序列同一性百分比的二個多肽或多核苷酸。該序列係以達成其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(如藉由該算法測定之“匹配的跨度”)的方式比對。於某些實施態樣中，該算法亦使用標準比較矩陣(參見，例如用於PAM 250比較矩陣之Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352；用於BLO-SUM 62比較矩陣之Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 10915-10919)。
如本文所使用之二十種常規(例如天然存在的)胺基酸及其縮寫係遵循常規用法。參見，例如Immunology A Synthesis(2nd Edition, Golub and Green, Eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991))，其以引用方式併入本文以用於任何目的。該二十種常規胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸，諸如α-、α-二取代之胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸和其他非常規胺基酸亦可為用於本揭示之多肽的合適組分。非常規胺基酸之實例包括：4-羥脯胺酸、γ羧基-麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、e-N-乙醯離胺酸、0-磷酸絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸，及其他類似之胺基酸和亞胺基酸(例如4-羥脯胺酸)。於本文使用之多肽符號中，根據標準用法和慣例，左手方向為胺基端方向，右手方向為羧基端方向。
保守性胺基酸取代可包含非天然存在之胺基酸殘基，其通常藉由化學肽合成被併入而非藉由在生物系統中合成被併入。這些包括肽模擬物和其他反向或倒轉形式之胺基酸部分。天然存在之殘基可根據常見之側鏈特性分為幾類： a)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； b)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； c)酸性：Asp、Glu； d)鹼性：His、Lys、Arg； e)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；和 f)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守性取代可能涉及將這些類別中之一員交換為另一類別之成員。
根據某些實施態樣，在改變抗原結合分子，該經工程處理之T細胞的共刺激或活化結構域時，可以考慮胺基酸之親水指數(hydropathic index)。各胺基酸基於其疏水性和電荷特性已被指定一個親水指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩胺醯胺(-3.5)；天門冬胺酸(-3.5)；天門冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；和精胺酸(-4.5)。參見，例如Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol., 157, 105-131。已知某些胺基酸可取代具有類似親水指數或分數的其他胺基酸，且仍保持相似之生物活性。本技藝亦理解可以在親水性之基礎上有效地進行類似胺基酸之取代，特別是當由此產生之生物功能性蛋白質或肽係意圖用於免疫學實施態樣時(如本案例)。示例性胺基酸取代列於表1中。
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術語“衍生物”係指包括除胺基酸(或核酸)之插入、缺失或取代之外的化學修飾之分子。於某些實施態樣中，衍生物包含共價修飾，包括，但不限於與聚合物、脂質或其他有機或無機部分之化學鍵結。於某些實施態樣中，經化學修飾之抗原結合分子可較未經化學修飾之抗原結合分子具有更長之循環半衰期。於一些實施態樣中，衍生之抗原結合分子經共價修飾以包括一或多個水溶性聚合物連接，包括，但不限於聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。
肽類似物常用於製藥工業中作為非肽藥物，其性質與模板肽的性質類似。這些類型之非肽化合物被稱為“肽模擬物(peptide mimetic)”或“肽模擬物(peptidomimetic)”。Fauchere, J. L., 1986, Adv. Drug Res., 1986, 15, 29；Veber, D. F. & Freidinger, R. M., 1985, Trends in Neuroscience, 8, 392-396；和Evans, B. E., et al., 1987, J.  Med. Chem., 30, 1229-1239，其以引用方式併入本文以用於任何目的。
術語“治療有效量”係指經測定用於在哺乳動物中產生治療反應之免疫細胞(例如T細胞)或其他治療劑之量。本技藝之一般技術人士可輕易查明該等治療有效量。
術語“患者”和“個體”可互換使用且包括人類和非人類動物個體，以及那些具有被正式診斷之疾病者、那些不具有被正式識別之病症者、那些接受醫療照顧者、那些處於發展出病症風險者，等。
術語“治療(treat)”和“治療(treatment)”包括治療性治療、預防性治療和其中降低個體發展出病症或其他風險因素之治療應用。治療不需要完全治愈病症且包含其中減輕症狀或潛在風險因子之治療實施態樣。術語“預防”並不需要100%排除事件發生之可能性。相反地，其表示在該化合物或方法之存在下，事件發生的可能性已降低。
標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養和轉形(例如電穿孔、脂質轉染)。酶促反應和純化技術可根據製造商之說明書或依本技藝中通常完成的或依本文之描述進行。上述技術和程序通常可根據本技藝所周知之常規方法，及依本說專利明書全文引用和討論之各種一般和更具體的參考文獻中之描述進行。參見，例如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其以引用方式併入本文以用於任何目的。
如本文所使用者，術語“基本上”或“實質上”係指與參考量、水準、數值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、數量、重量或長度相比較，高出約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之量、水準、數值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、數量、重量或長度。於某些實施態樣中，術語“實質上相同”或“基本上相同”係指與參考量、水準、數值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、數量、重量或長度相比較，約為相同之量、水準、數值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、數量、重量或長度的範圍。
如本文所使用者，術語“基本上不含”和“實質上不含”可互換使用，且當用於描述組成物，諸如細胞群或培養基時係指不含具體指定之物質(諸如95%不含、96%不含、97%不含、98%不含、99%不含該具體指定之物質)的組成物，或藉由常規方式測量時無法檢測到。類似之含義可應用於術語“不存在”，其中係指不存在組成物之特定物質或組分。
如本文所使用者，術語“可感知的”係指可藉由一或多種標準方法輕易檢測到之量、水準、數值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、數量、重量或長度的範圍。術語“不可感知的(not-appreciable)”和“不可感知的(not appreciable)”及等效詞係指藉由標準方法不易檢測或無法檢測之量、水準、數值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、數量、重量或長度的範圍。於某些實施態中，若事件發生少於5%、4%、3%、2%、1%、0.1%、0.001%或更少之時間，則該事件為不可察覺的。
在本專利說明書全文中，除非上下文另有要求，否則字詞“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”將被理解為暗示包括所陳述之步驟或元素，或步驟或元素群組，但並不排除任何其他步驟或元素、或步驟或元素群組。於特定之實施態樣中，術語“包括”、“具有”、“含有”和“包含”之使用為同義。
如本文所使用者，“由……組成”係指包括，且限於“由……組成”之後的任何內容。因此，短語“由……組成”表示所列之元素為必要的或強制性的，且不能存在其他元素。
“基本上由……組成”係指包括列於該短語之後的任何元素且限於不會干擾或促成本揭示中具體指明之該所列元素的活性或作用的其他元素。因此，短語“基本上由……組成”表示所列元素為必要的或強制性的，但無其他元素是可選擇的且可能存在或可能不存在係取決於它們是否影響所列之元素的活性或作用。
藉由保留附帶條件或排除任何該等群組之任何個別成員(包括可根據一個範圍或以任何類似方式主張之在該群組內的任何子範圍或子範圍之組合)的權利，可出於任何原因來主張少於本揭示之全部措施的權利。此外，藉由保留附帶條件或排除任何個別取代基、類似物、化合物、配體、結構或其基團或所主張權利之群組的任何成員，可出於任何原因來主張少於本揭示之全部措施的權利。
本專利說明書之全文中對“一(one)實施態樣”、“一(a)實施態樣”、“特定之實施態樣”、“相關之實施態樣”、“某一實施態樣”、“另外之實施態樣”或“進一步之實施態樣”或彼等之組合的引用意指針對該實施態樣描述之特定特性、結構或特徵包括在至少一個本揭示之實施態樣中。因此，在本專利說明書全文各處出現前述短語時不一定都指相同的實施態樣。再者，該特定特性、結構或特徵可在一或多個實施態樣中以任何合適之方式組合。
如本文所使用者，術語“約”或“近似”係指相對於參考量、水準、數值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、數量、重量或長度，變化多達30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%之量、水準、數值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、數量、重量或長度。於特定之實施態樣中，當術語“約”或“近似”在數值之前時，表示該值加上或減去15%、10%、5%或1%之範圍，或其中間任何範圍。
如本文所使用者，“與關聯”表示二個事件、實體和/或現象之間的關係。若一個事件、實體和/或現象的存在、水準和/或形式與另一事件、實體和/或現象的存在、水準和/或形式有關，則該二個事件、實體和/或現象彼此關聯，如該術語在本文中之用途。
如本文所使用者，術語“記憶”T細胞係指先前已遭遇並對其同源抗原(例如體內、生物體外或離體)有反應或已被刺激，例如使用抗-CD3抗體(例如在生物體外或離體)刺激的T細胞。免疫細胞在第二次暴露時具有“記憶樣”表型，該記憶T細胞可複製以產生較初次暴露期間更快和更強之免疫反應。於一些態樣中，記憶T細胞包含中央記憶T細胞(TCM細胞)、效應記憶T細胞(TEM細胞)、組織常駐記憶T細胞(TRM細胞)、幹細胞樣記憶T細胞(TSCM細胞)或彼等之任何組合。
如本文所使用者，術語“幹細胞樣記憶T細胞”、“T記憶幹細胞”或“TSCM細胞”係指表現CD95、CD45RA、CCR7和CD62L且被賦予幹細胞樣能力以自我更新，及多潛能能力以重建整個記憶和效應T細胞亞群譜之記憶T細胞。
如本文所使用者，術語“中央記憶T細胞”或“TCM細胞”係指表現CD45RO、CCR7和CD62L之記憶T細胞。中央記憶T細胞通常係在淋巴結和外周循環中發現。
如本文所使用者，術語“效應記憶T細胞”或“TEM細胞”係指表現CD45RO，但缺乏CCR7和CD62L表現之記憶T細胞。由於效應記憶T細胞缺乏淋巴結歸巢受體(例如CCR7和CD62L)，這些細胞通常係在外周循環和非淋巴組織中發現。
如本文所使用者，術語“組織駐留記憶T細胞”或“TRM細胞”係指不循環且保持駐留在外周組織，諸如皮膚、肺和胃腸道中之記憶T細胞。於一些態樣中，組織駐留記憶T細胞亦為效應記憶T細胞。
如本文所使用者，術語“初始T細胞”或“TN細胞”係指表現CD45RA、CCR7和CD62L，但不表現CD95之T細胞。TN細胞代表T細胞譜系中未分化程度最高之細胞。TN細胞和抗原呈遞細胞(APC)之間的交互作用誘導TN細胞之分化朝向活化之TEFF細胞和免疫反應。
如本文所使用者，術語“幹性”、“幹細胞樣”、“幹樣”或“分化程度較低”係指表現與較為初始之表型一致之標記的免疫細胞(例如T細胞或TIL)。例如，分化程度較低之T細胞可表現TN或TSCM細胞之一或多種標記特徵。於一些態樣中，“分化程度較低”或“幹樣”T細胞表現CD45RA、CCR7和CD62L。於一些態樣中，“分化程度較低”或“幹樣”T細胞表現CD45RA、CCR7、CD62L和TCF7。於一些態樣中，“分化程度較低”或“幹樣”T細胞不表現CD45RO或CD45RO低。於一些態樣中，本文揭示之方法促進具有分化程度較低之表型的免疫細胞(例如T細胞)。不受任何特定機制的束縛，於一些態樣中，本文揭示之方法阻斷、抑制或限制分化程度較低之免疫細胞(例如T細胞)的分化，導致培養中之幹樣細胞數量增加。例如，一般認為為了有效控制腫瘤，過繼性轉移分化程度較低之免疫細胞，例如具有幹細胞樣記憶或中央記憶表型之T細胞較佳。參見Gattinoni, L., et al., J. Clin. Invest. 115:1616-1626 (2005)、Gattinoni, L., et al. Nat Med 15(7):808-814 (2009)、Lynn, R.C., et al., Nature 576(7786): 293-300 (2019)；Gattinoni, L., et al. Nat Rev 12:671-684 (2012)、Klebanoff, C., et al., J. Immunother 35(9):651-670 (2012)和Gattinoni, L., et al., Nat Med 17(10): 1290-1297 (2011)。
幹性係藉由自我更新之能力、多潛能性和增殖潛力之持續性表徵。於一些態樣中，幹性係藉由特定之基因印記(gene signature)(例如跨多個基因之組合表現模式)表徵。於一些態樣中，該幹樣細胞可藉由總轉錄本分析來鑑定，例如使用本文揭示之幹性基因印記。於一些態樣中，該基因印記包含一或多個選自下列群組之基因：ACTN1、DSC1、TSHZ2、MYB、LEF1、TIMD4、MAL、KRT73、SESN3、CDCA7L、LOC283174、TCF7、SLC16A10、LASS6、UBE2E2、IL7R、GCNT4、TAF4B、SULT1B1、SELP、KRT72、STXBP1、TCEA3、FCGBP、CXCR5、GPA33、NELL2、APBA2、SELL、VIPR1、FAM153B、PPFIBP2、FCER1G、GJB6、OCM2、GCET2、LRRN1、IL6ST、LRRC16A、IGSF9B、EFHA2、LOC129293、APP、PKIA、ZC3H12D、CHMP7、KIAA0748、SLC22A17、FLJ13197、NRCAM、C5orf13、GIPC3、WNT7A、FAM117B、BEND5、LGMN、FAM63A、FAM153B、ARHGEF11、RBM11、RIC3、LDLRAP1、PELI1、PTK2、KCTD12、LMO7、CEP68、SDK2、MCOLN3、ZNF238、EDAR、FAM153C、FAAH2、BCL9、C17orf48、MAP1D、ZSWIM1、SORBS3、IL4R、SERPINF1、C16orf45、SPTBN1、KCNQ1、LDHB、BZW2、NBEA、GAL3ST4、CRTC3、MAP3K1、HLA-DOA、RAB43、SGTB、CNN3、CWH43、KLHL3、PIM2、RGMB、C16orf74、AEBP1、SNORD115-11、SNORD115-11、GRAP，以及彼等之任何組合(參見，例如Gattinoni et al., Nature Medicine 17(10):1290-97 (2011))。於一些態樣中，該基因印記包含一或多個選自下列群組之基因：NOG、TIMD4、MYB、UBE2E2、FCER1G、HAVCR1、FCGBP、PPFIBP2、TPST1、ACTN1、IGF1R、KRT72、SLC16A10、GJB6、LRRN1、PRAGMIN、GIPC3、FLNB、ARRB1、SLC7A8、NUCB2、LRRC7、MYO15B、MAL、AEBP1、SDK2、BZW2、GAL3ST4、PITPNM2、ZNF496、FAM117B、C16orf74、TDRD6、TSPAN32、C18orf22、C3orf44、LOC129293、ZC3H12D、MLXIP、C7orf10、STXBP1、KCNQ1、FLJ13197、LDLRAP1、RAB43、RIN3、SLC22A17、AGBL3、TCEA3、NCRNA00185、FAM153B、FAM153C、VIPR1、MMP19、HBS1L、EEF2K、SNORA5C、UBASH3A、FLJ43390、RP6-213H19.1、INPP5A、PIM2、TNFRSF10D、SNRK、LOC100128288、PIGV、LOC100129858、SPTBN1、PROS1、MMP28、HES1、CACHD1、NSUN5C、LEF1、TTTY14、SNORA54、HSF2、C16orf67、NSUN5B、KIAA1257、NRG2、CAD、TARBP1、STRADB、MT1F、TMEM41B、PDHX、KDM6B、LOC100288322、UXS1、LGMN、NANOS2、PYGB、RASGRP2、C14orf80、XPO6、SLC24A6、FAM113A、MRM1、FBXW8、NDUFS2、KCTD12，以及彼等之任何組合(參見，例如Gattinoni, L., et al., Nat Med 17(10): 1290-1297 (2011))。
如本文所使用者，術語“單核細胞”係指在血液中發現之具有單一，圓形核的細胞。
如本文所使用者，術語“全潛能(totipotent)”係指細胞產生在胚胎中發現之任何細胞類型以及胚胎外(胎盤)細胞之能力。
如本文所使用者，術語“分化多能(pluripotent)”係指細胞形成身體或體細胞之所有譜系(即，胚胎本身而非胎盤)的能力。例如，胚胎幹細胞為一種分化多能幹細胞之類型，其可用於從三個胚層：外胚層、中胚層和內胚層的各個胚層形成細胞。分化多能性可部分藉由評估細胞之分化多能性特徵來確定。分化多能性特徵可包括，但不限於：(i)分化多能幹細胞形態；(ii)無限自我更新之潛力；(iii)分化成所有三種體細胞譜系(外胚層、中胚層和內胚層)之能力；(iv)形成由三種體細胞譜系組成之畸胎瘤；及(v)形成由來自三個體細胞譜系之細胞組成的胚狀體；(vi)表現一或多種分化多能幹細胞標記，包括，但不限於SSEA1(僅小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA2-54(ALP)、TRA1-85、GCTM-2、TG343、TRA2-49、CD340、CD326、平足蛋白(Podoplanin)和TG30(CD9)；(vii)表現某些與體幹細胞或來自胚胎幹細胞之早期分化細胞相關的其他標記，包括，但不限於整合素α6β1、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、CD30和/或LD50；(viii)表現某些分化多能基因，包括OCT4、NANOG、SOX2。
如本文所使用者，術語“多潛能(multipotent)”係指細胞發育成特定譜系中之有限數量的細胞類型之能力。
如本文所使用者，術語“非分化多能細胞”係指任何不具有完全分化多能性之細胞，諸如不完全或部分分化多能幹細胞、多潛能細胞、寡能細胞、單能細胞(例如祖細胞)和終末分化細胞。
如本文所使用者，術語“引入”係指包含使細胞與多核苷酸、多肽或小分子接觸之過程。引入步驟亦可包含將多核苷酸或多肽顯微注射入細胞中，使用脂質體將多核苷酸或多肽遞送入細胞中，或將多核苷酸或多肽與細胞可滲透部分融合以將它們引入細胞中。
本揭示之一種實施態樣提供在生物體外製備經分離或純化之免疫細胞(例如T細胞)群的方法。經分離或純化之免疫細胞(例如T細胞)群可包含在用於治療或預防如本文所描述之各種不同病症的醫藥組成物中。
“分化”為細胞失去其自我更新之效力和能力而最終成為離散譜系內之成熟和離散細胞類型所憑藉的過程(參見，例如Crompton 2014,Trends in Immunol. 35:178-185)。
“去分化”係指細胞變得較不那麼特化所憑藉的過程。於某些實施態樣中，去分化為喪失正常發育路徑內或相同細胞譜系內之特化特徵。於某些實施態樣中，去分化為相同細胞譜系內的去分化(分級去分化)。然而，如本文所述，於另一實施態樣中，去分化可能不在相同細胞譜系內。例如，於某些實施態樣中，如本文所描述之經部分重編程的T細胞導致細胞藉由獲得CD9和/或CD90和/或SSEA4，通常不與人類常規T細胞譜系關聯之標記的表現而去分化，且該細胞開始失去T細胞標記CD3和/或CD4和/或CD8之表現。該等去分化不符合標準之T細胞分層譜系。在使用T細胞活化劑刺激後，這些細胞可恢復成常規T細胞。CD90表現僅與罕見之人類T細胞群有關，諸如皮質胸腺細胞和Th17之子集。
回春為回復因細胞老化而喪失之細胞功能的過程。細胞年齡可描述為供體之實際年齡加上α因子的總和，該α因子係藉由組合數種引起細胞微環境中之壓力的因子來測定。這些因子可在體內觀察到(例如重度吸煙、慢性疾病，包括自體免疫疾病、感染、肥胖、代謝問題，以及可能之抑鬱)，且可能在生物體外藉由人工方式誘導(例如長期暴露於腫瘤抗原或其他刺激、高水準之細胞介素、缺氧，等)。由於實際年齡或持續強壓力刺激之產物而變老的細胞被稱為衰老細胞。數種細胞過程已被確定受細胞年齡，諸如實際年齡、腫瘤抗原特異性、殺手細胞特性、增殖能力、代謝、DNA修復系統廢止、端粒長度和幹性潛能喪失影響。
如本文所使用者，“經回春之T細胞”係指已與一或多種重編程因子接觸一段期間之T細胞，該期間足以使該T細胞開始附著在培養容器表面以形成源自T細胞之附著型細胞，該源自T細胞之附著型細胞在使用T細胞活化劑和視需要地，免疫調節分子刺激後回復成功能性T細胞。
例如，本文描述之方法產生經回春之T細胞，該經回春之T細胞提供下列任何一或多者：體內增殖、存活、持久性和/或細胞毒性增加；與終末分化之T細胞相比較，表觀遺傳年齡降低、端粒長度增加、代謝改善、細胞凋亡和其他與細胞衰老相關之標記減少，以及抗腫瘤活性提升。於某些實施態樣中，經回春之T細胞表現出多株TCR組庫和長期體內移植之能力。在表觀遺傳印記、端粒長度、代謝活性和功能方面，經回春之T細胞可能表現出年輕T細胞之生物學和表型特徵。於各種實施態樣中，如本文所描述之部分重編程過程可導致T細胞部分去分化，例如失去T細胞表型的某些面向，這些可透過活化T細胞而重新獲得，而T細胞可透過TCR信號傳導和/或在適當之培養基中培養來活化。
於各種實施態樣中，該經回春之T細胞可用於靶向癌症、病毒或自身免疫疾病。於各種實施態樣中，該經部分重編程之T細胞可用於重建整個後天免疫系統或緩解免疫功能不全患者。
於某些實施態樣中，該T細胞係經部分重編程並透過短暫表現重編程因子回春。於各種實施態樣中，T細胞之形態和細胞表面表現變化形廓開始改變。特別是，於某些實施態樣中，該細胞開始表現某些細胞表面標記且T細胞標記之表現減少。於某些實施態樣中，該細胞開始表現某些細胞表面標記且T細胞標記之表現從部分重編程之約第5天開始降低，表明去分化過程已經開始。於各種實施態樣中，使用一或多種T細胞活化分子(諸如抗CD3抗體或其他CD3激動劑)刺激該去分化之T細胞(本文亦稱為“源自T細胞之附著型細胞”)，並培養在T細胞培養條件下。於某些實施態樣中，該T細胞刺激(本文亦稱為“再活化”)可驅動去分化之細胞回復成T譜系細胞。值得注意的是，基於表觀遺傳時鐘分析，再活化之T細胞具有年輕許多之細胞的特徵、具有更幹樣之表型，且獲得高增殖潛力。
如本文所使用者，“短暫”係指一段足以實現一或多種T細胞部分重編程的期間(例如一段足以形成源自T細胞之附著型細胞，但不夠長至足以使該一或多個T細胞轉形成iPS細胞或全潛能細胞的期間)。
例如，與一或多種重編程因子“短暫接觸”係指與一或多種重編程因子接觸一段期間，該期間足以形成源自T細胞之附著型細胞，或使該一或多個T細胞形成至少一個附著在培養容器表面的株落，但該期間不夠長至允許該一或多個T細胞轉形成iPS細胞或全潛能細胞。於各種實施態樣中，“短暫接觸”可意指接觸期間長達1天、或長達2天、或長達3天、或長達4天、或長達5天、或長達6天、或長達7天、或長達8天、或長達9天、或長達10天、或長達11天、或長達12天、或長達13天、或長達14天。
例如，“短暫表現(transiently expressing)”或“短暫表現(transient expression)”，等意指表現或引起一或多種山中因子表現以實現一或多個T細胞之部分重編程(即，其中未達到轉形為iPS細胞或全潛能細胞)。
如本文所使用者，“表觀遺傳年齡”(或“eAge”)係指使用已知的表觀遺傳時鐘，例如霍瓦斯鐘(Horvath Clock)、漢納姆(Hannum)鐘或萊文(Levine)鐘測定之細胞年齡(參見，例如Horvath et al., 2018, Aging 10, 1758-1775；Hannum et al.¸ 2013, Mol. Cell. 49(2), 359-367；Levine et al., 2018, Aging, 10(4):573-592)。於某些實施態樣中，eAge為使用測量353 CpG之甲基化狀態的霍瓦斯鐘方法測定的細胞年齡(Horvath and Raj, 2018 Nature Reviews Genetics, 19:371-385)。這些結果表明本文描述之部分重編程和再活化方法可產生經回春之T細胞，而無需經過iPS細胞階段，該iPS細胞階段耗時且需要複雜之分化步驟。再者，從iPS細胞分化而來之T細胞，在缺乏自體胸腺教育之情況下，缺乏真正的T細胞功能且擁有異常，包括不成熟之表型、非MHC依賴性滅殺、不當之CD8αβ二聚體化、基因表現失調及無法製造發育上同質的T細胞群。Vizcardo et al., 2018, Cell Rep 22, 3175-3190。因此，使用本文描述之部分重編程方法產生之經回春的T細胞提供優於使用本技藝已知之方法所產生之T細胞的令人意想不到且有利之特性。 I. 製造經回春的 T 細胞之方法
下文描述本發明之非限制性示例性實施態樣。基於本文提供之揭示內容，本發明之組成物和方法的其他態樣對本技藝之一般技術人士而言將變得顯明。
於各種實施態樣中，本揭示關於製造經回春的T細胞之方法。於各種實施態樣中，該方法包含(i)使T細胞群與該至少一種重編程因子短暫接觸一段期間，該期間足以實現部分重編程且其中該等T細胞未轉形為iPS細胞；及(ii)使該等經部分重編程之T細胞與至少一種T細胞活化化合物或活化劑，及視需要地，一或多種免疫調節劑接觸。
於各種實施態樣中，本揭示關於製造經回春的T細胞之方法。於各種實施態樣中，該方法包含(i)使T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28、L-MYC和C-MYC所組成之群組的重編程因子；和視需要地，SV40短暫接觸一段期間，該期間足以實現部分重編程，其中該等T細胞未轉形為iPS細胞；及(ii)使該等經部分重編程之T細胞與至少一種T細胞活化化合物或活化劑，及視需要地，一或多種免疫調節劑接觸。
於各種實施態樣中，本揭示關於製造經回春的T細胞之方法。於各種實施態樣中，該方法包含(i)使T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28、L-MYC和C-MYC所組成之群組的重編程因子；和視需要地SV40接觸一段期間，該期間足以形成源自T細胞之附著型細胞且其中該等T細胞未轉形為iPS細胞；及(ii)使該等源自T細胞之附著型細胞與至少一種T細胞活化化合物或活化劑和/或T細胞共刺激劑，和視需要地，一或多種免疫調節劑接觸。
如本文所使用者，“重編程”係指刪除和/或重建在哺乳動物細胞發育或在細胞培養期間獲得之表觀遺傳修飾的過程。例如，肌肉細胞可重編程為神經元。重編程非本質上與衰老和回春有關。(參見，例如Takahashi et al., Cell (2007) 131, 861-872)。
“完全重編程”係指將體細胞重編程為分化多能幹(iPS)細胞或全潛能幹細胞。
“部分重編程”係指未達到全潛能幹細胞狀態或分化多能幹細胞狀態(iPS細胞)之重編程過程。因此，部分重編程為未完全重編程之任何重編程。“部分”或“不完全”或“短暫”重編程為非完全重編程之重編程，例如與已完全重編程為iPS細胞之細胞相比較。於某些實施態樣中，部分重編程為進行約1天至約20天之重編程。於某些實施態樣中，部分重編程為進行約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或約25天之重編程。
於某些實施態樣中，部分T細胞重編程為進行直到T細胞開始重新活化的重編程過程。於另一實施態樣中，部分T細胞重編程為至少進行直到T細胞開始失去一或多種T細胞標記之表現和/或開始表現與非T細胞譜系相關之標記的重編程過程。於某些實施態樣中，部分T細胞重編程為進行一段期間，直到T細胞不能再藉由使用T細胞活化劑再活化而回復成表現CD3、CD4和/或CD8之細胞的重編程過程。
“經部分重編程之T細胞”係指已被重編程但未達到全潛能幹細胞狀態或分化多能幹細胞狀態(iPS細胞)之T細胞。於進一步之實施態樣中，與iPS細胞相比較，T細胞之部分重編程為不完全和/或部分重編程和/或短暫重編程。經部分重編程之T細胞係指已藉由使T細胞與一或多種重編程因子接觸一段期間來重編程，從而使T細胞形成源自T細胞之附著型細胞的T細胞。於某些實施態樣中，該源自T細胞之附著型細胞鬆散地附著於該培養容器表面。如本文所描述之源自T細胞之附著型細胞保持譜系穩定性，例如在使用T細胞活化劑和視需要地，免疫調節分子(例如細胞介素)刺激(再活化)後回復為T細胞譜系。於某些實施態樣中，源自T細胞之附著型細胞為半附著型、鬆散附著型、附著型或強力附著型(強力附著)。 1.T 細胞之來源和分離 T 細胞
於一些實施態樣中，可用於本文所描述之部分重編程之方法中的細胞係源自原代細胞，例如原代人細胞。該樣本包括直接取自該個體之組織、體液和其他樣本，以及由一或多個處理步驟，諸如分離、離心、基因工程(例如使用病毒載體轉導)、洗滌和/或培育所產生之樣本。該生物樣本可為直接從生物來源獲得之樣本或經過處理之樣本。生物樣本包括，但不限於體液，諸如血液、血漿、血清、腦脊液、滑液、尿液和汗液、組織和器官樣本，包括由此衍生之加工樣本。
於一些態樣中，衍生或分離出該細胞之樣本為血液或血液來源的樣本，或者該樣本為或源自血球分離術或白血球分離術產品。示例性樣本包括全血、外周血單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、組織切片檢查、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸道相關之淋巴樣組織、黏膜相關之淋巴樣組織、脾臟、其他淋巴樣組織、肝臟、肺、胃、腸、結腸、腎、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃體或其他器官，和/或由其衍生之細胞。在細胞療法(例如過繼性細胞療法)之背景下，樣本包括來自自體和同種異體來源之樣本。
於一些實施態樣中，用於部分重編程方法中之細胞係源自細胞株，例如T細胞株。於一些實施態樣中，該細胞係從異種來源，例如小鼠、大鼠、非人靈長類動物和豬獲得。
於各種實施態樣中，本揭示關於從來源分離出T細胞並將該等T細胞部分重編程以改善T細胞之老化並提升其功能。合適之來源細胞的實例包括，但不限於外周血單核細胞(PBMC)。用於本文方法中之T細胞可包括，但不限於培養之T細胞，例如原代T細胞或來自培養之T細胞株(例如Jurkat、SupT1，等)的T細胞，或從哺乳動物獲得之T細胞。若從哺乳動物獲得，該來源細胞可從多種來源取得，包括，但不限於血液、骨髓、淋巴結、腫瘤、胸腺、脾臟、或其他組織或流體。亦可富集或純化來源細胞。該T細胞可為任何類型之T細胞且可為任何發育階段，包括，但不限於CD4+CD8αβ+雙陽性T細胞、CD4+輔助T細胞，例如Th1和Th2細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞(例如細胞毒性T細胞)、外周血單核細胞(PBMC)、外周血白血球(PBL)、腫瘤浸潤細胞(TIL)、記憶T細胞、初始T細胞，等。
於各種實施態樣中，該T細胞係從腫瘤中分離，特別是該用於本文所描述之部分重編程方法中的T細胞為TIL。如本文所使用者，“腫瘤浸潤淋巴細胞”或“TIL”係指最初以已離開個體血流並遷移入腫瘤中之細胞形式獲得的細胞群。TIL包括，但不限於CD8+細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1和Th17 CD4+T細胞、天然殺手細胞、樹突細胞和M1巨噬細胞。TIL包括初代和次代TIL兩者。“初代TIL”為那些從如本文概述之患者組織樣本中獲得者(有時稱為“新鮮收穫的”)。於一些實施態樣中，TIL可藉由表現一或多種下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。
於本揭示之各種實施態樣中，該來源細胞可具有初始T細胞((TN)表型、中央記憶T細胞(TCM)表型或效應記憶T細胞(TEM)表型、幹樣T細胞(Tscm)。TN、TCM和TEM細胞之表型為本技藝已知且描述於本文他處。例如，TN和TCM細胞表現CCR7和CD62L，但TEM細胞不表現。TN和TCM細胞表現轉錄因子LEF1、FOXP1和KLF7，但TEM細胞不表現。TN細胞不表現CD45RO和KLRG1，但TEM細胞表現。Gattinoni et al., 2012, Nat. Rev. Cancer, 12:671-84。或者或此外，與TEM細胞之端粒相比較，TN和TCM細胞可藉由較長之端粒表徵。
T細胞之特定亞群，諸如CD3+、CD45+、CD137+、CD25+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、GITR+和/或CD45RO+T細胞可藉由正向或負向選汰技術(例如使用基於螢光或基於磁性之細胞分選)來分離。例如，可藉由將T細胞與多種市售之抗體結合珠粒(諸如Dynabeads®、CELLectionTM、DETACHaBEADTM(Thermo Fisher)或MACS®細胞分離產品(Miltenyi Biotec))中任一者一起培育一段足以正向選擇所需之T細胞或負向選擇去除不要的細胞的期間來分離出T細胞。
於本文之各種實施態樣中，該T細胞(或是用於分離、預活化階段、再活化、或擴增階段)係培養在合適之培養基中。T細胞培養條件為本技藝已知。於某些實施態樣中，用於培養此處之T細胞的培養基可從起始培養基進行，稱為“基礎”培養基。基礎培養基係指任何補充有一或多種本文揭示之附加元素的任何培養基，該附加元素為，例如葡萄糖、各種不同鹽類其中一者、一或多種細胞介素，諸如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或彼等之任何組合。該基礎培養基可為用於培養免疫細胞(例如T細胞)之任何培養基。於一些態樣中，該基礎培養基包含平衡鹽溶液(例如PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、Dulbecco氏改良之Eagle氏培養基(DMEM)、Click氏培養基、最低限度必需培養基(MEM)、基礎培養基Eagle(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥(Glasgow)最低限度必需培養基(GMEM)、α最低限度必需培養基(αMEM)、Iscove氏改良之Dulbecco氏培養基(IMDM)、M199、OPTMIZERTM Pro、OPTMIZER™ CTS™ T細胞擴增基礎培養基(ThermoFisher)、OPTMIZERTM、OPTMIZER™完全、IMMUNOCULT™ XF(STEMCELL™技術公司)、AIM V™、TEXMACS™培養基、PRIME-XV®T細胞CDM、X-VIVOTM 15(Lonza)、TRANSACT™TIL擴增培養基、或彼等之任何組合。於一些態樣中，該基礎培養基不含血清。於一些態樣中，該基礎培養基包含PRIME-XV®T細胞CDM。於一些態樣中，該基礎培養基包含OPTMIZERTM。於一些態樣中，該基礎培養基包含OPTMIZERTM Pro。於一些態樣中，該基礎培養基進一步包含免疫細胞血清替代物(ICSR)。
如本文所使用者，術語“細胞介素”係指由細胞釋出之小的、分泌的蛋白質，其對細胞之間的交互作用和通訊具有特定效果。細胞介素之非限制性實例包括介白素(例如介白素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15、IL-3、IL-5、IL-6、IL-11、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17、IL-21和IL-23)、干擾素(IFN；例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)家族成員和轉形生長因子(TGF)家族成員。本揭示之一些態樣針對在包含細胞介素之培養基中培養和/或擴增免疫細胞，例如T細胞或本文揭示之一或多種經工程處理之免疫細胞的方法。於一些態樣中，該細胞介素為介白素。於一些態樣中，該細胞介素包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或彼等之任何組合。
於本揭示之各種實施態樣中，用於本文之部分重編程方法中的T細胞為TCRαβ細胞。在這方面，該TCRαβ細胞可表現包含alpha(α)鏈和beta(β)鏈兩者之功能性、抗原特異性T細胞受體(TCR)。TCRα和β鏈為本技藝已知的。該TCR可包含任何胺基酸序列，惟其該TCR可特異結合及免疫識別抗原。該TCR可對任何所需抗原具有抗原特異性。如本文所使用者，短語“抗原特異的”和“抗原特異性”係指該TCR可特異結合及免疫識別抗原，例如條件特異性抗原或其表位，從而使TCR與抗原或其表位之結合引發免疫反應。
於各種不同之實施態樣中，使用病況之抗原或特異於病況之抗原將自其分離出T細胞之哺乳動物免疫化。理想上，該哺乳動物係在自該哺乳動物取得T細胞之前被免疫化。以此方式，該等經分離之T細胞可包括經誘導之對待治療之病況具有特異性的T細胞，或包括較高比例之對該病況具有特異性的細胞。
或者，包含內源性抗原特異性TCR之T細胞可為在從哺乳動物分離出之混合細胞群中的T細胞。於某些實施態樣中，該混合之群可在生物體外培養時暴露於被該內源性TCR識別之抗原。以此方式，該包含識別病況特異性抗原之TCR的T細胞在生物體外擴增或增殖，從而增加具有內源性抗原特異性受體之T細胞的數量。
該抗原特異性TCR可為外源性TCR，即，不是T細胞天然的(不是天然存在的)抗原特異性TCR。重組TCR為透過重組表現一或多種外源TCRα-、β-、γ-和/或δ-鏈編碼基因而產生的TCR。重組TCR可包含完全源自單一哺乳動物物種之多肽鏈，或者該抗原特異性TCR可為嵌合型或雜合TCR，其係由來自二種不同哺乳動物物種之TCR所衍生的胺基酸序列組成。例如，抗原特異性TCR可包含源自鼠TCR之可變區和源自人TCR之恆定區，從而使該TCR為“人源化的”。製造重組TCR之方法為本技藝所已知。參見，例如美國專利案7,820,174；8,785,601；8,216,565號；和美國專利申請案發表物2013/0274203號。
亦可使用一或多個編碼外源性(例如重組)TCR或其他重組嵌合型受體之核酸將包含內源性抗原特異性TCR之T細胞轉形，例如轉導或轉染。除了該內源性TCR天然具有之對抗原的特異性之外，該等外源性嵌合受體(例如嵌合CR)可賦予該經轉形的T細胞對額外抗原之特異性。此可，但不一定會導致產生具有雙重抗原特異性之T細胞。
亦可使用一或多個編碼“嵌合抗原受體”(CAR)之核酸將包含內源性抗原特異性TCR之T細胞轉形，例如轉導或轉染。通常，CAR包含抗體之抗原結合結構域，例如與TCR之跨膜和胞內結構域融合之單鏈可變片段(scFv)；且於一些實施態樣中，包含一或多個共刺激結構域，諸如T細胞共刺激分子之細胞內信號傳導區域。因此，TCR之抗原特異性可由與抗原或其表位特異結合之scFv編碼。製造該等CAR之方法為本技藝已知。參見，例如美國專利案8,465,743、10,533,055、10,603,380號和美國專利申請發表物2014/0037628和2014/0274909號。
可使用任何合適之編碼CAR、經工程處理之TCR或TCR樣蛋白或多肽的核酸。於這些實施態樣中，如下文進一步討論之部分重編程過程可在使用CAR、經工程處理之TCR或TCR樣蛋白或多肽之T細胞進行遺傳修飾之前、之後或同時發生。由核酸編碼之CAR或經工程處理之TCR可為任何合適的形式，包括，例如單鏈CAR或TCR或具有其他蛋白質或多肽之融合物(例如，但不限於共刺激分子)。
被本文之T細胞識別的抗原(無論是被內源性抗原特異性TCR、經工程處理之TCR或CAR識別)可為與病況相關之任何抗原。例如，該抗原可為，但不限於癌症抗原(亦稱為腫瘤抗原或與腫瘤相關之抗原)或感染性病況抗原(例如病毒抗原)。病毒抗原為本技藝已知且包括，例如任何病毒蛋白，例如env、gag、pol、gp120、胸苷激酶，等。
於某些實施態樣中，該抗原為或源自CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-1 1Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、豆莢蛋白酶(legumain)、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、prostein、存活蛋白(survivin)、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素(galectin)8、MelanA/MARTl，Ras突變體、hTERT、肉瘤轉位斷點、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白之細胞外部分、或彼等之任何組合。
於某些實施態樣中，該CAR或經工程處理之TCR靶向AFP、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-1 1Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、豆莢蛋白酶(legumain)、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、prostein、存活(surviving)、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素(galectin)8、MelanA/MARTl，Ras突變體、hTERT、肉瘤轉位斷點、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞周期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白之細胞外部分、或彼等之任何組合。
如本文所使用者，術語“癌症抗原”或“腫瘤相關抗原”係指由腫瘤細胞或癌細胞單獨或主要表現或過度表現的任何分子(例如蛋白質、多肽、肽、脂質、碳水化合物，等)，從而使該抗原與腫瘤或癌症相關。該癌症抗原可為，例如突變之腫瘤抗原或新抗原。該癌症抗原還可由正常、非腫瘤或非癌細胞表現。然而，於該等情況下，由正常細胞、非腫瘤細胞或非癌細呈遞之癌症抗原表現不如由腫瘤細胞或癌細胞呈遞之表現強。在此方面，與正常、非腫瘤或非癌細胞之抗原表現相比較，腫瘤或癌細胞可過度表現該抗原或以顯著較高之水準表現該抗原。此外，該癌症抗原還可由不同發育或成熟狀態之細胞表現。例如，該癌症抗原可另外由胚胎或胎兒階段之細胞表現，這些細胞通常不存於成年哺乳動物中。或者，該癌症抗原還可由幹細胞或前體細胞表現，這些細胞通常不存於成年哺乳動物中。癌症抗原為本技藝已知且包括，例如上文列出之癌症抗原、共有之腫瘤抗原，諸如，例如間皮素、CD19、CD22、CD276(B7H3)、gp100、MART-1、表皮生長因子受體變體III(EGFRvIII)、TRP-1、KRAS、TRP-2、酪胺酸酶、NY-ESO-1(亦稱為CAG-3)、MAGE-1、MAGE-3，等。於本揭示之一實施態樣中，該癌症抗原為患者特異性新抗原。患者特異性新抗原可能為腫瘤特異性突變之結果。
該癌症抗原可為由任何癌症或腫瘤之任何細胞表現的抗原，包括本文描述癌症和腫瘤。該癌症抗原可為僅一種類型之癌症或腫瘤的癌症抗原，從而使該癌症抗原僅與一種類型之癌症或腫瘤相關或為其特徵。或者，該癌症抗原可為多於一種類型之癌症或腫瘤的癌症抗原(例如，可為其特徵)。例如，該癌症抗原可由乳癌細胞和前列腺癌細胞兩者表現，且完全不由正常細胞、非腫瘤細胞或非癌細胞表現。
與被TCR或CAR識別之抗原相關或其特徵為被TCR或CAR識別之抗原的病況可為任何病況。例如，該病況可為癌症或感染病況，例如，如本文所討論之病毒病況。
該癌症可為任何癌症，包括下列任一者：肉瘤、癌、急性淋巴細胞癌、急性髓性白血病、肺泡橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳癌、肛門癌、肛管癌、或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌、或胸膜癌、頭頸癌(例如鼻癌、鼻腔癌、或中耳癌、口腔癌)、外陰癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓性細胞癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸道類癌、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、腎臟癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、腹膜癌、大網膜癌、和腸繫膜癌、咽喉癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌(例如腎細胞癌(RCC))、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、輸尿管癌、和膀胱癌。
出於本文之目的，“病毒病況”係指可在人與人之間或在生物體與生物體之間傳播且係由病毒引起之病況。於本揭示之一實施態樣中，該病毒病況係由選自由下列所組成之群組的病毒引起：皰疹病毒、痘病毒、肝炎病毒、乳頭狀瘤病毒(papilloma virus)、腺病毒、冠狀病毒、正黏病毒(orthomyxovirus)、副黏病毒(paramyxovirus)、黃病毒和杯狀病毒(calicivirus)。例如，該病毒病況可由選自由下列所組成之群組的病毒引起：呼吸道融合病毒(RSV)、流感病毒、單純皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、水痘病毒(varicella virus)、巨細胞病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類嗜T淋巴細胞病毒、杯狀病毒、腺病毒和砂狀病毒(Arena virus)。
該病毒病況可為，例如流感、肺炎、皰疹、肝炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、慢性疲勞症候群、突發之急性呼吸系統症候群(SARS)、胃腸道炎、腸炎、心臟炎、腦炎、細支氣管炎、呼吸道乳頭狀瘤病(papillomatosis)、腦膜炎、HIV/AIDS和單核細胞增多症。
用於本揭示之部分重編程方法的T細胞可使用本技藝已知之任何合適技術從來源分離出或純化之。例如，該免疫細胞(例如T細胞)可從個體獲得。免疫細胞(例如T細胞)可從多種來源獲得，包括外周血單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。於某些實施態樣中，免疫細胞(例如T細胞)可使用技術熟習人士已知之任何數量的技術(諸如FICOLL TM分離)，自從個體收集之血液單位獲得。較佳地，細胞可藉由血球分離術(apheresis)從個體之循環血液中獲得。該血球分離術產品通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白血球、紅血球和血小板。於某些實施態樣中，可洗滌該藉由血球分離術收集之細胞以去除血漿部分，並置於合適之緩衝液或培養基中以用於後續處理。可使用PBS洗滌該細胞。將可理解的是，可使用洗滌步驟，諸如使用半自動化之流通式離心機，例如Cobe TM2991細胞處理器、Baxter Cyto-Mate TM，等。洗滌後，可將細胞重新懸浮在各種生物相容之緩衝液或其他具有或不具有緩衝液之鹽水溶液中。於某些實施態樣中，可以去除該血球分離術樣本之不欲有的成分。 2. T 細胞之部分重編程
本揭示關於用於部分重編程T細胞之方法。於某些實施態樣中，藉由將T細胞與一或多種重編程因子接觸數天之期間，從而使一或多個T細胞形成附著(或部分附著)於培養容器表面的群落(形成源自T細胞之附著型細胞群落)來將T細胞部分重編程，其中該等附著型細胞在使用T細胞活化劑和視需要地，免疫調節分子(例如細胞介素)刺激(再活化)後恢復為功能性T細胞
如本文所使用者，術語“重編程因子”係指能夠將在哺乳動物細胞發育或細胞培養期間獲得之表觀遺傳修飾刪除和/或重建的任何蛋白質、多肽、胺基酸、mRNA、DNA或小分子。重編程因子可改變細胞之分化狀態。該等重編程因子可包括，但不限於由Yamanaka及其同事發現之轉錄因子OCT4(或OCT3/4)、SOX3、KLF4和C-MYC(參見，例如Takahashi and Yamanaka, 2006, Cell, 136, 364-377)，本文中稱為“OSKM”或“山中因子”。重編程因子係指可能改變細胞之分化狀態，或者可能增進或改變細胞重編程之效率的其他因子。該等因子為本技藝已知的。示例性重編程因子描述於Feng et al. 2009, Cell Stem Cell Review, 4:301-313中。
於各種實施態樣中，該重編程因子為由KLF4、OCT3/4、SOX2、C-MYC和SV40所組成之群組中至少一者。於各種實施態樣中，並非所有四種山中因子均為緊迫必需的(參見，例如Genome Biol. 2012；13(10):251；Cell Stem Cell, 2019, 25(6):737-753；Nature Communications(2018) 9:2865)。於各種實施態樣中，該經分離之免疫細胞(例如T細胞)係與OCT3/4和SOX2接觸。於各種實施態樣中，該經分離之免疫細胞(例如T細胞)係與OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸。於各種實施態樣中，該經分離之細胞係與OCT3/4、SOX2和KLF4接觸。於某些實施態樣中，該T細胞係與OCT3/4、SOX2和KLF4，以及C-MYC或SV40接觸。
另外之重編程因子可用於各種實施態樣中以將該經分離之免疫細胞(例如T細胞)進行部分重編程。該等因子包括，但不限於LIN28、NANOG、Esrrb、Pax5 shRNA、C/EBPa、p53 siRNA、UTF1、DNMT shRNA、Wnt3a、GLIS1、DLX4、CDH1、SV40 LT(T)和hTERT。於各種實施態樣中，重編程因子可將涉及重編程的某些miRNA上調或下調。於某些實施態樣中，重編程因子可將一或多種山中因子之一或多個基因上游或下游上調或下調。於各種實施態樣中，該一或多種重編程因子可包括，但不限於組蛋白甲基轉移酶抑制劑、L-型鈣道激動劑、G9a甲基轉移酶抑制劑、DNA甲基轉移酶抑制劑、組蛋白脫乙醯酶抑制劑、MEK抑制劑、GSK3抑制劑或TGF-B抑制劑。調節重編程轉錄因子之上游或下游分子途徑的任何因子均被考慮用於本文之部分重編程方法中。說明性抑制劑包括，但不限於BIX01294、BayK 8644、CHIR 99021、Forskolin和RepSox。於某些實施態樣中，絲胺酸/蘇胺酸-蛋白激酶B-Raf(BRAF)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑、血管內皮生長因子1(VEGFR1)抑制劑和/或纖維母細胞生長因子受體1(FGFR1)抑制劑可用於本文之重編程方法中(參見，例如US2017114323)。
於各種實施態樣中，本揭示關於製造經回春的T細胞之方法，其中將該T細胞與至少一種選自KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC之群組中的重編程因子短暫接觸。於本揭示之各種實施態樣中，使該經分離的免疫細胞(例如T細胞)與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC以及視需要地，SV40短暫接觸。
本技藝已知許多用於將重編程因子遞送至細胞之策略。這些策略包括利用單股負義RNA病毒(Vizcardo et al，2013年)、附加型質體系統，例如如Nat. Methods 2011, 8(5):409-412中所描述者，藉由奈米顆粒進行之mRNA轉染(Moffett等人，2017)，以及使用已知可誘導因子之基因表現的小分子，該因子賦予分化多能性(Feng et al., 2009; Hou et al., 2013)。
於各種實施態樣中，使一或多種重編程因子短暫表現在該經分離的免疫細胞(例如T細胞)中。於各種實施態樣中，該一或多種重編程因子可包括KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC中一或多者或全部；或可另外包括一或多種其他重編程因子。於各種實施態樣中，該重編程因子可使用本技藝已知之基因編輯技術(例如TALENS、CRISPR/cas)在該經分離之T細胞中表現。於各種實施態樣中，該基因編輯技術遞送欲在該經分離之T細胞中表現之可誘導的重編程因子集。於各種實施態樣中，編碼幹細胞相關基因之核酸係由一或多個重組表現載體攜帶。重組表現載體可包含任何類型之核苷酸，包括，但不限於DNA和RNA(其可為單股或雙股)、合成的或部分從天然來源獲得，且其可含有天然、非天然或改變之核苷酸。該重組表現載體可包含天然存在或非天然存在之核苷酸間鍵聯，或二種類型之鍵聯。該載體可含有提供幹細胞相關基因表現之調控核酸序列。
於一些實施態樣中，該重組表現載體為病毒載體。合適之病毒載體包括，但不限於仙台病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、α病毒、痘瘡病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和禽痘病毒載體，且較佳地，具有能夠將免疫細胞(例如T細胞)轉形之天然或工程處理能力。於某些實施態樣中，該病毒載體使用異源病毒外膜蛋白假型化。於某些實施態樣中，該病毒載體為使用合適之外膜，例如病毒外膜假型化的慢病毒或仙台病毒載體(參見，例如Blood Adv 2017 Oct 24;1(23):2088-2104；Mol Ther 2012 Sep;20(9):1699-712)。於某些實施態樣中，該病毒載體為整合缺陷型慢病毒載體。本技藝已知合適之病毒載體且描述於，例如J. Biol. Chem. (2011) 286:4760-4771; Stem Cell Research & Therapy (2019) 10:185中。
於各種實施態樣中，該重組表現載體係在奈米顆粒中遞送。於各種實施態樣中，該重編程因子係以奈米顆粒遞送。該等奈米顆粒可經過設計以短暫和劑量控制之方式將特定之mRNA或其他大分子遞送至淋巴細胞。該等奈米顆粒可經過設計以靶向特定細胞亞型，且在與它們結合後刺激由受體介導之內吞作用，從而引入它們攜帶之合成mRNA，細胞此時可表現這些mRNA。由於不需要核轉運和轉錄該轉基因，因此該過程快速且有效。
於各種實施態樣中，一或多種重編程載體係在分開之載體中遞送至免疫細胞(例如T細胞)。於各種實施態樣中，KLF4、OCT3/4、SOX2(KOS)係在單一載體中遞送。於各種實施態樣中，表現KOS之載體為病毒載體，且係以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30 MOI(感染複數)之力價遞送。於各種實施態樣中，KLF4係在病毒載體中以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30 MOI之力價遞送。於各種實施態樣中，cMyc係在病毒載體中以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30 MOI之力價遞送。於各種實施態樣中，表現SV40之載體被進一步遞送至細胞且係以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30 MOI之力價由病毒載體遞送。於各種實施態樣中，使免疫細胞(例如T細胞)與10 MOI之表現KOS的仙台載體、10 MOI之表現KLF4的仙台載體、3 MOI之表現C-MYC的仙台載體和5 MOI之表現SV40的仙台載體接觸。於某些實施態樣中，該T細胞係與表現KOSM之多順反子載體，諸如慢病毒載體、仙台病毒載體或非病毒載體接觸。
於某些實施態樣中，在與一或多種重編程因子接觸之前，使用T細胞活化劑和視需要地，一或多種免疫調節分子刺激T細胞一段足以刺激和活化該T細胞之時間。於某些實施態樣中，使用腫瘤抗原或使用自體腫瘤細胞或腫瘤細胞株來刺激T細胞。於一些實施態樣中，該T細胞為TIL並使用腫瘤標靶細胞或源自該腫瘤標靶細胞、來自癌症患者之腫瘤抗原或一或多種腫瘤相關抗原刺激該TIL。
腫瘤相關抗原之非限制性實例包括：AFP(α-胎兒蛋白)、αvβ6或另一種整合素、BCMA、BRAF、B7-H3、B7-H6、CA9(碳酸酐酶9)、(癌胚抗原)、密連蛋白(Claudin)18.2、密連蛋白6、c-MET、DLL3(δ樣蛋白3)、DLL4、ENPP3(胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3)、EpCAM、EPG-2(上皮糖蛋白2)、EPG-40、ephrinB2、EPHa2(ephrine受體A2)、ERBB二聚體、雌激素受體、ETBR(內皮素B受體)、FAP-α(纖維母細胞活化蛋白α)、胎兒AchR(胎兒乙醯膽鹼受體)、FBP(葉酸結合蛋白)、FCRL5、FR-α(葉酸受體α)、GCC(鳥苷酸環化酶C)、GD2、GD3、GPC2(磷脂醯肌醇蛋白(glypican)-2)、GPC3、gp100(糖蛋白100)、GPNMB(糖蛋白NMB)、GPRC5D(G蛋白偶聯受體5D)、HER2、HER3、HER4、B型肝炎表面抗原、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1(melan A)、間皮素、黏蛋白1(MUC1)、MUC16、MHC/肽複合物(例如，與源自AFP、KRAS、NY-ESO、MAGE-A和WT1之肽複合的HLA-A)、NCAM(神經細胞黏附分子)、黏連蛋白(Nectin)-4、NY-ESO、癌胎抗原、PRAME(優先表現之黑色素瘤抗原)、孕酮受體、PSA(前列腺特異性抗原)、PSCA(前列腺幹細胞抗原)、PSMA(前列腺特異性膜抗原)、ROR1、ROR2、SIRPα(信號調節蛋白α)、SLIT、SLITRK6(NTRK樣蛋白6)、存活蛋白(survivin)、TAG72(腫瘤相關糖蛋白72)、TPBG(滋養層(trophoblast)糖蛋白)、Trop-2、VEGFR1(血管內皮生長因子受體1)、p53、p53突變體、prostein、存活蛋白、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素(galectin)8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤轉位斷點、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白之細胞外部分、新抗原或彼等之任何組合。
以此方式，來自癌症患者之多株抗原特異性(例如腫瘤特異性)T細胞可經部分重編程並回春。於某些實施態樣中，對T細胞進行選擇、分選或富集以用於隨後使用抗原(諸如腫瘤抗原、腫瘤類器官、自體腫瘤細胞或腫瘤細胞株)刺激。於某些實施態樣中，藉由選擇表現一或多種細胞表面標記(諸如4-1BB(CD137)、PD1、LAG3、CD45、CD39、TIGIT、TIM3、CD69、OX40、CD28、CD25、CD49d和CTLA4)的細胞來富集、選擇或分選T細胞。於某些實施態樣中，該T細胞係在使用本文描述之任何T細胞活化劑活化之前富集、選擇或分選。於某些實施態樣中，CD45+T細胞係在使用本文描述之任何活化劑活化之前選擇或富集。
於一些實施態樣中，該方法包括在將細胞與病毒載體顆粒一起培育之前、期間和/或之後活化細胞。於一些實施態樣中，該刺激條件可包括在能夠活化TCR複合物之一或多種組分的一或多個細胞內信號傳導結構域之試劑的存在下培育細胞，該試劑為，諸如與TCR複合物之成員，例如CD3特異結合之一級試劑，以及與T細胞共刺激分子(例如CD28、CD27、CD137(4-1BB)、OX40或ICOS)特異結合之二級試劑，包括抗體，諸如存在於固體支持物，諸如珠粒(例如TRANSACT，Miltenyi)之表面者。不受理論束縛，以此方式(預活化階段)刺激T細胞會增加病毒轉導和重編程因子遞送之效率。類似地，若使用核酸轉染來遞送該重編程因子，則預先刺激T細胞會增加基因遞送之效率。
於某些實施態樣中，使用一或多種T細胞活化和/或共刺激和/或免疫調節化合物來預活化、再活化和/或擴增T細胞。
於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或約21天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸約7天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸約8天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸約9天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸約10天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸約11天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸約12天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸約13天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸約14天之期間。
於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸至少約5天且不超過約10天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸至少約5天且不超過約11天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸至少約5天且不超過約12天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸至少約5天且不超過約12天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸至少約5天且不超過約13天之期間。
於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸至少約6天且不超過約10天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸至少約6天且不超過約11天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸至少約6天且不超過約12天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸至少約6天且不超過約12天之期間。於某些實施態樣中，使T細胞與一或多種重編程因子接觸至少約6天且不超過約13天之期間。
T細胞與一或多種重編程因子接觸之期間可根據重編程因子之表現量或水準變化。例如，於其中使用表現高水準之一或多種重編程因子的病毒載體轉導T細胞的實施態樣中，可能需要較短之期間來實現所需之部分重編程(形成源自T細胞之附著型細胞)。於另一實施態樣中，使用表現低水準之一或多種重編程因子的病毒載體來轉導T細胞且可能需要較長之期間來實現所需之部分重編程(形成源自T細胞之附著型細胞)。在此方面，於某些實施態樣中，編碼該一或多種重編程因子之表現載體，諸如病毒載體，可包含誘導型啟動子，其中該部分重編程因子之表現可被調整至合需的表現水準。
於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約5至30天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約5至25天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約5至20天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約5至15天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約5至13天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約5至12天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約6至12天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約6至13天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約7至12天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約7至13天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約7至14天之期間。於某些實施態樣中，該T細胞係與一或多種重編程因子接觸約6至20、7至20、8至20、9至20、10至20、5至18、6至18、7至18、8至18、9至18、或10至18天。
在體細胞朝向全潛能或多化多能幹細胞(TSC或PSC)重編程期間，體細胞將開始去分化並失去其譜系特異性表觀遺傳狀態，同時它們亦開始獲得PSC表型。這些變化是逐漸進行的，因此體細胞停留在重編程過程的時間越長，它們將獲得越多PSC表型。於本揭示之各種實施態樣中，該重編程過程在體細胞去分化過度之前停止以防止它們失去其來源細胞功能。於各種實施態樣中，部分重編程將足以使免疫細胞(例如T細胞)形成至少一個附著於該培養容器表面之細胞並轉形為本文稱為“源自T細胞之附著型細胞”的中間細胞類型。
如本文所使用之“源自T細胞之附著型細胞”係指在T細胞部分重編程過程中之中間細胞。該源自T細胞之附著型細胞附著(至少部分)在培養容器表面並在部分重編程過程中形成群落。於某些實施態樣中，該源自T細胞之附著型細胞鬆散地附著於該培養容器表面。源自T細胞之附著型細胞與iPS細胞(和iTSC)的不同之處在於它們尚未被完全重新編程。於某些實施態樣中，源自T細胞之附著型細胞群落鬆散地附著於該培養容器表面。如本文所描述之源自T細胞之附著型細胞保持譜系穩定性，例如本揭示之源自T細胞的附著型細胞在T細胞活化/刺激條件(例如在活化和/或免疫調節分子，諸如抗-CD3、抗-CD28、抗-CD27抗體和細胞介素，諸如IL2、IL7、IL15，等之存在下使用T細胞培養基)下培養後保留回復T細胞譜系之能力。於某些實施態樣中，該源自T細胞之附著型細胞並非多潛能的。於某些實施態樣中，該源自T細胞之附著型細胞較非經部分重編程之T細胞或活化之T細胞大。於某些實施態樣中，該源自T細胞之附著型細胞較大且藉由FACS分析測量時具有較複雜之結構。於某些實施態樣中，該源自T細胞之附著型細胞為SSEA4+CD3+。於另一實施態樣中，當使用流式細胞術或總轉錄本分析測定時，該源自T細胞之附著型細胞表現一或多種下列細胞表面標記：CD50、CD352、CD31、整合素β7、CD49e、CD122、CD314、HLA-DR、CD134、CD245、CD105(內皮糖蛋白)、CD366、CD39、整合素α6β1、整合素β5、CD71、CD164、CD10、CD63、XCR1、CD298、CD201、CD151、CD325、CD324、CD147、SSEA-3、TRA-1-81、TRA-2-54、平足蛋白、CD9、CD340、CD24、CD90、CD326、SSEA-5、SSEA4、TRA-1-60-R。
本技藝之一般技術人士可輕易地理解，iPS細胞可藉由形態與源自T細胞之附著型細胞區分。特別是，如圖3F所示，iPS細胞群落大得多且具有更明確之群落結構。iPS細胞為本技藝所周知，且描述於，例如Nishimura 2013, Cell Stem Cell 12, 114-126；Vizcardo et al., 2013, Cell Stem Cell 12, 31-36)。
於某些實施態樣中，當使用流式細胞術或總轉錄本分析測定時，至少10%之該等源自T細胞的附著型細胞表現一或多種下列細胞表面標記：CD50、CD352、CD31、整合素α6β1、整合素β7、CD49e、CD122、CD314、HLA-DR、CD134、CD245、CD105(內皮糖蛋白)、CD366、CD39、整合素β5、CD71、CD164、CD10、CD63、XCR1、CD298、CD201、CD151、CD325、CD324、CD147、SSEA-3、TRA-1-81、TRA-2-54、平足蛋白、CD9、CD340、CD24、CD90、CD326、SSEA-5、SSEA4、TRA-1-60-R。
於某些實施態樣中，當使用流式細胞術或總轉錄本分析測定時，至少約10%至約80%之該等源自T細胞的附著型細胞表現一或多種下列細胞表面標記：CD50、CD352、CD31、整合素α6β1、整合素β7、CD49e、CD122、CD314、HLA-DR、CD134、CD245、CD105(內皮糖蛋白)、CD366、CD39、整合素β5、CD71、CD164、CD10、CD63、XCR1、CD298、CD201、CD151、CD325、CD324、CD147、SSEA-3、TRA-1-81、TRA-2-54、平足蛋白、CD9、CD340、CD24、CD90、CD326、SSEA-5、SSEA4、TRA-1-60-R。於另一實施態樣中，當使用本技藝已知之分析(諸如流式細胞術、基因表現或或總轉錄本分析)測定時，至少約15%至約80%、至少約20%至約75%、至少約25%至約75%、至少約30%至約50%、至少約10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、或約80%之該等源自T細胞的附著型細胞表現一或多種上述細胞表面標記。這些標記之表現水準和陽性細胞之百分比將根據部分重編程的天數而變化。
於某些實施態樣中，部分重編程可能導致免疫細胞(例如T細胞)特性的某些標記部分喪失。例如，於某些實施態樣中，T細胞之部分重編程可導致CD3、CD4、CD8(例如CD8αα和/或CD8αβ)中任何一或多者之表現喪失或降低。於某些實施態樣中，表現減少可指當藉由流式細胞術測量時，標記之表現減少約10%至約95%。於某些實施態樣中，表現減少為在至少一部分之源自T細胞的附著型細胞中的平均螢光強度(MFI)降低約0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75或2個對數。
於某些實施態樣中，使該等T細胞與一或多種重編程因子短暫接觸一段足以形成源自T細胞之附著型細胞的期間。於某些實施態樣中，使該等T細胞與一或多種重編程因子短暫接觸一段足以形成附著之細胞群落的期間，其中至少一部分該附著之細胞表現一或多種下列細胞表面標記：CD50、CD352、CD31、整合素α6β1、整合素β7、CD49e、CD122、CD314、HLA-DR、CD134、CD245、CD105(內皮糖蛋白)、CD366、CD39、整合素β5、CD71、CD164、CD10、CD63、XCR1、CD298、CD201、CD151、CD325、CD324、CD147、SSEA-3、TRA-1-81、TRA-2-54、平足蛋白、CD9、CD340、CD24、CD90、CD326、SSEA-5、SSEA4、TRA-1-60-R。該等標記之表現可使用流式細胞術、基因表現分析、RNAseq或其他本技藝已知之技術測定。
於某些實施態樣中，使該等T細胞與一或多種重編程因子短暫接觸一段足以形成附著之細胞群落的期間，其中至少一部分之附著之細胞表現整合素α6β1、CD9、CD90和/或SSEA4。
於某些實施態樣中，至少一部分之T細胞附著型細胞表現整合素α6β1、CD9、CD90或SSEA4，或彼等之任何組合。於某些實施態樣中，至少一部分之T細胞附著型細胞表現整合素α6β1；至少一部分之T細胞附著型細胞表現整合素α6β1和SSEA4、至少一部分之T細胞附著型細胞表現整合素α6β1、SSEA4和CD9；或至少一部分之T細胞附著型細胞表現整合素α6β1、SSEA4、CD9和CD90。於某些實施態樣中，至少一部分之T細胞附著型細胞表現SSEA4；SSEA4和CD9；或SSEA4、CD9和CD90。
於某些實施態樣中，至少一部分之源自T細胞的附著型細胞表現CD9和/或CD90，其為部分重編程過程之早期標記。CD9亦稱為四跨膜蛋白-29且具有四個跨膜結構域。其參與細胞黏附、信號轉導和細胞分化。CD90亦稱為THY-1。其為免疫球蛋白超家族表面糖蛋白且為與間質幹細胞相關之標記。其亦參與細胞黏附和通訊。雖然Thy-1普透表現在小鼠T細胞中，但人類T細胞譜系中之T細胞Thy-1表現僅限於胸腺皮質中之特化群及CD4 Th17 T細胞亞群。
於某些實施態樣中，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或更多之源自T細胞的附著型細胞表現CD9和/或CD90。
於某些實施態樣中，當與受刺激和未受刺激之T細胞相比較時，於某些實施態樣中，該源自T細胞之附著型細胞表現下列一或多者：整合素α6β1、CD164、CD9、CD63、CD90、CD71、CD326、TRA-1-81和TRA-1-60-R。於另一實施態樣中，當與受刺激和未受刺激之T細胞相比較時，該源自T細胞之附著型細胞具有降低之CD352和CD31表現。
於某些實施態樣中，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或更多之源自T細胞的附著型細胞表現下列一或多者：CD164、CD9、CD63、CD90、CD71、CD326、TRA-1-81和TRA-1-60-R。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較相關對照T細胞或起始經分離的T細胞群之實際年齡年輕至少5%之源自T細胞的附著型細胞群。於另一實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較該經分離之來源T細胞(即，與重編程因子接觸之經分離的T細胞)的實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%之源自T細胞的附著型細胞群。
於某些實施態樣中，當該等源自T細胞之附著型細胞與T細胞活化劑(例如抗CD3、抗CD28、一或多種細胞介素，諸如IL2、IL7、IL15)接觸時，與對照T細胞相比較，該等細胞表現出增加的擴增潛力。於某些實施態樣中，與未經部分重編程之對照T細胞相比較，該等經部分重編程之T細胞擴增至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、100、500、1000、1500或2000倍。於某些實施態樣中，該等經部分重編程之T細胞較未經部分重編程之對照T細胞擴增多出至少約50至2000倍、至少約50至1000倍、至少50至900倍、至少50至800倍、至少50至700倍、至少50至600倍、至少50至500倍、至少100至400倍、至少150至500倍、至少200至500倍或至少300至500倍。於某些實施態樣中，該等經部分重編程之T細胞較未經部分重編程之對照T細胞擴增得更快。於本揭示之特定實施態樣中，該部分重編程方法係在適合維持該等經分離之T細胞和/或經部分重編程之T細胞(源自T細胞之附著型細胞)的條件下進行。適合用於特定細胞類型之維持和增殖的條件對本技藝之技術熟習人士而言是顯而易見。專用培養基可從商業來源獲得，或者可將用於增強增殖所必需或合需的因子添加在標準培養基中。例如，亦可將另外之因子和劑添加在培養基中以誘導該細胞中之可誘導的無素表現或抑制對特定劑敏感之細胞生長。
於某些實施態樣中，將該等經分離之T細胞培養在T細胞培養基(TCM)中，該培養基包含針對T細胞培養優化之市售培養基，諸如TexMACS培養基或OpTmizer基礎培養基，並添加一或多種補充劑，諸如OpTmizer細胞補充劑，於某些實施態樣中，添加免疫細胞血清替代品(例如T細胞血清替代品)和/或其他補充劑，諸如L-麩胺醯胺；GlutaMAX；和/或細胞介素，諸如IL-2、IL-7和/或IL-15。
於某些實施態樣中，本文方法之部分重編程階段係使用針對細胞重編程優化之培養基進行，諸如，但不限於STEMFIT培養基(Amsbio，Abington，UK)、mTESR2(Stem Cell Technologies)和ESSENTIAL 6或8(Life Technologies)；STEMPRO hESC SFM(Gibco)；TESR、clone-R、dMEM F12、KSR。
於另一實施態樣中，該部分重編程係在包含50% T細胞培養基和50%幹細胞培養基(例如STEMFIT或Essential 8、mTESR、TESR、clone-R、dMEM F12、KSR)，且視需要地，添加一或多種細胞介素，諸如IL2、IL7和/或IL15的培養基中進行。於某些實施態樣中，部分重編程係在第一培養基中進行第一段期間，然後在第二培養基中進行第二段期間。例如，於某些實施態樣中，該第一培養基為如上述之50/50培養基，並視需要地添加一或多種細胞介素，在第一培養基中培養1、2、3、4、5、6天或更長之期間，然後將細胞在為幹細胞培養基之第二培養基(例如Essential 8之STEMFIT)中培養1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多天。於某些實施態樣中，該第一培養基為50/50且使用1、2或3天，而該第二培養基為幹細胞培養基(例如STEMFIT或Essential 8)且從第2、3或4天開始使用直到形成源自T細胞之附著型細胞，並依本文之進一步描述再活化。於部分重編程方法之某些實施態樣中，將T細胞在第一培養基中培養第一段期間，然後在第二培養基中培養第二段期間。於本文方法之部分重編程階段的某些實施態樣中，將與一或多種重編程因子(例如KLF4、OCT3/4、SOX2、C-MYC和SV40中之一或多者)接觸之T細胞培養在培養容器中的合適培養基中，該培養容器係經重組人層連結蛋白511-E8片段(諸如iMatrix)塗層。 3. 經部分重編程之源自 T 細胞之附著型細胞的再活化
於各種實施態樣中，該等經部分重編程之源自T細胞之附著型細胞係在活化培養基中再活化，該活化培養基能使該經重編程之免疫細胞(例如T細胞)重新獲得T細胞特性和功能。
於本揭示之各種實施態樣中，該等源自T細胞之附著型細胞係在部分重編程之後立即在適當之T細胞培養基中使用一或多種T細胞刺激或活化劑和/或共刺激劑再活化。
於本揭示之某些實施態樣中，該等源自T細胞之附著型細胞係在部分重編程之後立即在補充有一或多種細胞介素(諸如IL2、IL7、IL15、IL21)的T細胞培養基中，使用或不使用一或多種T細胞活化劑和/或一或多種共刺激劑再活化。
於某些實施態樣中，該等源自T細胞之附著型細胞係在用於T細胞培養的合適培養基中，使用一或多種如本文他處描述之T細胞活化劑和/或共刺激劑和/或免疫調節劑再活化，用於T細胞培養之合適培養基為，諸如包含針對培養T細胞而優化之市售培養基的T細胞培養基(TCM)，諸如TexMACS培養基或OpTmizer基礎培養基，其中並添加一或多種補充劑，諸如OpTmizer細胞補充劑，於某些實施態樣中，添加免疫細胞血清替代品(例如T細胞血清替代品)和其他補充劑，諸如L-麩胺醯胺；GlutaMAX；細胞介素，諸如IL-2、IL7和/或IL15。
於一些實施態樣中，本文使用之刺激或活化條件或試劑可用於本文方法之預活化、再活化和/或擴增階段。T細胞通常使用如，例如美國專利案編號5,858,358；5,883,223；6,352,694；6,534,055；6,797,514；6,867,041；6,692,964；6,887,466；6,905,680；6,905,681；6,905,874；7,067,318；7,144,575；7,172,869；7,175,843；7,232,566；7,572,631；和10,786,533中描述之方法來活化和擴增。於某些實施態樣中，使T細胞與提供初級活化信號之T細胞活化劑和/或共刺激劑和提供共刺激信號之劑接觸。提供初級活化信號之劑為本技藝已知且包括，例如與表現在T細胞上之CD3細胞表面受體(例如抗CD3抗體)結合的抗體、或其抗原結合片段、或配體、或其標靶結合片段。提供共刺激信號之劑為本技藝已知且包括，但不限於與CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40，等結合之抗體或配體。於某些實施態樣中，該活化劑包括一或多種試劑，例如能夠活化TCR複合物之細胞內信號傳結構域的配體。於一些態樣中，該劑開啟或起始T細胞中之初級TCR/CD3細胞內信號傳導級聯反應，諸如適合遞送初級信號之劑，例如啟始ITAM誘導之信號的活化，諸如那些特異於TCR組分者。於另一實施態樣中，該活化劑係與促進共刺激信號之劑組合或同時提供。促進共刺激信號之合適劑為本技藝已知且包括促進下列群組之信號傳導的抗體或配體：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、淋巴細胞功能相關之抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18)、CD247、CD276(B7-H3)、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體或彼等之任何組合。於某些實施態樣中，用於本文方法之活化步驟的刺激劑和共刺激劑包含，例如與固體支持物(諸如珠粒)結合之抗-CD3、抗-CD28、抗-41-BB或抗-CD27抗體和/或一或多種細胞介素。於某些實施態樣中，該劑包含用於活化受體或共刺激受體之配體，例如肽/MHC複合物和/或CD27配體(例如CD70或其三聚體版本)、CD80、CD86，等。刺激劑和共刺激劑中有抗CD3/抗CD28珠粒(例如DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T細胞擴增劑和/或Exp ACT珠)。視需要地，刺激和/或活化可包含在培養基中添加抗CD3和/或抗CD28抗體。於一些實施態樣中，該刺激劑包括IL-2、IL-7和/或IL-15。
於各種實施態樣中，該活化劑為腫瘤抗原，特別是本文揭示之腫瘤抗原。
於一些實施態樣中，本文之活化劑和/或共刺激劑可經塗覆或吸附在一或多個表面上。該等表面包括，例如固體表面、多孔表面、半多孔表面、球面、非球面、棒狀表面和聚合物表面。
於某些實施態樣中，使用市售劑，諸如TRANSACT(Miltenyi Biotec)活化T細胞(例如在本文方法之預活化、再活化或擴增階段)。於各種實施態樣中，該等經部分重編程之T細胞係使用TRANSACT，以允許源自T細胞之附著型細胞重新獲得其T細胞特性的比率被活化。於各種實施態樣中，該等經部分重編程之T細胞係以1：10、1：50、1：100、1：150、1：200、1：250、1：300、1：350、1：400、1：450、1：500、1：550、1：600、1：650、1：700、1：750、1：800、1：850、1：900、1：1,000、1：2000、1：3000、1：4000或1：10,000之比例使用TRANSACT活化。於各種實施態樣中，該等源自T細胞之附著型細胞係在合適之T細胞活化培養基中被活化並培養足夠之時間以允許該等源自T細胞之附著型細胞重新獲得其特性。於各種實施態樣中，該經部分重編程之細胞被活化並在T細胞活化培養基培養約1、2、3、4、5、6或7天或更多天之期間。於某些實施態樣中，該經部分重編程之細胞被活化並培養約1至20天、約2至20天、約3至20天、約4至20天、約5至20天、約6至20天、約7至20天、8至20天、約9至20天、或約10至20天。於某些實施態樣中，該經部分重編程之細胞被活化，然後培養約1至15天、約2至15天、約3至15天、約4至15天、約5至15天、約6至15天，約7至15天，約8至15天，約9至15天、或約10至15天。
於某些實施態樣中，使用抗原或抗原表現細胞(諸如表現腫瘤抗原之自體細胞或腫瘤抗原)將源自T細胞之附著型細胞重定向或再活化。於某些實施態樣中，藉由與表現串聯小基因之APC共同培養來將源自T細胞之附著型細胞再活化(即，可從由APC表現和呈遞之串聯小基因再表現之片段對腫瘤進行測序)。任何已知之與癌症相關的腫瘤抗原均可被考慮用於此處。抗原之非限制性實例包括：AFP(α胎兒蛋白)、αvβ6或另一種整合素、BCMA、BRAF、B7-H3、B7-H6、CA9(碳酸酐酶9)、(癌胚抗原)、Claudin18.2、Claudin 6、c-MET、DLL3(δ樣蛋白3)、DLL4、ENPP3(胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3)、EpCAM、EPG-2(表皮糖蛋白2)、EPG-40、ephrinB2、EPHa2(ephrin受體A2)、ERBB二聚體、雌激素受體、ETBR(內皮素B受體)、FAP-α(纖維母細胞活化蛋白α)、胎兒AchR(胎兒乙醯膽鹼受體)、FBP(葉酸結合蛋白)、FCRL5、FR-α(葉酸受體α)、GCC(鳥苷酸環化酶C)、GD2、GD3、GPC2(磷脂醯肌醇蛋白-2)、GPC3、gp100(糖蛋白100)、GPNMB(糖蛋白NMB)、GPRC5D(G蛋白偶聯受體5D)、HER2、HER3、HER4、B型肝炎表面抗原、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1(melan A)、間皮素、黏蛋白1(MUC1)、MUC16、MHC/肽複合物(例如與源自AFP、KRAS、NY-ESO、MAGE-A和WT1之肽複合的HLA-A)、NCAM(神經細胞黏附分子)、黏連蛋白(Nectin)-4、NY-ESO、癌胎抗原、PRAME(黑色素瘤之優先表現抗原)、孕酮受體、PSA(前列腺特異性抗原)、PSCA(前列腺幹細胞抗原)、PSMA(前列腺特異性膜抗原)、ROR1、ROR2、SIRPα(信號調節蛋白α)、SLIT、SLITRK6(NTRK樣蛋白6)、存活蛋白、TAG72(腫瘤相關糖蛋白72)、TPBG(滋養層糖蛋白)、Trop-2、VEGFR1(血管內皮生長因子受體1)、p53、p53突變體、prostein、存活蛋白、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤轉位斷點、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白之細胞外部分、新抗原或彼等之任何組合。
於各種實施態樣中，用於再活化該等源自T細胞之附著型細胞的活化培養基可進一步包含免疫調節分子，諸如細胞介素。免疫調節分子之實例有淋巴因子、單核因子(monokine)和傳統多肽激素。細胞介素包括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫胺醯人生長激素及牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；鬆弛素；鬆弛素原；糖蛋白激素，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；肝生長因子(HGF)；纖維母細胞生長因子(FGF)；泌乳素；胎盤泌乳原；密拉氏管(mullerian)抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子(NGF)，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉形生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；紅血球生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、β和-γ；群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和套組配體(KL)。如本文所使用者，術語細胞介素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質，以及該天然序列細胞介素之生物活性等效物。
於某些實施態樣中，本文之經部分重編程和再活化的T細胞可進一步使用與本文描述之用於再活化的相同方法進一步刺激和擴增。該等用於活化和擴增T細胞之方法為本技藝已知。
於各種實施態樣中，包含部分重編程，隨後再活化，及視需要地，進一步擴增之本文方法將足以使該等經回春的T細胞獲得下列任何一或多種特徵：
於某些實施態樣中，該經回春的T細胞具有一或多種幹性特性，包括高表觀遺傳可塑性。其他該經回春的細胞可獲得之有利表型標記包括表現L-選擇蛋白(CD62L)、IL-7Ra、CD132、CCR7、CD45RA、CD45RO、CD27、CD28、CD95、CXCR3、TCF7和LFA-1。於某些實施態樣中，該等經回春的T細胞獲得T記憶幹細胞表現標記，例如表現CD95、CD45RA、CCR7和CD62L並被賦予自我更新之幹細胞樣能力和重建整個記憶和效應T細胞亞群譜之多潛能能力的記憶T細胞。於某些實施態樣中，該經回春的T細胞為“中央記憶T細胞”或“TCM細胞”，其為表現CD45RO、CCR7和CD62L之記憶T細胞。於另一實施態樣中，該經回春的T細胞具有效應記憶T細胞標記，諸如表現CD45RO，但缺乏CCR7和CD62L之表現。於某些實施態樣中，本文之經回春的T細胞具有幹樣表型且具有改善之增殖能力。
於某些實施態樣中，該經回春之T細胞具有初始T細胞，“TN細胞”之特徵，該初始T細胞為表現CD45RA、CCR7和CD62L，但不表現CD95的T細胞。
於某些實施態樣中，該經回春的T細胞在表觀遺傳印記、端粒長度和功能性方面可能表現出年輕T細胞之生物學和表型特徵。
於各種實施態樣中，如本文描述之部分重編程和再活化導致經回春的T細胞，此可藉由評估細胞DNA中之不同CpG位點的甲基化狀態來測量。該等技術為本技藝已知。參見，例如Horvath and Raj, 2018, Nature Reviews Genetics, 19:371-375。不同群組已建立模型或“表觀遺傳時鐘”，其使用細胞之甲基化狀態來提供利用數學算法估計之細胞或組織的“生物年齡”，該數學算法使用分配給基因組中之特定CpG的甲基化狀態數值估計。於各種實施態樣中，使用各種CpG位點之甲基化狀態來測定是否發生部分重編程。於各種實施態樣中，使用各種CpG位點之甲基化狀態來預測耗盡之CD8T細胞的計數。於各種實施態樣中，使用各種CpG位點之甲基化狀態來測定免疫細胞群(例如T細胞)是否適合投予患者。
於各種實施態樣中，使用Horvath和Raj (2018, Nature Reviews Genetics,19:371-375)中描述之“Horvath時鐘”測定本文描述之細胞，包括經回春的免疫細胞(例如T細胞)之表觀遺傳年齡。於各種實施態樣中，使用Horvath時鐘來測定是否發生部分重編程。於各種實施態樣中，使用Horvath時鐘來預測耗盡之CD8 T細胞的計數。於各種實施態樣中，使用Horvath時鐘來測定免疫細胞群(例如T細胞)是否適合用於投予患者。於各種實施態樣中，使用其他表觀遺傳時鐘或算法(例如Hannum時鐘或Levine時鐘)。參見，例如Hannum et al., 2013, Mol. Cell., 49:359-369；Levine et al., 2018, Aging, 10(4):573-591。
於某些實施態樣中，與對照T細胞(例如在不與一或多種重編程因子接觸之情況下培養的T細胞)相比較，該等經回春的T細胞(如本文所描述之經部分重編程和再活化的T細胞)表現出降低之表觀遺傳年齡(eAge)。eAge可使用已知之表觀遺傳時鐘測定法測定，諸如本文他處描述之Horvath時鐘。於某些實施態樣中，與適當之對照T細胞(例如來自部分重編程和再活化之前的原始供體樣本之T細胞或按實際年齡匹配之T細胞)的eAge相比較，如本文描述之經回春的T細胞之eAge降低約5%至75%、10%至75%、10%至50%、15%至75%、15%至50%、20%至75%、或20%至50%。於某些實施態樣中，與適當之對照T細胞(例如來自部分重編程和再活化之前的原始供體樣本之T細胞或按實際年齡匹配之T細胞)的eAge相比較，如本文描述之經回春的T細胞之eAge降低至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或更多。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其實際年齡年輕至少5%之T細胞群。於另一實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群。於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其實際年齡年輕至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多年之T細胞群。在此方面，可使用本技藝已知之方法測量表觀遺傳年齡，諸如藉由測量Horvath表觀遺傳學時鐘進行。
於某些實施態樣中，該經回春之T細胞(如本文描之經部分重編程和再活化的T細胞)表現出約7至16歲的表觀遺傳年齡(eAge)。於某些實施態樣中，與對照T細胞(例如在不接觸一或多種重編程因子之情況下培養的T細胞；例如相當於該起始細胞之實際年齡)相比較，該經回春的T細胞顯示出降低至約等於青春期的年齡之表觀遺傳年齡(eAge)。於某些實施態樣中，與對照T細胞相比較，該經回春的T細胞具有增加之端粒長度。端粒長度可使用本技藝已知之方法(參見，例如Rosenberg et al., 2011, Clin Cancer Res 17, 4550-4557)和市售套組(例如TELOTAGGG，Sigma-Aldrich)測量。於某些實施態樣中，該端粒長度延長約0.1至3kb。於某些實施態樣中，該端粒長度延長約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或約1kb。於另一實施態樣中，該端粒延長約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、或2kb。
於某些實施態樣中，該經回春之T細胞表現出增加之擴增潛力。於某些實施態樣中，該經回春的T細胞較未經部分重編程的對照T細胞或按實際年齡匹配之T細胞擴增多出2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50倍。於某些實施態樣中，該經回春的T細胞較按實際年齡匹配之T細胞或未經部分重編程的對照T細胞擴增多出25至1000倍。於某些實施態樣中，該經回春的T細胞較按實際年齡匹配之T細胞或未經部分重編程之對照T細胞擴增多出25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500倍。於某些實施態樣中，該經回春的T細胞較未經部分重編程的T細胞擴增得更快。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其實際年齡年輕至少5%之T細胞群，其中該等T細胞不表現異常的NK、T或B細胞標記。
於另一實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其來源T細胞或適當之對照T細胞的實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群，且其中該等T細胞不表現異常的NK、T或B細胞標記。
於另一實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其來源T細胞或適當之對照T細胞的實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群，且其中該等T細胞具有幹樣表型。
於另一實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其來源T細胞或適當之對照T細胞的實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群，且其中該等T細胞表現CCR7、CD62L和TCF7。
於另一實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其來源T細胞或適當之對照T細胞的實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群，其中該等T細胞表現CCR7、CD62L和TCF7；且與適當之對照T細胞相比較，具有增加之殺傷能力。滅殺能力可使用本技藝已知之分析(諸如本文實施例中所描述者)測量。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其來源T細胞之實際年齡年輕至少5%的T細胞群，且其中該等T細胞不表現NCAM1、NCR2、FCGR3A、KIR2DL4或KIR2DS4。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群，且其中該等T細胞不表現NCAM1、NCR2、FCGR3A、KIR2DL4或KIR2DS4。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其實際年齡(或適當之對照T細胞)年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞，且其中藉由總轉錄本分析測定時，該T細胞富含氧化磷酸化、脂肪酸代謝、糖解和缺氧基因集。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其實際年齡(或適當之對照T細胞)年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞或該等T細胞群，且其中藉由總轉錄本分析測定時，與對照T細胞相比較，該T等細胞富含氧化磷酸化和糖解基因集兩者。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較適當之對照T細胞的實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞，且其中與對照T細胞相比較，該等T細胞具有增加之TCR組庫多樣性。
於各種實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較其實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群，且其中該等T細胞包含T細胞受體基因之V、D和J節段的不完整組。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較該等來源T細胞的實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群；其中該等T細胞不表現NCAM1、NCR2、FCGR3A、KIR2DL4或KIR2DS4；且其中藉由總轉錄本分析測定時，該等T細胞富含氧化磷酸化、脂肪酸代謝、糖解和缺氧基因集。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較該等來源T細胞的實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群；其中該等T細胞不表現NCAM1、NCR2、FCGR3A、KIR2DL4或KIR2DS4；且其中藉由總轉錄本分析測定時，與對照T細胞相比較，該等T細胞富含氧化磷酸化和糖解基因集兩者。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較該等來源T細胞的實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群；其中該等T細胞不表現NCAM1、NCR2、FCGR3A、KIR2DL4或KIR2DS4；其中藉由總轉錄本分析測定時，與對照T細胞相比較，該等T細胞富含氧化磷酸化和糖解基因集兩者；且其中與對照T細胞相比較，該等T細胞具有增加之TCR組庫多樣性。
於某些實施態樣中，本揭示提供其表觀遺傳年齡較該等來源T細胞的實際年齡年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、或至少80%之T細胞群；其中該等T細胞不表現NCAM1、NCR2、FCGR3A、KIR2DL4或KIR2DS4；其中藉由總轉錄本分析測定時，與對照T細胞相比較，該等T細胞富含氧化磷酸化和糖解基因集兩者；其中與對照T細胞相比較，該等T細胞具有增加之TCR組庫多樣性；且其中該等T細胞包含T細胞受體基因之V、D和J節段的不完整組。
本技藝之技術熟習人士將認可，T細胞受體V、D和J基因節段在T細胞發育期間重排以形成完整之可變結構域外顯子。這些基因重排發生在胸腺中。本文製造之經回春的T細胞係從具有重排之TCR基因座且表現TCR的經分離之T細胞製造。因此，於某些實施態樣中，本文製造之經回春的T細胞在表觀遺傳學上較分離出之來源T細胞年輕，但具有功能性TCR(即，T細胞受體基因之V、D和J節段的不完整組)，這將它們與分離出之T細胞區分。
於某些實施態樣中，經回春的T細胞之代謝狀態得到改善(參見，例如Cell Metabolism 14, 264–271)。於某些實施態樣中，與適當之對照組相比較，本文描述之該等經回春的T細胞中富含對應於氧化磷酸化、脂肪酸代謝、糖解和缺氧的代謝基因集(參見，例如Nishimura 2019 Int. J. Mol. Sci. 20:2254)。於某些實施態樣中，本文描述之該等經回春的T細胞具有上調之糖解酶和下調之電子傳遞鏈次單位。於某些實施態樣中，本文之該等經回春的T細胞表現下列特徵中之一或多者：將體細胞氧化代謝轉化為糖解通量依賴性、粒線體非依賴性狀態的代謝開關；p53腫瘤抑制通路中與年齡相關之壓力反應基因(包括p16INK4a、p21CIP1、Atf3和Gadd45B)的表現下調；與衰老相關之金屬蛋白酶MMP13和介白素-6下調；與衰老相關之β-半乳糖苷酶活性降低；粒線體活性氧類(ROS)的產生減少；H3K9me3和H4K20me3(涉及異染色質維持的表觀遺傳修飾)的水準恢復(參見，例如Ocampo, Cell. 2016, 167(7): 1719-1733；Benayoun BA, Nat Rev Mol Cell Biol. 2015; 16:593-610；Liu B, Nat Commun. 2013, 4:1868；Database, Volume 2016, baw100；doi.org/10.1093/database/ baw100)。
於某些實施態樣中，與未經回春的對照T細胞相比較，本文之經回春的T細胞富含幹性基因印記(參見，例如Gattinoni et al., 2011 Nature Medicine 17(10):1290-1297)。
Ⅱ. 治療方法
於各種實施態樣中，本揭示提供使用經回春的T細胞群治療有其需要之患者的方法，該等經回春的T細胞群係藉由本文揭示之部分重編程和再活化方法製造。提供藉由投予包含本文描述之經回春的T細胞之組成物來治療疾病或病症(包括癌症)的方法。於各種實施態樣中，本揭示關於使用藉由包含下列者之方法而製造的T細胞群來治療有其需要之患者的方法：(a)使該等T細胞與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和視需要地，SV40短暫接觸足夠形成源自T細胞之附著型細胞株之時間；及(c)使該等源自T細胞之附著型細胞與包含T細胞活化劑和/或共刺激劑，諸如抗CD3、抗CD28和/或一或多種細胞介素，諸如IL-2的培養基接觸。於一些實施態樣中，該等T細胞係經工程處理以表現能識別標靶細胞表面上之特定抗原部分的細胞表面受體。於本揭示之各種實施態樣中，該標靶細胞為癌細胞。
於某些實施態樣中，本揭示關於使用如本文描述之經回春的T細胞群治療有其需要之患者的方法。
於各種實施態樣中，本揭示關於使用藉由本文揭示之方法製造的經回春之免疫細胞(例如T細胞)群治療有其需要之患者的方法。提供用於治療疾病或病症，包括癌症、傳染病或自體免疫病之方法。於各種實施態樣中，本揭示關於使用藉由包含下列步驟之方法製造的免疫細胞(例如T細胞)群來治療有其需要之患者的方法：(a)從來源分離出多個免疫細胞(例如T細胞)；(b)使該多個免疫細胞(例如T細胞)與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組中的重編程因子短暫接觸；及(c)使該免疫細胞(例如T細胞)與包含IL-2之培養基接觸，其中該免疫細胞(例如T細胞)與該至少一種重編程因子接觸至少約四天之期間。於一些實施態樣中，該多個免疫細胞(例如T細胞)係經工程處理以表現能識別標靶細胞表面上之特定抗原部分的細胞表面受體。於本揭示之各種實施態樣中，該標標細胞為癌細胞。
於各種實施態樣中，本揭示包含醫藥組成物，該醫藥組成物包含多個藉由本文之方法製造之經回春的T細胞。於某些實施態樣中，該醫藥組成物包含藉由包含下列步驟之方法製造之經回春的T細胞：(a)使多個T細胞與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組中的重編程因子短暫接觸一段足以使該等經部分重編程的細胞附著於該培養容器表面之期間；(b)使該等經附著的重編程T細胞與包含T細胞活化劑之培養基接觸。於一些實施態樣中，該醫藥組成物進一步包含額外之活性劑。
於一些態樣中，本揭示包含醫藥組成物，該醫藥組成物包含至少一個如本文描述之經回春的T細胞和醫藥上可接受之賦形劑。於一些實施態樣中，該醫藥組成物進一步包含額外之活性劑。
應理解的是，該經回春的T細胞之目標劑量可在約1×106至約2×1010個細胞/kg之範圍內，較佳為2×106個細胞/kg。應理解的是，高於和低於該範圍之劑量可能適用於某些個體，且適當之劑量水準可由醫療保健提供者根據需要測定。於各種實施態樣中，該目標劑量為1x105。於各種實施態樣中，該目標劑量為1x106。於各種實施態樣中，該目標劑量為1x107。於各種實施態樣中，該目標劑量為1x108。於各種實施態樣中，該目標劑量為1x109。於各種實施態樣中，該目標劑量為1x1010。於各種實施態樣中，該目標劑量為2x1010。此外，根據本揭示可提供多個細胞劑量。於各種實施態樣中，對有其需要之患者投予至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個細胞劑量。
亦提供用於縮小個體體內腫瘤大小之方法，其包含對該個體投予本揭示之經回春的T細胞。於一些實施態樣中，該個體患有實體瘤或血液惡性腫瘤，諸如淋巴瘤或白血病。於一些實施態樣中，該經回春的免疫細胞(例如T細胞)係遞送至腫瘤床。於一些實施態樣中，該癌症存在於該個體之骨髓中。
如本文所使用者，術語“個體”或“患者”係指個體。於一些態樣中，該個體為哺乳動物，諸如人。於一些態樣中，該個體可為非人類靈長類動物。舉例而言，非人類靈長類動物包括狨猿、猴子、黑猩猩、大猩猩、猩猩和長臂猿。術語“個體”亦包括馴養動物(諸如貓、狗，等)、家畜(例如美洲駝、馬、牛)、野生動物(例如鹿、麋鹿、駝鹿，等)、實驗室動物(例如小鼠、兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠，等)和鳥類(例如雞、火雞、鴨，等)。較佳地，該個體為人個體。更佳地，該個體為人類患者。
該方法可進一步包含投予一或多種化療劑。於某些實施態樣中，該化學治療劑為淋巴耗竭(預處理)化學治療劑。有益之預處理治療方案及相關之有益生物標記描述於美國臨時專利申請案62/262,143和62/167,750中。這些描述，例如調理有需要T細胞療法之患者的方法，該方法包含對患者投予具體指定之有益的環磷醯胺劑量(介於200 mg/m2/天和2000 mg/m2/天之間)和具體指定之氟達拉濱(fludarabine)劑量(介於20 mg/m2/天和900 mg/m2/天之間)。較佳之劑量方案涉及包含每日對患者投予約500 mg/m2/天之環磷醯胺和約60 mg/m2/天之氟達拉濱，持續三天，再對患者投予治療有效量之經回春的T細胞來治療患者。
於其他實施態樣中，該經回春的T細胞和化療劑各自以能有效治療個體之疾病或病症的量投予。
於某些實施態樣中，包含本文揭示之經回春的免疫細胞(例如T細胞)之組成物可與任何數量之化學治療劑聯合投予。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN TM)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亞胺(ethylenimine)及甲基三聚氰胺，包括六甲密胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；氮芥類，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、雙氯乙基甲胺氧化物鹽酸鹽(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、膽固醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、刺孢黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-合氧基-L-正白胺酸、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如胺甲喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如地喋呤(denopterin)、胺甲喋呤、喋羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如夫羅林酸(frolinic acid)；乙醯葡醛酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；羅尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比達摩(mopidanmol)；硝拉維林(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西佐非朗(sizofiran)；鍺螺銨(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(Ara-C)；環磷醯胺；噻替派；紫杉烷類(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Taxol®，Bristol-Myers Squibb)和多西他賽(doxetaxel)(Taxotere®，Rhone-Poulenc Rorer)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長春鹼；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；溫諾平(navelbine)；諾凡酮(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾黴素；胺基喋呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑 RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylomithine) (DMFO)；視黃酸衍生物，諸如TargretinTM(貝瑟羅汀(bexarotene))、PanretinTM、防利維A酸(alitretinoin)；OntakTM(denileukin diftitox)；埃斯黴素(esperamicin)；卡培他濱；以及任何上述者之醫藥上可接受的鹽、酸或衍生物。該定義亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑，諸如抗雌激素劑，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑之芳香酶、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、酮昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那普利司通(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素劑，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯他胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及任何上述者之醫藥上可接受的鹽、酸或衍生物。在適當之情況下亦投予化學治療劑之組合，包括，但不限於CHOP(即，環磷醯胺(Cytoxan®)、多柔比星(羥基多柔比星)、氟達拉濱、長春新鹼(Oncovin®)和潑尼松)。
於一些實施態樣中，該化學治療劑係在投予經工程處理之細胞或核酸的同時或投予後之一週內投予。於其他實施態樣中，該化學治療劑係在投予經工程處理之細胞或核酸後之1至4週、或1週至1個月、1週至2個月、1週至3個月、1週至6個月、1週至9個月、或1週至12個月投予。於其他實施態樣中，該化學治療劑係在投予細胞或核酸之前至少1個月投予化學治療劑。於一些實施態樣中，該方法進一步包含投予二或更多種化學治療劑。
多種另外之治療劑可與本文所描述的組成物聯合使用。例如，可能有用之另外的治療劑包括PD-1(或PD-L1)抑制劑，諸如納武單抗(nivolumab)(Opdivo®)、派姆單抗(pembrolizumab)(Keytruda®)、派姆單抗(pembrolizumab)、匹利珠單抗(pidilizumab)和阿特珠單抗(atezolizumab)(Tecentriq®)。
適合與本揭示組合使用之另外的治療劑包括，但不限於依魯替尼(ibrutinib)(Imbruvica®)、奧法木單抗(ofatumumab)(Arzerra®)、利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan®)、貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin®)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin®)、曲妥珠單抗艾坦辛(trastuzumab emtansine)(KADCYLA®)、伊馬替尼(imatinib)(Gleevec®)、西妥昔單抗(cetuximab) (Erbitux®)、帕尼單抗(panitumumab)(Vectibix®)、卡妥索單抗(catumaxomab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、奧法木單抗(ofatumumab)、托西莫單抗(tositumomab)、布魯昔單抗(brentuximab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、奈拉替尼(neratinib)、阿西替尼(axitinib)、馬賽替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉菲尼(sorafenib)、托克拉尼(toceranib)、來他替尼(lestaurtinib)、阿西替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、樂伐替尼(lenvatinib)、尼達尼布(nintedanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞戈非尼(regorafenib)、賽馬西尼(semaxanib)、索拉菲尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、替伐紮尼(tivozanib)、托克拉尼(toceranib)、凡德他尼(vandetanib)、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊馬替尼(imatinib)、達沙替尼(dasatinib)、尼羅替尼(nilotinib)、帕納替尼(ponatinib)、拉多替尼(radotinib)、博舒替尼(bosutinib)、來他替尼(lestaurtinib)、盧索替尼(ruxolitinib)、帕利替尼(pacritinib)、柯比美替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、比美替尼(binimetinib)、艾樂替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克裡唑替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、脂肪肽(adipotide)、地尼介白素-毒素連接物(denileukin diftitox)、mTOR抑制劑，諸如依維莫司(Everolimus)及西羅莫司(Temsirolimus)、刺蝟抑制劑，諸如索尼吉布(sonidegib)及維莫德吉(vismodegib)、CDK抑制劑，諸如CDK抑制劑帕博西尼(palbociclib)。
於另外之實施態樣中，該包含經回春的T細胞之組成物可與抗炎劑一起投予。抗炎劑或藥物包括，但不限於類固醇和糖皮質激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、醋酸氫化可的松(hydrocortisone acetate)、氫化可的松(hydrocortisone)、氫化可的松、甲基強的松龍(methylprednisolone)、氫化潑尼松(prednisolone)、强的松(prednisone)、去炎松(triamcinolone))、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDS)，包括阿斯匹靈、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、胺甲喋呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥物、環磷醯胺及黴酚酸酯(mycophenolate)。示例性NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑及唾液酸鹽。示例性鎮痛劑包括對乙醯胺基酚、羥考酮(oxycodone)、鹽酸丙氧芬之曲馬多(tramadol)。示例性糖皮質激素包括可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基強的松龍、潑尼松龍或強的松。示例性生物反應修飾劑包括針對細胞表面標記(例如CD4、CD5，等)之分子、細胞介素抑制劑，諸如TNF拮抗劑(例如依那西普(etanercept)(ENBREL®)、阿達木單抗(adalimumab) (HUMIRA®)及英利昔單抗(infliximab) (REMICADE®))、趨化因子抑制劑及黏附分子抑制劑。該生物反應修飾劑包括單株抗體及重組形式之分子。示例性DMARD包括硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、環抱菌素、胺甲喋呤、青黴胺、來氟米特、柳氮磺胺吡啶、羥氯喹、金(口服(金諾芬(auranofin))和肌肉內)及米諾環素(minocycline)。
於某些實施態樣中，本文描述之組成物係與細胞介素聯合投予。於一些實施態樣中，細胞介素可包含來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質，以及該天然序列細胞介素之生物活性等效物。 Ⅲ . 配方和藥物製劑
可使用多種不同之已知技術來製造根據本揭示之多核苷酸、多肽、載體、抗原結合分子、免疫細胞(例如T細胞)、組成物，等。
該等經分離之T細胞可在使用已知方法分離後進行遺傳修飾，或者可在進行遺傳修飾之前在生物體外將T細胞部分重編程、活化和擴增。於另一實施態樣中，使用重組TCR或CAR將T細胞進行遺傳修飾，然後使用本文描述之部分重編程和再活化方法將T細胞回春。於某些實施態樣中，將本文描述之經回春的細胞在生物體外進一步活化和/或擴增。用於活化和擴增免疫細胞(例如T細胞)之方法為本技藝已知，且描述於，例如美國專利案6,905,874；6,867,041；6,797,514號；和WO2012/079000。通常，該等方法包括使T細胞與刺激(例如活化)劑(於某些實施態樣中，稱為T細胞活化化合物)(例如刺激CD3/TCR複合物之劑(例如抗-CD3抗體或CD3激動劑)和共刺激劑(諸如刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226或彼等之任何組合的抗體或配體劑)接觸。於某些實施態樣中，該刺激劑和共刺激劑係在具有合適之細胞介素，諸如IL-2的培養基中附著於珠粒或其他表面上。
於其他實施態樣中，可利用，諸如美國專利案6,040,177；5,827,642；和WO/2012129514號中描述之方法，使用飼養細胞及合適之抗體和細胞介素活化該經回春的T細胞並刺激其增殖。
某些用於製造本揭示之構建體和經工程處理之T細胞的方法描述於PCT申請案PCT/US2015/14520中。
於某些實施態樣中，本揭示提供儲存本文描述之經回春的T細胞之方法。此涉及冷凍保存該T細胞，從而使該細胞在解凍時能保持存活。一部分T細胞可藉由本技藝已知之方法冷凍保存，以提供該等細胞之永久來源以用於未來治療患有惡性腫瘤之患者。需要時，可將經冷凍保存之T細胞解凍、生長並擴增，以獲得更多該等細胞。
如本文所使用者，“冷凍保存”係指藉由冷卻至低於零度，諸如(通常)克氏溫度77度或196℃(液氮的沸點)來保存細胞。冷凍保護劑通常在低於零度下使用，以防止細胞因在低溫下冷凍或升溫至室溫而受損。冷凍保存劑和最佳冷卻速度可防止細胞損傷。可根據本揭示使用之冷凍保存劑包括，但不限於：二甲亞碸(DMSO)(Lovelock & Bishop, Nature, 1959, 183, 1394-1395；Ashwood-Smith, Nature, 1961, 190, 1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯啶(Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960, 85, 576)和聚乙二醇(Sloviter & Ravdin, Nature, 1962, 196, 48)。較佳之冷卻速率為1˚-3℃/分鐘。
術語“基本上純的”係用於表示指定組分以高水準存在。該組分理想為存在於組成物中之主要組分。較佳地，它以超過30%、超過50%、超過75%、超過90%、或甚至超過95%之水準存在，該水準係按所考慮之總組成物的乾重/乾重測定。在非常高之水準下(例如超過90%、超過95%、或超過99%之水準)，該組分可被視為處於“純型”。本揭示之生物活性物質(包括多肽、核酸分子、抗原結合分子、部分)可以基本上不含一或多種可能與其聯結之污染物的形式提供。當組成物基本上不含指定之污染物時，該污染物將為低水準(例如按上述之乾重/乾重計時低於10%、低於5%、或低於1%之水準)。
於一些實施態樣中，本文之細胞可藉由首先從其培養基中收穫該細胞，然後在適合用於以治療有效量投予的培養基和容器系統(“醫藥上可接受的”載體)中洗滌和濃縮該細胞來配製。合適之輸注介質可為任何等張介質配方，通常為生理鹽水、NormosolTM R(亞培)或Plasma-LyteTM A(Baxter)，但亦可使用在水中之5%葡萄糖或林氏格乳酸鹽。該輸液介質可輔以人血清白蛋白。
組成物中之細胞的理想治療量通常為至少2個細胞或更典型為多於102個細胞，且高達106個，高達且包括108個或109個細胞並可多於1010個細胞。細胞之數量將取決於該組成物之預期用途，以及其中所包含之細胞類型。合需之細胞的密度通常大於106個細胞/ml且通常大於107個細胞/ml，通常為108個細胞/ml或更大。免疫細胞(例如T細胞)之臨床相關數量可分配在多次輸注中，其累積起來等於或超過105、106、107、108、109、1010、1011或1012個細胞。於本揭示之一些態樣，特別是因為所有輸注之細胞將被重定向至特定之靶抗原，所以可投予在106個/公斤(每一患者106至1011)範圍內之較少數量的細胞。經回春的T細胞治療可以在該等範圍內之劑量多次投予。對於接受療法之患者而言，該細胞可為自體的、同種異體的或異源的。
本揭示之經回春的T細胞可單獨投予，或以醫藥組成物之形式與稀釋劑和/或其他組分，諸如IL-2或其他細胞介素或細胞群組合投予。本揭示之醫藥組成物可包含如本文描述之經回春的T細胞群，加上一或多種醫藥上或生理上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑。該等組成物可包含緩衝劑，諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水，等；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚醣、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；和防腐劑。本揭示之組成物較佳為被配製成用於靜脈內投予。治療亦可包括一或多種皮質類固醇治療，諸如地塞米松和/或甲基強的松龍。
本申請案之組成物可包含所揭示的組分、基本上由其組成或由其組成。
本揭示之醫藥組成物(溶液、懸浮液，等)可包括下列一或多者：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液，較佳為生理鹽水、林格氏液、等張氯化鈉、不揮發油，諸如可作為溶劑或懸浮介質之合成甘油單酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四醋酸；緩衝液，諸如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及調節張力之劑，諸如氯化鈉或右旋糖。腸胃道外製劑可封裝在安瓿、拋棄式注射器或玻璃或塑料製成的多劑量小瓶中。可注射之醫藥組成物較佳為無菌的。
應理解的是，不良事件可藉由使用自殺基因轉導該免疫細胞(例如T細胞)被最小化。合適之“終止開關(kill switch)”描述於，例如WO2021/189008中。亦可能需要將可誘導之“開啟”或“加速器”開關併入免疫細胞(例如T細胞)。這些技術可採用二聚體化結構域和該等結構域二聚體化之可選擇的活化劑之功用。這些技術包括，例如Wu et al., Science 2014, 350(6258)描述之在某些細胞中利用FKBP/Rapalog二聚體化系統。另外之二聚體化技術描述於，例如Fegan et al. Chem. Rev. 2010, 110, 3315-3336，以及美國專利案5,830,462；5,834,266；5,869,337；和6,165,787號中。另外之二聚體化對可包括環孢菌素-A/親環蛋白受體、雌激素/雌激素受體(視需要地使用他莫昔芬)、糖皮質激素/糖皮質激素受體、四環素/四環素受體、維生素D/維生素D受體。二聚體化技術之其他實例可在，例如WO 2014/127261、WO 2015/090229、US 2014/0286987、US 2015/0266973、US 2016/0046700、US專利案8,486,693號、US 2014/0171649,和US 2012/0130076中找到。
用於本文之經回春的細胞之遺傳修飾的合適技術包括在細胞進行遺傳修飾以表現CAR或其他經工程處理的TCR之前、之後或同時使用誘導型凋亡蛋白酶-9(美國申請案發表物2011/0286980號)或胸苷激酶。用於引入自殺基因和/或“開啟”開關的其他方法包括CRISPR、TALENS、MEGATALEN、鋅指、RNAi、siRNA、shRNA、反義技術和本技藝已知之其他技術。 IV. 套組
本揭示範圍內亦包括套組，例如製藥套組，其包含至少一種用於在生物體外與一或多種T細胞接觸之重編程因子。套組通常包括表明套組內容物之預期用途和使用說明的標籤。術語“標籤”包括提供在該套組上、或伴隨該套組的任何文字或記錄材料、或以其他方式伴隨該套組。
在各種情況下，本揭示提供用於製備一或多個T細胞之套組，該T細胞係用於有其需要之個體的T細胞療法，該套組包含至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，以及視需要地，SV40。於各種實施態樣中，本揭示提供用於製備一或多個T細胞之套組，該T細胞係用於有其需要之個體的T細胞療法，該套組包含至少一種表現載體，該表現載體能夠表現至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子。於各種實施態樣中，本揭示提供用於製備一或多個T細胞之套組，該T細胞係用於有其需要之個體的T細胞療法，該套組包含至少一個仙台病毒載體，該仙台病毒載體能夠表現至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子。於各種實施態樣中，該套組進一步包含能夠表現SV40之仙台病毒載體。
於各種實施態樣中，本揭示提供用於製備一或多個T細胞載體之套組，該T細胞載體係用於有其需要之個體的T細胞療法，該套組包含：
編碼KLF4、OCT3/4和SOX2之表現載體；
編碼KLF4之表現載體；
編碼C-MYC之表現載體；和
編碼SV40之表現載體。
於各種實施態樣中，本揭示提供用於製備一或多個T細胞載體之套組，該T細胞載體係用於有其需要之個體的T細胞療法，該套組包含：
編碼KLF4、OCT3/4和SOX2之仙台病毒；
編碼KLF4之仙台病毒；
編碼C-MYC之仙台病毒；和
編碼SV40之仙台病毒。
於各種實施態樣中，本揭示提供用於製備一或多個T細胞載體之套組，該T細胞載體係用於有其需要之個體的T細胞療法，該套組包含編碼KLF4、OCT3/4、SOX2、C-MYC和視需要地，SV40之多順反子仙台病毒載體。
於各種實施態樣中，該套組可進一步包含T細胞活化化合物或劑。於各種實施態樣中，該T細胞活化化合物或劑為抗CD3抗體。於各種實施態樣中，該套組包含共刺激劑，諸如抗CD28抗體。於各種實施態樣中，該套組包含抗CD3抗體和抗CD28抗體兩者。於各種實施態樣中，該套組可進一步包含一或多種用於培養和/或部分重編程T細胞之合適培養基。於各種實施態樣中，該套組可進一步包含一或多種細胞介素。該等細胞介素包括，但不限於IL-2、IL-7、IL-15和IL-12。 V. 進一步之實施態樣
本發明可藉由下列定義如本文所描述之各種實施態樣的條款中之一或多者表徵。
於第一實施態樣中，本發明關於[1]：
[1]一種製造至少一個經回春之T細胞的生物體外方法，其包含(a)使T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2、C-MYC和SV40所組成之群組的重編程因子接觸一段期間，該期間足夠形成源自T細胞之附著型細胞；其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；(b)使該等源自T細胞之附著型細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於第二實施態樣中，本發明關於[2]：
[2]一種製造至少一個T細胞之生物體外方法，其包含(a)使在培養容器中之第一培養基中的T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2、C-MYC和SV40所組成之群組的重編程因子接觸一段期間，該期間足以使該等T細胞形成至少一個附著於該培養容器表面之群落；其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及(b)使至少一個附著型群落與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於第三實施態樣中，本發明關於[3]：
[3]一種製造至少一個T細胞之生物體外方法，其包含(a)使在第一培養基中之T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2、C-MYC和SV40所組成之群組的重編程因子接觸至少約5天且不超過約10天之期間；其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及(b)使該等T細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於第四實施態樣中，本發明關於[4]：
[4]一種製造至少一個T細胞之生物體外方法，其包含(a)使T細胞群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2、C-MYC和SV40所組成之群組的重編程因子接觸一段足以使該等T細胞表現至少一種標記之期間，該至少一種標記係選自由下列所組成之群組：整合素α6β1、SSEA4、CD9和CD90；其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及(b)使T細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於進一步之實施態樣中，本發明關於：
[5]如[1]至[4]中任一項之方法，其中該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸一段期間，該期間足以使至少一部分之該等T細胞表現CD3和至少一種選自由下列所組成之群組的標記：整合素α6β1、SSEA4、CD9和CD90，較佳為SSEA4和CD3，更佳為CD3、CD9和CD90，甚至更佳為CD3、SSEA4、CD9和CD90。
[6]如[1]至[5]中任一項之方法，其中使該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸之前，使該等T細胞與IL-2和/或至少一種能夠活化該等T細胞之劑接觸，較佳地，能夠活化該等T細胞之劑為腫瘤抗原。
[7]如[1]至[6]中任一項之方法，其中該T細胞為TCRα+TCRβ+細胞；TCRg(γ)+TCRd(δ)細胞；CD4+CD8αβ+雙陽性細胞、CD4+單陽性細胞(諸如Th1、Th2、Th17、Treg)、初始T細胞、中央記憶T細胞、或效應記憶T細胞，或其中該T細胞在與自體腫瘤細胞共同培養後表現活化標記，其中該活化標記為4-1BB(CD137)、PD1、LAG3、CD45、CD39、TIGIT、TIM3、CD69、OX40、CD28、CD25、CD49d和CTLA4。
[8]如[1]至[7]中任一項之方法，其中該T細胞係自哺乳動物(較佳為人)分離出。
[9]如[1]至[8]中任一項之方法，其中使T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸。
[10]如[1]至[9]中任一項之方法，其中使T細胞與至少一種重編程因子，較佳為KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸至少約4至10天，較佳為至少約4至7天，更佳為約5天。
[11]如[1]至[10]中任一項之方法，其中該至少一種重編程因子係表現在T細胞，較佳地，該至少一種重編程因子係使用非整合型病毒載體或以奈米顆粒遞送至細胞之核酸表現，更佳地，該載體為仙台病毒，甚至更佳地，該至少一種重編程因子為KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC。
[11a]如[1]至[11]中任一項之方法，其中該至少一種重編程因子係在T細胞中表現：a)一段足以形成源自T細胞之附著型細胞的期間且其中該經分離之T細胞未轉形成iPS或全潛能細胞；b)約4天至約10天；c)約4天至約11天；d)約4天至約12天；e)約4天至約13天；或f)約4天至約14天。
[12]如[1]至[11a]中任一項之方法，其中該至少一種重編程因子為組成上表現的，其中隨後藉由添加T細胞活化劑或抑制該至少一種重編程因子之表現的化合物來抑制表現，較佳地，該化合物為特異抑制該至少一種重編程因子之表現的小分子抑制劑，更佳地，該化合物為特異抑制該至少一種重編程因子之表現的siRNA或shRNA分子，甚至更佳地，該至少一種重編程因子為KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC。
[13]如[1]至[12]中任一項之方法，其進一步包含使該等T細胞與至少一種選自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-12所組成之群組中的細胞介素接觸。
[14]如[1]至[13]中任一項之方法，其中該至少一種T細胞活化化合物包含結合CD3之抗體或結合CD28之抗體或兩者；和/或其中該至少一種T細胞活化化合物為腫瘤抗原。
[15]如[1]至[14]中任一項之方法，其進一步包含工程處理該T細胞以表現細胞表面受體，其中該T細胞係在使該T細胞與該至少一種重編程因子接觸之前或之後工程處理，較佳地，該細胞表面受體為嵌合抗原受體或T細胞受體或其雜合受體，更佳地，該細胞表面受體識別標靶細胞之表面上的特定抗原部分。
[16]如[15]之方法，其中該抗原部分為第I類MHC依賴性或非第I類MHC依賴性。
[17]如[1]至[16]中任一項之方法，其中該所產生之T細胞包含T細胞受體基因之V、D和J節段的不完整組和/或進一步包含測量所產生之T細胞的表觀遺傳年齡，較佳地，所產生之T細胞的表觀遺傳年齡較重編程前之T細胞群年輕至少5%。如[1]至[16]中任一項之方法，其中該所產生之T細胞包含T細胞受體基因之V、D和J節段的不完整組和/或進一步包含測量所產生之T細胞的表觀遺傳年齡，較佳地，所產生之T細胞的表觀遺傳年齡較重編程前之T細胞群年輕至少5%且該等T細胞不表現NCAM1、NCR2、FCGR3A、KIR2DL4或KIR2DS4。
[18]如[1]至[17]中任一項之方法，其中該等經部分重編程之T細胞能夠較與該至少一種重編程因子接觸之前的T細胞擴增多出至少25倍。
[19]如[1]至[18]中任一項之方法，其中使該等經分離之T細胞與該至少一種重編程因子接觸導致CD3和CD8表現減少。
於進一步之實施態樣中，本發明關於[20]：
[20]一種製造T細胞之生物體外方法，其包含將T細胞培養在包含IL-2之第一培養基中並使用至少一種特異於CD3、或CD28、或兩者之抗體活化該等T細胞；使該等經活化之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸約5天至約10天之期間；在不包含IL-2或特異於CD3或CD28之抗體的第二培養基中；其中該等T細胞未被完全重編程為iPSC細胞；以包含IL-2和至少一種特異於CD3和/或CD28之抗體的第三培養基替代該第二培養基；其中將該等T細胞培養在該第三培養基中至少約5天。
於進一步之實施態樣中，本發明關於下列一或多者：
[21]如[20]之方法，其進一步包含擴增該等T細胞。
[22]如[20]或[21]之方法，其中該T細胞為TCRα+TCRβ+細胞；TCRg(γ)+TCRd(δ)細胞；CD4+ CD8αβ+雙陽性細胞、CD4+單陽性細胞(Th1、Th2、Th17、Treg)、初始T細胞、中央記憶T細胞、或效應記憶T細胞。
[23]如[20]至[22]中任一項之方法，其中該接觸進一步包含使該等經活化之T細胞與SV40接觸。
[24]如[20]至[23]中任一項之方法，其中該T細胞在與自體腫瘤細胞共同培養後表現活化標記，其中該活化標記為4-1BB(CD137)、PD1、LAG3、CD45、CD39、TIGIT、TIM3、CD69、OX40、CD28、CD25、CD49d和CTLA4。
[25]如[1]至[24]中任一項之方法，其中該T細胞為從腫瘤獲得之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。
於進一步之實施態樣中，本發明關於[26]：
[26]一種T細胞群，其表觀遺傳年齡較其實際年齡年輕至少5%，較佳為較其實際年齡年輕至少25%。
於進一步之實施態樣中，本發明關於[27]：
[27]一種源自T細胞之附著型細胞群，其中至少70%之該等細胞表現CD3和SSEA4兩者。
於另一實施態樣中，本發明關於：
[28]如[27]之群，其中至少30%之該等細胞表現CD9和/或其中至少30%之該等細胞表現CD90，較佳為至少30%之該等細胞表現CD9和CD90兩者。
[29]一種T細胞群，其藉由如[1]至[25]中任一項之方法製造。
[30]如[26]至[29]中任一項之T細胞群，其中使該等T細胞與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2、C-MYC和SV40所組成之群組的因子接觸導致CD3和CD8表現減少。
[31]如[26]至[30]中任一項之群，其中該T細胞為TIL，其中至少50%之TIL表現CCR7和CD62L兩者，或其中至少50%之TIL表現CCR7和TCF7兩者。
[32]如[26]至[31]中任一項之群，其中該T細胞為經回春的TIL。
[33]如[26]至[32]中任一項之T細胞群，其係用於療法。
[34]如[26]至[32]中任一項之T細胞群，其係用於治療癌症、病毒病況或自體免疫病症的方法中。
[35]用於如[34]之用途的T細胞群，其中該癌症為急性淋巴細胞癌、急性髓性白血病、肺泡橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳癌、肛門癌、肛管癌、或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌、或胸膜癌、頭頸癌(例如鼻癌、鼻腔癌、或中耳癌、口腔癌)、外陰癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓性細胞癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸道類癌、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、腎臟癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、腹膜癌、大網膜癌、和腸繫膜癌、咽喉癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌(例如腎細胞癌(RCC))、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、輸尿管癌、或膀胱癌。
於進一步之實施態樣中，本發明關於：
[37]一種製造經回春的T細胞之方法，其包含使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地，SV40接觸至少一段足以使至少20%之該等經接觸的T細胞表現α6β1整合素的期間且其中該等經接觸的T細胞未轉形為iPS細胞；使用與α6β1整合素特異結合之結合分子將至少20%之該等經接觸的T細胞分離出；使(b)之經分離的細胞與T細胞活化劑和/或T細胞共刺激劑接觸；從而製造經回春的T細胞。
於進一步之實施態樣中，本發明關於：
[38]一種製造至少一種經回春的T細胞之方法，其包含使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地，SV40短暫接觸一段足以形成源自T細胞之附著型細胞的期間；其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；將表現a6(CD49f)或b1(CD29)整合素或兩者之源自T細胞之附著型細胞亞群分離出；使該分離出之亞群與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於進一步之實施態樣中，本發明關於：
[39]一種藉由包含下列步驟之方法製造之經回春的T細胞群：使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)SV40接觸一段足以形成源自T細胞之附著型細胞的期間；其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；將表現a6整合素、b1整合素或兩者之源自T細胞之附著型細胞亞群分離出；使該源自T細胞之附著型細胞亞群與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於進一步之實施態樣中，本發明關於：
[40]一種源自T細胞之附著型細胞群，其中至少70%之該等細胞表現整合素α6或整合素β1，或
[41]一種源自T細胞之附著型細胞群，其中至少50%之該等細胞表現整合素α6和整合素β1兩者。
於進一步之實施態樣中，本發明關於：
[42]一種源自T細胞之附著型細胞群，其中至少70%之該等細胞表現整合素α6和整合素β1兩者。
於進一步之實施態樣中，本發明關於：
[43]一種T細胞，其表觀遺傳年齡較其實際年齡(或適當之對照T細胞)年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%，且當藉由總轉錄本分析測定時，其中該T細胞富含氧化磷酸化、脂肪酸代謝、糖解和缺氧基因集。
[44]一種T細胞，其表觀遺傳年齡較其實際年齡(或適當之對照T細胞)年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%，且當藉由總轉錄本分析測定時，與對照T細胞相比較，其中該T細胞富含氧化磷酸化和糖解基因集。
[45]一種T細胞，其表觀遺傳年齡較其實際年齡(或適當之對照T細胞)年輕至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或至少80%，且其中該T細胞不表現非常規、NK、T或B細胞標記(例如NCAM1、NCR2、FCGR3A、KIR2DL4或KIR2DS4)。
於進一步之實施態樣中，本發明關於
[46]一種製造經回春的T細胞之方法，其包含：a)使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地，SV40接觸至少一段期間，該期間足以使至少20%之經接觸的T細胞表現α6β1整合素且其中該等經接觸之T細胞未轉形為iPS細胞；b)使用特異結合α6β1整合素之結合分子將至少20%之該等經接觸的T細胞分離出；c)使(b)之細胞與T細胞活化劑和/或T細胞共刺激劑接觸；從而製造經回春的T細胞；[47]其中該與α6β1整合素特異結合之結合分子係選自層連結蛋白(Laminin)-511、層連結蛋白-511E8、抗CD29抗體和抗Cd49f抗體。
於進一步之實施態樣中，本揭示關於
[48]一種製造經回春的T細胞之方法，其包含a)使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地，SV40短暫接觸一段期間，該期間足以形成源自T細胞之附著型細胞；其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；b)將表現a6(CD49f)或b1(CD29)整合素或兩者的源自T細胞之附著型細胞亞群分離出；c)將該亞群與至少一種T細胞活化化合物接觸。
於進一步之實施態樣中，本揭示關於
[48]一種藉由包含下列步驟之方法製造之經回春的T細胞群：a)使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)SV40接觸一段期間，該期間足以形成源自T細胞之附著型細胞；其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；b)將表現a6整合素、b1整合素或兩者之源自T細胞的附著型細胞亞群分離出；及c)使該等源自T細胞之附著型細胞亞群與至少一種T細胞活化化合物接觸。
[49]一種如[46]至[48]中任一項之經回春的T細胞群，其中於一亞群中，至少20%之該等細胞表現整合素α6或整合素β1；或[50]其中於該亞群中，至少50%之該等細胞表現整合素α6或整合素β1；[51]其中於該亞群中，至少20%之該等細胞表現整合素α6和整合素β1兩者；或[52]其中於該亞群中，至少50%之該等細胞表現整合素α6和整合素β1兩者。
[50]一種源自T細胞之附著型細胞群，其中至少70%之該等細胞表現整合素α6或整合素β1；或[51]其中至少50%之該等細胞表現整合素α6和整合素β1兩者；或[52]其中至少70%之該等細胞表現整合素α6和整合素β1兩者。
[53]一種使用如[1]至[52]之實施態樣中任一項的T細胞群治療有其需要之患者的方法。

Claims (112)

  1. 一種製造經回春的T細胞之方法，其包含 a. 使T細胞與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地SV40接觸一段期間，該期間足夠形成源自T細胞之附著型細胞(adherent cell)，且其中該T細胞未轉形為iPS或全潛能(totipotent)細胞；及 b. 使該源自T細胞之附著型細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
  2. 一種製造T細胞之方法，其包含 a. 使在培養容器中之第一培養基中的T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地SV40接觸一段期間，該期間足以使該等T細胞形成至少一個附著於該培養容器表面之群落(colony)，且其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及 b. 使至少一個附著型群落與至少一種T細胞活化化合物接觸。
  3. 一種製造T細胞之方法，其包含 a. 使第一培養基中之T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)SV40接觸至少約5天至約10天之期間，且其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及 b. 使(a)之該等T細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
  4. 一種製造T細胞之方法，其包含 a. 使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)SV40接觸一段期間，該期間足以使該等T細胞表現至少一種選自由下列所組成之群組的標記：整合素α6β1、SSEA4、CD9和CD90，且其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及 b. 使(a)之該等T細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
  5. 如請求項4之方法，其中該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等T細胞表現CD3和至少一種選自由下列所組成之群組的標記：整合素α6β1、SSEA4、CD9和CD90。
  6. 如請求項5之方法，其中該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等經接觸之T細胞表現SSEA4和CD3。
  7. 如請求項5之方法，其中該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等經接觸之T細胞表現CD3和CD9、或CD3和CD90、或CD3、CD9和CD90。
  8. 如請求項5之方法，其中該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等經接觸之T細胞表現CD3、SSEA4、CD9和CD90。
  9. 如請求項1之方法，其中使該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸之前，該等T細胞係以IL-2和至少一種能夠活化該等T細胞之劑來活化。
  10. 如請求項1之方法，其中該T細胞為TCRαβ細胞；TCRγδ細胞；CD4+CD8αβ+雙陽性細胞、CD4+單陽性細胞(諸如Th1、Th2、Th17、Treg)、初始T細胞(naïve T cell)、中央記憶T細胞、或效應記憶T細胞。
  11. 如請求項9之方法，其中該等經活化之T細胞係藉由選擇表現CD137、PD1或LAG3之細胞來富集。
  12. 如請求項1之方法，其中該等T細胞係來自哺乳動物。
  13. 如請求項1之方法，其中該等T細胞係來自人。
  14. 如請求項1之方法，其中該等T細胞係與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸。
  15. 如請求項14之方法，其中該等T細胞係與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸至少約4至約10天。
  16. 如請求項15之方法，其中該等T細胞係與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸至少約4至約7天。
  17. 如請求項16之方法，其中該等T細胞係與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸約7天。
  18. 如請求項1之方法，其中該至少一種重編程因子係表現在T細胞。
  19. 如請求項18之方法，其中該至少一種重編程因子係使用非整合型病毒載體來表現。
  20. 如請求項19之方法，其中該至少一種重編程因子係使用仙台(Sendai)病毒表現。
  21. 如請求項18之方法，其中表現該至少一種重編程因子且其中隨後藉由添加抑制該至少一種重編程因子表現之化合物來抑制表現。
  22. 如請求項21之方法，其中該化合物為小分子抑制劑，其特異地抑制KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC表現中一或多者的表現。
  23. 如請求項18之方法，其中該至少一種重編程因子的表現係藉由使該等源自T細胞之附著型細胞與活化T細胞之劑接觸來抑制。
  24. 如請求項18之方法，其中該至少一種重編程因子係以奈米顆粒遞送。
  25. 如請求項1之方法，其中包含使該等T細胞與細胞介素接觸。
  26. 如請求項1之方法，其中該至少一種T細胞活化劑包含與CD3結合之抗體、或與CD28結合之抗體、或兩者；或者其中該至少一種T細胞活化劑為腫瘤抗原。
  27. 如請求項1之方法，其進一步包含將該T細胞工程處理以表現細胞表面受體，其中該T細胞係在使該T細胞與該至少一種重編程因子接觸之前經工程處理。
  28. 如請求項1之方法，其進一步包含將該T細胞工程處理以表現細胞表面受體，其中該T細胞係在使該T細胞與該至少一種重編程因子接觸之後經工程處理。
  29. 如請求項27之方法，其中該細胞表面受體為嵌合型抗原受體(CAR)、或T細胞受體、或其雜合受體。
  30. 如請求項27之方法，其中該細胞表面受體識別標靶細胞表面上之特定抗原。
  31. 如請求項30之方法，其中該抗原為第I類MHC依賴性。
  32. 如請求項31之方法，其中該抗原為非第I類MHC依賴性。
  33. 如請求項1之方法，其中該所產生之T細胞包含T細胞受體基因之V、D和J節段的不完整組。
  34. 如請求項1之方法，其進一步包含測量所產生之T細胞的表觀遺傳年齡。
  35. 如請求項1之方法，其中所產生之T細胞的表觀遺傳年齡較重編程前之T細胞群年輕至少5%。
  36. 如請求項1之方法，其中該等經部分重編程之T細胞能夠較對照T細胞擴增多出至少25倍。
  37. 如請求項1之方法，其中使該等T細胞與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的因子；和(ii) SV40接觸導致CD3和CD8表現減少。
  38. 一種製造T細胞之方法，其包含 a. 將T細胞培養在包含IL-2之第一培養基中並使用至少一種特異於CD3、或CD28、或兩者之抗體；或腫瘤抗原、腫瘤類器官(organoid)、或腫瘤細胞株活化該等T細胞； b. 使該等經活化之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC在不包含IL-2或特異於CD3或CD28之抗體；或腫瘤抗原、腫瘤類器官、或腫瘤細胞株的第二培養基中接觸一段期間；其中該等T細胞未被完全重編程為iPS或全潛能細胞； c. 以包含IL-2和至少一種特異於CD3及/或CD28之抗體的第三培養基替代該第二培養基；其中該等經接觸之T細胞係在該第三培養基中培養至少約5天。
  39. 如請求項38之方法，其進一步包含擴增該等經接觸之T細胞。
  40. 如請求項38之方法，其中該T細胞為TCRαβ細胞；TCRγδ細胞；CD4 +CD8αβ +雙陽性細胞、CD4 +單陽性細胞(Th1、Th2、Th17、Treg)、初始T細胞、中央記憶T細胞、或效應記憶T細胞。
  41. 如請求項38之方法，其中該 接觸進一步包含使該等經活化之T細胞與SV40接觸。
  42. 如請求項38之方法，其中該T細胞在與自體腫瘤細胞共同培養後表現活化標記，其中該活化標記為CD137、PD1、或LAG3。
  43. 一種T細胞群，其表觀遺傳年齡較其實際年齡(chronological age)年輕至少5%。
  44. 如請求項43之T細胞群，其中該表觀遺傳年齡較其實際年齡年輕至少25%。
  45. 一種源自T細胞之附著型細胞群，其中至少70%之該等細胞表現CD3和SSEA4。
  46. 如請求項45之群，其中至少30%之該等細胞表現CD9。
  47. 如請求項45之群，其中至少30%之該等細胞表現CD90。
  48. 如請求項45之群，其中至少30%之該等細胞同時表現CD9和CD90。
  49. 一種源自T細胞之附著型細胞群，其中至少30%之該等細胞表現CD9或CD90。
  50. 一種源自T細胞之附著型細胞群，其中至少30%之該等細胞同時表現CD9和CD90。
  51. 一種T細胞群，其藉由包含下列者之方法而製造： a. 使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地SV40接觸一段期間，該期間足以形成源自T細胞之附著型細胞且其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及 b. 使該等源自T細胞之附著型細胞與至少一種T細胞活化劑接觸。
  52. 一種T細胞群，其藉由包含下列者之方法而製造： a. 使在培養容器中之第一培養基中的T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地SV40接觸一段期間，該期間足以使T細胞形成至少一個附著於該培養容器表面之群落，且其中該T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；和 b. 使該至少一個附著之群落與至少一種T細胞活化劑接觸。
  53. 一種T細胞群，其藉由包含下列者之方法而製造： a. 使第一培養基中之T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)SV40接觸至少約5天至約10天之期間，且其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞； b. 使(a)之該等T細胞與至少一種T細胞活化劑接觸。
  54. 一種T細胞群，其藉由包含下列者之方法而製造： a. 使T細胞群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)SV40接觸一段期間，該期間足以使該等T細胞表現至少一種選自由下列所組成之群組的標記：整合素α6β1、SSEA4、CD9和CD90，且其中該等T細胞未轉形為iPS或全潛能細胞；及 b. 使(a)之該等T細胞與至少一種T細胞活化劑接觸。
  55. 如請求項54之T細胞群，其中該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等T細胞表現CD3和至少一種選自由整合素α6β1、SSEA4、CD9和CD90所組成之群組的標記。
  56. 如請求項55之T細胞群，其中該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等經接觸之T細胞表現SSEA4和CD3。
  57. 如請求項55之T細胞群，其中該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等經接觸之T細胞表現CD3、CD9和CD90。
  58. 如請求項55之T細胞群，其中該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸一段期間，該期間足以使至少一部分該等經接觸之T細胞表現CD3、SSEA4、CD9和CD90。
  59. 如請求項51之T細胞群，其中使該等T細胞與該至少一種重編程因子接觸之前，藉由使該等T細胞與細胞介素和至少一種T細胞活化劑接觸來活化該等T細胞。
  60. 如請求項51之T細胞群，其中該T細胞為TCRαβ細胞；TCRγδ細胞；CD4+CD8αβ+雙陽性細胞、CD4+單陽性細胞(諸如Th1、Th2、Th17、Treg)、初始T細胞、中央記憶T細胞或效應記憶T細胞。
  61. 如請求項59之方法，其中該T細胞活化劑為自體腫瘤細胞。
  62. 如請求項61之方法，其中該等經活化之T細胞係藉由選擇表現CD137、PD1或LAG3之細胞來富集。
  63. 如請求項51之T細胞群，其中該等T細胞係來自哺乳動物。
  64. 如請求項51之T細胞群，其中該等T細胞係與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸。
  65. 如請求項64之T細胞群，其中該等T細胞係與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸至少約4至約11天。
  66. 如請求項65之T細胞群，其中該等T細胞係與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸至少約4至約7天。
  67. 如請求項66之T細胞群，其中該等T細胞係與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸約7天。
  68. 如請求項51之T細胞群，其中KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC係表現在該T細胞中。
  69. 如請求項68之T細胞群，其中KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC係使用非整合病毒載體表現。
  70. 如請求項69之T細胞群，其中KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC係使用仙台病毒表現。
  71. 如請求項69之T細胞群，其中表現KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC且其中隨後藉由添加抑制KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC表現之化合物來抑制表現。
  72. 如請求項69之T細胞群，其中該化合物為小分子抑制劑，該小分子抑制劑特異地抑制KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC表現中一或多者的表現。
  73. 如請求項66之T細胞群，其中該至少一種重編程因子之表現係藉由使該等源自T細胞之附著型細胞與T細胞活化劑接觸來抑制。
  74. 如請求項68之T細胞群，其中KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC係從一或多種在奈米顆粒中遞送至T細胞之表現載體來表現。
  75. 如請求項51之T細胞群，其進一步包含使該等T細胞與至少一種選自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-12所組成之細胞介素接觸。
  76. 如請求項51之T細胞群，其中該至少一種T細胞活化劑包含與CD3結合之抗體、或與CD28結合之抗體、或兩者；或者其中該至少一種T細胞活化劑為腫瘤抗原。
  77. 如請求項51之T細胞群，其進一步包含將該T細胞工程處理以表現細胞表面受體，其中該T細胞係在使該T細胞與該至少一種重編程因子接觸之前經工程處理。
  78. 如請求項51之T細胞群，其進一步包含將該T細胞工程處理以表現細胞表面受體，其中該T細胞係在使該T細胞與該至少一種重編程因子接觸之後經工程處理。
  79. 如請求項77之T細胞群，其中該細胞表面受體為嵌合型抗原受體、或T細胞受體、或其雜合受體。
  80. 如請求項77之T細胞群，其中該細胞表面受體識別標靶細胞表面上之特定抗原。
  81. 如請求項80之T細胞群，其中該抗原為第I類MHC依賴性。
  82. 如請求項80之T細胞群，其中該抗原為非第I類MHC依賴性。
  83. 如請求項51之T細胞群，其中所產生之T細胞包含T細胞受體基因之V、D和J節段的不完整組。
  84. 如請求項51之T細胞群，其進一步包含測量所產生之T細胞的表觀遺傳年齡。
  85. 如請求項84之T細胞群，其中所產生之T細胞的表觀遺傳年齡較重編程前之T細胞群年輕至少5%。
  86. 如請求項51之T細胞群，其中該等經部分重編程之T細胞能夠較對照T細胞擴增多出至少25倍。
  87. 如請求項51之T細胞群，其中使該等T細胞與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的因子；和SV40接觸導致CD3和CD8表現減少。
  88. 一種T細胞群，其藉由包含下列者之方法而製造： a. 將T細胞培養在包含IL-2之第一培養基中並以至少一種特異於CD3或CD28之抗體活化該等T細胞； b. 使該等經活化之T細胞與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC在不包含IL-2或特異於CD3或CD28之抗體的第二培養基中接觸約5天至約10天之期間；其中該等T細胞未完全重編程為iPS或全潛能細胞； c. 以包含IL-2和至少一種特異於CD3和/或CD28之抗體的第三培養基替代該第二培養基；其中該等經接觸之T細胞係在該第三培養基中培養至少約5天。
  89. 如請求項88之T細胞群，其進一步包含擴增該等T細胞。
  90. 如請求項89之T細胞群，其中該T細胞為TCRαβ細胞；TCRγδ細胞；CD4 +CD8αβ +雙陽性細胞、CD4 +單陽性細胞(Th1、Th2、Th17、Treg)、初始T細胞、中央記憶T細胞、或效應記憶T細胞。
  91. 一種使用T細胞群治療有其需要之個體之方法，該T細胞群係藉由如請求項1之方法製造。
  92. 一種使用如請求項43之群治療有其需要之患者之方法。
  93. 一種使用如請求項51之T細胞群治療有其需要之患者之方法。
  94. 如請求項92之方法，其中該治療方法為用於治療癌症、病毒病況、或自體免疫病症之方法。
  95. 如請求項94之方法，其中該癌症為急性淋巴細胞癌、急性髓性白血病、肺泡橫紋肌肉瘤(alveolar rhabdomyosarcoma)、骨癌、腦癌、乳癌、肛門癌、肛管癌、或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌、或胸膜癌、頭頸癌(例如鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌)、外陰癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓性細胞癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸道類癌、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、腎臟癌(kidney cancer)、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、腹膜癌、大網膜癌、和腸繫膜癌、咽喉癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌(renal cancer)(例如腎細胞癌(RCC))、肉瘤、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、輸尿管癌或膀胱癌。
  96. 一種製造經回春之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之方法，其包含： a. 使TIL群與至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和視需要地SV40接觸一段期間，該期間足以形成源自T細胞之附著型細胞，且其中該TIL未轉形為iPS或全潛能細胞；及 b. 使該等源自T細胞之附著型細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
  97. 一種TIL群，其係 根據如請求項96之方法製造。
  98. 一種製造經回春之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)之方法，其包含 a. 使用第一腫瘤抗原活化TIL群，從而使該等經活化之TIL表現CD137；視需要地，富集該CD137+TIL； b. 使該經活化之TIL群與(i)至少一種選自由KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC所組成之群組的重編程因子，和(ii)視需要地SV40接觸一段期間，該期間足以形成源自TIL之附著型細胞；其中該等TIL未轉形為iPS或全潛能細胞。
  99. 如請求項98之方法，其進一步包含使該等源自TIL之附著型細胞與至少一種T細胞活化化合物接觸。
  100. 如請求項99之方法，其中該至少一種T細胞活化化合物為第一腫瘤抗原。
  101. 如請求項100之方法，其中該第一腫瘤抗原為自體腫瘤細胞、自體腫瘤細胞株、腫瘤類器官、或源自前述任一者之抗原。
  102. 如請求項98之方法，其中該TIL群係與KLF4、OCT3/4、SOX2和C-MYC接觸。
  103. 如請求項102之方法，其中該TIL群係與SV40接觸。
  104. 如請求項98之方法，其中該TIL群係與KLF4、OCT3/4、SOX2、C-MYC和SV40接觸。
  105. 一種經回春之TIL群，其根據如請求項98之方法製備。
  106. 如請求項105之經回春的TIL群，其中至少50%之該等經回春的TIL表現CCR7和CD62L兩者。
  107. 如請求項105之經回春的TIL群，其中至少50%之該等經回春的TIL表現CCR7和CD62L兩者。
  108. 如請求項105之經回春的TIL群，其中至少50%之該等經回春的TIL表現CCR7和TCF7兩者。
  109. 如請求項105之經回春的TIL群，其中至少50%之該等經回春的TIL表現CCR7和TCF7兩者。
  110. 一種使用經回春之TIL群治療有其需要的患者之方法，該經回春之TIL群係藉由請求項98之方法製造。
  111. 如請求項110之方法，其中該治療方法為用於治療癌症、病毒病況、或自體免疫病症之方法。
  112. 如請求項111之方法，其中該癌症為急性淋巴細胞癌、急性髓性白血病、肺泡橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳癌、肛門癌、肛管癌、或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌、或胸膜癌、頭頸癌(例如鼻癌、鼻腔癌、或中耳癌、口腔癌)、外陰癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓性細胞癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸道類癌、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌、腎臟癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰臟癌、腹膜癌、大網膜癌、和腸繫膜癌、咽喉癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌(例如腎細胞癌(RCC))、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、輸尿管癌、或膀胱癌。
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